点状対象物の３次元位置決め用の顕微鏡装置および顕微鏡法

【課題】点状対象物の３次元位置決め用の顕微鏡装置と顕微鏡法を提供する。
【解決手段】顕微鏡装置には、点状対象物を、焦点配光４０、４０’の形態で２つの別個の画像空間に結像する２つの結像光学系２６、２６’と、且つそれぞれの画像空間で配置された検出面２７、２７’の検出点にて、分析可能な光点を捕捉する２つの検出ユニット２８、２８’と、２つの検出面２７、２７’の検出点を相互にペアで対応させ、且つ２つの光点を分析することによって点状対象物の横方向ｘ−ｙ位置および軸方向ｚ位置を確認する評価ユニットと、が含まれる。２つの結像光学系には、それぞれの検出ユニットの検出面に垂直な検出軸に対して、それぞれの焦点配光を斜めに向ける光学手段が含まれる。２つの焦点配光の傾斜が相互に反対であることにより、点状対象物のｚ位置の変化に応じて２つの光点が、反対方向にシフトする。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、点状対象物の３次元位置決め用の顕微鏡装置であって、２つの結像光学系、すなわち、対象物空間に位置する同一の点状対象物を、それぞれ焦点配光（focused light distribution、２つの検出ユニット、すなわち、それぞれが、２つの結像光学系の１つに割り当てられ、且つそれぞれの焦点配光を通して、平面断面を表すそれぞれの画像空間に配置された検出面の検出点において分析可能な光点を捕捉する２つの検出ユニットと、評価ユニット、すなわち、２つの検出面の検出点を相互にペアで対応させ、且つこの画像点対応を考慮して２つの交点を分析することによって、対象物空間に存在する対象物平面内における点状対象物の横方向ｘ−ｙ位置、および対象物平面に垂直に配置された光軸の方向における点状対象物の軸方向ｚ位置を確認する評価ユニットと、を有する顕微鏡装置に関する。本発明はまた、点状対象物の３次元位置決め用の顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個別マーカ、特に蛍光分子の連続した確率的な位置決めを用いることによって、従来の光顕微鏡における回折に誘起された解像限界より小さな試料構造の結像を可能にする光顕微鏡結像方法が、近年開発された。かかる方法は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献１および非特許文献２に説明されている。顕微鏡法のこの新しい部門はまた、位置決め顕微鏡法とも呼ばれる。適用される方法は、例えば、（Ｆ）ＰＡＬＭ（（蛍光）光活性化位置推定顕微鏡法）、ＰＡＬＭＩＲＡ（取得が独立して実行されるＰＡＬＭ）、ＧＳＤ（ＩＭ）（基底状態抑制（個別分子回帰）顕微鏡法）または（Ｆ）ＳＴＯＲＭ（（蛍光）確率的光学再構成顕微鏡法）の名称によって文献で知られている。
【０００３】
新しい方式は、結像される試料構造の準備が、２つの識別可能な状態、すなわち「明」状態および「暗」状態を有する、一般にマーカと呼ばれる点状対象物の使用を含むことに共通点がある。例えば、蛍光染料がマーカとして使用される場合に、明状態は、マーカが蛍光発光できる状態であり、暗状態は、マーカが蛍光発光できない状態である。
【０００４】
好ましい特定の実施形態において、例えば、特許文献６および特許文献１において、光切り替え可能または光活性化可能な蛍光分子が用いられる。代替として、独国審査済明細書の特許文献２におけるように、標準蛍光分子の固有の暗状態が用いられる。
【０００５】
結像光学系の従来の解像限界より高い解像度で試料構造を結像するために、マーカの小さなサブセットが、明状態へ繰り返し移される。これには、明状態における、およびしたがって光顕微鏡法によって結像できる状態における隣接マーカ間の平均距離が、結像光学系の解像限界より大きいことを保証する、この活性サブセットを形成するマーカ密度を選択することを必要とする。活性サブセットを形成するマーカは、空間分解光検出器、例えばＣＣＤカメラ上に結像され、その結果、光学系の解像限界によってサイズが決定される光点の形態をした配光は、各点状マーカから記録される。
【０００６】
それによって、多数の個別生データ画像が捕捉されるが、そのそれぞれにおいて別の活性サブセットが結像される。次に、各個別生データ画像において、明状態における点状マーカを表す配光の重心位置は、画像分析プロセスにおいて決定される。次に、個別生データ画像から確認された配光の重心位置は、集合画像データ記録の形態をした全体的な表現において一緒にされる。この全体的な表現からもたらされる高度に解像された集合画像は、マーカの分配を反映する。
【０００７】
結像される試料構造を典型的に再現するには、十分な数のマーカ信号が検出されることを必要とする。しかしながら、特定の活性サブセットにおけるマーカの数が、明状態における２つのマーカ間の必要な最小平均相互距離によって制限されるので、試料構造を完全に結像できるようにするために、多数の個別生データ画像を記録しなければならない。個別生データ画像の数は、典型的には１０，０００〜１００，０００に及ぶ。
【０００８】
上記の位置決め顕微鏡法において、光検出器上に生成された個別光点の重心位置は、典型的には単に２次元で決定され、その結果、重心位置の全てから再構成された試料構造の高解像画像も、同様に単に２次元画像である。しかしながら、試料構造を３次元で再構成するのが好ましいであろう。
【０００９】
試料において個別点状対象物の３次元位置決定を可能にする関連技術の方法がまた知られている。これに関連して、特許文献７および特許文献８と同様に、非特許文献３および非特許文献４が、例として参照される。特許文献８に説明されている方法は、異なる画像平面における少なくとも２つの画像センサ上の脱焦された画像パターンの分析に基づいている。特許文献７による方法において、光パターンの楕円率は、特別の光学系を用いて分析される。
【００１０】
関連技術の方法は、重心決定およびパターン認識用の複雑な画像分析、またはこれらの方法に従って機能する顕微鏡装置の一般的な有用性を制限する特別な光学系を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２７６９２Ａ２
【特許文献２】ＤＥ１０２００６０２１３１７Ｂ３
【特許文献３】ＷＯ２００７／１２８４３４Ａ１
【特許文献４】ＵＳ２００９／０１３４３４２Ａ１
【特許文献５】ＤＥ１０２００８０２４５６８Ａ１
【特許文献６】ＷＯ２００８／０９１２９６Ａ２
【特許文献７】ＷＯ２００９／０８５２１８Ａ１
【特許文献８】ＵＳ７，７７２，５６９Ｂ２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy （STORM），” Nature Methods ３，７９３-７９６（２００６），M. J. Rust，M. Bates，X. Zhuang
【非特許文献２】“Resolution of Lambda／１０ in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching，” Geisler C. et al，Appl. Phys. A，８８，２２３-２２６（２００７）
【非特許文献３】“Three-dimensional tracking of fluorescent nanoparticles with subnanometer precision by use of off-focus imaging，” Optics Letters，２００３，vol.２８（no.２）， Michael Speidel et al
【非特許文献４】“Three-dimensional Particle Tracking via Bifocal Imaging，” Nano Letters，２００７，vol.７（no.７）， pages ２０４３-２０４５，Erdal Toprak，et al
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、点状対象物の簡単な３次元位置決めを可能にする一方で、最小の技術的費用しか必要としない装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置用のこの目的を、次の点において達成する。すなわち、２つの結像光学系のそれぞれが、それぞれの検出ユニットの検出面に垂直な、それぞれの結像光学系に設けられた検出軸に対して、それぞれの焦点配光を斜めに向ける光学手段を含む点と、光学手段によって生成された２つの焦点配光の傾斜は、画像点対応を考慮し、２つの光点が、そのそれぞれの検出面の点状対象物におけるｚ位置の変化に応じて反対方向にシフトするような方法で、相互に反対側である点と、評価ユニットが、２つの光点の相対的位置に基づいて点状対象物の軸方向ｚ位置を確認する点と、において達成する。
【００１５】
本発明によれば、結像光学系の制限された解像力を考慮して、焦点配光が、（理想化された）点状対象物を結像することによって得られる３次元配光として理解される。本技術分野において、かかる焦点配光は、点広がり関数、一言でいえばＰＳＦとして一般に知られているものの観点から説明されることが多い。
【００１６】
したがって、本発明は、３次元焦点配光、すなわち、結像光学系によって生成され、且つその配光を通して点状対象物、例えば蛍光発光分子が２つの検出ユニット上に結像される３次元焦点配光が、それぞれの検出ユニットの検出軸に対して斜めに角度をつけられて、いわば、焦点配光の対称性における破れを達成するようにすることを規定するが、それは、点状対象物を位置決めするために非常に簡単且つ容易に利用可能である。したがって、それぞれの焦点配光の傾斜の結果、それぞれの検出ユニットの検出軸に沿った焦点配光のオフセットは、対応する検出ユニット上で焦点配光によって生成される光点における横方向シフトにつながる。２つの焦点配光の傾斜が相互に反対側なので、対応する光点における前述の横方向シフトは、２つの検出ユニット上で反対側に向けられている。したがって（横方向ｘ−ｙ位置に加えて）、対象物空間における点状対象物の軸方向ｚ位置は、光点のこの反対側に向けられた横方向シフトから決定可能である。それによって、対象物の簡単な３次元位置決めが可能になる。
【００１７】
検出ユニット上の２つの光点における上記の反対側に向けられたシフトから点状対象物の３次元位置を推測することができるように、一検出面の検出点と、他の検出面の検出点とのペアの空間的関連が提供される。この関連により、点状対象物の３次元位置を決定するために、２つの光点の位置を相互に比較できるようにする、２つの検出面における検出点の一意の対応が提供される。したがって、本発明による検出点対応はまた、位置決めを可能にする画像の重ね合わせとして理解してもよい。
【００１８】
本発明による装置によって、複雑な画像分析の必要もパターン認識の必要もなしに、検出ユニット上に生成された光点を簡単に評価することが可能になる。それによって、技術的に複雑かまたはコスト集約的な特別な光学系を必要とせずに、迅速で理想的にリアルタイム能力のある３次元対象物位置決めが可能になる。
【００１９】
この装置は、今まで単に２次元位置決めが一般に可能だった、最初に説明した高解像度位置決め顕微鏡法において用いてもよい。しかしながら、それは、かかる使用に限定されない。したがって、装置はまた、例えば時間の関数としての移動拡散粒子を追跡するために用いられる、例えば、「粒子追跡」と呼ばれる方法において用いてもよい。定義された点状対象物の３次元の位置決定を提供することが目的であるどんな使用も考えられる。単一分子顕微鏡法の言及がまた、ここで例示的になされる。本文脈において、点状対象物は、結像光学系の従来の（回折限界）解像度より空間範囲が小さい全ての対象物として理解されるべきである。
【００２０】
評価ユニットは、それぞれの光点の重心位置を取得し、且つ２つの光点の取得された重心位置に基づいて、横方向ｘ−ｙ位置と同様に軸方向ｚ位置を決定するのが好ましい。重心位置は、位置決め顕微鏡法から一般に周知の方法で取得してもよい。重心位置が決定される精度は、光点が検出ユニットによって捕捉される際の信号対ノイズ比に、したがって例えば、点状対象物を形成する蛍光発光分子の検出された光子数に実質的に依存する。位置決め精度は、背景またはノイズ信号を区別および／または除去する適切な画像処理の使用を通して向上させてもよい。とにかく、それぞれの重心位置を決定するプロセスは、特定の光点が単一の点状対象物によって生成されるという知識に基づいている。これによって、結像光学系の解像限界よりはるかに優れた空間精度で対象物の位置を決定することが可能になる。
【００２１】
有利な一実施形態において、評価ユニットは、２つの光点の重心位置の中間に基づいて点状対象物の横方向ｘ−ｙ位置を決定する。これによって、並はずれた精度で、対象物空間における対象物の横位置を決定することが可能になる。
【００２２】
好ましくは、評価ユニットは、２つの光点の重心位置間の距離に基づいて、点状対象物の軸方向ｚ位置を確認するのが好ましい。２つの検出ユニットの検出面が、光学的に相互に共役である場合、すなわち、同じ対象物平面を結像する場合に、（上記でさらに説明した検出点対応を考慮すると）２つの配光の重心位置間の距離は、対象物平面上の正確な集束を与えられたとすると、ほぼゼロに等しい。検出点対応が、画像の重ね合わせとして理解される場合、重心位置は、この場合には一致する。他方で、脱焦の増加と共に、距離は、２つの焦点配光の反対側の傾斜、すなわち、この脱焦が行われている方向もまた明確に区別できるようにする配光の反対側の傾斜、つまり、２つの検出面が、位置決めされる対象物を含む対象物平面に光学的に共役である画像空間に配置された平面の前または後ろに存在するかどうかによる絶対値の点で増加する。これによって、対象物の軸方向ｚ位置の一意で正確な決定が可能になる。
【００２３】
２つの検出ユニットの検出面は、対象物空間の同じ対象物平面に光学的に共役であることが好ましい。これによって、２つの光点の特に簡単な評価が可能になるが、それぞれの検出面における光点の位置は、位置決めされる対象物を含む対象物平面に対する、検出面の焦点状態の関数である。
【００２４】
好ましい特定の一実施形態において、本発明による装置は、両方の結像光学系によって共有される記録レンズであって、点状対象物から発する光を、好ましくは平行な光線束へと変換する記録レンズを特徴とし、且つ記録レンズによって生成された光線束を、それぞれの検出ユニット上に２つの光点の１つをそれぞれが生成する２つの部分光線束へと分割するビームスプリッタを特徴とする。ビームスプリッタは、例えば、点状対象物から発する光を、半分は一方の検出ユニットへ、もう半分をもう一方の検出ユニットへ向けるように構成してもよい。この特定の実施形態において、共有記録レンズは、一方の結像光学系の一部としてと同様に、もう一方の結像光学系の一部として見なしてもよい。記録レンズが、対象物から発する光を平行光線束に変換する場合に、記録レンズの下流の結像光学系は、それに割り当てられたビーム経路において非常に柔軟に配置可能である。
【００２５】
結像光学系のそれぞれは、それぞれの部分光線束をそれぞれの検出ユニット上に集束するチューブレンズを特徴とするのが好ましい。この場合に、チューブレンズをそれぞれの結像光学系で用い、本発明の方法に従って、斜めに配光に角度をつけてもよい。これは、例えば、次の点で達成可能である。すなわち、チューブレンズが、結像光学系の光軸から横方向にオフセットされ、その結果、焦点配光を生成する部分光線束が、偏心してチューブレンズに当たるという点で達成可能である。かかる偏心した入射の場合に、チューブレンズは、焦点配光の所望の傾斜を生成する。結像ビーム経路の光軸に対する、チューブレンズの横方向オフセットが、可変的に設定可能な場合に、焦点配光の傾斜は、希望通りに変更可能である。この場合に、対応する検出ユニットが、同様に、焦点配光の位置における変化に依存して、検出ユニットを制御できるように空間的に調整可能であるのが有利である。
【００２６】
例えば、それぞれの焦点配光に斜めに角度をつけるための光学手段は、それぞれの結像光学系に設けられた光学素子の偏心照明、好ましくは偏心低照明に備えている。したがって、チューブレンズに関連して上記で説明した偏心照明は、焦点配光の所望の傾斜を達成するために、それぞれの結像光学系における任意の他の所望の光学素子用に提供してもよい。低照明は、ここでは、光学素子の入射瞳が、光によって完全には横断されず、どちらかと言えば単に部分的にのみ横断される光入射として理解される。焦点配光の大きさは、かかる低照明によって増加させることができる。可変低照明が特に好ましい。なぜなら、それによって、広範な範囲内で、焦点配光のサイズの調整が可能になるからである。
【００２７】
焦点配光における所望の反対側の傾斜はまた、任意の他の所望の方法で実現してもよい。それぞれのビーム経路の光軸から横方向にオフセットされたレンズまたはレンズ群に加えて、例えば、焦点配光の所望の傾斜を生成する非球面のレンズ面を有するレンズもまた用いてもよい。本発明による光学手段はまた、焦点配光の所望の傾斜を達成するために、入射光の波面に影響を及ぼす空間光変調器であってもよい。
【００２８】
２つの検出ユニットは、必ずしも別々に実現されたコンポーネントではない。それらはまた、例えば、ＣＣＤカメラモジュールにおける２つのサブエリアの形態をした１つのモジュール上に一緒に構成してもよい。これによって、所望の方法で２つの検出ユニットを相互に位置決めするために、それらを調整する必要が除去される。
【００２９】
本発明の別の態様は、請求項１２に従って点状対象物の３次元位置決め用の顕微鏡法を規定する。
【００３０】
本発明による方法は、最初は説明した位置決め顕微鏡法において非常に有益に使用可能である。この場合に、複数の点状対象物が、３次元位置決め用に、それぞれの検出ユニット上に同時に結像される。対象物空間において、点状対象物は、それぞれの検出面において点状対象物を結像する光点を互いに空間的に別々に捕捉できるようにするほど十分に大きい横方向の距離によって離間される。したがって、多数の点状マーカが、単一生データ画像を記録することによって、３次元的に位置決め可能である。複雑な３次元構造もまた、集合画像における一連の個別画像用の確認された重心位置を後で一緒にすることによって、簡単且つ迅速に再構成可能である。
【００３１】
図に関連して、本発明を下記で詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】検出ユニット上への点状対象物の従来の結像を示すための光顕微鏡の概略図である。
【図２】検出ユニット上への、点状対象物の本発明による結像を示すための図１に対応する光顕微鏡の図である。
【図３】図２による光顕微鏡の検出器側ビーム経路の概略図であり、斜めに角度をつけられた焦点配光の生成を示す。
【図４】異なる焦点状態用の２つの検出ユニットの、本発明による使用を示す概略図である。
【図５】異なる焦点状態用の両方の検出ユニット上における、同じものによって生成された２つの焦点配光および光点を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明に従って点状対象物の３次元位置決めを実行できる広視野顕微鏡１０が、図２〜４に示されている。特許請求される関連主題の理解に不可欠な顕微鏡コンポーネントだけが、図２〜４のそれぞれに示されている。
【００３４】
本発明による位置決めの原理を明確にするために、図２に示す光顕微鏡１０は、図１に示す顕微鏡、すなわち、設計において図２による光顕微鏡とかなりの程度まで同一であるが、しかし本発明の方法に従っては機能しない図１に示す顕微鏡と、最初に比較されることになる。図１および２において、同等または相互に対応する顕微鏡コンポーネントは、同じ参照数字によって示されている。
【００３５】
図１による従来の方法で動作する広視野光顕微鏡１０には、２つの点状対象物１４および１６から発する光を受信する記録レンズ１２が含まれる。点状対象物１４および１６は、例えば、試料１８に存在する蛍光発光分子である。
【００３６】
下記は、点状対象物１４および１６が、どのように試料１８内で位置決めされるかを説明する。この位置決めは、軸ｘ、ｙ、ｚによって図１に示された座標系に関連して行われることになる。横方向ｘ−ｙ位置が、対象物平面、すなわち、試料１８によって形成された対象物空間に存在し、且つ図１に示された座標系に関連してｘ−ｙ平面と平行に配置された対象物平面内の点状対象物１４および１６用に決定されることが特に意図されている。さらに、それぞれの対象物１４、１６の軸方向ｚ位置が、前述の対象物平面に垂直な光軸Ｏ１の方向において確認されることになる。
【００３７】
点状対象物１４から発する光は、記録レンズ１２によって光線束２０に変換される。したがって、記録レンズ１２は、点状対象物１６から発する光から平行光線束２２を形成する。図１に示す例において、点状対象物１４が光軸Ｏ１上に存在し、その結果、対象物１４に関連する光線束２０が、光軸Ｏ１と平行に伝播すると仮定される。他方において、点状対象物１６が、光軸Ｏ１から横方向にオフセットされ、その結果、対象物１６に関連する光線束２２が、光軸Ｏ１に対して斜めに伝播すると仮定される。
【００３８】
２つの光線束２０および２２は、ミラー２４によってチューブレンズ２６上に反射される。チューブレンズ２６によって、両方の光線束２２および２４は、検出ユニット２８の検出面２７上に集束することが可能になる。２つの点状対象物１４および１６は、このように、レンズ１２およびチューブレンズ２６で構成された結像光学系を介して、検出ユニット２８の検出面２７上に結像される。
【００３９】
検出面２７は、検出面２７の方向に集束する光線束２０および２２と同様に、拡大図で図１に再び示されて、点状対象物１４および１６が、試料１８内におけるその空間位置に従って、３次元画像空間３４の異なる領域３０および３２に結像されることを明白に示す。したがって、検出ユニット２８の検出面２７内において、ｚ方向における点状対象物１４および１６の空間位置に依存して、検出面２７上で多かれ少なかれ軸方向に集束された点状対象物１４および１６の画像が形成される。説明を単純化するために、検出器側でも同様に、試料１８に関連する、自身の軸ｘ、ｙ、ｚを含む座標系が、ここおよびまた下記において参照される。
【００４０】
検出面２７における光線束２０および２２の不鮮明さから、点状対象物１４および１６は、検出面２７が光学的に共役である対象物平面の内側または外側に存在するかどうかを推定することが可能である。しかしながら、図１に示す光学的結像の場合に、光線束２０および２２が、検出面２７上に垂直に、すなわち検出面２７に垂直に配置された検出軸３６の方向で当たるので、点状対象物１４および１６が、対象物に共役な平面の前または後ろでｚ方向に存在するかどうかを結論つけることは不可能である。図１による表現から理解可能なように、光線束２０および２２の脱焦は、すなわち、検出面２７の前または後ろにおけるシフトに対して対称的に振る舞う。
【００４１】
上記の説明から、次のような結果になる。すなわち、図１に示す結像の場合に、横方向位置決定は、実際に、ｘ−ｙ平面と平行な対象物平面において可能であるが、しかしながら位置決定は、光線束２０および２２によって生成された焦点配光がｚ方向において対称的であるので、ｚ方向では可能でないという結果になる。ｚ方向における決定を含む３次元の位置決定用に、いわば、図２による例示的な実施形態に関連して下記で明確にする、焦点配光の対称性の破れが必要とされる。
【００４２】
図２による発明的な光顕微鏡１０は、図１に示す顕微鏡と同じコンポーネントを本質的に特徴とする。しかしながら、光顕微鏡１０が、図２に示す検出ユニット２８を含むだけではなく、例えば、以下でさらに明確にされる、図４に由来するような、設計においてほぼ同一の別の検出ユニットもまた含むことがここで注目される。したがって、図２による表現は、図１による従来の構成との差を際立たせるために単純化されている。
【００４３】
図２に示すアプローチの重要な特徴は、点状対象物１４および１６から発する光線束２０および２２が、検出ユニット２８の検出軸３６に対して斜めに角度をつけられた焦点配光４０、４２を画像空間３４にそれぞれ生成する点に存在する。図２による表現から推測可能なように、焦点配光４０および４２は、同様に対角線として特徴づけることができる、検出軸３６に対する経路を示す。焦点配光４０および４２のこの対角線形状は、チューブレンズ２６が、チューブレンズ２６の方向へミラー２４によって偏向される光軸Ｏ１から横方向にオフセットされる点において、図２による例示的な実施形態で達成される。チューブレンズ２６のこの横方向オフセットの結果、チューブレンズ２６は、光線束２０、２２によって偏心して横断される。
【００４４】
これは、図１に示す実例と比較して、光軸Ｏ１上に位置する対象物１４から発して光軸Ｏ１と平行に伝播する光線束２０によって最もよく認識され得る。図１に示す従来の構成において、光線束２０は、チューブレンズ２６の光軸と軸方向に対称的に配置される。図２によるアプローチにおいて、チューブレンズ２６に対するビーム２０の軸対称は、破られている。この実際の状況は、図３による表現で再び示されている。図３は、ａ）の下で、光線束２０が、どのようにチューブレンズ２６を通して検出面２７上に集束されるかを示し、一方でｂ）の下で、光線束２０から発する焦点配光４０をｘ−ｚ平面において示し、且つｃ）の下で、チューブレンズ２６の入射瞳４４の偏心低照明をｘ−ｙ平面において示す。
【００４５】
図３のｃ）から推測可能なように、チューブレンズ２６の入射瞳４４は、ビーム２０によって完全には照明されない。むしろ、光線束２０が、入射瞳４４の中央からｘ方向にオフセットされた、入射瞳４４の部分領域だけを通過するような方法で、低照明が提供される。その結果は、ｂ）の下で示すように、画像空間３４においてｘ−ｚ平面に対角線的に延びる焦点配光４０の形状である。
【００４６】
上記でさらに説明したように、記録レンズ１２とチューブレンズ２６との間を伝播する２つの光線束２０および２２は、平行光ビームを形成する。しかしながら、結像ビーム経路のこのエリアにおいて、光線束２０、２２は、必ずしも平行光ビームではない。例えば、チューブレンズ２６の瞳平面が、記録レンズ１２の瞳平面の共役平面であるような方法で、光学的結像を構成することが同様に考えられる。
【００４７】
したがって、図２に示す構成において、チューブレンズ２６は、上記の方法で非対称的に、不十分に照明される。そのために、チューブレンズ２６は、光軸Ｏ１から横方向にオフセットされる。しかしながら、チューブレンズ２６の非対称な不十分な照明を実現するために、ビーム２０および２２の案内自体を同様にオフセットしてもよい。そのために、例えば、傾斜ミラーなどの特別のビーム案内コンポーネントをビーム経路に挿入してもよい。
【００４８】
図２および３に示すチューブレンズ２６の非対称低照明はまた、単に例として理解すべきである。しかしながら、図２および３に示す焦点配光４０および４２の対角線形状を生成する他の手段もまた考えられる。所望の焦点配光を同様に生成できる非球面レンズの使用または空間光変調器の使用が例として参照される。
【００４９】
既に上記でさらに言及したように、本発明による光顕微鏡１０は、図２に示す検出ユニット２８だけでなく、図４に２８’で示された別の検出ユニットも特徴とする。したがって、検出ユニット２８’に割り当てられるさらなるチューブレンズ２６’が設けられる。したがって、チューブレンズ２６は、記録レンズ１２と一緒に、第１の結像光学系を形成する。したがって、第２の結像光学系が、記録レンズ１２およびチューブレンズ２６’によって提供される。
【００５０】
図４は、ビームスプリッタ５０によって第１の部分光線束５２および第２の部分光線束５２’ に分割される光線束２０を例示的に示す。第１の光線束５２は、チューブレンズ２６を通過し、次に焦点配光４０を生成する。したがって、第２の光線束５２’は、チューブレンズ２６’を通過し、焦点配光４０’を生成する。
【００５１】
異なる２つの焦点状態が、ａ）およびｂ）の下で図４に示されている。したがって、ａ）の下において、焦点配光４０および４０’が、大部分は、それぞれの検出面２７、２７’の下流にそれぞれ構成されることが分かる。他方では、ｂ）の下で示す焦点状態において、焦点配光４０および４０’は、大部分は、それぞれの検出面２７、２７’の上流にそれぞれ構成される。
【００５２】
図５は、２つの焦点配光４０および４０’が、例示的な本実施形態において、ｘ−ｚ平面と平行な断面図に傾斜して配置されることをａ）の下で示す。図５においてＩ、ＩＩおよびＩＩＩによって示され、且つそれぞれ対応する焦点配光４０、４０’に対して、検出面２７、２７’の所定の空間位置によってそれぞれ区別される３つの異なる焦点状態が示されている。図５は、各場合においてそれぞれ対応する検出面２７、２７’における、ａ）の下で示した３つの焦点状態Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ用の焦点配光４０、４０’を生成する光点５４、５４’をｂ）の下でそれぞれ示す。光点５４および５４’は、ｘ−ｙ平面と平行な、それぞれの焦点３次元配光４０、４０’を通して平面断面を表す２次元配光をそれぞれ形成する。
【００５３】
検出面２７および２７’に生成された光点５４および５４’に基づく点状対象物１４の軸方向ｚ位置とともに、横方向ｘ−ｙ位置を決定するために、光点５４および５４’が記録される両方の検出面２７および２７’の検出点（例えば、ＣＣＤ画像センサの個別画像素子）が、相互にペアとして対応するように設定される。それによって、検出面２７’の検出点が、検出面２７の各検出点に一意に割り当てられる。かかる検出点対応は、検出面２７および２７’上で生成された対象物画像の重ね合わせに実質的に対応する。
【００５４】
図５のａ）のもとで示す３つの焦点状態Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、試料１２内における点状対象物１４の３つの異なるｚ位置の特徴を反映する。図５に示す例において、焦点状態Ｉにおける焦点配光４０および４０’は、大部分は、それぞれ対応する検出面２７、２７’の後ろに存在する。したがって、光点５４および５４’は、それぞれ対応する検出面２７、２７’におけるｘ方向において、それぞれ下方、上方に移動される。他方で、焦点状態ＩＩにおいて、焦点配光４０および４０’は、それぞれの重心と一緒に、それぞれ対応する検出面２７、２７に直接位置する。したがって、光点５４および５４’は、それぞれ検出面２７、２７’の中心に位置する。最後に、焦点状態ＩＩＩにおける焦点配光４０および４０’は、主に、検出面２７、２７’の前にそれぞれ存在する。したがって、光点５４は、検出面２７の上方へ移動され、光点５４’は、検出面２７’の下方に移動される。
【００５５】
本例において、焦点配光４０および４０’の逆相関は、光点５４および５４’にそれぞれ割り当てられた検出面２７、２７’のｘ軸に沿って光点５４および５４’の、反対側に向けられたシフトを誘起する。例えば、焦点状態Ｉにおける場合のように、光点５４が、検出面２７の負方向（図５における下方）でｘ軸に沿ってシフトされる場合に、光点５４’は、検出面２７’の正方向（図５における上方）でｘ軸に沿って移動される。正確には、焦点状態ＩＩＩにおいて逆も真であり、一方で焦点状態ＩＩ、すなわち、結像光学系の解像限界の文脈において、点状対象物１４の最適に鮮明な結像を検出面２７および２７’上に示すように意図されている焦点状態ＩＩにおいて、２つの光点５４および５４’のそれぞれは、それぞれの検出面２７、２７’の中心にそれぞれ位置する。
【００５６】
点状対象物１４を３次元において位置決めするために、両方の光点５４および５４’の重心位置が、最初に確認される。次に、対象物１４の横方向ｘ−ｙ位置を決定するために、光点５４および５４’の重心位置の中間が決定される。図５による例から推測可能なように、両方の光点５４および５４’における重心位置の中間は、３つの全ての焦点状態Ｉ〜ＩＩＩに対して同じである。したがって、この中間は、それぞれの検出面２７、２７’の中心に正確にそれぞれ対応する（最適な焦点状態ＩＩにおいて、中心は、既に、両方の光点５４および５４’の重心位置と一致している）。したがって、最適な焦点状態ＩＩだけでなく、他の両方の焦点状態ＩおよびＩＩＩ、すなわち、検出面２７および２７’が、位置決めされる対象物が位置している対象物平面に対して正確には光学的に共役ではない焦点状態ＩおよびＩＩＩにおいても、横方向ｘ−ｙ位置を正確に決定することが可能である。
【００５７】
次に、軸方向ｚ位置は、２つの光点５４および５４’の予め確認された共有中心点からの２つの光点５４および５４’の距離に基づいて決定される。これは、位置決めされる対象物のｚ位置が、特に２つの光点５４および５４’の相対的相互距離の相対的位置に基づいて確認されることを意味する。図５による表現から推測可能なように、３つの図示の焦点状態Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ用のこの相対的相互距離は、焦点状態の基となる、位置決めされる対象物の様々なｚ位置を反映する異なる値に帰着する。図５に示す例に関して、光学焦点状態ＩＩにおける２つの光点５４および５４’間の相対的距離は、理想的に値０を生成し、一方で２つの他の焦点状態ＩおよびＩＩＩに関して、それは、絶対値の点からは多かれ少なかれ同じであり得るが、しかしその演算符号によって互いに異なる可能性がある値を生成する。いずれにせよ、対象物のｚ位置における一意の決定が可能である。
【００５８】
図２に示す光顕微鏡１０が、上記で明確にした光点５４および５４’を評価するための評価ユニット６０を特徴とすることにもまた留意されたい。この評価ユニット６０は、点状対象物の位置決め用に用意された全ての演算を実行する。したがって、例えば、評価ユニット６０は、検出点対応、重心位置の決定、および最後に横方向ｘ−ｙ位置と同様に軸方向ｚ位置の計算を行うために、上記の画像重ね合わせを引き受ける。
【００５９】
単一の対象物だけでなく多数の対象物がまた、上記の方法で同時に位置決めされることが自明である。これに関連して、単一の点状対象物からそれぞれが生じる、検出面２７および２７’上に生成される光点が、互いに空間的に分離可能であることに単に留意されたい。
【符号の説明】
【００６０】
１０光顕微鏡
１２記録レンズ
１４、１６点状対象物
１８試料
２０、２２光線束
２６、２６’ チューブレンズ
２７、２７’ 検出面
２８、２８’ 検出ユニット
３０、３２画像フレームの領域
３４画像空間
３６検出軸
４０、４０’、４２、４２’ 焦点配光
４４入射瞳
５０ビームスプリッタ
５２、５２’ 部分光線束
５４、５４’ 光点
Ｏ１光軸

【特許請求の範囲】
【請求項１】
点状対象物（１４、１６）の３次元位置決め用の顕微鏡装置（１０）であって、２つの結像光学系（１２、２６、２６’）と、２つの検出ユニット（２８、２８’）と、評価ユニット（６０）とを備えて構成され、
前記２つの結像光学系は、対象物空間（１８）に位置する同一の点状対象物（１４、１６）を、それぞれ焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）の形態で２つの別個の画像空間（３４）に結像するものであり、
前記２つの検出ユニットは、前記２つの結像光学系（１２、２６、２６’）の１つにそれぞれ割り当てられ、且つ前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）を通して、平面断面を表す前記それぞれの画像空間（３４）に配置された検出面（２７、２７’）の検出点に、分析可能な光点（５４、５４’）を捕捉するものであり、
前記評価ユニットは、前記２つの検出面（２７、２７’）の前記検出点を相互にペアで対応させ、且つこの画像点対応を考慮して２つの光点（５４、５４’）を分析することによって、前記対象物空間（１８）に存在する対象物平面内の前記点状対象物（１４、１６）の横方向ｘ−ｙ位置、および前記対象物平面に垂直に配置された光軸（Ｏ１）の方向における前記点状対象物（１４、１６）の軸方向ｚ位置を確認するものであり、
前記２つの結像光学系（１２、２６、２６’）のそれぞれが、前記それぞれの結像光学系（１２、２６、２６’）に設けられ且つ前記それぞれの検出ユニット（２８、２８’）の前記検出面（２７、２７’）に垂直に配置された検出軸（３６）に対して、前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）を斜めに向ける光学手段（２６、２６’）を含み、
前記光学手段（２６、２６’）によって生成された前記２つの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）の傾斜が相互に反対であって、前記検出点対応を考慮すると、前記２つの光点（５４、５４’）がそれらの前記それぞれの検出面（２７、２７’）における前記点状対象物（１４、１６）のｚ位置の変化に応じて反対方向にシフトしており、
前記評価ユニット（６０）が、前記２つの光点（５４、５４’）の相対的位置に基づいて、前記点状対象物（１４、１６）の前記軸方向ｚ位置を確認する、顕微鏡装置（１０）。
【請求項２】
前記評価ユニット（６０）が、前記それぞれの光点（５４、５４’）の重心位置を取得し、且つ前記２つの光点（５４、５４’）の取得された重心位置に基づいて、横方向ｘ−ｙ位置と軸方向ｚ位置を決定する、請求項１に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項３】
前記評価ユニット（６０）が、前記２つの光点（５４、５４’）の前記重心位置の中間に基づいて前記点状対象物（１４、１６）の前記横方向ｘ−ｙ位置を決定する、請求項２に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項４】
前記評価ユニットが、前記２つの光点（５４、５４’）の前記重心位置間の距離に基づいて、前記点状対象物（１４、１６）の前記軸方向ｚ位置を確認する、請求項２または３に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項５】
前記２つの結像光学系（２６、２６’）の前記検出面（２７、２７’）が、前記対象物空間（１８）における同じ対象物平面に光学的に共役である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項６】
両方の結像光学系（１２、２６、２６’）によって共有され、且つ前記点状対象物（１４、１６）から発する光を、好ましくは平行な光線束（２０、２２）へと変換する記録レンズ（１２）と、
前記記録レンズ（１２）によって生成された前記光線束（２０、２２）を、前記それぞれの検出面（２７、２７’）上に前記２つの光点（５４、５４’）の１つをそれぞれが生成する２つの部分光線束（５２、５２’）へと分割するビームスプリッタ（５０）と、を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項７】
前記結像光学系（１２、２６、２６’）のそれぞれが、前記それぞれの部分光線束（５２、５２’）を前記それぞれの検出面（２７、２７’）上に集束するチューブレンズ（２６、２６’）を含む、請求項６に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項８】
前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）に斜めに角度をつけるための前記光学手段（２６、２６’）が、偏心照明、好ましくは前記それぞれの結像光学系（１２、２６、２６’）に設けられた光学素子（２６、２６’）の偏心低照明のために好ましくは備えている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項９】
前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）に斜めに角度をつけるための前記光学手段が、非球面レンズ面を有するレンズである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項１０】
前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）に斜めに角度をつけるための前記光学手段が、空間光変調器である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項１１】
前記２つの検出ユニット（２８、２８’）が、１つのモジュール上に一緒に構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置（１０）。
【請求項１２】
点状対象物（１４、１６）の３次元位置決め用の顕微鏡法であって、
対象物空間（１８）に位置する同一の点状対象物（１４、１６）が、焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）の形態で、２つの別個の画像空間（３４）に結像され、
分析可能な光点（５４、５４’）が、それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）を通して、平面断面を表すそれぞれの画像空間（３４）に配置された検出面（２７、２７’）の検出点にて捕捉され、
２つの検出面（２７、２７’）の検出点が、相互にペアで対応させられ、
前記検出点対応を考慮して前記２つの光点（５４、５４’）を分析することによって、前記点状対象物（１４、１６）の横方向ｘ−ｙ位置が、前記対象物空間（１８）に存在する対象物平面内で確認され、前記点状対象物（１４、１６）の軸方向ｚ位置が、前記対象物平面に垂直に配置された光軸（Ｏ１）の方向において確認され、
前記それぞれの焦点配光（４０、４０’、４２、４２’）が、前記それぞれの検出面（２７、２７’）に垂直に配置された検出軸（３６）に対して斜めに向けられ、
前記検出点対応を考慮すると、前記２つの光点（５４、５４’）が、それらのそれぞれの検出面（２７、２７’）における前記点状対象物（１４、１６）のｚ位置の変化に応じて反対方向にシフトするように、前記２つの焦点配光の傾斜が相互に反対であり、
前記点状対象物（１４、１６）の前記軸方向ｚ位置が、前記２つの光点（５４、５４’）の相対的位置に基づいて確認される、顕微鏡法。
【請求項１３】
複数の点状対象物（１４、１６）が、それぞれ、３次元位置決め用にそれぞれの検出面（２７、２７’）上に同時に結像され、且つ前記対象物空間（１８）にて、前記点状対象物（１４、１６）が、前記それぞれの検出面（２７、２７’）に前記点状対象物（１４、１６）を結像する前記光点（５４、５４’）を、互いに空間的に別々に捕捉できるようにするほど十分に大きい横方向の距離によって離間される、請求項１２に記載の顕微鏡法。
【請求項１４】
前記点状対象物（１４、１６）が、明状態と暗状態との間で切り替え可能な対象物、特に蛍光発光分子である、請求項１３に記載の顕微鏡法。

【図１】