皮膚細胞増殖促進組成物およびその製造方法
【課題】カカオ豆外皮抽出物を有効成分とするより有効な皮膚の細胞増殖促進剤およびその製造方法を見出し、かかる細胞増殖促進剤により皮膚の表皮角化細胞および真皮線維芽細胞の増殖を促進させることにより皮膚の老化および肌荒れ症状の防止、改善さらには創傷治癒効果を有する皮膚外用剤、並びに組成物、飲食品を提供する。
【解決手段】表皮角化細胞及び、真皮線維芽細胞の増殖を促進させる皮膚細胞増殖促進剤として、カカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分を有効成分とする。
【解決手段】表皮角化細胞及び、真皮線維芽細胞の増殖を促進させる皮膚細胞増殖促進剤として、カカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分を有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カカオ豆外皮抽出物およびカカオ豆外皮の中性脂質画分を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の構造は最上層から表皮、真皮、皮下組織の三層に分かれている。表皮は皮膚の最も外側にあり外気や紫外線などの様々な刺激にさらされている。表皮はその大部分を表皮角化細胞（ケラチノサイト）で構成されており、表皮角化細胞の分化段階によって、外側から角質層、顆粒層、有棘層、基底層の４つの細胞層に分かれている。細胞が基底層から角質層まで成熟し、はがれ落ちるまでのサイクルをターンオーバーといい、このサイクルがスムーズに行われることにより、皮膚は一定の厚さと若さを保っている。
【０００３】
真皮は皮膚の張りや弾力性に関わるエラスチンやコラーゲン、保水性の維持に重要なヒアルロン酸等の細胞外マトリックスと真皮細胞により構成されており、真皮細胞の中で線維芽細胞が細胞外マトリックス成分を合成している。
【０００４】
加齢、紫外線暴露、空気乾燥等により、皮膚の表皮細胞および真皮細胞はダメージを受ける。表皮においては表皮角化細胞の減少と代謝の低下によりターンオーバー速度が遅くなることによって、肌は保湿性やなめらかさを失い、硬くなったりくすみや小ジワが現れたりする。更には、メラニンが過剰に生成された部位では表皮細胞の分裂、増殖が低下しメラニン排出が滞り、よりシミのできやすい状態となる。真皮においては細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチンやコラーゲンの分解及び変質、線維芽細胞の増殖低下に伴う細胞外マトリックスの産生能力の低下により、肌は張りや弾力を失い、肌荒れ、シワ等を生じる。
【０００５】
従って、表皮角化細胞の増殖促進により、皮膚のターンオーバーが早くなり、小ジワやくすみ、しみを軽減させる。また、真皮線維芽細胞の増殖促進により、コラーゲンやヒアルロン酸の産生を向上させ、シワの形成や肌の弾性低下を防止及び改善することができると考えられる。さらには外傷や火傷、手術等による創傷治癒の促進効果も期待される。また、重度のやけど等を負った患者等に対する治療法として、患者自身の皮膚断片を培養し、これを移植する方法がある。培養可能な皮膚組織の採取から完成まで時間を必要とすることが問題とされているが、細胞増殖促進剤の使用により皮膚細胞の培養期間短縮が期待される。
【０００６】
これまで、皮膚の抗老化予防素材としてコラーゲン産生促進作用、表皮角化細胞増殖 作用を有する物質を天然物から取得しようという試みがなされている。
【０００７】
例えば、表皮細胞増殖促進組成物としてカカオマスおよびココアパウダー（特許文献１参照）が開示されているが、カカオ豆外皮に関する効果は示されていない。ケラチノサイトの分化及び角化に関与する遺伝子を活性化させる素材としてカカオ豆および外皮の水、水―アルコール抽出物（特許文献２、３参照）が開示されているが、カカオ豆外皮の低極性溶媒抽出物である脂質画分に関する効果は示されていない。皮膚の加齢症状防止組成物、化粧品としてポリフェノールを含有するココア抽出物、より詳細にはポリフェノール、アミノ酸、及びケン化され得ない物質の濃縮物を組み合わせて含有するココア抽出物（特許文献４参照）に関して開示されているが、カカオ豆外皮の低極性溶媒抽出物である脂質画分に関する細胞増殖促進効果は示されていない。また、上記のカカオ外皮由来の非ケン化性脂質画分が毒性物質ジメチルホルムアミドの添加された培養液中で線維芽細胞の増殖を部分的に保護したとの報告はあるが、通常の培養条件で増殖を促進させたとの報告はされていない（非特許文献１参照）。
【０００８】
カカオマスおよびココアパウダーを有効成分とする創傷治癒促進剤（特許文献５、６参照）が開示されているがカカオ豆外皮の中性脂質画分に関する効果は開示されていない。
【０００９】
また表皮線維芽細胞の増殖促進剤、創傷治癒促進剤として、例えば、サフランの雌しべ抽出物（特許文献７参照）、アーモンド、セイヨウタンポポ、セイヨウニワトコ、センキュウ、センブリ、ソウハクヒ、トウニン、ニンジン、ホップ、ムクゲ、ヨクイニン抽出物（特許文献８参照）などが確認されている。しかしながら、これらの効果は必ずしも満足のいくものではなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−６９９２３号公報
【特許文献２】特開２００６−２０６５９９号公報
【特許文献３】特開２００５−４７９１４号公報
【特許文献４】特開２００４−５０３４８１号公報
【特許文献５】特開２００１−２３３７７９号公報
【特許文献６】特開２００６−２８２５７３号公報
【特許文献７】特開２００５−４１８１２号公報
【特許文献８】特開平１０−３６２７９号公報
【非特許文献１】Ｒ．Ｗａｒｏｃｑｕｉｅｒ−ｃｌｅｒｏｕｔ，ｅｔ．ａｌ著，“インターナショナル ジャーナル オブ コスメティック サイエンス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｃｅ）”，“Ｎｏｎ−ｓａｐｏｎｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｃｏａ ｓｈｅｌｌ ｂｕｔｔｅｒ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”，１９９２年，Ｖｏｌ１４，Ｐ．３９〜４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、カカオ豆外皮抽出物を有効成分とするより有効な皮膚の細胞増殖促進剤およびその製造方法を見出し、かかる細胞増殖促進剤により皮膚の表皮角化細胞および真皮線維芽細胞の増殖を促進させることにより皮膚の老化および肌荒れ症状の防止、改善さらには創傷治癒効果を有する皮膚外用剤、並びに組成物、飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため探索を行い、アオギリ科植物のテオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）の外皮抽出物およびその中性脂質画分がそれぞれ高いヒト表皮角化細胞増殖促進作用およびヒト真皮線維芽細胞増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明はカカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分を有効成分とする表皮角化細胞及び、真皮線維芽細胞の増殖を促進させる皮膚細胞増殖促進剤に関するものである。
【００１４】
また、本発明はカカオ豆外皮を水と相溶性のない非極性溶媒により抽出し、中性脂質画分を得ることを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のカカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分は、表皮角化細胞増殖促進作用および真皮線維芽細胞増殖促進作用を有する。従って、これらを皮膚に適用することにより皮膚の老化を防ぎシワやくすみ、しみを低減させ、弾力の低下の防止及び改善することができ、さらには創傷治癒の促進効果や皮膚再生移植で使用する自家培養表皮細胞及び研究用の皮膚細胞の増殖促進剤としても期待される。
【００１６】
また、本発明でのカカオ外皮抽出物は、皮膚細胞増殖組成物、皮膚外用剤、飲食品に配合するのに好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の表皮角化細胞増殖促進作用および真皮線維芽細胞増殖促進作用を有する皮膚細胞増殖促進剤それを有効成分とする組成物、皮膚外用剤および飲食品、それらの製造方法、並びにそれらの効果について述べるが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００１８】
本発明で用いるカカオ豆外皮溶媒抽出物及び中性脂質画分を得るカカオ豆外皮は、チョコレート、ココアの原料となるアオギリ科の常緑高木であるカカオの種子から得られ、チョコレート製造時にカカオ豆より剥離されるものであり、剥離方法、カカオ豆の種類等に限定されるものではない。
【００１９】
脂質は中性脂質と複合脂質（糖脂質、リン脂質）に区別され、中性脂質は誘導脂質及び単純脂質よりなっている。誘導脂質には脂質の加水分解によって誘導される長鎖炭化水素、長鎖アルコール、脂肪酸、テルペノイド、ステロイド等が含まれる。一方、単純脂質は原則として脂肪酸とアルコールが結合したエステル型脂質のことをいい、ワックス、アシルグリセロール、エーテルグリセリド等が含まれる。分画の際、中性脂質は極性がきわめて低く、極性を有する複合脂質とは別の行動を示す。よって、カカオ豆外皮から溶媒抽出物を得るには、特に限定しないが、水と相溶性の無い非極性溶媒、例えば、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶剤もしくはこれらの混合液を抽出溶媒として用いることができる。抽出にあたり、カカオ豆外皮に対して一般的に２〜５０倍量（容量）の抽出溶媒を使用し、好ましくは３〜１０倍量の抽出溶媒を使用する。抽出方法としては、撹拌抽出、還流抽出、浸漬抽出、振とう抽出、超音波抽出などを採用することができ、抽出温度は特に限定しないが２０℃〜１００℃が望ましい。抽出時間は溶媒の種類や抽出温度によって異なるが、３０分〜２日間程度とするのが好ましい。なお、抽出操作は一回に限定されず、抽出効率を上げるため抽出残渣に新鮮な溶媒を再度添加し、抽出操作を繰り返してもよい。溶媒抽出物は、濾過または遠心分離等により、溶媒抽出物と植物とを分離するのが良い。更に得られた抽出物は、適当な濃縮処理により、例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより濃縮し濃縮液を得る事が出来る。さらに濃縮液を乾燥させて濃縮乾固物を得ることも出来る。
【００２０】
カカオ豆外皮の中性脂質画分は、カカオ豆外皮抽出物を液−液分配、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマト、高速液体クロマトグラフィーなどの方法により得る事ができる。特に限定しないが、液−液分配による中性脂質画分の調製例として、カカオ豆外皮抽出物をＧａｌａｎｏｓ＆Ｋａｐｏｕｌａｓの石油エーテルエタノール分配法を用いて中性脂質画分と複合脂質画分に分配出来る。
【００２１】
カラムクロマトグラフィーによる中性脂質画分の調製例としてカカオ豆外皮抽出物をヘキサン又はクロロホルム等に溶解後、シリカゲルクロマトグラフィーに注入した。ヘキサン又はクロロホルムを流下し、溶出液を回収することにより、精製された中性脂質画分を得た。又は定法に従い、ＤＥＡＥ−セルロースカラムグラフィーを用いても中性脂質画分を得る事ができる。
【００２２】
薄層クロマトによる中性脂質画分の調製例として、薄層プレート（Ｓｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０）上にクロロホルムに溶解させたカカオ豆外皮抽出物をスポットし、クロロホルム／メタノール／水＝８０：２５：４の溶液で展開させる。発色処理後、中性脂質を含むスポットをかき取り、クロロホルム溶液中へ入れ十分に撹拌後、ガラスフィルターにて濾過し、得られた濾液を濃縮することにより中性脂質画分を得る事ができる。
【００２３】
本発明の増殖促進剤はそのままでも使用出来るが、濃縮、または乾固させて使用してもよい。また、増殖促進剤は、必要に応じて上記抽出物に、保存やその取り扱いを容易にするため、ショ糖や乳糖などの各種糖類、たんぱく質やデンプンなどの賦形剤、その他の任意の助剤を用いてもよい。また、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの任意の剤形として製剤化して提供することも可能である。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤には、本発明の皮膚細胞増殖促進剤の成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油類、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、色材、酸化防止剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、水性成分、水、各種皮膚栄養剤、各種薬剤、キレート剤、ｐＨ調製剤等や、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤等の生理活性成分を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明の皮膚外用剤とは、通常医薬品、医薬部外品、化粧品等の分野で用いられるものを指し、その剤型は本発明の効果が発揮できる限り、特に限定されるものではない。例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いられているものであればいずれでもよい。
【００２５】
又、表皮及び真皮の増殖促進、老化防止、肌荒れ並びに創傷治癒促進などを目的として、皮膚以外の頭皮、口腔、耳、鼻、肛門、陰部などの様々な外傷にも用いることができる。
【００２６】
さらに、本発明の皮膚細胞増殖促進剤は、各種飲食素材として使用することができる。例えばチューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、アイスクリーム、飲料等に配合し、日常的に利用することが可能である。
【００２７】
本発明に係る抽出物の皮膚外用剤、飲食品中への配合量は、その目的、剤形により異なるが、０．０１〜８０重量％程度とするのが適当である。
【００２８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
−カカオ豆外皮抽出物の調製−
（製造例１）
カカオ豆外皮に含まれる中性脂質、糖脂質、リン脂質を回収する抽出法としてＦｏｌｃｈ法に準じて行った。カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部にクロロホルム／メタノール（２：１）溶液を５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液に対し２０％容量の水を添加撹拌後、分液ロートにて下層のクロロホルム層を回収し乾固させた。回収物はエタノール／水（８７：１３）と石油エーテルの等量混合液に溶解させ、分液ロートで分離させた上層と下層のそれぞれを回収し、乾固させた。上層の石油エーテル層からの回収物はクロロホルムに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。下層からの回収物もクロロホルムに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。上記の溶出液は溶媒ごとに回収し乾固させた。クロロホルム溶出液から中性脂質画分（５．９ｇ）、アセトン溶出液から糖脂質画分（０．７５ｇ）、メタノール溶出液からリン脂質画分（０．１４ｇ）を得た。
【００３０】
（製造例２）
カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部に酢酸エチルを５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様の方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液はロータリーエバポレーターで濃縮し少量のクロロホルムに溶解後、シリカゲルクロマトグラフィーに注入した。クロロホルムを流下することによって中性脂質画分（５．９８ｇ）を得た。
【００３１】
（製造例３）
カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部にヘキサンを５重量部加え、室温下で２４時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出し、中性脂質画分（６．０３ｇ）を得た。
【００３２】
−カカオニブ抽出物の調製−
（比較例１）
カカオニブに含まれる中性脂質、糖脂質、リン脂質を回収する抽出法として、Ｆｏｌｃｈ法に準じて抽出を行った。カカオ豆からカカオ豆外皮を除去したカカオニブ（１００ｇ）を乳棒と乳鉢にてすりつぶし、カカオニブの１重量部にクロロホルム／メタノール（２：１）溶液を５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液に対し２０％容量の水を添加撹拌後、分液ロートにて下層のクロロホルム層を回収し乾固させた。回収物はエタノール／水（８７：１３）と石油エーテルの等量混合液に溶解させ、分液ロートで分離させた上層と下層のそれぞれを回収し、乾固させた。上層の石油エーテル層からの回収物はクロロホルムに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。下層からの回収物もクロロホルムに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。上記の溶出液は溶媒ごとに回収し乾固させた。クロロホルム溶出液から中性脂質画分（５８．９ｇ）、アセトン溶出液から糖脂質画分（０．６ｇ）、メタノール溶出液からリン脂質画分（０．６ｇ）を得た。
【００３３】
（試験例１）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
試験試料として製造例１、比較例１で得られたカカオニブとカカオ豆外皮の中性脂質画分、糖脂質画分、リン脂質画分について、表皮細胞増殖の評価を行った。細胞増殖評価法は、正常ヒト表皮角化細胞を１ウェル当たり１．０×１０４ 個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、カカオニブとハスク脂質の各抽出画分を２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの各試験濃度含有する表皮角化細胞増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）にて３７℃で２４時間培養し、次いで２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−１）を１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンをマイクロプレートリーダーにてリファレンス波長を６５５ｎｍとし、４５０ｎｍの吸光度（Ａｓ）を測定した。同様にして試験試料を添加せずに正常ヒト表皮角化細胞を培養し、上記と同様の方法でマイクロプレートリーダーにて測定した値をＡｂとし、細胞増殖率をＡｓ／Ａｂ×１００（％）で計算し表１に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１の結果から、製造例１のカカオ外皮の中性脂質画分は１００μｇ／ｍｌ濃度で有意に表皮角化細胞の増殖を促進させていた。またカカオ外皮の糖脂質も細胞の増殖促進傾向が確認された。一方、比較例１のカカオニブ由来の脂質画分には活性が認められなかった。
【００３６】
（試験例２）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例２、３で得られたカカオ豆外皮の酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物について、表皮細胞増殖作用の評価を行った。評価法は、試験例１と同様の方法にて行い、表２に結果を示した。その結果、製造例２、３の酢酸エチル抽出物及びヘキサン抽出物は１００μｇ／ｍｌ濃度で表皮角化細胞の増殖を促進させていた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
（試験例３）
真皮線維芽細胞増殖促進作用試験
試験試料として製造例１、比較例１で得られたカカオニブとカカオ豆外皮のそれぞれについての中性脂質画分、糖脂質画分、リン脂質画分について、真皮細胞増殖作用の評価を行った。細胞増殖評価法は、正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり０．３２×１０４ 個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、カカオニブとハスク脂質の各抽出画分を２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの各試験濃度含有する真皮繊維芽細胞増殖用培地（Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ）にて３７℃で２４時間培養し、次いで２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−１）を１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンをマイクロプレートリーダーにてリファレンス波長を６５５ｎｍとし、４５０ｎｍの吸光度（Ａｓ）を測定した。同様にして試験試料を添加せずに正常ヒト真皮線維芽細胞を培養し、上記と同様の方法でマイクロプレートリーダーにて測定した値をＡｂとし、細胞増殖率をＡｓ／Ａｂ×１００（％）で計算し表３に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３の結果から、製造例１のカカオ外皮の中性脂質画分は６０μｇ／ｍｌ濃度で有意に真皮線維芽細胞の増殖を促進させていることが確認できた。一方、比較例１のカカオニブ由来の脂質画分には活性が認められなかった。
【００４１】
（試験例４）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例２、３で得られたカカオ豆外皮のヘキサン抽出画分（中性脂質画分）について、真皮細胞増殖作用の評価を行った。評価法は、試験例１と同様の方法にて行い、表４に結果を示した。その結果、製造例２、３の酢酸エチル抽出物及びヘキサン抽出物は１００μｇ／ｍｌ濃度で真皮線維芽細胞の増殖を促進させていた。
【００４２】
【表４】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、各実施例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。また、各実施例における製品の配合の際に使用するカカオ豆外皮中性脂質画分は、上記製造例１、２および３で製造された中性脂質画分のいずれを利用しても良い。
【００４４】
（実施例１） 錠剤の処方
Ｄ−マンニトール ４２．６重量％
乳糖 ４２．６
結晶セルロース ８．５
ヒドロキシプロピルセルロース ４．３
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ２．０
１００．０
【００４５】
（実施例２） 軟膏剤の処方
ミツロウ ３．０重量％
水素添加ラノリン ８．０
スクワラン ３４．０
固形パラフィン ２．０
マイクロクリスタリンワックス ９．０
白色ワセリン ５．０
アジピン酸ヘキシルデシル １３．０
セスキオレイン酸ソルビタン ３．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
グリセリン １０．０
エタノール １．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） １．０
水 残
１００．０
【００４６】
（実施例３） クリームの処方
スクワラン ２７．０重量％
ミツロウ ６．０
セタノール ５．０
還元ラノリン ８．０
グリセリン脂肪酸エステル ４．０
親油型グリセリルモノスレアリン酸エステル ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル ５．０
プロピレングリコール ５．０
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
水 残
１００．０
【００４７】
（実施例４） 乳液の処方
スクワラン １０．０重量％
メチルフェニルポリシロキサン ４．０
水素添加パーム核油 ０．５
水素添加大豆リン脂質 ０．１
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン １．３
モノステアリン酸ソルビタン １．０
グリセリン ４．０
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ５．０
香料 適量
水 残
１００．０
【００４８】
（実施例５） ローションの処方
ジプロピレングリコール ５．０重量％
１，３−ブチレングリコール １０．０
ポリエチレングリコール４００ １０．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ３．０
エタノール ２０．０
パラメトキシケイ皮酸オクチル １．０
アルブチン ４．０
亜硫酸水素ナトリウム ０．０３
アスコルビン酸グルコシド ５．０
トリエタノールアミン ５．０
香料 ０．１
カカオ外豆皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
水 残
１００．０
【００４９】
（実施例６） 美容液の処方
グリセリン １０．０重量％
ショ糖脂肪酸エステル １．３
カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） １７．５
アルギン酸ナトリウム（１重量％水溶液） １５．０
モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
硬化パーム油 ２．０
スクワラン １．０
ベヘニルアルコール ０．７５
ミツロウ １．０
ホホバ油 １．０
１，３−ブチレングリコール １０．０
Ｌ−アルギニン（１０重量％水溶液） ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
水 残
１００．０
【００５０】
（実施例７） 洗顔料の処方
ステアリン酸 １６．０重量％
ミリスチン酸 １６．０
親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
グリセリン ２０．０
水酸化ナトリウム ７．５
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
水 残
１００．０
【００５１】
（実施例８） パックの処方
ポリビニルアルコール １２．０重量％
エタノール １０．０
グリセリン ５．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
香料 ０．１
水 残
１００．０
【００５２】
（実施例９） 入浴剤の処方
炭酸水素ナトリウム ４９．０重量％
硫酸ナトリウム ４９．７
香料 ０．３
カカオ外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
１００．０
【００５３】
（実施例１０） チューインガムの処方
ガムベース ２０．０重量％
砂糖 ５５．０
グルコース １５．０
水飴 ９．０
香料 ０．５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
１００．０
【００５４】
（実施例１１） キャンディの処方
砂糖 ５０．０重量％
水飴 ３４．０
香料 ０．５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
水 残
１００．０
【００５５】
（実施例１２） 錠菓の処方
砂糖 ７６．４重量％
グルコース １９．０
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
香料 ０．２
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
水 残
１００．０
【００５６】
（実施例１３） チョコレートの処方
粉糖 ３９．８重量％
カカオビター ２０．０
全脂粉乳 ２０．０
カカオバター １７．０
マンニトール ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） １．０
香料 ０．２
１００．０
【００５７】
（実施例１４） ビスケットの処方
薄力粉１級 ２５．５９重量％
中力粉１級 ２２．２２
精白糖 ４．８
食塩 ０．７３
ブドウ糖 ０．７８
パームショートニング １１．７８
炭酸水素ナトリウム ０．１７
重亜硫酸ナトリウム ０．１６
米粉 １．４５
全脂粉乳 １．１６
代用粉乳 ０．２９
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
水 残
１００．０
【００５８】
（実施例１５） アイスクリームの処方
脱脂粉乳 ５０．０重量％
生クリーム ２５．０
砂糖 １０．０
卵黄 １０．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
香料 ０．１
水 残
１００．０
【００５９】
（実施例１６） 飲料の処方
オレンジ果汁 ３０．０重量％
異性化糖 １５．２４
クエン酸 ０．１
ビタミンＣ ０．０４
香料 ０．１
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
水 残
１００．０
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カカオ豆外皮抽出物およびカカオ豆外皮の中性脂質画分を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の構造は最上層から表皮、真皮、皮下組織の三層に分かれている。表皮は皮膚の最も外側にあり外気や紫外線などの様々な刺激にさらされている。表皮はその大部分を表皮角化細胞（ケラチノサイト）で構成されており、表皮角化細胞の分化段階によって、外側から角質層、顆粒層、有棘層、基底層の４つの細胞層に分かれている。細胞が基底層から角質層まで成熟し、はがれ落ちるまでのサイクルをターンオーバーといい、このサイクルがスムーズに行われることにより、皮膚は一定の厚さと若さを保っている。
【０００３】
真皮は皮膚の張りや弾力性に関わるエラスチンやコラーゲン、保水性の維持に重要なヒアルロン酸等の細胞外マトリックスと真皮細胞により構成されており、真皮細胞の中で線維芽細胞が細胞外マトリックス成分を合成している。
【０００４】
加齢、紫外線暴露、空気乾燥等により、皮膚の表皮細胞および真皮細胞はダメージを受ける。表皮においては表皮角化細胞の減少と代謝の低下によりターンオーバー速度が遅くなることによって、肌は保湿性やなめらかさを失い、硬くなったりくすみや小ジワが現れたりする。更には、メラニンが過剰に生成された部位では表皮細胞の分裂、増殖が低下しメラニン排出が滞り、よりシミのできやすい状態となる。真皮においては細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチンやコラーゲンの分解及び変質、線維芽細胞の増殖低下に伴う細胞外マトリックスの産生能力の低下により、肌は張りや弾力を失い、肌荒れ、シワ等を生じる。
【０００５】
従って、表皮角化細胞の増殖促進により、皮膚のターンオーバーが早くなり、小ジワやくすみ、しみを軽減させる。また、真皮線維芽細胞の増殖促進により、コラーゲンやヒアルロン酸の産生を向上させ、シワの形成や肌の弾性低下を防止及び改善することができると考えられる。さらには外傷や火傷、手術等による創傷治癒の促進効果も期待される。また、重度のやけど等を負った患者等に対する治療法として、患者自身の皮膚断片を培養し、これを移植する方法がある。培養可能な皮膚組織の採取から完成まで時間を必要とすることが問題とされているが、細胞増殖促進剤の使用により皮膚細胞の培養期間短縮が期待される。
【０００６】
これまで、皮膚の抗老化予防素材としてコラーゲン産生促進作用、表皮角化細胞増殖 作用を有する物質を天然物から取得しようという試みがなされている。
【０００７】
例えば、表皮細胞増殖促進組成物としてカカオマスおよびココアパウダー（特許文献１参照）が開示されているが、カカオ豆外皮に関する効果は示されていない。ケラチノサイトの分化及び角化に関与する遺伝子を活性化させる素材としてカカオ豆および外皮の水、水―アルコール抽出物（特許文献２、３参照）が開示されているが、カカオ豆外皮の低極性溶媒抽出物である脂質画分に関する効果は示されていない。皮膚の加齢症状防止組成物、化粧品としてポリフェノールを含有するココア抽出物、より詳細にはポリフェノール、アミノ酸、及びケン化され得ない物質の濃縮物を組み合わせて含有するココア抽出物（特許文献４参照）に関して開示されているが、カカオ豆外皮の低極性溶媒抽出物である脂質画分に関する細胞増殖促進効果は示されていない。また、上記のカカオ外皮由来の非ケン化性脂質画分が毒性物質ジメチルホルムアミドの添加された培養液中で線維芽細胞の増殖を部分的に保護したとの報告はあるが、通常の培養条件で増殖を促進させたとの報告はされていない（非特許文献１参照）。
【０００８】
カカオマスおよびココアパウダーを有効成分とする創傷治癒促進剤（特許文献５、６参照）が開示されているがカカオ豆外皮の中性脂質画分に関する効果は開示されていない。
【０００９】
また表皮線維芽細胞の増殖促進剤、創傷治癒促進剤として、例えば、サフランの雌しべ抽出物（特許文献７参照）、アーモンド、セイヨウタンポポ、セイヨウニワトコ、センキュウ、センブリ、ソウハクヒ、トウニン、ニンジン、ホップ、ムクゲ、ヨクイニン抽出物（特許文献８参照）などが確認されている。しかしながら、これらの効果は必ずしも満足のいくものではなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−６９９２３号公報
【特許文献２】特開２００６−２０６５９９号公報
【特許文献３】特開２００５−４７９１４号公報
【特許文献４】特開２００４−５０３４８１号公報
【特許文献５】特開２００１−２３３７７９号公報
【特許文献６】特開２００６−２８２５７３号公報
【特許文献７】特開２００５−４１８１２号公報
【特許文献８】特開平１０−３６２７９号公報
【非特許文献１】Ｒ．Ｗａｒｏｃｑｕｉｅｒ−ｃｌｅｒｏｕｔ，ｅｔ．ａｌ著，“インターナショナル ジャーナル オブ コスメティック サイエンス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｃｅ）”，“Ｎｏｎ−ｓａｐｏｎｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｃｏａ ｓｈｅｌｌ ｂｕｔｔｅｒ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”，１９９２年，Ｖｏｌ１４，Ｐ．３９〜４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、カカオ豆外皮抽出物を有効成分とするより有効な皮膚の細胞増殖促進剤およびその製造方法を見出し、かかる細胞増殖促進剤により皮膚の表皮角化細胞および真皮線維芽細胞の増殖を促進させることにより皮膚の老化および肌荒れ症状の防止、改善さらには創傷治癒効果を有する皮膚外用剤、並びに組成物、飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため探索を行い、アオギリ科植物のテオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）の外皮抽出物およびその中性脂質画分がそれぞれ高いヒト表皮角化細胞増殖促進作用およびヒト真皮線維芽細胞増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明はカカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分を有効成分とする表皮角化細胞及び、真皮線維芽細胞の増殖を促進させる皮膚細胞増殖促進剤に関するものである。
【００１４】
また、本発明はカカオ豆外皮を水と相溶性のない非極性溶媒により抽出し、中性脂質画分を得ることを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のカカオ豆外皮抽出物およびその中性脂質画分は、表皮角化細胞増殖促進作用および真皮線維芽細胞増殖促進作用を有する。従って、これらを皮膚に適用することにより皮膚の老化を防ぎシワやくすみ、しみを低減させ、弾力の低下の防止及び改善することができ、さらには創傷治癒の促進効果や皮膚再生移植で使用する自家培養表皮細胞及び研究用の皮膚細胞の増殖促進剤としても期待される。
【００１６】
また、本発明でのカカオ外皮抽出物は、皮膚細胞増殖組成物、皮膚外用剤、飲食品に配合するのに好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の表皮角化細胞増殖促進作用および真皮線維芽細胞増殖促進作用を有する皮膚細胞増殖促進剤それを有効成分とする組成物、皮膚外用剤および飲食品、それらの製造方法、並びにそれらの効果について述べるが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００１８】
本発明で用いるカカオ豆外皮溶媒抽出物及び中性脂質画分を得るカカオ豆外皮は、チョコレート、ココアの原料となるアオギリ科の常緑高木であるカカオの種子から得られ、チョコレート製造時にカカオ豆より剥離されるものであり、剥離方法、カカオ豆の種類等に限定されるものではない。
【００１９】
脂質は中性脂質と複合脂質（糖脂質、リン脂質）に区別され、中性脂質は誘導脂質及び単純脂質よりなっている。誘導脂質には脂質の加水分解によって誘導される長鎖炭化水素、長鎖アルコール、脂肪酸、テルペノイド、ステロイド等が含まれる。一方、単純脂質は原則として脂肪酸とアルコールが結合したエステル型脂質のことをいい、ワックス、アシルグリセロール、エーテルグリセリド等が含まれる。分画の際、中性脂質は極性がきわめて低く、極性を有する複合脂質とは別の行動を示す。よって、カカオ豆外皮から溶媒抽出物を得るには、特に限定しないが、水と相溶性の無い非極性溶媒、例えば、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶剤もしくはこれらの混合液を抽出溶媒として用いることができる。抽出にあたり、カカオ豆外皮に対して一般的に２〜５０倍量（容量）の抽出溶媒を使用し、好ましくは３〜１０倍量の抽出溶媒を使用する。抽出方法としては、撹拌抽出、還流抽出、浸漬抽出、振とう抽出、超音波抽出などを採用することができ、抽出温度は特に限定しないが２０℃〜１００℃が望ましい。抽出時間は溶媒の種類や抽出温度によって異なるが、３０分〜２日間程度とするのが好ましい。なお、抽出操作は一回に限定されず、抽出効率を上げるため抽出残渣に新鮮な溶媒を再度添加し、抽出操作を繰り返してもよい。溶媒抽出物は、濾過または遠心分離等により、溶媒抽出物と植物とを分離するのが良い。更に得られた抽出物は、適当な濃縮処理により、例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより濃縮し濃縮液を得る事が出来る。さらに濃縮液を乾燥させて濃縮乾固物を得ることも出来る。
【００２０】
カカオ豆外皮の中性脂質画分は、カカオ豆外皮抽出物を液−液分配、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマト、高速液体クロマトグラフィーなどの方法により得る事ができる。特に限定しないが、液−液分配による中性脂質画分の調製例として、カカオ豆外皮抽出物をＧａｌａｎｏｓ＆Ｋａｐｏｕｌａｓの石油エーテルエタノール分配法を用いて中性脂質画分と複合脂質画分に分配出来る。
【００２１】
カラムクロマトグラフィーによる中性脂質画分の調製例としてカカオ豆外皮抽出物をヘキサン又はクロロホルム等に溶解後、シリカゲルクロマトグラフィーに注入した。ヘキサン又はクロロホルムを流下し、溶出液を回収することにより、精製された中性脂質画分を得た。又は定法に従い、ＤＥＡＥ−セルロースカラムグラフィーを用いても中性脂質画分を得る事ができる。
【００２２】
薄層クロマトによる中性脂質画分の調製例として、薄層プレート（Ｓｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０）上にクロロホルムに溶解させたカカオ豆外皮抽出物をスポットし、クロロホルム／メタノール／水＝８０：２５：４の溶液で展開させる。発色処理後、中性脂質を含むスポットをかき取り、クロロホルム溶液中へ入れ十分に撹拌後、ガラスフィルターにて濾過し、得られた濾液を濃縮することにより中性脂質画分を得る事ができる。
【００２３】
本発明の増殖促進剤はそのままでも使用出来るが、濃縮、または乾固させて使用してもよい。また、増殖促進剤は、必要に応じて上記抽出物に、保存やその取り扱いを容易にするため、ショ糖や乳糖などの各種糖類、たんぱく質やデンプンなどの賦形剤、その他の任意の助剤を用いてもよい。また、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの任意の剤形として製剤化して提供することも可能である。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤には、本発明の皮膚細胞増殖促進剤の成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油類、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、色材、酸化防止剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、水性成分、水、各種皮膚栄養剤、各種薬剤、キレート剤、ｐＨ調製剤等や、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤等の生理活性成分を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明の皮膚外用剤とは、通常医薬品、医薬部外品、化粧品等の分野で用いられるものを指し、その剤型は本発明の効果が発揮できる限り、特に限定されるものではない。例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いられているものであればいずれでもよい。
【００２５】
又、表皮及び真皮の増殖促進、老化防止、肌荒れ並びに創傷治癒促進などを目的として、皮膚以外の頭皮、口腔、耳、鼻、肛門、陰部などの様々な外傷にも用いることができる。
【００２６】
さらに、本発明の皮膚細胞増殖促進剤は、各種飲食素材として使用することができる。例えばチューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、アイスクリーム、飲料等に配合し、日常的に利用することが可能である。
【００２７】
本発明に係る抽出物の皮膚外用剤、飲食品中への配合量は、その目的、剤形により異なるが、０．０１〜８０重量％程度とするのが適当である。
【００２８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
−カカオ豆外皮抽出物の調製−
（製造例１）
カカオ豆外皮に含まれる中性脂質、糖脂質、リン脂質を回収する抽出法としてＦｏｌｃｈ法に準じて行った。カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部にクロロホルム／メタノール（２：１）溶液を５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液に対し２０％容量の水を添加撹拌後、分液ロートにて下層のクロロホルム層を回収し乾固させた。回収物はエタノール／水（８７：１３）と石油エーテルの等量混合液に溶解させ、分液ロートで分離させた上層と下層のそれぞれを回収し、乾固させた。上層の石油エーテル層からの回収物はクロロホルムに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。下層からの回収物もクロロホルムに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。上記の溶出液は溶媒ごとに回収し乾固させた。クロロホルム溶出液から中性脂質画分（５．９ｇ）、アセトン溶出液から糖脂質画分（０．７５ｇ）、メタノール溶出液からリン脂質画分（０．１４ｇ）を得た。
【００３０】
（製造例２）
カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部に酢酸エチルを５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様の方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液はロータリーエバポレーターで濃縮し少量のクロロホルムに溶解後、シリカゲルクロマトグラフィーに注入した。クロロホルムを流下することによって中性脂質画分（５．９８ｇ）を得た。
【００３１】
（製造例３）
カカオ豆外皮（１００ｇ）はミルで粉砕後、カカオ豆外皮の１重量部にヘキサンを５重量部加え、室温下で２４時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出し、中性脂質画分（６．０３ｇ）を得た。
【００３２】
−カカオニブ抽出物の調製−
（比較例１）
カカオニブに含まれる中性脂質、糖脂質、リン脂質を回収する抽出法として、Ｆｏｌｃｈ法に準じて抽出を行った。カカオ豆からカカオ豆外皮を除去したカカオニブ（１００ｇ）を乳棒と乳鉢にてすりつぶし、カカオニブの１重量部にクロロホルム／メタノール（２：１）溶液を５重量部加え、室温下で３時間振とう後、濾過により抽出液を回収した。更に残渣を同様な方法で３回繰り返し抽出した。得られた濾液に対し２０％容量の水を添加撹拌後、分液ロートにて下層のクロロホルム層を回収し乾固させた。回収物はエタノール／水（８７：１３）と石油エーテルの等量混合液に溶解させ、分液ロートで分離させた上層と下層のそれぞれを回収し、乾固させた。上層の石油エーテル層からの回収物はクロロホルムに溶かし、シリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。下層からの回収物もクロロホルムに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーに注入し、クロロホルム、アセトン、メタノールを連続的に流下させ、各溶出液を回収した。上記の溶出液は溶媒ごとに回収し乾固させた。クロロホルム溶出液から中性脂質画分（５８．９ｇ）、アセトン溶出液から糖脂質画分（０．６ｇ）、メタノール溶出液からリン脂質画分（０．６ｇ）を得た。
【００３３】
（試験例１）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
試験試料として製造例１、比較例１で得られたカカオニブとカカオ豆外皮の中性脂質画分、糖脂質画分、リン脂質画分について、表皮細胞増殖の評価を行った。細胞増殖評価法は、正常ヒト表皮角化細胞を１ウェル当たり１．０×１０４ 個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、カカオニブとハスク脂質の各抽出画分を２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの各試験濃度含有する表皮角化細胞増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）にて３７℃で２４時間培養し、次いで２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−１）を１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンをマイクロプレートリーダーにてリファレンス波長を６５５ｎｍとし、４５０ｎｍの吸光度（Ａｓ）を測定した。同様にして試験試料を添加せずに正常ヒト表皮角化細胞を培養し、上記と同様の方法でマイクロプレートリーダーにて測定した値をＡｂとし、細胞増殖率をＡｓ／Ａｂ×１００（％）で計算し表１に示した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１の結果から、製造例１のカカオ外皮の中性脂質画分は１００μｇ／ｍｌ濃度で有意に表皮角化細胞の増殖を促進させていた。またカカオ外皮の糖脂質も細胞の増殖促進傾向が確認された。一方、比較例１のカカオニブ由来の脂質画分には活性が認められなかった。
【００３６】
（試験例２）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例２、３で得られたカカオ豆外皮の酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物について、表皮細胞増殖作用の評価を行った。評価法は、試験例１と同様の方法にて行い、表２に結果を示した。その結果、製造例２、３の酢酸エチル抽出物及びヘキサン抽出物は１００μｇ／ｍｌ濃度で表皮角化細胞の増殖を促進させていた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
（試験例３）
真皮線維芽細胞増殖促進作用試験
試験試料として製造例１、比較例１で得られたカカオニブとカカオ豆外皮のそれぞれについての中性脂質画分、糖脂質画分、リン脂質画分について、真皮細胞増殖作用の評価を行った。細胞増殖評価法は、正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり０．３２×１０４ 個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、カカオニブとハスク脂質の各抽出画分を２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの各試験濃度含有する真皮繊維芽細胞増殖用培地（Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ）にて３７℃で２４時間培養し、次いで２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−１）を１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを１ウェル当たり１０μｌ添加し、３７℃で３時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンをマイクロプレートリーダーにてリファレンス波長を６５５ｎｍとし、４５０ｎｍの吸光度（Ａｓ）を測定した。同様にして試験試料を添加せずに正常ヒト真皮線維芽細胞を培養し、上記と同様の方法でマイクロプレートリーダーにて測定した値をＡｂとし、細胞増殖率をＡｓ／Ａｂ×１００（％）で計算し表３に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３の結果から、製造例１のカカオ外皮の中性脂質画分は６０μｇ／ｍｌ濃度で有意に真皮線維芽細胞の増殖を促進させていることが確認できた。一方、比較例１のカカオニブ由来の脂質画分には活性が認められなかった。
【００４１】
（試験例４）
表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例２、３で得られたカカオ豆外皮のヘキサン抽出画分（中性脂質画分）について、真皮細胞増殖作用の評価を行った。評価法は、試験例１と同様の方法にて行い、表４に結果を示した。その結果、製造例２、３の酢酸エチル抽出物及びヘキサン抽出物は１００μｇ／ｍｌ濃度で真皮線維芽細胞の増殖を促進させていた。
【００４２】
【表４】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、各実施例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。また、各実施例における製品の配合の際に使用するカカオ豆外皮中性脂質画分は、上記製造例１、２および３で製造された中性脂質画分のいずれを利用しても良い。
【００４４】
（実施例１） 錠剤の処方
Ｄ−マンニトール ４２．６重量％
乳糖 ４２．６
結晶セルロース ８．５
ヒドロキシプロピルセルロース ４．３
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ２．０
１００．０
【００４５】
（実施例２） 軟膏剤の処方
ミツロウ ３．０重量％
水素添加ラノリン ８．０
スクワラン ３４．０
固形パラフィン ２．０
マイクロクリスタリンワックス ９．０
白色ワセリン ５．０
アジピン酸ヘキシルデシル １３．０
セスキオレイン酸ソルビタン ３．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
グリセリン １０．０
エタノール １．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） １．０
水 残
１００．０
【００４６】
（実施例３） クリームの処方
スクワラン ２７．０重量％
ミツロウ ６．０
セタノール ５．０
還元ラノリン ８．０
グリセリン脂肪酸エステル ４．０
親油型グリセリルモノスレアリン酸エステル ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル ５．０
プロピレングリコール ５．０
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
水 残
１００．０
【００４７】
（実施例４） 乳液の処方
スクワラン １０．０重量％
メチルフェニルポリシロキサン ４．０
水素添加パーム核油 ０．５
水素添加大豆リン脂質 ０．１
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン １．３
モノステアリン酸ソルビタン １．０
グリセリン ４．０
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ５．０
香料 適量
水 残
１００．０
【００４８】
（実施例５） ローションの処方
ジプロピレングリコール ５．０重量％
１，３−ブチレングリコール １０．０
ポリエチレングリコール４００ １０．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ３．０
エタノール ２０．０
パラメトキシケイ皮酸オクチル １．０
アルブチン ４．０
亜硫酸水素ナトリウム ０．０３
アスコルビン酸グルコシド ５．０
トリエタノールアミン ５．０
香料 ０．１
カカオ外豆皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
水 残
１００．０
【００４９】
（実施例６） 美容液の処方
グリセリン １０．０重量％
ショ糖脂肪酸エステル １．３
カルボキシビニルポリマー（１重量％水溶液） １７．５
アルギン酸ナトリウム（１重量％水溶液） １５．０
モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
硬化パーム油 ２．０
スクワラン １．０
ベヘニルアルコール ０．７５
ミツロウ １．０
ホホバ油 １．０
１，３−ブチレングリコール １０．０
Ｌ−アルギニン（１０重量％水溶液） ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
水 残
１００．０
【００５０】
（実施例７） 洗顔料の処方
ステアリン酸 １６．０重量％
ミリスチン酸 １６．０
親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
グリセリン ２０．０
水酸化ナトリウム ７．５
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
水 残
１００．０
【００５１】
（実施例８） パックの処方
ポリビニルアルコール １２．０重量％
エタノール １０．０
グリセリン ５．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例１） ５．０
香料 ０．１
水 残
１００．０
【００５２】
（実施例９） 入浴剤の処方
炭酸水素ナトリウム ４９．０重量％
硫酸ナトリウム ４９．７
香料 ０．３
カカオ外皮中性脂質画分（製造例２） １．０
１００．０
【００５３】
（実施例１０） チューインガムの処方
ガムベース ２０．０重量％
砂糖 ５５．０
グルコース １５．０
水飴 ９．０
香料 ０．５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
１００．０
【００５４】
（実施例１１） キャンディの処方
砂糖 ５０．０重量％
水飴 ３４．０
香料 ０．５
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
水 残
１００．０
【００５５】
（実施例１２） 錠菓の処方
砂糖 ７６．４重量％
グルコース １９．０
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
香料 ０．２
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
水 残
１００．０
【００５６】
（実施例１３） チョコレートの処方
粉糖 ３９．８重量％
カカオビター ２０．０
全脂粉乳 ２０．０
カカオバター １７．０
マンニトール ２．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） １．０
香料 ０．２
１００．０
【００５７】
（実施例１４） ビスケットの処方
薄力粉１級 ２５．５９重量％
中力粉１級 ２２．２２
精白糖 ４．８
食塩 ０．７３
ブドウ糖 ０．７８
パームショートニング １１．７８
炭酸水素ナトリウム ０．１７
重亜硫酸ナトリウム ０．１６
米粉 １．４５
全脂粉乳 １．１６
代用粉乳 ０．２９
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．５
水 残
１００．０
【００５８】
（実施例１５） アイスクリームの処方
脱脂粉乳 ５０．０重量％
生クリーム ２５．０
砂糖 １０．０
卵黄 １０．０
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
香料 ０．１
水 残
１００．０
【００５９】
（実施例１６） 飲料の処方
オレンジ果汁 ３０．０重量％
異性化糖 １５．２４
クエン酸 ０．１
ビタミンＣ ０．０４
香料 ０．１
カカオ豆外皮中性脂質画分（製造例３） ０．１
水 残
１００．０
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆外皮抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項２】
カカオ豆外皮の水と相溶性のない非極性溶媒による抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項３】
皮膚細胞が表皮角化細胞である請求項１記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項４】
皮膚細胞が真皮線維芽細胞である請求項１記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項５】
抽出物がカカオ豆外皮の中性脂質画分であることを特徴とする１乃至４記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項６】
請求項１乃至５記載の皮膚細胞増殖促進剤を配合することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項７】
カカオ豆外皮を水と相溶性のない非極性溶媒により抽出し、濾過または遠心分離し、液−液分配、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーにより中性脂質画分を得ることを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項８】
カカオ豆外皮を酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、エーテルからなる群から選択される有機溶剤もしくはこれらの混合液により溶解し、濾過後、更にクロロホルムまたはヘキサンに溶解し、カラムクロマトグラフィーにて溶出することにより中性脂質画分を得ることを特徴とする請求項７記載の皮膚細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項１】
カカオ豆外皮抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項２】
カカオ豆外皮の水と相溶性のない非極性溶媒による抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項３】
皮膚細胞が表皮角化細胞である請求項１記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項４】
皮膚細胞が真皮線維芽細胞である請求項１記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項５】
抽出物がカカオ豆外皮の中性脂質画分であることを特徴とする１乃至４記載の皮膚細胞増殖促進剤。
【請求項６】
請求項１乃至５記載の皮膚細胞増殖促進剤を配合することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項７】
カカオ豆外皮を水と相溶性のない非極性溶媒により抽出し、濾過または遠心分離し、液−液分配、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーにより中性脂質画分を得ることを特徴とする皮膚細胞増殖促進剤の製造方法。
【請求項８】
カカオ豆外皮を酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、エーテルからなる群から選択される有機溶剤もしくはこれらの混合液により溶解し、濾過後、更にクロロホルムまたはヘキサンに溶解し、カラムクロマトグラフィーにて溶出することにより中性脂質画分を得ることを特徴とする請求項７記載の皮膚細胞増殖促進剤の製造方法。
【公開番号】特開２００８−２０８０５３（Ｐ２００８−２０８０５３Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４４７６６（Ｐ２００７−４４７６６）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（３０７０１３８５７）株式会社ロッテ (101)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（３０７０１３８５７）株式会社ロッテ (101)
【Ｆターム（参考）】
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