美容用組成物
【課題】皮膚の老化の防止および／または改善に有用な組成物を提供すること。
【解決手段】ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含む組成物により、上記の課題を解決する。
【解決手段】ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含む組成物により、上記の課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨ（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物を含む美容用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮および皮下組織の三層からなり、これらのうち真皮には、皮膚の弾力や保水性など、皮膚の機能維持に重要なコラーゲンおよびヒアルロン酸が多く含まれている。これらコラーゲンおよびヒアルロン酸は、真皮中に存在する線維芽細胞により産生される。
【０００３】
一方で、加齢や紫外線などのストレスにより線維芽細胞の機能が衰え、真皮におけるコラーゲンの変性および産生減少、ならびにヒアルロン酸の産生減少が起こる。特に、紫外線に曝露された皮膚においては、スーパーオキサイドやフリーラジカルなどが発生し、これらが皮膚の脂質やタンパク質に対する酸化反応を促進することにより、皮膚の急性炎症や真皮の障害などが引き起こされる。
その結果として、皮膚のしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などのような皮膚の老化現象があらわれる。
【０００４】
このような皮膚の老化の防止および／または改善を目的として、糖、アミノ酸、有機酸、ピロリドンカルボン酸などを配合した組成物や失われたコラーゲンおよびヒアルロン酸を補うためにこれらを配合した組成物などが、これまでに開発されてきた。
しかしながら、これらは皮膚の保湿性を高めて、表皮の角質の状態を改善するだけであり、皮膚の老化を根本的に防止または改善するものではないため、いずれも満足できる効果を有していなかった。
【０００５】
また、様々な植物体の抽出物などを配合した皮膚外用剤なども、これまでに開発されてきた（特許文献１および２参照）。しかしながら、これらはコラーゲンおよびヒアルロン酸の産生を促進し得るが、スーパーオキサイド、フリーラジカルなどに対しては有効ではなく、皮膚の老化の防止および／または改善には満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１７６２３０号公報
【特許文献２】特開２００３−３２１３７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような事情に鑑みて、本発明は、皮膚の老化の根本的な防止および／または改善に有用なコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物のいずれかを含む美容用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナ（Terminalia arjuna）の各抽出物が、コラーゲン産生促進活性、ヒアルロニダーゼ阻害活性、スーパーオキサイド消去活性およびＤＰＰＨラジカル消去活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含むコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物を含む美容用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物を使用または摂取することにより、線維芽細胞におけるコラーゲンの産生が促進され、ヒアルロニダーゼの活性が阻害されることによりヒアルロン酸が維持され、皮膚障害の原因であるスーパーオキサイドおよび／またはフリーラジカルが消去される効果が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「皮膚の老化」とは、加齢や紫外線などの影響により引き起こされる皮膚のしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などを意図する。
【００１２】
ヒアルロニダーゼとは、皮膚、血管、関節などに存在するヒアルロン酸を分解する酵素である。該酵素の活性を阻害することにより、生体内でのヒアルロン酸の分解が抑制され、生体内のヒアルロン酸の量を一定に保ち得る。
【００１３】
スーパーオキサイド（Ｏ2-）とは、活性酸素の一つであり、特に皮膚においては紫外線の曝露により発生することが知られている。一方、生体内にはスーパーオキサイドを消去する活性を有する酵素ＳＯＤ（Super Oxide Dismutase）が存在する。
スーパーオキサイド消去活性とは、ＳＯＤ様活性とも呼ばれ、スーパーオキサイドを分解して消去する活性を意味する。
【００１４】
ＤＰＰＨは、安定なフリーラジカルとして知られ、ある物質が有するフリーラジカル消去活性を評価する際の標的物質として用いられる。したがって、ＤＰＰＨラジカル消去活性とは、ＤＰＰＨを用いて評価した、ある物質が有するフリーラジカルを消去する活性を意味する。
【００１５】
ボダイジュは、シナノキ科（Tiliaceae）の植物であり、その花を乾燥させた菩提樹花茶（リンデンフラワーティー）は、ヨーロッパを中心に１８世紀から飲用され、鎮静、鎮痙、発汗などの作用を有することが知られている。
本発明に用いられるボダイジュ花としては、ナツボダイジュ（Tilia platyphyllos Scop.）、フユボダイジュ（Tilia cordata Mill.）、セイヨウシナノキ（Tilia europaea L.）などのシナノキ科、シナノキ属（Tilia）の植物の花が挙げられるが、好ましくはこれらの花の花弁である。
【００１６】
シャクヤクは、中国北西部、華北、西北地方から東シベリア、朝鮮半島にかけて自生するボタン科（Paeoniaceae）の植物であり、その根を乾燥させたものは、鎮痛、鎮痙、解熱、利尿などの作用を有する生薬として知られている。
本発明に用いられるシャクヤク花としては、シャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas）、シベリアシャクヤク（Paeonia lactiflora）、ベニバナヤマシャクヤク（Paeonia obovata）、ヤマシャクヤク（Paeonia japonica）などのボタン科、ボタン属（Paeonia）の植物の花が挙げられるが、好ましくはこれらの花の花弁である。
【００１７】
テルミナリア アルジュナとは、シクンシ科（Cambretaceae）モモタマナ属（Terminalia）の植物で、インド全域に植生し、約１８〜２８ｍの高さまで成長する落葉樹である。
テルミナリア アルジュナの樹皮は、インドでは強心剤として用いられており、また、冠動脈疾患、心不全および高コレステロール血症の治療、ならびに狭心症の疼痛緩和のために処方されてきた（特表２００８−５３７５３９号公報参照）。
本発明に用いられるテルミナリア アルジュナとしては、テルミナリア アルジュナの花、花穂、果実、果皮、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根、根茎、根皮、種子などが挙げられるが、中でも根皮を用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明において原料として用いられるボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナは、市場で入手することができる。
また、上記の各原料は、そのままの形態で用いてもよいが、乾燥および／または粉砕したものを用いるのが好ましい。
【００１９】
本発明に用いられる原料を抽出するための溶媒は、特に限定されないが、水、親水性有機溶媒またはこれらの混液が好ましい。親水性有機溶媒としては、例えば、１価の低級アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなど）、多価アルコール（グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコールなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど）、エステル類（酢酸エチル、酢酸イソプロピルなど）およびエーテル類（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなど）が挙げられるが、中でもメタノールまたはエタノールが好ましい。
【００２０】
抽出方法は、特に限定されないが、室温〜加熱下、溶媒に原料を浸漬して抽出する方法が好ましい。例えば、室温〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃の温度で、撹拌下または非撹拌下に原料を浸漬することによって、抽出することができる。
抽出の際の溶媒量は、原料の量に応じて適宜設定できるが、通常、重量比で原料の１〜
３０倍量、好ましくは５〜２０倍量である。また、抽出時間は、特に限定されないが、撹拌下に浸漬する場合は１〜３時間程度、非撹拌下に浸漬する場合は５〜２４時間程度が適当である。
なお、上記の温度より低い温度で抽出することも可能であるが、その場合には、上記の抽出時間より長く浸漬することが好ましい。
また、抽出処理は、同一原料について１回のみ行ってもよいが、複数回、例えば、２〜５回程度行うこともできる。
【００２１】
上記の抽出方法により得られるボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物は、そのままでもコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物として用い得るが、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、脱臭、脱色、乾燥などの処理に付してもよい。また、各抽出物に含まれる特定の成分をカラム精製などにより、単離および／または濃縮してもよい。
【００２２】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物は、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含むことを特徴とするが、中でもテルミナリア アルジュナの抽出物を含むことが好ましく、また、上記の３種の抽出物を全て含んでいてもよい。
【００２３】
また、上記の各抽出物に、これらの抽出物が有する活性を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品（特定保健用食品、栄養機能食品を含む）などの技術分野において通常用いられている、他の成分を適宜配合してもよい。
そのような成分としては、例えば、油脂類（カカオ脂、ヤシ油、パーム核油など）、ロウ類（ミツロウ、カルナバロウなど）、炭化水素類（固形パラフィン、流動パラフィン、ワセリンなど）、脂肪酸類（オレイン酸、リノール酸、イソステアリン酸、ウンデシレン酸など）、アルコール類（エタノール、セチルアルコール、イソステアリルアルコールなど）、エステル類（ミリスチン酸ミリスチル、モノステアリン酸グリセリン、オレイン酸デシルなど）、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ソルビタン、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムなど）、香料（合成香料、天然香料など）、甘味料（ショ糖、ステビアなど）、ｐＨ調整剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなど）、保存剤（安息香酸ナトリウム、ソルビン酸など）、保湿剤（グリセリン、コラーゲン、ヒアルロン酸など）、美白剤（Ｌ−アスコルビン酸、ハイドロキノンβ−Ｄ−グルコース、エラグ酸、コウジ酸、トラネキサム酸など）、粉体（顔料、色素、樹脂など）、紫外線吸収剤（パラメトキシケイ皮酸２エチルヘキシルなど）、紫外線散乱剤（酸化チタン、酸化亜鉛など）、増粘剤（アラビアゴム、メチルセルロースなど）、酸化防止剤（ビタミンＣ、ビタミンＥなど）、キレート剤（エデト酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、崩壊剤（デンプン類、結晶セルロースなど）などが挙げられる。
【００２４】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物は、これらの組成物を含む美容用組成物、好ましくは皮膚の老化の防止および／または改善するための美容用組成物として提供することができる。
本発明の美容用組成物を使用または摂取することにより、美容効果、特にしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などの皮膚の老化を防止および／または改善する効果が期待できる。
【００２５】
本発明の美容用組成物の形態としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、エッセンス（エキス）、オイル、パック、マスク、口紅、打粉、クレンジングローション、シャンプー、リンス、コンディショナー、石鹸、ボディーシャンプー、浴用剤、日焼け止めローション、軟膏剤、パップ剤、散剤、錠剤、乳剤、トローチ剤、内用液剤、シロップ剤、ゲル剤、エアロゾル剤、飲料、菓子類などが挙げられる。
【００２６】
上記の化粧品、医薬部外品、医薬品または食品（特定保健用食品、栄養機能食品を含む）などの形態の美容用組成物における、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物の含量は、特に制限されず、該組成物の形態に応じて適宜選定することができる。
一例を挙げれば、上記の各抽出物の乾燥重量として、美容用組成物の全重量に対して、０．０００１〜５０重量％、好ましくは０．０００５〜４０重量％、より好ましくは０．００１〜３０重量％である。
【００２７】
本発明の美容用組成物が皮膚外用剤である場合、上記の各抽出物の乾燥重量としての含量は、通常、該皮膚外用剤の全重量に対して、０．００１〜１０重量％であればよい。この含量が、０．００１重量％未満では十分な美容効果を期待できず、逆に、１０重量％を超えても超過分に見合った美容効果の増強は期待できず、不経済である。
【００２８】
また、本発明の美容用組成物を内服する場合の摂取量は、投与形態、年齢、体重などによって異なるが、上記の各抽出物の乾燥重量として、０．０１〜１０ｇ／日、好ましくは０．１〜３ｇ／日である。
【００２９】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
製造例１：ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの抽出物の調製
以下のようにして、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの抽出物を得た。
（１）ボダイジュ花抽出物の調製
ボダイジュの花弁乾燥品（中国産）の粗粉砕物４０ｇを５０％（ｖ／ｖ）エタノール１０００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のボダイジュ花抽出物４．３ｇを得た。
【００３１】
（２）シャクヤク花抽出物の調製
シャクヤクの花弁乾燥品（中国産）の粗粉砕物３０ｇを５０％（ｖ／ｖ）エタノール５００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のシャクヤク花抽出物１１．２ｇを得た。
【００３２】
（３）テルミナリア アルジュナ抽出物の調製
テルミナリア アルジュナの根皮乾燥品（スリランカ産）の粗粉砕物３０ｇを水５００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のテルミナリア アルジュナ抽出物６．１ｇを得た。
【００３３】
試験例１：コラーゲン産生促進活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のコラーゲン産生促進活性を、コラーゲンを特異的に染色する色素シリウスレッドを用いて、以下のように評価した。
（１）各抽出物の試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、各試料溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
（２）細胞培養
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞ＮＨＤＦ（ＮＢ）（倉敷紡績株式会社）を、正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地Ｍｅｄｉｕｍ １０６Ｓ（倉敷紡績株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で５日間培養した。
５日後、前記培地にて２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞浮遊液を９６ウェルプレート（マイクロプレート：ＩＷＡＫＩ社製）に１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４８時間培養した。
４８時間後、各ウェルの培地を除去し、これらのウェルに前記培地９９μｌと試料溶液１μｌとの混合液（試料終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに４８時間培養した。また、対照ブランクとして、試料溶液に代えてＤＭＳＯ１μｌを前記培地９９μｌと混合した液を対照用のウェルに添加した。
【００３４】
（３）被験反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（２）の培養後、各ウェルから培地を除去し、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、シリウスレッド試薬（０．１％ Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ Ｆ３ＢＡ（Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｄ ８０：ＳＩＧＭＡ社）／０．５Ｍ 酢酸水溶液））を各ウェルに５０μｌ滴下し、室温で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルの細胞を１０ｍＭ 塩酸で３回洗浄し、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で５分間インキュベーションして色素を抽出して、被験反応液および対照ブランク液を得た。
（４）吸光度の測定およびコラーゲン産生促進活性の算出
上記の工程（３）のインキュベーション終了後、プレートを軽く撹拌し、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液および対照ブランク液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、測定される吸光度は、コラーゲンに特異的結合したシリウスレッドに由来する。
下記の式を用いて、得られた各測定値からコラーゲン産生促進活性を算出した。なお、該活性は、試料溶液を添加していない対照ブランクの細胞のコラーゲン産生活性を１００％とした場合の相対的な数値として算出される。
コラーゲン産生促進活性（％）＝（Ｓ／Ｃ）×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｃ：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表１に示す。
表１より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物は、正常ヒト新生児包皮線維芽細胞ＮＨＤＦ（ＮＢ）に対してコラーゲン産生促進活性を示すことが確認された。
【００３５】
【表１】
【００３６】
試験例２：ヒアルロニダーゼ阻害活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を、ヒアルロン酸などの糖類の定量法であるモルガン−エルソン法（生化学実験，第１１巻，第２２−２３頁（１９６８年）参照）を応用して評価した。
（１）試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、各試料溶液（１２．５ｍｇ/ｍｌ）を調製した。
（２）酵素溶液の調製
牛精巣ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、酵素溶液（４００ユニット／ｍｌ）を調製した。
（３）酵素活性化溶液の調製
ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（ＳＩＧＭＡ社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、酵素活性化溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００３７】
（４）基質溶液の調製
ヒアルロン酸カリウム（和光純薬社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
（５）ホウ酸溶液の調製
ホウ酸（和光純薬社）４．９５ｇに水５０ｍｌを加え、１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．１にした後、水を加えて１００ｍｌに調製した。
（６）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢ）試薬の調製
ｐ−ＤＡＢ（和光純薬社）１０ｇを１０Ｎ 塩酸１２．５ｍｌと酢酸８７．５ｍｌとの混液に溶解し、ｐ−ＤＡＢ試薬（０．１ｇ／ｍｌ）を調製した。なお、該試薬は使用時まで冷蔵保存し、使用直前に酢酸で１０倍容量に希釈して、濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。
【００３８】
（７）被験反応液および被験ブランク液の調製
９６ディープウェルプレート（マイクロプレート：ステム社製）に各試料溶液を２μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルに酵素溶液２８μｌを加えて、３７℃で２０分間インキュベーションした。また、被験ブランクとして、酵素溶液に代えて０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２８μｌを被験ブランク用のウェルに添加した。
次いで、酵素活性化溶液２０μｌを各ウェルに加えて３７℃で２０分間インキュベーションした。さらに、基質溶液５０μｌを加えて３７℃で４０分間反応させた。その後、０．４Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを加え、プレートを氷冷して反応を停止させた。そして、ホウ酸溶液２０μｌを加え、プレートを沸騰浴にて１００〜１２０℃で５分間加熱した後、氷冷した。その後、各ウェルにｐ−ＤＡＢ試薬３００μｌを加え、プレートを３７℃で２０分間インキュベーションして発色させて、被験反応液および被験ブランク液を得た。
（８）対照反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（７）において、各試料溶液に代えてＤＭＳＯを９６ディープウェルプレートに２μｌ／ウェルで添加し、以後の操作を上記の工程（７）と同様にして、対照反応液および対照ブランク液を得た。
【００３９】
（９）吸光度の測定およびヒアルロニダーゼ阻害活性の算出
上記の工程（７）および（８）のインキュベーション終了後、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液、被験ブランク液、対照反応液および対照ブランク液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、次の式を用いて、得られた各測定値からヒアルロニダーゼ阻害活性を算出した。
ヒアルロニダーゼ阻害活性（％）＝｛１−（Ｓ−Ｓb）／（Ｃ−Ｃb）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｓb：被験ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値、
Ｃb：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表２に示す。
表２より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がヒアルロニダーゼ阻害活性を有することが確認された。
【００４０】
【表２】
【００４１】
試験例３：スーパーオキサイド消去活性（ＳＯＤ様活性）試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のスーパーオキサイド消去活性を、以下のようにＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所）を用いて評価した。
上記のキットは、キサンチンとキサンチンオキシダーゼとの反応によってスーパーオキサイドを発生させ、さらに、スーパーオキサイドと該キットの発色試薬との反応によって黄色のテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１が生成することを利用するものである。例えば、試験対象の試料がスーパーオキサイド消去活性を有する場合、発生したスーパーオキサイドが消去されるため、ＷＳＴ−１の生成量が減少し、反応液の黄色の発色が抑制される。したがって、該反応液の吸光度を測定することにより、スーパーオキサイド消去活性をＷＳＴ−１の生成抑制率として求めることができる。
【００４２】
（１）試験溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物及びテルミナリア アルジュナ抽出物を、５０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解し、各試料溶液（１２０μｇ／ｍｌ）を調製した。
（２）被験反応液および被験ブランク液の調製
９６ウェルプレート（マイクロプレート：アズワン株式会社製）に各試料溶液を２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルにＷＳＴ溶液を２００μｌ加え、プレートミキサーで撹拌した。その後、各ウェルに酵素溶液を２０μｌ加えた。また、ブランク対照として、酵素溶液に代えて希釈緩衝液を２０μｌ加えた。その後、プレートを３７℃で２０分間インキュベートし、被験反応液および被験ブランク液を得た。
【００４３】
（３）対照反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（２）において、各試料溶液に代えて５０％（ｖ／ｖ）エタノールを９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルで添加し、以後の操作を上記の工程（２）と同様にして、対照反応液および対照ブランク液を得た。
（４）吸光度の測定およびスーパーオキサイド消去活性の算出
上記の工程（２）および（３）のインキュベーション終了後、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液、被験ブランク液、対照反応液および対照ブランク液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、次の式を用いて、得られた各測定値からスーパーオキサイド消去活性を算出した。
スーパーオキサイド消去活性（％）＝｛１−（Ｓ−Ｓb）／（Ｃ−Ｃb）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｓb：被験ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値、
Ｃb：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表３に示す。
表３より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がスーパーオキサイド消去活性を有することが確認された。
【００４４】
【表３】
【００４５】
試験例４：ＤＰＰＨラジカル消去活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を、ＤＰＰＨラジカルの減少量を測定することにより評価した。なお、この試験においては、ラジカル消去活性を有する標準物質としてビタミンＥ誘導体Ｔｒｏｌｏｘ（商標）を用いた。
（１）試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、ＤＭＳＯに溶解し、各試料溶液（２ｍｇ/ｍｌ）を調製した。
（２）ＤＰＰＨ／エタノール溶液の調製
ＤＰＰＨ（和光純薬株式会社）をエタノールに溶解し、ＤＰＰＨ／エタノール溶液（０．４ｍＭ）を調製した。なお、試験には調製から２時間以内のものを使用した。
（３）ＭＥＳ緩衝液の調製
ＭＥＳ緩衝液（株式会社同仁化学研究所）を水で希釈し、１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．１に調整後、２００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液とした。
（４）ＤＰＰＨ希釈標準溶液の調製
０．４ｍＭ ＤＰＰＨ／エタノール溶液、２００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液および水を２：１：１の割合で混合し、ＤＰＰＨ希釈標準溶液を調製した。
（５）被験反応液および対照ブランク液の調製
９６ウェルプレート（マイクロプレート：アズワン株式会社製）に各試料溶液を１０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルにＤＰＰＨ希釈標準溶液１９０μlを加えた。また、被験ブランクとして試料溶液に代えて、ＤＭＳＯを各ウェルに１０μｌ添加した。その後、プレートを室温で３０分間インキュベートして、被験反応液および対照ブランク液を得た。
（６）対照反応液の調製
上記の工程（５）において、各試料溶液に代えて２０ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ（商標）（和光純薬工業株式会社）を９６ウェルプレートの各ウェルに２０μｌ添加し、以後の操作を上記の工程（５）と同様にして、対照反応液を得た。
そして、次の式を用いて、対照反応液のＤＰＰＨラジカル消去活性を１００％として各試料溶液の該活性を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝｛（Ｃb−Ｓ）／（Ｃb−Ｃ）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｃb：対照ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値）
得られた結果を表４に示す。
表４より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がＤＰＰＨラジカル消去活性を有することが確認された。
【００４６】
【表４】
【００４７】
以下に、本発明の美容用組成物の処方例を示す。なお、各抽出物は、製造例１の方法によって得られたものを用いた。
実施例１〜７
クリーム
本発明の美容用組成物（皮膚外用剤）である、化粧品（クリーム）を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表５に重量％で示す。
（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分をそれぞれ混合し８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に、（Ｂ）の混合物を撹拌しながら徐々に加えて乳化させ、その後３５℃に冷却して、クリームを得た。
【００４８】
【表５】
【００４９】
実施例８〜１４
化粧水
本発明の美容用組成物（皮膚外用剤）である、化粧品（化粧水）を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表６に重量％で示す。
（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱して、さらに混合、均一化した後、冷却する。これに３５℃で（Ｂ）の各成分を順次添加し、混合、均一化して、ローションを得た。
【００５０】
【表６】
【００５１】
実施例１５〜２１
錠剤
本発明の美容用組成物である、錠剤の形態にある食品を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表７に重量％で示す。
各成分を混合、均一化した後、これを打錠機により形成し、錠剤の形態にある食品を得た。
【００５２】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨ（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物を含む美容用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮および皮下組織の三層からなり、これらのうち真皮には、皮膚の弾力や保水性など、皮膚の機能維持に重要なコラーゲンおよびヒアルロン酸が多く含まれている。これらコラーゲンおよびヒアルロン酸は、真皮中に存在する線維芽細胞により産生される。
【０００３】
一方で、加齢や紫外線などのストレスにより線維芽細胞の機能が衰え、真皮におけるコラーゲンの変性および産生減少、ならびにヒアルロン酸の産生減少が起こる。特に、紫外線に曝露された皮膚においては、スーパーオキサイドやフリーラジカルなどが発生し、これらが皮膚の脂質やタンパク質に対する酸化反応を促進することにより、皮膚の急性炎症や真皮の障害などが引き起こされる。
その結果として、皮膚のしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などのような皮膚の老化現象があらわれる。
【０００４】
このような皮膚の老化の防止および／または改善を目的として、糖、アミノ酸、有機酸、ピロリドンカルボン酸などを配合した組成物や失われたコラーゲンおよびヒアルロン酸を補うためにこれらを配合した組成物などが、これまでに開発されてきた。
しかしながら、これらは皮膚の保湿性を高めて、表皮の角質の状態を改善するだけであり、皮膚の老化を根本的に防止または改善するものではないため、いずれも満足できる効果を有していなかった。
【０００５】
また、様々な植物体の抽出物などを配合した皮膚外用剤なども、これまでに開発されてきた（特許文献１および２参照）。しかしながら、これらはコラーゲンおよびヒアルロン酸の産生を促進し得るが、スーパーオキサイド、フリーラジカルなどに対しては有効ではなく、皮膚の老化の防止および／または改善には満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１７６２３０号公報
【特許文献２】特開２００３−３２１３７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような事情に鑑みて、本発明は、皮膚の老化の根本的な防止および／または改善に有用なコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物のいずれかを含む美容用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナ（Terminalia arjuna）の各抽出物が、コラーゲン産生促進活性、ヒアルロニダーゼ阻害活性、スーパーオキサイド消去活性およびＤＰＰＨラジカル消去活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含むコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物、ならびにこれらの組成物を含む美容用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物を使用または摂取することにより、線維芽細胞におけるコラーゲンの産生が促進され、ヒアルロニダーゼの活性が阻害されることによりヒアルロン酸が維持され、皮膚障害の原因であるスーパーオキサイドおよび／またはフリーラジカルが消去される効果が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「皮膚の老化」とは、加齢や紫外線などの影響により引き起こされる皮膚のしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などを意図する。
【００１２】
ヒアルロニダーゼとは、皮膚、血管、関節などに存在するヒアルロン酸を分解する酵素である。該酵素の活性を阻害することにより、生体内でのヒアルロン酸の分解が抑制され、生体内のヒアルロン酸の量を一定に保ち得る。
【００１３】
スーパーオキサイド（Ｏ2-）とは、活性酸素の一つであり、特に皮膚においては紫外線の曝露により発生することが知られている。一方、生体内にはスーパーオキサイドを消去する活性を有する酵素ＳＯＤ（Super Oxide Dismutase）が存在する。
スーパーオキサイド消去活性とは、ＳＯＤ様活性とも呼ばれ、スーパーオキサイドを分解して消去する活性を意味する。
【００１４】
ＤＰＰＨは、安定なフリーラジカルとして知られ、ある物質が有するフリーラジカル消去活性を評価する際の標的物質として用いられる。したがって、ＤＰＰＨラジカル消去活性とは、ＤＰＰＨを用いて評価した、ある物質が有するフリーラジカルを消去する活性を意味する。
【００１５】
ボダイジュは、シナノキ科（Tiliaceae）の植物であり、その花を乾燥させた菩提樹花茶（リンデンフラワーティー）は、ヨーロッパを中心に１８世紀から飲用され、鎮静、鎮痙、発汗などの作用を有することが知られている。
本発明に用いられるボダイジュ花としては、ナツボダイジュ（Tilia platyphyllos Scop.）、フユボダイジュ（Tilia cordata Mill.）、セイヨウシナノキ（Tilia europaea L.）などのシナノキ科、シナノキ属（Tilia）の植物の花が挙げられるが、好ましくはこれらの花の花弁である。
【００１６】
シャクヤクは、中国北西部、華北、西北地方から東シベリア、朝鮮半島にかけて自生するボタン科（Paeoniaceae）の植物であり、その根を乾燥させたものは、鎮痛、鎮痙、解熱、利尿などの作用を有する生薬として知られている。
本発明に用いられるシャクヤク花としては、シャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas）、シベリアシャクヤク（Paeonia lactiflora）、ベニバナヤマシャクヤク（Paeonia obovata）、ヤマシャクヤク（Paeonia japonica）などのボタン科、ボタン属（Paeonia）の植物の花が挙げられるが、好ましくはこれらの花の花弁である。
【００１７】
テルミナリア アルジュナとは、シクンシ科（Cambretaceae）モモタマナ属（Terminalia）の植物で、インド全域に植生し、約１８〜２８ｍの高さまで成長する落葉樹である。
テルミナリア アルジュナの樹皮は、インドでは強心剤として用いられており、また、冠動脈疾患、心不全および高コレステロール血症の治療、ならびに狭心症の疼痛緩和のために処方されてきた（特表２００８−５３７５３９号公報参照）。
本発明に用いられるテルミナリア アルジュナとしては、テルミナリア アルジュナの花、花穂、果実、果皮、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根、根茎、根皮、種子などが挙げられるが、中でも根皮を用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明において原料として用いられるボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナは、市場で入手することができる。
また、上記の各原料は、そのままの形態で用いてもよいが、乾燥および／または粉砕したものを用いるのが好ましい。
【００１９】
本発明に用いられる原料を抽出するための溶媒は、特に限定されないが、水、親水性有機溶媒またはこれらの混液が好ましい。親水性有機溶媒としては、例えば、１価の低級アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなど）、多価アルコール（グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコールなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど）、エステル類（酢酸エチル、酢酸イソプロピルなど）およびエーテル類（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなど）が挙げられるが、中でもメタノールまたはエタノールが好ましい。
【００２０】
抽出方法は、特に限定されないが、室温〜加熱下、溶媒に原料を浸漬して抽出する方法が好ましい。例えば、室温〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃の温度で、撹拌下または非撹拌下に原料を浸漬することによって、抽出することができる。
抽出の際の溶媒量は、原料の量に応じて適宜設定できるが、通常、重量比で原料の１〜
３０倍量、好ましくは５〜２０倍量である。また、抽出時間は、特に限定されないが、撹拌下に浸漬する場合は１〜３時間程度、非撹拌下に浸漬する場合は５〜２４時間程度が適当である。
なお、上記の温度より低い温度で抽出することも可能であるが、その場合には、上記の抽出時間より長く浸漬することが好ましい。
また、抽出処理は、同一原料について１回のみ行ってもよいが、複数回、例えば、２〜５回程度行うこともできる。
【００２１】
上記の抽出方法により得られるボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物は、そのままでもコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物として用い得るが、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、脱臭、脱色、乾燥などの処理に付してもよい。また、各抽出物に含まれる特定の成分をカラム精製などにより、単離および／または濃縮してもよい。
【００２２】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物は、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含むことを特徴とするが、中でもテルミナリア アルジュナの抽出物を含むことが好ましく、また、上記の３種の抽出物を全て含んでいてもよい。
【００２３】
また、上記の各抽出物に、これらの抽出物が有する活性を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品（特定保健用食品、栄養機能食品を含む）などの技術分野において通常用いられている、他の成分を適宜配合してもよい。
そのような成分としては、例えば、油脂類（カカオ脂、ヤシ油、パーム核油など）、ロウ類（ミツロウ、カルナバロウなど）、炭化水素類（固形パラフィン、流動パラフィン、ワセリンなど）、脂肪酸類（オレイン酸、リノール酸、イソステアリン酸、ウンデシレン酸など）、アルコール類（エタノール、セチルアルコール、イソステアリルアルコールなど）、エステル類（ミリスチン酸ミリスチル、モノステアリン酸グリセリン、オレイン酸デシルなど）、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ソルビタン、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムなど）、香料（合成香料、天然香料など）、甘味料（ショ糖、ステビアなど）、ｐＨ調整剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなど）、保存剤（安息香酸ナトリウム、ソルビン酸など）、保湿剤（グリセリン、コラーゲン、ヒアルロン酸など）、美白剤（Ｌ−アスコルビン酸、ハイドロキノンβ−Ｄ−グルコース、エラグ酸、コウジ酸、トラネキサム酸など）、粉体（顔料、色素、樹脂など）、紫外線吸収剤（パラメトキシケイ皮酸２エチルヘキシルなど）、紫外線散乱剤（酸化チタン、酸化亜鉛など）、増粘剤（アラビアゴム、メチルセルロースなど）、酸化防止剤（ビタミンＣ、ビタミンＥなど）、キレート剤（エデト酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、崩壊剤（デンプン類、結晶セルロースなど）などが挙げられる。
【００２４】
本発明のコラーゲン産生促進用組成物、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物、スーパーオキサイド消去用組成物およびＤＰＰＨラジカル消去用組成物は、これらの組成物を含む美容用組成物、好ましくは皮膚の老化の防止および／または改善するための美容用組成物として提供することができる。
本発明の美容用組成物を使用または摂取することにより、美容効果、特にしわ、たるみの発生、保水性や弾力などの皮膚機能の低下などの皮膚の老化を防止および／または改善する効果が期待できる。
【００２５】
本発明の美容用組成物の形態としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、エッセンス（エキス）、オイル、パック、マスク、口紅、打粉、クレンジングローション、シャンプー、リンス、コンディショナー、石鹸、ボディーシャンプー、浴用剤、日焼け止めローション、軟膏剤、パップ剤、散剤、錠剤、乳剤、トローチ剤、内用液剤、シロップ剤、ゲル剤、エアロゾル剤、飲料、菓子類などが挙げられる。
【００２６】
上記の化粧品、医薬部外品、医薬品または食品（特定保健用食品、栄養機能食品を含む）などの形態の美容用組成物における、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物の含量は、特に制限されず、該組成物の形態に応じて適宜選定することができる。
一例を挙げれば、上記の各抽出物の乾燥重量として、美容用組成物の全重量に対して、０．０００１〜５０重量％、好ましくは０．０００５〜４０重量％、より好ましくは０．００１〜３０重量％である。
【００２７】
本発明の美容用組成物が皮膚外用剤である場合、上記の各抽出物の乾燥重量としての含量は、通常、該皮膚外用剤の全重量に対して、０．００１〜１０重量％であればよい。この含量が、０．００１重量％未満では十分な美容効果を期待できず、逆に、１０重量％を超えても超過分に見合った美容効果の増強は期待できず、不経済である。
【００２８】
また、本発明の美容用組成物を内服する場合の摂取量は、投与形態、年齢、体重などによって異なるが、上記の各抽出物の乾燥重量として、０．０１〜１０ｇ／日、好ましくは０．１〜３ｇ／日である。
【００２９】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
製造例１：ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの抽出物の調製
以下のようにして、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの抽出物を得た。
（１）ボダイジュ花抽出物の調製
ボダイジュの花弁乾燥品（中国産）の粗粉砕物４０ｇを５０％（ｖ／ｖ）エタノール１０００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のボダイジュ花抽出物４．３ｇを得た。
【００３１】
（２）シャクヤク花抽出物の調製
シャクヤクの花弁乾燥品（中国産）の粗粉砕物３０ｇを５０％（ｖ／ｖ）エタノール５００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のシャクヤク花抽出物１１．２ｇを得た。
【００３２】
（３）テルミナリア アルジュナ抽出物の調製
テルミナリア アルジュナの根皮乾燥品（スリランカ産）の粗粉砕物３０ｇを水５００ｍｌに投入し、５５℃で撹拌下に１時間浸漬した後、これを吸引ろ過して抽出液を得た。この抽出液を５５℃で減圧下に濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥して、粉末状のテルミナリア アルジュナ抽出物６．１ｇを得た。
【００３３】
試験例１：コラーゲン産生促進活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のコラーゲン産生促進活性を、コラーゲンを特異的に染色する色素シリウスレッドを用いて、以下のように評価した。
（１）各抽出物の試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、各試料溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
（２）細胞培養
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞ＮＨＤＦ（ＮＢ）（倉敷紡績株式会社）を、正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地Ｍｅｄｉｕｍ １０６Ｓ（倉敷紡績株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で５日間培養した。
５日後、前記培地にて２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞浮遊液を９６ウェルプレート（マイクロプレート：ＩＷＡＫＩ社製）に１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で４８時間培養した。
４８時間後、各ウェルの培地を除去し、これらのウェルに前記培地９９μｌと試料溶液１μｌとの混合液（試料終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに４８時間培養した。また、対照ブランクとして、試料溶液に代えてＤＭＳＯ１μｌを前記培地９９μｌと混合した液を対照用のウェルに添加した。
【００３４】
（３）被験反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（２）の培養後、各ウェルから培地を除去し、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、シリウスレッド試薬（０．１％ Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ Ｆ３ＢＡ（Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｄ ８０：ＳＩＧＭＡ社）／０．５Ｍ 酢酸水溶液））を各ウェルに５０μｌ滴下し、室温で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルの細胞を１０ｍＭ 塩酸で３回洗浄し、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で５分間インキュベーションして色素を抽出して、被験反応液および対照ブランク液を得た。
（４）吸光度の測定およびコラーゲン産生促進活性の算出
上記の工程（３）のインキュベーション終了後、プレートを軽く撹拌し、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液および対照ブランク液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、測定される吸光度は、コラーゲンに特異的結合したシリウスレッドに由来する。
下記の式を用いて、得られた各測定値からコラーゲン産生促進活性を算出した。なお、該活性は、試料溶液を添加していない対照ブランクの細胞のコラーゲン産生活性を１００％とした場合の相対的な数値として算出される。
コラーゲン産生促進活性（％）＝（Ｓ／Ｃ）×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｃ：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表１に示す。
表１より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物は、正常ヒト新生児包皮線維芽細胞ＮＨＤＦ（ＮＢ）に対してコラーゲン産生促進活性を示すことが確認された。
【００３５】
【表１】
【００３６】
試験例２：ヒアルロニダーゼ阻害活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を、ヒアルロン酸などの糖類の定量法であるモルガン−エルソン法（生化学実験，第１１巻，第２２−２３頁（１９６８年）参照）を応用して評価した。
（１）試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、各試料溶液（１２．５ｍｇ/ｍｌ）を調製した。
（２）酵素溶液の調製
牛精巣ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、酵素溶液（４００ユニット／ｍｌ）を調製した。
（３）酵素活性化溶液の調製
ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（ＳＩＧＭＡ社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、酵素活性化溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００３７】
（４）基質溶液の調製
ヒアルロン酸カリウム（和光純薬社）を０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
（５）ホウ酸溶液の調製
ホウ酸（和光純薬社）４．９５ｇに水５０ｍｌを加え、１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．１にした後、水を加えて１００ｍｌに調製した。
（６）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢ）試薬の調製
ｐ−ＤＡＢ（和光純薬社）１０ｇを１０Ｎ 塩酸１２．５ｍｌと酢酸８７．５ｍｌとの混液に溶解し、ｐ−ＤＡＢ試薬（０．１ｇ／ｍｌ）を調製した。なお、該試薬は使用時まで冷蔵保存し、使用直前に酢酸で１０倍容量に希釈して、濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。
【００３８】
（７）被験反応液および被験ブランク液の調製
９６ディープウェルプレート（マイクロプレート：ステム社製）に各試料溶液を２μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルに酵素溶液２８μｌを加えて、３７℃で２０分間インキュベーションした。また、被験ブランクとして、酵素溶液に代えて０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２８μｌを被験ブランク用のウェルに添加した。
次いで、酵素活性化溶液２０μｌを各ウェルに加えて３７℃で２０分間インキュベーションした。さらに、基質溶液５０μｌを加えて３７℃で４０分間反応させた。その後、０．４Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを加え、プレートを氷冷して反応を停止させた。そして、ホウ酸溶液２０μｌを加え、プレートを沸騰浴にて１００〜１２０℃で５分間加熱した後、氷冷した。その後、各ウェルにｐ−ＤＡＢ試薬３００μｌを加え、プレートを３７℃で２０分間インキュベーションして発色させて、被験反応液および被験ブランク液を得た。
（８）対照反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（７）において、各試料溶液に代えてＤＭＳＯを９６ディープウェルプレートに２μｌ／ウェルで添加し、以後の操作を上記の工程（７）と同様にして、対照反応液および対照ブランク液を得た。
【００３９】
（９）吸光度の測定およびヒアルロニダーゼ阻害活性の算出
上記の工程（７）および（８）のインキュベーション終了後、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液、被験ブランク液、対照反応液および対照ブランク液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、次の式を用いて、得られた各測定値からヒアルロニダーゼ阻害活性を算出した。
ヒアルロニダーゼ阻害活性（％）＝｛１−（Ｓ−Ｓb）／（Ｃ−Ｃb）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｓb：被験ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値、
Ｃb：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表２に示す。
表２より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がヒアルロニダーゼ阻害活性を有することが確認された。
【００４０】
【表２】
【００４１】
試験例３：スーパーオキサイド消去活性（ＳＯＤ様活性）試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のスーパーオキサイド消去活性を、以下のようにＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所）を用いて評価した。
上記のキットは、キサンチンとキサンチンオキシダーゼとの反応によってスーパーオキサイドを発生させ、さらに、スーパーオキサイドと該キットの発色試薬との反応によって黄色のテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１が生成することを利用するものである。例えば、試験対象の試料がスーパーオキサイド消去活性を有する場合、発生したスーパーオキサイドが消去されるため、ＷＳＴ−１の生成量が減少し、反応液の黄色の発色が抑制される。したがって、該反応液の吸光度を測定することにより、スーパーオキサイド消去活性をＷＳＴ−１の生成抑制率として求めることができる。
【００４２】
（１）試験溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物及びテルミナリア アルジュナ抽出物を、５０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解し、各試料溶液（１２０μｇ／ｍｌ）を調製した。
（２）被験反応液および被験ブランク液の調製
９６ウェルプレート（マイクロプレート：アズワン株式会社製）に各試料溶液を２０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルにＷＳＴ溶液を２００μｌ加え、プレートミキサーで撹拌した。その後、各ウェルに酵素溶液を２０μｌ加えた。また、ブランク対照として、酵素溶液に代えて希釈緩衝液を２０μｌ加えた。その後、プレートを３７℃で２０分間インキュベートし、被験反応液および被験ブランク液を得た。
【００４３】
（３）対照反応液および対照ブランク液の調製
上記の工程（２）において、各試料溶液に代えて５０％（ｖ／ｖ）エタノールを９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルで添加し、以後の操作を上記の工程（２）と同様にして、対照反応液および対照ブランク液を得た。
（４）吸光度の測定およびスーパーオキサイド消去活性の算出
上記の工程（２）および（３）のインキュベーション終了後、マイクロプレートリーダー（モデル６８０：バイオラッド社製）を用いて、プレート中の被験反応液、被験ブランク液、対照反応液および対照ブランク液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、次の式を用いて、得られた各測定値からスーパーオキサイド消去活性を算出した。
スーパーオキサイド消去活性（％）＝｛１−（Ｓ−Ｓb）／（Ｃ−Ｃb）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｓb：被験ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値、
Ｃb：対照ブランク液の測定値）
得られた結果を表３に示す。
表３より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がスーパーオキサイド消去活性を有することが確認された。
【００４４】
【表３】
【００４５】
試験例４：ＤＰＰＨラジカル消去活性試験
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を、ＤＰＰＨラジカルの減少量を測定することにより評価した。なお、この試験においては、ラジカル消去活性を有する標準物質としてビタミンＥ誘導体Ｔｒｏｌｏｘ（商標）を用いた。
（１）試料溶液の調製
ボダイジュ花抽出物、シャクヤク花抽出物およびテルミナリア アルジュナ抽出物を、ＤＭＳＯに溶解し、各試料溶液（２ｍｇ/ｍｌ）を調製した。
（２）ＤＰＰＨ／エタノール溶液の調製
ＤＰＰＨ（和光純薬株式会社）をエタノールに溶解し、ＤＰＰＨ／エタノール溶液（０．４ｍＭ）を調製した。なお、試験には調製から２時間以内のものを使用した。
（３）ＭＥＳ緩衝液の調製
ＭＥＳ緩衝液（株式会社同仁化学研究所）を水で希釈し、１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．１に調整後、２００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液とした。
（４）ＤＰＰＨ希釈標準溶液の調製
０．４ｍＭ ＤＰＰＨ／エタノール溶液、２００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液および水を２：１：１の割合で混合し、ＤＰＰＨ希釈標準溶液を調製した。
（５）被験反応液および対照ブランク液の調製
９６ウェルプレート（マイクロプレート：アズワン株式会社製）に各試料溶液を１０μｌ／ウェルで添加し、次いでこれらのウェルにＤＰＰＨ希釈標準溶液１９０μlを加えた。また、被験ブランクとして試料溶液に代えて、ＤＭＳＯを各ウェルに１０μｌ添加した。その後、プレートを室温で３０分間インキュベートして、被験反応液および対照ブランク液を得た。
（６）対照反応液の調製
上記の工程（５）において、各試料溶液に代えて２０ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ（商標）（和光純薬工業株式会社）を９６ウェルプレートの各ウェルに２０μｌ添加し、以後の操作を上記の工程（５）と同様にして、対照反応液を得た。
そして、次の式を用いて、対照反応液のＤＰＰＨラジカル消去活性を１００％として各試料溶液の該活性を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝｛（Ｃb−Ｓ）／（Ｃb−Ｃ）｝×１００
（Ｓ：被験反応液の測定値、Ｃb：対照ブランク液の測定値、Ｃ：対照反応液の測定値）
得られた結果を表４に示す。
表４より、ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナの各抽出物がＤＰＰＨラジカル消去活性を有することが確認された。
【００４６】
【表４】
【００４７】
以下に、本発明の美容用組成物の処方例を示す。なお、各抽出物は、製造例１の方法によって得られたものを用いた。
実施例１〜７
クリーム
本発明の美容用組成物（皮膚外用剤）である、化粧品（クリーム）を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表５に重量％で示す。
（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分をそれぞれ混合し８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に、（Ｂ）の混合物を撹拌しながら徐々に加えて乳化させ、その後３５℃に冷却して、クリームを得た。
【００４８】
【表５】
【００４９】
実施例８〜１４
化粧水
本発明の美容用組成物（皮膚外用剤）である、化粧品（化粧水）を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表６に重量％で示す。
（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱して、さらに混合、均一化した後、冷却する。これに３５℃で（Ｂ）の各成分を順次添加し、混合、均一化して、ローションを得た。
【００５０】
【表６】
【００５１】
実施例１５〜２１
錠剤
本発明の美容用組成物である、錠剤の形態にある食品を製造した。各実施例における各成分の配合割合を表７に重量％で示す。
各成分を混合、均一化した後、これを打錠機により形成し、錠剤の形態にある食品を得た。
【００５２】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含む、コラーゲン産生促進用、ヒアルロニダーゼ阻害用、スーパーオキサイド消去用および／またはＤＰＰＨラジカル消去用の組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含む美容用組成物。
【請求項３】
美容用組成物が、皮膚の老化を防止および／または改善するためのものである、請求項２に記載の美容用組成物。
【請求項４】
美容用組成物が、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品である、請求項２または３に記載の美容用組成物。
【請求項５】
化粧品が化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、エッセンス、パック、マスク、口紅、打粉またはクレンジングローションの形態にある、請求項４に記載の美容用組成物。
【請求項１】
ボダイジュ花、シャクヤク花およびテルミナリア アルジュナから選択される１種または２種以上の抽出物を含む、コラーゲン産生促進用、ヒアルロニダーゼ阻害用、スーパーオキサイド消去用および／またはＤＰＰＨラジカル消去用の組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含む美容用組成物。
【請求項３】
美容用組成物が、皮膚の老化を防止および／または改善するためのものである、請求項２に記載の美容用組成物。
【請求項４】
美容用組成物が、化粧品、医薬部外品、医薬品または食品である、請求項２または３に記載の美容用組成物。
【請求項５】
化粧品が化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、エッセンス、パック、マスク、口紅、打粉またはクレンジングローションの形態にある、請求項４に記載の美容用組成物。
【公開番号】特開２０１１−４２６４４（Ｐ２０１１−４２６４４Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９１６１５（Ｐ２０１０−９１６１５）
【出願日】平成２２年４月１２日（２０１０．４．１２）
【出願人】（５９２１５６４８２）大峰堂薬品工業株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１２日（２０１０．４．１２）
【出願人】（５９２１５６４８２）大峰堂薬品工業株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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