膀胱癌における治療標的としてのｐ３８α
本発明はｐ３８インヒビターにより膀胱癌を処置するための方法及び組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のため、及び、より一般的には膀胱癌又は腫瘍の処置のための、医薬の分野、特に組成物及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＦＧＦＲ３（繊維芽細胞増殖因子受容体３）は、胚発生及び組織の恒常性の多くの局面に関与する構造的に関連するチロシンキナーゼ受容体のファミリー（ＦＧＦＲ１−４）に属する。これらの受容体は、増殖、分化、遊走、及びアポトーシスを含む様々な生物学的過程を制御する。それらは病態にも関与しており、多くの研究で発生遺伝病及び良性又は悪性腫瘍におけるそれらの重要性が強調されてきた。ＦＧＦＲは、２つ又は３つの免疫グロブリン様ドメイン、細胞膜貫通領域、及びチロシンキナーゼ活性を伴う細胞質内ドメインからなる細胞外リガンド結合ドメインを有する。細胞外ドメインへのリガンド結合によってＦＧＦＲの二量化が導かれ、細胞内チロシンのトランスリン酸化による受容体の活性化が誘発される。細胞内ドメインは、次に、様々な細胞内シグナル伝達タンパク質と相互作用し、それをリン酸化する。選択的ｍＲＮＡスプライシングは、ＦＧＦＲの異なる領域に影響を及ぼす。ＦＧＦＲ１−３の膜近傍Ｉｇ様ドメインの第２部分は２つの相互に排他的なエクソンによりコード化され、異なるリガンド特異性及び組織分布を有する２つの異なるアイソフォームｂ及びｃをもたらす。ＦＧＦＲ３ｂが上皮細胞において主に発現されるのに対し、ＦＧＦＲ３ｃは軟骨細胞を含む間葉由来細胞において大部分が見出される。
【０００３】
ＦＧＦＲ３における特定の生殖細胞系点突然変異は、様々な常染色体優性のヒト骨障害に関連付けられる。これらの全ての突然変異は、ヌクレオチド置換の位置及び性質に依存して、様々な機構により自己活性化された受容体を生成する。
【０００４】
ＦＧＦＲ３の同じ活性化突然変異は良性及び悪性腫瘍において同定されている。良性腫瘍として皮膚（脂漏性角化症及び表皮母斑）及び膀胱（膀胱乳頭腫）における腫瘍が挙げられる。悪性腫瘍として血液癌、多発性骨髄腫、ならびに膀胱及び頚部の癌が挙げられる。ＦＧＦＲ３突然変異の頻度は多発性骨髄腫及び頚癌において低いが（腫瘍の２％未満がこれらの突然変異を呈する）、しかし、膀胱癌においてずっと高い（５０％前後）。多発骨髄腫において発現する主なＦＧＦＲ３アイソフォームである突然変異型ＦＧＦＲ３ｃの形質転換特性が明確に実証されている。突然変異型ＦＧＦＲ３ｂアイソフォームが主に良性腫瘍又は低悪性能の腫瘍において見いだされるとの事実にもかかわらず、本発明者らは近年、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及び膀胱癌細胞株において突然変異型ＦＧＦＲ３ｂの発癌性を明確に実証した。実際に、膀胱腫瘍におけるＦＧＦＲ３の最も共通の突然変異型であるＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９ＣはＮＩＨ−３Ｔ３細胞を形質転換でき、ヌードマウスに皮下注射した場合にそれらの足場非依存性増殖及び腫瘍形成を誘発し、そして、ｓｉＲＮＡを使用したＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃノックダウンは細胞増殖を低下させ、足場非依存性増殖を抑制した（Bernard-Pierrot, 2006, Carcinogenesis 4: 740-747）。それにもかかわらず、突然変異型ＦＧＦＲ３受容体のこれらの発癌性に関連する（関与する）分子機構は解明されなかった。
【０００５】
膀胱癌は、発生率の観点から、男性において４番目、女性において９番目の癌である。患者１人当たり、それは社会にとって最も費用のかかる癌である。しかし、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の利用可能な処置の数は非常に限られており、新しい処置が必要とされる。
【０００６】
本発明者からの２００５年４月のアメリカ癌学会（ＡＡＣＲ）の要約では、突然変異型ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９ＣによるトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３実験細胞株に関連するインビトロでの結果が開示されている。ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９ＣはＥＲＫ１／２及びＰ１３キナーゼを活性化し、それはｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路を特異的に活性化する。それぞれＰ１３キナーゼ及びｐ３８ ＭＡＰキナーゼのインヒビターであるＬＹ２９４００２又はＳＢ２０３５８０によるトランスフェクト細胞株の処置によって、細胞の形質転換した表現型及び軟寒天においてコロニーを形成するそれらの能力が抑制される。従って、著者らは、Ｐ１３キナーゼ経路及びｐ３８経路の両方がＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性の細胞形質転換を達成するために必要とされると結論付けた。著者らの目的は発癌機構の発見であった。任意の処置のためにこれらのインヒビターの１つを使用するとの示唆はない。加えて、これらのデータは実験モデル細胞株でのインビトロの結果のみに関し、当業者はそのようなインビトロでの結果から何らかの可能な治療効果を推定することが不可能であることを知っている。最後に、ｐ３８のアイソフォームについての情報はない。
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、以下の理由から、ｐ３８αが、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、より一般的には膀胱癌又は腫瘍のための治療標的であることを確証した：
−ｐ３８αアイソフォームは突然変異型ＦＧＦＲ３により誘発される増殖に関与する唯一のアイソフォームである。
−ｐ３８αインヒビターは突然変異型ＦＧＦＲ３に特異的と思われる。実際に、それらは３Ｔ３細胞における活性化された野生型ＦＧＦＲ３により誘発される増殖を遮断しない
−ヒトのサンプルを使用し、膀胱腫瘍サンプルの大半がリン酸化ｐ３８αを発現したことが示されており、それは活性化ｐ３８αである。
ＦＧＦＲ３突然変異を保有する全ての膀胱腫瘍サンプルがリン酸化ｐ３８αを発現した。興味深いことに、ＦＧＦＲ３について突然変異のない一部のヒトのサンプルもリン酸化ｐ３８を発現しており、ヒトの膀胱腫瘍において、ｐ３８αの役割がＦＧＦＲ３突然変異を伴う腫瘍に限定されないことを示唆する。例えば、ＲＡＳ突然変異を呈する全てのヒトの膀胱腫瘍もｐ３８αの強いリン酸化を呈した。
−ｐ３８αインヒビターは、膀胱腫瘍細胞株における突然変異型ＦＧＦＲ３により誘発される軟寒天中での増殖及びコロニー形成能を遮断する。
−ｐ３８αインヒビターはインビボで増殖を遮断し、特にそれらはヌードマウスにおける膀胱腫瘍の異種移植片の増殖及び皮膚マウス腫瘍モデルにおける腫瘍細胞の増殖も低減する。
−ｐ３８αインヒビターはいくつかのＦＧＦＲ３突然変異、特にＳ２４９Ｃ及びＹ３７５Ｃについて効率的である。
【０００８】
従って、ｐ３８αインヒビターは、病的細胞に及ぼすそれらの標的効果のため、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理に対する魅力的な処置である。特に、ｐ３８αインヒビターは膀胱腫瘍に対する魅力的な処置であるが、それは、ＦＧＦＲ３が突然変異した腫瘍に対する薬物を使用して膀胱腫瘍の５０％を処置できたのに対し、ｐ３８αに対する薬物を故に使用してＦＧＦＲ３が突然変異した腫瘍を含む膀胱腫瘍の７５％を処置できたためである。
【０００９】
従って、本発明は、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。
【００１０】
特定の態様において、ｐ３８αインヒビターは、
【表１】
からなる群より選択する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。例えば、特異的ｐ３８αインヒビターは、
【表２】
からなる群より選択できる。
【００１１】
別の特定の態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに対して向けたｓｉＲＮＡである。
【００１２】
別の特定の態様において、ｐ３８αインヒビターはアンチセンス、リボザイム、又は抗体である。
【００１３】
好ましい態様において、リン酸化ｐ３８αは、処置する被験体からのサンプルにおいて検出される。特に、膀胱癌又は腫瘍からのサンプルはリン酸化ｐ３８αを呈する。より特定の態様において、膀胱癌又は腫瘍はＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する。
【００１４】
好ましい態様において、処置する被験体は、好ましくは病理により罹患した組織において、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する。
【００１５】
特定の態様において、ＦＧＦＲ３突然変異は、
【表３】
からなる群より選択される（コドン番号はＦＧＦＲ３ｂアイソフォームに対応する）。
【００１６】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは経口、局所、又は非経口で投与する。
【００１７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３もしくはＲＡＳが突然変異を有するか否か、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できるか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３もしくはＲＡＳを有する、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できる被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ａ）ＮＩＨ−３Ｔ３対照細胞（Ｎｅｏ１．５、Ｎｅｏ２．３）、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞（Ｓ２４９Ｃ１．１、Ｓ２４９Ｃ１．２）、及び野生型ＦＧＦＲ３発現細胞（Ｒ３ｂ１．１， Ｒ３ｂ１．３）を２４時間血清飢餓させ、適宜、５０μg/mlヘパリンの存在下において２０ng/ml ＦＧＦ１で刺激した。７５μgの全細胞ライセートタンパク質を、以下の特異的抗体を使用してイムノブロットした：抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体、抗ｐ３８抗体、抗ホスホ−Ａｋｔ（ＰＡｋｔ）抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗ホスホ−ｐ４２／ｐ４４（ＥＲＫ１／２）（Ｐｐ４２／ｐ４４）抗体、及び抗ｐ４２／ｐ４４抗体。
【図１Ｂ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｂ）３０μMのＳＵ５４０２（ＦＧＦＲインヒビター）で２４時間処置したＳ２４９Ｃ１．２細胞及び未処置細胞の細胞ライセート（７５ μｇタンパク質）を抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体でイムノブロットした。
【図１Ｃ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｃ）３０μMのＳＵ５４０２又は２０μMのＳＢ２０３５８０（ｐ３８インヒビター）で４８時間処置したＮＩＨ−３Ｔ３対照細胞（ｎｅｏ１．５）及びＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（クローンＳ２４９Ｃ１．２）の形態学的分析。
【図１Ｄ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｄ）３０μMのＳＵ５４０２又は２０μMのＳＢ２０３５８０の存在下又は不在でのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞（Ｓ２４９Ｃ１．２）の軟寒天アッセイ。２１日後、直径が５０μmより大きいコロニーをカウントした。データは３回実施した２つの独立した実験での平均値であり、標準誤差を示す。
【図２Ａ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ａ）ＦＧＦＲ３抑制又は欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるｐ３８活性化が抑制される。３０μMのＳＵ５４０２（ＦＧＦＲインヒビター）で２４時間処置したＭＧＨ−Ｕ３細胞、未処置細胞、及びｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞（トランスフェクションから７２時間後）の細胞ライセート（７５μgタンパク質）を抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体でイムノブロットした。
【図２Ｂ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｂ）挿入図、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＧＨ−Ｕ３細胞（トランスフェクションから７２時間後）の細胞ライセート（５０μg）を抗ｐ３８抗体又は抗Ａｋｔ抗体でイムノブロットした。ｐ３８抑制又は欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖が抑制された。ＭＴＴ取り込みを、ＳＢ２０３５８０での処置又は２００nMのｐ３８α ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションから７２時間後に評価した。
【図２Ｃ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｃ）ＳＢ２０３５８０を使用したｐ３８抑制、又はｓｉＲＮＡを使用したｐ３８α欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞の足場非依存性増殖が抑制された。結果は３回実施した２つの独立した実験での平均値であり、標準誤差を示す。
【図２Ｄ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｄ）ｐ３８抑制によってＭＧＨ−Ｕ３異種移植片の増殖が抑制される。マウス（ｎ＝５／群）にＳＢ２０３５８０又はＰＢＳを毎日腫瘍内投与した。０日目は、腫瘍容積が約５０ ｍｍ３であった細胞接種後６日目に相当する。腫瘍直径をキャリパーにより一定間隔で測定し、腫瘍容積を算出した。実験終了時、腫瘍の重量を測定した。結果は平均値＋／−ＳＥ（ｎ＝１０個の腫瘍）である。統計分析はウィルコクソンの対応のない検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｅｓｔ）を使用して実施した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ａ）Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウス（Ｔ）及び同腹仔対照マウス（Ｃ）の表現型。
【図３Ｂ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｂ）ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及びｐ３８抗体を使用した７５μgの口吻全ライセートのイムノブロット分析。Ｔ、トランスジェニックマウス、Ｃ、同腹仔対照マウス。
【図３Ｃ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｃ）トランスジェニックマウス（Ｔ）の口吻をアセトン又は１００μMのＳＵ５４０２で２週間に毎日処置した。７５μgの口吻全ライセートをホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）を使用してイムノブロットした。
【図３Ｄ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｄ）トランスジェニックマウス（Ｔ）又は同腹仔対照マウス（Ｃ）の口吻をアセトン又は１００μMのＳＢ２０３５８０で２週間に毎日処置した。表皮基底細胞の増殖をＢｒｄＵ標識により評価した。ＳＢ２０３５８０で処置した、又は未処置のトランスジェニックマウスの口吻での典型的な標識を描写する、倍率ｘ１００。結果は平均値＋／− ＳＤ（ｎ＝５匹のマウス）である。統計分析は対応のないスチューデントのｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を使用して実施した、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４Ａ】図４：ヒト膀胱腫瘍におけるｐ３８活性化 Ｐ３８リン酸化は、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍におけるウエスタンブロットにより分析した。５０μgの全ヒト膀胱腫瘍ライセートを抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でイムノブロットした。典型的なウエスタンブロットを示し（図４Ａ）、全ての結果を表中にまとめる（図４Ｂ）。ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態を図４Ａ（＋＝突然変異あり、−＝突然変異なし）及び図４Ｂ（黒色＝突然変異なし、薄灰色＝突然変異あり）の両方において示す。
【図４Ｂ】図４：ヒト膀胱腫瘍におけるｐ３８活性化 Ｐ３８リン酸化は、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍におけるウエスタンブロットにより分析した。５０μgの全ヒト膀胱腫瘍ライセートを抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でイムノブロットした。典型的なウエスタンブロットを示し（図４Ａ）、全ての結果を表中にまとめる（図４Ｂ）。ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態を図４Ａ（＋＝突然変異あり、−＝突然変異なし）及び図４Ｂ（黒色＝突然変異なし、薄灰色＝突然変異あり）の両方において示す。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
「含む」を使用する場合、これは好ましくは「本質的になる」、より好ましくは「からなる」により置換できる。
【００２０】
本明細書内全体で「膀胱癌又は腫瘍の処置」又は同様のものをｐ３８αインヒビターに関して言及する場合はいつでも、それは以下を意味する：
ａ）方法が、膀胱癌又は腫瘍の処置を可能にする用量（＝治療的有効量）において、そのような処置を必要とする被験体、特にヒトに、ｐ３８αインヒビター（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質）を（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含む、膀胱癌又は腫瘍の処置の（＝処置するための）方法；
ｂ）膀胱癌又は腫瘍の処置のためのｐ３８αインヒビターの使用；又は該処置における（特にヒトにおける）使用のためのｐ３８αインヒビター；
ｃ）膀胱癌又は腫瘍の処置のための薬学的製剤の製造のためのｐ３８αインヒビターの使用；
ｄ）膀胱癌又は腫瘍の処置のために適切であるｐ３８αインヒビターの用量を含む薬学的製剤；及び／又は
ｅ）膀胱癌又は腫瘍の処置における同時、分割、又は連続使用のための併用製剤としてｐ３８αインヒビター及び他の薬物を含む産物。
【００２１】
本明細書内全体で「ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置」又は同様のものをｐ３８αインヒビターに関して言及する場合はいつでも、それは以下を意味する：
ａ）方法が、病理の処置を可能にする用量（＝治療的有効量）において、そのような処置を必要とする被験体、特にヒトに、ｐ３８αインヒビター（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質）を（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含む、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置の（＝処置するための）方法；
ｂ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のためのｐ３８αインヒビターの使用；又は該処置における（特にヒトにおける）使用のためのｐ３８αインヒビター；
ｃ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のための薬学的製剤の製造のためのｐ３８αインヒビターの使用；
ｄ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のために適切であるｐ３８αインヒビターの用量を含む薬学的製剤；及び／又は
ｅ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置における同時、分割、又は連続使用のための併用製剤としてｐ３８αインヒビター及び他の薬物を含む産物。
【００２２】
従って、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。ｐ３８αインヒビターは好ましくは以下に詳述するインヒビターである。
【００２３】
好ましい態様において、病理は、多発骨髄腫、癌（悪性上皮腫瘍）、良性上皮腫瘍、及び先天性軟骨形成不全症からなる群より選択される。特定の態様において、上皮腫瘍は、膀胱、頚部、肺、乳房、結腸、及び皮膚腫瘍、好ましくは膀胱癌及び良性皮膚腫瘍からなる群より選択される。好ましい態様において、良性皮膚腫瘍は、脂漏性角化症又は表皮母斑である。特定の態様において、先天性軟骨形成不全症は、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨無形成症、ならびに致死性骨異形成症からなる群より選択される。好ましい態様において、先天性軟骨形成不全症は軟骨無形成症である。より好ましい態様において、病理は膀胱癌である。
【００２４】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体は、ＦＧＦＲ３突然変異、特に活性化ＦＧＦＲ３突然変異を有する。特定の態様において、ＦＧＦＲ３突然変異は、病理に罹患した組織において検出される。ＦＧＦＲ３突然変異を以下でさらに詳述する。あるいは、ＦＧＦＲ３突然変異は、特にｐ３８α活性化を通して、例えばリン酸化ｐ３８αを検出することにより間接的に検出できる。
【００２５】
従って、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連しうる疾患、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３が突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。あるいは、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連しうる疾患、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αが活性化されているか否かを決定すること、及び、活性化ｐ３８αを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。活性化ｐ３８αはリン酸化ｐ３８αである。それは、例えば実施例において詳述される通りに、リン酸化ｐ３８αに対して特異的な抗体で検出できる。
【００２６】
本発明は、さらに、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。特定の態様において、本発明は、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において膀胱癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。それは、また、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において良性皮膚癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。
【００２７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３が突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した被験体を選択するための方法に関する。
【００２８】
本発明の方法及び使用の好ましい態様において、ＦＧＦＲ３の突然変異は活性化突然変異である。
【００２９】
好ましい態様において、疾患は、多発骨髄腫、癌（悪性上皮腫瘍）、良性上皮腫瘍、及び先天性軟骨形成不全症からなる群より選択される。特定の態様において、上皮腫瘍は、膀胱、頚部、肺、乳房、結腸、及び皮膚の腫瘍、好ましくは膀胱癌及び良性皮膚腫瘍からなる群より選択される。好ましい態様において、良性皮膚腫瘍は、脂漏性角化症又は表皮母斑である。特定の態様において、先天性軟骨形成不全症は、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨無形成症、ならびに致死性骨異形成症からなる群より選択される。好ましい態様において、先天性軟骨形成不全症は軟骨無形成症である。より好ましい態様において、疾患は膀胱癌である。
【００３０】
ＦＧＦＲ３突然変異の存在を決定する工程は、当業者に周知の任意の方法により実施される。ＦＧＦＲ３突然変異は、適切なプローブ及び／又はプライマーにより核酸レベルで、あるいは適切な抗体によりポリペプチドレベルで検出できる。例えば、そのような方法は特許出願書ＷＯ００／６８４２４において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
サンプルは、組織、骨髄、及び血液や尿などの体液からなる群より選択できる。皮膚腫瘍の場合、サンプルは好ましくは皮膚生検又は血液サンプルである。膀胱癌の場合、サンプルは、好ましくは、膀胱腫瘍生検、血液サンプル、又は尿サンプルである。軟骨形成不全症の場合、サンプルは血液サンプルである。
【００３２】
被験体は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくヒトでありうる。
【００３３】
加えて、本発明は、場合によりＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。ｐ３８αインヒビターは好ましくは以下に詳述するインヒビターである。
【００３４】
好ましい態様において、処置する被験者はリン酸化ｐ３８αを呈する。特に、膀胱癌又は腫瘍からのサンプルは、活性化（即ち、リン酸化）ｐ３８αを呈する。ｐ３８αの活性化は、例えば、リン酸化ｐ３８αを検出することにより検出できる。より特定の態様において、膀胱癌又は腫瘍は、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異を呈する、又は、それに関連する。ＦＧＦＲ３突然変異を以下でさらに詳述する。ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異は、特にｐ３８α活性化を通して、例えばリン酸化ｐ３８αを検出することにより間接的に検出できる。
【００３５】
従って、本発明は、膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否か、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できるか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。あるいは、本発明は、膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αがリン酸化されているか否かを決定すること、及び、リン酸化ｐ３８αを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。活性化ｐ３８αはリン酸化ｐ３８αである。それは、例えば実施例において詳述される通りに、リン酸化ｐ３８αに対して特異的な抗体で検出できる。
【００３６】
本発明は、さらに、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。特定の態様において、本発明は、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。それは、また、活性化ｐ３８αを有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。
【００３７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。あるいは、本発明は、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αがリン酸化されているか否かを決定すること、及び、リン酸化ｐ３８αを有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。
【００３８】
本発明の方法及び使用の好ましい態様において、ＦＧＦＲ３の突然変異は活性化突然変異である。
【００３９】
ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異の存在を決定する工程は、当業者に周知の任意の方法により実施する。ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異は、適切なプローブ及び／又はプライマーにより核酸レベルで、あるいは適切な抗体によりポリペプチドレベルで検出できる。例えば、そのような方法は特許出願書ＷＯ００／６８４２４において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
サンプルは、膀胱組織、及び血液や尿などの体液からなる群より選択できる。サンプルは、好ましくは、膀胱腫瘍生検、血液サンプル、又は尿サンプルである。
【００４１】
被験体は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくヒトでありうる。
【００４２】
膀胱腫瘍は膀胱癌又は膀胱腺腫でありうる。
【００４３】
膀胱腫瘍のための最も共通の病期分類システムはＴＮＭ（ｔｕｍｏｕｒ（腫瘍）、ｎｏｄｅ（結節）、ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（転移））システムである。この病期分類システムでは、腫瘍がどれだけ深く膀胱中に増殖したか、リンパ節中に癌が存在するか否か、及び、癌が身体の任意の他の部分に広がったか否かを考慮に入れる。好ましい態様において、膀胱腫瘍は膀胱癌である。好ましい態様において、処置する膀胱癌はＴ期である。加えて、Ｔ期の膀胱癌はサブステージ（ｓｕｂｓｔａｇｅ）を有しうる：
ＣＩＳ−非常に初期の癌細胞が膀胱内膜の最内層においてのみ検出される；
Ｔａ−癌は膀胱内膜の最内層中にのみある；
Ｔ１−癌が膀胱内膜下の結合組織中に増殖している；
Ｔ２−癌が結合組織を通じて筋肉中に増殖している；
Ｔ２ａ−癌が浅筋中に増殖している；
Ｔ２ｂ−癌が深筋中に増殖している；
Ｔ３−癌が筋肉を通じて脂肪層中に増殖している；
Ｔ３ａ−脂肪層中の癌が顕微鏡下でのみ見ることができる；
Ｔ３ｂ−脂肪層中の癌が試験で見ることができる、又は、医師により触診できる；
Ｔ４−癌が膀胱外に広がっている；
Ｔ４ａ−癌が前立腺、子宮、又は腟に広がっている；
Ｔ４ｂ−癌が骨盤壁及び腹壁に広がっている。
【００４４】
従って、本発明により処置できる膀胱腫瘍又は癌は、表在性（Ｔａ、Ｔ１）又は浸潤性（Ｔ２からＴ４）でありうる。特定の態様において、本発明により処置できる膀胱癌は、任意の、及び、全てのＴサブステージでありうる。
【００４５】
しかし、膀胱癌の他の病期、特にＮ期及びＭ期も本発明で予定される。
【００４６】
本発明は、さらに、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、突然変異型ＦＧＦＲ３を発現する細胞を候補化合物と接触させること、及び、軟寒天中での細胞の増殖及び／又はコロニー形成能を低減又は抑制する候補化合物を選択することを含む。
【００４７】
本発明は、また、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、候補化合物を、突然変異型ＦＧＦＲ３発現細胞を伴う異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスへ投与すること、一定期間後に異種移植片の腫瘍のサイズを測ること、及び、腫瘍増殖を低減又は遮断する候補化合物を選択することを含む。
【００４８】
本発明は、さらに、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、候補化合物を突然変異型ＦＧＦＲ３発現トランスジェニック非ヒト動物へ投与すること、及び、腫瘍細胞の増殖を低減又は抑制する候補化合物を選択することを含む。
【００４９】
ｐ３８インヒビター
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼｐ３８は、本来は、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した単球から単離されたセリン／スレオニンキナーゼである。４つのアイソフォーム、即ちｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、及びｐ３８δが存在する。ｐ３８αは、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４）、ＣＳＢＰ、又はＳＡＰＫ２Ａ（ＧｅｎｅＩＤ： １４３２ ； Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１６５３９）と呼ぶこともできる。このアイソフォームは炎症での治療標的である。従って、多くのｐ３８αインヒビターが開発されてきた。
【００５０】
ｐ３８αインヒビターは、小分子、ｓｉＲＮＡ（例、ＵＳ２００５／０２３９７３１；ＷＯ０４／０９７０２０；ＷＯ０３／０７２５９０）、アンチセンス、リボザイム、又は抗体でありうる。
【００５１】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは、例えば実施例において記載するｓｉＲＮＡである。
【００５２】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは小分子である。本発明において使用できるｐ３８αインヒビターの例は、それらに限定されないが、
【表４】
からなる群より選択される。他のｐ３８αインヒビターが、以下の特許及び特許出願において記載される：
【表５】
それらの開示は全てが、その全体において参照により本明細書に組み入れられる。
【００５３】
アイソフォームαに対して選択的なｐ３８αインヒビターが本発明において好ましい。そのようなｐ３８αの特異性によって、他のｐ３８アイソフォームの抑制に起因する任意の潜在的な副作用が回避される。「に対して選択的」により、インヒビターが、ｐ３８の他のアイソフォームの少なくとも１つ、好ましくは３つの他のアイソフォームよりもｐ３８αの抑制においてより効率的であることを意図する。より好ましくは、選択的ｐ３８αインヒビターは、処置のために使用する治療的有効量で、他のアイソフォームに対する抑制効果をほとんど有さず、さらにより好ましくは全く抑制効果を有さない。特定の態様において、インヒビターのＩＣ５０は、ｐ３８αでのＩＣ５０と比較して、他のｐ３８アイソフォームで少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、又は１００００倍高い（ＩＣ５０は、ｐ３８αキナーゼ活性の５０％抑制を有するために必要な用量である）。本発明において使用できるｐ３８αインヒビターの例は、それらに限定されないが、
【表６】
からなる群より選択される。
【００５４】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、投与方法、被験体の年齢、体重、性別、及び全般的な健康状態に応じて変動する。所与の適用のために治療的有効量を決定するための、当技術分野において公知の多くの方法が存在しうることが認められる。
【００５５】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、好ましくは、細胞増殖、好ましくは癌細胞増殖を抑制するため、及び／又は腫瘍増殖を低減又は遮断するため、及び／又は形質転換の表現型を低減又は抑制するため、及び／又は軟寒天中での細胞のコロニー形成能を低減又は抑制するために十分な量である。
【００５６】
適切な用量は０．０１から１０００mg/日まででよい。例えば、ＡＭＧ ５４８の用量は、経口投与による０．１mgから１０００mg/日まで、好ましくは１から５００mg/日の間でよい。ＢＩＲＢ７９６の用量は、経口投与による０．１mgから５００mg/日まで、好ましくは１０から２００mg/日の間でよい。
【００５７】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、１日に１回、２回、３回、又は４回投与できる。あるいは、ｐ３８αインヒビターの治療的効果量は、毎日、隔日、又は週に１、２、もしくは３回投与できる。
【００５８】
ｐ３８αインヒビターは、経口、非経口、吸入噴霧により、局所、直腸、経鼻、口腔、経膣により、又は埋込型リザーバー（implanted reservoir）を介して投与できる。本明細書において使用する「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、及び病巣内を含む。好ましくは、ｐ３８αインヒビターは、経口、腹腔内、腫瘍内、関節内、滑液嚢内、局所、又は静脈内投与する。
【００５９】
本発明において使用するｐ３８αインヒビターは、薬学的に許容可能な担体を一般的に含む薬学的組成物として製剤化できる。薬学的に許容可能な担体は、処置する哺乳動物に生理学的に許容可能であり、それが共に投与される薬物の治療特性を保持している担体を意図する。例えば、薬学的に許容可能な担体は生理食塩水でありうる。他の薬学的に許容可能な担体は、当業者に公知であり、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins)”において記載されている。
【００６０】
良性皮膚癌では、局所投与が好ましい。皮膚への局所的な適用では、ｐ３８αインヒビターは、担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む、適した軟膏と共に製剤化されるであろう。本発明の化合物の局所投与のための担体として、限定はされないが、鉱油、液化石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水が挙げられる。あるいは、ｐ３８αインヒビターは、担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む、適したローション又はクリームと共に製剤化できる。適した担体として、限定はされないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられる。局所−経皮パッチ及びイオン注入投与も本発明に含まれる。
【００６１】
経口投与に適したｐ３８αインヒビターは、所定量の活性成分をそれぞれ含むカプセル剤、分包剤、又は錠剤などの別々の単位として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁剤として；又は水中油型乳濁剤もしくは油中水型乳濁剤として、又はリポソーム中に梱包して、及びボーラスなどとして提供してよい。ソフトゼラチンカプセルはそのような懸濁剤を含めるために有用となりうるが、それは化合物の吸収速度を増大するために有益となりうる。
【００６２】
非経口投与に適した組成物として、対象とするレシピエントの血液と等張の製剤を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び溶質を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液；ならびに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液が挙げられる。製剤は単回用量又は複数回用量の容器中、例えば、密封アンプル及びバイアル中で提供でき、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存できる。即時注射液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製できる。
【００６３】
ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理
ＦＧＦＲ３は繊維芽細胞増殖因子受容体３を指す。特に、ＦＧＦＲ３が癌及び良性皮膚腫瘍におけるＦＧＦＲ３ｂアイソフォームであるのに対し、それは骨格病理においてＦＧＦＲ３ｃの好ましいアイソフォームである。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂアイソフォームのヌクレオチド配列は、欧州特許第１ ２０８ ２３１ Ｂ１号において記載される。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃアイソフォームのヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅｂａｎｋにおいてＮＭ＿０００１４２と呼ばれる配列である。
【００６４】
ＦＧＦＲ３突然変異は、好ましくは、活性化突然変異である。「活性化突然変異」により、本明細書において突然変異の活性化機能を意図し、それは、受容体リン酸化又はカルシウム流入としての間接的効果、標的配列のリン酸化などの活性化シグナルの観察により決定できる。特定の態様において、標的配列はｐ３８αである。
【００６５】
活性化ＦＧＦＲ３突然変異は、一般的に、ＦＧＦＲ３の免疫グロブリン様ドメインＩＩ及びＩＩＩの間の接合部をコード化するエクソン７中、膜貫通ドメインをコード化するエクソン１０中、チロシンキナーゼドメインＩをコード化するエクソン１５中、及び／又はＣ末端部分をコード化するエクソン中にある。好ましくは、前記突然変異は、
【表７】
からなる群より選択される。コドン及び突然変異型ヌクレオチド（ｎｔ位置）に、上皮細胞における優勢型であるＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに従って番号を付ける。より好ましくは、ＦＧＦＲ３突然変異は、Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７２Ｃ、Ｋ６５２Ｅ、及びＹ３７５Ｃからなる群より選択される。さらにより好ましくは、ＦＧＦＲ３突然変異はＳ２４９Ｃ又はＹ３７５Ｃである。
【００６６】
ＲＡＳタンパク質
ＲＡＳは、シグナル伝達、特にＦＧＦ受容体を含むチロシンキナーゼ受容体のシグナル伝達に関与するタンパク質（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ）のファミリーを指す（Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J, 2005, Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-49）。それらは２つの異なる状態、ＧＴＰに結合した活性状態及びＲＡＳのＧＴＰａｓｅ活性のためにＧＴＰがＧＤＰに変換された不活性状態で存在する。膀胱癌を含む癌において、全て３つのＲＡＳ遺伝子の突然変異型が記載されている。これらの突然変異型はより低いＧＴＰａｓｅ活性を有し、そのためそれらは活性状態のままである。膀胱癌におけるＲＡＳ突然変異（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳ突然変異）の１７％の推定率は、Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｓｍｉｃデータベース（www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/）から推定できる。例えば、ＲＡＳ突然変異は、ＨＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｓ及びＧ１３Ｖ、ＫＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｃ及びＧ１２ＤならびにＮＲＡＳ突然変異Ｍ７２Ｉの間で選択できる。しかし、突然変異に加えて、ＲＡＳの過剰発現も検討する。
【００６７】
ＲＡＳは以下の配列により例示できる：
【表８】
【００６８】
ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳの異なる活性化突然変異に関する参考文献は、www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/及びSchubbertら(2007)の概説（Schubbert S, Shannon K, Bollag G, 2007. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 7: 295-308）において見出すことができる。
【００６９】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために有用であり、しかし、同時に、その任意の限定を構成しない。それとは逆に、手段を様々な他の態様、改変、及びその同等物に加えることができ、それらは、本明細書における記載を読んだ後に、当業者に、本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それら自体を示唆しうることが明確に理解されるはずである。
【００７０】
材料＆方法
細胞培養及びトランスフェクション
野生型ＦＧＦＲ３ｂアイソフォーム（クローンＲ３ｂ１．１、Ｒ３ｂ１．３）を発現する、もしくは突然変異型ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ受容体（クローンＳ２４９Ｃ１．１、Ｓ２４９Ｃ １．２）を発現するトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又は、対照ｐｃＤＮＡＩ−Ｎｅｏプラスミド（クローンＮｅｏ１．５、Ｎｅｏ２．１）でトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を先に樹立し｛Bernard-Pierrot, 2006, Carcinogenesis 4, 740-747｝、１０％ウシ新生児血清、２mMグルタミン、１００u/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、４００μg/ml Ｇ４１８を伴うＤＭＥＭ中で培養した。ヒト膀胱癌細胞株ＭＧＨ−Ｕ３｛Lin, 1985 #96｝を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２mMグルタミンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。全ての細胞を３７℃で５％ ＣＯ２を含む空気中で培養した。
【００７１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、ＭＧＨ−Ｕ３細胞を８０００個細胞／ｃｍ２の密度で６ウェル又は２４ウェルプレート中に播種し、製造者のプロトコールに従い、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）を使用して２００nM ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＦＧＦＲ３ ｓｉＲＮＡｓ、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）ｓｉＲＮＡｓ、及び対照として使用したナンセンスｓｉＲＮＡは化学的に合成した（Ambion, Huntingdon, United Kingdom）。ｐ３８α ｓｉＲＮＡに関して、本発明者らは、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）検証済みｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）：ｐ３８α ｓｉＲＮＡ１（ｓｉＲＮＡ ＩＤ： １３１２）及びｐ３８α ｓｉＲＮＡ２（ｓｉＲＮＡ ＩＤ： １２１７）を使用した。他のｓｉＲＮＡでは、センス鎖の配列は：
【表９】
であった。本発明者らは、両方のＦＧＦＲ３ ｓｉＲＮＡがＭＧＨ−Ｕ３細胞においてＦＧＦＲ３タンパク質の８０−９０％の欠乏を導くことを先に示していた｛Bernard-Pierrot, 2005｝。彼らは、トランスフェクションから７２時間後のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の取り込みを測定し（２４ウェルプレート）、細胞増殖／生存を評価し、又は、溶解バッファーでそれらを溶解した（６ウェルプレート）。
【００７２】
形態分析
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を異なるインヒビターＳＢ２０３５８０及びＳＵ５４０２（Calbiochem, Merck Eurolab, Fontenay Sous Bois, France）の存在下で４８時間培養し、位相差顕微鏡を使用して写真を撮った。
【００７３】
イムノブロット分析
トランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２４時間血清飢餓した。必要な場合、細胞を５０μg/mlヘパリンの存在下で、３７℃で、２０ng/ml ＦＧＦ１で５分間刺激した。それらを次に溶解バッファー（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ、１mM Ｎａ３ＶＯ４、５mM ＮａＦ、１μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、及び１μg/mlペプスタチン）中で溶解し、ライセートを遠心分離により清澄化した。上精のタンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（BioRad, Ivry sur Seine, France）で決定した。全細胞ライセートからのタンパク質（７５μgタンパク質）を１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、２５mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３）、２００mMグリシン、１０％エタノール中で Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にエレクトロトランスファーし、ｐ３８（＃９２１２）、Ａｋｔ（＃９２７２）、ｐ４２／ｐ４４（＃９１０２）、及び３つのタンパク質のリン酸化（ホスホＡＫＴ （Ｔｈｒ３０８） ＃９２７５；ホスホｐ４２／ｐ４４（ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４）＃ ９１０１；ホスホｐ３８（ｔｈｒ１８０／ｔｙｒ１８２）（Cell Signaling Technology , Ozyme, Montigny le Bretonneux, France）に対する抗体を使用して分析した。
【００７４】
ＭＧＨ−Ｕ３全細胞ライセート（７５μg）をｐ３８、ホスホ−ｐ３８、及びＡｋｔに対する抗体を使用して同様に分析した。
【００７５】
軟寒天アッセイ
ＮＩＨ−３Ｔ３では、３０，０００個のトランスフェクト細胞を、トリプリケートで、１０％ ＮＣＳを添加し、寒天で凝固したＤＭＥＭを含む１２ウェルプレートの各々のウェルに加えた。ＭＧＨ−Ｕ３では、２０，０００個の非トランスフェクト又はｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞を、トリプリケートで、１０％ＦＣＳ及び寒天を添加したＭＥＭを含む１２ウェルプレートのウェルに加えた。必要な場合、両方の細胞型を、寒天中及び培養液中での異なるインヒビターの存在下又は不在において培養した。同量のインヒビターを週１回培養液に加えた。
【００７６】
プレートをＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びＭＧＨ−Ｕ３細胞についてそれぞれ２１日間又は１４日間インキュベートし、次に、測定格子を備えた位相差顕微鏡を使用して、直径が５０μmより大きいコロニーを陽性と記録した。
【００７７】
ヌードマウスにおける腫瘍形成
１０匹の６週齢雌Ｓｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウスをＣｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設において特定病原体除去条件で飼育した。それらの世話及び収容は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ministere de l'Agriculture et de la Foret, Direction de la Sante et de la Protection Animale, Paris, France）の施設ガイドラインに従い、許可を受けた研究者により管理された。各マウスの各側腹部（背部）に４ ｘ １０６個細胞／部位を皮下注射した。腫瘍が５０mm３（＋／− １０）に達した時、マウスを無作為に５匹のマウスの２群に分けた。１００μlの２０μM ＳＢ２０３５８０又は当容積のＰＢＳを毎日腫瘍中に投与した。腫瘍形成を２５日までモニターし、腫瘍のサイズをノギスで測定した：２つの垂直直径を使用して、式ａｂ２／２により腫瘍容積を推定し、式中、ａは最大径、ｂは最小径である。
【００７８】
トランスジェニックマウス
表皮の基底細胞において突然変異型受容体ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃを発現するトランスジェニックマウス（Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ）を先に樹立した（Logie et al 2005, Hum. Mol. Genet. 14, 1153-1160）。４０μlの１００μM ＳＵ５４０２もしくは１００μM ＳＢ２０３５８０又は賦形剤（アセトン）を２週間毎日、口吻に表皮腫瘍を発生した３から４ヵ月齢のトランスジェニックマウス又は対照同腹仔マウスの口吻に適用した。屠殺の２時間前に、マウスに０．２５mg/g体重のＢｒｄｕ（Sigma, Saint-Quentin Falavier, France）を注射（腹腔内）した。Ｂｒｄｕ免疫組織化学的検査を、パラフィン包埋した口吻組織上で、製造業者の指示に従いＢｒｄＵ ｉｎ ｓｉｔｕ検出キット（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）で実施した。基底表皮層からの５００個の細胞中のＢｒｄＵ標識細胞数を、各々のマウスについて決定した。全口吻細胞ライセート（７５μg）を、上記の通りに、ｐ３８及びホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）に対する抗体を使用して分析した。
【００７９】
結果
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ依存的である。
本発明者らは、突然変異型ＦＧＦＲ３ｂに反して、そのリガンドの１つにより活性化された野生型ＦＧＦＲ３ｂでさえ、両方の受容体のリン酸化レベルが同様であったにもかかわらず、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を形質転換しなかったことを先に示している｛Bernard-Pierrot, 2005｝。本発明者らは、（突然変異型及びリガンド刺激された）２つの受容体が異なる伝達経路を活性化できうるとの仮説を立て、観察された形質転換活性における差を説明している。
【００８０】
本発明者らは、変異ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）及び野生型受容体を発現するＦＧＦ１刺激されたクローン（Ｒ３ｂ１．１及びＲ３ｂ１．３）における３つのシグナル伝達経路の活性化を初めて検討した（図１Ａ）。
【００８１】
変異ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するクローン（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）及び野生型受容体を発現するＦＧＦ１刺激されたクローン（Ｒ３ｂ１．１及びＲ３ｂ１．３）の両方が、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４）をリン酸化できたが、しかし、突然変異型受容体がこれらの経路の持続性の活性化を誘発したのに対し、刺激された受容体がこれらの経路の一過性の活性化を誘発したことは注目すべきである（データ未掲載）。この矛盾によって、観察された２つの受容体の形質転換能における差を説明できた。さらに、興味深いことに、本発明者らは、変異受容体を発現しているクローンにおいてのみｐ３８の強いリン酸化を検出し、ＦＧＦ１により刺激したＦＧＦＲ３発現クローンにおいてはされず（図１Ａ）（クローンを４８時間中にＦＧＦ１により刺激し、ＦＧＦＲ３の持続性の活性化を模倣した場合でさえ（データ未掲載））、突然変異型ＦＧＦＲ３によるｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の特異的活性化及びＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性の細胞形質転換におけるこの経路の関与を示唆した。
【００８２】
ｐ３８活性化が、安定的に樹立したＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現ＮＩＨ−３Ｔ３クローンにおけるＦＧＦＲ３活性化に起因したことを確認するために、本発明者は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるＳＵ５４０２で処置した２つのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現クローン（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）におけるｐ３８リン酸化を研究した。予測された通り、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現クローンにおけるｐ３８リン酸化は３０μM ＳＵ５４０２の存在下で抑制され、ｐ３８活性化がＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ活性化にまさしく依存していることを実証した（図１Ｂ）。
【００８３】
細胞形質転換におけるＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性ｐ３８リン酸化の機能的意義を評価するために、彼らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに特異的な化学インヒビターであるＳＢ２０３５８０がクローンＳ２４９Ｃ１．２の形態及び足場非依存性増殖に及ぼす効果を評価した。対照として、本発明者らはＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性のインヒビターであるＳＵ５４０２の効果も評価した。３０μM ＳＢ２０３５８０又は３０μM ＳＵ５４０２でのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞の処置によって、それらの形質転換の表現型が逆転したが（図１Ｃ）、両方の薬物は対象である細胞表現型には効果を有さなかった（データ未掲載）。両方の処置によって軟寒天アッセイにおいてコロニーを形成するＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞の能力も抑制された（図１Ｄ）。これらの結果によって、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の形質転換がＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性に起因すること、及び、それがｐ３８依存的であることが実証される。
【００８４】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃによるｐ３８活性化には、ＭＧＨ−Ｕ３細胞の増殖及び形質転換が必要とされる。
本発明者らは、次に、突然変異型ＦＧＦＲ３誘発性の細胞形質転換におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼのこの関与が、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に特異的であり、上皮細胞株において生物学的により有意であるのではないかと考えた。彼らは、膀胱癌細胞であるＭＧＨ−Ｕ３の腫瘍特性が突然変異型受容体活性（ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃ）に依存することを先に実証していたため｛Bernard-Pierrot, 2005｝、彼らは突然変異型ＦＧＦＲ３がこの細胞株においてｐ３８活性化を誘発するか否かを調べた。
【００８５】
免疫ブロット分析によってＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるｐ３８の強いリン酸化が示され（図２Ａ）、このｐ３８活性化がＦＧＦＲ３−Ｙ３７５Ｃ活性に起因することを実証したが、それは、ＳＵ５４０２でのＦＧＦＲ３チロシンキナーゼ抑制又はｓｉＲＮＡ処置後のＦＧＦＲ３発現における低下によってｐ３８リン酸化が抑えられたためである（図２Ａ）。
【００８６】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃによるｐ３８活性化の役割を調べるために、本発明者らは、ＭＧＨ−Ｕ３細胞の増殖及び足場非依存性増殖に及ぼすｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターＳＢ２０３５８０の効果を評価した。対照として、彼らはＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性のインヒビターであるＳＵ５４０２の効果も評価した。ＭＴＴの取り込みによって、両方のインヒビターでの膀胱癌細胞における４０から５０％の増殖抑制が実証され（図２Ｂ）、ＳＢ２０３５８０処置細胞は軟寒天上で対照細胞の３分の１のコロニーを形成した（図２Ｃ）。しかし、ＳＢ２０３５８０が特異的にｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）及びｐ３８β（ＭＡＰＫ１１）を抑制する場合でさえ、この特異性についてのいくらかの疑念が生じうる。それ故、観察されたｐ３８不活化の効果を確認するために、本発明者らは、ＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換に及ぼすｓｉＲＮＡを使用したｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）欠乏の効果を評価した。実際に、ＭＧＨ−Ｕ３細胞はｐ３８β（ＭＡＰＫ１１）ｍＲＮＡを発現せず（データ未掲載）、ＳＢ２０３５８０を使用して観察された効果がｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）活性の抑制に起因すると考えられた。免疫ブロット分析によって、トランスフェクションから４８時間後、両方のｐ３８α ｓｉＲＮＡｓが９０から１００％のｐ３８α発現抑制を誘発することが示された（挿入図、図２Ｂ）。ｐ３８α ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞での５０から６０％の増殖抑制（図２Ｂ）及び７０から８０％の足場非依存性増殖（図２Ｃ）が観察された。このように、ｐ３８α発現又は活性における低下は、インビトロでＭＧＨ−Ｕ３膀胱癌細胞における細胞増殖及び細胞形質転換の抑制を導く。
【００８７】
さらに、ＳＢ２０３５８０での腫瘍内処置によって無胸腺ヌードマウスにおけるＭＧＨ−Ｕ３異種移植片の増殖が有意に低減され、それ故、インビボでのＭＧＨ−Ｕ３細胞形質転換におけるｐ３８活性化の関与が実証された（図２Ｄ）。
【００８８】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化は、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスの表皮性口吻腫瘍における基底上皮細胞の過剰増殖を誘発するために必要とされる。
本発明者らはトランスジェニックマウスモデルを先に樹立しており、それにおいて、彼らはケラチン（keratine）５プロモーターを使用して表皮の基底細胞に対して突然変異型ＦＧＦＲ３ｂであるＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃの発現を標的とした｛Logie, 2005, Hum. Mol. Genet. 14, 1153-1160｝。これらのマウスは、特に口吻で良性の表皮性腫瘍を発生した（図３Ａ）。本発明者は、このように、このモデルにおいて、腫瘍細胞の増殖が突然変異型ＦＧＦＲ３ｂによるｐ３８活性化にも起因しうるのではないかと考えた。最初に、本発明者らは、免疫ブロット分析により、ｐ３８がトランスジェニックマウスの口吻ライセート中でリン酸化されたのに対し、リン酸化は対照同腹仔マウスの口吻においては観察されないことを示し、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現がトランスジェニックマウスの口吻においてｐ３８活性化を導くことを示唆する（図３Ｂ）。この結果を検証するために、トランスジェニックマウスの口吻をＦＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるＳＵ５４０２で処置し、ｐ３８のリン酸化状態を評価した。免疫ブロット分析によってＦＧＦＲ３抑制時でのｐ３８リン酸化における低下が示され、故に、突然変異型ＦＧＦＲ３がトランスジェニックマウスの口吻細胞においてｐ３８経路をまさしく活性化することを実証した（図３Ｃ）。次に、本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターであるＳＢ２０３５８０での口吻処置によって、ＢｒｄＵ標識により評価された通り、トランスジェニックマウスの腫瘍細胞の増殖における有意な低下が誘発されるのに対し、それは対照マウスでの基底表皮細胞の増殖に及ぼす効果を有さないことを実証した（図３Ｄ）。まとめると、それらの結果によって、基底表皮細胞における突然変異型ＦＧＦＲ３ｂ によるＰ３８ＭＡＰキナーゼ経路の活性化及び我々の皮膚マウス腫瘍モデルにおける表皮腫瘍細胞の増殖におけるその関与が明確に指摘された。
【００８９】
ヒト膀胱腫瘍におけるＰ３８活性化
本発明者らは、異なるインビトロ及びインビボのモデルにおいて、突然変異型ＦＧＦＲ３発現がｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を導き、それは突然変異型ＦＧＦＲ３が細胞形質転換を誘発するために必要とされることを明確に実証した。
【００９０】
それ故、彼らは、突然変異型ＦＧＦＲ３もヒト膀胱腫瘍においてｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化を導くのではないかと考えた。従って、彼らは、抗ホスホ−ｐ３８抗体及び抗ｐ３８抗体を使用したウエスタン−ブロットにより、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍において、ｐ３８のリン酸化状態を調べた（図４）。全てのＦＧＦＲ３突然変異型腫瘍がｐ３８の強いリン酸化を呈したが、しかし、興味深いことに、ＦＧＦＲ３突然変異のない腫瘍のほぼ半分もｐ３８ＭＡＰキナーゼの強い活性化を呈した。印象的なのは、ＲＡＳ突然変異を呈する全ての腫瘍が、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの強い活性化を呈した。ＲＡＳ突然変異を有し、リン酸化ｐ３８を示す５サンプル中の２つがＨＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｓ及びＧ１３Ｖを有し、他の２つがＫＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｃ及びＧ１２Ｄを有し、１つがＮＲＡＳ突然変異Ｍ７２Ｉを有する。いかなる理論にも束縛されることなく、ＲＡＳはＦＧＦＲ３経路に属すると考えられ、それは１）異なるチロシンキナーゼ受容体の公知の伝達経路、２）両方のタンパク質の突然変異が独占的であるためである。それ故、ＦＧＦＲ３突然変異よりも一般的に、ヒト膀胱腫瘍中のＦＧＦＲ３経路における変化は、ｐ３８α活性化に関連付けられる可能性が高いと思われる。
【００９１】
従って、ｐ３８α活性化がＦＧＦＲ３突然変異よりも多くのヒト膀胱腫瘍において観察され、それ故、ｐ３８αインヒビターがＦＧＦＲ３突然変異型腫瘍においてだけでなく、これら全ての腫瘍において使用できた。
【００９２】
本発明者らは、３つの異なるモデルにおいて、突然変異型ＦＧＦＲ３発現がｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を導き、それは突然変異型ＦＧＦＲ３が細胞形質転換を誘発するために必要とされることを明確に実証した。本発明者らが、ｐ３８α及びβアイソフォームにより特異的なインヒビターであるＳＢ２０３５８０を使用したことから、これが、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びトランスジェニックマウス表皮におけるＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ形質転換活性に関与するこれらの２つのｐ３８アイソフォームの１つであることが推測できた。本発明者らは、特異的ｓｉＲＮＡを使用して、ｐ３８αがＭＧＨ−Ｕ３細胞の形質転換に関与することを実証した。加えて、ｐ３８αがヒト膀胱尿路上皮において発現する主な形状であるとの事実（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ９５、データ未掲載）によって、ｐ３８αが標的とするタンパク質であることが実証される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のため、及び、より一般的には膀胱癌又は腫瘍の処置のための、医薬の分野、特に組成物及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＦＧＦＲ３（繊維芽細胞増殖因子受容体３）は、胚発生及び組織の恒常性の多くの局面に関与する構造的に関連するチロシンキナーゼ受容体のファミリー（ＦＧＦＲ１−４）に属する。これらの受容体は、増殖、分化、遊走、及びアポトーシスを含む様々な生物学的過程を制御する。それらは病態にも関与しており、多くの研究で発生遺伝病及び良性又は悪性腫瘍におけるそれらの重要性が強調されてきた。ＦＧＦＲは、２つ又は３つの免疫グロブリン様ドメイン、細胞膜貫通領域、及びチロシンキナーゼ活性を伴う細胞質内ドメインからなる細胞外リガンド結合ドメインを有する。細胞外ドメインへのリガンド結合によってＦＧＦＲの二量化が導かれ、細胞内チロシンのトランスリン酸化による受容体の活性化が誘発される。細胞内ドメインは、次に、様々な細胞内シグナル伝達タンパク質と相互作用し、それをリン酸化する。選択的ｍＲＮＡスプライシングは、ＦＧＦＲの異なる領域に影響を及ぼす。ＦＧＦＲ１−３の膜近傍Ｉｇ様ドメインの第２部分は２つの相互に排他的なエクソンによりコード化され、異なるリガンド特異性及び組織分布を有する２つの異なるアイソフォームｂ及びｃをもたらす。ＦＧＦＲ３ｂが上皮細胞において主に発現されるのに対し、ＦＧＦＲ３ｃは軟骨細胞を含む間葉由来細胞において大部分が見出される。
【０００３】
ＦＧＦＲ３における特定の生殖細胞系点突然変異は、様々な常染色体優性のヒト骨障害に関連付けられる。これらの全ての突然変異は、ヌクレオチド置換の位置及び性質に依存して、様々な機構により自己活性化された受容体を生成する。
【０００４】
ＦＧＦＲ３の同じ活性化突然変異は良性及び悪性腫瘍において同定されている。良性腫瘍として皮膚（脂漏性角化症及び表皮母斑）及び膀胱（膀胱乳頭腫）における腫瘍が挙げられる。悪性腫瘍として血液癌、多発性骨髄腫、ならびに膀胱及び頚部の癌が挙げられる。ＦＧＦＲ３突然変異の頻度は多発性骨髄腫及び頚癌において低いが（腫瘍の２％未満がこれらの突然変異を呈する）、しかし、膀胱癌においてずっと高い（５０％前後）。多発骨髄腫において発現する主なＦＧＦＲ３アイソフォームである突然変異型ＦＧＦＲ３ｃの形質転換特性が明確に実証されている。突然変異型ＦＧＦＲ３ｂアイソフォームが主に良性腫瘍又は低悪性能の腫瘍において見いだされるとの事実にもかかわらず、本発明者らは近年、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及び膀胱癌細胞株において突然変異型ＦＧＦＲ３ｂの発癌性を明確に実証した。実際に、膀胱腫瘍におけるＦＧＦＲ３の最も共通の突然変異型であるＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９ＣはＮＩＨ−３Ｔ３細胞を形質転換でき、ヌードマウスに皮下注射した場合にそれらの足場非依存性増殖及び腫瘍形成を誘発し、そして、ｓｉＲＮＡを使用したＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃノックダウンは細胞増殖を低下させ、足場非依存性増殖を抑制した（Bernard-Pierrot, 2006, Carcinogenesis 4: 740-747）。それにもかかわらず、突然変異型ＦＧＦＲ３受容体のこれらの発癌性に関連する（関与する）分子機構は解明されなかった。
【０００５】
膀胱癌は、発生率の観点から、男性において４番目、女性において９番目の癌である。患者１人当たり、それは社会にとって最も費用のかかる癌である。しかし、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の利用可能な処置の数は非常に限られており、新しい処置が必要とされる。
【０００６】
本発明者からの２００５年４月のアメリカ癌学会（ＡＡＣＲ）の要約では、突然変異型ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９ＣによるトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３実験細胞株に関連するインビトロでの結果が開示されている。ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９ＣはＥＲＫ１／２及びＰ１３キナーゼを活性化し、それはｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路を特異的に活性化する。それぞれＰ１３キナーゼ及びｐ３８ ＭＡＰキナーゼのインヒビターであるＬＹ２９４００２又はＳＢ２０３５８０によるトランスフェクト細胞株の処置によって、細胞の形質転換した表現型及び軟寒天においてコロニーを形成するそれらの能力が抑制される。従って、著者らは、Ｐ１３キナーゼ経路及びｐ３８経路の両方がＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性の細胞形質転換を達成するために必要とされると結論付けた。著者らの目的は発癌機構の発見であった。任意の処置のためにこれらのインヒビターの１つを使用するとの示唆はない。加えて、これらのデータは実験モデル細胞株でのインビトロの結果のみに関し、当業者はそのようなインビトロでの結果から何らかの可能な治療効果を推定することが不可能であることを知っている。最後に、ｐ３８のアイソフォームについての情報はない。
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、以下の理由から、ｐ３８αが、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、より一般的には膀胱癌又は腫瘍のための治療標的であることを確証した：
−ｐ３８αアイソフォームは突然変異型ＦＧＦＲ３により誘発される増殖に関与する唯一のアイソフォームである。
−ｐ３８αインヒビターは突然変異型ＦＧＦＲ３に特異的と思われる。実際に、それらは３Ｔ３細胞における活性化された野生型ＦＧＦＲ３により誘発される増殖を遮断しない
−ヒトのサンプルを使用し、膀胱腫瘍サンプルの大半がリン酸化ｐ３８αを発現したことが示されており、それは活性化ｐ３８αである。
ＦＧＦＲ３突然変異を保有する全ての膀胱腫瘍サンプルがリン酸化ｐ３８αを発現した。興味深いことに、ＦＧＦＲ３について突然変異のない一部のヒトのサンプルもリン酸化ｐ３８を発現しており、ヒトの膀胱腫瘍において、ｐ３８αの役割がＦＧＦＲ３突然変異を伴う腫瘍に限定されないことを示唆する。例えば、ＲＡＳ突然変異を呈する全てのヒトの膀胱腫瘍もｐ３８αの強いリン酸化を呈した。
−ｐ３８αインヒビターは、膀胱腫瘍細胞株における突然変異型ＦＧＦＲ３により誘発される軟寒天中での増殖及びコロニー形成能を遮断する。
−ｐ３８αインヒビターはインビボで増殖を遮断し、特にそれらはヌードマウスにおける膀胱腫瘍の異種移植片の増殖及び皮膚マウス腫瘍モデルにおける腫瘍細胞の増殖も低減する。
−ｐ３８αインヒビターはいくつかのＦＧＦＲ３突然変異、特にＳ２４９Ｃ及びＹ３７５Ｃについて効率的である。
【０００８】
従って、ｐ３８αインヒビターは、病的細胞に及ぼすそれらの標的効果のため、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理に対する魅力的な処置である。特に、ｐ３８αインヒビターは膀胱腫瘍に対する魅力的な処置であるが、それは、ＦＧＦＲ３が突然変異した腫瘍に対する薬物を使用して膀胱腫瘍の５０％を処置できたのに対し、ｐ３８αに対する薬物を故に使用してＦＧＦＲ３が突然変異した腫瘍を含む膀胱腫瘍の７５％を処置できたためである。
【０００９】
従って、本発明は、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。
【００１０】
特定の態様において、ｐ３８αインヒビターは、
【表１】
からなる群より選択する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。例えば、特異的ｐ３８αインヒビターは、
【表２】
からなる群より選択できる。
【００１１】
別の特定の態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに対して向けたｓｉＲＮＡである。
【００１２】
別の特定の態様において、ｐ３８αインヒビターはアンチセンス、リボザイム、又は抗体である。
【００１３】
好ましい態様において、リン酸化ｐ３８αは、処置する被験体からのサンプルにおいて検出される。特に、膀胱癌又は腫瘍からのサンプルはリン酸化ｐ３８αを呈する。より特定の態様において、膀胱癌又は腫瘍はＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する。
【００１４】
好ましい態様において、処置する被験体は、好ましくは病理により罹患した組織において、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する。
【００１５】
特定の態様において、ＦＧＦＲ３突然変異は、
【表３】
からなる群より選択される（コドン番号はＦＧＦＲ３ｂアイソフォームに対応する）。
【００１６】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは経口、局所、又は非経口で投与する。
【００１７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３もしくはＲＡＳが突然変異を有するか否か、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できるか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３もしくはＲＡＳを有する、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できる被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ａ）ＮＩＨ−３Ｔ３対照細胞（Ｎｅｏ１．５、Ｎｅｏ２．３）、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞（Ｓ２４９Ｃ１．１、Ｓ２４９Ｃ１．２）、及び野生型ＦＧＦＲ３発現細胞（Ｒ３ｂ１．１， Ｒ３ｂ１．３）を２４時間血清飢餓させ、適宜、５０μg/mlヘパリンの存在下において２０ng/ml ＦＧＦ１で刺激した。７５μgの全細胞ライセートタンパク質を、以下の特異的抗体を使用してイムノブロットした：抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体、抗ｐ３８抗体、抗ホスホ−Ａｋｔ（ＰＡｋｔ）抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗ホスホ−ｐ４２／ｐ４４（ＥＲＫ１／２）（Ｐｐ４２／ｐ４４）抗体、及び抗ｐ４２／ｐ４４抗体。
【図１Ｂ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｂ）３０μMのＳＵ５４０２（ＦＧＦＲインヒビター）で２４時間処置したＳ２４９Ｃ１．２細胞及び未処置細胞の細胞ライセート（７５ μｇタンパク質）を抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体でイムノブロットした。
【図１Ｃ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｃ）３０μMのＳＵ５４０２又は２０μMのＳＢ２０３５８０（ｐ３８インヒビター）で４８時間処置したＮＩＨ−３Ｔ３対照細胞（ｎｅｏ１．５）及びＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（クローンＳ２４９Ｃ１．２）の形態学的分析。
【図１Ｄ】図１：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換はｐ３８依存性である。図１Ｄ）３０μMのＳＵ５４０２又は２０μMのＳＢ２０３５８０の存在下又は不在でのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞（Ｓ２４９Ｃ１．２）の軟寒天アッセイ。２１日後、直径が５０μmより大きいコロニーをカウントした。データは３回実施した２つの独立した実験での平均値であり、標準誤差を示す。
【図２Ａ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ａ）ＦＧＦＲ３抑制又は欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるｐ３８活性化が抑制される。３０μMのＳＵ５４０２（ＦＧＦＲインヒビター）で２４時間処置したＭＧＨ−Ｕ３細胞、未処置細胞、及びｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞（トランスフェクションから７２時間後）の細胞ライセート（７５μgタンパク質）を抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体でイムノブロットした。
【図２Ｂ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｂ）挿入図、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＧＨ−Ｕ３細胞（トランスフェクションから７２時間後）の細胞ライセート（５０μg）を抗ｐ３８抗体又は抗Ａｋｔ抗体でイムノブロットした。ｐ３８抑制又は欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖が抑制された。ＭＴＴ取り込みを、ＳＢ２０３５８０での処置又は２００nMのｐ３８α ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションから７２時間後に評価した。
【図２Ｃ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｃ）ＳＢ２０３５８０を使用したｐ３８抑制、又はｓｉＲＮＡを使用したｐ３８α欠乏によってＭＧＨ−Ｕ３細胞の足場非依存性増殖が抑制された。結果は３回実施した２つの独立した実験での平均値であり、標準誤差を示す。
【図２Ｄ】図２：ｐ３８欠乏又は抑制によってＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換がインビボ及びインビボで抑制される。図２Ｄ）ｐ３８抑制によってＭＧＨ−Ｕ３異種移植片の増殖が抑制される。マウス（ｎ＝５／群）にＳＢ２０３５８０又はＰＢＳを毎日腫瘍内投与した。０日目は、腫瘍容積が約５０ ｍｍ３であった細胞接種後６日目に相当する。腫瘍直径をキャリパーにより一定間隔で測定し、腫瘍容積を算出した。実験終了時、腫瘍の重量を測定した。結果は平均値＋／−ＳＥ（ｎ＝１０個の腫瘍）である。統計分析はウィルコクソンの対応のない検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｅｓｔ）を使用して実施した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ａ）Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウス（Ｔ）及び同腹仔対照マウス（Ｃ）の表現型。
【図３Ｂ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｂ）ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及びｐ３８抗体を使用した７５μgの口吻全ライセートのイムノブロット分析。Ｔ、トランスジェニックマウス、Ｃ、同腹仔対照マウス。
【図３Ｃ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｃ）トランスジェニックマウス（Ｔ）の口吻をアセトン又は１００μMのＳＵ５４０２で２週間に毎日処置した。７５μgの口吻全ライセートをホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）を使用してイムノブロットした。
【図３Ｄ】図３：ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化が、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスにおける口吻腫瘍の表皮細胞増殖を誘発するために必要とされる。図３Ｄ）トランスジェニックマウス（Ｔ）又は同腹仔対照マウス（Ｃ）の口吻をアセトン又は１００μMのＳＢ２０３５８０で２週間に毎日処置した。表皮基底細胞の増殖をＢｒｄＵ標識により評価した。ＳＢ２０３５８０で処置した、又は未処置のトランスジェニックマウスの口吻での典型的な標識を描写する、倍率ｘ１００。結果は平均値＋／− ＳＤ（ｎ＝５匹のマウス）である。統計分析は対応のないスチューデントのｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を使用して実施した、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４Ａ】図４：ヒト膀胱腫瘍におけるｐ３８活性化 Ｐ３８リン酸化は、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍におけるウエスタンブロットにより分析した。５０μgの全ヒト膀胱腫瘍ライセートを抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でイムノブロットした。典型的なウエスタンブロットを示し（図４Ａ）、全ての結果を表中にまとめる（図４Ｂ）。ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態を図４Ａ（＋＝突然変異あり、−＝突然変異なし）及び図４Ｂ（黒色＝突然変異なし、薄灰色＝突然変異あり）の両方において示す。
【図４Ｂ】図４：ヒト膀胱腫瘍におけるｐ３８活性化 Ｐ３８リン酸化は、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍におけるウエスタンブロットにより分析した。５０μgの全ヒト膀胱腫瘍ライセートを抗ホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）抗体及び抗ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でイムノブロットした。典型的なウエスタンブロットを示し（図４Ａ）、全ての結果を表中にまとめる（図４Ｂ）。ＦＧＦＲ３及びＲＡＳの突然変異状態を図４Ａ（＋＝突然変異あり、−＝突然変異なし）及び図４Ｂ（黒色＝突然変異なし、薄灰色＝突然変異あり）の両方において示す。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
「含む」を使用する場合、これは好ましくは「本質的になる」、より好ましくは「からなる」により置換できる。
【００２０】
本明細書内全体で「膀胱癌又は腫瘍の処置」又は同様のものをｐ３８αインヒビターに関して言及する場合はいつでも、それは以下を意味する：
ａ）方法が、膀胱癌又は腫瘍の処置を可能にする用量（＝治療的有効量）において、そのような処置を必要とする被験体、特にヒトに、ｐ３８αインヒビター（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質）を（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含む、膀胱癌又は腫瘍の処置の（＝処置するための）方法；
ｂ）膀胱癌又は腫瘍の処置のためのｐ３８αインヒビターの使用；又は該処置における（特にヒトにおける）使用のためのｐ３８αインヒビター；
ｃ）膀胱癌又は腫瘍の処置のための薬学的製剤の製造のためのｐ３８αインヒビターの使用；
ｄ）膀胱癌又は腫瘍の処置のために適切であるｐ３８αインヒビターの用量を含む薬学的製剤；及び／又は
ｅ）膀胱癌又は腫瘍の処置における同時、分割、又は連続使用のための併用製剤としてｐ３８αインヒビター及び他の薬物を含む産物。
【００２１】
本明細書内全体で「ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置」又は同様のものをｐ３８αインヒビターに関して言及する場合はいつでも、それは以下を意味する：
ａ）方法が、病理の処置を可能にする用量（＝治療的有効量）において、そのような処置を必要とする被験体、特にヒトに、ｐ３８αインヒビター（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質）を（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含む、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置の（＝処置するための）方法；
ｂ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のためのｐ３８αインヒビターの使用；又は該処置における（特にヒトにおける）使用のためのｐ３８αインヒビター；
ｃ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のための薬学的製剤の製造のためのｐ３８αインヒビターの使用；
ｄ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置のために適切であるｐ３８αインヒビターの用量を含む薬学的製剤；及び／又は
ｅ）ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理の処置における同時、分割、又は連続使用のための併用製剤としてｐ３８αインヒビター及び他の薬物を含む産物。
【００２２】
従って、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。ｐ３８αインヒビターは好ましくは以下に詳述するインヒビターである。
【００２３】
好ましい態様において、病理は、多発骨髄腫、癌（悪性上皮腫瘍）、良性上皮腫瘍、及び先天性軟骨形成不全症からなる群より選択される。特定の態様において、上皮腫瘍は、膀胱、頚部、肺、乳房、結腸、及び皮膚腫瘍、好ましくは膀胱癌及び良性皮膚腫瘍からなる群より選択される。好ましい態様において、良性皮膚腫瘍は、脂漏性角化症又は表皮母斑である。特定の態様において、先天性軟骨形成不全症は、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨無形成症、ならびに致死性骨異形成症からなる群より選択される。好ましい態様において、先天性軟骨形成不全症は軟骨無形成症である。より好ましい態様において、病理は膀胱癌である。
【００２４】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体は、ＦＧＦＲ３突然変異、特に活性化ＦＧＦＲ３突然変異を有する。特定の態様において、ＦＧＦＲ３突然変異は、病理に罹患した組織において検出される。ＦＧＦＲ３突然変異を以下でさらに詳述する。あるいは、ＦＧＦＲ３突然変異は、特にｐ３８α活性化を通して、例えばリン酸化ｐ３８αを検出することにより間接的に検出できる。
【００２５】
従って、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連しうる疾患、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３が突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。あるいは、本発明は、ＦＧＦＲ３突然変異に関連しうる疾患、特に膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αが活性化されているか否かを決定すること、及び、活性化ｐ３８αを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。活性化ｐ３８αはリン酸化ｐ３８αである。それは、例えば実施例において詳述される通りに、リン酸化ｐ３８αに対して特異的な抗体で検出できる。
【００２６】
本発明は、さらに、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理、特に膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。特定の態様において、本発明は、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において膀胱癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。それは、また、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において良性皮膚癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。
【００２７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３が突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した被験体を選択するための方法に関する。
【００２８】
本発明の方法及び使用の好ましい態様において、ＦＧＦＲ３の突然変異は活性化突然変異である。
【００２９】
好ましい態様において、疾患は、多発骨髄腫、癌（悪性上皮腫瘍）、良性上皮腫瘍、及び先天性軟骨形成不全症からなる群より選択される。特定の態様において、上皮腫瘍は、膀胱、頚部、肺、乳房、結腸、及び皮膚の腫瘍、好ましくは膀胱癌及び良性皮膚腫瘍からなる群より選択される。好ましい態様において、良性皮膚腫瘍は、脂漏性角化症又は表皮母斑である。特定の態様において、先天性軟骨形成不全症は、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨無形成症、ならびに致死性骨異形成症からなる群より選択される。好ましい態様において、先天性軟骨形成不全症は軟骨無形成症である。より好ましい態様において、疾患は膀胱癌である。
【００３０】
ＦＧＦＲ３突然変異の存在を決定する工程は、当業者に周知の任意の方法により実施される。ＦＧＦＲ３突然変異は、適切なプローブ及び／又はプライマーにより核酸レベルで、あるいは適切な抗体によりポリペプチドレベルで検出できる。例えば、そのような方法は特許出願書ＷＯ００／６８４２４において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
サンプルは、組織、骨髄、及び血液や尿などの体液からなる群より選択できる。皮膚腫瘍の場合、サンプルは好ましくは皮膚生検又は血液サンプルである。膀胱癌の場合、サンプルは、好ましくは、膀胱腫瘍生検、血液サンプル、又は尿サンプルである。軟骨形成不全症の場合、サンプルは血液サンプルである。
【００３２】
被験体は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくヒトでありうる。
【００３３】
加えて、本発明は、場合によりＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。本発明は、また、治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む、任意にＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関する。好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターはｐ３８αに特異的である。ｐ３８αインヒビターは好ましくは以下に詳述するインヒビターである。
【００３４】
好ましい態様において、処置する被験者はリン酸化ｐ３８αを呈する。特に、膀胱癌又は腫瘍からのサンプルは、活性化（即ち、リン酸化）ｐ３８αを呈する。ｐ３８αの活性化は、例えば、リン酸化ｐ３８αを検出することにより検出できる。より特定の態様において、膀胱癌又は腫瘍は、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異を呈する、又は、それに関連する。ＦＧＦＲ３突然変異を以下でさらに詳述する。ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異は、特にｐ３８α活性化を通して、例えばリン酸化ｐ３８αを検出することにより間接的に検出できる。
【００３５】
従って、本発明は、膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否か、又は、リン酸化ｐ３８αを検出できるか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。あるいは、本発明は、膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を処置するための方法に関し、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αがリン酸化されているか否かを決定すること、及び、リン酸化ｐ３８αを有する被験体に治療的有効量のｐ３８αインヒビターを投与することを含む。活性化ｐ３８αはリン酸化ｐ３８αである。それは、例えば実施例において詳述される通りに、リン酸化ｐ３８αに対して特異的な抗体で検出できる。
【００３６】
本発明は、さらに、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。特定の態様において、本発明は、突然変異型ＦＧＦＲ３を有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。それは、また、活性化ｐ３８αを有する被験体において、膀胱癌又は腫瘍を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用に関する。
【００３７】
本発明は、また、被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。あるいは、本発明は、被験体からのサンプルにおいてｐ３８αがリン酸化されているか否かを決定すること、及び、リン酸化ｐ３８αを有する被験体を選択することを含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法に関する。
【００３８】
本発明の方法及び使用の好ましい態様において、ＦＧＦＲ３の突然変異は活性化突然変異である。
【００３９】
ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異の存在を決定する工程は、当業者に周知の任意の方法により実施する。ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異は、適切なプローブ及び／又はプライマーにより核酸レベルで、あるいは適切な抗体によりポリペプチドレベルで検出できる。例えば、そのような方法は特許出願書ＷＯ００／６８４２４において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
サンプルは、膀胱組織、及び血液や尿などの体液からなる群より選択できる。サンプルは、好ましくは、膀胱腫瘍生検、血液サンプル、又は尿サンプルである。
【００４１】
被験体は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくヒトでありうる。
【００４２】
膀胱腫瘍は膀胱癌又は膀胱腺腫でありうる。
【００４３】
膀胱腫瘍のための最も共通の病期分類システムはＴＮＭ（ｔｕｍｏｕｒ（腫瘍）、ｎｏｄｅ（結節）、ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（転移））システムである。この病期分類システムでは、腫瘍がどれだけ深く膀胱中に増殖したか、リンパ節中に癌が存在するか否か、及び、癌が身体の任意の他の部分に広がったか否かを考慮に入れる。好ましい態様において、膀胱腫瘍は膀胱癌である。好ましい態様において、処置する膀胱癌はＴ期である。加えて、Ｔ期の膀胱癌はサブステージ（ｓｕｂｓｔａｇｅ）を有しうる：
ＣＩＳ−非常に初期の癌細胞が膀胱内膜の最内層においてのみ検出される；
Ｔａ−癌は膀胱内膜の最内層中にのみある；
Ｔ１−癌が膀胱内膜下の結合組織中に増殖している；
Ｔ２−癌が結合組織を通じて筋肉中に増殖している；
Ｔ２ａ−癌が浅筋中に増殖している；
Ｔ２ｂ−癌が深筋中に増殖している；
Ｔ３−癌が筋肉を通じて脂肪層中に増殖している；
Ｔ３ａ−脂肪層中の癌が顕微鏡下でのみ見ることができる；
Ｔ３ｂ−脂肪層中の癌が試験で見ることができる、又は、医師により触診できる；
Ｔ４−癌が膀胱外に広がっている；
Ｔ４ａ−癌が前立腺、子宮、又は腟に広がっている；
Ｔ４ｂ−癌が骨盤壁及び腹壁に広がっている。
【００４４】
従って、本発明により処置できる膀胱腫瘍又は癌は、表在性（Ｔａ、Ｔ１）又は浸潤性（Ｔ２からＴ４）でありうる。特定の態様において、本発明により処置できる膀胱癌は、任意の、及び、全てのＴサブステージでありうる。
【００４５】
しかし、膀胱癌の他の病期、特にＮ期及びＭ期も本発明で予定される。
【００４６】
本発明は、さらに、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、突然変異型ＦＧＦＲ３を発現する細胞を候補化合物と接触させること、及び、軟寒天中での細胞の増殖及び／又はコロニー形成能を低減又は抑制する候補化合物を選択することを含む。
【００４７】
本発明は、また、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、候補化合物を、突然変異型ＦＧＦＲ３発現細胞を伴う異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスへ投与すること、一定期間後に異種移植片の腫瘍のサイズを測ること、及び、腫瘍増殖を低減又は遮断する候補化合物を選択することを含む。
【００４８】
本発明は、さらに、ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理を処置するために適した化合物を同定／スクリーニングするための方法に関し、候補化合物を突然変異型ＦＧＦＲ３発現トランスジェニック非ヒト動物へ投与すること、及び、腫瘍細胞の増殖を低減又は抑制する候補化合物を選択することを含む。
【００４９】
ｐ３８インヒビター
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼｐ３８は、本来は、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した単球から単離されたセリン／スレオニンキナーゼである。４つのアイソフォーム、即ちｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、及びｐ３８δが存在する。ｐ３８αは、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４）、ＣＳＢＰ、又はＳＡＰＫ２Ａ（ＧｅｎｅＩＤ： １４３２ ； Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１６５３９）と呼ぶこともできる。このアイソフォームは炎症での治療標的である。従って、多くのｐ３８αインヒビターが開発されてきた。
【００５０】
ｐ３８αインヒビターは、小分子、ｓｉＲＮＡ（例、ＵＳ２００５／０２３９７３１；ＷＯ０４／０９７０２０；ＷＯ０３／０７２５９０）、アンチセンス、リボザイム、又は抗体でありうる。
【００５１】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは、例えば実施例において記載するｓｉＲＮＡである。
【００５２】
好ましい態様において、ｐ３８αインヒビターは小分子である。本発明において使用できるｐ３８αインヒビターの例は、それらに限定されないが、
【表４】
からなる群より選択される。他のｐ３８αインヒビターが、以下の特許及び特許出願において記載される：
【表５】
それらの開示は全てが、その全体において参照により本明細書に組み入れられる。
【００５３】
アイソフォームαに対して選択的なｐ３８αインヒビターが本発明において好ましい。そのようなｐ３８αの特異性によって、他のｐ３８アイソフォームの抑制に起因する任意の潜在的な副作用が回避される。「に対して選択的」により、インヒビターが、ｐ３８の他のアイソフォームの少なくとも１つ、好ましくは３つの他のアイソフォームよりもｐ３８αの抑制においてより効率的であることを意図する。より好ましくは、選択的ｐ３８αインヒビターは、処置のために使用する治療的有効量で、他のアイソフォームに対する抑制効果をほとんど有さず、さらにより好ましくは全く抑制効果を有さない。特定の態様において、インヒビターのＩＣ５０は、ｐ３８αでのＩＣ５０と比較して、他のｐ３８アイソフォームで少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、又は１００００倍高い（ＩＣ５０は、ｐ３８αキナーゼ活性の５０％抑制を有するために必要な用量である）。本発明において使用できるｐ３８αインヒビターの例は、それらに限定されないが、
【表６】
からなる群より選択される。
【００５４】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、投与方法、被験体の年齢、体重、性別、及び全般的な健康状態に応じて変動する。所与の適用のために治療的有効量を決定するための、当技術分野において公知の多くの方法が存在しうることが認められる。
【００５５】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、好ましくは、細胞増殖、好ましくは癌細胞増殖を抑制するため、及び／又は腫瘍増殖を低減又は遮断するため、及び／又は形質転換の表現型を低減又は抑制するため、及び／又は軟寒天中での細胞のコロニー形成能を低減又は抑制するために十分な量である。
【００５６】
適切な用量は０．０１から１０００mg/日まででよい。例えば、ＡＭＧ ５４８の用量は、経口投与による０．１mgから１０００mg/日まで、好ましくは１から５００mg/日の間でよい。ＢＩＲＢ７９６の用量は、経口投与による０．１mgから５００mg/日まで、好ましくは１０から２００mg/日の間でよい。
【００５７】
ｐ３８αインヒビターの治療的有効量は、１日に１回、２回、３回、又は４回投与できる。あるいは、ｐ３８αインヒビターの治療的効果量は、毎日、隔日、又は週に１、２、もしくは３回投与できる。
【００５８】
ｐ３８αインヒビターは、経口、非経口、吸入噴霧により、局所、直腸、経鼻、口腔、経膣により、又は埋込型リザーバー（implanted reservoir）を介して投与できる。本明細書において使用する「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、及び病巣内を含む。好ましくは、ｐ３８αインヒビターは、経口、腹腔内、腫瘍内、関節内、滑液嚢内、局所、又は静脈内投与する。
【００５９】
本発明において使用するｐ３８αインヒビターは、薬学的に許容可能な担体を一般的に含む薬学的組成物として製剤化できる。薬学的に許容可能な担体は、処置する哺乳動物に生理学的に許容可能であり、それが共に投与される薬物の治療特性を保持している担体を意図する。例えば、薬学的に許容可能な担体は生理食塩水でありうる。他の薬学的に許容可能な担体は、当業者に公知であり、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins)”において記載されている。
【００６０】
良性皮膚癌では、局所投与が好ましい。皮膚への局所的な適用では、ｐ３８αインヒビターは、担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む、適した軟膏と共に製剤化されるであろう。本発明の化合物の局所投与のための担体として、限定はされないが、鉱油、液化石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水が挙げられる。あるいは、ｐ３８αインヒビターは、担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む、適したローション又はクリームと共に製剤化できる。適した担体として、限定はされないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられる。局所−経皮パッチ及びイオン注入投与も本発明に含まれる。
【００６１】
経口投与に適したｐ３８αインヒビターは、所定量の活性成分をそれぞれ含むカプセル剤、分包剤、又は錠剤などの別々の単位として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁剤として；又は水中油型乳濁剤もしくは油中水型乳濁剤として、又はリポソーム中に梱包して、及びボーラスなどとして提供してよい。ソフトゼラチンカプセルはそのような懸濁剤を含めるために有用となりうるが、それは化合物の吸収速度を増大するために有益となりうる。
【００６２】
非経口投与に適した組成物として、対象とするレシピエントの血液と等張の製剤を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び溶質を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液；ならびに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液が挙げられる。製剤は単回用量又は複数回用量の容器中、例えば、密封アンプル及びバイアル中で提供でき、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存できる。即時注射液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製できる。
【００６３】
ＦＧＦＲ３突然変異に関連する病理
ＦＧＦＲ３は繊維芽細胞増殖因子受容体３を指す。特に、ＦＧＦＲ３が癌及び良性皮膚腫瘍におけるＦＧＦＲ３ｂアイソフォームであるのに対し、それは骨格病理においてＦＧＦＲ３ｃの好ましいアイソフォームである。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂアイソフォームのヌクレオチド配列は、欧州特許第１ ２０８ ２３１ Ｂ１号において記載される。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃアイソフォームのヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅｂａｎｋにおいてＮＭ＿０００１４２と呼ばれる配列である。
【００６４】
ＦＧＦＲ３突然変異は、好ましくは、活性化突然変異である。「活性化突然変異」により、本明細書において突然変異の活性化機能を意図し、それは、受容体リン酸化又はカルシウム流入としての間接的効果、標的配列のリン酸化などの活性化シグナルの観察により決定できる。特定の態様において、標的配列はｐ３８αである。
【００６５】
活性化ＦＧＦＲ３突然変異は、一般的に、ＦＧＦＲ３の免疫グロブリン様ドメインＩＩ及びＩＩＩの間の接合部をコード化するエクソン７中、膜貫通ドメインをコード化するエクソン１０中、チロシンキナーゼドメインＩをコード化するエクソン１５中、及び／又はＣ末端部分をコード化するエクソン中にある。好ましくは、前記突然変異は、
【表７】
からなる群より選択される。コドン及び突然変異型ヌクレオチド（ｎｔ位置）に、上皮細胞における優勢型であるＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに従って番号を付ける。より好ましくは、ＦＧＦＲ３突然変異は、Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７２Ｃ、Ｋ６５２Ｅ、及びＹ３７５Ｃからなる群より選択される。さらにより好ましくは、ＦＧＦＲ３突然変異はＳ２４９Ｃ又はＹ３７５Ｃである。
【００６６】
ＲＡＳタンパク質
ＲＡＳは、シグナル伝達、特にＦＧＦ受容体を含むチロシンキナーゼ受容体のシグナル伝達に関与するタンパク質（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ）のファミリーを指す（Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J, 2005, Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-49）。それらは２つの異なる状態、ＧＴＰに結合した活性状態及びＲＡＳのＧＴＰａｓｅ活性のためにＧＴＰがＧＤＰに変換された不活性状態で存在する。膀胱癌を含む癌において、全て３つのＲＡＳ遺伝子の突然変異型が記載されている。これらの突然変異型はより低いＧＴＰａｓｅ活性を有し、そのためそれらは活性状態のままである。膀胱癌におけるＲＡＳ突然変異（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳ突然変異）の１７％の推定率は、Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｓｍｉｃデータベース（www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/）から推定できる。例えば、ＲＡＳ突然変異は、ＨＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｓ及びＧ１３Ｖ、ＫＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｃ及びＧ１２ＤならびにＮＲＡＳ突然変異Ｍ７２Ｉの間で選択できる。しかし、突然変異に加えて、ＲＡＳの過剰発現も検討する。
【００６７】
ＲＡＳは以下の配列により例示できる：
【表８】
【００６８】
ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳの異なる活性化突然変異に関する参考文献は、www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/及びSchubbertら(2007)の概説（Schubbert S, Shannon K, Bollag G, 2007. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 7: 295-308）において見出すことができる。
【００６９】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために有用であり、しかし、同時に、その任意の限定を構成しない。それとは逆に、手段を様々な他の態様、改変、及びその同等物に加えることができ、それらは、本明細書における記載を読んだ後に、当業者に、本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それら自体を示唆しうることが明確に理解されるはずである。
【００７０】
材料＆方法
細胞培養及びトランスフェクション
野生型ＦＧＦＲ３ｂアイソフォーム（クローンＲ３ｂ１．１、Ｒ３ｂ１．３）を発現する、もしくは突然変異型ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ受容体（クローンＳ２４９Ｃ１．１、Ｓ２４９Ｃ １．２）を発現するトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又は、対照ｐｃＤＮＡＩ−Ｎｅｏプラスミド（クローンＮｅｏ１．５、Ｎｅｏ２．１）でトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を先に樹立し｛Bernard-Pierrot, 2006, Carcinogenesis 4, 740-747｝、１０％ウシ新生児血清、２mMグルタミン、１００u/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、４００μg/ml Ｇ４１８を伴うＤＭＥＭ中で培養した。ヒト膀胱癌細胞株ＭＧＨ−Ｕ３｛Lin, 1985 #96｝を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２mMグルタミンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。全ての細胞を３７℃で５％ ＣＯ２を含む空気中で培養した。
【００７１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、ＭＧＨ−Ｕ３細胞を８０００個細胞／ｃｍ２の密度で６ウェル又は２４ウェルプレート中に播種し、製造者のプロトコールに従い、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）を使用して２００nM ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＦＧＦＲ３ ｓｉＲＮＡｓ、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）ｓｉＲＮＡｓ、及び対照として使用したナンセンスｓｉＲＮＡは化学的に合成した（Ambion, Huntingdon, United Kingdom）。ｐ３８α ｓｉＲＮＡに関して、本発明者らは、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）検証済みｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）：ｐ３８α ｓｉＲＮＡ１（ｓｉＲＮＡ ＩＤ： １３１２）及びｐ３８α ｓｉＲＮＡ２（ｓｉＲＮＡ ＩＤ： １２１７）を使用した。他のｓｉＲＮＡでは、センス鎖の配列は：
【表９】
であった。本発明者らは、両方のＦＧＦＲ３ ｓｉＲＮＡがＭＧＨ−Ｕ３細胞においてＦＧＦＲ３タンパク質の８０−９０％の欠乏を導くことを先に示していた｛Bernard-Pierrot, 2005｝。彼らは、トランスフェクションから７２時間後のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の取り込みを測定し（２４ウェルプレート）、細胞増殖／生存を評価し、又は、溶解バッファーでそれらを溶解した（６ウェルプレート）。
【００７２】
形態分析
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を異なるインヒビターＳＢ２０３５８０及びＳＵ５４０２（Calbiochem, Merck Eurolab, Fontenay Sous Bois, France）の存在下で４８時間培養し、位相差顕微鏡を使用して写真を撮った。
【００７３】
イムノブロット分析
トランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２４時間血清飢餓した。必要な場合、細胞を５０μg/mlヘパリンの存在下で、３７℃で、２０ng/ml ＦＧＦ１で５分間刺激した。それらを次に溶解バッファー（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ、１mM Ｎａ３ＶＯ４、５mM ＮａＦ、１μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、及び１μg/mlペプスタチン）中で溶解し、ライセートを遠心分離により清澄化した。上精のタンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（BioRad, Ivry sur Seine, France）で決定した。全細胞ライセートからのタンパク質（７５μgタンパク質）を１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、２５mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３）、２００mMグリシン、１０％エタノール中で Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にエレクトロトランスファーし、ｐ３８（＃９２１２）、Ａｋｔ（＃９２７２）、ｐ４２／ｐ４４（＃９１０２）、及び３つのタンパク質のリン酸化（ホスホＡＫＴ （Ｔｈｒ３０８） ＃９２７５；ホスホｐ４２／ｐ４４（ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４）＃ ９１０１；ホスホｐ３８（ｔｈｒ１８０／ｔｙｒ１８２）（Cell Signaling Technology , Ozyme, Montigny le Bretonneux, France）に対する抗体を使用して分析した。
【００７４】
ＭＧＨ−Ｕ３全細胞ライセート（７５μg）をｐ３８、ホスホ−ｐ３８、及びＡｋｔに対する抗体を使用して同様に分析した。
【００７５】
軟寒天アッセイ
ＮＩＨ−３Ｔ３では、３０，０００個のトランスフェクト細胞を、トリプリケートで、１０％ ＮＣＳを添加し、寒天で凝固したＤＭＥＭを含む１２ウェルプレートの各々のウェルに加えた。ＭＧＨ−Ｕ３では、２０，０００個の非トランスフェクト又はｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞を、トリプリケートで、１０％ＦＣＳ及び寒天を添加したＭＥＭを含む１２ウェルプレートのウェルに加えた。必要な場合、両方の細胞型を、寒天中及び培養液中での異なるインヒビターの存在下又は不在において培養した。同量のインヒビターを週１回培養液に加えた。
【００７６】
プレートをＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びＭＧＨ−Ｕ３細胞についてそれぞれ２１日間又は１４日間インキュベートし、次に、測定格子を備えた位相差顕微鏡を使用して、直径が５０μmより大きいコロニーを陽性と記録した。
【００７７】
ヌードマウスにおける腫瘍形成
１０匹の６週齢雌Ｓｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウスをＣｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設において特定病原体除去条件で飼育した。それらの世話及び収容は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ministere de l'Agriculture et de la Foret, Direction de la Sante et de la Protection Animale, Paris, France）の施設ガイドラインに従い、許可を受けた研究者により管理された。各マウスの各側腹部（背部）に４ ｘ １０６個細胞／部位を皮下注射した。腫瘍が５０mm３（＋／− １０）に達した時、マウスを無作為に５匹のマウスの２群に分けた。１００μlの２０μM ＳＢ２０３５８０又は当容積のＰＢＳを毎日腫瘍中に投与した。腫瘍形成を２５日までモニターし、腫瘍のサイズをノギスで測定した：２つの垂直直径を使用して、式ａｂ２／２により腫瘍容積を推定し、式中、ａは最大径、ｂは最小径である。
【００７８】
トランスジェニックマウス
表皮の基底細胞において突然変異型受容体ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃを発現するトランスジェニックマウス（Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ）を先に樹立した（Logie et al 2005, Hum. Mol. Genet. 14, 1153-1160）。４０μlの１００μM ＳＵ５４０２もしくは１００μM ＳＢ２０３５８０又は賦形剤（アセトン）を２週間毎日、口吻に表皮腫瘍を発生した３から４ヵ月齢のトランスジェニックマウス又は対照同腹仔マウスの口吻に適用した。屠殺の２時間前に、マウスに０．２５mg/g体重のＢｒｄｕ（Sigma, Saint-Quentin Falavier, France）を注射（腹腔内）した。Ｂｒｄｕ免疫組織化学的検査を、パラフィン包埋した口吻組織上で、製造業者の指示に従いＢｒｄＵ ｉｎ ｓｉｔｕ検出キット（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）で実施した。基底表皮層からの５００個の細胞中のＢｒｄＵ標識細胞数を、各々のマウスについて決定した。全口吻細胞ライセート（７５μg）を、上記の通りに、ｐ３８及びホスホ−ｐ３８（Ｐｐ３８）に対する抗体を使用して分析した。
【００７９】
結果
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃ誘発性のＮＩＨ−３Ｔ３細胞形質転換は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ依存的である。
本発明者らは、突然変異型ＦＧＦＲ３ｂに反して、そのリガンドの１つにより活性化された野生型ＦＧＦＲ３ｂでさえ、両方の受容体のリン酸化レベルが同様であったにもかかわらず、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を形質転換しなかったことを先に示している｛Bernard-Pierrot, 2005｝。本発明者らは、（突然変異型及びリガンド刺激された）２つの受容体が異なる伝達経路を活性化できうるとの仮説を立て、観察された形質転換活性における差を説明している。
【００８０】
本発明者らは、変異ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）及び野生型受容体を発現するＦＧＦ１刺激されたクローン（Ｒ３ｂ１．１及びＲ３ｂ１．３）における３つのシグナル伝達経路の活性化を初めて検討した（図１Ａ）。
【００８１】
変異ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃを発現するクローン（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）及び野生型受容体を発現するＦＧＦ１刺激されたクローン（Ｒ３ｂ１．１及びＲ３ｂ１．３）の両方が、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４）をリン酸化できたが、しかし、突然変異型受容体がこれらの経路の持続性の活性化を誘発したのに対し、刺激された受容体がこれらの経路の一過性の活性化を誘発したことは注目すべきである（データ未掲載）。この矛盾によって、観察された２つの受容体の形質転換能における差を説明できた。さらに、興味深いことに、本発明者らは、変異受容体を発現しているクローンにおいてのみｐ３８の強いリン酸化を検出し、ＦＧＦ１により刺激したＦＧＦＲ３発現クローンにおいてはされず（図１Ａ）（クローンを４８時間中にＦＧＦ１により刺激し、ＦＧＦＲ３の持続性の活性化を模倣した場合でさえ（データ未掲載））、突然変異型ＦＧＦＲ３によるｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の特異的活性化及びＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性の細胞形質転換におけるこの経路の関与を示唆した。
【００８２】
ｐ３８活性化が、安定的に樹立したＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現ＮＩＨ−３Ｔ３クローンにおけるＦＧＦＲ３活性化に起因したことを確認するために、本発明者は、ＦＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるＳＵ５４０２で処置した２つのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現クローン（Ｓ２４９Ｃ１．１及びＳ２４９Ｃ１．２）におけるｐ３８リン酸化を研究した。予測された通り、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現クローンにおけるｐ３８リン酸化は３０μM ＳＵ５４０２の存在下で抑制され、ｐ３８活性化がＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ活性化にまさしく依存していることを実証した（図１Ｂ）。
【００８３】
細胞形質転換におけるＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ誘発性ｐ３８リン酸化の機能的意義を評価するために、彼らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに特異的な化学インヒビターであるＳＢ２０３５８０がクローンＳ２４９Ｃ１．２の形態及び足場非依存性増殖に及ぼす効果を評価した。対照として、本発明者らはＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性のインヒビターであるＳＵ５４０２の効果も評価した。３０μM ＳＢ２０３５８０又は３０μM ＳＵ５４０２でのＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞の処置によって、それらの形質転換の表現型が逆転したが（図１Ｃ）、両方の薬物は対象である細胞表現型には効果を有さなかった（データ未掲載）。両方の処置によって軟寒天アッセイにおいてコロニーを形成するＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現細胞の能力も抑制された（図１Ｄ）。これらの結果によって、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の形質転換がＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性に起因すること、及び、それがｐ３８依存的であることが実証される。
【００８４】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃによるｐ３８活性化には、ＭＧＨ−Ｕ３細胞の増殖及び形質転換が必要とされる。
本発明者らは、次に、突然変異型ＦＧＦＲ３誘発性の細胞形質転換におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼのこの関与が、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に特異的であり、上皮細胞株において生物学的により有意であるのではないかと考えた。彼らは、膀胱癌細胞であるＭＧＨ−Ｕ３の腫瘍特性が突然変異型受容体活性（ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃ）に依存することを先に実証していたため｛Bernard-Pierrot, 2005｝、彼らは突然変異型ＦＧＦＲ３がこの細胞株においてｐ３８活性化を誘発するか否かを調べた。
【００８５】
免疫ブロット分析によってＭＧＨ−Ｕ３細胞におけるｐ３８の強いリン酸化が示され（図２Ａ）、このｐ３８活性化がＦＧＦＲ３−Ｙ３７５Ｃ活性に起因することを実証したが、それは、ＳＵ５４０２でのＦＧＦＲ３チロシンキナーゼ抑制又はｓｉＲＮＡ処置後のＦＧＦＲ３発現における低下によってｐ３８リン酸化が抑えられたためである（図２Ａ）。
【００８６】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｙ３７５Ｃによるｐ３８活性化の役割を調べるために、本発明者らは、ＭＧＨ−Ｕ３細胞の増殖及び足場非依存性増殖に及ぼすｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターＳＢ２０３５８０の効果を評価した。対照として、彼らはＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性のインヒビターであるＳＵ５４０２の効果も評価した。ＭＴＴの取り込みによって、両方のインヒビターでの膀胱癌細胞における４０から５０％の増殖抑制が実証され（図２Ｂ）、ＳＢ２０３５８０処置細胞は軟寒天上で対照細胞の３分の１のコロニーを形成した（図２Ｃ）。しかし、ＳＢ２０３５８０が特異的にｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）及びｐ３８β（ＭＡＰＫ１１）を抑制する場合でさえ、この特異性についてのいくらかの疑念が生じうる。それ故、観察されたｐ３８不活化の効果を確認するために、本発明者らは、ＭＧＨ−Ｕ３細胞増殖及び形質転換に及ぼすｓｉＲＮＡを使用したｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）欠乏の効果を評価した。実際に、ＭＧＨ−Ｕ３細胞はｐ３８β（ＭＡＰＫ１１）ｍＲＮＡを発現せず（データ未掲載）、ＳＢ２０３５８０を使用して観察された効果がｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）活性の抑制に起因すると考えられた。免疫ブロット分析によって、トランスフェクションから４８時間後、両方のｐ３８α ｓｉＲＮＡｓが９０から１００％のｐ３８α発現抑制を誘発することが示された（挿入図、図２Ｂ）。ｐ３８α ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞での５０から６０％の増殖抑制（図２Ｂ）及び７０から８０％の足場非依存性増殖（図２Ｃ）が観察された。このように、ｐ３８α発現又は活性における低下は、インビトロでＭＧＨ−Ｕ３膀胱癌細胞における細胞増殖及び細胞形質転換の抑制を導く。
【００８７】
さらに、ＳＢ２０３５８０での腫瘍内処置によって無胸腺ヌードマウスにおけるＭＧＨ−Ｕ３異種移植片の増殖が有意に低減され、それ故、インビボでのＭＧＨ−Ｕ３細胞形質転換におけるｐ３８活性化の関与が実証された（図２Ｄ）。
【００８８】
ＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃによるｐ３８活性化は、Ｋ５−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃトランスジェニックマウスの表皮性口吻腫瘍における基底上皮細胞の過剰増殖を誘発するために必要とされる。
本発明者らはトランスジェニックマウスモデルを先に樹立しており、それにおいて、彼らはケラチン（keratine）５プロモーターを使用して表皮の基底細胞に対して突然変異型ＦＧＦＲ３ｂであるＦＧＦＲ３ｂ−Ｓ２４９Ｃの発現を標的とした｛Logie, 2005, Hum. Mol. Genet. 14, 1153-1160｝。これらのマウスは、特に口吻で良性の表皮性腫瘍を発生した（図３Ａ）。本発明者は、このように、このモデルにおいて、腫瘍細胞の増殖が突然変異型ＦＧＦＲ３ｂによるｐ３８活性化にも起因しうるのではないかと考えた。最初に、本発明者らは、免疫ブロット分析により、ｐ３８がトランスジェニックマウスの口吻ライセート中でリン酸化されたのに対し、リン酸化は対照同腹仔マウスの口吻においては観察されないことを示し、ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ発現がトランスジェニックマウスの口吻においてｐ３８活性化を導くことを示唆する（図３Ｂ）。この結果を検証するために、トランスジェニックマウスの口吻をＦＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるＳＵ５４０２で処置し、ｐ３８のリン酸化状態を評価した。免疫ブロット分析によってＦＧＦＲ３抑制時でのｐ３８リン酸化における低下が示され、故に、突然変異型ＦＧＦＲ３がトランスジェニックマウスの口吻細胞においてｐ３８経路をまさしく活性化することを実証した（図３Ｃ）。次に、本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターであるＳＢ２０３５８０での口吻処置によって、ＢｒｄＵ標識により評価された通り、トランスジェニックマウスの腫瘍細胞の増殖における有意な低下が誘発されるのに対し、それは対照マウスでの基底表皮細胞の増殖に及ぼす効果を有さないことを実証した（図３Ｄ）。まとめると、それらの結果によって、基底表皮細胞における突然変異型ＦＧＦＲ３ｂ によるＰ３８ＭＡＰキナーゼ経路の活性化及び我々の皮膚マウス腫瘍モデルにおける表皮腫瘍細胞の増殖におけるその関与が明確に指摘された。
【００８９】
ヒト膀胱腫瘍におけるＰ３８活性化
本発明者らは、異なるインビトロ及びインビボのモデルにおいて、突然変異型ＦＧＦＲ３発現がｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を導き、それは突然変異型ＦＧＦＲ３が細胞形質転換を誘発するために必要とされることを明確に実証した。
【００９０】
それ故、彼らは、突然変異型ＦＧＦＲ３もヒト膀胱腫瘍においてｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化を導くのではないかと考えた。従って、彼らは、抗ホスホ−ｐ３８抗体及び抗ｐ３８抗体を使用したウエスタン−ブロットにより、異なる病期及び悪性度、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異状態のヒト膀胱腫瘍において、ｐ３８のリン酸化状態を調べた（図４）。全てのＦＧＦＲ３突然変異型腫瘍がｐ３８の強いリン酸化を呈したが、しかし、興味深いことに、ＦＧＦＲ３突然変異のない腫瘍のほぼ半分もｐ３８ＭＡＰキナーゼの強い活性化を呈した。印象的なのは、ＲＡＳ突然変異を呈する全ての腫瘍が、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの強い活性化を呈した。ＲＡＳ突然変異を有し、リン酸化ｐ３８を示す５サンプル中の２つがＨＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｓ及びＧ１３Ｖを有し、他の２つがＫＲＡＳ突然変異Ｇ１２Ｃ及びＧ１２Ｄを有し、１つがＮＲＡＳ突然変異Ｍ７２Ｉを有する。いかなる理論にも束縛されることなく、ＲＡＳはＦＧＦＲ３経路に属すると考えられ、それは１）異なるチロシンキナーゼ受容体の公知の伝達経路、２）両方のタンパク質の突然変異が独占的であるためである。それ故、ＦＧＦＲ３突然変異よりも一般的に、ヒト膀胱腫瘍中のＦＧＦＲ３経路における変化は、ｐ３８α活性化に関連付けられる可能性が高いと思われる。
【００９１】
従って、ｐ３８α活性化がＦＧＦＲ３突然変異よりも多くのヒト膀胱腫瘍において観察され、それ故、ｐ３８αインヒビターがＦＧＦＲ３突然変異型腫瘍においてだけでなく、これら全ての腫瘍において使用できた。
【００９２】
本発明者らは、３つの異なるモデルにおいて、突然変異型ＦＧＦＲ３発現がｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を導き、それは突然変異型ＦＧＦＲ３が細胞形質転換を誘発するために必要とされることを明確に実証した。本発明者らが、ｐ３８α及びβアイソフォームにより特異的なインヒビターであるＳＢ２０３５８０を使用したことから、これが、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びトランスジェニックマウス表皮におけるＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ形質転換活性に関与するこれらの２つのｐ３８アイソフォームの１つであることが推測できた。本発明者らは、特異的ｓｉＲＮＡを使用して、ｐ３８αがＭＧＨ−Ｕ３細胞の形質転換に関与することを実証した。加えて、ｐ３８αがヒト膀胱尿路上皮において発現する主な形状であるとの事実（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ９５、データ未掲載）によって、ｐ３８αが標的とするタンパク質であることが実証される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱腫瘍又は癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用。
【請求項２】
ｐ３８αインヒビターが、
【表１０】
からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ｐ３８αインヒビターが、ｐ３８αに特異的である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
特異的ｐ３８αインヒビターが、
【表１１】
からなる群において選択される、請求項３記載の使用。
【請求項５】
ｐ３８αインヒビターが、ｐ３８αに対して向けたｓｉＲＮＡである、請求項１記載の使用。
【請求項６】
ｐ３８αインヒビターが、アンチセンス、抗体及びリボザイムからなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項７】
リン酸化ｐ３８αが、処置する被験体からのサンプルにおいて検出される、請求項１−６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
膀胱癌が、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する、請求項７記載の使用。
【請求項９】
処置する被験体が、好ましくは病理に罹患した組織において突然変異型ＦＧＦＲ３を有する、請求項１−８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ３突然変異が、
【表１２】
からなる群より選択される、請求項１−９のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
ｐ３８αインヒビターが、経口、局所、又は非経口で投与される、請求項１−１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体を選択すること、を含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法。
【請求項１３】
ＦＧＦＲ３突然変異が、
【表１３】
からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１】
膀胱腫瘍又は癌を処置するための医薬を調製するためのｐ３８αインヒビターの使用。
【請求項２】
ｐ３８αインヒビターが、
【表１０】
からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ｐ３８αインヒビターが、ｐ３８αに特異的である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
特異的ｐ３８αインヒビターが、
【表１１】
からなる群において選択される、請求項３記載の使用。
【請求項５】
ｐ３８αインヒビターが、ｐ３８αに対して向けたｓｉＲＮＡである、請求項１記載の使用。
【請求項６】
ｐ３８αインヒビターが、アンチセンス、抗体及びリボザイムからなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項７】
リン酸化ｐ３８αが、処置する被験体からのサンプルにおいて検出される、請求項１−６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
膀胱癌が、ＦＧＦＲ３又はＲＡＳの突然変異に関連する、請求項７記載の使用。
【請求項９】
処置する被験体が、好ましくは病理に罹患した組織において突然変異型ＦＧＦＲ３を有する、請求項１−８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ３突然変異が、
【表１２】
からなる群より選択される、請求項１−９のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
ｐ３８αインヒビターが、経口、局所、又は非経口で投与される、請求項１−１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
被験体からのサンプルにおいてＦＧＦＲ３又はＲＡＳが突然変異を有するか否かを決定すること、及び、突然変異型ＦＧＦＲ３又はＲＡＳを有する被験体を選択すること、を含む、ｐ３８αインヒビターにより処置するのに適した膀胱癌又は腫瘍を患う被験体を選択するための方法。
【請求項１３】
ＦＧＦＲ３突然変異が、
【表１３】
からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５２９９５３（Ｐ２０１０−５２９９５３Ａ）
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８８１０（Ｐ２０１０−５０８８１０）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５６０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４２０３１
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５９１１４０１２３）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ − ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【出願人】（５０９３１９２１４）ユニヴェルシテ・パリ・１２ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ １２
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５６０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４２０３１
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５９１１４０１２３）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ − ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【出願人】（５０９３１９２１４）ユニヴェルシテ・パリ・１２ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ １２
【Ｆターム（参考）】
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