顕微鏡システム、標本画像生成方法及びプログラム
【課題】多重染色標本に対し、標的分子を蛍光観察する際の合焦位置を短時間に精度よく検出することができる顕微鏡システム等を提供する。
【解決手段】細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野ＶＳ撮像制御部２７２と、標本に対する蛍光観察により、標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光ＶＳ撮像制御部２７３と、明視野観察の際に用いられる標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、第１の合焦位置を用いて、蛍光観察の際に用いられる標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得部２７４とを備える。
【解決手段】細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野ＶＳ撮像制御部２７２と、標本に対する蛍光観察により、標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光ＶＳ撮像制御部２７３と、明視野観察の際に用いられる標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、第１の合焦位置を用いて、蛍光観察の際に用いられる標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得部２７４とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡を用いて標本を撮像した標本画像を取得して表示する顕微鏡システム、並びに、標本画像生成方法及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を用いて標本を観察する場合、一度に観察できる範囲は主に対物レンズの倍率によって決まる。例えば対物レンズの倍率を高くすると、高精細な画像が得られる反面、観察範囲が狭くなってしまう。そこで、電動ステージ等を利用して視野を移動しながら、複数枚の画像を撮影し、それらを貼合わせる（又は結合する）ことで、広視野かつ高解像度の顕微鏡画像を作成し、病理診断等に活用するシステム（以下、バーチャル顕微鏡システムと言う）が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１及び２には、標本の範囲を小区画に分割し、各小区画に対応する標本の部分を高解像度の対物レンズで撮影して得られた画像を繋ぎ合わせることにより、広視野且つ高解像度の標本全体の画像を構築する顕微鏡システムが開示されている。以下、このようにして構築された顕微鏡のことをバーチャルスライド（ＶＳ：Virtual Slide）画像という。同様に、特許文献３及び４にも、広視野かつ高解像度の顕微鏡画像を作成する顕微鏡システムが開示されている。
【０００４】
このように標本全体を高精細に画像化したＶＳ画像は、例えばパソコンとネットワーク環境があれば、場所や時間を問わずに閲覧することが可能となる。そのため、医学生の病理学実習や、病理医間での遠隔コンサルテーション等にも活用され始めている。なお、ＶＳ画像は、ホール・スライド・イメージング（Whole Slide Imaging）とも呼ばれる。
【０００５】
ところで、病理観察においては、観察対象や目的に応じて種々の染色手法や観察法が用いられる。例えば組織や細胞の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリン及びエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（以下、「ＨＥ染色」と記す）や、パパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等の非蛍光染色が知られている。このような形態観察染色がなされた標本に対しては、光学顕微鏡による明視野観察が行われる。
【０００６】
また、病理観察においては、形態情報に基づく形態診断を補完する目的で、標本に分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、標的分子（特定の遺伝子やタンパク）の発現異常といった機能異常を診断する分子学的病理検査が行われることもある。この場合、例えば、ＩＨＣ（immunohistochemistry：免疫組織化学）法、ＩＣＣ（immunocytochemistry：免疫細胞化学）法、ＩＳＨ（in situ hybridization）法等で標本に蛍光標識（染色）を施して蛍光観察を行ったり、酵素標識を施して明視野観察を行ったりする。
【０００７】
さらに、病理観察においては、上述した手法を併用して診断を行う場合もある。例えば、ＨＥ染色等を施した標本に対する明視野観察で形態異常の診断を行い、蛍光観察（ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）、蛍光抗体法）で分子発現異常といった機能異常の診断を行うことがある。
【０００８】
近年では、癌等の治療として、特定の分子を標的として作用する治療薬（抗体治療薬）を用いた分子標的治療と呼ばれる治療が行われており、治療効果と副作用の軽減効果とが期待されている。この分子標的治療では、癌細胞に特異的に発現する分子（抗原タンパク質）を標的とする抗体治療薬が用いられる。このような分子標的治療を行う場合、治療に先立って、例えば、細胞の表面、即ち細胞膜上に抗体治療薬の標的分子となる抗原が発現しているか否かをＩＨＣ法等で観察し、適応患者の選択が行われる。
【０００９】
例えば、乳癌治療においては、抗体治療薬を選択的に用いたターゲット治療が進んでおり、腫瘍部における複数の標的分子の発現パターンに応じて病型（細胞亜型）を「Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ」「Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ」「ＨＥＲ２ ｄｉｓｅａｓｅ」「Ｂａｓａｌ ｌｉｋｅ」と称す４つの型に分類し、この分類に基づいて治療法の基本的な選択がなされる。具体的には、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体（以下、「ＥＲ」と略記する。）やプロゲステロン受容体（以下、「ＰｇＲ」と略記する。）の細胞核上での発現の有無によってホルモン依存性に増殖する癌か否かを判断し、内分泌療法（ホルモン療法）の適用可否を選択する。また、ＨＥＲ２受容体（以下、「ＨＥＲ２」と略記する。）の細胞膜上での発現の有無に応じて抗ＨＥＲ２抗体製剤であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の適用可否を選択する。そして、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２のいずれも発現していない所謂トリプルネガティブ乳癌（Ｔriple Ｎegative Ｂreast Ｃancer：ＴＮＢＣ）と呼ばれるタイプでは、化学療法を中心に治療を行う。
【００１０】
このように複数の標的分子を可視化する場合、蛍光観察が有用であるが、一方で、蛍光標本は長期保存ができないといった問題もある。この点において、バーチャル顕微鏡システムによって標本をＶＳ画像化することは、診断の根拠の記録及び保持にもつながり、標本の長期保存に関する問題を考慮する必要がなくなる。
【００１１】
ＶＳ画像に関連する技術として、特許文献５には、明視野観察可能な通常染色と標的分子に対する蛍光標識とを同一のスライド標本に施し、明視野ＶＳ画像上で指定した任意の領域における標的分子の発現を蛍光ＶＳ画像として取得する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平９−２８１４０５号公報
【特許文献２】特開平１０−３３３０５６号公報
【特許文献３】特開２００６−３４３５７３号公報
【特許文献４】特表２００２−５１４３１９号公報
【特許文献５】特開２００９−１４９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、蛍光観察においては、明視野観察と比べて視野が暗いため、１ショットあたりの撮影時間が長くなる。そのため、標本全体をＶＳ画像化しようとすると、通常、数時間以上の時間がかかってしまう。また、分子病理診断において必要とされる検査領域は、主に腫瘍部といった限定された領域であり、正常部位は検査対象外であることが多い。このため、腫瘍部が標本全体の内のごく僅かな領域にしか存在しない場合、ＶＳ画像の取得に際して無駄な時間を費やすだけでなく、不必要な画像容量の増大を招くことにもなる。さらに、蛍光染色を施した標本は未励起状態では無色透明であるため、通常の形態観察染色を施した標本上で明視野観察により腫瘍部の位置を特定したとしても、未励起状態の蛍光標本においてその位置を確認し、標本上の腫瘍部を選択的に撮影することは非常に困難である。
【００１４】
この点について、上記特許文献５においては、明視野ＶＳ画像上で蛍光観察を行う領域を指定するので、蛍光ＶＳ画像の作成処理時間を短縮することができる。しかしながら、特許文献５には、明視野観察と各標的分子に対する蛍光観察とにおけるフォーカス位置（合焦位置）の違いについて言及されていない。
【００１５】
蛍光観察における合焦位置を取得するために、例えば、明視野画像における合焦位置をそのまま流用することが考えられる。しかしながら、この場合、蛍光画像において合焦位置のずれが生じるおそれがある。或いは、蛍光画像の各ショットにおいてオートフォーカス処理を毎回行うことも考えられる。しかしながら、上述のとおり、蛍光観察の際の視野は暗いため、オートフォーカス処理にも時間がかかる。このため、結局、蛍光ＶＳ画像の生成に長時間を要することとなってしまう。
【００１６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察可能な非蛍光染色と標的分子に対する蛍光標識とを同一スライド標本上に施した多重染色標本に対し、標的分子を蛍光観察する際の合焦位置を短時間に精度よく検出することができる顕微鏡システム、標本画像生成方法、及び標本画像生成プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡システムは、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御手段と、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段と、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得手段とを備えることを特徴とする。
【００１８】
上記顕微鏡システムにおいて、前記フォーカス位置取得手段は、前記標本内から前記第１の合焦位置を実測する複数の抽出ポイントを抽出し、該複数の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置を実測により取得すると共に、前記複数の抽出ポイントの内の少なくとも一部における前記第２の合焦位置を実測により取得することを特徴とする。
【００１９】
上記顕微鏡システムにおいて、前記フォーカス位置取得手段は、前記複数の抽出ポイントの各々における前記第２の合焦位置を取得する際に、同一の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置からの所定のオフセットを用いることを特徴とする。
【００２０】
上記顕微鏡システムにおいて、前記標本の観察法に応じて光路に選択的に挿入される光学キューブを切り換える光学キューブ切換部をさらに備え、前記フォーカス位置取得手段は、前記第１の合焦位置を取得する場合に、前記蛍光画像観察用の光学キューブを前記光路に挿入したままの状態で前記第１の合焦位置を実測により取得することを特徴とする。
【００２１】
上記顕微鏡システムにおいて、前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記第１の合焦位置を基準として光軸方向に複数の座標値を設定し、該複数の座標値において複数の蛍光画像をそれぞれ取得する処理を、前記光軸に直交する面を分割した複数の小区画の各々について実行する制御を行い、前記複数の座標値の配列順毎に、互いに隣接する前記小区画に対応する複数の蛍光画像を相互に繋ぎ合わせることにより、複数の蛍光バーチャル画像を作成することを特徴とする。
【００２２】
上記顕微鏡システムにおいて、前記明視野バーチャルスライド画像と前記蛍光バーチャルスライド画像とを重ね合わせた合成画像を作成する画像合成手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２３】
上記顕微鏡システムにおいて、前記標本は、２種類以上の標的分子にそれぞれ対応する２種類以上の蛍光色素により標識がなされており、前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記標的分子の種類ごとに前記蛍光バーチャルスライド画像を取得することを特徴とする。
【００２４】
上記顕微鏡システムにおいて、前記明視野バーチャルスライド画像を用いて、前記標本の内、前記蛍光バーチャルスライド画像の取得対象とする領域を設定する領域設定手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２５】
上記顕微鏡システムにおいて、前記細胞構成要素は細胞核であることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る標本画像生成方法は、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する標本画像生成方法において、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップとを含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る標本画像生成プログラムは、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する処理をコンピュータに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップとを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、明視野観察の際に用いられる第１の合焦位置を取得し、この第１の合焦位置を用いて、蛍光観察の際に用いられる第２の合焦位置を取得するので、多重染色標本を蛍光観察する際の合焦位置を短時間に精度良く検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
【図２】図２は、図１に示すホストシステムの構成例を示すブロック図である。
【図３】図３は、図１に示す顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。
【図４】図４は、標本が配置されたスライドガラスを示す上面図である。
【図５】図５は、標本サーチ領域から検出された標本領域を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、注目領域を格子状に分割した小区画及びフォーカス位置抽出ポイントを示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、注目領域を格子状に分割した小区画及びフォーカス位置抽出ポイントを示す模式図である。
【図７】図７は、フォーカスマップの一例を示す図である。
【図８】図８は、画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。
【図９】図９は、フォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、ポイントＢにおける合焦位置を実測する処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、実施の形態２におけるフォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、実施の形態３において作成される３次元画像の構成を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施の形態３における蛍光画像の取得処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、これらの実施の形態により本発明が限定されるものではない。
本発明に係る顕微鏡システムは、多重染色された病理組織標本又は細胞診標本の全体またはその一部を、顕微鏡を用いて広視野かつ高精細にディジタル画像として記録して表示するものである。より詳細には、本発明に係る顕微鏡システムは、形態観察染色と分子標的染色とが多重に染色された標本を観察及び診断に供するものである。
【００３１】
以下においては、本発明を、バーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システム（バーチャル顕微鏡システム）に適用した場合を例にとって説明する。バーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像とも記す）とは、標本を載置する電動ステージを動かすなどして、顕微鏡の対物レンズ及び標本を対物レンズの光軸に対して直交する方向に相対的に移動させ、視野範囲をずらしながら標本を部分毎に撮像した複数の画像を互いに繋ぎ合わせることによって生成した画像のことである。
【００３２】
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０と、該顕微鏡装置１０とデータ送受可能に接続されたホストシステム２０と、ホストシステム２０の制御の下で顕微鏡装置１０の各部を制御する顕微鏡コントローラ３０と、ホストシステム２０に接続されたテレビ（ＴＶ）カメラコントローラ４０と、顕微鏡装置１０に取り付けられ、ＴＶカメラコントローラ４０の制御の下で動作するテレビ（ＴＶ）カメラ５０とを備える。
【００３３】
顕微鏡装置１０は、標本Ｓが配置されたスライドガラス１００を載置する電動ステージ１１と、側面視略コの字状を有し、電動ステージ１１を支持する顕微鏡本体１２と、顕微鏡本体１２の底部に設けられ、標本Ｓを透過照明する透過照明光学系１３と、顕微鏡本体１２の上部に設けられ、標本Ｓを落射照明する落射照明光学系１４と、顕微鏡本体１２に回転自在に設けられ、複数の対物レンズ１５１が装着されたレボルバ１５と、標本Ｓの観察光の光路Ｌに選択的に挿入される複数の光学キューブ１６１を切り替える光学キューブ切換部１６と、顕微鏡本体１２の上部に載置された鏡筒１７とを備える。以下、図１に示す対物レンズ１５１ａの光軸方向をＺ方向とし、Ｚ方向と直交する平面をＸＹ平面として説明する。また、Ｚ座標は標本面（電動ステージ１１の標本載置面）が対物レンズ１５１から離れる方向を負の方向とし、標本面に近づく方向を正の方向とする。
【００３４】
電動ステージ１１は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１の制御の下で動作するモータ３２、及び、ステージＺ駆動制御部３３の制御の下で動作するモータ３４によって駆動され、ＸＹ平面内及びＺ方向にそれぞれ自在に移動する。また、電動ステージ１１は、原点センサによる原点位置検出機能（不図示）を有し、電動ステージ１１に載置したスライドガラス１００（標本Ｓ）の各部に対して座標を設定することができる。
【００３５】
透過照明光学系１３は、透過照明用光源１３０と、透過照明用光源１３０から射出した照明光（以下、透過照明光という）を集光するコレクタレンズ１３１と、透過用フィルタユニット１３２と、透過シャッタ１３３と、透過視野絞り１３４と、透過開口絞り１３５と、透過照明光の光路Ｌ１を対物レンズ１５１ａの光軸に沿って折り曲げる折曲げミラー１３６と、コンデンサ光学素子ユニット１３７と、トップレンズユニット１３８とを備える。
【００３６】
落射照明光学系１４は、落射照明用光源１４０と、落射照明用光源１４０から射出した照明光（以下、落射照明光という）を集光するコレクタレンズ１４１と、落射用フィルタユニット１４２と、落射シャッタ１４３と、落射視野絞り１４４と、落射開口絞り１４５とを備える。
【００３７】
レボルバ１５には、倍率（観察倍率）が互いに異なる複数の対物レンズ１５１ａ、１５１ｂ、…（これらを総称して対物レンズ１５１ともいう）が装着されている。対物レンズ１５１は、レボルバ１５の回転に応じて択一的に切り換えられて観察光路Ｌに挿入され、標本Ｓの観察に用いられる。なお、図１においては、対物レンズ１５１ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
【００３８】
レボルバ１５は、対物レンズ１５１として、倍率が比較的低い低倍率（例えば２倍、４倍）の対物レンズ（以下、低倍対物レンズという）と、倍率が低倍対物レンズよりも高い高倍率（例えば、１０倍、２０倍、４０倍）の対物レンズ（以下、高倍対物レンズという。）とを少なくとも１つずつ保持している。なお、低倍及び高倍とした倍率は一例であり、少なくとも一方の倍率が他方の倍率に対して高ければよい。
【００３９】
光学キューブ切換部１６は、複数の光学キューブ１６１ａ、１６１ｂ、…（これらを総称して光学キューブ１６１ともいう）を保持しており、検鏡法に応じていずれかの光学キューブ１６１を選択して観察光路Ｌ（より詳細には、観察光路Ｌと落射照明光の光路Ｌ２とが交差する位置）に挿入する。
【００４０】
各光学キューブ１６１は、標本Ｓを染色した蛍光色素の励起波長の光を透過させる励起フィルターと、標本Ｓを染色した全ての蛍光色素の蛍光波長を含む波長の光を透過させる吸収フィルターと、ダイクロイックミラーとをユニット化したものである。観察光路Ｌに挿入された光学キューブ１６１は、落射照明用光源１４０から射出された光の内、標本Ｓを染色した蛍光色素の励起波長成分を反射して標本Ｓの方向に導くと共に、標本Ｓからの反射光の内、標本Ｓで発光した蛍光波長成分を透過させて鏡筒１７の方向に導く。
【００４１】
鏡筒１７には、接眼レンズを内設し、標本Ｓの標本像を目視観察するための双眼部１７１と、ＴＶカメラ５０と、標本Ｓからの観察光を双眼部１７１側とＴＶカメラ５０側とに分岐するビームスプリッタ１７２とが設けられている。
【００４２】
このような顕微鏡装置１０の各部は電動化されており、顕微鏡コントローラ３０の制御の下で動作する。なお、顕微鏡装置１０の各部を、ユーザが手動で操作することも可能である。
【００４３】
ホストシステム２０は、ＣＰＵやビデオボード、メインメモリ等の主記憶装置、ハードディスクや各種記憶媒体等の外部記憶装置、通信装置、表示装置や印刷装置等の出力装置、入力装置、各部を接続し、あるいは外部入力を接続するインターフェース装置等を備えた公知のハードウェア構成（例えば、ワークステーションやパソコン等の汎用コンピュータ）によって実現される。
【００４４】
図２は、ホストシステム２０の構成を示すブロック図である。図２に示すように、ホストシステム２０は、入力部２１と、表示部２２と、画像データ記録部２３と、撮影座標記録部２４と、プログラム記録部２５と、ＴＶカメラ５０から入力されるビデオ信号を処理するビデオボード２６と、これらの各部及び顕微鏡システム全体の動作を制御する制御部２７とを備える。この他、図示はしないが、ホストシステム２０は、図１に示す顕微鏡システムを構成する各部との間で各種データの授受を管理するインタフェースユニットを備える。
【００４５】
入力部２１は、マウスやキーボード等の入力デバイスによって実現される。入力部２１は、ユーザが各種情報や命令をホストシステム２０に入力する際に用いられる。
表示部２２は、ＬＣＤやＥＬディスプレイ等の表示装置によって実現される。
【００４６】
画像データ記録部２３、撮影座標記録部２４、及びプログラム記録部２５は、例えば、更新記録可能なフラッシュメモリ等のＲＯＭやＲＡＭといった各種ＩＣメモリ、内蔵若しくは外付けハードディスク、又は、ＣＤ−ＲＯＭ等の情報記録媒体及びその読取装置によって実現される。画像データ記録部２３は、ＴＶカメラ５０によって標本Ｓを撮影した画像（以下、観察画像ともいう）を記録する。撮影座標記録部２４は、標本Ｓの観察画像を撮影する際のＸＹＺ座標を記録する。プログラム記録部２５は、顕微鏡システム１の動作を制御するための各種制御プログラムや、これらの制御プログラムの実行中に用いられるデータ等を記録する。
【００４７】
制御部２７は、例えば、プログラム記録部２５に記録されている各種制御プログラムをＣＰＵ（中央演算装置）に読み込んで実行することにより実現される。制御部２７は、蛍光ＶＳ画像領域設定部２７１と、明視野ＶＳ画像取得制御手段としての明視野ＶＳ撮像制御部２７２と、蛍光ＶＳ画像取得制御手段としての蛍光ＶＳ撮像制御部２７３と、フォーカス位置取得部２７４と、ＶＳ画像作成部２７５と、画像合成部２７６とを有し、顕微鏡装置１０の動作を制御するための各種制御信号を生成して顕微鏡コントローラ３０に出力する。また、制御部２７は、ＴＶカメラコントローラ４０に制御信号を送信して、ＴＶカメラ５０による撮影を実行させる。
【００４８】
蛍光ＶＳ画像領域設定部２７１は、ユーザ操作による入力部２１からの入力信号に従って、蛍光ＶＳ画像の取得対象とする標本Ｓ上の領域（以下、注目領域ともいう）を設定する。
【００４９】
明視野ＶＳ撮像制御部２７２は、透過照明光学系１３により標本Ｓに透過照明光を照射して、非蛍光色素で染色された細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素（細胞核等。以下、単に細胞構成要素ともいう）に対応する明視野画像を取得する一連の動作を制御する。
【００５０】
蛍光ＶＳ撮像制御部２７３は、落射照明光学系１４により標本Ｓに落射照明光を照射して、蛍光標識された標的分子に対応する蛍光画像を取得する一連の動作を制御する。
【００５１】
フォーカス位置取得部２７４は、標本Ｓの明視野画像及び蛍光画像を取得する際の合焦位置を実測又は演算により取得する。より詳細には、フォーカス位置取得部２７４は、明視野画像用の合焦位置を取得し、この合焦位置を用いて蛍光画像用の合焦位置を取得する。合焦位置の実測は、フォーカス位置取得部２７４が顕微鏡コントローラ３０を介して電動ステージ１１をＺ方向に移動させながら、ＴＶカメラ５０によって撮像された画像のコントラストを各Ｚ座標について評価することにより行われる。なお、この合焦動作は、ビデオＡＦ機能とも呼ばれる。
【００５２】
ＶＳ画像作成部２７５は、顕微鏡装置１０により標本Ｓの注目領域内を部分的に撮像した複数の明視野画像同士を繋ぎ合わせて明視野ＶＳ画像を作成すると共に、標本Ｓの注目領域内を部分的に撮像した複数の蛍光画像同士を繋ぎ合わせて蛍光ＶＳ画像を作成する。
画像合成部２７６は、明視野ＶＳ画像と蛍光ＶＳ画像とを重ね合わせた合成画像を作成する。
【００５３】
顕微鏡コントローラ３０は、ホストシステム２０からの制御信号に応じて、顕微鏡装置１０全体の動作を制御する。具体的には、顕微鏡コントローラ３０は、顕微鏡装置１０に対し、検鏡法（明視野観察／蛍光観察）の変更、透過照明用光源１３０及び落射照明用光源１４０の調光等といった各部の制御、現在の顕微鏡装置１０の各部の状態の検出及びホストシステム２０への送出等を実行する。また、顕微鏡コントローラ３０は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１及びステージＺ駆動制御部３３に対し、電動ステージ１１の移動を制御するための制御信号を出力する。
【００５４】
ＴＶカメラコントローラ４０は、ホストシステム２０からの制御信号に応じて、ＴＶカメラ５０の動作を制御する。具体的には、ＴＶカメラ５０に対し、自動ゲイン制御のＯＮ／ＯＦＦ、ゲイン設定、自動露出制御のＯＮ／ＯＦＦ、及び露光時間の設定等を実行する。
【００５５】
ＴＶカメラ５０は、標本像（詳細には対物レンズ１５１の視野範囲）を結像するＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を備え、標本像を撮像して標本像の画像データをホストシステム２０に出力する。
【００５６】
次に、実施の形態１に係る顕微鏡システム１の動作について説明する。図３は、実施の形態１に係る顕微鏡システム１の動作を示すフローチャートである。なお、以下に説明する顕微鏡装置１０の操作は、基本的にホストシステム２０の制御の下で顕微鏡コントローラ３０を介して自動的になされるが、ユーザが手動で操作しても良い。
【００５７】
まず、ステップＳ１０において、顕微鏡システム１は、観察法を明視野観察に設定し、顕微鏡装置１０の各部に対し、透過明視野観察法を実行するために各種光学部材の光路への挿脱制御を行う。それに応じて、落射シャッタ１４３が落射照明用の光路Ｌ２に挿入され、透過照明用の光路Ｌ１上の透過シャッタ１３３が開放され、明視野観察用の光学キューブ１６１が選択されて観察光路Ｌに挿入される。それにより、透過照明光が標本Ｓに照射される。
続くステップＳ１１において、顕微鏡装置１０は、低倍（例えば４倍）の対物レンズ１５１を光路に挿入する。
【００５８】
ステップＳ１２において、顕微鏡システム１は、標本Ｓ全体に対応する低解像度の明視野画像を取得する。
図４は、標本Ｓが配置されたスライドガラス１００全体を示す上面図である。以下の説明においては、標本Ｓの一例として、多重染色を施した乳癌組織標本を用いる。多重染色としては、形態観察用の染色として、細胞核に対してヘマトキシリン染色を施し、エストロゲン受容体（以下、単にＥＲとも記す）を認識する抗ＥＲ抗体に対してＡｌｅｘａ５５５で蛍光標識を施し、ＨＥＲ２受容体（以下、単にＨＥＲ２とも記す）を認識する抗ＨＥＲ２抗体に対してＣｙ５で蛍光標識を施すものとする。実施の形態１においては、このような標本Ｓに対して明視野（細胞核）観察及び蛍光観察を行う。なお、ラベルＬＢには、標本Ｓに関する情報が記載されている。
【００５９】
このような標本Ｓに対し、顕微鏡装置１０は、スライドガラス１００上の予め定められた標本サーチ領域Ｒ１（例えば、縦：２５ｍｍ、横：５０ｍｍの領域）を、ＴＶカメラ５０に投影される１ショットの撮像領域に応じて複数の区画に分割する。なお、この撮像領域の大きさ（縦×横の長さ）は、観察光路Ｌ上に挿入された対物レンズ１５１の倍率によって決定される。そして、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１をＸＹ方向に移動させ、これらの各区画をＴＶカメラ５０により順次撮像して、複数の顕微鏡画像（明視野画像）の画像データを取得する。ホストシステム２０は、これらの複数の顕微鏡画像を相互に結合することで、標本サーチ領域Ｒ１の全体画像を生成する。この全体画像に対応する画像データは、画像データ記録部２３にスライドガラス全体像ファイルとして記録される。
【００６０】
ステップＳ１３において、顕微鏡装置１０は、レボルバ１５を回転させ、対物レンズ１５１を高倍（例えば２０倍）のものに交換する。ここで高倍のレンズに交換するのは、明視野観察による高解像度の細胞核像と、蛍光観察による標的分子像とを取得するためである。
【００６１】
ステップＳ１４において、顕微鏡システム１は、標本サーチ領域Ｒ１の内、高解像度の明視野観察及び蛍光観察を行う対象とする注目領域を設定し、注目領域内において合焦位置を実測するポイント（以下、フォーカス位置抽出ポイントと呼ぶ）を抽出する。
【００６２】
より詳細には、顕微鏡システム１は、ステップＳ１２において取得した標本サーチ領域Ｒ１の全体画像から、標本Ｓを含む標本領域Ｒ２を自動検出して表示部２２に表示する。図５は、自動検出された標本領域Ｒ２を示す模式図である。なお、標本領域Ｒ２の自動検出方法としては、既知の画像処理方法が用いられる。
【００６３】
このような標本領域Ｒ２が表示された画面上で、ユーザが入力部２１（例えば、マウス等のポインティングデバイス）を用いて矩形の注目領域Ｒ３、Ｒ４を指定すると、ホストシステム２０は、入力部２１からの入力信号に従って、注目領域Ｒ３、Ｒ４の座標を撮像座標記録部２４に一時的に記憶する。注目領域Ｒ３、Ｒ４としては、通常、腫瘍部のように、ユーザが目視により異常を認識した部分を含む領域が指定される。
【００６４】
なお、顕微鏡システム１は、ユーザに注目領域Ｒ３、Ｒ４を選択させる際に、標本サーチ領域Ｒ１全体を表示部２２に表示するようにしても良いし、標本サーチ領域Ｒ１を表示部２２に表示した上で、標本領域Ｒ２をユーザに目視で指定させるようにしても良い。
【００６５】
さらに、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、顕微鏡システム１は、各注目領域Ｒ３、Ｒ４を格子状に分割して複数の小区画Ｐを設定する。各小区画Ｐは、ＴＶカメラ５０に投影される１ショットの撮像領域に対応しており、各小区画Ｐの大きさ（縦×横の長さ）は対物レンズ１５１の倍率によって決定される。従って、小区画Ｐの大きさは、ステップＳ１２において撮像される１つの区画よりも小さくなる。
【００６６】
そして、顕微鏡システム１は、これらの小区画Ｐの内から、合焦位置を実測する複数の小区画（フォーカス位置抽出ポイント）ＦＰを抽出する。
ここで、全ての小区画Ｐについてフォーカス位置を実測で求めようとすると、非常に多くの時間がかかってしまう。そこで、本実施の形態１においては、全ての小区画Ｐの内からフォーカス位置をサンプリング（実測）する小区画を自動抽出し、それ以外の小区画については、サンプリングされた値に基づいて演算により求める。なお、フォーカス位置抽出ポイントの自動抽出方法は任意で良く、ランダムであっても良いし、規則的（例えば３区画おき）であっても良い。
【００６７】
自動抽出されたフォーカス位置抽出ポイントＦＰは、明視野画像を取得する際のフォーカス位置の実測ポイントとして用いられる。また、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントは、好ましくは、明視野画像用のフォーカス位置抽出ポイントＦＰからさらに絞り込まれる。これは、蛍光観察は基本的に暗視野で行われ、撮像に時間がかかるため、フォーカス位置の実測処理においては明視野観察の場合よりも数倍〜数十倍、時間を要するからである。そのため、実施の形態１においては、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイント数を絞ることにより、全体の処理時間の短縮を図っている。なお、明視野画像用のフォーカス位置抽出ポイントＦＰから蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントを抽出する方法は任意で良く、ランダムに抽出しても良いし、規則的に間引くことにより抽出しても良い。以下において、明視野画像用として抽出されたフォーカス位置抽出ポイントＦＰの内、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントとして抽出されたポイントをポイントＡと呼び、抽出されなかったポイントをポイントＢと呼ぶ。
【００６８】
続くステップＳ１５において、顕微鏡システム１は、明視野画像用及び蛍光画像用のフォーカスマップを、各注目領域Ｒ３、Ｒ４について作成する。より詳細には、明視野画像用の合焦位置の実測及び算出を行ってフォーカスマップを作成した後、明視野画像用の合焦位置に基づき、蛍光画像用の合焦位置の実測及び算出を標的分子（ＥＲ、ＨＥＲ２）毎に行い、ＥＲ用及びＨＥＲ２用のフォーカスマップをそれぞれ作成する。図７は、フォーカスマップの一例を示す図である。図７に示すように、フォーカスマップＭは、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の各小区画Ｐに割り当てられた座標番号（（００１，００１）、（００２，００１）、…）と、各小区画Ｐを撮像する際の電動ステージ１１の座標情報（ステージ座標）とを含む。各座標情報は、小区画Ｐを対物レンズ１５１の光軸に合わせたときの電動ステージ１１のＸ座標及びＹ座標、及び、合焦位置を表すＺ座標とからなる。このようなフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に記録される。フォーカスマップ作成の詳細な処理については後述する。
【００６９】
ステップＳ１６において、顕微鏡システム１は、フォーカスマップＭに基づいて顕微鏡装置１０を動作させ、高倍の対物レンズ１５１を用いて注目領域Ｒ３、Ｒ４に対応する高解像度の明視野画像及び蛍光画像を取得する。
【００７０】
より詳細には、顕微鏡装置１０は、フォーカスマップに登録されている座標情報に従って電動ステージ１１を移動させ、小区画Ｐ毎に合焦位置を調節する。そして、透過照明光学系１３及び落射照明光学系１４を順次動作させて、各小区画Ｐの明視野画像、ＥＲ画像、及びＨＥＲ２画像をＴＶカメラ５０に撮像させる。ホストシステム２０は、ＴＶカメラ５０から入力された画像を、画像の種類（明視野画像及び各種蛍光画像）毎に、隣接する小区画Ｐの画像と結合する。このような画像の入力及び結合処理を、フォーカスマップＭに登録された全小区画Ｐに対して繰り返すことにより、広視野且つ高精細な注目領域Ｒ３、Ｒ４の全体画像（ＶＳ画像）が作成される。これらのＶＳ画像に対応する画像ファイルは、画像データ記録部２３に格納される。なお、ＶＳ画像を画像データ記録部２３に記録する際には、ＪＰＥＧ、ＪＰＥＧ２０００等の公知の圧縮アルゴリズムにより圧縮しても良い。
【００７１】
図８は、画像データ記録部２３に格納される画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。図８に示すように、画像ファイル６は、付帯情報６１、標本全体画像データ６２、及び注目領域指定情報６３を含む。
【００７２】
付帯情報６１は、スライド番号６１１、スライドガラス全体像（即ち、標本サーチ領域Ｒ１）の撮像倍率６１２、蛍光色素数（ｍ）６１３、蛍光色素＃１情報〜蛍光色素＃ｍ情報６１４といった情報を含む。スライド番号は、スライドガラス１００に任意に割り当てられる識別番号である。この識別番号は、例えばラベルＬＢ（図４参照）に印刷されたバーコードを図示しないバーコードリーダで読み込むことにより、ホストシステム２０に入力される。また、スライドガラス全体像の撮像倍率は、ステップＳ１２において標本サーチ領域Ｒ１を撮像した際に使用した低倍率の対物レンズ１５１の倍率である。蛍光色素数（ｍ）は、標本Ｓの染色に使用した蛍光色素の種類の数であり、実施の形態１においては、Ａｌｅｘａ５５５、Ｃｙ５の２種類（ｍ＝２）である。蛍光色素＃１情報〜蛍光色素＃ｍ情報は、使用した各蛍光色素に関する情報を含む。
【００７３】
標本全体画像データ６２は、ステップＳ１２において取得した標本サーチ領域Ｒ１に対応する低解像度画像の画像データを含む。
【００７４】
注目領域指定情報６３は、注目領域指定数（ｎ）６３１、注目領域＃１情報〜注目領域＃ｎ情報６３２といった情報を含む。注目領域指定数（ｎ）６３１は、標本領域Ｒ２からユーザが注目領域として指定した領域の数であり、実施の形態１においては、注目領域Ｒ３及びＲ４の２つである（ｎ＝２）。
【００７５】
各注目領域＃ｊ情報６３２（ｊ＝１、２、…、ｎ）は、撮像情報６３２ａ、フォーカスマップデータ６３２ｂ、及び画像データ６３２ｃを含む。撮像情報６３２ａは、撮像倍率６３２ａ−１、スキャン（Ｓｃａｎ）開始ステージＸ座標６３２ａ−２、スキャン（Ｓｃａｎ）開始ステージＹ座標６３２ａ−３、Ｘ方向のピクセル数６３２ａ−４、Ｙ方向のピクセル数６３２ａ−５といった情報を含む。この内、撮像倍率は、ステップＳ１６において注目領域Ｒ３、Ｒ４を撮像した際に使用した高倍率の対物レンズ１５１の倍率である。また、スキャン開始ステージＸ座標及びＹ座標は、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の小区画Ｐの撮像を開始した位置座標であり、通常は、各注目領域Ｒ３、Ｒ４の左上の小区画Ｐの位置となる（図６Ａ、図６Ｂ参照）。Ｘ方向及びＹ方向のピクセル数は、注目領域Ｒ３、Ｒ４のＸ方向及びＹ方向の各辺に含まれる注目領域画像の画素数である。
【００７６】
フォーカスマップデータ６３２ｂは、ステップＳ１５において作成されたフォーカスマップＭに関する情報を含む。画像データ６３２ｃは、ステップＳ１６において取得された各注目領域Ｒ３、Ｒ４のＶＳ画像（明視野（細胞核）画像、ＥＲ画像、及びＨＥＲ２画像）に対応する画像データである。
【００７７】
ステップＳ１７において、顕微鏡システム１は、画像データ記録部２３に格納された画像ファイルに基づいて、標本ＳのＶＳ画像を表示部（モニタ）２２に表示する。この際、ホストシステム２０は、明視野（細胞核）画像に例えばＢ（青）チャネル、ＥＲ画像を例えばＧ（緑）チャネル、ＨＥＲ２画像を例えばＲ（赤）チャネルに割り当て、これらの画像を重ね合わせて表示する。或いは、ホストシステム２０は、入力部２１を介してユーザにより入力された入力信号に従い、明視野画像に対して所望の蛍光画像を重ね合わせた画像を表示しても良い。なお、各画像に割り当てるチャネルは、ユーザ所望の設定にすることができる。
【００７８】
次に、ステップＳ１５におけるフォーカスマップの作成処理について詳細に説明する。図９は、フォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
まず、明視野画像用のフォーカスマップを作成する。即ち、ステップＳ１０１において、顕微鏡システム１は、ステップＳ１４において抽出した各フォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける合焦位置を実測する。より詳細には、顕微鏡装置１０は、対物レンズ１５１の光軸にフォーカス位置抽出ポイントＦＰが合うように、電動ステージ１１をＸＹ平面内で移動させる。続いて、ホストシステム２０は、電動ステージ１１をＺ方向に移動させながらＴＶカメラ５０により撮像された画像の入力を受け付け、画像の明るさやコントラストを評価することにより、合焦位置を求める。このようにして実測された各フォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００７９】
続くステップＳ１０２において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰとして抽出されなかった各小区画Ｐの合焦位置を、近傍で実測された合焦位置に基づいて補間演算を行うことにより算出する。算出された各小区画Ｐの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
以上の処理により、高解像度の明視野画像用のフォーカスマップＭが完成する。このフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に格納される。
【００８０】
続いて、蛍光画像用のフォーカスマップの作成処理に移行する。実施の形態１においては、ＥＲ及びＨＥＲ２の２種類の蛋白の発現を観察するため、注目領域Ｒ３、Ｒ４の各々に対してＥＲ用及びＨＥＲ２用（即ち、計４個）のフォーカスマップを作成する。
【００８１】
ステップＳ１０３において、顕微鏡システム１は、観察法を観察対象の標的分子に合わせた蛍光観察に切り替える。それに応じて、透過シャッタ１３３が透過照明用の光路Ｌ１に挿入され、落射照明用の光路Ｌ２上の落射シャッタ１４３が開放され、標的分子の観察用の光学キューブ（例えばＥＲ用）１６１が選択されて観察光路Ｌに挿入される。それにより、標的分子に対応する励起光が標本Ｓに照射される。
【００８２】
続くステップＳ１０４において、顕微鏡システム１は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰの内、蛍光画像用に抽出された全てのポイントＡにおける合焦位置を実測する。より詳細には、顕微鏡装置１０は、対物レンズ１５１の光軸にポイントＡが合うように、電動ステージ１１をＸＹ平面内で移動させる。続いて、ホストシステム２０は、電動ステージ１１をＺ方向に移動させながらＴＶカメラ５０により撮像された画像の入力を受け付け、画像の明るさやコントラストを評価することにより、合焦位置を求める。この際、顕微鏡コントローラ３０は、ステップＳ１０１において実測された明視野画像用の合焦位置を中心とした所定の範囲内（例えば標本Ｓの厚さを考慮に入れた範囲内）で電動ステージ１１をＺ方向に上下させると良い。それにより、合焦位置の実測処理の高速化を測ることができる。
このようにして取得された各ポイントＡの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８３】
ステップＳ１０５において、ホストシステム２０は、ポイントＡにおける合焦位置の実測値から、次の統計量を算出する。即ち、あるポイントＡについてステップＳ１０１において実測した明視野画像用の合焦位置と、これに対応するＸＹ座標のポイントＡについてステップＳ１０４において実測した蛍光画像用の合焦位置との差分を算出する。そして、全てのポイントＡにおける当該差分の平均値μ及び標準偏差δを算出する。
【００８４】
ホストシステム２０は、標準偏差δが所定値（例えば、使用中の対物レンズ１５１の被写界深度の１／２）以下である場合（ステップＳ１０６：Ｙｅｓ）、明視野画像用の合焦位置から蛍光画像用の合焦位置を推定可能と判断し、全てのポイントＢにおける蛍光画像用の合焦位置をオフセットで決定する（ステップＳ１０７）。具体的には、明視野画像用の合焦位置座標ＺBF及び差分の平均値μから算出した値ＺBF−μを、蛍光画像用の合焦位置座標とする。このように算出されたポイントＢの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８５】
一方、顕微鏡システム１は、標準偏差δが上記所定値よりも大きい場合（ステップＳ１０６：Ｎｏ）、全てのポイントＢにおける蛍光画像用の合焦位置を実測する（ステップＳ１０８）。実測されたポイントＢの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８６】
図１０は、ポイントＢにおける合焦位置を実測する処理を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ１２１において、顕微鏡システム１は、各ポイントＢの近傍（例えば５区画以内）に蛍光画像用の合焦位置を実測した小区画Ｐが存在するか否かを判定する。なお、近傍の範囲は注目領域Ｒ３、Ｒ４の面積に応じて可変としても良い。顕微鏡システム１は、近傍に合焦位置を実測した小区画Ｐが存在する場合（ステップＳ１２１：Ｙｅｓ）、近傍の小区画Ｐの合焦位置座標を当該ポイントＢのＺ座標に設定して、第１の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２２）。
【００８７】
続くステップＳ１２３において、顕微鏡システム１は、第１の蛍光画像の合焦評価を行う。合焦評価は、既知の様々な方法で行って良い。例えば、第１の蛍光画像の明るさやコントラストを、ステップＳ１０４において実行した合焦評価演算（明るさやコントラストの評価）の平均値と比較することにより、標本状態に応じた合焦評価を行うことができる。
【００８８】
ステップＳ１２３における合焦評価の結果、第１の蛍光画像が合焦状態にあると判定された場合（ステップＳ１２３：Ｙｅｓ）、ホストシステム２０は、第１の蛍光画像を撮像した際のＺ座標（即ち、近傍で実測された合焦位置座標と同じ値）を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する（ステップＳ１３３）。
【００８９】
第１の蛍光画像が合焦状態にないと判定された場合（ステップＳ１２３：Ｎｏ）、又は、当該ポイントＢの近傍に合焦位置を実測した小区画Ｐが存在しない場合（ステップＳ１２１：Ｎｏ）、処理はステップＳ１２４に移行する。
【００９０】
ステップＳ１２４において、顕微鏡システム１は、当該ポイントＢにおいて実測された明視野画像用の合焦位置座標ＺBFを取得し、この座標値ＺBF及びステップＳ１０５において算出した差分の平均値μを用いて値ＺBF−μを算出する。そして、Ｚ座標を値ＺBF−μに設定して、ポイントＢにおける第２の蛍光画像を取得する。
続くステップＳ１２５において、顕微鏡システム１は、第２の蛍光画像の合焦評価を行う。合焦評価の詳細については、ステップＳ１２３と同様である。
【００９１】
ステップＳ１２５における合焦評価の結果、第２の蛍光画像が合焦状態にあると判定された場合（ステップＳ１２５：Ｙｅｓ）、ホストシステム２０は、この値ＺBF−μを当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する（ステップＳ１３３）。
【００９２】
一方、第２の蛍光画像が合焦状態にないと判定された場合（ステップＳ１２５：Ｎｏ）、ホストシステム２０は、明視野画像用の合焦位置座標ＺBF、並びに差分の平均値μ及び標準偏差δを用いて、値ＺBF−μ−δを算出する。そして、Ｚ座標を値ＺBF−μ−δに設定して、ポイントＢにおける第３の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２６）。
【００９３】
ステップＳ１２７において、ホストシステム２０は、第２の蛍光画像と第３の蛍光画像との合焦状態を比較する。なお、図１０においては、不等号の大きい方が、合焦状態がより良好であることを示している。
【００９４】
第３の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１２７：Ｙｅｓ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ〜ＺBF−μ−２δの範囲内で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１２８）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢにおける合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
【００９５】
一方、第２の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１２７：Ｎｏ）、顕微鏡システム１は、Ｚ座標を値ＺBF−μ＋δに設定して、ポイントＢにおける第４の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２９）。
【００９６】
ステップＳ１３０において、ホストシステム２０は、第２の蛍光画像と第４の蛍光画像との合焦状態を比較する。そして、第４の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１３０：Ｙｅｓ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ〜ＺBF−μ＋２δの範囲内で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１３１）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
【００９７】
一方、第２の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１３０：Ｎｏ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ−δ〜ＺBF−μ＋δの範囲で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１３２）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
これらのステップＳ１２１〜Ｓ１３３が全てのポイントＢに対してなされた後、処理はメインルーチンに戻る。
【００９８】
再び図９を参照すると、ステップＳ１０９において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰ（ポイントＡ及びＢ）以外の小区画Ｐの合焦位置を、近傍のフォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標に基づき補間演算により求める。算出された各小区画Ｐの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００９９】
観察対象とする他の標的分子（例えば、ＨＥＲ２）がさらにある場合（ステップＳ１１０：Ｙｅｓ）、処理はステップＳ１０３に戻る。一方、観察対象とする他の標的分子がない場合（ステップＳ１１０：Ｎｏ）、処理はメインルーチンに戻る。
【０１００】
これらのステップＳ１０３〜Ｓ１１０により、標的分子毎（例えば、ＥＲ用及びＨＥＲ２用）のフォーカスマップＭが完成する。これらのフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に格納される。
【０１０１】
なお、ステップＳ１２６においては、合焦位置の探索範囲を決定する際に、差分の標準偏差δを用いて基準の座標値ＺBF−μからの移動方向（プラス方向／マイナス方向）を判定しているが、対物レンズの被写界深度といった規定の値を用いてこの判定を行っても良い。また、ステップＳ１２８及びＳ１３１においては、合焦位置を探索する範囲を２δとしているが、合焦位置の検出精度をより向上させるために、３δの範囲で探索を行うこととしても良い。
【０１０２】
また、ステップＳ１２４、Ｓ１２６、Ｓ１２９における蛍光画像の取得の際に、座標値ＺBF−μ、ＺBF−μ−δ、ＺBF−μ＋δのいずれにおいても所定の光量又はコントラストが得られなかった場合、標的分子が存在しないと判断し、「フォーカス位置なし」を示す値をフォーカスマップＭに記録しても良い。更に、明視野画像用の合焦位置ＺBFが「フォーカス位置なし」と判断された場合は、蛍光画像のフォーカス位置を求めずに「フォーカス位置なし」と設定するようにしてもよい。
【０１０３】
また、ステップＳ１６において、細胞核を表す明視野ＶＳ画像と各種の標的分子を表す蛍光ＶＳ画像とを重ね合わせる際に、ヘマトキシリン（細胞核）、ＥＲ、ＨＥＲ２をＲＧＢチャネルに割り当てて合成表示を行ったが、例えば特開２０１０−１３４１９５号公報に開示されているように、標本Ｓを染色した各色素を仮想的なスペクトルを有する色素に変換して合成を行うことにより、ＲＧＢ表色系では表示しきれない４種類以上の多重染色標本を合成表示しても良い。
【０１０４】
以上説明したように、実施の形態１においては、細胞構成要素（細胞核）を非蛍光色素により染色し、検出目的とする標的分子を蛍光色素によって標識した多重染色標本を観察する際に、低解像度の明視野観察により取得した明視野画像上で領域選択した上で、選択された領域に対し、高解像度の明視野観察により取得した明視野画像から明視野ＶＳ画像を作成すると共に、蛍光観察により取得した蛍光画像から蛍光ＶＳ画像を作成する。その際に、明視野画像の取得の際に使用した合焦位置を用いて、蛍光画像の取得に用いる合焦位置を決定するので、蛍光画像用の合焦位置合わせ速度を向上させることができる。それにより、精度の良い蛍光ＶＳ画像を従来よりも短時間に作成することができると共に、励起光による標本の退色を軽減することが可能となる。
【０１０５】
また、実施の形態１によれば、明視野画像用の合焦位置座標と蛍光画像用の合焦位置座標との差の分布（統計量）に基づいて蛍光画像用の合焦位置座標の取得方式を決定するので、標本における標的分子の発現を効率的、且つ精度良く検出することが可能となる。
【０１０６】
また、実施の形態１によれば、低解像度の明視野観察により取得された標本Ｓ全体に対応する明視野ＶＳ画像を画面表示するので、腫瘍部といった領域の選択をユーザが容易に行うことができる。このため、ユーザが蛍光画像のみを見ながら領域選択する場合に生じ得る選択ミスを抑制することができる。また、ユーザが対象部位を検索する時間を短縮することができるので、標本の退色を防止することが可能となる。加えて、蛍光顕微鏡の熟練者でなくても、簡単に領域選択を行うことができる。
【０１０７】
また、実施の形態１によれば、細胞核を明視野観察した明視野ＶＳ画像に、標的分子を蛍光観察した蛍光ＶＳ画像を重ねて表示するので、標本の全体像を容易に把握することができると共に、細胞核の画像をランドマークとして、標的分子が発現している細胞を識別することが可能となる。
【０１０８】
また、実施の形態１によれば、病変部等における複数種類の標的分子の発現評価を、細胞単位でタイプ別に分類して表示することができる。また、タイプ別に細胞を特異的に表示することにより、タイプ別の細胞の分布確認を容易に行うことができる。従って、標的分子の発現量等を数値化して、治療法の選択や予後予測等に活用することが可能となる。さらに、複数種類の標的分子の発現と形態情報との関係を数値化して比べることもできるようになるので、ＨＥ染色で得られる細胞核等の形態情報から、細胞タイプを推測することも可能となる。
【０１０９】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
実施の形態２に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態１と同様であり、フォーカスマップの作成処理（図３のステップＳ１５）が実施の形態１とは異なる。より詳細には、実施の形態１においては、まず明視野画像用のフォーカスマップを作成し、これを利用して蛍光画像用のフォーカスマップを作成した。これに対し、実施の形態２においては、ステップＳ１４において抽出したフォーカス位置抽出ポイント毎に、明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を取得する。それにより、電動ステージ１１の移動及び光学キューブ１６１の切替回数を必要最小限に留め、フォーカスマップの作成時間を短縮することを特徴とする。
【０１１０】
図１１は、実施の形態２におけるフォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。なお、以下の説明においては、一例として、明視野画像、ＥＲ蛍光画像、及びＨＥＲ２蛍光画像を取得する際に用いる３種類のフォーカスマップを作成する。
【０１１１】
まず、ステップＳ２０１において、顕微鏡システム１は、ＥＲ蛍光画像用の光学キューブ１６１を選択して観察光路Ｌに挿入する。この際、Ａｌｅｘａ５５５色素で標識されたＥＲ抗体の蛍光画像を取得するため、青色〜緑色の波長領域（波長が４５０ｎｍ〜５７０ｎｍ）の可視光の透過率が高い光学キューブ１６１を選択する。この他、発現量が高い抗体が標識されている蛍光色素用の特定の光学キューブ１６１を選択しても良い。
【０１１２】
ステップＳ２０２において、顕微鏡コントローラ３０は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１を介して、ステップＳ１４で抽出したフォーカス位置抽出ポイントＦＰが対物レンズ１５１の光軸に合うように、電動ステージ１１をＸＹ方向に移動させる。
【０１１３】
続くステップＳ２０３において、顕微鏡システム１は、標本Ｓに対する照明を透過照明光に切り替える。即ち、落射シャッタ１４３を落射照明用の光路Ｌ２に挿入すると共に、透過照明用の光路Ｌ１に挿入された透過シャッタ１３３を開放して、透過照明光を標本Ｓに照射する。
ステップＳ２０４において、顕微鏡システム１は、明視野画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標を明視野画像用のフォーカスマップＭに記録する。
【０１１４】
続くステップＳ２０５において、顕微鏡システム１は、標本Ｓに対する照明を落射照明光に切り替える。即ち、透過シャッタ１３３を透過照明用の光路Ｌ１に挿入すると共に、落射照明用の光路Ｌ２に挿入された落射シャッタ１４３を開放し、さらに、ＥＲ蛍光観察用の上記光学キューブ１６１を観察光路Ｌに挿入して、落射照明光を標本Ｓに照射する。
ステップＳ２０６において、顕微鏡システム１は、ＥＲ蛍光画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標をＥＲ蛍光画像用のフォーカスマップＭに記録する。
【０１１５】
続くステップＳ２０７において、顕微鏡システム１は、ＨＥＲ２蛍光画像用の合焦位置を求め、その合焦位置座標をＨＥＲ２蛍光画像用のフォーカスマップＭに記録する。この合焦位置座標は、ＥＲ蛍光画像用及び／又は明視野画像用に実測した合焦位置座標に対し所定のオフセット値を加算することにより求めても良いし、実測により求めても良い。また、実測する場合には、光学キューブ１６１をＨＥＲ２蛍光観察用のものに切り替える。
【０１１６】
ここで用いるオフセット値としては、例えば、基準標本や標本Ｓの一領域を用いて、ＥＲ蛍光画像用及び／又は明視野画像用に実測した合焦位置座標に対するＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置のずれを事前に実験により求めておき、そのずれの値を用いてもよい。この際、複数ポイントにおける合焦位置のずれを求め、それらの平均値をオフセット値としても良い。
【０１１７】
ステップＳ２０８において、ホストシステム２０は、ステップＳ１４で抽出した全てのフォーカス位置抽出ポイントＦＰについて合焦位置を取得した否かを判定する（ステップＳ２０８）。全てのフォーカス位置抽出ポイントＦＰについて合焦位置を取得した場合（ステップＳ２０８：Ｙｅｓ）、処理はステップＳ２０９に移行する。一方、まだ合焦位置を取得していないフォーカス位置抽出ポイントＦＰが存在する場合（ステップＳ２０８：Ｎｏ）、処理はステップＳ２０２に戻る。
【０１１８】
この場合、繰り返し後のステップＳ２０４においては、蛍光観察用の光学キューブ１６１を観察光路Ｌに挿入したまま明視野画像の合焦位置の実測を行っても良い。それにより、光学キューブ切換部１６における光学キューブ１６１の切り替え回数を削減することができる。また、ステップＳ２０７においてＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置を実測により求める場合、ステップＳ２０６及びステップＳ２０７の順序を交互に入れ替えても良い。即ち、あるフォーカス位置抽出ポイントＦＰに対しては、ステップＳ２０６→Ｓ２０７の順で処理を実行し、次のフォーカス位置抽出ポイントＦＰに対しては、ステップＳ２０７→Ｓ２０６の順で処理を実行する。それにより、ＥＲ用及びＨＥＲ２用の光学キューブ１６１の切り替え回数をさらに削減することができる。
【０１１９】
ステップＳ２０９において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰ以外の小区画Ｐの合焦位置を、近傍に存在するフォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標に基づき補間演算を行うことにより求める。それにより、明視野画像用、ＥＲ蛍光画像用、及びＨＥＲ２蛍光画像用の３種類のフォーカスマップＭが完成する。その後、処理はメインルーチンに戻る。
【０１２０】
以上説明したように、実施の形態２によれば、フォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける合焦位置を求める際に、電動ステージ１１の移動回数及び光学キューブ１６１の切替回数を削減することができるので、複数種類のフォーカスマップを効率良く作成することが可能となる。
【０１２１】
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について説明する。
実施の形態３に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態１と同様であり、フォーカスマップの作成処理（図３のステップＳ１５）及びＶＳ画像の表示処理（ステップＳ１７）が実施の形態１とは異なる。より詳細には、実施の形態３においては、図１２に示すように、１つの明視野ＶＳ画像ＧBFを作成すると共に、この明視野ＶＳ画像ＧBF上の合焦位置座標ＺBFを基準として、標的分子毎（本実施の形態では、ＥＲ用及びＨＥＲ２用）に合焦位置座標（ＥＲ用の合焦位置座標ＺER、ＨＥＲ２用の合焦位置座標ＺHER2）を求める。そして、各合焦位置座標ＺER、ＺHER2、及びそれらの周辺の座標ＺER(k)、ＺHER2(k)（ｋ＝１、２、…、及び１’、２’、…）において、各標的分子に対応する蛍光ＶＳ画像（ＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER、ＧER(k)、及び、ＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2、ＧHER2(k)）を作成する。さらに、これらの蛍光ＶＳ画像を標的分子毎に重ね合わせて合成することにより、３次元的な蛍光ＶＳ画像を標的分子毎に構成する。なお、図１２においては、各ＶＳ画像ＧBF、ＧER、ＧER(k)、ＧHER2、及びＧHER2(k)をＺ座標軸と対応付けられたバーによって表している。また、図１２においては、模式的に、各ＶＳ画像ＧBF、ＧER、ＧER(k)、ＧHER2、及びＧHER2(k)内の合焦位置座標（Ｚ座標）を全て等しいものとして示しているが、これらのＺ座標は実測又は演算により個別に取得されるため、実際には全て等しくなるわけではなく、３次元的に構成されるものである。
【０１２２】
次に、実施の形態３における顕微鏡システム１の動作について説明する。
高解像度の明視野画像用のフォーカスマップの作成処理及び明視野画像ＧBFの取得処理については、実施の形態１において説明したものと同様である（図３及び図９参照）。
【０１２３】
一方、蛍光画像については、以下のようにして取得される。図１３は、実施の形態３における蛍光画像の取得処理を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ３０１において、ホストシステム２０は、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の各小区画Ｐにおける明視野画像用の合焦位置座標ＺBFを取得する。
【０１２４】
続くステップＳ３０２において、ホストシステム２０は、明視野画像用の合焦位置座標ＺBFに所定のオフセット値α１、α２をそれぞれ加えたＺ座標の値ＺER及びＺHER2を、ＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER、及びＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2の合焦中心位置として設定してフォーカスマップを作成する。このオフセット値α１、α２としては、実施の形態１と同様に、基準標本や標本Ｓの一領域を用いて、明視野画像用に実測した合焦位置座標に対するＥＲ蛍光画像及びＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置のずれをそれぞれ事前に実験により求めておき、それらのずれの値を用いても良い。
【０１２５】
ステップＳ３０３において、顕微鏡システム１は、ステップＳ３０２において作成したフォーカスマップに基づき、各小区画Ｐについて、合焦中心位置ＺER、及びそこから上下方向に所定の間隔Δずつ離れた位置ＺER±Δ、ＺER±２Δ、…におけるＥＲ蛍光画像をＴＶカメラ５０によって取得する。ここで、間隔Δは、対物レンズ１５１の焦点深度に基づいて予め設定された値である。同様にして、顕微鏡システム１は、合焦中心位置ＺHER2、及びそこから上下方向に所定の間隔Δずつ離れた位置ＺHER2±Δ、ＺHER2±２Δ、…におけるＨＥＲ２蛍光画像をＴＶカメラ５０によって取得する。
【０１２６】
この際、蛍光画像を取得するＺ座標の配列順に電動ステージ１１を移動させると良い。それにより、電動ステージ１１の移動時間を短縮することができる。また、ある小区画ＰについてＺ座標の配列順に蛍光画像を取得した場合には、その隣の小区画Ｐについて、Ｚ座標の逆配列順に蛍光画像を取得すると良い。それにより、電動ステージ１１の移動時間をさらに短縮することができる。
【０１２７】
続くステップＳ３０４において、ホストシステム２０は、Ｚ座標の配列順毎に、互いに隣接する小区画Ｐに対応するＥＲ蛍光画像を繋ぎ合わせて、複数の蛍光ＶＳ画像ＧER、ＧER(k)を作成する。ＨＥＲ２蛍光画像についても同様に繋ぎ合わせて、複数の蛍光ＶＳ画像ＧHER2及びＧHER2(k)を作成する。
【０１２８】
さらに、ホストシステム２０は、明視野画像上に、作成した蛍光ＶＳ画像群を標的分子毎に、Ｚ座標の配列順となるように重ね合わせる。それにより、細胞構成要素（細胞核等）上に標的分子が３次元的に表示された画像が生成される。具体的には、明視野ＶＳ画像ＧBFにＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER及びＧER(k)を重ね合わせた３次元的な合成画像と、明視野ＶＳ画像ＧBFにＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2及びＧHER2(k)を重ね合わせた３次元的な合成画像とが生成される。
【０１２９】
なお、明視野画像と蛍光画像を合成表示する際には、ＥＲ用３次元蛍光画像、ＨＥＲ２用３次元蛍光画像毎に、同一ＸＹ座標上で一番輝度の高い画素を持つＺ座標の画素のみを選択することにより、各々２次元画像化して、明視野画像、ＥＲ蛍光画像、ＨＥＲ２蛍光画像を表示することも可能である。
また、３次元の広視野且つ高精細な画像の取得方法の詳細については、特開２００６−３４３５７３号公報も参照されたい。
【０１３０】
以上説明したように、実施の形態３によれば、細胞核等の細胞構成要素上に標的分子が３次元的に合成表示された画像を生成することができる。また、実施の形態３によれば、蛍光画像用の合焦位置算出を実測しないで済むので、処理時間を短縮でき、３次元のＶＳ画像を高速に作成することが可能となる。さらに、例えばマルチカラーＦＩＳＨ標本のように、複数の遺伝子をターゲットに蛍光標識を行った場合、細胞核内で互いに異なるＺ座標に位置する複数種類の遺伝子の発現をもれなく画像化することができるので、診断の際の見落としを低減することが可能となる。
【０１３１】
以上説明した実施の形態１〜３においては、１種類の非蛍光染色と、２種類の蛍光染色とを組み合わせた３種類の多重染色を行ったが、本実施の形態は、非蛍光染色を含む少なくとも２種類の染色法を施した多重染色標本に対して適用することができる。
【０１３２】
また、本発明は、上記した各実施の形態そのままに限定されるものではなく、各実施の形態に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成することができる。例えば、実施の形態に示される全構成要素からいくつかの構成要素を除外して形成してもよい。あるいは、異なる実施の形態に示した構成要素を適宜組み合わせて形成してもよい。
【符号の説明】
【０１３３】
１ 顕微鏡システム
１０ 顕微鏡装置
１１ 電動ステージ
１２ 顕微鏡本体
１３ 透過照明光学系
１３０ 透過照明用光源
１３１ コレクタレンズ
１３２ 透過用フィルタユニット
１３３ 透過シャッタ
１３４ 透過視野絞り
１３５ 透過開口絞り
１３６ 折曲げミラー
１３７ コンデンサ光学素子ユニット
１３８ トップレンズユニット
１４ 落射照明光学系
１４０ 落射照明用光源
１４１ コレクタレンズ
１４２ 落射用フィルタユニット
１４３ 落射シャッタ
１４４ 落射視野絞り
１４５ 落射開口絞り
１５ レボルバ
１５１、１５１ａ、１５１ｂ 対物レンズ
１６ 光学キューブ切換部
１６１、１６１ａ、１６１ｂ 光学キューブ
１７ 鏡筒
１７１ 双眼部
１７２ ビームスプリッタ
２０ ホストシステム
２１ 入力部
２２ 表示部
２３ 画像データ記録部
２４ 撮影座標記録部
２５ プログラム記録部
２６ ビデオボード
２７ 制御部
２７１ 蛍光ＶＳ画像領域設定部
２７２ 明視野ＶＳ撮像制御部
２７３ 蛍光ＶＳ撮像制御部
２７４ フォーカス位置取得部
２７５ ＶＳ画像作成部
２７６ 画像合成部
３０ 顕微鏡コントローラ
３１ ステージＸ−Ｙ駆動制御部
３２、３４ モータ
３３ ステージＺ駆動制御部
４０ ＴＶカメラコントローラ
５０ ＴＶカメラ
１００ スライドガラス
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡を用いて標本を撮像した標本画像を取得して表示する顕微鏡システム、並びに、標本画像生成方法及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を用いて標本を観察する場合、一度に観察できる範囲は主に対物レンズの倍率によって決まる。例えば対物レンズの倍率を高くすると、高精細な画像が得られる反面、観察範囲が狭くなってしまう。そこで、電動ステージ等を利用して視野を移動しながら、複数枚の画像を撮影し、それらを貼合わせる（又は結合する）ことで、広視野かつ高解像度の顕微鏡画像を作成し、病理診断等に活用するシステム（以下、バーチャル顕微鏡システムと言う）が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１及び２には、標本の範囲を小区画に分割し、各小区画に対応する標本の部分を高解像度の対物レンズで撮影して得られた画像を繋ぎ合わせることにより、広視野且つ高解像度の標本全体の画像を構築する顕微鏡システムが開示されている。以下、このようにして構築された顕微鏡のことをバーチャルスライド（ＶＳ：Virtual Slide）画像という。同様に、特許文献３及び４にも、広視野かつ高解像度の顕微鏡画像を作成する顕微鏡システムが開示されている。
【０００４】
このように標本全体を高精細に画像化したＶＳ画像は、例えばパソコンとネットワーク環境があれば、場所や時間を問わずに閲覧することが可能となる。そのため、医学生の病理学実習や、病理医間での遠隔コンサルテーション等にも活用され始めている。なお、ＶＳ画像は、ホール・スライド・イメージング（Whole Slide Imaging）とも呼ばれる。
【０００５】
ところで、病理観察においては、観察対象や目的に応じて種々の染色手法や観察法が用いられる。例えば組織や細胞の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリン及びエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（以下、「ＨＥ染色」と記す）や、パパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等の非蛍光染色が知られている。このような形態観察染色がなされた標本に対しては、光学顕微鏡による明視野観察が行われる。
【０００６】
また、病理観察においては、形態情報に基づく形態診断を補完する目的で、標本に分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、標的分子（特定の遺伝子やタンパク）の発現異常といった機能異常を診断する分子学的病理検査が行われることもある。この場合、例えば、ＩＨＣ（immunohistochemistry：免疫組織化学）法、ＩＣＣ（immunocytochemistry：免疫細胞化学）法、ＩＳＨ（in situ hybridization）法等で標本に蛍光標識（染色）を施して蛍光観察を行ったり、酵素標識を施して明視野観察を行ったりする。
【０００７】
さらに、病理観察においては、上述した手法を併用して診断を行う場合もある。例えば、ＨＥ染色等を施した標本に対する明視野観察で形態異常の診断を行い、蛍光観察（ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）、蛍光抗体法）で分子発現異常といった機能異常の診断を行うことがある。
【０００８】
近年では、癌等の治療として、特定の分子を標的として作用する治療薬（抗体治療薬）を用いた分子標的治療と呼ばれる治療が行われており、治療効果と副作用の軽減効果とが期待されている。この分子標的治療では、癌細胞に特異的に発現する分子（抗原タンパク質）を標的とする抗体治療薬が用いられる。このような分子標的治療を行う場合、治療に先立って、例えば、細胞の表面、即ち細胞膜上に抗体治療薬の標的分子となる抗原が発現しているか否かをＩＨＣ法等で観察し、適応患者の選択が行われる。
【０００９】
例えば、乳癌治療においては、抗体治療薬を選択的に用いたターゲット治療が進んでおり、腫瘍部における複数の標的分子の発現パターンに応じて病型（細胞亜型）を「Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ」「Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ」「ＨＥＲ２ ｄｉｓｅａｓｅ」「Ｂａｓａｌ ｌｉｋｅ」と称す４つの型に分類し、この分類に基づいて治療法の基本的な選択がなされる。具体的には、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体（以下、「ＥＲ」と略記する。）やプロゲステロン受容体（以下、「ＰｇＲ」と略記する。）の細胞核上での発現の有無によってホルモン依存性に増殖する癌か否かを判断し、内分泌療法（ホルモン療法）の適用可否を選択する。また、ＨＥＲ２受容体（以下、「ＨＥＲ２」と略記する。）の細胞膜上での発現の有無に応じて抗ＨＥＲ２抗体製剤であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の適用可否を選択する。そして、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２のいずれも発現していない所謂トリプルネガティブ乳癌（Ｔriple Ｎegative Ｂreast Ｃancer：ＴＮＢＣ）と呼ばれるタイプでは、化学療法を中心に治療を行う。
【００１０】
このように複数の標的分子を可視化する場合、蛍光観察が有用であるが、一方で、蛍光標本は長期保存ができないといった問題もある。この点において、バーチャル顕微鏡システムによって標本をＶＳ画像化することは、診断の根拠の記録及び保持にもつながり、標本の長期保存に関する問題を考慮する必要がなくなる。
【００１１】
ＶＳ画像に関連する技術として、特許文献５には、明視野観察可能な通常染色と標的分子に対する蛍光標識とを同一のスライド標本に施し、明視野ＶＳ画像上で指定した任意の領域における標的分子の発現を蛍光ＶＳ画像として取得する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平９−２８１４０５号公報
【特許文献２】特開平１０−３３３０５６号公報
【特許文献３】特開２００６−３４３５７３号公報
【特許文献４】特表２００２−５１４３１９号公報
【特許文献５】特開２００９−１４９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、蛍光観察においては、明視野観察と比べて視野が暗いため、１ショットあたりの撮影時間が長くなる。そのため、標本全体をＶＳ画像化しようとすると、通常、数時間以上の時間がかかってしまう。また、分子病理診断において必要とされる検査領域は、主に腫瘍部といった限定された領域であり、正常部位は検査対象外であることが多い。このため、腫瘍部が標本全体の内のごく僅かな領域にしか存在しない場合、ＶＳ画像の取得に際して無駄な時間を費やすだけでなく、不必要な画像容量の増大を招くことにもなる。さらに、蛍光染色を施した標本は未励起状態では無色透明であるため、通常の形態観察染色を施した標本上で明視野観察により腫瘍部の位置を特定したとしても、未励起状態の蛍光標本においてその位置を確認し、標本上の腫瘍部を選択的に撮影することは非常に困難である。
【００１４】
この点について、上記特許文献５においては、明視野ＶＳ画像上で蛍光観察を行う領域を指定するので、蛍光ＶＳ画像の作成処理時間を短縮することができる。しかしながら、特許文献５には、明視野観察と各標的分子に対する蛍光観察とにおけるフォーカス位置（合焦位置）の違いについて言及されていない。
【００１５】
蛍光観察における合焦位置を取得するために、例えば、明視野画像における合焦位置をそのまま流用することが考えられる。しかしながら、この場合、蛍光画像において合焦位置のずれが生じるおそれがある。或いは、蛍光画像の各ショットにおいてオートフォーカス処理を毎回行うことも考えられる。しかしながら、上述のとおり、蛍光観察の際の視野は暗いため、オートフォーカス処理にも時間がかかる。このため、結局、蛍光ＶＳ画像の生成に長時間を要することとなってしまう。
【００１６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察可能な非蛍光染色と標的分子に対する蛍光標識とを同一スライド標本上に施した多重染色標本に対し、標的分子を蛍光観察する際の合焦位置を短時間に精度よく検出することができる顕微鏡システム、標本画像生成方法、及び標本画像生成プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡システムは、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御手段と、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段と、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得手段とを備えることを特徴とする。
【００１８】
上記顕微鏡システムにおいて、前記フォーカス位置取得手段は、前記標本内から前記第１の合焦位置を実測する複数の抽出ポイントを抽出し、該複数の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置を実測により取得すると共に、前記複数の抽出ポイントの内の少なくとも一部における前記第２の合焦位置を実測により取得することを特徴とする。
【００１９】
上記顕微鏡システムにおいて、前記フォーカス位置取得手段は、前記複数の抽出ポイントの各々における前記第２の合焦位置を取得する際に、同一の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置からの所定のオフセットを用いることを特徴とする。
【００２０】
上記顕微鏡システムにおいて、前記標本の観察法に応じて光路に選択的に挿入される光学キューブを切り換える光学キューブ切換部をさらに備え、前記フォーカス位置取得手段は、前記第１の合焦位置を取得する場合に、前記蛍光画像観察用の光学キューブを前記光路に挿入したままの状態で前記第１の合焦位置を実測により取得することを特徴とする。
【００２１】
上記顕微鏡システムにおいて、前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記第１の合焦位置を基準として光軸方向に複数の座標値を設定し、該複数の座標値において複数の蛍光画像をそれぞれ取得する処理を、前記光軸に直交する面を分割した複数の小区画の各々について実行する制御を行い、前記複数の座標値の配列順毎に、互いに隣接する前記小区画に対応する複数の蛍光画像を相互に繋ぎ合わせることにより、複数の蛍光バーチャル画像を作成することを特徴とする。
【００２２】
上記顕微鏡システムにおいて、前記明視野バーチャルスライド画像と前記蛍光バーチャルスライド画像とを重ね合わせた合成画像を作成する画像合成手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２３】
上記顕微鏡システムにおいて、前記標本は、２種類以上の標的分子にそれぞれ対応する２種類以上の蛍光色素により標識がなされており、前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記標的分子の種類ごとに前記蛍光バーチャルスライド画像を取得することを特徴とする。
【００２４】
上記顕微鏡システムにおいて、前記明視野バーチャルスライド画像を用いて、前記標本の内、前記蛍光バーチャルスライド画像の取得対象とする領域を設定する領域設定手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２５】
上記顕微鏡システムにおいて、前記細胞構成要素は細胞核であることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る標本画像生成方法は、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する標本画像生成方法において、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップとを含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る標本画像生成プログラムは、明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する処理をコンピュータに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップとを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、明視野観察の際に用いられる第１の合焦位置を取得し、この第１の合焦位置を用いて、蛍光観察の際に用いられる第２の合焦位置を取得するので、多重染色標本を蛍光観察する際の合焦位置を短時間に精度良く検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
【図２】図２は、図１に示すホストシステムの構成例を示すブロック図である。
【図３】図３は、図１に示す顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。
【図４】図４は、標本が配置されたスライドガラスを示す上面図である。
【図５】図５は、標本サーチ領域から検出された標本領域を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、注目領域を格子状に分割した小区画及びフォーカス位置抽出ポイントを示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、注目領域を格子状に分割した小区画及びフォーカス位置抽出ポイントを示す模式図である。
【図７】図７は、フォーカスマップの一例を示す図である。
【図８】図８は、画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。
【図９】図９は、フォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、ポイントＢにおける合焦位置を実測する処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、実施の形態２におけるフォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、実施の形態３において作成される３次元画像の構成を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施の形態３における蛍光画像の取得処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、これらの実施の形態により本発明が限定されるものではない。
本発明に係る顕微鏡システムは、多重染色された病理組織標本又は細胞診標本の全体またはその一部を、顕微鏡を用いて広視野かつ高精細にディジタル画像として記録して表示するものである。より詳細には、本発明に係る顕微鏡システムは、形態観察染色と分子標的染色とが多重に染色された標本を観察及び診断に供するものである。
【００３１】
以下においては、本発明を、バーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システム（バーチャル顕微鏡システム）に適用した場合を例にとって説明する。バーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像とも記す）とは、標本を載置する電動ステージを動かすなどして、顕微鏡の対物レンズ及び標本を対物レンズの光軸に対して直交する方向に相対的に移動させ、視野範囲をずらしながら標本を部分毎に撮像した複数の画像を互いに繋ぎ合わせることによって生成した画像のことである。
【００３２】
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０と、該顕微鏡装置１０とデータ送受可能に接続されたホストシステム２０と、ホストシステム２０の制御の下で顕微鏡装置１０の各部を制御する顕微鏡コントローラ３０と、ホストシステム２０に接続されたテレビ（ＴＶ）カメラコントローラ４０と、顕微鏡装置１０に取り付けられ、ＴＶカメラコントローラ４０の制御の下で動作するテレビ（ＴＶ）カメラ５０とを備える。
【００３３】
顕微鏡装置１０は、標本Ｓが配置されたスライドガラス１００を載置する電動ステージ１１と、側面視略コの字状を有し、電動ステージ１１を支持する顕微鏡本体１２と、顕微鏡本体１２の底部に設けられ、標本Ｓを透過照明する透過照明光学系１３と、顕微鏡本体１２の上部に設けられ、標本Ｓを落射照明する落射照明光学系１４と、顕微鏡本体１２に回転自在に設けられ、複数の対物レンズ１５１が装着されたレボルバ１５と、標本Ｓの観察光の光路Ｌに選択的に挿入される複数の光学キューブ１６１を切り替える光学キューブ切換部１６と、顕微鏡本体１２の上部に載置された鏡筒１７とを備える。以下、図１に示す対物レンズ１５１ａの光軸方向をＺ方向とし、Ｚ方向と直交する平面をＸＹ平面として説明する。また、Ｚ座標は標本面（電動ステージ１１の標本載置面）が対物レンズ１５１から離れる方向を負の方向とし、標本面に近づく方向を正の方向とする。
【００３４】
電動ステージ１１は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１の制御の下で動作するモータ３２、及び、ステージＺ駆動制御部３３の制御の下で動作するモータ３４によって駆動され、ＸＹ平面内及びＺ方向にそれぞれ自在に移動する。また、電動ステージ１１は、原点センサによる原点位置検出機能（不図示）を有し、電動ステージ１１に載置したスライドガラス１００（標本Ｓ）の各部に対して座標を設定することができる。
【００３５】
透過照明光学系１３は、透過照明用光源１３０と、透過照明用光源１３０から射出した照明光（以下、透過照明光という）を集光するコレクタレンズ１３１と、透過用フィルタユニット１３２と、透過シャッタ１３３と、透過視野絞り１３４と、透過開口絞り１３５と、透過照明光の光路Ｌ１を対物レンズ１５１ａの光軸に沿って折り曲げる折曲げミラー１３６と、コンデンサ光学素子ユニット１３７と、トップレンズユニット１３８とを備える。
【００３６】
落射照明光学系１４は、落射照明用光源１４０と、落射照明用光源１４０から射出した照明光（以下、落射照明光という）を集光するコレクタレンズ１４１と、落射用フィルタユニット１４２と、落射シャッタ１４３と、落射視野絞り１４４と、落射開口絞り１４５とを備える。
【００３７】
レボルバ１５には、倍率（観察倍率）が互いに異なる複数の対物レンズ１５１ａ、１５１ｂ、…（これらを総称して対物レンズ１５１ともいう）が装着されている。対物レンズ１５１は、レボルバ１５の回転に応じて択一的に切り換えられて観察光路Ｌに挿入され、標本Ｓの観察に用いられる。なお、図１においては、対物レンズ１５１ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
【００３８】
レボルバ１５は、対物レンズ１５１として、倍率が比較的低い低倍率（例えば２倍、４倍）の対物レンズ（以下、低倍対物レンズという）と、倍率が低倍対物レンズよりも高い高倍率（例えば、１０倍、２０倍、４０倍）の対物レンズ（以下、高倍対物レンズという。）とを少なくとも１つずつ保持している。なお、低倍及び高倍とした倍率は一例であり、少なくとも一方の倍率が他方の倍率に対して高ければよい。
【００３９】
光学キューブ切換部１６は、複数の光学キューブ１６１ａ、１６１ｂ、…（これらを総称して光学キューブ１６１ともいう）を保持しており、検鏡法に応じていずれかの光学キューブ１６１を選択して観察光路Ｌ（より詳細には、観察光路Ｌと落射照明光の光路Ｌ２とが交差する位置）に挿入する。
【００４０】
各光学キューブ１６１は、標本Ｓを染色した蛍光色素の励起波長の光を透過させる励起フィルターと、標本Ｓを染色した全ての蛍光色素の蛍光波長を含む波長の光を透過させる吸収フィルターと、ダイクロイックミラーとをユニット化したものである。観察光路Ｌに挿入された光学キューブ１６１は、落射照明用光源１４０から射出された光の内、標本Ｓを染色した蛍光色素の励起波長成分を反射して標本Ｓの方向に導くと共に、標本Ｓからの反射光の内、標本Ｓで発光した蛍光波長成分を透過させて鏡筒１７の方向に導く。
【００４１】
鏡筒１７には、接眼レンズを内設し、標本Ｓの標本像を目視観察するための双眼部１７１と、ＴＶカメラ５０と、標本Ｓからの観察光を双眼部１７１側とＴＶカメラ５０側とに分岐するビームスプリッタ１７２とが設けられている。
【００４２】
このような顕微鏡装置１０の各部は電動化されており、顕微鏡コントローラ３０の制御の下で動作する。なお、顕微鏡装置１０の各部を、ユーザが手動で操作することも可能である。
【００４３】
ホストシステム２０は、ＣＰＵやビデオボード、メインメモリ等の主記憶装置、ハードディスクや各種記憶媒体等の外部記憶装置、通信装置、表示装置や印刷装置等の出力装置、入力装置、各部を接続し、あるいは外部入力を接続するインターフェース装置等を備えた公知のハードウェア構成（例えば、ワークステーションやパソコン等の汎用コンピュータ）によって実現される。
【００４４】
図２は、ホストシステム２０の構成を示すブロック図である。図２に示すように、ホストシステム２０は、入力部２１と、表示部２２と、画像データ記録部２３と、撮影座標記録部２４と、プログラム記録部２５と、ＴＶカメラ５０から入力されるビデオ信号を処理するビデオボード２６と、これらの各部及び顕微鏡システム全体の動作を制御する制御部２７とを備える。この他、図示はしないが、ホストシステム２０は、図１に示す顕微鏡システムを構成する各部との間で各種データの授受を管理するインタフェースユニットを備える。
【００４５】
入力部２１は、マウスやキーボード等の入力デバイスによって実現される。入力部２１は、ユーザが各種情報や命令をホストシステム２０に入力する際に用いられる。
表示部２２は、ＬＣＤやＥＬディスプレイ等の表示装置によって実現される。
【００４６】
画像データ記録部２３、撮影座標記録部２４、及びプログラム記録部２５は、例えば、更新記録可能なフラッシュメモリ等のＲＯＭやＲＡＭといった各種ＩＣメモリ、内蔵若しくは外付けハードディスク、又は、ＣＤ−ＲＯＭ等の情報記録媒体及びその読取装置によって実現される。画像データ記録部２３は、ＴＶカメラ５０によって標本Ｓを撮影した画像（以下、観察画像ともいう）を記録する。撮影座標記録部２４は、標本Ｓの観察画像を撮影する際のＸＹＺ座標を記録する。プログラム記録部２５は、顕微鏡システム１の動作を制御するための各種制御プログラムや、これらの制御プログラムの実行中に用いられるデータ等を記録する。
【００４７】
制御部２７は、例えば、プログラム記録部２５に記録されている各種制御プログラムをＣＰＵ（中央演算装置）に読み込んで実行することにより実現される。制御部２７は、蛍光ＶＳ画像領域設定部２７１と、明視野ＶＳ画像取得制御手段としての明視野ＶＳ撮像制御部２７２と、蛍光ＶＳ画像取得制御手段としての蛍光ＶＳ撮像制御部２７３と、フォーカス位置取得部２７４と、ＶＳ画像作成部２７５と、画像合成部２７６とを有し、顕微鏡装置１０の動作を制御するための各種制御信号を生成して顕微鏡コントローラ３０に出力する。また、制御部２７は、ＴＶカメラコントローラ４０に制御信号を送信して、ＴＶカメラ５０による撮影を実行させる。
【００４８】
蛍光ＶＳ画像領域設定部２７１は、ユーザ操作による入力部２１からの入力信号に従って、蛍光ＶＳ画像の取得対象とする標本Ｓ上の領域（以下、注目領域ともいう）を設定する。
【００４９】
明視野ＶＳ撮像制御部２７２は、透過照明光学系１３により標本Ｓに透過照明光を照射して、非蛍光色素で染色された細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素（細胞核等。以下、単に細胞構成要素ともいう）に対応する明視野画像を取得する一連の動作を制御する。
【００５０】
蛍光ＶＳ撮像制御部２７３は、落射照明光学系１４により標本Ｓに落射照明光を照射して、蛍光標識された標的分子に対応する蛍光画像を取得する一連の動作を制御する。
【００５１】
フォーカス位置取得部２７４は、標本Ｓの明視野画像及び蛍光画像を取得する際の合焦位置を実測又は演算により取得する。より詳細には、フォーカス位置取得部２７４は、明視野画像用の合焦位置を取得し、この合焦位置を用いて蛍光画像用の合焦位置を取得する。合焦位置の実測は、フォーカス位置取得部２７４が顕微鏡コントローラ３０を介して電動ステージ１１をＺ方向に移動させながら、ＴＶカメラ５０によって撮像された画像のコントラストを各Ｚ座標について評価することにより行われる。なお、この合焦動作は、ビデオＡＦ機能とも呼ばれる。
【００５２】
ＶＳ画像作成部２７５は、顕微鏡装置１０により標本Ｓの注目領域内を部分的に撮像した複数の明視野画像同士を繋ぎ合わせて明視野ＶＳ画像を作成すると共に、標本Ｓの注目領域内を部分的に撮像した複数の蛍光画像同士を繋ぎ合わせて蛍光ＶＳ画像を作成する。
画像合成部２７６は、明視野ＶＳ画像と蛍光ＶＳ画像とを重ね合わせた合成画像を作成する。
【００５３】
顕微鏡コントローラ３０は、ホストシステム２０からの制御信号に応じて、顕微鏡装置１０全体の動作を制御する。具体的には、顕微鏡コントローラ３０は、顕微鏡装置１０に対し、検鏡法（明視野観察／蛍光観察）の変更、透過照明用光源１３０及び落射照明用光源１４０の調光等といった各部の制御、現在の顕微鏡装置１０の各部の状態の検出及びホストシステム２０への送出等を実行する。また、顕微鏡コントローラ３０は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１及びステージＺ駆動制御部３３に対し、電動ステージ１１の移動を制御するための制御信号を出力する。
【００５４】
ＴＶカメラコントローラ４０は、ホストシステム２０からの制御信号に応じて、ＴＶカメラ５０の動作を制御する。具体的には、ＴＶカメラ５０に対し、自動ゲイン制御のＯＮ／ＯＦＦ、ゲイン設定、自動露出制御のＯＮ／ＯＦＦ、及び露光時間の設定等を実行する。
【００５５】
ＴＶカメラ５０は、標本像（詳細には対物レンズ１５１の視野範囲）を結像するＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を備え、標本像を撮像して標本像の画像データをホストシステム２０に出力する。
【００５６】
次に、実施の形態１に係る顕微鏡システム１の動作について説明する。図３は、実施の形態１に係る顕微鏡システム１の動作を示すフローチャートである。なお、以下に説明する顕微鏡装置１０の操作は、基本的にホストシステム２０の制御の下で顕微鏡コントローラ３０を介して自動的になされるが、ユーザが手動で操作しても良い。
【００５７】
まず、ステップＳ１０において、顕微鏡システム１は、観察法を明視野観察に設定し、顕微鏡装置１０の各部に対し、透過明視野観察法を実行するために各種光学部材の光路への挿脱制御を行う。それに応じて、落射シャッタ１４３が落射照明用の光路Ｌ２に挿入され、透過照明用の光路Ｌ１上の透過シャッタ１３３が開放され、明視野観察用の光学キューブ１６１が選択されて観察光路Ｌに挿入される。それにより、透過照明光が標本Ｓに照射される。
続くステップＳ１１において、顕微鏡装置１０は、低倍（例えば４倍）の対物レンズ１５１を光路に挿入する。
【００５８】
ステップＳ１２において、顕微鏡システム１は、標本Ｓ全体に対応する低解像度の明視野画像を取得する。
図４は、標本Ｓが配置されたスライドガラス１００全体を示す上面図である。以下の説明においては、標本Ｓの一例として、多重染色を施した乳癌組織標本を用いる。多重染色としては、形態観察用の染色として、細胞核に対してヘマトキシリン染色を施し、エストロゲン受容体（以下、単にＥＲとも記す）を認識する抗ＥＲ抗体に対してＡｌｅｘａ５５５で蛍光標識を施し、ＨＥＲ２受容体（以下、単にＨＥＲ２とも記す）を認識する抗ＨＥＲ２抗体に対してＣｙ５で蛍光標識を施すものとする。実施の形態１においては、このような標本Ｓに対して明視野（細胞核）観察及び蛍光観察を行う。なお、ラベルＬＢには、標本Ｓに関する情報が記載されている。
【００５９】
このような標本Ｓに対し、顕微鏡装置１０は、スライドガラス１００上の予め定められた標本サーチ領域Ｒ１（例えば、縦：２５ｍｍ、横：５０ｍｍの領域）を、ＴＶカメラ５０に投影される１ショットの撮像領域に応じて複数の区画に分割する。なお、この撮像領域の大きさ（縦×横の長さ）は、観察光路Ｌ上に挿入された対物レンズ１５１の倍率によって決定される。そして、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１をＸＹ方向に移動させ、これらの各区画をＴＶカメラ５０により順次撮像して、複数の顕微鏡画像（明視野画像）の画像データを取得する。ホストシステム２０は、これらの複数の顕微鏡画像を相互に結合することで、標本サーチ領域Ｒ１の全体画像を生成する。この全体画像に対応する画像データは、画像データ記録部２３にスライドガラス全体像ファイルとして記録される。
【００６０】
ステップＳ１３において、顕微鏡装置１０は、レボルバ１５を回転させ、対物レンズ１５１を高倍（例えば２０倍）のものに交換する。ここで高倍のレンズに交換するのは、明視野観察による高解像度の細胞核像と、蛍光観察による標的分子像とを取得するためである。
【００６１】
ステップＳ１４において、顕微鏡システム１は、標本サーチ領域Ｒ１の内、高解像度の明視野観察及び蛍光観察を行う対象とする注目領域を設定し、注目領域内において合焦位置を実測するポイント（以下、フォーカス位置抽出ポイントと呼ぶ）を抽出する。
【００６２】
より詳細には、顕微鏡システム１は、ステップＳ１２において取得した標本サーチ領域Ｒ１の全体画像から、標本Ｓを含む標本領域Ｒ２を自動検出して表示部２２に表示する。図５は、自動検出された標本領域Ｒ２を示す模式図である。なお、標本領域Ｒ２の自動検出方法としては、既知の画像処理方法が用いられる。
【００６３】
このような標本領域Ｒ２が表示された画面上で、ユーザが入力部２１（例えば、マウス等のポインティングデバイス）を用いて矩形の注目領域Ｒ３、Ｒ４を指定すると、ホストシステム２０は、入力部２１からの入力信号に従って、注目領域Ｒ３、Ｒ４の座標を撮像座標記録部２４に一時的に記憶する。注目領域Ｒ３、Ｒ４としては、通常、腫瘍部のように、ユーザが目視により異常を認識した部分を含む領域が指定される。
【００６４】
なお、顕微鏡システム１は、ユーザに注目領域Ｒ３、Ｒ４を選択させる際に、標本サーチ領域Ｒ１全体を表示部２２に表示するようにしても良いし、標本サーチ領域Ｒ１を表示部２２に表示した上で、標本領域Ｒ２をユーザに目視で指定させるようにしても良い。
【００６５】
さらに、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、顕微鏡システム１は、各注目領域Ｒ３、Ｒ４を格子状に分割して複数の小区画Ｐを設定する。各小区画Ｐは、ＴＶカメラ５０に投影される１ショットの撮像領域に対応しており、各小区画Ｐの大きさ（縦×横の長さ）は対物レンズ１５１の倍率によって決定される。従って、小区画Ｐの大きさは、ステップＳ１２において撮像される１つの区画よりも小さくなる。
【００６６】
そして、顕微鏡システム１は、これらの小区画Ｐの内から、合焦位置を実測する複数の小区画（フォーカス位置抽出ポイント）ＦＰを抽出する。
ここで、全ての小区画Ｐについてフォーカス位置を実測で求めようとすると、非常に多くの時間がかかってしまう。そこで、本実施の形態１においては、全ての小区画Ｐの内からフォーカス位置をサンプリング（実測）する小区画を自動抽出し、それ以外の小区画については、サンプリングされた値に基づいて演算により求める。なお、フォーカス位置抽出ポイントの自動抽出方法は任意で良く、ランダムであっても良いし、規則的（例えば３区画おき）であっても良い。
【００６７】
自動抽出されたフォーカス位置抽出ポイントＦＰは、明視野画像を取得する際のフォーカス位置の実測ポイントとして用いられる。また、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントは、好ましくは、明視野画像用のフォーカス位置抽出ポイントＦＰからさらに絞り込まれる。これは、蛍光観察は基本的に暗視野で行われ、撮像に時間がかかるため、フォーカス位置の実測処理においては明視野観察の場合よりも数倍〜数十倍、時間を要するからである。そのため、実施の形態１においては、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイント数を絞ることにより、全体の処理時間の短縮を図っている。なお、明視野画像用のフォーカス位置抽出ポイントＦＰから蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントを抽出する方法は任意で良く、ランダムに抽出しても良いし、規則的に間引くことにより抽出しても良い。以下において、明視野画像用として抽出されたフォーカス位置抽出ポイントＦＰの内、蛍光画像用のフォーカス位置抽出ポイントとして抽出されたポイントをポイントＡと呼び、抽出されなかったポイントをポイントＢと呼ぶ。
【００６８】
続くステップＳ１５において、顕微鏡システム１は、明視野画像用及び蛍光画像用のフォーカスマップを、各注目領域Ｒ３、Ｒ４について作成する。より詳細には、明視野画像用の合焦位置の実測及び算出を行ってフォーカスマップを作成した後、明視野画像用の合焦位置に基づき、蛍光画像用の合焦位置の実測及び算出を標的分子（ＥＲ、ＨＥＲ２）毎に行い、ＥＲ用及びＨＥＲ２用のフォーカスマップをそれぞれ作成する。図７は、フォーカスマップの一例を示す図である。図７に示すように、フォーカスマップＭは、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の各小区画Ｐに割り当てられた座標番号（（００１，００１）、（００２，００１）、…）と、各小区画Ｐを撮像する際の電動ステージ１１の座標情報（ステージ座標）とを含む。各座標情報は、小区画Ｐを対物レンズ１５１の光軸に合わせたときの電動ステージ１１のＸ座標及びＹ座標、及び、合焦位置を表すＺ座標とからなる。このようなフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に記録される。フォーカスマップ作成の詳細な処理については後述する。
【００６９】
ステップＳ１６において、顕微鏡システム１は、フォーカスマップＭに基づいて顕微鏡装置１０を動作させ、高倍の対物レンズ１５１を用いて注目領域Ｒ３、Ｒ４に対応する高解像度の明視野画像及び蛍光画像を取得する。
【００７０】
より詳細には、顕微鏡装置１０は、フォーカスマップに登録されている座標情報に従って電動ステージ１１を移動させ、小区画Ｐ毎に合焦位置を調節する。そして、透過照明光学系１３及び落射照明光学系１４を順次動作させて、各小区画Ｐの明視野画像、ＥＲ画像、及びＨＥＲ２画像をＴＶカメラ５０に撮像させる。ホストシステム２０は、ＴＶカメラ５０から入力された画像を、画像の種類（明視野画像及び各種蛍光画像）毎に、隣接する小区画Ｐの画像と結合する。このような画像の入力及び結合処理を、フォーカスマップＭに登録された全小区画Ｐに対して繰り返すことにより、広視野且つ高精細な注目領域Ｒ３、Ｒ４の全体画像（ＶＳ画像）が作成される。これらのＶＳ画像に対応する画像ファイルは、画像データ記録部２３に格納される。なお、ＶＳ画像を画像データ記録部２３に記録する際には、ＪＰＥＧ、ＪＰＥＧ２０００等の公知の圧縮アルゴリズムにより圧縮しても良い。
【００７１】
図８は、画像データ記録部２３に格納される画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。図８に示すように、画像ファイル６は、付帯情報６１、標本全体画像データ６２、及び注目領域指定情報６３を含む。
【００７２】
付帯情報６１は、スライド番号６１１、スライドガラス全体像（即ち、標本サーチ領域Ｒ１）の撮像倍率６１２、蛍光色素数（ｍ）６１３、蛍光色素＃１情報〜蛍光色素＃ｍ情報６１４といった情報を含む。スライド番号は、スライドガラス１００に任意に割り当てられる識別番号である。この識別番号は、例えばラベルＬＢ（図４参照）に印刷されたバーコードを図示しないバーコードリーダで読み込むことにより、ホストシステム２０に入力される。また、スライドガラス全体像の撮像倍率は、ステップＳ１２において標本サーチ領域Ｒ１を撮像した際に使用した低倍率の対物レンズ１５１の倍率である。蛍光色素数（ｍ）は、標本Ｓの染色に使用した蛍光色素の種類の数であり、実施の形態１においては、Ａｌｅｘａ５５５、Ｃｙ５の２種類（ｍ＝２）である。蛍光色素＃１情報〜蛍光色素＃ｍ情報は、使用した各蛍光色素に関する情報を含む。
【００７３】
標本全体画像データ６２は、ステップＳ１２において取得した標本サーチ領域Ｒ１に対応する低解像度画像の画像データを含む。
【００７４】
注目領域指定情報６３は、注目領域指定数（ｎ）６３１、注目領域＃１情報〜注目領域＃ｎ情報６３２といった情報を含む。注目領域指定数（ｎ）６３１は、標本領域Ｒ２からユーザが注目領域として指定した領域の数であり、実施の形態１においては、注目領域Ｒ３及びＲ４の２つである（ｎ＝２）。
【００７５】
各注目領域＃ｊ情報６３２（ｊ＝１、２、…、ｎ）は、撮像情報６３２ａ、フォーカスマップデータ６３２ｂ、及び画像データ６３２ｃを含む。撮像情報６３２ａは、撮像倍率６３２ａ−１、スキャン（Ｓｃａｎ）開始ステージＸ座標６３２ａ−２、スキャン（Ｓｃａｎ）開始ステージＹ座標６３２ａ−３、Ｘ方向のピクセル数６３２ａ−４、Ｙ方向のピクセル数６３２ａ−５といった情報を含む。この内、撮像倍率は、ステップＳ１６において注目領域Ｒ３、Ｒ４を撮像した際に使用した高倍率の対物レンズ１５１の倍率である。また、スキャン開始ステージＸ座標及びＹ座標は、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の小区画Ｐの撮像を開始した位置座標であり、通常は、各注目領域Ｒ３、Ｒ４の左上の小区画Ｐの位置となる（図６Ａ、図６Ｂ参照）。Ｘ方向及びＹ方向のピクセル数は、注目領域Ｒ３、Ｒ４のＸ方向及びＹ方向の各辺に含まれる注目領域画像の画素数である。
【００７６】
フォーカスマップデータ６３２ｂは、ステップＳ１５において作成されたフォーカスマップＭに関する情報を含む。画像データ６３２ｃは、ステップＳ１６において取得された各注目領域Ｒ３、Ｒ４のＶＳ画像（明視野（細胞核）画像、ＥＲ画像、及びＨＥＲ２画像）に対応する画像データである。
【００７７】
ステップＳ１７において、顕微鏡システム１は、画像データ記録部２３に格納された画像ファイルに基づいて、標本ＳのＶＳ画像を表示部（モニタ）２２に表示する。この際、ホストシステム２０は、明視野（細胞核）画像に例えばＢ（青）チャネル、ＥＲ画像を例えばＧ（緑）チャネル、ＨＥＲ２画像を例えばＲ（赤）チャネルに割り当て、これらの画像を重ね合わせて表示する。或いは、ホストシステム２０は、入力部２１を介してユーザにより入力された入力信号に従い、明視野画像に対して所望の蛍光画像を重ね合わせた画像を表示しても良い。なお、各画像に割り当てるチャネルは、ユーザ所望の設定にすることができる。
【００７８】
次に、ステップＳ１５におけるフォーカスマップの作成処理について詳細に説明する。図９は、フォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。
まず、明視野画像用のフォーカスマップを作成する。即ち、ステップＳ１０１において、顕微鏡システム１は、ステップＳ１４において抽出した各フォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける合焦位置を実測する。より詳細には、顕微鏡装置１０は、対物レンズ１５１の光軸にフォーカス位置抽出ポイントＦＰが合うように、電動ステージ１１をＸＹ平面内で移動させる。続いて、ホストシステム２０は、電動ステージ１１をＺ方向に移動させながらＴＶカメラ５０により撮像された画像の入力を受け付け、画像の明るさやコントラストを評価することにより、合焦位置を求める。このようにして実測された各フォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００７９】
続くステップＳ１０２において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰとして抽出されなかった各小区画Ｐの合焦位置を、近傍で実測された合焦位置に基づいて補間演算を行うことにより算出する。算出された各小区画Ｐの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
以上の処理により、高解像度の明視野画像用のフォーカスマップＭが完成する。このフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に格納される。
【００８０】
続いて、蛍光画像用のフォーカスマップの作成処理に移行する。実施の形態１においては、ＥＲ及びＨＥＲ２の２種類の蛋白の発現を観察するため、注目領域Ｒ３、Ｒ４の各々に対してＥＲ用及びＨＥＲ２用（即ち、計４個）のフォーカスマップを作成する。
【００８１】
ステップＳ１０３において、顕微鏡システム１は、観察法を観察対象の標的分子に合わせた蛍光観察に切り替える。それに応じて、透過シャッタ１３３が透過照明用の光路Ｌ１に挿入され、落射照明用の光路Ｌ２上の落射シャッタ１４３が開放され、標的分子の観察用の光学キューブ（例えばＥＲ用）１６１が選択されて観察光路Ｌに挿入される。それにより、標的分子に対応する励起光が標本Ｓに照射される。
【００８２】
続くステップＳ１０４において、顕微鏡システム１は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰの内、蛍光画像用に抽出された全てのポイントＡにおける合焦位置を実測する。より詳細には、顕微鏡装置１０は、対物レンズ１５１の光軸にポイントＡが合うように、電動ステージ１１をＸＹ平面内で移動させる。続いて、ホストシステム２０は、電動ステージ１１をＺ方向に移動させながらＴＶカメラ５０により撮像された画像の入力を受け付け、画像の明るさやコントラストを評価することにより、合焦位置を求める。この際、顕微鏡コントローラ３０は、ステップＳ１０１において実測された明視野画像用の合焦位置を中心とした所定の範囲内（例えば標本Ｓの厚さを考慮に入れた範囲内）で電動ステージ１１をＺ方向に上下させると良い。それにより、合焦位置の実測処理の高速化を測ることができる。
このようにして取得された各ポイントＡの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８３】
ステップＳ１０５において、ホストシステム２０は、ポイントＡにおける合焦位置の実測値から、次の統計量を算出する。即ち、あるポイントＡについてステップＳ１０１において実測した明視野画像用の合焦位置と、これに対応するＸＹ座標のポイントＡについてステップＳ１０４において実測した蛍光画像用の合焦位置との差分を算出する。そして、全てのポイントＡにおける当該差分の平均値μ及び標準偏差δを算出する。
【００８４】
ホストシステム２０は、標準偏差δが所定値（例えば、使用中の対物レンズ１５１の被写界深度の１／２）以下である場合（ステップＳ１０６：Ｙｅｓ）、明視野画像用の合焦位置から蛍光画像用の合焦位置を推定可能と判断し、全てのポイントＢにおける蛍光画像用の合焦位置をオフセットで決定する（ステップＳ１０７）。具体的には、明視野画像用の合焦位置座標ＺBF及び差分の平均値μから算出した値ＺBF−μを、蛍光画像用の合焦位置座標とする。このように算出されたポイントＢの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８５】
一方、顕微鏡システム１は、標準偏差δが上記所定値よりも大きい場合（ステップＳ１０６：Ｎｏ）、全てのポイントＢにおける蛍光画像用の合焦位置を実測する（ステップＳ１０８）。実測されたポイントＢの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００８６】
図１０は、ポイントＢにおける合焦位置を実測する処理を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ１２１において、顕微鏡システム１は、各ポイントＢの近傍（例えば５区画以内）に蛍光画像用の合焦位置を実測した小区画Ｐが存在するか否かを判定する。なお、近傍の範囲は注目領域Ｒ３、Ｒ４の面積に応じて可変としても良い。顕微鏡システム１は、近傍に合焦位置を実測した小区画Ｐが存在する場合（ステップＳ１２１：Ｙｅｓ）、近傍の小区画Ｐの合焦位置座標を当該ポイントＢのＺ座標に設定して、第１の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２２）。
【００８７】
続くステップＳ１２３において、顕微鏡システム１は、第１の蛍光画像の合焦評価を行う。合焦評価は、既知の様々な方法で行って良い。例えば、第１の蛍光画像の明るさやコントラストを、ステップＳ１０４において実行した合焦評価演算（明るさやコントラストの評価）の平均値と比較することにより、標本状態に応じた合焦評価を行うことができる。
【００８８】
ステップＳ１２３における合焦評価の結果、第１の蛍光画像が合焦状態にあると判定された場合（ステップＳ１２３：Ｙｅｓ）、ホストシステム２０は、第１の蛍光画像を撮像した際のＺ座標（即ち、近傍で実測された合焦位置座標と同じ値）を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する（ステップＳ１３３）。
【００８９】
第１の蛍光画像が合焦状態にないと判定された場合（ステップＳ１２３：Ｎｏ）、又は、当該ポイントＢの近傍に合焦位置を実測した小区画Ｐが存在しない場合（ステップＳ１２１：Ｎｏ）、処理はステップＳ１２４に移行する。
【００９０】
ステップＳ１２４において、顕微鏡システム１は、当該ポイントＢにおいて実測された明視野画像用の合焦位置座標ＺBFを取得し、この座標値ＺBF及びステップＳ１０５において算出した差分の平均値μを用いて値ＺBF−μを算出する。そして、Ｚ座標を値ＺBF−μに設定して、ポイントＢにおける第２の蛍光画像を取得する。
続くステップＳ１２５において、顕微鏡システム１は、第２の蛍光画像の合焦評価を行う。合焦評価の詳細については、ステップＳ１２３と同様である。
【００９１】
ステップＳ１２５における合焦評価の結果、第２の蛍光画像が合焦状態にあると判定された場合（ステップＳ１２５：Ｙｅｓ）、ホストシステム２０は、この値ＺBF−μを当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する（ステップＳ１３３）。
【００９２】
一方、第２の蛍光画像が合焦状態にないと判定された場合（ステップＳ１２５：Ｎｏ）、ホストシステム２０は、明視野画像用の合焦位置座標ＺBF、並びに差分の平均値μ及び標準偏差δを用いて、値ＺBF−μ−δを算出する。そして、Ｚ座標を値ＺBF−μ−δに設定して、ポイントＢにおける第３の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２６）。
【００９３】
ステップＳ１２７において、ホストシステム２０は、第２の蛍光画像と第３の蛍光画像との合焦状態を比較する。なお、図１０においては、不等号の大きい方が、合焦状態がより良好であることを示している。
【００９４】
第３の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１２７：Ｙｅｓ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ〜ＺBF−μ−２δの範囲内で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１２８）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢにおける合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
【００９５】
一方、第２の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１２７：Ｎｏ）、顕微鏡システム１は、Ｚ座標を値ＺBF−μ＋δに設定して、ポイントＢにおける第４の蛍光画像を取得する（ステップＳ１２９）。
【００９６】
ステップＳ１３０において、ホストシステム２０は、第２の蛍光画像と第４の蛍光画像との合焦状態を比較する。そして、第４の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１３０：Ｙｅｓ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ〜ＺBF−μ＋２δの範囲内で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１３１）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
【００９７】
一方、第２の蛍光画像の方が、合焦状態がより良好である場合（ステップＳ１３０：Ｎｏ）、顕微鏡システム１は、電動ステージ１１のＺ座標を値ＺBF−μ−δ〜ＺBF−μ＋δの範囲で移動させながら、ポイントＢにおける合焦位置を探索する（ステップＳ１３２）。その後、処理はステップＳ１３３に移行し、探索結果を当該ポイントＢの合焦位置座標として、フォーカスマップＭに記録する。
これらのステップＳ１２１〜Ｓ１３３が全てのポイントＢに対してなされた後、処理はメインルーチンに戻る。
【００９８】
再び図９を参照すると、ステップＳ１０９において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰ（ポイントＡ及びＢ）以外の小区画Ｐの合焦位置を、近傍のフォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標に基づき補間演算により求める。算出された各小区画Ｐの合焦位置座標は、フォーカスマップＭに記録される。
【００９９】
観察対象とする他の標的分子（例えば、ＨＥＲ２）がさらにある場合（ステップＳ１１０：Ｙｅｓ）、処理はステップＳ１０３に戻る。一方、観察対象とする他の標的分子がない場合（ステップＳ１１０：Ｎｏ）、処理はメインルーチンに戻る。
【０１００】
これらのステップＳ１０３〜Ｓ１１０により、標的分子毎（例えば、ＥＲ用及びＨＥＲ２用）のフォーカスマップＭが完成する。これらのフォーカスマップＭは、撮像座標記録部２４に格納される。
【０１０１】
なお、ステップＳ１２６においては、合焦位置の探索範囲を決定する際に、差分の標準偏差δを用いて基準の座標値ＺBF−μからの移動方向（プラス方向／マイナス方向）を判定しているが、対物レンズの被写界深度といった規定の値を用いてこの判定を行っても良い。また、ステップＳ１２８及びＳ１３１においては、合焦位置を探索する範囲を２δとしているが、合焦位置の検出精度をより向上させるために、３δの範囲で探索を行うこととしても良い。
【０１０２】
また、ステップＳ１２４、Ｓ１２６、Ｓ１２９における蛍光画像の取得の際に、座標値ＺBF−μ、ＺBF−μ−δ、ＺBF−μ＋δのいずれにおいても所定の光量又はコントラストが得られなかった場合、標的分子が存在しないと判断し、「フォーカス位置なし」を示す値をフォーカスマップＭに記録しても良い。更に、明視野画像用の合焦位置ＺBFが「フォーカス位置なし」と判断された場合は、蛍光画像のフォーカス位置を求めずに「フォーカス位置なし」と設定するようにしてもよい。
【０１０３】
また、ステップＳ１６において、細胞核を表す明視野ＶＳ画像と各種の標的分子を表す蛍光ＶＳ画像とを重ね合わせる際に、ヘマトキシリン（細胞核）、ＥＲ、ＨＥＲ２をＲＧＢチャネルに割り当てて合成表示を行ったが、例えば特開２０１０−１３４１９５号公報に開示されているように、標本Ｓを染色した各色素を仮想的なスペクトルを有する色素に変換して合成を行うことにより、ＲＧＢ表色系では表示しきれない４種類以上の多重染色標本を合成表示しても良い。
【０１０４】
以上説明したように、実施の形態１においては、細胞構成要素（細胞核）を非蛍光色素により染色し、検出目的とする標的分子を蛍光色素によって標識した多重染色標本を観察する際に、低解像度の明視野観察により取得した明視野画像上で領域選択した上で、選択された領域に対し、高解像度の明視野観察により取得した明視野画像から明視野ＶＳ画像を作成すると共に、蛍光観察により取得した蛍光画像から蛍光ＶＳ画像を作成する。その際に、明視野画像の取得の際に使用した合焦位置を用いて、蛍光画像の取得に用いる合焦位置を決定するので、蛍光画像用の合焦位置合わせ速度を向上させることができる。それにより、精度の良い蛍光ＶＳ画像を従来よりも短時間に作成することができると共に、励起光による標本の退色を軽減することが可能となる。
【０１０５】
また、実施の形態１によれば、明視野画像用の合焦位置座標と蛍光画像用の合焦位置座標との差の分布（統計量）に基づいて蛍光画像用の合焦位置座標の取得方式を決定するので、標本における標的分子の発現を効率的、且つ精度良く検出することが可能となる。
【０１０６】
また、実施の形態１によれば、低解像度の明視野観察により取得された標本Ｓ全体に対応する明視野ＶＳ画像を画面表示するので、腫瘍部といった領域の選択をユーザが容易に行うことができる。このため、ユーザが蛍光画像のみを見ながら領域選択する場合に生じ得る選択ミスを抑制することができる。また、ユーザが対象部位を検索する時間を短縮することができるので、標本の退色を防止することが可能となる。加えて、蛍光顕微鏡の熟練者でなくても、簡単に領域選択を行うことができる。
【０１０７】
また、実施の形態１によれば、細胞核を明視野観察した明視野ＶＳ画像に、標的分子を蛍光観察した蛍光ＶＳ画像を重ねて表示するので、標本の全体像を容易に把握することができると共に、細胞核の画像をランドマークとして、標的分子が発現している細胞を識別することが可能となる。
【０１０８】
また、実施の形態１によれば、病変部等における複数種類の標的分子の発現評価を、細胞単位でタイプ別に分類して表示することができる。また、タイプ別に細胞を特異的に表示することにより、タイプ別の細胞の分布確認を容易に行うことができる。従って、標的分子の発現量等を数値化して、治療法の選択や予後予測等に活用することが可能となる。さらに、複数種類の標的分子の発現と形態情報との関係を数値化して比べることもできるようになるので、ＨＥ染色で得られる細胞核等の形態情報から、細胞タイプを推測することも可能となる。
【０１０９】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
実施の形態２に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態１と同様であり、フォーカスマップの作成処理（図３のステップＳ１５）が実施の形態１とは異なる。より詳細には、実施の形態１においては、まず明視野画像用のフォーカスマップを作成し、これを利用して蛍光画像用のフォーカスマップを作成した。これに対し、実施の形態２においては、ステップＳ１４において抽出したフォーカス位置抽出ポイント毎に、明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を取得する。それにより、電動ステージ１１の移動及び光学キューブ１６１の切替回数を必要最小限に留め、フォーカスマップの作成時間を短縮することを特徴とする。
【０１１０】
図１１は、実施の形態２におけるフォーカスマップの作成処理を示すフローチャートである。なお、以下の説明においては、一例として、明視野画像、ＥＲ蛍光画像、及びＨＥＲ２蛍光画像を取得する際に用いる３種類のフォーカスマップを作成する。
【０１１１】
まず、ステップＳ２０１において、顕微鏡システム１は、ＥＲ蛍光画像用の光学キューブ１６１を選択して観察光路Ｌに挿入する。この際、Ａｌｅｘａ５５５色素で標識されたＥＲ抗体の蛍光画像を取得するため、青色〜緑色の波長領域（波長が４５０ｎｍ〜５７０ｎｍ）の可視光の透過率が高い光学キューブ１６１を選択する。この他、発現量が高い抗体が標識されている蛍光色素用の特定の光学キューブ１６１を選択しても良い。
【０１１２】
ステップＳ２０２において、顕微鏡コントローラ３０は、ステージＸ−Ｙ駆動制御部３１を介して、ステップＳ１４で抽出したフォーカス位置抽出ポイントＦＰが対物レンズ１５１の光軸に合うように、電動ステージ１１をＸＹ方向に移動させる。
【０１１３】
続くステップＳ２０３において、顕微鏡システム１は、標本Ｓに対する照明を透過照明光に切り替える。即ち、落射シャッタ１４３を落射照明用の光路Ｌ２に挿入すると共に、透過照明用の光路Ｌ１に挿入された透過シャッタ１３３を開放して、透過照明光を標本Ｓに照射する。
ステップＳ２０４において、顕微鏡システム１は、明視野画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標を明視野画像用のフォーカスマップＭに記録する。
【０１１４】
続くステップＳ２０５において、顕微鏡システム１は、標本Ｓに対する照明を落射照明光に切り替える。即ち、透過シャッタ１３３を透過照明用の光路Ｌ１に挿入すると共に、落射照明用の光路Ｌ２に挿入された落射シャッタ１４３を開放し、さらに、ＥＲ蛍光観察用の上記光学キューブ１６１を観察光路Ｌに挿入して、落射照明光を標本Ｓに照射する。
ステップＳ２０６において、顕微鏡システム１は、ＥＲ蛍光画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標をＥＲ蛍光画像用のフォーカスマップＭに記録する。
【０１１５】
続くステップＳ２０７において、顕微鏡システム１は、ＨＥＲ２蛍光画像用の合焦位置を求め、その合焦位置座標をＨＥＲ２蛍光画像用のフォーカスマップＭに記録する。この合焦位置座標は、ＥＲ蛍光画像用及び／又は明視野画像用に実測した合焦位置座標に対し所定のオフセット値を加算することにより求めても良いし、実測により求めても良い。また、実測する場合には、光学キューブ１６１をＨＥＲ２蛍光観察用のものに切り替える。
【０１１６】
ここで用いるオフセット値としては、例えば、基準標本や標本Ｓの一領域を用いて、ＥＲ蛍光画像用及び／又は明視野画像用に実測した合焦位置座標に対するＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置のずれを事前に実験により求めておき、そのずれの値を用いてもよい。この際、複数ポイントにおける合焦位置のずれを求め、それらの平均値をオフセット値としても良い。
【０１１７】
ステップＳ２０８において、ホストシステム２０は、ステップＳ１４で抽出した全てのフォーカス位置抽出ポイントＦＰについて合焦位置を取得した否かを判定する（ステップＳ２０８）。全てのフォーカス位置抽出ポイントＦＰについて合焦位置を取得した場合（ステップＳ２０８：Ｙｅｓ）、処理はステップＳ２０９に移行する。一方、まだ合焦位置を取得していないフォーカス位置抽出ポイントＦＰが存在する場合（ステップＳ２０８：Ｎｏ）、処理はステップＳ２０２に戻る。
【０１１８】
この場合、繰り返し後のステップＳ２０４においては、蛍光観察用の光学キューブ１６１を観察光路Ｌに挿入したまま明視野画像の合焦位置の実測を行っても良い。それにより、光学キューブ切換部１６における光学キューブ１６１の切り替え回数を削減することができる。また、ステップＳ２０７においてＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置を実測により求める場合、ステップＳ２０６及びステップＳ２０７の順序を交互に入れ替えても良い。即ち、あるフォーカス位置抽出ポイントＦＰに対しては、ステップＳ２０６→Ｓ２０７の順で処理を実行し、次のフォーカス位置抽出ポイントＦＰに対しては、ステップＳ２０７→Ｓ２０６の順で処理を実行する。それにより、ＥＲ用及びＨＥＲ２用の光学キューブ１６１の切り替え回数をさらに削減することができる。
【０１１９】
ステップＳ２０９において、ホストシステム２０は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰ以外の小区画Ｐの合焦位置を、近傍に存在するフォーカス位置抽出ポイントＦＰの合焦位置座標に基づき補間演算を行うことにより求める。それにより、明視野画像用、ＥＲ蛍光画像用、及びＨＥＲ２蛍光画像用の３種類のフォーカスマップＭが完成する。その後、処理はメインルーチンに戻る。
【０１２０】
以上説明したように、実施の形態２によれば、フォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける合焦位置を求める際に、電動ステージ１１の移動回数及び光学キューブ１６１の切替回数を削減することができるので、複数種類のフォーカスマップを効率良く作成することが可能となる。
【０１２１】
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について説明する。
実施の形態３に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態１と同様であり、フォーカスマップの作成処理（図３のステップＳ１５）及びＶＳ画像の表示処理（ステップＳ１７）が実施の形態１とは異なる。より詳細には、実施の形態３においては、図１２に示すように、１つの明視野ＶＳ画像ＧBFを作成すると共に、この明視野ＶＳ画像ＧBF上の合焦位置座標ＺBFを基準として、標的分子毎（本実施の形態では、ＥＲ用及びＨＥＲ２用）に合焦位置座標（ＥＲ用の合焦位置座標ＺER、ＨＥＲ２用の合焦位置座標ＺHER2）を求める。そして、各合焦位置座標ＺER、ＺHER2、及びそれらの周辺の座標ＺER(k)、ＺHER2(k)（ｋ＝１、２、…、及び１’、２’、…）において、各標的分子に対応する蛍光ＶＳ画像（ＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER、ＧER(k)、及び、ＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2、ＧHER2(k)）を作成する。さらに、これらの蛍光ＶＳ画像を標的分子毎に重ね合わせて合成することにより、３次元的な蛍光ＶＳ画像を標的分子毎に構成する。なお、図１２においては、各ＶＳ画像ＧBF、ＧER、ＧER(k)、ＧHER2、及びＧHER2(k)をＺ座標軸と対応付けられたバーによって表している。また、図１２においては、模式的に、各ＶＳ画像ＧBF、ＧER、ＧER(k)、ＧHER2、及びＧHER2(k)内の合焦位置座標（Ｚ座標）を全て等しいものとして示しているが、これらのＺ座標は実測又は演算により個別に取得されるため、実際には全て等しくなるわけではなく、３次元的に構成されるものである。
【０１２２】
次に、実施の形態３における顕微鏡システム１の動作について説明する。
高解像度の明視野画像用のフォーカスマップの作成処理及び明視野画像ＧBFの取得処理については、実施の形態１において説明したものと同様である（図３及び図９参照）。
【０１２３】
一方、蛍光画像については、以下のようにして取得される。図１３は、実施の形態３における蛍光画像の取得処理を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ３０１において、ホストシステム２０は、注目領域Ｒ３、Ｒ４内の各小区画Ｐにおける明視野画像用の合焦位置座標ＺBFを取得する。
【０１２４】
続くステップＳ３０２において、ホストシステム２０は、明視野画像用の合焦位置座標ＺBFに所定のオフセット値α１、α２をそれぞれ加えたＺ座標の値ＺER及びＺHER2を、ＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER、及びＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2の合焦中心位置として設定してフォーカスマップを作成する。このオフセット値α１、α２としては、実施の形態１と同様に、基準標本や標本Ｓの一領域を用いて、明視野画像用に実測した合焦位置座標に対するＥＲ蛍光画像及びＨＥＲ２蛍光画像の合焦位置のずれをそれぞれ事前に実験により求めておき、それらのずれの値を用いても良い。
【０１２５】
ステップＳ３０３において、顕微鏡システム１は、ステップＳ３０２において作成したフォーカスマップに基づき、各小区画Ｐについて、合焦中心位置ＺER、及びそこから上下方向に所定の間隔Δずつ離れた位置ＺER±Δ、ＺER±２Δ、…におけるＥＲ蛍光画像をＴＶカメラ５０によって取得する。ここで、間隔Δは、対物レンズ１５１の焦点深度に基づいて予め設定された値である。同様にして、顕微鏡システム１は、合焦中心位置ＺHER2、及びそこから上下方向に所定の間隔Δずつ離れた位置ＺHER2±Δ、ＺHER2±２Δ、…におけるＨＥＲ２蛍光画像をＴＶカメラ５０によって取得する。
【０１２６】
この際、蛍光画像を取得するＺ座標の配列順に電動ステージ１１を移動させると良い。それにより、電動ステージ１１の移動時間を短縮することができる。また、ある小区画ＰについてＺ座標の配列順に蛍光画像を取得した場合には、その隣の小区画Ｐについて、Ｚ座標の逆配列順に蛍光画像を取得すると良い。それにより、電動ステージ１１の移動時間をさらに短縮することができる。
【０１２７】
続くステップＳ３０４において、ホストシステム２０は、Ｚ座標の配列順毎に、互いに隣接する小区画Ｐに対応するＥＲ蛍光画像を繋ぎ合わせて、複数の蛍光ＶＳ画像ＧER、ＧER(k)を作成する。ＨＥＲ２蛍光画像についても同様に繋ぎ合わせて、複数の蛍光ＶＳ画像ＧHER2及びＧHER2(k)を作成する。
【０１２８】
さらに、ホストシステム２０は、明視野画像上に、作成した蛍光ＶＳ画像群を標的分子毎に、Ｚ座標の配列順となるように重ね合わせる。それにより、細胞構成要素（細胞核等）上に標的分子が３次元的に表示された画像が生成される。具体的には、明視野ＶＳ画像ＧBFにＥＲ用の蛍光ＶＳ画像ＧER及びＧER(k)を重ね合わせた３次元的な合成画像と、明視野ＶＳ画像ＧBFにＨＥＲ２用の蛍光ＶＳ画像ＧHER2及びＧHER2(k)を重ね合わせた３次元的な合成画像とが生成される。
【０１２９】
なお、明視野画像と蛍光画像を合成表示する際には、ＥＲ用３次元蛍光画像、ＨＥＲ２用３次元蛍光画像毎に、同一ＸＹ座標上で一番輝度の高い画素を持つＺ座標の画素のみを選択することにより、各々２次元画像化して、明視野画像、ＥＲ蛍光画像、ＨＥＲ２蛍光画像を表示することも可能である。
また、３次元の広視野且つ高精細な画像の取得方法の詳細については、特開２００６−３４３５７３号公報も参照されたい。
【０１３０】
以上説明したように、実施の形態３によれば、細胞核等の細胞構成要素上に標的分子が３次元的に合成表示された画像を生成することができる。また、実施の形態３によれば、蛍光画像用の合焦位置算出を実測しないで済むので、処理時間を短縮でき、３次元のＶＳ画像を高速に作成することが可能となる。さらに、例えばマルチカラーＦＩＳＨ標本のように、複数の遺伝子をターゲットに蛍光標識を行った場合、細胞核内で互いに異なるＺ座標に位置する複数種類の遺伝子の発現をもれなく画像化することができるので、診断の際の見落としを低減することが可能となる。
【０１３１】
以上説明した実施の形態１〜３においては、１種類の非蛍光染色と、２種類の蛍光染色とを組み合わせた３種類の多重染色を行ったが、本実施の形態は、非蛍光染色を含む少なくとも２種類の染色法を施した多重染色標本に対して適用することができる。
【０１３２】
また、本発明は、上記した各実施の形態そのままに限定されるものではなく、各実施の形態に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成することができる。例えば、実施の形態に示される全構成要素からいくつかの構成要素を除外して形成してもよい。あるいは、異なる実施の形態に示した構成要素を適宜組み合わせて形成してもよい。
【符号の説明】
【０１３３】
１ 顕微鏡システム
１０ 顕微鏡装置
１１ 電動ステージ
１２ 顕微鏡本体
１３ 透過照明光学系
１３０ 透過照明用光源
１３１ コレクタレンズ
１３２ 透過用フィルタユニット
１３３ 透過シャッタ
１３４ 透過視野絞り
１３５ 透過開口絞り
１３６ 折曲げミラー
１３７ コンデンサ光学素子ユニット
１３８ トップレンズユニット
１４ 落射照明光学系
１４０ 落射照明用光源
１４１ コレクタレンズ
１４２ 落射用フィルタユニット
１４３ 落射シャッタ
１４４ 落射視野絞り
１４５ 落射開口絞り
１５ レボルバ
１５１、１５１ａ、１５１ｂ 対物レンズ
１６ 光学キューブ切換部
１６１、１６１ａ、１６１ｂ 光学キューブ
１７ 鏡筒
１７１ 双眼部
１７２ ビームスプリッタ
２０ ホストシステム
２１ 入力部
２２ 表示部
２３ 画像データ記録部
２４ 撮影座標記録部
２５ プログラム記録部
２６ ビデオボード
２７ 制御部
２７１ 蛍光ＶＳ画像領域設定部
２７２ 明視野ＶＳ撮像制御部
２７３ 蛍光ＶＳ撮像制御部
２７４ フォーカス位置取得部
２７５ ＶＳ画像作成部
２７６ 画像合成部
３０ 顕微鏡コントローラ
３１ ステージＸ−Ｙ駆動制御部
３２、３４ モータ
３３ ステージＺ駆動制御部
４０ ＴＶカメラコントローラ
５０ ＴＶカメラ
１００ スライドガラス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
前記フォーカス位置取得手段は、
前記標本内から前記第１の合焦位置を実測する複数の抽出ポイントを抽出し、該複数の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置を実測により取得すると共に、前記複数の抽出ポイントの内の少なくとも一部における前記第２の合焦位置を実測により取得することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記フォーカス位置取得手段は、
前記複数の抽出ポイントの各々における前記第２の合焦位置を取得する際に、同一の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置からの所定のオフセットを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記標本の観察法に応じて光路に選択的に挿入される光学キューブを切り換える光学キューブ切換部をさらに備え、
前記フォーカス位置取得手段は、前記第１の合焦位置を取得する場合に、前記蛍光画像観察用の光学キューブを前記光路に挿入したままの状態で前記第１の合焦位置を実測により取得することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記第１の合焦位置を基準として光軸方向に複数の座標値を設定し、該複数の座標値において複数の蛍光画像をそれぞれ取得する処理を、前記光軸に直交する面を分割した複数の小区画の各々について実行する制御を行い、前記複数の座標値の配列順毎に、互いに隣接する前記小区画に対応する複数の蛍光画像を相互に繋ぎ合わせることにより、複数の蛍光バーチャル画像を作成することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記明視野バーチャルスライド画像と前記蛍光バーチャルスライド画像とを重ね合わせた合成画像を作成する画像合成手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記標本は、２種類以上の標的分子にそれぞれ対応する２種類以上の蛍光色素により標識がなされており、
前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記標的分子の種類ごとに前記蛍光バーチャルスライド画像を取得することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記明視野バーチャルスライド画像を用いて、前記標本の内、前記蛍光バーチャルスライド画像の取得対象とする領域を設定する領域設定手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記細胞構成要素は細胞核であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡システム。
【請求項１１】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する標本画像生成方法において、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成方法。
【請求項１２】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する処理をコンピュータに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成プログラム。
【請求項１】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
前記フォーカス位置取得手段は、
前記標本内から前記第１の合焦位置を実測する複数の抽出ポイントを抽出し、該複数の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置を実測により取得すると共に、前記複数の抽出ポイントの内の少なくとも一部における前記第２の合焦位置を実測により取得することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記フォーカス位置取得手段は、
前記複数の抽出ポイントの各々における前記第２の合焦位置を取得する際に、同一の抽出ポイントにおける前記第１の合焦位置からの所定のオフセットを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記標本の観察法に応じて光路に選択的に挿入される光学キューブを切り換える光学キューブ切換部をさらに備え、
前記フォーカス位置取得手段は、前記第１の合焦位置を取得する場合に、前記蛍光画像観察用の光学キューブを前記光路に挿入したままの状態で前記第１の合焦位置を実測により取得することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記第１の合焦位置を基準として光軸方向に複数の座標値を設定し、該複数の座標値において複数の蛍光画像をそれぞれ取得する処理を、前記光軸に直交する面を分割した複数の小区画の各々について実行する制御を行い、前記複数の座標値の配列順毎に、互いに隣接する前記小区画に対応する複数の蛍光画像を相互に繋ぎ合わせることにより、複数の蛍光バーチャル画像を作成することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記明視野バーチャルスライド画像と前記蛍光バーチャルスライド画像とを重ね合わせた合成画像を作成する画像合成手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記標本は、２種類以上の標的分子にそれぞれ対応する２種類以上の蛍光色素により標識がなされており、
前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記標的分子の種類ごとに前記蛍光バーチャルスライド画像を取得することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記明視野バーチャルスライド画像を用いて、前記標本の内、前記蛍光バーチャルスライド画像の取得対象とする領域を設定する領域設定手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記細胞構成要素は細胞核であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡システム。
【請求項１１】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する標本画像生成方法において、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成方法。
【請求項１２】
明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する処理をコンピュータに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、
細胞を構成する１つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記明視野観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第１の合焦位置を取得すると共に、前記第１の合焦位置を用いて、前記蛍光観察の際に用いられる前記標本内の複数箇所における第２の合焦位置を取得するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成プログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１３−４４９６７（Ｐ２０１３−４４９６７Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８３０６４（Ｐ２０１１−１８３０６４）
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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