Ｅｌｋ１リン酸化関連遺伝子
【課題】ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する新規な遺伝子及びタンパク質と、これを医薬、診断薬、医療に利用する方法を提供すること。
【解決手段】Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、及び該抗体の製造方法を提供する。
【解決手段】Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、及び該抗体の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの取得方法、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体ならびに該蛋白質と特異的に反応する抗体に関する。また、本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの過剰な活性化または阻害が関与する疾患の診断、治療または予防を行なう際の本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体の使用に関する。
また本発明は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
MAP（mitogen-activated protein）キナーゼ（MAPK）は1980年代後半に発見された。1990年代に、MAPキナーゼ活性化にいたるシグナル伝達経路は、チロシンキナーゼ活性を有する細胞増殖因子受容体から、SH2とSH3から成るアダプター分子を経て、癌遺伝子産物でGTP結合蛋白質であるRas、さらにセリン／スレオニンキナーゼをコードする癌遺伝子産物Raf-1を介してMAPキナーゼへと至るシグナル伝達経路として解明された。現在ではそのMAPキナーゼシグナル伝達経路が、高等真核生物の増殖、分化および発生を規定する中枢経路であると理解されている（Nishida,E et al., Trends Biochem.Sci.,18:128-131(1993), Marshall, C.J., Curr.Opin.Genet.Dev.,4:82-89(1994), Cobb,M.H. et al., J.Biol.Chem., 270:14843-14846(1995)）。
【０００３】
MAPキナーゼの活性化には、キナーゼサブドメインVIIとVIIIの間にあるThr-Glu-Tyr(TEY)配列中のThrとTyrがリン酸化されることが必須である。この両アミノ酸残基のリン酸化を触媒する酵素として見出されたのが、MAPKキナーゼ（MAPKK）あるいはMAPK/ERKキナーゼ（MEK）である。従ってこの酵素は、セリン／スレオニンとチロシンの両方をリン酸化できるdual-specificity kinaseである。さらに、MAPKKもその活性化には、キナーゼドメインVIIとVIIIの間にある2つのセリン（あるいはスレオニン）残基のリン酸化が必要で、このリン酸化を担うセリン／スレオニンキナーゼをMAPKKキナーゼ（MAPKKK）と総称する。Raf-1はMAPKKKの一種であり、Ras→Raf-1(=MAPKKK)→MAPKK→MAPKという連鎖がシグナル伝達の主要経路の一つである。MAPKKK/MAPKK/MAPKという3分子からなるキナーゼの連鎖を古典的MAPキナーゼカスケードと呼ぶ。現在、古典的MAPキナーゼに類似のキナーゼとして、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2の存在が明らかになっており、これらの系のカスケードを総称してMAPキナーゼカスケードと呼んでいる。
【０００４】
SAPK/JNKとは、細胞に蛋白合成阻害剤などの化学的ストレスや、熱ショックや浸透圧変化などの物理的ストレスが加わったときに活性化されるキナーゼとして同定されたStress-Activated Protein Kinase(SAPK)と呼ばれるキナーゼ（Kyriakis,J.M., Nature,369:156-160(1994)）と、転写因子JunのN末端をリン酸化して転写活性を上昇させるキナーゼ c-Jun N-terminal Kinase(JNK)（Derijard,B., Cell,76:1025-1037(1994)）が同一であることが判明した結果、SAPK/JNKと呼ばれるものである。
【０００５】
一方、p38/CSBP/MPK2とは、リンパ球細胞を刺激した時に早期にチロシンリン酸化される蛋白質として同定・クローニングされたp38と呼ばれるMAPキナーゼと類縁のキナーゼ（Han,J., et al., Science,265:808-811(1994)）と、リンパ球における炎症性のサイトカインの産生を抑制する薬剤、cytokine-suppressive antiinflammatory drug（CSAID）に結合する蛋白質として同定されたCSAID binding protein（CSBP）（Lee,J.C., et al., Nature,372:739-746(1994)）がp38のヒト型であることが判明し、更にストレス刺激で活性化するキナーゼとして独立に取られたMPK2も同じ分子である（Rouse,J., et al., Cell,78:1027-1037(1994)）ことが判明した結果、p38/CSBP/MPK2と呼ばれるものである。
【０００６】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2は互いに配列の相同性があってスーパーファミリーを形成している。例えば、SAPK/JNKでは、古典的MAPキナーゼの活性化に必要なTEY配列がTPY(Thr-Pro-Tyr)であり、p38/CSBP/MPK2では、TGY配列であり、いずれの場合においてもThrとTyrが上流のキナーゼMAPKKによってリン酸化されて活性化される。
【０００７】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2のそれぞれに特異的なMAPKKも互いに配列の相同性があってスーパーファミリーを形成しており、MEK, SEK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7などがこのスーパーファミリーに属する（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem., 271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci., 19:470-473(1994)）。例えば、SAPK/JNKを特異的にリン酸化するMAPKKとしては、SAPK/ERK kinase-1（SEK1）あるいはmitogen-activated protein kinase kinase 4 （MKK4）（Lin,A., et al., Science,268:286-290(1995), Sanchez,I., Nature, 372:794-798(1994), Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem., 270:12969-12972 (1995)）と、mitogen-activated protein kinase kinase 7 （MKK7）（Moriguchi,T.,et al, EMBO J.,16:7045-7053(1997), Tournier,C., et al, P.N.A.S., 94:7337-7342 (1997),他）が知られている。また、p38を特異的に活性化するMAPKKとしてMKK3とMKK6が知られている（Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem., 271:26981-26988(1996), Cuenda,A., et al., EMBO J., 15:4156-4164 (1996)）。
【０００８】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2に至る経路の上流に位置するMAPKKKにおいては、互いの相同性が比較的低く、Raf, TAK1, MEKK, MLK3, Ask1, Mos, CotなどMAPKKK活性を持つキナーゼ同士ではキナーゼドメイン内でも30%程度の相同性しかない。このことは、非常にバラエティーに富んだ刺激に応じて必要なMAPキナーゼシグナル伝達経路を特異的に起動するというシステムの合目的性とよく一致している。現在、SAPK/JNKに至る経路の上流のMAPKKKとしてMEKK1が知られているが、他にもMAPKKKとして働くキナーゼが存在する可能性が高いと考えられる。
【０００９】
SAPK/JNKとp38/CSBP/MPK2は、古典的MAPキナーゼを活性化する増殖因子の刺激ではほとんど活性化されず、いずれも浸透圧ショックや熱ショックなどのストレスやTNF-α、IL-1などの炎症性サイトカインで活性化されることが知られている（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473(1994)）。また細胞死を誘導するUV照射や血清・増殖因子除去などによっても活性化される（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci., 19:470-473(1994)）。古典的なMAPキナーゼがチロシンキナーゼ型の受容体から発するシグナルによって活性化されるのに対し、SAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の系はその入口が非常に多様なのが特徴である。
【００１０】
以上のように、MAPキナーゼカスケード、特にSAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の系は多様な刺激で活性化する。細胞外の刺激から最終的にSAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の活性化に至るまでの経路には、数多くのMAPKKキナーゼやMAPKキナーゼ、あるいはそれらをつなげるアダプター分子群が存在すると考えられるが、いまだにその全容は明らかにされていない。さらなる解明を行い、医薬・診断・医療の分野でこれらを利用することが望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のように有用なMAPキナーゼカスケードを活性化する作用を有する新規な遺伝子及びタンパク質を見出し、これを医薬、診断薬、医療の分野で利用する方法を提供することにある。上述の３種のMAPキナーゼはどれもElk１をよい基質としてリン酸化する。よって、本発明の課題は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、及び該抗体の製造方法を提供することである。
【００１２】
また、本発明の別の課題は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを阻害または促進する物質をスクリーニングする方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニング用キットを用いて得られるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する物質、該物質の製造方法、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する物質を含有している医薬などを提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、SAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2が細胞外の各種炎症性サイトカインによる刺激によって速やかに活性化されるという点に注目し、上記課題を解決するために、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用について鋭意研究を重ねた結果、オリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を用いた発現クローニング法による遺伝子機能アッセイ系を完成し、該アッセイ系によりElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離することに成功した。この新規ＤＮＡは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞内で発現させることによりElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を誘発することを確認した。この結果は、この新規ＤＮＡがElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化経路に関与するシグナル伝達分子であることを示しており、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１４】
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）の精製されたタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【００１５】
（２） （１）に記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する精製されたタンパク質。
（３） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【００１６】
（４） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【００１７】
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかのタンパク質コード領域に示されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるタンパク質コード領域のいずれかであって、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【００１８】
（６） （３）に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（７） （４）または（５）に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（８） （３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる精製されたタンパク質。
【００１９】
（９） （３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１０） （９）に記載の組換えベクターを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
（１１） （９）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１２） 膜タンパク質である（１）または（２）に記載のタンパク質を有する、（１１）に記載の形質転換体の膜。
（１３） （ａ）（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を発現する条件下で（１１）に記載の形質転換体を培養する工程；および
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する工程、
を含む、（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質の製造方法。
（１４） （ａ）個体のゲノムにおける（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；
および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する工程を含む、該個体における該遺伝子の発現または活性に関連した疾病または疾病への感受性の診断方法。
【００２０】
（１５） 以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【００２１】
（１６） 以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【００２２】
（１７） （１５）または（１６）に記載のスクリーニング方法により選択される、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物。
【００２３】
（１８） 以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００２４】
（１９） 以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００２５】
（２０） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングするためのキットであって、（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、を含む上記のキット。
【００２６】
（２１） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
（２２） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する、（２１）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
（２３） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を抗原あるいはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することを含む、（２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法。
【００２７】
（２４） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を阻害する、（３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（２５） （１）、（２）または（８）記載のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有するか、またはElk１をリン酸化へ導く経路および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化へ導く経路のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有する、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイム。
（２６） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を抑制する、（３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列の一部に対応する配列を持つ二本鎖RNA。
【００２８】
（２７） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の（１５）または（１６）に記載の方法でスクリーニングされた化合物、および／または（２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片、および／または（２４）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または（２５）に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイム、および／または（２６）に記載の二本鎖RNAを個体に投与することを含む、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用に関連する疾患の治療方法。
【００２９】
（２８） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または活性化するための、（１８）または（１９）に記載の方法により製造された医薬組成物。
（２９） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎の治療および／または予防のための、（２８）記載の医薬組成物。
（３０） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の異常に起因した疾患を患っている患者に（１８）または（１９）に記載の方法により製造された医薬組成物を投与することを含む、炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎を治療する方法。
【００３０】
（３１） （２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物。
（３２） （２４）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物。
（３３） （２５）に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイムを有効成分として含有する医薬組成物。
（３４） （２６）に記載の二本鎖RNAあるいはその二本鎖RNAを発現することが可能なベクターを有効成分として含有する医薬組成物あるいは遺伝子治療剤。
（３５） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療および／または予防のための、（３１）から（３４）の何れかに記載の医薬組成物。
【００３１】
（３６） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるヌクレオチド配列もしくはそれらのコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセット、および／または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体。
（３７）（３６）に記載の媒体上のデータと他のポリヌクレオチド配列および／または他のアミノ酸配列のデータを比較して他のポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列との同一性の算出を行なう方法。
【００３２】
（３８） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
（３９） 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質。
【００３３】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明について説明する。MAPキナーゼカスケードを活性化する作用を有する新規遺伝子を取得する目的で、実施例に示すように、以下の実験を実行した。
【００３４】
まずヒト末梢血単核球（PBMC）より調製したｍＲＮＡより、オリゴキャッピング法によって完全長ｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡをベクターpME18S-FL3（GenBank Accession AB009864）に組み込んだ完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した。次に、該ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌に導入し、１クローンずつプラスミドを調製した。次に、HEK293EBNA細胞（INVITROGEN社）に、ヒトＪＮＫ遺伝子をコードするＤＮＡを含有する動物細胞発現用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、ヒトｐ３８遺伝子をコードするＤＮＡを含有する動物細胞発現用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、それらの基質となるElk1の一部とGAL4DNA結合領域との融合蛋白質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドpFA2-Elk1（STRATAGENE社）、およびGal4認識部位をルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に持つレポータープラスミドpFR-Luc（STRATAGENE社）と上記の完全長ｃＤＮＡプラスミドとを共導入した。そして、２４時間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性が対照実験（完全長ｃＤＮＡの代わりに、ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を入れた細胞）と比べて有意に上昇している（対照実験と比べてルシフェラーゼ活性が３倍以上の値を示した）プラスミドを選抜し、該プラスミドにクローニングされているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を決定した。前述したように、MAPキナーゼカスケードの最下流に存在するｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫなどは、Elk1をよい基質とするため、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化に関与するシグナル伝達分子は、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化するシグナル伝達分子である可能性が高い。よってこのようにして得られたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化に関与するシグナル伝達分子であると同時に、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化に関与するシグナル伝達分子である可能性が高いことが期待できる。
【００３５】
Elk1をリン酸化するキナーゼを活性化するとは、具体的にはElk1をリン酸化するキナーゼを直接修飾して活性化する場合と、その更に上流のシグナルを活性化することによって間接的に活性化する場合が含まれる。
【００３６】
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるElk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するとは、適切な宿主内に遺伝子を導入し、該遺伝子がコードするタンパク質を過剰発現させた時、Elk1が直接的あるいは間接的にリン酸化されることをいう。Elk1のリン酸化は、例えばElk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子とともに、GAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子を細胞に共導入することによるレポーター遺伝子アッセイにより測定できる。Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、該レポーター活性を対照実験（空のベクターのみを導入した宿主）に比し上昇させる作用を指標として確認することができる。指標とするレポーター活性の上昇は、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。
【００３７】
レポーター活性は、発現させたいタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を適切な発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをElk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子、GAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子とともに適切な宿主に共導入（コ・トランスフェクション）し、一定時間培養後レポーターの活性を測定することにより測定することができる。適切な発現ベクターは当業者にはよく知られており、例えばｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。レポーター遺伝子は、当業者がその発現を容易に検出できるものであればよく、例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を使用することがもっとも好ましい。Elk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子としては、例えばｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）が挙げられ、またGAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子としては、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）が例示される。適切な宿主とは、ＩＬ−１あるいはＴＮＦ−αなどの刺激によりＭＡＰＫカスケードが活性化されるような応答を示すような宿主であり、例えば２９３−ＥＢＮＡ細胞が挙げられる。宿主培養及び宿主への遺伝子導入（トランスフェクション）は、当業者であれば当該技術分野で公知の慣用方法により実施でき最適化できる。
【００３８】
好ましい方法としては、２９３−ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６穴プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数となるように、５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）存在下のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した後、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche社）を用いてｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＦＡ２−Elk１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）、及び発現ベクターを１ウエルに共導入する。３７℃で２４時間培養後、ロングタームルシフェラーゼシステムピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を測定する。ルシフェラーゼ活性の測定は、たとえばＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて測定できる。ＦｕＧＥＮＥ６による遺伝子導入の方法及びピッカジーンＬＴ２．０によるルシフェラーゼ活性測定は、それぞれに添付されているプロトコールに従い実施できる。ＦｕＧＥＮＥ６を用いた９６穴プレートでの遺伝子導入の方法は、１ウエルあたりＦｕＧＥＮＥ６の量は０．３〜０．５μｌが良く、好ましくは０．５μｌであり、導入するそれぞれのプラスミド遺伝子量は、ｐＦＲ−Ｌｕｃプラスミド量は５０〜１００ｎｇが良く、好ましくは６０ｎｇであり、ｐＦＡ２−Elk1プラスミド量は０．１〜０．５ｎｇが良く、好ましくは０．２５ｎｇであり、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド量は５ｎｇが好ましく、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド量は３０ｎｇが好ましい。Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、該レポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を対照実験（空のベクターのみを導入した宿主）に比し上昇させる作用を指標として確認することができる。指標とするレポーター活性の上昇は、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。
【００３９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列に関連して、本発明は以下のタンパク質を提供する。
（ａ）上記アミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）上記アミノ酸配列の１つを有するペプチド。
（ｃ） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有し、かつ上記アミノ酸配列において、１または複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を有するタンパク質。
（ｄ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有し、かつその全長にわたり上記アミノ酸配列番号に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００４０】
本明細書で言う“同一性”とは、当該技術で知られている通り、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係により決定される。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性”および“類似性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００４１】
アミノ酸置換行列とは２０種類のアミノ酸の各々のペアの類縁性を数値化した行列であり、通常BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられる。このアミノ酸置換行列の理論については、Altschul S.F., J. Mol. Biol., 219:555-565(1991)に、DNA配列の比較への適用については、States D.J., Gish W., Altschul S.F., Methods, 3:66-70(1991)に示されている。その際の最適なギャップコストは経験的に決定されており、BLOSUM62の場合は好ましくは、Existence11、Extension 1のパラメーターが用いられる。期待値（EXPECT）とは、データベース配列に対してマッチする際の統計的有意性に関する閾値であり、デフォルト値は１０である。
【００４２】
上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質がElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、本願明細書実施例に記載の通りである。
【００４３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のポリヌクレオチドまたはこれらの配列に示されるコード領域（ＣＤＳ）からなるポリヌクレオチドに関連して、本発明はさらに以下の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）上記配列を有するポリヌクレオチド。
（ｂ）上記配列に少なくとも９５％、好ましくは９７９９％の同一性を有し、かつ、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【００４４】
上記ヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド配列に同一またはほとんど同一なポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンまたは上記配列に対応する相同性の高い他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記配列に７０％同一であり、好ましくは、８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは、９５％以上同一である。プローブまたはプライマーは、一般的には少なくとも１５ヌクレオチドを含有し、好ましくは３０ヌクレオチドを含有し、５０ヌクレオチドを含有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態(たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む)であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００４６】
当業者であれば、公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様にElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質を作製することが可能である。一つの方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡに対して、慣用の突然変異誘発法を使用する方法がある。別の方法としてはたとえば部位特異的変異法（たとえば宝酒造株式会社のMutan-Super Express Km キット）が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。アミノ酸の変異の数は特に限定されないが、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個が好ましい。
【００４７】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００４８】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）またはその一部を基に、これと類似性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同様にElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質を得ることも通常行ない得ることである。
【００４９】
このように上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列のタンパク質と高い同一性を有するタンパク質であって、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。高い同一性とは、上記配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表わされるアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９７９９％の同一性を有するアミノ酸配列を示す。
【００５０】
本発明のタンパク質としては、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞や組織に由来する天然のタンパク質でもよく、化学合成タンパク質であってもよく、また遺伝子組換え技術によって得られたタンパク質でもよい。タンパク質は糖鎖やリン酸化などの翻訳後修飾は受けていても受けていなくても良い。
本発明の遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、分泌タンパク質（増殖因子、サイトカイン、ホルモン等）、タンパク質修飾酵素（タンパク質リン酸化酵素、タンパク質脱リン酸化酵素、プロテアーゼ等）、シグナル伝達分子（タンパク間相互作用分子等）、核内タンパク質（核内受容体、転写因子等）、膜タンパク質等が挙げられる。膜タンパク質は、受容体、細胞接着分子、イオンチャンネル、トランスポーター等が挙げられる。タンパク質が膜タンパク質である場合、後述するスクリーニングにより選択された化合物は、細胞内へ容易に移行する或いは細胞内にシグナルを伝達させることが予想されるため、医薬化合物のリードサーチツールとしては、より有用である。
【００５１】
本発明はまた、上記で示される本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。上記の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列としてより具体的には、たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＤＮＡはｃＤＮＡのほか、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡも含まれる。遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドを他の種類のヌクレオチドに置換することができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換されたヌクレオチド配列も含有する。このようなＤＮＡは、公知の方法により合成することができる。
【００５２】
本発明のＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列あるいはこれらと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。ストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）に従えば容易に実施できる。
【００５３】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（低ストリンジェンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（高ストリンジェンシー）。この際、得られたＤＮＡは、Elk１をリン酸化する作用および／またははElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードすることが必須である。
【００５４】
本発明は、上記（３）、（４）あるいは（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と高い類似性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記（３）、（４）または（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の全長にわたり９５％同一であり、より好ましくは９７％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００５５】
上記の本発明のＤＮＡは、上記（１）、（２）あるいは（８）のタンパク質を、組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本発明のＤＮＡ及びペプチドは、概略以下のようにして得ることができる。
（Ａ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。
（Ｂ）タンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込んで、組換えベクターを構築する。
（Ｃ）構築した組換えベクターにより、宿主を形質転換する。
（Ｄ）得られた宿主を培養し、該タンパク質、またはその類縁体を発現させ、カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。
【００５６】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記T.Maniatisらの実験操作書に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。以下に上記（Ａ）〜（Ｄ）の工程について更に詳しく説明する。
【００５７】
上記工程（Ａ）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本願明細書実施例に記載した方法の他に、本発明のヌクレオチド配列（たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）の一部を有する合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって増幅する方法、あるいは、適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。細胞、組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（ＲＴ-ＰＣＲ法）によって増幅することもできる。
【００５８】
適当なベクターに組み込んだＤＮＡとしては、たとえば市販されている（CLONTECH社、STRATAGENE社）ライブラリーを使用することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記T.Maniatisらの実験操作書に従えば容易に実施できる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。上記のようにして得られるＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子であるか、あるいは前述の（３）〜（７）のポリヌクレオチドであればよい。上記（Ｂ）において発現ベクターに組み込むＤＮＡは、上述のタンパク質の全長をコードする全長ｃＤＮＡでも、ＤＮＡ断片でも良いし、その一部分を発現する様に構築されたＤＮＡ断片でも良い。
【００５９】
すなわち、本発明によれば、上記のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
用いる発現ベクターとしては、大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由来、真菌由来、昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来いずれのベクターでも良いが、宿主に適したものを選択する必要がある。また、発現物に応じて、宿主―発現ベクター系としては、適切な組み合わせが選択される。
【００６０】
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組み換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。たとえば、大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、及び組換え体ＤＮＡで形質転換した宿主を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、βラクタマーゼプロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００６１】
酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００６２】
真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミナーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。
昆虫細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞に適した発現ベクターの例としては、バキュロウイルスベクターなどが挙げられる。
【００６３】
動物細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための組換えベクターは、一般に遺伝子を制御するための機能配列、たとえば、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、ポリアデニル化部位や転写終止配列を含有している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることができるそのような機能配列はウイルスやウイルス性物質から得ることができる。
【００６４】
例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主ベクター系で使用するのに適しているならば使用することができる。複製起源については、外来性の起源、たとえばアデノウイルス、ポリオーマ、ＳＶ４０等のウイルス由来の複製起点を用いることができる。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれるような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用することができる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＳＶｄｈｆｒ（ATCC 37146）、ｐＢＰＶ１（９１）（ATCC 37111）、ｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３等が挙げられる。
【００６５】
本発明によれば、上記の組換えベクターを含む形質転換体も提供される。本発明の複製可能な組換えベクターで形質転換された微生物または細胞等の宿主は、前述の通り、組換えベクターに与えられた少なくとも１種の表現型によって形質転換されずに残った親宿主から選別される。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換えベクターに挿入することによって与えることができる。また複製可能なベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、たとえば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
【００６６】
上記工程（Ｃ）において用いる宿主としては、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでも良いが、用いる発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生物の例としては、エシュリヒア コリ（Escherichia coli）の菌株、たとえばE.coliK12株２９４（ATCC 31446）、E.coli X1776（ATCC 31537）、E.coli C600、E.coli JM109、E.coli B株、あるいはバチラス サブチリス（Bacillus subtilis）等のBacillus属の菌株、あるいはサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア マーゼサンス（Serratia marcesans）等の大腸菌以外の腸内菌、あるいはシュードモナス（Pseudomonas）属の種々の菌株が挙げられる。酵母としては、たとえば、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。真菌としては、たとえば、アスペルギルス ニドランス（Aspergillus nidulans）、アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）（ATCC 11550）等が挙げられる。
【００６７】
昆虫細胞としては、たとえば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda：Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、などが用いられる。動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞等が挙げられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が好ましい。細胞を宿主とする場合、用いられる発現ベクターと宿主細胞の組み合わせは実験の目的により異なるが、その組み合わせにより、一過的発現、構成的発現の２種類の発現方式が考えられる。
【００６８】
上記工程（Ｃ）における微生物及び細胞等の宿主の形質転換とは、ＤＮＡを強制的方法や、宿主の貪食能により宿主に取り込ませ、プラスミド状態あるいは染色体に組み込まれた状態でＤＮＡの形質を一過的あるいは構成的に発現させることである。当業者であれば公知の方法によって形質転換できる（たとえば実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック）。たとえば動物細胞の場合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポフェクション法などの方法でＤＮＡを宿主に導入することができる。動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる細胞を取得する方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、Dihydroforate reductase（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択マーカーとして用いた場合Methotrexate（ＭＴＸ）濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ＤＨＦＲ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
【００６９】
上記の形質転換体を本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質を製造することができる。すなわち、本発明は、上記（３）〜（７）に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む形質転換体を、該ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下で培養し、次いで培養物（即ち、宿主自体または培地）から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法も提供される。
【００７０】
上記の形質転換体の培養は、当業者に公知の方法で行なうことができる（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社）。たとえば動物細胞の場合、各種の動物細胞培養法、たとえば、シャーレ培養、マルチトレー式培養、モジュール培養などの付着培養、または細胞培養用担体（マイクロキャリアー）に付着させるか生産細胞自体を浮遊化させ浮遊培養等の公知の方法により培養を行なえば良い。培地は通常良く用いられる動物細胞用の培地、たとえばＤＭＥＭやＩ−ＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０等を用いれば良い。
【００７１】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。たとえば、本発明のタンパク質は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に使用される。ポリペプチドが細胞内合成、単離または精製の間に変性するときには、活性なコンフォーメションを再生するためにタンパク質をリフォールディングするためのよく知られた技術を使用できる。
【００７２】
本発明のタンパク質は、他のタンパク質との融合タンパク質として製造することができる。これら融合タンパク質も、本発明の範囲内である。この融合タンパク質を発現する際に用いられるベクターとしては、該タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができ、かつ該融合タンパク質を発現することができるベクターであれば、いかなるベクターでも用いることができる。本発明のペプチドに融合できるタンパク質としては、たとえばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン残基の６個の連続配列（６×Ｈｉｓ）等が挙げられる。本発明のタンパク質を他の蛋白質と融合した蛋白質として発現させた場合には、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、有利である。例えば、ＧＳＴとの融合蛋白質として生産した場合は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７３】
本発明のタンパク質が膜タンパク質である場合には、上記した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換体は、その細胞の膜上にタンパク質を発現することができる。このような形質転換体から調製される膜であって本発明のタンパク質を有する膜も本発明の範囲内である。なお、本明細書で言う細胞の膜とは、細胞膜、並びに細胞内小器官の膜の全てを包含する。細胞の膜の調製は当業者に公知の方法により行なう事ができる。例えば、形質転換体を培養した培養物から細胞を回収し、好適な緩衝液に懸濁後、ホモジナイザーを用いて、あるいはガラスビーズを加えボルテックスにて細胞を破砕する。破砕溶液を遠心し未破砕の細胞等を除去し、得られた上清を適切な条件で超遠心し、得られた沈殿を緩衝液に懸濁することにより膜画分調製することができる。超遠心の条件は膜の種類などに応じて適宜設定することができる。
【００７４】
本発明によれば、本発明のタンパク質の活性を阻害するタンパク質も提供される。このようなタンパク質の具体例としては、例えば、抗体または本発明のタンパク質の活性中心等に結合し活性の発現を妨げる他のタンパク質が挙げられる。
【００７５】
本発明は、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに反応する抗体ならびに該抗体の製造方法に関する。さらに好ましくは、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に反応する抗体、並びにそのような抗体の製造方法に関する。ここでいう「特異的」とは、本発明のタンパク質以外の物質に対する交差反応性が少ないもの、より好ましくはないものを意味する。
【００７６】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体の何れであってもよい。抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。たとえば、該抗体フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦｖフラグメントが含まれる。たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上記（１）または（２）に記載のタンパク質を抗原またはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することにより得られる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質あるいはそのペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。たとえば実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版に記載の方法が挙げられる。
【００７７】
ポリクローナル抗体の場合であれば、たとえば、ウサギなどの動物に本発明のタンパク質あるいはペプチドを注射することにより該タンパク質あるいはペプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００７８】
モノクローナル抗体の場合は、たとえば、本発明のタンパク質をマウスなどの動物に免疫し、同マウスから脾臓を抽出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００７９】
得られた抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト抗体を用いることが好ましい。ヒト抗体は、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を用いて作製することができる。これらのヒト型化抗体やヒト抗体の一般的概説は、たとえば、Morrison,S.L.et al.〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)〕、Jones,P.T.et al〔Nature 321:522-525(1986)〕、野口浩〔医学のあゆみ １６７：４５７４６２（１９９３）〕、松本隆志〔化学と生物 ３６：４４８４５６（１９９８）〕によって供されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
【００８０】
また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを用いて、該マウスを免疫して、通常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することもできる。これらの抗体は、タンパク質を発現するクローンを単離したり、同定するのに使用できる。
また、これらの抗体は、本発明のタンパク質を細胞抽出液、または本発明のタンパク質を産生する形質転換体から精製するのに使用できる。更にこれらの抗体は、細胞や組織中の本発明のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡやＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、またはウエスタンブロット系の構築に使用できる。このような検出系は、動物、好ましくは、ヒトの組織または血管内流体などの身体サンプル中に存在する本発明のタンパク質の存在量を検出する診断目的に使用することができる。たとえば、これらの抗体は、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などの、本発明のタンパク質の(発現)異常に起因するＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の診断に使用できる。
【００８１】
疾患の診断の基礎を提供するために、本発明のタンパク質の発現についての通常の値、すなわち標準値が確立されなければならないが、これは当業者においては周知の技術である。すなわち、複合体形成のための適切な条件下で、ヒトあるいは動物のどちらでもよいが、正常の被験者から得られた体液あるいは細胞抽出物と、本発明のタンパク質に対する抗体とを結合させ、この抗体タンパク複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原（本発明のタンパク質）を含む標準液を用いて作成した標準曲線を用いて、正常サンプルから得られた標準値を算出する。標準値と本発明のタンパク質が関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルから得られた値と比較し、標準値との偏差によって疾病の存在を確認することができる。また、これらの抗体は、本発明のタンパク質の機能を研究する試薬としても用いることができる。
【００８２】
本発明の抗体は、以下の通り医薬として用いることができる。本発明の抗体を医薬として用いる場合には、本発明のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害することができる抗体（即ち、中和抗体）を用いることが好ましい。
【００８３】
本発明の抗体は精製することができ、次いで、たとえば、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などの、本発明のタンパク質の(発現)異常に起因するElk1をリン酸化するキナーゼの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の患者に投与することができる。すなわち本発明によれば、上記に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および抗体を用いた治療および／または予防方法が提供される。本発明の医薬組成物は、上記抗体を有効成分として用いて、さらに治療または予防的使用のための他の有効成分または不活性成分（たとえば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（たとえば、免疫原性アジュバント）と、生理学的に無毒の安定化剤／または賦形剤を用いて調製することができる。本発明の抗体を含む医薬組成物は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として、投薬形態に製剤化することができる。
【００８４】
患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行ない得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。これらの抗体は、本発明のタンパク質で仲介されるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害し、治療効果を示す。より具体的には、本発明の抗体は、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などのＭＡＰキナーゼカスケードの活性化異常が関係する疾患を治療および／または予防する医薬として有用である。
【００８５】
本発明のＤＮＡは、細胞内シグナリングプロセスに関与する他のタンパク質を単離、同定、クローン化することにも使用できる。たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コードされたタンパク質を「ベイト（ｂａｉｔ）」として用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、本発明のタンパク質に結合できるタンパク質をコードする他の配列「プレイ（ｐｒｅｙ）」を単離し、クローン化する酵母ツーハイブリッドシステム（たとえばＮａｔｕｒｅ、３４０：２４５２４６（１９８９））に用いることができる。同様の方式で、本発明のタンパク質が、他の細胞タンパク質（たとえばＪＮＫ，ｐ３８）に結合できるかどうかも決定することができる。あるいは別の方法として、本発明のタンパク質の抗体を用いた免疫沈降法（たとえば、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によって、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を細胞抽出物から単離する方法が挙げられる。さらに別の方法として、上記に記載のように、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降法を行ない、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を単離する方法が挙げられる。
【００８６】
本発明によれば、（ａ）個体のゲノムにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該遺伝子の発現量を分析する工程を含む、該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した疾病または該疾病への感受性の診断方法が提供される。
【００８７】
本発明の診断方法では、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する機能に関与する本発明のタンパク質をコードする該遺伝子中の変異を検出することにより、疾患の診断や該疾患への感受性を診断することができる。さらにこのような疾患は、個体に由来するサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡレベルの異常な減少または増加を測定することを含む方法によって診断してもよい。
【００８８】
ここで、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する機能に関与する本発明のタンパク質をコードする該遺伝子中の変異を検出する方法としては、それらの遺伝子のヌクレオチド配列の一部をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後通常のヌクレオチド配列決定方法によって配列を決定し、変異の有無を検出する方法が挙げられる。あるいは、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Gennomics、5:874-879、1989年、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によっても変異の有無を調べることができる。
【００８９】
サンプル中の遺伝子の発現の減少または増加は、当該技術でＲＮＡレベルでのポリヌクレオチドの定量によく知られた方法、たとえば、ＲＴＰＣＲなどの核酸増幅法、およびＲＮａｓｅ保護法、ノーザンブロット法その他のハイブリダイゼーション法などの方法で測定できる。宿主に由来するサンプル中のタンパク質レベルの測定に使用され得るアッセイ技術は、当業者によく知られている。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合測定法、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。タンパク質レベルでの発現量を調べる場合には、前記した本発明の抗体を利用して測定することができる。
サンプル中の遺伝子の発現量の異常の程度は特に限定されないが、本発明の一実施態様によれば、発現するタンパク質の量が正常の2倍以上、あるいは、１／２以下の場合に病気であると診断することができる。本発明の別の実施態様によれば、発現するタンパク質の量が正常の３倍以上、あるいは、１／３以下の場合に病気であると診断することができる。
【００９０】
個体のゲノムにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝子中に変異があることが検出された場合には、該変異がElk１のリン酸化に関与する該タンパク質の発現および／または活性に関連した疾病を引き起こす可能性がある
また、個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析した結果、当該発現量が正常値と異なる値を示す場合は、Elk１のリン酸化に関与する本発明のタンパク質の発現量の異常が、Elk１のリン酸化に関与する該タンパク質の発現および／または活性に関連した疾病の原因となる可能性がある。
【００９１】
また、本発明は、本発明のタンパク質を介するＭＡＰキナーゼカスケードを活性化（Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化）する作用を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法に関する。
上記のスクリーニング方法は、
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk1をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、
を含む。
【００９２】
本発明では、シグナル量を正常より２倍以上に増加させる化合物を活性化剤化合物として単離または同定し、２分の１以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
Elk1をリン酸化する作用を検出できるシグナルをコードする遺伝子としては、たとえばレポーター遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子は、テストを行なう転写因子の活性化を直接検出するかわりに用いられるもので、調べたい遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子につなぎ、レポーター遺伝子の産物の活性を測定することによってプロモーターの転写活性の解析を行なうものである（バイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））。
【００９３】
レポーター遺伝子としては、その発現産物の活性または生産量（ｍＲＮＡの生産量も含まれる）を当業者が測定可能なものであれば、いかなるペプチド、タンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダゼ、ルシフェラーゼ等の酵素活性を測定することで利用できる。Elk１のリン酸化の活性化を評価するのに用いるレポータープラスミドとしては、イーストの転写因子Gal4の認識配列をレポーター遺伝子の上流に組み込んだものであれば良く、例えばｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社）と、各種ＭＡＰキナーゼの基質となる遺伝子例えばElk1やＡＴＦ２などとイーストのGal4タンパク質のDNA結合領域をつないだ融合蛋白質例えばｐＦＡ２Elk1やｐＦＡ２ＡＴＦ２（STRATAGENE社）とを同時に宿主内に導入することにより利用できる。
【００９４】
宿主としては、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出し得る宿主であればよく、好ましくは、哺乳動物細胞であり、たとえばＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞が好適に用いられる。形質転換及び培養に関しては、上記に記載の通りである。
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物のスクリーニングは、具体的には、たとえば、一定時間培養した形質転換体に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該形質転換体が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない宿主のレポーター活性と比較することにより、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物をスクリーニングすることができる。レポーター活性の測定は、当業者に公知の方法（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））で行なうことができる。
【００９５】
スクリーニングの被検物質には特に制限はなく、低分子化合物、高分子化合物及びペプチドなどが挙げられる。被検化合物は、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。また単一物質でも、混合物でもよい。例えば、低分子化合物のライブラリー、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物ライブラリー、細胞、植物、動物またはその一部を含む天然物、又は当該天然物由来の抽出物などを用いることもできる。複数の化合物を含む混合物をスクリーニングの被験物質として用いた場合は、本発明のタンパク質によるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する活性が認められた被験物質についてさらにスクリーニングを行なうことにより、該活性を有する単一物質を単離することができる。また、混合物から目的化合物を単離、精製するには、公知の方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なう事ができる。
【００９６】
また、本発明のスクリーニング法は以下の工程で行なうこともできる。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程。
【００９７】
上記方法で、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を測定する方法としては、例えば細胞抽出液を得た後に、リン酸化された各種MAPキナーゼに対する抗体を用いて、各種MAPキナーゼの活性化を検出する方法があげられる。リン酸化された各種MAPキナーゼに対する抗体は、例えばNEB（New England Biolabs社）社の製品を用いることができる。上記抗体を用いた検出の方法としては、ELISA法、ウエスタンブロット法、ドットハイブリダイゼーション法などがあげられる。また、各種MAPキナーゼに対する抗体を用いた免疫沈降法によって各種MAPキナーゼの活性を測定することも可能である。各種MAPキナーゼに対する抗体、及びそれらに対する基質は例えばUpstate Biotechnology社の製品を用いることができる。
【００９８】
さらに本発明によれば、以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法が提供される。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、およびElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００９９】
さらに本発明では、以下の工程により医薬組成物を製造することもできる。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
また、上記医薬組成物製造方法の工程（ｄ）においては、シグナル量を正常より２倍以上に増加させる化合物を活性化剤化合物、２分の１以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
【０１００】
本発明のタンパク質は、以下の工程により、該タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を、構造を基礎にして設計する方法に使用してもよい。
（ａ）まず、タンパク質の三次元構造を決定する工程、
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応性部位または結合部位と思われる部位の三次元構造を推論する工程、
（ｃ）推論した結合部位または反応性部位に結合するかあるいは結合すると予測される候補化合物を合成する工程、および
（ｄ）該候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか否かを試験する工程。
【０１０１】
また本発明によれば、上記スクリーニングによって選択された化合物が提供される。該化合物は、本発明のタンパク質によるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害または促進する活性を有する。さらに詳細には、該化合物は、本発明のタンパク質によるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する活性を有する。
【０１０２】
上記スクリーニングによって得られた化合物は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼ活性化する作用を阻害または促進する作用を有しているので、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの望ましくない活性化あるいは不活性化に起因する疾患を治療または予防するための医薬として有用である。
【０１０３】
化合物の塩を取得したい時は、化合物が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれば良く、また遊離の形で得られる場合には、通常の方法により適当な溶媒に溶解または懸濁し、所望の酸または塩基を添加し、塩を形成させて単離精製すれば良い。本発明の方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として調製する工程としては、例えば以下のように常法により製剤化することが挙げられる。すなわち活性成分として有効な量の上記化合物またはその薬理的に許容される塩と、薬理的に許容される担体とを混合すれば良い。また製剤化は選択された投与様式に適した形態が選ばれる。経口投与に適した組成物としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。上記の担体としては、例えばゼラチン、乳糖、グルコース等の糖類、コーン・小麦・米・とうもろこし澱粉等の澱粉類、ステアリン酸等の脂肪酸、ステアリン酸カルシウム・ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、タルク、植物油、ステアリンアルコール・ベンジルアルコール等のアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール等が挙げられる。これらのうち液状担体の例としては、一般に水、生理食塩水、デキストロースまたは類似の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
【０１０４】
本発明によれば、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の阻害剤または活性化剤としての活性について化合物をスクリーニングするためのキットも含まれる。該キットは、（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子、およびElk１をリン酸化する作用が検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、から成るものであり、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物をスクリーニングするために必要な試薬類を含む。
【０１０５】
別の側面において、本発明は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表わされるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質またはそれらの断片；または、
（ｄ）（ｃ）の本発明のタンパク質に対する抗体；
を含む診断キットに関する。
【０１０６】
少なくとも（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含むキットは、炎症、自己免疫疾患、感染性疾患（たとえばＨＩＶ感染）および癌などの疾患または該疾患への感受性を診断するのに有用である。
ＭＡＰキナーゼカスケードは、炎症、自己免疫疾患、癌及びウイルス感染などの多種の病理学的状態におけるその関与のため、薬物デザイン及び治療介在のための魅力的な標的である。多数の実験が、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化の阻害が深い生理学的作用を有し得ることを示している（例えば、J Cell Biochem 2001 Apr 3-27;82(1):68-77、Pharmacol Res 2001 Mar;43(3):275-83、Diabetes 2001 Jun;50(6):1495-504、Diabetes 2001 Jun;50(6):1464-71、 Atherosclerosis 2001 May;156(1):81-90））。
【０１０７】
本明細書中に報告するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質の発見により、異常なＭＡＰキナーゼカスケード活性化を阻害する新しい方法が提供された。さらなる具体例において、本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害するための前記のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質の機能を阻害する化合物を用いる方法に関する。また、本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を促進するための前記のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質の機能を促進する化合物を用いる方法に関する。上記スクリーニング方法によって得られた、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害する化合物または促進する化合物は、たとえば炎症、自己免疫疾患、感染症（１例としてＨＩＶ感染症）などの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の治療または予防をする医薬として有用である。
【０１０８】
ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化は、アポトーシスを誘導する場合があることが知られており、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化阻害剤はアポトーシスを抑制する可能性が考えられる。アポトーシスの抑制が治療につながる疾患としてはＧＶＨＤ、Toxic epidermal necrolysis（ＴＥＮ）などの皮膚疾患、増殖性腎炎（ＩｇＡ腎炎、紫斑病性腎炎、ループス腎炎）、劇症肝炎などが挙げられる。逆にアポトーシスの誘導が治療につながる疾患としては癌疾患等を含む腫瘍が挙げられる。
よって、上記スクリーニング方法によって得られた、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する化合物または促進する化合物はこれらの疾患の治療または予防のための医薬として有用である。
【０１０９】
更に、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、および炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療を目的とした遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療とは、疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与することを意味する。本発明のタンパク質や該タンパク質をコードするDNAは、診断目的にも使用できる。すなわち、本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子治療剤が提供される。
【０１１０】
また本発明のタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子治療剤に用いる場合、後述するRNA interference（ＲＮＡｉ）の手法を応用することもできる。すなわち本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を持つ二本鎖ＲＮＡを発現するような遺伝子治療用のベクターも提供される。
【０１１１】
遺伝子治療剤の形態は特に限定されないが、例えば生理緩衝液からなる薬剤キャリア中に本発明の遺伝子を含む発現ベクターを含む医薬組成物などが挙げられる。薬剤キャリアとしては、その他に適当な安定剤（例えばヌクレアーゼ阻害剤など）、キレート剤（例えばEDTAなど）、及び／またはその他の助剤も含むことができる。あるいはまた、本発明の遺伝子治療剤は、本発明の遺伝子を含む発現ベクターとリポソームとの複合体として提供しても良い。上記した遺伝子治療剤は、例えばカテーテルを利用して適用することもできる。例えば、本発明の遺伝子治療剤を患者の血管などに直接注入することも可能である。
【０１１２】
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には成人1回あたりは有効成分のDNA量として１μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。たとえば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、たとえば、ヒトや哺乳動物（たとえば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行ないうる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢などにより変動するが、当業者であれば適宜投与方法を選択すると共に、投与方法に応じて適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行なうことも考えられる。
すなわち本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進または阻害する化合物を有効成分として含有する医薬に関する。
【０１１４】
さらに、上記化合物は、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、感染症、癌などの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の治療または予防する医薬として有用である。すなわち本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を促進または阻害する化合物を含む、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、ガンなどの医薬にを提供する。具体的には、例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、敗血症、喘息、アレルギー性鼻炎、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、くも膜下出血、ウイルス肝炎、エイズ、ＧＶＨＤ、Toxic epidermal necrolysis（ＴＥＮ）などの皮膚疾患、増殖性腎炎（ＩｇＡ腎炎、紫斑病性腎炎、ループス腎炎）、劇症肝炎などに対する治療及び予防薬として有用である。
さらにまた、本発明は、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、ガンなどの治療および予防のための医薬の製造における上記化合物の使用も提供される。
【０１１５】
また本発明によれば、上記（３）〜（７）に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とした遺伝子配列に対して相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質への翻訳、細胞質への輸送、あるいは全体的な生物活性機能に必要な他の活性等のＲＮＡの機能を阻害することによって、標的遺伝子の発現を抑制することができる。この際、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＲＮＡを用いても良いし、ＤＮＡを用いても良い。本発明のＤＮＡ配列は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために使用できる。一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドが、その遺伝子の発現に対して抑制的に作用することは公知での事実である（たとえば、細胞工学 Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．４（１９９４））。本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスコード配列を有するオリゴヌクレオチドは、標準の方法で細胞内に導入することができ、該オリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を効果的に遮断して、その発現を遮断して、望ましくない作用を抑制することができる。
【０１１６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に見出されるオリゴヌクレオチドの他に、修飾されたものであっても良い〔たとえば、村上＆牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996）〕。従って、オリゴヌクレオチドは変化した糖部分あるいは糖間部分を有していても良い。これらの例は、当該技術分野において使用が知られているホスホチオエート及び他のイオウ含有種である。幾つかの好ましい態様に従えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのホスホジエステル結合が、その活性が調節されるべきＲＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能力を高める機能を有する構造により置換される。
【０１１７】
このような置換は、ホスホロチオエート結合、ホスホロアミデート結合、メチルホスホネート結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造を含むことが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも幾つかの修飾されたヌクレオチド型を含んでいても良い。従って、天然に通常見いだされるもの以外のプリン及びピリミジンを使用していても良い。同様に本発明の本質的な意図が実行される限り、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分を修飾することもできる。このような修飾の例は、２’Ｏアルキル、及び２’ハロゲン置換ヌクレオチドである。本発明において有用な幾つかの糖部分の２’位の修飾の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは１から約１０である）、及び同様の特性を有する他の置換基である。全てのこのような類似体は、本発明の遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機能を阻害する機能を果たす限り、本発明に包含される。
【０１１８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約３から約５０ヌクレオチドを含み、約８から約３０ヌクレオチドを含むことが好ましく、約１２から約２５ヌクレオチドを含むことがさらに好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、周知の方法である固相合成法により作製することができる。このような合成のための装置は、Applied Biosystemsを含む幾つかの業者により販売されている。ホスホチオエート等の他のオリゴヌクレオチドの製造も当業者に公知の方法で作製できる。
【０１１９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写されるｍＲＮＡとハイブリダイズできるように設計される。与えられた遺伝子の配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当業者であれば容易である〔たとえば、村上および牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996)〕。最近の研究は、ｍＲＮＡの５’領域、好ましくは翻訳開始部位を含む領域に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の阻害に最も効果的であることを示唆している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、１５から３０ヌクレオチドが好ましく、２０から２５ヌクレオチドがより好ましい。ホモロジー検索で他のｍＲＮＡとの相互作用がないこと、オリゴヌクレオチド配列内で二次構造を取らないことを確認しておくことは重要である。設計したアンチセンス分子が機能したかどうかの評価は、適当な細胞を用いて、該細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、当業者には公知の方法で、対象ｍＲＮＡの量（たとえば、ノーザンブロットまたはＲＴＰＣＲ法）、あるいは対象タンパク質の量（たとえば、ウエスタンブロットまたは蛍光抗体法）を測定することにより、発現抑制の効果を確認できる。
【０１２０】
一方、三重らせん形成（トリプル・ヘリックス技術）は、核内のＤＮＡを標的とした、主に転写の段階での遺伝子発現制御方法である。オリゴヌクレオチドは、主に転写に関与する遺伝子領域に設計され、それにより、転写及び本発明のタンパク質の産生を抑える。これらのＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドは、公知の合成装置などを用いて製造することができる。
【０１２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞に、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などのDNAトランスフェクション法、またはウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法のいずれを用いて導入してもよい。適切なレトロウイルスベクターを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチド発現ベクターを作製し、その後、該発現ベクターを細胞とin vivoまたはex vivoで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入できる。
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術またはトリプル・へリックス技術を用いて、本発明のタンパクを介するＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害する目的で使用できる。
【０１２２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば炎症、自己免疫疾患、感染症（たとえば、ＨＩＶ感染症症）、ガンなどの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患を治療または予防する医薬として有用である。すなわち、本発明は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬が提供される。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の検出に利用することもできる。
本発明によれば、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイムも提供される。リボザイムまたはデオキシリボザイムは、核酸のヌクレオチド配列を認識して、核酸を切断する活性を持つＲＮＡである（たとえば、柳川弘志 実験医学バイオサイエンス１２、ＲＮＡのニューエイジ）。リボザイムまたはデオキシリボザイムは、選択された標的ＲＮＡ、たとえば本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡを開裂するように製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を基に、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムまたはデオキシリボザイムを設計することができ、かようなリボザイムまたはデオキシリボザイムは本発明のタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有し、該ｍＲＮＡと相補的結合し、ついで該ｍＲＮＡが開裂され本発明のタンパク質の発現が減少し（または完全に発現せず）、発現減少のレベルは標的細胞内でのリボザイムまたはデオキシリボザイム発現のレベルに依存している。
【０１２３】
よく用いられるリボザイムまたはデオキシリボザイムには、ハンマーヘッド型とヘアピン型の２種類があり、特にハンマーヘッド型リボザイムまたはデオキシリボザイムは切断活性に必要な一次構造や二次構造がよく調べられており、当業者であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列情報のみで容易にリボザイムまたはデオキシリボザイムの設計が可能である〔たとえば、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445 (1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)〕。ハンマーヘッドリボザイムまたはデオキシリボザイムは、標的ＲＮＡと相補鎖を形成する２ヶ所の認識部位（認識部位Ｉと認識部位ＩＩ）と活性部位からなる構造をなし、標的ＲＮＡと認識部位で相補対を形成した後、標的ＲＮＡのＮＵＸの配列（Ｎ：ＡまたはＧまたはＣまたはＵ、Ｘ：ＡまたはＣまたはＵ）の３’末端側で切断することが知られており、特にＧＵＣ（あるいはＧＵＡ）が一番高い活性を持つことが知られている〔たとえばKoizumi,Mら:Nucl. Acids Res.17,7059-7071(1989)、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445 (1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)、川崎＆多比良：実験医学 Vol.18 No.3 p381-386 (2000)〕。
【０１２４】
そこでまず、本発明のＤＮＡ配列の中からＧＴＣ（またはＧＴＡ）の配列を探し出し、その前後で数ヌクレオチドから十数ヌクレオチドの相補対をつくることができるようにリボザイムまたはデオキシリボザイムを設計する。設計したリボザイムまたはデオキシリボザイムの適切性の評価は、たとえば、大川＆平比良の文献〔実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994) 〕に記載の方法によって、作製したリボザイムまたはデオキシリボザイムが、イン ビトロ（in vitro）で標的ｍＲＮＡを切断できるかどうかを調べることで評価できる。リボザイムまたはデオキシリボザイムの調製は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を合成するための当分野で周知の方法により調製する。
【０１２５】
別法としては、リボザイムの配列をＤＮＡ合成機で合成し、たとえばＴ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込み、イン ビトロで酵素的にＲＮＡを合成させる方法が挙げられる。これらのリボザイムは、たとえばマイクロインジェクション法などの遺伝子導入方法によって細胞内に導入できる。あるいは別の方法として、リボザイムをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、株細胞、細胞或いは組織内に導入する。選択された細胞中にリボザイムを導入するのに、適切なベクターを使用することができ、たとえばプラスミドベクター、動物ウイルス（たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスあるいはワクシニアウイルス）ベクターがこれらの目的に通常用いられる。これらのリボザイムは、本発明のタンパク質で仲介されるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを阻害する作用を有する。
【０１２６】
本発明によれば、Elk-1をリン酸化する作用および／またはElk-1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する二本鎖RNAも提供される。
二本鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、その配列に対応するｍＲＮＡが特異的に分解されることにより遺伝子発現が抑制されるRNA interference（ＲＮＡｉ）という現象が最近明らかにされてきた。ＲＮＡｉを利用する方法として、人工的に合成したsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入する方法が一例として挙げられる。ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡｉ現象を引き起こすために重要なトリガーといわれる19から25塩基対の二本鎖ＲＮＡである。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列中の適当な領域の19〜25塩基配列について、センスＲＮＡ（ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列に置き換えたＲＮＡ）とアンチセンスＲＮＡ（センスＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡ）を合成してｓｉＲＮＡを作製し、そのｓｉＲＮＡを例えばfugene6などのリポフェクション法で細胞へ導入することによってＲＮＡｉを利用することができる。
【０１２７】
また、合成ｓｉＲＮＡの導入以外の方法として、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列中の適当な領域の19〜25塩基の配列、及びそれと相補的な配列をプラスミドに組み込み、一時的に細胞内でｓｉＲＮＡを発現させる方法も効果的な方法であることが最近徐々に明らかにされてきている。具体的には、例えばAmbion社のpSilencer siRNA Expression Vectorなどを用いることができる。（森田隆ら タンパク質 核酸 酵素 Vol.4 No.14 p1939-p1945（2001）、杉本亜砂子 化学と生物 Vol.40 No.11 p713-718）
【０１２８】
本発明のｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡであるため、その５’末端の配列がｍＲＮＡの転写開始点であり、該ｃＤＮＡ配列をゲノムのヌクレオチド配列と比較することにより、該遺伝子のプロモーター領域を同定することに利用できる。ゲノムのヌクレオチド配列は、データベースに公知の配列として登録されている場合はその配列を利用できる。あるいは、該ｃＤＮＡを用いてたとえばハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーからクローニングし、ヌクレオチド配列を決めることもできる。このようにして、本発明のｃＤＮＡのヌクレオチド配列をゲノムの配列と比較することによって、その上流に存在する該遺伝子のプロモーター領域を同定することが可能である。さらに、このようにして同定した該遺伝子のプロモーター断片を用いて該遺伝子の発現を調べるレポータープラスミドを作製することができる。レポータープラスミドは、大方の場合、転写開始点からその上流２ｋｂ、好ましくは転写開始点からその上流１ｋｂのＤＮＡ断片をレポーター遺伝子の上流に組み込むことによって作製できる。さらに該レポータープラスミドは、該遺伝子の発現を増強あるいは減弱させる化合物のスクリーニングに利用できる。具体的には例えば、該レポータープラスミドで適当な宿主を形質転換し、一定時間培養した形質転換体に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該形質転換体が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない形質転換体のレポーター活性と比較することによりスクリーニングすることができる。これらの方法も本発明に含まれる。
【０１２９】
また本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列もしくはコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットおよび／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体に関する。
【０１３０】
さらに本発明は、上記に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列のデータを比較して相同性の算出を行なう方法に関する。すなわち、本発明のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、その２次元および３次元構造を決定し、たとえば同様の機能を有する相同性の高いさらなる配列を同定するための貴重な情報源となる。これらの配列をコンピュータ読み込み可能媒体に保存し、ついで既知の高分子構造プログラムにおいて保存したデータを用いて、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)）のような既知検索ツールを用いてデータべースを検索すれば、データベース中の、ある相同性を有する配列を見出すことは容易である。
【０１３１】
コンピュータ読み取り可能媒体は情報またはデータを保存するのに用いる物体のいずれの組成物であってもよく、たとえば、市販フレキシブルディスク、テープ、チップ、ハードディスク、コンパクトディスク、およびビデオディスク等がある。また、本媒体上のデータは、他のヌクレオチド配列のデータと比較して相同性の算出を行なう方法を可能にする。この方法には、本発明ポリヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド配列をコンピュータ読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第一のポリヌクレオチド配列を少なくとも一つの第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１３２】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質に関する。ＤＮＡプローブである複数の各種ポリヌクレオチドがスライドガラス等の特別に加工された基質上に固定され、次いで標識された標的ポリヌクレオチドを、固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それぞれのプローブからのシグナルを検出する。得られるデータは、解析され、遺伝子発現が測定される。
本発明はさらにまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質に関する。このタンパク質を固定した不溶性基質と、生物由来の細胞抽出液とを混合し、不溶性基質上に捕獲された、診断あるいは新薬開発のために有効であることが期待されるタンパク質などの細胞由来成分を、単離あるいは同定することができる。
【０１３３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらの例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）オリゴキャッピング法を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ヒト末梢血単核球（PBMC）からのＲＮＡ調製
約２×１０７個のヒトPBMCを、１０％FBS（Fetal Bovine Serum：GIBCO社より購入）、終濃度１０μg/mlでPHA（Phytohemagglutinin）を含むRPMI1640培地（GIBCO社より購入）にて５％CO2存在下、３７℃で７日間培養した。かくして得られた培養液を遠心分離に供したあと、PBSで１回洗浄し、約１×１０８個の細胞を回収し、RNA抽出源（１）とした。また、残りの細胞（約１×１０８個）は、PHAを欠く同上の培地にて２４時間培養した後２等分し、一方はそのまま２４時間培養を継続した後、上記と同様に回収してRNA抽出源（２）とした。そしてもう一方には終濃度10ｎM、10μMとなるようPMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）、A23187をそれぞれ添加し、24時間培養を行った後、細胞回収を実施し、抽出源（３）とした。ついでこれら（１）〜（３）の３種類の回収細胞からＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーンより購入）を用いて全ＲＮＡを各々取得した。取得の具体的方法は、添付のプロトコールに従った。次いで、オリゴｄＴセルロース カラムを用いて、全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを取得した。ポリＡ＋ＲＮＡ取得の具体的方法は、上記Maniatisの実験書に従った。
【０１３４】
（２）オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製
上記、ヒトPBMCのポリＡ＋ＲＮＡから、オリゴキャッピング法により完全長ｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製の具体的方法は、菅野らの方法〔たとえば、Maruyama,K.& Sugano,S.Gene,138:171-174(1994)、Suzuki、Y.et al.Gene、200:149-156(1997)、鈴木・菅野 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック改訂第３版〕に従って作製した。
【０１３５】
（３）プラスミドＤＮＡの調製
上記実施例で作製した完全長ｃＤＮＡライブラリーを、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＴＯＰ１０株に形質転換した後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌のコロニーから、QIAGEN社のQIAwell 96 Ultra Plasmid Kitを用いてプラスミドを回収した。具体的方法は、QIAwell 96 Ultra Plasmid Kitに添付のプロトコールに従った。
【０１３６】
（実施例２）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するＤＮＡのクローニング
（１）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
２９３ＥＢＮＡ細胞（INVITROGEN社より購入）を細胞培養用９６穴プレートに１×１０4Cells/wellとなるように５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地を用いて播種し、そののち２４時間３７℃で培養した（５％ＣＯ2存在下）。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、ｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２Elk1（STRATAGENE社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）３０ｎｇ、及び上記実施例１．（３）で調製した完全長ｃＤＮＡ２μｌを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。２４時間３７℃で培養後、ロングタームルシフェラーゼアッセイシステム、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を測定した。なおルシフェラーゼ活性の測定は、Perkin Elmer社のWallac ARVOTMST 1420 MULTILA BEL COUNTERを用いて行った。
【０１３７】
（２）ヌクレオチド配列の決定
上記スクリーニングを行い、ルシフェラーゼ活性が対照実験で得られた値（完全長ｃＤＮＡの代わりに、空ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を導入した細胞のルシフェラーゼ活性）と比べて３倍以上上昇しているプラスミドを選抜し、クローニングされているｃＤＮＡの５’側（シークエンスプライマ：5'-CTTCTGCTCTAAAAGCTGCG-3'（配列番号６９）と３’側（シークエンスプライマ：5'-CGACCTGCAGCTCGAGCACA-3'（配列番号７０））からそれぞれｏｎｅｐａｓｓシークエンスを行ない、できる限り長く決定した。なお、ヌクレオチド配列決定のための試薬や方法は、Thermo Sequenase II Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（アマシャムファルマシア社）、あるいはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用い、ABI PRISM 377シークエンサー、あるいは、ABI PRISM 3100シークエンサーを用い、各々キットに添付されている説明書に従って行なった。
【０１３８】
（３）得られたクローンのデータベース解析
得られたヌクレオチド配列について、GenBankに対するＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）〔S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990) 〕検索を行なった。その結果、３４クローンがElk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規のタンパク質をコードする３４種類の遺伝子であった。
【０１３９】
（４）全長シークエンス
上記スクリーニングによって得られた３４種類の新規のクローンについて、全長ヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）を決定し、タンパク質をコードする部分（オープンリーディングフレーム）のアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８）を予想した。
【０１４０】
（実施例３）ＭＡＰキナーゼカスケード、特にｐ３８のシグナルの活性化を阻害する化合物の評価系
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、上記実施例２のスクリーニングで得た、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有することが既に公知のタンパク質ＭＫＫ３をコードする遺伝子を含有するプラスミド１０ｎｇと、ｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２Elk1（STRATAGENE社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）５ｎｇ、を１ｗｅｌｌに共導入した。１時間以内にＭＡＰキナーゼの一種であるｐ３８阻害剤であることが知られているＳＢ２０３５８０（CALBIOCHEMより購入）を終濃度０．０８２〜２０μＭになるように培養液中に加えた。３７℃で２４時間培養後、ピッカジーンＬＴ２．０を用いてレポーター活性を測定した。その結果、ＳＢ２０３５８０はレポーター遺伝子の発現をＩＣ50がおよそ０．４μＭで抑制した（図１）。
【０１４１】
（実施例４）内部標準を用いて補正したレポーター活性の測定
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、１０、１６、１８、２４、２６、３２、３６、４４、５０、５２、５６、６０、６２、６４、６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇと、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２−Elk1（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）３０ｎｇ、及び内部標準用のレポーター遺伝子としてｐＲＬ−ｔｋ（東洋インキ社より購入）１０ｎｇを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。２４時間３７℃で培養後、ピッカジーンデュアル（東洋インキ製造株式会社より購入）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性（ハタルシフェラーゼ活性）と、内部標準となるレポーター活性（シーパンジールシフェラーゼ）を測定した。なおルシフェラーゼ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて測定した。
【０１４２】
その結果、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、１０、１６、１８、２４、２６、３２、３６、４４、５０、５２、５６、６０、６２、６４、６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇと導入量を変えて導入した際、内部標準レポーター活性で補正したＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性が、導入量に依存して上昇した。
表１に、上記の遺伝子を含有する発現プラスミドを導入した際の、内部標準レポーター活性で補正したＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性を、空ベクターを導入した際の同じレポーター活性で割った値（Ｓ／Ｂ値）で示した。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
（実施例５）阻害剤のスクリーニング
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ５０ｎｇ、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）３０ｎｇを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。３７℃で２時間培養後、手持ちの化合物１０００種類を１ウエルあたり最終濃度１０μＭとなるように添加し、更に２４時間３７℃で培養後、ピッカジーンＬＴ２（東洋インキ製造株式会社より購入）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性を測定した。化合物を添加しないウエルをコントロールとして、化合物を添加したウエルのレポーター活性が５０パーセント以下となるような化合物を探索した。その結果、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドを導入した系で、各種カイネースの活性を非特異的に阻害することが既に知られているスタウロスポリンが阻害剤として得られた。今回得られたスタウロスポリンの構造式を図２に示す。
【０１４５】
【発明の効果】
本発明により、産業上有用性の高いＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用、即ちElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質やそれらの遺伝子が提供される。本発明のタンパク質やそれらの遺伝子により、ＭＡＰキナーゼカスケードの過剰な活性化、又は阻害が関与する疾患の治療や予防に有用な化合物のスクリーニング、さらにそのような疾患の診断薬を作製することが可能である。更に本発明の遺伝子は、遺伝子治療に用いられる遺伝子ソースとしても有用である。
【０１４６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号６９：プライマー
配列番号７０：プライマー
【０１４７】
【配列表】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＰキナーゼの一種であるｐ３８阻害剤であるＢ２０３５８０を用いてレポーター活性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、スタウロスポリンの構造式を示す。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの取得方法、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体ならびに該蛋白質と特異的に反応する抗体に関する。また、本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの過剰な活性化または阻害が関与する疾患の診断、治療または予防を行なう際の本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体の使用に関する。
また本発明は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
MAP（mitogen-activated protein）キナーゼ（MAPK）は1980年代後半に発見された。1990年代に、MAPキナーゼ活性化にいたるシグナル伝達経路は、チロシンキナーゼ活性を有する細胞増殖因子受容体から、SH2とSH3から成るアダプター分子を経て、癌遺伝子産物でGTP結合蛋白質であるRas、さらにセリン／スレオニンキナーゼをコードする癌遺伝子産物Raf-1を介してMAPキナーゼへと至るシグナル伝達経路として解明された。現在ではそのMAPキナーゼシグナル伝達経路が、高等真核生物の増殖、分化および発生を規定する中枢経路であると理解されている（Nishida,E et al., Trends Biochem.Sci.,18:128-131(1993), Marshall, C.J., Curr.Opin.Genet.Dev.,4:82-89(1994), Cobb,M.H. et al., J.Biol.Chem., 270:14843-14846(1995)）。
【０００３】
MAPキナーゼの活性化には、キナーゼサブドメインVIIとVIIIの間にあるThr-Glu-Tyr(TEY)配列中のThrとTyrがリン酸化されることが必須である。この両アミノ酸残基のリン酸化を触媒する酵素として見出されたのが、MAPKキナーゼ（MAPKK）あるいはMAPK/ERKキナーゼ（MEK）である。従ってこの酵素は、セリン／スレオニンとチロシンの両方をリン酸化できるdual-specificity kinaseである。さらに、MAPKKもその活性化には、キナーゼドメインVIIとVIIIの間にある2つのセリン（あるいはスレオニン）残基のリン酸化が必要で、このリン酸化を担うセリン／スレオニンキナーゼをMAPKKキナーゼ（MAPKKK）と総称する。Raf-1はMAPKKKの一種であり、Ras→Raf-1(=MAPKKK)→MAPKK→MAPKという連鎖がシグナル伝達の主要経路の一つである。MAPKKK/MAPKK/MAPKという3分子からなるキナーゼの連鎖を古典的MAPキナーゼカスケードと呼ぶ。現在、古典的MAPキナーゼに類似のキナーゼとして、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2の存在が明らかになっており、これらの系のカスケードを総称してMAPキナーゼカスケードと呼んでいる。
【０００４】
SAPK/JNKとは、細胞に蛋白合成阻害剤などの化学的ストレスや、熱ショックや浸透圧変化などの物理的ストレスが加わったときに活性化されるキナーゼとして同定されたStress-Activated Protein Kinase(SAPK)と呼ばれるキナーゼ（Kyriakis,J.M., Nature,369:156-160(1994)）と、転写因子JunのN末端をリン酸化して転写活性を上昇させるキナーゼ c-Jun N-terminal Kinase(JNK)（Derijard,B., Cell,76:1025-1037(1994)）が同一であることが判明した結果、SAPK/JNKと呼ばれるものである。
【０００５】
一方、p38/CSBP/MPK2とは、リンパ球細胞を刺激した時に早期にチロシンリン酸化される蛋白質として同定・クローニングされたp38と呼ばれるMAPキナーゼと類縁のキナーゼ（Han,J., et al., Science,265:808-811(1994)）と、リンパ球における炎症性のサイトカインの産生を抑制する薬剤、cytokine-suppressive antiinflammatory drug（CSAID）に結合する蛋白質として同定されたCSAID binding protein（CSBP）（Lee,J.C., et al., Nature,372:739-746(1994)）がp38のヒト型であることが判明し、更にストレス刺激で活性化するキナーゼとして独立に取られたMPK2も同じ分子である（Rouse,J., et al., Cell,78:1027-1037(1994)）ことが判明した結果、p38/CSBP/MPK2と呼ばれるものである。
【０００６】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2は互いに配列の相同性があってスーパーファミリーを形成している。例えば、SAPK/JNKでは、古典的MAPキナーゼの活性化に必要なTEY配列がTPY(Thr-Pro-Tyr)であり、p38/CSBP/MPK2では、TGY配列であり、いずれの場合においてもThrとTyrが上流のキナーゼMAPKKによってリン酸化されて活性化される。
【０００７】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2のそれぞれに特異的なMAPKKも互いに配列の相同性があってスーパーファミリーを形成しており、MEK, SEK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7などがこのスーパーファミリーに属する（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem., 271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci., 19:470-473(1994)）。例えば、SAPK/JNKを特異的にリン酸化するMAPKKとしては、SAPK/ERK kinase-1（SEK1）あるいはmitogen-activated protein kinase kinase 4 （MKK4）（Lin,A., et al., Science,268:286-290(1995), Sanchez,I., Nature, 372:794-798(1994), Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem., 270:12969-12972 (1995)）と、mitogen-activated protein kinase kinase 7 （MKK7）（Moriguchi,T.,et al, EMBO J.,16:7045-7053(1997), Tournier,C., et al, P.N.A.S., 94:7337-7342 (1997),他）が知られている。また、p38を特異的に活性化するMAPKKとしてMKK3とMKK6が知られている（Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem., 271:26981-26988(1996), Cuenda,A., et al., EMBO J., 15:4156-4164 (1996)）。
【０００８】
古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38/CSBP/MPK2に至る経路の上流に位置するMAPKKKにおいては、互いの相同性が比較的低く、Raf, TAK1, MEKK, MLK3, Ask1, Mos, CotなどMAPKKK活性を持つキナーゼ同士ではキナーゼドメイン内でも30%程度の相同性しかない。このことは、非常にバラエティーに富んだ刺激に応じて必要なMAPキナーゼシグナル伝達経路を特異的に起動するというシステムの合目的性とよく一致している。現在、SAPK/JNKに至る経路の上流のMAPKKKとしてMEKK1が知られているが、他にもMAPKKKとして働くキナーゼが存在する可能性が高いと考えられる。
【０００９】
SAPK/JNKとp38/CSBP/MPK2は、古典的MAPキナーゼを活性化する増殖因子の刺激ではほとんど活性化されず、いずれも浸透圧ショックや熱ショックなどのストレスやTNF-α、IL-1などの炎症性サイトカインで活性化されることが知られている（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473(1994)）。また細胞死を誘導するUV照射や血清・増殖因子除去などによっても活性化される（Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996), Davis,R.J., Trends Biochem.Sci., 19:470-473(1994)）。古典的なMAPキナーゼがチロシンキナーゼ型の受容体から発するシグナルによって活性化されるのに対し、SAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の系はその入口が非常に多様なのが特徴である。
【００１０】
以上のように、MAPキナーゼカスケード、特にSAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の系は多様な刺激で活性化する。細胞外の刺激から最終的にSAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2の活性化に至るまでの経路には、数多くのMAPKKキナーゼやMAPKキナーゼ、あるいはそれらをつなげるアダプター分子群が存在すると考えられるが、いまだにその全容は明らかにされていない。さらなる解明を行い、医薬・診断・医療の分野でこれらを利用することが望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のように有用なMAPキナーゼカスケードを活性化する作用を有する新規な遺伝子及びタンパク質を見出し、これを医薬、診断薬、医療の分野で利用する方法を提供することにある。上述の３種のMAPキナーゼはどれもElk１をよい基質としてリン酸化する。よって、本発明の課題は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、及び該抗体の製造方法を提供することである。
【００１２】
また、本発明の別の課題は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを阻害または促進する物質をスクリーニングする方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニング用キットを用いて得られるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する物質、該物質の製造方法、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する物質を含有している医薬などを提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、SAPK/JNKやp38/CSBP/MPK2が細胞外の各種炎症性サイトカインによる刺激によって速やかに活性化されるという点に注目し、上記課題を解決するために、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用について鋭意研究を重ねた結果、オリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を用いた発現クローニング法による遺伝子機能アッセイ系を完成し、該アッセイ系によりElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離することに成功した。この新規ＤＮＡは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞内で発現させることによりElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を誘発することを確認した。この結果は、この新規ＤＮＡがElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化経路に関与するシグナル伝達分子であることを示しており、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１４】
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）の精製されたタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【００１５】
（２） （１）に記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する精製されたタンパク質。
（３） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【００１６】
（４） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【００１７】
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかのタンパク質コード領域に示されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるタンパク質コード領域のいずれかであって、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【００１８】
（６） （３）に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（７） （４）または（５）に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（８） （３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる精製されたタンパク質。
【００１９】
（９） （３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１０） （９）に記載の組換えベクターを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
（１１） （９）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１２） 膜タンパク質である（１）または（２）に記載のタンパク質を有する、（１１）に記載の形質転換体の膜。
（１３） （ａ）（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を発現する条件下で（１１）に記載の形質転換体を培養する工程；および
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する工程、
を含む、（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質の製造方法。
（１４） （ａ）個体のゲノムにおける（１）、（２）または（８）に記載のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；
および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する工程を含む、該個体における該遺伝子の発現または活性に関連した疾病または疾病への感受性の診断方法。
【００２０】
（１５） 以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【００２１】
（１６） 以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【００２２】
（１７） （１５）または（１６）に記載のスクリーニング方法により選択される、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物。
【００２３】
（１８） 以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００２４】
（１９） 以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００２５】
（２０） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングするためのキットであって、（ａ）（１）、（２）または（８）に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、を含む上記のキット。
【００２６】
（２１） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
（２２） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する、（２１）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
（２３） （１）、（２）または（８）に記載のタンパク質を抗原あるいはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することを含む、（２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法。
【００２７】
（２４） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を阻害する、（３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（２５） （１）、（２）または（８）記載のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有するか、またはElk１をリン酸化へ導く経路および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化へ導く経路のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有する、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイム。
（２６） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を抑制する、（３）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列の一部に対応する配列を持つ二本鎖RNA。
【００２８】
（２７） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の（１５）または（１６）に記載の方法でスクリーニングされた化合物、および／または（２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片、および／または（２４）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または（２５）に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイム、および／または（２６）に記載の二本鎖RNAを個体に投与することを含む、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用に関連する疾患の治療方法。
【００２９】
（２８） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または活性化するための、（１８）または（１９）に記載の方法により製造された医薬組成物。
（２９） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎の治療および／または予防のための、（２８）記載の医薬組成物。
（３０） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の異常に起因した疾患を患っている患者に（１８）または（１９）に記載の方法により製造された医薬組成物を投与することを含む、炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎を治療する方法。
【００３０】
（３１） （２１）または（２２）に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物。
（３２） （２４）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物。
（３３） （２５）に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイムを有効成分として含有する医薬組成物。
（３４） （２６）に記載の二本鎖RNAあるいはその二本鎖RNAを発現することが可能なベクターを有効成分として含有する医薬組成物あるいは遺伝子治療剤。
（３５） 炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療および／または予防のための、（３１）から（３４）の何れかに記載の医薬組成物。
【００３１】
（３６） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるヌクレオチド配列もしくはそれらのコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセット、および／または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体。
（３７）（３６）に記載の媒体上のデータと他のポリヌクレオチド配列および／または他のアミノ酸配列のデータを比較して他のポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列との同一性の算出を行なう方法。
【００３２】
（３８） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
（３９） 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質。
【００３３】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明について説明する。MAPキナーゼカスケードを活性化する作用を有する新規遺伝子を取得する目的で、実施例に示すように、以下の実験を実行した。
【００３４】
まずヒト末梢血単核球（PBMC）より調製したｍＲＮＡより、オリゴキャッピング法によって完全長ｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡをベクターpME18S-FL3（GenBank Accession AB009864）に組み込んだ完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した。次に、該ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌に導入し、１クローンずつプラスミドを調製した。次に、HEK293EBNA細胞（INVITROGEN社）に、ヒトＪＮＫ遺伝子をコードするＤＮＡを含有する動物細胞発現用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、ヒトｐ３８遺伝子をコードするＤＮＡを含有する動物細胞発現用のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、それらの基質となるElk1の一部とGAL4DNA結合領域との融合蛋白質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドpFA2-Elk1（STRATAGENE社）、およびGal4認識部位をルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に持つレポータープラスミドpFR-Luc（STRATAGENE社）と上記の完全長ｃＤＮＡプラスミドとを共導入した。そして、２４時間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性が対照実験（完全長ｃＤＮＡの代わりに、ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を入れた細胞）と比べて有意に上昇している（対照実験と比べてルシフェラーゼ活性が３倍以上の値を示した）プラスミドを選抜し、該プラスミドにクローニングされているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を決定した。前述したように、MAPキナーゼカスケードの最下流に存在するｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫなどは、Elk1をよい基質とするため、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化に関与するシグナル伝達分子は、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化するシグナル伝達分子である可能性が高い。よってこのようにして得られたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化に関与するシグナル伝達分子であると同時に、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化に関与するシグナル伝達分子である可能性が高いことが期待できる。
【００３５】
Elk1をリン酸化するキナーゼを活性化するとは、具体的にはElk1をリン酸化するキナーゼを直接修飾して活性化する場合と、その更に上流のシグナルを活性化することによって間接的に活性化する場合が含まれる。
【００３６】
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるElk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するとは、適切な宿主内に遺伝子を導入し、該遺伝子がコードするタンパク質を過剰発現させた時、Elk1が直接的あるいは間接的にリン酸化されることをいう。Elk1のリン酸化は、例えばElk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子とともに、GAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子を細胞に共導入することによるレポーター遺伝子アッセイにより測定できる。Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、該レポーター活性を対照実験（空のベクターのみを導入した宿主）に比し上昇させる作用を指標として確認することができる。指標とするレポーター活性の上昇は、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。
【００３７】
レポーター活性は、発現させたいタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を適切な発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをElk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子、GAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子とともに適切な宿主に共導入（コ・トランスフェクション）し、一定時間培養後レポーターの活性を測定することにより測定することができる。適切な発現ベクターは当業者にはよく知られており、例えばｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。レポーター遺伝子は、当業者がその発現を容易に検出できるものであればよく、例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を使用することがもっとも好ましい。Elk1とGAL4DNA結合領域を融合させた遺伝子としては、例えばｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）が挙げられ、またGAL4認識配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーター遺伝子としては、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）が例示される。適切な宿主とは、ＩＬ−１あるいはＴＮＦ−αなどの刺激によりＭＡＰＫカスケードが活性化されるような応答を示すような宿主であり、例えば２９３−ＥＢＮＡ細胞が挙げられる。宿主培養及び宿主への遺伝子導入（トランスフェクション）は、当業者であれば当該技術分野で公知の慣用方法により実施でき最適化できる。
【００３８】
好ましい方法としては、２９３−ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６穴プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数となるように、５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）存在下のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した後、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche社）を用いてｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＦＡ２−Elk１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）、及び発現ベクターを１ウエルに共導入する。３７℃で２４時間培養後、ロングタームルシフェラーゼシステムピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を測定する。ルシフェラーゼ活性の測定は、たとえばＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて測定できる。ＦｕＧＥＮＥ６による遺伝子導入の方法及びピッカジーンＬＴ２．０によるルシフェラーゼ活性測定は、それぞれに添付されているプロトコールに従い実施できる。ＦｕＧＥＮＥ６を用いた９６穴プレートでの遺伝子導入の方法は、１ウエルあたりＦｕＧＥＮＥ６の量は０．３〜０．５μｌが良く、好ましくは０．５μｌであり、導入するそれぞれのプラスミド遺伝子量は、ｐＦＲ−Ｌｕｃプラスミド量は５０〜１００ｎｇが良く、好ましくは６０ｎｇであり、ｐＦＡ２−Elk1プラスミド量は０．１〜０．５ｎｇが良く、好ましくは０．２５ｎｇであり、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド量は５ｎｇが好ましく、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド量は３０ｎｇが好ましい。Elk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、該レポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を対照実験（空のベクターのみを導入した宿主）に比し上昇させる作用を指標として確認することができる。指標とするレポーター活性の上昇は、好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。
【００３９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列に関連して、本発明は以下のタンパク質を提供する。
（ａ）上記アミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）上記アミノ酸配列の１つを有するペプチド。
（ｃ） Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有し、かつ上記アミノ酸配列において、１または複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を有するタンパク質。
（ｄ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有し、かつその全長にわたり上記アミノ酸配列番号に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００４０】
本明細書で言う“同一性”とは、当該技術で知られている通り、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係により決定される。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性”および“類似性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００４１】
アミノ酸置換行列とは２０種類のアミノ酸の各々のペアの類縁性を数値化した行列であり、通常BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられる。このアミノ酸置換行列の理論については、Altschul S.F., J. Mol. Biol., 219:555-565(1991)に、DNA配列の比較への適用については、States D.J., Gish W., Altschul S.F., Methods, 3:66-70(1991)に示されている。その際の最適なギャップコストは経験的に決定されており、BLOSUM62の場合は好ましくは、Existence11、Extension 1のパラメーターが用いられる。期待値（EXPECT）とは、データベース配列に対してマッチする際の統計的有意性に関する閾値であり、デフォルト値は１０である。
【００４２】
上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質がElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有することは、本願明細書実施例に記載の通りである。
【００４３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のポリヌクレオチドまたはこれらの配列に示されるコード領域（ＣＤＳ）からなるポリヌクレオチドに関連して、本発明はさらに以下の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）上記配列を有するポリヌクレオチド。
（ｂ）上記配列に少なくとも９５％、好ましくは９７９９％の同一性を有し、かつ、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【００４４】
上記ヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド配列に同一またはほとんど同一なポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンまたは上記配列に対応する相同性の高い他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記配列に７０％同一であり、好ましくは、８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは、９５％以上同一である。プローブまたはプライマーは、一般的には少なくとも１５ヌクレオチドを含有し、好ましくは３０ヌクレオチドを含有し、５０ヌクレオチドを含有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態(たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む)であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００４６】
当業者であれば、公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様にElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質を作製することが可能である。一つの方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡに対して、慣用の突然変異誘発法を使用する方法がある。別の方法としてはたとえば部位特異的変異法（たとえば宝酒造株式会社のMutan-Super Express Km キット）が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。アミノ酸の変異の数は特に限定されないが、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個が好ましい。
【００４７】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００４８】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）またはその一部を基に、これと類似性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同様にElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質を得ることも通常行ない得ることである。
【００４９】
このように上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列のタンパク質と高い同一性を有するタンパク質であって、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。高い同一性とは、上記配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表わされるアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９７９９％の同一性を有するアミノ酸配列を示す。
【００５０】
本発明のタンパク質としては、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞や組織に由来する天然のタンパク質でもよく、化学合成タンパク質であってもよく、また遺伝子組換え技術によって得られたタンパク質でもよい。タンパク質は糖鎖やリン酸化などの翻訳後修飾は受けていても受けていなくても良い。
本発明の遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、分泌タンパク質（増殖因子、サイトカイン、ホルモン等）、タンパク質修飾酵素（タンパク質リン酸化酵素、タンパク質脱リン酸化酵素、プロテアーゼ等）、シグナル伝達分子（タンパク間相互作用分子等）、核内タンパク質（核内受容体、転写因子等）、膜タンパク質等が挙げられる。膜タンパク質は、受容体、細胞接着分子、イオンチャンネル、トランスポーター等が挙げられる。タンパク質が膜タンパク質である場合、後述するスクリーニングにより選択された化合物は、細胞内へ容易に移行する或いは細胞内にシグナルを伝達させることが予想されるため、医薬化合物のリードサーチツールとしては、より有用である。
【００５１】
本発明はまた、上記で示される本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。上記の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列としてより具体的には、たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＤＮＡはｃＤＮＡのほか、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡも含まれる。遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドを他の種類のヌクレオチドに置換することができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換されたヌクレオチド配列も含有する。このようなＤＮＡは、公知の方法により合成することができる。
【００５２】
本発明のＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列あるいはこれらと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。ストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）に従えば容易に実施できる。
【００５３】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（低ストリンジェンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（高ストリンジェンシー）。この際、得られたＤＮＡは、Elk１をリン酸化する作用および／またははElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードすることが必須である。
【００５４】
本発明は、上記（３）、（４）あるいは（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と高い類似性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記（３）、（４）または（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の全長にわたり９５％同一であり、より好ましくは９７％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００５５】
上記の本発明のＤＮＡは、上記（１）、（２）あるいは（８）のタンパク質を、組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本発明のＤＮＡ及びペプチドは、概略以下のようにして得ることができる。
（Ａ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。
（Ｂ）タンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込んで、組換えベクターを構築する。
（Ｃ）構築した組換えベクターにより、宿主を形質転換する。
（Ｄ）得られた宿主を培養し、該タンパク質、またはその類縁体を発現させ、カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。
【００５６】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記T.Maniatisらの実験操作書に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。以下に上記（Ａ）〜（Ｄ）の工程について更に詳しく説明する。
【００５７】
上記工程（Ａ）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本願明細書実施例に記載した方法の他に、本発明のヌクレオチド配列（たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）の一部を有する合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって増幅する方法、あるいは、適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。細胞、組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（ＲＴ-ＰＣＲ法）によって増幅することもできる。
【００５８】
適当なベクターに組み込んだＤＮＡとしては、たとえば市販されている（CLONTECH社、STRATAGENE社）ライブラリーを使用することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記T.Maniatisらの実験操作書に従えば容易に実施できる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。上記のようにして得られるＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子であるか、あるいは前述の（３）〜（７）のポリヌクレオチドであればよい。上記（Ｂ）において発現ベクターに組み込むＤＮＡは、上述のタンパク質の全長をコードする全長ｃＤＮＡでも、ＤＮＡ断片でも良いし、その一部分を発現する様に構築されたＤＮＡ断片でも良い。
【００５９】
すなわち、本発明によれば、上記のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
用いる発現ベクターとしては、大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由来、真菌由来、昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来いずれのベクターでも良いが、宿主に適したものを選択する必要がある。また、発現物に応じて、宿主―発現ベクター系としては、適切な組み合わせが選択される。
【００６０】
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組み換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。たとえば、大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、及び組換え体ＤＮＡで形質転換した宿主を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、βラクタマーゼプロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００６１】
酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００６２】
真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミナーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。
昆虫細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞に適した発現ベクターの例としては、バキュロウイルスベクターなどが挙げられる。
【００６３】
動物細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための組換えベクターは、一般に遺伝子を制御するための機能配列、たとえば、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、ポリアデニル化部位や転写終止配列を含有している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることができるそのような機能配列はウイルスやウイルス性物質から得ることができる。
【００６４】
例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主ベクター系で使用するのに適しているならば使用することができる。複製起源については、外来性の起源、たとえばアデノウイルス、ポリオーマ、ＳＶ４０等のウイルス由来の複製起点を用いることができる。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれるような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用することができる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＳＶｄｈｆｒ（ATCC 37146）、ｐＢＰＶ１（９１）（ATCC 37111）、ｐｃＤＮＡ３．１（INVITROGEN社）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３等が挙げられる。
【００６５】
本発明によれば、上記の組換えベクターを含む形質転換体も提供される。本発明の複製可能な組換えベクターで形質転換された微生物または細胞等の宿主は、前述の通り、組換えベクターに与えられた少なくとも１種の表現型によって形質転換されずに残った親宿主から選別される。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換えベクターに挿入することによって与えることができる。また複製可能なベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、たとえば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
【００６６】
上記工程（Ｃ）において用いる宿主としては、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでも良いが、用いる発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生物の例としては、エシュリヒア コリ（Escherichia coli）の菌株、たとえばE.coliK12株２９４（ATCC 31446）、E.coli X1776（ATCC 31537）、E.coli C600、E.coli JM109、E.coli B株、あるいはバチラス サブチリス（Bacillus subtilis）等のBacillus属の菌株、あるいはサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア マーゼサンス（Serratia marcesans）等の大腸菌以外の腸内菌、あるいはシュードモナス（Pseudomonas）属の種々の菌株が挙げられる。酵母としては、たとえば、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。真菌としては、たとえば、アスペルギルス ニドランス（Aspergillus nidulans）、アクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）（ATCC 11550）等が挙げられる。
【００６７】
昆虫細胞としては、たとえば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda：Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、などが用いられる。動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞等が挙げられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が好ましい。細胞を宿主とする場合、用いられる発現ベクターと宿主細胞の組み合わせは実験の目的により異なるが、その組み合わせにより、一過的発現、構成的発現の２種類の発現方式が考えられる。
【００６８】
上記工程（Ｃ）における微生物及び細胞等の宿主の形質転換とは、ＤＮＡを強制的方法や、宿主の貪食能により宿主に取り込ませ、プラスミド状態あるいは染色体に組み込まれた状態でＤＮＡの形質を一過的あるいは構成的に発現させることである。当業者であれば公知の方法によって形質転換できる（たとえば実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック）。たとえば動物細胞の場合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポフェクション法などの方法でＤＮＡを宿主に導入することができる。動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる細胞を取得する方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、Dihydroforate reductase（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択マーカーとして用いた場合Methotrexate（ＭＴＸ）濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ＤＨＦＲ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
【００６９】
上記の形質転換体を本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質を製造することができる。すなわち、本発明は、上記（３）〜（７）に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む形質転換体を、該ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下で培養し、次いで培養物（即ち、宿主自体または培地）から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法も提供される。
【００７０】
上記の形質転換体の培養は、当業者に公知の方法で行なうことができる（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社）。たとえば動物細胞の場合、各種の動物細胞培養法、たとえば、シャーレ培養、マルチトレー式培養、モジュール培養などの付着培養、または細胞培養用担体（マイクロキャリアー）に付着させるか生産細胞自体を浮遊化させ浮遊培養等の公知の方法により培養を行なえば良い。培地は通常良く用いられる動物細胞用の培地、たとえばＤＭＥＭやＩ−ＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０等を用いれば良い。
【００７１】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。たとえば、本発明のタンパク質は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に使用される。ポリペプチドが細胞内合成、単離または精製の間に変性するときには、活性なコンフォーメションを再生するためにタンパク質をリフォールディングするためのよく知られた技術を使用できる。
【００７２】
本発明のタンパク質は、他のタンパク質との融合タンパク質として製造することができる。これら融合タンパク質も、本発明の範囲内である。この融合タンパク質を発現する際に用いられるベクターとしては、該タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができ、かつ該融合タンパク質を発現することができるベクターであれば、いかなるベクターでも用いることができる。本発明のペプチドに融合できるタンパク質としては、たとえばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン残基の６個の連続配列（６×Ｈｉｓ）等が挙げられる。本発明のタンパク質を他の蛋白質と融合した蛋白質として発現させた場合には、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、有利である。例えば、ＧＳＴとの融合蛋白質として生産した場合は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７３】
本発明のタンパク質が膜タンパク質である場合には、上記した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換体は、その細胞の膜上にタンパク質を発現することができる。このような形質転換体から調製される膜であって本発明のタンパク質を有する膜も本発明の範囲内である。なお、本明細書で言う細胞の膜とは、細胞膜、並びに細胞内小器官の膜の全てを包含する。細胞の膜の調製は当業者に公知の方法により行なう事ができる。例えば、形質転換体を培養した培養物から細胞を回収し、好適な緩衝液に懸濁後、ホモジナイザーを用いて、あるいはガラスビーズを加えボルテックスにて細胞を破砕する。破砕溶液を遠心し未破砕の細胞等を除去し、得られた上清を適切な条件で超遠心し、得られた沈殿を緩衝液に懸濁することにより膜画分調製することができる。超遠心の条件は膜の種類などに応じて適宜設定することができる。
【００７４】
本発明によれば、本発明のタンパク質の活性を阻害するタンパク質も提供される。このようなタンパク質の具体例としては、例えば、抗体または本発明のタンパク質の活性中心等に結合し活性の発現を妨げる他のタンパク質が挙げられる。
【００７５】
本発明は、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに反応する抗体ならびに該抗体の製造方法に関する。さらに好ましくは、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に反応する抗体、並びにそのような抗体の製造方法に関する。ここでいう「特異的」とは、本発明のタンパク質以外の物質に対する交差反応性が少ないもの、より好ましくはないものを意味する。
【００７６】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体の何れであってもよい。抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。たとえば、該抗体フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦｖフラグメントが含まれる。たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上記（１）または（２）に記載のタンパク質を抗原またはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することにより得られる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質あるいはそのペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。たとえば実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版に記載の方法が挙げられる。
【００７７】
ポリクローナル抗体の場合であれば、たとえば、ウサギなどの動物に本発明のタンパク質あるいはペプチドを注射することにより該タンパク質あるいはペプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００７８】
モノクローナル抗体の場合は、たとえば、本発明のタンパク質をマウスなどの動物に免疫し、同マウスから脾臓を抽出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００７９】
得られた抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト抗体を用いることが好ましい。ヒト抗体は、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を用いて作製することができる。これらのヒト型化抗体やヒト抗体の一般的概説は、たとえば、Morrison,S.L.et al.〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)〕、Jones,P.T.et al〔Nature 321:522-525(1986)〕、野口浩〔医学のあゆみ １６７：４５７４６２（１９９３）〕、松本隆志〔化学と生物 ３６：４４８４５６（１９９８）〕によって供されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
【００８０】
また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを用いて、該マウスを免疫して、通常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することもできる。これらの抗体は、タンパク質を発現するクローンを単離したり、同定するのに使用できる。
また、これらの抗体は、本発明のタンパク質を細胞抽出液、または本発明のタンパク質を産生する形質転換体から精製するのに使用できる。更にこれらの抗体は、細胞や組織中の本発明のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡやＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、またはウエスタンブロット系の構築に使用できる。このような検出系は、動物、好ましくは、ヒトの組織または血管内流体などの身体サンプル中に存在する本発明のタンパク質の存在量を検出する診断目的に使用することができる。たとえば、これらの抗体は、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などの、本発明のタンパク質の(発現)異常に起因するＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の診断に使用できる。
【００８１】
疾患の診断の基礎を提供するために、本発明のタンパク質の発現についての通常の値、すなわち標準値が確立されなければならないが、これは当業者においては周知の技術である。すなわち、複合体形成のための適切な条件下で、ヒトあるいは動物のどちらでもよいが、正常の被験者から得られた体液あるいは細胞抽出物と、本発明のタンパク質に対する抗体とを結合させ、この抗体タンパク複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原（本発明のタンパク質）を含む標準液を用いて作成した標準曲線を用いて、正常サンプルから得られた標準値を算出する。標準値と本発明のタンパク質が関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルから得られた値と比較し、標準値との偏差によって疾病の存在を確認することができる。また、これらの抗体は、本発明のタンパク質の機能を研究する試薬としても用いることができる。
【００８２】
本発明の抗体は、以下の通り医薬として用いることができる。本発明の抗体を医薬として用いる場合には、本発明のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害することができる抗体（即ち、中和抗体）を用いることが好ましい。
【００８３】
本発明の抗体は精製することができ、次いで、たとえば、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などの、本発明のタンパク質の(発現)異常に起因するElk1をリン酸化するキナーゼの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の患者に投与することができる。すなわち本発明によれば、上記に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および抗体を用いた治療および／または予防方法が提供される。本発明の医薬組成物は、上記抗体を有効成分として用いて、さらに治療または予防的使用のための他の有効成分または不活性成分（たとえば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（たとえば、免疫原性アジュバント）と、生理学的に無毒の安定化剤／または賦形剤を用いて調製することができる。本発明の抗体を含む医薬組成物は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として、投薬形態に製剤化することができる。
【００８４】
患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行ない得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。これらの抗体は、本発明のタンパク質で仲介されるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害し、治療効果を示す。より具体的には、本発明の抗体は、炎症、自己免疫疾患、感染症（一例としてＨＩＶ感染）、癌などのＭＡＰキナーゼカスケードの活性化異常が関係する疾患を治療および／または予防する医薬として有用である。
【００８５】
本発明のＤＮＡは、細胞内シグナリングプロセスに関与する他のタンパク質を単離、同定、クローン化することにも使用できる。たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コードされたタンパク質を「ベイト（ｂａｉｔ）」として用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、本発明のタンパク質に結合できるタンパク質をコードする他の配列「プレイ（ｐｒｅｙ）」を単離し、クローン化する酵母ツーハイブリッドシステム（たとえばＮａｔｕｒｅ、３４０：２４５２４６（１９８９））に用いることができる。同様の方式で、本発明のタンパク質が、他の細胞タンパク質（たとえばＪＮＫ，ｐ３８）に結合できるかどうかも決定することができる。あるいは別の方法として、本発明のタンパク質の抗体を用いた免疫沈降法（たとえば、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によって、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を細胞抽出物から単離する方法が挙げられる。さらに別の方法として、上記に記載のように、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降法を行ない、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を単離する方法が挙げられる。
【００８６】
本発明によれば、（ａ）個体のゲノムにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該遺伝子の発現量を分析する工程を含む、該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した疾病または該疾病への感受性の診断方法が提供される。
【００８７】
本発明の診断方法では、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する機能に関与する本発明のタンパク質をコードする該遺伝子中の変異を検出することにより、疾患の診断や該疾患への感受性を診断することができる。さらにこのような疾患は、個体に由来するサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡレベルの異常な減少または増加を測定することを含む方法によって診断してもよい。
【００８８】
ここで、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する機能に関与する本発明のタンパク質をコードする該遺伝子中の変異を検出する方法としては、それらの遺伝子のヌクレオチド配列の一部をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後通常のヌクレオチド配列決定方法によって配列を決定し、変異の有無を検出する方法が挙げられる。あるいは、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Gennomics、5:874-879、1989年、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によっても変異の有無を調べることができる。
【００８９】
サンプル中の遺伝子の発現の減少または増加は、当該技術でＲＮＡレベルでのポリヌクレオチドの定量によく知られた方法、たとえば、ＲＴＰＣＲなどの核酸増幅法、およびＲＮａｓｅ保護法、ノーザンブロット法その他のハイブリダイゼーション法などの方法で測定できる。宿主に由来するサンプル中のタンパク質レベルの測定に使用され得るアッセイ技術は、当業者によく知られている。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合測定法、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。タンパク質レベルでの発現量を調べる場合には、前記した本発明の抗体を利用して測定することができる。
サンプル中の遺伝子の発現量の異常の程度は特に限定されないが、本発明の一実施態様によれば、発現するタンパク質の量が正常の2倍以上、あるいは、１／２以下の場合に病気であると診断することができる。本発明の別の実施態様によれば、発現するタンパク質の量が正常の３倍以上、あるいは、１／３以下の場合に病気であると診断することができる。
【００９０】
個体のゲノムにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝子中に変異があることが検出された場合には、該変異がElk１のリン酸化に関与する該タンパク質の発現および／または活性に関連した疾病を引き起こす可能性がある
また、個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析した結果、当該発現量が正常値と異なる値を示す場合は、Elk１のリン酸化に関与する本発明のタンパク質の発現量の異常が、Elk１のリン酸化に関与する該タンパク質の発現および／または活性に関連した疾病の原因となる可能性がある。
【００９１】
また、本発明は、本発明のタンパク質を介するＭＡＰキナーゼカスケードを活性化（Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化）する作用を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法に関する。
上記のスクリーニング方法は、
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk1をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、
を含む。
【００９２】
本発明では、シグナル量を正常より２倍以上に増加させる化合物を活性化剤化合物として単離または同定し、２分の１以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
Elk1をリン酸化する作用を検出できるシグナルをコードする遺伝子としては、たとえばレポーター遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子は、テストを行なう転写因子の活性化を直接検出するかわりに用いられるもので、調べたい遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子につなぎ、レポーター遺伝子の産物の活性を測定することによってプロモーターの転写活性の解析を行なうものである（バイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））。
【００９３】
レポーター遺伝子としては、その発現産物の活性または生産量（ｍＲＮＡの生産量も含まれる）を当業者が測定可能なものであれば、いかなるペプチド、タンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダゼ、ルシフェラーゼ等の酵素活性を測定することで利用できる。Elk１のリン酸化の活性化を評価するのに用いるレポータープラスミドとしては、イーストの転写因子Gal4の認識配列をレポーター遺伝子の上流に組み込んだものであれば良く、例えばｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社）と、各種ＭＡＰキナーゼの基質となる遺伝子例えばElk1やＡＴＦ２などとイーストのGal4タンパク質のDNA結合領域をつないだ融合蛋白質例えばｐＦＡ２Elk1やｐＦＡ２ＡＴＦ２（STRATAGENE社）とを同時に宿主内に導入することにより利用できる。
【００９４】
宿主としては、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出し得る宿主であればよく、好ましくは、哺乳動物細胞であり、たとえばＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞が好適に用いられる。形質転換及び培養に関しては、上記に記載の通りである。
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物のスクリーニングは、具体的には、たとえば、一定時間培養した形質転換体に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該形質転換体が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない宿主のレポーター活性と比較することにより、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物をスクリーニングすることができる。レポーター活性の測定は、当業者に公知の方法（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））で行なうことができる。
【００９５】
スクリーニングの被検物質には特に制限はなく、低分子化合物、高分子化合物及びペプチドなどが挙げられる。被検化合物は、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。また単一物質でも、混合物でもよい。例えば、低分子化合物のライブラリー、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物ライブラリー、細胞、植物、動物またはその一部を含む天然物、又は当該天然物由来の抽出物などを用いることもできる。複数の化合物を含む混合物をスクリーニングの被験物質として用いた場合は、本発明のタンパク質によるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する活性が認められた被験物質についてさらにスクリーニングを行なうことにより、該活性を有する単一物質を単離することができる。また、混合物から目的化合物を単離、精製するには、公知の方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なう事ができる。
【００９６】
また、本発明のスクリーニング法は以下の工程で行なうこともできる。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程。
【００９７】
上記方法で、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を測定する方法としては、例えば細胞抽出液を得た後に、リン酸化された各種MAPキナーゼに対する抗体を用いて、各種MAPキナーゼの活性化を検出する方法があげられる。リン酸化された各種MAPキナーゼに対する抗体は、例えばNEB（New England Biolabs社）社の製品を用いることができる。上記抗体を用いた検出の方法としては、ELISA法、ウエスタンブロット法、ドットハイブリダイゼーション法などがあげられる。また、各種MAPキナーゼに対する抗体を用いた免疫沈降法によって各種MAPキナーゼの活性を測定することも可能である。各種MAPキナーゼに対する抗体、及びそれらに対する基質は例えばUpstate Biotechnology社の製品を用いることができる。
【００９８】
さらに本発明によれば、以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法が提供される。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、およびElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【００９９】
さらに本発明では、以下の工程により医薬組成物を製造することもできる。
（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在下の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
また、上記医薬組成物製造方法の工程（ｄ）においては、シグナル量を正常より２倍以上に増加させる化合物を活性化剤化合物、２分の１以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
【０１００】
本発明のタンパク質は、以下の工程により、該タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を、構造を基礎にして設計する方法に使用してもよい。
（ａ）まず、タンパク質の三次元構造を決定する工程、
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応性部位または結合部位と思われる部位の三次元構造を推論する工程、
（ｃ）推論した結合部位または反応性部位に結合するかあるいは結合すると予測される候補化合物を合成する工程、および
（ｄ）該候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか否かを試験する工程。
【０１０１】
また本発明によれば、上記スクリーニングによって選択された化合物が提供される。該化合物は、本発明のタンパク質によるＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害または促進する活性を有する。さらに詳細には、該化合物は、本発明のタンパク質によるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する活性を有する。
【０１０２】
上記スクリーニングによって得られた化合物は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼ活性化する作用を阻害または促進する作用を有しているので、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの望ましくない活性化あるいは不活性化に起因する疾患を治療または予防するための医薬として有用である。
【０１０３】
化合物の塩を取得したい時は、化合物が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれば良く、また遊離の形で得られる場合には、通常の方法により適当な溶媒に溶解または懸濁し、所望の酸または塩基を添加し、塩を形成させて単離精製すれば良い。本発明の方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として調製する工程としては、例えば以下のように常法により製剤化することが挙げられる。すなわち活性成分として有効な量の上記化合物またはその薬理的に許容される塩と、薬理的に許容される担体とを混合すれば良い。また製剤化は選択された投与様式に適した形態が選ばれる。経口投与に適した組成物としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。上記の担体としては、例えばゼラチン、乳糖、グルコース等の糖類、コーン・小麦・米・とうもろこし澱粉等の澱粉類、ステアリン酸等の脂肪酸、ステアリン酸カルシウム・ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、タルク、植物油、ステアリンアルコール・ベンジルアルコール等のアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール等が挙げられる。これらのうち液状担体の例としては、一般に水、生理食塩水、デキストロースまたは類似の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
【０１０４】
本発明によれば、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の阻害剤または活性化剤としての活性について化合物をスクリーニングするためのキットも含まれる。該キットは、（ａ）本発明のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子、およびElk１をリン酸化する作用が検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、から成るものであり、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または促進する化合物をスクリーニングするために必要な試薬類を含む。
【０１０５】
別の側面において、本発明は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表わされるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質またはそれらの断片；または、
（ｄ）（ｃ）の本発明のタンパク質に対する抗体；
を含む診断キットに関する。
【０１０６】
少なくとも（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含むキットは、炎症、自己免疫疾患、感染性疾患（たとえばＨＩＶ感染）および癌などの疾患または該疾患への感受性を診断するのに有用である。
ＭＡＰキナーゼカスケードは、炎症、自己免疫疾患、癌及びウイルス感染などの多種の病理学的状態におけるその関与のため、薬物デザイン及び治療介在のための魅力的な標的である。多数の実験が、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化の阻害が深い生理学的作用を有し得ることを示している（例えば、J Cell Biochem 2001 Apr 3-27;82(1):68-77、Pharmacol Res 2001 Mar;43(3):275-83、Diabetes 2001 Jun;50(6):1495-504、Diabetes 2001 Jun;50(6):1464-71、 Atherosclerosis 2001 May;156(1):81-90））。
【０１０７】
本明細書中に報告するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規タンパク質の発見により、異常なＭＡＰキナーゼカスケード活性化を阻害する新しい方法が提供された。さらなる具体例において、本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害するための前記のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質の機能を阻害する化合物を用いる方法に関する。また、本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を促進するための前記のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質の機能を促進する化合物を用いる方法に関する。上記スクリーニング方法によって得られた、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害する化合物または促進する化合物は、たとえば炎症、自己免疫疾患、感染症（１例としてＨＩＶ感染症）などの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の治療または予防をする医薬として有用である。
【０１０８】
ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化は、アポトーシスを誘導する場合があることが知られており、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化阻害剤はアポトーシスを抑制する可能性が考えられる。アポトーシスの抑制が治療につながる疾患としてはＧＶＨＤ、Toxic epidermal necrolysis（ＴＥＮ）などの皮膚疾患、増殖性腎炎（ＩｇＡ腎炎、紫斑病性腎炎、ループス腎炎）、劇症肝炎などが挙げられる。逆にアポトーシスの誘導が治療につながる疾患としては癌疾患等を含む腫瘍が挙げられる。
よって、上記スクリーニング方法によって得られた、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する化合物または促進する化合物はこれらの疾患の治療または予防のための医薬として有用である。
【０１０９】
更に、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、および炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療を目的とした遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療とは、疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与することを意味する。本発明のタンパク質や該タンパク質をコードするDNAは、診断目的にも使用できる。すなわち、本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子治療剤が提供される。
【０１１０】
また本発明のタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子治療剤に用いる場合、後述するRNA interference（ＲＮＡｉ）の手法を応用することもできる。すなわち本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を持つ二本鎖ＲＮＡを発現するような遺伝子治療用のベクターも提供される。
【０１１１】
遺伝子治療剤の形態は特に限定されないが、例えば生理緩衝液からなる薬剤キャリア中に本発明の遺伝子を含む発現ベクターを含む医薬組成物などが挙げられる。薬剤キャリアとしては、その他に適当な安定剤（例えばヌクレアーゼ阻害剤など）、キレート剤（例えばEDTAなど）、及び／またはその他の助剤も含むことができる。あるいはまた、本発明の遺伝子治療剤は、本発明の遺伝子を含む発現ベクターとリポソームとの複合体として提供しても良い。上記した遺伝子治療剤は、例えばカテーテルを利用して適用することもできる。例えば、本発明の遺伝子治療剤を患者の血管などに直接注入することも可能である。
【０１１２】
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には成人1回あたりは有効成分のDNA量として１μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。たとえば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、たとえば、ヒトや哺乳動物（たとえば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行ないうる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢などにより変動するが、当業者であれば適宜投与方法を選択すると共に、投与方法に応じて適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行なうことも考えられる。
すなわち本発明は、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進または阻害する化合物を有効成分として含有する医薬に関する。
【０１１４】
さらに、上記化合物は、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、感染症、癌などの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患の治療または予防する医薬として有用である。すなわち本発明は、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を促進または阻害する化合物を含む、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、ガンなどの医薬にを提供する。具体的には、例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、敗血症、喘息、アレルギー性鼻炎、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、くも膜下出血、ウイルス肝炎、エイズ、ＧＶＨＤ、Toxic epidermal necrolysis（ＴＥＮ）などの皮膚疾患、増殖性腎炎（ＩｇＡ腎炎、紫斑病性腎炎、ループス腎炎）、劇症肝炎などに対する治療及び予防薬として有用である。
さらにまた、本発明は、炎症、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、ガンなどの治療および予防のための医薬の製造における上記化合物の使用も提供される。
【０１１５】
また本発明によれば、上記（３）〜（７）に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とした遺伝子配列に対して相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質への翻訳、細胞質への輸送、あるいは全体的な生物活性機能に必要な他の活性等のＲＮＡの機能を阻害することによって、標的遺伝子の発現を抑制することができる。この際、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＲＮＡを用いても良いし、ＤＮＡを用いても良い。本発明のＤＮＡ配列は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために使用できる。一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドが、その遺伝子の発現に対して抑制的に作用することは公知での事実である（たとえば、細胞工学 Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．４（１９９４））。本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスコード配列を有するオリゴヌクレオチドは、標準の方法で細胞内に導入することができ、該オリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を効果的に遮断して、その発現を遮断して、望ましくない作用を抑制することができる。
【０１１６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に見出されるオリゴヌクレオチドの他に、修飾されたものであっても良い〔たとえば、村上＆牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996）〕。従って、オリゴヌクレオチドは変化した糖部分あるいは糖間部分を有していても良い。これらの例は、当該技術分野において使用が知られているホスホチオエート及び他のイオウ含有種である。幾つかの好ましい態様に従えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのホスホジエステル結合が、その活性が調節されるべきＲＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能力を高める機能を有する構造により置換される。
【０１１７】
このような置換は、ホスホロチオエート結合、ホスホロアミデート結合、メチルホスホネート結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造を含むことが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも幾つかの修飾されたヌクレオチド型を含んでいても良い。従って、天然に通常見いだされるもの以外のプリン及びピリミジンを使用していても良い。同様に本発明の本質的な意図が実行される限り、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分を修飾することもできる。このような修飾の例は、２’Ｏアルキル、及び２’ハロゲン置換ヌクレオチドである。本発明において有用な幾つかの糖部分の２’位の修飾の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは１から約１０である）、及び同様の特性を有する他の置換基である。全てのこのような類似体は、本発明の遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機能を阻害する機能を果たす限り、本発明に包含される。
【０１１８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約３から約５０ヌクレオチドを含み、約８から約３０ヌクレオチドを含むことが好ましく、約１２から約２５ヌクレオチドを含むことがさらに好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、周知の方法である固相合成法により作製することができる。このような合成のための装置は、Applied Biosystemsを含む幾つかの業者により販売されている。ホスホチオエート等の他のオリゴヌクレオチドの製造も当業者に公知の方法で作製できる。
【０１１９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写されるｍＲＮＡとハイブリダイズできるように設計される。与えられた遺伝子の配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当業者であれば容易である〔たとえば、村上および牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996)〕。最近の研究は、ｍＲＮＡの５’領域、好ましくは翻訳開始部位を含む領域に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の阻害に最も効果的であることを示唆している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、１５から３０ヌクレオチドが好ましく、２０から２５ヌクレオチドがより好ましい。ホモロジー検索で他のｍＲＮＡとの相互作用がないこと、オリゴヌクレオチド配列内で二次構造を取らないことを確認しておくことは重要である。設計したアンチセンス分子が機能したかどうかの評価は、適当な細胞を用いて、該細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、当業者には公知の方法で、対象ｍＲＮＡの量（たとえば、ノーザンブロットまたはＲＴＰＣＲ法）、あるいは対象タンパク質の量（たとえば、ウエスタンブロットまたは蛍光抗体法）を測定することにより、発現抑制の効果を確認できる。
【０１２０】
一方、三重らせん形成（トリプル・ヘリックス技術）は、核内のＤＮＡを標的とした、主に転写の段階での遺伝子発現制御方法である。オリゴヌクレオチドは、主に転写に関与する遺伝子領域に設計され、それにより、転写及び本発明のタンパク質の産生を抑える。これらのＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドは、公知の合成装置などを用いて製造することができる。
【０１２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞に、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などのDNAトランスフェクション法、またはウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法のいずれを用いて導入してもよい。適切なレトロウイルスベクターを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチド発現ベクターを作製し、その後、該発現ベクターを細胞とin vivoまたはex vivoで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入できる。
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術またはトリプル・へリックス技術を用いて、本発明のタンパクを介するＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害する目的で使用できる。
【０１２２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば炎症、自己免疫疾患、感染症（たとえば、ＨＩＶ感染症症）、ガンなどの、ＭＡＰキナーゼカスケードの望ましくない活性化によって特徴付けられる疾患を治療または予防する医薬として有用である。すなわち、本発明は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬が提供される。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の検出に利用することもできる。
本発明によれば、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼの活性化を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイムも提供される。リボザイムまたはデオキシリボザイムは、核酸のヌクレオチド配列を認識して、核酸を切断する活性を持つＲＮＡである（たとえば、柳川弘志 実験医学バイオサイエンス１２、ＲＮＡのニューエイジ）。リボザイムまたはデオキシリボザイムは、選択された標的ＲＮＡ、たとえば本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡを開裂するように製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を基に、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムまたはデオキシリボザイムを設計することができ、かようなリボザイムまたはデオキシリボザイムは本発明のタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有し、該ｍＲＮＡと相補的結合し、ついで該ｍＲＮＡが開裂され本発明のタンパク質の発現が減少し（または完全に発現せず）、発現減少のレベルは標的細胞内でのリボザイムまたはデオキシリボザイム発現のレベルに依存している。
【０１２３】
よく用いられるリボザイムまたはデオキシリボザイムには、ハンマーヘッド型とヘアピン型の２種類があり、特にハンマーヘッド型リボザイムまたはデオキシリボザイムは切断活性に必要な一次構造や二次構造がよく調べられており、当業者であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列情報のみで容易にリボザイムまたはデオキシリボザイムの設計が可能である〔たとえば、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445 (1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)〕。ハンマーヘッドリボザイムまたはデオキシリボザイムは、標的ＲＮＡと相補鎖を形成する２ヶ所の認識部位（認識部位Ｉと認識部位ＩＩ）と活性部位からなる構造をなし、標的ＲＮＡと認識部位で相補対を形成した後、標的ＲＮＡのＮＵＸの配列（Ｎ：ＡまたはＧまたはＣまたはＵ、Ｘ：ＡまたはＣまたはＵ）の３’末端側で切断することが知られており、特にＧＵＣ（あるいはＧＵＡ）が一番高い活性を持つことが知られている〔たとえばKoizumi,Mら:Nucl. Acids Res.17,7059-7071(1989)、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445 (1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)、川崎＆多比良：実験医学 Vol.18 No.3 p381-386 (2000)〕。
【０１２４】
そこでまず、本発明のＤＮＡ配列の中からＧＴＣ（またはＧＴＡ）の配列を探し出し、その前後で数ヌクレオチドから十数ヌクレオチドの相補対をつくることができるようにリボザイムまたはデオキシリボザイムを設計する。設計したリボザイムまたはデオキシリボザイムの適切性の評価は、たとえば、大川＆平比良の文献〔実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994) 〕に記載の方法によって、作製したリボザイムまたはデオキシリボザイムが、イン ビトロ（in vitro）で標的ｍＲＮＡを切断できるかどうかを調べることで評価できる。リボザイムまたはデオキシリボザイムの調製は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を合成するための当分野で周知の方法により調製する。
【０１２５】
別法としては、リボザイムの配列をＤＮＡ合成機で合成し、たとえばＴ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込み、イン ビトロで酵素的にＲＮＡを合成させる方法が挙げられる。これらのリボザイムは、たとえばマイクロインジェクション法などの遺伝子導入方法によって細胞内に導入できる。あるいは別の方法として、リボザイムをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、株細胞、細胞或いは組織内に導入する。選択された細胞中にリボザイムを導入するのに、適切なベクターを使用することができ、たとえばプラスミドベクター、動物ウイルス（たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスあるいはワクシニアウイルス）ベクターがこれらの目的に通常用いられる。これらのリボザイムは、本発明のタンパク質で仲介されるElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを阻害する作用を有する。
【０１２６】
本発明によれば、Elk-1をリン酸化する作用および／またはElk-1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する二本鎖RNAも提供される。
二本鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、その配列に対応するｍＲＮＡが特異的に分解されることにより遺伝子発現が抑制されるRNA interference（ＲＮＡｉ）という現象が最近明らかにされてきた。ＲＮＡｉを利用する方法として、人工的に合成したsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入する方法が一例として挙げられる。ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡｉ現象を引き起こすために重要なトリガーといわれる19から25塩基対の二本鎖ＲＮＡである。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列中の適当な領域の19〜25塩基配列について、センスＲＮＡ（ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列に置き換えたＲＮＡ）とアンチセンスＲＮＡ（センスＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡ）を合成してｓｉＲＮＡを作製し、そのｓｉＲＮＡを例えばfugene6などのリポフェクション法で細胞へ導入することによってＲＮＡｉを利用することができる。
【０１２７】
また、合成ｓｉＲＮＡの導入以外の方法として、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列中の適当な領域の19〜25塩基の配列、及びそれと相補的な配列をプラスミドに組み込み、一時的に細胞内でｓｉＲＮＡを発現させる方法も効果的な方法であることが最近徐々に明らかにされてきている。具体的には、例えばAmbion社のpSilencer siRNA Expression Vectorなどを用いることができる。（森田隆ら タンパク質 核酸 酵素 Vol.4 No.14 p1939-p1945（2001）、杉本亜砂子 化学と生物 Vol.40 No.11 p713-718）
【０１２８】
本発明のｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡであるため、その５’末端の配列がｍＲＮＡの転写開始点であり、該ｃＤＮＡ配列をゲノムのヌクレオチド配列と比較することにより、該遺伝子のプロモーター領域を同定することに利用できる。ゲノムのヌクレオチド配列は、データベースに公知の配列として登録されている場合はその配列を利用できる。あるいは、該ｃＤＮＡを用いてたとえばハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーからクローニングし、ヌクレオチド配列を決めることもできる。このようにして、本発明のｃＤＮＡのヌクレオチド配列をゲノムの配列と比較することによって、その上流に存在する該遺伝子のプロモーター領域を同定することが可能である。さらに、このようにして同定した該遺伝子のプロモーター断片を用いて該遺伝子の発現を調べるレポータープラスミドを作製することができる。レポータープラスミドは、大方の場合、転写開始点からその上流２ｋｂ、好ましくは転写開始点からその上流１ｋｂのＤＮＡ断片をレポーター遺伝子の上流に組み込むことによって作製できる。さらに該レポータープラスミドは、該遺伝子の発現を増強あるいは減弱させる化合物のスクリーニングに利用できる。具体的には例えば、該レポータープラスミドで適当な宿主を形質転換し、一定時間培養した形質転換体に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該形質転換体が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない形質転換体のレポーター活性と比較することによりスクリーニングすることができる。これらの方法も本発明に含まれる。
【０１２９】
また本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７で表されるヌクレオチド配列もしくはコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットおよび／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体に関する。
【０１３０】
さらに本発明は、上記に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列のデータを比較して相同性の算出を行なう方法に関する。すなわち、本発明のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、その２次元および３次元構造を決定し、たとえば同様の機能を有する相同性の高いさらなる配列を同定するための貴重な情報源となる。これらの配列をコンピュータ読み込み可能媒体に保存し、ついで既知の高分子構造プログラムにおいて保存したデータを用いて、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)）のような既知検索ツールを用いてデータべースを検索すれば、データベース中の、ある相同性を有する配列を見出すことは容易である。
【０１３１】
コンピュータ読み取り可能媒体は情報またはデータを保存するのに用いる物体のいずれの組成物であってもよく、たとえば、市販フレキシブルディスク、テープ、チップ、ハードディスク、コンパクトディスク、およびビデオディスク等がある。また、本媒体上のデータは、他のヌクレオチド配列のデータと比較して相同性の算出を行なう方法を可能にする。この方法には、本発明ポリヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド配列をコンピュータ読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第一のポリヌクレオチド配列を少なくとも一つの第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１３２】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質に関する。ＤＮＡプローブである複数の各種ポリヌクレオチドがスライドガラス等の特別に加工された基質上に固定され、次いで標識された標的ポリヌクレオチドを、固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それぞれのプローブからのシグナルを検出する。得られるデータは、解析され、遺伝子発現が測定される。
本発明はさらにまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質に関する。このタンパク質を固定した不溶性基質と、生物由来の細胞抽出液とを混合し、不溶性基質上に捕獲された、診断あるいは新薬開発のために有効であることが期待されるタンパク質などの細胞由来成分を、単離あるいは同定することができる。
【０１３３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらの例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）オリゴキャッピング法を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ヒト末梢血単核球（PBMC）からのＲＮＡ調製
約２×１０７個のヒトPBMCを、１０％FBS（Fetal Bovine Serum：GIBCO社より購入）、終濃度１０μg/mlでPHA（Phytohemagglutinin）を含むRPMI1640培地（GIBCO社より購入）にて５％CO2存在下、３７℃で７日間培養した。かくして得られた培養液を遠心分離に供したあと、PBSで１回洗浄し、約１×１０８個の細胞を回収し、RNA抽出源（１）とした。また、残りの細胞（約１×１０８個）は、PHAを欠く同上の培地にて２４時間培養した後２等分し、一方はそのまま２４時間培養を継続した後、上記と同様に回収してRNA抽出源（２）とした。そしてもう一方には終濃度10ｎM、10μMとなるようPMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）、A23187をそれぞれ添加し、24時間培養を行った後、細胞回収を実施し、抽出源（３）とした。ついでこれら（１）〜（３）の３種類の回収細胞からＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーンより購入）を用いて全ＲＮＡを各々取得した。取得の具体的方法は、添付のプロトコールに従った。次いで、オリゴｄＴセルロース カラムを用いて、全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを取得した。ポリＡ＋ＲＮＡ取得の具体的方法は、上記Maniatisの実験書に従った。
【０１３４】
（２）オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製
上記、ヒトPBMCのポリＡ＋ＲＮＡから、オリゴキャッピング法により完全長ｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製の具体的方法は、菅野らの方法〔たとえば、Maruyama,K.& Sugano,S.Gene,138:171-174(1994)、Suzuki、Y.et al.Gene、200:149-156(1997)、鈴木・菅野 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック改訂第３版〕に従って作製した。
【０１３５】
（３）プラスミドＤＮＡの調製
上記実施例で作製した完全長ｃＤＮＡライブラリーを、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＴＯＰ１０株に形質転換した後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌のコロニーから、QIAGEN社のQIAwell 96 Ultra Plasmid Kitを用いてプラスミドを回収した。具体的方法は、QIAwell 96 Ultra Plasmid Kitに添付のプロトコールに従った。
【０１３６】
（実施例２）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するＤＮＡのクローニング
（１）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
２９３ＥＢＮＡ細胞（INVITROGEN社より購入）を細胞培養用９６穴プレートに１×１０4Cells/wellとなるように５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地を用いて播種し、そののち２４時間３７℃で培養した（５％ＣＯ2存在下）。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、ｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２Elk1（STRATAGENE社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）３０ｎｇ、及び上記実施例１．（３）で調製した完全長ｃＤＮＡ２μｌを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。２４時間３７℃で培養後、ロングタームルシフェラーゼアッセイシステム、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を測定した。なおルシフェラーゼ活性の測定は、Perkin Elmer社のWallac ARVOTMST 1420 MULTILA BEL COUNTERを用いて行った。
【０１３７】
（２）ヌクレオチド配列の決定
上記スクリーニングを行い、ルシフェラーゼ活性が対照実験で得られた値（完全長ｃＤＮＡの代わりに、空ベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を導入した細胞のルシフェラーゼ活性）と比べて３倍以上上昇しているプラスミドを選抜し、クローニングされているｃＤＮＡの５’側（シークエンスプライマ：5'-CTTCTGCTCTAAAAGCTGCG-3'（配列番号６９）と３’側（シークエンスプライマ：5'-CGACCTGCAGCTCGAGCACA-3'（配列番号７０））からそれぞれｏｎｅｐａｓｓシークエンスを行ない、できる限り長く決定した。なお、ヌクレオチド配列決定のための試薬や方法は、Thermo Sequenase II Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（アマシャムファルマシア社）、あるいはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用い、ABI PRISM 377シークエンサー、あるいは、ABI PRISM 3100シークエンサーを用い、各々キットに添付されている説明書に従って行なった。
【０１３８】
（３）得られたクローンのデータベース解析
得られたヌクレオチド配列について、GenBankに対するＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）〔S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990) 〕検索を行なった。その結果、３４クローンがElk１をリン酸化する作用若しくはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する新規のタンパク質をコードする３４種類の遺伝子であった。
【０１３９】
（４）全長シークエンス
上記スクリーニングによって得られた３４種類の新規のクローンについて、全長ヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７）を決定し、タンパク質をコードする部分（オープンリーディングフレーム）のアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８）を予想した。
【０１４０】
（実施例３）ＭＡＰキナーゼカスケード、特にｐ３８のシグナルの活性化を阻害する化合物の評価系
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、上記実施例２のスクリーニングで得た、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有することが既に公知のタンパク質ＭＫＫ３をコードする遺伝子を含有するプラスミド１０ｎｇと、ｐＦＲＬｕｃ（STRATAGENE社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２Elk1（STRATAGENE社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（INVITROGEN社）５ｎｇ、を１ｗｅｌｌに共導入した。１時間以内にＭＡＰキナーゼの一種であるｐ３８阻害剤であることが知られているＳＢ２０３５８０（CALBIOCHEMより購入）を終濃度０．０８２〜２０μＭになるように培養液中に加えた。３７℃で２４時間培養後、ピッカジーンＬＴ２．０を用いてレポーター活性を測定した。その結果、ＳＢ２０３５８０はレポーター遺伝子の発現をＩＣ50がおよそ０．４μＭで抑制した（図１）。
【０１４１】
（実施例４）内部標準を用いて補正したレポーター活性の測定
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、１０、１６、１８、２４、２６、３２、３６、４４、５０、５２、５６、６０、６２、６４、６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇと、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２−Elk1（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）３０ｎｇ、及び内部標準用のレポーター遺伝子としてｐＲＬ−ｔｋ（東洋インキ社より購入）１０ｎｇを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。２４時間３７℃で培養後、ピッカジーンデュアル（東洋インキ製造株式会社より購入）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性（ハタルシフェラーゼ活性）と、内部標準となるレポーター活性（シーパンジールシフェラーゼ）を測定した。なおルシフェラーゼ活性は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて測定した。
【０１４２】
その結果、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、１０、１６、１８、２４、２６、３２、３６、４４、５０、５２、５６、６０、６２、６４、６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇと導入量を変えて導入した際、内部標準レポーター活性で補正したＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性が、導入量に依存して上昇した。
表１に、上記の遺伝子を含有する発現プラスミドを導入した際の、内部標準レポーター活性で補正したＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性を、空ベクターを導入した際の同じレポーター活性で割った値（Ｓ／Ｂ値）で示した。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
（実施例５）阻害剤のスクリーニング
２９３ＥＢＮＡ細胞を細胞培養用９６ｗｅｌｌプレートに、１×１０4Cells/100μl/wellの細胞数になるように、５％ＦＢＳ存在下のＤＭＥＭ培地に播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、上記実施例２で得た、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドをそれぞれ５０ｎｇ、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）６０ｎｇ、ｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より購入）０．２５ｎｇ、ヒトｐ３８遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）５ｎｇ、ヒトＪＮＪ１β１遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）３０ｎｇを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。３７℃で２時間培養後、手持ちの化合物１０００種類を１ウエルあたり最終濃度１０μＭとなるように添加し、更に２４時間３７℃で培養後、ピッカジーンＬＴ２（東洋インキ製造株式会社より購入）を用いて添付されている説明書に従い、ＭＡＰキナーゼカスケード活性化を反映するレポーター活性を測定した。化合物を添加しないウエルをコントロールとして、化合物を添加したウエルのレポーター活性が５０パーセント以下となるような化合物を探索した。その結果、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現プラスミドを導入した系で、各種カイネースの活性を非特異的に阻害することが既に知られているスタウロスポリンが阻害剤として得られた。今回得られたスタウロスポリンの構造式を図２に示す。
【０１４５】
【発明の効果】
本発明により、産業上有用性の高いＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する作用、即ちElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質やそれらの遺伝子が提供される。本発明のタンパク質やそれらの遺伝子により、ＭＡＰキナーゼカスケードの過剰な活性化、又は阻害が関与する疾患の治療や予防に有用な化合物のスクリーニング、さらにそのような疾患の診断薬を作製することが可能である。更に本発明の遺伝子は、遺伝子治療に用いられる遺伝子ソースとしても有用である。
【０１４６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号６９：プライマー
配列番号７０：プライマー
【０１４７】
【配列表】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＰキナーゼの一種であるｐ３８阻害剤であるＢ２０３５８０を用いてレポーター活性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、スタウロスポリンの構造式を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の精製されたタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する精製されたタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかのタンパク質コード領域に示されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるタンパク質コード領域のいずれかであって、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる精製されたタンパク質。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
【請求項１１】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１２】
膜タンパク質である請求項１または２に記載のタンパク質を有する、請求項１１に記載の形質転換体の膜。
【請求項１３】
（ａ）請求項１、２または８に記載のタンパク質を発現する条件下で請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程；および
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する工程、
を含む、請求項１、２または８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
（ａ）個体のゲノムにおける請求項１、２または８に記載のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；
および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する工程を含む、該個体における該遺伝子の発現または活性に関連した疾病または疾病への感受性の診断方法。
【請求項１５】
以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【請求項１６】
以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のスクリーニング方法により選択される、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物。
【請求項１８】
以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【請求項２０】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングするためのキットであって、（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、を含む上記のキット。
【請求項２１】
請求項１、２または８に記載のタンパク質を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
【請求項２２】
請求項１、２または８に記載のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する、請求項２１に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
【請求項２３】
請求項１、２または８に記載のタンパク質を抗原あるいはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することを含む、請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項２４】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を阻害する、請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１、２または８記載のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有するか、またはElk１をリン酸化へ導く経路および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化へ導く経路のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有する、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイム。
【請求項２６】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を抑制する、請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列の一部に対応する配列を持つ二本鎖RNA。
【請求項２７】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の請求項１５または１６に記載の方法でスクリーニングされた化合物、および／または請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片、および／または請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または請求項２５に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイム、および／または請求項２６に記載の二本鎖RNAを個体に投与することを含む、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用に関連する疾患の治療方法。
【請求項２８】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または活性化するための、請求項１８または１９に記載の方法により製造された医薬組成物。
【請求項２９】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎の治療および／または予防のための、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の異常に起因した疾患を患っている患者に請求項１８または１９に記載の方法により製造された医薬組成物を投与することを含む、炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎を治療する方法。
【請求項３１】
請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２５に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイムを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２６に記載の二本鎖RNAあるいはその二本鎖RNAを発現することが可能なベクターを有効成分として含有する医薬組成物あるいは遺伝子治療剤。
【請求項３５】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療および／または予防のための、請求項３１から３４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項３６】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるヌクレオチド配列もしくはそれらのコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセット、および／または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体。
【請求項３７】
請求項３６に記載の媒体上のデータと他のポリヌクレオチド配列および／または他のアミノ酸配列のデータを比較して他のポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列との同一性の算出を行なう方法。
【請求項３８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
【請求項３９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の精製されたタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有する精製されたタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７のいずれかのタンパク質コード領域に示されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるタンパク質コード領域のいずれかであって、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる精製されたタンパク質。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
【請求項１１】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１２】
膜タンパク質である請求項１または２に記載のタンパク質を有する、請求項１１に記載の形質転換体の膜。
【請求項１３】
（ａ）請求項１、２または８に記載のタンパク質を発現する条件下で請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程；および
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する工程、
を含む、請求項１、２または８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
（ａ）個体のゲノムにおける請求項１、２または８に記載のタンパク質をコードする遺伝子中の変異の存在または不存在を決定する工程；
および／または（ｂ）個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する工程を含む、該個体における該遺伝子の発現または活性に関連した疾病または疾病への感受性の診断方法。
【請求項１５】
以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【請求項１６】
以下の工程を含むElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出する工程、および
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のスクリーニング方法により選択される、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物。
【請求項１８】
以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、シグナル量を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を持つタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、形質転換体を作製する工程、
（ｂ）１あるいは複数個の候補化合物の存在下または非存在下で、該遺伝子が発現可能となる条件下で該形質転換体を培養する工程、
（ｃ）Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を検出できるシグナルを測定する工程、
（ｄ）候補化合物の非存在の場合と比較して、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を変化させることができる候補化合物を、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物として選択する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で選択された化合物を含む医薬組成物を調製する工程。
【請求項２０】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングするためのキットであって、（ａ）請求項１、２または８に記載のElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質をコードする遺伝子、並びにElk１をリン酸化する作用を検出できるシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、および（ｂ）上記シグナルを測定するための試薬、を含む上記のキット。
【請求項２１】
請求項１、２または８に記載のタンパク質を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
【請求項２２】
請求項１、２または８に記載のタンパク質が有するElk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害する、請求項２１に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片。
【請求項２３】
請求項１、２または８に記載のタンパク質を抗原あるいはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することを含む、請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項２４】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を阻害する、請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１、２または８記載のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有するか、またはElk１をリン酸化へ導く経路および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化へ導く経路のタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する作用を有する、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害するリボザイムまたはデオキシリボザイム。
【請求項２６】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を促進するタンパク質の発現を抑制する、請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列の一部に対応する配列を持つ二本鎖RNA。
【請求項２７】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の請求項１５または１６に記載の方法でスクリーニングされた化合物、および／または請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片、および／または請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または請求項２５に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイム、および／または請求項２６に記載の二本鎖RNAを個体に投与することを含む、Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用に関連する疾患の治療方法。
【請求項２８】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用を阻害または活性化するための、請求項１８または１９に記載の方法により製造された医薬組成物。
【請求項２９】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎の治療および／または予防のための、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
Elk１をリン酸化する作用および／またはElk1をリン酸化するキナーゼを活性化する作用の異常に起因した疾患を患っている患者に請求項１８または１９に記載の方法により製造された医薬組成物を投与することを含む、炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎を治療する方法。
【請求項３１】
請求項２１または２２に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２５に記載のリボザイムまたはデオキシリボザイムを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２６に記載の二本鎖RNAあるいはその二本鎖RNAを発現することが可能なベクターを有効成分として含有する医薬組成物あるいは遺伝子治療剤。
【請求項３５】
炎症、自己免疫疾患、癌疾患、感染症、骨疾患、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性障害、ＧＶＨＤ、皮膚疾患、IgA腎炎、紫斑病性腎炎、増殖性腎炎、および劇症肝炎からなる群から選択される疾患の治療および／または予防のための、請求項３１から３４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項３６】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７に示されるヌクレオチド配列もしくはそれらのコード領域のヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセット、および／または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体。
【請求項３７】
請求項３６に記載の媒体上のデータと他のポリヌクレオチド配列および／または他のアミノ酸配列のデータを比較して他のポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列との同一性の算出を行なう方法。
【請求項３８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５または６７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
【請求項３９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３４０６０１（Ｐ２００６−３４０６０１Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−３４８７５（Ｐ２００３−３４８７５）
【出願日】平成１５年２月１３日（２００３．２．１３）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年２月１３日（２００３．２．１３）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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