ＨＩＶ感染症を治療するためのＮ−ヒドロキシベンズアミドの誘導体
本発明は、ＨＩＶ感染患者の治療方法に用いられる、ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル−カルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド；４−（２−（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；および／またはベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミドなどのＮ−ヒドロキシ−ベンズアミドを基剤とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に係る。このヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、５０から２００ｍｇ／日、好ましくは１００から２００ｍｇ／日の範囲の用量で投与され、１２５から２５０ｎＭの間の血中濃度が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しているヒトの治療への、Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドを基剤とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用に関する。特に、ＨＩＶ感染症の排除を目的として、持続性の潜在ＨＩＶによるＴ ＣＤ４+細胞の感染を有する患者への治療に、高活性抗レトロウイルス剤療法（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＨＡＡＲＴ）と併用する。
【背景技術】
【０００２】
１０年余り前に高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）が導入されて以来、ＨＩＶ−１感染症を効率的に制御し、ＨＩＶ−１ウイルス血症（ＨＩＶ−１ ｖｉｒｅｍｉａ）を検出可能な値未満に維持することはできる。しかし、長期のＨＡＡＲＴ療法によるＨＩＶ−１感染症の排除はまだ可能ではない。ＨＡＡＲＴを中断すると、典型的には２週間後にウイルス血症のリバウンドが起こる（非特許文献１参照）。
【０００３】
ウイルスリバウンドの原因は、長期の細胞プールであり、十中八九、メモリーＴ細胞リザーバーといえる。メモリーＴ細胞リザーバーは、比較的感染が遅く、ＨＩＶ−１が組み込まれたプロウイルスＤＮＡの宿主である。潜在性細胞プールを数値化するための統合技術が使用可能であり、１人のＨＩＶ−１陽性患者のメモリー細胞１００万個のうち１つが複製可能な組込みプロウイルスを１つ保有すると計算されている。
【０００４】
静止細胞中でプロウイルスＤＮＡを転写不活性に保持するメカニズムは知られている。しかし、このメカニズムは、クロマチンに関連する調節を伴うと長い間考えられてきた（非特許文献２参照）。潜在性細胞中では、組込みプロウイルスＤＮＡは、ヌクレオソームに高密度で組織化されている。プロモーター配列およびエンハンサー配列を含むＨＩＶ−１の５’末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）は、多数の転写因子の結合の標的であり、２つのヌクレオソーム（ｎｕｃ−０およびｎｕｃ−１）に組織化されている。ＮＦκＢ ｐ５０ホモ二量体は、ＡＰ−４、ＹＹ１およびＬＳＦ１と同様、ＬＴＲにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を補充し、それが次に局所ヒストンを脱アセチル化し、クロマチンを圧縮し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を防止する。
【０００５】
新たな一群の合成化合物であるＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＨＤＡＣの酵素活性およびＨＩＶ−１遺伝子発現の相対的な抑制を無効にし得る。さらにまた、ＩＬ−２、ＯＫＴ３またはＴＮＦαのようなＮＦκＢ細胞活性化因子とは逆に、ＨＤＡＣｉは、Ｔ細胞を全体的に活性化することなく、遺伝子発現を促進し得る。
【０００６】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのＮ末端部分または他のタンパク質中の、リジン残基に結合しているアセチル基を除去することができる酵素である。
【０００７】
ＨＤＡＣは、構造相同性によって４つのクラスに分けることができる。クラスＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ １、２、３および８）は、ＲＰＤ３酵母タンパク質に類似し、細胞核に見られる。クラスＩＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ ４、５、６、７、９および１０）は、ＨＤＡ１酵母タンパク質と類似し、核と細胞質のいずれにも見られる。クラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ＳＩＲ２酵母タンパク質と相関するＮＡＤ依存性酵素の構造的に別個の形態である。クラスＩＶ（ＨＤＡＣ １１）は一般に、特定の構造特性を有する単一酵素からなる。クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＶのＨＤＡＣは、亜鉛を含む酵素であり、種々の分子クラス：ヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、短鎖脂肪酸、アミノベンズアミド、求電子性ケトン誘導体などによって阻害され得る。クラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ヒドロキサム酸によって阻害されず、それらの阻害剤は、他のクラスの阻害剤とは異なる構造特性を有する。
【０００８】
本発明のために、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」という表現は、クラスＩ、ＩＩまたはＩＶのヒストン脱アセチル化酵素として分類される少なくとも１種の酵素の活性を阻害できる、天然由来、組換え型または合成の任意の分子を示すことを意図している。
【０００９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、抗腫瘍活性および抗炎症活性を有する一群の分子である。
【００１０】
腫瘍細胞において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、細胞増殖を阻害し、細胞の死および分化を誘導する（非特許文献３参照）。
【００１１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はまた、免疫担当細胞によるサイトカインおよび他の炎症誘発性因子の産生を調整でき、インビボで抗炎症性を有することが証明されている（非特許文献４および非特許文献５参照）。
【００１２】
腫瘍疾患および炎症性疾患の両者に種々の阻害剤を用いる多数の臨床試験が現在進捗中であり、それらの進捗段階は様々である（非特許文献６参照）。
【００１３】
参照によりともに本明細書に組み込まれる特許文献１（無水型）および特許文献２（一水和物結晶型）に記載されている、ジエチル−［６−（−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドは、良好な抗炎症活性を有するＨＤＡＣ阻害剤であり、このような活性成分の一水和物結晶型は、ＩＴＦ２３５７および／またはＧｉｖｉｎｏｓｔａｔとしても知られている。
【００１４】
ＨＤＡＣ酵素を阻害できる他の４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ヒドロキシベンズアミド誘導体は、参照によりともに本明細書に組み込まれている特許文献３および特許文献４に開示されている。
【００１５】
種々のＨＤＡＣ阻害剤が、潜伏感染した細胞株からのＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導し得ることがわかったが、他方において、誘導の実施に必要な濃度における阻害剤の毒性作用の可能性に対する懸念がもち上がり（非特許文献７参照）、これに関して、選択的なクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞毒性が比較的低い強力なＨＩＶ誘導物質となり得ることが最近提案された（非特許文献８参照）。
【００１６】
痙攣性および精神性障害に対して処方される、カルボン酸ＨＤＡＣｉのバルプロ酸（ＶＰＡ）は、一部の臨床試験でＨＡＡＲＴと併用されたが、潜在性リザーバーをかなり縮小するには至らなかった（非特許文献９参照）。したがって、ＶＰＡを用いたこれらの試験では、ＨＤＡＣｉのウイルスを排除する潜在能力が明らかにならなかった。
【００１７】
ＨＩＶ感染症の治療へのＳＡＨＡの使用が開示されている（特許文献５参照）。ＳＡＨＡは、Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド構造を有していないＨＤＡＣｉであり、ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔまたはＺｏｌｉｎｚａとして市販されている。ＳＡＨＡは、ＡＣＨ−２細胞株においてＥＣ50 ０．６３２μＭでＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導することが示されている（特許文献５の実施例２および図１を参照）。
【００１８】
Ｚｏｌｉｎｚａの添付文書は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫に冒されている患者の治療に有効と考えられるＳＡＨＡの血中濃度が、４００ｍｇ／日の用量で得られることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第９７／４３２５１号
【特許文献２】国際公開第２００４／０６５３５５号
【特許文献３】国際公開第２００４／０６３１４６号
【特許文献４】国際公開第２００６／００３０６８号
【特許文献５】国際公開第２００８／０９７６５４号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Imamichi H. et al. J Infect. Dis. 183, 36 (2001)
【非特許文献２】Quivy V. et al. Subcell Biochem. 41, 371 (2007)
【非特許文献３】Gaofeng Bi and Guosheng Jiang, Cellular & Molecular Immunology 3, 285-290 (2006)
【非特許文献４】Frederic Blanchard and Celine Chipoy, Drug Discovery Today 10, 197 -204 (2005)
【非特許文献５】IM Adcock, British Journal of Pharmacology 150, 829-831 (2007)
【非特許文献６】Marielle Paris et al., Journal of Medicinal Chemistry 51, 1505-1529 (2008)
【非特許文献７】Shehu-Xhilaga, M. et al. AIDS 23, 2047 (2009)
【非特許文献８】Archin, NM et al. AIDS 23, 1799 (2009)
【非特許文献９】Lehrman G et al. Lancet 366 (9485), 549 (2005)
【非特許文献１０】Monzani, VM et al., EUROTOX 2007, 44th Congress of toxicology, poster G33
【非特許文献１１】Vojinovic, J. et al., The 72nd annual meeting of the American College of Rheumatology, San Francisco, California, 29 October 2008
【非特許文献１２】Nold M.F. et al. J. Immunol. 181, 557 (2008)
【非特許文献１３】Jones P. et al. Bioorg Med Chem Lett. 18, 3456 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかし、この用量のＳＡＨＡは、下痢、疲労感、吐き気、血小板減少、食欲不振および味覚異常などの多数の重篤な副作用を引き起こす可能性がある。さらにまた、Ｚｏｌｉｎｚａの添付文書の情報によれば、ＳＡＨＡは、細菌復帰突然変異アッセイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（Ａｍｅｓ試験）においてインビトロで変異原性であり、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞中にインビトロで染色体異常を引き起こし、マウスへの投与時（マウス小核アッセイ）に小核赤血球の出現率を増加させる。
【００２２】
したがって、ＨＩＶ−１遺伝子発現の誘導に有効であることが既に知られているＨＤＡＣ阻害剤より活性であり且つ低毒性である、好ましくは、それより活性でありしかも低毒性である新規ＨＩＶ−１発現誘導剤、おそらくはＨＤＡＣ阻害剤に対する必要が生じることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドが、好ましくは一水和物型、より好ましくは一水和物結晶型（ＩＴＦ２３５７、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ）で、ＡＣＨ−２細胞株において好ましくは１２５〜２５０ｎＭの間の濃度でＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導できることをこのたび発見した。これは本発明の一態様を構成する。
【００２４】
ＩＴＦ２３５７は、非変異原性であることが明らかにされており（非特許文献１０参照）；臨床治療においては、ＩＴＦ２３５７を５０〜２００ｍｇ投与することによって、１２５〜２５０ｎＭの間の治療血中濃度を容易に得ることができる。この範囲内の用量が多数の臨床試験で使用され、検出された毒性作用は極めて低かった。全身型若年性特発性関節炎（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｏｎｓｅｔ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（ＳＯＪＩＡ）の小児には１．５ｍｇ／ｋｇ／日の等価用量が投与され、期待の持てる結果が得られ、毒性作用が検出されなかった（非特許文献１１参照）。
【００２５】
したがって、４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド誘導体である一部のＨＤＡＣ阻害剤（ＩＴＦ２３５７を含む）が、かなりの毒性を全く示さない濃度においてＨＩＶ遺伝子発現の誘導に極めて有効となり得ることを発見した。これは本発明の第２の態様である。この発見は、ＨＩＶ遺伝子誘導および毒性の２つの作用が同じ構造的理由および／またはメカニズム上の理由によって決まる可能性があることを示唆する以前の見解（非特許文献７参照）とは対照的であると思われる。
【００２６】
さらに、ＨＤＡＣ酵素を阻害できるこのような４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド誘導体のいくつかが、ＡＣＨ−２細胞株において１２５から２５０ｎＭの間の濃度で、ＩＴＦ２３５７よりもＨＩＶ−１遺伝子発現の誘導にさらに強力であることを発見した。これが本発明の第３の態様である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
単なる例として、４−（２（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（化合物ｇ）およびベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド（化合物ｔ）（いずれも、前記特許文献４の実施例２を参照）は、ＡＣＨ−２細胞において２５０ｎＭで、ＨＩＶ発現を３０倍増加させる。これに対して、同一濃度のＩＴＦ２３５７で得られるのは、１５倍の増加である。
【００２８】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド；
４−（２−（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（化合物ｇ）；および
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド（化合物ｔ）
の化学構造を以下に示す。
【００２９】
【化１】
【００３０】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド
【００３１】
【化２】
【００３２】
したがって、本発明の目的は、ＨＩＶ感染症、好ましくはＨＩＶ−１感染症の治療用の一般式Ｉの化合物によって代表され、
【００３３】
【化３】
【００３４】
式中、
Ｘは、Ｏ、ＣＨであるかまたは存在せず；
Ａｒは、アリール、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；前記炭素環式または複素環式アリール残基が、１つまたは複数の同一または異なるハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシで任意選択で置換されており；
Ｒは、存在しないかまたはＲ1−ＣＯ−ＮＨ−残基であり、
［式中、Ｒ1は、アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；前記アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、炭素環式または複素環式残基は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシから選択される、互いに同一または異なる１つもしくは複数の残基を任意選択で有する］である。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、
Ｘは、ＯまたはＣＨであり、
Ａｒは、６−ジエチルアミノメチル−ナフタレン−２−イルまたはナフタレン−２−イルである。
【００３６】
最も好ましい化合物は、
好ましくは一水和物型、より好ましくは一水和物結晶型のジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル−カルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド；
４−（２−（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；および／または
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド
である。
【００３７】
式Ｉの化合物は主に、ヒトに投与し、好ましくは１２５から２５０ｎＭの間の血中濃度を得ることを目的とし；好ましくは、このような化合物は５０から２００ｍｇ／日、より好ましくは１００から２００ｍｇ／日の範囲の用量で投与する。
【００３８】
一実施形態によれば、式Ｉの化合物は、５０ｍｇ１日２回から２００ｍｇ１日１回の範囲の用量で投与する。
【００３９】
別の実施形態によれば、式Ｉの化合物は、少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と組み合わせておよび／または少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と近い時間内に投与する。好ましい抗レトロウイルス剤としては、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、侵入阻害剤（ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、インテグラーゼ阻害剤、共同受容体拮抗剤、ウイルス吸着阻害剤、ウイルス特異的転写阻害剤および／またはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が挙げられ；最も好ましい抗レトロウイルス剤は、エファビレンツ、硫酸インジナビルおよび／またはラルテグラビルカリウムである。
【実施例１】
【００４０】
ＡＣＨ−２細胞株におけるＨＩＶ−１発現の誘導
ＡＣＨ２細胞は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、エイズ部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ）のＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（メリーランド州ベセズダ）から入手した。細胞をフラスコ中で培養し、ＲＰＭＩで洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中に細胞２×１０6個／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞２５０μＬ、培地２００μＬおよび０．０１％ＤＭＳＯを含む種々の濃度（０から２５０ｎＭ）のＨＤＡＣ阻害剤溶液５０μＬを、４８ウェルポリスチレン組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中で一定分量に分割した。３７℃／５％ＣＯ2において２４時間インキュベーション後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の細胞毒性アッセイのために上清５０μＬを取り出し、各培養物にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（最終濃度０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を加えた。直ちに、溶解産物のｐ２４アッセイを実施した。
【００４１】
２４時間後のＬＤＨ活性によって決定した場合の細胞死は、無処置細胞と比較して、ＨＤＡＣ阻害剤に曝露された細胞においてさほどの相違がなかった。
【００４２】
既に記載された方法（非特許文献１２参照）で磁気ビーズ上に固定された特異抗体を用いて、ｐ２４を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤を用いない各実験のｐ２４のレベルを１．０に固定し、各実験および各類似体（ａｎａｌｏｇｏｕｓ）に関する増加値（倍数）を計算した。結果を、下記表に示す。
【００４３】
【表１】
【実施例２】
【００４４】
ヒストン脱アセチル化酵素イソ型の阻害
組換えヒト酵素は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。イソ型のクラスＩ ＨＤＡＣ１、２、３；クラスＩＩｂＩｂのＨＤＡＣ６、１０およびクラスＩＶ ＨＤＡＣ１１を、Ｆｌｕｏｒ−ｄｅ−Ｌｙｓ蛍光発生合成基質（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を用いて試験した。イソ型のクラスＩＩａ ＨＤＡＣ４、７、９を、これらの酵素の特異的基質として記載されている（非特許文献１３参照）、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｔｆａ）−ＭＣＡ（ＴＦＡＬ）誘導体を用いて試験した。組換えヒトＨＤＡＣ８アッセイは、ＨＤＡＣ８ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。各阻害剤をＤＭＳＯに溶解し、次いでアッセイ緩衝液で希釈した。０．５％未満のＤＭＳＯ濃度は、アッセイの活性に影響を及ぼさない。アッセイは、各酵素を阻害剤と共に３７℃において１５分間プレインキュベートすることによって実施した。基質を３７℃において添加することによって反応を開始させ、６０分間進行させた。トリコスタチンＡ ４μＭを含む２倍濃縮顕色剤溶液（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２（Ｅｎｚｏ）を５０μＬ添加することによって、蛍光シグナルを発生させた。発生した螢光を、３５５ｎｍ（励起）および４６０ｎｍ（発光）の波長で検出した。
【００４５】
結果を、ＩＣ50（酵素活性を５０％低下させるのに必要な濃度）として表し、下記表に示す（ＳＡＨＡ値も測定した。これを表中に示す）。
【００４６】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しているヒトの治療への、Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドを基剤とするヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用に関する。特に、ＨＩＶ感染症の排除を目的として、持続性の潜在ＨＩＶによるＴ ＣＤ４+細胞の感染を有する患者への治療に、高活性抗レトロウイルス剤療法（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＨＡＡＲＴ）と併用する。
【背景技術】
【０００２】
１０年余り前に高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）が導入されて以来、ＨＩＶ−１感染症を効率的に制御し、ＨＩＶ−１ウイルス血症（ＨＩＶ−１ ｖｉｒｅｍｉａ）を検出可能な値未満に維持することはできる。しかし、長期のＨＡＡＲＴ療法によるＨＩＶ−１感染症の排除はまだ可能ではない。ＨＡＡＲＴを中断すると、典型的には２週間後にウイルス血症のリバウンドが起こる（非特許文献１参照）。
【０００３】
ウイルスリバウンドの原因は、長期の細胞プールであり、十中八九、メモリーＴ細胞リザーバーといえる。メモリーＴ細胞リザーバーは、比較的感染が遅く、ＨＩＶ−１が組み込まれたプロウイルスＤＮＡの宿主である。潜在性細胞プールを数値化するための統合技術が使用可能であり、１人のＨＩＶ−１陽性患者のメモリー細胞１００万個のうち１つが複製可能な組込みプロウイルスを１つ保有すると計算されている。
【０００４】
静止細胞中でプロウイルスＤＮＡを転写不活性に保持するメカニズムは知られている。しかし、このメカニズムは、クロマチンに関連する調節を伴うと長い間考えられてきた（非特許文献２参照）。潜在性細胞中では、組込みプロウイルスＤＮＡは、ヌクレオソームに高密度で組織化されている。プロモーター配列およびエンハンサー配列を含むＨＩＶ−１の５’末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）は、多数の転写因子の結合の標的であり、２つのヌクレオソーム（ｎｕｃ−０およびｎｕｃ−１）に組織化されている。ＮＦκＢ ｐ５０ホモ二量体は、ＡＰ−４、ＹＹ１およびＬＳＦ１と同様、ＬＴＲにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を補充し、それが次に局所ヒストンを脱アセチル化し、クロマチンを圧縮し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を防止する。
【０００５】
新たな一群の合成化合物であるＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＨＤＡＣの酵素活性およびＨＩＶ−１遺伝子発現の相対的な抑制を無効にし得る。さらにまた、ＩＬ−２、ＯＫＴ３またはＴＮＦαのようなＮＦκＢ細胞活性化因子とは逆に、ＨＤＡＣｉは、Ｔ細胞を全体的に活性化することなく、遺伝子発現を促進し得る。
【０００６】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのＮ末端部分または他のタンパク質中の、リジン残基に結合しているアセチル基を除去することができる酵素である。
【０００７】
ＨＤＡＣは、構造相同性によって４つのクラスに分けることができる。クラスＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ １、２、３および８）は、ＲＰＤ３酵母タンパク質に類似し、細胞核に見られる。クラスＩＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ ４、５、６、７、９および１０）は、ＨＤＡ１酵母タンパク質と類似し、核と細胞質のいずれにも見られる。クラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ＳＩＲ２酵母タンパク質と相関するＮＡＤ依存性酵素の構造的に別個の形態である。クラスＩＶ（ＨＤＡＣ １１）は一般に、特定の構造特性を有する単一酵素からなる。クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＶのＨＤＡＣは、亜鉛を含む酵素であり、種々の分子クラス：ヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、短鎖脂肪酸、アミノベンズアミド、求電子性ケトン誘導体などによって阻害され得る。クラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ヒドロキサム酸によって阻害されず、それらの阻害剤は、他のクラスの阻害剤とは異なる構造特性を有する。
【０００８】
本発明のために、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」という表現は、クラスＩ、ＩＩまたはＩＶのヒストン脱アセチル化酵素として分類される少なくとも１種の酵素の活性を阻害できる、天然由来、組換え型または合成の任意の分子を示すことを意図している。
【０００９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、抗腫瘍活性および抗炎症活性を有する一群の分子である。
【００１０】
腫瘍細胞において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、細胞増殖を阻害し、細胞の死および分化を誘導する（非特許文献３参照）。
【００１１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はまた、免疫担当細胞によるサイトカインおよび他の炎症誘発性因子の産生を調整でき、インビボで抗炎症性を有することが証明されている（非特許文献４および非特許文献５参照）。
【００１２】
腫瘍疾患および炎症性疾患の両者に種々の阻害剤を用いる多数の臨床試験が現在進捗中であり、それらの進捗段階は様々である（非特許文献６参照）。
【００１３】
参照によりともに本明細書に組み込まれる特許文献１（無水型）および特許文献２（一水和物結晶型）に記載されている、ジエチル−［６−（−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドは、良好な抗炎症活性を有するＨＤＡＣ阻害剤であり、このような活性成分の一水和物結晶型は、ＩＴＦ２３５７および／またはＧｉｖｉｎｏｓｔａｔとしても知られている。
【００１４】
ＨＤＡＣ酵素を阻害できる他の４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ヒドロキシベンズアミド誘導体は、参照によりともに本明細書に組み込まれている特許文献３および特許文献４に開示されている。
【００１５】
種々のＨＤＡＣ阻害剤が、潜伏感染した細胞株からのＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導し得ることがわかったが、他方において、誘導の実施に必要な濃度における阻害剤の毒性作用の可能性に対する懸念がもち上がり（非特許文献７参照）、これに関して、選択的なクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞毒性が比較的低い強力なＨＩＶ誘導物質となり得ることが最近提案された（非特許文献８参照）。
【００１６】
痙攣性および精神性障害に対して処方される、カルボン酸ＨＤＡＣｉのバルプロ酸（ＶＰＡ）は、一部の臨床試験でＨＡＡＲＴと併用されたが、潜在性リザーバーをかなり縮小するには至らなかった（非特許文献９参照）。したがって、ＶＰＡを用いたこれらの試験では、ＨＤＡＣｉのウイルスを排除する潜在能力が明らかにならなかった。
【００１７】
ＨＩＶ感染症の治療へのＳＡＨＡの使用が開示されている（特許文献５参照）。ＳＡＨＡは、Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド構造を有していないＨＤＡＣｉであり、ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔまたはＺｏｌｉｎｚａとして市販されている。ＳＡＨＡは、ＡＣＨ−２細胞株においてＥＣ50 ０．６３２μＭでＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導することが示されている（特許文献５の実施例２および図１を参照）。
【００１８】
Ｚｏｌｉｎｚａの添付文書は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫に冒されている患者の治療に有効と考えられるＳＡＨＡの血中濃度が、４００ｍｇ／日の用量で得られることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第９７／４３２５１号
【特許文献２】国際公開第２００４／０６５３５５号
【特許文献３】国際公開第２００４／０６３１４６号
【特許文献４】国際公開第２００６／００３０６８号
【特許文献５】国際公開第２００８／０９７６５４号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Imamichi H. et al. J Infect. Dis. 183, 36 (2001)
【非特許文献２】Quivy V. et al. Subcell Biochem. 41, 371 (2007)
【非特許文献３】Gaofeng Bi and Guosheng Jiang, Cellular & Molecular Immunology 3, 285-290 (2006)
【非特許文献４】Frederic Blanchard and Celine Chipoy, Drug Discovery Today 10, 197 -204 (2005)
【非特許文献５】IM Adcock, British Journal of Pharmacology 150, 829-831 (2007)
【非特許文献６】Marielle Paris et al., Journal of Medicinal Chemistry 51, 1505-1529 (2008)
【非特許文献７】Shehu-Xhilaga, M. et al. AIDS 23, 2047 (2009)
【非特許文献８】Archin, NM et al. AIDS 23, 1799 (2009)
【非特許文献９】Lehrman G et al. Lancet 366 (9485), 549 (2005)
【非特許文献１０】Monzani, VM et al., EUROTOX 2007, 44th Congress of toxicology, poster G33
【非特許文献１１】Vojinovic, J. et al., The 72nd annual meeting of the American College of Rheumatology, San Francisco, California, 29 October 2008
【非特許文献１２】Nold M.F. et al. J. Immunol. 181, 557 (2008)
【非特許文献１３】Jones P. et al. Bioorg Med Chem Lett. 18, 3456 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかし、この用量のＳＡＨＡは、下痢、疲労感、吐き気、血小板減少、食欲不振および味覚異常などの多数の重篤な副作用を引き起こす可能性がある。さらにまた、Ｚｏｌｉｎｚａの添付文書の情報によれば、ＳＡＨＡは、細菌復帰突然変異アッセイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（Ａｍｅｓ試験）においてインビトロで変異原性であり、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞中にインビトロで染色体異常を引き起こし、マウスへの投与時（マウス小核アッセイ）に小核赤血球の出現率を増加させる。
【００２２】
したがって、ＨＩＶ−１遺伝子発現の誘導に有効であることが既に知られているＨＤＡＣ阻害剤より活性であり且つ低毒性である、好ましくは、それより活性でありしかも低毒性である新規ＨＩＶ−１発現誘導剤、おそらくはＨＤＡＣ阻害剤に対する必要が生じることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドが、好ましくは一水和物型、より好ましくは一水和物結晶型（ＩＴＦ２３５７、Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ）で、ＡＣＨ−２細胞株において好ましくは１２５〜２５０ｎＭの間の濃度でＨＩＶ−１遺伝子発現を誘導できることをこのたび発見した。これは本発明の一態様を構成する。
【００２４】
ＩＴＦ２３５７は、非変異原性であることが明らかにされており（非特許文献１０参照）；臨床治療においては、ＩＴＦ２３５７を５０〜２００ｍｇ投与することによって、１２５〜２５０ｎＭの間の治療血中濃度を容易に得ることができる。この範囲内の用量が多数の臨床試験で使用され、検出された毒性作用は極めて低かった。全身型若年性特発性関節炎（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｏｎｓｅｔ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（ＳＯＪＩＡ）の小児には１．５ｍｇ／ｋｇ／日の等価用量が投与され、期待の持てる結果が得られ、毒性作用が検出されなかった（非特許文献１１参照）。
【００２５】
したがって、４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド誘導体である一部のＨＤＡＣ阻害剤（ＩＴＦ２３５７を含む）が、かなりの毒性を全く示さない濃度においてＨＩＶ遺伝子発現の誘導に極めて有効となり得ることを発見した。これは本発明の第２の態様である。この発見は、ＨＩＶ遺伝子誘導および毒性の２つの作用が同じ構造的理由および／またはメカニズム上の理由によって決まる可能性があることを示唆する以前の見解（非特許文献７参照）とは対照的であると思われる。
【００２６】
さらに、ＨＤＡＣ酵素を阻害できるこのような４−アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド誘導体のいくつかが、ＡＣＨ−２細胞株において１２５から２５０ｎＭの間の濃度で、ＩＴＦ２３５７よりもＨＩＶ−１遺伝子発現の誘導にさらに強力であることを発見した。これが本発明の第３の態様である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
単なる例として、４−（２（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（化合物ｇ）およびベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド（化合物ｔ）（いずれも、前記特許文献４の実施例２を参照）は、ＡＣＨ−２細胞において２５０ｎＭで、ＨＩＶ発現を３０倍増加させる。これに対して、同一濃度のＩＴＦ２３５７で得られるのは、１５倍の増加である。
【００２８】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド；
４−（２−（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（化合物ｇ）；および
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド（化合物ｔ）
の化学構造を以下に示す。
【００２９】
【化１】
【００３０】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド
【００３１】
【化２】
【００３２】
したがって、本発明の目的は、ＨＩＶ感染症、好ましくはＨＩＶ−１感染症の治療用の一般式Ｉの化合物によって代表され、
【００３３】
【化３】
【００３４】
式中、
Ｘは、Ｏ、ＣＨであるかまたは存在せず；
Ａｒは、アリール、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；前記炭素環式または複素環式アリール残基が、１つまたは複数の同一または異なるハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシで任意選択で置換されており；
Ｒは、存在しないかまたはＲ1−ＣＯ−ＮＨ−残基であり、
［式中、Ｒ1は、アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；前記アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、炭素環式または複素環式残基は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシから選択される、互いに同一または異なる１つもしくは複数の残基を任意選択で有する］である。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、
Ｘは、ＯまたはＣＨであり、
Ａｒは、６−ジエチルアミノメチル−ナフタレン−２−イルまたはナフタレン−２−イルである。
【００３６】
最も好ましい化合物は、
好ましくは一水和物型、より好ましくは一水和物結晶型のジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル−カルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライド；
４−（２−（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；および／または
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミド
である。
【００３７】
式Ｉの化合物は主に、ヒトに投与し、好ましくは１２５から２５０ｎＭの間の血中濃度を得ることを目的とし；好ましくは、このような化合物は５０から２００ｍｇ／日、より好ましくは１００から２００ｍｇ／日の範囲の用量で投与する。
【００３８】
一実施形態によれば、式Ｉの化合物は、５０ｍｇ１日２回から２００ｍｇ１日１回の範囲の用量で投与する。
【００３９】
別の実施形態によれば、式Ｉの化合物は、少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と組み合わせておよび／または少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と近い時間内に投与する。好ましい抗レトロウイルス剤としては、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、侵入阻害剤（ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、インテグラーゼ阻害剤、共同受容体拮抗剤、ウイルス吸着阻害剤、ウイルス特異的転写阻害剤および／またはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が挙げられ；最も好ましい抗レトロウイルス剤は、エファビレンツ、硫酸インジナビルおよび／またはラルテグラビルカリウムである。
【実施例１】
【００４０】
ＡＣＨ−２細胞株におけるＨＩＶ−１発現の誘導
ＡＣＨ２細胞は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、エイズ部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ）のＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（メリーランド州ベセズダ）から入手した。細胞をフラスコ中で培養し、ＲＰＭＩで洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中に細胞２×１０6個／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞２５０μＬ、培地２００μＬおよび０．０１％ＤＭＳＯを含む種々の濃度（０から２５０ｎＭ）のＨＤＡＣ阻害剤溶液５０μＬを、４８ウェルポリスチレン組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中で一定分量に分割した。３７℃／５％ＣＯ2において２４時間インキュベーション後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の細胞毒性アッセイのために上清５０μＬを取り出し、各培養物にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（最終濃度０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を加えた。直ちに、溶解産物のｐ２４アッセイを実施した。
【００４１】
２４時間後のＬＤＨ活性によって決定した場合の細胞死は、無処置細胞と比較して、ＨＤＡＣ阻害剤に曝露された細胞においてさほどの相違がなかった。
【００４２】
既に記載された方法（非特許文献１２参照）で磁気ビーズ上に固定された特異抗体を用いて、ｐ２４を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤を用いない各実験のｐ２４のレベルを１．０に固定し、各実験および各類似体（ａｎａｌｏｇｏｕｓ）に関する増加値（倍数）を計算した。結果を、下記表に示す。
【００４３】
【表１】
【実施例２】
【００４４】
ヒストン脱アセチル化酵素イソ型の阻害
組換えヒト酵素は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。イソ型のクラスＩ ＨＤＡＣ１、２、３；クラスＩＩｂＩｂのＨＤＡＣ６、１０およびクラスＩＶ ＨＤＡＣ１１を、Ｆｌｕｏｒ−ｄｅ−Ｌｙｓ蛍光発生合成基質（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を用いて試験した。イソ型のクラスＩＩａ ＨＤＡＣ４、７、９を、これらの酵素の特異的基質として記載されている（非特許文献１３参照）、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｔｆａ）−ＭＣＡ（ＴＦＡＬ）誘導体を用いて試験した。組換えヒトＨＤＡＣ８アッセイは、ＨＤＡＣ８ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。各阻害剤をＤＭＳＯに溶解し、次いでアッセイ緩衝液で希釈した。０．５％未満のＤＭＳＯ濃度は、アッセイの活性に影響を及ぼさない。アッセイは、各酵素を阻害剤と共に３７℃において１５分間プレインキュベートすることによって実施した。基質を３７℃において添加することによって反応を開始させ、６０分間進行させた。トリコスタチンＡ ４μＭを含む２倍濃縮顕色剤溶液（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２（Ｅｎｚｏ）を５０μＬ添加することによって、蛍光シグナルを発生させた。発生した螢光を、３５５ｎｍ（励起）および４６０ｎｍ（発光）の波長で検出した。
【００４５】
結果を、ＩＣ50（酵素活性を５０％低下させるのに必要な濃度）として表し、下記表に示す（ＳＡＨＡ値も測定した。これを表中に示す）。
【００４６】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染症治療用の一般式Ｉ
【化１】
の化合物であって、
式中、
Ｘは、Ｏ、ＣＨであるかまたは存在せず；
Ａｒは、アリール、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；
前記炭素環式または複素環式アリール残基は、１つまたは複数の同一または異なるハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシで任意に置換されており；
Ｒは、存在しないか、またはＲ1−ＣＯ−ＮＨ−残基であり、
［式中、
Ｒ1は、アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系、三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系、三環系複素環式残基であり；
前記アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、炭素環式または複素環式アリール残基は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシから選択される、互いに同一または異なる１つもしくは複数の残基を任意に有する］
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｘは、ＯまたはＣＨであり、
Ａｒは、６−ジエチルアミノメチル−ナフタレン−２−イルまたはナフタレン−２−イルである、
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル−カルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
一水和物型、好ましくは一水和物結晶型であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
４−（２（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＨＩＶ感染症は、ＨＩＶ−１感染症であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ヒトに投与されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
５０から２００ｍｇ／日、好ましくは１００から２００ｍｇ／日の範囲の用量で投与されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
５０ｍｇ１日２回から２００ｍｇ１日１回の範囲の用量で投与されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ヒトにおけるその血中濃度は１２５から２５０ｎＭの間であることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と組み合わせておよび／または少なくとも１種の抗レトロウイルス剤の時間的近傍で投与されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の抗レトロウイルス剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、侵入阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、共同受容体拮抗剤、ウイルス吸着阻害剤、ウイルス特異的転写阻害剤および／またはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記抗レトロウイルス剤は、エファビレンツ、硫酸インジナビルおよび／またはラルテグラビルカリウムから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の化合物。
【請求項１】
ＨＩＶ感染症治療用の一般式Ｉ
【化１】
の化合物であって、
式中、
Ｘは、Ｏ、ＣＨであるかまたは存在せず；
Ａｒは、アリール、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系もしくは三環系複素環式残基であり；
前記炭素環式または複素環式アリール残基は、１つまたは複数の同一または異なるハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシで任意に置換されており；
Ｒは、存在しないか、またはＲ1−ＣＯ−ＮＨ−残基であり、
［式中、
Ｒ1は、アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、または飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系、三環系炭素環式残基、またはＮ、ＳおよびＯから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を含む飽和、不飽和もしくは部分的に不飽和の単環系、二環系、三環系複素環式残基であり；
前記アリール、アリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、炭素環式または複素環式アリール残基は、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）モノアルキルアミノもしくは（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルで一置換もしくは二置換されている（Ｃ1〜Ｃ4）アミノアルキル、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシルカルボニル、メルカプトアルコキシ、メルカプトフェノキシ、ニトロ、シアノ、オキソ、ペルフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルアルコキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルアルキル、ベンゾイル、フェニルスルホニルおよびヒドロキシから選択される、互いに同一または異なる１つもしくは複数の残基を任意に有する］
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｘは、ＯまたはＣＨであり、
Ａｒは、６−ジエチルアミノメチル−ナフタレン−２−イルまたはナフタレン−２−イルである、
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ジエチル−［６−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル−カルバモイルオキシメチル）−ナフタレン−２−イル−メチル］−アンモニウムクロライドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
一水和物型、好ましくは一水和物結晶型であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
４−（２（Ｓ）−ベンゾイルアミノ−３−ナフタレン−２−イル−プロピオニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸［１（Ｓ）−（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニルカルバモイル）−２−ナフタレン−２−イル−エチル］−アミドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＨＩＶ感染症は、ＨＩＶ−１感染症であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ヒトに投与されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
５０から２００ｍｇ／日、好ましくは１００から２００ｍｇ／日の範囲の用量で投与されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
５０ｍｇ１日２回から２００ｍｇ１日１回の範囲の用量で投与されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ヒトにおけるその血中濃度は１２５から２５０ｎＭの間であることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも１種の抗レトロウイルス剤と組み合わせておよび／または少なくとも１種の抗レトロウイルス剤の時間的近傍で投与されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の抗レトロウイルス剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、侵入阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、共同受容体拮抗剤、ウイルス吸着阻害剤、ウイルス特異的転写阻害剤および／またはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記抗レトロウイルス剤は、エファビレンツ、硫酸インジナビルおよび／またはラルテグラビルカリウムから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の化合物。
【公表番号】特表２０１３−５０８３４９（Ｐ２０１３−５０８３４９Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４７９８（Ｐ２０１２−５３４７９８）
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４１３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８５１４
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５９１２７９２９４）イタルファルマコ ソシエタ ペル アチオニ (8)
【氏名又は名称原語表記】ＩＴＡＬＦＡＲＭＡＣＯ ＳＯＣＩＥＴＡ ＰＥＲ ＡＺＩＯＮＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４１３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８５１４
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５９１２７９２９４）イタルファルマコ ソシエタ ペル アチオニ (8)
【氏名又は名称原語表記】ＩＴＡＬＦＡＲＭＡＣＯ ＳＯＣＩＥＴＡ ＰＥＲ ＡＺＩＯＮＩ
【Ｆターム（参考）】
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