ｂｃｌ−２遺伝子発現の調節
【課題】本発明は、新規なアンチコードオリゴマーおよびこれを用いてｂｃｌ−２遺伝子を発現する癌細胞の成長を制御する方法を提供する。
【解決手段】（ｉ）配列ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７、当該配列中の少なくとも１個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー；（ｉｉ）１又は２以上の癌化学療法剤；および（ｉｉｉ）医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、ｂｃｌ−２タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
【解決手段】（ｉ）配列ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７、当該配列中の少なくとも１個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー；（ｉｉ）１又は２以上の癌化学療法剤；および（ｉｉｉ）医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、ｂｃｌ−２タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願に記載された研究の一部は、合衆国国立衛生研究所の認可番号ＣＡ２６３８０による援助を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、癌の治療の分野に関するものであり、より詳細には癌のアンチコードオリゴマー治療に関する。
【０００３】
本出願は、現在放棄されている１９８８年１２月２２日に出願された出願番号第０７／２８８，６９２号の一部継続出願である１９９２年２月２１日に出願された出願番号第０７／８４０，７１６号の一部継続出願である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌治療に対する現行のアプローチは、特異性の欠如という問題を抱えている。これまで開発されてきた医薬の多くは、酵素経路をブロックするかあるいはＤＮＡとランダムに相互作用する天然物質や誘導体である。多くの癌治療医薬は治療指数が低いため、毒性によって用量を制限しなければならないという深刻な問題を有している。癌を殺す医薬の投与によって癌細胞ばかりか癌性でない正常細胞も殺されてしまう。このような有害性があるために、癌性の細胞により特異的な治療が必要とされている。
【０００５】
遺伝子の一分類である腫瘍遺伝子が癌状態の転換と維持において大きな役割を果たしているということ、およびこれらの遺伝子を避ける(turning off) かあるいはさもなければその作用を阻害することによって細胞を正常な表現型に戻すことができるということがすでに判明している。多くのヒト癌の疫学における腫瘍遺伝子の役割については、ビショップ(Bishop)の“細胞性腫瘍遺伝子とレトロウイルス”［サイエンス、２３５：３０５−３１１（１９８７）］において概説されている。リンパ腫および白血病を含む多くのタイプのヒト腫瘍においては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子が過剰発現されており、腫瘍化性と関連している可能性がある（ツジモトら、“ヒト濾胞性リンパ腫におけるｂｃｌ−２遺伝子の関与”［サイエンス、２２８：１４４０−１４４３（１９８５）］。
【０００６】
アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドは、腫瘍遺伝子の機能を取り去る潜在能力を有する特異的治療ツールの一例である。これらの短い（通常約３０塩基）一本鎖の合成ＤＮＡは標的ｍＲＮＡに対する相補的塩基配列を有し、水素結合した塩基対形成によってハイブリッド二重構造(hybrid duplex)を形成する。このハイブリダイゼーションによって、標的ｍＲＮＡのコードがそのタンパク産物中に発現することが防止され、その結果タンパク産物のその後の作用が阻害されると予想される。前記遺伝子によって発現されたｍＲＮＡ配列がセンス配列と称されることから、その相補的配列はアンチセンス配列と称する。ある場合には、ｍＲＮＡの阻害は酵素の活性部位の阻害よりもより効率的である。これは１つのｍＲＮＡ分子が多数のタンパクコピーを生じるためである。
【０００７】
インビトロでｃ−ｍｙｃタンパクの生産を特異的に阻害しヒト白血病細胞の成長を阻止するために、ｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の（アンチセンス）ｍＲＮＡに相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドが用いられてきた［ホルト(Holt)ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：９６３−９７３（１９８８年）およびウィックストローム(Wickstrom) ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：１０２８−１−３２（１９８８年）］。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）を含むレトロウイルスの特異的インヒビターとしてもまたオリゴデオキシヌクレオチドが用いられてきた［ザメクニック(Zamecnik)とステフェンソン(Stephenson)、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：２８０−２８４（１９７８）、ザメクニックら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４１４３−４１４６（１９８６年）］。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アンチコードオリゴマーおよび癌細胞の生育を阻害するための方法を提供する。リンパ球の型の一つであるリンパ腫細胞や白血病細胞の生育はアンチコードオリゴマーによってまた本発明方法によって阻害される。ヒトｂｃｌ−２遺伝子におけるｍＲＮＡセンス鎖の少なくとも有効部分に対して相補的なアンチコードオリゴマーが提供され、次いで細胞を、当該細胞の生育を阻害するのに十分な濃度でアンチコードオリゴマーと接触させる。本発明方法は、ヒトｂｃｌ−２遺伝子を発現し、かつｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有するリンパ腫／白血病細胞の生育、並びにヒトｂｃｌ−２遺伝子を発現し、かつｔ（１４；１８）染色体転座を有しないリンパ腫／白血病細胞の生育を阻害するために好適である。
【０００９】
好ましい態様によれば、アンチコードオリゴマーはプレ−ｍＲＮＡセンス鎖中の戦略部位（ストラテジックサイト）と実質的に相補的であるかあるいはｍＲＮＡに実質的に相補的である。好ましい戦略部位はプレ−ｍＲＮＡコード化鎖(coding strand) の翻訳開始部位である。あるいは別の戦略部位としては、スプライシング、輸送、または分解のための部位が挙げられる。本発明のアンチコードオリゴマーは、“生の（native）”未変性形態即ちオリゴヌクレオチドであれ誘導体形態であれ、標的であるリンパ腫あるいは白血病細胞と接触するようにされる。インビボでの治療用途では、“生の”オリゴヌクレオチドの誘導体（フォスフォロチオエート形態等）が好ましい。その理由は、ある種のアナログ（フォスフォロチオエート・アナログ等）に対する応答時間がオリゴヌクレオチドの“生の”形態のものに比較して幾分遅いことが判明しているとはいえ、この形態がより分解抵抗性であると信じられているからである。
【００１０】
好ましいアンチコードオリゴマーは本明細書でＴＩ−ＡＳ（翻訳開始アンチコードオリゴマー，translation initiation anticode oligomer）と称するものであり、ヒトｂｃｌ−２遺伝子のｍＲＮＡコード化鎖の翻訳開始部位に跨がるとともにこの領域に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドである。より好ましくはこのヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のコード化鎖のＡＴＧ開始配列に相補的なＴＡＣ部を含有する。また好ましくは、この他にさらに前記開始配列と隣り合う(flanking)ｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の：より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。このＴＩ−ＡＳヌクレオチドは血清の存在下においても無血清の場合においても共に標的細胞の生育を効果的に阻害することが見いだされている。
【００１１】
また、アンチコードオリゴマーは、ヒトｂｃｌ−２遺伝子のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖のスプライス供与体部位中の少なくとも一有効部位に相補的なアンチセンスヌクレオチドを含有する。より好ましくはこのヌクレオチドは、ｂｃｌ−２のＧＴスプライス供与体に相補的なＣＡ部を含有し、またさらに前記スプライス供与体と隣り合うｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の、より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。
【００１２】
さらに他の態様においては、アンチコードオリゴマーはヒトｂｃｌ−２遺伝子のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖のスプライス受容体領域中の少なくとも一有効部位に相補的である。このオリゴマーは、ｂｃｌ−２遺伝子のＡＧスプライス受容体に相補的な少なくとも１つのＴＣ部を含有し、またさらに前記受容体と隣り合うｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の、より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。
【００１３】
本発明のオリゴマーは、ｂｃｌ−２遺伝子のタンパク産物である２６ｋＤａのタンパク（ｂｃｌ−２−α）あるいは２２ｋＤａのタンパク（ｂｃｌ−２−β）のコード化部位(coding site) とオーバーラップするように選択することもできる。オリゴマーの選択は、他の遺伝子配列のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖もしくはｍＲＮＡコード化鎖のアンチコードオリゴマーとの相同性を最小にするように行うのが好ましい。
【００１４】
従って、本発明の主要な目的は、癌細胞の成長を阻害するのに有用な新規アンチコードオリゴマーを提供することである。本発明はまた、腫瘍細胞の成長を阻害するための組成物をも包含し、この組成物は、本発明のアンチコードオリゴマーと医薬として許容される担体とを含有する。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記のアンチコードオリゴマーを用いて癌細胞の成長を阻害する方法を提供することである。次の発見が本発明の一特徴を構成する。即ち、ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルが平均３０〜４０％低減すると、リンパ腫細胞特にｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞株の、癌化学療法剤（従来の抗ガン薬を含む）に対する感受性が顕著に向上するという発見である。この低減は、腫瘍細胞内にｂｃｌ−２遺伝子から発現されたプレ−ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡのいずれかに結合するアンチコードオリゴマーを導入することによって達成された。本発明においては、２つの方法によって腫瘍細胞に前記アンチコードオリゴマーを導入している。その１つの方法においては、腫瘍細胞をアンチコードオリゴマーを含有する組成物と接触させる。他の方法においては、腫瘍細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするベクターを形質移入することである。アンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することによってｂｃｌ−２発現を低減させることができるとともに、癌化学療法剤あるいは抗ガン薬に対する新生細胞の化学的感受性を増大させることができる。
【００１６】
従って、本発明は、腫瘍細胞が癌化学療法剤と接触する前に、ｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるか若しくはＢｃｌ−２タンパクの機能を損なうアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することによって、腫瘍細胞を殺す方法を達成した。このようにすると癌化学療法剤は生存可能な悪性細胞の数を減少させ、殺された腫瘍細胞の量は、当該細胞にアンチコードオリゴマーオリゴデオキシヌクレオチドを導入しなかった場合に同量の薬剤によって殺されたであろう腫瘍細胞の量よりも多かった。
本発明の上記目的およびその他の目的は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明によれば、癌細胞の成長を阻害するため、あるいは癌細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増加させるため、あるいはまた一以上の癌化学療法剤と組み合わせるか若しくは組み合わせることなく単独で癌細胞を死滅させるためのアンチコードオリゴマーが提供される。
【００１８】
定義
本明細書においては、“アンチコードオリゴマー”とはアンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログを意味し、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合の相互作用を介してポリヌクレオチド標的配列を認識する化学種群を含む。この標的配列は一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡであることができる。
【００１９】
前記アンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、またはＲＮＡ若しくはＤＮＡのアナログであることができ、これらをアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと称する。このようなＲＮＡあるいはＤＮＡアナログの例としては、２’−Ｏ−アルキル糖修飾物、メチルフォスフォネート、フォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエート、フォルムアセタール、３'−チオフォル
ムアセタール、スルフォン、スルファメート、およびニトロキサイド基本骨格修飾物、および塩基部が修飾されているアナログが挙げられるがこれらに限定されない。加えて、オリゴマーのアナログは次のようなポリマーであることもできる。即ち、糖部分が修飾されている、あるいはその他の適切な部分によって置換されてその結果モルフォリノアナログやペプチド核酸（ＰＮＡ）（但しこれらに限定されない）を含むようにされたポリマーである［エグホルム(Egholm)ら、“ペプチド核酸（ＰＮＡ）−アキラルのペプチド基本骨格を有するオリゴヌクレオチドアナログ”（１９９２年）］。アンチコードアナログは、オリゴヌクレオチドアナログの各種タイプの混合物、あるいは生ＤＮＡまたはＲＮＡとの組合せであることができる。同時にオリゴヌクレオチドとそのアナログは単独で、あるいは一以上の追加のオリゴヌクレオチドまたはそのアナログとの組合せで用いることもできる。オリゴヌクレオチドは約１０〜１０００のヌクレオチド長であることができる。本発明においては１０〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いることができるが、好ましいオリゴヌクレオチドは約１５から約２４の塩基長のものである。
【００２０】
アンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログはまたオリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよびそのアナログを包含する［ジョン・グッドチャイルド(John Goodchild)、「オリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよび修飾オリゴヌクレオチド：その合成と性質のレビュー」“バイオコンジュゲート・ケミストリー”第１巻、第３号５月／６月（１９９０年）］。そのようなコンジュゲートは、取り込み、薬理動態、およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を有し、あるいはオリゴヌクレオチドによる標的配列の架橋や開裂を高める能力を有する。
【００２１】
本明細書においては、“細胞増殖”とは細胞の分裂速度／細胞サイクルをいう。また“成長”とは、より早い細胞分裂によって増加した細胞数およびより遅い細胞死によって増加した細胞数の双方を包含する。
本明細書においては、ｂｃｌ−２遺伝子発現とはヒトｂｃｌ−２遺伝子からのｂｃｌ−２タンパク生産をいう：例えばｂｃｌ−２遺伝子発現の低下はｂｃｌ−２タンパクレベルの低下を意味する。本明細書においては、“戦略的部位（ストラテジックサイト）”とは、請求項に記載のアンチコード分子やそのアナログと結合した時にｂｃｌ−２遺伝子の発現を阻害する部位として定義される。本明細書においては、“配列部分”とは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を指す。文脈によっては、“配列部分”がＤＮＡオリゴヌクレオチドやＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の一部を指すこともある。
【００２２】
コントロールされない細胞増殖は癌性のあるいは異常な細胞型に対するマーカーである。正常で非癌性の細胞は、細胞型によって特徴付けられる頻度で規則的に分裂する。ある細胞が癌性の状態に転換すると、その細胞は制御不能に分裂・増殖する。増殖の阻害によって細胞の制御不能な分裂が調節される。細胞分裂の拘束は、しばしば非癌性状態への復帰に関連している。
【００２３】
ｂｃｌ−２（Ｂ細胞リンパ腫／白血病−２）と命名されたヒト遺伝子は幾つかの共通リンパ腫腫瘍の疫学に関連付けられている。クロース(Croce) らによる「ヒトＢおよびＴ細胞新生物の分子的基礎」（“ウイルス腫瘍学の進歩”、７：３５−５１、Ｇ．クライン(Klein) 編、ニューヨーク：レイヴン・プレス、１９８７年を参照。ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現は、最も濾胞性であるＢ細胞リンパ腫および多くの大細胞非ホジキンリンパ腫を含む、ｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有するすべてのリンパ腫において見いだされてきた。ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現はまた、ｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有しないある種の白血病においても見いだされてきた。このような白血病には、慢性リンパ性白血病急性の殆どの症例、多くのプレ−Ｂ細胞型のリンパ性白血病、神経芽細胞腫、鼻咽頭カルチノーマ、および多くの前立腺、胸部、および大腸のアデノカルチノーマが含まれる［リード(Reed)ら、“神経芽細胞腫および神経起源のヒト腫瘍細胞株におけるｂｃｌ−２ガン原遺伝子の差別的な発現”、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１年）；ユニス(Yunis) ら、“大細胞リンパ腫の予後におけるｂｃｌ−２およびその他のゲノム変更”、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．、３２０：１０４７；カンポス(Campos)ら、“急性骨髄性白血病におけるｂｃｌ−２タンパクの高発現は化学療法に対する低応答に関連する”、Ｂｌｏｏｄ、８１：３０９１〜３０９６（１９９３年）；マクダネル(McDonnell) ら、ガン原遺伝子ｂｃｌ−２の発現およびアンドロゲン独立性前立腺ガンの出現への関与” 、Ｃｎａｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６９４０〜６９４４（１９９２年）；ルー(Lu) Ｑ−Ｌら、“エプステイン−バールウイルス関連性鼻咽頭カルチノーマにおけるｂｃｌ−２ガン原遺伝子の発現”、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５３：２９−３５（１９９３年）；ボンナー(Bonner)ら、“提唱された形態学的および分子論的配列に関連させたｂｃｌ−２ガン原遺伝子と消化管粘膜上皮腫瘍悪化モデル”、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４３Ａ（１９９３年）］。
【００２４】
次の説明に限定されるものではないが、本発明は正常な細胞死に関連する細胞メカニズムを利用するものである。細胞の多くのタイプは有限の寿命を有し死ぬことがプログラムされているため、細胞分裂速度の増加によるというよりむしろ正常細胞の死亡のメカニズムにおける欠陥によって細胞が制御不能に蓄積することもある。ｂｃｌ−２遺伝子は、細胞分裂を加速するのではなく主として細胞の生存を延長することによってガンの病因に寄与している。
【００２５】
本発明で好適に用いることができるアンチセンスオリゴマーは２〜２００ヌクレオチド塩基長のヌクレオチドオリゴマーであって、より好ましくは１０〜４０の塩基長、さらに好ましくは２０塩基長のものである。オリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位、供与およびスプライシング部位、あるいは輸送や分解のための部位等、ｂｃｌ−２のプレ−ｍＲＮＡに沿った戦略部位に相補的なオリゴヌクレオチドから選択するのが好ましい。
【００２６】
そのような戦略部位で翻訳をブロックすることが機能的なｂｃｌ−２遺伝子産物の形成を防ぐ。しかしながら、アンチコードオリゴマーのいかなる組合せも、またそのような組合せの一部分も（例えば細胞増殖を阻害するｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡに相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド）、本発明においては好適に用いうるものであることが理解されるべきである。例えば、ｂｃｌ−２ ＲＮＡに隣接したあるいは隣接しないストレッチの配列部分に相補的なオリゴヌクレオチドは細胞増殖を阻害し、よって本発明で好適に用いることができるであろう。
本発明において用いるアンチコードオリゴマーはまた、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに沿う戦略的部位またはその他の部位の配列部分と相補的であるか実質的に相補的なオリゴヌクレオチドに隣接するオリゴヌクレオチドを包含してもよい点を理解するべきである。隣接する（フランキング）配列部分は好ましくは約２〜約１００塩基、より好ましくは約５から約２０塩基長である。アンチコードオリゴマーは、他の遺伝子からのプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡコード化鎖に対するアンチコードオリゴマー同士の相同性を最小にするために、他の遺伝子のプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡに共通に見いだされることのないプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡの配列部分に相補的であることが好ましい。
好ましいアンチセンスの、あるいは相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを表１に示す。
【００２７】
（表１）
ｂｃｌ−２ オリゴデオキシヌクレオチド
翻訳開始アンチセンス(TI-AS) 3′…CCCTTCCTACCGCGTGCGAC…5′
ｂｃｌ−２ 5′…CTTTTCCTCTGGGAAGGATGGCGCACGCTGGGAGA…3′
スプライス供与体アンチセンス(SD-AS) 3′…CCTCCGACCCATCCACGTAG…5′
ｂｃｌ−２ 5′…ACGGGGTAC…GGAGGCTGGGTAGGTGCATCTGGT…3′
スプライス受容体アンチセンス(SA-AS)3′…GTTGACGTCCTACGGAAACA…5′
ｂｃｌ−２ 5′…CCCCCAACTGCAGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGG…3′
【００２８】
本発明が属する分野における当業者であれば、多数のあるいは少数の置換ヌクレオチドを有するアンチコードオリゴマー、または好ましい態様以外の３'あるいは５'方向でｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに沿ってさらに延在するがやはり細胞増殖を阻害するアンチコードオリゴマーもまた本発明の範囲に含まれることがわかるだろう。
【００２９】
本発明の実施にあたっては、“生の”あるいは未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドよりむしろ、アンチコードオリゴマーの化学的修飾誘導体やそのアナログを用いるのが好ましい。“生の”オリゴデオキシヌクレオチドは、標準的なフォスフォラミダイト化学によってＤＮＡシンセサイザーで容易に合成することができる。好ましい誘導体および誘導体の調製方法としては、以下のものが挙げられる：フォスフォロチオエート、スタイン(Stein) ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１６：３２０９−３２２１（１９８８年）；メチルフォスフォネート、ブレイク(Blake) ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：６１３２−６１３８（１９８５年）、およびアルファデオキシヌクレオチド；モルヴァン(Morvan)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：５０１９−５０３２（１９８６年）；２'−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド、［モニア (Monia)ら、“遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしての２'デオキシギャップを含有する２'−修飾オリゴヌクレオチドの評価”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４−１４５２２（１９３３年）］およびアクリジン等の共有結合した誘導体、アセライン(Asseline)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３２９７−３２０１（１９８４年）；アルキル化物（例えばＮ−２−クロロセチラミン）、ノール (Knorre) ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、６７：７８３−７８９（１９８５年）およびヴラソフ (Vlassov)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４０６５−４０７６（１９８６年）；フェナジン、ノール(Knorre)ら、上記書、およびヴラソフ (Vlassov)ら、上記書；５−メチル−Ｎ4−Ｎ4−エタノシトシン、ウェッブ(Webb)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１４：７６６１−７６７４（１９８６年）；鉄−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびアナログ類、ブトリン (Boutorin) ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ'ｓ、１７２：４３−４６（１９８４年）；５−グリシルアミド−１，１０−ｏ−フェナントロリン、チーホン(Chi-Hong)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１４７−７１５１（１９８６年）；およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）誘導体、チュー (Chu)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：９６３−９６７（１９８５年）。これらの刊行物を、あたかもその上掲箇所がここに完全に記載されていると同一の効果をもって、本明細書の一部として引用する。
【００３０】
本発明のアンチコードオリゴマーは、医薬として許容される担体と組み合せして、対象に投与するかあるいは生体外投与することもできる。好適な医薬担体としては各種カチオン性脂質を用いることができ、具体的にはＮ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルフォスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。リポソームもまた本発明のアンチコードオリゴマーの担体として好ましく用いることができる。
【００３１】
アンチコードオリゴマーは如何なるルートで患者に投与してもよい。例えば、静脈内、筋肉内、鞘内、鼻腔内、腹腔内、皮下の各注射、ｉｎ ｓｉｔｕ注射、および経口投与を挙げることができる。経口投与の場合、本発明のアンチコード分子やそのアナログが消化管内で分解しないように腸溶コーティングが必要である。アンチコードオリゴマーは、生理的に許容される一定量の担体あるいは希釈剤（生理食塩水やその他の適切な液体）と混合してもよい。アンチコードオリゴマーは、リポソームやその他の担体手段と組み合せてアンチコード分子やそのアナログが標的に到達するまで保護したり、および／または、アンチコード分子やそのアナログが組織のバリアを通過するのを容易にすることができる。
【００３２】
アンチコードオリゴマーは生体外での骨髄浄化にも有用である。通常、患者が受けることができる従来の癌化学療法剤ないし医薬および照射の量は、骨髄に対する毒性によって制限される。骨髄に対する毒性とは即ち貧血（疲労、心不全）血小板減少症（出血）、好中球減少症（感染）である。このように、腫瘍を完全に撲滅するために十分な濃度の薬剤を運搬あるいは照射すれば、医師は同時に患者の正常な骨髄細胞を破壊してしまい、患者の死亡を招くであろう。またあるいは、患者から多量の骨髄を外科的に採取してこれをインビトロで保存する一方、患者に攻撃的な従来法による処置を行うこともできる。この場合、患者に患者自身の骨髄細胞を再導入して救命できるが、これもその骨髄から残存悪性細胞が“追放・浄化”されている場合に限られる。本発明のアンチコードオリゴマーは、骨髄から残存悪性細胞を除去するために用いることができる。
【００３３】
アンチコードオリゴマーは癌や新生物細胞の成長を阻害するのに有効な量投与される。投与される特定のアンチコードオリゴマーの実際の量は、癌の種類、体の他の細胞に対するそのアンチコードオリゴマーの毒性、癌細胞によって取り込まれる速さ、およびそのアンチコードオリゴマーが投与される個体の体重や年齢等、各種ファクターによって変わるであろう。ヒトの血清中に存在する阻害剤がアンチコードオリゴマーの活性と干渉する可能性から、各個人に対するアンチコードオリゴマーの有効量は変わるであろう。患者に対する有効量は従来の方法によって確認することができる。これは例えばアンチコードオリゴマーを細胞増殖の阻害に無効な量から有効な量まで段階的に増加させて行く方法である。細胞増殖を阻害するためには０．００１マイクロモル〜１００マイクロモルの濃度幅で癌細胞に提示すれば有効であろうと期待される。
【００３４】
アンチコードオリゴマーは、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な時間少なくとも一回患者に投与する。アンチコードオリゴマーは、癌細胞中または癌細胞の周囲でアンチコードオリゴマーが有効レベルを維持するのに十分な頻度で患者に投与するのが好ましい。有効レベルを維持するためには、アンチコードオリゴマーは一日数回、毎日またはこれより間隔を置いて投与することが必要となるかもしれない。アンチコードオリゴマーは、癌細胞がもはや検出されなくなるか、癌細胞の数が減少してそれ以上投与治療を続けてももはや顕著な数の減少がもたらされなくなるか、あるいはまた癌細胞が減少して、外科手術その他の処置で対応可能となる時点まで継続投与する。アンチコードオリゴマーが投与される時間の長さは、癌細胞が特定のオリゴデオキシヌクレオチドを取り込む速さや、細胞がオリゴデオキシヌクレオチドに応答するのに要する時間によって異なる。インビトロでは、“生の”未修飾アンチコードオリゴマーによる新生物細胞の生育の最大阻害は培養開始後２日で起こったが、フォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは４〜７日かかって最大阻害に到達した。インビボでは細胞増殖の最大阻害に必要な時間はより長い場合もより短い場合もあろう。
【００３５】
本発明のアンチコードオリゴマーは、２以上のアンチコードオリゴマーオリゴデオキシヌクレオチド配列の組合せとして、あるいは一つの型の配列として患者に投与することができる。例えば、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳを投与することもできるし、ＴＩ−ＡＳ単独で投与することもできる。
【００３６】
本発明のアンチコードオリゴマーは自己免疫疾患の治療にも役立つことは確実である。自己免疫疾患とは、体の免疫系が正常に機能しない疾患である。本発明のアンチコードオリゴマーを自己免疫疾患を有するヒトに投与すればｂｃｌ−２過剰発現リンパ球の増殖を阻害するはずであり、これにより自己免疫疾患の症状が改善される。自己免疫疾患の治療用途に用いるには、本明細書の記載に従ってアンチコードオリゴマーを投与する。
【実施例】
【００３７】
方法一般
実施例には次のプロトコールを用いた。
【００３８】
Ａ．細胞と細胞培養
本研究のために用いたヒト白血病細胞株はＲＳ１１８４６濾胞性リンパ腫細胞、６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ球性白血病細胞、およびＪＵＲＡＴ Ｔ細胞急性リンパ球性白血病細胞であり、これらはツジモトらによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４−５２１８（１９８６年）に、またワイス(Weiss) らによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１３８：２１６９−２１７４（１９８７年）に記載されている。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を新鮮全血から、リードら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：３１４−３１９（１９８５年）に記載のようにして単離した。全リンフォイド細胞を１ｍＭのグルタミン、抗生物質、および次の何れかを含むＲＰＭＩ培地中で５×１０5細胞／mLの濃度で培養した：５〜１０％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５〜１０％（ｖ：ｖ）の子ウシ血清（ＣＳ）（両者ともハイクローンラボラトリーズ製）、あるいは無血清培養には１％（ｖ：ｖ）のＨＬＩ濃縮補充剤（ベントレックスラボラトリーズ）。マウス繊維芽細胞株を、グルタミン、抗生物質、および５〜１０％（ｖ：ｖ）のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中に、１０3細胞／ｃｍ2添加した。繊維芽細胞株はＮＩＨ ３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｂ−α−Ｓ細胞、および３Ｔ３−Ｂ−αーＡＳ細胞であった。このうちの後の２つの細胞株は、発現ベクター構築物での安定した形質移入によって、センス配向、アンチセンス配向のいずれかでヒトｂｃｌ−２−α ｃＤＮＡを高レベルに発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞である。
【００３９】
Ｂ．細胞成長の測定
アンチコードオリゴマーの存在下あるいは不在下、培養細胞株の成長を次の二つの方法で測定した：血球計を用いた細胞カウント；およびリードら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：３１４−３１９（１９８５年）に基本的に記載されている、［3Ｈ］−チミジン導入量をアッセイすることによるＤＮＡ合成。即ち、細胞を９６穴の平底マイクロタイタープレート（ファルコン社）にウェルあたり０．２mL加えて培養した。適切な時間に細胞を再懸濁し、２５μｌを取り出し細胞数をカウントした。この２５μｌ量は２０ＵＣｉ／Ｍｌの［3Ｈ］−チミジン（特異活性＝６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）（ニューイングランド・ニュークリアー）で置き換えた。次いでマイクロタイター培養物を３７℃で９５％空気：５％炭酸ガス雰囲気に８時間戻し、その後細胞とガラスフィルターを溶解し、シンチレーションカウンティングでＤＮＡへの［3Ｈ］−チミジンの導入の相対レベルを決定した。細胞のカウントは、トリパンブルー染料の存在下、二重に用意したマイクロ培養物中の生存可能細胞の濃度を決定することにより行った。
【００４０】
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム・ブロマイド］］色素低減アッセイをタダらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、９３、１５７（１９８６年））に従って行い、本明細書に記載の条件下においてアッセイの線形領域内にあることを確認した。ウェル当たりの生存可能細胞の数は、各アッセイにおける標準曲線から外挿した。標準曲線は、ＨＬ−１培地において指数的に成長するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の、１０6細胞／mL（０．２ｍｉ／ウェル）から始まる連続２倍希釈からなるものであった。サンプルは３重にアッセイし、培地／試薬のブランクに対するＯＤ６００ｎｍを計算前に全ての値から差し引いた。
【００４１】
Ｃ．ＲＮＡブロット分析
全細胞ＲＮＡを、チョムジンスキー(Chomczynski) らがＡｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６−１３９（１９８７年）に記載しているクゥォニジニウム・イソチオシアネート／フェノール手続によって単離した。ポリアデニル化された分画をオリゴデオキシチミジン−セルロースクロマトグラフィーによってアヴィブ(Aviv)らがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：１４０８−１４１２（１９７２年）に記載のようにして精製した。約５μｇ分割量のｍＲＮＡを０．８％アガロース／６％フォルムアルデヒドゲル中でサイズ分画し、ナイロン膜に移した。ブロットは、リードらがＭｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５：３３６１−３３６６（１９８５年）に記載した方法を正確に行って、まず予ハイブリダイズ、次いでハイブリダイズ後に洗浄した。これには、ツジモトがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４−５２１８（１９８６年）に記載したヒトｂｃｌ−２に対する32Ｐ−ｃＤＮＡあるいはネグリニ(Negrini) らがＣｅｌｌ、４９：４５５−４６３（１９８７年）に記載したマウスｂｃｌ−２プローブであるｐＭＢＣＬ５．４を利用した。ブロットは、強調スクリーンと共に−７０℃で１〜１０日間コダック社のＸＡＲフィルムに露光した。32Ｐ−ｂｃｌ−２プローブを膜から溶出させ、32Ｐプローブと共にマウスのβ−マイクログロブリンに関して再ハイブリダイズさせると、ブロット上の全サンプルについて略等量のｍＲＮＡが確認された。
【００４２】
実施例１
アンチコードオリゴマーの調製
アプライド・バイオシステムズ社３８０Ｂ ＤＮＡ合成器を使用して、ここに特に全文をレファレンスとして援用するスタインら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６：３２０９−３２２１（１９８８）に記載の方法により、ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ（ＰＲＰ−１カラム）により精製した。いくつかのケースにおいては、非特異的な細胞毒性作用を除去するために、さらにオリゴデオキシヌクレオチドをカーンら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：２３７−２４４（１９８８）にすでに記述されているように、Ｃ１８−Ｓｅｐ−ＰａＫクロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）により精製する必要があった。３０％酢酸ニトリルに溶出したオリゴデオキシヌクレオチドを蒸発乾燥させ、滅菌したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクスの緩衝塩溶液（ともにＧｉｂｃｏ製）に１−２ｍＭ濃度に再懸濁させ、少量のアリコートに分けて−８０℃で保存した。
合成したオリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらのヒトｂｃｌ−２遺伝子のセンス−ストランドとの関係を表１に示した。ヒトｂｃｌ−２遺伝子のコードストランド配列部分を示しているが、これには翻訳開始部位（上）、スプライス供与部位（中央）およびスプライス受容部位（下）、ならびにｂｃｌ−２プレｍＲＮＡの５'非翻訳部分中の経験的に選択した部位が含まれている。ＡＴＧ開始コドン、ＧＴスプライス供与体、およびＡＧスプライス受容コンセンサス配列はボックスで囲んだ部分である。
これらの研究のために合成されたオリゴデオキシヌクレオチドの配列が示され、それらのヒトｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのセンス−ストランドとの関係が示されている。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは翻訳開始部位のアンチセンスであり、ＴＩ−Ｓはその相補センス体である。ＳＤ−ＡＳおよびＳＤ−Ｓはそれぞれ、スプライス供与領域に対するアンチセンスおよびセンス配向を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
オリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳはｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの予測される翻訳開始部位にまたがり、この領域に対して相補的（アンチセンス）である。対照として、この２０ｂｐオリゴデオキシヌクレオチドのセンス配列ＴＩ−Ｓを合成した。
ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのスプライシングを特異的に遮断するために、２０ｂｐオリゴデオキシヌクレオチドのアンチセンス配列ＳＤ−ＡＳを合成したが、これはｂｃｌ−２の一次転写産物のスプライス供与部位とオーバーラップする。さらに、表１に示されているように相補センスオリゴデオキシヌクレオチドＳＤ−Ｓも調製した。ヒトｂｃｌ−２遺伝子は、ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６）にあるように、別のスプライス部位選択によりいくつかの転写産物をもたらす。これら転写産物の優位性はスプライシングに依存し、２６ＫＤａタンパクであるｂｃｌ−２−アルファをコードする。しかしながら、マイナーな１つの転写産物はスプライスされず、したがって２２ＫＤａタンパクのｂｃｌ−２−ベータをコードする。このようにＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは基本的に、すべてではないが殆どのｂｃｌ−２転写産物の完成を遮断することができる。
【００４３】
実施例２
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのＩｎ Ｖｉｔｒｏ研究のための血清の処理
ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは血清中に存在するヌクレアーゼによる劣化に敏感なため、５６℃で３０分間加熱（血清補体を不活性化するための通常の手順）した牛胎児血清（ＦＢＳ）中におけるＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドの効果と、６８℃で１時間加熱（多くのヌクレアーゼ類を非可逆的に不活性化するのに充分な温度）した牛胎児血清（ＦＢＳ）中におけるＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較した。ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞系統を使用した。ＲＳ１１８４６細胞はｂｃｌ−２発現を自由にするｔ（１４；１８）染色体転座を含み、その結果ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを高レベルで蓄積する（ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６））。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞を、予め５６℃で０．５時間または６８℃で１時間加熱した牛胎児血清５％（容量/容量）を含む培地で培養した。培養の開始時にＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加え、２日後に生存細胞の密度を測定した。
ＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは６８℃処理血清の方がこれらリンパ腫細胞の培養の成長を効果的に抑制した。以下の実験ではすべて、培養に供する前に６８℃で１時間加熱した血清を使用した。この処理は血清の成長支援能力を阻害するものではない。
【００４４】
実施例３
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによるリンパ細胞成長の特異的阻止
ｂｃｌ−２の翻訳開始部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＡＳ）およびスプライス供与部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド（ＳＤ−ＡＳ）について、正常および新生物リンパ細胞の増殖抑制力を試験した。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ細胞、ＪＵＫＲＡＴ Ｔ細胞白血病細胞、および新鮮な単離抹消血液リンパ球を、予め６８℃で１時間加熱した１０％（容量/容量）ＦＢＳを含む培地で培養した。培養開始時に種々の濃度のＴＩ−ＡＳ、ＴＩ−Ｓ、ＳＤ−ＡＳ、およびＳＤ−Ｓなどのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加えた。培養２−３日後に、[3Ｈ]−チミジン取り込み量を測定することにより、培養物中の相対ＤＮＡ合成率を測定した。オリゴデオキシヌクレオチド処理培養物と等量のＰＢＳまたはＨＢＳＳを含む対照培養物に対するパーセンテージを計算してデータを求め、複製培養の平均（±標準偏差）を求めた。
低温チミジン阻止を除いて、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処理した培養中のＤＮＡ合成抑制の１つの指標として、細胞数を計測し同様のデータを求めた。
図１および図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはともに、ＲＳ１１８４６細胞の成長を濃度に依存して抑制した。ＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドにくらべて細胞成長を抑制する効果は少なかった。これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと対照的に、センスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＳＤ−Ｓ）は濃度２５０μＧ／mLまで抑制効果は認められなかった。さらに非センスオリゴデオキシヌクレオチド（すなわち、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同じ塩基組成を有するが、スクランブル配列となっているもの）もまた、ＲＳ１１８４６細胞の増殖を抑制しなかった。これらのデータはしたがって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがこれらの腫瘍性細胞の増殖を特異的に遮断することを示している。ｂｃｌ−２遺伝子を発現するその他いくつかの白血性細胞種についても、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドによってそれらの増殖が抑制されるか試験した。ＪＵＲＫＡＴ Ｔ細胞急性リンパ細胞白血性細胞の場合と同様、すべてのケースにおいてアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養中で、これらのヒト白血性細胞の成長は特異的かつ濃度依存性で減少するのが観察された。
健常なヒト抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）の増殖が刺激される時、これらの中でｂｃｌ−２の発現が一時的に誘発されることが示されており、これはこの遺伝子が正常なリンパ球の成長調節にある役割をはたしていることが示唆されている（リードら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９５−１２９７（１９８７））。よって、それらの増殖を刺激するモノクローナル抗体ＯＫＴ３（ヴァン・デン・エルセンら，Ｎａｔｕｒｅ３１２：４１３ー４１８（１９８４））をＰＢＬとともに培養した場合、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのＰＢＬの成長抑制に対する能力を試験した。ＰＢＬは５０μｌの精製ＯＫＴ３モノクローナル抗体で刺激した。図１および図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＰＢＬの増殖を濃度依存性で特異的に抑制した。このようにこれらのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子を構成的に発現する白血病細胞の培養物中の成長ならびにｂｃｌ−２発現が誘発されるノーマルなリンパ球の培養中の増殖を抑制した。
【００４５】
実施例４
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる阻止の時間的経過
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の力学をＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞および６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ細胞白血病細胞で検査した。これら両方の新生物Ｂ細胞種はｂｃｌ−２ｍＲＮＡを高レベルで転写・蓄積した（ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６））。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞および６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ細胞白血病細胞を、６８℃で処理したＦＢＳおよびノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを１０％（容量/容量）含む培地中で培養した。細胞は、５０μｇ／mLのＴＩ−ＡＳ、１００μｇ／mLのＳＤ−ＡＳ、５０μｇ／mLのＴＩ−Ｓ（ＲＳ１１８４６細胞）または１００μｇ／mLのＳＤ−Ｓ（６９７細胞）、あるいは対照としてのＰＢＳとともに培養した。培養開始後種々の時間でＤＮＡ合成（ｋｃｐｍ/１０5生存細胞数）および細胞密度（１０5生存細胞数/mL）を測定した。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドはこれらの細胞培養物中で測定されるＤＮＡ合成を２４時間以内に著しく抑制した。これらの培養物における細胞密度の低下は明らかに２日以内に起きている。このようにアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは白血病細胞のＩｎ Ｖｉｔｒｏ成長を急激に抑制した。センスオリゴデオキシヌクレオチドはこれら培養物中の増殖を阻害しなかったことから、アンチセンスオリゴデオヌクレオチドの作用は特異的なものである。細胞の生存はしばしば培養の後期に低下するが、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと一緒の培養では細胞死の増加は最初の１−２日には認められず、これは非細胞毒性メカニズムであることを示唆している。
【００４６】
実施例５
異なる血清調製品の比較
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞の増殖抑制は培養に使用される血清のロットによって大幅に変わる。
増殖抑制に対する血清の効果を測定するために、２００μＭのＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの添加２日後の６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞培養物中の相対ＤＮＡ合成を測定した。１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態）、５％（容量：容量）ウシ血清（ＣＳ１およびＣＳ２）の異なる２ロット、または５％（容量：容量）牛胎児血清（ＦＢＳ１およびＦＢＳ２）を添加した培地中で細胞を培養した。すべての血清は培養に使用する前に６８℃で１時間加熱した。
ノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＤＮＡ合成（９２％）ならびに６９７細胞の無血清培養物（ＨＬ１）における細胞増殖を著しく抑制した。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは５％（容量：容量）牛胎児血清（ＦＢＳ２）を含む培養物中でも同様に効果的（９４％）であった。対照的に、その他の血清調製品（ＣＳ１、ＣＳ２、ＦＢＳ１）を含む培養物中では抑制作用は顕著に低下した。一般的にはアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むものよりもウシ血清（ＣＳ）を添加した培養物中での効果が少ないことが観察されている。
【００４７】
実施例６
無血清培養におけるアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態または５％（容量：容量）６８℃処理ＦＢＳ２）のいずれかを含む培地中で６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を培養した。種々の濃度のノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中で２日後のＤＮＡ合成および細胞密度の相対レベルを測定した。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは、無血清培養に使用された場合、低濃度で抑制的であった。たとえば、１００μＭにおいては、ＦＢＳ２を含む培養物中では細胞増殖の抑制は見られなかったのに対し、無血清培養物中では細胞数は約７５％減少した。しかしながら、より高濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（２００−２５０μＭ）の場合は、両方のタイプの培養物中の６９７細胞増殖の抑制は同程度であった。無血清培養物中のノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの増進する効果は特異的なものであったが、これはセンスオリゴヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）が同一濃度では抑制的でないからである。
【００４８】
実施例７
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド：抑制の時間的経過
ヒト白血病細胞成長抑制に関するホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果とノーマルホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較するために、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞とともに培養し、その抑制効果を測定した。６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を無血清培地中で何回か培養し、ＤＮＡ合成（ｋｃｐｍ）および細胞密度（１０6細胞数／mL）を測定した。
細胞は当初密度０．２×１０5細胞／mLまたは０．５×１０5細胞／mLのいずれかで接種した。培養条件は２５μＭＴＩ−ＡＳホスホロチオエート、２５μＭ ＴＩ−Ｓホスホロチオエートとし、対照培養はＨＢＳＳで処理した。
血清ロットの差による実験変動を避けるために、６９７白血病細胞を無血清条件で培養した。当初接種密度０．５×１０6細胞／mLで培養した場合、６９７細胞は培養４−５日で最高のＤＮＡ合成および細胞密度を達成した。これらの培養開始時に２５μＭのセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）を添加しても６９７細胞成長には効果がほとんど無かった。しかしながら、２５μＭのアンチセンスホスホロチオエート（ＴＩ−ＡＳ）を含む複製培養物中では、２日以内にＤＮＡ合成のある程度の減少が明白となり、４−５日で最高となった。細胞数計測で測定される６９７細胞成長の最大抑制は培養開始後６日後に見られた。
６９７細胞を当初０．２×１０6細胞／mLで接種した場合、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＡＳ）は２日目にわずかな抑制を示し、これら培養物中でのＤＮＡ合成の最大抑制は７日目に達成された。ノーマルオリゴヌクレオチドの場合と同様に、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制は非細胞毒性メカニズムに仲介されるものと思われる。なぜならば細胞生存数は培養の後期にならないと低下しなかったからである。したがって、ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと比較した場合、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは作用開始時期が遅い。
【００４９】
実施例８
アンチセンスｂｃｌ−２ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
無血清培地中での６９７細胞の培養におけるホスホロチオエートおよびノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性を下記のようにして比較した。
６９７細胞を無血清培地中で、３日間（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド）または４日間（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド）培養し、細胞密度およびＤＮＡ合成のレベルを測定した。培養物へのオリゴデオキシヌクレオチドの添加物には、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエート、ＴＩ−Ｓホスホロチオエート、ＴＩ−ＡＳノーマルおよびＴＩ−Ｓノーマルが含まれる。
図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは２５−５０μＭで６９７細胞の増殖を顕著に抑制した。対照的に、ノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは同等の６９７細胞増殖抑制をするためには５倍から１０倍高い濃度（約２５０μＭ）を必要とした。アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳによる抑制は、この濃度範囲では特異的であったが、これはその相補センスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）が複製培養において６９７細胞抑制をほとんどしなかったためである（図３参照）。
【００５０】
実施例９
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清調製品の影響
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に関する血清調製品の効果をさらに明確にするために、培養物への添加の前に５６℃で３０分間もしくは６８℃で１時間加熱した、または加熱しないＦＢＳをＲＳ１１８４６リンパ腫細胞の培養物へ添加した。
ＲＳ１１８４６細胞は、予め５６℃で０．５時間もしくは６８℃で１時間加熱した、または加熱をしていない１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレートまたは５％（容量：容量）ＦＢＳを含む培地中で培養した。複製培養物の４日および５日目の細胞数を、等濃度のＴＩ−Ｓホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで処理した対照培養に対するパーセンテージとして計測し、平均パーセンテージを求めた（標準偏差はすべての値について１０％以下であった）。ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは２５μＭで完全にＲＳ１１８４６の成長を抑制し、半−最大抑制濃度は１１μＭと推定された。対照的に、このホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは５％（ｖ：ｖ）ＦＢＳを含む培養中では極端に効果が少なかった。さらに、培養液に添加する前にＦＢＳを加熱しても、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのＲＳ１１８４６リンパ腫細胞の成長を抑制する能力は顕著には改善されなかった。オリゴデオキシヌクレオチドの濃度が５０μＭの場合、ＲＳ１１８４６細胞の増殖抑制は、加熱操作の有無にかかわらず、血清を含んだ培養中では４８％を超えることはなかった。
【００５１】
実施例１０
ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清の透析の影響
血清中の妨害物質の性質をさらに明らかにするために、６８℃加熱血清を６９７白血病細胞の培養物に添加する前に、厳密に透析（遮断分子量＝３５００）して実験を行った。実験は１２．５μＭのＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドおよび２００μＭのノーマル酸素ベースのＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを使用して行った。
６９７細胞を、１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（Ａ）または６８℃加熱処理の３ロットの５％（容量：容量）ＦＢＳ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）を含む培地中で培養した。各血清調製品は厳密な透析前（ＮＤ）および透析後（Ｄ）で対比した。ＴＩ−ＡＳ（＋）およびＴＩ−Ｓ（−）オリゴデオキシヌクレオチドは、ノーマル酸素ベースのオリゴデオキシヌクレオチドについては２００μＭ（ＯＸＹ）、およびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＴ）については１２．５μＭを、複製培養物に添加した。ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドそれぞれの培養２ないし４日目にＤＮＡ合成の相対レベル（ｋｃｐｍ）を測定した。
試験したＦＢＳの３つの異なるロットの内、２つは透析後もノーマルまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培養物でほとんど変化を示さなかった。しかしながらＦＢＳの１ロットは、透析後これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に僅かの影響を与えた。
【００５２】
実施例１１
安定的に形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した実験
ここで述べるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２ｍＲＮＡ翻訳（ＴＩ−ＡＳ）およびスプライシング（ＳＤ−ＡＳ）を遮断するように設計されたものであるが、それらの作用の分子メカニズムはまだ解明されていない。細胞内でのオリゴデオキシヌクレオチド−ＲＮＡハイブリッドの形成の細胞成長抑制に対する効果を調べるために、ヌクレオチドの配列に関係なく、ヒトｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ転写物を発現するように形質転換した細胞をノーマルオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した。
２００μＭのノーマルＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドを、典型的なＮＩＨ ３Ｔ３細胞の培養物、ならびに通常のセンス（３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞）またはアンチセンス（３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞）ストランドのいずれかのヒトｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ転写物を高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換したこれらの細胞の培養物に、添加した。
ＲＮＡブロット分析を行うために、ノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ならびにセンス（３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞）またはアンチセンス（３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞）リコンビナントｂｃｌ−２−アルファｍＲＮＡを高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換した細胞から、ポリアデニル化ｍＲＮＡを１３の方法に基づいて精製した。約５μｇのｍＲＮＡを、基本的に（１６）に記載したように、ヒトまたはネズミｂｃｌ−２配列由来の32Ｐ−標識ハイブリダイゼーションプローブを使用したＲＮＡブロット検定に供した。
ノーマル３Ｔ３細胞、３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞、および３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞からのＲＮＡを含むブロットに対する１日曝露によるオートラジオグラムでは、３Ｔ３−アルファ−ＡＳおよび３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞に形質転換したｂｃｌ−２発現構築物から産生されたリコンビナント２．４および１．４ｋｂｐ ｂｃｌ−２転写産物が高い相対レベルを示した。
ＲＮＡを採取する時点で増殖中または鎮静状態のいずれかのノーマル３Ｔ３細胞からのＲＮＡを含むブロットの１０日間の曝露では、増殖中の３Ｔ３細胞中に低レベルではあるが検出可能なレベルのノーマル７．５および２．４ｋｂｐネズミｂｃｌ−２転写産物の存在が示された。
ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞の培養中のＤＮＡ合成および細胞複製を特異的に抑制したが、これは低レベルではあるが線維芽胞がｂｃｌ−２転写産物を含むという他者の発見とも符合するものである。ここで開示したこのＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは、マウスｂｃｌ−２配列においてその２０塩基中１８が相補的であり（１７）、ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長を抑止する役割を果たしているものと思われる。
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞、および３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞を、５％（容量：容量）の６８℃処理血清、ならびにＨＢＳＳ、２００μＭ ＴＩ−Ｓノーマルオリゴデオキシヌクレオチド、または２００μＭ ＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培地中で培養した。３日目の培養物中のＤＮＡ合成の相対レベル（ｋｃｐｍ）を測定し、[3Ｈ]−チミジンの０．５μｃｉ/穴の１６時間インキュベートと比較した。位相差顕微鏡による推定細胞密度は測定した培養物中のＤＮＡ合成と一致した。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中のＤＮＡ合成の抑制パーセンテージは、ＨＢＳＳを含む対照培養物との相対比較で求めた。
ノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞の場合と同様に、ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞（ヒトｂｃｌ−２−アルファセンス転写物を産生）は特異的な抑制を示した。なぜならば、センスオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−Ｓは抑制的でなかったからである。しかしながらアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖抑制のレベルは３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞ほど大きくはなかった。これは予想されるとおり、これらの細胞がより多くのｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを含んでいるからである。
３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞培養物（アンチセンスｂｃｌ−２転写物を産生）に対するＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドの添加は、オリゴデオキシヌクレオチド−ＲＮＡハイブリッド形成を含む非特異的なメカニズムを通して細胞成長の抑制を妨げた。ＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドは３Ｔ３−アルファーＡＳ細胞増殖をほとんど抑制しなかったが、一方ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはこれら細胞に対して著しく抑制的であった。ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドについても同様のデータが得られた。
【００５３】
実施例１２
ヒトリンパ腫細胞におけるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド介在プログラム細胞死の指標としてのＤＮＡ断片化の測定
表２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドのヒトｔ（１４：１８）含有ヒトリンパ腫細胞種ＲＳ１１４８６のプログラム細胞死（ＤＮＡ断片化）を誘発する能力を調べるための試験を行った。これらのオリゴヌクレオチドはすべてホスホジエステルであり、ｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡの翻訳開始部位または５'−キャップ領域を標的とするものである。
対照オリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＩ−ＡＳ（配列番号：７）のｂｃｌ−２センス型（ＴＩ−Ｓ）、および同じ塩基組成を有するがヌクレオチド順序がバラバラのＴＩ−ＡＳのスクランブル型を含めた。
【００５４】
（表２）
配列 配列番号
CGCGTGCGAC CCTCTTG(3′→5′) 8
TACCGCGTGC GACCCTC(3′→5′) 9
CCTTCCTACC GCGTGCG(3′→5′) 11
GACCCTTCCT ACCGCGT(3′→5′) 12
GGAGACCCTT CCTACCG(3′→5′) 13
GCGGCGGCAG CGCGG(3′→5′) 14
CGGCGGGGCG ACGGA(3′→5′) 15
CGGGAGCGCG GCGGGC(3′→5′) 16
【００５５】
ＲＳ１１８４６細胞を、１％ＦＣＳならびに125Ｉ−デオキシウリジンの添加により代謝的に標識したそれらのＤＮＡとともに、ＨＬ１培地で３時間培養した。標識された細胞を次に完全に洗浄し、５０ＡＭの種々のオリゴヌクレオチドの存在下で２日間培養した。次いで遠心分離により２００μｌの培養液から細胞を回収し、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１４ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む低張性緩衝液中に溶離した。断片化されていないゲノムＤＮＡをペレット化するために１６，０００×Ｇで遠心分離した後、断片化されたＤＮＡを含む上澄み画分をフェノール/クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈降させた。次にこのＤＮＡを１．５％アガロースゲルのゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィにかけるためにナイロン膜に移した。
２つの実験の結果を図４および５に示す。ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始ＡＴＧ部位近辺を標的とする６種類のｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。「Ｃ−オリゴ−２」は４つの意図的なミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを示す。「Ｕ」は無処理の対照細胞を示す。図５は図４に示したオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。「Ｓｃ２０」はＴＩ−ＡＳと同じ塩基組成を有するがスクランブル配列である２０ｍｅｒを指す。図５（ｂ）はｂｃｌ−２ｍＲＮＡの５'−キャップを標的とする３つのオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。数字はこれらのオリゴマーのＡＴＧ−翻訳開始部位からの距離を示す。
ＤＮＡ断片（単位サイズ約２００ｂｐ）のラダー（はしご）の存在はプログラム細胞死を示唆している。５０μＭにおいて、ＴＩ−ＡＳはほとんどＤＮＡを断片化しなかったのに対し、配列番号９および配列番号１０、ならびに５'−キャップオリゴヌクレオチドの一つ（配列番号１４）は顕著なＤＮＡ断片化をもたらした。
【００５６】
実施例１３
無血清培養物中におけるアンチセンスホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を、１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態[0]または３％（容量：容量）６８℃加熱処理血清（ＦＢＳ２）[＿]を含む培地中で培養した。図６参照。示されているのは、種々の濃度のホスホジエステルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養液中の培養２日目における細胞密度である。これらのデータはセンスオリゴヌクレオチドで処理した対照培養に対する相対パーセンテージで示されており、複製サンプルの平均±標準偏差も表している。
【００５７】
実施例１４
オリゴデオキシヌクレオチド処理６９７細胞中のｂｃｌ−２タンパクレベルの免疫蛍光分析
オリゴデオキシヌクレオチドとの関係を検討するために、０．２５×１０4（ホスホロチオエート）または０．５×１０5（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド）の６９７細胞を１mLのＨＬ−１無血清培地で２４穴培養皿（Ｌｉｎｂｒｏ．Ｆｌｏｗ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）で培養した。２日目（ノーマルの場合）または４日目（ホスホロチオエートの場合）に、細胞を培養液から回収し、[ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）−０．１％ウシ血清アルブミン−０．１％アジ化ナトリウム]中で１回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で５−１０分間氷上固定した。次いで細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１mLの純粋メタノール中で２０℃、１０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ａ中で１回洗浄後、細胞を０．０５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ中に氷上で３分間再懸濁させ、ＰＢＳ−Ａ中で洗浄し、ＰＢＳ中４℃で３０分間１０％（ｖ/ｖ）加熱非活性化ヤギ血清で予備遮断した。
第１の抗体を添加するために、予備遮断した細胞を１００μｌのＰＢＳ−Ｇ（ＰＢＳ−１％ヤギ血清−０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁させ、ＢＣＬ−２抗体（ハルダーら，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン），３４２：１９５−１９７（１９８９））またはアフィニティ精製したノーマルウサギ対照ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ６０１２−００８０）のいずれかを含有させた個別の試験管に５０μｌずつに分割し、氷上で１時間インキュベートした。これらの検討に使用したＢＣＬ２抗体は、ＢＣＬ２タンパクのアミノ酸（９８−１１４）に相当する合成ペプチドをウサギに使用し、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィによりアフィニティ精製し、約１mg／mLで使用した。細胞は次にＰＢＳ−Ａ中で洗浄し、０．５−１．０mL ＰＢＳ−Ａ中で氷上１５−２０分間インキュベートし、非特異性の細胞会合抗体を分散させたあと、５μｇのビオチニル化ｓｃａｔ抗ウサギＩｇＧ（ＢＡＩＯＯＯ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を含む１００μｌのＰＢＳ−Ｇ中に細胞を３０分間再懸濁させた。ＰＢＳ−Ａで１回洗浄および１５分間インキュベートした後、細胞を最終的に、２μｇのＦＩＴＣ接合アビジン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ Ａ２０１１）を含む１００μｌのＰＢＳ−Ａに２０分間再懸濁させ、ＰＢＳ−Ａで３回洗浄した後、オルソ２１５０データ処理システムに連結されたオルソチトフルオログラフ５０−Ｈで分析した。本法のＢＣＬ２タンパク検出特異性は免疫蛍光顕微鏡（細胞質ゾル着色ペプチド競合を示す）、ならびに遺伝子トランスファー操作により種々のレベルのＢＣＬ２ ｍＲＮＡおよびタンパクを発現する細胞種を調べることにより確認した。
表面ＨＬＡ−ＤＲ抗原発現を測定するために、間接免疫蛍光分析法（リードら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１６３１−１６３９（１９８５））を使用したが、これは生存細胞をネズミ抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ７３６０）または負の調節抗体 Ｒ３−３６７（ＩｇＧ２ａ）、続いてＦＩＴＣ接合ｓｃａｔ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ １７１１−００８１）とともにインキュベートすることを含むものである。細胞はＦＡＣＳ分析に供する前に１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。
６９７細胞を種々のオリゴヌクレオチドとともに２日（ＰＯ）または４日間（ＰＳ）培養した図７および図８において、黒のカラムはセンスオリゴヌクレオチドの結果を、また斜線のカラムはアンチセンスオリゴヌクレオチドＴＩ−ＡＳの結果を示す。細胞は抗−ｂｃｌ−２抗血清で標識し、ＦＡＣＳにより分析した。データは無処理６９７細胞により得られた平均蛍光度に対する相対パーセンテージで表した。
図９および図１０は６９７細胞を１００μｌのＰＯ ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前および処理した後の典型的なＦＡＣＳ結果を示している。Ａ：抗−ｂｃｌ−２抗血清（斜線部分）またはノーマルウサギ血清対照（白い部分）のいずれかで標識した無処理の６９７細胞；Ｂ：抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体（斜線部分）または負の調節抗体（白い部分）のいずれかで標識した無処理の６９７細胞；Ｃ：ノーマルｂｃｌ−２ ＴＩ−ＡＳ（白い部分）またはＴＩ−ＡＳ（斜線部分）オリゴデオキシヌクレオチドのいずれかとともに２日間培養し、抗−ｂｃｌ−２抗体で標識した６９７細胞；Ｄ：ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチド（Ｃで示されている）とともに培養し、ただし抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で標識した６９７細胞。
図７および図８に示されているように、ＰＯおよびＰＳ ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＬＡ−ＤＲ（図９および図１０）およびその他の調節抗原の発現レベルを変えることなく、ｂｃｌ−２タンパクのレベルを特異的な濃度依存性で減少させた。たとえば１５０μＭにおいて、ＰＯアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２蛍光を約７５−９５％減少させ、一方対照センスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２タンパクのレベルを１０−２０％だけ減少させた（図７）。同様に、ＰＳアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド２５μＭとともに４日間培養した６９７細胞は、ｂｃｌ−２蛍光が約７０％減少した。これに対し、センスＰＳオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳは、本検定における測定ではｂｃｌ−２タンパクレベルを約１５％減少させただけであった（図８）。
重要性
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにおいては、各ヌクレオチド間のホスフェート結合中の非ブリッジ酸素原子のひとつはイオウ原子で置換することができる。この修飾によりホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはヌクレアーゼによる開裂に対して極端に抵抗性が与えられる。スタインら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９−３２２１（１９８８）。酸素原子をイオウ原子に置換しても、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは水溶液への良好な溶解性を維持し；ＲＮＡ−オリゴデオキシヌクレオチド複合体の溶解温度がいくらか低下するものの良好にハイブリッド化し；また広く使用されているホスホロアミド類とのオリゴデオキシヌクレオチド自動合成法で簡便に合成することができる。
アンチセンスｂｃｌ−２ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類は、それらのノーマル酸素ベースのものに比べて白血病細胞成長のより有効な抑制剤であることが判明している。無血清状態で試験した場合、これらのオリゴデオキシヌクレオチド類は約１５−２３μＭの濃度で細胞増殖を半減させるのに対し、ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは１２５−２５０μＭで５０％の抑制を達成する。この知見は、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの細胞性ヌクレアーゼに対する感受性の低さ、またはその他のメカニズムに起因するものとして説明することができるであろう。たとえば、ｍＲＮＡとホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドとのハイブリッド化はＲＮＡアーゼＨ様活性に関わるメカニズムによって劣化が促進されることになろう。
抑制作用が増加するにもかかわらず、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは配列特異性を維持した。試験した濃度（２５μＭ以下）においては、これらのオリゴデオキシヌクレオチドのセンス型は白血病細胞の成長にほとんど効果が無かった。ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはともに、当初非細胞毒性メカニズムにより白血病細胞の増殖を抑制したようである。培養の最初の数日間、細胞の複製は抑制されたが、細胞死の増加とは一致しなかった。しかしながら、培養の後期（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドについては４−５日目、ホスホロチオエートについては６−８日目）では細胞生存性は低下した。
ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制動態の比較において、後者の物質は作用の開始時点が遅いことが判明した。ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞増殖の最大抑制は培養開始後２日目に起きたが、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは最大抑制を達成するのに４−７日間必要とした。
本発明の実施例により、ｂｃｌ−２遺伝子を発現するヒトリンパ腫/白血病細胞およびその他のタイプの癌細胞の抑制に対するアンチオリゴマー類の有用性が示された。ヒトｂｃｌ−２遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも有効部分に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＲＳ１１８４６ヒト小胞性リンパ腫細胞ｔ（１４；１８）染色体転座および高いｂｃｌ−２発現、６９７ヒトプレＢ細胞白血病細胞（高いｂｃｌ−２発現）、ＪＵＲＫＡＴヒト急性リンパ球白血病細胞（中度ｂｃｌ−２発現）、ノーマルヒトリンパ球（中度ｂｃｌ−２発現）ならびにネズミ線維芽胞（低ｂｃｌ−２発現）の成長を抑制することが判明した。ｂｃｌ−２アンチセンス薬剤は多くのタイプの細胞の成長を抑制することができるが、ｔ（１４：１８）リンパ腫および白血病細胞は敏感であり、悪性細胞の特異的な抑制が可能となる。
以下の実施例に示されているように、本発明には各種のＤＮＡ相同体を使用することができる。たとえば、ホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、ならびにホスホジエステル類およびホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド類の組み合わせを含む混合オリゴマー類である。また本発明にはＲＮＡ相同体も使用することができるのは当然である。
【００５８】
実施例１５
メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマー類はＤｏＨＨ２リンパ腫細胞の死を誘発する
本検討の目的はリンパ腫細胞の生存を抑制するアンチコードオリゴマー類の各種の相同体の効果を調べることにある。
ＤｏＨＨ２はｂｃｌ−２遺伝子を賦活するｔ（１４：１８）−転座を含むヒトリンパ腫細胞種である。ＤｏＨＨ２細胞を３日間オリゴマーを加えずに、または各種濃度のアンチセンス（Ａｓ）およびスクランブル（Ｓｃ）メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）オリゴマーの存在下で３日間培養した。細胞の生存性はトリパンブルー色素排除法により評価し、データはオリゴマー無しで培養したＤｏＨＨ２細胞に対する相対パーセンテージで示した。ＭＰ/ＰＯオリゴマーはｂｃｌ−２オープンリーディングフレームの最初の６つのコドンを標的とする１８−ｍｅｒであり、オープンリーディングフレームの中の５つの内部結合はホスホジエステルであり、フランキングヌクレオシドはメチルホスホネートである。これらの結果は、
これらのアンチコードオリゴマー相同体はリンパ腫細胞生存に効果を有する特異的な抑制剤であるということを示している。
【００５９】
実施例１６
メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）キメラオリゴマー類はＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の成長を抑制する
本検討の目的は本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体がｂｃｌ−２を高度に発現する固体腫瘍細胞の生存を抑制する効果を調べることにある。
ＭＣＦ−７は比較的高レベルのｂｃｌ−２タンパクを含むヒト胸（乳房）アデノカルチノーマ細胞種である。この細胞をＭＰ/ＰＯオリゴマーの存在下または非存在下で９６穴マイクロタイタープレートで、１穴当り４０００個で培養した。次に、１穴当りの相対細胞数を、新しく接種した無処理のＭＣＦ−７細胞を使用して作成した標準曲線に基づいて、ＭＴＴアッセイにより推定した。アンチセンス（Ａｓ）およびスクランブル（Ｓｃ）ＭＰ/ＰＯオリゴマーは実施例１５に述べたものと同様である。データは判定のための平均＋/−標準偏差を表す。
この結果は、本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体によるｓｏｌｉｄ腫瘍細胞の成長の配列特異的な抑制を示している。
【００６０】
実施例１７
アンチコードｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化
本検討の目的は、コンピュータで作成した配列の本願請求の範囲の各種のアンチコード分子を細胞に接触することによって細胞の生存を抑制する場合に、最適のｍＲＮＡ標的部位または配列部分を調べることにある。
ＤｏＨＨ２リンパ腫細胞をｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの異なった部位を標的とする種々の濃度のオリゴマーで処理した。ＡＴＧオリゴマーは翻訳開始部位を標的とし、オープンリーディングフレームの最初の６つのコドンに相補性である。Ｄｓｃｏｒｅ２３（図２２中のＳｃ２３）およびＤｓｃｏｒｅ７２（図２３中のＳｃ７２）オリゴマーはｍＲＮＡの５'非翻訳領域部位を標的とする。スクランブル（Ｓｃ）オリゴマーは同じ長さと塩基組成を有するがスクランブル型配列の負の対照である。すべてのオリゴマーはホスホジエステル（ＰＯ）/ホスホロチオエート（ＰＳ）キメラとして調製され、最後の（３'）２つの内部ヌクレオシド結合だけがホスホロチオエートである。オリゴマーを直接培養液に添加し、３日後にＭＴＴアッセイにより相対生存細胞数を推定した。データは平均＋/−標準偏差を表す。
これらの結果は、５'非翻訳領域を標的とするＤｓｃｏｒｅ２３オリゴマーは本実施例で試験したその他のアンチコードオリゴマー類に比べて、優れた細胞生存抑制作用を有することを示している。
【００６１】
実施例１８
ｂｃｌ−２遺伝子発現のアンチセンス介在による低減の腫瘍細胞の化学療法抵抗性の逆転
以下の検討はｂｃｌ−２遺伝子の発現を指向したアンチコードオリゴマーが化学療法抵抗性を減少（逆転）させるものかどうか、すなわちアンチコードオリゴマーがｂｃｌ−２遺伝子を発現する癌腫瘍性細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増加させるかどうかを検討するために行ったものである。
多様な癌化学療法剤、たとえば下記に限定されるわけではないが、Ａｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、アドリアマイシン、エトポシド、ミトザントロン、２−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、およびアルキル化剤などの効能に対して、高レベルのｂｃｌ−２タンパクはリンパ腫細胞の相対的抵抗性を増加させるように思われる（ミヤシタ，Ｔおよびリード，Ｊ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５４０７，１９９２年１０月１日）。これらの薬剤は多様な生化学的作用メカニズムを有するが、これらはすべて共通してアポプトシスを起こさせる内因性の細胞経路を賦活することによって最終的に癌細胞の死を引き起こさせる能力を有するものと考えられている（イーストマン，Ａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ２：２７５（１９９０））。本願請求の範囲のアンチコード分子およびそれらの相同体はここで使用されているように、代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド、および抗生物質などの癌化学療法剤、ただしこれらに限定されるものではないが、の感受性を増強させる目的に有効であると考えられている。
代謝拮抗物質としては、特に限定されないが、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、２−クロロデオキシアデノシンなどが含まれる。
アルキル化剤としては、特に限定されないが、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル、およびナイトロジェンマスタードなどが含まれる。
植物アルカロイドとしては、特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＶＰ−１６などが含まれる。
抗生物質としては、特に限定されないが、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンなどが含まれる。その他の癌化学療法剤としては、ＤＴＩＣ（デカルバジン）、ｍＡＭＳＡ、ヘキサメチルメラミン、ミトロキサントロン、タキソール、エトポシド、デキサメタゾンなどが含まれる。
本検討においては、３'−最内部ヌクレオシド結合だけがチオエート結合（ＰＯ/ＰＳ）であるヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステルを使用した。このＰＯ/ＰＳオリゴマーは３'エキソヌクレアーゼ（血清の基本的ヌクレアーゼ活性）に対して抵抗性があり、通常標的ＲＮＡとともにより安定な異種複合体を形成する。
細胞内コンパートメントへのオリゴマーの効果的な取り込みとその後の放出を改善するためにカチオン脂質を使用したが、これは本願請求の範囲のアンチコードオリゴマーの薬学的キャリヤの一例である。
本検討で使用したアンチセンス（ＡＳ）およびスクランブル（ＳＣ）１８'ｍｅｒオリゴヌクレオチドを調製し、精製する方法は上記の一般的な方法およびキタダら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ＆Ｄ，３：１５７（１９９３））に記述されている。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをホスホロアミデートの化学とヨウ素による酸化を利用して１０−１５マイクロモルスケールで合成し、次いでＣ18−逆相カラムを使用して精製した。ほとんどの場合、非特異的な細胞毒性活性を除去するためにオリゴマーをさらに５回エタノール沈降させ、次いで乾燥し、滅菌したＨＬ−１培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に１−１０ｍＭで再懸濁した。この溶液のｐＨは、培地中のフェノールレッド標示試薬が本来の色に回復するまで、１−１０Ｍ ＮａＯＨを使用して
調節した。
使用した基本的オリゴマーは１８−ｍｅｒで、以下のいずれかの配列を有するものである：
Ｉ．ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７）、これはヒトｂｃｌ−２オープンリーディングフレーム（配列番号１９）の最初の６つのコドンのアンチセンスである；または
ＩＩ．ＴＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＣＴ（配列番号１８）、これは対照として使用したスクランブル型である。
ｂｃｌ−２遺伝子またはｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドいずれかを発現する腫瘍細胞を作るために標準形質転換法を使用した。ベクターもまたｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドをコードすることができると考えられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする特定のヌクレオチド配列は、腫瘍細胞中のｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現し、かつ癌化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるか、または癌化学療法剤で処理した場合に腫瘍細胞を殺すのに充分な配列を選択する以外は重要ではない。ベクターにコードされたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが腫瘍細胞中のｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分な条件で発現されることだけが必要である。遺伝子をほ乳類細胞に転移させるためのベクターならびに、特に発現プラスミドを調製する方法は、分子生物学の分野における通常の手法による。本発明で使用する発現プラスミドを調製する一般的な方法を開示した基本的なテキストはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，サンブルックら編，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）であり、特に培養ほ乳類細胞へのクローン化遺伝子の発現に関する第１６章である。以下の実施例１５Ｃ−Ｄは、本発明で使用した発現プラスミドを調製する特定の方法を記述したものである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを転移するのに用いられる特定のベクターは決定的なものではなく、それらベクターとしてはラムダおよび関連ファージまたは糸状ファージ由来のベクターでよい。必要なことは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし転移されるヌクレオチド配列が、腫瘍細胞中でｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分な条件下で形質転換腫瘍細胞中に発現されることだけである。本発明は、リコンビナントレトロウイルスベクター（リードら，Ｔ細胞リンパ細胞種におけるｂｃｌ−２介在腫瘍化：Ｃ−ＭＹＣとの相乗効果およびｂｃｌ−２アンチセンスによる抑制，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：３６６０（１９９０））のような他のベクターの介在によって、染色体外の位置（たとえば、発現プラスミドから）または宿主ゲノム自体、すなわち組み込まれた位置、のいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を含むものである。
【００６２】
Ａ．リンパ腫細胞の１８−ｍｅｒ合成ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる処理
散在性、組織球腫、非ホジンスリンパ腫を使用して得られたリンパ腫細胞種ＳＵ−ＤＨＬ−４（エプスタインら、Ｂ５ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織で反応性のある２つの新しいモノクローナル抗体（ＬＮ−１、ＬＮ−２）、小胞状センターとマントルゾーンを有するヒトＢリンパ球および派生腫瘍．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１０２８（１９８４））およびｔ（１４；１８）転座を含むものを、ｂｃｌ−２ｍ ＲＮＡの最初の６つのコドンへの結合を標的とするために１８−ｍｅｒ合成ｂｃｌ−２−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドで処理した。対照として、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を、ＡＳオリゴマーと同じヌクレオシド組成を有するが塩基の配列はスクランブル型（ＳＣ）である１８−ｍｅｒを含む各種の対照オリゴマーで処理した。
【００６３】
１ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ユニット/mLペニシリン、および１００μｇ/mLストレプトマイシンおよび５μｇの精製オリゴヌクレオチドまたは３０μｇのリポフェクチン（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM）[Ｎ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル]−ｎ，ｎ,ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１ｗ/ｗ混合物]]を添加した１．５mLのＨＬ−１無血清培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のアリコートを混合し、３mLのＨＬ−１培地中に０．７５×１０6 ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞に加えた。細胞は次に、５％ＣＯ2/９５％空気の湿潤環境下、３７℃で２４穴プレート（２mL/穴）でイムノブロットおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイのために培養するか、またはＭＴＴアッセイのために９６穴平底マイクロタイタープレート（０．１mL/穴）で培養した。マイクロタイター培養の細胞の場合は、典型的には１日後に各種の化学療法剤を添加または添加せずに０．１mLの追加ＨＬ−１培地を加え、さらに細胞を２日間培養し、ＭＴＴアッセイを実施した。
【００６４】
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む緩衝液中に溶解し、サ
ンプルのタンパク含有量を規定量（２５μｇ）に調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）によるタンパクのサイズ分画を行い、リードら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１）に記載のイムノブロットアッセイを行うためにニトロセルロースフィルターに移した。予備実験において全タンパク量として２５μｇを含む溶液アリコートはアッセイの直線部分に入ることが確認された。ブロットは最初に、ヒトｂｃｌ−２タンパク（前記配列番号２１）のアミノ酸（ａａ）４１−５４に相当する合成ペプチドに向けられた０．１％（ｖ．ｖ）のウサギ抗血清とインキュベートし、次いで２．８μｇ/mLのビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）とインキュベートした。次にｐ２６−Ｂｃｌ−２に対応するバンドをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジン−ビオチン複合試薬（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ Ｉｎｃ．）および３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して発色させ、可視化した。次に、着色したブロットをＢｃｌ−２タンパク（配列番号２１）のａａ６１−７６に向けられた第２の抗−Ｂｃｌ−２抗体とインキュベートし、さらに０．２５μＣｉ/mLの＊125Ｉ−タンパクＡとインキュベートした。Ｂｃｌ−２バンドをブロットから切り取り、ガンマ計測にかけた。
【００６５】
Ｂｃｌ−２タンパクのミトコンドリア位置にもかかわらず、ｐ２６−Ｂｃｌ−２のレベル以外は同一の細胞においてミトコンドリア酵素によるＭＴＴ染色の低下には差が見られなかった。これらの比較は、１つはリコンビナントｂｃｌ−２レトロウイルスにより安定的に感作された種と、他方はｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ挿入が欠質している親レトロウイルスベクターである点だけが異なる一対の指数増殖リンパ腫細胞種を使用して行われた（ミヤシタら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５４０７（１９９２）；Ｂｌｏｏｄ８１：１５１（１９９３））。
【００６６】
ｂｃｌ−２ ｍＲＨＡのアンチコード特異性の相対レベルの低下は、半定量的逆トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイにより１日以内に検出された図１１（ａ）参照。
ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を、無血清培地ｙ（１３，１９）１mL当り５μｇのカチオン脂質（リポフェクチン；ＢＲＬ/Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．）を複合化した０．８３μｇ/mLのオリゴマーとともに培養した。図８Ａにおいて、ＲＮＡ全量を１日後に細胞から単離し、ｂｃｌ−２およびグリセルアルデヒド３'−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの相対レベルを、キタダら，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲ＆Ｄ ３：１５７（１９９３）に記載のＲＴ−ＰＣＲアッセイで評価した。
【００６７】
図１１（ｂ）において、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をＰＳ（四角）またはＰＯ/ＰＳ（丸）Ａｓ−およびＳｃ−オリゴマーのいずれかのペアとともに３日間培養した。次いで、Ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルを上記のように定量イムノブロットアッセイを使用して測定し、そのデータを対照Ｓｃ−オリゴマーで処理した細胞の場合に対するパーセンテージで表した。挿入図は、Ａｓ−ＰＯ/ＰＳオリゴマーがＢｃｌ−２タンパクレベルを相対的に４１％低下させた場合の、ｐ２６−Ｂｃｌ−２およびｐ７５のクロス反応（ＣＲ）バンドのイムノブロット結果を示す。図１２においては、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の培養物にＰＳ（四角）またはＰＯ/ＰＳ（丸）オリゴマーを添加した１日後に１０-4ＭのＡｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、またはＤＥＸを添加し、３日目にＭＴＴアッセイを行ったものである。データはオリゴマーの非存在下で薬剤とともに培養された細胞の対照に対する相対パーセントで表されており、１０個の連続実験のうちの９実験の結果を表している[１つの実験でＭＴＴアッセイは失敗]。細胞生存性を評価するのにＭＴＴアッセイではなく色素排除アッセイを使用した場合にも同様の結果が、得られた[図示なし]。
【００６８】
データの平均値は横線で示されている。データの統計的分析はペアのＴ−試験（Ａｓ対Ｓｃ）によるものである。Ａｓ−およびＳｃ−オリゴマー（１５０ｎＭ）の濃度は、配列特異性を維持しながらＡｓの効果を最大にするように調節した。
開始ＲＮＡの量の変動はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析によりコントロールした。
ｂｃｌ−２タンパクの長い半減時間（約１４時間）はｂｃｌ−２タンパクのＡｓ介在による減少がｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの減少ほど劇的でないことを示すものであり、達成するのに長時間（約３日間）かかり、かつ変動が大きいようである。
【００６９】
図１１（ｂ）は、ＡＳまたはＳＣオリゴマーで処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞中のｂｃｌ−２タンパクの相対レベルを比較した１０実験をあわせた結果を示すものである。ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は６６％と高いものから１０％と低いものまでの範囲にあり、対照オリゴマーにより同様に処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の場合と比較している。Ｆ1−ベータ−ＡＴＰアーゼおよびチトクロムＣ、のような対照ミトコンドリアタンパクのレベルの違いはＡＳ−オリゴマーによって影響を受けることはなく（図示なし）、ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は特異的なものであることを示している。たとえば 図１１（ｂ）の挿入部分は、イムノブロットアッセイに採用されているウサギ抗血清の１つと交差反応する７８−ｋＤａタンパクとｐ２６−Ｂｃｌ−２との比較を示しており、対照ＳＣ−オリゴマーを受け取った細胞との対比においてｐ２６−ｂｃｌ−２のレベルは低下し、ｐ７８のレベルは低下しないことを示している。
【００７０】
Ｂ．ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーで処理した場合の癌化学療法剤に対する細胞感受性の効果
本検討はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をｂｃｌ−２ ＡＳ−オリゴマーで処理した場合に、抗癌剤であるＡｒａ−Ｃ，ＭＴＸ，およびＤＥＸなどの癌化学療法剤による細胞死に対する相対的な感受性を増加させるものかどうかを調べるために行った。
以前の対照検討においてｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞成長および生存に、少なくとも培養の最初の３日間はわずか、またはまったく効果のないことが示されている（キタダら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ＆Ｄ ３：１５７（１９９３））。これらのリンパ腫細胞ならびにその他の細胞におけるｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は、典型的には、培養中の細胞から血清成長ファクターが取り除かれないかぎり、細胞死滅速度を加速しない（リードら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３６６０（１９９０））。
【００７１】
本検討においては、予備試験において高用量（１０-4）のＡｒａ−Ｃ，ＭＴＸ，またはＤＥＸによる４日間の治療後にも９０％以上のＳＵ−ＤＨＬ−４細胞が生存することが示されているが、これはおそらくそれらのｂｃｌ−２タンパクの高いレベルによるものと考えれる（図示なし）。しかしながら、これらの濃度においてはすべての薬剤は基本的にＳＵ−ＤＨＬ−４細胞増殖の完全な抑制を誘発し、ｂｃｌ−２が薬剤を細胞毒性から細胞抑制性へ転換させるのと一致している。ＡＳおよびＳＣオリゴマーの比較では、ｂｃｌ−２ＡＳ処理はこれらのリンパ腫細胞のＭＴＸおよびＡｒａ−Ｃに対する感受性を著しく増強し、またＤＥＸに対しても多少の増強を示した（図１２）。
【００７２】
結果にいくらかのばらつきがあるが、平均的にはＭＴＸまたはＡｒａ−Ｃで処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の培養物へのｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの添加は、本発明のｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーを導入せずにそれらのいずれかの薬剤を単独で（ＡＳ対ＳＣの場合Ｐ＜０．００２）使用した場合に比べて７９−８４％大きな抑制効果（生存細胞数の減少）をもたらした。ＤＥＸ処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞（Ｐ＝０．０１）において統計的に重要な結果が得られた。対照オリゴマー処理した細胞で生存細胞数の２０−３０％の減少が観察されたことは、配列の非特異性の程度を反映しているものと考えられるが、これは多分細胞へのオリゴマーの送出を容易にするためにカチオン脂質を使用したことに関係するものであろう。
【００７３】
Ｃ．ヒトｂｃｌ−２タンパクをコードする発現プラスミドを有する形質移入細胞の化学療法剤に対する感受性に対する効果
化学療法抗ガン剤に対する感受性を高めるためのｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの配列特異性を更に確認するため、ヒトｂｃｌ−２タンパクまたはｂｃｌ−２と２２％しか相同性を有しないｂｃｌ−２のウイルスホモローグであるＢＨＲＦ−１のいずれかをコードする発現プラスミドを安定的に移入させたインターロイキン−３（ＩＬ−３）依存のマウス造血細胞株３２Ｄ．Ｃ１３を用いた研究を行った。３２Ｄ．Ｃ１３細胞はペンシルバニア州フィラデルフィアのウィスター研究所のジョバンニ・ロベラ（Giovanni Rovera ）博士から入手した。
【００７４】
３２Ｄ細胞のオリゴマー／カチオン脂質複合体による処理は、５０単位／mLのマウスリコンビナートＩＬ−３（ｒｌＬ−３）をＨＬ−１培地に含有させ、初期細胞濃度を１０5/mLとし、また、細胞をオリゴマーに暴露してから３０分後に複製欠陥アデノウイルスｄｌ３１２（ＭＯＩ＝２００）を加え、ＤＮＡのエンドソームからの脱離を容易にしたことを除けば上記と同じであった［ヨシムラ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２３００、（１９９３）］。
【００７５】
ヒトｐ２６−Ｂｃｌ−２またはＥＢＶ ｐ−１９−ＢＨＲＦ−１（タカヤマＳらより提供）をコードする発現プラスミドを安定的に移入させた３２Ｄ細胞を：ＩＬ−３とＰＯ／ＰＳオリゴマーを含む培地（１０5／mL）中で３日間培養し、ヒトＢｃｌ−２タンパクレベルを減少させた。その後、本細胞をオリゴマーのみ（Ｃ）で、または各種濃度のＭＴＸと組み合わせて再処理し、２日後にＭＴＴアッセイにより相対生存可能細胞数を調べた。データは三重決定をするための平均＋／−標準偏差を表し、ＭＴＸを受け取らなかった細胞に対する相対％で表している。１０-6〜１０-4ＭのＭＴＸについてのデータの統計解析は、変数の二方向解析法（フィニー（Finney）、Ｄ．Ｊ．「生物アッセイにおける統計手法」、ｐ．７２，１９７８（第３版、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ）によって行った。比較結果を色素排除試験により得た［図示なし］。
【００７６】
３２Ｄ−ＢＣＬ−２細胞内のヒトｂｃｌ−２構成体に由来するＲＮＡが、ｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの標的であった。一方、ＢＨＲＦ−１発現プラスミドに由来するＲＮＡは標的ではない。従って、ＢＨＲＦ−１を発現する３２Ｄ．Ｃ１３細胞の細胞毒性薬剤に対する化学的感受性は、ＡＳ処理の影響は受けていないはずである。
予備実験によれば、ＩＬ−３を３２Ｄ．Ｃ１３細胞から離脱させると、内因性マウスｂｃｌ−２タンパクのレベルが減少し、細胞は死枯した。ｂｃｌ−２とＢＨＲＦ−１は、ＩＬ−３が存在しない状態で３２Ｄ．Ｃ１３細胞の生存を同程度にサポートした。これらタンパクを高レベルで含む３２Ｄ．Ｃ１３細胞の増殖率は、ＩＬ−３の存在下においてはほぼ同じであった。従って、これらの変数を化学的感受性の差異を説明するものとして除外している。
【００７７】
図１３および図１４は各種濃度のＭＴＸに対する３２Ｄ−ＢＣＬ−２と３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞の感受性を比較している。ｂｃｌ−２ ＡＳ−オリゴマーによる処理の結果、濃度が１０-6〜１０-4Ｍ（ＡＳ対ＳＣの場合Ｐ＜０．００１）のＭＴＸによる阻害に対する３２Ｄ−ＢＣＬ−２細胞の感受性について配列特異的な増加がみられた。これに対し、ｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーによる処理は、コントロールＳＣ−オリゴマー（図１３および図１４）に比べ、３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞のＭＴＸに対する感受性については著しい差異はもたらさなかった。これらのデータは細胞毒性薬剤に対する化学的感受性へのｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーの効果は配列特異的であることを示している。更に、ｂｃｌ−２センス、ＡＳと同じヌクレオシド組成を有するその他の混合配列（scrambled sequences）、および全く無関係な配列を有するオリゴマーを含むその他のいくつかの対照オリゴマーは、全て本細胞の化学感受性にはほとんど効果を有しなかった（図示なし）。
【００７８】
上記の結果は、ｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーが配列特異的なｂｃｌ−２ｍＲＮＡとｂｃｌ−２タンパクレベルの減少をもたらし、またこれらの結果は抗ガン剤などの化学療法剤に対する感受性の向上に関連していることを示したものである。化学療法剤により死滅させられた腫瘍細胞の量は、本発明のｂｃｌ−２ＡＳオリゴマー不在下での同じ量の化学療法剤により死滅させられた腫瘍細胞の量よりも多かった。
【００７９】
Ｄ．ヒトｂｃｌ−２タンパクをコードする発現プラスミドを有する形質移入細胞の化学療法剤に対するリンパ腫細胞の感受性に対する効果
別の方法を用いて、他のトランスローケーションｔ（１４；１８）含有リンパ腫株であるＲＳ１１８４６中の重金属応答性ヒトメタロイオネインＩＩＡプロモーターを使用した誘発性ｂｃｌ−２ ＡＳ発現プラスミドが、ｂｃｌ−２遺伝子発現 をＡＳの媒介によって減少させ得るかどうかを調べた。ＲＳ１１８４６はカーロ・クロース（Carlo Croce ）博士から入手した（ペンシルバニア州フィラデデルフィアのウィスター研究所（ツジモトとクロース、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４（１９８６））。
【００８０】
発現プラスミドの調製は、０．９１ｋｂｐのｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ（前記中に）を、プラスミドｐＭＥＰ−４（Invitrogen, Inc.）中のヒトメタロイオネイン−ＩＩＡプロモーターの下流側のＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンチセンス（ＡＳ）またはセンス（Ｓ）配向でサブクローニングした。プラスミドｐＭＥＰ−４は、コピーエピソームを高く維持するために、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＥＢＮＡ−１遺伝子、エプスタイン−バールウイルスからのＤＮＡ複製の源を含む。
【００８１】
３０μｇのプラスミドＤＮＡを含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水中のＲＳ１１８４６細胞（５×１０6）を、エクイビオ社（Equi Bio, Inc.）のセルジェクト・エレクトロ ポーレーション装置を用いて電気穿孔（１５００μＦ、２７０ｖ／ｃｍ）した。細胞は通常の培養培地（１０％胎仔ウシ血清、１ｍＭＬ−グルタミン、５０単位／mLのペニシリン、および１００μｇ／mLのストレプトマイシン添加ＲＰＭ Ｉ−Ｌ １６４０）に１mLあたり２×１０5細胞数で戻し、２日間培養し、２００μｇ／mLのハイグロマイシンを含む培地に１mLあたり２×１０5細胞数で細胞を播種した。３週間の培養後、得られた細胞株のバルクを、濃度が１mg／mLに到達するまで（およそ４週間）２００μｇ／mLづつハイグロマイシンの濃度を連続的に増加させながら継代培養した。
【００８２】
ハイグロマイシン抵抗性ＲＳ１１８４６細胞を、０．５μＭのＣｄＣｌ2を含むＲＰＭＩ／１０％血清培地で培養し、３日後に２５μｇタンパク／レーンを用いて免疫ブロットアッセイを行った。基本的にはタナカ ＳらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１０９２０（１９９３年）およびリード（Reed）らのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１年）に記載の方法に従った。
【００８３】
図１５〜図１８に示すように、コントロール（“Ｃ”）およびｂｃｌ−２−Ａｓ（“Ａｓ”）プラスミドをＲＳ１１８４６細胞に導入し、各種時間かけて０．５μＭのＣｄＣｌ2または５０μＭのＺｎＣｌ2のいずれかを用いて発現を誘発した。追加コントロールとして、ｂｃｌ−２ ｃＤＮＡをセンス（“Ｓ”）配向した誘発性 プラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞についても分析した。ＲＳ１１８４６細胞を３日かけて誘発し、タナカらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９２０（１９９３）に記載の免疫ブロットアッセイにより、Ｂｃ１−２およびＦ1−β−ＡＴＰａｓｅタンパクの相対レベルを評価した。図１５において、ＲＳ１１８４６細胞を１０5細胞／mLで０．５μＭのＣｄＣｌ2を含む培地で培養し、１日後に１０-7ＭのＡｒａ−Ｃまたは同等容量の希釈液を加えた。相対生存可能細胞数を各種時点においてＭＴＴアッセイにより評価し、三重のサンプルについて平均＋／−Ｓ．Ｄ．を計算した。図１６〜１８においては、ＲＳ１１８４６細胞は各種濃度のＡｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、またはＤＥＸを加える以外は図１５と同様に培養した。データは三重サンプルについての平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。変数の二方向解析により統計計算を行った。ＲＳ１１８４６細胞はグルココルチコイド・レセプターを失っているので、ここではＤＥＸは陰性コントロールとして働いた。
【００８４】
予備実験の結果、ＲＳ１１８４６細胞は０．５μＭまでのＣｄＣｌ2またはＺｎＣｌ2が培養に添加されても１週間耐えることが示され。成長速度に多少の低下がみられたが、本質的には細胞生存率は減少しなかった（結果は略）。
【００８５】
重金属誘発がない場合には、コントロールまたはｂｃｌ−２ ＡＳプラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞におけるｂｃｌ−２タンパクの相対レベルは似通っており、免疫ブロットアッセイ結果（結果は略）の示すとおりであった。０．５μＭのＣｄＣｌ2またはＺｎＣｌ2を加えた場合、ｂｃｌ−２タンパクの減少がＡＳ−発現細胞において２日で明白となり、コントロールＲＳ１１８４６細胞に対して３０−４０％の最大抑制が３日〜４日で得られた。
【００８６】
図１５は０．５ｍＭのＣｄＣｌ2に暴露してから３日後のＲＳ１１８４６細胞に関する免疫ブロットデータの一例を示す。このデータによれば、対照プラスミドを有するＲＳ１１８４６細胞に比べ、ＡＳ−プラスミドを含む細胞におけるｂｃｌ−２タンパクのレベルは減少している。コントロールのミトコンドリア・タンパクＦ1−β−ＡＴｐａｓｅの相対レベルは、全ての細胞株において類似し、ｂｃｌ−２タンパクレベルの配列特異的変化と一致した。
コントロールまたはｂｃｌ−２−Ａｓプラスミドのいずれかを含むＲＳ１１８４６細胞を、０．５μＭのＣｄＣｌ2または５０μＭのＺｎＣｌ2内で各種時間培養した場合、これら２つの細胞株の成長速度には著しい差はみられなかった（図１１（ｂ））。従って、Ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は、それ自身ではＲＳ１１８４６細胞の増殖または生存を損なうことはなかった。
【００８７】
コントロールＲＳ１１８４６細胞の培養物に低量のＡｒａ−Ｃ（１０-7Ｍ）を加えた場合、正味生存可能細胞数に若干の減少がみられただけであった。これは、これらｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞中の高レベルＢｃｌ−２タンパクによるもとの思われる。これに対し、１０-7Ｍ Ａｒａ−Ｃをｂｃｌ−２−ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞の培養物に加えると著しい抑制効果があった（図１１（ｂ））。しかし、Ａｒａ−Ｃは、対照プラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞と同じ条件下で直接比較した場合（結果は略）、ＭＴプロモーターの重金属誘発不在下では、ｂｃｌ−２ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞に対する効果を示さなかった。図１２は、ｂｃｌ−２−ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞で観察されたＡｒａ−Ｃに対する高感受性が、広い範囲の薬剤濃度にわたって（Ｐ＜０．００１）いたことを示している。ｂｃｌ−２−ＡＳ発現プラスミドの重金属誘発もまた、ＲＳ１１８４６リンパ腫細胞のＭＴＸ（Ｐ＜０．００１）に対する相対感受性を著しく増加させたが、ＤＥＸに対する相対感受性を増加させることはなかった。グルココルチコイド・レセプター結合アッセイの結果、ＲＳ１１８４６細胞はこれらステロイドホルモンのレセプターを失っており［結果は略］、このようにして、ｂｃｌ−２タンパクレベルの、ＡＳ介在による減少だけではこれらリンパ腫細胞の成長あるいは生存を妨げるには不十分であることを示す特異性の制御を提供している。
【００８８】
本発明は、ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルの平均３０〜４０％の減少が、リンパ腫細胞の感受性、特に従来の抗ガン剤などの化学療法剤に対するｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞株の感受性を著しく高めたことを、複数のアンチコード手法を用いて示した。これら実施例は請求の範囲に記載したアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入すると、ｂｃｌ−２発現の減少をもたらし、新生物細胞の化学療法剤または抗ガン剤に対する化学的感受性を増大させることを示した。
【００８９】
従って、本発明は抗ガン剤を含む化学療法剤と腫瘍細胞を接触させる前にｂｃｌ−２遺伝子発現を減少させる、またはＢｃｌ−２タンパク機能を損なわせるアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することにより腫瘍細胞を死滅させる方法を達成した。従来の抗ガン剤は生存可能な悪性細胞数を減少させ、また死滅させた腫瘍細胞の量は、アンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入しない状態で同量の薬剤により死滅させられたであろう量よりも多かった。以上、本発明の実施例を開示したが、本開示は説明のためのものであり、その他各種変更、改造等を本発明の範囲内で行ってもよいことは当業者には明白である。従って、本発明はここに説明した特定の実施例に限定されるものではなく、以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】各種濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＴＩ−ＡＳ：（ａ）、ＳＤ−ＳおよびＳＤ−ＡＳ：（ｂ））が細胞増殖阻害に及ばす影響を示すグラフである。
【図２】各種濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＴＩ−ＡＳ：（ａ）、ＳＤ−ＳおよびＳＤ−ＡＳ：（ｂ））が細胞増殖阻害に及ばす影響を示すグラフである。
【図３】アンチセンス正常オリゴデオキシヌクレオチドおよびフォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖阻害の濃度依存性を示すグラフである。培養物に対するオリゴデオキシヌクレオチド添加は次の通りである：ＴＩ−ＡＳフォスフォロチオエート（○および○；２つの別個の実験）、ＴＩ−Ｓフォスフォロチオエート（△）、ＴＩ−ＡＳ正常（□）、およびＴＩ−Ｓ正常（△）。
【図４】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を標的とした６つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Oligo １〜６は、配列番号８〜１３に対応する）のゲル電気泳動像である。
【図５】ＲＳ１１８４６細胞のオリゴヌクレオチド処置によってもたらされたＤＮＡの断片化の程度を示す。（ａ）は翻訳開始部位を標的としたオリゴヌクレオチドの効果を示す。（ｂ）はｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの５'−キャップ領域を標的としたオリゴヌクレオチドの効果を示す（（ｂ）中の数値は、用いたオリゴマーの翻訳開始コドンから非翻訳領域への距離（塩基数）を示す）。
【図６】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害の濃度依存性を示すグラフである。
【図７】オリゴヌクレオチドで処理した細胞中のｂｃｌ−２タンパクレベルを免疫蛍光法で分析した結果を示すグラフである。
【図８】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害の濃度依存性を示すグラフである。
【図９】（ａ）および（ｂ）は、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理の前後における、６９７細胞のＦＡＣＳ像である。
【図１０】（ａ）および（ｂ）は、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理の前後における、６９７細胞のＦＡＣＳ像である。
【図１１】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡおよびｂｃｌ−２タンパクを配列特異的に減少させかつ癌化学療法剤に対するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の感受性を増大させるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【図１２】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡおよびｂｃｌ−２タンパクを配列特異的に減少させかつ癌化学療法剤に対するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の感受性を増大させるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【図１３】ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーが３２Ｄ−ｂｃｌ−２細胞の化学的感受性に及ぼす効果の差異を示す。
【図１４】ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーが３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞の化学的感受性に及ぼす効果の差異を示す。
【図１５】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１６】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１７】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１８】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１９】ＤＯＨＨ２リンパ腫細胞を死滅させるメチルフォスフォネート／リン酸ジエステルｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーを示す。
【図２０】ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の成長を阻害するメチルフォスフォネート（ＭＰ）／リン酸ジエステル（ＰＯ）キメラオリゴマーを示す。
【図２１】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【図２２】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【図２３】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本特許出願に記載された研究の一部は、合衆国国立衛生研究所の認可番号ＣＡ２６３８０による援助を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、癌の治療の分野に関するものであり、より詳細には癌のアンチコードオリゴマー治療に関する。
【０００３】
本出願は、現在放棄されている１９８８年１２月２２日に出願された出願番号第０７／２８８，６９２号の一部継続出願である１９９２年２月２１日に出願された出願番号第０７／８４０，７１６号の一部継続出願である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌治療に対する現行のアプローチは、特異性の欠如という問題を抱えている。これまで開発されてきた医薬の多くは、酵素経路をブロックするかあるいはＤＮＡとランダムに相互作用する天然物質や誘導体である。多くの癌治療医薬は治療指数が低いため、毒性によって用量を制限しなければならないという深刻な問題を有している。癌を殺す医薬の投与によって癌細胞ばかりか癌性でない正常細胞も殺されてしまう。このような有害性があるために、癌性の細胞により特異的な治療が必要とされている。
【０００５】
遺伝子の一分類である腫瘍遺伝子が癌状態の転換と維持において大きな役割を果たしているということ、およびこれらの遺伝子を避ける(turning off) かあるいはさもなければその作用を阻害することによって細胞を正常な表現型に戻すことができるということがすでに判明している。多くのヒト癌の疫学における腫瘍遺伝子の役割については、ビショップ(Bishop)の“細胞性腫瘍遺伝子とレトロウイルス”［サイエンス、２３５：３０５−３１１（１９８７）］において概説されている。リンパ腫および白血病を含む多くのタイプのヒト腫瘍においては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子が過剰発現されており、腫瘍化性と関連している可能性がある（ツジモトら、“ヒト濾胞性リンパ腫におけるｂｃｌ−２遺伝子の関与”［サイエンス、２２８：１４４０−１４４３（１９８５）］。
【０００６】
アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドは、腫瘍遺伝子の機能を取り去る潜在能力を有する特異的治療ツールの一例である。これらの短い（通常約３０塩基）一本鎖の合成ＤＮＡは標的ｍＲＮＡに対する相補的塩基配列を有し、水素結合した塩基対形成によってハイブリッド二重構造(hybrid duplex)を形成する。このハイブリダイゼーションによって、標的ｍＲＮＡのコードがそのタンパク産物中に発現することが防止され、その結果タンパク産物のその後の作用が阻害されると予想される。前記遺伝子によって発現されたｍＲＮＡ配列がセンス配列と称されることから、その相補的配列はアンチセンス配列と称する。ある場合には、ｍＲＮＡの阻害は酵素の活性部位の阻害よりもより効率的である。これは１つのｍＲＮＡ分子が多数のタンパクコピーを生じるためである。
【０００７】
インビトロでｃ−ｍｙｃタンパクの生産を特異的に阻害しヒト白血病細胞の成長を阻止するために、ｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の（アンチセンス）ｍＲＮＡに相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドが用いられてきた［ホルト(Holt)ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：９６３−９７３（１９８８年）およびウィックストローム(Wickstrom) ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：１０２８−１−３２（１９８８年）］。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）を含むレトロウイルスの特異的インヒビターとしてもまたオリゴデオキシヌクレオチドが用いられてきた［ザメクニック(Zamecnik)とステフェンソン(Stephenson)、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：２８０−２８４（１９７８）、ザメクニックら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４１４３−４１４６（１９８６年）］。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アンチコードオリゴマーおよび癌細胞の生育を阻害するための方法を提供する。リンパ球の型の一つであるリンパ腫細胞や白血病細胞の生育はアンチコードオリゴマーによってまた本発明方法によって阻害される。ヒトｂｃｌ−２遺伝子におけるｍＲＮＡセンス鎖の少なくとも有効部分に対して相補的なアンチコードオリゴマーが提供され、次いで細胞を、当該細胞の生育を阻害するのに十分な濃度でアンチコードオリゴマーと接触させる。本発明方法は、ヒトｂｃｌ−２遺伝子を発現し、かつｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有するリンパ腫／白血病細胞の生育、並びにヒトｂｃｌ−２遺伝子を発現し、かつｔ（１４；１８）染色体転座を有しないリンパ腫／白血病細胞の生育を阻害するために好適である。
【０００９】
好ましい態様によれば、アンチコードオリゴマーはプレ−ｍＲＮＡセンス鎖中の戦略部位（ストラテジックサイト）と実質的に相補的であるかあるいはｍＲＮＡに実質的に相補的である。好ましい戦略部位はプレ−ｍＲＮＡコード化鎖(coding strand) の翻訳開始部位である。あるいは別の戦略部位としては、スプライシング、輸送、または分解のための部位が挙げられる。本発明のアンチコードオリゴマーは、“生の（native）”未変性形態即ちオリゴヌクレオチドであれ誘導体形態であれ、標的であるリンパ腫あるいは白血病細胞と接触するようにされる。インビボでの治療用途では、“生の”オリゴヌクレオチドの誘導体（フォスフォロチオエート形態等）が好ましい。その理由は、ある種のアナログ（フォスフォロチオエート・アナログ等）に対する応答時間がオリゴヌクレオチドの“生の”形態のものに比較して幾分遅いことが判明しているとはいえ、この形態がより分解抵抗性であると信じられているからである。
【００１０】
好ましいアンチコードオリゴマーは本明細書でＴＩ−ＡＳ（翻訳開始アンチコードオリゴマー，translation initiation anticode oligomer）と称するものであり、ヒトｂｃｌ−２遺伝子のｍＲＮＡコード化鎖の翻訳開始部位に跨がるとともにこの領域に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドである。より好ましくはこのヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子のコード化鎖のＡＴＧ開始配列に相補的なＴＡＣ部を含有する。また好ましくは、この他にさらに前記開始配列と隣り合う(flanking)ｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の：より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。このＴＩ−ＡＳヌクレオチドは血清の存在下においても無血清の場合においても共に標的細胞の生育を効果的に阻害することが見いだされている。
【００１１】
また、アンチコードオリゴマーは、ヒトｂｃｌ−２遺伝子のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖のスプライス供与体部位中の少なくとも一有効部位に相補的なアンチセンスヌクレオチドを含有する。より好ましくはこのヌクレオチドは、ｂｃｌ−２のＧＴスプライス供与体に相補的なＣＡ部を含有し、またさらに前記スプライス供与体と隣り合うｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の、より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。
【００１２】
さらに他の態様においては、アンチコードオリゴマーはヒトｂｃｌ−２遺伝子のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖のスプライス受容体領域中の少なくとも一有効部位に相補的である。このオリゴマーは、ｂｃｌ−２遺伝子のＡＧスプライス受容体に相補的な少なくとも１つのＴＣ部を含有し、またさらに前記受容体と隣り合うｂｃｌ−２遺伝子コード化鎖の各部に相補的な２〜約１００の塩基の、より好ましくは約５〜約２０の塩基のフランキング部を含有する。
【００１３】
本発明のオリゴマーは、ｂｃｌ−２遺伝子のタンパク産物である２６ｋＤａのタンパク（ｂｃｌ−２−α）あるいは２２ｋＤａのタンパク（ｂｃｌ−２−β）のコード化部位(coding site) とオーバーラップするように選択することもできる。オリゴマーの選択は、他の遺伝子配列のプレ−ｍＲＮＡコード化鎖もしくはｍＲＮＡコード化鎖のアンチコードオリゴマーとの相同性を最小にするように行うのが好ましい。
【００１４】
従って、本発明の主要な目的は、癌細胞の成長を阻害するのに有用な新規アンチコードオリゴマーを提供することである。本発明はまた、腫瘍細胞の成長を阻害するための組成物をも包含し、この組成物は、本発明のアンチコードオリゴマーと医薬として許容される担体とを含有する。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記のアンチコードオリゴマーを用いて癌細胞の成長を阻害する方法を提供することである。次の発見が本発明の一特徴を構成する。即ち、ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルが平均３０〜４０％低減すると、リンパ腫細胞特にｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞株の、癌化学療法剤（従来の抗ガン薬を含む）に対する感受性が顕著に向上するという発見である。この低減は、腫瘍細胞内にｂｃｌ−２遺伝子から発現されたプレ−ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡのいずれかに結合するアンチコードオリゴマーを導入することによって達成された。本発明においては、２つの方法によって腫瘍細胞に前記アンチコードオリゴマーを導入している。その１つの方法においては、腫瘍細胞をアンチコードオリゴマーを含有する組成物と接触させる。他の方法においては、腫瘍細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするベクターを形質移入することである。アンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することによってｂｃｌ−２発現を低減させることができるとともに、癌化学療法剤あるいは抗ガン薬に対する新生細胞の化学的感受性を増大させることができる。
【００１６】
従って、本発明は、腫瘍細胞が癌化学療法剤と接触する前に、ｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるか若しくはＢｃｌ−２タンパクの機能を損なうアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することによって、腫瘍細胞を殺す方法を達成した。このようにすると癌化学療法剤は生存可能な悪性細胞の数を減少させ、殺された腫瘍細胞の量は、当該細胞にアンチコードオリゴマーオリゴデオキシヌクレオチドを導入しなかった場合に同量の薬剤によって殺されたであろう腫瘍細胞の量よりも多かった。
本発明の上記目的およびその他の目的は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明によれば、癌細胞の成長を阻害するため、あるいは癌細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増加させるため、あるいはまた一以上の癌化学療法剤と組み合わせるか若しくは組み合わせることなく単独で癌細胞を死滅させるためのアンチコードオリゴマーが提供される。
【００１８】
定義
本明細書においては、“アンチコードオリゴマー”とはアンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログを意味し、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合の相互作用を介してポリヌクレオチド標的配列を認識する化学種群を含む。この標的配列は一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡであることができる。
【００１９】
前記アンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、またはＲＮＡ若しくはＤＮＡのアナログであることができ、これらをアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと称する。このようなＲＮＡあるいはＤＮＡアナログの例としては、２’−Ｏ−アルキル糖修飾物、メチルフォスフォネート、フォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエート、フォルムアセタール、３'−チオフォル
ムアセタール、スルフォン、スルファメート、およびニトロキサイド基本骨格修飾物、および塩基部が修飾されているアナログが挙げられるがこれらに限定されない。加えて、オリゴマーのアナログは次のようなポリマーであることもできる。即ち、糖部分が修飾されている、あるいはその他の適切な部分によって置換されてその結果モルフォリノアナログやペプチド核酸（ＰＮＡ）（但しこれらに限定されない）を含むようにされたポリマーである［エグホルム(Egholm)ら、“ペプチド核酸（ＰＮＡ）−アキラルのペプチド基本骨格を有するオリゴヌクレオチドアナログ”（１９９２年）］。アンチコードアナログは、オリゴヌクレオチドアナログの各種タイプの混合物、あるいは生ＤＮＡまたはＲＮＡとの組合せであることができる。同時にオリゴヌクレオチドとそのアナログは単独で、あるいは一以上の追加のオリゴヌクレオチドまたはそのアナログとの組合せで用いることもできる。オリゴヌクレオチドは約１０〜１０００のヌクレオチド長であることができる。本発明においては１０〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いることができるが、好ましいオリゴヌクレオチドは約１５から約２４の塩基長のものである。
【００２０】
アンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログはまたオリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよびそのアナログを包含する［ジョン・グッドチャイルド(John Goodchild)、「オリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよび修飾オリゴヌクレオチド：その合成と性質のレビュー」“バイオコンジュゲート・ケミストリー”第１巻、第３号５月／６月（１９９０年）］。そのようなコンジュゲートは、取り込み、薬理動態、およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を有し、あるいはオリゴヌクレオチドによる標的配列の架橋や開裂を高める能力を有する。
【００２１】
本明細書においては、“細胞増殖”とは細胞の分裂速度／細胞サイクルをいう。また“成長”とは、より早い細胞分裂によって増加した細胞数およびより遅い細胞死によって増加した細胞数の双方を包含する。
本明細書においては、ｂｃｌ−２遺伝子発現とはヒトｂｃｌ−２遺伝子からのｂｃｌ−２タンパク生産をいう：例えばｂｃｌ−２遺伝子発現の低下はｂｃｌ−２タンパクレベルの低下を意味する。本明細書においては、“戦略的部位（ストラテジックサイト）”とは、請求項に記載のアンチコード分子やそのアナログと結合した時にｂｃｌ−２遺伝子の発現を阻害する部位として定義される。本明細書においては、“配列部分”とは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を指す。文脈によっては、“配列部分”がＤＮＡオリゴヌクレオチドやＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の一部を指すこともある。
【００２２】
コントロールされない細胞増殖は癌性のあるいは異常な細胞型に対するマーカーである。正常で非癌性の細胞は、細胞型によって特徴付けられる頻度で規則的に分裂する。ある細胞が癌性の状態に転換すると、その細胞は制御不能に分裂・増殖する。増殖の阻害によって細胞の制御不能な分裂が調節される。細胞分裂の拘束は、しばしば非癌性状態への復帰に関連している。
【００２３】
ｂｃｌ−２（Ｂ細胞リンパ腫／白血病−２）と命名されたヒト遺伝子は幾つかの共通リンパ腫腫瘍の疫学に関連付けられている。クロース(Croce) らによる「ヒトＢおよびＴ細胞新生物の分子的基礎」（“ウイルス腫瘍学の進歩”、７：３５−５１、Ｇ．クライン(Klein) 編、ニューヨーク：レイヴン・プレス、１９８７年を参照。ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現は、最も濾胞性であるＢ細胞リンパ腫および多くの大細胞非ホジキンリンパ腫を含む、ｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有するすべてのリンパ腫において見いだされてきた。ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現はまた、ｔ（１４；１８）染色体トランスロケーションを有しないある種の白血病においても見いだされてきた。このような白血病には、慢性リンパ性白血病急性の殆どの症例、多くのプレ−Ｂ細胞型のリンパ性白血病、神経芽細胞腫、鼻咽頭カルチノーマ、および多くの前立腺、胸部、および大腸のアデノカルチノーマが含まれる［リード(Reed)ら、“神経芽細胞腫および神経起源のヒト腫瘍細胞株におけるｂｃｌ−２ガン原遺伝子の差別的な発現”、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１年）；ユニス(Yunis) ら、“大細胞リンパ腫の予後におけるｂｃｌ−２およびその他のゲノム変更”、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．、３２０：１０４７；カンポス(Campos)ら、“急性骨髄性白血病におけるｂｃｌ−２タンパクの高発現は化学療法に対する低応答に関連する”、Ｂｌｏｏｄ、８１：３０９１〜３０９６（１９９３年）；マクダネル(McDonnell) ら、ガン原遺伝子ｂｃｌ−２の発現およびアンドロゲン独立性前立腺ガンの出現への関与” 、Ｃｎａｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６９４０〜６９４４（１９９２年）；ルー(Lu) Ｑ−Ｌら、“エプステイン−バールウイルス関連性鼻咽頭カルチノーマにおけるｂｃｌ−２ガン原遺伝子の発現”、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５３：２９−３５（１９９３年）；ボンナー(Bonner)ら、“提唱された形態学的および分子論的配列に関連させたｂｃｌ−２ガン原遺伝子と消化管粘膜上皮腫瘍悪化モデル”、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４３Ａ（１９９３年）］。
【００２４】
次の説明に限定されるものではないが、本発明は正常な細胞死に関連する細胞メカニズムを利用するものである。細胞の多くのタイプは有限の寿命を有し死ぬことがプログラムされているため、細胞分裂速度の増加によるというよりむしろ正常細胞の死亡のメカニズムにおける欠陥によって細胞が制御不能に蓄積することもある。ｂｃｌ−２遺伝子は、細胞分裂を加速するのではなく主として細胞の生存を延長することによってガンの病因に寄与している。
【００２５】
本発明で好適に用いることができるアンチセンスオリゴマーは２〜２００ヌクレオチド塩基長のヌクレオチドオリゴマーであって、より好ましくは１０〜４０の塩基長、さらに好ましくは２０塩基長のものである。オリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位、供与およびスプライシング部位、あるいは輸送や分解のための部位等、ｂｃｌ−２のプレ−ｍＲＮＡに沿った戦略部位に相補的なオリゴヌクレオチドから選択するのが好ましい。
【００２６】
そのような戦略部位で翻訳をブロックすることが機能的なｂｃｌ−２遺伝子産物の形成を防ぐ。しかしながら、アンチコードオリゴマーのいかなる組合せも、またそのような組合せの一部分も（例えば細胞増殖を阻害するｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡに相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド）、本発明においては好適に用いうるものであることが理解されるべきである。例えば、ｂｃｌ−２ ＲＮＡに隣接したあるいは隣接しないストレッチの配列部分に相補的なオリゴヌクレオチドは細胞増殖を阻害し、よって本発明で好適に用いることができるであろう。
本発明において用いるアンチコードオリゴマーはまた、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに沿う戦略的部位またはその他の部位の配列部分と相補的であるか実質的に相補的なオリゴヌクレオチドに隣接するオリゴヌクレオチドを包含してもよい点を理解するべきである。隣接する（フランキング）配列部分は好ましくは約２〜約１００塩基、より好ましくは約５から約２０塩基長である。アンチコードオリゴマーは、他の遺伝子からのプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡコード化鎖に対するアンチコードオリゴマー同士の相同性を最小にするために、他の遺伝子のプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡに共通に見いだされることのないプレ−ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡの配列部分に相補的であることが好ましい。
好ましいアンチセンスの、あるいは相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを表１に示す。
【００２７】
（表１）
ｂｃｌ−２ オリゴデオキシヌクレオチド
翻訳開始アンチセンス(TI-AS) 3′…CCCTTCCTACCGCGTGCGAC…5′
ｂｃｌ−２ 5′…CTTTTCCTCTGGGAAGGATGGCGCACGCTGGGAGA…3′
スプライス供与体アンチセンス(SD-AS) 3′…CCTCCGACCCATCCACGTAG…5′
ｂｃｌ−２ 5′…ACGGGGTAC…GGAGGCTGGGTAGGTGCATCTGGT…3′
スプライス受容体アンチセンス(SA-AS)3′…GTTGACGTCCTACGGAAACA…5′
ｂｃｌ−２ 5′…CCCCCAACTGCAGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGG…3′
【００２８】
本発明が属する分野における当業者であれば、多数のあるいは少数の置換ヌクレオチドを有するアンチコードオリゴマー、または好ましい態様以外の３'あるいは５'方向でｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに沿ってさらに延在するがやはり細胞増殖を阻害するアンチコードオリゴマーもまた本発明の範囲に含まれることがわかるだろう。
【００２９】
本発明の実施にあたっては、“生の”あるいは未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドよりむしろ、アンチコードオリゴマーの化学的修飾誘導体やそのアナログを用いるのが好ましい。“生の”オリゴデオキシヌクレオチドは、標準的なフォスフォラミダイト化学によってＤＮＡシンセサイザーで容易に合成することができる。好ましい誘導体および誘導体の調製方法としては、以下のものが挙げられる：フォスフォロチオエート、スタイン(Stein) ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１６：３２０９−３２２１（１９８８年）；メチルフォスフォネート、ブレイク(Blake) ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：６１３２−６１３８（１９８５年）、およびアルファデオキシヌクレオチド；モルヴァン(Morvan)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：５０１９−５０３２（１９８６年）；２'−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド、［モニア (Monia)ら、“遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしての２'デオキシギャップを含有する２'−修飾オリゴヌクレオチドの評価”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４−１４５２２（１９３３年）］およびアクリジン等の共有結合した誘導体、アセライン(Asseline)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３２９７−３２０１（１９８４年）；アルキル化物（例えばＮ−２−クロロセチラミン）、ノール (Knorre) ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、６７：７８３−７８９（１９８５年）およびヴラソフ (Vlassov)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４０６５−４０７６（１９８６年）；フェナジン、ノール(Knorre)ら、上記書、およびヴラソフ (Vlassov)ら、上記書；５−メチル−Ｎ4−Ｎ4−エタノシトシン、ウェッブ(Webb)ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１４：７６６１−７６７４（１９８６年）；鉄−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびアナログ類、ブトリン (Boutorin) ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ'ｓ、１７２：４３−４６（１９８４年）；５−グリシルアミド−１，１０−ｏ−フェナントロリン、チーホン(Chi-Hong)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１４７−７１５１（１９８６年）；およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）誘導体、チュー (Chu)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：９６３−９６７（１９８５年）。これらの刊行物を、あたかもその上掲箇所がここに完全に記載されていると同一の効果をもって、本明細書の一部として引用する。
【００３０】
本発明のアンチコードオリゴマーは、医薬として許容される担体と組み合せして、対象に投与するかあるいは生体外投与することもできる。好適な医薬担体としては各種カチオン性脂質を用いることができ、具体的にはＮ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルフォスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。リポソームもまた本発明のアンチコードオリゴマーの担体として好ましく用いることができる。
【００３１】
アンチコードオリゴマーは如何なるルートで患者に投与してもよい。例えば、静脈内、筋肉内、鞘内、鼻腔内、腹腔内、皮下の各注射、ｉｎ ｓｉｔｕ注射、および経口投与を挙げることができる。経口投与の場合、本発明のアンチコード分子やそのアナログが消化管内で分解しないように腸溶コーティングが必要である。アンチコードオリゴマーは、生理的に許容される一定量の担体あるいは希釈剤（生理食塩水やその他の適切な液体）と混合してもよい。アンチコードオリゴマーは、リポソームやその他の担体手段と組み合せてアンチコード分子やそのアナログが標的に到達するまで保護したり、および／または、アンチコード分子やそのアナログが組織のバリアを通過するのを容易にすることができる。
【００３２】
アンチコードオリゴマーは生体外での骨髄浄化にも有用である。通常、患者が受けることができる従来の癌化学療法剤ないし医薬および照射の量は、骨髄に対する毒性によって制限される。骨髄に対する毒性とは即ち貧血（疲労、心不全）血小板減少症（出血）、好中球減少症（感染）である。このように、腫瘍を完全に撲滅するために十分な濃度の薬剤を運搬あるいは照射すれば、医師は同時に患者の正常な骨髄細胞を破壊してしまい、患者の死亡を招くであろう。またあるいは、患者から多量の骨髄を外科的に採取してこれをインビトロで保存する一方、患者に攻撃的な従来法による処置を行うこともできる。この場合、患者に患者自身の骨髄細胞を再導入して救命できるが、これもその骨髄から残存悪性細胞が“追放・浄化”されている場合に限られる。本発明のアンチコードオリゴマーは、骨髄から残存悪性細胞を除去するために用いることができる。
【００３３】
アンチコードオリゴマーは癌や新生物細胞の成長を阻害するのに有効な量投与される。投与される特定のアンチコードオリゴマーの実際の量は、癌の種類、体の他の細胞に対するそのアンチコードオリゴマーの毒性、癌細胞によって取り込まれる速さ、およびそのアンチコードオリゴマーが投与される個体の体重や年齢等、各種ファクターによって変わるであろう。ヒトの血清中に存在する阻害剤がアンチコードオリゴマーの活性と干渉する可能性から、各個人に対するアンチコードオリゴマーの有効量は変わるであろう。患者に対する有効量は従来の方法によって確認することができる。これは例えばアンチコードオリゴマーを細胞増殖の阻害に無効な量から有効な量まで段階的に増加させて行く方法である。細胞増殖を阻害するためには０．００１マイクロモル〜１００マイクロモルの濃度幅で癌細胞に提示すれば有効であろうと期待される。
【００３４】
アンチコードオリゴマーは、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な時間少なくとも一回患者に投与する。アンチコードオリゴマーは、癌細胞中または癌細胞の周囲でアンチコードオリゴマーが有効レベルを維持するのに十分な頻度で患者に投与するのが好ましい。有効レベルを維持するためには、アンチコードオリゴマーは一日数回、毎日またはこれより間隔を置いて投与することが必要となるかもしれない。アンチコードオリゴマーは、癌細胞がもはや検出されなくなるか、癌細胞の数が減少してそれ以上投与治療を続けてももはや顕著な数の減少がもたらされなくなるか、あるいはまた癌細胞が減少して、外科手術その他の処置で対応可能となる時点まで継続投与する。アンチコードオリゴマーが投与される時間の長さは、癌細胞が特定のオリゴデオキシヌクレオチドを取り込む速さや、細胞がオリゴデオキシヌクレオチドに応答するのに要する時間によって異なる。インビトロでは、“生の”未修飾アンチコードオリゴマーによる新生物細胞の生育の最大阻害は培養開始後２日で起こったが、フォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは４〜７日かかって最大阻害に到達した。インビボでは細胞増殖の最大阻害に必要な時間はより長い場合もより短い場合もあろう。
【００３５】
本発明のアンチコードオリゴマーは、２以上のアンチコードオリゴマーオリゴデオキシヌクレオチド配列の組合せとして、あるいは一つの型の配列として患者に投与することができる。例えば、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳを投与することもできるし、ＴＩ−ＡＳ単独で投与することもできる。
【００３６】
本発明のアンチコードオリゴマーは自己免疫疾患の治療にも役立つことは確実である。自己免疫疾患とは、体の免疫系が正常に機能しない疾患である。本発明のアンチコードオリゴマーを自己免疫疾患を有するヒトに投与すればｂｃｌ−２過剰発現リンパ球の増殖を阻害するはずであり、これにより自己免疫疾患の症状が改善される。自己免疫疾患の治療用途に用いるには、本明細書の記載に従ってアンチコードオリゴマーを投与する。
【実施例】
【００３７】
方法一般
実施例には次のプロトコールを用いた。
【００３８】
Ａ．細胞と細胞培養
本研究のために用いたヒト白血病細胞株はＲＳ１１８４６濾胞性リンパ腫細胞、６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ球性白血病細胞、およびＪＵＲＡＴ Ｔ細胞急性リンパ球性白血病細胞であり、これらはツジモトらによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４−５２１８（１９８６年）に、またワイス(Weiss) らによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１３８：２１６９−２１７４（１９８７年）に記載されている。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を新鮮全血から、リードら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：３１４−３１９（１９８５年）に記載のようにして単離した。全リンフォイド細胞を１ｍＭのグルタミン、抗生物質、および次の何れかを含むＲＰＭＩ培地中で５×１０5細胞／mLの濃度で培養した：５〜１０％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５〜１０％（ｖ：ｖ）の子ウシ血清（ＣＳ）（両者ともハイクローンラボラトリーズ製）、あるいは無血清培養には１％（ｖ：ｖ）のＨＬＩ濃縮補充剤（ベントレックスラボラトリーズ）。マウス繊維芽細胞株を、グルタミン、抗生物質、および５〜１０％（ｖ：ｖ）のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中に、１０3細胞／ｃｍ2添加した。繊維芽細胞株はＮＩＨ ３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｂ−α−Ｓ細胞、および３Ｔ３−Ｂ−αーＡＳ細胞であった。このうちの後の２つの細胞株は、発現ベクター構築物での安定した形質移入によって、センス配向、アンチセンス配向のいずれかでヒトｂｃｌ−２−α ｃＤＮＡを高レベルに発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞である。
【００３９】
Ｂ．細胞成長の測定
アンチコードオリゴマーの存在下あるいは不在下、培養細胞株の成長を次の二つの方法で測定した：血球計を用いた細胞カウント；およびリードら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：３１４−３１９（１９８５年）に基本的に記載されている、［3Ｈ］−チミジン導入量をアッセイすることによるＤＮＡ合成。即ち、細胞を９６穴の平底マイクロタイタープレート（ファルコン社）にウェルあたり０．２mL加えて培養した。適切な時間に細胞を再懸濁し、２５μｌを取り出し細胞数をカウントした。この２５μｌ量は２０ＵＣｉ／Ｍｌの［3Ｈ］−チミジン（特異活性＝６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）（ニューイングランド・ニュークリアー）で置き換えた。次いでマイクロタイター培養物を３７℃で９５％空気：５％炭酸ガス雰囲気に８時間戻し、その後細胞とガラスフィルターを溶解し、シンチレーションカウンティングでＤＮＡへの［3Ｈ］−チミジンの導入の相対レベルを決定した。細胞のカウントは、トリパンブルー染料の存在下、二重に用意したマイクロ培養物中の生存可能細胞の濃度を決定することにより行った。
【００４０】
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム・ブロマイド］］色素低減アッセイをタダらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、９３、１５７（１９８６年））に従って行い、本明細書に記載の条件下においてアッセイの線形領域内にあることを確認した。ウェル当たりの生存可能細胞の数は、各アッセイにおける標準曲線から外挿した。標準曲線は、ＨＬ−１培地において指数的に成長するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の、１０6細胞／mL（０．２ｍｉ／ウェル）から始まる連続２倍希釈からなるものであった。サンプルは３重にアッセイし、培地／試薬のブランクに対するＯＤ６００ｎｍを計算前に全ての値から差し引いた。
【００４１】
Ｃ．ＲＮＡブロット分析
全細胞ＲＮＡを、チョムジンスキー(Chomczynski) らがＡｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６−１３９（１９８７年）に記載しているクゥォニジニウム・イソチオシアネート／フェノール手続によって単離した。ポリアデニル化された分画をオリゴデオキシチミジン−セルロースクロマトグラフィーによってアヴィブ(Aviv)らがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：１４０８−１４１２（１９７２年）に記載のようにして精製した。約５μｇ分割量のｍＲＮＡを０．８％アガロース／６％フォルムアルデヒドゲル中でサイズ分画し、ナイロン膜に移した。ブロットは、リードらがＭｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５：３３６１−３３６６（１９８５年）に記載した方法を正確に行って、まず予ハイブリダイズ、次いでハイブリダイズ後に洗浄した。これには、ツジモトがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４−５２１８（１９８６年）に記載したヒトｂｃｌ−２に対する32Ｐ−ｃＤＮＡあるいはネグリニ(Negrini) らがＣｅｌｌ、４９：４５５−４６３（１９８７年）に記載したマウスｂｃｌ−２プローブであるｐＭＢＣＬ５．４を利用した。ブロットは、強調スクリーンと共に−７０℃で１〜１０日間コダック社のＸＡＲフィルムに露光した。32Ｐ−ｂｃｌ−２プローブを膜から溶出させ、32Ｐプローブと共にマウスのβ−マイクログロブリンに関して再ハイブリダイズさせると、ブロット上の全サンプルについて略等量のｍＲＮＡが確認された。
【００４２】
実施例１
アンチコードオリゴマーの調製
アプライド・バイオシステムズ社３８０Ｂ ＤＮＡ合成器を使用して、ここに特に全文をレファレンスとして援用するスタインら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６：３２０９−３２２１（１９８８）に記載の方法により、ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ（ＰＲＰ−１カラム）により精製した。いくつかのケースにおいては、非特異的な細胞毒性作用を除去するために、さらにオリゴデオキシヌクレオチドをカーンら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：２３７−２４４（１９８８）にすでに記述されているように、Ｃ１８−Ｓｅｐ−ＰａＫクロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）により精製する必要があった。３０％酢酸ニトリルに溶出したオリゴデオキシヌクレオチドを蒸発乾燥させ、滅菌したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクスの緩衝塩溶液（ともにＧｉｂｃｏ製）に１−２ｍＭ濃度に再懸濁させ、少量のアリコートに分けて−８０℃で保存した。
合成したオリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらのヒトｂｃｌ−２遺伝子のセンス−ストランドとの関係を表１に示した。ヒトｂｃｌ−２遺伝子のコードストランド配列部分を示しているが、これには翻訳開始部位（上）、スプライス供与部位（中央）およびスプライス受容部位（下）、ならびにｂｃｌ−２プレｍＲＮＡの５'非翻訳部分中の経験的に選択した部位が含まれている。ＡＴＧ開始コドン、ＧＴスプライス供与体、およびＡＧスプライス受容コンセンサス配列はボックスで囲んだ部分である。
これらの研究のために合成されたオリゴデオキシヌクレオチドの配列が示され、それらのヒトｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのセンス−ストランドとの関係が示されている。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは翻訳開始部位のアンチセンスであり、ＴＩ−Ｓはその相補センス体である。ＳＤ−ＡＳおよびＳＤ−Ｓはそれぞれ、スプライス供与領域に対するアンチセンスおよびセンス配向を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
オリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳはｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの予測される翻訳開始部位にまたがり、この領域に対して相補的（アンチセンス）である。対照として、この２０ｂｐオリゴデオキシヌクレオチドのセンス配列ＴＩ−Ｓを合成した。
ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのスプライシングを特異的に遮断するために、２０ｂｐオリゴデオキシヌクレオチドのアンチセンス配列ＳＤ−ＡＳを合成したが、これはｂｃｌ−２の一次転写産物のスプライス供与部位とオーバーラップする。さらに、表１に示されているように相補センスオリゴデオキシヌクレオチドＳＤ−Ｓも調製した。ヒトｂｃｌ−２遺伝子は、ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６）にあるように、別のスプライス部位選択によりいくつかの転写産物をもたらす。これら転写産物の優位性はスプライシングに依存し、２６ＫＤａタンパクであるｂｃｌ−２−アルファをコードする。しかしながら、マイナーな１つの転写産物はスプライスされず、したがって２２ＫＤａタンパクのｂｃｌ−２−ベータをコードする。このようにＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは基本的に、すべてではないが殆どのｂｃｌ−２転写産物の完成を遮断することができる。
【００４３】
実施例２
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのＩｎ Ｖｉｔｒｏ研究のための血清の処理
ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは血清中に存在するヌクレアーゼによる劣化に敏感なため、５６℃で３０分間加熱（血清補体を不活性化するための通常の手順）した牛胎児血清（ＦＢＳ）中におけるＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドの効果と、６８℃で１時間加熱（多くのヌクレアーゼ類を非可逆的に不活性化するのに充分な温度）した牛胎児血清（ＦＢＳ）中におけるＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較した。ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞系統を使用した。ＲＳ１１８４６細胞はｂｃｌ−２発現を自由にするｔ（１４；１８）染色体転座を含み、その結果ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを高レベルで蓄積する（ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６））。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞を、予め５６℃で０．５時間または６８℃で１時間加熱した牛胎児血清５％（容量/容量）を含む培地で培養した。培養の開始時にＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加え、２日後に生存細胞の密度を測定した。
ＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは６８℃処理血清の方がこれらリンパ腫細胞の培養の成長を効果的に抑制した。以下の実験ではすべて、培養に供する前に６８℃で１時間加熱した血清を使用した。この処理は血清の成長支援能力を阻害するものではない。
【００４４】
実施例３
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによるリンパ細胞成長の特異的阻止
ｂｃｌ−２の翻訳開始部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＡＳ）およびスプライス供与部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド（ＳＤ−ＡＳ）について、正常および新生物リンパ細胞の増殖抑制力を試験した。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ細胞、ＪＵＫＲＡＴ Ｔ細胞白血病細胞、および新鮮な単離抹消血液リンパ球を、予め６８℃で１時間加熱した１０％（容量/容量）ＦＢＳを含む培地で培養した。培養開始時に種々の濃度のＴＩ−ＡＳ、ＴＩ−Ｓ、ＳＤ−ＡＳ、およびＳＤ−Ｓなどのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加えた。培養２−３日後に、[3Ｈ]−チミジン取り込み量を測定することにより、培養物中の相対ＤＮＡ合成率を測定した。オリゴデオキシヌクレオチド処理培養物と等量のＰＢＳまたはＨＢＳＳを含む対照培養物に対するパーセンテージを計算してデータを求め、複製培養の平均（±標準偏差）を求めた。
低温チミジン阻止を除いて、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処理した培養中のＤＮＡ合成抑制の１つの指標として、細胞数を計測し同様のデータを求めた。
図１および図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはともに、ＲＳ１１８４６細胞の成長を濃度に依存して抑制した。ＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドにくらべて細胞成長を抑制する効果は少なかった。これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと対照的に、センスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＳＤ−Ｓ）は濃度２５０μＧ／mLまで抑制効果は認められなかった。さらに非センスオリゴデオキシヌクレオチド（すなわち、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同じ塩基組成を有するが、スクランブル配列となっているもの）もまた、ＲＳ１１８４６細胞の増殖を抑制しなかった。これらのデータはしたがって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがこれらの腫瘍性細胞の増殖を特異的に遮断することを示している。ｂｃｌ−２遺伝子を発現するその他いくつかの白血性細胞種についても、ＴＩ−ＡＳおよびＳＤ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドによってそれらの増殖が抑制されるか試験した。ＪＵＲＫＡＴ Ｔ細胞急性リンパ細胞白血性細胞の場合と同様、すべてのケースにおいてアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養中で、これらのヒト白血性細胞の成長は特異的かつ濃度依存性で減少するのが観察された。
健常なヒト抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）の増殖が刺激される時、これらの中でｂｃｌ−２の発現が一時的に誘発されることが示されており、これはこの遺伝子が正常なリンパ球の成長調節にある役割をはたしていることが示唆されている（リードら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９５−１２９７（１９８７））。よって、それらの増殖を刺激するモノクローナル抗体ＯＫＴ３（ヴァン・デン・エルセンら，Ｎａｔｕｒｅ３１２：４１３ー４１８（１９８４））をＰＢＬとともに培養した場合、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのＰＢＬの成長抑制に対する能力を試験した。ＰＢＬは５０μｌの精製ＯＫＴ３モノクローナル抗体で刺激した。図１および図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＰＢＬの増殖を濃度依存性で特異的に抑制した。このようにこれらのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは、ｂｃｌ−２遺伝子を構成的に発現する白血病細胞の培養物中の成長ならびにｂｃｌ−２発現が誘発されるノーマルなリンパ球の培養中の増殖を抑制した。
【００４５】
実施例４
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる阻止の時間的経過
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の力学をＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞および６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ細胞白血病細胞で検査した。これら両方の新生物Ｂ細胞種はｂｃｌ−２ｍＲＮＡを高レベルで転写・蓄積した（ツジモトら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８（１９８６））。
ＲＳ１１８４６小胞リンパ腫細胞および６９７プレ−Ｂ細胞急性リンパ細胞白血病細胞を、６８℃で処理したＦＢＳおよびノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを１０％（容量/容量）含む培地中で培養した。細胞は、５０μｇ／mLのＴＩ−ＡＳ、１００μｇ／mLのＳＤ−ＡＳ、５０μｇ／mLのＴＩ−Ｓ（ＲＳ１１８４６細胞）または１００μｇ／mLのＳＤ−Ｓ（６９７細胞）、あるいは対照としてのＰＢＳとともに培養した。培養開始後種々の時間でＤＮＡ合成（ｋｃｐｍ/１０5生存細胞数）および細胞密度（１０5生存細胞数/mL）を測定した。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドはこれらの細胞培養物中で測定されるＤＮＡ合成を２４時間以内に著しく抑制した。これらの培養物における細胞密度の低下は明らかに２日以内に起きている。このようにアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは白血病細胞のＩｎ Ｖｉｔｒｏ成長を急激に抑制した。センスオリゴデオキシヌクレオチドはこれら培養物中の増殖を阻害しなかったことから、アンチセンスオリゴデオヌクレオチドの作用は特異的なものである。細胞の生存はしばしば培養の後期に低下するが、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと一緒の培養では細胞死の増加は最初の１−２日には認められず、これは非細胞毒性メカニズムであることを示唆している。
【００４６】
実施例５
異なる血清調製品の比較
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞の増殖抑制は培養に使用される血清のロットによって大幅に変わる。
増殖抑制に対する血清の効果を測定するために、２００μＭのＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの添加２日後の６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞培養物中の相対ＤＮＡ合成を測定した。１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態）、５％（容量：容量）ウシ血清（ＣＳ１およびＣＳ２）の異なる２ロット、または５％（容量：容量）牛胎児血清（ＦＢＳ１およびＦＢＳ２）を添加した培地中で細胞を培養した。すべての血清は培養に使用する前に６８℃で１時間加熱した。
ノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはＤＮＡ合成（９２％）ならびに６９７細胞の無血清培養物（ＨＬ１）における細胞増殖を著しく抑制した。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは５％（容量：容量）牛胎児血清（ＦＢＳ２）を含む培養物中でも同様に効果的（９４％）であった。対照的に、その他の血清調製品（ＣＳ１、ＣＳ２、ＦＢＳ１）を含む培養物中では抑制作用は顕著に低下した。一般的にはアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むものよりもウシ血清（ＣＳ）を添加した培養物中での効果が少ないことが観察されている。
【００４７】
実施例６
無血清培養におけるアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態または５％（容量：容量）６８℃処理ＦＢＳ２）のいずれかを含む培地中で６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を培養した。種々の濃度のノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中で２日後のＤＮＡ合成および細胞密度の相対レベルを測定した。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは、無血清培養に使用された場合、低濃度で抑制的であった。たとえば、１００μＭにおいては、ＦＢＳ２を含む培養物中では細胞増殖の抑制は見られなかったのに対し、無血清培養物中では細胞数は約７５％減少した。しかしながら、より高濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（２００−２５０μＭ）の場合は、両方のタイプの培養物中の６９７細胞増殖の抑制は同程度であった。無血清培養物中のノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの増進する効果は特異的なものであったが、これはセンスオリゴヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）が同一濃度では抑制的でないからである。
【００４８】
実施例７
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド：抑制の時間的経過
ヒト白血病細胞成長抑制に関するホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果とノーマルホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較するために、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞とともに培養し、その抑制効果を測定した。６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を無血清培地中で何回か培養し、ＤＮＡ合成（ｋｃｐｍ）および細胞密度（１０6細胞数／mL）を測定した。
細胞は当初密度０．２×１０5細胞／mLまたは０．５×１０5細胞／mLのいずれかで接種した。培養条件は２５μＭＴＩ−ＡＳホスホロチオエート、２５μＭ ＴＩ−Ｓホスホロチオエートとし、対照培養はＨＢＳＳで処理した。
血清ロットの差による実験変動を避けるために、６９７白血病細胞を無血清条件で培養した。当初接種密度０．５×１０6細胞／mLで培養した場合、６９７細胞は培養４−５日で最高のＤＮＡ合成および細胞密度を達成した。これらの培養開始時に２５μＭのセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）を添加しても６９７細胞成長には効果がほとんど無かった。しかしながら、２５μＭのアンチセンスホスホロチオエート（ＴＩ−ＡＳ）を含む複製培養物中では、２日以内にＤＮＡ合成のある程度の減少が明白となり、４−５日で最高となった。細胞数計測で測定される６９７細胞成長の最大抑制は培養開始後６日後に見られた。
６９７細胞を当初０．２×１０6細胞／mLで接種した場合、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＡＳ）は２日目にわずかな抑制を示し、これら培養物中でのＤＮＡ合成の最大抑制は７日目に達成された。ノーマルオリゴヌクレオチドの場合と同様に、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制は非細胞毒性メカニズムに仲介されるものと思われる。なぜならば細胞生存数は培養の後期にならないと低下しなかったからである。したがって、ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと比較した場合、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは作用開始時期が遅い。
【００４９】
実施例８
アンチセンスｂｃｌ−２ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
無血清培地中での６９７細胞の培養におけるホスホロチオエートおよびノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性を下記のようにして比較した。
６９７細胞を無血清培地中で、３日間（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド）または４日間（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド）培養し、細胞密度およびＤＮＡ合成のレベルを測定した。培養物へのオリゴデオキシヌクレオチドの添加物には、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエート、ＴＩ−Ｓホスホロチオエート、ＴＩ−ＡＳノーマルおよびＴＩ−Ｓノーマルが含まれる。
図２に示されているように、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは２５−５０μＭで６９７細胞の増殖を顕著に抑制した。対照的に、ノーマルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは同等の６９７細胞増殖抑制をするためには５倍から１０倍高い濃度（約２５０μＭ）を必要とした。アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳによる抑制は、この濃度範囲では特異的であったが、これはその相補センスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−Ｓ）が複製培養において６９７細胞抑制をほとんどしなかったためである（図３参照）。
【００５０】
実施例９
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清調製品の影響
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に関する血清調製品の効果をさらに明確にするために、培養物への添加の前に５６℃で３０分間もしくは６８℃で１時間加熱した、または加熱しないＦＢＳをＲＳ１１８４６リンパ腫細胞の培養物へ添加した。
ＲＳ１１８４６細胞は、予め５６℃で０．５時間もしくは６８℃で１時間加熱した、または加熱をしていない１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレートまたは５％（容量：容量）ＦＢＳを含む培地中で培養した。複製培養物の４日および５日目の細胞数を、等濃度のＴＩ−Ｓホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで処理した対照培養に対するパーセンテージとして計測し、平均パーセンテージを求めた（標準偏差はすべての値について１０％以下であった）。ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは２５μＭで完全にＲＳ１１８４６の成長を抑制し、半−最大抑制濃度は１１μＭと推定された。対照的に、このホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは５％（ｖ：ｖ）ＦＢＳを含む培養中では極端に効果が少なかった。さらに、培養液に添加する前にＦＢＳを加熱しても、ＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのＲＳ１１８４６リンパ腫細胞の成長を抑制する能力は顕著には改善されなかった。オリゴデオキシヌクレオチドの濃度が５０μＭの場合、ＲＳ１１８４６細胞の増殖抑制は、加熱操作の有無にかかわらず、血清を含んだ培養中では４８％を超えることはなかった。
【００５１】
実施例１０
ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清の透析の影響
血清中の妨害物質の性質をさらに明らかにするために、６８℃加熱血清を６９７白血病細胞の培養物に添加する前に、厳密に透析（遮断分子量＝３５００）して実験を行った。実験は１２．５μＭのＴＩ−ＡＳホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドおよび２００μＭのノーマル酸素ベースのＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを使用して行った。
６９７細胞を、１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（Ａ）または６８℃加熱処理の３ロットの５％（容量：容量）ＦＢＳ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）を含む培地中で培養した。各血清調製品は厳密な透析前（ＮＤ）および透析後（Ｄ）で対比した。ＴＩ−ＡＳ（＋）およびＴＩ−Ｓ（−）オリゴデオキシヌクレオチドは、ノーマル酸素ベースのオリゴデオキシヌクレオチドについては２００μＭ（ＯＸＹ）、およびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＴ）については１２．５μＭを、複製培養物に添加した。ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドそれぞれの培養２ないし４日目にＤＮＡ合成の相対レベル（ｋｃｐｍ）を測定した。
試験したＦＢＳの３つの異なるロットの内、２つは透析後もノーマルまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培養物でほとんど変化を示さなかった。しかしながらＦＢＳの１ロットは、透析後これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に僅かの影響を与えた。
【００５２】
実施例１１
安定的に形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した実験
ここで述べるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２ｍＲＮＡ翻訳（ＴＩ−ＡＳ）およびスプライシング（ＳＤ−ＡＳ）を遮断するように設計されたものであるが、それらの作用の分子メカニズムはまだ解明されていない。細胞内でのオリゴデオキシヌクレオチド−ＲＮＡハイブリッドの形成の細胞成長抑制に対する効果を調べるために、ヌクレオチドの配列に関係なく、ヒトｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ転写物を発現するように形質転換した細胞をノーマルオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した。
２００μＭのノーマルＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドを、典型的なＮＩＨ ３Ｔ３細胞の培養物、ならびに通常のセンス（３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞）またはアンチセンス（３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞）ストランドのいずれかのヒトｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ転写物を高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換したこれらの細胞の培養物に、添加した。
ＲＮＡブロット分析を行うために、ノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ならびにセンス（３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞）またはアンチセンス（３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞）リコンビナントｂｃｌ−２−アルファｍＲＮＡを高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換した細胞から、ポリアデニル化ｍＲＮＡを１３の方法に基づいて精製した。約５μｇのｍＲＮＡを、基本的に（１６）に記載したように、ヒトまたはネズミｂｃｌ−２配列由来の32Ｐ−標識ハイブリダイゼーションプローブを使用したＲＮＡブロット検定に供した。
ノーマル３Ｔ３細胞、３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞、および３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞からのＲＮＡを含むブロットに対する１日曝露によるオートラジオグラムでは、３Ｔ３−アルファ−ＡＳおよび３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞に形質転換したｂｃｌ−２発現構築物から産生されたリコンビナント２．４および１．４ｋｂｐ ｂｃｌ−２転写産物が高い相対レベルを示した。
ＲＮＡを採取する時点で増殖中または鎮静状態のいずれかのノーマル３Ｔ３細胞からのＲＮＡを含むブロットの１０日間の曝露では、増殖中の３Ｔ３細胞中に低レベルではあるが検出可能なレベルのノーマル７．５および２．４ｋｂｐネズミｂｃｌ−２転写産物の存在が示された。
ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞の培養中のＤＮＡ合成および細胞複製を特異的に抑制したが、これは低レベルではあるが線維芽胞がｂｃｌ−２転写産物を含むという他者の発見とも符合するものである。ここで開示したこのＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドは、マウスｂｃｌ−２配列においてその２０塩基中１８が相補的であり（１７）、ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長を抑止する役割を果たしているものと思われる。
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞、および３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞を、５％（容量：容量）の６８℃処理血清、ならびにＨＢＳＳ、２００μＭ ＴＩ−Ｓノーマルオリゴデオキシヌクレオチド、または２００μＭ ＴＩ−ＡＳノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培地中で培養した。３日目の培養物中のＤＮＡ合成の相対レベル（ｋｃｐｍ）を測定し、[3Ｈ]−チミジンの０．５μｃｉ/穴の１６時間インキュベートと比較した。位相差顕微鏡による推定細胞密度は測定した培養物中のＤＮＡ合成と一致した。ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中のＤＮＡ合成の抑制パーセンテージは、ＨＢＳＳを含む対照培養物との相対比較で求めた。
ノーマルＮＩＨ ３Ｔ３細胞の場合と同様に、ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞（ヒトｂｃｌ−２−アルファセンス転写物を産生）は特異的な抑制を示した。なぜならば、センスオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−Ｓは抑制的でなかったからである。しかしながらアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖抑制のレベルは３Ｔ３−アルファ−Ｓ細胞ほど大きくはなかった。これは予想されるとおり、これらの細胞がより多くのｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを含んでいるからである。
３Ｔ３−アルファ−ＡＳ細胞培養物（アンチセンスｂｃｌ−２転写物を産生）に対するＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドの添加は、オリゴデオキシヌクレオチド−ＲＮＡハイブリッド形成を含む非特異的なメカニズムを通して細胞成長の抑制を妨げた。ＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチドは３Ｔ３−アルファーＡＳ細胞増殖をほとんど抑制しなかったが、一方ＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドはこれら細胞に対して著しく抑制的であった。ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドについても同様のデータが得られた。
【００５３】
実施例１２
ヒトリンパ腫細胞におけるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド介在プログラム細胞死の指標としてのＤＮＡ断片化の測定
表２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドのヒトｔ（１４：１８）含有ヒトリンパ腫細胞種ＲＳ１１４８６のプログラム細胞死（ＤＮＡ断片化）を誘発する能力を調べるための試験を行った。これらのオリゴヌクレオチドはすべてホスホジエステルであり、ｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡの翻訳開始部位または５'−キャップ領域を標的とするものである。
対照オリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＩ−ＡＳ（配列番号：７）のｂｃｌ−２センス型（ＴＩ−Ｓ）、および同じ塩基組成を有するがヌクレオチド順序がバラバラのＴＩ−ＡＳのスクランブル型を含めた。
【００５４】
（表２）
配列 配列番号
CGCGTGCGAC CCTCTTG(3′→5′) 8
TACCGCGTGC GACCCTC(3′→5′) 9
CCTTCCTACC GCGTGCG(3′→5′) 11
GACCCTTCCT ACCGCGT(3′→5′) 12
GGAGACCCTT CCTACCG(3′→5′) 13
GCGGCGGCAG CGCGG(3′→5′) 14
CGGCGGGGCG ACGGA(3′→5′) 15
CGGGAGCGCG GCGGGC(3′→5′) 16
【００５５】
ＲＳ１１８４６細胞を、１％ＦＣＳならびに125Ｉ−デオキシウリジンの添加により代謝的に標識したそれらのＤＮＡとともに、ＨＬ１培地で３時間培養した。標識された細胞を次に完全に洗浄し、５０ＡＭの種々のオリゴヌクレオチドの存在下で２日間培養した。次いで遠心分離により２００μｌの培養液から細胞を回収し、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１４ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む低張性緩衝液中に溶離した。断片化されていないゲノムＤＮＡをペレット化するために１６，０００×Ｇで遠心分離した後、断片化されたＤＮＡを含む上澄み画分をフェノール/クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈降させた。次にこのＤＮＡを１．５％アガロースゲルのゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィにかけるためにナイロン膜に移した。
２つの実験の結果を図４および５に示す。ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始ＡＴＧ部位近辺を標的とする６種類のｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。「Ｃ−オリゴ−２」は４つの意図的なミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを示す。「Ｕ」は無処理の対照細胞を示す。図５は図４に示したオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。「Ｓｃ２０」はＴＩ−ＡＳと同じ塩基組成を有するがスクランブル配列である２０ｍｅｒを指す。図５（ｂ）はｂｃｌ−２ｍＲＮＡの５'−キャップを標的とする３つのオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。数字はこれらのオリゴマーのＡＴＧ−翻訳開始部位からの距離を示す。
ＤＮＡ断片（単位サイズ約２００ｂｐ）のラダー（はしご）の存在はプログラム細胞死を示唆している。５０μＭにおいて、ＴＩ−ＡＳはほとんどＤＮＡを断片化しなかったのに対し、配列番号９および配列番号１０、ならびに５'−キャップオリゴヌクレオチドの一つ（配列番号１４）は顕著なＤＮＡ断片化をもたらした。
【００５６】
実施例１３
無血清培養物中におけるアンチセンスホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
６９７プレ−Ｂ細胞白血病細胞を、１％（容量：容量）ＨＬ１−コンセントレート（無血清状態[0]または３％（容量：容量）６８℃加熱処理血清（ＦＢＳ２）[＿]を含む培地中で培養した。図６参照。示されているのは、種々の濃度のホスホジエステルＴＩ−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養液中の培養２日目における細胞密度である。これらのデータはセンスオリゴヌクレオチドで処理した対照培養に対する相対パーセンテージで示されており、複製サンプルの平均±標準偏差も表している。
【００５７】
実施例１４
オリゴデオキシヌクレオチド処理６９７細胞中のｂｃｌ−２タンパクレベルの免疫蛍光分析
オリゴデオキシヌクレオチドとの関係を検討するために、０．２５×１０4（ホスホロチオエート）または０．５×１０5（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド）の６９７細胞を１mLのＨＬ−１無血清培地で２４穴培養皿（Ｌｉｎｂｒｏ．Ｆｌｏｗ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）で培養した。２日目（ノーマルの場合）または４日目（ホスホロチオエートの場合）に、細胞を培養液から回収し、[ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）−０．１％ウシ血清アルブミン−０．１％アジ化ナトリウム]中で１回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で５−１０分間氷上固定した。次いで細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１mLの純粋メタノール中で２０℃、１０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ａ中で１回洗浄後、細胞を０．０５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ中に氷上で３分間再懸濁させ、ＰＢＳ−Ａ中で洗浄し、ＰＢＳ中４℃で３０分間１０％（ｖ/ｖ）加熱非活性化ヤギ血清で予備遮断した。
第１の抗体を添加するために、予備遮断した細胞を１００μｌのＰＢＳ−Ｇ（ＰＢＳ−１％ヤギ血清−０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁させ、ＢＣＬ−２抗体（ハルダーら，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン），３４２：１９５−１９７（１９８９））またはアフィニティ精製したノーマルウサギ対照ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ６０１２−００８０）のいずれかを含有させた個別の試験管に５０μｌずつに分割し、氷上で１時間インキュベートした。これらの検討に使用したＢＣＬ２抗体は、ＢＣＬ２タンパクのアミノ酸（９８−１１４）に相当する合成ペプチドをウサギに使用し、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィによりアフィニティ精製し、約１mg／mLで使用した。細胞は次にＰＢＳ−Ａ中で洗浄し、０．５−１．０mL ＰＢＳ−Ａ中で氷上１５−２０分間インキュベートし、非特異性の細胞会合抗体を分散させたあと、５μｇのビオチニル化ｓｃａｔ抗ウサギＩｇＧ（ＢＡＩＯＯＯ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を含む１００μｌのＰＢＳ−Ｇ中に細胞を３０分間再懸濁させた。ＰＢＳ−Ａで１回洗浄および１５分間インキュベートした後、細胞を最終的に、２μｇのＦＩＴＣ接合アビジン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ Ａ２０１１）を含む１００μｌのＰＢＳ−Ａに２０分間再懸濁させ、ＰＢＳ−Ａで３回洗浄した後、オルソ２１５０データ処理システムに連結されたオルソチトフルオログラフ５０−Ｈで分析した。本法のＢＣＬ２タンパク検出特異性は免疫蛍光顕微鏡（細胞質ゾル着色ペプチド競合を示す）、ならびに遺伝子トランスファー操作により種々のレベルのＢＣＬ２ ｍＲＮＡおよびタンパクを発現する細胞種を調べることにより確認した。
表面ＨＬＡ−ＤＲ抗原発現を測定するために、間接免疫蛍光分析法（リードら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１６３１−１６３９（１９８５））を使用したが、これは生存細胞をネズミ抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ７３６０）または負の調節抗体 Ｒ３−３６７（ＩｇＧ２ａ）、続いてＦＩＴＣ接合ｓｃａｔ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ １７１１−００８１）とともにインキュベートすることを含むものである。細胞はＦＡＣＳ分析に供する前に１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。
６９７細胞を種々のオリゴヌクレオチドとともに２日（ＰＯ）または４日間（ＰＳ）培養した図７および図８において、黒のカラムはセンスオリゴヌクレオチドの結果を、また斜線のカラムはアンチセンスオリゴヌクレオチドＴＩ−ＡＳの結果を示す。細胞は抗−ｂｃｌ−２抗血清で標識し、ＦＡＣＳにより分析した。データは無処理６９７細胞により得られた平均蛍光度に対する相対パーセンテージで表した。
図９および図１０は６９７細胞を１００μｌのＰＯ ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前および処理した後の典型的なＦＡＣＳ結果を示している。Ａ：抗−ｂｃｌ−２抗血清（斜線部分）またはノーマルウサギ血清対照（白い部分）のいずれかで標識した無処理の６９７細胞；Ｂ：抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体（斜線部分）または負の調節抗体（白い部分）のいずれかで標識した無処理の６９７細胞；Ｃ：ノーマルｂｃｌ−２ ＴＩ−ＡＳ（白い部分）またはＴＩ−ＡＳ（斜線部分）オリゴデオキシヌクレオチドのいずれかとともに２日間培養し、抗−ｂｃｌ−２抗体で標識した６９７細胞；Ｄ：ＴＩ−ＡＳおよびＴＩ−Ｓオリゴデオキシヌクレオチド（Ｃで示されている）とともに培養し、ただし抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で標識した６９７細胞。
図７および図８に示されているように、ＰＯおよびＰＳ ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＬＡ−ＤＲ（図９および図１０）およびその他の調節抗原の発現レベルを変えることなく、ｂｃｌ−２タンパクのレベルを特異的な濃度依存性で減少させた。たとえば１５０μＭにおいて、ＰＯアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２蛍光を約７５−９５％減少させ、一方対照センスオリゴデオキシヌクレオチドはｂｃｌ−２タンパクのレベルを１０−２０％だけ減少させた（図７）。同様に、ＰＳアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド２５μＭとともに４日間培養した６９７細胞は、ｂｃｌ−２蛍光が約７０％減少した。これに対し、センスＰＳオリゴデオキシヌクレオチドＴＩ−ＡＳは、本検定における測定ではｂｃｌ−２タンパクレベルを約１５％減少させただけであった（図８）。
重要性
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにおいては、各ヌクレオチド間のホスフェート結合中の非ブリッジ酸素原子のひとつはイオウ原子で置換することができる。この修飾によりホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはヌクレアーゼによる開裂に対して極端に抵抗性が与えられる。スタインら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９−３２２１（１９８８）。酸素原子をイオウ原子に置換しても、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは水溶液への良好な溶解性を維持し；ＲＮＡ−オリゴデオキシヌクレオチド複合体の溶解温度がいくらか低下するものの良好にハイブリッド化し；また広く使用されているホスホロアミド類とのオリゴデオキシヌクレオチド自動合成法で簡便に合成することができる。
アンチセンスｂｃｌ−２ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類は、それらのノーマル酸素ベースのものに比べて白血病細胞成長のより有効な抑制剤であることが判明している。無血清状態で試験した場合、これらのオリゴデオキシヌクレオチド類は約１５−２３μＭの濃度で細胞増殖を半減させるのに対し、ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは１２５−２５０μＭで５０％の抑制を達成する。この知見は、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの細胞性ヌクレアーゼに対する感受性の低さ、またはその他のメカニズムに起因するものとして説明することができるであろう。たとえば、ｍＲＮＡとホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドとのハイブリッド化はＲＮＡアーゼＨ様活性に関わるメカニズムによって劣化が促進されることになろう。
抑制作用が増加するにもかかわらず、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは配列特異性を維持した。試験した濃度（２５μＭ以下）においては、これらのオリゴデオキシヌクレオチドのセンス型は白血病細胞の成長にほとんど効果が無かった。ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはともに、当初非細胞毒性メカニズムにより白血病細胞の増殖を抑制したようである。培養の最初の数日間、細胞の複製は抑制されたが、細胞死の増加とは一致しなかった。しかしながら、培養の後期（ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドについては４−５日目、ホスホロチオエートについては６−８日目）では細胞生存性は低下した。
ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制動態の比較において、後者の物質は作用の開始時点が遅いことが判明した。ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞増殖の最大抑制は培養開始後２日目に起きたが、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは最大抑制を達成するのに４−７日間必要とした。
本発明の実施例により、ｂｃｌ−２遺伝子を発現するヒトリンパ腫/白血病細胞およびその他のタイプの癌細胞の抑制に対するアンチオリゴマー類の有用性が示された。ヒトｂｃｌ−２遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも有効部分に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＲＳ１１８４６ヒト小胞性リンパ腫細胞ｔ（１４；１８）染色体転座および高いｂｃｌ−２発現、６９７ヒトプレＢ細胞白血病細胞（高いｂｃｌ−２発現）、ＪＵＲＫＡＴヒト急性リンパ球白血病細胞（中度ｂｃｌ−２発現）、ノーマルヒトリンパ球（中度ｂｃｌ−２発現）ならびにネズミ線維芽胞（低ｂｃｌ−２発現）の成長を抑制することが判明した。ｂｃｌ−２アンチセンス薬剤は多くのタイプの細胞の成長を抑制することができるが、ｔ（１４：１８）リンパ腫および白血病細胞は敏感であり、悪性細胞の特異的な抑制が可能となる。
以下の実施例に示されているように、本発明には各種のＤＮＡ相同体を使用することができる。たとえば、ホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、ならびにホスホジエステル類およびホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド類の組み合わせを含む混合オリゴマー類である。また本発明にはＲＮＡ相同体も使用することができるのは当然である。
【００５８】
実施例１５
メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマー類はＤｏＨＨ２リンパ腫細胞の死を誘発する
本検討の目的はリンパ腫細胞の生存を抑制するアンチコードオリゴマー類の各種の相同体の効果を調べることにある。
ＤｏＨＨ２はｂｃｌ−２遺伝子を賦活するｔ（１４：１８）−転座を含むヒトリンパ腫細胞種である。ＤｏＨＨ２細胞を３日間オリゴマーを加えずに、または各種濃度のアンチセンス（Ａｓ）およびスクランブル（Ｓｃ）メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）オリゴマーの存在下で３日間培養した。細胞の生存性はトリパンブルー色素排除法により評価し、データはオリゴマー無しで培養したＤｏＨＨ２細胞に対する相対パーセンテージで示した。ＭＰ/ＰＯオリゴマーはｂｃｌ−２オープンリーディングフレームの最初の６つのコドンを標的とする１８−ｍｅｒであり、オープンリーディングフレームの中の５つの内部結合はホスホジエステルであり、フランキングヌクレオシドはメチルホスホネートである。これらの結果は、
これらのアンチコードオリゴマー相同体はリンパ腫細胞生存に効果を有する特異的な抑制剤であるということを示している。
【００５９】
実施例１６
メチルホスホネート（ＭＰ）/ホスホジエステル（ＰＯ）キメラオリゴマー類はＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の成長を抑制する
本検討の目的は本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体がｂｃｌ−２を高度に発現する固体腫瘍細胞の生存を抑制する効果を調べることにある。
ＭＣＦ−７は比較的高レベルのｂｃｌ−２タンパクを含むヒト胸（乳房）アデノカルチノーマ細胞種である。この細胞をＭＰ/ＰＯオリゴマーの存在下または非存在下で９６穴マイクロタイタープレートで、１穴当り４０００個で培養した。次に、１穴当りの相対細胞数を、新しく接種した無処理のＭＣＦ−７細胞を使用して作成した標準曲線に基づいて、ＭＴＴアッセイにより推定した。アンチセンス（Ａｓ）およびスクランブル（Ｓｃ）ＭＰ/ＰＯオリゴマーは実施例１５に述べたものと同様である。データは判定のための平均＋/−標準偏差を表す。
この結果は、本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体によるｓｏｌｉｄ腫瘍細胞の成長の配列特異的な抑制を示している。
【００６０】
実施例１７
アンチコードｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化
本検討の目的は、コンピュータで作成した配列の本願請求の範囲の各種のアンチコード分子を細胞に接触することによって細胞の生存を抑制する場合に、最適のｍＲＮＡ標的部位または配列部分を調べることにある。
ＤｏＨＨ２リンパ腫細胞をｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの異なった部位を標的とする種々の濃度のオリゴマーで処理した。ＡＴＧオリゴマーは翻訳開始部位を標的とし、オープンリーディングフレームの最初の６つのコドンに相補性である。Ｄｓｃｏｒｅ２３（図２２中のＳｃ２３）およびＤｓｃｏｒｅ７２（図２３中のＳｃ７２）オリゴマーはｍＲＮＡの５'非翻訳領域部位を標的とする。スクランブル（Ｓｃ）オリゴマーは同じ長さと塩基組成を有するがスクランブル型配列の負の対照である。すべてのオリゴマーはホスホジエステル（ＰＯ）/ホスホロチオエート（ＰＳ）キメラとして調製され、最後の（３'）２つの内部ヌクレオシド結合だけがホスホロチオエートである。オリゴマーを直接培養液に添加し、３日後にＭＴＴアッセイにより相対生存細胞数を推定した。データは平均＋/−標準偏差を表す。
これらの結果は、５'非翻訳領域を標的とするＤｓｃｏｒｅ２３オリゴマーは本実施例で試験したその他のアンチコードオリゴマー類に比べて、優れた細胞生存抑制作用を有することを示している。
【００６１】
実施例１８
ｂｃｌ−２遺伝子発現のアンチセンス介在による低減の腫瘍細胞の化学療法抵抗性の逆転
以下の検討はｂｃｌ−２遺伝子の発現を指向したアンチコードオリゴマーが化学療法抵抗性を減少（逆転）させるものかどうか、すなわちアンチコードオリゴマーがｂｃｌ−２遺伝子を発現する癌腫瘍性細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増加させるかどうかを検討するために行ったものである。
多様な癌化学療法剤、たとえば下記に限定されるわけではないが、Ａｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、アドリアマイシン、エトポシド、ミトザントロン、２−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、およびアルキル化剤などの効能に対して、高レベルのｂｃｌ−２タンパクはリンパ腫細胞の相対的抵抗性を増加させるように思われる（ミヤシタ，Ｔおよびリード，Ｊ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５４０７，１９９２年１０月１日）。これらの薬剤は多様な生化学的作用メカニズムを有するが、これらはすべて共通してアポプトシスを起こさせる内因性の細胞経路を賦活することによって最終的に癌細胞の死を引き起こさせる能力を有するものと考えられている（イーストマン，Ａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ２：２７５（１９９０））。本願請求の範囲のアンチコード分子およびそれらの相同体はここで使用されているように、代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド、および抗生物質などの癌化学療法剤、ただしこれらに限定されるものではないが、の感受性を増強させる目的に有効であると考えられている。
代謝拮抗物質としては、特に限定されないが、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、２−クロロデオキシアデノシンなどが含まれる。
アルキル化剤としては、特に限定されないが、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル、およびナイトロジェンマスタードなどが含まれる。
植物アルカロイドとしては、特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＶＰ−１６などが含まれる。
抗生物質としては、特に限定されないが、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンなどが含まれる。その他の癌化学療法剤としては、ＤＴＩＣ（デカルバジン）、ｍＡＭＳＡ、ヘキサメチルメラミン、ミトロキサントロン、タキソール、エトポシド、デキサメタゾンなどが含まれる。
本検討においては、３'−最内部ヌクレオシド結合だけがチオエート結合（ＰＯ/ＰＳ）であるヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステルを使用した。このＰＯ/ＰＳオリゴマーは３'エキソヌクレアーゼ（血清の基本的ヌクレアーゼ活性）に対して抵抗性があり、通常標的ＲＮＡとともにより安定な異種複合体を形成する。
細胞内コンパートメントへのオリゴマーの効果的な取り込みとその後の放出を改善するためにカチオン脂質を使用したが、これは本願請求の範囲のアンチコードオリゴマーの薬学的キャリヤの一例である。
本検討で使用したアンチセンス（ＡＳ）およびスクランブル（ＳＣ）１８'ｍｅｒオリゴヌクレオチドを調製し、精製する方法は上記の一般的な方法およびキタダら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ＆Ｄ，３：１５７（１９９３））に記述されている。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをホスホロアミデートの化学とヨウ素による酸化を利用して１０−１５マイクロモルスケールで合成し、次いでＣ18−逆相カラムを使用して精製した。ほとんどの場合、非特異的な細胞毒性活性を除去するためにオリゴマーをさらに５回エタノール沈降させ、次いで乾燥し、滅菌したＨＬ−１培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に１−１０ｍＭで再懸濁した。この溶液のｐＨは、培地中のフェノールレッド標示試薬が本来の色に回復するまで、１−１０Ｍ ＮａＯＨを使用して
調節した。
使用した基本的オリゴマーは１８−ｍｅｒで、以下のいずれかの配列を有するものである：
Ｉ．ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７）、これはヒトｂｃｌ−２オープンリーディングフレーム（配列番号１９）の最初の６つのコドンのアンチセンスである；または
ＩＩ．ＴＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＣＴ（配列番号１８）、これは対照として使用したスクランブル型である。
ｂｃｌ−２遺伝子またはｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドいずれかを発現する腫瘍細胞を作るために標準形質転換法を使用した。ベクターもまたｂｃｌ−２プレ−ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドをコードすることができると考えられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする特定のヌクレオチド配列は、腫瘍細胞中のｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現し、かつ癌化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるか、または癌化学療法剤で処理した場合に腫瘍細胞を殺すのに充分な配列を選択する以外は重要ではない。ベクターにコードされたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが腫瘍細胞中のｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分な条件で発現されることだけが必要である。遺伝子をほ乳類細胞に転移させるためのベクターならびに、特に発現プラスミドを調製する方法は、分子生物学の分野における通常の手法による。本発明で使用する発現プラスミドを調製する一般的な方法を開示した基本的なテキストはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，サンブルックら編，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）であり、特に培養ほ乳類細胞へのクローン化遺伝子の発現に関する第１６章である。以下の実施例１５Ｃ−Ｄは、本発明で使用した発現プラスミドを調製する特定の方法を記述したものである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを転移するのに用いられる特定のベクターは決定的なものではなく、それらベクターとしてはラムダおよび関連ファージまたは糸状ファージ由来のベクターでよい。必要なことは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし転移されるヌクレオチド配列が、腫瘍細胞中でｂｃｌ−２遺伝子発現を低減させるのに充分な条件下で形質転換腫瘍細胞中に発現されることだけである。本発明は、リコンビナントレトロウイルスベクター（リードら，Ｔ細胞リンパ細胞種におけるｂｃｌ−２介在腫瘍化：Ｃ−ＭＹＣとの相乗効果およびｂｃｌ−２アンチセンスによる抑制，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：３６６０（１９９０））のような他のベクターの介在によって、染色体外の位置（たとえば、発現プラスミドから）または宿主ゲノム自体、すなわち組み込まれた位置、のいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を含むものである。
【００６２】
Ａ．リンパ腫細胞の１８−ｍｅｒ合成ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる処理
散在性、組織球腫、非ホジンスリンパ腫を使用して得られたリンパ腫細胞種ＳＵ−ＤＨＬ−４（エプスタインら、Ｂ５ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織で反応性のある２つの新しいモノクローナル抗体（ＬＮ−１、ＬＮ−２）、小胞状センターとマントルゾーンを有するヒトＢリンパ球および派生腫瘍．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１０２８（１９８４））およびｔ（１４；１８）転座を含むものを、ｂｃｌ−２ｍ ＲＮＡの最初の６つのコドンへの結合を標的とするために１８−ｍｅｒ合成ｂｃｌ−２−ＡＳオリゴデオキシヌクレオチドで処理した。対照として、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を、ＡＳオリゴマーと同じヌクレオシド組成を有するが塩基の配列はスクランブル型（ＳＣ）である１８−ｍｅｒを含む各種の対照オリゴマーで処理した。
【００６３】
１ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ユニット/mLペニシリン、および１００μｇ/mLストレプトマイシンおよび５μｇの精製オリゴヌクレオチドまたは３０μｇのリポフェクチン（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM）[Ｎ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル]−ｎ，ｎ,ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１ｗ/ｗ混合物]]を添加した１．５mLのＨＬ−１無血清培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のアリコートを混合し、３mLのＨＬ−１培地中に０．７５×１０6 ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞に加えた。細胞は次に、５％ＣＯ2/９５％空気の湿潤環境下、３７℃で２４穴プレート（２mL/穴）でイムノブロットおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイのために培養するか、またはＭＴＴアッセイのために９６穴平底マイクロタイタープレート（０．１mL/穴）で培養した。マイクロタイター培養の細胞の場合は、典型的には１日後に各種の化学療法剤を添加または添加せずに０．１mLの追加ＨＬ−１培地を加え、さらに細胞を２日間培養し、ＭＴＴアッセイを実施した。
【００６４】
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む緩衝液中に溶解し、サ
ンプルのタンパク含有量を規定量（２５μｇ）に調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）によるタンパクのサイズ分画を行い、リードら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１）に記載のイムノブロットアッセイを行うためにニトロセルロースフィルターに移した。予備実験において全タンパク量として２５μｇを含む溶液アリコートはアッセイの直線部分に入ることが確認された。ブロットは最初に、ヒトｂｃｌ−２タンパク（前記配列番号２１）のアミノ酸（ａａ）４１−５４に相当する合成ペプチドに向けられた０．１％（ｖ．ｖ）のウサギ抗血清とインキュベートし、次いで２．８μｇ/mLのビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）とインキュベートした。次にｐ２６−Ｂｃｌ−２に対応するバンドをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジン−ビオチン複合試薬（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ Ｉｎｃ．）および３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して発色させ、可視化した。次に、着色したブロットをＢｃｌ−２タンパク（配列番号２１）のａａ６１−７６に向けられた第２の抗−Ｂｃｌ−２抗体とインキュベートし、さらに０．２５μＣｉ/mLの＊125Ｉ−タンパクＡとインキュベートした。Ｂｃｌ−２バンドをブロットから切り取り、ガンマ計測にかけた。
【００６５】
Ｂｃｌ−２タンパクのミトコンドリア位置にもかかわらず、ｐ２６−Ｂｃｌ−２のレベル以外は同一の細胞においてミトコンドリア酵素によるＭＴＴ染色の低下には差が見られなかった。これらの比較は、１つはリコンビナントｂｃｌ−２レトロウイルスにより安定的に感作された種と、他方はｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ挿入が欠質している親レトロウイルスベクターである点だけが異なる一対の指数増殖リンパ腫細胞種を使用して行われた（ミヤシタら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５４０７（１９９２）；Ｂｌｏｏｄ８１：１５１（１９９３））。
【００６６】
ｂｃｌ−２ ｍＲＨＡのアンチコード特異性の相対レベルの低下は、半定量的逆トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイにより１日以内に検出された図１１（ａ）参照。
ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を、無血清培地ｙ（１３，１９）１mL当り５μｇのカチオン脂質（リポフェクチン；ＢＲＬ/Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．）を複合化した０．８３μｇ/mLのオリゴマーとともに培養した。図８Ａにおいて、ＲＮＡ全量を１日後に細胞から単離し、ｂｃｌ−２およびグリセルアルデヒド３'−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの相対レベルを、キタダら，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲ＆Ｄ ３：１５７（１９９３）に記載のＲＴ−ＰＣＲアッセイで評価した。
【００６７】
図１１（ｂ）において、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をＰＳ（四角）またはＰＯ/ＰＳ（丸）Ａｓ−およびＳｃ−オリゴマーのいずれかのペアとともに３日間培養した。次いで、Ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルを上記のように定量イムノブロットアッセイを使用して測定し、そのデータを対照Ｓｃ−オリゴマーで処理した細胞の場合に対するパーセンテージで表した。挿入図は、Ａｓ−ＰＯ/ＰＳオリゴマーがＢｃｌ−２タンパクレベルを相対的に４１％低下させた場合の、ｐ２６−Ｂｃｌ−２およびｐ７５のクロス反応（ＣＲ）バンドのイムノブロット結果を示す。図１２においては、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の培養物にＰＳ（四角）またはＰＯ/ＰＳ（丸）オリゴマーを添加した１日後に１０-4ＭのＡｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、またはＤＥＸを添加し、３日目にＭＴＴアッセイを行ったものである。データはオリゴマーの非存在下で薬剤とともに培養された細胞の対照に対する相対パーセントで表されており、１０個の連続実験のうちの９実験の結果を表している[１つの実験でＭＴＴアッセイは失敗]。細胞生存性を評価するのにＭＴＴアッセイではなく色素排除アッセイを使用した場合にも同様の結果が、得られた[図示なし]。
【００６８】
データの平均値は横線で示されている。データの統計的分析はペアのＴ−試験（Ａｓ対Ｓｃ）によるものである。Ａｓ−およびＳｃ−オリゴマー（１５０ｎＭ）の濃度は、配列特異性を維持しながらＡｓの効果を最大にするように調節した。
開始ＲＮＡの量の変動はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析によりコントロールした。
ｂｃｌ−２タンパクの長い半減時間（約１４時間）はｂｃｌ−２タンパクのＡｓ介在による減少がｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの減少ほど劇的でないことを示すものであり、達成するのに長時間（約３日間）かかり、かつ変動が大きいようである。
【００６９】
図１１（ｂ）は、ＡＳまたはＳＣオリゴマーで処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞中のｂｃｌ−２タンパクの相対レベルを比較した１０実験をあわせた結果を示すものである。ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は６６％と高いものから１０％と低いものまでの範囲にあり、対照オリゴマーにより同様に処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の場合と比較している。Ｆ1−ベータ−ＡＴＰアーゼおよびチトクロムＣ、のような対照ミトコンドリアタンパクのレベルの違いはＡＳ−オリゴマーによって影響を受けることはなく（図示なし）、ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は特異的なものであることを示している。たとえば 図１１（ｂ）の挿入部分は、イムノブロットアッセイに採用されているウサギ抗血清の１つと交差反応する７８−ｋＤａタンパクとｐ２６−Ｂｃｌ−２との比較を示しており、対照ＳＣ−オリゴマーを受け取った細胞との対比においてｐ２６−ｂｃｌ−２のレベルは低下し、ｐ７８のレベルは低下しないことを示している。
【００７０】
Ｂ．ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーで処理した場合の癌化学療法剤に対する細胞感受性の効果
本検討はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞をｂｃｌ−２ ＡＳ−オリゴマーで処理した場合に、抗癌剤であるＡｒａ−Ｃ，ＭＴＸ，およびＤＥＸなどの癌化学療法剤による細胞死に対する相対的な感受性を増加させるものかどうかを調べるために行った。
以前の対照検討においてｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞成長および生存に、少なくとも培養の最初の３日間はわずか、またはまったく効果のないことが示されている（キタダら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ＆Ｄ ３：１５７（１９９３））。これらのリンパ腫細胞ならびにその他の細胞におけるｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は、典型的には、培養中の細胞から血清成長ファクターが取り除かれないかぎり、細胞死滅速度を加速しない（リードら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３６６０（１９９０））。
【００７１】
本検討においては、予備試験において高用量（１０-4）のＡｒａ−Ｃ，ＭＴＸ，またはＤＥＸによる４日間の治療後にも９０％以上のＳＵ−ＤＨＬ−４細胞が生存することが示されているが、これはおそらくそれらのｂｃｌ−２タンパクの高いレベルによるものと考えれる（図示なし）。しかしながら、これらの濃度においてはすべての薬剤は基本的にＳＵ−ＤＨＬ−４細胞増殖の完全な抑制を誘発し、ｂｃｌ−２が薬剤を細胞毒性から細胞抑制性へ転換させるのと一致している。ＡＳおよびＳＣオリゴマーの比較では、ｂｃｌ−２ＡＳ処理はこれらのリンパ腫細胞のＭＴＸおよびＡｒａ−Ｃに対する感受性を著しく増強し、またＤＥＸに対しても多少の増強を示した（図１２）。
【００７２】
結果にいくらかのばらつきがあるが、平均的にはＭＴＸまたはＡｒａ−Ｃで処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の培養物へのｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの添加は、本発明のｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーを導入せずにそれらのいずれかの薬剤を単独で（ＡＳ対ＳＣの場合Ｐ＜０．００２）使用した場合に比べて７９−８４％大きな抑制効果（生存細胞数の減少）をもたらした。ＤＥＸ処理したＳＵ−ＤＨＬ−４細胞（Ｐ＝０．０１）において統計的に重要な結果が得られた。対照オリゴマー処理した細胞で生存細胞数の２０−３０％の減少が観察されたことは、配列の非特異性の程度を反映しているものと考えられるが、これは多分細胞へのオリゴマーの送出を容易にするためにカチオン脂質を使用したことに関係するものであろう。
【００７３】
Ｃ．ヒトｂｃｌ−２タンパクをコードする発現プラスミドを有する形質移入細胞の化学療法剤に対する感受性に対する効果
化学療法抗ガン剤に対する感受性を高めるためのｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの配列特異性を更に確認するため、ヒトｂｃｌ−２タンパクまたはｂｃｌ−２と２２％しか相同性を有しないｂｃｌ−２のウイルスホモローグであるＢＨＲＦ−１のいずれかをコードする発現プラスミドを安定的に移入させたインターロイキン−３（ＩＬ−３）依存のマウス造血細胞株３２Ｄ．Ｃ１３を用いた研究を行った。３２Ｄ．Ｃ１３細胞はペンシルバニア州フィラデルフィアのウィスター研究所のジョバンニ・ロベラ（Giovanni Rovera ）博士から入手した。
【００７４】
３２Ｄ細胞のオリゴマー／カチオン脂質複合体による処理は、５０単位／mLのマウスリコンビナートＩＬ−３（ｒｌＬ−３）をＨＬ−１培地に含有させ、初期細胞濃度を１０5/mLとし、また、細胞をオリゴマーに暴露してから３０分後に複製欠陥アデノウイルスｄｌ３１２（ＭＯＩ＝２００）を加え、ＤＮＡのエンドソームからの脱離を容易にしたことを除けば上記と同じであった［ヨシムラ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２３００、（１９９３）］。
【００７５】
ヒトｐ２６−Ｂｃｌ−２またはＥＢＶ ｐ−１９−ＢＨＲＦ−１（タカヤマＳらより提供）をコードする発現プラスミドを安定的に移入させた３２Ｄ細胞を：ＩＬ−３とＰＯ／ＰＳオリゴマーを含む培地（１０5／mL）中で３日間培養し、ヒトＢｃｌ−２タンパクレベルを減少させた。その後、本細胞をオリゴマーのみ（Ｃ）で、または各種濃度のＭＴＸと組み合わせて再処理し、２日後にＭＴＴアッセイにより相対生存可能細胞数を調べた。データは三重決定をするための平均＋／−標準偏差を表し、ＭＴＸを受け取らなかった細胞に対する相対％で表している。１０-6〜１０-4ＭのＭＴＸについてのデータの統計解析は、変数の二方向解析法（フィニー（Finney）、Ｄ．Ｊ．「生物アッセイにおける統計手法」、ｐ．７２，１９７８（第３版、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ）によって行った。比較結果を色素排除試験により得た［図示なし］。
【００７６】
３２Ｄ−ＢＣＬ−２細胞内のヒトｂｃｌ−２構成体に由来するＲＮＡが、ｂｃｌ−２ＡＳオリゴマーの標的であった。一方、ＢＨＲＦ−１発現プラスミドに由来するＲＮＡは標的ではない。従って、ＢＨＲＦ−１を発現する３２Ｄ．Ｃ１３細胞の細胞毒性薬剤に対する化学的感受性は、ＡＳ処理の影響は受けていないはずである。
予備実験によれば、ＩＬ−３を３２Ｄ．Ｃ１３細胞から離脱させると、内因性マウスｂｃｌ−２タンパクのレベルが減少し、細胞は死枯した。ｂｃｌ−２とＢＨＲＦ−１は、ＩＬ−３が存在しない状態で３２Ｄ．Ｃ１３細胞の生存を同程度にサポートした。これらタンパクを高レベルで含む３２Ｄ．Ｃ１３細胞の増殖率は、ＩＬ−３の存在下においてはほぼ同じであった。従って、これらの変数を化学的感受性の差異を説明するものとして除外している。
【００７７】
図１３および図１４は各種濃度のＭＴＸに対する３２Ｄ−ＢＣＬ−２と３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞の感受性を比較している。ｂｃｌ−２ ＡＳ−オリゴマーによる処理の結果、濃度が１０-6〜１０-4Ｍ（ＡＳ対ＳＣの場合Ｐ＜０．００１）のＭＴＸによる阻害に対する３２Ｄ−ＢＣＬ−２細胞の感受性について配列特異的な増加がみられた。これに対し、ｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーによる処理は、コントロールＳＣ−オリゴマー（図１３および図１４）に比べ、３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞のＭＴＸに対する感受性については著しい差異はもたらさなかった。これらのデータは細胞毒性薬剤に対する化学的感受性へのｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーの効果は配列特異的であることを示している。更に、ｂｃｌ−２センス、ＡＳと同じヌクレオシド組成を有するその他の混合配列（scrambled sequences）、および全く無関係な配列を有するオリゴマーを含むその他のいくつかの対照オリゴマーは、全て本細胞の化学感受性にはほとんど効果を有しなかった（図示なし）。
【００７８】
上記の結果は、ｂｃｌ−２ ＡＳオリゴマーが配列特異的なｂｃｌ−２ｍＲＮＡとｂｃｌ−２タンパクレベルの減少をもたらし、またこれらの結果は抗ガン剤などの化学療法剤に対する感受性の向上に関連していることを示したものである。化学療法剤により死滅させられた腫瘍細胞の量は、本発明のｂｃｌ−２ＡＳオリゴマー不在下での同じ量の化学療法剤により死滅させられた腫瘍細胞の量よりも多かった。
【００７９】
Ｄ．ヒトｂｃｌ−２タンパクをコードする発現プラスミドを有する形質移入細胞の化学療法剤に対するリンパ腫細胞の感受性に対する効果
別の方法を用いて、他のトランスローケーションｔ（１４；１８）含有リンパ腫株であるＲＳ１１８４６中の重金属応答性ヒトメタロイオネインＩＩＡプロモーターを使用した誘発性ｂｃｌ−２ ＡＳ発現プラスミドが、ｂｃｌ−２遺伝子発現 をＡＳの媒介によって減少させ得るかどうかを調べた。ＲＳ１１８４６はカーロ・クロース（Carlo Croce ）博士から入手した（ペンシルバニア州フィラデデルフィアのウィスター研究所（ツジモトとクロース、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：５２１４（１９８６））。
【００８０】
発現プラスミドの調製は、０．９１ｋｂｐのｂｃｌ−２ ｃＤＮＡ（前記中に）を、プラスミドｐＭＥＰ−４（Invitrogen, Inc.）中のヒトメタロイオネイン−ＩＩＡプロモーターの下流側のＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンチセンス（ＡＳ）またはセンス（Ｓ）配向でサブクローニングした。プラスミドｐＭＥＰ−４は、コピーエピソームを高く維持するために、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＥＢＮＡ−１遺伝子、エプスタイン−バールウイルスからのＤＮＡ複製の源を含む。
【００８１】
３０μｇのプラスミドＤＮＡを含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水中のＲＳ１１８４６細胞（５×１０6）を、エクイビオ社（Equi Bio, Inc.）のセルジェクト・エレクトロ ポーレーション装置を用いて電気穿孔（１５００μＦ、２７０ｖ／ｃｍ）した。細胞は通常の培養培地（１０％胎仔ウシ血清、１ｍＭＬ−グルタミン、５０単位／mLのペニシリン、および１００μｇ／mLのストレプトマイシン添加ＲＰＭ Ｉ−Ｌ １６４０）に１mLあたり２×１０5細胞数で戻し、２日間培養し、２００μｇ／mLのハイグロマイシンを含む培地に１mLあたり２×１０5細胞数で細胞を播種した。３週間の培養後、得られた細胞株のバルクを、濃度が１mg／mLに到達するまで（およそ４週間）２００μｇ／mLづつハイグロマイシンの濃度を連続的に増加させながら継代培養した。
【００８２】
ハイグロマイシン抵抗性ＲＳ１１８４６細胞を、０．５μＭのＣｄＣｌ2を含むＲＰＭＩ／１０％血清培地で培養し、３日後に２５μｇタンパク／レーンを用いて免疫ブロットアッセイを行った。基本的にはタナカ ＳらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１０９２０（１９９３年）およびリード（Reed）らのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６５２９（１９９１年）に記載の方法に従った。
【００８３】
図１５〜図１８に示すように、コントロール（“Ｃ”）およびｂｃｌ−２−Ａｓ（“Ａｓ”）プラスミドをＲＳ１１８４６細胞に導入し、各種時間かけて０．５μＭのＣｄＣｌ2または５０μＭのＺｎＣｌ2のいずれかを用いて発現を誘発した。追加コントロールとして、ｂｃｌ−２ ｃＤＮＡをセンス（“Ｓ”）配向した誘発性 プラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞についても分析した。ＲＳ１１８４６細胞を３日かけて誘発し、タナカらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９２０（１９９３）に記載の免疫ブロットアッセイにより、Ｂｃ１−２およびＦ1−β−ＡＴＰａｓｅタンパクの相対レベルを評価した。図１５において、ＲＳ１１８４６細胞を１０5細胞／mLで０．５μＭのＣｄＣｌ2を含む培地で培養し、１日後に１０-7ＭのＡｒａ−Ｃまたは同等容量の希釈液を加えた。相対生存可能細胞数を各種時点においてＭＴＴアッセイにより評価し、三重のサンプルについて平均＋／−Ｓ．Ｄ．を計算した。図１６〜１８においては、ＲＳ１１８４６細胞は各種濃度のＡｒａ−Ｃ、ＭＴＸ、またはＤＥＸを加える以外は図１５と同様に培養した。データは三重サンプルについての平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。変数の二方向解析により統計計算を行った。ＲＳ１１８４６細胞はグルココルチコイド・レセプターを失っているので、ここではＤＥＸは陰性コントロールとして働いた。
【００８４】
予備実験の結果、ＲＳ１１８４６細胞は０．５μＭまでのＣｄＣｌ2またはＺｎＣｌ2が培養に添加されても１週間耐えることが示され。成長速度に多少の低下がみられたが、本質的には細胞生存率は減少しなかった（結果は略）。
【００８５】
重金属誘発がない場合には、コントロールまたはｂｃｌ−２ ＡＳプラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞におけるｂｃｌ−２タンパクの相対レベルは似通っており、免疫ブロットアッセイ結果（結果は略）の示すとおりであった。０．５μＭのＣｄＣｌ2またはＺｎＣｌ2を加えた場合、ｂｃｌ−２タンパクの減少がＡＳ−発現細胞において２日で明白となり、コントロールＲＳ１１８４６細胞に対して３０−４０％の最大抑制が３日〜４日で得られた。
【００８６】
図１５は０．５ｍＭのＣｄＣｌ2に暴露してから３日後のＲＳ１１８４６細胞に関する免疫ブロットデータの一例を示す。このデータによれば、対照プラスミドを有するＲＳ１１８４６細胞に比べ、ＡＳ−プラスミドを含む細胞におけるｂｃｌ−２タンパクのレベルは減少している。コントロールのミトコンドリア・タンパクＦ1−β−ＡＴｐａｓｅの相対レベルは、全ての細胞株において類似し、ｂｃｌ−２タンパクレベルの配列特異的変化と一致した。
コントロールまたはｂｃｌ−２−Ａｓプラスミドのいずれかを含むＲＳ１１８４６細胞を、０．５μＭのＣｄＣｌ2または５０μＭのＺｎＣｌ2内で各種時間培養した場合、これら２つの細胞株の成長速度には著しい差はみられなかった（図１１（ｂ））。従って、Ｂｃｌ−２タンパクレベルのＡＳ介在による減少は、それ自身ではＲＳ１１８４６細胞の増殖または生存を損なうことはなかった。
【００８７】
コントロールＲＳ１１８４６細胞の培養物に低量のＡｒａ−Ｃ（１０-7Ｍ）を加えた場合、正味生存可能細胞数に若干の減少がみられただけであった。これは、これらｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞中の高レベルＢｃｌ−２タンパクによるもとの思われる。これに対し、１０-7Ｍ Ａｒａ−Ｃをｂｃｌ−２−ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞の培養物に加えると著しい抑制効果があった（図１１（ｂ））。しかし、Ａｒａ−Ｃは、対照プラスミドを含むＲＳ１１８４６細胞と同じ条件下で直接比較した場合（結果は略）、ＭＴプロモーターの重金属誘発不在下では、ｂｃｌ−２ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞に対する効果を示さなかった。図１２は、ｂｃｌ−２−ＡＳ発現ＲＳ１１８４６細胞で観察されたＡｒａ−Ｃに対する高感受性が、広い範囲の薬剤濃度にわたって（Ｐ＜０．００１）いたことを示している。ｂｃｌ−２−ＡＳ発現プラスミドの重金属誘発もまた、ＲＳ１１８４６リンパ腫細胞のＭＴＸ（Ｐ＜０．００１）に対する相対感受性を著しく増加させたが、ＤＥＸに対する相対感受性を増加させることはなかった。グルココルチコイド・レセプター結合アッセイの結果、ＲＳ１１８４６細胞はこれらステロイドホルモンのレセプターを失っており［結果は略］、このようにして、ｂｃｌ−２タンパクレベルの、ＡＳ介在による減少だけではこれらリンパ腫細胞の成長あるいは生存を妨げるには不十分であることを示す特異性の制御を提供している。
【００８８】
本発明は、ｂｃｌ−２タンパクの相対レベルの平均３０〜４０％の減少が、リンパ腫細胞の感受性、特に従来の抗ガン剤などの化学療法剤に対するｔ（１４；１８）含有リンパ腫細胞株の感受性を著しく高めたことを、複数のアンチコード手法を用いて示した。これら実施例は請求の範囲に記載したアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入すると、ｂｃｌ−２発現の減少をもたらし、新生物細胞の化学療法剤または抗ガン剤に対する化学的感受性を増大させることを示した。
【００８９】
従って、本発明は抗ガン剤を含む化学療法剤と腫瘍細胞を接触させる前にｂｃｌ−２遺伝子発現を減少させる、またはＢｃｌ−２タンパク機能を損なわせるアンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入することにより腫瘍細胞を死滅させる方法を達成した。従来の抗ガン剤は生存可能な悪性細胞数を減少させ、また死滅させた腫瘍細胞の量は、アンチコードオリゴマーを腫瘍細胞に導入しない状態で同量の薬剤により死滅させられたであろう量よりも多かった。以上、本発明の実施例を開示したが、本開示は説明のためのものであり、その他各種変更、改造等を本発明の範囲内で行ってもよいことは当業者には明白である。従って、本発明はここに説明した特定の実施例に限定されるものではなく、以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】各種濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＴＩ−ＡＳ：（ａ）、ＳＤ−ＳおよびＳＤ−ＡＳ：（ｂ））が細胞増殖阻害に及ばす影響を示すグラフである。
【図２】各種濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＴＩ−ＳおよびＴＩ−ＡＳ：（ａ）、ＳＤ−ＳおよびＳＤ−ＡＳ：（ｂ））が細胞増殖阻害に及ばす影響を示すグラフである。
【図３】アンチセンス正常オリゴデオキシヌクレオチドおよびフォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖阻害の濃度依存性を示すグラフである。培養物に対するオリゴデオキシヌクレオチド添加は次の通りである：ＴＩ−ＡＳフォスフォロチオエート（○および○；２つの別個の実験）、ＴＩ−Ｓフォスフォロチオエート（△）、ＴＩ−ＡＳ正常（□）、およびＴＩ−Ｓ正常（△）。
【図４】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を標的とした６つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Oligo １〜６は、配列番号８〜１３に対応する）のゲル電気泳動像である。
【図５】ＲＳ１１８４６細胞のオリゴヌクレオチド処置によってもたらされたＤＮＡの断片化の程度を示す。（ａ）は翻訳開始部位を標的としたオリゴヌクレオチドの効果を示す。（ｂ）はｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの５'−キャップ領域を標的としたオリゴヌクレオチドの効果を示す（（ｂ）中の数値は、用いたオリゴマーの翻訳開始コドンから非翻訳領域への距離（塩基数）を示す）。
【図６】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害の濃度依存性を示すグラフである。
【図７】オリゴヌクレオチドで処理した細胞中のｂｃｌ−２タンパクレベルを免疫蛍光法で分析した結果を示すグラフである。
【図８】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの翻訳開始領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害の濃度依存性を示すグラフである。
【図９】（ａ）および（ｂ）は、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理の前後における、６９７細胞のＦＡＣＳ像である。
【図１０】（ａ）および（ｂ）は、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理の前後における、６９７細胞のＦＡＣＳ像である。
【図１１】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡおよびｂｃｌ−２タンパクを配列特異的に減少させかつ癌化学療法剤に対するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の感受性を増大させるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【図１２】ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡおよびｂｃｌ−２タンパクを配列特異的に減少させかつ癌化学療法剤に対するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の感受性を増大させるｂｃｌ−２アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【図１３】ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーが３２Ｄ−ｂｃｌ−２細胞の化学的感受性に及ぼす効果の差異を示す。
【図１４】ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーが３２Ｄ−ＢＨＲＦ−１細胞の化学的感受性に及ぼす効果の差異を示す。
【図１５】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１６】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１７】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１８】発現プラスミドから誘導可能なｂｃｌ−２アンチセンス発現によってもたらされたＲＳ１１８４６細胞の化学的抵抗性の低下を示す。
【図１９】ＤＯＨＨ２リンパ腫細胞を死滅させるメチルフォスフォネート／リン酸ジエステルｂｃｌ−２アンチセンスオリゴマーを示す。
【図２０】ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の成長を阻害するメチルフォスフォネート（ＭＰ）／リン酸ジエステル（ＰＯ）キメラオリゴマーを示す。
【図２１】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【図２２】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【図２３】アンチセンスｂｃｌ−２オリゴマー配列の最適化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７、当該配列中の少なくとも１個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー；（ｉｉ）１又は２以上の癌化学療法剤；および（ｉｉｉ）医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、ｂｃｌ−２タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
【請求項２】
各内部ヌクレオチドフォスフェート結合中の非ブリッジ酸素の一つがイオウ原子に置換しているものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
アンチコードオリゴマーが、フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも２個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも３個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
癌が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、プレＢ−細胞型のリンパ性白血病、神経芽細胞腫、鼻咽頭カルチノーマ、前立腺アデノカルチノーマ、胸部アデノカルチノーマ、又は大腸アデノカルチノーマである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌がリンパ腫、又は白血病である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌が前立腺、胸部、消化管、または大腸のアデノカルチノーマである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒト用である請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アンチコードオリゴマーが、全てのヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合であることで特徴づけられる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬として許容される担体がカチオン性脂質であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アンチコードオリゴマーがリポソームに包まれていることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌化学療法剤がデカルバジン、パクリタキセル、エトポシド、２−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン、ｍＡＭＳＡ、ヘキサメチルメラミン及びミトロキサントロンから選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
癌化学療法剤が代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド及び抗生物質から選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
代謝拮抗物質がメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素及び２−クロロデオキシアデノシンから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
アルキル化剤がシクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル及びナイトロジェンマスタードから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
植物アルカロイドがビンクリスチン、ビンブラスチン及びＶＰ−１６から選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗生物質がドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ及びブレオマイシンから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１】
（ｉ）配列ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７、当該配列中の少なくとも１個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー；（ｉｉ）１又は２以上の癌化学療法剤；および（ｉｉｉ）医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、ｂｃｌ−２タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
【請求項２】
各内部ヌクレオチドフォスフェート結合中の非ブリッジ酸素の一つがイオウ原子に置換しているものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
アンチコードオリゴマーが、フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも２個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
フォスフォジエステル／フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも３個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
癌が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、プレＢ−細胞型のリンパ性白血病、神経芽細胞腫、鼻咽頭カルチノーマ、前立腺アデノカルチノーマ、胸部アデノカルチノーマ、又は大腸アデノカルチノーマである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌がリンパ腫、又は白血病である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌が前立腺、胸部、消化管、または大腸のアデノカルチノーマである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒト用である請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アンチコードオリゴマーが、全てのヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合であることで特徴づけられる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬として許容される担体がカチオン性脂質であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アンチコードオリゴマーがリポソームに包まれていることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌化学療法剤がデカルバジン、パクリタキセル、エトポシド、２−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン、ｍＡＭＳＡ、ヘキサメチルメラミン及びミトロキサントロンから選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
癌化学療法剤が代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド及び抗生物質から選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
代謝拮抗物質がメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素及び２−クロロデオキシアデノシンから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
アルキル化剤がシクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル及びナイトロジェンマスタードから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
植物アルカロイドがビンクリスチン、ビンブラスチン及びＶＰ−１６から選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗生物質がドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ及びブレオマイシンから選択される、請求項１４記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００９−２９８１２（Ｐ２００９−２９８１２Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９４３４４（Ｐ２００８−１９４３４４）
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【分割の表示】特願２００６−１１１５４５（Ｐ２００６−１１１５４５）の分割
【原出願日】平成６年９月２０日（１９９４．９．２０）
【出願人】（５０２１７８６８７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【分割の表示】特願２００６−１１１５４５（Ｐ２００６−１１１５４５）の分割
【原出願日】平成６年９月２０日（１９９４．９．２０）
【出願人】（５０２１７８６８７）
【Ｆターム（参考）】
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