ヒト上皮細胞修復で用いるジエン化合物、並びにそれを含有する医薬及び化粧品組成物
本発明は、サイトケラチンｃＫ−１９によって媒介されるケラチンの産生によってヒト上皮細胞修復活性を向上させるための医薬又は化粧品組成物における有効成分としての、一般式（Ｉ）：ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ（Ｉ）［式中、ｎ＝２〜７であり、Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物の単独又は混合物での新規な使用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ケラチンフィラメントの網の目は、一般に構造骨組として役立ち、個々の細胞だけでなく、上皮層全体の機械的な支持をも提供する。ケラチンは、ケラチン１型（ケラチン９〜２３）及びケラチン２型（ケラチン１〜８）のヘテロ二量体を形成するように構築された中間径フィラメントタンパク質のファミリーを構成する。その二重の、上皮組織タイプと分化特異的制御のため、ケラチンは、サイトケラチンの特異的ｍＲＮＡ発現プロファイル（ｃＫ ｍＲＮＡ）を用いて上皮分化を研究するのに有用な手段である。
【背景技術】
【０００２】
ケラチン１型及び２型は、同義遺伝子ファミリー（それぞれが２５を超えるメンバーを持つ）によってコードされ、それらは、上皮細胞の細胞質における中間寸法のフィラメントを産生するため、互いに必ずヘテロ多量体化する（Ｈｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｃｏｕｌｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ，２００１）。
・ケラチンＩ型（Ｋ９−Ｋ２１；Ｈａ１−Ｈａ８）は、４０〜６３ｋＤａの範囲に及び、より酸性である。
・ケラチンＩＩ型（Ｋ１−Ｋ８；Ｈｂ１−Ｈｂ６）は、より大きく（５３〜６７ｋＤａ）、より塩基性である。
【０００３】
Ｋ１６は、無傷のヒトの皮膚において珍しく又は確認できず、多数の複合上皮においてＫ６イソ型と共に発現されるが、その発現と上皮のあらゆる特定最終分化プログラム又は機能との間には、明らかな相互関係はない。
【０００４】
Ｋ１６の発現は、急性負荷によって強く誘発され、異常な上皮分化を伴う病気と関連している。ｃＫ−１６は、皮膚刺激の早期兆候のマーカーである。
【０００５】
成人の皮膚において、Ｋ１９は、毛包の根の外鞘に限定されており、上皮では検出されていない。各種上皮においてＫ１９が陽性である細胞の特定部位は、それが上皮の前駆体のマーカーになり得るという仮説を立てた。上記皮膚において、この考えは、３Ｈ−チミジンで標識された細胞が確認された毛包の「バルジ領域」においてＫ１９が存在することを根拠にして提案された。ｃＫ１９は、レチノイン酸及びその誘導体によって上記皮膚において選択的に発現され、上皮分化の促進における役割を示す。
【０００６】
ｃＫ１０〜ｃＫ１４は、有糸分裂活性のマーカーである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ｃＫ−１９サイトケラチンによって媒介されるケラチン産生を介してヒト上皮細胞修復を向上させるための医薬又は化粧品組成物における有効成分としての、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物の単独又は混合物での新規な使用に関するものである。
【０００８】
生体外で再構築された上皮に関する実験的な研究が、本願明細書の以下の段落において報告されるが、驚くべきことに、本発明に係る化合物で処理された上皮の最終分化においてｃＫ−１９の発現の増加を示した。
【０００９】
また、本発明は、治療分野及び化粧品分野の両方における上述の用途の組成物であり、上述の有効成分と、特に皮膚への使用に、適切な任意の賦形剤とを含む組成物に関するものである。
【００１０】
本発明において想定された用途用の式（Ｉ）に対応する好適な化合物は、以下のとおりである。
２，４，６−オクタトリエン−１−オール（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
２，４，６−オクタトリエン酸（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
２，４，６−オクタトリエン酸ナトリウム塩（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステル（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：５９４１−４９−１
２，４，６−オクタトリエン酸Ｌ−リシン塩，ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
２，４，６−オクタトリエン−１−オールアセタート（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃７９５４１−７９−０
２，４，６−オクタトリエン−１−オールパルミタート（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
【００１１】
以下に示す例は、本発明を説明するものであるが、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００１２】
以下、一般式（Ｉ）の化合物の一部についての特性データ及び式を与える。
【００１３】
【化１】
Ｃ８Ｈ１２Ｏ ｍｗ １２４．１８
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタトリエン−１−オール
ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
【００１４】
【化２】
Ｃ８Ｈ１０Ｏ２ ｍｗ １３８．１７
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタ−２，４，６−トリエン酸
ＣＡＳ＃：５２０５−３２−３
ナトリウム塩：Ｃ８Ｈ９Ｏ２Ｎａ ｍｗ １６０．１５，ＣＡＳ＃：利用不可
リシン塩：Ｃ８Ｈ９Ｏ２．Ｃ６Ｈ１５Ｎ２Ｏ２，ｍｗ ２８４．３６，ＣＡＳ＃：利用不可
【００１５】
【化３】
Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２ ｍｗ １６６．２２
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタ−２，４，６−トリエン酸エチルエステル
ＣＡＳ＃：５９４１−４９．１
【００１６】
【化４】
Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２ ｍｗ １６６．２２
２，４，６−オクタトリエン−１−オール，アセタート，（Ｅ，Ｅ，Ｅ）
ＣＡＳ＃：７９５４１−７９−０
【００１７】
【化５】
Ｃ２４Ｈ４２Ｏ２ ｍｗ ３６２．６０
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタトリエン−１−オール，パルミタート
ＣＡＳ＃：利用不可
【００１８】
以下のものは、上述の用途に特に適した組成物の非制限的な例である。
【００１９】
上記組成物の量は、重量対重量の百分率として示される。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
【表６】
【００２６】
【表７】
【００２７】
【表８】
【００２８】
以下に示す通り、添付図面の図１〜３を参照しながら、本発明の化合物の上皮に対する効果を実証するために研究を行った。なお、図１〜３は、以下、この研究、特に「結果」との関連で詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１３日目の再構築ヒト上皮組織（ＲＨＥ）における、処置の２４時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【図２】１５日目のＲＨＥにおける、処置の４８時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【図３】１７日目のＲＨＥにおける、処置の１２０時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
実験的な研究
１．序論及び目的
再構築されたヒト上皮組織（ＲＨＥ）等の３Ｄヒト組織培養物は、その組織機能性及び多層構造のために使用され、生体内の場合と同様に、浸透及び組織吸収を考慮する。
【００３１】
それらは、実験動物の使用に取って代わることを目的とし、また、ヒトへの試験との関連で物質の刺激力の予測を向上させるため、皮膚に関する生物学的調査及び適合性試験に適切で感受性のあるモデルとして認識されている（ＥＣＶＡＭ−Ａｔｌａ ３３ Ｓｕｐｐｌ １，４７−８１−２００５）。
【００３２】
本研究の目的は、以下に示す特定のサイトケラチンの発現に基づき、１１日間の分化から始まり１７日間にわたって、ＲＨＥにおける細胞修復に対する活性と毒性効果を試験することであった。
・ｃＫ−１６ サイトカイン活性化及び炎症のマーカー
・ｃＫ−１９ 試験される化合物の活性及び役割を評価する
・ｃＫ−１４ 基底レベルでの有糸分裂活性のマーカー
【００３３】
それら３つの遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ定量化及び免疫組織化学（ｃＫ１９及びｃＫ１６）によって評価された。
【００３４】
適切な細胞の再生を定義するための相補パラメータとして、研究の期間中、ＩＬ−１αの放出を監視した。
【００３５】
２．実験計画
２．１ 器具及び試薬
・メトラー・トレド 天びん Ｓ２０４ ０１ｇ
・ＣＯ２インキュベーター ＮｕＡｉｒ
・ＤＭＳＯ シグマ（バッチ Ｄ５８７９）
・リン酸緩衝食塩溶液−ＰＢＳ Ｆｌｕｋａ（バッチ ７９３８２）
・１０％緩衝ホルマリン−シグマ（ＨＴ ５０−１−１２８）
【００３６】
２．２ 実験モデル
上皮の形態を再生するＲＨＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標））０．５ｃｍ２を正確に特徴付けた：完全に分化した上皮は、所定の培地（ＭＣＤＢ１５３）における皮膚の生検から、ＮＨＫ（正常ヒトケラチノサイト）の１７日間のエアリフト培養後に発現する。
【００３７】
生体外でのヒトモデルと比べると、試験分子に対する浸透性の観点から、良好なバリア機能、良好なバッチ内再現性及び低い可変性が、文献に報告されている。
【００３８】
２．２ 実験条件
明確に規定された品質保証手順（ＩＳＯ認証９００２）に従って、組織を作製した。
【００３９】
上皮及び成長培地キットの全生物学的要素について、ウイルス、細菌及びマイコプラズマが存在するかどうか試験した。
【００４０】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＭＴＴ細胞毒性テストを用いて、最終産物の品質を確かめた。
【００４１】
到達次第、無菌空気の流れの下、アガロース栄養液からＲＨＥ（１１日目）を取り除いた。挿入物の下に気泡が形成するのを避けるように注意しながら、３７℃、０．５％ＣＯ２及び９０％相対湿度にて、成長培地１ｍｌが予め充填された６ウェルプレート中に挿入物を迅速に蒔いた。
【００４２】
ＲＨＥ（１２日目）の到達の２４時間後に研究を始めた。
【００４３】
研究の期間中に用いた成長培地を２４時間毎に取り換えた。
【００４４】
３．試験物質
本発明に従う以下の化合物を試験物質として選択した。
２，４，６−オクタトリエン−１−オール
２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステル（オクタトリエン酸エチル）
【００４５】
【表９】
【００４６】
３．１ 投与量及び曝露
０．２％の最終濃度を得るように、試験物質をＤＭＳＯ（シグマ）中で可溶化した。
この原液は、０．１％の有効成分を達成するためにＰＢＳ中で希釈された。
その溶液を試験まで−２０℃にて保存した。
マイクロピペットを用い、その溶液を２０μｌの単一用量で注意しながら各組織に適用した。
【００４７】
３．２ 対照
我々は、上記試験物質（２０μｌ）と同様の手順で適用されたレチノールを正の対照として考えた。
【００４８】
負の対照としては、以下のものである。
・ＰＢＳ中のＤＭＳＯで処理された１ＲＨＥ
・ＰＢＳで処理された１ＲＨＥ
【００４９】
【表１０】
【００５０】
４．方法
４．１ 組織学及び免疫組織化学
原理
組織学は、再構築組織に関する生体外での全ての研究において、重要な相補パラメータであり、生化学的分子結果を確認することを可能にする。皮膚修復過程の場合、組織学は、皮膚適合性及び組織再構築についての定量的情報を提供することができる。
【００５１】
免疫組織化学は、タンパク質発現の定量的評価を可能にする。
【００５２】
−材料
・ライカ顕微鏡ＤＭ２５００−２０Ｘ
・１０％ホルマリン−シグマ
【００５３】
−手順
研究期間の終了時に、その組織をＰＢＣで洗浄し、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、組織学的検査用に調製した。
【００５４】
その組織をパラフィンブロックに埋め込み、ミクロトーム上で切片（３〜５μ厚）に切り取った。次いで、その切片をスライドに移し、脱パラフィン及び脱水を行い、次いで、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００５５】
免疫組織学用に、ｐＨ＝６の１０ｎＭクエン酸塩緩衝液中で、Ｃｏｏｋｅｒ法により、抗原検索を行った。
抗体：
・ｃＫ１６：マウスモノクローナル抗体，クローンＬＬ０２５（Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ ＵＳＡ）
・ｃＫ１９：マウスモノクローナル抗体，クローンＫｓ１９．１（Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ ＵＳＡ）
信号増幅−ポリマー（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ ＵＳＡ）
酵素：酸化酵素（ＨＲＰ）
色素原：ＤＡＢ（Ｄａｋｏ）
対比染色：ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ）
【００５６】
４．２ リアルタイムＰＣＲ
４．２．１ ＲＮＡ抽出
−材料
・ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（ＡＭＢＩＯＮ）
【００５７】
−原理
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ法は、フェノール無しの急速濾過に基づきＤＮＡを単離するために用いるシステムである。
【００５８】
その方法は、カオトロピック濃縮食塩溶液中で核酸を結合するガラス繊維の能力に基づいている。サンプルは、細胞を溶解し且つ内在性リボヌクレアーゼを不活性化するグアニジウム塩の高濃縮溶液中で分裂する。フィルターカートリッジ内のフィルターのガラス繊維と結合するのに適格なＤＮＡを作るため、可溶化液をエタノールで希釈する。ＲＮＡはフィルターに結合するが、他の細胞成分は、フィルターを通って自由にスライドする。次いで、フィルターを３回洗浄し、非常に低いイオン強度の溶液にＲＮＡを溶出する。
【００５９】
４．２．２ ｃＤＮＡ逆転写
−材料
・大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００６０】
−原理
この方法の原理は、存在する全てのＲＮＡ分子の第一へリックスの効率的な合成を確保するｃＤＮＡ合成を始めるためにランダムプライマーを使用することに基づいている。
【００６１】
ｃＤＮＡは、希釈され、−２０℃で保存される。
【００６２】
４．２．３．リアルタイムＰＣＲ
−原理
「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ」機器は、蛍光に基づくＰＣＲ化学，ＴａｑＭａｎアッセイを用いる。
【００６３】
この技術は、蛍光信号を確認するためにＴａｑｍａｎプローブを用いる：それは、高い感受性があり、特定の核酸配列を増幅し定量化することにある。ＰＣＲ産物は、リアルタイムで検出される。ＰＣＲ産物を最初に確認できるサイクルを決定することによって、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡが定量化され、それ故に、反応が飽和に達する場合がない。その産物は、サイクル毎に測定される蛍光を検出することによって定量化される：信号の実体は、増幅した産物の量に正比例する。
【００６４】
試験サンプルの核酸配列と較正サンプルの同一配列の発現間の違いから、相対定量化を測定する。
【００６５】
遺伝子発現は、ＤＮＡ配列等の遺伝子の伝染性情報を遺伝子の機能性産物、即ちタンパク質又はＲＮＡに転換するプロセスである。
【００６６】
多くの遺伝子の発現は、転写後に調節されるため、ｍＲＮＡの濃度の増加がタンパク質の発現の増加を常に決定するのではない。そのため、ｍＲＮＡの研究が重要である。遺伝子の調節は、細胞に、構造及び機能の制御を与える。遺伝子発現のタイミング、部位及び量を制御することは、身体における遺伝子機能（作用）への計り知れない影響を与えることができる。
【００６７】
ｍＲＮＡの存在量を測定する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）である。ＲＴ−ＰＣＲにより得られるデータにおける低いレベルのノイズは、遺伝子発現を評価するための選択方法となることが多い。
【００６８】
−材料
・２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
・２０Ｘ ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現アッセイ
・「ヌクレアーゼフリー」水
・ＧＡＰＤＨ（内在性制御）Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１
・標的遺伝子：
【００６９】
【表１１】
【００７０】
−手順
各生物サンプルを三通りに加工した。Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及びｃＤＮＡ（２５ｎｇ）を「２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」に加え、全体積を２５μｌにした。
【００７１】
ＰＲＩＳＭ反応器７５００の工程は以下の通りであった。
【００７２】
【表１２】
【００７３】
４．２．４ ＲＴ−ＰＣＲ分析用のサンプル調製
ＤＮＡ抽出用溶解緩衝液３００μｌ中で、組織を均質化した。
【００７４】
４．３ ＥＬＩＳＡを用いた成長培地におけるＩＬ−１α定量化
−原理
インターロイキン１−αは、炎症の初期兆候として認められる。
【００７５】
ＩＬ−１αの放出は、製造者の取扱説明書に従って高感度の特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）キットを用い、本サンプリング時間にて、ＲＨＥの下、成長培地２００μｌ中でアッセイされた。最終産物は、４５０ｎｍで数量化された。
【００７６】
回復時間後速やかに各ＲＨＥの基礎成長培地を集め、プラスチック製冷凍バイアル中、−２０℃で保存した。
【００７７】
試験前に、該培地を室温にて調整した。その結果をＩＬ−１αのｐｇ／ｍｌとして表した。３．９〜２５０ｐｇ／ｍｌ間の濃度は感度の範囲内であると考えられた。
【００７８】
−材料
・Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｃｏｄｅ ＤＬＡ５０（ＩＬ−１）
・成長培地−ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ
・ミクロプレートオートリーダーＭ−１００ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｔｅｃａｎ
【００７９】
５．手順
時間及び分析を表Ｉに示す。
【００８０】
毎日、設定した時間にて、方法にて説明したように、対応するサンプルを分析用に加工した。
【００８１】
【表１３】
【００８２】
１日目−産物の適用
１日目で、ＲＨＥは、生後１２日であった。試験物質（２通り）及び対照を単回投与量（２０μｌ）で適用した。
次いで、ＲＨＥを更なる処置なしで２４時間インキュベートした。
【００８３】
２日目−２４時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
２４時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８４】
４日目−４８時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
４８時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８５】
６日目−１２０時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
１２０時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８６】
６．データ収集及び解釈
分析によりもたらされたデータを社内ソフトウェアＳＤＳ１．３．１に直接記録し、生の相対定量的データとして記録した。
【００８７】
その結果をエクセルにエクスポートした。
【００８８】
較正サンプルとの比較により遺伝子が±１ＳＤ増加したときの値を受け入れた。
【００８９】
組織学用サンプルを顕微鏡下で分析した。総合的な形態及び負の対照との比較によるあらゆる変化を評価し、実験報告に記録した。
【００９０】
組織学用サンプルをライカ顕微鏡ＤＭ２５００の下で分析し、ライカアプリケーションスイート（ＬＡＳ）ソフトウェアを用いて記録した。
【００９１】
６．結果
ＤＭＳＯによる対照は、ｃＫ１９の発現に関してＰＢＳによる対照と異なっていた：その結果は、較正用のＤＭＳＯによる対照を用いてもたらされ、添付のグラフに示される。
【００９２】
図１は、試験物質及び対照に関し、１３日目、２４時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す（上記識別コード参照）。
【００９３】
ｃＫ−１４は、ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ対照との比較により、ＰＢＳ対照において有意に増大したことが分かった。
【００９４】
２４時間後、有意なｃＫ−１６の発現の痕跡はなかった。
【００９５】
ｃＫ−１９は、ＰＲＴ及びＤＰＲＴで処理したサンプルにおいてかなり減少し、キャリブレーターの値と似ている調節レベルを示したＲＥＴ（正の対照）とは異なっていた。
【００９６】
図２は、１５日目、４８時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【００９７】
ＰＢＳ対照に関し、処理により誘導されたｃＫ−１４における有意な差異はなかった。
【００９８】
ｃＫ−１９は、ＰＢＳ対照との比較により、ＲＥＴ及びＰＲＴの両方の処理について減少したことが分かった。一方、ＤＰＲＴによる処理後の遺伝子の発現は、減少しなかった。
【００９９】
ｃＫ−１６の遺伝子発現は、３つ全ての試験物質による処理後の対照との比較により、低いことが分かった。
【０１００】
図３は、１７日目、１２０時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【０１０１】
処置後に、ＲＨＥの最終分化に対応した、有意な変化はｃＫ−１４及びｃＫ−１６の発現において見られず、一方、ｃＫ−１９の発現は、対照との比較により、処理組織で有意に増大した。
【０１０２】
ＰＲＴは、ＲＥＴの正の対照のものと同程度の増加を引き起こした。
【０１０３】
また、炎症の状態への長期的効果を研究するため、ＩＬ−１αの放出を監視した。その結果は以下のことを示した。
・２４時間後では、ＲＥＴによる処理後、ＩＬ−１αの放出は早いが非常に低く、ＰＲＴ又はＤＰＲＴについては、かかる放出がなかった。
・４８時間後では、ＰＲＴ及びＲＥＴの両方と、ＤＭＳＯ対照について、ＩＬ−１αの放出が有意であった。
・１２０時間後では、ＤＭＳＯ対照（０．２％）のみがサイトカインの著しい放出を示した。
【０１０４】
ＩＬ−１αは、一方で、組織学的結果に関連している必要があり、他方では、レチノイドの作用機序に関連している必要がある：４８時間後の結果は、組織学的観察（ＩＬ−１αの高い放出に対応する組織の損傷）との相互関係を示し、確認させるが、１２０時間後では、生細胞の非存在によって、ＲＥＴ及びＰＲＴについてのＩＬ−１αの放出がないことが説明される（壊死組織，Ｈ＆Ｅ組織学において示され、ｃＫ−１６の活性化により確認される）。
【０１０５】
レチノイドによる処理後のＩＬ−１αの放出は、皮膚レベルでの機能的意義を有する。レチノイド（特にレチノイン酸による処理後）は、基底ケラチノサイトによるＩＬ−１αの放出を介して、炎症促進性効果を有するが、この現象は、間接的上皮増殖促進活性にも関連している。この挙動は、ＲＨＥモデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２００２，１１；５９−７４ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｆ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．）において確認されており、このＩＬ−１αメッセージは、ｃＫではなく、皮膚線維芽細胞等の細胞下部と相関しているように思われる。
【０１０６】
【表１４】
【０１０７】
同一の垂直断面でさえ、同一の処置の分析において違いが明らかになったことを強調することが重要である。
【０１０８】
様々な処置後１７日目の上皮分化は、その対照と比較して満足できる。
【０１０９】
免疫組織化学的結果は、ｃＫ−１６の発現の転写の研究と一致する。
【０１１０】
反対に、ｃＫ−１９の発現は、その比較が最も重要な時、即ち１７日目での免疫局在性におけるＲＴ−ＰＣＲの結果で描かれる場合、全く観察されなかった：それらの所見の説明は、処理された組織で起こった形態変化（多くの壊死細胞）にあり、形質導入反応に影響を与えることができる。
【０１１１】
７．結論
上述の研究は、ヒト上皮の生体外モデルに関して行われ、セクション３．３「試験物質」において定義されるように、本発明に係る２つの化合物の活性を確認した。それを以下に示す。
・組織学分析に関し、ｃＫ−１６の発現及びＩＬ−１αの局在性は、考察された濃度（０．１％）での単一の急性投与後に、レチノール及び２，４，６−オクタトリエン−１−オールについて類似の毒性を示し、一方、オクタトリエン酸エチルは毒性の関連兆候を示さなかった。
・ｃＫ−１４の発現は、その対照との比較により、研究の期間中、著しく異ならず、本発明に係る２つの化合物又はレチノールによる処理により、有糸分裂活性が影響を受けなかったことを示した。
・ｃＫ−１９に関する転写の研究は、レチノール、２，４，６−オクタトリエン−１−オール又はオクタトリエン酸エチルによる処理後の生体外での再構築ヒト上皮組織（１７日目のＲＨＥ）の最終分化において、ｃＫ−１９の上方制御を示した。これは、本発明に係る化合物の細胞修復活性の有意な証拠を提供する。
・ＲＴ−ＰＣＲの結果は、先に結果で検討された理由により、免疫組織化学的所見によって確認されなかった。
【０１１２】
ＲＨＥにおけるｃＫ１０の発現
最後に、類似の方法を用いて行った別の研究において、ＲＨＥにおけるｃＫ１０の発現を、分化の１５日目及び１７日目に関して研究し、その免疫組織化学的発現によって記録した。ｃＫ−１０は、顆粒及び脊髄レベルでのケラチノサイトの末端分化のマーカーである。
【０１１３】
その結果が示すように、１７日目では、２，４，６−オクタトリエン−１−オールで処理したサンプルについての発現は、未処理の対照と比べて強く、レチノールサンプルについてはマイナスであり、本発明に係る化合物の優れた活性が確認された。
【技術分野】
【０００１】
ケラチンフィラメントの網の目は、一般に構造骨組として役立ち、個々の細胞だけでなく、上皮層全体の機械的な支持をも提供する。ケラチンは、ケラチン１型（ケラチン９〜２３）及びケラチン２型（ケラチン１〜８）のヘテロ二量体を形成するように構築された中間径フィラメントタンパク質のファミリーを構成する。その二重の、上皮組織タイプと分化特異的制御のため、ケラチンは、サイトケラチンの特異的ｍＲＮＡ発現プロファイル（ｃＫ ｍＲＮＡ）を用いて上皮分化を研究するのに有用な手段である。
【背景技術】
【０００２】
ケラチン１型及び２型は、同義遺伝子ファミリー（それぞれが２５を超えるメンバーを持つ）によってコードされ、それらは、上皮細胞の細胞質における中間寸法のフィラメントを産生するため、互いに必ずヘテロ多量体化する（Ｈｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｃｏｕｌｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ，２００１）。
・ケラチンＩ型（Ｋ９−Ｋ２１；Ｈａ１−Ｈａ８）は、４０〜６３ｋＤａの範囲に及び、より酸性である。
・ケラチンＩＩ型（Ｋ１−Ｋ８；Ｈｂ１−Ｈｂ６）は、より大きく（５３〜６７ｋＤａ）、より塩基性である。
【０００３】
Ｋ１６は、無傷のヒトの皮膚において珍しく又は確認できず、多数の複合上皮においてＫ６イソ型と共に発現されるが、その発現と上皮のあらゆる特定最終分化プログラム又は機能との間には、明らかな相互関係はない。
【０００４】
Ｋ１６の発現は、急性負荷によって強く誘発され、異常な上皮分化を伴う病気と関連している。ｃＫ−１６は、皮膚刺激の早期兆候のマーカーである。
【０００５】
成人の皮膚において、Ｋ１９は、毛包の根の外鞘に限定されており、上皮では検出されていない。各種上皮においてＫ１９が陽性である細胞の特定部位は、それが上皮の前駆体のマーカーになり得るという仮説を立てた。上記皮膚において、この考えは、３Ｈ−チミジンで標識された細胞が確認された毛包の「バルジ領域」においてＫ１９が存在することを根拠にして提案された。ｃＫ１９は、レチノイン酸及びその誘導体によって上記皮膚において選択的に発現され、上皮分化の促進における役割を示す。
【０００６】
ｃＫ１０〜ｃＫ１４は、有糸分裂活性のマーカーである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ｃＫ−１９サイトケラチンによって媒介されるケラチン産生を介してヒト上皮細胞修復を向上させるための医薬又は化粧品組成物における有効成分としての、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物の単独又は混合物での新規な使用に関するものである。
【０００８】
生体外で再構築された上皮に関する実験的な研究が、本願明細書の以下の段落において報告されるが、驚くべきことに、本発明に係る化合物で処理された上皮の最終分化においてｃＫ−１９の発現の増加を示した。
【０００９】
また、本発明は、治療分野及び化粧品分野の両方における上述の用途の組成物であり、上述の有効成分と、特に皮膚への使用に、適切な任意の賦形剤とを含む組成物に関するものである。
【００１０】
本発明において想定された用途用の式（Ｉ）に対応する好適な化合物は、以下のとおりである。
２，４，６−オクタトリエン−１−オール（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
２，４，６−オクタトリエン酸（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
２，４，６−オクタトリエン酸ナトリウム塩（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステル（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：５９４１−４９−１
２，４，６−オクタトリエン酸Ｌ−リシン塩，ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
２，４，６−オクタトリエン−１−オールアセタート（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃７９５４１−７９−０
２，４，６−オクタトリエン−１−オールパルミタート（Ｅ，Ｅ，Ｅ），ＣＡＳ＃：ｎ／ａ
【００１１】
以下に示す例は、本発明を説明するものであるが、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００１２】
以下、一般式（Ｉ）の化合物の一部についての特性データ及び式を与える。
【００１３】
【化１】
Ｃ８Ｈ１２Ｏ ｍｗ １２４．１８
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタトリエン−１−オール
ＣＡＳ＃：１３０９７１−００−５
【００１４】
【化２】
Ｃ８Ｈ１０Ｏ２ ｍｗ １３８．１７
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタ−２，４，６−トリエン酸
ＣＡＳ＃：５２０５−３２−３
ナトリウム塩：Ｃ８Ｈ９Ｏ２Ｎａ ｍｗ １６０．１５，ＣＡＳ＃：利用不可
リシン塩：Ｃ８Ｈ９Ｏ２．Ｃ６Ｈ１５Ｎ２Ｏ２，ｍｗ ２８４．３６，ＣＡＳ＃：利用不可
【００１５】
【化３】
Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２ ｍｗ １６６．２２
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタ−２，４，６−トリエン酸エチルエステル
ＣＡＳ＃：５９４１−４９．１
【００１６】
【化４】
Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２ ｍｗ １６６．２２
２，４，６−オクタトリエン−１−オール，アセタート，（Ｅ，Ｅ，Ｅ）
ＣＡＳ＃：７９５４１−７９−０
【００１７】
【化５】
Ｃ２４Ｈ４２Ｏ２ ｍｗ ３６２．６０
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−オクタトリエン−１−オール，パルミタート
ＣＡＳ＃：利用不可
【００１８】
以下のものは、上述の用途に特に適した組成物の非制限的な例である。
【００１９】
上記組成物の量は、重量対重量の百分率として示される。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
【表６】
【００２６】
【表７】
【００２７】
【表８】
【００２８】
以下に示す通り、添付図面の図１〜３を参照しながら、本発明の化合物の上皮に対する効果を実証するために研究を行った。なお、図１〜３は、以下、この研究、特に「結果」との関連で詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１３日目の再構築ヒト上皮組織（ＲＨＥ）における、処置の２４時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【図２】１５日目のＲＨＥにおける、処置の４８時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【図３】１７日目のＲＨＥにおける、処置の１２０時間後のｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
実験的な研究
１．序論及び目的
再構築されたヒト上皮組織（ＲＨＥ）等の３Ｄヒト組織培養物は、その組織機能性及び多層構造のために使用され、生体内の場合と同様に、浸透及び組織吸収を考慮する。
【００３１】
それらは、実験動物の使用に取って代わることを目的とし、また、ヒトへの試験との関連で物質の刺激力の予測を向上させるため、皮膚に関する生物学的調査及び適合性試験に適切で感受性のあるモデルとして認識されている（ＥＣＶＡＭ−Ａｔｌａ ３３ Ｓｕｐｐｌ １，４７−８１−２００５）。
【００３２】
本研究の目的は、以下に示す特定のサイトケラチンの発現に基づき、１１日間の分化から始まり１７日間にわたって、ＲＨＥにおける細胞修復に対する活性と毒性効果を試験することであった。
・ｃＫ−１６ サイトカイン活性化及び炎症のマーカー
・ｃＫ−１９ 試験される化合物の活性及び役割を評価する
・ｃＫ−１４ 基底レベルでの有糸分裂活性のマーカー
【００３３】
それら３つの遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ定量化及び免疫組織化学（ｃＫ１９及びｃＫ１６）によって評価された。
【００３４】
適切な細胞の再生を定義するための相補パラメータとして、研究の期間中、ＩＬ−１αの放出を監視した。
【００３５】
２．実験計画
２．１ 器具及び試薬
・メトラー・トレド 天びん Ｓ２０４ ０１ｇ
・ＣＯ２インキュベーター ＮｕＡｉｒ
・ＤＭＳＯ シグマ（バッチ Ｄ５８７９）
・リン酸緩衝食塩溶液−ＰＢＳ Ｆｌｕｋａ（バッチ ７９３８２）
・１０％緩衝ホルマリン−シグマ（ＨＴ ５０−１−１２８）
【００３６】
２．２ 実験モデル
上皮の形態を再生するＲＨＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標））０．５ｃｍ２を正確に特徴付けた：完全に分化した上皮は、所定の培地（ＭＣＤＢ１５３）における皮膚の生検から、ＮＨＫ（正常ヒトケラチノサイト）の１７日間のエアリフト培養後に発現する。
【００３７】
生体外でのヒトモデルと比べると、試験分子に対する浸透性の観点から、良好なバリア機能、良好なバッチ内再現性及び低い可変性が、文献に報告されている。
【００３８】
２．２ 実験条件
明確に規定された品質保証手順（ＩＳＯ認証９００２）に従って、組織を作製した。
【００３９】
上皮及び成長培地キットの全生物学的要素について、ウイルス、細菌及びマイコプラズマが存在するかどうか試験した。
【００４０】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＭＴＴ細胞毒性テストを用いて、最終産物の品質を確かめた。
【００４１】
到達次第、無菌空気の流れの下、アガロース栄養液からＲＨＥ（１１日目）を取り除いた。挿入物の下に気泡が形成するのを避けるように注意しながら、３７℃、０．５％ＣＯ２及び９０％相対湿度にて、成長培地１ｍｌが予め充填された６ウェルプレート中に挿入物を迅速に蒔いた。
【００４２】
ＲＨＥ（１２日目）の到達の２４時間後に研究を始めた。
【００４３】
研究の期間中に用いた成長培地を２４時間毎に取り換えた。
【００４４】
３．試験物質
本発明に従う以下の化合物を試験物質として選択した。
２，４，６−オクタトリエン−１−オール
２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステル（オクタトリエン酸エチル）
【００４５】
【表９】
【００４６】
３．１ 投与量及び曝露
０．２％の最終濃度を得るように、試験物質をＤＭＳＯ（シグマ）中で可溶化した。
この原液は、０．１％の有効成分を達成するためにＰＢＳ中で希釈された。
その溶液を試験まで−２０℃にて保存した。
マイクロピペットを用い、その溶液を２０μｌの単一用量で注意しながら各組織に適用した。
【００４７】
３．２ 対照
我々は、上記試験物質（２０μｌ）と同様の手順で適用されたレチノールを正の対照として考えた。
【００４８】
負の対照としては、以下のものである。
・ＰＢＳ中のＤＭＳＯで処理された１ＲＨＥ
・ＰＢＳで処理された１ＲＨＥ
【００４９】
【表１０】
【００５０】
４．方法
４．１ 組織学及び免疫組織化学
原理
組織学は、再構築組織に関する生体外での全ての研究において、重要な相補パラメータであり、生化学的分子結果を確認することを可能にする。皮膚修復過程の場合、組織学は、皮膚適合性及び組織再構築についての定量的情報を提供することができる。
【００５１】
免疫組織化学は、タンパク質発現の定量的評価を可能にする。
【００５２】
−材料
・ライカ顕微鏡ＤＭ２５００−２０Ｘ
・１０％ホルマリン−シグマ
【００５３】
−手順
研究期間の終了時に、その組織をＰＢＣで洗浄し、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、組織学的検査用に調製した。
【００５４】
その組織をパラフィンブロックに埋め込み、ミクロトーム上で切片（３〜５μ厚）に切り取った。次いで、その切片をスライドに移し、脱パラフィン及び脱水を行い、次いで、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００５５】
免疫組織学用に、ｐＨ＝６の１０ｎＭクエン酸塩緩衝液中で、Ｃｏｏｋｅｒ法により、抗原検索を行った。
抗体：
・ｃＫ１６：マウスモノクローナル抗体，クローンＬＬ０２５（Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ ＵＳＡ）
・ｃＫ１９：マウスモノクローナル抗体，クローンＫｓ１９．１（Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ ＵＳＡ）
信号増幅−ポリマー（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ ＵＳＡ）
酵素：酸化酵素（ＨＲＰ）
色素原：ＤＡＢ（Ｄａｋｏ）
対比染色：ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ）
【００５６】
４．２ リアルタイムＰＣＲ
４．２．１ ＲＮＡ抽出
−材料
・ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（ＡＭＢＩＯＮ）
【００５７】
−原理
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ法は、フェノール無しの急速濾過に基づきＤＮＡを単離するために用いるシステムである。
【００５８】
その方法は、カオトロピック濃縮食塩溶液中で核酸を結合するガラス繊維の能力に基づいている。サンプルは、細胞を溶解し且つ内在性リボヌクレアーゼを不活性化するグアニジウム塩の高濃縮溶液中で分裂する。フィルターカートリッジ内のフィルターのガラス繊維と結合するのに適格なＤＮＡを作るため、可溶化液をエタノールで希釈する。ＲＮＡはフィルターに結合するが、他の細胞成分は、フィルターを通って自由にスライドする。次いで、フィルターを３回洗浄し、非常に低いイオン強度の溶液にＲＮＡを溶出する。
【００５９】
４．２．２ ｃＤＮＡ逆転写
−材料
・大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００６０】
−原理
この方法の原理は、存在する全てのＲＮＡ分子の第一へリックスの効率的な合成を確保するｃＤＮＡ合成を始めるためにランダムプライマーを使用することに基づいている。
【００６１】
ｃＤＮＡは、希釈され、−２０℃で保存される。
【００６２】
４．２．３．リアルタイムＰＣＲ
−原理
「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ」機器は、蛍光に基づくＰＣＲ化学，ＴａｑＭａｎアッセイを用いる。
【００６３】
この技術は、蛍光信号を確認するためにＴａｑｍａｎプローブを用いる：それは、高い感受性があり、特定の核酸配列を増幅し定量化することにある。ＰＣＲ産物は、リアルタイムで検出される。ＰＣＲ産物を最初に確認できるサイクルを決定することによって、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡが定量化され、それ故に、反応が飽和に達する場合がない。その産物は、サイクル毎に測定される蛍光を検出することによって定量化される：信号の実体は、増幅した産物の量に正比例する。
【００６４】
試験サンプルの核酸配列と較正サンプルの同一配列の発現間の違いから、相対定量化を測定する。
【００６５】
遺伝子発現は、ＤＮＡ配列等の遺伝子の伝染性情報を遺伝子の機能性産物、即ちタンパク質又はＲＮＡに転換するプロセスである。
【００６６】
多くの遺伝子の発現は、転写後に調節されるため、ｍＲＮＡの濃度の増加がタンパク質の発現の増加を常に決定するのではない。そのため、ｍＲＮＡの研究が重要である。遺伝子の調節は、細胞に、構造及び機能の制御を与える。遺伝子発現のタイミング、部位及び量を制御することは、身体における遺伝子機能（作用）への計り知れない影響を与えることができる。
【００６７】
ｍＲＮＡの存在量を測定する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）である。ＲＴ−ＰＣＲにより得られるデータにおける低いレベルのノイズは、遺伝子発現を評価するための選択方法となることが多い。
【００６８】
−材料
・２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
・２０Ｘ ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現アッセイ
・「ヌクレアーゼフリー」水
・ＧＡＰＤＨ（内在性制御）Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１
・標的遺伝子：
【００６９】
【表１１】
【００７０】
−手順
各生物サンプルを三通りに加工した。Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及びｃＤＮＡ（２５ｎｇ）を「２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」に加え、全体積を２５μｌにした。
【００７１】
ＰＲＩＳＭ反応器７５００の工程は以下の通りであった。
【００７２】
【表１２】
【００７３】
４．２．４ ＲＴ−ＰＣＲ分析用のサンプル調製
ＤＮＡ抽出用溶解緩衝液３００μｌ中で、組織を均質化した。
【００７４】
４．３ ＥＬＩＳＡを用いた成長培地におけるＩＬ−１α定量化
−原理
インターロイキン１−αは、炎症の初期兆候として認められる。
【００７５】
ＩＬ−１αの放出は、製造者の取扱説明書に従って高感度の特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）キットを用い、本サンプリング時間にて、ＲＨＥの下、成長培地２００μｌ中でアッセイされた。最終産物は、４５０ｎｍで数量化された。
【００７６】
回復時間後速やかに各ＲＨＥの基礎成長培地を集め、プラスチック製冷凍バイアル中、−２０℃で保存した。
【００７７】
試験前に、該培地を室温にて調整した。その結果をＩＬ−１αのｐｇ／ｍｌとして表した。３．９〜２５０ｐｇ／ｍｌ間の濃度は感度の範囲内であると考えられた。
【００７８】
−材料
・Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｃｏｄｅ ＤＬＡ５０（ＩＬ−１）
・成長培地−ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ
・ミクロプレートオートリーダーＭ−１００ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｔｅｃａｎ
【００７９】
５．手順
時間及び分析を表Ｉに示す。
【００８０】
毎日、設定した時間にて、方法にて説明したように、対応するサンプルを分析用に加工した。
【００８１】
【表１３】
【００８２】
１日目−産物の適用
１日目で、ＲＨＥは、生後１２日であった。試験物質（２通り）及び対照を単回投与量（２０μｌ）で適用した。
次いで、ＲＨＥを更なる処置なしで２４時間インキュベートした。
【００８３】
２日目−２４時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
２４時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８４】
４日目−４８時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
４８時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８５】
６日目−１２０時間の処置
成長培地を毎日変更し、集めて、更なる分析のため−２０℃にて保存した。
１２０時間処置に対応するサンプルを加工し、分析した（表Ｉ参照）。
【００８６】
６．データ収集及び解釈
分析によりもたらされたデータを社内ソフトウェアＳＤＳ１．３．１に直接記録し、生の相対定量的データとして記録した。
【００８７】
その結果をエクセルにエクスポートした。
【００８８】
較正サンプルとの比較により遺伝子が±１ＳＤ増加したときの値を受け入れた。
【００８９】
組織学用サンプルを顕微鏡下で分析した。総合的な形態及び負の対照との比較によるあらゆる変化を評価し、実験報告に記録した。
【００９０】
組織学用サンプルをライカ顕微鏡ＤＭ２５００の下で分析し、ライカアプリケーションスイート（ＬＡＳ）ソフトウェアを用いて記録した。
【００９１】
６．結果
ＤＭＳＯによる対照は、ｃＫ１９の発現に関してＰＢＳによる対照と異なっていた：その結果は、較正用のＤＭＳＯによる対照を用いてもたらされ、添付のグラフに示される。
【００９２】
図１は、試験物質及び対照に関し、１３日目、２４時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す（上記識別コード参照）。
【００９３】
ｃＫ−１４は、ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ対照との比較により、ＰＢＳ対照において有意に増大したことが分かった。
【００９４】
２４時間後、有意なｃＫ−１６の発現の痕跡はなかった。
【００９５】
ｃＫ−１９は、ＰＲＴ及びＤＰＲＴで処理したサンプルにおいてかなり減少し、キャリブレーターの値と似ている調節レベルを示したＲＥＴ（正の対照）とは異なっていた。
【００９６】
図２は、１５日目、４８時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【００９７】
ＰＢＳ対照に関し、処理により誘導されたｃＫ−１４における有意な差異はなかった。
【００９８】
ｃＫ−１９は、ＰＢＳ対照との比較により、ＲＥＴ及びＰＲＴの両方の処理について減少したことが分かった。一方、ＤＰＲＴによる処理後の遺伝子の発現は、減少しなかった。
【００９９】
ｃＫ−１６の遺伝子発現は、３つ全ての試験物質による処理後の対照との比較により、低いことが分かった。
【０１００】
図３は、１７日目、１２０時間処理後のＲＨＥにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。
【０１０１】
処置後に、ＲＨＥの最終分化に対応した、有意な変化はｃＫ−１４及びｃＫ−１６の発現において見られず、一方、ｃＫ−１９の発現は、対照との比較により、処理組織で有意に増大した。
【０１０２】
ＰＲＴは、ＲＥＴの正の対照のものと同程度の増加を引き起こした。
【０１０３】
また、炎症の状態への長期的効果を研究するため、ＩＬ−１αの放出を監視した。その結果は以下のことを示した。
・２４時間後では、ＲＥＴによる処理後、ＩＬ−１αの放出は早いが非常に低く、ＰＲＴ又はＤＰＲＴについては、かかる放出がなかった。
・４８時間後では、ＰＲＴ及びＲＥＴの両方と、ＤＭＳＯ対照について、ＩＬ−１αの放出が有意であった。
・１２０時間後では、ＤＭＳＯ対照（０．２％）のみがサイトカインの著しい放出を示した。
【０１０４】
ＩＬ−１αは、一方で、組織学的結果に関連している必要があり、他方では、レチノイドの作用機序に関連している必要がある：４８時間後の結果は、組織学的観察（ＩＬ−１αの高い放出に対応する組織の損傷）との相互関係を示し、確認させるが、１２０時間後では、生細胞の非存在によって、ＲＥＴ及びＰＲＴについてのＩＬ−１αの放出がないことが説明される（壊死組織，Ｈ＆Ｅ組織学において示され、ｃＫ−１６の活性化により確認される）。
【０１０５】
レチノイドによる処理後のＩＬ−１αの放出は、皮膚レベルでの機能的意義を有する。レチノイド（特にレチノイン酸による処理後）は、基底ケラチノサイトによるＩＬ−１αの放出を介して、炎症促進性効果を有するが、この現象は、間接的上皮増殖促進活性にも関連している。この挙動は、ＲＨＥモデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２００２，１１；５９−７４ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｆ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．）において確認されており、このＩＬ−１αメッセージは、ｃＫではなく、皮膚線維芽細胞等の細胞下部と相関しているように思われる。
【０１０６】
【表１４】
【０１０７】
同一の垂直断面でさえ、同一の処置の分析において違いが明らかになったことを強調することが重要である。
【０１０８】
様々な処置後１７日目の上皮分化は、その対照と比較して満足できる。
【０１０９】
免疫組織化学的結果は、ｃＫ−１６の発現の転写の研究と一致する。
【０１１０】
反対に、ｃＫ−１９の発現は、その比較が最も重要な時、即ち１７日目での免疫局在性におけるＲＴ−ＰＣＲの結果で描かれる場合、全く観察されなかった：それらの所見の説明は、処理された組織で起こった形態変化（多くの壊死細胞）にあり、形質導入反応に影響を与えることができる。
【０１１１】
７．結論
上述の研究は、ヒト上皮の生体外モデルに関して行われ、セクション３．３「試験物質」において定義されるように、本発明に係る２つの化合物の活性を確認した。それを以下に示す。
・組織学分析に関し、ｃＫ−１６の発現及びＩＬ−１αの局在性は、考察された濃度（０．１％）での単一の急性投与後に、レチノール及び２，４，６−オクタトリエン−１−オールについて類似の毒性を示し、一方、オクタトリエン酸エチルは毒性の関連兆候を示さなかった。
・ｃＫ−１４の発現は、その対照との比較により、研究の期間中、著しく異ならず、本発明に係る２つの化合物又はレチノールによる処理により、有糸分裂活性が影響を受けなかったことを示した。
・ｃＫ−１９に関する転写の研究は、レチノール、２，４，６−オクタトリエン−１−オール又はオクタトリエン酸エチルによる処理後の生体外での再構築ヒト上皮組織（１７日目のＲＨＥ）の最終分化において、ｃＫ−１９の上方制御を示した。これは、本発明に係る化合物の細胞修復活性の有意な証拠を提供する。
・ＲＴ−ＰＣＲの結果は、先に結果で検討された理由により、免疫組織化学的所見によって確認されなかった。
【０１１２】
ＲＨＥにおけるｃＫ１０の発現
最後に、類似の方法を用いて行った別の研究において、ＲＨＥにおけるｃＫ１０の発現を、分化の１５日目及び１７日目に関して研究し、その免疫組織化学的発現によって記録した。ｃＫ−１０は、顆粒及び脊髄レベルでのケラチノサイトの末端分化のマーカーである。
【０１１３】
その結果が示すように、１７日目では、２，４，６−オクタトリエン−１−オールで処理したサンプルについての発現は、未処理の対照と比べて強く、レチノールサンプルについてはマイナスであり、本発明に係る化合物の優れた活性が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトケラチンｃＫ−１９によって媒介されるケラチン産生を介してヒト上皮細胞修復を向上させるための医薬又は化粧品組成物における有効成分としての、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物の単独又はその混合物での使用。
【請求項２】
請求項１の使用のための組成物であって、
前記有効成分が、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物又はその混合物であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オールであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸の薬理学的に又は美容的に容認できる塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸ナトリウム塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸Ｌ−リシン塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステルであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オール，アセタートであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オール，パルミタートであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記有効成分が、式（Ｉ）の化合物の２種以上の混合物であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記有効成分を０．０５〜０．３重量％の範囲の量で含むことを特徴とする請求項２〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記有効成分を皮膚上への局所投与に適した任意の賦形剤と共に含むことを特徴とする請求項２〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１】
サイトケラチンｃＫ−１９によって媒介されるケラチン産生を介してヒト上皮細胞修復を向上させるための医薬又は化粧品組成物における有効成分としての、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物の単独又はその混合物での使用。
【請求項２】
請求項１の使用のための組成物であって、
前記有効成分が、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３(−ＣＨ＝ＣＨ)ｎ−Ｒ （Ｉ）
［式中、
ｎ＝２〜７であり、
Ｒは、ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯ−Ｒ’、ＣＯ−ＯＲ’及びＣＯ−Ｏ(−)から選択される（ここで、Ｒ’は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ２２のアルキルから選択される）］を有する化合物又はその混合物であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オールであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸の薬理学的に又は美容的に容認できる塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸ナトリウム塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸Ｌ−リシン塩であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン酸エチルエステルであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オール，アセタートであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記有効成分が、２，４，６−オクタトリエン−１−オール，パルミタートであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記有効成分が、式（Ｉ）の化合物の２種以上の混合物であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記有効成分を０．０５〜０．３重量％の範囲の量で含むことを特徴とする請求項２〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記有効成分を皮膚上への局所投与に適した任意の賦形剤と共に含むことを特徴とする請求項２〜１２のいずれかに記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５０８２１３（Ｐ２０１２−５０８２１３Ａ）
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５１２７（Ｐ２０１１−５３５１２７）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４８８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２３２８
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５０４２４４０２５）ギウリアニ ソシエタ ペル アチオニ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４８８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２３２８
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５０４２４４０２５）ギウリアニ ソシエタ ペル アチオニ (7)
【Ｆターム（参考）】
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