マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌、その製造方法ならびに使用
本発明は、マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌に関する。薬物としてこの細菌の製造方法およびその使用も開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌ならびにその製造方法に関する。この非病原性細菌および／または弱毒化細菌を、特に種々の腫瘍を処置するための薬物として用いることができる。
【０００２】
１８９３年、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂ． Ｃｏｌｅｙは、急性連鎖球菌感染症の患者における腫瘍の縮小を記述した（Ｃｏｌｅｙ ＷＢ， Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ， １９９１：３−１１）。
【０００３】
それ以来、他の細菌が腫瘍に浸潤し、複製し、次いで優先的に蓄積することが示されてきた（Ｙｕ ＹＡ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４， ２２：３１３−３２０； Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｐａｒｋｅｒ ＲＣ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９４７， ６６：４６１−４６７； Ｍａｌｍｇｒｅｎ ＲＡ ＆ Ｆｌａｎｉｇａｎ ＣＣ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９５５， １５：４７３−４７８； Ｍｏｅｓｅ ＪＲ， Ｍｅｄ Ｋｌｉｎ １９６４， ５９：１１８９−１１９２； Ｇｅｒｉｃｋｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９６４， ２４：２１７−２２１； Ｔｈｉｅｌｅ ＥＨ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９６４， ２４：２２２−２３３； Ｃａｒｅｙ ＲＷ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １９６７， ３：３７−４６； Ｋｏｈｗｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｎｎ １９７８， ６９：６１３−６１８； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ ＆ Ｇｉａｃｃｉａ ＡＪ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８， ５８：１４０８−１４１６； Ｆｏｘ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９６， ３：１７３−１７８； Ｌｅｍｍｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９７， ４：７９１−７９６； Ｓｚｎｏｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００， １０５：１０２７−１０３０； Ｌｏｗ ＫＢ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９， １７：３７−４１；Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０００， １８１：１９９６−２００２； Ｙａｚａｗａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００， ７：２６９−２７４； Ｙａｚａｗａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２００１， ６６：１６５−１７０； Ｋｉｍｕｒａ ＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８０， ４０：２０６１−２０６８）。
【０００４】
腫瘍でのこの増菌の原因となるいくつかの因子が提唱されてきた。腫瘍に見られる異常な血管供給は、腫瘍の細菌コロニー形成に対する重要な一因子と考えられている。腫瘍または転移腫瘍は発達するにつれて、血管新生を刺激して新たな血管の形成を促進する。しかし、新たに形成された血管は、不完全な内皮内面および盲端を有し、極めて組織が乱れた状態であり、結果として血流が緩慢になり、かつ腫瘍または転移腫瘍への栄養分および酸素の送達が非効率的となる。この血管は組織が乱れかつ漏出しやすい構造体であるので、細菌が腫瘍組織に容易に侵入し、および不十分な血管新生による腫瘍増殖によって、腫瘍において複数の領域で低酸素および無酸素状態を引き起こす（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， ５９：５８６３−５８７０； Ｖａｕｐｅｌ ＰＷ， Ｔｕｍｏｕｒ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９５， ２１９−２３２）。
【０００５】
低栄養分の送達と酸素欠乏とが組み合わさることより、腫瘍内に低酸素／無酸素の細胞の非増殖をもたらし、細胞外嫌気性菌（クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉａ）等）および通性嫌気性菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖を促進する（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， ５９：５８６３−５８７０； Ｖａｕｐｅｌ ＰＷ， Ｔｕｍｏｕｒ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９５， ２１９−２３２）。
【０００６】
遺伝子組換え偏性嫌気性菌クロストリジウム等の細胞外細菌の抗腫瘍効果は、低酸素領域において腫瘍細胞に対して毒性がある因子の局所産生および炎症の誘発に起因すると考えられた（Ａｇｒａｗａｌ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００４， １０１（４２）：１５１７２−１５１７７）。
【０００７】
また、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の通性細胞内細菌が腫瘍治療のために使用され、実験モデルの一部に有効であった（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｌｏｗ ＫＢ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９， １７：３７−４１； Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０００， １８１：１９９６−２００２； Ｐａｗｅｌｅｋ， Ｊ． Ｍ．， Ｌｏｗ， Ｋ．Ｂ． ａｎｄ Ｂｅｒｍｕｄｅｓ， Ｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７， ５７：４５３７−４５４４）。ここでも、炎症反答を誘発することで抗腫瘍効果を媒介すると推測された。しかし、ヒトにおいて抗腫瘍薬としてのサルモネラの有効性は、わずかであった。
【０００８】
ごく最近では、真核細胞へのＤＮＡ送達のために細胞内細菌を使用したことが記述されている。したがって、サルモネラ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）等の細胞内細菌を用いて、毒素またはプロドラッグ変換酵素等の治療分子を腫瘍細胞に直接送達することが可能である。細胞外細菌による炎症反答の誘発または治療方法と対照的に、細胞内細菌の腫瘍標的の有効性は、感染している腫瘍細胞の割合および性質によって影響される。
【０００９】
しかし、現時点で、細胞内細菌に感染した腫瘍細胞の割合に関する定量的情報は入手できず、および感染した細胞の性質も分っていない。
【００１０】
実際、腫瘍は悪性細胞だけで構成されているのではなく、むしろ形質転換細胞および腫瘍間質の複合混合物からなる。さらに、非形質転換間質細胞は、その生理学的環境において同等の細胞と比較して、明確な表現型を示すことが多い。多くの腫瘍では、単球マクロファージ系統に属する細胞が腫瘍の白血球浸潤物の主構成成分である。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、循環血中単球から生ずる。ｉｎ ｓｉｔｕでのその補充および生存は、腫瘍由来のサイトカインおよびケモカインによって導かれる（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９２， １３：２６５−２７０）。これに関連して、用語ＴＡＭを用いて、さらなる機能特性を意味することなく、腫瘍に存在するＦ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋マクロファージを表す。
【００１１】
組織学的には、かなりの組織損傷が生じていると考えられる十分に血管新生化していない低酸素部位またはその近くに、多くのマクロファージが蓄積するように思われる。多くのマクロファージは、乳癌腫の無血管部位および壊死部位（Ｌｅｅｋ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６， ５６：４６２５−４６２９； Ｌｅｅｋ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９， ７９：９９１−９９５； Ｌｅｗｉｓ ＪＳ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０００， １９２：１５０−１５８）および卵巣癌腫の無血管部位および壊死部位（Ｎｅｇｕｓ ＲＰ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９７， １５０：１７２３−１７３４）に関して報告がされており、ネガティブな予後と関連している。低酸素を含む腫瘍内環境は、マクロファージの分泌活性において著しい変化を誘発することができ、マクロファージによる血管新生促進サイトカインおよび炎症性サイトカインの両放出を誘発する。これは、ＣＤ２０６等の明瞭な表面マーカーの発現においても明らかである（Ｃａｚｉｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １９９０， ３：１０１５−１０２２； Ｙｕｎ ＪＫ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７， ９４：１３９０３−１３９０８； Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６， ９８：１９３０−１９４１； Ｒｙｍｓａ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９０， ６８：２６３−２６６； Ｒｙｍｓａ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９１， ２６１：Ｇ６０２−Ｇ６０７； Ｌｅｅｐｅｒ−Ｗｏｏｄｆｏｒｄ ＳＫ ＆ Ｍｉｌｌｓ ＪＷ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９２， ６：３２６−３３４； Ｌｕｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６， １１６：２１３２−２１４１）。
【００１２】
一部の著者は、血管新生の促進、マトリックスリモデリングおよび適応免疫の抑制を含む、いくつかの腫瘍促進機能を発現するＭ２マクロファージとしてＴＡＭを特徴付けてきた（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２００６， ２５：３１５−３２２； Ｌｕｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６， １１６：２１３２−２１４１； Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２００４， ４０：１６６０−１６６７）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたマクロファージと比較すると、大部分のＴＡＭにも、反応性酸素中間体および反応性窒素中間体の産生不全があるように見え（Ｓｉｅｇｅｒｔ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９， ９８：５５１−５５６； Ｍｕｒｄｏｃｈ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５， １１７：７０１−７０８）、かつ食作用の機能が損なわれている。多数のマクロファージが存在するにもかかわらず、これらの欠損が腫瘍組織において長期間にわたる増菌の原因となる可能性があり、この細菌には通常の条件下で食細胞によって容易に除去される非病原性細菌も含まれる。
【００１３】
近年、Ｗｅｉｂｅｌら（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｌ ２００８， Ｐｏｓｔｐｒｉｎｔ； ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ． １４６２−５８２２．２００８．０１１２２．ｘ）は、マクロファージも位置する腫瘍組織内の領域で、偏性細胞外細菌の大腸菌Ｋ１２が局在化し、複製することを示した。この著者らが示したことは、細菌の大部分が細胞外に存在し、一部の細菌だけがマクロファージによって取り込まれることである。しかしこれは、組織学的に示されただけであった。この細菌の存在が、少なくとも部分的には、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージの再プログラミングをもたらしたことに留意されたい。しかし、この処置は、４Ｔ１乳がんモデルにおいていかなる治療効果も示すことができなった。
【００１４】
細胞外細菌と対照的に、病原性細胞内細菌は、マクロファージ内で生存するために戦略を生み出す。マクロファージまたは樹状細胞等の食細胞は、サルモネラ、赤痢菌およびリステリアを含む経口の細胞内病原体の初期標的であることが重要である。生理的条件下で、この細菌を全身適用すると、脾臓、肝臓または腸で食細胞によって血流からこの細菌が除去されることとなる。明確な毒性発現機構を用いてサルモネラおよび赤痢菌は、マクロファージ内で生存することができる。この両種は、ＩＩＩ型分泌系（ＴＴＳＳ）を介して分泌されるＩｐａＢ（赤痢菌）およびＳｉｐＢタンパク質（サルモネラ）によって媒介されるカスパーゼ−１の活性を介して、感染したマクロファージの炎症およびアポトーシスをさらに誘発することができる（Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５， ２８０：１４０４２−１４０５０； Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， １１：６１９−６２７； Ｃｈｅｎ ＬＭ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６， ２１：１１０１−１１１５； Ｈｉｌｂｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ２７３：３２８９５−３２９００）。この生理的状況と対照的に、Ｗｅｉｂｅｌら（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８， Ｐｏｓｔｐｒｉｎｔ； ｄｏｉ： １０．１１１１／ｊ．１４６２−５８２２．２００８．０１１２２．ｘ）によって示されたように細胞外細菌にとっても明らかなＴＡＭの食作用欠損は、細胞内細菌の取り込みをブロックし、腫瘍細胞の直接感染に有利に働くと思われる。
【００１５】
さらに関連する先行技術の文献は以下のとおりである。Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７； Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｌ． ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ． Ｄ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９２， ５：３２８−３４２； Ｆｏｒｂｅｓ， Ｎ． Ｓ．， Ｍｕｎｎ， Ｌ．Ｌ．， Ｆｕｋｕｍｕｒａ， Ｄ． ａｎｄ Ｊａｉｎ， Ｒ． Ｋ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３， ６３：５１８８−５１９３。
【００１６】
本発明の説明
本発明の目的は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にまたは完全に枯渇し、かつ腫瘍治療を効率的に達成できる方法によって新規の腫瘍ワクチンを提供することにある。
【００１７】
一態様では、本発明の目的は、マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌を提供することによって意外なことに解決される。
【００１８】
好ましい一実施形態では、上述の細菌はマクロファージを感染させる能力がある。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌からなる群から選択される。
【００２０】
さらに好ましい一実施形態では、この細菌は、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種からなる群から選択される。
【００２１】
さらに好ましい一実施形態では、この細菌は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ウシ型結核菌ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる群から選択される。
【００２２】
好ましい一実施形態では、この弱毒化は、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失または不活性化によって起こる。
【００２３】
好ましい一実施形態では、この弱毒化は、栄養要求性細菌をもたらす。
【００２４】
さらに好ましい一実施形態では、このマクロファージは、Ｍ１マクロファージおよび／またはＭ２マクロファージであり、Ｍ２マクロファージが好ましい。
【００２５】
さらに好ましい一実施形態では、アポトーシスの誘発は、カスパーゼ活性化、好ましくはカスパーゼ−１活性化によって達成する。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、この細菌は組換え型である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つの染色体に組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体に組み込まれた調節ＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの調節ＤＮＡの染色体欠失または不活性化を保有する。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを保有する。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、この少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドは、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、この少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドは、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡをコードする。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、この非病原性細菌および／または弱毒化細菌は、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００からなる群から選択される。
【００３４】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの細菌、好ましくは凍結乾燥した少なくとも１つの細菌と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３５】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物、または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３６】
別の態様では、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択された生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３７】
別の態様では、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択された生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供ことによって、本発明の目的は意外なことに解決された。その薬物または医薬組成物によって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的もしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇する。
【００３８】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による薬物の使用を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。ここでは、前述の薬物はさらに少なくとも１つの薬理学的活性物質を用いる処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与する。
【００３９】
好ましい一実施形態では、このさらなる薬理学的活性物質は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩインヒビターおよび／またはＩＩインヒビター、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、微小管（microtubuli）脱安定化剤、ホルモンおよび／または増殖因子受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、シグナル伝達インヒビター、増殖因子に対する抗体およびその受容体、キナーゼインヒビター、代謝拮抗剤からなる群から選択される。
【００４０】
さらに好ましい一実施形態では、このさらなる薬理学的活性物質は、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アバスチン、アザチオプリン、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、エピルビシン、エルビタックス、エリスロヒドキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルダラビンホスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリーベック／グリベック（Gleevec/Glivec）、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン、イレッサ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、オキサリプラチン、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ラパマイシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルセバ、タキソテール、テニポシド、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トリメチルメラミン、ウリジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスフェート、５−アザシチジンクラドリビン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリンからなる群から選択される。
【００４１】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による薬物の使用を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。ここでは、前述の薬物は放射線治療および／または手術による処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される。
【００４２】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による非病原性細菌および／または弱毒化細菌の製造のための、以下のステップを含む方法を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００４３】
（ａ）非病原性細菌および／または非弱毒化細菌において、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子を欠失もしくは不活性化する、および／または
（ｂ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込む、および／または
（ｃ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを、この非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入する、および／または
（ｄ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込む、および／または
（ｅ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡを染色体欠失させるかもしくは不活性化する、および／または
（ｆ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌に組み込む。
【００４４】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物または上述の諸態様および諸実施形態による薬物と、静脈注射用の薬理学的に許容される緩衝液とを含む医薬キットを提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００４５】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物または上述の諸態様および諸実施形態による薬物を、ある疾患にかかっている哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含む、前述の哺乳類、好ましくはヒトを処置する方法を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。その方法によって、
（ａ）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアポトーシスを誘発し、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にもしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）疾患関連マクロファージにおいてアポトーシスを誘発し、次いで疾患関連マクロファージが部分的にもしくは完全に枯渇する。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前述の疾患は、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択されるものである。
【００４７】
定義
本発明の過程において、細菌と関連して、用語「マクロファージを感染させる」とは、細胞のウイルス感染に類似して、マクロファージに侵入しまたは入り、次いでこのマクロファージの細胞内構成成分になる細菌をいう。
【００４８】
本発明の過程において、細菌と関連して、用語「マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する」とは、このマクロファージが自殺して死ぬように、このマクロファージ内でプログラム細胞死（アポトーシス）を誘発する細菌をいう。
【００４９】
本発明の過程において、用語「Ｍ１マクロファージ」または「Ｍ１型マクロファージ」または「Ｍ１型極性化マクロファージ」とは、通常は腫瘍部位に存在しないマクロファージをいう（Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７）。
【００５０】
本発明の過程において、用語「Ｍ２マクロファージ」または「Ｍ２型マクロファージ」または「Ｍ２型極性化マクロファージ」とは、通常は腫瘍部位に存在するマクロファージをいい、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂおよびＭ２ｃ亜集団を含む（Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７）。このマクロファージは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）になり得るが、必ずしもなる必要はない。おそらく、ＴＡＭは偏ったＭ２集団を表す。
【００５１】
本発明の過程において、用語「腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）」とは、ある腫瘍に存在するＦ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋マクロファージをいう。
【００５２】
本発明の過程において、用語「栄養要求性細菌」とは、感染した宿主において増殖速度の低下をもたらす、少なくとも１つの変異を保有している細菌をいう。
【００５３】
本発明の過程において、用語「弱毒化細菌」とは、宿主を感染させるために必要な少なくも１つの毒性発現因子の機能喪失および／または宿主内での増殖障害をもたらす栄養要求突然変異のいずれかによりその毒性発現を弱毒化されている細菌をいう。言い換えれば、非弱毒化された野生型の対応物と比較すると、毒性発現が減少しており、たとえば、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐ遺伝子が欠失もしくは不活性化している細菌、または温度感受性変異もしくは抗生物質依存性変異を有する細菌（Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｌ． ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ． Ｄ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９２； ５：３２８−３４２）である。
【００５４】
本発明の過程において、用語「組換え型ＤＮＡ」とは、１つ以上のＤＮＡ鎖（の部分）の組み合わせまたは欠失または挿入を介して、それによって自然では通常、同時に発生しないＤＮＡ配列を組み合わせることによって分子遺伝学的に改変されている人工ＤＮＡをいう。遺伝子修飾に関して、免疫等のある特定の目的で異なる形質をコードまたは変化させるために、細菌の染色体および／またはプラスミド等の現存する生命体のゲノムに関連するＤＮＡを付加する、または現存する生命体のゲノムにおいて関連するＤＮＡを欠失させることで組換え型ＤＮＡが生成される。これは細胞内またはリボソーム内でプロセスを介して生じるのではなく、分子遺伝工学的にのみ改変されるという点において、遺伝的組換えとは異なる。
【００５５】
本発明の過程において、用語「組換え型プラスミド」とは、プラスミドの形で存在する組換え型ＤＮＡをいう。
【００５６】
本発明の過程において、用語「組換え型細菌」とは、この細菌に人工的に導入された組換え型ＤＮＡおよび／または組換え型プラスミドおよび／または非組換え型ＤＮＡを内部に持つ細菌をいう。
【００５７】
本発明の過程において、用語「ヌクレオチド配列」とは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドをいう。二本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００５８】
本発明の過程において、用語「後成的変化」とは、ＤＮＡレベルにおける変化、すなわち、ＤＮＡメチル化もしくは脱メチル化、ポリコームタンパク質間の結合、ヒストンのアシル化等による変化をいう。これは少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに影響する。
【００５９】
本発明の過程において、用語「調節ＤＮＡ」とは、調節タンパク質間の結合によってまたは後成的変化を誘発することによって少なくとも１つの遺伝子の発現に影響するＤＮＡの領域をいう。
【００６０】
任意の細菌と関連して用語「菌種（spp.）」とは、本発明の目的のために、種、亜種等を含む所定の属の全メンバーを含むことを意味する。たとえば用語「サルモネラ菌種」は、チフス菌およびネズミチフス菌等のサルモネラ属の全メンバーを含むことを意味する。
【００６１】
本発明の過程において、「細菌」と関連する用語「非病原性の」とは、宿主において疾患または病状を引き起こさない細菌をいう。
【００６２】
細菌感染症には、炭疽病、細菌性髄膜炎、ボツリヌス症、ブルセラ症、カンピロバクター症、猫引っかき病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、膿痂疹、レジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳（ゼーゼーいう咳）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山脈紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路感染症、細菌性心臓病が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６３】
ウイルス感染症には、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、水疱瘡（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、単純ペルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（流感）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核症、流行性耳下腺炎、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病、黄熱病が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６４】
慢性炎症または慢性炎症性疾患には、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、炎症性大腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、珪肺症および他の塵肺症が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６５】
自己免疫疾患には、全身性症候群（たとえばＳＬＥ、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチおよび多発性筋炎）ならびに局所症候群（たとえばＩＤＤＭ、橋本甲状腺炎、アジソン病、尋常性天疱瘡、乾癬、アトピー性皮膚炎、アトピー性症候群、喘息、自己免疫性溶血性貧血症、多発性硬化症）が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６６】
上述の細菌ならびに好ましい実施形態は、本明細書では本発明の細菌と呼ぶ。
【００６７】
本発明の細菌は、腫瘍標的の過程において、有利には生ワクチンとして腫瘍治療での使用に適している。すなわち、本発明の細菌によって、部分的または完全に枯渇した腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアポトーシスが誘発される。それによって、腫瘍は露出され、従来の抗腫瘍薬によって攻撃されうる。
【００６８】
本発明の細菌は、生治療薬（live therapeutic）として、マクロファージ炎症が付随する慢性炎症性疾患の治療で使用するのに適しており有利である。すなわち、本発明の細菌によって、疾患に付随するマクロファージにおいてアポトーシスを誘発し、次いでこのマクロファージは炎症部位から部分的または完全に枯渇する。それによって、持続性炎症の原因である１つの因子が欠損し、この慢性炎症を消失させることができる。この疾患の例としては、良性前立腺肥大症等の炎症に付随する良性増殖性疾患、またはクローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、喘息等の慢性炎症性自己免疫疾患がある。
【００６９】
本発明の非病原性細菌および／または弱毒化細菌は、既知の様式で投与することができる。それによって、投与経路は、作用の適切な部位にもしくは所望の部位に前述の細菌を効果的に運ぶ、たとえば非経口的もしくは経口的に、特に静脈内に、局所的に、経皮的に、肺に、直腸に、膣内に、経鼻的に、もしくは非経口で運ぶ、または埋め込みによる任意の経路であってよい。静脈内投与が好ましい。
【００７０】
非経口投与は、たとえば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射用の無菌の水溶液剤もしくは油性溶液剤、懸濁剤もしくは乳濁剤によって、埋め込みによってまたは軟膏剤、クリーム剤もしくは坐剤によって行うことができる。徐放形態としての投与も、必要に応じて可能である。埋め込みは、たとえば、生分解性ポリマーまたは合成シリコーン（たとえばシリコーンゴム）の不活性物質を含んでもよい。腟内投与は、たとえば膣リングによって可能である。子宮内投与は、たとえばベッサリーまたは他の適切な子宮内器具によって可能である。経皮投与は、特に、この目的に適している剤形によっておよび／またはたとえばパッチ等の適した方法によって追加的に提供される。
【００７１】
経口投与は、たとえば、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、コーティング錠剤、顆粒剤または散剤として固形形態で行うことができるが、飲料溶液剤の形態でも行える。本発明の経口投与用化合物として、既知の通常使用され、生理的に許容される賦形剤と、担体（たとえばアラビアゴム、タルク、デンプン、糖（たとえばマンニトール、メチルセルロース、ラクトース）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、シクロデキストリン、水溶性担体もしくは非水溶性担体、希釈剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤および香味料（たとえば精油））とを組み合わせることができる。本発明の細菌は、ナノ微粒子等の微粒子の組成物に分散させることも可能である。
【００７２】
本発明の非病原性細菌および／または弱毒化細菌を製造する可能な様式は、以下のとおりである。
【００７３】
（Ａ）変異誘発、選択、および／または標的ゲノム修飾によって毒性細菌株、好ましくはサルモネラ菌株を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。弱毒化細菌株、好ましくはサルモネラ菌株を次のとおりに処置することができる。
【００７４】
（ｉ）恒常的なＳｉｐＢ／ＩｐａＢ発現をもたらす負の調節ＤＮＡのゲノム欠失。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、分泌系、輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７５】
（ｉｉ）恒常的なＳｉｐＢ／ＩｐａＢ発現をもたらす正の調節ＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、分泌系、輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７６】
（ｉｉｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７７】
（Ｂ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によってリステリアまたは赤痢菌等の毒性の細胞内病原性細菌を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００７８】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７９】
（Ｃ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によって無毒性赤痢菌菌株を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００８０】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００８１】
（Ｄ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によって大腸菌、ビブリオ等の非病原性細菌または細胞外病原性細菌を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００８２】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００８３】
［図１］相当量のＴＡＭが異なるマウス腫瘍モデルで検出できることを示す。直径１〜１．５ｃｍの腫瘍を、１×１０6Ｂ７８−Ｄ１４細胞（ａ）、１×１０4４Ｔ１細胞（ｂ）および１×１０6Ｐ８１５−ＰＳＡ細胞（ｃ）を皮下注射したマウスから分離した。さらに、トランスジェニックＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢから自発性乳腺腫瘍を分離した（ｄ）。腫瘍組織を固定してパラフィンに包埋した。ビオチン化抗Ｆ４／８０モノクローナル抗体で腫瘍切片を免疫染色し、続いてヘマトキシリンで対比染色した（右側）。対照として、Ｆ４／８０抗体を使用せずにアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼによる染色を行った（左側）。
【００８４】
［図２］ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す。腫瘍を有するマウス（群あたりおよびｔ時点でｎ＝３マウス）に、１×１０6のネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを静脈内感染させてから４時間後、６時間後、および７日後に、分離腫瘍細胞および対照として脾臓細胞のコロニー形成単位／細胞数（ａ）ならびに感染細胞／細胞数（ｂ）を決定した。Ｌ−Ｔｏｐアガーに、段階希釈した細胞ライセートを播種することによってコロニー形成単位を決定し、非溶解のゲンタマイシン処置細胞を播種することによって感染した細胞数を決定した。右下がり縞のカラムは、ゲンタマイシンを使わずに処置した全脾臓細胞を表し、右上がり縞のカラムは、ゲンタマイシン処置した脾臓細胞を表す。横縞のカラムは、ゲンタマイシンを使わずに処置した全腫瘍細胞画分を表す。縦縞のカラムは、ゲンタマイシン処置した全腫瘍細胞画分を表す。黒カラムはマクロファージ画分を表し、白カラムはマクロファージが枯渇した画分を示す。いずれの時点においても、マクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分においてかなり多くの細胞が見られた。感染から４時間後および６時間後、ほとんどの細菌は細胞内にあった。対して感染から７日後、無処置の全腫瘍細胞と比較すると、ゲンタマイシン処置した群においてコロニー形成単位数によって決定したように、１０倍以上の細菌が細胞外で見られた。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、（スチューデントのｔ検定）であった。
【００８５】
［図３］腫瘍を有するマウスにサルモネラを静脈内感染させることにより、腫瘍関連マクロファージにおいて感染から６時間後にカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発し、感染から７日後には誘発しないことを示す。４Ｔ１腫瘍を有するマウスにサルモネラを感染させてから４時間後、６時間後および７日後、分離し溶解した細胞のカスパーゼ−１活性化（ａ）およびＰＡＲＰ切断（ｂ）をウエスタンブロット法によって分析した。カスパーゼ−１抗体は、カスパーゼ−１の２０ｋＤａの活性サブユニットを検出し、ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、全細胞ならびに感染から６時間後のマウス由来の腫瘍マクロファージ画分で検出できたが、マクロファージを枯渇した画分では検出できなかった。感染から７日後、カスパーゼ−１またはアポトーシスは、どの画分でも検出できなかった。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。感染から７日後、ＦＡＣＳによって相対量のＴＭＡを決定した。棒グラフは、群毎に分析した３つの腫瘍の平均値±標準偏差を表す（ｃ）。感染から７日後、サルモネラはマクロファージ数に影響を及ぼさなかった。
【００８６】
［図４］ａｒｏＡ変異体フレクスナー赤痢菌菌株の特徴付けを示す。（ａ）ＬＢ培地中３７℃、１８０ｒｍｐでの増殖速度の決定。一晩培養物を本培養用に１：２０に希釈して、一時間ごとに外径を測定した。プラスミドのない無毒性菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６を、ＬＢ培地で、０．３外径／時間の最大増殖速度によって特徴付けた。これに対して毒性菌株のフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの最大増殖速度は、若干低下した０．２外径／時間であった（ａ）。ａｒｏＡ変異体を保有する菌株の最大増殖速度は、実質的に低下したものであった。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの最大増殖速度は、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの最大増殖速度よりも２．５倍遅かった。ここでも、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと比較して、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡの最大増殖速度は、若干高かった。（ｂ）ＨｅＬａ細胞を用いた浸潤アッセイ。１００：１の感染効率で感染させた。この野生型菌株Ｍ９０Ｔに比べて、３５分間の感染（結合）および感染後１時間（浸潤）、続いてコロニー形成単位を決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ菌株（Ｍ９０ＴΔ）は、その接着挙動または浸潤挙動において、野生型菌株と比較すると何ら相違を示さなかった。これに対して無毒性菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（ＢＳ１７６Δ）菌株は、浸潤障害を示した。（ｃ）細胞内の複製潜在能力を決定するために、１００：１の感染効率で１時間、細胞を感染させた。続いて、ゲンタマイシンの存在下でさらに２時間、細胞をインキュベートして、溶解細胞のコロニー形成単位を決定した。前述の野生型菌株は細胞内複製の能力があったが、Ｍ９０ＴΔまたはＢＳ１７６Δのいずれも能力がなかった。（ｄ）細胞間伝播の能力を決定するために、５００：１の感染効率で１時間、ＨｅＬａ細胞を感染させた。次いで、この感染した細胞を２０グレイで２０分間放射線照射し、Ｈｅｌａ細胞の複製をブロックした。感染し照射した細胞および非感染ＨｅＬａ細胞を７０：１の割合で、２時間、８時間および１２時間、ゲンタマイシンの存在下で同時インキュベートした。続いて、非溶解細胞をＳｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロースで段階希釈して、ＢＨＩアガープレート上に播種した。同時感染から１２時間後、Ｍ９０ＴΔのコロニー形成単位は１７倍増大した。これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δのコロニー形成単位は、わずか３倍増大し、細胞間伝播に対してＭ９０ＴΔの損なわれていない潜在力を示唆した。（ｅ）感染から１時間後（補足データ）および４時間後、ＨｅＬａ細胞をＧｉｅｍｓａ染色することによって、Ｍ９０ＴΔの細胞間伝播能力を確認した。カスパーゼ−１活性化およびアポトーシス誘導を誘発するａｒｏＡ変異体の能力を決定するために、Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージを感染させ、カスパーゼ−１の２０ｋＤａ活性断片を認識するカスパーゼ−１抗体（ｆ）ならびに８５ｋＤａ切断断片を認識するＰＡＲＰ抗体（ｇ）を用いて、細胞溶解物をウエスタンブロット法によって異なる時点で分析した。ＭＴ９０Δは、カスパーゼ−１誘導およびアポトーシスの双方を誘発することができたが、ＢＳ１７６Δはできなかった。Ｍ９０ＴΔによるアポトーシス誘導およびカスパーゼ−１プロセシングは、カスパーゼ−１特異的インヒビターＹＶＡＤ−ＣＨＯ（２．５ｍＭ）によって完全にブロックされた。β−アクチンをローディング対照として用いた。棒グラフは、３種類の異なる実験の平均値±標準偏差、＊＊＊：ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）を表している。
【００８７】
［図５］フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す。腫瘍を有するマウス（群およびｔ時点でｎ＝３マウス）を、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（ｃ、ｄ）およびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（ａ、ｂ）で静脈注射で感染させてから６時間および７日後に、分離した腫瘍細胞および対照として脾臓細胞のコロニー形成単位／細胞数（ａ、ｃ）ならびに感染細胞／細胞数（ｂ、ｄ）を決定する。Ｌ−Ｔｏｐアガーに、細胞ライセートの段階希釈物を播種することによってコロニー形成単位を決定し、非溶解したゲンタマイシン処置細胞を播種することによって感染した細胞数を決定した。右下がり縞のカラムは、ゲンタマイシンを使用せずに処置した全脾臓細胞を表し、右上がり縞のカラムは、ゲンタマイシンで処置した脾臓細胞を表す。横縞のカラムは、ゲンタマイシンを使用せずに処置した全腫瘍細胞画分を表す。縦縞のカラムは、ゲンタマイシンで処置した全腫瘍細胞画分を表す。黒カラムはマクロファージ画分を表し、白カラムはマクロファージが枯渇した画分を示す。いずれの時点においても、マクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分においてかなり多くの細胞が見られた。いずれの時点においても、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの大部分は細胞内に見られた。これに対して無菌性菌株ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染から６時間後、５０倍以上の細菌が細胞外で見られた（ａ、ｂ）。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、（スチューデントのｔ検定）であった。
【００８８】
［図６］腫瘍を有するマウスにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを静脈注射で感染させることで、感染から４時間、６時間および７日後、ＴＡＭにおいてカスパーゼ−１プロセシングならびにアポトーシスを誘発し、かつ感染から７日後マクロファージ数を実質的に減少させたが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染では見られなかったことを示す。４Ｔ１腫瘍を有するマウスに赤痢菌を感染させてから４時間、６時間および７日後、分離し溶解した細胞のカスパーゼ−１活性化（ａ）ならびにＰＡＲＰ切断（ｂ）をウエスタンブロット法で分析した。カスパーゼ−１抗体は、カスパーゼ−１の２０ｋＤａ活性サブユニットを検出し、ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、Ｍ９０ＴΔに対しては、感染から４時間および６時間後、マウス由来の腫瘍の全細胞およびマクロファージ画分において、ならびに感染から７日後、マクロファージ画分において検出できた。しかしＢＳ１７６Δに対しては検出できなかった。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。感染から７日後、相当量のＴＡＭがＦＡＣＳによって決定され（ｃ、ｄ）、感染から７日後Ｍ９０ＴΔはマクロファージ数において実質的な減少をもたらしたが、ＢＳ１７６Δではこの現象は見られなかった。ナイーブマウス、ＢＳ１７６ΔおよびＭ９０ＴΔに感染したマウスの組織学的検査（ｅ）によって、Ｍ９０ＴΔ感染から７日後のマウス由来の腫瘍において、マクロファージ（抗Ｆ４８０染色）および強い炎症（抗ＣＤ４５染色）の実質的な減少、ならびにサイトケラチン陽性４Ｔ１腫瘍細胞（抗ＣＫ染色）のほぼ完全な減少が明らかになったが、ナイーブマウスまたはＢＳ１７６Δ感染のマウスではこの現象は見られなかった。棒グラフは、群毎に分析した４つの腫瘍の平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）を表す。
【００８９】
［図７］４Ｔ１腫瘍を有するマウスにＭ９０ＴΔを静脈注射で感染させることで、腫瘍増殖がブロックされ、ＢＳ１７６Δの場合はブロックされないことを示す。（ａ）腫瘍移植から１４日後、群あたりｎ＝８マウスに１×１０6細菌を静脈注射で投与した。１×ＰＢＳ静脈注射で対照群を処置した。Ｍ９０ＴΔによる感染後、腫瘍増殖が実質的に減少し、続いて腫瘍増殖がブロックされた。ＢＳ１７６Δによる感染は、少量ではあるが有意な腫瘍増殖の減少をもたらした。腫瘍接種から３１日後、動物福祉の理由でナイーブマウスおよびＢＳ１７６Δマウスを屠殺した。すべての群に対してｎ＝８、Ｍ９０ＴΔに対してｎ＝６（腫瘍増殖を比較するために、２匹のマウスを屠殺した）およびｎ＝３（コロニー形成単位の決定およびＦＡＣＳ分析のために、３匹のマウスを屠殺した）。感染した動物は、それぞれ最初の感染から１日目−１８、１８日目−４８、４８日目−６８。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。（ｂ）感染から４８日後、マクロファージ数およびコロニー形成単位を、それぞれＦＡＣＳおよび段階希釈法で決定した。非増殖腫瘍は、極めて低いマクロファージ数を示し、細菌が検出できなかった。感染から４９日目に、残りの３匹のマウスに１×１０6細菌を静脈注射で投与した。腫瘍の大きさが縮小したものは検出されなかった。感染から６８日目に、コロニー形成単位を決定し、続いて組織学的検査を行った。細菌は、腫瘍、肝臓および脾臓で検出できなかった。
【００９０】
［図８］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したマクロファージにおいてＴＡＭを主に標的にして、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す（ａ）。ある患者からの細胞を分離した後３つの異なる細胞画分を、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを用いて１００：１の感染効率で１時間ｅｘ ｖｉｖｏ感染を行った。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に１時間のインキュベーション後、段階希釈物をＢＨＩアガー上に播種した。翌日、コロニー形成単位を決定した。感染細胞中のカスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰプロセシングをウエスタンブロット法で分析した（ｂ）。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性化２０ｋＤａのサブユニットを検出した。マクロファージが枯渇した画分には、検出可能なレベルのプロカスパーゼ−１が含まれていないことに留意されたい。ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）であった。
【００９１】
［図９］カスパーゼ−１がマクロファージによって独占的に発現されることを示す。カスパーゼ−１発現についての、ＲＴ−ＰＣＲ（左側）およびウエスタンブロット（右側）による分析。以下のプライマーを用いた。アクチンｓ１ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧ−３’、アクチンａｓ ５’−ＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧ−３’；Ｃａｓｐ１ＲＴ＿左５’−ＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡ−３’、Ｃａｓｐ１ＲＴ＿右５’−ＧＧＴＣＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＣＴＣＣＴ−３’。
【００９２】
［図１０］ＲＡＷマクロファージにおけるカスパーゼ−１サルモネラおよび赤痢菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージに１０：１の感染効率で、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（対数増殖期の中間部）およびネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（定常増殖期）を異なる時点で感染させた。続いて、細胞ライセートのカスパーゼ−１活性化についてウエスタンブロットを行った。ａｒｏＡ欠失を包含する赤痢菌菌株は、野生型赤痢菌菌株と比較するとカスパーゼ−１活性化において若干の遅れを示したが、２時間後同じ活性に達した。サルモネラ菌株は、インキュベーションから３時間後、カスパーゼ−１プロセシングを誘発した。対数期に収集したサルモネラ菌株は、このアッセイ（データを図示せず）においてカスパーゼ−１プロセシングを誘発しなかった。その後のすべての感染実験のために、定常期で収集した菌株を用いた。
【００９３】
［図１１］Ｇｉｅｍｓａ染色によるＪ７７４Ａ．１マクロファージを示す。表示したものは、それぞれＭ９０Ｔ（左側）、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（中央）およびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（右）による感染から１時間後のＪ７７４Ａ．１マクロファージである。
【００９４】
［図１２］ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡに対するゲンタマイシンの細胞外活性および細胞内活性を示す。（ａ）１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを、５０、１００、２００および３００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを用いて１／２時間、１時間および２時間処置し、次いでコロニー形成単位を段階希釈法で決定した。（ｂ）Ｊ７４４Ａ．１マクロファージを、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（対数増殖期）で感染させた。ＤＭＥＭ培養液で細菌を３回洗浄して、４０００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心する。感染から1時間後、細胞を、５０、１００、２００および３００μ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートした。細胞を溶解した後、コロニー形成単位を段階希釈法で決定した。ＭＡＣＳ分離の間に細胞が再感染しないようにしかつ細胞外細菌数を算定するためには、１時間のインキュベーション間に細胞外細菌を死滅させるか、または実質的に減少させる必要がある。（ａ）に示したように、５０、１００または２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートすると、対照と比較して、コロニー形成単位の３倍、１０倍または１００倍の減少をもたらした。これと対照的に、３００μｇ／ｍｌとともにインキュベートした場合、1時間のインキュベーション後、遊離細菌が１０００倍以上減少し、2時間のインキュベーション後には細菌は完全に除去された。上述の濃度での細胞内細菌の活性を決定するため、細胞分離で使用したプロトコールと同様のものを用いた（ｂ）。１００〜３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンでは、これらの短いインキュベーション時間で細胞外細菌に対して僅かな活性を示す５０μｇ用量と比較すると、わずかに１．５倍の活性増大を示した。１００〜３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンでは、細胞内コロニー形成単位において有意差がなかった。したがって、最も高い３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンを今後の実験のために選択した。この用量は、細胞分離で用いた実験設定において細胞外細菌を１０００倍以上減少させることになる。
【００９５】
［図１３］細胞分離の実験予定を示す。（ａ）腫瘍除去および全腫瘍細胞の分離後、（ｂ）０．００１％デオキシリボヌクレアーゼおよび２μｇ／ｍｌディスパーゼで処置することで、全腫瘍細胞の一部分（１）を３００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで、またはゲンタマイシンを使わずに１時間処置した。処置後、コロニー形成単位およびカスパーゼ−１活性化について細胞を分析した。ゲンタマイシンで処置した標本は、主に細胞内細菌を含み、これに対して未処置の標本は細胞外細菌および細胞内細菌を含む。全腫瘍細胞の第２の部分（２）を、抗Ｆ４／８０（ＩｇＧ）抗体で標識化した。次いで、磁気ビーズで標識化した第２の抗ＩｇＧ抗体を加えた。磁場でＭＡＣＳカラムを用いて分離を行い、マクロファージ画分およびマクロファージ枯渇画分の２つの細胞画分をもたらした。マクロファージ画分の純度は、９６〜９９％（ｎ＝７）である。遊離細菌による細胞の再感染を防止するために、処置の間を通じて３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともにインキュベートしたこれらの画分をもちいて、コロニー形成単位およびカスパーゼ−１プロセシングも評価した。マクロファージが枯渇した画分（ｄ）と比較して、マクロファージ画分（ｃ）が含む細胞量が実質的に低いことに留意されたい。コロニー形成単位を数えるために、播種後に標準化（コロニー形成単位／細胞数、感染細胞／細胞数）を行った。ウエスタンブロットのため、同等の細胞数を添加した。
【００９６】
［図１４］細胞分離後、３つの細胞画分の光学顕微鏡検査（×１００）を示す。感染した細胞の数に関して結果に影響を及ぼし得る細胞分離の有効性を評価するために、３つの異なる細胞画分について光学顕微鏡検査を行った。左側パネルは、全腫瘍細胞の画分を示し、中央のパネルは分離したマクロファージを示す。左側パネルは、マクロファージが枯渇した画分を示す。すべての細胞画分の細胞は、主に単細胞のようにみえる。
【００９７】
［図１５］腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ）および感染から６時間後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｂ）を決定する。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から６時間後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染した細胞の数を決定した。
【００９８】
［図１６］腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｂ）ならびに感染から４時間後、６時間後および７日後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｃ、ｄ）を決定する。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から４時間後、６時間後および７日後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。
【００９９】
［図１７］腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｂ）および感染から６時間後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｃ、ｄ）を決定する。腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウス（ｎ＝４）に、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から６時間後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。感染動物および非感染動物において感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。移植腫瘍で得た結果と同様に、自発性乳腺がんを有するトランスジェニック動物モデルにおけるマクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、サルモネラは約１００倍も高い効率でＴＡＭを感染させた（ａ〜ｄ）。このモデルにおいても、細菌の大部分は細胞内に存在した。サルモネラ処置は、感染から７日後の腫瘍においてマクロファージ数に測定可能な減少をもたらさなかった。
【０１００】
［図１８］Ｍ９０Ｔ、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスジェニックマウス由来の自発性乳腺がんから分離したマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す。Ｂａｌｂ／ｃ（ａ、ｂ）およびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２（ｃ、ｄ）由来の細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１８６Δ−ａｒｏＡを１００：１の感染効率で１時間、ｅｘ ｖｉｖｏ感染させた。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした後、ウエスタンブロットのために異なるプローブを製造した。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性化カスパーゼ−１（２０ｋＤａ）のサブユニットを検出した。マクロファージが枯渇した画分には、検出可能なレベルのプロカスパーゼ−１が含まれていないことに留意されたい。ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出する。
【０１０１】
［図１９］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、自発性乳腺がんを有するトランスジェニックマウスの腫瘍のマクロファージに主に存在し、感染から７日後、実質的にマクロファージ数を減少させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｃ）および感染から７日後のＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｂ、ｄ）を決定する。ＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から７日後、脾臓および腫瘍を摘出し、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。感染動物および非感染動物において感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、感染から７日後、依然として主にＴＭＡを感染させていた。発明者らも、感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡに感染したマウスと比較すると、感染から７日後、マクロファージの量において有意差があった。＊＊＊：ｐ＜０．００５。静脈注射による感染から７日後、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、自発性腫瘍のマクロファージ内に主に存在している（マクロファージが枯渇した画分と比較すると５倍の差）。非浸潤性ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株は、極めて低い細胞数で、依然として腫瘍内に存在し、かつ主にマクロファージ内にも見られる。サルモネラと対照的に、非毒性ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株と比較すると、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発する能力がある感染性Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ菌株に感染したマウスの腫瘍においてマクロファージ数は、実質的に４倍以上（＊＊＊：ｐ＜０．００５）減少している。
【０１０２】
［図２０］腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスにＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、静脈注射による感染から６時間後および７日後、腫瘍のマクロファージ画分においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発するが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを感染させると、この現象が見られないことを示す。腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δａｒｏ−Ａ（１×１０6）を静脈注射で感染させる。６時間後および７日後、ウエスタンブロット法によって細胞画分を分離し、分析した。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性（２０ｋＤａ）のサブユニットを検出した。抗切断ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。自発性腫瘍を有するトランスジェニックマウスに、静脈注射でＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、感染から６時間後、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスの実質的な減少をもたらした。サルモネラと対照的に、アポトーシス促進性活性が７日目に存続していた。腫瘍を移植した動物で観察された結果と同様に、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ感染から７日後のマウスの全腫瘍細胞画分において、測定できるカスパーゼ−１誘導がなかった。これは、これらの腫瘍においてマクロファージが実質的に減少したことによって説明されると思われる。
【０１０３】
［図２１］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したＴＡＭを主に標的にすることを示す。腹水細胞は、２つの異なる細胞集団からなり、一方の細胞集団には接着細胞があり、他方の細胞集団には懸濁細胞がある。この２つの細胞集団（ａ、ｂ）を分離細胞型として処置した。ある患者から細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを１００：１の感染効率で１時間、ｅｘ ｖｉｖｏ感染させ、対照としてＲＡＷ２６４．７マクロファージを感染させた。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした後、段階希釈物をＢＨＩアガー上に播種した。翌日、全コロニー形成単位を決定した。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差；＊＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）であった。
【０１０４】
［図２２］ｐＭＯｈｌｉｐａプラスミドのグラフィカル模式図である。
【０１０５】
［図２３］大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌の決定を示す。Ｍ９０Ｔ（陽性、ＩｐａＢ ６４ｋＤａ）によって、およびＢＳ１７６（陰性）によって感染させたＲＡＷ２６４．７マクロファージを対照として用いた。ＨｌｙＡシグナル配列をＩｐａＢに融合させたために、大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌を７０ｋＤａ生成物によって検出した。
【０１０６】
［図２４］ｉｎ ｖｉｔｒｏ大腸菌によるカスパーゼ−１活性化についてのウエスタンブロット分析を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージに、異なる大腸菌ＤＨ５α菌株（定常増殖期）を３時間および６時間感染させた。カスパーゼ−１活性化に対する陽性対照として、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ（対数増殖期の中間部）を感染させかつスタウロスポリン（４μＭ）を用いて３時間処置した。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。
【０１０７】
［図２５］ｉｎ ｖｉｖｏ脾臓組織におけるカスパーゼ−１活性化に関するウエスタンブロット分析を示す。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに１×１０6大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａをｉｎ ｖｉｖｏ感染させ、脾臓細胞の分離およびカスパーゼ−１活性化のウエスタンブロット分析を行った。Ｂａｌｂ／ｃから分離したＴＡＭにＭ９０Ｔを感染させ、カスパーゼ−１活性化に関する陽性対照とした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。
【０１０８】
［図２６］プラスミドｐＳＰＲ１７のグラフィカル模式図である。
【０１０９】
すべての引用文献および特許の内容を、参考として本明細書で援用する。以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、その実施例に限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、相当量のＴＡＭが異なるマウス腫瘍モデルで検出できることを示す図である。
【図２】図２は、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す図である。
【図３】図３は、腫瘍を有するマウスにサルモネラを静脈内感染させることにより、腫瘍関連マクロファージにおいて感染から６時間後にカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発し、感染から７日後には誘発しないことを示す図である。
【図４】図４は、ａｒｏＡ変異体フレクスナー赤痢菌菌株の特徴付けを示す図である。
【図５】図５は、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す図である。
【図６】図６は、腫瘍を有するマウスにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを静脈注射で感染させることで、感染から４時間、６時間および７日後、ＴＡＭにおいてカスパーゼ−１プロセシングならびにアポトーシスを誘発し、かつ感染から７日後マクロファージ数を実質的に減少させたが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染では見られなかったことを示す図である。
【図７】図７は、４Ｔ１腫瘍を有するマウスにＭ９０ＴΔを静脈注射で感染させることで、腫瘍増殖がブロックされ、ＢＳ１７６Δの場合はブロックされないことを示す図である。
【図８】図８は、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したマクロファージにおいてＴＡＭを主に標的にして、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す図（ａ）、感染細胞中のカスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰプロセシングをウエスタンブロット法での分析により示す図（ｂ）である。
【図９】カスパーゼ−１がマクロファージによって独占的に発現されることを示す図である。
【図１０】ＲＡＷマクロファージにおけるカスパーゼ−１サルモネラおよび赤痢菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を示す図である。
【図１１】Ｇｉｅｍｓａ染色によるＪ７７４Ａ．１マクロファージを示す図である。
【図１２】ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡに対するゲンタマイシンの細胞外活性および細胞内活性を示す図である。
【図１３】細胞分離の実験予定を示す図である。
【図１４】細胞分離後、３つの細胞画分の光学顕微鏡検査（×１００）を示す図である。
【図１５】腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１６】腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１７】腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１８】Ｍ９０Ｔ、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスジェニックマウス由来の自発性乳腺がんから分離したマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す図である。
【図１９】Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、自発性乳腺がんを有するトランスジェニックマウスの腫瘍のマクロファージに主に存在し、感染から７日後、実質的にマクロファージ数を減少させたことを示す図である。
【図２０】腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスにＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、静脈注射による感染から６時間後および７日後、腫瘍のマクロファージ画分においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発するが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを感染させると、この現象が見られないことを示す図である。
【図２１】Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したＴＡＭを主に標的にすることを示す図である。
【図２２】ｐＭＯｈｌｉｐａプラスミドのグラフィカル模式図である。
【図２３】大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌の決定を示す図である。
【図２４】ｉｎ ｖｉｔｒｏ大腸菌によるカスパーゼ−１活性化についてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２５】ｉｎ ｖｉｖｏ脾臓組織におけるカスパーゼ−１活性化に関するウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２６】プラスミドｐＳＰＲ１７のグラフィカル模式図である。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：
方法
プラスミド。プラスミドｐＫＤ３、ｐＤＫ４（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）およびｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ， Ｐ．Ｐ． ＆ Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ， Ｗ． Ｇｅｎｅ １９９５， １５８：９−１４）を保有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株を、Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ大学、バイオテクノロジー学部から入手した。このプラスミドｐＫＤ３およびｐＤＫ４は、π依存性であり、かつＦＬＰリコンビナーゼ認識部位（ＦＲＴ部位）に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子をそれぞれ保有する。ｐＣＰ２０プラスミドは、１つの温度感受性レプリコンと、ｌ ｃｌ８５７リプレッサーの制御下においてＩｐＲプロモーターから転写された酵母ＦＬＰコンビナーゼとを含む（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ， Ｐ．Ｐ． ＆ Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ， Ｗ． Ｇｅｎｅ １９９５， １５８：９−１４）。
【０１１２】
培地、化学薬品および他の試薬。アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）およびカナマイシン耐性（ＫｍＲ）の形質転換体を、１００、２５、および３０μｇ／ｍｌでそれぞれの抗生物質を含有するトリプチケースソイアガー（１．２％アガー）（ＴＳＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で選択した。計１ｍＭのＬ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ）を使用した。オリゴヌクレオチドはＭＷＧ社製であった。特に明記しない限り、酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ社製であった。すべてのＰＣＲ検査では、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。Ｔａｑ（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用し、クローニングおよび変異誘発用のＤＮＡを生成した。Ｑｉａｇｅｎ製品（Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、プラスミドＤＮＡの分離、断片のゲル精製またはＰＣＲ産物の精製を行った。
【０１１３】
細菌株、増殖条件および遺伝学的方法。使用したネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Δ−ａｒｏＡ菌株は、プラスミドベースのカナマイシン耐用を持つ（プラスミドｐＴｏｌＣＫａｎ、Ｈｏｔｚ ｅｔ ａｌ．、未発表データ）。プラスミド安定性は、ｉｎ ｖｉｖｏで１００％であり、したがってこの菌株を用いることで、カナマイシン上での選択が可能になった（データは図示せず）。使用したフレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）５ａ菌株は、ＮｉｃｅのＳｏｐｈｉａ−Ａｎｔｉｐｏｌｉｓ大学からの野生型Ｍ９０Ｔ［ストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性］（Ａｌｌａｏｕｉ， Ａ．， Ｍｏｕｎｉｅｒ， Ｊ．， Ｐｒｅｖｏｓｔ， Ｍ．Ｃ．， Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． ＆ Ｐａｒｓｏｔ， Ｃ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９２， ６：１６０５−１６１６）およびその非浸潤性変異体ＢＳ１７６（毒性プラスミドｐＷＲ１００が欠如している）（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ｆｏｒｍａｌ， Ｓ．Ｂ． Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ １９８２， ３５：８５２−８６０；Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０００， ３８：７６０−７）である。すべての菌株を、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．）、トリプチケースソイアガー（１．２％アガー）（ＴＳＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ． Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９９２）またはブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）の培地上で規定どおりに増殖した。１リットルあたり１００ｍｇのコンゴーレッド染料（Ｃｒ）を含有するＴＳＡを用いて、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種のＣｒ＋クローン（Ｍａｕｒｅｌｌｉ， Ａ．Ｔ．， Ｂｌａｃｋｍｏｎ， Ｂ． ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ， Ｒ．， ３ｒｄ．Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ １９８４， ４３：１９５−２０１）を選択した。必要に応じて、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）またはＣｍ（３０ｍｇ／ｍｌ）（すべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を細菌培養物に加えた。ｐＣＰ２０を含有する菌株は、以下に特に記述しない限り３０℃でインキュベートした。２２０ｋｂ毒性プラスミドｐＷＲ１００のＭ９０Ｔからの分離は、大型コンストラクトキット（ＱＩＡＧＥＮ）によって行った。
【０１１４】
直鎖ＤＮＡ製造。抗生物質耐性遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）によって記述された方法を用いて、ｐＫＤ３またはｐＫＤ４から製造した。ＰＣＲ反応用のプライマーは、目的の遺伝子と５０ｂｐの相同性を有しならびにｐＫＤ３またはｐＫＤ４から準備するために使用するＰ１およびＰ２の部位を含有するようにデザインした。挿入断片の検証（下記）は、プライマーＡｒｏＡｕｐおよびＡｒｏＡｄｏｗｎを用いて行った。ＰＣＲ反応は、製造者（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）の推奨に従ってＴａｑポリメラ−ゼを用いて行った。
【０１１５】
ＰＣＲ分析は、コロニーＰＣＲ法によって行った。簡潔にいうと、コロニーを５０μｌの水に再懸濁させて、１０分間沸騰させＤＮＡライセートを作製する。ＰＣＲ法による適切なプライマーセットを用いて、各ライセートをアッセイした。ＰＣＲ反応は、製造者（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）の推奨に従ってＴａｑポリメラ−ゼを用いて行った。以下のプライマーを使用した。
ＡｒｏＡｕｐ ＧＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＡｒｏＡｄｏｗｎ ＧＧＣＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡ
ＡｒｏＡＦｒ＿ｕｐ ＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＣＧ
ＡｒｏＡＦｒ＿ｄｏｗｎ ＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣ
Ｃ１ ＴＴＡＴＡＣＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＧＧ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｃ２ ＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｋ１ ＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｋ２ ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
増殖において減弱されているがその毒性においては減弱されてない菌株を作製するために、発明者らは、遺伝子操作した菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡから始めた。したがって、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの２００ｋｂ毒性プラスミドｐＷＲ１００を大型コンストラクトキット（ＱＩＡＧＥＮ）によって分離した。次いで、この毒性プラスミドおよびアンピシリン耐性を保有するペルパープラスミドｐＣＤ２０を、すでに構築されているＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株に形質転換した。この二重形質転換および３０℃で一晩のインキュベーションの後、毒性プラスミドｐＷＲ１００（ｐＷＲ１００＿ｕｐ ５’−ＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧ−３’；ｐＷＲ１００＿ｄｏｗｎ ５’−ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＣＡＴＣ−３’）およびａｒｏＡノックアウト（ＡｒｏＡＦｒ＿ｕｐ ５’−ＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＣＧ−３’；ＡｒｏＡＦｒ＿ｄｏｗｎ ５’−ＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣ−３’）を求めてアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングした。この菌株をフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと名付けた。温度感受性レプリコンを含有するｐＣＰ２０プラスミドを、４３℃で一晩インキュベートすることによってキュアリングした。
【０１１６】
ＨｅＬａ細胞浸潤アッセイおよび生存アッセイ。ＨｅＬａ細胞によるゲンタマイシン保護アッセイを、若干の修飾を加えて前述（Ｅｌｓｉｎｇｈｏｒｓｔ ＥＡ， １９９４）のように行った。複数の７５ｃｍ2フラスコ内で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ， Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（双方とも１８０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ）で、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）単層をセミコンフルエンスになるまで増殖させた。１つのフラスコを０．２５％トリプシン（Ｐａｎ）でトリプシン処理し、次いでその細胞濃度をＤＭＥＭで２×１０5細胞／ｍｌまで調整した。６穴プレートに２ｍｌのＨｅＬａ細胞を播種し、約９０％のコンフルエンスになるまで５％ＣＯ2中、３７℃で一晩増殖させた。細菌を加える2時間前に、ＨｅＬａ細胞を洗浄してＤＭＥＭを交換した。細菌の対数期培養物（ＬＢ培地で増殖した）を、１００の推定感染効率で加えた。細菌を加えてから、プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で1時間、インキュベートした。Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で、前述のプレートを３回洗浄し、次いでゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭとともに、５％ＣＯ2中、３７℃で1時間、インキュベートした。特定の時点後に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液中でＨｅＬａ細胞を１０分間溶解させた。この細菌をＬＢアガープレート上に播種し、次いで３７℃で１８時間増殖させてから細菌コロニーをカウントした。
【０１１７】
細胞内増殖アッセイおよび細胞間増殖アッセイ。細胞内増殖および細胞間伝播の挙動を調べるために、初めに細胞のＧｉｅｍｓａ染色法を用いた。簡潔にいうと、カバーガラス（直径２０ｍｍ）上の直径４５ｍｍの組織培養プレート中で１００：１の感染効率で１時間感染させたＨｅＬａ細胞（１×１０5）を１×ＰＢＳで２回洗浄し、室温でメタノールを用いて５〜７分間固定した。プレートを風乾し、製造者の説明書に記述されているように製造したＧｉｅｍｓａ染料（Ｓｉｇｍａ）を用いて１５〜６０分間染色した。プレートを蒸留水で３回洗浄してから、風乾させて、油浸下で観察した。感染から１時間後および４時間後の時点で調べた。
【０１１８】
Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイ。Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイを用いて細胞間伝播を決定した。６穴組織培養プレート中でＨｅＬａ細胞（７×１０5）に、５００：１の感染効率で１時間感染させてから、１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、感染した細胞に、２０グレイで２０分間放射線照射した。続いて、非感染ＨｅＬａ細胞と、放射線照射した赤痢菌感染ＨｅＬａ細胞とを７０：１の割合で、２時間、８時間および１２時間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとの１時間のインキュベーションの後、ゲンタマイシンの濃度が１０μｇ／ｍｌまで減少した。すべての時点で、Ｓｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロース（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ， Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ）で作製した段階希釈物をＢＨＩアガープレート上に播種した。このアガープレートを３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、感染したＨｅＬａ細胞を特徴づけていた。
【０１１９】
マウス。６週齢〜８週齢のメスマウスに、それぞれ１００μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた以下のいずれかを皮下に注射した。１×１０4マウス４Ｔ１乳がん細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２５３９）、１×１０6Ｂ７８−Ｄ１４（Ｒｙｍｓａ， Ｂ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｈ．Ｄ．， Ｌａｕｃｈａｒｔ， Ｗ． ＆ ｄｅ Ｇｒｏｏｔ， Ｈ． Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９０， ６８：２６３−２６６；Ｌｏｄｅ， Ｈ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００， １０５：１６２３−１６３０）黒色腫細胞、および１×１０6Ｐ８１５−ＰＳＡ（Ｊ Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ， Ｊ．， Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｂ， Ｙｏｎｅ， ＣＬＲＰ， Ｈｏｔｚ， Ｃ， Ｍｅｙｅｒ， ＳＲ， Ｓｐｒｅｎｇ， Ｓ， Ｇｏｅｂｅｌ， Ｗ， Ｒａｐｐ， ＵＲ ａｎｄ Ｉ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００７）マスト細胞腫細胞。
【０１２０】
マウスに関わるすべての処置は、「Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ」（Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って行った。Ｂａｌｂ／ｃ ｏ１ａ ＨＳＤ、Ｃ５７／ＢＬ６、ＤＢＡ−２およびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢは、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨ（Ｂｏｒｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。すべての動物は、ｌｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｓｔｒａｈｌｅｎｋｕｎｄｅ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（ＭＳＺ）の動物飼育施設で飼育した。
【０１２１】
腫瘍についての組織学的分析および免疫組織化学分析。４Ｔ１細胞（１×１０4）、Ｂ７８−Ｄ１４細胞（１×１０6）およびＰ８１５−ＰＳＡ細胞（１×１０6）を、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７／ＢＬ６およびＤＢＡ／２マウスに皮下注射した。腫瘍の径が１．５〜２ｃｍまで大きくなったとき、この腫瘍を無菌的に切除した。この腫瘍をホルマリンで固定し、薄切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１２２】
腫瘍部位でマクロファージを識別するために、組織を４％緩衝パラホルムアルデヒド中で１日固定し、パラフィン包埋し、処理して薄切片化した。続いて、(Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ， Ｖ．， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， １２７：２２６９−２２８２)に記述されているように、パンマクロファージ抗Ｆ４／８０ラットモノクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いて薄切片を免疫染色し、次いでペルオキシダーゼをベースにした検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて比反応性を検出した。抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびペルオキシダーゼをベースにした検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、炎症の程度も検査した。
【０１２３】
腫瘍を有するマウスの静脈（I.v.）注射による感染。注射の前に細菌を対数期の中間部（赤痢菌）または定常期（サルモネラ）で収集して、１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳで希釈した。細胞を移植してから１４日後の４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの外側尾静脈に、または０．５年齢の腫瘍を有するメスのＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウスにこの懸濁液１００μｌを注射した。腫瘍および脾臓組織での細菌数を決定するために、マウスを屠殺して、臓器を切除し、重さを量り、７０μｍおよび４０μｍのセルストレーナーでホモジナイズした。各細胞画分の細胞数をカウントして、コロニー形成単位または感染した細胞の数を決定した。
【０１２４】
コロニー形成単位および感染した細胞数の決定。コロニー形成単位の数を決定するために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｒｏｔｈ）を含有する１×ＰＢＳ中の段階希釈物をＬＢアガープレート上に播種した。ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを用いる実験のために、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するｐＴｏｌＣKanＬＢアガープレートを使用した。このアガープレートを、上下逆さまにして３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、細菌コロニーを特徴づけていた。Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイ用に、１×ＰＢＳで段階希釈物を作製し、次いで５ｍｌのＳｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロース（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ， Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ）と約４０℃で混合させた。ＬＢアガープレート上に希釈物を慎重に滴下した。このアガープレートの底を下にして、３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、感染した真核細胞を特徴づけていた。
【０１２５】
ＴＭＡの分離。磁気細胞分離のための染色法。磁気ビーズを用いる細胞標識化のための二段階方法を選択した。第１に、パンマクロファージ抗Ｆ４／８０（ＩｇＧ， Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ；ＩｇＧ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体で細胞を標識化した。第２に、この標識化細胞を抗ＩｇＧ抗体で染色し、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で標識化した。染色時間は計約３０分であった。細胞の抗体標識化は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ中、４℃で、１０〜１５分行った。１×ＰＢＳで１回洗浄した後、抗体を標識化した第２のミクロビーズとともに前述の細胞をインキュベートした。４℃で１０分間インキュベートした後、１回の洗浄段階で、まず非結合粒子を除去した。次いで、ミニカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を約０．６テスラ（ＭＡＣＳ永久磁石， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に設置して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含む５００μｌ１×ＰＢＳで平衡化し、次いで細胞を分離した。磁気ビーズで標識化した細胞を磁場に保持し、スチールウールファイバーに結合させる。このカラムを外部磁場から取り出すと、前述のスチールウールは容易に消磁し、磁気細胞は、もはや結合した状態ではなく、単細胞懸濁として溶出することができる。
【０１２６】
ＦＡＣＳ分析用の細胞の製造。腫瘍細胞上で発現する細胞表面抗原を、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ（２．４Ｇ２， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置した後、抗体を用いて染色することによって、およびＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるフローサイトメトリー分析によって分析した。以下のモノクローナル抗体を使用した。すなわち、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０．１５．１１．５， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、フィコエリトリン（ＰＥ）−抗マウスＧｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＰＥ−抗マウスＦ４／８０（ＢＭ４００８Ｒ， Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。
【０１２７】
有効性研究。腫瘍増殖の際の赤痢菌感染の治療効果を探索するために、６週齢〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス２８匹に１×１０4４Ｔ１細胞を皮下注射で投与した。腫瘍増殖は一日おきに定規で決定した。腫瘍量が約１７０ｍｍ3に達したとき（細胞移植から14日目）、３群のマウス（ｎ＝８）を無作為化によって決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔおよびＢＳ１７６Δを前述のように製造し、その懸濁液１００μｌを、４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの外側尾静脈に注射した。ナイーブ群では、１００μｌ１×ＰＢＳを投与した。腫瘍の増殖は一日おきに観察した。腫瘍細胞移植から３１日目、ナイーブ群およびＢＳ７６Δ−ａｒｏＡ群ならびに２匹のＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡマウスを屠殺して、腫瘍の大きさを比較した（データは図示せず）。感染から４８日目、３匹のＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡマウスを屠殺し、腫瘍、肝臓および脾臓組織におけるコロニー形成単位を決定した。さらに、ＦＡＣＳ分析を行い、前述のように腫瘍組織におけるマクロファージの量を決定した。感染から４９日目、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを再び静脈注射で投与した。感染から６８日目、腫瘍、肝臓および脾臓組織におけるコロニー形成単位を再び決定した。さらに、前述のように、組織学的分析および免疫組織化学分析のために２つの腫瘍を製造した。
【０１２８】
ヒト腹水細胞のｅｘ ｖｉｖｏ感染。この腹水細胞は、腹水細胞は、２つの異なる細胞集団からなり、一方の細胞集団には接着細胞があり、他方の細胞集団には懸濁細胞がある。この２つの細胞集団を分離細胞型として処置した。腫瘍細胞を分離して、前述のようにＴＡＭを分離した。ある患者から細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡをｅｘ ｖｉｖｏ感染させた。対数増殖期まで増殖した細菌を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、Ｄ−ＭＥＭ培地で３回洗浄した。１００：１の感染効率で１時間感染させた後、細胞を３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした。次いで、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを使用した。コロニー形成単位を決定するために、感染後２時間の細胞を収集し、またはウエスタンブロット用に製造した。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析。６穴培養皿からの赤痢菌感染細胞または非感染細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８；グリセリン８６％；β−メルカプトエタノール；２０％ＳＤＳ、ｄＨ2Ｏ）中で溶解させた。遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間）によって不溶物を除去した。免疫ブロットのために、１０〜３０μｌのライセートを１０％または１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ １９７０， ２２７：６８０−６８５）によって分離させ、ニトロセルロース膜の上に移した。５％脱脂粉乳を補充した１×ＰＢＳ中で１時間ブロックした後、１×ＰＢＳ中５％脱脂粉乳（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈した適切な一次抗体（抗カスパーゼ−１（ＩＣＥ）、Ｓｉｇｍａ製；抗切断ＰＡＲＰ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ））を用いて前述の膜を探索し、その後ペルオキシダーゼを結合させた二次抗体とのインキュベーション、高感度化学発光（ＥＣＬ試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＫ）による検出を行い、次いでＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ， ＸＯ−ＭＡＴ−ＡＲ）に１〜１０分間露出させた。
【０１３０】
結果
マクロファージ浸潤は、乳腺腫瘍（Ｌｅｅｋ， Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６， ５６：４６２５−４６２９； Ｌｅｅｋ， Ｒ．Ｄ．， Ｌａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．Ｌ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９， ７９：９９１−９９５； Ｌｅｗｉｓ， Ｊ．Ｓ．， Ｌａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｊ．Ｃ， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．Ｌ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０００， １９２：１５０−１５８）および卵巣癌腫（Ｎｅｇｕｓ， Ｒ．Ｐ．， Ｓｔａｍｐ， Ｇ．Ｗ．， Ｈａｄｌｅｙ， Ｊ． ＆ Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｆ．Ｒ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９７， １５０：１７２３−１７３４）を含む数種類のヒト腫瘍で記述されている。異なる実験腫瘍モデルにおいて浸潤したＴＡＭのレベルを決定するために、異なる腫瘍モデルのパラフィン包埋組織におけるマクロファージ（図１）を染色した。試験したすべての腫瘍では、マクロファージのホットスポット（茶色の染色）を検出した。ＴＡＭはヒト乳癌腫では広範囲に及び（Ｋｅｌｌｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｒ．Ｓ．， Ｂｌｉｓｓ， Ｅ． ＆ ＭｃＧｅｅ， Ｊ．Ｏ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８８， ５７：１７４−１７７；Ｖｏｌｏｄｋｏ， Ｎ．， Ｒｅｉｎｅｒ， Ａ．， Ｒｕｄａｓ， Ｍ． ＆ Ｊａｋｅｓｚ， Ｒ． Ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ １９９８， ７：９９−１０５； Ｌｉｎ， Ｅ．Ｙ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ．Ｖ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｒ．Ｇ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１， １９３：７２７−７４０； Ｂｉｎｇｌｅ， Ｌ， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２， １９６：２５４−２６５）かつネガティブな予後を伴うために、４Ｔ１モデルおよびトランスジェニックＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２腫瘍モデルをさらなる研究のために使用した。
【０１３１】
初めに、細胞外区画および細胞内区画におけるサルモネラおよび赤痢菌の量的分布、ならびに腫瘍の異なる細胞型を調べることを模索した。したがって、移植（４Ｔ１）腫瘍および自発性（ＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２）腫瘍を用いて、１つのモデルを確立した。腫瘍を有するマウスに細菌を感染させ、感染後、異なる時点で腫瘍を摘出した。腫瘍細胞を分離し、腫瘍細胞懸濁液を得た。細胞外細菌および細胞内細菌を識別するために、ゲンタマイシンを使用してまたは使用せずにこの腫瘍細胞懸濁液を処置した。同時に、マクロファージおよびマクロファージが枯渇した画分で細胞を分離して、その細菌内容物を分析した（図１３参照）。全コロニー形成単位タイターを決定するために真核細胞を溶解した後に、または感染細胞数を決定するために細胞溶解せずにＴｏｐアガーに播種することによって、平板培養を行った。
【０１３２】
実験の第一の組では、確立した４Ｔ１（図２）腫瘍または自発性乳癌腫（図１７参照）を有するマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを静脈内に投与した。図２に示すように、菌株ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡは、感染から４時間後および６時間後に主にＴＡＭをｉｎ ｖｉｖｏで標的にするが、とはいえこの菌株はｉｎ ｖｉｔｒｏで４Ｔ１細胞を容易に感染させる（データは図示せず）。感染から7日後、脾臓で検出されたのはわずかな細菌のみであった。これは先行研究（Ａｒｎｏｌｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ２００４， ７２：６５４６−６５５３）と一致している。４時間後、６時間後および７日後、マクロファージ枯渇腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分ではかなり多くの細菌が見られた。感染から４時間後および６時間後、ほとんどの細菌は細胞内に存在した。これに対して、ゲンタマイシンで処置しなかった全腫瘍細胞と比較すると、ゲンタマイシン処置した腫瘍細胞から算出されたコロニー形成単位数によって決定されたように、感染から７日後、１０倍以上の細菌が細胞外で見られた。
【０１３３】
続いて、ＳｉｐＢ分泌によるカスパーゼ−１活性化を介して、マクロファージにおいてアポトーシスが誘発されるか追及した。さらに、アポトーシスの際に腫瘍組織においてマクロファージが減少するかにも関心を持った。したがって、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡによる感染（図３）後、カスパーゼ−１活性化およびアポトーシスの誘発に関して細胞集団を分析した。カスパーゼ−１活性化（図３ａ）およびＰＡＲＰ切断（図３ｂ）は、感染から６時間後のマウス由来の腫瘍の全細胞およびマアクロファージ画分において検出できたが、しかしマクロファージが枯渇した画分においては検出できなかった。マクロファージ枯渇画分ではカスパーゼ−１プロセシングまたはカスパーゼ−１発現のいずれも検出できなかった。感染から７日後、カスパーゼ−１の誘発はいずれの画分でも検出されなかった。感染から７日後、ＴＡＭの相対量をＦＡＣＳによって決定した（図３ｃ）。この時点で、非感染マウスと比較すると、サルモネラはマクロファージ数に影響を及ぼしてなかった。これは、アポトーシス誘発が一過性であるか、または最低限であり、非効率的であることをさらに示唆している。一過性のアポトーシス誘発は、サルモネラの感染生物学によって説明することができる。サルモネラは、病原性アイランドＳＰ１（ＳｉｐＢを含む）を感染の早期およびＳＰ１からＳＰ２に移る後期に発現する。ＳＰ２病原性アイランドは、カスパーゼ−１プロセシングを直接活性化することができるＳｉｐＢ等の毒性因子を含んでいない（Ｐａｎｔｈｅｌ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ２００５， ７３：３３４−３４１）。
【０１３４】
サルモネラと対照的に、赤痢菌は、感染期間のあらゆる時点でＩｐａＢを発現する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｇ．Ｎ．， Ｊａｎｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｈｉｌｂｉ， Ｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７， １５３：２８６２−２８７６； Ｃｏｓｓａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４， ３０４：２４２−２４８； Ｔａｍａｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ ２０００， １９：３８７６−３８８７）。したがって、フレクスナー赤痢菌もＴＡＭを標的にしかつマクロファージ数を減少させるのに適しているか追及した。本研究では、フレクスナー赤痢菌菌株Ｍ９０ＴおよびＢＳ１７６を使用した。後者はプラスミドレス非毒性変異体である。その毒性に影響されない、動物実験用の弱毒化菌株を得るために、ａｒｏＡ遺伝子座の染色体欠失を保有する、ある菌株を構築した。サルモネラ等の他の細菌では、芳香族アミノ酸の生成に重要なａｒｏＡ遺伝子の欠失は細菌において弱毒化をもたらす（Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｒ． ＆ Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ， Ｔ．Ｋ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９２， ６０：７９１−７９７）。増殖減弱化した毒性菌株と非毒性菌株との遺伝的に定義された比較（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ｆｏｒｍａｌ， Ｓ．Ｂ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８２， ３５：８５２−８６０）を可能にするために、無毒性フレクスナー赤痢菌菌株ＢＳ１７６内のａｒｏＡ遺伝子座を除去し、続いて電気穿孔法によって毒性プラスミドｐＷＲ１００を加えることを模索した。フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６菌株のａｒｏＡ遺伝子座をノックアウトするために、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）の方法を適用した。結果として生じた菌株、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡをＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡまたは以下ではＢＳ１７６Δと名付けた。続いて、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔから分離した毒性プラスミドｐＷＲ１００を、菌株ＢＳ１７６Δに形質転換し、菌株フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００をもたらした。この菌株は、毒性菌株フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの主要な特徴を保有しているので、この菌株をＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡまたは以下ではＭ９０ＴΔと名付ける。
【０１３５】
フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡに等しいフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００菌株を、ＤＳＭ２１０５８としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に寄託した。
【０１３６】
このａｒｏＡ変異体を構築した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞外増殖および細胞内増殖、初期結合、浸潤および細胞間伝播に関して、この菌株を特徴付けた（図４）。プラスミドレス無毒性菌細胞のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６を、ＬＢ培地で０．３外径／時間の最大増殖速度によって特徴付け、これに対して毒性菌株のフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔは０．２外径／時間と最大増殖速度が若干減少した（図４ａ）。これは、大型の毒性プラスミドｐＷＲ１００の存在によって説明できるであろう。予想どおり、ａｒｏＡ変異体を保有する菌株は、最大増殖速度が実質的に低下した。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔよりも最大増殖速度が２．５倍遅かった。ここでも、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと比較すると、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡの最大増殖速度は若干速かった。
【０１３７】
続いて、初期結合、浸潤、細胞内複製および細胞間伝播に関してこのａｒｏＡ変異体の寄与を調べた。
【０１３８】
図４ｂに示すように、菌株Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔと比較して、その結合速度および浸潤において有意差を示さなかった。これと対照的に、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡは、予想どおりその浸潤挙動が減弱された。
【０１３９】
野生型Ｍ９０Ｔは、２時間、ａｒｏＡ変異体よりも１２倍速い細胞内複製速度を示した（図４ｃ）。菌株フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、予想どおりその細胞内複製において強く減弱されていることをこれらのデータは示している。
【０１４０】
ａｒｏＡ変異体の細胞内複製におけるこの欠損のために、細胞間伝播は、従来のアッセイで評価するのは難しい。したがって、細胞内複製に対して感受性がより低い、新規の伝播アッセイを開発した（図４ｄ）。第１の段階では、ＨｅＬａ細胞を５００：１の高ＭＯＩ（感染効率）で１時間感染させた。続いて、感染した細胞に放射線照射して、ＨｅＬａ細胞の複製をブロックした。ゲンタマイシンの存在下で、非感染ＨｅＬａ細胞の単層上で、感染し放射線照射したＨｅＬａ細胞を１：７０の割合で、同時インキュベートした。感染細胞の数は、細胞溶解をしないようにＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースの上に播種することで、決定した。予想したように、８時間後、野生型Ｍ９０Ｔは、感染細胞の数が１２倍増加したことを示した。その後の時点で、非弱毒化した毒性菌株は、細胞に対して毒性があり、かつコロニー形成単位決定がもはや可能ではなかった。Ｍ９０ＴΔの場合、感染細胞数の増加は、同時感染から８時間後で６倍、１２時間後で１７倍であった。これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δの場合、感染細胞数は、８時間後わずか３倍しか増加せず、１２時間後までさらなる増加を示さなかった。これらの結果は、細胞間伝播に対してＭ９０ＴΔの能力が損なわれてないことを示唆している。細胞間伝播のための遺伝情報を保有してないＢＳ１７６Δで観察されたわずかな増加は、真核細胞を保護するためにわずかに１０μｇ／ｍｌの低めのゲンタマイシン濃度で１２時間、細胞外細菌をわずかに部分的に死滅させることで、高度に感染した放射線照射細胞を初期の時点で部分的に細胞溶解させたことに起因すると思われる。細胞感染の特徴をさらに調べるために、Ｇｉｅｍｓａ染色法によって感染細胞を組織学的に評価した（図４ｅ）。感染から１時間後（図１１参照）および４時間後（図４ｅ）のＨｅＬａ細胞のＧｉｅｍｓａ染色から、菌株Ｍ９０ＴおよびＭ９０ＴΔの細菌が細胞間接触部に主に位置していることが明らかになった。細胞間伝播も検出できた。これと対照的に、感染から４時間後でも菌株ＢＳ１７６Δの細胞内細菌は、検出できるものがほとんどなかった。さらに、無毒性菌株の場合、細胞間伝播の兆しが見られなかった。
【０１４１】
ａｒｏＡ変異体のカスパーゼ−１活性化を誘発する能力（図４ｆ）およびアポトーシス誘発（図４ｇ）を決定するために、Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージを感染させて、細胞ライセートを分析した。Ｍ９０ＴΔは、カスパーゼ−１誘発およびアポトーシスの両方を誘発できたが、ＢＳ１７６Δはできなかった。カスパーゼ−１特異的インヒビターＹＶＡＤ−ＣＨＯがカスパーゼ−１およびＰＡＲＰプロセシングを完全にブロックしたので、Ｍ９０ＴΔによるアポトーシス誘発はカスパーゼ１に依存することに留意されたい（図４ｆおよび４ｇ）。
【０１４２】
続いて、サルモネラに対して観察されるように赤痢菌がマクロファージについて同様の好ましいターゲティングを示すか分析した。サルモネラに対して以前行ったものと同様の設定で、確立された４Ｔ１腫瘍（図５および図１６）を用いてＢａｌｂ／ｃマウスに赤痢菌を静脈注射した。ここでも、いずれの時点においても、細胞あたり著しく多い細菌（図５ａ、ｂ）およびさらに多い感染細胞（図５ｂ、ｄ）がマクロファージ画分で見られた。さらに、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの大部分は、細胞内で見られ（図５ａ、ｂ）、これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染から６時間後、５０倍多い細菌が細胞外で見られた（図５ａ）。
【０１４３】
また、カスパーゼ−１発現および活性化ならびにアポトーシスの誘発に関してマクロファージ画分を分析した（図６および図２０）。感染から４時間後、６時間後および７日後、カスパーゼ−１活性化（図６ａ）およびＰＡＲＰ切断（図６ｂ）をウエスタンブロット法によって分析した。Ｍ９０ＴΔの場合、カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、感染から４時間後および６時間後マウスから採取した腫瘍の全細胞およびマクロファージ画分で、ならびに感染から７日後のマクロファージで検出できたが、ＢＳ１７６Δの場合は検出できなかった。さらに、感染から７日後、相対量の腫瘍関連マクロファージをＦＡＣＳによって決定した（図６ｃ）。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスおよびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウスにおいて、Ｍ９０ＴΔ感染はマクロファージ数の実質的な減少をもたらしたが、ＢＳ１７６Δ感染はもたらさなかった（補足データ）（Ｌｉｎ， Ｅ．Ｙ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ．Ｖ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｒ．Ｇ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１， １９３：７２７−７４０； Ｂｉｎｇｌｅ， Ｌ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２， １９６：２５４−２６５； Ｓｃｈｏｌｌ， Ｓ．Ｍ．， Ｃｒｏｃｋｅｒ， Ｐ．， Ｔａｎｇ， Ｒ．， Ｐｏｕｉｌｌａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ １９９３， ７：２０７−２１１； Ｋｉｒｍａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４， ６４：４１６２−４１７０； Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ， Ｖ．， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， １２７：２２６９−２２８２； Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ．＆ Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ， Ｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４， ９１：９３１２−９３１６； Ｖａｎ Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００２， ２４７：１１−２５； Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００４， ４：７１−７８； Ｍｕｒｄｏｃｈ， Ｃ．， Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ， Ａ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｂｌｏｏｄ ２００４， １０４：２２２４−２２３４； Ｆｉｌｄｅｒｍａｎ， Ａ．Ｅ．， Ｂｒｕｃｋｎｅｒ， Ａ．， Ｋａｃｉｎｓｋｉ， Ｂ．Ｍ．， Ｄｅｎｇ， Ｎ． ＆ Ｒｅｍｏｌｄ， Ｈ．Ｇ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２， ５２：３６６１−３６６６）。
【０１４４】
ナイーブマウス（図６ｅ、上段パネル）、ＢＳ１７６Δ（図６ｅ、中央パネル）およびＭ９０ＴΔ（図６ｅ、下段パネル）に感染したマウスの組織学的検査では、Ｍ９０ＴΔ由来の腫瘍においてマクロファージの実質的な減少およびマクロファージ凝集体の破壊（図６ｅ、抗Ｆ４８０の染色、左側パネル）を確認し、強い炎症（図６ｅ、抗ＣＤ４５染色、右側パネル）が示された。しかしナイーブマウスまたはＢＳ１７６Δに感染した感染７日後のマウスには前述の現象が見られなかった。
【０１４５】
Ｍ９０ＴΔによって誘発された、マクロファージ数におけるこの実質的な減少および著しい炎症が治療効果と関連しているか調べるために、腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに細菌を投与して、腫瘍増殖を評価した（図７ａ）。ＢＳ１７６Δによる感染は、わずかであるが有意な腫瘍増殖の減少をもたらした。これと対照的に、Ｍ９０ＴΔの単回静脈注射による感染は、腫瘍増殖において実質的かつ有意な減少をもたらした。腫瘍増殖は処置から１９日後に完全にブロックされたことに留意されたい。非増殖腫瘍は極めて低いマクロファージ（３〜４％）数を示し、感染から４８日後に細菌は検出できなかった（図７ｃ）。４９日目に１×１０6細菌を残りの３匹のマウスに静脈投与した。腫瘍の大きさにおいてさらなる減少は検出されなかった。６８日目にコロニー形成単位を決定し、次いで組織学的検査を行った。腫瘍、肝臓および脾臓において細菌は検出されなかった（データは図示せず）。
【０１４６】
フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡによる処置がヒトにおいても適用可能か調べるために、卵巣癌腫患者から新しく分離した腹水に由来する細胞にＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させた（図８ａおよび図２０参照）。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ヒト腫瘍から分離したＴＡＭを効率的に感染させ、かつこれらの細胞においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発した（図８ｂ）。ここでも、分離したヒト腫瘍に由来するＴＡＭの感染は、マクロファージが枯渇した画分と比較して、少なくとも１００倍より効率的であった。
実施例２： グラム陰性菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ Ｋ１２］におけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子（ＮＣ＿００４８５１）の発現および分泌
２ａ）分泌プラスミドにおけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子（ＮＣ＿００４８５１）のクローニング
赤痢菌のようにサルモネラは、ＳｉｐＢタンパク質によって仲介されるカスパーゼ−１の活性化を介して、感染したマクロファージの炎症およびアポトーシスを誘発することができる。このタンパク質はＩＩＩ型分泌系（ＴＴＳＳ）を介して分泌される（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５， ２８０：１４０４２−１４０５０； Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， １１：６１９−６２７； Ｃｈｅｎ， Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６， ２１：１１０１−１１１５； Ｈｉｌｂｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ２７３：３２８９５−３２９００）。サルモネラは、ＳｉｐＢによってカスパーゼ−１を活性化し、かつ初期の時点でＴＡＭにおいてアポトーシスを誘発するが、後期の時点ではアポトーシスを誘発せず、相対量のＴＡＭを減少させられなかった。これと対照的に、代謝的に減弱された毒性赤痢菌菌株は、４Ｔ１および自発性乳がんのモデルにおいてすべての時点でＩｐａＢによってＴＡＭでカスパーゼ−１を活性化し、アポトーシスを誘発することができるが、無毒性赤痢菌ではできなかった。
【０１４７】
サルモネラによる一過性のアポトーシス誘発は、感染の初期時点およびＳＰＩ１からＳＰ１２に移る後期時点で、病原性アイランドＳＰＩ１（ＳｉｐＢを含む）の発現によって説明されうる。ＳＰ１２病原性アイランドには、カスパーゼ−１プロセシングを直接活性化できるＳｉｐＢ等の毒性因子が含まれてない（Ｐａｎｔｈｅｌ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ２００５， ７３：３３４−３４１）。サルモネラと対照的に、赤痢菌は、感染の間のあらゆる時点でＩｐａＢを発現する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｇ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７， １５３：２８６２−２８７６； Ｃｏｓｓａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４， ３０４：２４２−２４８； Ｔａｍａｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ ２０００， １９：３８７６−３８８７）。
【０１４８】
グラム陰性菌株において機能性ｉｐａＢを機能的に発現、分泌させる可能性を評価するために、ｉｐａＢ遺伝子をｐＭｏＨｌｙ発現ベクターにクローン化させて、ｉｐａＢタンパク質の発現および分泌をもたらした。この分泌は、大腸菌のＩ型溶血素分泌系（Ｔ１ＳＳ）をコードしたプラスミドによって仲介される。分泌プラスミドについてはすでに述べており、種々のグラム陰性菌の目的で有用である。概念実証として、大腸菌菌株へのクローン化を行った。
【０１４９】
以下に、ｉｐａＢの分泌のためのＩ型分泌系を包含する大腸菌Ｋ１２菌株の構成を記述する。原理的には、いかなる弱毒化通性細胞内グラム陰性菌株でも、この目的のために使用することができる。
【０１５０】
ｉｐａＢ遺伝子を、Ｉ型送達プラスミドｐＭＯｈｌｙｋａｎ内でクローン化した。単一のＮｓｉｌ制限酵素部位を、異種タンパク質を決定するインフレーム挿入配列のためのｈｌｙＡ遺伝子の２つの残留配列間に位置づけた（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００８）。Ｎｓｉｌ制限酵素部位を含有する配列の挿入のために、新しいポリリンカーをｐＭＯｈｌｙｋａｎ内に確立した。以下の制限酵素部位を、拡張多重クローニング部位（ｍｃｓ）であるＸｈｏｌ、Ｐｖｕｌ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎｌのために使用した。
【０１５１】
Ｎｓｉｌ部位（５’−ＴＧＣＡ−３’）に相補的なオーバーハングとともに制限酵素部位の配列を含有するオリゴヌクレオチド（ＣＧＧＴＡＣＣＧＣＴＡＧＣＣＧＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡおよびＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＣＡ）をアニーリングして挿入した制限酵素部位を有する配列部分を作製した。この結果として得た二本鎖ＤＮＡ部分をアニーリングした後、Ｎｓｉｌを消化したｐＭＯｈｌｙｋａｎ内にポリリンカーを挿入して、新しいプラスミドｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓをもたらした。その後、抗生物質耐性クローンをスクリーニングした。ｍｃｓの正確な挿入を、制限酵素での消化および配列決定によって確認した。
【０１５２】
ｉｐａＢのコード配列は、１，１３８（ｂｐ）位にＮｓｉｌ制限酵素部位を含む。したがって、新しく構築したｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓを用いて、ｉｐａＢの読み取り枠を挿入した。ｉｐａＢ遺伝子を、プライマーＳａｌｍ： ｍｃｓ ｉｐａＢ Ｘｈｏｌ ｈｉｎ（ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＣＡＣ）およびＳａｌｍ： ｍｃｓ ｉｐａＢ Ｋｐｎｌ ｒｕeｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣ）によるＰＣＲによって増幅させた。順方向プライマーをデザインして、Ｘｈｏｌ制限酵素部位を作製し、次いで逆方向プライマーをデザインしてＫｐｎｌ部位を作製した。ＰＣＲ産物およびｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓをＸｈｏｌおよびＫｐｎｌによって消化させ、その後、ライゲーションによってｉｐａＢをｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓ内に挿入した。抗生物質耐性クローンのスクリーニングをＰＣＲによって行い、次いで挿入を配列決定によって確認した。配列決定したクローンのｐＭＯｈｌｉｐａと呼ばれるプラスミドを、Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ法によって分離して、さらなる研究のために使用した（図２２）。
【０１５３】
このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α内に形質転換して、機能性を評価した。図２３には、組換え型大腸菌菌株による融合タンパク質の成功した発現および分泌を示す。大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａおよび大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ発現は、７０ｋＤａの産物を示した。これは、クローン化ＩｐａＢが、ｐＭＯｈｌｙｋａｎモデルにおいてＣ末端のＨｌｙＡ分泌シグナルと融合したためである。Ｍ９０Ｔライセート中で、大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａの沈渣中でおよび上清中でＩｐａＢを検出した。この菌株には、大腸菌Ｉ型分泌機構の機能に必要とされるｔｏｌＣ遺伝子が欠けているので、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａの上清中では、ＩｐａＢが検出できなかった。
【０１５４】
異なる大腸菌ＤＨ５α菌株によってカスパーゼ−１が活性化されるか調べるため、ＲＡＷ２６４．７マクロファージに感染させ、次いで感染後さまざまな時点でウエスタンブロット分析を行った（図２４）。
【０１５５】
大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａ菌株がＲＡＷ２６４．７マクロファージ内でカスパーゼ−１を活性化したことをウエスタンブロットが示した（図２４）。さらに、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａは、感染から６時間後、カスパーゼ−１活性化が極めて減弱したことを示した。ウエスタンブロット分析は２回行った。この結果をその都度決定したが、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａを介するカスパーゼ−１活性化のために、この分析は技術的問題になることもあり得た。大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａは、感染から３時間後にカスパーゼ−１を活性化したが、Ｍ９０Ｔ対照と比較すると、このカスパーゼ−１活性化は極めて減少したものであった。感染していないＲＡＷ２６４．７マクロファージを負の対照として用いた。大腸菌ΔＴｏｌＣによって感染したＲＡＷ２６４．７マクロファージは、カスパーゼ−１活性化を示さず、カスパーゼ−１の酵素前駆体を示した。
【０１５６】
次の段階では、この系の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ＴＡＭは非浸潤性細菌の取り込みが欠損しているので（ＢＳ１７６の結果を参照されたい。大腸菌の結果のデータは図示せず）、静脈投与後、脾臓のマクロファージにおいてアポトーシスを誘発する大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａの能力を評価した。図２５に示すように、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａは、脾臓のマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングの誘発に成功し、この系がｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることを示した。
【０１５７】
ＴＡＭに影響を及ぼすために、赤痢菌、サルモネラおよび侵潤性大腸菌菌株を含むがこれらに限定されない侵潤性のグラム陰性細菌に、この系を移植する必要がある。侵潤性のｉｐａＢ発現赤痢菌がＴＡＭにおいてアポトーシスを誘発できることを立証するとともに、静脈投与後マクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングを誘発するこの系の機能性は、この系に従ってマクロファージを枯渇することを標的とする組換え型細菌をもたらすことになる。
【０１５８】
２ｂ）グラム陽性細菌（リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＥＧＤｅ）におけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子のクローニング
リステリアによるカスパーゼ−１活性化に関するデータは、矛盾しており、かつマクロファージ内でのカスパーゼ−１およびアポトーシスの誘発は、赤痢菌と比較すると少なくとも効率が低い（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８， １０：４１−５２； Ｆｒａｎｃｈｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７， ２８２：１８８１０−１８８１８）。しかし、リステリアは細胞内細菌であり、腫瘍内でマクロファージを標的とし、したがって（Ｓｉｎｇｈ， Ｒ． ＆ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｙ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２００６． ５：５４１−５５２）マクロファージを標的とする細菌性腫瘍の治療に適していると思われる。持続したアポトーシス誘発を達成するために、ｉｐａＢの恒常的発現および分泌を有する弱毒化リステリア菌株を構築することにする。
【０１５９】
リステリア菌ＥＧＤｅΔ−ａｒｏＡ内でＩｐａＢを発現させるために、ａｃｔＡ遺伝子（ＰａｃｔＡ）由来のリステリアプロモーターを用いた。リステリア菌ＥＧＤｅΔ−ａｒｏＡ内でＩｐａＢを分泌させるために、リステリオリシンの分泌シグナル（ＳＳｈｌｙ）を、前述のプロモーターの３’末端に融合した。以下のプライマーを用いて、リステリア菌ＥＧＤから分離したゲノムＤＮＡからＰＣＲによってＰａｃｔＡを増幅した。すなわち順方向プライマーとして：ＰａｃｔＡ Ｐｓｔｌ Ｎｃｏｌ ｈｉｎ（ＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡ）および逆方向プライマーとして：ＰａｃｔＡオーバーハングｒｕｅｃｋ（ＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣ）。この逆方向プライマーは、分泌シグナルＳＳｈｌｙからの配列に相補的なオーバーハングを用いてデザインした。およびこの分泌シグナルを以下のプライマーによって増幅した。すなわち、ＳＳ ｈｌｙオーバーハングｈｉｎ（ＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧ）およびＳＳ ｈｌｙ ＢａｍＨｌ ｒｕｅｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧ）。その後、組換え型ＰＣＲを、ＰａｃｔＡ ＳＳｈｌｙの増幅ＰＣＲ産物を用いてかつ以下のプライマーによって行った。すなわち、ＰａｃｔＡ Ｐｓｔｌ Ｎｃｏｌ ｈｉｎ（順方向）およびＳＳ ｈｌｙ ＢａｍＨｌ ｒｕｅｃｋ（逆方向）。その後、組換え型ＰＣＲの産物ＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙおよびプラスミドｐＵＣ１８を、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢａｍＨｌによって消化させた。隣接するＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙをライゲーションによってｐＵＣ１８内に挿入して、次いで制限酵素での消化および配列決定によって適切に挿入されたかを確認した。ＳＳｈｌｙが逆方向プライマーであるために、ＢａｍＨｌ制限酵素部位を組み込んだ。したがって、プライマーを用いてＰＣＲによってｉｐａＢを増幅し、それぞれの制限酵素部位、開始点のＢａｍＨｌおよび末端のＳａｃｌ、を作製した。すなわち、ｉｐａＢ ＢａｍＨｌ ｈｉｎ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＣＡＣ）およびｉｐａＢ Ｓａｃｌ ｒｕｅｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣ）。次いで、ｉｐａＢ遺伝子を、ｐＵＣ１８内のシグナル配列の後にシームレスにクローニングして、それを配列決定した。
【０１６０】
続いて、コンストラクトＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙ＋ｉｐａＢを、制限酵素ＰｓｔｌおよびＳａｃｌによってｐＵＣ１８から切り取り、ＰｓｔｌおよびＳａｃｌが消化したグラム陽性発現ベクターｐＳＰ０内にライゲーションによって挿入し、新たなプラスミドｐＳＰＲ１７を得た（図２６）。
【０１６１】
このコンストラクトを弱毒化したリステリア菌株内に形質転換させて、ＴＡＭの標的枯渇のために使用することができる。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌ならびにその製造方法に関する。この非病原性細菌および／または弱毒化細菌を、特に種々の腫瘍を処置するための薬物として用いることができる。
【０００２】
１８９３年、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂ． Ｃｏｌｅｙは、急性連鎖球菌感染症の患者における腫瘍の縮小を記述した（Ｃｏｌｅｙ ＷＢ， Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ， １９９１：３−１１）。
【０００３】
それ以来、他の細菌が腫瘍に浸潤し、複製し、次いで優先的に蓄積することが示されてきた（Ｙｕ ＹＡ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４， ２２：３１３−３２０； Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｐａｒｋｅｒ ＲＣ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９４７， ６６：４６１−４６７； Ｍａｌｍｇｒｅｎ ＲＡ ＆ Ｆｌａｎｉｇａｎ ＣＣ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９５５， １５：４７３−４７８； Ｍｏｅｓｅ ＪＲ， Ｍｅｄ Ｋｌｉｎ １９６４， ５９：１１８９−１１９２； Ｇｅｒｉｃｋｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９６４， ２４：２１７−２２１； Ｔｈｉｅｌｅ ＥＨ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９６４， ２４：２２２−２３３； Ｃａｒｅｙ ＲＷ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １９６７， ３：３７−４６； Ｋｏｈｗｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｎｎ １９７８， ６９：６１３−６１８； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ ＆ Ｇｉａｃｃｉａ ＡＪ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８， ５８：１４０８−１４１６； Ｆｏｘ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９６， ３：１７３−１７８； Ｌｅｍｍｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９７， ４：７９１−７９６； Ｓｚｎｏｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００， １０５：１０２７−１０３０； Ｌｏｗ ＫＢ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９， １７：３７−４１；Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０００， １８１：１９９６−２００２； Ｙａｚａｗａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００， ７：２６９−２７４； Ｙａｚａｗａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２００１， ６６：１６５−１７０； Ｋｉｍｕｒａ ＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８０， ４０：２０６１−２０６８）。
【０００４】
腫瘍でのこの増菌の原因となるいくつかの因子が提唱されてきた。腫瘍に見られる異常な血管供給は、腫瘍の細菌コロニー形成に対する重要な一因子と考えられている。腫瘍または転移腫瘍は発達するにつれて、血管新生を刺激して新たな血管の形成を促進する。しかし、新たに形成された血管は、不完全な内皮内面および盲端を有し、極めて組織が乱れた状態であり、結果として血流が緩慢になり、かつ腫瘍または転移腫瘍への栄養分および酸素の送達が非効率的となる。この血管は組織が乱れかつ漏出しやすい構造体であるので、細菌が腫瘍組織に容易に侵入し、および不十分な血管新生による腫瘍増殖によって、腫瘍において複数の領域で低酸素および無酸素状態を引き起こす（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， ５９：５８６３−５８７０； Ｖａｕｐｅｌ ＰＷ， Ｔｕｍｏｕｒ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９５， ２１９−２３２）。
【０００５】
低栄養分の送達と酸素欠乏とが組み合わさることより、腫瘍内に低酸素／無酸素の細胞の非増殖をもたらし、細胞外嫌気性菌（クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉａ）等）および通性嫌気性菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖を促進する（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｄａｎｇ ＬＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：１５１５５−１５１６０； Ｂｒｏｗｎ ＪＭ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， ５９：５８６３−５８７０； Ｖａｕｐｅｌ ＰＷ， Ｔｕｍｏｕｒ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９５， ２１９−２３２）。
【０００６】
遺伝子組換え偏性嫌気性菌クロストリジウム等の細胞外細菌の抗腫瘍効果は、低酸素領域において腫瘍細胞に対して毒性がある因子の局所産生および炎症の誘発に起因すると考えられた（Ａｇｒａｗａｌ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００４， １０１（４２）：１５１７２−１５１７７）。
【０００７】
また、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の通性細胞内細菌が腫瘍治療のために使用され、実験モデルの一部に有効であった（Ｊａｉｎ ＲＫ ＆ Ｆｏｒｂｅｓ ＮＳ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００１， ９８：１４７４８−１４７５０； Ｌｏｗ ＫＢ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９， １７：３７−４１； Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０００， １８１：１９９６−２００２； Ｐａｗｅｌｅｋ， Ｊ． Ｍ．， Ｌｏｗ， Ｋ．Ｂ． ａｎｄ Ｂｅｒｍｕｄｅｓ， Ｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７， ５７：４５３７−４５４４）。ここでも、炎症反答を誘発することで抗腫瘍効果を媒介すると推測された。しかし、ヒトにおいて抗腫瘍薬としてのサルモネラの有効性は、わずかであった。
【０００８】
ごく最近では、真核細胞へのＤＮＡ送達のために細胞内細菌を使用したことが記述されている。したがって、サルモネラ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）等の細胞内細菌を用いて、毒素またはプロドラッグ変換酵素等の治療分子を腫瘍細胞に直接送達することが可能である。細胞外細菌による炎症反答の誘発または治療方法と対照的に、細胞内細菌の腫瘍標的の有効性は、感染している腫瘍細胞の割合および性質によって影響される。
【０００９】
しかし、現時点で、細胞内細菌に感染した腫瘍細胞の割合に関する定量的情報は入手できず、および感染した細胞の性質も分っていない。
【００１０】
実際、腫瘍は悪性細胞だけで構成されているのではなく、むしろ形質転換細胞および腫瘍間質の複合混合物からなる。さらに、非形質転換間質細胞は、その生理学的環境において同等の細胞と比較して、明確な表現型を示すことが多い。多くの腫瘍では、単球マクロファージ系統に属する細胞が腫瘍の白血球浸潤物の主構成成分である。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、循環血中単球から生ずる。ｉｎ ｓｉｔｕでのその補充および生存は、腫瘍由来のサイトカインおよびケモカインによって導かれる（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９２， １３：２６５−２７０）。これに関連して、用語ＴＡＭを用いて、さらなる機能特性を意味することなく、腫瘍に存在するＦ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋マクロファージを表す。
【００１１】
組織学的には、かなりの組織損傷が生じていると考えられる十分に血管新生化していない低酸素部位またはその近くに、多くのマクロファージが蓄積するように思われる。多くのマクロファージは、乳癌腫の無血管部位および壊死部位（Ｌｅｅｋ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６， ５６：４６２５−４６２９； Ｌｅｅｋ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９， ７９：９９１−９９５； Ｌｅｗｉｓ ＪＳ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０００， １９２：１５０−１５８）および卵巣癌腫の無血管部位および壊死部位（Ｎｅｇｕｓ ＲＰ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９７， １５０：１７２３−１７３４）に関して報告がされており、ネガティブな予後と関連している。低酸素を含む腫瘍内環境は、マクロファージの分泌活性において著しい変化を誘発することができ、マクロファージによる血管新生促進サイトカインおよび炎症性サイトカインの両放出を誘発する。これは、ＣＤ２０６等の明瞭な表面マーカーの発現においても明らかである（Ｃａｚｉｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １９９０， ３：１０１５−１０２２； Ｙｕｎ ＪＫ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７， ９４：１３９０３−１３９０８； Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６， ９８：１９３０−１９４１； Ｒｙｍｓａ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９０， ６８：２６３−２６６； Ｒｙｍｓａ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９１， ２６１：Ｇ６０２−Ｇ６０７； Ｌｅｅｐｅｒ−Ｗｏｏｄｆｏｒｄ ＳＫ ＆ Ｍｉｌｌｓ ＪＷ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９２， ６：３２６−３３４； Ｌｕｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６， １１６：２１３２−２１４１）。
【００１２】
一部の著者は、血管新生の促進、マトリックスリモデリングおよび適応免疫の抑制を含む、いくつかの腫瘍促進機能を発現するＭ２マクロファージとしてＴＡＭを特徴付けてきた（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２００６， ２５：３１５−３２２； Ｌｕｏ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６， １１６：２１３２−２１４１； Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２００４， ４０：１６６０−１６６７）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたマクロファージと比較すると、大部分のＴＡＭにも、反応性酸素中間体および反応性窒素中間体の産生不全があるように見え（Ｓｉｅｇｅｒｔ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９， ９８：５５１−５５６； Ｍｕｒｄｏｃｈ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５， １１７：７０１−７０８）、かつ食作用の機能が損なわれている。多数のマクロファージが存在するにもかかわらず、これらの欠損が腫瘍組織において長期間にわたる増菌の原因となる可能性があり、この細菌には通常の条件下で食細胞によって容易に除去される非病原性細菌も含まれる。
【００１３】
近年、Ｗｅｉｂｅｌら（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｌ ２００８， Ｐｏｓｔｐｒｉｎｔ； ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ． １４６２−５８２２．２００８．０１１２２．ｘ）は、マクロファージも位置する腫瘍組織内の領域で、偏性細胞外細菌の大腸菌Ｋ１２が局在化し、複製することを示した。この著者らが示したことは、細菌の大部分が細胞外に存在し、一部の細菌だけがマクロファージによって取り込まれることである。しかしこれは、組織学的に示されただけであった。この細菌の存在が、少なくとも部分的には、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージの再プログラミングをもたらしたことに留意されたい。しかし、この処置は、４Ｔ１乳がんモデルにおいていかなる治療効果も示すことができなった。
【００１４】
細胞外細菌と対照的に、病原性細胞内細菌は、マクロファージ内で生存するために戦略を生み出す。マクロファージまたは樹状細胞等の食細胞は、サルモネラ、赤痢菌およびリステリアを含む経口の細胞内病原体の初期標的であることが重要である。生理的条件下で、この細菌を全身適用すると、脾臓、肝臓または腸で食細胞によって血流からこの細菌が除去されることとなる。明確な毒性発現機構を用いてサルモネラおよび赤痢菌は、マクロファージ内で生存することができる。この両種は、ＩＩＩ型分泌系（ＴＴＳＳ）を介して分泌されるＩｐａＢ（赤痢菌）およびＳｉｐＢタンパク質（サルモネラ）によって媒介されるカスパーゼ−１の活性を介して、感染したマクロファージの炎症およびアポトーシスをさらに誘発することができる（Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５， ２８０：１４０４２−１４０５０； Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， １１：６１９−６２７； Ｃｈｅｎ ＬＭ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６， ２１：１１０１−１１１５； Ｈｉｌｂｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ２７３：３２８９５−３２９００）。この生理的状況と対照的に、Ｗｅｉｂｅｌら（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８， Ｐｏｓｔｐｒｉｎｔ； ｄｏｉ： １０．１１１１／ｊ．１４６２−５８２２．２００８．０１１２２．ｘ）によって示されたように細胞外細菌にとっても明らかなＴＡＭの食作用欠損は、細胞内細菌の取り込みをブロックし、腫瘍細胞の直接感染に有利に働くと思われる。
【００１５】
さらに関連する先行技術の文献は以下のとおりである。Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７； Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｌ． ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ． Ｄ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９２， ５：３２８−３４２； Ｆｏｒｂｅｓ， Ｎ． Ｓ．， Ｍｕｎｎ， Ｌ．Ｌ．， Ｆｕｋｕｍｕｒａ， Ｄ． ａｎｄ Ｊａｉｎ， Ｒ． Ｋ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３， ６３：５１８８−５１９３。
【００１６】
本発明の説明
本発明の目的は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にまたは完全に枯渇し、かつ腫瘍治療を効率的に達成できる方法によって新規の腫瘍ワクチンを提供することにある。
【００１７】
一態様では、本発明の目的は、マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌を提供することによって意外なことに解決される。
【００１８】
好ましい一実施形態では、上述の細菌はマクロファージを感染させる能力がある。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌からなる群から選択される。
【００２０】
さらに好ましい一実施形態では、この細菌は、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種からなる群から選択される。
【００２１】
さらに好ましい一実施形態では、この細菌は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ウシ型結核菌ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる群から選択される。
【００２２】
好ましい一実施形態では、この弱毒化は、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失または不活性化によって起こる。
【００２３】
好ましい一実施形態では、この弱毒化は、栄養要求性細菌をもたらす。
【００２４】
さらに好ましい一実施形態では、このマクロファージは、Ｍ１マクロファージおよび／またはＭ２マクロファージであり、Ｍ２マクロファージが好ましい。
【００２５】
さらに好ましい一実施形態では、アポトーシスの誘発は、カスパーゼ活性化、好ましくはカスパーゼ−１活性化によって達成する。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、この細菌は組換え型である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つの染色体に組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体に組み込まれた調節ＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの調節ＤＮＡの染色体欠失または不活性化を保有する。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、この細菌は、少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを保有する。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、この少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドは、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、この少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドは、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡをコードする。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、この非病原性細菌および／または弱毒化細菌は、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００からなる群から選択される。
【００３４】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの細菌、好ましくは凍結乾燥した少なくとも１つの細菌と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３５】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物、または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３６】
別の態様では、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択された生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００３７】
別の態様では、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択された生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌を含む薬物または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物を提供ことによって、本発明の目的は意外なことに解決された。その薬物または医薬組成物によって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的もしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇する。
【００３８】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による薬物の使用を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。ここでは、前述の薬物はさらに少なくとも１つの薬理学的活性物質を用いる処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与する。
【００３９】
好ましい一実施形態では、このさらなる薬理学的活性物質は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩインヒビターおよび／またはＩＩインヒビター、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、微小管（microtubuli）脱安定化剤、ホルモンおよび／または増殖因子受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、シグナル伝達インヒビター、増殖因子に対する抗体およびその受容体、キナーゼインヒビター、代謝拮抗剤からなる群から選択される。
【００４０】
さらに好ましい一実施形態では、このさらなる薬理学的活性物質は、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アバスチン、アザチオプリン、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、エピルビシン、エルビタックス、エリスロヒドキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルダラビンホスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリーベック／グリベック（Gleevec/Glivec）、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン、イレッサ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、オキサリプラチン、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ラパマイシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルセバ、タキソテール、テニポシド、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トリメチルメラミン、ウリジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスフェート、５−アザシチジンクラドリビン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリンからなる群から選択される。
【００４１】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による生理的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のために、上述の諸態様および諸実施形態による薬物の使用を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。ここでは、前述の薬物は放射線治療および／または手術による処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される。
【００４２】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による非病原性細菌および／または弱毒化細菌の製造のための、以下のステップを含む方法を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００４３】
（ａ）非病原性細菌および／または非弱毒化細菌において、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子を欠失もしくは不活性化する、および／または
（ｂ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込む、および／または
（ｃ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを、この非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入する、および／または
（ｄ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込む、および／または
（ｅ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡを染色体欠失させるかもしくは不活性化する、および／または
（ｆ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドをこの非病原性細菌および／または弱毒化細菌に組み込む。
【００４４】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物または上述の諸態様および諸実施形態による薬物と、静脈注射用の薬理学的に許容される緩衝液とを含む医薬キットを提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。
【００４５】
別の態様では、上述の諸態様および諸実施形態による少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または上述の諸態様および諸実施形態による医薬組成物または上述の諸態様および諸実施形態による薬物を、ある疾患にかかっている哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含む、前述の哺乳類、好ましくはヒトを処置する方法を提供することによって、本発明の目的は意外なことに解決された。その方法によって、
（ａ）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアポトーシスを誘発し、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にもしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）疾患関連マクロファージにおいてアポトーシスを誘発し、次いで疾患関連マクロファージが部分的にもしくは完全に枯渇する。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前述の疾患は、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）癌、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択されるものである。
【００４７】
定義
本発明の過程において、細菌と関連して、用語「マクロファージを感染させる」とは、細胞のウイルス感染に類似して、マクロファージに侵入しまたは入り、次いでこのマクロファージの細胞内構成成分になる細菌をいう。
【００４８】
本発明の過程において、細菌と関連して、用語「マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する」とは、このマクロファージが自殺して死ぬように、このマクロファージ内でプログラム細胞死（アポトーシス）を誘発する細菌をいう。
【００４９】
本発明の過程において、用語「Ｍ１マクロファージ」または「Ｍ１型マクロファージ」または「Ｍ１型極性化マクロファージ」とは、通常は腫瘍部位に存在しないマクロファージをいう（Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７）。
【００５０】
本発明の過程において、用語「Ｍ２マクロファージ」または「Ｍ２型マクロファージ」または「Ｍ２型極性化マクロファージ」とは、通常は腫瘍部位に存在するマクロファージをいい、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂおよびＭ２ｃ亜集団を含む（Ｓｉｃａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ４２：７１７−７２７）。このマクロファージは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）になり得るが、必ずしもなる必要はない。おそらく、ＴＡＭは偏ったＭ２集団を表す。
【００５１】
本発明の過程において、用語「腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）」とは、ある腫瘍に存在するＦ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋マクロファージをいう。
【００５２】
本発明の過程において、用語「栄養要求性細菌」とは、感染した宿主において増殖速度の低下をもたらす、少なくとも１つの変異を保有している細菌をいう。
【００５３】
本発明の過程において、用語「弱毒化細菌」とは、宿主を感染させるために必要な少なくも１つの毒性発現因子の機能喪失および／または宿主内での増殖障害をもたらす栄養要求突然変異のいずれかによりその毒性発現を弱毒化されている細菌をいう。言い換えれば、非弱毒化された野生型の対応物と比較すると、毒性発現が減少しており、たとえば、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐ遺伝子が欠失もしくは不活性化している細菌、または温度感受性変異もしくは抗生物質依存性変異を有する細菌（Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｌ． ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ． Ｄ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９２； ５：３２８−３４２）である。
【００５４】
本発明の過程において、用語「組換え型ＤＮＡ」とは、１つ以上のＤＮＡ鎖（の部分）の組み合わせまたは欠失または挿入を介して、それによって自然では通常、同時に発生しないＤＮＡ配列を組み合わせることによって分子遺伝学的に改変されている人工ＤＮＡをいう。遺伝子修飾に関して、免疫等のある特定の目的で異なる形質をコードまたは変化させるために、細菌の染色体および／またはプラスミド等の現存する生命体のゲノムに関連するＤＮＡを付加する、または現存する生命体のゲノムにおいて関連するＤＮＡを欠失させることで組換え型ＤＮＡが生成される。これは細胞内またはリボソーム内でプロセスを介して生じるのではなく、分子遺伝工学的にのみ改変されるという点において、遺伝的組換えとは異なる。
【００５５】
本発明の過程において、用語「組換え型プラスミド」とは、プラスミドの形で存在する組換え型ＤＮＡをいう。
【００５６】
本発明の過程において、用語「組換え型細菌」とは、この細菌に人工的に導入された組換え型ＤＮＡおよび／または組換え型プラスミドおよび／または非組換え型ＤＮＡを内部に持つ細菌をいう。
【００５７】
本発明の過程において、用語「ヌクレオチド配列」とは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドをいう。二本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００５８】
本発明の過程において、用語「後成的変化」とは、ＤＮＡレベルにおける変化、すなわち、ＤＮＡメチル化もしくは脱メチル化、ポリコームタンパク質間の結合、ヒストンのアシル化等による変化をいう。これは少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに影響する。
【００５９】
本発明の過程において、用語「調節ＤＮＡ」とは、調節タンパク質間の結合によってまたは後成的変化を誘発することによって少なくとも１つの遺伝子の発現に影響するＤＮＡの領域をいう。
【００６０】
任意の細菌と関連して用語「菌種（spp.）」とは、本発明の目的のために、種、亜種等を含む所定の属の全メンバーを含むことを意味する。たとえば用語「サルモネラ菌種」は、チフス菌およびネズミチフス菌等のサルモネラ属の全メンバーを含むことを意味する。
【００６１】
本発明の過程において、「細菌」と関連する用語「非病原性の」とは、宿主において疾患または病状を引き起こさない細菌をいう。
【００６２】
細菌感染症には、炭疽病、細菌性髄膜炎、ボツリヌス症、ブルセラ症、カンピロバクター症、猫引っかき病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、膿痂疹、レジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳（ゼーゼーいう咳）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山脈紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路感染症、細菌性心臓病が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６３】
ウイルス感染症には、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、水疱瘡（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、単純ペルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（流感）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核症、流行性耳下腺炎、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病、黄熱病が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６４】
慢性炎症または慢性炎症性疾患には、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、炎症性大腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、珪肺症および他の塵肺症が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６５】
自己免疫疾患には、全身性症候群（たとえばＳＬＥ、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチおよび多発性筋炎）ならびに局所症候群（たとえばＩＤＤＭ、橋本甲状腺炎、アジソン病、尋常性天疱瘡、乾癬、アトピー性皮膚炎、アトピー性症候群、喘息、自己免疫性溶血性貧血症、多発性硬化症）が含まれるが、これらに限定されないものとする。
【００６６】
上述の細菌ならびに好ましい実施形態は、本明細書では本発明の細菌と呼ぶ。
【００６７】
本発明の細菌は、腫瘍標的の過程において、有利には生ワクチンとして腫瘍治療での使用に適している。すなわち、本発明の細菌によって、部分的または完全に枯渇した腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）においてアポトーシスが誘発される。それによって、腫瘍は露出され、従来の抗腫瘍薬によって攻撃されうる。
【００６８】
本発明の細菌は、生治療薬（live therapeutic）として、マクロファージ炎症が付随する慢性炎症性疾患の治療で使用するのに適しており有利である。すなわち、本発明の細菌によって、疾患に付随するマクロファージにおいてアポトーシスを誘発し、次いでこのマクロファージは炎症部位から部分的または完全に枯渇する。それによって、持続性炎症の原因である１つの因子が欠損し、この慢性炎症を消失させることができる。この疾患の例としては、良性前立腺肥大症等の炎症に付随する良性増殖性疾患、またはクローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、喘息等の慢性炎症性自己免疫疾患がある。
【００６９】
本発明の非病原性細菌および／または弱毒化細菌は、既知の様式で投与することができる。それによって、投与経路は、作用の適切な部位にもしくは所望の部位に前述の細菌を効果的に運ぶ、たとえば非経口的もしくは経口的に、特に静脈内に、局所的に、経皮的に、肺に、直腸に、膣内に、経鼻的に、もしくは非経口で運ぶ、または埋め込みによる任意の経路であってよい。静脈内投与が好ましい。
【００７０】
非経口投与は、たとえば、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射用の無菌の水溶液剤もしくは油性溶液剤、懸濁剤もしくは乳濁剤によって、埋め込みによってまたは軟膏剤、クリーム剤もしくは坐剤によって行うことができる。徐放形態としての投与も、必要に応じて可能である。埋め込みは、たとえば、生分解性ポリマーまたは合成シリコーン（たとえばシリコーンゴム）の不活性物質を含んでもよい。腟内投与は、たとえば膣リングによって可能である。子宮内投与は、たとえばベッサリーまたは他の適切な子宮内器具によって可能である。経皮投与は、特に、この目的に適している剤形によっておよび／またはたとえばパッチ等の適した方法によって追加的に提供される。
【００７１】
経口投与は、たとえば、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、コーティング錠剤、顆粒剤または散剤として固形形態で行うことができるが、飲料溶液剤の形態でも行える。本発明の経口投与用化合物として、既知の通常使用され、生理的に許容される賦形剤と、担体（たとえばアラビアゴム、タルク、デンプン、糖（たとえばマンニトール、メチルセルロース、ラクトース）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、シクロデキストリン、水溶性担体もしくは非水溶性担体、希釈剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤および香味料（たとえば精油））とを組み合わせることができる。本発明の細菌は、ナノ微粒子等の微粒子の組成物に分散させることも可能である。
【００７２】
本発明の非病原性細菌および／または弱毒化細菌を製造する可能な様式は、以下のとおりである。
【００７３】
（Ａ）変異誘発、選択、および／または標的ゲノム修飾によって毒性細菌株、好ましくはサルモネラ菌株を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。弱毒化細菌株、好ましくはサルモネラ菌株を次のとおりに処置することができる。
【００７４】
（ｉ）恒常的なＳｉｐＢ／ＩｐａＢ発現をもたらす負の調節ＤＮＡのゲノム欠失。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、分泌系、輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７５】
（ｉｉ）恒常的なＳｉｐＢ／ＩｐａＢ発現をもたらす正の調節ＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、分泌系、輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７６】
（ｉｉｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７７】
（Ｂ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によってリステリアまたは赤痢菌等の毒性の細胞内病原性細菌を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００７８】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００７９】
（Ｃ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によって無毒性赤痢菌菌株を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００８０】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００８１】
（Ｄ）変異誘発、選択および標的ゲノム修飾によって大腸菌、ビブリオ等の非病原性細菌または細胞外病原性細菌を弱毒化、好ましくは栄養要求性にする。この弱毒化細胞を次のとおりに処置する。
【００８２】
（ｉ）恒常的に発現されるＳｉｐＢ／ＩｐａＢをコードするＤＮＡのゲノム挿入またはプラスミド挿入。必要であれば、追加のＤＮＡ操作と組み合わせて、マクロファージ（浸潤物、ＩＩＩ型輸送系）においてアポトーシスの誘発に必要な追加のエレメントを確実に発現させる。
【００８３】
［図１］相当量のＴＡＭが異なるマウス腫瘍モデルで検出できることを示す。直径１〜１．５ｃｍの腫瘍を、１×１０6Ｂ７８−Ｄ１４細胞（ａ）、１×１０4４Ｔ１細胞（ｂ）および１×１０6Ｐ８１５−ＰＳＡ細胞（ｃ）を皮下注射したマウスから分離した。さらに、トランスジェニックＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢから自発性乳腺腫瘍を分離した（ｄ）。腫瘍組織を固定してパラフィンに包埋した。ビオチン化抗Ｆ４／８０モノクローナル抗体で腫瘍切片を免疫染色し、続いてヘマトキシリンで対比染色した（右側）。対照として、Ｆ４／８０抗体を使用せずにアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼによる染色を行った（左側）。
【００８４】
［図２］ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す。腫瘍を有するマウス（群あたりおよびｔ時点でｎ＝３マウス）に、１×１０6のネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを静脈内感染させてから４時間後、６時間後、および７日後に、分離腫瘍細胞および対照として脾臓細胞のコロニー形成単位／細胞数（ａ）ならびに感染細胞／細胞数（ｂ）を決定した。Ｌ−Ｔｏｐアガーに、段階希釈した細胞ライセートを播種することによってコロニー形成単位を決定し、非溶解のゲンタマイシン処置細胞を播種することによって感染した細胞数を決定した。右下がり縞のカラムは、ゲンタマイシンを使わずに処置した全脾臓細胞を表し、右上がり縞のカラムは、ゲンタマイシン処置した脾臓細胞を表す。横縞のカラムは、ゲンタマイシンを使わずに処置した全腫瘍細胞画分を表す。縦縞のカラムは、ゲンタマイシン処置した全腫瘍細胞画分を表す。黒カラムはマクロファージ画分を表し、白カラムはマクロファージが枯渇した画分を示す。いずれの時点においても、マクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分においてかなり多くの細胞が見られた。感染から４時間後および６時間後、ほとんどの細菌は細胞内にあった。対して感染から７日後、無処置の全腫瘍細胞と比較すると、ゲンタマイシン処置した群においてコロニー形成単位数によって決定したように、１０倍以上の細菌が細胞外で見られた。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、（スチューデントのｔ検定）であった。
【００８５】
［図３］腫瘍を有するマウスにサルモネラを静脈内感染させることにより、腫瘍関連マクロファージにおいて感染から６時間後にカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発し、感染から７日後には誘発しないことを示す。４Ｔ１腫瘍を有するマウスにサルモネラを感染させてから４時間後、６時間後および７日後、分離し溶解した細胞のカスパーゼ−１活性化（ａ）およびＰＡＲＰ切断（ｂ）をウエスタンブロット法によって分析した。カスパーゼ−１抗体は、カスパーゼ−１の２０ｋＤａの活性サブユニットを検出し、ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、全細胞ならびに感染から６時間後のマウス由来の腫瘍マクロファージ画分で検出できたが、マクロファージを枯渇した画分では検出できなかった。感染から７日後、カスパーゼ−１またはアポトーシスは、どの画分でも検出できなかった。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた。感染から７日後、ＦＡＣＳによって相対量のＴＭＡを決定した。棒グラフは、群毎に分析した３つの腫瘍の平均値±標準偏差を表す（ｃ）。感染から７日後、サルモネラはマクロファージ数に影響を及ぼさなかった。
【００８６】
［図４］ａｒｏＡ変異体フレクスナー赤痢菌菌株の特徴付けを示す。（ａ）ＬＢ培地中３７℃、１８０ｒｍｐでの増殖速度の決定。一晩培養物を本培養用に１：２０に希釈して、一時間ごとに外径を測定した。プラスミドのない無毒性菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６を、ＬＢ培地で、０．３外径／時間の最大増殖速度によって特徴付けた。これに対して毒性菌株のフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの最大増殖速度は、若干低下した０．２外径／時間であった（ａ）。ａｒｏＡ変異体を保有する菌株の最大増殖速度は、実質的に低下したものであった。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの最大増殖速度は、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの最大増殖速度よりも２．５倍遅かった。ここでも、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと比較して、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡの最大増殖速度は、若干高かった。（ｂ）ＨｅＬａ細胞を用いた浸潤アッセイ。１００：１の感染効率で感染させた。この野生型菌株Ｍ９０Ｔに比べて、３５分間の感染（結合）および感染後１時間（浸潤）、続いてコロニー形成単位を決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ菌株（Ｍ９０ＴΔ）は、その接着挙動または浸潤挙動において、野生型菌株と比較すると何ら相違を示さなかった。これに対して無毒性菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（ＢＳ１７６Δ）菌株は、浸潤障害を示した。（ｃ）細胞内の複製潜在能力を決定するために、１００：１の感染効率で１時間、細胞を感染させた。続いて、ゲンタマイシンの存在下でさらに２時間、細胞をインキュベートして、溶解細胞のコロニー形成単位を決定した。前述の野生型菌株は細胞内複製の能力があったが、Ｍ９０ＴΔまたはＢＳ１７６Δのいずれも能力がなかった。（ｄ）細胞間伝播の能力を決定するために、５００：１の感染効率で１時間、ＨｅＬａ細胞を感染させた。次いで、この感染した細胞を２０グレイで２０分間放射線照射し、Ｈｅｌａ細胞の複製をブロックした。感染し照射した細胞および非感染ＨｅＬａ細胞を７０：１の割合で、２時間、８時間および１２時間、ゲンタマイシンの存在下で同時インキュベートした。続いて、非溶解細胞をＳｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロースで段階希釈して、ＢＨＩアガープレート上に播種した。同時感染から１２時間後、Ｍ９０ＴΔのコロニー形成単位は１７倍増大した。これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δのコロニー形成単位は、わずか３倍増大し、細胞間伝播に対してＭ９０ＴΔの損なわれていない潜在力を示唆した。（ｅ）感染から１時間後（補足データ）および４時間後、ＨｅＬａ細胞をＧｉｅｍｓａ染色することによって、Ｍ９０ＴΔの細胞間伝播能力を確認した。カスパーゼ−１活性化およびアポトーシス誘導を誘発するａｒｏＡ変異体の能力を決定するために、Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージを感染させ、カスパーゼ−１の２０ｋＤａ活性断片を認識するカスパーゼ−１抗体（ｆ）ならびに８５ｋＤａ切断断片を認識するＰＡＲＰ抗体（ｇ）を用いて、細胞溶解物をウエスタンブロット法によって異なる時点で分析した。ＭＴ９０Δは、カスパーゼ−１誘導およびアポトーシスの双方を誘発することができたが、ＢＳ１７６Δはできなかった。Ｍ９０ＴΔによるアポトーシス誘導およびカスパーゼ−１プロセシングは、カスパーゼ−１特異的インヒビターＹＶＡＤ−ＣＨＯ（２．５ｍＭ）によって完全にブロックされた。β−アクチンをローディング対照として用いた。棒グラフは、３種類の異なる実験の平均値±標準偏差、＊＊＊：ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）を表している。
【００８７】
［図５］フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す。腫瘍を有するマウス（群およびｔ時点でｎ＝３マウス）を、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（ｃ、ｄ）およびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（ａ、ｂ）で静脈注射で感染させてから６時間および７日後に、分離した腫瘍細胞および対照として脾臓細胞のコロニー形成単位／細胞数（ａ、ｃ）ならびに感染細胞／細胞数（ｂ、ｄ）を決定する。Ｌ−Ｔｏｐアガーに、細胞ライセートの段階希釈物を播種することによってコロニー形成単位を決定し、非溶解したゲンタマイシン処置細胞を播種することによって感染した細胞数を決定した。右下がり縞のカラムは、ゲンタマイシンを使用せずに処置した全脾臓細胞を表し、右上がり縞のカラムは、ゲンタマイシンで処置した脾臓細胞を表す。横縞のカラムは、ゲンタマイシンを使用せずに処置した全腫瘍細胞画分を表す。縦縞のカラムは、ゲンタマイシンで処置した全腫瘍細胞画分を表す。黒カラムはマクロファージ画分を表し、白カラムはマクロファージが枯渇した画分を示す。いずれの時点においても、マクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分においてかなり多くの細胞が見られた。いずれの時点においても、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの大部分は細胞内に見られた。これに対して無菌性菌株ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染から６時間後、５０倍以上の細菌が細胞外で見られた（ａ、ｂ）。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、（スチューデントのｔ検定）であった。
【００８８】
［図６］腫瘍を有するマウスにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを静脈注射で感染させることで、感染から４時間、６時間および７日後、ＴＡＭにおいてカスパーゼ−１プロセシングならびにアポトーシスを誘発し、かつ感染から７日後マクロファージ数を実質的に減少させたが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染では見られなかったことを示す。４Ｔ１腫瘍を有するマウスに赤痢菌を感染させてから４時間、６時間および７日後、分離し溶解した細胞のカスパーゼ−１活性化（ａ）ならびにＰＡＲＰ切断（ｂ）をウエスタンブロット法で分析した。カスパーゼ−１抗体は、カスパーゼ−１の２０ｋＤａ活性サブユニットを検出し、ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、Ｍ９０ＴΔに対しては、感染から４時間および６時間後、マウス由来の腫瘍の全細胞およびマクロファージ画分において、ならびに感染から７日後、マクロファージ画分において検出できた。しかしＢＳ１７６Δに対しては検出できなかった。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。感染から７日後、相当量のＴＡＭがＦＡＣＳによって決定され（ｃ、ｄ）、感染から７日後Ｍ９０ＴΔはマクロファージ数において実質的な減少をもたらしたが、ＢＳ１７６Δではこの現象は見られなかった。ナイーブマウス、ＢＳ１７６ΔおよびＭ９０ＴΔに感染したマウスの組織学的検査（ｅ）によって、Ｍ９０ＴΔ感染から７日後のマウス由来の腫瘍において、マクロファージ（抗Ｆ４８０染色）および強い炎症（抗ＣＤ４５染色）の実質的な減少、ならびにサイトケラチン陽性４Ｔ１腫瘍細胞（抗ＣＫ染色）のほぼ完全な減少が明らかになったが、ナイーブマウスまたはＢＳ１７６Δ感染のマウスではこの現象は見られなかった。棒グラフは、群毎に分析した４つの腫瘍の平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）を表す。
【００８９】
［図７］４Ｔ１腫瘍を有するマウスにＭ９０ＴΔを静脈注射で感染させることで、腫瘍増殖がブロックされ、ＢＳ１７６Δの場合はブロックされないことを示す。（ａ）腫瘍移植から１４日後、群あたりｎ＝８マウスに１×１０6細菌を静脈注射で投与した。１×ＰＢＳ静脈注射で対照群を処置した。Ｍ９０ＴΔによる感染後、腫瘍増殖が実質的に減少し、続いて腫瘍増殖がブロックされた。ＢＳ１７６Δによる感染は、少量ではあるが有意な腫瘍増殖の減少をもたらした。腫瘍接種から３１日後、動物福祉の理由でナイーブマウスおよびＢＳ１７６Δマウスを屠殺した。すべての群に対してｎ＝８、Ｍ９０ＴΔに対してｎ＝６（腫瘍増殖を比較するために、２匹のマウスを屠殺した）およびｎ＝３（コロニー形成単位の決定およびＦＡＣＳ分析のために、３匹のマウスを屠殺した）。感染した動物は、それぞれ最初の感染から１日目−１８、１８日目−４８、４８日目−６８。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。（ｂ）感染から４８日後、マクロファージ数およびコロニー形成単位を、それぞれＦＡＣＳおよび段階希釈法で決定した。非増殖腫瘍は、極めて低いマクロファージ数を示し、細菌が検出できなかった。感染から４９日目に、残りの３匹のマウスに１×１０6細菌を静脈注射で投与した。腫瘍の大きさが縮小したものは検出されなかった。感染から６８日目に、コロニー形成単位を決定し、続いて組織学的検査を行った。細菌は、腫瘍、肝臓および脾臓で検出できなかった。
【００９０】
［図８］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したマクロファージにおいてＴＡＭを主に標的にして、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す（ａ）。ある患者からの細胞を分離した後３つの異なる細胞画分を、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを用いて１００：１の感染効率で１時間ｅｘ ｖｉｖｏ感染を行った。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に１時間のインキュベーション後、段階希釈物をＢＨＩアガー上に播種した。翌日、コロニー形成単位を決定した。感染細胞中のカスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰプロセシングをウエスタンブロット法で分析した（ｂ）。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性化２０ｋＤａのサブユニットを検出した。マクロファージが枯渇した画分には、検出可能なレベルのプロカスパーゼ−１が含まれていないことに留意されたい。ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差、＊＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）であった。
【００９１】
［図９］カスパーゼ−１がマクロファージによって独占的に発現されることを示す。カスパーゼ−１発現についての、ＲＴ−ＰＣＲ（左側）およびウエスタンブロット（右側）による分析。以下のプライマーを用いた。アクチンｓ１ ５’−ＧＴＣＧＴＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧ−３’、アクチンａｓ ５’−ＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧ−３’；Ｃａｓｐ１ＲＴ＿左５’−ＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡ−３’、Ｃａｓｐ１ＲＴ＿右５’−ＧＧＴＣＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＣＴＣＣＴ−３’。
【００９２】
［図１０］ＲＡＷマクロファージにおけるカスパーゼ−１サルモネラおよび赤痢菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージに１０：１の感染効率で、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（対数増殖期の中間部）およびネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（定常増殖期）を異なる時点で感染させた。続いて、細胞ライセートのカスパーゼ−１活性化についてウエスタンブロットを行った。ａｒｏＡ欠失を包含する赤痢菌菌株は、野生型赤痢菌菌株と比較するとカスパーゼ−１活性化において若干の遅れを示したが、２時間後同じ活性に達した。サルモネラ菌株は、インキュベーションから３時間後、カスパーゼ−１プロセシングを誘発した。対数期に収集したサルモネラ菌株は、このアッセイ（データを図示せず）においてカスパーゼ−１プロセシングを誘発しなかった。その後のすべての感染実験のために、定常期で収集した菌株を用いた。
【００９３】
［図１１］Ｇｉｅｍｓａ染色によるＪ７７４Ａ．１マクロファージを示す。表示したものは、それぞれＭ９０Ｔ（左側）、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（中央）およびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（右）による感染から１時間後のＪ７７４Ａ．１マクロファージである。
【００９４】
［図１２］ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡに対するゲンタマイシンの細胞外活性および細胞内活性を示す。（ａ）１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを、５０、１００、２００および３００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを用いて１／２時間、１時間および２時間処置し、次いでコロニー形成単位を段階希釈法で決定した。（ｂ）Ｊ７４４Ａ．１マクロファージを、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（対数増殖期）で感染させた。ＤＭＥＭ培養液で細菌を３回洗浄して、４０００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心する。感染から1時間後、細胞を、５０、１００、２００および３００μ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートした。細胞を溶解した後、コロニー形成単位を段階希釈法で決定した。ＭＡＣＳ分離の間に細胞が再感染しないようにしかつ細胞外細菌数を算定するためには、１時間のインキュベーション間に細胞外細菌を死滅させるか、または実質的に減少させる必要がある。（ａ）に示したように、５０、１００または２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに1時間インキュベートすると、対照と比較して、コロニー形成単位の３倍、１０倍または１００倍の減少をもたらした。これと対照的に、３００μｇ／ｍｌとともにインキュベートした場合、1時間のインキュベーション後、遊離細菌が１０００倍以上減少し、2時間のインキュベーション後には細菌は完全に除去された。上述の濃度での細胞内細菌の活性を決定するため、細胞分離で使用したプロトコールと同様のものを用いた（ｂ）。１００〜３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンでは、これらの短いインキュベーション時間で細胞外細菌に対して僅かな活性を示す５０μｇ用量と比較すると、わずかに１．５倍の活性増大を示した。１００〜３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンでは、細胞内コロニー形成単位において有意差がなかった。したがって、最も高い３００μｇ／ｍｌ用量のゲンタマイシンを今後の実験のために選択した。この用量は、細胞分離で用いた実験設定において細胞外細菌を１０００倍以上減少させることになる。
【００９５】
［図１３］細胞分離の実験予定を示す。（ａ）腫瘍除去および全腫瘍細胞の分離後、（ｂ）０．００１％デオキシリボヌクレアーゼおよび２μｇ／ｍｌディスパーゼで処置することで、全腫瘍細胞の一部分（１）を３００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで、またはゲンタマイシンを使わずに１時間処置した。処置後、コロニー形成単位およびカスパーゼ−１活性化について細胞を分析した。ゲンタマイシンで処置した標本は、主に細胞内細菌を含み、これに対して未処置の標本は細胞外細菌および細胞内細菌を含む。全腫瘍細胞の第２の部分（２）を、抗Ｆ４／８０（ＩｇＧ）抗体で標識化した。次いで、磁気ビーズで標識化した第２の抗ＩｇＧ抗体を加えた。磁場でＭＡＣＳカラムを用いて分離を行い、マクロファージ画分およびマクロファージ枯渇画分の２つの細胞画分をもたらした。マクロファージ画分の純度は、９６〜９９％（ｎ＝７）である。遊離細菌による細胞の再感染を防止するために、処置の間を通じて３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともにインキュベートしたこれらの画分をもちいて、コロニー形成単位およびカスパーゼ−１プロセシングも評価した。マクロファージが枯渇した画分（ｄ）と比較して、マクロファージ画分（ｃ）が含む細胞量が実質的に低いことに留意されたい。コロニー形成単位を数えるために、播種後に標準化（コロニー形成単位／細胞数、感染細胞／細胞数）を行った。ウエスタンブロットのため、同等の細胞数を添加した。
【００９６】
［図１４］細胞分離後、３つの細胞画分の光学顕微鏡検査（×１００）を示す。感染した細胞の数に関して結果に影響を及ぼし得る細胞分離の有効性を評価するために、３つの異なる細胞画分について光学顕微鏡検査を行った。左側パネルは、全腫瘍細胞の画分を示し、中央のパネルは分離したマクロファージを示す。左側パネルは、マクロファージが枯渇した画分を示す。すべての細胞画分の細胞は、主に単細胞のようにみえる。
【００９７】
［図１５］腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ）および感染から６時間後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｂ）を決定する。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から６時間後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染した細胞の数を決定した。
【００９８】
［図１６］腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｂ）ならびに感染から４時間後、６時間後および７日後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｃ、ｄ）を決定する。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から４時間後、６時間後および７日後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。
【００９９】
［図１７］腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｂ）および感染から６時間後にＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｃ、ｄ）を決定する。腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウス（ｎ＝４）に、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から６時間後、脾臓および腫瘍を摘出して、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。感染動物および非感染動物において感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。移植腫瘍で得た結果と同様に、自発性乳腺がんを有するトランスジェニック動物モデルにおけるマクロファージが枯渇した腫瘍細胞と比較すると、サルモネラは約１００倍も高い効率でＴＡＭを感染させた（ａ〜ｄ）。このモデルにおいても、細菌の大部分は細胞内に存在した。サルモネラ処置は、感染から７日後の腫瘍においてマクロファージ数に測定可能な減少をもたらさなかった。
【０１００】
［図１８］Ｍ９０Ｔ、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスジェニックマウス由来の自発性乳腺がんから分離したマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す。Ｂａｌｂ／ｃ（ａ、ｂ）およびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２（ｃ、ｄ）由来の細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１８６Δ−ａｒｏＡを１００：１の感染効率で１時間、ｅｘ ｖｉｖｏ感染させた。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした後、ウエスタンブロットのために異なるプローブを製造した。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性化カスパーゼ−１（２０ｋＤａ）のサブユニットを検出した。マクロファージが枯渇した画分には、検出可能なレベルのプロカスパーゼ−１が含まれていないことに留意されたい。ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出する。
【０１０１】
［図１９］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、自発性乳腺がんを有するトランスジェニックマウスの腫瘍のマクロファージに主に存在し、感染から７日後、実質的にマクロファージ数を減少させたことを示す。コロニー形成単位（ａ、ｃ）および感染から７日後のＬ−Ｔｏｐアガーアッセイによって感染細胞数（ｂ、ｄ）を決定する。ＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ（１×１０6）を感染させた。感染から７日後、脾臓および腫瘍を摘出し、細胞を分離した。溶解細胞を段階希釈することによって全コロニー形成単位を決定し、次いでＬ−Ｔｏｐアガーに段階希釈した無傷細胞を播種することによって感染細胞数を決定した。感染動物および非感染動物において感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、感染から７日後、依然として主にＴＭＡを感染させていた。発明者らも、感染から７日後のマクロファージの相対的割合（ｅ）を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡに感染したマウスと比較すると、感染から７日後、マクロファージの量において有意差があった。＊＊＊：ｐ＜０．００５。静脈注射による感染から７日後、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、自発性腫瘍のマクロファージ内に主に存在している（マクロファージが枯渇した画分と比較すると５倍の差）。非浸潤性ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株は、極めて低い細胞数で、依然として腫瘍内に存在し、かつ主にマクロファージ内にも見られる。サルモネラと対照的に、非毒性ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株と比較すると、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発する能力がある感染性Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ菌株に感染したマウスの腫瘍においてマクロファージ数は、実質的に４倍以上（＊＊＊：ｐ＜０．００５）減少している。
【０１０２】
［図２０］腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスにＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、静脈注射による感染から６時間後および７日後、腫瘍のマクロファージ画分においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発するが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを感染させると、この現象が見られないことを示す。腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウス（ｎ＝４）に、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δａｒｏ−Ａ（１×１０6）を静脈注射で感染させる。６時間後および７日後、ウエスタンブロット法によって細胞画分を分離し、分析した。この抗体は、プロカスパーゼ−１（４５ｋＤａ）および活性（２０ｋＤａ）のサブユニットを検出した。抗切断ＰＡＲＰ抗体は、８５ｋＤａの切断ＰＡＲＰ断片を検出した。自発性腫瘍を有するトランスジェニックマウスに、静脈注射でＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、感染から６時間後、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスの実質的な減少をもたらした。サルモネラと対照的に、アポトーシス促進性活性が７日目に存続していた。腫瘍を移植した動物で観察された結果と同様に、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ感染から７日後のマウスの全腫瘍細胞画分において、測定できるカスパーゼ−１誘導がなかった。これは、これらの腫瘍においてマクロファージが実質的に減少したことによって説明されると思われる。
【０１０３】
［図２１］Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したＴＡＭを主に標的にすることを示す。腹水細胞は、２つの異なる細胞集団からなり、一方の細胞集団には接着細胞があり、他方の細胞集団には懸濁細胞がある。この２つの細胞集団（ａ、ｂ）を分離細胞型として処置した。ある患者から細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを１００：１の感染効率で１時間、ｅｘ ｖｉｖｏ感染させ、対照としてＲＡＷ２６４．７マクロファージを感染させた。３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした後、段階希釈物をＢＨＩアガー上に播種した。翌日、全コロニー形成単位を決定した。表示したすべての結果は、平均値±標準偏差；＊＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）であった。
【０１０４】
［図２２］ｐＭＯｈｌｉｐａプラスミドのグラフィカル模式図である。
【０１０５】
［図２３］大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌の決定を示す。Ｍ９０Ｔ（陽性、ＩｐａＢ ６４ｋＤａ）によって、およびＢＳ１７６（陰性）によって感染させたＲＡＷ２６４．７マクロファージを対照として用いた。ＨｌｙＡシグナル配列をＩｐａＢに融合させたために、大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌を７０ｋＤａ生成物によって検出した。
【０１０６】
［図２４］ｉｎ ｖｉｔｒｏ大腸菌によるカスパーゼ−１活性化についてのウエスタンブロット分析を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージに、異なる大腸菌ＤＨ５α菌株（定常増殖期）を３時間および６時間感染させた。カスパーゼ−１活性化に対する陽性対照として、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ（対数増殖期の中間部）を感染させかつスタウロスポリン（４μＭ）を用いて３時間処置した。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。
【０１０７】
［図２５］ｉｎ ｖｉｖｏ脾臓組織におけるカスパーゼ−１活性化に関するウエスタンブロット分析を示す。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに１×１０6大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａをｉｎ ｖｉｖｏ感染させ、脾臓細胞の分離およびカスパーゼ−１活性化のウエスタンブロット分析を行った。Ｂａｌｂ／ｃから分離したＴＡＭにＭ９０Ｔを感染させ、カスパーゼ−１活性化に関する陽性対照とした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨを用いた。
【０１０８】
［図２６］プラスミドｐＳＰＲ１７のグラフィカル模式図である。
【０１０９】
すべての引用文献および特許の内容を、参考として本明細書で援用する。以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、その実施例に限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、相当量のＴＡＭが異なるマウス腫瘍モデルで検出できることを示す図である。
【図２】図２は、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す図である。
【図３】図３は、腫瘍を有するマウスにサルモネラを静脈内感染させることにより、腫瘍関連マクロファージにおいて感染から６時間後にカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発し、感染から７日後には誘発しないことを示す図である。
【図４】図４は、ａｒｏＡ変異体フレクスナー赤痢菌菌株の特徴付けを示す図である。
【図５】図５は、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡがｉｎ ｖｉｖｏで主にＴＡＭを標的にすることを示す図である。
【図６】図６は、腫瘍を有するマウスにフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを静脈注射で感染させることで、感染から４時間、６時間および７日後、ＴＡＭにおいてカスパーゼ−１プロセシングならびにアポトーシスを誘発し、かつ感染から７日後マクロファージ数を実質的に減少させたが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染では見られなかったことを示す図である。
【図７】図７は、４Ｔ１腫瘍を有するマウスにＭ９０ＴΔを静脈注射で感染させることで、腫瘍増殖がブロックされ、ＢＳ１７６Δの場合はブロックされないことを示す図である。
【図８】図８は、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したマクロファージにおいてＴＡＭを主に標的にして、カスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す図（ａ）、感染細胞中のカスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰプロセシングをウエスタンブロット法での分析により示す図（ｂ）である。
【図９】カスパーゼ−１がマクロファージによって独占的に発現されることを示す図である。
【図１０】ＲＡＷマクロファージにおけるカスパーゼ−１サルモネラおよび赤痢菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を示す図である。
【図１１】Ｇｉｅｍｓａ染色によるＪ７７４Ａ．１マクロファージを示す図である。
【図１２】ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡに対するゲンタマイシンの細胞外活性および細胞内活性を示す図である。
【図１３】細胞分離の実験予定を示す図である。
【図１４】細胞分離後、３つの細胞画分の光学顕微鏡検査（×１００）を示す図である。
【図１５】腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１６】腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１７】腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡをｉｎ ｖｉｖｏ感染させたことを示す図である。
【図１８】Ｍ９０Ｔ、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスジェニックマウス由来の自発性乳腺がんから分離したマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発することを示す図である。
【図１９】Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、自発性乳腺がんを有するトランスジェニックマウスの腫瘍のマクロファージに主に存在し、感染から７日後、実質的にマクロファージ数を減少させたことを示す図である。
【図２０】腫瘍を有するＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢマウスにＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させると、静脈注射による感染から６時間後および７日後、腫瘍のマクロファージ画分においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発するが、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡを感染させると、この現象が見られないことを示す図である。
【図２１】Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡが、ｅｘ ｖｉｖｏヒト腹水細胞から分離したＴＡＭを主に標的にすることを示す図である。
【図２２】ｐＭＯｈｌｉｐａプラスミドのグラフィカル模式図である。
【図２３】大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ分泌の決定を示す図である。
【図２４】ｉｎ ｖｉｔｒｏ大腸菌によるカスパーゼ−１活性化についてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２５】ｉｎ ｖｉｖｏ脾臓組織におけるカスパーゼ−１活性化に関するウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２６】プラスミドｐＳＰＲ１７のグラフィカル模式図である。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：
方法
プラスミド。プラスミドｐＫＤ３、ｐＤＫ４（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）およびｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ， Ｐ．Ｐ． ＆ Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ， Ｗ． Ｇｅｎｅ １９９５， １５８：９−１４）を保有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株を、Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ大学、バイオテクノロジー学部から入手した。このプラスミドｐＫＤ３およびｐＤＫ４は、π依存性であり、かつＦＬＰリコンビナーゼ認識部位（ＦＲＴ部位）に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子をそれぞれ保有する。ｐＣＰ２０プラスミドは、１つの温度感受性レプリコンと、ｌ ｃｌ８５７リプレッサーの制御下においてＩｐＲプロモーターから転写された酵母ＦＬＰコンビナーゼとを含む（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ， Ｐ．Ｐ． ＆ Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ， Ｗ． Ｇｅｎｅ １９９５， １５８：９−１４）。
【０１１２】
培地、化学薬品および他の試薬。アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）およびカナマイシン耐性（ＫｍＲ）の形質転換体を、１００、２５、および３０μｇ／ｍｌでそれぞれの抗生物質を含有するトリプチケースソイアガー（１．２％アガー）（ＴＳＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で選択した。計１ｍＭのＬ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ）を使用した。オリゴヌクレオチドはＭＷＧ社製であった。特に明記しない限り、酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ社製であった。すべてのＰＣＲ検査では、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。Ｔａｑ（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用し、クローニングおよび変異誘発用のＤＮＡを生成した。Ｑｉａｇｅｎ製品（Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、プラスミドＤＮＡの分離、断片のゲル精製またはＰＣＲ産物の精製を行った。
【０１１３】
細菌株、増殖条件および遺伝学的方法。使用したネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Δ−ａｒｏＡ菌株は、プラスミドベースのカナマイシン耐用を持つ（プラスミドｐＴｏｌＣＫａｎ、Ｈｏｔｚ ｅｔ ａｌ．、未発表データ）。プラスミド安定性は、ｉｎ ｖｉｖｏで１００％であり、したがってこの菌株を用いることで、カナマイシン上での選択が可能になった（データは図示せず）。使用したフレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）５ａ菌株は、ＮｉｃｅのＳｏｐｈｉａ−Ａｎｔｉｐｏｌｉｓ大学からの野生型Ｍ９０Ｔ［ストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性］（Ａｌｌａｏｕｉ， Ａ．， Ｍｏｕｎｉｅｒ， Ｊ．， Ｐｒｅｖｏｓｔ， Ｍ．Ｃ．， Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． ＆ Ｐａｒｓｏｔ， Ｃ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９２， ６：１６０５−１６１６）およびその非浸潤性変異体ＢＳ１７６（毒性プラスミドｐＷＲ１００が欠如している）（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ｆｏｒｍａｌ， Ｓ．Ｂ． Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ １９８２， ３５：８５２−８６０；Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０００， ３８：７６０−７）である。すべての菌株を、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．）、トリプチケースソイアガー（１．２％アガー）（ＴＳＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ． Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９９２）またはブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）の培地上で規定どおりに増殖した。１リットルあたり１００ｍｇのコンゴーレッド染料（Ｃｒ）を含有するＴＳＡを用いて、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種のＣｒ＋クローン（Ｍａｕｒｅｌｌｉ， Ａ．Ｔ．， Ｂｌａｃｋｍｏｎ， Ｂ． ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ， Ｒ．， ３ｒｄ．Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ １９８４， ４３：１９５−２０１）を選択した。必要に応じて、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）またはＣｍ（３０ｍｇ／ｍｌ）（すべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を細菌培養物に加えた。ｐＣＰ２０を含有する菌株は、以下に特に記述しない限り３０℃でインキュベートした。２２０ｋｂ毒性プラスミドｐＷＲ１００のＭ９０Ｔからの分離は、大型コンストラクトキット（ＱＩＡＧＥＮ）によって行った。
【０１１４】
直鎖ＤＮＡ製造。抗生物質耐性遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）によって記述された方法を用いて、ｐＫＤ３またはｐＫＤ４から製造した。ＰＣＲ反応用のプライマーは、目的の遺伝子と５０ｂｐの相同性を有しならびにｐＫＤ３またはｐＫＤ４から準備するために使用するＰ１およびＰ２の部位を含有するようにデザインした。挿入断片の検証（下記）は、プライマーＡｒｏＡｕｐおよびＡｒｏＡｄｏｗｎを用いて行った。ＰＣＲ反応は、製造者（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）の推奨に従ってＴａｑポリメラ−ゼを用いて行った。
【０１１５】
ＰＣＲ分析は、コロニーＰＣＲ法によって行った。簡潔にいうと、コロニーを５０μｌの水に再懸濁させて、１０分間沸騰させＤＮＡライセートを作製する。ＰＣＲ法による適切なプライマーセットを用いて、各ライセートをアッセイした。ＰＣＲ反応は、製造者（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ， Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）の推奨に従ってＴａｑポリメラ−ゼを用いて行った。以下のプライマーを使用した。
ＡｒｏＡｕｐ ＧＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ＡｒｏＡｄｏｗｎ ＧＧＣＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡ
ＡｒｏＡＦｒ＿ｕｐ ＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＣＧ
ＡｒｏＡＦｒ＿ｄｏｗｎ ＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣ
Ｃ１ ＴＴＡＴＡＣＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＧＧ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｃ２ ＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｋ１ ＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
Ｋ２ ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｗａｎｎｅｒ， Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００， ９７：６６４０−６６４５）
増殖において減弱されているがその毒性においては減弱されてない菌株を作製するために、発明者らは、遺伝子操作した菌株のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡから始めた。したがって、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの２００ｋｂ毒性プラスミドｐＷＲ１００を大型コンストラクトキット（ＱＩＡＧＥＮ）によって分離した。次いで、この毒性プラスミドおよびアンピシリン耐性を保有するペルパープラスミドｐＣＤ２０を、すでに構築されているＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ菌株に形質転換した。この二重形質転換および３０℃で一晩のインキュベーションの後、毒性プラスミドｐＷＲ１００（ｐＷＲ１００＿ｕｐ ５’−ＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧ−３’；ｐＷＲ１００＿ｄｏｗｎ ５’−ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＣＡＴＣ−３’）およびａｒｏＡノックアウト（ＡｒｏＡＦｒ＿ｕｐ ５’−ＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＣＧ−３’；ＡｒｏＡＦｒ＿ｄｏｗｎ ５’−ＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣ−３’）を求めてアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングした。この菌株をフレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと名付けた。温度感受性レプリコンを含有するｐＣＰ２０プラスミドを、４３℃で一晩インキュベートすることによってキュアリングした。
【０１１６】
ＨｅＬａ細胞浸潤アッセイおよび生存アッセイ。ＨｅＬａ細胞によるゲンタマイシン保護アッセイを、若干の修飾を加えて前述（Ｅｌｓｉｎｇｈｏｒｓｔ ＥＡ， １９９４）のように行った。複数の７５ｃｍ2フラスコ内で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ， Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（双方とも１８０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ）で、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）単層をセミコンフルエンスになるまで増殖させた。１つのフラスコを０．２５％トリプシン（Ｐａｎ）でトリプシン処理し、次いでその細胞濃度をＤＭＥＭで２×１０5細胞／ｍｌまで調整した。６穴プレートに２ｍｌのＨｅＬａ細胞を播種し、約９０％のコンフルエンスになるまで５％ＣＯ2中、３７℃で一晩増殖させた。細菌を加える2時間前に、ＨｅＬａ細胞を洗浄してＤＭＥＭを交換した。細菌の対数期培養物（ＬＢ培地で増殖した）を、１００の推定感染効率で加えた。細菌を加えてから、プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で1時間、インキュベートした。Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で、前述のプレートを３回洗浄し、次いでゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭとともに、５％ＣＯ2中、３７℃で1時間、インキュベートした。特定の時点後に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液中でＨｅＬａ細胞を１０分間溶解させた。この細菌をＬＢアガープレート上に播種し、次いで３７℃で１８時間増殖させてから細菌コロニーをカウントした。
【０１１７】
細胞内増殖アッセイおよび細胞間増殖アッセイ。細胞内増殖および細胞間伝播の挙動を調べるために、初めに細胞のＧｉｅｍｓａ染色法を用いた。簡潔にいうと、カバーガラス（直径２０ｍｍ）上の直径４５ｍｍの組織培養プレート中で１００：１の感染効率で１時間感染させたＨｅＬａ細胞（１×１０5）を１×ＰＢＳで２回洗浄し、室温でメタノールを用いて５〜７分間固定した。プレートを風乾し、製造者の説明書に記述されているように製造したＧｉｅｍｓａ染料（Ｓｉｇｍａ）を用いて１５〜６０分間染色した。プレートを蒸留水で３回洗浄してから、風乾させて、油浸下で観察した。感染から１時間後および４時間後の時点で調べた。
【０１１８】
Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイ。Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイを用いて細胞間伝播を決定した。６穴組織培養プレート中でＨｅＬａ細胞（７×１０5）に、５００：１の感染効率で１時間感染させてから、１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、感染した細胞に、２０グレイで２０分間放射線照射した。続いて、非感染ＨｅＬａ細胞と、放射線照射した赤痢菌感染ＨｅＬａ細胞とを７０：１の割合で、２時間、８時間および１２時間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとの１時間のインキュベーションの後、ゲンタマイシンの濃度が１０μｇ／ｍｌまで減少した。すべての時点で、Ｓｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロース（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ， Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ）で作製した段階希釈物をＢＨＩアガープレート上に播種した。このアガープレートを３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、感染したＨｅＬａ細胞を特徴づけていた。
【０１１９】
マウス。６週齢〜８週齢のメスマウスに、それぞれ１００μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた以下のいずれかを皮下に注射した。１×１０4マウス４Ｔ１乳がん細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２５３９）、１×１０6Ｂ７８−Ｄ１４（Ｒｙｍｓａ， Ｂ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｈ．Ｄ．， Ｌａｕｃｈａｒｔ， Ｗ． ＆ ｄｅ Ｇｒｏｏｔ， Ｈ． Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９０， ６８：２６３−２６６；Ｌｏｄｅ， Ｈ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００， １０５：１６２３−１６３０）黒色腫細胞、および１×１０6Ｐ８１５−ＰＳＡ（Ｊ Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ， Ｊ．， Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｂ， Ｙｏｎｅ， ＣＬＲＰ， Ｈｏｔｚ， Ｃ， Ｍｅｙｅｒ， ＳＲ， Ｓｐｒｅｎｇ， Ｓ， Ｇｏｅｂｅｌ， Ｗ， Ｒａｐｐ， ＵＲ ａｎｄ Ｉ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００７）マスト細胞腫細胞。
【０１２０】
マウスに関わるすべての処置は、「Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ」（Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って行った。Ｂａｌｂ／ｃ ｏ１ａ ＨＳＤ、Ｃ５７／ＢＬ６、ＤＢＡ−２およびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２／ｎｅｗ ＦＶＢは、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ＧｍｂＨ（Ｂｏｒｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。すべての動物は、ｌｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｓｔｒａｈｌｅｎｋｕｎｄｅ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（ＭＳＺ）の動物飼育施設で飼育した。
【０１２１】
腫瘍についての組織学的分析および免疫組織化学分析。４Ｔ１細胞（１×１０4）、Ｂ７８−Ｄ１４細胞（１×１０6）およびＰ８１５−ＰＳＡ細胞（１×１０6）を、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７／ＢＬ６およびＤＢＡ／２マウスに皮下注射した。腫瘍の径が１．５〜２ｃｍまで大きくなったとき、この腫瘍を無菌的に切除した。この腫瘍をホルマリンで固定し、薄切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１２２】
腫瘍部位でマクロファージを識別するために、組織を４％緩衝パラホルムアルデヒド中で１日固定し、パラフィン包埋し、処理して薄切片化した。続いて、(Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ， Ｖ．， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， １２７：２２６９−２２８２)に記述されているように、パンマクロファージ抗Ｆ４／８０ラットモノクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いて薄切片を免疫染色し、次いでペルオキシダーゼをベースにした検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて比反応性を検出した。抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびペルオキシダーゼをベースにした検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、炎症の程度も検査した。
【０１２３】
腫瘍を有するマウスの静脈（I.v.）注射による感染。注射の前に細菌を対数期の中間部（赤痢菌）または定常期（サルモネラ）で収集して、１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳで希釈した。細胞を移植してから１４日後の４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの外側尾静脈に、または０．５年齢の腫瘍を有するメスのＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウスにこの懸濁液１００μｌを注射した。腫瘍および脾臓組織での細菌数を決定するために、マウスを屠殺して、臓器を切除し、重さを量り、７０μｍおよび４０μｍのセルストレーナーでホモジナイズした。各細胞画分の細胞数をカウントして、コロニー形成単位または感染した細胞の数を決定した。
【０１２４】
コロニー形成単位および感染した細胞数の決定。コロニー形成単位の数を決定するために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｒｏｔｈ）を含有する１×ＰＢＳ中の段階希釈物をＬＢアガープレート上に播種した。ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを用いる実験のために、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するｐＴｏｌＣKanＬＢアガープレートを使用した。このアガープレートを、上下逆さまにして３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、細菌コロニーを特徴づけていた。Ｌ−Ｔｏｐアガーアッセイ用に、１×ＰＢＳで段階希釈物を作製し、次いで５ｍｌのＳｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロース（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ， Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ）と約４０℃で混合させた。ＬＢアガープレート上に希釈物を慎重に滴下した。このアガープレートの底を下にして、３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーの数は、スポットをカウントすることによって決定した。すべてのコロニーは、感染した真核細胞を特徴づけていた。
【０１２５】
ＴＭＡの分離。磁気細胞分離のための染色法。磁気ビーズを用いる細胞標識化のための二段階方法を選択した。第１に、パンマクロファージ抗Ｆ４／８０（ＩｇＧ， Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ；ＩｇＧ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体で細胞を標識化した。第２に、この標識化細胞を抗ＩｇＧ抗体で染色し、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で標識化した。染色時間は計約３０分であった。細胞の抗体標識化は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ中、４℃で、１０〜１５分行った。１×ＰＢＳで１回洗浄した後、抗体を標識化した第２のミクロビーズとともに前述の細胞をインキュベートした。４℃で１０分間インキュベートした後、１回の洗浄段階で、まず非結合粒子を除去した。次いで、ミニカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を約０．６テスラ（ＭＡＣＳ永久磁石， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に設置して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含む５００μｌ１×ＰＢＳで平衡化し、次いで細胞を分離した。磁気ビーズで標識化した細胞を磁場に保持し、スチールウールファイバーに結合させる。このカラムを外部磁場から取り出すと、前述のスチールウールは容易に消磁し、磁気細胞は、もはや結合した状態ではなく、単細胞懸濁として溶出することができる。
【０１２６】
ＦＡＣＳ分析用の細胞の製造。腫瘍細胞上で発現する細胞表面抗原を、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ（２．４Ｇ２， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置した後、抗体を用いて染色することによって、およびＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるフローサイトメトリー分析によって分析した。以下のモノクローナル抗体を使用した。すなわち、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０．１５．１１．５， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、フィコエリトリン（ＰＥ）−抗マウスＧｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＰＥ−抗マウスＦ４／８０（ＢＭ４００８Ｒ， Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。
【０１２７】
有効性研究。腫瘍増殖の際の赤痢菌感染の治療効果を探索するために、６週齢〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス２８匹に１×１０4４Ｔ１細胞を皮下注射で投与した。腫瘍増殖は一日おきに定規で決定した。腫瘍量が約１７０ｍｍ3に達したとき（細胞移植から14日目）、３群のマウス（ｎ＝８）を無作為化によって決定した。フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔおよびＢＳ１７６Δを前述のように製造し、その懸濁液１００μｌを、４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの外側尾静脈に注射した。ナイーブ群では、１００μｌ１×ＰＢＳを投与した。腫瘍の増殖は一日おきに観察した。腫瘍細胞移植から３１日目、ナイーブ群およびＢＳ７６Δ−ａｒｏＡ群ならびに２匹のＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡマウスを屠殺して、腫瘍の大きさを比較した（データは図示せず）。感染から４８日目、３匹のＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡマウスを屠殺し、腫瘍、肝臓および脾臓組織におけるコロニー形成単位を決定した。さらに、ＦＡＣＳ分析を行い、前述のように腫瘍組織におけるマクロファージの量を決定した。感染から４９日目、１×１０6フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡを再び静脈注射で投与した。感染から６８日目、腫瘍、肝臓および脾臓組織におけるコロニー形成単位を再び決定した。さらに、前述のように、組織学的分析および免疫組織化学分析のために２つの腫瘍を製造した。
【０１２８】
ヒト腹水細胞のｅｘ ｖｉｖｏ感染。この腹水細胞は、腹水細胞は、２つの異なる細胞集団からなり、一方の細胞集団には接着細胞があり、他方の細胞集団には懸濁細胞がある。この２つの細胞集団を分離細胞型として処置した。腫瘍細胞を分離して、前述のようにＴＡＭを分離した。ある患者から細胞を分離した後、３つの異なる細胞画分に、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡおよびフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡをｅｘ ｖｉｖｏ感染させた。対数増殖期まで増殖した細菌を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、Ｄ−ＭＥＭ培地で３回洗浄した。１００：１の感染効率で１時間感染させた後、細胞を３００μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに１時間インキュベートした。次いで、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを使用した。コロニー形成単位を決定するために、感染後２時間の細胞を収集し、またはウエスタンブロット用に製造した。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析。６穴培養皿からの赤痢菌感染細胞または非感染細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８；グリセリン８６％；β−メルカプトエタノール；２０％ＳＤＳ、ｄＨ2Ｏ）中で溶解させた。遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間）によって不溶物を除去した。免疫ブロットのために、１０〜３０μｌのライセートを１０％または１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ １９７０， ２２７：６８０−６８５）によって分離させ、ニトロセルロース膜の上に移した。５％脱脂粉乳を補充した１×ＰＢＳ中で１時間ブロックした後、１×ＰＢＳ中５％脱脂粉乳（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈した適切な一次抗体（抗カスパーゼ−１（ＩＣＥ）、Ｓｉｇｍａ製；抗切断ＰＡＲＰ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ））を用いて前述の膜を探索し、その後ペルオキシダーゼを結合させた二次抗体とのインキュベーション、高感度化学発光（ＥＣＬ試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＫ）による検出を行い、次いでＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ， ＸＯ−ＭＡＴ−ＡＲ）に１〜１０分間露出させた。
【０１３０】
結果
マクロファージ浸潤は、乳腺腫瘍（Ｌｅｅｋ， Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６， ５６：４６２５−４６２９； Ｌｅｅｋ， Ｒ．Ｄ．， Ｌａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．Ｌ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９， ７９：９９１−９９５； Ｌｅｗｉｓ， Ｊ．Ｓ．， Ｌａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｊ．Ｃ， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．Ｌ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０００， １９２：１５０−１５８）および卵巣癌腫（Ｎｅｇｕｓ， Ｒ．Ｐ．， Ｓｔａｍｐ， Ｇ．Ｗ．， Ｈａｄｌｅｙ， Ｊ． ＆ Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｆ．Ｒ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９７， １５０：１７２３−１７３４）を含む数種類のヒト腫瘍で記述されている。異なる実験腫瘍モデルにおいて浸潤したＴＡＭのレベルを決定するために、異なる腫瘍モデルのパラフィン包埋組織におけるマクロファージ（図１）を染色した。試験したすべての腫瘍では、マクロファージのホットスポット（茶色の染色）を検出した。ＴＡＭはヒト乳癌腫では広範囲に及び（Ｋｅｌｌｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｒ．Ｓ．， Ｂｌｉｓｓ， Ｅ． ＆ ＭｃＧｅｅ， Ｊ．Ｏ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８８， ５７：１７４−１７７；Ｖｏｌｏｄｋｏ， Ｎ．， Ｒｅｉｎｅｒ， Ａ．， Ｒｕｄａｓ， Ｍ． ＆ Ｊａｋｅｓｚ， Ｒ． Ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ １９９８， ７：９９−１０５； Ｌｉｎ， Ｅ．Ｙ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ．Ｖ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｒ．Ｇ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１， １９３：７２７−７４０； Ｂｉｎｇｌｅ， Ｌ， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２， １９６：２５４−２６５）かつネガティブな予後を伴うために、４Ｔ１モデルおよびトランスジェニックＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２腫瘍モデルをさらなる研究のために使用した。
【０１３１】
初めに、細胞外区画および細胞内区画におけるサルモネラおよび赤痢菌の量的分布、ならびに腫瘍の異なる細胞型を調べることを模索した。したがって、移植（４Ｔ１）腫瘍および自発性（ＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２）腫瘍を用いて、１つのモデルを確立した。腫瘍を有するマウスに細菌を感染させ、感染後、異なる時点で腫瘍を摘出した。腫瘍細胞を分離し、腫瘍細胞懸濁液を得た。細胞外細菌および細胞内細菌を識別するために、ゲンタマイシンを使用してまたは使用せずにこの腫瘍細胞懸濁液を処置した。同時に、マクロファージおよびマクロファージが枯渇した画分で細胞を分離して、その細菌内容物を分析した（図１３参照）。全コロニー形成単位タイターを決定するために真核細胞を溶解した後に、または感染細胞数を決定するために細胞溶解せずにＴｏｐアガーに播種することによって、平板培養を行った。
【０１３２】
実験の第一の組では、確立した４Ｔ１（図２）腫瘍または自発性乳癌腫（図１７参照）を有するマウスに、１×１０6ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡを静脈内に投与した。図２に示すように、菌株ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡは、感染から４時間後および６時間後に主にＴＡＭをｉｎ ｖｉｖｏで標的にするが、とはいえこの菌株はｉｎ ｖｉｔｒｏで４Ｔ１細胞を容易に感染させる（データは図示せず）。感染から7日後、脾臓で検出されたのはわずかな細菌のみであった。これは先行研究（Ａｒｎｏｌｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ２００４， ７２：６５４６−６５５３）と一致している。４時間後、６時間後および７日後、マクロファージ枯渇腫瘍細胞と比較すると、マクロファージ画分ではかなり多くの細菌が見られた。感染から４時間後および６時間後、ほとんどの細菌は細胞内に存在した。これに対して、ゲンタマイシンで処置しなかった全腫瘍細胞と比較すると、ゲンタマイシン処置した腫瘍細胞から算出されたコロニー形成単位数によって決定されたように、感染から７日後、１０倍以上の細菌が細胞外で見られた。
【０１３３】
続いて、ＳｉｐＢ分泌によるカスパーゼ−１活性化を介して、マクロファージにおいてアポトーシスが誘発されるか追及した。さらに、アポトーシスの際に腫瘍組織においてマクロファージが減少するかにも関心を持った。したがって、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡによる感染（図３）後、カスパーゼ−１活性化およびアポトーシスの誘発に関して細胞集団を分析した。カスパーゼ−１活性化（図３ａ）およびＰＡＲＰ切断（図３ｂ）は、感染から６時間後のマウス由来の腫瘍の全細胞およびマアクロファージ画分において検出できたが、しかしマクロファージが枯渇した画分においては検出できなかった。マクロファージ枯渇画分ではカスパーゼ−１プロセシングまたはカスパーゼ−１発現のいずれも検出できなかった。感染から７日後、カスパーゼ−１の誘発はいずれの画分でも検出されなかった。感染から７日後、ＴＡＭの相対量をＦＡＣＳによって決定した（図３ｃ）。この時点で、非感染マウスと比較すると、サルモネラはマクロファージ数に影響を及ぼしてなかった。これは、アポトーシス誘発が一過性であるか、または最低限であり、非効率的であることをさらに示唆している。一過性のアポトーシス誘発は、サルモネラの感染生物学によって説明することができる。サルモネラは、病原性アイランドＳＰ１（ＳｉｐＢを含む）を感染の早期およびＳＰ１からＳＰ２に移る後期に発現する。ＳＰ２病原性アイランドは、カスパーゼ−１プロセシングを直接活性化することができるＳｉｐＢ等の毒性因子を含んでいない（Ｐａｎｔｈｅｌ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ２００５， ７３：３３４−３４１）。
【０１３４】
サルモネラと対照的に、赤痢菌は、感染期間のあらゆる時点でＩｐａＢを発現する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｇ．Ｎ．， Ｊａｎｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｈｉｌｂｉ， Ｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７， １５３：２８６２−２８７６； Ｃｏｓｓａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４， ３０４：２４２−２４８； Ｔａｍａｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ ２０００， １９：３８７６−３８８７）。したがって、フレクスナー赤痢菌もＴＡＭを標的にしかつマクロファージ数を減少させるのに適しているか追及した。本研究では、フレクスナー赤痢菌菌株Ｍ９０ＴおよびＢＳ１７６を使用した。後者はプラスミドレス非毒性変異体である。その毒性に影響されない、動物実験用の弱毒化菌株を得るために、ａｒｏＡ遺伝子座の染色体欠失を保有する、ある菌株を構築した。サルモネラ等の他の細菌では、芳香族アミノ酸の生成に重要なａｒｏＡ遺伝子の欠失は細菌において弱毒化をもたらす（Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｒ． ＆ Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ， Ｔ．Ｋ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９２， ６０：７９１−７９７）。増殖減弱化した毒性菌株と非毒性菌株との遺伝的に定義された比較（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ｆｏｒｍａｌ， Ｓ．Ｂ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８２， ３５：８５２−８６０）を可能にするために、無毒性フレクスナー赤痢菌菌株ＢＳ１７６内のａｒｏＡ遺伝子座を除去し、続いて電気穿孔法によって毒性プラスミドｐＷＲ１００を加えることを模索した。フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６菌株のａｒｏＡ遺伝子座をノックアウトするために、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）の方法を適用した。結果として生じた菌株、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡをＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡまたは以下ではＢＳ１７６Δと名付けた。続いて、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔから分離した毒性プラスミドｐＷＲ１００を、菌株ＢＳ１７６Δに形質転換し、菌株フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００をもたらした。この菌株は、毒性菌株フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔの主要な特徴を保有しているので、この菌株をＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡまたは以下ではＭ９０ＴΔと名付ける。
【０１３５】
フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡに等しいフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００菌株を、ＤＳＭ２１０５８としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に寄託した。
【０１３６】
このａｒｏＡ変異体を構築した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞外増殖および細胞内増殖、初期結合、浸潤および細胞間伝播に関して、この菌株を特徴付けた（図４）。プラスミドレス無毒性菌細胞のフレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６を、ＬＢ培地で０．３外径／時間の最大増殖速度によって特徴付け、これに対して毒性菌株のフレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔは０．２外径／時間と最大増殖速度が若干減少した（図４ａ）。これは、大型の毒性プラスミドｐＷＲ１００の存在によって説明できるであろう。予想どおり、ａｒｏＡ変異体を保有する菌株は、最大増殖速度が実質的に低下した。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔよりも最大増殖速度が２．５倍遅かった。ここでも、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡと比較すると、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡの最大増殖速度は若干速かった。
【０１３７】
続いて、初期結合、浸潤、細胞内複製および細胞間伝播に関してこのａｒｏＡ変異体の寄与を調べた。
【０１３８】
図４ｂに示すように、菌株Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、野生型フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔと比較して、その結合速度および浸潤において有意差を示さなかった。これと対照的に、ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡは、予想どおりその浸潤挙動が減弱された。
【０１３９】
野生型Ｍ９０Ｔは、２時間、ａｒｏＡ変異体よりも１２倍速い細胞内複製速度を示した（図４ｃ）。菌株フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、予想どおりその細胞内複製において強く減弱されていることをこれらのデータは示している。
【０１４０】
ａｒｏＡ変異体の細胞内複製におけるこの欠損のために、細胞間伝播は、従来のアッセイで評価するのは難しい。したがって、細胞内複製に対して感受性がより低い、新規の伝播アッセイを開発した（図４ｄ）。第１の段階では、ＨｅＬａ細胞を５００：１の高ＭＯＩ（感染効率）で１時間感染させた。続いて、感染した細胞に放射線照射して、ＨｅＬａ細胞の複製をブロックした。ゲンタマイシンの存在下で、非感染ＨｅＬａ細胞の単層上で、感染し放射線照射したＨｅＬａ細胞を１：７０の割合で、同時インキュベートした。感染細胞の数は、細胞溶解をしないようにＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースの上に播種することで、決定した。予想したように、８時間後、野生型Ｍ９０Ｔは、感染細胞の数が１２倍増加したことを示した。その後の時点で、非弱毒化した毒性菌株は、細胞に対して毒性があり、かつコロニー形成単位決定がもはや可能ではなかった。Ｍ９０ＴΔの場合、感染細胞数の増加は、同時感染から８時間後で６倍、１２時間後で１７倍であった。これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δの場合、感染細胞数は、８時間後わずか３倍しか増加せず、１２時間後までさらなる増加を示さなかった。これらの結果は、細胞間伝播に対してＭ９０ＴΔの能力が損なわれてないことを示唆している。細胞間伝播のための遺伝情報を保有してないＢＳ１７６Δで観察されたわずかな増加は、真核細胞を保護するためにわずかに１０μｇ／ｍｌの低めのゲンタマイシン濃度で１２時間、細胞外細菌をわずかに部分的に死滅させることで、高度に感染した放射線照射細胞を初期の時点で部分的に細胞溶解させたことに起因すると思われる。細胞感染の特徴をさらに調べるために、Ｇｉｅｍｓａ染色法によって感染細胞を組織学的に評価した（図４ｅ）。感染から１時間後（図１１参照）および４時間後（図４ｅ）のＨｅＬａ細胞のＧｉｅｍｓａ染色から、菌株Ｍ９０ＴおよびＭ９０ＴΔの細菌が細胞間接触部に主に位置していることが明らかになった。細胞間伝播も検出できた。これと対照的に、感染から４時間後でも菌株ＢＳ１７６Δの細胞内細菌は、検出できるものがほとんどなかった。さらに、無毒性菌株の場合、細胞間伝播の兆しが見られなかった。
【０１４１】
ａｒｏＡ変異体のカスパーゼ−１活性化を誘発する能力（図４ｆ）およびアポトーシス誘発（図４ｇ）を決定するために、Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージを感染させて、細胞ライセートを分析した。Ｍ９０ＴΔは、カスパーゼ−１誘発およびアポトーシスの両方を誘発できたが、ＢＳ１７６Δはできなかった。カスパーゼ−１特異的インヒビターＹＶＡＤ−ＣＨＯがカスパーゼ−１およびＰＡＲＰプロセシングを完全にブロックしたので、Ｍ９０ＴΔによるアポトーシス誘発はカスパーゼ１に依存することに留意されたい（図４ｆおよび４ｇ）。
【０１４２】
続いて、サルモネラに対して観察されるように赤痢菌がマクロファージについて同様の好ましいターゲティングを示すか分析した。サルモネラに対して以前行ったものと同様の設定で、確立された４Ｔ１腫瘍（図５および図１６）を用いてＢａｌｂ／ｃマウスに赤痢菌を静脈注射した。ここでも、いずれの時点においても、細胞あたり著しく多い細菌（図５ａ、ｂ）およびさらに多い感染細胞（図５ｂ、ｄ）がマクロファージ画分で見られた。さらに、Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡの大部分は、細胞内で見られ（図５ａ、ｂ）、これに対して無毒性菌株ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡによる感染から６時間後、５０倍多い細菌が細胞外で見られた（図５ａ）。
【０１４３】
また、カスパーゼ−１発現および活性化ならびにアポトーシスの誘発に関してマクロファージ画分を分析した（図６および図２０）。感染から４時間後、６時間後および７日後、カスパーゼ−１活性化（図６ａ）およびＰＡＲＰ切断（図６ｂ）をウエスタンブロット法によって分析した。Ｍ９０ＴΔの場合、カスパーゼ−１活性化およびＰＡＲＰ切断は、感染から４時間後および６時間後マウスから採取した腫瘍の全細胞およびマクロファージ画分で、ならびに感染から７日後のマクロファージで検出できたが、ＢＳ１７６Δの場合は検出できなかった。さらに、感染から７日後、相対量の腫瘍関連マクロファージをＦＡＣＳによって決定した（図６ｃ）。腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスおよびＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２マウスにおいて、Ｍ９０ＴΔ感染はマクロファージ数の実質的な減少をもたらしたが、ＢＳ１７６Δ感染はもたらさなかった（補足データ）（Ｌｉｎ， Ｅ．Ｙ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ．Ｖ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｒ．Ｇ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１， １９３：７２７−７４０； Ｂｉｎｇｌｅ， Ｌ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ．Ｊ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２， １９６：２５４−２６５； Ｓｃｈｏｌｌ， Ｓ．Ｍ．， Ｃｒｏｃｋｅｒ， Ｐ．， Ｔａｎｇ， Ｒ．， Ｐｏｕｉｌｌａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ １９９３， ７：２０７−２１１； Ｋｉｒｍａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４， ６４：４１６２−４１７０； Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ， Ｖ．， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， １２７：２２６９−２２８２； Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ．＆ Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ， Ｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４， ９１：９３１２−９３１６； Ｖａｎ Ｎｇｕｙｅｎ， Ａ． ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００２， ２４７：１１−２５； Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｗ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００４， ４：７１−７８； Ｍｕｒｄｏｃｈ， Ｃ．， Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ， Ａ． ＆ Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．Ｅ． Ｂｌｏｏｄ ２００４， １０４：２２２４−２２３４； Ｆｉｌｄｅｒｍａｎ， Ａ．Ｅ．， Ｂｒｕｃｋｎｅｒ， Ａ．， Ｋａｃｉｎｓｋｉ， Ｂ．Ｍ．， Ｄｅｎｇ， Ｎ． ＆ Ｒｅｍｏｌｄ， Ｈ．Ｇ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２， ５２：３６６１−３６６６）。
【０１４４】
ナイーブマウス（図６ｅ、上段パネル）、ＢＳ１７６Δ（図６ｅ、中央パネル）およびＭ９０ＴΔ（図６ｅ、下段パネル）に感染したマウスの組織学的検査では、Ｍ９０ＴΔ由来の腫瘍においてマクロファージの実質的な減少およびマクロファージ凝集体の破壊（図６ｅ、抗Ｆ４８０の染色、左側パネル）を確認し、強い炎症（図６ｅ、抗ＣＤ４５染色、右側パネル）が示された。しかしナイーブマウスまたはＢＳ１７６Δに感染した感染７日後のマウスには前述の現象が見られなかった。
【０１４５】
Ｍ９０ＴΔによって誘発された、マクロファージ数におけるこの実質的な減少および著しい炎症が治療効果と関連しているか調べるために、腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに細菌を投与して、腫瘍増殖を評価した（図７ａ）。ＢＳ１７６Δによる感染は、わずかであるが有意な腫瘍増殖の減少をもたらした。これと対照的に、Ｍ９０ＴΔの単回静脈注射による感染は、腫瘍増殖において実質的かつ有意な減少をもたらした。腫瘍増殖は処置から１９日後に完全にブロックされたことに留意されたい。非増殖腫瘍は極めて低いマクロファージ（３〜４％）数を示し、感染から４８日後に細菌は検出できなかった（図７ｃ）。４９日目に１×１０6細菌を残りの３匹のマウスに静脈投与した。腫瘍の大きさにおいてさらなる減少は検出されなかった。６８日目にコロニー形成単位を決定し、次いで組織学的検査を行った。腫瘍、肝臓および脾臓において細菌は検出されなかった（データは図示せず）。
【０１４６】
フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡによる処置がヒトにおいても適用可能か調べるために、卵巣癌腫患者から新しく分離した腹水に由来する細胞にＭ９０ＴΔ−ａｒｏＡを感染させた（図８ａおよび図２０参照）。Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡは、ヒト腫瘍から分離したＴＡＭを効率的に感染させ、かつこれらの細胞においてカスパーゼ−１プロセシングおよびアポトーシスを誘発した（図８ｂ）。ここでも、分離したヒト腫瘍に由来するＴＡＭの感染は、マクロファージが枯渇した画分と比較して、少なくとも１００倍より効率的であった。
実施例２： グラム陰性菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ Ｋ１２］におけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子（ＮＣ＿００４８５１）の発現および分泌
２ａ）分泌プラスミドにおけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子（ＮＣ＿００４８５１）のクローニング
赤痢菌のようにサルモネラは、ＳｉｐＢタンパク質によって仲介されるカスパーゼ−１の活性化を介して、感染したマクロファージの炎症およびアポトーシスを誘発することができる。このタンパク質はＩＩＩ型分泌系（ＴＴＳＳ）を介して分泌される（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５， ２８０：１４０４２−１４０５０； Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， １１：６１９−６２７； Ｃｈｅｎ， Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６， ２１：１１０１−１１１５； Ｈｉｌｂｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ２７３：３２８９５−３２９００）。サルモネラは、ＳｉｐＢによってカスパーゼ−１を活性化し、かつ初期の時点でＴＡＭにおいてアポトーシスを誘発するが、後期の時点ではアポトーシスを誘発せず、相対量のＴＡＭを減少させられなかった。これと対照的に、代謝的に減弱された毒性赤痢菌菌株は、４Ｔ１および自発性乳がんのモデルにおいてすべての時点でＩｐａＢによってＴＡＭでカスパーゼ−１を活性化し、アポトーシスを誘発することができるが、無毒性赤痢菌ではできなかった。
【０１４７】
サルモネラによる一過性のアポトーシス誘発は、感染の初期時点およびＳＰＩ１からＳＰ１２に移る後期時点で、病原性アイランドＳＰＩ１（ＳｉｐＢを含む）の発現によって説明されうる。ＳＰ１２病原性アイランドには、カスパーゼ−１プロセシングを直接活性化できるＳｉｐＢ等の毒性因子が含まれてない（Ｐａｎｔｈｅｌ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ２００５， ７３：３３４−３４１）。サルモネラと対照的に、赤痢菌は、感染の間のあらゆる時点でＩｐａＢを発現する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｇ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７， １５３：２８６２−２８７６； Ｃｏｓｓａｒｔ， Ｐ． ＆ Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｐ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４， ３０４：２４２−２４８； Ｔａｍａｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ ２０００， １９：３８７６−３８８７）。
【０１４８】
グラム陰性菌株において機能性ｉｐａＢを機能的に発現、分泌させる可能性を評価するために、ｉｐａＢ遺伝子をｐＭｏＨｌｙ発現ベクターにクローン化させて、ｉｐａＢタンパク質の発現および分泌をもたらした。この分泌は、大腸菌のＩ型溶血素分泌系（Ｔ１ＳＳ）をコードしたプラスミドによって仲介される。分泌プラスミドについてはすでに述べており、種々のグラム陰性菌の目的で有用である。概念実証として、大腸菌菌株へのクローン化を行った。
【０１４９】
以下に、ｉｐａＢの分泌のためのＩ型分泌系を包含する大腸菌Ｋ１２菌株の構成を記述する。原理的には、いかなる弱毒化通性細胞内グラム陰性菌株でも、この目的のために使用することができる。
【０１５０】
ｉｐａＢ遺伝子を、Ｉ型送達プラスミドｐＭＯｈｌｙｋａｎ内でクローン化した。単一のＮｓｉｌ制限酵素部位を、異種タンパク質を決定するインフレーム挿入配列のためのｈｌｙＡ遺伝子の２つの残留配列間に位置づけた（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００８）。Ｎｓｉｌ制限酵素部位を含有する配列の挿入のために、新しいポリリンカーをｐＭＯｈｌｙｋａｎ内に確立した。以下の制限酵素部位を、拡張多重クローニング部位（ｍｃｓ）であるＸｈｏｌ、Ｐｖｕｌ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎｌのために使用した。
【０１５１】
Ｎｓｉｌ部位（５’−ＴＧＣＡ−３’）に相補的なオーバーハングとともに制限酵素部位の配列を含有するオリゴヌクレオチド（ＣＧＧＴＡＣＣＧＣＴＡＧＣＣＧＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡおよびＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＣＡ）をアニーリングして挿入した制限酵素部位を有する配列部分を作製した。この結果として得た二本鎖ＤＮＡ部分をアニーリングした後、Ｎｓｉｌを消化したｐＭＯｈｌｙｋａｎ内にポリリンカーを挿入して、新しいプラスミドｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓをもたらした。その後、抗生物質耐性クローンをスクリーニングした。ｍｃｓの正確な挿入を、制限酵素での消化および配列決定によって確認した。
【０１５２】
ｉｐａＢのコード配列は、１，１３８（ｂｐ）位にＮｓｉｌ制限酵素部位を含む。したがって、新しく構築したｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓを用いて、ｉｐａＢの読み取り枠を挿入した。ｉｐａＢ遺伝子を、プライマーＳａｌｍ： ｍｃｓ ｉｐａＢ Ｘｈｏｌ ｈｉｎ（ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＣＡＣ）およびＳａｌｍ： ｍｃｓ ｉｐａＢ Ｋｐｎｌ ｒｕeｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣ）によるＰＣＲによって増幅させた。順方向プライマーをデザインして、Ｘｈｏｌ制限酵素部位を作製し、次いで逆方向プライマーをデザインしてＫｐｎｌ部位を作製した。ＰＣＲ産物およびｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓをＸｈｏｌおよびＫｐｎｌによって消化させ、その後、ライゲーションによってｉｐａＢをｐＭＯｈｌｙｋａｎ ｍｃｓ内に挿入した。抗生物質耐性クローンのスクリーニングをＰＣＲによって行い、次いで挿入を配列決定によって確認した。配列決定したクローンのｐＭＯｈｌｉｐａと呼ばれるプラスミドを、Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ法によって分離して、さらなる研究のために使用した（図２２）。
【０１５３】
このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α内に形質転換して、機能性を評価した。図２３には、組換え型大腸菌菌株による融合タンパク質の成功した発現および分泌を示す。大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａおよび大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａによるＩｐａＢ発現は、７０ｋＤａの産物を示した。これは、クローン化ＩｐａＢが、ｐＭＯｈｌｙｋａｎモデルにおいてＣ末端のＨｌｙＡ分泌シグナルと融合したためである。Ｍ９０Ｔライセート中で、大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａの沈渣中でおよび上清中でＩｐａＢを検出した。この菌株には、大腸菌Ｉ型分泌機構の機能に必要とされるｔｏｌＣ遺伝子が欠けているので、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａの上清中では、ＩｐａＢが検出できなかった。
【０１５４】
異なる大腸菌ＤＨ５α菌株によってカスパーゼ−１が活性化されるか調べるため、ＲＡＷ２６４．７マクロファージに感染させ、次いで感染後さまざまな時点でウエスタンブロット分析を行った（図２４）。
【０１５５】
大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａ菌株がＲＡＷ２６４．７マクロファージ内でカスパーゼ−１を活性化したことをウエスタンブロットが示した（図２４）。さらに、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａは、感染から６時間後、カスパーゼ−１活性化が極めて減弱したことを示した。ウエスタンブロット分析は２回行った。この結果をその都度決定したが、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａを介するカスパーゼ−１活性化のために、この分析は技術的問題になることもあり得た。大腸菌ｐＭＯｈｌｉｐａは、感染から３時間後にカスパーゼ−１を活性化したが、Ｍ９０Ｔ対照と比較すると、このカスパーゼ−１活性化は極めて減少したものであった。感染していないＲＡＷ２６４．７マクロファージを負の対照として用いた。大腸菌ΔＴｏｌＣによって感染したＲＡＷ２６４．７マクロファージは、カスパーゼ−１活性化を示さず、カスパーゼ−１の酵素前駆体を示した。
【０１５６】
次の段階では、この系の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ＴＡＭは非浸潤性細菌の取り込みが欠損しているので（ＢＳ１７６の結果を参照されたい。大腸菌の結果のデータは図示せず）、静脈投与後、脾臓のマクロファージにおいてアポトーシスを誘発する大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａの能力を評価した。図２５に示すように、大腸菌ΔＴｏｌＣ ｐＭＯｈｌｉｐａは、脾臓のマクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングの誘発に成功し、この系がｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることを示した。
【０１５７】
ＴＡＭに影響を及ぼすために、赤痢菌、サルモネラおよび侵潤性大腸菌菌株を含むがこれらに限定されない侵潤性のグラム陰性細菌に、この系を移植する必要がある。侵潤性のｉｐａＢ発現赤痢菌がＴＡＭにおいてアポトーシスを誘発できることを立証するとともに、静脈投与後マクロファージにおいてカスパーゼ−１プロセシングを誘発するこの系の機能性は、この系に従ってマクロファージを枯渇することを標的とする組換え型細菌をもたらすことになる。
【０１５８】
２ｂ）グラム陽性細菌（リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＥＧＤｅ）におけるフレクスナー赤痢菌のｉｐａＢ遺伝子のクローニング
リステリアによるカスパーゼ−１活性化に関するデータは、矛盾しており、かつマクロファージ内でのカスパーゼ−１およびアポトーシスの誘発は、赤痢菌と比較すると少なくとも効率が低い（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８， １０：４１−５２； Ｆｒａｎｃｈｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７， ２８２：１８８１０−１８８１８）。しかし、リステリアは細胞内細菌であり、腫瘍内でマクロファージを標的とし、したがって（Ｓｉｎｇｈ， Ｒ． ＆ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｙ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２００６． ５：５４１−５５２）マクロファージを標的とする細菌性腫瘍の治療に適していると思われる。持続したアポトーシス誘発を達成するために、ｉｐａＢの恒常的発現および分泌を有する弱毒化リステリア菌株を構築することにする。
【０１５９】
リステリア菌ＥＧＤｅΔ−ａｒｏＡ内でＩｐａＢを発現させるために、ａｃｔＡ遺伝子（ＰａｃｔＡ）由来のリステリアプロモーターを用いた。リステリア菌ＥＧＤｅΔ−ａｒｏＡ内でＩｐａＢを分泌させるために、リステリオリシンの分泌シグナル（ＳＳｈｌｙ）を、前述のプロモーターの３’末端に融合した。以下のプライマーを用いて、リステリア菌ＥＧＤから分離したゲノムＤＮＡからＰＣＲによってＰａｃｔＡを増幅した。すなわち順方向プライマーとして：ＰａｃｔＡ Ｐｓｔｌ Ｎｃｏｌ ｈｉｎ（ＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡ）および逆方向プライマーとして：ＰａｃｔＡオーバーハングｒｕｅｃｋ（ＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣ）。この逆方向プライマーは、分泌シグナルＳＳｈｌｙからの配列に相補的なオーバーハングを用いてデザインした。およびこの分泌シグナルを以下のプライマーによって増幅した。すなわち、ＳＳ ｈｌｙオーバーハングｈｉｎ（ＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧ）およびＳＳ ｈｌｙ ＢａｍＨｌ ｒｕｅｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧ）。その後、組換え型ＰＣＲを、ＰａｃｔＡ ＳＳｈｌｙの増幅ＰＣＲ産物を用いてかつ以下のプライマーによって行った。すなわち、ＰａｃｔＡ Ｐｓｔｌ Ｎｃｏｌ ｈｉｎ（順方向）およびＳＳ ｈｌｙ ＢａｍＨｌ ｒｕｅｃｋ（逆方向）。その後、組換え型ＰＣＲの産物ＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙおよびプラスミドｐＵＣ１８を、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢａｍＨｌによって消化させた。隣接するＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙをライゲーションによってｐＵＣ１８内に挿入して、次いで制限酵素での消化および配列決定によって適切に挿入されたかを確認した。ＳＳｈｌｙが逆方向プライマーであるために、ＢａｍＨｌ制限酵素部位を組み込んだ。したがって、プライマーを用いてＰＣＲによってｉｐａＢを増幅し、それぞれの制限酵素部位、開始点のＢａｍＨｌおよび末端のＳａｃｌ、を作製した。すなわち、ｉｐａＢ ＢａｍＨｌ ｈｉｎ（ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＣＡＣ）およびｉｐａＢ Ｓａｃｌ ｒｕｅｃｋ（ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣ）。次いで、ｉｐａＢ遺伝子を、ｐＵＣ１８内のシグナル配列の後にシームレスにクローニングして、それを配列決定した。
【０１６０】
続いて、コンストラクトＰａｃｔＡ＋ＳＳｈｌｙ＋ｉｐａＢを、制限酵素ＰｓｔｌおよびＳａｃｌによってｐＵＣ１８から切り取り、ＰｓｔｌおよびＳａｃｌが消化したグラム陽性発現ベクターｐＳＰ０内にライゲーションによって挿入し、新たなプラスミドｐＳＰＲ１７を得た（図２６）。
【０１６１】
このコンストラクトを弱毒化したリステリア菌株内に形質転換させて、ＴＡＭの標的枯渇のために使用することができる。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項２】
前記細菌が、マクロファージを感染させる能力がある請求項１に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項３】
前記細菌が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌からなる群から選択される請求項１から２のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項４】
前記細菌が、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種からなる群から選択される請求項１から３のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項５】
前記細菌が、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる群から選択される請求項４に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項６】
前記弱毒化が、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失もしくは不活性化によって起こる請求項１から５のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項７】
前記弱毒化が、栄養要求性細菌を結果として生じる請求項１から６のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項８】
前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージおよび／またはＭ２マクロファージであり、好ましくはＭ２マクロファージである請求項１から７のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項９】
前記アポトーシスの誘発が、カスパーゼ活性化、好ましくはカスパーゼ−１活性化によって達成される請求項１から８のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１０】
前記細菌が、組換え型である請求項１から９のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１１】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つの染色体に組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する請求項１０に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１２】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体に組み込まれた調節ＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する請求項１０から１１のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１３】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体欠失または少なくとも１つの調節ＤＮＡの不活性化を保有する請求項１０から１１のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１４】
前記細菌が、少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを保有する請求項１０に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドが、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする請求項１４に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドが、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡをコードする請求項１４から１５のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１７】
前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌が、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００からなる群から選択される請求項１から１６のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌、好ましくは少なくとも１つの凍結乾燥した非病原性細菌および／または弱毒化細菌と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
薬物であって、請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物を含む薬物。
【請求項２０】
マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、 胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱癌、膀胱癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択される生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物を含む薬物。
【請求項２１】
それによって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にもしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇する請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項２０に記載の薬物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物の使用であって、前記薬物が、少なくとも１つのさらなる薬理学的活性物質とともに前記処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される薬物の使用。
【請求項２３】
前記さらなる薬理学的活性物質が、ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよび／またはＩＩインヒビター、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、微小管脱安定化剤、ホルモンおよび／または増殖因子受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、シグナル伝達のインヒビター、増殖因子に対する抗体およびその受容体、キナーゼインヒビター、代謝拮抗剤からなる群から選択される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
さらなる薬理学的活性物質が、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アバスチン、アザチオプリン、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、エピルビシン、エルビタックス、エリスロヒドキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルダラビンホスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリーベック／グリベック、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン、イレッサ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、オキサリプラチン、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ラパマイシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルセバ、タキソテール、テニポシド、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トリメチルメラミン、ウリジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスフェート、５−アザシチジンクラドリビン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリンからなる群から選択される請求項２２から２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記薬物が、放射線治療および／または手術による処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される、請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防ための請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物の使用。
【請求項２６】
請求項１から１７のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌の製造のための方法であって、以下
（ａ）ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を、非病原性細菌および／または非弱毒化細菌内で欠失もしくは不活性化するステップおよび／または
（ｂ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込むステップおよび／または
（ｃ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入するステップおよび／または
（ｄ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込むステップおよび／または
（ｅ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡを染色体欠失もしくは不活性化するステップおよび／または
（ｆ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入するステップを含む方法。
【請求項２７】
請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物または請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物ならびに静脈注射用の薬理学的に許容される緩衝液を含む医薬キット。
【請求項２８】
疾患を患う哺乳類、好ましくはヒトを処置する方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物または請求項１９から２０のいずれかに記載の薬物を前記哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含み、それによって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的もしくは完全に枯渇され、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇される処置方法。
【請求項２９】
前記疾患が、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱癌、膀胱癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルス感染症もしくは細菌感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
マクロファージにおいてアポトーシスを誘発する能力がある非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項２】
前記細菌が、マクロファージを感染させる能力がある請求項１に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項３】
前記細菌が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌からなる群から選択される請求項１から２のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項４】
前記細菌が、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種からなる群から選択される請求項１から３のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項５】
前記細菌が、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる群から選択される請求項４に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項６】
前記弱毒化が、ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失もしくは不活性化によって起こる請求項１から５のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項７】
前記弱毒化が、栄養要求性細菌を結果として生じる請求項１から６のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項８】
前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージおよび／またはＭ２マクロファージであり、好ましくはＭ２マクロファージである請求項１から７のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項９】
前記アポトーシスの誘発が、カスパーゼ活性化、好ましくはカスパーゼ−１活性化によって達成される請求項１から８のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１０】
前記細菌が、組換え型である請求項１から９のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１１】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする、少なくとも１つの染色体に組み込まれたＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する請求項１０に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１２】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体に組み込まれた調節ＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを保有する請求項１０から１１のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１３】
前記細菌が、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす、少なくとも１つの染色体欠失または少なくとも１つの調節ＤＮＡの不活性化を保有する請求項１０から１１のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１４】
前記細菌が、少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを保有する請求項１０に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドが、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする請求項１４に記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドが、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡをコードする請求項１４から１５のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１７】
前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌が、フレクスナー赤痢菌Ｍ９０ＴΔ−ａｒｏＡ、ネズミチフス菌Δ−ａｒｏＡ、フレクスナー赤痢菌ＢＳ１７６Δ−ａｒｏＡ ｐＷＲ１００からなる群から選択される請求項１から１６のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌、好ましくは少なくとも１つの凍結乾燥した非病原性細菌および／または弱毒化細菌と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
薬物であって、請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物を含む薬物。
【請求項２０】
マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、 胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱癌、膀胱癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルスもしくは細菌感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択される生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物を含む薬物。
【請求項２１】
それによって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的にもしくは完全に枯渇し、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇する請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項２０に記載の薬物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防のための請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物の使用であって、前記薬物が、少なくとも１つのさらなる薬理学的活性物質とともに前記処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される薬物の使用。
【請求項２３】
前記さらなる薬理学的活性物質が、ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよび／またはＩＩインヒビター、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、微小管脱安定化剤、ホルモンおよび／または増殖因子受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、シグナル伝達のインヒビター、増殖因子に対する抗体およびその受容体、キナーゼインヒビター、代謝拮抗剤からなる群から選択される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
さらなる薬理学的活性物質が、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アバスチン、アザチオプリン、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、エピルビシン、エルビタックス、エリスロヒドキシノニルアデニン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルダラビンホスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリーベック／グリベック、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン、イレッサ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、オキサリプラチン、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ラパマイシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルセバ、タキソテール、テニポシド、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トリメチルメラミン、ウリジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスフェート、５−アザシチジンクラドリビン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリンからなる群から選択される請求項２２から２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記薬物が、放射線治療および／または手術による処置の前および／または処置の間および／または処置の後に投与される、請求項２０に記載の生理学的状態および／または病態生理学的状態の処置および／または予防ための請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物の使用。
【請求項２６】
請求項１から１７のいずれかに記載の非病原性細菌および／または弱毒化細菌の製造のための方法であって、以下
（ａ）ａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を、非病原性細菌および／または非弱毒化細菌内で欠失もしくは不活性化するステップおよび／または
（ｂ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込むステップおよび／または
（ｃ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入するステップおよび／または
（ｄ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは組換え型ＤＮＡを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌のゲノムに組み込むステップおよび／または
（ｅ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現をもたらす少なくとも１つの調節ＤＮＡを染色体欠失もしくは不活性化するステップおよび／または
（ｆ）ＩｐａＢ、ＳｉｐＢの群から選択される少なくとも１つのタンパク質の恒常的発現を可能にする少なくとも１つの調節ＤＮＡを含む少なくとも１つのプラスミド、好ましくは組換え型プラスミドを前記非病原性細菌および／または弱毒化細菌に導入するステップを含む方法。
【請求項２７】
請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物または請求項１９から２１のいずれかに記載の薬物ならびに静脈注射用の薬理学的に許容される緩衝液を含む医薬キット。
【請求項２８】
疾患を患う哺乳類、好ましくはヒトを処置する方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの非病原性細菌および／または弱毒化細菌または請求項１８に記載の医薬組成物または請求項１９から２０のいずれかに記載の薬物を前記哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含み、それによって
（ａ）アポトーシスが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において誘発され、次いで腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が部分的もしくは完全に枯渇され、および／または
（ｂ）アポトーシスが疾患関連マクロファージにおいて誘発され、次いで疾患関連マクロファージが部分的もしくは完全に枯渇される処置方法。
【請求項２９】
前記疾患が、マクロファージが疾患発症もしくは病状悪化に付随するマクロファージ炎症を含む疾患、腫瘍疾患、制御不能細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓がん、腎細胞細胞腫、前立腺癌、前立腺癌腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、胸腺腫、精巣がん、肺癌、気管支癌、乳がん、乳癌腫、腸癌、直腸結腸腫瘍、結腸癌腫、直腸癌腫、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣性腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、子宮頚癌腫、子宮体癌、子宮体癌腫、子宮内膜癌腫、尿路膀胱癌、膀胱癌、皮膚がん、基底細胞腫、棘細胞がん、黒色腫、眼球内黒色腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルス感染症もしくは細菌感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、自己免疫疾患、糖尿病および／または２型糖尿病からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１１−５１０６４６（Ｐ２０１１−５１０６４６Ａ）
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４６９６（Ｐ２０１０−５４４６９６）
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０９９５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５４３６
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０３３００５０２）エテルナ ツェンタリス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (25)
【氏名又は名称原語表記】ＡＥｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｉｓｍｕｅｌｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｄ−６０３１４ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０９９５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５４３６
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０３３００５０２）エテルナ ツェンタリス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (25)
【氏名又は名称原語表記】ＡＥｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｉｓｍｕｅｌｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ ５０，Ｄ−６０３１４ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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