新規治療用および診断用生成物および方法
本発明はｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の診断、処置および開発のための薬物標的および手段としてのｐ１１の使用に関する。本発明はさらにｐ１１ノックアウト動物およびｐ１１トランスジェニック動物、および新規精神治療薬の開発のためのモデルとしてのその使用、ならびにｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の診断、予防および処置の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年６月１３日出願の米国仮特許第６０／８１３１７０号および２００７年１月５日出願の第６０／８７８７３０号の利益を主張し、その内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（技術分野）
本発明はｐ１１と５−ＨＴ１Ｂおよび５−ＨＴ４受容体との間の生物学的関連性を紹介し、これらの受容体が関連する疾患のための薬物標的およびｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者の同定のための診断手段としてのｐ１１の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現在利用可能な抗うつ剤および抗不安薬はノルエピネフリン、ドーパミンおよびとりわけセロトニン（５−ヒドロキシ−トリプタミンまたは５−ＨＴ）のようなモノアミン神経伝達物質の生合成、分解および作動経路を標的とする。１９４０年代後期に最初に発見されたセロトニンは気分、睡眠、食欲および性的行為を含む身体における多くの機能を調整するのに重大な役割を果たす。それは中枢神経系内で神経伝達物質として、およびまた末梢シグナルモジュレーターとしての双方で機能する。結果的にセロトニン利用性および活性における改変はうつ病、摂食障害（例えば過食症）、強迫性障害（ＯＣＤ）、薬物依存、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、月経前症候群、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害、胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）、躁病、偏頭痛および双極性障害に関係している。従来の抗うつ剤は、典型的には（１）モノアミンオキシゲナーゼを阻止することによりセロトニンの分解を防御する；または（２）シナプス前ニューロンによるセロトニン再取り込みを阻止することによりセロトニンのニューロン輸送を増加させる；のいずれかによりシグナル伝達を調節する。しかしながら半世紀にわたるセロトニン経路の集中的な研究にもかかわらず、これらの経路の理解は不完全であり、そしてセロトニン経路機能障害に関する確立された生化学基盤の診断またはバイオマーカーはない。
【０００４】
５−ＨＴ（セロトニン）受容体は異種性であり、そして種々の細胞の表面において見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体は１４個のセロトニン受容体サブタイプのうちの一つであり、そして中枢神経系全体にわたって豊富に見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体の構造、分布および見かけの機能はげっ歯類およびヒトにおいて非常に類似する。この受容体は気分、認知、攻撃性、耽溺、睡眠および摂食を含む多様な生理学的機能および行動に関係している。５−ＨＴ１Ｂ受容体はセロトニンおよび非セロトニン含有ニューロンの双方において見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体は大部分がニューロンのシナプス前部分において見出され、ここでそれはニューロンによるセロトニン放出の調節に関与する終末自己受容体として機能する。セロトニンに結合することにより刺激される場合、それらはニューロンによるさらなるセロトニンの放出を阻止し；刺激されない場合、セロトニン放出は強化される。故にこれらの５−ＨＴ１Ｂ受容体の遮断はセロトニンレベルを増強する傾向がある。５−ＨＴ１Ｂ受容体がアセチルコリン、グルタミン酸、ドーパミン、ノルエピネフリンおよびガンマアミノ酪酸のようなその他の神経伝達物質、ならびにセロトニンの放出の制御に関与するヘテロ受容体であるといういくつかの証拠がある。シナプス後で見出される５−ＨＴ１Ｂ受容体もある。５−ＨＴ４受容体は胃腸管系（ここでそれは胃腸管運動性に関与する）および中枢神経系において見出される。５−ＨＴ１Ｂは一般的にｃＡＭＰの低下に関連するが、５−ＨＴ４受容体はｃＡＭＰ活性上昇に関連する。脳における５−ＨＴ４受容体は神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンおよびＧＡＢＡ）放出を調整し、そしてシナプス伝達を強化する。それらはまた非アミロイド形成的可溶性アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰアルファ）の放出を促進することにより記憶強化において役割を果たし得る。アルツハイマー病はベータ−アミロイドプラーク形成の沈着により媒介されると広く考えられているので、５−ＨＴ４受容体機能を強化し、それによりｓＡＰＰアルファの放出を強化することは、アルツハイマー病の処置または予防に対する可能性のある研究法に相当する。
【０００５】
タンパク質ｐ１１はＳ１００ＥＦハンドタンパク質ファミリーのメンパーである。ｐ１１はまたアネキシンＩＩ軽鎖、リポコルチンＩＩ軽鎖、カルパクチンＩ軽鎖、４２ＣまたはＳ−１００関連タンパク質としても公知であり、そして本明細書ではこれらの用語を互換的に使用できる。R. Donato, Biochim. Biophys. Acta, １４５０：１９１（１９９９）。それは種々の細胞内に別々に、またはヘテロ四量体として存在する。ヘテロ四量体はアネキシンＩＩまたはカルパクチンＩ重鎖としても公知のｐ３６の２個のコピー、およびｐ１１の２個のコピーからなる。細胞内ではヘテロ四量体は偽膜性細胞骨格における細胞膜の細胞質表面に局在し、そして複合体はエクソサイトーシス、エンドサイトーシスおよび細胞間接着のような膜トラフィッキング事象において役割を果たし得ることが示唆される。ｐ１１は腫瘍細胞浸潤、腫瘍成長および転移において役割を有すると主張されている。米国特許出願公開第２００４／０１４２８９７（Ａ１）。ｐ１１が５−ＨＴ受容体または精神障害に関与しているとは以前に報告されたことはない。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
出願人は、本発明により、驚くべき事にｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体と特異的に相互作用し、そして多くの精神治療薬の中心的な標的である脳メッセンジャー化学セロトニンのシグナリングの調節を支援すると考えられることを発見した。Svenningsson et al., Science３３１：７７−８０（２００６）；Svenningsson et al., Current Opinion in Pharmacology ６：１−６（２００６）（双方を出典明示により本明細書の一部とする）。ｐ１１は、５−ＨＴ１Ｂ受容体の、より機能的な場所であるニューロン細胞膜への補充において重大な役割を果たすと考えられる。出願人はさらにｐ１１が５−ＨＴ４受容体とも相互作用することを発見した。出願人は、欠陥のあるセロトニン受容体を伴うと考えられるうつ病、不安障害および類似の精神病の発達においてｐ１１レベルが直接関与し得ることを示している。うつ病対象の脳におけるｐ１１レベル（うつ病のヒトおよびマウスモデル）の、非うつ病対象のレベル（非うつ病のヒトおよび対照マウス）に対する比較により、非うつ病対象と比較して、うつ病対象ではｐ１１のレベルが相当低いことが示される。さらにｐ１１レベルは、三環系抗うつ剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）および電撃療法を含む種々の型の抗うつ剤で処置された対象においてより高い傾向がある。抗うつ剤で処置された動物においてｐ１１は過剰発現される。例えば選択的セロトニン取り込み阻害剤、フルオキセチンを投与されたサルは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてｐ１１発現の顕著な（２倍を超える）増加を示すことが観察されており、そして類似の効果がフルオキセチンを投与されたマウスの脳において実証される。同様に、ｐ１１ノックアウト遺伝子を有する動物モデルは、ニューロン細胞膜で呈される５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少なく、セロトニンシグナリングは低下しており、そしてうつ病様の表現型を呈する。興味深いことに、しばしばストレスに応答して放出されるグルココルチコイドホルモンの過剰レベルに応答してｐ１１発現が低下し、それは出願人の研究を踏まえて、うつ病と高度なストレス源との間で観察された連関に関して可能な生化学的説明を提供する。出願人によるこれらの驚くべき発見に基づいてｐ１１が、従来の５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体に、またはセロトニン機能（またはその欠如）に関連した障害のための処置の開発のための適当な診断標的および薬物標的ならびにスクリーニング手段であることが示される。
【０００７】
「ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害」なる用語は本明細書にて使用される際にはｐ１１タンパク質による５−ＨＴ受容体、例えば５−ＨＴ１Ｂまたは５−ＨＴ４受容体の動員（または動員の欠如）により媒介される、関連する、引き起こされる、影響を受ける、引き金となる、またはそれを伴う任意の障害を含む。ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害には、限定するものではないが精神障害（例えばうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、薬物依存および強迫性障害、ならびにアルツハイマー病）、睡眠障害（例えば不眠症）、摂食障害（例えば過食症）、性機能障害および胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）；特にうつ病が含まれ得る。
【０００８】
故に本発明はとりわけ：
１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法；
２. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法；
３. ｐ１１を過剰または過少発現するトランスジェニック動物；および
４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置する方法；
を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
一つの実施態様では、本発明は；
（１）対象の生物学的試料、例えば血液または組織試料、例えば単球および／または白血球、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のｐ１１タンパク質のレベルを検定すること；ならびに（２）該ｐ１１レベルを参照標準、例えば任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照集団におけるｐ１１レベルと比較することであって、ここで参照標準と比較して、対象におけるｐ１１の異常レベルはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する；
を含む、対象においてｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法に関する（方法１）。
【００１０】
故に本発明は以下の方法１の実施態様を含む。
１.１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで参照標準と比較して対象において低下したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する方法１の方法。
１.２. 障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そしてうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される方法１または１.１に記載の方法。
１.３. 障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そしてうつ病である前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.４. 該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで参照標準のレベルと比較して対象において上昇したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する方法１に記載の方法。
【００１１】
１.５. 障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そして躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択される方法１または１.４のいずれかに記載の方法。
１.６. 該ｐ１１のレベルが該対象からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｐ１１タンパク質レベルを検定することにより決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.７. ＰＢＭＣが単球、ＮＫ細胞およびＣＤ−８＋Ｔ細胞から選択される１.６に記載の方法。
１.８. 該ｐ１１のレベルが該対象からの生物学的試料中のｐ１１ ｍＲＮＡレベルを検定することにより決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.９. ｐ１１のレベルがｐ１１に特異的なモノクローナル抗体を用いて決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.１０. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
【００１２】
１.１１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.１２. 例えば前記の方法１−１.１１のいずれかにしたがって、ｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体、および使用のための説明書を含むｐ１１レベルを測定するのに有用なキット。
１.１３. 方法１−１.１１のいずれかにおけるｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体の使用。
１.１４. 請求項１−１.１１のいずれかに記載の方法または１.１２に記載のキットにおいて使用するための試薬の製造におけるｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体の使用。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は５−ＨＴ受容体に関連するｐ１１発現またはｐ１１活性を調節（上方または下方のいずれか）する候補モジュレーターの能力を検定することを含む、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法に関する（方法２）。
【００１４】
それ故に方法２は以下を含む：
２.１. 均等量のｐ１１遺伝子生成物（例えばタンパク質またはｍＲＮＡ）を含有する第１試料および第２試料、例えば細胞培養物または細胞もしくは組織試料を提供すること；第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；ならびに第１試料中のｐ１１遺伝子生成物の量が変化しているかどうかを決定すること；の工程を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法であって、ここで遺伝子生成物の量の増加は、候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方量の低下は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示す。
【００１５】
２.２. 細胞表面での均等数の５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を含有する第１試料および第２試料を提供すること；第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；ならびに第１試料の細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数が第２試料と相対して変化しているかどうかを決定すること；の工程を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法であって、ここで細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数の増加は、候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数の低下は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示す。
【００１６】
２.３. 候補ｐ１１モジュレーターを、ｐ１１プロモーターに作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含む細胞と接触させること、およびｐ１１発現の代理としてレポーター遺伝子発現を使用することを含む１１モジュレーターを同定するための方法。
２.４. 候補モジュレーターが５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連するｐ１１発現を上方調節するか、またはｐ１１活性を上昇させて、ニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含む、低レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法。
【００１７】
２.５. 異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される方法２−２.４のいずれかに記載の方法。
２.６. 障害がうつ病である前記の方法２−２.５のいずれかに記載の方法。
２.７. ｐ１１のモジュレーターを陽性対照として使用する前記の方法２−２.６のいずれかに記載の方法。
２.８. ｐ１１のモジュレーターが三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、トリプタンおよびモノアミンオキシダーゼ阻害剤から選択される方法２.６に記載の方法。
【００１８】
２.９. ｐ１１のモジュレーターがアミトリプチリン（商品名：Elavil）、デシプラミン（商品名：Norpramin）、イミプラミン（商品名：Tofranil）およびノルトリプチリン（商品名：Aventyl、Pamelor）から選択される三環系抗うつ剤である方法２.８に記載の方法。
２.１０. ｐ１１のモジュレーターがイミプラミンである方法２.８に記載の方法。
２.１１. ｐ１１のモジュレーターが例えばイソカルボキサジド（商品名：Marplan）；フェネルジン（商品名：Nardil）およびトラニルシプロミン（商品名：Parnate）から選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）である方法２.８に記載の方法。
２.１２. ＭＡＯＩがトラニルシプロミンである２.１１に記載の方法。
２.１３. ｐ１１のモジュレーターが例えばシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft）から選択される選択的セロトニン再取り込み阻害剤である方法２.８に記載の方法。
【００１９】
２.１４. 候補モジュレーターがｐ１１発現を下方調節するか、５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連するｐ１１活性を阻止もしくは低下させて、ｐ１１がニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力を低下させるかまたは阻止する能力に関して検定することを含む、高レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法。
２.１５. 高レベルのｐ１１に関連する障害には、限定するものではないが躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害が含まれる２.１４に記載の方法。
２.１６. 該モジュレーターがｐ１１に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびモノクローナル抗体から選択される高レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための２.１５に記載の方法。
【００２０】
２.１７. ｐ１１に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびモノクローナル抗体から選択されるｐ１１サプレッサー化合物を対照またはコンパレーターとして使用する方法２−２.１６のいずれかに記載の方法。
２.１８. 候補ｐ１１擬似物質が５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連または相互作用してニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含む、異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法２−２.１７のいずれかに記載の方法。
【００２１】
２.１９. 候補ｐ１１擬似物質がニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含むうつ病を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法２.１８に記載の方法。
２.２０. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
２.２１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
２.２２. ｐ１１プロモーターに作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含む細胞。
２.２３. 方法２−２.２１のいずれかに記載の方法における２.２２に記載の細胞の使用。
【００２２】
さらに別の実施態様では、本発明はｐ１１を過剰または過少発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物またはその子孫および新しい医薬品を発見するための方法におけるその使用を志向する（方法３）。故に本発明には以下が含まれる：
３.１. ｐ１１遺伝子に欠陥、変異または欠損を有するＤＮＡ配列を保有し、そしてそれ故にｐ１１タンパク質を過少発現し、ならびに／またはニューロン細胞膜で保有する５−ＨＴ１Ｂおよび／もしくは５−ＨＴ４受容体がより少なく、そしてそれ故に同一種の野生型のヒト以外の哺乳動物と比較してうつ病様の表現型を呈するヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
３.２. ヒト以外の該哺乳動物がｐ１１タンパク質を過剰発現し、ならびに／またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂおよび／もしくは５−ＨＴ４受容体のレベル上昇を呈し、そしてそれ故に同一種の野生型のヒト以外の哺乳動物と比較して活動亢進の表現型を呈するヒト以外のｐ１１トランスジェニック哺乳動物。
【００２３】
３.３. マウスである３.１または３.２に記載のヒト以外の哺乳動物。
３.４. 調節プロモーター、例えばドキシサイクリン調節カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターに作動可能なように連結されたｐ１１をコードするコード化領域を含む導入遺伝子を有する３.２または３.３に記載のヒト以外の哺乳動物。
３.５. （１）新規精神治療薬を（ａ）３.１または３.３に記載のｐ１１ノックアウト哺乳動物および（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない同一種の対照哺乳動物に投与すること；ならびに（２）該（ａ）ノックアウト哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物の行動および／または５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体のレベルを評価し、そして比較すること；を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するためか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかもしくは寛解させるのに有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
【００２４】
３.６. （ａ）ｐ１１ノックアウト哺乳動物および（ｂ）うつ病を有していないかまたは有している疑いのない対照哺乳動物に抗うつ剤を投与すること；ならびに（２）該（ａ）ノックアウト哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物の行動および／または５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体レベルを評価し、そして比較すること；を含むうつ病を研究するための、例えば３.４に記載の方法。
３.７. （１）新規抗精神病薬を（ａ）ｐ１１を過剰発現するマウスおよび（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照マウスに投与すること；ならびに（２）該（ａ）トランスジェニックマウスおよび（ｂ）対照マウスのｐ１１のレベルを評価し、そして比較すること；を含む新規抗精神病薬を開発するのに有用なマウスモデル。
【００２５】
３.８. （１）新規精神治療薬を（ａ）３.２または３.３に記載の哺乳動物および（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない同一種の対照哺乳動物に投与すること；ならびに（２）該（ａ）３.２または３.３に記載の哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物のｐ１１レベルを評価し、そして比較すること；を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するためか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかもしくは寛解させるのに有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
３.９. （１）新規抗精神病薬を（ａ）例えば３.２に記載のｐ１１を過剰発現するマウスおよび（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照マウスに投与すること；ならびに（２）該（ａ）トランスジェニックマウスおよび（ｂ）対照マウスの行動および／またはｐ１１もしくは５−ＨＴ受容体レベルを評価し、そして比較すること；を含む新規抗精神病薬を開発するのに有用なｐ１１マウスモデル。
【００２６】
３.１０. 測定されるかまたは過剰もしくは過少発現される５−ＨＴ受容体が５−ＨＴ１Ｂ受容体である前記の方法またはモデルのいずれかに記載の方法またはモデル。
３.１１. 測定されるかまたは過剰もしくは過少発現される５−ＨＴ受容体が５−ＨＴ４受容体である前記の方法またはモデルのいずれかに記載の方法またはモデル。
【００２７】
本発明はさらに治療上有効量のｐ１１モジュレーターを投与することを含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者を処置するための方法に関する（方法４）。
４.１. 患者が最初に方法１−１.１のいずれかにしたがって同定される場合の方法４。
４.２. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される、異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である４または４.１に記載の方法。
４.３. 障害がうつ病である４.２に記載の方法。
【００２８】
４.４. 方法３にしたがって、例えば実施態様３.１−３.１１のいずれかを用いて同定されるｐ１１モジュレーターを投与することを含む前記の方法４−４.３のいずれかに記載の方法。
４.５. ｐ１１のモジュレーターが三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤から選択される前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.６. ｐ１１のモジュレーターがアミトリプチリン（商品名：Elavil）、デシプラミン（商品名：Norpramin）、イミプラミン（商品名：Tofranil）およびノルトリプチリン（商品名：Aventyl、Pamelor）から選択される三環系抗うつ剤である４.４に記載の方法。
４.７. ｐ１１のモジュレーターがイミプラミンである４.５に記載の方法。
【００２９】
４.８. ｐ１１のモジュレーターがイソカルボキサジド（商品名：Marplan）；フェネルジン（商品名：Nardil）およびトラニルシプロミン（商品名：Parnate）から選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）である４.４に記載の方法。
４.９. ＭＡＯＩがトラニルシプロミンである４.８に記載の方法。
４.１０. ｐ１１のモジュレーターがシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft）から選択される選択的セロトニン再取り込み阻害剤である方法４.４に記載の方法。
【００３０】
４.１１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う対象に有効量のｐ１１モジュレーターまたは擬似物質を投与し、ｐ１１発現および／またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体を調節（上方または下方）することを含む該対象を処置するかまたは寛解させる前記の方法４−４.１０のいずれかに記載の方法。
４.１２. 異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を患う対象に有効量のｐ１１モジュレーターまたは擬似物質を投与して、ｐ１１発現を上方調節するかまたはニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体を補充することを含む該対象を処置するかまたは寛解させる４.１１に記載の方法。
４.１３. 障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される４.１２に記載の方法。
【００３１】
４.１４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.１５. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.１６. 例えば方法４−４.１５のいずれかにおける、ｐ１１／５−ＨＴ受容体媒介障害を処置するための医薬品の製造における、例えば本明細書に記載されるようなｐ１１モジュレーターの使用。
４.１７. 例えば方法４−４.１５のいずれかにおいてｐ１１／５−ＨＴ受容体媒介障害の処置に使用するためのｐ１１モジュレーターを含む医薬組成物。
【００３２】
別の実施態様では本発明は、ｐ１１を発現する核酸を投与すること、または該患者の脳においてｐ１１の発現を誘起することを含み、ここで該核酸は該患者の脳においてｐ１１を上方調節するか、またはｐ１１発現を増加させる、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者においてｐ１１発現を強化するかまたはｐ１１を上方調節する方法に関する（方法５）。ｐ１１をコードするかまたはその発現を誘起する核酸は好ましくはその核酸を含むベクターにより、または細胞により患者の脳に分配される。かかるベクターは適当な分配系のＤＮＡまたはＲＮＡの形態、例えばリポソームに封入されたＤＮＡ構築物、またはウイルスベクターの形態、例えば複製欠損アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクターでよい。好ましい実施態様では、ベクターは導入遺伝子の感染細胞への組み込みよりもむしろ望ましい導入遺伝子の一過性の発現を提供するウイルスベクター、例えばアデノウイルス由来のベクターである。ベクターは例えばｐ１１をコードするＤＮＡの発現を制御して、標的細胞におけるｐ１１の発現を可能にするプロモーター、例えば構成的プロモーター（例えばＣＭＶプロモーターのような）、組織特異的プロモーター（例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターのような）または誘導プロモーター（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリン誘導プロモーター）に作動可能なように連結されたｐ１１をコードするＤＮＡを含む。例えばウイルスベクターは組織特異的プロモーターの制御下でｐ１１ＤＮＡ構築物を含み、そして複製に必須の一つまたはそれより多い遺伝子（例えばＥ１および／またはＥ３遺伝子）の機能的コピーを欠如して、ヘルパー細胞系または複製に必須の一つまたは複数の遺伝子の生成物が供給されるその他の環境においてのみウイルスが複製できる、組換えにより修飾されたアデノウイルスでよい。ウイルスベクターはまた免疫原性を低減させ、および／またはベクターを望ましい細胞に標的化するための表面修飾を含むこともできる。ＣＮＳにおける遺伝子治療に適当なウイルスベクターは当分野において公知であり、例えばBenitez, et al., 「中枢神経系における標的化遺伝子治療」Current Gene Therapy ３：１２７−１４５（２００３）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるような、例えばＣＮＳ細胞に標的化されたベクターおよび導入遺伝子の発現のための組織特異的または誘導プロモーターを利用するベクターを含む。非ウイルス性核酸分配系は、核酸が細胞膜を通って侵入するのを促すために薬剤に随伴されるかまたは複合化された核酸を含むことができる。かかる非ウイルスベクター複合体の実例には、ＤＮＡの濃縮を促すポリカチオン性薬剤を伴う処方および脂質基盤の分配系、例えばリポソーム基盤の分配系が挙げられる。別の実施態様では、ｐ１１を発現するかまたはその発現を誘起する該核酸は細胞、例えば患者の細胞により発現されるレベルよりも高いレベルでｐ１１を発現する、患者の脳に移植されたニューロン幹細胞により分配される。細胞の供給源は患者またヒトドナーでよい。（ｉ）ｐ１１構築物、（ｉｉ）ｐ１１発現を増強する、天然のｐ１１配列の上流のプロモーター、または（ｉｉｉ）ｐ１１発現を増強するタンパク質をコードする構築物を用いて、ｐ１１発現に関して選択することにより、および／または形質転換、例えばエキソビボ形質転換することにより、移植された細胞におけるｐ１１発現を達成できる。好ましくは、構築物が細胞のゲノム組み込まれるように、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞を安定して形質転換する。細胞が癌性になるか、またはウイルスが患者に感染するか、またはそれ以外に患者に害を及ぼす危険性がある場合、宿主細胞のガンシクロビルに対する感受性を高くして、細胞またはウイルスを容易に破壊できるように、細胞またはウイルスベクターはさらに「安全性遺伝子（safety gene）」、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）を含むことができる。好ましい実施態様では、ｐ１１発現を増強する核酸（例えばｐ１１を発現する構築物を含む細胞またはウイルスベクター）を、例えば海馬領域への脳内投与を介して標的細胞に導入する。核酸を単回用量または多回処置で投与することができる。
【００３３】
それ故に、本発明はさらに以下のような方法を提供する：
５.１. 該方法がｐ１１発現を増加させる方法５。
５.２. 核酸構築物が脳細胞においてｐ１１を発現することができる方法５または５.１。
５.３. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が、例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である方法５、５.１−５.２。
５.４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が不安障害またはうつ病である方法５、５.１−５.２。
５.５. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である方法５、５.１−５.２。
【００３４】
５.６. ｐ１１をコードする該核酸がｐ１１をコードするＤＮＡを含む複製欠損アデノウイルスベクターにより分配される方法５、５.１または５.５。
５.７. ｐ１１をコードするＤＮＡが組織特異的プロモーター、例えばＮＳＥプロモーターの制御下にある方法５.６。
５.８. ｐ１１をコードする該核酸がｐ１１構築物で形質転換された幹細胞により分配される方法５、５.１または５.５。
５.９. ｐ１１の該核酸が脳内投与により導入される方法５、または５.１−５.８のいずれか。
５.１０. ｐ１１の該核酸が海馬に導入される方法５、または５.１−５.８のいずれか。
【００３５】
本明細書で使用される際には、および添付の請求の範囲では、単数表現「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特記しない場合、複数の言及を含む。故に例えば「抗体」に対する言及は、一つまたはそれより多い抗体および当業者に公知のその均等物等に対する言及である。ｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体媒介障害の処置には複数のかかる障害の処置が含まれ得る。
本明細書では「ｐ１１」なる用語は、限定するものではないが、ヒトまたは任意のその他の種からの前記のいずれかのｐ１１配列またはフラグメントを含有する部分形態、アイソフォーム、前駆体形態、全長ポリペプチド、融合タンパク質を含むｐ１１ポリペプチドの任意のおよび全ての形態を指す。
【００３６】
本明細書では「ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害」なる語句は、ｐ１１タンパク質およびその５−ＨＴ受容体、特に５−ＨＴ１Ｂまたは５−ＨＴ４受容体の動員により媒介される、関連する、引き起こされる、影響を受ける、引き金となる、またはそれを伴う任意の障害を指す。ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害には、限定するものではないが精神障害（例えばうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、薬物依存および強迫性障害）、睡眠障害（例えば不眠症）、摂食障害（例えば過食症）、性機能障害および胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）が含まれ得る。本明細書では「異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害」とはうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害もしくは注意欠陥多動性障害、またはアルツハイマー病、特にうつ病のような障害を指す。同様に「異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害」とは、躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害のような障害を指す。
【００３７】
「ｐ１１モジュレーター」なる語句は、ｐ１１タンパク質をコードする遺伝子の発現、ｐ１１遺伝子もしくはｃＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、ｐ１１ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳、ｐ１１タンパク質の翻訳後修飾、ｐ１１タンパク質の細胞もしくは細胞外局在化、または類似の細胞におけるｐ１１活性と相対して、細胞膜内もしくは膜上または細胞内に局在するｐ１１の量を変化させる（増加させるかまたは減少させるかのいずれか）ことができる任意の物質または化合物（例えば本明細書に記載されるような小型分子またはポリペプチド）または処置の方法（例えば電撃療法）を指す。「ｐ１１モジュレーター」なる用語はまた、ｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力に影響を及ぼす（正または負のいずれかに）ことができる任意の物質を指す。うつ病のような異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するのに有用なｐ１１モジュレーターの実例には、三環系抗うつ剤（例えばイミプラミン（Tofranil（登録商標））、アミトリプチリン（ELAVIL（登録商標）、ENDEP（登録商標）、TRYPTANOL（登録商標））、クロミプラミン（ANAFRANIL（登録商標））、デシプラミン（NORPRAMIN（登録商標）、PERTOFRANE（登録商標））、ロフェプラミン（GAMANIL（登録商標）、LOMONT（登録商標））、ノルトリプチリン（PAMELOR（登録商標））、トリミプラミン（SURMONTIL（登録商標）））が挙げられる。低レベルのｐ１１に関連する障害（例えばうつ病）を処置するかまたは寛解させるのに有用なその他のモジュレーターにはモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）（例えばトラニルシプロミン（Parnate）、イソカルボキサジド（Marplan）、モクロベミド（Aurorix、Manerix、MOCLODURA（登録商標））またはフェネルジン（Nardil））および選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えばシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft））が含まれる。
【００３８】
従来のスクリーニングアッセイ（インビトロおよびインビボの双方）を使用してｐ１１活性および／またはｐ１１遺伝子発現を阻止または誘起するモジュレーターを同定することができる。一つのかかるアッセイは、ｐ１１結合部位の下流にマーカー遺伝子（例えばルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を含むレポーター構築物でトランスフェクトされた細胞を候補モジュレーター化合物と接触させ、そしてマーカータンパク質の発現における変化を測定し、そしていずれのモジュレーターとも接触していないトランスフェクトされた細胞試料と比較する遺伝子レポーターアッセイである。マーカータンパク質発現を阻止または誘起のいずれかを行う候補モジュレーターは、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な薬物として同定される。マーカータンパク質発現を阻止する候補モジュレーターは、異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害の処置のための有用な薬物候補であり、一方マーカータンパク質発現を誘起する候補モジュレーターは異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害の処置のための有用な薬物候補であろう。
【００３９】
ｐ１１モジュレーターには、例えば遊離の、もしくは薬学的に許容される塩形態の天然もしくは非天然化学化合物、センスもしくはアンチセンスｐ１１オリゴヌクレオチド、ｐ１１に対する阻止抗体、ｐ１１受容体遮断ペプチド、ｐ１１アンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが含まれ得る。本明細書で使用される際には「アンチセンス」なる用語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を指す。それ故に「ｐ１１アンチセンスポリヌクレオチド」とはｐ１１ ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的である任意のヌクレオチド配列を指す。機能的には、ｐ１１アンチセンスポリヌクレオチドは細胞におけるｐ１１タンパク質の発現を低下させることができる。「アンチセンス鎖」なる用語は「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関連して用いられる。相補鎖の合成を許容するウイルスプロモーターに対して逆配向で目的の（複数の）遺伝子をライゲートすることによる合成を含む任意の方法によりアンチセンス分子を生成することができる。一度細胞に導入されると、この転写された鎖は細胞により生成された天然の配列と組み合わされて二重鎖を形成する。次いでこれらの二重鎖はさらなる転写または翻訳のいずれかを遮断する。「負」なる指定は時にアンチセンス鎖に関して用いられ、そして「正」は時にセンス鎖に関して用いられる。同様に、「センス」なる用語は本明細書で使用される際には、翻訳されて特異的ポリペプチドまたはそのフラグメントを生成することができるヌクレオチド配列を指す。それ故に「ｐ１１センスポリヌクレオチド」は翻訳されてｐ１１ポリペプチドまたはそのフラグメントを生成することができる任意のヌクレオチド配列を指す。機能的には、ｐ１１センスポリヌクレオチドは細胞におけるｐ１１タンパク質の発現を増加させることができる。
【００４０】
具体的には、核酸レベルでｐ１１の発現を阻止する物質には、ｐ１１核酸の適切なヌクレオチド配列を指向するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが含まれ得る。当業者による従来の技術を用いて、過度な負担または実験を伴わずにこれらの阻止分子を創成することができる。例えば本明細書で論じたポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域に対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡ、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンを設計することにより、遺伝子発現の修飾（例えば阻止）を得ることができる。例えば転写開始部位から、例えば出発部位から−１０位置と＋１０位置の間で誘導されるオリゴヌクレオチドを使用できる。それにもかかわらず、ｍＲＮＡに強力にハイブリダイズするものを創成するために遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計し、そして当業者によく知られた標準的なアッセイ手順によりかかる適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、そして同定することができる。
【００４１】
同様に、遺伝子発現の発現阻止を「三重らせん」基盤の塩基対形成法を用いて達成することができる。Gee, J.E. et al.（１９９４）In：Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。転写物のリボソームへの結合を防御することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するようにこれらの分子を設計することもできる。リボザイム、酵素性ＲＮＡ分子を使用してＲＮＡの特異的切断を触媒することにより遺伝子発現を阻止することもできる。リボザイム作用のメカニズムはリボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。用いることができる実例には、遺伝子配列、例えばｐ１１に関する遺伝子のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的および有効に触媒するように設計することができる、操作された「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子が挙げられる。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初に、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位に関する標的分子を読み取ることにより同定される。一度同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する１５個と２０個の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを作動不能にし得る二次構造的様相に関して評価することができる。Grassi and Marini, Annals of Medicine ２８：４９９−５１０（１９９６）；Gibson, Cancer and Metastasis Reviews １５：２８７−２９９（１９９６）；Cotten et al., EMBO J. ８：３８６１−３８６６（１９８９）。ＲＮＡ存在度または活性を修飾するためにＲＮＡアプタマーを細胞に導入するかまたは発現させることもできる。ＲＮＡアプタマーは特異的にその翻訳を阻止できるＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ（Good et al., Gene Therapy ４：４５−５４（１９９７））のようなタンパク質に特異的なＲＮＡリガンドである。遺伝子発現の遺伝子特異的阻止を従来の二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成することもできる。かかる技術の記載を第ＷＯ９９／３２６１９号（その全てを出典明示により本明細書の一部とする）に見出すことができる。
【００４２】
核酸分子の合成に関する当分野において公知の任意の方法により、本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムを調製することができる。これには固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。これに代えて、本明細書で論じたポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によりＲＮＡ分子を作成することができる。かかるＤＮＡ配列をＴ７またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて広範な種類のベクターに組み込むことができる。これに代えて、構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するｃＤＮＡ構築物を細胞系、細胞または組織に導入することができる。
【００４３】
二つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を一緒にアニーリングすることにより（その一つは標的ｍＲＮＡの一部と対合する）（Fire et al., 米国特許第６５０６５５９号）、または必要な二本鎖部分を生成するためにそれ自体に折り重ねられた単一のヘアピンＲＮＡ分子の使用により（Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：６０４７−５２（２００２））本発明のｓｉＲＮＡ分子を作成することができる。ｓｉＲＮＡ分子を化学的に合成するか（Elbashir et al., Nature ４１１：４９４−９８（２００１））または一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用してインビトロ転写により生成することができる（Yu et al., supra）。これに代えて、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する（複数の）発現ベクターを使用して、ｓｉＲＮＡ分子を一過性で（Yu et al., supra；Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：５５１５−２０（２００２））、または安定して（Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：１４４３−４８（２００２））生成することができる。最近では、効率的な、および配列特異的な様式でのヒト一次細胞における標的ｍＲＮＡのレベルの低下が、ヘアピンＲＮＡ（これはさらにｓｉＲＮＡにプロセシングされる）を発現するアデノウイルスベクターを使用して実証される（Arts et al., Genome Res. １３：２３２５−３２（２００３））。
【００４４】
本明細書で使用される際には「ｐ１１活性」なる語句はｐ１１の任意の直接的な生化学的活性または、ｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体との相互作用に（陽性にまたは陰性に）影響を及ぼすようにｐ１１に関連する間接的な活性を指す。５−ＨＴ１Ｂ受容体とのｐ１１活性を増加させるモジュレーターはｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力を増大させるようにｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体への会合を増加させる任意の物質でよい。逆に５−ＨＴ１Ｂ受容体とのｐ１１活性を阻止するかまたは低下させるモジュレーターは、ｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力を低下させるようにｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体との間の相互作用を遮断するかまたは低下させる任意の物質でよい。
【００４５】
「ｐ１１擬似物質」なる用語は構造、機能、特性および／または活性においてｐ１１タンパク質を擬似し、それによりニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体利用性を調整、調節または増大させる天然もしくは非天然物質またはポリペプチドまたはその任意のフラグメントを指す。ｐ１１擬似物質は全体的または部分的にｐ１１を擬似し得る。
【００４６】
「対象」なる用語は任意のヒトまたはヒト以外の生物を指す。
「対照対象」とはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の障害、症候群、疾患、症状および／または病徴を有していない、および／または有している疑いのない任意のヒトまたはヒト以外の生物を指す。
「生物学的試料」なる用語には、例えばｐ１１タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡもしくはポリヌクレオチドまたは前記のいずれかの任意のフラグメントを含有する生物、体液、老廃物、細胞もしくはその細胞の一部、細胞系、生検、組織培養またはその他の供給源から得られる生物学的材料を含む任意の試料が含まれ得る。
【００４７】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の「陽性診断」とはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、試験されている対象が異常なレベルのｐ１１を呈する症状を指す。異常なレベルとは対照対象におけるレベルよりも高いまたは低いレベルを指す。例えばうつ病の陽性診断の対象は、うつ病および／またはその病徴を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、低下したレベルのｐ１１を呈する。一方不安障害状態の陽性診断の対象は、不安障害および／またはその病徴を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、上昇したｐ１１発現を呈する。
【００４８】
ｐ１１を過剰発現する型の対象から得られた組織または細胞の試料中のｐ１１タンパク質を検定することによりｐ１１のレベルを決定することができる。例えば単球および／またはリンパ球を使用することができる。同様に試料中のｐ１１ ｍＲＮＡに関して検定することによりｐ１１レベルを決定することもできる。例えば従来のノーザン分析または市販により入手可能であるマイクロアレイを含む当業者によく知られた方法を用いてｐ１１遺伝子発現（例えばｍＲＮＡレベル）を決定することができる。加えて、被験化合物のｐ１１阻止の効果および／または関連する調節タンパク質レベルをＥＬＩＳＡ抗体基盤アッセイまたは蛍光標識反応アッセイで検出することができる。参照、例えば対照対象または対照集団（または対照集団における事前の測定に基づいた参照標準）と比較して、対象における異常なレベルのｐ１１タンパク質またはｍＲＮＡはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する。それ故に、参照と比較して対象において上昇したｐ１１のレベルは高レベルのｐ１１に関連する障害、例えば躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性障害、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害（例えばＩＢＤ）の陽性診断を構成する。一方、対照対象のレベルと比較して抑制されたまたは低下したｐ１１のレベルは低レベルのｐ１１に関連する障害、例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害の陽性診断を構成する。好ましい実施態様では、本発明はうつ病を患う対象におけるｐ１１レベルを検定すること、およびかかるレベルを対照対象におけるｐ１１レベルと比較することを含むうつ病を患う対象における診断方法を包含し、ここで対照対象のレベルと比較して、該対象において抑制されたｐ１１のレベルはうつ病の陽性診断を構成する。
【００４９】
本明細書で使用される際には、「抗体」なる用語は、エピトープ決定基に結合できるインタクトな分子およびＦａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのようなそのフラグメントを指す。免疫抗原として目的の小型ペプチドを含有するインタクトなポリペプチドまたはフラグメントを用いてｐ１１ポリペプチドに結合する抗体を調製することができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドまたはペプチドをＲＮＡの翻訳から誘導するか、または化学的に合成することができ、そして所望によりキャリアタンパク質に抱合させることができる。ペプチドに化学的に結合させる一般的に使用されるキャリアには、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンが含まれる。次いで結合したペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラットまたはウサギ）を免役する。
【００５０】
患者のための治療の最適化に関する検討材料のための因子には、処置されている特定の症状、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、活性化合物の分配の部位、活性化合物の特定の型、投与の方法、投与のスケジュール、および医師に公知のその他の因子が含まれる。投与される活性化合物の治療上有効量はかかる検討材料により支配され、そしてｐ１１媒介障害、好ましくはうつ病の処置に必要な最低量である。
【００５１】
ｐ１１に対する適当な抗体または関連する調節タンパク質を商業的供給源から入手できるか、または従来の方法にしたがって生成することができる。例えば一つまたはそれより多い差次的に発現される遺伝子エピトープを特異的に認識できる抗体の生成のための方法が本明細書にて記載される。かかる抗体には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。
【００５２】
本明細書で論じたｐ１１ポリペプチドに対する抗体の生成のために、そのポリペプチドまたはその一部を種々の宿主動物に注射することにより免役することができる。かかる宿主動物には、限定するものではないがウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主種に依存して、限定するものではないが、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアミン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムのような有用な可能性のあるヒトアジュバントを含む種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができる。
【００５３】
ポリクローナル抗体は標的遺伝子生成物、またはその抗原性機能的誘導体のような抗原で免役された動物の血清から誘導された抗体分子の異種性集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、前記されたもののような宿主動物を、これもまた前記されたようなアジュバントを追加されたポリペプチドまたはその一部での注射により免役することができる。
【００５４】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体を、培養中の連続細胞系による抗体分子の生成を提供する任意の技術により得ることができ、かかる技術は当分野において周知である。かかる抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免役グロブリンクラス、好ましくはＩｇＧでよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマまたは形質転換された細胞系をインビトロまたはインビボで培養することができる。これに代えて、一本鎖抗体の生成のための記載された技術を、差次的に発現される遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドを生じさせることより一本鎖抗体を形成することができる。
【００５５】
標準的なＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析およびインビトロまたはインビボで用いられる標準的な撮像技術を用いて本明細書に記載される抗体の検出を達成することができる。抗体を検出可能な物質に結合（すなわち物理的連結）させることにより検出を促すことができる。検出可能な物質の実例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。適当な酵素の実例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適当な補欠分子族複合体の実例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適当な蛍光材料にはウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の実例にはルミノールが挙げられ；生物発光材料の実例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、ならびに適当な放射性材料の実例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００５６】
例えば典型的な前進アッセイ（forward assay）では、未標識抗体を固体基質に固定し、そして試験される試料を結合分子と接触させる。適当な期間のインキュベーションの後、抗体−抗原二成分複合体の形成を可能にするのに十分な期間、検出可能なシグナルを誘起することができるレポーター分子で標識された第二の抗体を加え、そして抗体−抗原−標識抗体の三成分複合体を形成できるように十分な時間を見込んでインキュベートする。次いで任意の未反応材料を洗い流し、そしてシグナルの観察により抗原の存在を決定するか、または公知の量の抗原を含有する対照試料と比較することにより定量することができる。前進アッセイの変法には、試料および抗体の双方を同時に結合抗体に加える同時アッセイ、または標識抗体および試験される試料を最初に組み合わせ、インキュベートし、そして未標識表面結合抗体に加える逆行アッセイ（reverse assay）が含まれる。これらの技術は当業者に周知であり、そして軽微な変更の可能性は容易に明らかになろう。本明細書で使用される際には「サンドイッチアッセイ」は基本的な２部位技術における全ての変法を包含すると意図される。本発明のイムノアッセイに関しては、唯一の限定因子は、標識抗体がｐ１１ポリペプチドもしくは関連する調節タンパク質またはそのフラグメントに特異的である抗体であるという点である。
【００５７】
最も一般的に用いられるレポーター分子は酵素、フルオロフォアまたは放射性核種含有分子のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により酵素を第二の抗体に抱合させる。しかしながら容易に認識されるように、広範な種類の様々なライゲーション技術が存在し、それは当業者に周知である。一般的に用いられる酵素には、とりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に用いられる基質は一般的に対応する酵素の加水分解時の検出可能な色の変化の生成に関して選択される。例えばｐ−ニトロフェニルリン酸がアルカリホスファターゼ抱合体との使用に適当であり；ペルオキシダーゼ抱合体に関しては１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。前記された色素生成基質よりもむしろ蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を用いることも可能である。次いで適切な基質を含有する溶液を三次複合体に加える。基質は第二抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生じ、それを通常分光光度法によりさらに定量して血清試料中に存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価を得ることができる。
【００５８】
これに代えて、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光化合物をその結合能力を改変することなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光の照明により活性化されると、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子において励起状態を誘起し、続いて特徴的なより長い波長で光を発光する。発光は光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において非常によく確立されており、そして本方法に関して特に好ましい。しかしながら放射性同位元素、化学発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。要求される用途に適合させるために手順を変える方法は当業者には容易に明らかになろう。
【００５９】
抗体が治療用途を意図される場合、それらはその免疫原性を最小にするようにヒト定常領域を有するのが好ましい。適切な抗原特異性のドナー抗体分子からの可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体分子の定常領域をコードするＤＮＡと一緒にスプライシングすることによりキメラ抗体を作成する。抗体をさらに修飾して、ヒト以外の残基を除去するように加えて修飾されたヒト化抗体を提供することができる。ヒト化抗体は大部分でヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基を、望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基と置換する。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基をヒト以外の対応する残基により置換する場合もある。ヒト化抗体はレシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれでも見出されない残基を含み得る。これらの修飾を行って抗体の性能をさらに精緻にし、そして最適化する。一般的にヒト化抗体は少なくとも一つの、そして典型的には二つの可変ドメインを含み、ここでヒト以外の免疫グロブリンのものに対応する全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域、および全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた典型的にはヒト免疫グロブリンである免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むのが最適であろう。これに代えて、ヒト以外の供給源に由来するが、完全なヒト免疫グロブリン遺伝子を用いる抗体を、例えばファージディスプレイ技術またはトランスジェニック動物、例えばヒトＩｇＶおよびＩｇＣ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて作成でき、そしてかかる抗体が呈する免疫原性は最小限であるはずである。
【００６０】
「治療上有効量」とは、本明細書で使用される際にはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分な薬物の量を指す。例えばｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーターの治療上有効量は、ｐ１１発現を誘起もしくは阻止のいずれか、またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体レベルを調節（上方または下方のいずれか）するのに十分な量である。それ故にうつ病の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーターの治療上有効量は、ｐ１１発現を誘起するか、またはニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂ受容体を補充するｐ１１の能力を増大させるかのいずれかに十分な量である。逆に不安障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーター治療上有効量は、ｐ１１発現を阻止するかまたはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体を下方調節するかのいずれかに十分な量であろう。静脈内、皮下、筋肉内、経皮または脳内投与を含む当分野において公知の方法を介してｐ１１モジュレーターを投与することができる。投与は注射によるように急速に、または緩徐な注入によるような時間をかけて、または徐放処方の投与でよい。
【００６１】
「ｐ１１ノックアウト」なる語句は全体的もしくは部分的欠陥、改変もしくは変異を有するか、またはｐ１１遺伝子において欠けているかもしくは欠損しているＤＮＡ配列を指す。それ故に「ｐ１１ノックアウトマウス」または「ｐ１１ノックアウトトランスジェニックマウス」とは、該マウスに導入されたＤＮＡが、ｐ１１タンパク質を発現する遺伝子において欠陥、欠損、変異または改変を含有するマウスを指す。ｐ１１遺伝子における欠陥または欠損の結果として、ｐ１１ノックアウトマウスはニューロン細胞膜で有する５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少なく、および／またはニューロン細胞膜での５−ＨＴ１Ｂ受容体の低下を呈するか、もしくは５−ＨＴ１Ｂ受容体が存在しないことを示し、それにより野生型マウスと比較してうつ病様の表現型を呈する。「ノックアウト」なる用語は元来の遺伝子と比較していずれかの場所での１ヌクレオチドから全遺伝子の欠失までの偏差を指し得る。標的相同組換えのような当分野において公知の任意の技術を用いてノックアウトマウスを作成することができる。
【００６２】
「組換え」なる用語は、その天然または内因性供給源から単離されており、そして化学的または酵素的のいずれかで修飾されて自然発生フランキングヌクレオチドを欠失するか、または自然発生しないフランキングヌクレオチドを提供するＤＮＡを指す。フランキングヌクレオチドは記載された配列またはヌクレオチドの部分配列から上流または下流のいずれかにあるこれらのヌクレオチドである。
【００６３】
「ベクター」は本明細書で使用される際には望ましい細胞または組織に組換え核酸を分配するいずれかのものであり、例えば細胞を感染、トランスフェクト、または一過性もしくは持続的に形質導入することができるウイルスである。ベクターは裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合された核酸でよいと認識される。ベクターは場合によってはウイルス性もしくは細菌性核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜（例えば細胞膜、ウイルス性脂質エンベロープ等）を含む。本出願の目的に関しては、ベクターはまた組換え核酸を含む細胞でもよい。ベクターは典型的には目的の核酸をプロモーターの制御下に置く発現カセットを含み得るか、または単純にその発現が望まれる遺伝子の上流に挿入を達成するための標的配列によりフランキングされたプロモーターを含み得ると認識される。ベクターには、限定するものではないが、ＤＮＡのフラグメントが結合し、そして複製できるようになるレプリコン（例えばプラスミド、バクテリオファージ）が含まれる。故にベクターには限定するものではないがＲＮＡ、自己複製環状ＤＮＡ（プラスミド）が含まれ、そして発現および非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養が「発現ベクター」の宿主であると記載される場合、これには、染色体外環状ＤＮＡおよび宿主の（複数の）染色体に組み込まれているＤＮＡの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持されている場合、ベクターは有糸分裂の間に、自律的構造として細胞により安定して複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれ得るかのいずれかである。
【００６４】
「コードする核酸」なる語句は転写および／または翻訳された場合に特異的タンパク質またはペプチドを発現するコドンを含有する核酸を指す。核酸配列は加えてフランキング配列、イントロン、および／または続いて翻訳後切断されるペプチドをコードする配列を含み得る。核酸配列にはＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列の双方が含まれる。核酸配列には全長核酸配列および全長配列から誘導される非全長配列の双方が含まれる。配列には天然の配列および、例えば特異的な宿主細胞におけるコドン優先性に配列を適合させるために縮重コドンを利用する配列が含まれるということがさらに理解されよう。
「核酸」は本明細書で使用される際にはＤＮＡまたはＲＮＡでよい。また核酸には、ポリメラーゼにより正確に解読されることを許容し、そしてその核酸によりコードされるポリペプチドの発現を改変しない、修飾されたヌクレオチドも含まれ得る。
【実施例】
【００６５】
実施例
実施例１
酵母２ハイブリッドスクリーニング
５−ＨＴ１Ｂ受容体の機能をよりよく理解するために、この受容体の第三細胞内ループを酵母２ハイブリッドスクリーニングのベイトとして使用する。ラット５−ＨＴ１Ｂ受容体の第三細胞内ループ（アミノ酸２２６−３１１）を全長ｃＤＮＡラット脳ライブラリーからＰＣＲ増幅し、そしてＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質として発現するためにベイトｐＡＳ２由来ベクターのＮｃｏ Ｉ／Ｓａｌ部位にサブクローニングする。酢酸リチウム法を用いて５−ＨＴ１Ｂ受容体−ベイトプラスミドを酵母株ＣＧ１９４５に形質転換する。抗ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン抗体を用いて免疫ブロットにより融合タンパク質の大きさおよび発現レベルを確認する。ｐＡＣＴ２ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを酵母株Ｙ１８７に形質転換する。ベイトおよびプレイ形質転換体をＹＰＤ培地上で対にし、そしてヒスチジンレポーター遺伝子の発現に関して選択的な培地（−ＬＷＨ）にプレートする。ｐＡＣＴ２ラット脳ｃＤＮＡライブラリーから２４４×１０６二倍体クローンをスクリーニングする。この培地で成長させた後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシドオーバーレイアッセイを実施する。３００を超えるクローンが選択培地で成長し、そしてβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に関して陽性である。酵母抽出物を二重陽性クローンから調製する。プレイインサートをＰＣＲ（５’−ＣＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡ ＧＧＧＡＴＧ−３’および５’−ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣ−３’）により増幅し、そしてプレイベクターオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣ−３’）を用いてシークエンシングする。ＢＬＡＳＴ検索によりｐ１１を主要プレイとして同定する。ｐ１１プレイプラスミドクローンを酵母から選択的にレスキューし、ＤＮＡ増幅のために大腸菌に形質転換し、そして相互作用の特異性を確認するために酵母株Ｙ１８７に（ｉ）元来の５−ＨＴ１Ｂ受容体−ベイトベクター、（ｉｉ）トランス活性化を確認するためのベイト対照ベクター、（ｉｉｉ）二つのその他の無関係のベイト構築物、ｐＲＰ２１およびＣΔ１１５、または（ｉｖ）５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ６、Ｄ１またはＤ２受容体の第三細胞内ループに相当するベイト構築物で再形質転換する。５−ＨＴ１A（アミノ酸２１８−３４５）、５−ＨＴ２A（アミノ酸２３６−３０２）、５−ＨＴ５A（アミノ酸２３３−２９５）、５−ＨＴ６（アミノ酸２０９−２６５）、Ｄ１（アミノ酸２５６−３１２）およびＤ２（アミノ酸２１１−３４３）受容体の各々に対応するベイトをラット脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅により作成し、そしてｐＡＳ２由来のベクターにサブクローニングする。これらのベイトの各々を酵母にｐ１１プレイ構築物と共に同時形質転換し、そして−ＬＷまたは−ＬＷＨ培地およびＸ−ｇａｌオーバーレイアッセイを用いることにより相互作用を分析する。全ての同時形質転換体を非選択培地（−ＬＷ）対照プレートで成長させた。選択培地（−ＬＷＨ）ではｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体との陽性相互作用が検出されるが、その他のいずれのベイトとも相互作用は検出されない。
【００６６】
２９個の二重陽性プレイクローンのうち、２６個がｐ１１に関する遺伝子をコードする。このアッセイでｐ１１は５−ＨＴ１Ｂ受容体と相互作用するが、５−ＨＴ１A、５−ＨＴ２A、５−ＨＴ５A、５−ＨＴ６、ドーパミンＤ１またはドーパミンＤ２受容体、二つの無関係のベイト（Ｃデルタ１１５およびｐＲＰ２１）、または空のプラスミドとは相互作用せず、それはｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体との会合の特性を示している。
【００６７】
実施例２
免疫共沈降
内因性ｐ１１（Ｓ１）を含有するＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ培地中６０％コンフルエンスまで成長させ、そしてリポフェクタミンを用いて製造者のプロトコールにしたがってｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲ−Ｖ５または空のプラスミド構築物でトランスフェクトする。トランスフェクションの後、細胞抽出物を４℃で可溶化する（５０ｍＭ Tris、ｐＨ７.４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＥＧＴＡ／０.１％Tritonおよびプロテアーゼ阻害剤中）。細胞抽出物を抗Ｖ５モノクローナル抗体で免疫沈降し、プロテインＧと共にインキュベートし、そして完全に洗浄する。その他の実験では、野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの大脳皮質からの脳組織を可溶化バッファー中４℃でホモジナイズする。脳抽出物を.ポリクローナル５−ＨＴ１Ｂ受容体抗体で免疫沈降し、プロテインＡと共にインキュベートし、そして完全に洗浄する。細胞および脳組織からの免疫沈降をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、そしてＰＶＤＦ膜に移す。ｐ１１に対するマウスモノクローナル抗体（１／１００）を用いて免疫ブロッティングを実施する。マウスＩｇＧに対して指向するＨＲＰ連結二次抗体と共にインキュベートすることにより抗体結合を検出し、化学発光が増強される。
ｐ１１はＨｅＬａ細胞および脳組織において５−ＨＴ１Ｂ受容体と免疫共沈降する。
【００６８】
実施例３
免疫蛍光
ＨｅＬａ細胞をｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲまたはｐｃＤＮＡ３.１−Ｖ５構築物でトランスフェクトする。トランスフェクション後３６時間の細胞を４％パラホルムアルデヒド／０.０１Ｍ ＰＢＳで１０分間固定する。ＰＢＳ中１０％ＢＳＡと共にインキュベートすることにより非特異的染色を遮断する。抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１／５００）および抗マウスｐ１１抗体（１／１０００）、続いてAlexa Fluor５６８標識ヤギ抗マウス二次抗体（１／５００）と共にインキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体およびｐ１１を可視化する。ＰＢＳで洗浄した後、Gel／Mountを用いてスライドにカバースリップをマウントする。レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の画像を獲得する。
免疫蛍光は細胞表面のｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体の間での顕著な共局在化を示す。
【００６９】
実施例４
インサイチュハイブリダイゼーション実験
ロックフェラー大学、カロリンスカ研究所および国立衛生研究所の実験動物保護委員会からのガイドラインにしたがって全ての動物実験を実施する。成熟雄Sprague Dawleyラットからの脳を用いてｐ１１遺伝子発現の局所分布および５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子発現とそれの共分布を決定する。いくつかの実験に関してはｐ１１ ＫＯマウスからの脳およびその野生型の対応物を使用する。ｐ１１ ｍＲＮＡ発現に及ぼす向精神薬処置の効果を研究するために、野生型成熟雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスをベヒクル、イミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、ジアゼパム（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、トラニルシプロミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）またはリスペリドン（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）の単回注射または反復注射（１日１回、１４日間）で処置する。動物を最後の注射の１時間後に屠殺する。ｐ１１発現に及ぼす電撃療法（ＥＣＴ）の影響を研究するために、雄Spraque Dawleyラット（２００ｇ）を、耳クリップ電極を介して毎日１０日間ＥＣＴに暴露し（４５ｍＡ；０.３秒）、そして最後の刺激の１８時間後に屠殺する。対照動物に、ラットの耳に電極をクリップするが電流を適用しない偽処置を施す。
イミプラミンおよびトラニルシプロミンで１４日間の処置の後、ならびに電撃療法の反復の後、前脳でｐ１１ ｍＲＮＡが上方調節されるが、ハロペリドール、リスペリドンまたはジアゼパムでは上方調節されない。
【００７０】
実施例５
マウスうつ病モデルならびに正常およびうつ病のヒトにおけるｐ１１タンパク質レベル
野生型成熟雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスをベヒクルまたはイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）で１日１回１４日間処置し、そして最後の注射の１時間後に屠殺する。雄Spraque Dawleyラットを、耳クリップ電極を介して毎日１０日間ＥＣＴに暴露し（４５ｍＡ；０.３秒）、そして最後の刺激の１８時間後に屠殺する。成熟雌無力（helpless）Ｈ／Rouenマウスおよび非無力ＮＨ／Rouenマウスを屠殺する。これらの三つの異なる処置群および対応する対照から、前頭皮質を切り裂き、そして凍結する。
【００７１】
正常対照および大うつ病を患う患者のヒト帯状皮質からの新鮮凍結組織をStanley Foundation Neuropathology Consortiumから入手する。凍結皮質を１％ ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によりタンパク質を決定するためにホモジネートの小アリコートを保持する。
【００７２】
１０−２０％グラジエントアクリルアミドゲルを用いて均等量のタンパク質を処理する。ｐ１１に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体（ヒト試料に関して１／１０００、およびげっ歯類試料に関して１／２００）ならびにアクチンに対するポリクローナル抗血清（１／１０００）のいずれかで免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。ｐ１１のレベルをアクチンのレベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００７３】
うつ病の遺伝的マウスモデルにおけるｐ１１ ｍＲＮＡの調節を研究するために、成熟雌および雄無力Ｈ／Rouenマウスおよび非無力ＮＨ／Rouenマウスからの前脳組織を比較する。ｐ１１ ｍＲＮＡおよびタンパク質はＨ／Rouenマウスにおいてより著明に低い。類似の結果が双方の性で見出される。
【００７４】
正常対照および大うつ病を患う患者のヒト帯状皮質の４０μｍ厚のクリオスタット切片をStanley Foundation Neuropathology Consortiumから入手する。双方の性（正常およびうつ病群の双方で女性６人および男性９人）、ならびに年齢２９−６８歳（正常）および３０−６５歳（うつ病）からの試料を分析する。うつ病の患者の疾患の期間は１から４２年で異なる。うつ病の個体のうち７人が自殺した。脳組織を凍結する前の死後の脳組織の間隔は８−４２時間（正常）および７−４７時間（うつ病）であり、そして組織のｐＨは５.８−６.６（正常）および５.９−６.５（うつ病）である。ラット５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１１５９−１４２０、マウスまたはヒトｐ１１遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１−２９３、およびラットｐ１１遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１−２８７の各々のＰＣＲ増幅によりインサイチュハイブリダイゼーションプローブを作成する。様々なＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングする。ヒト組織に関する研究を除いて、全研究用に１２μｍ厚のクリオスタット切片を作成する。前記されたようにラット５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子またはマウス、ラットもしくはヒトｐ１１遺伝子に対応するｃＤＮＡからのインビトロ転写物により調製された［−３５Ｓ］ＵＴＰ標識リボプローブで切片をハイブリダイズする（Ｓ５）。ハイブリダイゼーションの後、切片をBiomax ＭＲフィルムに７から２４日間暴露し、そしてＮＩＨ Image１.６３ソフトウェアを用いて分析する。特記しない場合、縁前方／前帯状皮質で分析を行う。いくつかの切片を細胞分析用にIlford Ｋ５エマルジョンに浸漬する。８週後、切片を展開し、ニッスル染色し、そしてマウントする。
【００７５】
Ｈ／Rouenマウスに類似して、単極性大うつ病障害を患っていた患者の前帯状皮質においてｐ１１ ｍＲＮＡおよびタンパク質が下方調節される。
【００７６】
実施例６
ｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体同時トランスフェクション実験
存在する場合、低い天然ｐ１１を含有するＣＯＳ７細胞をｐ１１（ｐｃＤＮＡ３.１−ｐ１１）、５−ＨＴ１Ｂ（ｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲ−Ｖ５）、ドーパミンＤ１受容体（ｐｃＤＮＡ３.１−Ｄ１Ｒ−Ｖ５）、または空のプラスミドでトランスフェクトする。プレートされたＣＯＳ７細胞を、１ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを含有する培地と共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞をＴＢＳで濯いでビオチン反応をクエンチする。修飾ＲＩＰＡバッファー（１％Triton Ｘ−１００、０.１％ＳＤＳ、０.５％デオキシコール酸、５０ｍＭ ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌロイペプチン）３００μl中で細胞を溶解する。ホモジネートを１４０００ｇで、４℃で１５分間遠心する。上澄１５μlを除去して５−ＨＴ１Ｂ受容体の全レベルを測定する。残りの上澄を５０％Neutravidinアガロース１００μlと共に４℃で３時間インキュベートし、そして短時間遠心する。細胞質５−ＨＴ１Ｂ受容体を含有する上澄を収集する。その後、アガロースビーズをＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、そして最後の短時間遠心の後、結合タンパク質をＳＤＳ試料バッファー４０μlに再懸濁し、そして煮沸する。抗Ｖ５（５−ＨＴ１Ｂ受容体を検出するために；１：１０００）および抗ｐ１１（１：１０００）抗体を用いて全ての細胞質およびビオチン化（表面）タンパク質に関して定量的ウェスタンブロットを実施する。増強された化学発光、続いてオートラジオグラフィーにより免疫反応性ビーズを検出する。ＮＩＨ Image１.６３ソフトウェアを用いてバンドの強度を定量する。各ウェルに関して表面／全体の比率を計算する。対照実験により、細胞内タンパク質アクチンはこのアッセイではビオチン化されないことが確認された。
【００７７】
５−ＨＴ１Ｂ受容体およびｐ１１で同時トランスフェクトされた細胞は細胞表面で５−ＨＴ１Ｂ受容体単独でトランスフェクトされた細胞よりも多くの５−ＨＴ１Ｂを呈する。対照的に表面の全ドーパミンＤ１受容体に対する比率はｐ１１の不在の存在下で類似する。
【００７８】
実施例７
ＣＯＳ７細胞におけるｃＡＭＰ測定
ＤＭＥＭ培地で成長させたＣＯＳ７細胞を５−ＨＴ１Ｂ受容体および／またはｐ１１でトランスフェクトする。３６時間後、細胞をテオフィリン（５ｍＭ）およびパルギリン（１０μＭ）で１５分間前処理する。次いでセロトニン（１０μＭ）を伴うかまたは伴わないベヒクルまたはフォルスコリン（１０μＭ）をさらに１５分間添加する。処理の終わりに薬物含有培地を除去し、ウェルをＰＢＳで濯ぎ、そして細胞を収集する。直接的ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキットにより製造者の説明書にしたがってｃＡＭＰ形成を定量する。対照実験により、セロトニンがトランスフェクトされていないＣＯＳ７細胞においてｃＡＭＰ形成を改変しないことが示される。
【００７９】
セロトニン（１０ｍＭ）が５−ＨＴ１Ｂ受容体でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるフォルスコリン誘起のｃＡＭＰ形成に対抗する能力は、同時トランスフェクトされたｐ１１の存在下で増大される。ｐ１１を伴うかまたは伴わないでフォルスコリンに対するｃＡＭＰ応答において有意な差はない。データは、ｐ１１を伴うかまたは伴わないでフォルスコリン刺激された条件に対して正規化され、そして平均Ｔ ＳＥＭを表す。
【００８０】
実施例８
ｐ１１を過剰発現するトランスジェニックマウスの作成および分析
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターの下でドキシサイクリン調節可能なｐ１１の過剰発現を伴うランスジェニックマウスを作成する。ＰＣＲを用いてマウスｐ１１をＭｙｃエピトープタグと融合し、そしてｐＴｅｔスプライスのＳａｌ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位にサブクローニングする（Ｓ６）。このプラスミド（ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ）をｔＴＡ発現ＣＨＯ細胞（Dr Patrick Allenより寄贈）にトランスフェクトする。これらの細胞の抽出物からのＭｙｃの発現を抗Ｍｙｃ（１：１０００）抗体を用いる免疫ブロッティングにより確認する。ｐ１１−Ｍｙｃが発現されることを確認した後、ＤＮＡフラグメント（ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ、ＳＶ４０イントロン、およびポリ（Ａ）＋シグナルを含有）を直線化し、電気溶出により精製し、そしてＣ５７ＢＬ６マウスからの卵母細胞の前核にマイクロインジェクトし、そして偽妊娠Ｃ５７ＢＬ６／ＣＢＡマウス（Rockefeller University Transgenic Facility）に移植する。テールＤＮＡを導入遺伝子に関してＰＣＲにより分析する（５’−ＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＣ ＡＡＡＴＧＧ−３’および５’−ＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣ ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧ−３’）。ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ構築物に関して陽性である創始マウスをＣ５７Ｂｌ６マウスと交雑させてＦ１マウスを作成する。Ｆ１同胞を交雑させることによりＦ２ホモ接合性ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ−トランスジェニックマウスが得られる。（ホモ接合性遺伝子型は、それらの野生型マウスとの交雑により確認される。）これらのマウスをＣａｍＫＩＩプロモーター下でｔＴＡを発現するＣ５７Ｂｌ６マウスと交雑させる（Ｓ７）。ＰＣＲにより前記のプライマー（ｐ１１−Ｍｙｃを検出するため）および５’−ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＧＧＴＣＧ ＧＡＡＴＣ−３’および５’−ＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＴＡＴＧＧ−３’（ｔＴＡを検出するため）を用いてマウスの遺伝子型を同定する。二重トランスジェニックマウスにおけるｐ１１−Ｍｙｃの過剰発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いる免疫ブロッティングにより、およびマウスｐ１１遺伝子に対するインサイチュハイブリダイゼーションにより確認する（図Ｓ２）。ＣａｍＫＩＩに推進されるｔＴＡの発現をｔＴＡのコード化領域に対するリボプローブ（Dr Alexei Morozov, Columbia Universityより寄贈）でのインサイチュハイブリダイゼーションを用いて検出する（図Ｓ２）。行動実験では、二重トランスジェニックマウスを対照として提供された導入遺伝子を発現しないか、または一つの導入遺伝子を発現する同腹仔と比較する。いく匹かの二重トランスジェニックマウスは飲料水中５０ｍｇ／ｌドキシサイクリンを実験前に１８日間投与される。
【００８１】
ドキシサイクリン不在下では、前脳でセロトニンを含有しないトランスジェニックマウスではニューロンにおけるｐ１１が上昇しているが、縫線核におけるセロトニンニューロンでは上昇しない。これらのマウスは黒質での機能的５−ＨＴ１Ｂ受容体が増加しており、そしてオープンフィールド試験において接触走性の低下（不安関連窮迫困難の指標）および水平方向活動性の増大を呈する。それらはまた尾懸垂試験において不動性の低下を示す（うつ病様状態の指標）。故にｐ１１を過剰発現するマウスはあたかも抗うつ剤で処置されたように振る舞うが、交絡因子は、それらが一般的に異常に活動的であるように思われるということである。ドキシサイクリンで処置されたトランスジェニックマウスは正規化されたｐ１１発現を有し（図Ｓ４）、そして接触走性、不動性または水平方向活動性の有意な改変はない。
【００８２】
実施例９
ｐ１１ノックアウトマウスの作成および分析
ｐ１１ＫＯマウスの作成および分析
ラットｐ１１のコード化配列からのプローブを用いて６個のゲノムクローンをＢＡＣライブラリースクリーニングから単離する。１３.７ｋｂのＢａｍ ＨＩフラグメントをＢＡＣクローンからサブクローニングし、そして制限酵素分析によりマッピングする。マウスｐ１１遺伝子はＡＴＧ含有エクソン、３.５ｋｂイントロン、続いて停止コドンを有する別のエクソンを含有する。ｐ１１遺伝子のＡＴＧ含有エクソンにわたる１１.３ｋｂのターゲティングベクター（５’Ｈｉｎｃ ＩＩ−Ｂｇｌ ＩＩ＋［Ｂａｍ Ｈ１−ｌｏｘＰＮｅｏｌｏｘＰ−Ｋｐｎ Ｉ］＋Ａｐａ Ｉ＊−Ｅｃｏ ＲＶ ３’）をｐＢＳＫ（−）で作成する（図Ｓ５）。ターゲティングベクターを１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞にエレクトロポレートし、そしてＧ４１８により組換えクローンに関して選択する。各々ＳｐｅＩおよびＢａｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉの各々で消化されたＥＳ細胞ＤＮＡの分析において、５’および３’外部プローブ（各々３００ｂｐ Ｂａｍ ＨＩ／Ｂｓｐ Ｍ１フラグメントおよび２８５ｂｐ Ｂａｍ ＨＩ／ＳｃａＩフラグメント）を用いるサザンブロッティングにより相同組換えに関してＥＳクローンを陽性として同定する。陽性クローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射し、そしてキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６雌と繁殖させて生殖細胞系伝達を得る。ヘテロ接合子孫を交配させてノックアウトおよび野生型マウスを作成する。テールＤＮＡからのサザンブロッティングにより、双方の対立遺伝子がｐ１１ ＫＯマウスで変異していることが確認された（図Ｓ５）。ｐ１１ノックアウトマウスにおけるｐ１１遺伝子の不在はさらにマウスｐ１１遺伝子に対するプローブでのインサイチュハイブリダイゼーションを用いて確認される（図Ｓ５）。以下のオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧ−３’、５’−ＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＡＴＡＴ ＧＣＴＣＣＴＡＡＴＣ−３’および５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣ ＡＣＴＣＡＴＧ−３’を用いるＰＣＲ手順を発展させて野生型、ヘテロ接合性、およびノックアウトマウスを区別する（図Ｓ５）。このＰＣＲ基盤の研究法は日常的な遺伝子型決定に用いられる。一次皮質培養物での研究を除いて、全ての実験をヘテロ接合体繁殖から作成されたｐ１１ ＫＯおよび野生型同腹仔で実施する。ヘテロ接合体×ヘテロ接合体繁殖により２９％野生型、５３％ｐ１１ヘテロ接合体および１８％ｐ１１ ＫＯマウスを生じた。なぜＫＯマウスがより少ないのかは明らかではないが、ｐ１１が初期胚移植に関与していることが見出されている（Ｓ８）。ヘテロ接合体ｐ１１マウスをＣ５７Ｂｌ６マウスと２世代戻し交配させる。１０４個の特異的Ｃ５７Ｂｌ６マーカー（Rockefeller University Genomics Resource Center）を用いるマイクロサテライト遺伝子型決定により、実験動物の繁殖に用いられたヘテロ接合体ｐ１１マウスは７４±２.８％Ｃ５７Ｂｌ６バックグラウンドであることが示される。
【００８３】
定量的受容体オートラジオグラフィー
クリオスタット切片（１２μｍ厚）をｐ１１ ＫＯおよび野生型マウスから作成する。アンタゴニスト［１２５Ｉ］シアノピンドロール（０.３、１、３、１０、３０、１００ｐＭ；２２００Ｃｉ／ミリモル）、５−ＨＴ１A遮断薬として１００ｎＭ ８−ＯＨ−ＤＰＡＴおよびβ−アドレナリン作動性受容体遮断薬として３０μＭ イソプロテレノールを含有する１７０ｍＭ Tris／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４（２５℃）中で切片を２時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体を検出する（Ｓ９）。非特異的結合を１００μＭセロトニンの存在下での測定により決定する。置換実験では、漸増濃度のセロトニン（０、０.３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、１００００ｎＭ）を前記したような１０ｐＭ［１２５Ｉ］シアノピンドロールと共にインキュベートする。切片を９ １７０ｍＭ Tris／４ｍＭ ＣａＣｌ２／０.１％アスコルビン酸、ｐＨ７.４（２５℃）中アンタゴニスト［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３（０.３、１、３、１０、３０ｎＭ；８０Ｃｉ／ミリモル；GE Healthcare）と共に２時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体もまた検出する。１００μＭセロトニンの存在下での測定により非特異的結合を決定する。切片を５０ｍＭ Tris、ｐＨ７.４、４ｍＭＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０.１％ウシ血清アルブミン（２５℃）中アゴニスト［３Ｈ］８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−テトラリン（［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ；１０ｎＭ；１２５Ｃｉ／ミリモル；GE Healthcare）、５−ＨＴ７受容体遮断薬として３００ｎＭ ＳＢ−２６９９７０と共に１時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１A受容体を検出する。１００μＭセロトニンの存在下での測定により非特異的結合を決定する。アンタゴニスト［３Ｈ］７−クロロ−２,３,４,５−テトラヒドロ−３−メチル−５−フェニル−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−オール（［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０；２ｎＭ；８７.０Ｃｉ／ミリモル）を含有する２５ｍＭ Tris／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１μＭパルギリン／２０ｎＭミアンセリン／０.００１％アスコルビン酸中で切片を２時間インキュベートすることによりＤ１様受容体を検出する。１００μＭ ＳＫＦ８２９５８の存在下での測定により非特異的結合を決定する。アンタゴニスト［３Ｈ］ラクリプリド（５ｎＭ；７２Ｃｉ／ミリモル）を含有する１７０ｍＭ Tris／１２０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ／２ｍＭ ＣａＣｌ２／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１０μＭ ＧＴＰ／０.００１％アスコルビン酸と共に切片を１時間インキュベートすることによりＤ２様受容体を検出する。１００μＭキンピロールの存在下での測定により非特異的結合を決定する。全てのオートラジオグラフィー実験の終わりに切片をその対応する冷結合バッファー中２×５分間濯ぎ、４℃の蒸留水に浸漬し、そして冷気下で乾燥させる。切片をBiomax ＭＲフィルムに３−５日間（［１２５Ｉ］シアノピンドロール）または４−１０週間（［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３、［３Ｈ］８−ＯＨＤＰＡＴ、［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０、［３Ｈ］ラクリプリド）マイクロスケールの［１２５Ｉ］または［３Ｈ］と一緒に並置する。ＮＩＨ Image１.６３画像分析システムでいくつかの脳領域における光学密度測定値が得られる。全結合から非特異的標識のデジタルサブトラクションにより特異的結合を計算する。マイクロスケールの［３Ｈ］または［１２５Ｉ］から作成された標準曲線を用いて光学密度をタンパク質のミリグラムあたりのフェムトモルに変換する。飽和および置換実験から得られたデータを非線形回帰方程式を用いて分析する。
【００８４】
オートラジオグラフィーリガンド結合実験により、野生型マウスよりもｐ１１ ＫＯの淡蒼球において５−ＨＴ１Ｂ受容体アンタゴニスト放射性リガンド［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロールおよび［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３に関する結合部位が少ないことが示された。同様に［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロール結合は野生型マウスよりもｐ１１ ＫＯの黒質網様部において低い（７７.３±５.８対９８.８±６.２フェムトモル／ｍｇタンパク質；Ｐ＜０.０５スチューデントｔ検定）。野生型とｐ１１ ＫＯマウスとの間に結合［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロールを置換するセロトニンの親和性には差異はない［半有効濃度（ＥＣ５０）値：５７対５２ｎＭ）。野生型とｐ１１ ＫＯマウスとの間で５−ＨＴ１A、Ｄ１またはＤ２受容体の量の差異は検出されない。［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロール結合もまたＮＨ／Rouenマウスに対してＨ／Rouenマウスで低下する。
【００８５】
５−ＨＴ１Ａまたは５−ＨＴ１Ｂ受容体刺激に応答した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合
野生型、ｐ１１ ＫＯおよびｐ１１トランスジェニックマウスからの新鮮なクリオスタット切片（１２μｍ）を、１００ｍＭＮａＣｌ、＼１０ ３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＧＤＰおよび内因性アデノシンを除去するために１Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼを追加したTris−ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７.４）中３０分間プレインキュベートする。その後切片を４０ｐＭ［３５Ｓ］ＧＴＰ Ｓを含有する同一溶液中、５０μＭ ５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴまたは５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニスト、アンピルトリンを伴って（刺激条件）、または伴わずに（基本条件）２５℃で２時間インキュベートする。１０μＭの未標識ＧＴＰ Ｓと共にインキュベートした隣接する切片からのオートラジオグラフで非特異的標識（バックグラウンド）を決定する。切片を５０ｍＭ Tris−ＨＣｌバッファーで２回（各３分）、蒸留水で１回（３０秒）濯いでバッファー塩を除去し、そして空気乾燥させる。Biomax ＭＲフィルムで２−４日間暴露することによりオートラジオグラフが得られる。ＮＩＨ Image１.６３画像分析システムでいくつかの脳領域における光学密度測定値が得られる。
【００８６】
ｐ１１ ＫＯマウスの細胞膜での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の低下は、５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニスト、アンピルトリンがこれらのマウスの淡蒼球における［３５Ｓ］グアノシン５'−Ｏ−（３'−チオ三リン酸（ＧＴＰ−Ｓ）結合を増大させる能力の低下に反映される。対照的に野生型およびｐ１１ ＫＯマウスにおける５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ［（＋／−）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン］による［３５Ｓ］ＧＴＰ−Ｓ結合に差異はない（６.０±２.１対５.０±２.０光学密度単位）。ｐ１１ ＫＯマウスの細胞表面での機能的５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の低下はまた、セロトニンおよびアンピルトリンがｐ１１ ＫＯマウスからの一次皮質培養物におけるホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節キナーゼ）レベルを下方調節する能力、ならびにアンピルトリンがｐ１１ ＫＯマウスからの線状体切片においてｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼによりリン酸化される部位であるホスホ−Ｓｅｒ９−シナプシンＩを低下させる能力の喪失に反映される。
【００８７】
一次皮質培養物におけるリン酸化ＥＲＫ１／２を検出するためのウェスタンブロッティング
ＷＴ×ＷＴまたはｐ１１ＫＯ×ｐ１１ＫＯ繁殖から生じたＥ１８マウスから皮質を除去し、トリプシン処理し（０.２５％）、粉砕により分離し、そしてポリ−Ｌ−リジン（１ｍｇ／ｍｌ）コーティングされた６ウェルプレートにプレートする。５％ウシ胎仔血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｂ−２７栄養素補給、ペニシリン（５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）伴うＤＭＥＭを含有する培地で培養物（５０００００セル／ｍｌ）を成長させる。２週後に培養物をベヒクル、セロトニン（１０μＭ）またはアンピルトリン（１０μＭ）で１５分間処理する。処理の最後に薬物含有培地を除去し、ウェルを氷冷ＰＢＳで濯ぎ、セルスクレーパーによりニューロンを除去し、そして液体窒素中で凍結する。凍結細胞試料を１％ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によるタンパク質決定のためにホモジネートの小アリコートを保持する。前記したように１０％アクリルアミドゲルを使用することにより均等量のタンパク質を処理する（Ｓ１０）。ホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＥＲＫ１／２に対するリン酸化部位特異的抗体またはリン酸化部位特異的でない全ＥＲＫ１／２に対する抗体で免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。ＥＲＫ１／２のリン酸化形態のレベルをその全レベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００８８】
脳切片におけるリン酸化シナプシンＩを検出するためのウェスタンブロッティング
前記したような野生型およびｐ１１ ＫＯマウスから線状体の切片（３００μｍ）を調製する（Ｓ１０）。切片をKrebsバッファー（１１８ｍＭ ＮａＣｌ／４.７ｍＭ ＫＣｌ／１.５ｍＭ Ｍｇ２ＳＯ４／１.２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３／１１.７ｍＭグルコース／１.３ｍＭ ＣａＣｌ２）中３０℃で一定の酸素添加で（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）６０分間プレインキュベートし、３０分後にバッファーを変える。切片をベヒクルまたはアンピルトリン（５０μＭ）で２分間処理する。薬物処理の後、バッファーを除去し、切片をドライアイス上で急速に凍結し、１％ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によるタンパク質決定のためにホモジネートの小アリコートを保持する。１０％アクリルアミドゲルを使用することにより均等量のタンパク質を処理する。ＰＫＡおよびＣａｍＫＩＩによりリン酸化される部位であるホスホ−Ｓｅｒ９−シナプシンＩに対するリン酸化部位特異的ウサギポリクローナル抗体、またはリン酸化部位特異的でないウサギポリクローナルシナプシン抗体で免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。シナプシンのリン酸化形態のレベルをその全レベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００８９】
電気生理学
フルオロタン麻酔した雄ｐ１１ ＫＯおよび野生型マウス（４−７週齢）を断頭する。その脳を迅速に除去し、そしてマイクロスライサーで側坐核を含有する脳冠状切片（４００μｍ厚）を調製する。切片を酸素添加された（９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２）、１２６ＮａＣｌ、２.５ＫＣｌ、１.２ＮａＨ２ＰＯ４、１.３ＭｇＣｌ２、２.４ＣａＣｌ２、１０グルコースおよび２６ＮａＨＣＯ３（ｍＭで）を含有する人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）（ｐＨ７.４）中３２℃で少なくとも１時間インキュベートする。切片を正立顕微鏡にマウントされた記録チャンバーに移し、そして２８℃で酸素添加されたａＣＳＦで連続的に灌流する。側坐核の切片表面に位置するａＣＳＦで充填されたガラスマイクロピペットを用いて細胞外電場電位を記録する。１０ｋＨｚで獲得されるAxopatch２００Ｂ増幅器を介してシグナルを５００倍に増幅し、２ｋＨｚでフィルタリングし、そして獲得およびpClamp９データ分析ソフトウェアを用いてコンピューターに記録する。切片の表面の記録電極近くに置かれた同心両極刺激電極でシナプス反応を惹起する。切片に適用された刺激の強度のｆＥＰＳＰ振幅への依存性はＷＴおよびｐ１１ ＫＯマウスで類似し、それはグルタミン酸作動性１２シナプス伝達がＷＴおよびｐ１１ ＫＯマウス間で異ならないことを実証している。刺激強度の増大により惹起される電場電位の振幅を測定することにより試験される各切片に関して確立された刺激／応答曲線により評価されるように、最大応答の５０−７０％を生じる強度で単一の刺激（０.１ミリ秒間隔）を１５秒毎に適用する。グルタミン酸作動性シナプス伝達に及ぼすセロトニン受容体活性化の影響を評価するために、セロトニンを灌流溶液に適用しながらｆＥＰＳＰ／ＰＳ振幅を測定する。セロトニン（５０μＭ；１０μＭフルオキセチンの存在下）はＷＴマウスからの切片においてｆＥＰＳＰ／ＰＳの振幅を抑制し（７２ ベースライン値の２.７％）、そしてこの効果はｐ１１ ＫＯマウスからの切片では除かれる（９８ ベースライン値の３.６％）。数値を平均 ＳＥＭとして表現する。薬物は三方活栓を切り替えることにより灌流溶液中で適用される
【００９０】
セロトニンは５−ＨＴ１Ｂ受容体を介して大脳皮質に由来するニューロンの末端でグルタミン酸放出を低下させ、そして皮質線状体シナプスでのシナプス伝達を阻止する。グルタミン酸作動性線維の短い電気刺激により惹起され、そして側坐核で細胞外で記録される興奮性シナプス後電場電位（ｆＥＰＳＰ）の振幅をモニタリングする。ｆＥＰＳＰは野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの双方で切片の電気刺激により放出される内因性グルタミン酸により活性化されるＡＭＰＡ受容体により媒介される［ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２,３−ジオン（ＣＮＱＸ）の１５分後、ベースラインと比較してｆＥＰＳＰ／集合スパイク（ＰＳ）低下、各々７７および８１％］。灌流溶液に適用された場合、セロトニンは野生型マウスからの切片におけるｆＥＰＳＰ／ＰＳの振幅を抑制するが、ｐ１１ ＫＯマウスからの切片では抑制しない。
【００９１】
モノアミンおよび代謝物の組織含量
雄ｐ１１ ＫＯ、ｐ１１ヘテロ接合体および野生型マウス（遺伝子型あたりｎ＝８）を収束マイクロ波照射により屠殺し、そして線状体、皮質および海馬を別々にし、そしてドライアイス上で凍結する。次いで組織試料を１０容量の０.１Ｎ ＴＣＡ中で超音波処理し、ボルテックスし、そして１２０００ｇで２分間遠心する。上澄を収集し、そして電気化学検出を備えたＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＥＣ）を用いてセロトニンおよびセロトニン代謝物、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）に関して分析する。塩基不活性化シリカHypersil ５μｍ Ｃ１８分析カラム（４.６×１５０ｍｍ）を用いて７５ｍＭリン酸一ナトリウム、３５０ｍｇ／ｌ １−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.８％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣ等級、阻害剤不含）および８％アセトニトリル、ｐＨ３（リン酸で調整）からなる移動相で、流速１.２ｍｌ／分でセロトニンおよび５−ＨＩＡＡを分離する。ガラス状炭素二重電極を有する電気化学検出器を使用する（電極１＝６８０ｍＶ、レンジ、０.５ｎＡ；電極２＝−１００ｍＶ、レンジ、０.２ｎＡ）。ピーク高さおよび試料濃度を計算するEZChromソフトウェアを用いてデータを収集する。セロトニンおよび５−ＨＩＡＡに関する感度は０.１ピコモル／ｍｌである。
【００９２】
５−ＨＴ１Ｂ受容体は自己受容体として振る舞い、そしてセロトニン放出を阻止する。ｐ１１は縫線核で発現されるので、セロトニンおよびその主要代謝物、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の量を野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの投射部、主に皮質、線状体および海馬で測定する。５−ＨＴターンオーバーおよび／または５−ＨＴ１Ｂ受容体による代謝の負の調節、ならびに５−ＨＴ１Ｂ受容体機能に及ぼすｐ１１の増強の役割にしたがって、ｐ１１ ＫＯマウスはセロトニンターンオーバーおよび／または代謝のレベルを増大させている。
【００９３】
行動分析：オープンフィールド分析
完全コンピューター化マルチケージ赤色および赤外感受性運動検出システムで日中に３０分間（結果を毎５分間分析する）水平方向活動性を測定する。末梢活動性の値を全水平方向活動性により１３に分け、接触走性を決定する。アンピルトリン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）での実験では、動物を注射後１５分間試験する。いくつかのアンピルトリン処置マウスは実験前日までイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）を毎日４週間注射されていた。
【００９４】
行動分析：尾懸垂試験
抗うつ剤様活性のモデルである尾懸垂試験を前記のように実施し（Ｓ１１）、そしてＣ５７Ｂｌ６（Ｓ１２）およびＮＭＲＩマウス（Ｓ１３）に関して確認されたものを修飾したものである。マウスは粘着テープを使用して（尾の先端から２ｃｍの距離）個々に水平バーに尾により懸垂される（床からの距離は３５ｃｍの距離）。典型的にはマウスは、一時的に増加する不動性の期間が散在するいくつかの逃避志向性行動を実証した。６分間の試験期間はビデオテープに録画され、そして遺伝子型を知らない観察者により採点される。記録されたパラメーターは不動で過ごした秒数である。アンピルトリン（５ｍｇ／ｋｇ）およびイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ）での実験では、動物を注射後１５分間試験する。
【００９５】
行動分析：スクロース消費試験
個々に収容されたｐ１１ ＫＯマウスおよび野生型マウスで単一の瓶の手順を用いてスクロース消費を試験する。９６時間の間、水中２％スクロース溶液の消費を測定する。次の実験では同一の期間、水の摂取を測定する。
【００９６】
ｐ１１欠失の行動的影響を評価するために、基本条件下で、ならびに薬物未使用マウスおよびイミプラミンで長期間処置されているマウスにおけるアンピルトリンに対して応答した、野生型およびｐ１１ ＫＯマウスにおける接触走性を比較する。イミプラミンで処置された動物では、アンピルトリンは野生型マウスの接触走性において有意な低下を引き起こすが、ｐ１１ ＫＯマウスでは引き起こさない（図４Ｇ）。加えて、生理食塩水注射された野生型ではｐ１１ ＫＯマウスよりも接触走性が少ない（図４Ｃ）。薬物未使用野生型およびｐ１１ ＫＯマウスはアンピルトリン不在下または存在下のいずれかで類似の接触走性を呈する。野生型マウスと比較してｐ１１ ＫＯマウスでは、ベースライン条件下およびアンピルトリンまたはイミプラミンのいずれかでの急性処置後の双方で、尾懸垂試験における不動性が増大する（図４Ｈ）。これらの行動結果により、ｐ１１ ＫＯマウスはうつ病様表現型を呈し、そしてｐ１１は５−ＨＴ１Ｂ受容体を介してイミプラミンに対する行動的応答を媒介することが示される。ｐ１１ ＫＯマウスのうつ病様表現型をさらに支持するに、ｐ１１ ＫＯマウスがその野生型同腹仔よりも美味な２％スクロース溶液の消費が少なく（１.７４±０.０７対２.１７±０.１１ｍｌ／ｇ体重／日；Ｐ＜０.０５スチューデントｔ検定）、それは甘い報酬に対する応答性の低下を示している。水摂取はｐ１１ ＫＯマウスおよびその野生型同腹仔で類似し（１.５１±０.０５対１.４２±０.０５ｍｌ／ｇ体重／日）、それはこの行動における体液均衡の崩れの役割を排除する。
【００９７】
実施例１０：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｐ１１の検出
ヘパリン化チューブに全血（１０−１５ｍｌ）を収集する。血液１ｍｌは単核細胞およそ１ｍｉｌｊを生じるが、その数は個体間で相当異なる。血液をリン酸基盤の生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈する。Lymphoprep（Medinor カタログ番号１１１４５４７）２.５ｍｌを１５ｍｌチューブに加え、そして希釈した血液１０ｍｌを上部に注意深く層にする。チューブを１８００ｒｐｍおよび室温で２０分間回転させる。パスツールピペットを使用してＰＢＭＣを２本のチューブから１本の透明の１５ｍｌチューブに収集する。このチューブをＰＢＳで充填し、そして１５００ｒｐｍで１０分間遠沈させる。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄する（血小板およびLymphoprepを除去する）。計数するために、ＰＢＭＣを元来の全血容量１０ｍｌあたり培地（９０％ウシ胎仔血清／１０％ＤＭＳＯ）１ｍｌで希釈する。（トリパンブルーで１：１０希釈して計数）。ＰＢＭＣを−８０℃（ドライアイス）または冷却器で凍結し、そしてそれを保存し、そして−８０℃で分配する。ウェルあたり０.５ｍｉｌｊ ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに加える。プレートを回転させ、そして上澄を捨てる。細胞をＢＤ固定バッファー（BD Biosciences、カタログ番号５５４７１５のキットより）中で固定する。同一キットからの透過バッファーを加え、そして細胞を洗浄する。ここで細胞は細胞内染色の準備が整っている。ｐ１１抗体（BD Biosciences；２,５μｇ／ｍｌ）を透過バッファーで希釈し、そしてウェルに加える。一つのウェルをＩｇＧ１対照のために使用する。細胞をピペッティングにより懸濁する。細胞を３０分間インキュベートし、そして透過バッファーで洗浄する。二次抗体（例えばヤギ抗マウスＰＥ抱合）を透過バッファーで希釈し、そして各ウェルに加える。細胞を懸濁し、そして３０分間インキュベートする。それを透過バッファーで２回およびＰＢＳ−１％ＦＣＳで１回洗浄する。二重染色のために、二次抗体をＰＢＳ−１％ＦＣＳ−１％ＮＭＳ（正常マウス血清）１００μｌで１回洗浄することにより遮断する。遮断工程は次の抗体が任意の残りの二次抗体に結合することを回避するために必要である。表面マーカーを染色するために、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ含有ＰＢＳ（単球を識別するため）またはＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ５６−ＰＥ（Ｔ細胞およびＮＫ細胞を識別するため）またはＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｂ細胞を識別するため）を各ウェルに加える。細胞をピペッティングにより懸濁し、そして冷蔵庫内で１０分間インキュベートする。次いでそれをＰＢＳ−１％ＦＣＳ２００μｌで１回洗浄する。標準的なＦＡＣＳ手順を用いて様々な型の単核細胞におけるｐ１１の染色を決定する。ｐ１１はいくつかの白血球、単球、ＮＫキラー細胞およびＣＤ−８陽性Ｔ細胞において高度に発現される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年６月１３日出願の米国仮特許第６０／８１３１７０号および２００７年１月５日出願の第６０／８７８７３０号の利益を主張し、その内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（技術分野）
本発明はｐ１１と５−ＨＴ１Ｂおよび５−ＨＴ４受容体との間の生物学的関連性を紹介し、これらの受容体が関連する疾患のための薬物標的およびｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者の同定のための診断手段としてのｐ１１の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現在利用可能な抗うつ剤および抗不安薬はノルエピネフリン、ドーパミンおよびとりわけセロトニン（５−ヒドロキシ−トリプタミンまたは５−ＨＴ）のようなモノアミン神経伝達物質の生合成、分解および作動経路を標的とする。１９４０年代後期に最初に発見されたセロトニンは気分、睡眠、食欲および性的行為を含む身体における多くの機能を調整するのに重大な役割を果たす。それは中枢神経系内で神経伝達物質として、およびまた末梢シグナルモジュレーターとしての双方で機能する。結果的にセロトニン利用性および活性における改変はうつ病、摂食障害（例えば過食症）、強迫性障害（ＯＣＤ）、薬物依存、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、月経前症候群、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害、胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）、躁病、偏頭痛および双極性障害に関係している。従来の抗うつ剤は、典型的には（１）モノアミンオキシゲナーゼを阻止することによりセロトニンの分解を防御する；または（２）シナプス前ニューロンによるセロトニン再取り込みを阻止することによりセロトニンのニューロン輸送を増加させる；のいずれかによりシグナル伝達を調節する。しかしながら半世紀にわたるセロトニン経路の集中的な研究にもかかわらず、これらの経路の理解は不完全であり、そしてセロトニン経路機能障害に関する確立された生化学基盤の診断またはバイオマーカーはない。
【０００４】
５−ＨＴ（セロトニン）受容体は異種性であり、そして種々の細胞の表面において見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体は１４個のセロトニン受容体サブタイプのうちの一つであり、そして中枢神経系全体にわたって豊富に見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体の構造、分布および見かけの機能はげっ歯類およびヒトにおいて非常に類似する。この受容体は気分、認知、攻撃性、耽溺、睡眠および摂食を含む多様な生理学的機能および行動に関係している。５−ＨＴ１Ｂ受容体はセロトニンおよび非セロトニン含有ニューロンの双方において見出される。５−ＨＴ１Ｂ受容体は大部分がニューロンのシナプス前部分において見出され、ここでそれはニューロンによるセロトニン放出の調節に関与する終末自己受容体として機能する。セロトニンに結合することにより刺激される場合、それらはニューロンによるさらなるセロトニンの放出を阻止し；刺激されない場合、セロトニン放出は強化される。故にこれらの５−ＨＴ１Ｂ受容体の遮断はセロトニンレベルを増強する傾向がある。５−ＨＴ１Ｂ受容体がアセチルコリン、グルタミン酸、ドーパミン、ノルエピネフリンおよびガンマアミノ酪酸のようなその他の神経伝達物質、ならびにセロトニンの放出の制御に関与するヘテロ受容体であるといういくつかの証拠がある。シナプス後で見出される５−ＨＴ１Ｂ受容体もある。５−ＨＴ４受容体は胃腸管系（ここでそれは胃腸管運動性に関与する）および中枢神経系において見出される。５−ＨＴ１Ｂは一般的にｃＡＭＰの低下に関連するが、５−ＨＴ４受容体はｃＡＭＰ活性上昇に関連する。脳における５−ＨＴ４受容体は神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンおよびＧＡＢＡ）放出を調整し、そしてシナプス伝達を強化する。それらはまた非アミロイド形成的可溶性アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰアルファ）の放出を促進することにより記憶強化において役割を果たし得る。アルツハイマー病はベータ−アミロイドプラーク形成の沈着により媒介されると広く考えられているので、５−ＨＴ４受容体機能を強化し、それによりｓＡＰＰアルファの放出を強化することは、アルツハイマー病の処置または予防に対する可能性のある研究法に相当する。
【０００５】
タンパク質ｐ１１はＳ１００ＥＦハンドタンパク質ファミリーのメンパーである。ｐ１１はまたアネキシンＩＩ軽鎖、リポコルチンＩＩ軽鎖、カルパクチンＩ軽鎖、４２ＣまたはＳ−１００関連タンパク質としても公知であり、そして本明細書ではこれらの用語を互換的に使用できる。R. Donato, Biochim. Biophys. Acta, １４５０：１９１（１９９９）。それは種々の細胞内に別々に、またはヘテロ四量体として存在する。ヘテロ四量体はアネキシンＩＩまたはカルパクチンＩ重鎖としても公知のｐ３６の２個のコピー、およびｐ１１の２個のコピーからなる。細胞内ではヘテロ四量体は偽膜性細胞骨格における細胞膜の細胞質表面に局在し、そして複合体はエクソサイトーシス、エンドサイトーシスおよび細胞間接着のような膜トラフィッキング事象において役割を果たし得ることが示唆される。ｐ１１は腫瘍細胞浸潤、腫瘍成長および転移において役割を有すると主張されている。米国特許出願公開第２００４／０１４２８９７（Ａ１）。ｐ１１が５−ＨＴ受容体または精神障害に関与しているとは以前に報告されたことはない。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
出願人は、本発明により、驚くべき事にｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体と特異的に相互作用し、そして多くの精神治療薬の中心的な標的である脳メッセンジャー化学セロトニンのシグナリングの調節を支援すると考えられることを発見した。Svenningsson et al., Science３３１：７７−８０（２００６）；Svenningsson et al., Current Opinion in Pharmacology ６：１−６（２００６）（双方を出典明示により本明細書の一部とする）。ｐ１１は、５−ＨＴ１Ｂ受容体の、より機能的な場所であるニューロン細胞膜への補充において重大な役割を果たすと考えられる。出願人はさらにｐ１１が５−ＨＴ４受容体とも相互作用することを発見した。出願人は、欠陥のあるセロトニン受容体を伴うと考えられるうつ病、不安障害および類似の精神病の発達においてｐ１１レベルが直接関与し得ることを示している。うつ病対象の脳におけるｐ１１レベル（うつ病のヒトおよびマウスモデル）の、非うつ病対象のレベル（非うつ病のヒトおよび対照マウス）に対する比較により、非うつ病対象と比較して、うつ病対象ではｐ１１のレベルが相当低いことが示される。さらにｐ１１レベルは、三環系抗うつ剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）および電撃療法を含む種々の型の抗うつ剤で処置された対象においてより高い傾向がある。抗うつ剤で処置された動物においてｐ１１は過剰発現される。例えば選択的セロトニン取り込み阻害剤、フルオキセチンを投与されたサルは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてｐ１１発現の顕著な（２倍を超える）増加を示すことが観察されており、そして類似の効果がフルオキセチンを投与されたマウスの脳において実証される。同様に、ｐ１１ノックアウト遺伝子を有する動物モデルは、ニューロン細胞膜で呈される５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少なく、セロトニンシグナリングは低下しており、そしてうつ病様の表現型を呈する。興味深いことに、しばしばストレスに応答して放出されるグルココルチコイドホルモンの過剰レベルに応答してｐ１１発現が低下し、それは出願人の研究を踏まえて、うつ病と高度なストレス源との間で観察された連関に関して可能な生化学的説明を提供する。出願人によるこれらの驚くべき発見に基づいてｐ１１が、従来の５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体に、またはセロトニン機能（またはその欠如）に関連した障害のための処置の開発のための適当な診断標的および薬物標的ならびにスクリーニング手段であることが示される。
【０００７】
「ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害」なる用語は本明細書にて使用される際にはｐ１１タンパク質による５−ＨＴ受容体、例えば５−ＨＴ１Ｂまたは５−ＨＴ４受容体の動員（または動員の欠如）により媒介される、関連する、引き起こされる、影響を受ける、引き金となる、またはそれを伴う任意の障害を含む。ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害には、限定するものではないが精神障害（例えばうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、薬物依存および強迫性障害、ならびにアルツハイマー病）、睡眠障害（例えば不眠症）、摂食障害（例えば過食症）、性機能障害および胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）；特にうつ病が含まれ得る。
【０００８】
故に本発明はとりわけ：
１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法；
２. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法；
３. ｐ１１を過剰または過少発現するトランスジェニック動物；および
４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置する方法；
を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
一つの実施態様では、本発明は；
（１）対象の生物学的試料、例えば血液または組織試料、例えば単球および／または白血球、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のｐ１１タンパク質のレベルを検定すること；ならびに（２）該ｐ１１レベルを参照標準、例えば任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照集団におけるｐ１１レベルと比較することであって、ここで参照標準と比較して、対象におけるｐ１１の異常レベルはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する；
を含む、対象においてｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法に関する（方法１）。
【００１０】
故に本発明は以下の方法１の実施態様を含む。
１.１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで参照標準と比較して対象において低下したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する方法１の方法。
１.２. 障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そしてうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される方法１または１.１に記載の方法。
１.３. 障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そしてうつ病である前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.４. 該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで参照標準のレベルと比較して対象において上昇したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する方法１に記載の方法。
【００１１】
１.５. 障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害であり、そして躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択される方法１または１.４のいずれかに記載の方法。
１.６. 該ｐ１１のレベルが該対象からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｐ１１タンパク質レベルを検定することにより決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.７. ＰＢＭＣが単球、ＮＫ細胞およびＣＤ−８＋Ｔ細胞から選択される１.６に記載の方法。
１.８. 該ｐ１１のレベルが該対象からの生物学的試料中のｐ１１ ｍＲＮＡレベルを検定することにより決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.９. ｐ１１のレベルがｐ１１に特異的なモノクローナル抗体を用いて決定される前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.１０. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
【００１２】
１.１１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
１.１２. 例えば前記の方法１−１.１１のいずれかにしたがって、ｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体、および使用のための説明書を含むｐ１１レベルを測定するのに有用なキット。
１.１３. 方法１−１.１１のいずれかにおけるｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体の使用。
１.１４. 請求項１−１.１１のいずれかに記載の方法または１.１２に記載のキットにおいて使用するための試薬の製造におけるｐ１１ ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはｐ１１に特異的なモノクローナル抗体の使用。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は５−ＨＴ受容体に関連するｐ１１発現またはｐ１１活性を調節（上方または下方のいずれか）する候補モジュレーターの能力を検定することを含む、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法に関する（方法２）。
【００１４】
それ故に方法２は以下を含む：
２.１. 均等量のｐ１１遺伝子生成物（例えばタンパク質またはｍＲＮＡ）を含有する第１試料および第２試料、例えば細胞培養物または細胞もしくは組織試料を提供すること；第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；ならびに第１試料中のｐ１１遺伝子生成物の量が変化しているかどうかを決定すること；の工程を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法であって、ここで遺伝子生成物の量の増加は、候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方量の低下は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示す。
【００１５】
２.２. 細胞表面での均等数の５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を含有する第１試料および第２試料を提供すること；第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；ならびに第１試料の細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数が第２試料と相対して変化しているかどうかを決定すること；の工程を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法であって、ここで細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数の増加は、候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方細胞表面での５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体の数の低下は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示す。
【００１６】
２.３. 候補ｐ１１モジュレーターを、ｐ１１プロモーターに作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含む細胞と接触させること、およびｐ１１発現の代理としてレポーター遺伝子発現を使用することを含む１１モジュレーターを同定するための方法。
２.４. 候補モジュレーターが５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連するｐ１１発現を上方調節するか、またはｐ１１活性を上昇させて、ニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含む、低レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法。
【００１７】
２.５. 異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される方法２−２.４のいずれかに記載の方法。
２.６. 障害がうつ病である前記の方法２−２.５のいずれかに記載の方法。
２.７. ｐ１１のモジュレーターを陽性対照として使用する前記の方法２−２.６のいずれかに記載の方法。
２.８. ｐ１１のモジュレーターが三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、トリプタンおよびモノアミンオキシダーゼ阻害剤から選択される方法２.６に記載の方法。
【００１８】
２.９. ｐ１１のモジュレーターがアミトリプチリン（商品名：Elavil）、デシプラミン（商品名：Norpramin）、イミプラミン（商品名：Tofranil）およびノルトリプチリン（商品名：Aventyl、Pamelor）から選択される三環系抗うつ剤である方法２.８に記載の方法。
２.１０. ｐ１１のモジュレーターがイミプラミンである方法２.８に記載の方法。
２.１１. ｐ１１のモジュレーターが例えばイソカルボキサジド（商品名：Marplan）；フェネルジン（商品名：Nardil）およびトラニルシプロミン（商品名：Parnate）から選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）である方法２.８に記載の方法。
２.１２. ＭＡＯＩがトラニルシプロミンである２.１１に記載の方法。
２.１３. ｐ１１のモジュレーターが例えばシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft）から選択される選択的セロトニン再取り込み阻害剤である方法２.８に記載の方法。
【００１９】
２.１４. 候補モジュレーターがｐ１１発現を下方調節するか、５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連するｐ１１活性を阻止もしくは低下させて、ｐ１１がニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力を低下させるかまたは阻止する能力に関して検定することを含む、高レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための方法。
２.１５. 高レベルのｐ１１に関連する障害には、限定するものではないが躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害が含まれる２.１４に記載の方法。
２.１６. 該モジュレーターがｐ１１に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびモノクローナル抗体から選択される高レベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１モジュレーターを同定するための２.１５に記載の方法。
【００２０】
２.１７. ｐ１１に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびモノクローナル抗体から選択されるｐ１１サプレッサー化合物を対照またはコンパレーターとして使用する方法２−２.１６のいずれかに記載の方法。
２.１８. 候補ｐ１１擬似物質が５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体に関連または相互作用してニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含む、異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法２−２.１７のいずれかに記載の方法。
【００２１】
２.１９. 候補ｐ１１擬似物質がニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂおよび／または５−ＨＴ４受容体を補充する能力に関して検定することを含むうつ病を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法２.１８に記載の方法。
２.２０. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
２.２１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
２.２２. ｐ１１プロモーターに作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含む細胞。
２.２３. 方法２−２.２１のいずれかに記載の方法における２.２２に記載の細胞の使用。
【００２２】
さらに別の実施態様では、本発明はｐ１１を過剰または過少発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物またはその子孫および新しい医薬品を発見するための方法におけるその使用を志向する（方法３）。故に本発明には以下が含まれる：
３.１. ｐ１１遺伝子に欠陥、変異または欠損を有するＤＮＡ配列を保有し、そしてそれ故にｐ１１タンパク質を過少発現し、ならびに／またはニューロン細胞膜で保有する５−ＨＴ１Ｂおよび／もしくは５−ＨＴ４受容体がより少なく、そしてそれ故に同一種の野生型のヒト以外の哺乳動物と比較してうつ病様の表現型を呈するヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
３.２. ヒト以外の該哺乳動物がｐ１１タンパク質を過剰発現し、ならびに／またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂおよび／もしくは５−ＨＴ４受容体のレベル上昇を呈し、そしてそれ故に同一種の野生型のヒト以外の哺乳動物と比較して活動亢進の表現型を呈するヒト以外のｐ１１トランスジェニック哺乳動物。
【００２３】
３.３. マウスである３.１または３.２に記載のヒト以外の哺乳動物。
３.４. 調節プロモーター、例えばドキシサイクリン調節カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターに作動可能なように連結されたｐ１１をコードするコード化領域を含む導入遺伝子を有する３.２または３.３に記載のヒト以外の哺乳動物。
３.５. （１）新規精神治療薬を（ａ）３.１または３.３に記載のｐ１１ノックアウト哺乳動物および（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない同一種の対照哺乳動物に投与すること；ならびに（２）該（ａ）ノックアウト哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物の行動および／または５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体のレベルを評価し、そして比較すること；を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するためか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかもしくは寛解させるのに有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
【００２４】
３.６. （ａ）ｐ１１ノックアウト哺乳動物および（ｂ）うつ病を有していないかまたは有している疑いのない対照哺乳動物に抗うつ剤を投与すること；ならびに（２）該（ａ）ノックアウト哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物の行動および／または５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体レベルを評価し、そして比較すること；を含むうつ病を研究するための、例えば３.４に記載の方法。
３.７. （１）新規抗精神病薬を（ａ）ｐ１１を過剰発現するマウスおよび（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照マウスに投与すること；ならびに（２）該（ａ）トランスジェニックマウスおよび（ｂ）対照マウスのｐ１１のレベルを評価し、そして比較すること；を含む新規抗精神病薬を開発するのに有用なマウスモデル。
【００２５】
３.８. （１）新規精神治療薬を（ａ）３.２または３.３に記載の哺乳動物および（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない同一種の対照哺乳動物に投与すること；ならびに（２）該（ａ）３.２または３.３に記載の哺乳動物および（ｂ）対照哺乳動物のｐ１１レベルを評価し、そして比較すること；を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するためか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかもしくは寛解させるのに有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
３.９. （１）新規抗精神病薬を（ａ）例えば３.２に記載のｐ１１を過剰発現するマウスおよび（ｂ）任意のｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していないかまたは有している疑いのない対照マウスに投与すること；ならびに（２）該（ａ）トランスジェニックマウスおよび（ｂ）対照マウスの行動および／またはｐ１１もしくは５−ＨＴ受容体レベルを評価し、そして比較すること；を含む新規抗精神病薬を開発するのに有用なｐ１１マウスモデル。
【００２６】
３.１０. 測定されるかまたは過剰もしくは過少発現される５−ＨＴ受容体が５−ＨＴ１Ｂ受容体である前記の方法またはモデルのいずれかに記載の方法またはモデル。
３.１１. 測定されるかまたは過剰もしくは過少発現される５−ＨＴ受容体が５−ＨＴ４受容体である前記の方法またはモデルのいずれかに記載の方法またはモデル。
【００２７】
本発明はさらに治療上有効量のｐ１１モジュレーターを投与することを含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者を処置するための方法に関する（方法４）。
４.１. 患者が最初に方法１−１.１のいずれかにしたがって同定される場合の方法４。
４.２. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される、異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である４または４.１に記載の方法。
４.３. 障害がうつ病である４.２に記載の方法。
【００２８】
４.４. 方法３にしたがって、例えば実施態様３.１−３.１１のいずれかを用いて同定されるｐ１１モジュレーターを投与することを含む前記の方法４−４.３のいずれかに記載の方法。
４.５. ｐ１１のモジュレーターが三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤から選択される前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.６. ｐ１１のモジュレーターがアミトリプチリン（商品名：Elavil）、デシプラミン（商品名：Norpramin）、イミプラミン（商品名：Tofranil）およびノルトリプチリン（商品名：Aventyl、Pamelor）から選択される三環系抗うつ剤である４.４に記載の方法。
４.７. ｐ１１のモジュレーターがイミプラミンである４.５に記載の方法。
【００２９】
４.８. ｐ１１のモジュレーターがイソカルボキサジド（商品名：Marplan）；フェネルジン（商品名：Nardil）およびトラニルシプロミン（商品名：Parnate）から選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）である４.４に記載の方法。
４.９. ＭＡＯＩがトラニルシプロミンである４.８に記載の方法。
４.１０. ｐ１１のモジュレーターがシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft）から選択される選択的セロトニン再取り込み阻害剤である方法４.４に記載の方法。
【００３０】
４.１１. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う対象に有効量のｐ１１モジュレーターまたは擬似物質を投与し、ｐ１１発現および／またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体を調節（上方または下方）することを含む該対象を処置するかまたは寛解させる前記の方法４−４.１０のいずれかに記載の方法。
４.１２. 異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を患う対象に有効量のｐ１１モジュレーターまたは擬似物質を投与して、ｐ１１発現を上方調節するかまたはニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ４受容体を補充することを含む該対象を処置するかまたは寛解させる４.１１に記載の方法。
４.１３. 障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される４.１２に記載の方法。
【００３１】
４.１４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.１５. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がｐ１１／５−ＨＴ４受容体関連障害である前記の方法のいずれかに記載の方法。
４.１６. 例えば方法４−４.１５のいずれかにおける、ｐ１１／５−ＨＴ受容体媒介障害を処置するための医薬品の製造における、例えば本明細書に記載されるようなｐ１１モジュレーターの使用。
４.１７. 例えば方法４−４.１５のいずれかにおいてｐ１１／５−ＨＴ受容体媒介障害の処置に使用するためのｐ１１モジュレーターを含む医薬組成物。
【００３２】
別の実施態様では本発明は、ｐ１１を発現する核酸を投与すること、または該患者の脳においてｐ１１の発現を誘起することを含み、ここで該核酸は該患者の脳においてｐ１１を上方調節するか、またはｐ１１発現を増加させる、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者においてｐ１１発現を強化するかまたはｐ１１を上方調節する方法に関する（方法５）。ｐ１１をコードするかまたはその発現を誘起する核酸は好ましくはその核酸を含むベクターにより、または細胞により患者の脳に分配される。かかるベクターは適当な分配系のＤＮＡまたはＲＮＡの形態、例えばリポソームに封入されたＤＮＡ構築物、またはウイルスベクターの形態、例えば複製欠損アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクターでよい。好ましい実施態様では、ベクターは導入遺伝子の感染細胞への組み込みよりもむしろ望ましい導入遺伝子の一過性の発現を提供するウイルスベクター、例えばアデノウイルス由来のベクターである。ベクターは例えばｐ１１をコードするＤＮＡの発現を制御して、標的細胞におけるｐ１１の発現を可能にするプロモーター、例えば構成的プロモーター（例えばＣＭＶプロモーターのような）、組織特異的プロモーター（例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターのような）または誘導プロモーター（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリン誘導プロモーター）に作動可能なように連結されたｐ１１をコードするＤＮＡを含む。例えばウイルスベクターは組織特異的プロモーターの制御下でｐ１１ＤＮＡ構築物を含み、そして複製に必須の一つまたはそれより多い遺伝子（例えばＥ１および／またはＥ３遺伝子）の機能的コピーを欠如して、ヘルパー細胞系または複製に必須の一つまたは複数の遺伝子の生成物が供給されるその他の環境においてのみウイルスが複製できる、組換えにより修飾されたアデノウイルスでよい。ウイルスベクターはまた免疫原性を低減させ、および／またはベクターを望ましい細胞に標的化するための表面修飾を含むこともできる。ＣＮＳにおける遺伝子治療に適当なウイルスベクターは当分野において公知であり、例えばBenitez, et al., 「中枢神経系における標的化遺伝子治療」Current Gene Therapy ３：１２７−１４５（２００３）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるような、例えばＣＮＳ細胞に標的化されたベクターおよび導入遺伝子の発現のための組織特異的または誘導プロモーターを利用するベクターを含む。非ウイルス性核酸分配系は、核酸が細胞膜を通って侵入するのを促すために薬剤に随伴されるかまたは複合化された核酸を含むことができる。かかる非ウイルスベクター複合体の実例には、ＤＮＡの濃縮を促すポリカチオン性薬剤を伴う処方および脂質基盤の分配系、例えばリポソーム基盤の分配系が挙げられる。別の実施態様では、ｐ１１を発現するかまたはその発現を誘起する該核酸は細胞、例えば患者の細胞により発現されるレベルよりも高いレベルでｐ１１を発現する、患者の脳に移植されたニューロン幹細胞により分配される。細胞の供給源は患者またヒトドナーでよい。（ｉ）ｐ１１構築物、（ｉｉ）ｐ１１発現を増強する、天然のｐ１１配列の上流のプロモーター、または（ｉｉｉ）ｐ１１発現を増強するタンパク質をコードする構築物を用いて、ｐ１１発現に関して選択することにより、および／または形質転換、例えばエキソビボ形質転換することにより、移植された細胞におけるｐ１１発現を達成できる。好ましくは、構築物が細胞のゲノム組み込まれるように、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞を安定して形質転換する。細胞が癌性になるか、またはウイルスが患者に感染するか、またはそれ以外に患者に害を及ぼす危険性がある場合、宿主細胞のガンシクロビルに対する感受性を高くして、細胞またはウイルスを容易に破壊できるように、細胞またはウイルスベクターはさらに「安全性遺伝子（safety gene）」、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）を含むことができる。好ましい実施態様では、ｐ１１発現を増強する核酸（例えばｐ１１を発現する構築物を含む細胞またはウイルスベクター）を、例えば海馬領域への脳内投与を介して標的細胞に導入する。核酸を単回用量または多回処置で投与することができる。
【００３３】
それ故に、本発明はさらに以下のような方法を提供する：
５.１. 該方法がｐ１１発現を増加させる方法５。
５.２. 核酸構築物が脳細胞においてｐ１１を発現することができる方法５または５.１。
５.３. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が、例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害、およびアルツハイマー病から選択される異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である方法５、５.１−５.２。
５.４. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が不安障害またはうつ病である方法５、５.１−５.２。
５.５. ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である方法５、５.１−５.２。
【００３４】
５.６. ｐ１１をコードする該核酸がｐ１１をコードするＤＮＡを含む複製欠損アデノウイルスベクターにより分配される方法５、５.１または５.５。
５.７. ｐ１１をコードするＤＮＡが組織特異的プロモーター、例えばＮＳＥプロモーターの制御下にある方法５.６。
５.８. ｐ１１をコードする該核酸がｐ１１構築物で形質転換された幹細胞により分配される方法５、５.１または５.５。
５.９. ｐ１１の該核酸が脳内投与により導入される方法５、または５.１−５.８のいずれか。
５.１０. ｐ１１の該核酸が海馬に導入される方法５、または５.１−５.８のいずれか。
【００３５】
本明細書で使用される際には、および添付の請求の範囲では、単数表現「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特記しない場合、複数の言及を含む。故に例えば「抗体」に対する言及は、一つまたはそれより多い抗体および当業者に公知のその均等物等に対する言及である。ｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体媒介障害の処置には複数のかかる障害の処置が含まれ得る。
本明細書では「ｐ１１」なる用語は、限定するものではないが、ヒトまたは任意のその他の種からの前記のいずれかのｐ１１配列またはフラグメントを含有する部分形態、アイソフォーム、前駆体形態、全長ポリペプチド、融合タンパク質を含むｐ１１ポリペプチドの任意のおよび全ての形態を指す。
【００３６】
本明細書では「ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害」なる語句は、ｐ１１タンパク質およびその５−ＨＴ受容体、特に５−ＨＴ１Ｂまたは５−ＨＴ４受容体の動員により媒介される、関連する、引き起こされる、影響を受ける、引き金となる、またはそれを伴う任意の障害を指す。ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害には、限定するものではないが精神障害（例えばうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、薬物依存および強迫性障害）、睡眠障害（例えば不眠症）、摂食障害（例えば過食症）、性機能障害および胃腸障害（例えば過敏性腸症候群）が含まれ得る。本明細書では「異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害」とはうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害もしくは注意欠陥多動性障害、またはアルツハイマー病、特にうつ病のような障害を指す。同様に「異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害」とは、躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害のような障害を指す。
【００３７】
「ｐ１１モジュレーター」なる語句は、ｐ１１タンパク質をコードする遺伝子の発現、ｐ１１遺伝子もしくはｃＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、ｐ１１ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳、ｐ１１タンパク質の翻訳後修飾、ｐ１１タンパク質の細胞もしくは細胞外局在化、または類似の細胞におけるｐ１１活性と相対して、細胞膜内もしくは膜上または細胞内に局在するｐ１１の量を変化させる（増加させるかまたは減少させるかのいずれか）ことができる任意の物質または化合物（例えば本明細書に記載されるような小型分子またはポリペプチド）または処置の方法（例えば電撃療法）を指す。「ｐ１１モジュレーター」なる用語はまた、ｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力に影響を及ぼす（正または負のいずれかに）ことができる任意の物質を指す。うつ病のような異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するのに有用なｐ１１モジュレーターの実例には、三環系抗うつ剤（例えばイミプラミン（Tofranil（登録商標））、アミトリプチリン（ELAVIL（登録商標）、ENDEP（登録商標）、TRYPTANOL（登録商標））、クロミプラミン（ANAFRANIL（登録商標））、デシプラミン（NORPRAMIN（登録商標）、PERTOFRANE（登録商標））、ロフェプラミン（GAMANIL（登録商標）、LOMONT（登録商標））、ノルトリプチリン（PAMELOR（登録商標））、トリミプラミン（SURMONTIL（登録商標）））が挙げられる。低レベルのｐ１１に関連する障害（例えばうつ病）を処置するかまたは寛解させるのに有用なその他のモジュレーターにはモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）（例えばトラニルシプロミン（Parnate）、イソカルボキサジド（Marplan）、モクロベミド（Aurorix、Manerix、MOCLODURA（登録商標））またはフェネルジン（Nardil））および選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えばシタロプラム（商品名：Celexa）；エスシタロプラム（商品名：Lexapro）；フルオキセチン（商品名：Prozac）；パロキセチン（商品名：Paxil、Pexeva）；セルトラリン（商品名：Zoloft））が含まれる。
【００３８】
従来のスクリーニングアッセイ（インビトロおよびインビボの双方）を使用してｐ１１活性および／またはｐ１１遺伝子発現を阻止または誘起するモジュレーターを同定することができる。一つのかかるアッセイは、ｐ１１結合部位の下流にマーカー遺伝子（例えばルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を含むレポーター構築物でトランスフェクトされた細胞を候補モジュレーター化合物と接触させ、そしてマーカータンパク質の発現における変化を測定し、そしていずれのモジュレーターとも接触していないトランスフェクトされた細胞試料と比較する遺伝子レポーターアッセイである。マーカータンパク質発現を阻止または誘起のいずれかを行う候補モジュレーターは、ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な薬物として同定される。マーカータンパク質発現を阻止する候補モジュレーターは、異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害の処置のための有用な薬物候補であり、一方マーカータンパク質発現を誘起する候補モジュレーターは異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害の処置のための有用な薬物候補であろう。
【００３９】
ｐ１１モジュレーターには、例えば遊離の、もしくは薬学的に許容される塩形態の天然もしくは非天然化学化合物、センスもしくはアンチセンスｐ１１オリゴヌクレオチド、ｐ１１に対する阻止抗体、ｐ１１受容体遮断ペプチド、ｐ１１アンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが含まれ得る。本明細書で使用される際には「アンチセンス」なる用語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を指す。それ故に「ｐ１１アンチセンスポリヌクレオチド」とはｐ１１ ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的である任意のヌクレオチド配列を指す。機能的には、ｐ１１アンチセンスポリヌクレオチドは細胞におけるｐ１１タンパク質の発現を低下させることができる。「アンチセンス鎖」なる用語は「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関連して用いられる。相補鎖の合成を許容するウイルスプロモーターに対して逆配向で目的の（複数の）遺伝子をライゲートすることによる合成を含む任意の方法によりアンチセンス分子を生成することができる。一度細胞に導入されると、この転写された鎖は細胞により生成された天然の配列と組み合わされて二重鎖を形成する。次いでこれらの二重鎖はさらなる転写または翻訳のいずれかを遮断する。「負」なる指定は時にアンチセンス鎖に関して用いられ、そして「正」は時にセンス鎖に関して用いられる。同様に、「センス」なる用語は本明細書で使用される際には、翻訳されて特異的ポリペプチドまたはそのフラグメントを生成することができるヌクレオチド配列を指す。それ故に「ｐ１１センスポリヌクレオチド」は翻訳されてｐ１１ポリペプチドまたはそのフラグメントを生成することができる任意のヌクレオチド配列を指す。機能的には、ｐ１１センスポリヌクレオチドは細胞におけるｐ１１タンパク質の発現を増加させることができる。
【００４０】
具体的には、核酸レベルでｐ１１の発現を阻止する物質には、ｐ１１核酸の適切なヌクレオチド配列を指向するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが含まれ得る。当業者による従来の技術を用いて、過度な負担または実験を伴わずにこれらの阻止分子を創成することができる。例えば本明細書で論じたポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域に対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡ、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンを設計することにより、遺伝子発現の修飾（例えば阻止）を得ることができる。例えば転写開始部位から、例えば出発部位から−１０位置と＋１０位置の間で誘導されるオリゴヌクレオチドを使用できる。それにもかかわらず、ｍＲＮＡに強力にハイブリダイズするものを創成するために遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計し、そして当業者によく知られた標準的なアッセイ手順によりかかる適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、そして同定することができる。
【００４１】
同様に、遺伝子発現の発現阻止を「三重らせん」基盤の塩基対形成法を用いて達成することができる。Gee, J.E. et al.（１９９４）In：Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。転写物のリボソームへの結合を防御することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するようにこれらの分子を設計することもできる。リボザイム、酵素性ＲＮＡ分子を使用してＲＮＡの特異的切断を触媒することにより遺伝子発現を阻止することもできる。リボザイム作用のメカニズムはリボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。用いることができる実例には、遺伝子配列、例えばｐ１１に関する遺伝子のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的および有効に触媒するように設計することができる、操作された「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子が挙げられる。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初に、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位に関する標的分子を読み取ることにより同定される。一度同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する１５個と２０個の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを作動不能にし得る二次構造的様相に関して評価することができる。Grassi and Marini, Annals of Medicine ２８：４９９−５１０（１９９６）；Gibson, Cancer and Metastasis Reviews １５：２８７−２９９（１９９６）；Cotten et al., EMBO J. ８：３８６１−３８６６（１９８９）。ＲＮＡ存在度または活性を修飾するためにＲＮＡアプタマーを細胞に導入するかまたは発現させることもできる。ＲＮＡアプタマーは特異的にその翻訳を阻止できるＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ（Good et al., Gene Therapy ４：４５−５４（１９９７））のようなタンパク質に特異的なＲＮＡリガンドである。遺伝子発現の遺伝子特異的阻止を従来の二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成することもできる。かかる技術の記載を第ＷＯ９９／３２６１９号（その全てを出典明示により本明細書の一部とする）に見出すことができる。
【００４２】
核酸分子の合成に関する当分野において公知の任意の方法により、本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムを調製することができる。これには固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。これに代えて、本明細書で論じたポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によりＲＮＡ分子を作成することができる。かかるＤＮＡ配列をＴ７またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて広範な種類のベクターに組み込むことができる。これに代えて、構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するｃＤＮＡ構築物を細胞系、細胞または組織に導入することができる。
【００４３】
二つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を一緒にアニーリングすることにより（その一つは標的ｍＲＮＡの一部と対合する）（Fire et al., 米国特許第６５０６５５９号）、または必要な二本鎖部分を生成するためにそれ自体に折り重ねられた単一のヘアピンＲＮＡ分子の使用により（Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：６０４７−５２（２００２））本発明のｓｉＲＮＡ分子を作成することができる。ｓｉＲＮＡ分子を化学的に合成するか（Elbashir et al., Nature ４１１：４９４−９８（２００１））または一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用してインビトロ転写により生成することができる（Yu et al., supra）。これに代えて、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する（複数の）発現ベクターを使用して、ｓｉＲＮＡ分子を一過性で（Yu et al., supra；Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：５５１５−２０（２００２））、または安定して（Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：１４４３−４８（２００２））生成することができる。最近では、効率的な、および配列特異的な様式でのヒト一次細胞における標的ｍＲＮＡのレベルの低下が、ヘアピンＲＮＡ（これはさらにｓｉＲＮＡにプロセシングされる）を発現するアデノウイルスベクターを使用して実証される（Arts et al., Genome Res. １３：２３２５−３２（２００３））。
【００４４】
本明細書で使用される際には「ｐ１１活性」なる語句はｐ１１の任意の直接的な生化学的活性または、ｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体との相互作用に（陽性にまたは陰性に）影響を及ぼすようにｐ１１に関連する間接的な活性を指す。５−ＨＴ１Ｂ受容体とのｐ１１活性を増加させるモジュレーターはｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力を増大させるようにｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体への会合を増加させる任意の物質でよい。逆に５−ＨＴ１Ｂ受容体とのｐ１１活性を阻止するかまたは低下させるモジュレーターは、ｐ１１タンパク質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力を低下させるようにｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体との間の相互作用を遮断するかまたは低下させる任意の物質でよい。
【００４５】
「ｐ１１擬似物質」なる用語は構造、機能、特性および／または活性においてｐ１１タンパク質を擬似し、それによりニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体利用性を調整、調節または増大させる天然もしくは非天然物質またはポリペプチドまたはその任意のフラグメントを指す。ｐ１１擬似物質は全体的または部分的にｐ１１を擬似し得る。
【００４６】
「対象」なる用語は任意のヒトまたはヒト以外の生物を指す。
「対照対象」とはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の障害、症候群、疾患、症状および／または病徴を有していない、および／または有している疑いのない任意のヒトまたはヒト以外の生物を指す。
「生物学的試料」なる用語には、例えばｐ１１タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡもしくはポリヌクレオチドまたは前記のいずれかの任意のフラグメントを含有する生物、体液、老廃物、細胞もしくはその細胞の一部、細胞系、生検、組織培養またはその他の供給源から得られる生物学的材料を含む任意の試料が含まれ得る。
【００４７】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の「陽性診断」とはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、試験されている対象が異常なレベルのｐ１１を呈する症状を指す。異常なレベルとは対照対象におけるレベルよりも高いまたは低いレベルを指す。例えばうつ病の陽性診断の対象は、うつ病および／またはその病徴を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、低下したレベルのｐ１１を呈する。一方不安障害状態の陽性診断の対象は、不安障害および／またはその病徴を有していない、および／または有している疑いのない対照対象と比較して、上昇したｐ１１発現を呈する。
【００４８】
ｐ１１を過剰発現する型の対象から得られた組織または細胞の試料中のｐ１１タンパク質を検定することによりｐ１１のレベルを決定することができる。例えば単球および／またはリンパ球を使用することができる。同様に試料中のｐ１１ ｍＲＮＡに関して検定することによりｐ１１レベルを決定することもできる。例えば従来のノーザン分析または市販により入手可能であるマイクロアレイを含む当業者によく知られた方法を用いてｐ１１遺伝子発現（例えばｍＲＮＡレベル）を決定することができる。加えて、被験化合物のｐ１１阻止の効果および／または関連する調節タンパク質レベルをＥＬＩＳＡ抗体基盤アッセイまたは蛍光標識反応アッセイで検出することができる。参照、例えば対照対象または対照集団（または対照集団における事前の測定に基づいた参照標準）と比較して、対象における異常なレベルのｐ１１タンパク質またはｍＲＮＡはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する。それ故に、参照と比較して対象において上昇したｐ１１のレベルは高レベルのｐ１１に関連する障害、例えば躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性障害、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害（例えばＩＢＤ）の陽性診断を構成する。一方、対照対象のレベルと比較して抑制されたまたは低下したｐ１１のレベルは低レベルのｐ１１に関連する障害、例えばうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害の陽性診断を構成する。好ましい実施態様では、本発明はうつ病を患う対象におけるｐ１１レベルを検定すること、およびかかるレベルを対照対象におけるｐ１１レベルと比較することを含むうつ病を患う対象における診断方法を包含し、ここで対照対象のレベルと比較して、該対象において抑制されたｐ１１のレベルはうつ病の陽性診断を構成する。
【００４９】
本明細書で使用される際には、「抗体」なる用語は、エピトープ決定基に結合できるインタクトな分子およびＦａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのようなそのフラグメントを指す。免疫抗原として目的の小型ペプチドを含有するインタクトなポリペプチドまたはフラグメントを用いてｐ１１ポリペプチドに結合する抗体を調製することができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドまたはペプチドをＲＮＡの翻訳から誘導するか、または化学的に合成することができ、そして所望によりキャリアタンパク質に抱合させることができる。ペプチドに化学的に結合させる一般的に使用されるキャリアには、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンが含まれる。次いで結合したペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラットまたはウサギ）を免役する。
【００５０】
患者のための治療の最適化に関する検討材料のための因子には、処置されている特定の症状、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、活性化合物の分配の部位、活性化合物の特定の型、投与の方法、投与のスケジュール、および医師に公知のその他の因子が含まれる。投与される活性化合物の治療上有効量はかかる検討材料により支配され、そしてｐ１１媒介障害、好ましくはうつ病の処置に必要な最低量である。
【００５１】
ｐ１１に対する適当な抗体または関連する調節タンパク質を商業的供給源から入手できるか、または従来の方法にしたがって生成することができる。例えば一つまたはそれより多い差次的に発現される遺伝子エピトープを特異的に認識できる抗体の生成のための方法が本明細書にて記載される。かかる抗体には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。
【００５２】
本明細書で論じたｐ１１ポリペプチドに対する抗体の生成のために、そのポリペプチドまたはその一部を種々の宿主動物に注射することにより免役することができる。かかる宿主動物には、限定するものではないがウサギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主種に依存して、限定するものではないが、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアミン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムのような有用な可能性のあるヒトアジュバントを含む種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができる。
【００５３】
ポリクローナル抗体は標的遺伝子生成物、またはその抗原性機能的誘導体のような抗原で免役された動物の血清から誘導された抗体分子の異種性集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、前記されたもののような宿主動物を、これもまた前記されたようなアジュバントを追加されたポリペプチドまたはその一部での注射により免役することができる。
【００５４】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体を、培養中の連続細胞系による抗体分子の生成を提供する任意の技術により得ることができ、かかる技術は当分野において周知である。かかる抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免役グロブリンクラス、好ましくはＩｇＧでよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマまたは形質転換された細胞系をインビトロまたはインビボで培養することができる。これに代えて、一本鎖抗体の生成のための記載された技術を、差次的に発現される遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドを生じさせることより一本鎖抗体を形成することができる。
【００５５】
標準的なＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析およびインビトロまたはインビボで用いられる標準的な撮像技術を用いて本明細書に記載される抗体の検出を達成することができる。抗体を検出可能な物質に結合（すなわち物理的連結）させることにより検出を促すことができる。検出可能な物質の実例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。適当な酵素の実例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適当な補欠分子族複合体の実例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適当な蛍光材料にはウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の実例にはルミノールが挙げられ；生物発光材料の実例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、ならびに適当な放射性材料の実例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００５６】
例えば典型的な前進アッセイ（forward assay）では、未標識抗体を固体基質に固定し、そして試験される試料を結合分子と接触させる。適当な期間のインキュベーションの後、抗体−抗原二成分複合体の形成を可能にするのに十分な期間、検出可能なシグナルを誘起することができるレポーター分子で標識された第二の抗体を加え、そして抗体−抗原−標識抗体の三成分複合体を形成できるように十分な時間を見込んでインキュベートする。次いで任意の未反応材料を洗い流し、そしてシグナルの観察により抗原の存在を決定するか、または公知の量の抗原を含有する対照試料と比較することにより定量することができる。前進アッセイの変法には、試料および抗体の双方を同時に結合抗体に加える同時アッセイ、または標識抗体および試験される試料を最初に組み合わせ、インキュベートし、そして未標識表面結合抗体に加える逆行アッセイ（reverse assay）が含まれる。これらの技術は当業者に周知であり、そして軽微な変更の可能性は容易に明らかになろう。本明細書で使用される際には「サンドイッチアッセイ」は基本的な２部位技術における全ての変法を包含すると意図される。本発明のイムノアッセイに関しては、唯一の限定因子は、標識抗体がｐ１１ポリペプチドもしくは関連する調節タンパク質またはそのフラグメントに特異的である抗体であるという点である。
【００５７】
最も一般的に用いられるレポーター分子は酵素、フルオロフォアまたは放射性核種含有分子のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により酵素を第二の抗体に抱合させる。しかしながら容易に認識されるように、広範な種類の様々なライゲーション技術が存在し、それは当業者に周知である。一般的に用いられる酵素には、とりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に用いられる基質は一般的に対応する酵素の加水分解時の検出可能な色の変化の生成に関して選択される。例えばｐ−ニトロフェニルリン酸がアルカリホスファターゼ抱合体との使用に適当であり；ペルオキシダーゼ抱合体に関しては１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。前記された色素生成基質よりもむしろ蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を用いることも可能である。次いで適切な基質を含有する溶液を三次複合体に加える。基質は第二抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生じ、それを通常分光光度法によりさらに定量して血清試料中に存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価を得ることができる。
【００５８】
これに代えて、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光化合物をその結合能力を改変することなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光の照明により活性化されると、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子において励起状態を誘起し、続いて特徴的なより長い波長で光を発光する。発光は光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において非常によく確立されており、そして本方法に関して特に好ましい。しかしながら放射性同位元素、化学発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。要求される用途に適合させるために手順を変える方法は当業者には容易に明らかになろう。
【００５９】
抗体が治療用途を意図される場合、それらはその免疫原性を最小にするようにヒト定常領域を有するのが好ましい。適切な抗原特異性のドナー抗体分子からの可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体分子の定常領域をコードするＤＮＡと一緒にスプライシングすることによりキメラ抗体を作成する。抗体をさらに修飾して、ヒト以外の残基を除去するように加えて修飾されたヒト化抗体を提供することができる。ヒト化抗体は大部分でヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基を、望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基と置換する。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基をヒト以外の対応する残基により置換する場合もある。ヒト化抗体はレシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれでも見出されない残基を含み得る。これらの修飾を行って抗体の性能をさらに精緻にし、そして最適化する。一般的にヒト化抗体は少なくとも一つの、そして典型的には二つの可変ドメインを含み、ここでヒト以外の免疫グロブリンのものに対応する全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域、および全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた典型的にはヒト免疫グロブリンである免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むのが最適であろう。これに代えて、ヒト以外の供給源に由来するが、完全なヒト免疫グロブリン遺伝子を用いる抗体を、例えばファージディスプレイ技術またはトランスジェニック動物、例えばヒトＩｇＶおよびＩｇＣ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて作成でき、そしてかかる抗体が呈する免疫原性は最小限であるはずである。
【００６０】
「治療上有効量」とは、本明細書で使用される際にはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分な薬物の量を指す。例えばｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーターの治療上有効量は、ｐ１１発現を誘起もしくは阻止のいずれか、またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体レベルを調節（上方または下方のいずれか）するのに十分な量である。それ故にうつ病の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーターの治療上有効量は、ｐ１１発現を誘起するか、またはニューロン細胞膜に５−ＨＴ１Ｂ受容体を補充するｐ１１の能力を増大させるかのいずれかに十分な量である。逆に不安障害の病理学的影響を処置するかまたは寛解させるのに十分なｐ１１モジュレーター治療上有効量は、ｐ１１発現を阻止するかまたはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体を下方調節するかのいずれかに十分な量であろう。静脈内、皮下、筋肉内、経皮または脳内投与を含む当分野において公知の方法を介してｐ１１モジュレーターを投与することができる。投与は注射によるように急速に、または緩徐な注入によるような時間をかけて、または徐放処方の投与でよい。
【００６１】
「ｐ１１ノックアウト」なる語句は全体的もしくは部分的欠陥、改変もしくは変異を有するか、またはｐ１１遺伝子において欠けているかもしくは欠損しているＤＮＡ配列を指す。それ故に「ｐ１１ノックアウトマウス」または「ｐ１１ノックアウトトランスジェニックマウス」とは、該マウスに導入されたＤＮＡが、ｐ１１タンパク質を発現する遺伝子において欠陥、欠損、変異または改変を含有するマウスを指す。ｐ１１遺伝子における欠陥または欠損の結果として、ｐ１１ノックアウトマウスはニューロン細胞膜で有する５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少なく、および／またはニューロン細胞膜での５−ＨＴ１Ｂ受容体の低下を呈するか、もしくは５−ＨＴ１Ｂ受容体が存在しないことを示し、それにより野生型マウスと比較してうつ病様の表現型を呈する。「ノックアウト」なる用語は元来の遺伝子と比較していずれかの場所での１ヌクレオチドから全遺伝子の欠失までの偏差を指し得る。標的相同組換えのような当分野において公知の任意の技術を用いてノックアウトマウスを作成することができる。
【００６２】
「組換え」なる用語は、その天然または内因性供給源から単離されており、そして化学的または酵素的のいずれかで修飾されて自然発生フランキングヌクレオチドを欠失するか、または自然発生しないフランキングヌクレオチドを提供するＤＮＡを指す。フランキングヌクレオチドは記載された配列またはヌクレオチドの部分配列から上流または下流のいずれかにあるこれらのヌクレオチドである。
【００６３】
「ベクター」は本明細書で使用される際には望ましい細胞または組織に組換え核酸を分配するいずれかのものであり、例えば細胞を感染、トランスフェクト、または一過性もしくは持続的に形質導入することができるウイルスである。ベクターは裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合された核酸でよいと認識される。ベクターは場合によってはウイルス性もしくは細菌性核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜（例えば細胞膜、ウイルス性脂質エンベロープ等）を含む。本出願の目的に関しては、ベクターはまた組換え核酸を含む細胞でもよい。ベクターは典型的には目的の核酸をプロモーターの制御下に置く発現カセットを含み得るか、または単純にその発現が望まれる遺伝子の上流に挿入を達成するための標的配列によりフランキングされたプロモーターを含み得ると認識される。ベクターには、限定するものではないが、ＤＮＡのフラグメントが結合し、そして複製できるようになるレプリコン（例えばプラスミド、バクテリオファージ）が含まれる。故にベクターには限定するものではないがＲＮＡ、自己複製環状ＤＮＡ（プラスミド）が含まれ、そして発現および非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養が「発現ベクター」の宿主であると記載される場合、これには、染色体外環状ＤＮＡおよび宿主の（複数の）染色体に組み込まれているＤＮＡの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持されている場合、ベクターは有糸分裂の間に、自律的構造として細胞により安定して複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれ得るかのいずれかである。
【００６４】
「コードする核酸」なる語句は転写および／または翻訳された場合に特異的タンパク質またはペプチドを発現するコドンを含有する核酸を指す。核酸配列は加えてフランキング配列、イントロン、および／または続いて翻訳後切断されるペプチドをコードする配列を含み得る。核酸配列にはＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列の双方が含まれる。核酸配列には全長核酸配列および全長配列から誘導される非全長配列の双方が含まれる。配列には天然の配列および、例えば特異的な宿主細胞におけるコドン優先性に配列を適合させるために縮重コドンを利用する配列が含まれるということがさらに理解されよう。
「核酸」は本明細書で使用される際にはＤＮＡまたはＲＮＡでよい。また核酸には、ポリメラーゼにより正確に解読されることを許容し、そしてその核酸によりコードされるポリペプチドの発現を改変しない、修飾されたヌクレオチドも含まれ得る。
【実施例】
【００６５】
実施例
実施例１
酵母２ハイブリッドスクリーニング
５−ＨＴ１Ｂ受容体の機能をよりよく理解するために、この受容体の第三細胞内ループを酵母２ハイブリッドスクリーニングのベイトとして使用する。ラット５−ＨＴ１Ｂ受容体の第三細胞内ループ（アミノ酸２２６−３１１）を全長ｃＤＮＡラット脳ライブラリーからＰＣＲ増幅し、そしてＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質として発現するためにベイトｐＡＳ２由来ベクターのＮｃｏ Ｉ／Ｓａｌ部位にサブクローニングする。酢酸リチウム法を用いて５−ＨＴ１Ｂ受容体−ベイトプラスミドを酵母株ＣＧ１９４５に形質転換する。抗ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン抗体を用いて免疫ブロットにより融合タンパク質の大きさおよび発現レベルを確認する。ｐＡＣＴ２ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを酵母株Ｙ１８７に形質転換する。ベイトおよびプレイ形質転換体をＹＰＤ培地上で対にし、そしてヒスチジンレポーター遺伝子の発現に関して選択的な培地（−ＬＷＨ）にプレートする。ｐＡＣＴ２ラット脳ｃＤＮＡライブラリーから２４４×１０６二倍体クローンをスクリーニングする。この培地で成長させた後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシドオーバーレイアッセイを実施する。３００を超えるクローンが選択培地で成長し、そしてβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に関して陽性である。酵母抽出物を二重陽性クローンから調製する。プレイインサートをＰＣＲ（５’−ＣＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡ ＧＧＧＡＴＧ−３’および５’−ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣ−３’）により増幅し、そしてプレイベクターオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣ−３’）を用いてシークエンシングする。ＢＬＡＳＴ検索によりｐ１１を主要プレイとして同定する。ｐ１１プレイプラスミドクローンを酵母から選択的にレスキューし、ＤＮＡ増幅のために大腸菌に形質転換し、そして相互作用の特異性を確認するために酵母株Ｙ１８７に（ｉ）元来の５−ＨＴ１Ｂ受容体−ベイトベクター、（ｉｉ）トランス活性化を確認するためのベイト対照ベクター、（ｉｉｉ）二つのその他の無関係のベイト構築物、ｐＲＰ２１およびＣΔ１１５、または（ｉｖ）５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ６、Ｄ１またはＤ２受容体の第三細胞内ループに相当するベイト構築物で再形質転換する。５−ＨＴ１A（アミノ酸２１８−３４５）、５−ＨＴ２A（アミノ酸２３６−３０２）、５−ＨＴ５A（アミノ酸２３３−２９５）、５−ＨＴ６（アミノ酸２０９−２６５）、Ｄ１（アミノ酸２５６−３１２）およびＤ２（アミノ酸２１１−３４３）受容体の各々に対応するベイトをラット脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅により作成し、そしてｐＡＳ２由来のベクターにサブクローニングする。これらのベイトの各々を酵母にｐ１１プレイ構築物と共に同時形質転換し、そして−ＬＷまたは−ＬＷＨ培地およびＸ−ｇａｌオーバーレイアッセイを用いることにより相互作用を分析する。全ての同時形質転換体を非選択培地（−ＬＷ）対照プレートで成長させた。選択培地（−ＬＷＨ）ではｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体との陽性相互作用が検出されるが、その他のいずれのベイトとも相互作用は検出されない。
【００６６】
２９個の二重陽性プレイクローンのうち、２６個がｐ１１に関する遺伝子をコードする。このアッセイでｐ１１は５−ＨＴ１Ｂ受容体と相互作用するが、５−ＨＴ１A、５−ＨＴ２A、５−ＨＴ５A、５−ＨＴ６、ドーパミンＤ１またはドーパミンＤ２受容体、二つの無関係のベイト（Ｃデルタ１１５およびｐＲＰ２１）、または空のプラスミドとは相互作用せず、それはｐ１１の５−ＨＴ１Ｂ受容体との会合の特性を示している。
【００６７】
実施例２
免疫共沈降
内因性ｐ１１（Ｓ１）を含有するＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ培地中６０％コンフルエンスまで成長させ、そしてリポフェクタミンを用いて製造者のプロトコールにしたがってｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲ−Ｖ５または空のプラスミド構築物でトランスフェクトする。トランスフェクションの後、細胞抽出物を４℃で可溶化する（５０ｍＭ Tris、ｐＨ７.４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＥＧＴＡ／０.１％Tritonおよびプロテアーゼ阻害剤中）。細胞抽出物を抗Ｖ５モノクローナル抗体で免疫沈降し、プロテインＧと共にインキュベートし、そして完全に洗浄する。その他の実験では、野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの大脳皮質からの脳組織を可溶化バッファー中４℃でホモジナイズする。脳抽出物を.ポリクローナル５−ＨＴ１Ｂ受容体抗体で免疫沈降し、プロテインＡと共にインキュベートし、そして完全に洗浄する。細胞および脳組織からの免疫沈降をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、そしてＰＶＤＦ膜に移す。ｐ１１に対するマウスモノクローナル抗体（１／１００）を用いて免疫ブロッティングを実施する。マウスＩｇＧに対して指向するＨＲＰ連結二次抗体と共にインキュベートすることにより抗体結合を検出し、化学発光が増強される。
ｐ１１はＨｅＬａ細胞および脳組織において５−ＨＴ１Ｂ受容体と免疫共沈降する。
【００６８】
実施例３
免疫蛍光
ＨｅＬａ細胞をｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲまたはｐｃＤＮＡ３.１−Ｖ５構築物でトランスフェクトする。トランスフェクション後３６時間の細胞を４％パラホルムアルデヒド／０.０１Ｍ ＰＢＳで１０分間固定する。ＰＢＳ中１０％ＢＳＡと共にインキュベートすることにより非特異的染色を遮断する。抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１／５００）および抗マウスｐ１１抗体（１／１０００）、続いてAlexa Fluor５６８標識ヤギ抗マウス二次抗体（１／５００）と共にインキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体およびｐ１１を可視化する。ＰＢＳで洗浄した後、Gel／Mountを用いてスライドにカバースリップをマウントする。レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の画像を獲得する。
免疫蛍光は細胞表面のｐ１１と５−ＨＴ１Ｂ受容体の間での顕著な共局在化を示す。
【００６９】
実施例４
インサイチュハイブリダイゼーション実験
ロックフェラー大学、カロリンスカ研究所および国立衛生研究所の実験動物保護委員会からのガイドラインにしたがって全ての動物実験を実施する。成熟雄Sprague Dawleyラットからの脳を用いてｐ１１遺伝子発現の局所分布および５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子発現とそれの共分布を決定する。いくつかの実験に関してはｐ１１ ＫＯマウスからの脳およびその野生型の対応物を使用する。ｐ１１ ｍＲＮＡ発現に及ぼす向精神薬処置の効果を研究するために、野生型成熟雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスをベヒクル、イミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、ジアゼパム（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）、トラニルシプロミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）またはリスペリドン（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）の単回注射または反復注射（１日１回、１４日間）で処置する。動物を最後の注射の１時間後に屠殺する。ｐ１１発現に及ぼす電撃療法（ＥＣＴ）の影響を研究するために、雄Spraque Dawleyラット（２００ｇ）を、耳クリップ電極を介して毎日１０日間ＥＣＴに暴露し（４５ｍＡ；０.３秒）、そして最後の刺激の１８時間後に屠殺する。対照動物に、ラットの耳に電極をクリップするが電流を適用しない偽処置を施す。
イミプラミンおよびトラニルシプロミンで１４日間の処置の後、ならびに電撃療法の反復の後、前脳でｐ１１ ｍＲＮＡが上方調節されるが、ハロペリドール、リスペリドンまたはジアゼパムでは上方調節されない。
【００７０】
実施例５
マウスうつ病モデルならびに正常およびうつ病のヒトにおけるｐ１１タンパク質レベル
野生型成熟雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスをベヒクルまたはイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）で１日１回１４日間処置し、そして最後の注射の１時間後に屠殺する。雄Spraque Dawleyラットを、耳クリップ電極を介して毎日１０日間ＥＣＴに暴露し（４５ｍＡ；０.３秒）、そして最後の刺激の１８時間後に屠殺する。成熟雌無力（helpless）Ｈ／Rouenマウスおよび非無力ＮＨ／Rouenマウスを屠殺する。これらの三つの異なる処置群および対応する対照から、前頭皮質を切り裂き、そして凍結する。
【００７１】
正常対照および大うつ病を患う患者のヒト帯状皮質からの新鮮凍結組織をStanley Foundation Neuropathology Consortiumから入手する。凍結皮質を１％ ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によりタンパク質を決定するためにホモジネートの小アリコートを保持する。
【００７２】
１０−２０％グラジエントアクリルアミドゲルを用いて均等量のタンパク質を処理する。ｐ１１に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体（ヒト試料に関して１／１０００、およびげっ歯類試料に関して１／２００）ならびにアクチンに対するポリクローナル抗血清（１／１０００）のいずれかで免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。ｐ１１のレベルをアクチンのレベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００７３】
うつ病の遺伝的マウスモデルにおけるｐ１１ ｍＲＮＡの調節を研究するために、成熟雌および雄無力Ｈ／Rouenマウスおよび非無力ＮＨ／Rouenマウスからの前脳組織を比較する。ｐ１１ ｍＲＮＡおよびタンパク質はＨ／Rouenマウスにおいてより著明に低い。類似の結果が双方の性で見出される。
【００７４】
正常対照および大うつ病を患う患者のヒト帯状皮質の４０μｍ厚のクリオスタット切片をStanley Foundation Neuropathology Consortiumから入手する。双方の性（正常およびうつ病群の双方で女性６人および男性９人）、ならびに年齢２９−６８歳（正常）および３０−６５歳（うつ病）からの試料を分析する。うつ病の患者の疾患の期間は１から４２年で異なる。うつ病の個体のうち７人が自殺した。脳組織を凍結する前の死後の脳組織の間隔は８−４２時間（正常）および７−４７時間（うつ病）であり、そして組織のｐＨは５.８−６.６（正常）および５.９−６.５（うつ病）である。ラット５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１１５９−１４２０、マウスまたはヒトｐ１１遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１−２９３、およびラットｐ１１遺伝子のコード化配列のヌクレオチド１−２８７の各々のＰＣＲ増幅によりインサイチュハイブリダイゼーションプローブを作成する。様々なＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングする。ヒト組織に関する研究を除いて、全研究用に１２μｍ厚のクリオスタット切片を作成する。前記されたようにラット５−ＨＴ１Ｂ受容体遺伝子またはマウス、ラットもしくはヒトｐ１１遺伝子に対応するｃＤＮＡからのインビトロ転写物により調製された［−３５Ｓ］ＵＴＰ標識リボプローブで切片をハイブリダイズする（Ｓ５）。ハイブリダイゼーションの後、切片をBiomax ＭＲフィルムに７から２４日間暴露し、そしてＮＩＨ Image１.６３ソフトウェアを用いて分析する。特記しない場合、縁前方／前帯状皮質で分析を行う。いくつかの切片を細胞分析用にIlford Ｋ５エマルジョンに浸漬する。８週後、切片を展開し、ニッスル染色し、そしてマウントする。
【００７５】
Ｈ／Rouenマウスに類似して、単極性大うつ病障害を患っていた患者の前帯状皮質においてｐ１１ ｍＲＮＡおよびタンパク質が下方調節される。
【００７６】
実施例６
ｐ１１／５−ＨＴ１Ｂ受容体同時トランスフェクション実験
存在する場合、低い天然ｐ１１を含有するＣＯＳ７細胞をｐ１１（ｐｃＤＮＡ３.１−ｐ１１）、５−ＨＴ１Ｂ（ｐｃＤＮＡ３.１−５−ＨＴ１ＢＲ−Ｖ５）、ドーパミンＤ１受容体（ｐｃＤＮＡ３.１−Ｄ１Ｒ−Ｖ５）、または空のプラスミドでトランスフェクトする。プレートされたＣＯＳ７細胞を、１ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを含有する培地と共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞をＴＢＳで濯いでビオチン反応をクエンチする。修飾ＲＩＰＡバッファー（１％Triton Ｘ−１００、０.１％ＳＤＳ、０.５％デオキシコール酸、５０ｍＭ ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌロイペプチン）３００μl中で細胞を溶解する。ホモジネートを１４０００ｇで、４℃で１５分間遠心する。上澄１５μlを除去して５−ＨＴ１Ｂ受容体の全レベルを測定する。残りの上澄を５０％Neutravidinアガロース１００μlと共に４℃で３時間インキュベートし、そして短時間遠心する。細胞質５−ＨＴ１Ｂ受容体を含有する上澄を収集する。その後、アガロースビーズをＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、そして最後の短時間遠心の後、結合タンパク質をＳＤＳ試料バッファー４０μlに再懸濁し、そして煮沸する。抗Ｖ５（５−ＨＴ１Ｂ受容体を検出するために；１：１０００）および抗ｐ１１（１：１０００）抗体を用いて全ての細胞質およびビオチン化（表面）タンパク質に関して定量的ウェスタンブロットを実施する。増強された化学発光、続いてオートラジオグラフィーにより免疫反応性ビーズを検出する。ＮＩＨ Image１.６３ソフトウェアを用いてバンドの強度を定量する。各ウェルに関して表面／全体の比率を計算する。対照実験により、細胞内タンパク質アクチンはこのアッセイではビオチン化されないことが確認された。
【００７７】
５−ＨＴ１Ｂ受容体およびｐ１１で同時トランスフェクトされた細胞は細胞表面で５−ＨＴ１Ｂ受容体単独でトランスフェクトされた細胞よりも多くの５−ＨＴ１Ｂを呈する。対照的に表面の全ドーパミンＤ１受容体に対する比率はｐ１１の不在の存在下で類似する。
【００７８】
実施例７
ＣＯＳ７細胞におけるｃＡＭＰ測定
ＤＭＥＭ培地で成長させたＣＯＳ７細胞を５−ＨＴ１Ｂ受容体および／またはｐ１１でトランスフェクトする。３６時間後、細胞をテオフィリン（５ｍＭ）およびパルギリン（１０μＭ）で１５分間前処理する。次いでセロトニン（１０μＭ）を伴うかまたは伴わないベヒクルまたはフォルスコリン（１０μＭ）をさらに１５分間添加する。処理の終わりに薬物含有培地を除去し、ウェルをＰＢＳで濯ぎ、そして細胞を収集する。直接的ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキットにより製造者の説明書にしたがってｃＡＭＰ形成を定量する。対照実験により、セロトニンがトランスフェクトされていないＣＯＳ７細胞においてｃＡＭＰ形成を改変しないことが示される。
【００７９】
セロトニン（１０ｍＭ）が５−ＨＴ１Ｂ受容体でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるフォルスコリン誘起のｃＡＭＰ形成に対抗する能力は、同時トランスフェクトされたｐ１１の存在下で増大される。ｐ１１を伴うかまたは伴わないでフォルスコリンに対するｃＡＭＰ応答において有意な差はない。データは、ｐ１１を伴うかまたは伴わないでフォルスコリン刺激された条件に対して正規化され、そして平均Ｔ ＳＥＭを表す。
【００８０】
実施例８
ｐ１１を過剰発現するトランスジェニックマウスの作成および分析
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターの下でドキシサイクリン調節可能なｐ１１の過剰発現を伴うランスジェニックマウスを作成する。ＰＣＲを用いてマウスｐ１１をＭｙｃエピトープタグと融合し、そしてｐＴｅｔスプライスのＳａｌ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位にサブクローニングする（Ｓ６）。このプラスミド（ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ）をｔＴＡ発現ＣＨＯ細胞（Dr Patrick Allenより寄贈）にトランスフェクトする。これらの細胞の抽出物からのＭｙｃの発現を抗Ｍｙｃ（１：１０００）抗体を用いる免疫ブロッティングにより確認する。ｐ１１−Ｍｙｃが発現されることを確認した後、ＤＮＡフラグメント（ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ、ＳＶ４０イントロン、およびポリ（Ａ）＋シグナルを含有）を直線化し、電気溶出により精製し、そしてＣ５７ＢＬ６マウスからの卵母細胞の前核にマイクロインジェクトし、そして偽妊娠Ｃ５７ＢＬ６／ＣＢＡマウス（Rockefeller University Transgenic Facility）に移植する。テールＤＮＡを導入遺伝子に関してＰＣＲにより分析する（５’−ＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＣ ＡＡＡＴＧＧ−３’および５’−ＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣ ＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧ−３’）。ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ構築物に関して陽性である創始マウスをＣ５７Ｂｌ６マウスと交雑させてＦ１マウスを作成する。Ｆ１同胞を交雑させることによりＦ２ホモ接合性ｐＴｅｔＯｐ−ｐ１１−Ｍｙｃ−トランスジェニックマウスが得られる。（ホモ接合性遺伝子型は、それらの野生型マウスとの交雑により確認される。）これらのマウスをＣａｍＫＩＩプロモーター下でｔＴＡを発現するＣ５７Ｂｌ６マウスと交雑させる（Ｓ７）。ＰＣＲにより前記のプライマー（ｐ１１−Ｍｙｃを検出するため）および５’−ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＧＧＴＣＧ ＧＡＡＴＣ−３’および５’−ＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＴＡＴＧＧ−３’（ｔＴＡを検出するため）を用いてマウスの遺伝子型を同定する。二重トランスジェニックマウスにおけるｐ１１−Ｍｙｃの過剰発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いる免疫ブロッティングにより、およびマウスｐ１１遺伝子に対するインサイチュハイブリダイゼーションにより確認する（図Ｓ２）。ＣａｍＫＩＩに推進されるｔＴＡの発現をｔＴＡのコード化領域に対するリボプローブ（Dr Alexei Morozov, Columbia Universityより寄贈）でのインサイチュハイブリダイゼーションを用いて検出する（図Ｓ２）。行動実験では、二重トランスジェニックマウスを対照として提供された導入遺伝子を発現しないか、または一つの導入遺伝子を発現する同腹仔と比較する。いく匹かの二重トランスジェニックマウスは飲料水中５０ｍｇ／ｌドキシサイクリンを実験前に１８日間投与される。
【００８１】
ドキシサイクリン不在下では、前脳でセロトニンを含有しないトランスジェニックマウスではニューロンにおけるｐ１１が上昇しているが、縫線核におけるセロトニンニューロンでは上昇しない。これらのマウスは黒質での機能的５−ＨＴ１Ｂ受容体が増加しており、そしてオープンフィールド試験において接触走性の低下（不安関連窮迫困難の指標）および水平方向活動性の増大を呈する。それらはまた尾懸垂試験において不動性の低下を示す（うつ病様状態の指標）。故にｐ１１を過剰発現するマウスはあたかも抗うつ剤で処置されたように振る舞うが、交絡因子は、それらが一般的に異常に活動的であるように思われるということである。ドキシサイクリンで処置されたトランスジェニックマウスは正規化されたｐ１１発現を有し（図Ｓ４）、そして接触走性、不動性または水平方向活動性の有意な改変はない。
【００８２】
実施例９
ｐ１１ノックアウトマウスの作成および分析
ｐ１１ＫＯマウスの作成および分析
ラットｐ１１のコード化配列からのプローブを用いて６個のゲノムクローンをＢＡＣライブラリースクリーニングから単離する。１３.７ｋｂのＢａｍ ＨＩフラグメントをＢＡＣクローンからサブクローニングし、そして制限酵素分析によりマッピングする。マウスｐ１１遺伝子はＡＴＧ含有エクソン、３.５ｋｂイントロン、続いて停止コドンを有する別のエクソンを含有する。ｐ１１遺伝子のＡＴＧ含有エクソンにわたる１１.３ｋｂのターゲティングベクター（５’Ｈｉｎｃ ＩＩ−Ｂｇｌ ＩＩ＋［Ｂａｍ Ｈ１−ｌｏｘＰＮｅｏｌｏｘＰ−Ｋｐｎ Ｉ］＋Ａｐａ Ｉ＊−Ｅｃｏ ＲＶ ３’）をｐＢＳＫ（−）で作成する（図Ｓ５）。ターゲティングベクターを１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞にエレクトロポレートし、そしてＧ４１８により組換えクローンに関して選択する。各々ＳｐｅＩおよびＢａｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉの各々で消化されたＥＳ細胞ＤＮＡの分析において、５’および３’外部プローブ（各々３００ｂｐ Ｂａｍ ＨＩ／Ｂｓｐ Ｍ１フラグメントおよび２８５ｂｐ Ｂａｍ ＨＩ／ＳｃａＩフラグメント）を用いるサザンブロッティングにより相同組換えに関してＥＳクローンを陽性として同定する。陽性クローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射し、そしてキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６雌と繁殖させて生殖細胞系伝達を得る。ヘテロ接合子孫を交配させてノックアウトおよび野生型マウスを作成する。テールＤＮＡからのサザンブロッティングにより、双方の対立遺伝子がｐ１１ ＫＯマウスで変異していることが確認された（図Ｓ５）。ｐ１１ノックアウトマウスにおけるｐ１１遺伝子の不在はさらにマウスｐ１１遺伝子に対するプローブでのインサイチュハイブリダイゼーションを用いて確認される（図Ｓ５）。以下のオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧ−３’、５’−ＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＡＴＡＴ ＧＣＴＣＣＴＡＡＴＣ−３’および５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣ ＡＣＴＣＡＴＧ−３’を用いるＰＣＲ手順を発展させて野生型、ヘテロ接合性、およびノックアウトマウスを区別する（図Ｓ５）。このＰＣＲ基盤の研究法は日常的な遺伝子型決定に用いられる。一次皮質培養物での研究を除いて、全ての実験をヘテロ接合体繁殖から作成されたｐ１１ ＫＯおよび野生型同腹仔で実施する。ヘテロ接合体×ヘテロ接合体繁殖により２９％野生型、５３％ｐ１１ヘテロ接合体および１８％ｐ１１ ＫＯマウスを生じた。なぜＫＯマウスがより少ないのかは明らかではないが、ｐ１１が初期胚移植に関与していることが見出されている（Ｓ８）。ヘテロ接合体ｐ１１マウスをＣ５７Ｂｌ６マウスと２世代戻し交配させる。１０４個の特異的Ｃ５７Ｂｌ６マーカー（Rockefeller University Genomics Resource Center）を用いるマイクロサテライト遺伝子型決定により、実験動物の繁殖に用いられたヘテロ接合体ｐ１１マウスは７４±２.８％Ｃ５７Ｂｌ６バックグラウンドであることが示される。
【００８３】
定量的受容体オートラジオグラフィー
クリオスタット切片（１２μｍ厚）をｐ１１ ＫＯおよび野生型マウスから作成する。アンタゴニスト［１２５Ｉ］シアノピンドロール（０.３、１、３、１０、３０、１００ｐＭ；２２００Ｃｉ／ミリモル）、５−ＨＴ１A遮断薬として１００ｎＭ ８−ＯＨ−ＤＰＡＴおよびβ−アドレナリン作動性受容体遮断薬として３０μＭ イソプロテレノールを含有する１７０ｍＭ Tris／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４（２５℃）中で切片を２時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体を検出する（Ｓ９）。非特異的結合を１００μＭセロトニンの存在下での測定により決定する。置換実験では、漸増濃度のセロトニン（０、０.３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、１００００ｎＭ）を前記したような１０ｐＭ［１２５Ｉ］シアノピンドロールと共にインキュベートする。切片を９ １７０ｍＭ Tris／４ｍＭ ＣａＣｌ２／０.１％アスコルビン酸、ｐＨ７.４（２５℃）中アンタゴニスト［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３（０.３、１、３、１０、３０ｎＭ；８０Ｃｉ／ミリモル；GE Healthcare）と共に２時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１Ｂ受容体もまた検出する。１００μＭセロトニンの存在下での測定により非特異的結合を決定する。切片を５０ｍＭ Tris、ｐＨ７.４、４ｍＭＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０.１％ウシ血清アルブミン（２５℃）中アゴニスト［３Ｈ］８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−テトラリン（［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ；１０ｎＭ；１２５Ｃｉ／ミリモル；GE Healthcare）、５−ＨＴ７受容体遮断薬として３００ｎＭ ＳＢ−２６９９７０と共に１時間インキュベートすることにより５−ＨＴ１A受容体を検出する。１００μＭセロトニンの存在下での測定により非特異的結合を決定する。アンタゴニスト［３Ｈ］７−クロロ−２,３,４,５−テトラヒドロ−３−メチル−５−フェニル−１Ｈ−３−ベンズアゼピン−７−オール（［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０；２ｎＭ；８７.０Ｃｉ／ミリモル）を含有する２５ｍＭ Tris／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１μＭパルギリン／２０ｎＭミアンセリン／０.００１％アスコルビン酸中で切片を２時間インキュベートすることによりＤ１様受容体を検出する。１００μＭ ＳＫＦ８２９５８の存在下での測定により非特異的結合を決定する。アンタゴニスト［３Ｈ］ラクリプリド（５ｎＭ；７２Ｃｉ／ミリモル）を含有する１７０ｍＭ Tris／１２０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ／２ｍＭ ＣａＣｌ２／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１０μＭ ＧＴＰ／０.００１％アスコルビン酸と共に切片を１時間インキュベートすることによりＤ２様受容体を検出する。１００μＭキンピロールの存在下での測定により非特異的結合を決定する。全てのオートラジオグラフィー実験の終わりに切片をその対応する冷結合バッファー中２×５分間濯ぎ、４℃の蒸留水に浸漬し、そして冷気下で乾燥させる。切片をBiomax ＭＲフィルムに３−５日間（［１２５Ｉ］シアノピンドロール）または４−１０週間（［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３、［３Ｈ］８−ＯＨＤＰＡＴ、［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０、［３Ｈ］ラクリプリド）マイクロスケールの［１２５Ｉ］または［３Ｈ］と一緒に並置する。ＮＩＨ Image１.６３画像分析システムでいくつかの脳領域における光学密度測定値が得られる。全結合から非特異的標識のデジタルサブトラクションにより特異的結合を計算する。マイクロスケールの［３Ｈ］または［１２５Ｉ］から作成された標準曲線を用いて光学密度をタンパク質のミリグラムあたりのフェムトモルに変換する。飽和および置換実験から得られたデータを非線形回帰方程式を用いて分析する。
【００８４】
オートラジオグラフィーリガンド結合実験により、野生型マウスよりもｐ１１ ＫＯの淡蒼球において５−ＨＴ１Ｂ受容体アンタゴニスト放射性リガンド［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロールおよび［３Ｈ］ＧＲ１２５７４３に関する結合部位が少ないことが示された。同様に［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロール結合は野生型マウスよりもｐ１１ ＫＯの黒質網様部において低い（７７.３±５.８対９８.８±６.２フェムトモル／ｍｇタンパク質；Ｐ＜０.０５スチューデントｔ検定）。野生型とｐ１１ ＫＯマウスとの間に結合［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロールを置換するセロトニンの親和性には差異はない［半有効濃度（ＥＣ５０）値：５７対５２ｎＭ）。野生型とｐ１１ ＫＯマウスとの間で５−ＨＴ１A、Ｄ１またはＤ２受容体の量の差異は検出されない。［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロール結合もまたＮＨ／Rouenマウスに対してＨ／Rouenマウスで低下する。
【００８５】
５−ＨＴ１Ａまたは５−ＨＴ１Ｂ受容体刺激に応答した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合
野生型、ｐ１１ ＫＯおよびｐ１１トランスジェニックマウスからの新鮮なクリオスタット切片（１２μｍ）を、１００ｍＭＮａＣｌ、＼１０ ３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＧＤＰおよび内因性アデノシンを除去するために１Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼを追加したTris−ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７.４）中３０分間プレインキュベートする。その後切片を４０ｐＭ［３５Ｓ］ＧＴＰ Ｓを含有する同一溶液中、５０μＭ ５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴまたは５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニスト、アンピルトリンを伴って（刺激条件）、または伴わずに（基本条件）２５℃で２時間インキュベートする。１０μＭの未標識ＧＴＰ Ｓと共にインキュベートした隣接する切片からのオートラジオグラフで非特異的標識（バックグラウンド）を決定する。切片を５０ｍＭ Tris−ＨＣｌバッファーで２回（各３分）、蒸留水で１回（３０秒）濯いでバッファー塩を除去し、そして空気乾燥させる。Biomax ＭＲフィルムで２−４日間暴露することによりオートラジオグラフが得られる。ＮＩＨ Image１.６３画像分析システムでいくつかの脳領域における光学密度測定値が得られる。
【００８６】
ｐ１１ ＫＯマウスの細胞膜での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の低下は、５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニスト、アンピルトリンがこれらのマウスの淡蒼球における［３５Ｓ］グアノシン５'−Ｏ−（３'−チオ三リン酸（ＧＴＰ−Ｓ）結合を増大させる能力の低下に反映される。対照的に野生型およびｐ１１ ＫＯマウスにおける５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ［（＋／−）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン］による［３５Ｓ］ＧＴＰ−Ｓ結合に差異はない（６.０±２.１対５.０±２.０光学密度単位）。ｐ１１ ＫＯマウスの細胞表面での機能的５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の低下はまた、セロトニンおよびアンピルトリンがｐ１１ ＫＯマウスからの一次皮質培養物におけるホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節キナーゼ）レベルを下方調節する能力、ならびにアンピルトリンがｐ１１ ＫＯマウスからの線状体切片においてｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼによりリン酸化される部位であるホスホ−Ｓｅｒ９−シナプシンＩを低下させる能力の喪失に反映される。
【００８７】
一次皮質培養物におけるリン酸化ＥＲＫ１／２を検出するためのウェスタンブロッティング
ＷＴ×ＷＴまたはｐ１１ＫＯ×ｐ１１ＫＯ繁殖から生じたＥ１８マウスから皮質を除去し、トリプシン処理し（０.２５％）、粉砕により分離し、そしてポリ−Ｌ−リジン（１ｍｇ／ｍｌ）コーティングされた６ウェルプレートにプレートする。５％ウシ胎仔血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｂ−２７栄養素補給、ペニシリン（５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）伴うＤＭＥＭを含有する培地で培養物（５０００００セル／ｍｌ）を成長させる。２週後に培養物をベヒクル、セロトニン（１０μＭ）またはアンピルトリン（１０μＭ）で１５分間処理する。処理の最後に薬物含有培地を除去し、ウェルを氷冷ＰＢＳで濯ぎ、セルスクレーパーによりニューロンを除去し、そして液体窒素中で凍結する。凍結細胞試料を１％ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によるタンパク質決定のためにホモジネートの小アリコートを保持する。前記したように１０％アクリルアミドゲルを使用することにより均等量のタンパク質を処理する（Ｓ１０）。ホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＥＲＫ１／２に対するリン酸化部位特異的抗体またはリン酸化部位特異的でない全ＥＲＫ１／２に対する抗体で免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。ＥＲＫ１／２のリン酸化形態のレベルをその全レベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００８８】
脳切片におけるリン酸化シナプシンＩを検出するためのウェスタンブロッティング
前記したような野生型およびｐ１１ ＫＯマウスから線状体の切片（３００μｍ）を調製する（Ｓ１０）。切片をKrebsバッファー（１１８ｍＭ ＮａＣｌ／４.７ｍＭ ＫＣｌ／１.５ｍＭ Ｍｇ２ＳＯ４／１.２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３／１１.７ｍＭグルコース／１.３ｍＭ ＣａＣｌ２）中３０℃で一定の酸素添加で（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）６０分間プレインキュベートし、３０分後にバッファーを変える。切片をベヒクルまたはアンピルトリン（５０μＭ）で２分間処理する。薬物処理の後、バッファーを除去し、切片をドライアイス上で急速に凍結し、１％ＳＤＳ中で超音波処理し、そして１０分間煮沸する。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法によるタンパク質決定のためにホモジネートの小アリコートを保持する。１０％アクリルアミドゲルを使用することにより均等量のタンパク質を処理する。ＰＫＡおよびＣａｍＫＩＩによりリン酸化される部位であるホスホ−Ｓｅｒ９−シナプシンＩに対するリン酸化部位特異的ウサギポリクローナル抗体、またはリン酸化部位特異的でないウサギポリクローナルシナプシン抗体で免疫ブロッティングを実施する。増強された化学発光により抗体結合を検出し、そして国立衛生研究所 IMAGE１.６３ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより定量する。シナプシンのリン酸化形態のレベルをその全レベルに対して正規化する。全てのデータは正規化されたレベルとして提示される。
【００８９】
電気生理学
フルオロタン麻酔した雄ｐ１１ ＫＯおよび野生型マウス（４−７週齢）を断頭する。その脳を迅速に除去し、そしてマイクロスライサーで側坐核を含有する脳冠状切片（４００μｍ厚）を調製する。切片を酸素添加された（９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２）、１２６ＮａＣｌ、２.５ＫＣｌ、１.２ＮａＨ２ＰＯ４、１.３ＭｇＣｌ２、２.４ＣａＣｌ２、１０グルコースおよび２６ＮａＨＣＯ３（ｍＭで）を含有する人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）（ｐＨ７.４）中３２℃で少なくとも１時間インキュベートする。切片を正立顕微鏡にマウントされた記録チャンバーに移し、そして２８℃で酸素添加されたａＣＳＦで連続的に灌流する。側坐核の切片表面に位置するａＣＳＦで充填されたガラスマイクロピペットを用いて細胞外電場電位を記録する。１０ｋＨｚで獲得されるAxopatch２００Ｂ増幅器を介してシグナルを５００倍に増幅し、２ｋＨｚでフィルタリングし、そして獲得およびpClamp９データ分析ソフトウェアを用いてコンピューターに記録する。切片の表面の記録電極近くに置かれた同心両極刺激電極でシナプス反応を惹起する。切片に適用された刺激の強度のｆＥＰＳＰ振幅への依存性はＷＴおよびｐ１１ ＫＯマウスで類似し、それはグルタミン酸作動性１２シナプス伝達がＷＴおよびｐ１１ ＫＯマウス間で異ならないことを実証している。刺激強度の増大により惹起される電場電位の振幅を測定することにより試験される各切片に関して確立された刺激／応答曲線により評価されるように、最大応答の５０−７０％を生じる強度で単一の刺激（０.１ミリ秒間隔）を１５秒毎に適用する。グルタミン酸作動性シナプス伝達に及ぼすセロトニン受容体活性化の影響を評価するために、セロトニンを灌流溶液に適用しながらｆＥＰＳＰ／ＰＳ振幅を測定する。セロトニン（５０μＭ；１０μＭフルオキセチンの存在下）はＷＴマウスからの切片においてｆＥＰＳＰ／ＰＳの振幅を抑制し（７２ ベースライン値の２.７％）、そしてこの効果はｐ１１ ＫＯマウスからの切片では除かれる（９８ ベースライン値の３.６％）。数値を平均 ＳＥＭとして表現する。薬物は三方活栓を切り替えることにより灌流溶液中で適用される
【００９０】
セロトニンは５−ＨＴ１Ｂ受容体を介して大脳皮質に由来するニューロンの末端でグルタミン酸放出を低下させ、そして皮質線状体シナプスでのシナプス伝達を阻止する。グルタミン酸作動性線維の短い電気刺激により惹起され、そして側坐核で細胞外で記録される興奮性シナプス後電場電位（ｆＥＰＳＰ）の振幅をモニタリングする。ｆＥＰＳＰは野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの双方で切片の電気刺激により放出される内因性グルタミン酸により活性化されるＡＭＰＡ受容体により媒介される［ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２,３−ジオン（ＣＮＱＸ）の１５分後、ベースラインと比較してｆＥＰＳＰ／集合スパイク（ＰＳ）低下、各々７７および８１％］。灌流溶液に適用された場合、セロトニンは野生型マウスからの切片におけるｆＥＰＳＰ／ＰＳの振幅を抑制するが、ｐ１１ ＫＯマウスからの切片では抑制しない。
【００９１】
モノアミンおよび代謝物の組織含量
雄ｐ１１ ＫＯ、ｐ１１ヘテロ接合体および野生型マウス（遺伝子型あたりｎ＝８）を収束マイクロ波照射により屠殺し、そして線状体、皮質および海馬を別々にし、そしてドライアイス上で凍結する。次いで組織試料を１０容量の０.１Ｎ ＴＣＡ中で超音波処理し、ボルテックスし、そして１２０００ｇで２分間遠心する。上澄を収集し、そして電気化学検出を備えたＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＥＣ）を用いてセロトニンおよびセロトニン代謝物、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）に関して分析する。塩基不活性化シリカHypersil ５μｍ Ｃ１８分析カラム（４.６×１５０ｍｍ）を用いて７５ｍＭリン酸一ナトリウム、３５０ｍｇ／ｌ １−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.８％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣ等級、阻害剤不含）および８％アセトニトリル、ｐＨ３（リン酸で調整）からなる移動相で、流速１.２ｍｌ／分でセロトニンおよび５−ＨＩＡＡを分離する。ガラス状炭素二重電極を有する電気化学検出器を使用する（電極１＝６８０ｍＶ、レンジ、０.５ｎＡ；電極２＝−１００ｍＶ、レンジ、０.２ｎＡ）。ピーク高さおよび試料濃度を計算するEZChromソフトウェアを用いてデータを収集する。セロトニンおよび５−ＨＩＡＡに関する感度は０.１ピコモル／ｍｌである。
【００９２】
５−ＨＴ１Ｂ受容体は自己受容体として振る舞い、そしてセロトニン放出を阻止する。ｐ１１は縫線核で発現されるので、セロトニンおよびその主要代謝物、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の量を野生型およびｐ１１ ＫＯマウスの投射部、主に皮質、線状体および海馬で測定する。５−ＨＴターンオーバーおよび／または５−ＨＴ１Ｂ受容体による代謝の負の調節、ならびに５−ＨＴ１Ｂ受容体機能に及ぼすｐ１１の増強の役割にしたがって、ｐ１１ ＫＯマウスはセロトニンターンオーバーおよび／または代謝のレベルを増大させている。
【００９３】
行動分析：オープンフィールド分析
完全コンピューター化マルチケージ赤色および赤外感受性運動検出システムで日中に３０分間（結果を毎５分間分析する）水平方向活動性を測定する。末梢活動性の値を全水平方向活動性により１３に分け、接触走性を決定する。アンピルトリン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）での実験では、動物を注射後１５分間試験する。いくつかのアンピルトリン処置マウスは実験前日までイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.）を毎日４週間注射されていた。
【００９４】
行動分析：尾懸垂試験
抗うつ剤様活性のモデルである尾懸垂試験を前記のように実施し（Ｓ１１）、そしてＣ５７Ｂｌ６（Ｓ１２）およびＮＭＲＩマウス（Ｓ１３）に関して確認されたものを修飾したものである。マウスは粘着テープを使用して（尾の先端から２ｃｍの距離）個々に水平バーに尾により懸垂される（床からの距離は３５ｃｍの距離）。典型的にはマウスは、一時的に増加する不動性の期間が散在するいくつかの逃避志向性行動を実証した。６分間の試験期間はビデオテープに録画され、そして遺伝子型を知らない観察者により採点される。記録されたパラメーターは不動で過ごした秒数である。アンピルトリン（５ｍｇ／ｋｇ）およびイミプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ）での実験では、動物を注射後１５分間試験する。
【００９５】
行動分析：スクロース消費試験
個々に収容されたｐ１１ ＫＯマウスおよび野生型マウスで単一の瓶の手順を用いてスクロース消費を試験する。９６時間の間、水中２％スクロース溶液の消費を測定する。次の実験では同一の期間、水の摂取を測定する。
【００９６】
ｐ１１欠失の行動的影響を評価するために、基本条件下で、ならびに薬物未使用マウスおよびイミプラミンで長期間処置されているマウスにおけるアンピルトリンに対して応答した、野生型およびｐ１１ ＫＯマウスにおける接触走性を比較する。イミプラミンで処置された動物では、アンピルトリンは野生型マウスの接触走性において有意な低下を引き起こすが、ｐ１１ ＫＯマウスでは引き起こさない（図４Ｇ）。加えて、生理食塩水注射された野生型ではｐ１１ ＫＯマウスよりも接触走性が少ない（図４Ｃ）。薬物未使用野生型およびｐ１１ ＫＯマウスはアンピルトリン不在下または存在下のいずれかで類似の接触走性を呈する。野生型マウスと比較してｐ１１ ＫＯマウスでは、ベースライン条件下およびアンピルトリンまたはイミプラミンのいずれかでの急性処置後の双方で、尾懸垂試験における不動性が増大する（図４Ｈ）。これらの行動結果により、ｐ１１ ＫＯマウスはうつ病様表現型を呈し、そしてｐ１１は５−ＨＴ１Ｂ受容体を介してイミプラミンに対する行動的応答を媒介することが示される。ｐ１１ ＫＯマウスのうつ病様表現型をさらに支持するに、ｐ１１ ＫＯマウスがその野生型同腹仔よりも美味な２％スクロース溶液の消費が少なく（１.７４±０.０７対２.１７±０.１１ｍｌ／ｇ体重／日；Ｐ＜０.０５スチューデントｔ検定）、それは甘い報酬に対する応答性の低下を示している。水摂取はｐ１１ ＫＯマウスおよびその野生型同腹仔で類似し（１.５１±０.０５対１.４２±０.０５ｍｌ／ｇ体重／日）、それはこの行動における体液均衡の崩れの役割を排除する。
【００９７】
実施例１０：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｐ１１の検出
ヘパリン化チューブに全血（１０−１５ｍｌ）を収集する。血液１ｍｌは単核細胞およそ１ｍｉｌｊを生じるが、その数は個体間で相当異なる。血液をリン酸基盤の生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈する。Lymphoprep（Medinor カタログ番号１１１４５４７）２.５ｍｌを１５ｍｌチューブに加え、そして希釈した血液１０ｍｌを上部に注意深く層にする。チューブを１８００ｒｐｍおよび室温で２０分間回転させる。パスツールピペットを使用してＰＢＭＣを２本のチューブから１本の透明の１５ｍｌチューブに収集する。このチューブをＰＢＳで充填し、そして１５００ｒｐｍで１０分間遠沈させる。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄する（血小板およびLymphoprepを除去する）。計数するために、ＰＢＭＣを元来の全血容量１０ｍｌあたり培地（９０％ウシ胎仔血清／１０％ＤＭＳＯ）１ｍｌで希釈する。（トリパンブルーで１：１０希釈して計数）。ＰＢＭＣを−８０℃（ドライアイス）または冷却器で凍結し、そしてそれを保存し、そして−８０℃で分配する。ウェルあたり０.５ｍｉｌｊ ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに加える。プレートを回転させ、そして上澄を捨てる。細胞をＢＤ固定バッファー（BD Biosciences、カタログ番号５５４７１５のキットより）中で固定する。同一キットからの透過バッファーを加え、そして細胞を洗浄する。ここで細胞は細胞内染色の準備が整っている。ｐ１１抗体（BD Biosciences；２,５μｇ／ｍｌ）を透過バッファーで希釈し、そしてウェルに加える。一つのウェルをＩｇＧ１対照のために使用する。細胞をピペッティングにより懸濁する。細胞を３０分間インキュベートし、そして透過バッファーで洗浄する。二次抗体（例えばヤギ抗マウスＰＥ抱合）を透過バッファーで希釈し、そして各ウェルに加える。細胞を懸濁し、そして３０分間インキュベートする。それを透過バッファーで２回およびＰＢＳ−１％ＦＣＳで１回洗浄する。二重染色のために、二次抗体をＰＢＳ−１％ＦＣＳ−１％ＮＭＳ（正常マウス血清）１００μｌで１回洗浄することにより遮断する。遮断工程は次の抗体が任意の残りの二次抗体に結合することを回避するために必要である。表面マーカーを染色するために、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ含有ＰＢＳ（単球を識別するため）またはＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ５６−ＰＥ（Ｔ細胞およびＮＫ細胞を識別するため）またはＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｂ細胞を識別するため）を各ウェルに加える。細胞をピペッティングにより懸濁し、そして冷蔵庫内で１０分間インキュベートする。次いでそれをＰＢＳ−１％ＦＣＳ２００μｌで１回洗浄する。標準的なＦＡＣＳ手順を用いて様々な型の単核細胞におけるｐ１１の染色を決定する。ｐ１１はいくつかの白血球、単球、ＮＫキラー細胞およびＣＤ−８陽性Ｔ細胞において高度に発現される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの生物学的試料中のｐ１１のレベルを決定すること、および該ｐ１１レベルを参照と比較することを含み、ここで参照と比較してｐ１１の異常レベルはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する対象においてｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法。
【請求項２】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで対照対象と比較して対象において低下したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常に低いレベルのｐ１１に関連する該障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
異常に低いレベルのｐ１１に関連する該障害がうつ病である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連し、ここで対照対象のレベルと比較して対象において上昇したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
異常に高いレベルのｐ１１に関連する該障害が躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ｐ１１のレベルが該対象からの該生物学的試料中の単球および／またはリンパ球におけるｐ１１タンパク質レベルを検定することにより決定される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該ｐ１１のレベルが該対象からの生物学的試料中のｐ１１ ｍＲＮＡレベルを検定することにより決定される請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ａ）均等量のｐ１１遺伝子生成物を含有する第１試料および第２試料を提供すること；
ｂ）第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；および
ｃ）第１試料中のｐ１１遺伝子生成物の量が候補ｐ１１モジュレーターと接触させていない第２試料中のｐ１１遺伝子生成物の量と相対して増加または減少しているかどうかを決定すること；の工程を含み、ここで遺伝子生成物の量の増加は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方遺伝子生成物の量の低下は候補モジュレーターが異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示すｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なモジュレーターを同定するための方法。
【請求項１０】
ａ）細胞表面で均等数の５−ＨＴ１Ｂ受容体を含有する第１試料および第２試料を提供すること；
ｂ）第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；および
ｃ）第１試料の細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数が第２試料と相対して増加しているかどうかを決定すること；の工程を含み、ここで細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の増加は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１活性に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の量の低下は候補モジュレーターが異常に高いレベルのｐ１１活性に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示すｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なモジュレーターを同定するための方法。
【請求項１１】
該モジュレーターがうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害からなる群から選択されるｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり、該候補モジュレーターがｐ１１発現を上方調節する能力に関して検定することを含む請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｐ１１モジュレーターが三環系抗うつ剤、セロトニン再取り込み阻害剤またはモノアミンオキシダーゼ阻害剤である請求項９、１０、１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
候補ｐ１１擬似物質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力に関して検定することを含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法。
【請求項１５】
該候補ｐ１１擬似物質が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり、ここで該候補ｐ１１擬似物質は５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該障害がうつ病である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一つまたはそれより多いｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患うと診断された対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含む該対象におけるｐ１１機能障害を処置するかまたは寛解させる方法。
【請求項１９】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択され、該対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含み、ここでｐ１１モジュレーターまたは擬似物質はｐ１１発現を上方調節するか、または５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択され、該対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含み、ここで該ｐ１１モジュレーターまたは擬似物質はｐ１１発現を阻止するか、またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体を下方調節する請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
同一種の野生型の哺乳動物と比較してｐ１１遺伝子に欠陥、変異または欠損を有するヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
【請求項２３】
マウスであるヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
【請求項２４】
該マウスが野生型マウスと比較してｐ１１タンパク質を過少発現する請求項２３に記載のノックアウトマウス。
【請求項２５】
該マウスが野生型マウスと比較してニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少ない請求項２３に記載のノックアウトマウス。
【請求項２６】
該マウスがうつ病様表現型を呈する請求項２３、２４または２５のいずれかに記載のマウス。
【請求項２７】
ａ）有効量の新規精神治療薬をｐ１１ノックアウトマウスおよび対照マウスに投与すること；
ｂ）該ノックアウトマウスおよび対照マウスにおいてｐ１１レベルおよび／または該薬剤に対する行動的応答のレベルを評価すること；
ｃ）ｐ１１ノックアウトマウスにおける該ｐ１１レベルおよび／または行動的応答を対照マウスと比較すること；
を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
【請求項２８】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、睡眠障害、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、性機能障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害および胃腸障害からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
調節プロモーターの制御下でｐ１１をコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳動物。
【請求項３０】
マウスである請求項２９に記載の哺乳動物。
【請求項３１】
プロモーターがカルモジュリン／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターである請求項２９または３０に記載の哺乳動物。
【請求項３２】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者の脳においてｐ１１の発現を増強する核酸を投与することを含む該患者においてｐ１１発現を増強する方法。
【請求項３３】
核酸がｐ１１をコードする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害およびアルツハイマー病から選択される異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
該核酸がｐ１１をコードするＤＮＡ構築物を含む組換え複製欠損アデノウイルスベクターにより分配される求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
該ＤＮＡ構築物が神経組織特異的プロモーターの制御下にある請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該核酸が患者の脳細胞により発現されるレベルよりも高いレベルでｐ１１を発現する神経幹細胞により分配される請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ｐ１１をコードする該核酸が海馬に分配される請求項３２から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
対象からの生物学的試料中のｐ１１のレベルを決定すること、および該ｐ１１レベルを参照と比較することを含み、ここで参照と比較してｐ１１の異常レベルはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の陽性診断を構成する対象においてｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を診断する方法。
【請求項２】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害であり、ここで対照対象と比較して対象において低下したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常に低いレベルのｐ１１に関連する該障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
異常に低いレベルのｐ１１に関連する該障害がうつ病である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が異常に高いレベルのｐ１１に関連し、ここで対照対象のレベルと比較して対象において上昇したｐ１１のレベルがかかる障害の陽性診断を構成する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
異常に高いレベルのｐ１１に関連する該障害が躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ｐ１１のレベルが該対象からの該生物学的試料中の単球および／またはリンパ球におけるｐ１１タンパク質レベルを検定することにより決定される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該ｐ１１のレベルが該対象からの生物学的試料中のｐ１１ ｍＲＮＡレベルを検定することにより決定される請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ａ）均等量のｐ１１遺伝子生成物を含有する第１試料および第２試料を提供すること；
ｂ）第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；および
ｃ）第１試料中のｐ１１遺伝子生成物の量が候補ｐ１１モジュレーターと接触させていない第２試料中のｐ１１遺伝子生成物の量と相対して増加または減少しているかどうかを決定すること；の工程を含み、ここで遺伝子生成物の量の増加は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方遺伝子生成物の量の低下は候補モジュレーターが異常に高いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示すｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なモジュレーターを同定するための方法。
【請求項１０】
ａ）細胞表面で均等数の５−ＨＴ１Ｂ受容体を含有する第１試料および第２試料を提供すること；
ｂ）第１試料を候補ｐ１１モジュレーターと接触させること；および
ｃ）第１試料の細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数が第２試料と相対して増加しているかどうかを決定すること；の工程を含み、ここで細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の数の増加は候補モジュレーターが異常に低いレベルのｐ１１活性に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示し、一方細胞表面での５−ＨＴ１Ｂ受容体の量の低下は候補モジュレーターが異常に高いレベルのｐ１１活性に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり得ることを示すｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なモジュレーターを同定するための方法。
【請求項１１】
該モジュレーターがうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害からなる群から選択されるｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり、該候補モジュレーターがｐ１１発現を上方調節する能力に関して検定することを含む請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｐ１１モジュレーターが三環系抗うつ剤、セロトニン再取り込み阻害剤またはモノアミンオキシダーゼ阻害剤である請求項９、１０、１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
候補ｐ１１擬似物質が５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する能力に関して検定することを含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を処置するかまたは寛解させるのに有用なｐ１１擬似物質を同定するための方法。
【請求項１５】
該候補ｐ１１擬似物質が異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害を処置するかまたは寛解させるのに有用であり、ここで該候補ｐ１１擬似物質は５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該障害がうつ病である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一つまたはそれより多いｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患うと診断された対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含む該対象におけるｐ１１機能障害を処置するかまたは寛解させる方法。
【請求項１９】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害および注意欠陥多動性障害からなる群から選択され、該対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含み、ここでｐ１１モジュレーターまたは擬似物質はｐ１１発現を上方調節するか、または５−ＨＴ１Ｂ受容体をニューロン細胞膜に補充する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害が躁病、双極性障害、不安障害、攻撃性、睡眠障害、性機能障害および胃腸障害からなる群から選択され、該対象に治療上有効量のｐ１１モジュレーターまたはｐ１１擬似物質を投与することを含み、ここで該ｐ１１モジュレーターまたは擬似物質はｐ１１発現を阻止するか、またはニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体を下方調節する請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
同一種の野生型の哺乳動物と比較してｐ１１遺伝子に欠陥、変異または欠損を有するヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
【請求項２３】
マウスであるヒト以外のｐ１１ノックアウト哺乳動物。
【請求項２４】
該マウスが野生型マウスと比較してｐ１１タンパク質を過少発現する請求項２３に記載のノックアウトマウス。
【請求項２５】
該マウスが野生型マウスと比較してニューロン細胞膜で５−ＨＴ１Ｂ受容体がより少ない請求項２３に記載のノックアウトマウス。
【請求項２６】
該マウスがうつ病様表現型を呈する請求項２３、２４または２５のいずれかに記載のマウス。
【請求項２７】
ａ）有効量の新規精神治療薬をｐ１１ノックアウトマウスおよび対照マウスに投与すること；
ｂ）該ノックアウトマウスおよび対照マウスにおいてｐ１１レベルおよび／または該薬剤に対する行動的応答のレベルを評価すること；
ｃ）ｐ１１ノックアウトマウスにおける該ｐ１１レベルおよび／または行動的応答を対照マウスと比較すること；
を含むｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を研究するか、またはｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害の処置に有用な新規精神治療薬を開発するための方法。
【請求項２８】
該ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、不安障害、攻撃性、躁病、双極性障害、睡眠障害、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、性機能障害、アルツハイマー病、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害および胃腸障害からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
調節プロモーターの制御下でｐ１１をコードする導入遺伝子を含むヒト以外の哺乳動物。
【請求項３０】
マウスである請求項２９に記載の哺乳動物。
【請求項３１】
プロモーターがカルモジュリン／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーターである請求項２９または３０に記載の哺乳動物。
【請求項３２】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害を患う患者の脳においてｐ１１の発現を増強する核酸を投与することを含む該患者においてｐ１１発現を増強する方法。
【請求項３３】
核酸がｐ１１をコードする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病、強迫性障害、薬物依存、摂食障害、注意欠陥障害または注意欠陥多動性障害およびアルツハイマー病から選択される異常に低いレベルのｐ１１に関連する障害である請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｐ１１／５−ＨＴ受容体関連障害がうつ病である請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
該核酸がｐ１１をコードするＤＮＡ構築物を含む組換え複製欠損アデノウイルスベクターにより分配される求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
該ＤＮＡ構築物が神経組織特異的プロモーターの制御下にある請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該核酸が患者の脳細胞により発現されるレベルよりも高いレベルでｐ１１を発現する神経幹細胞により分配される請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ｐ１１をコードする該核酸が海馬に分配される請求項３２から３８のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５４４２７８（Ｐ２００９−５４４２７８Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５４８４（Ｐ２００９−５１５４８４）
【出願日】平成１９年６月１３日（２００７．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６３７２
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５９６１７１８３４）ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１３日（２００７．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６３７２
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５９６１７１８３４）ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ (11)
【Ｆターム（参考）】
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