水溶性ジテルペンの調製方法およびその適用
可溶化剤として適当に置換されたシクロデキストリンを用いて、約６％濃度までのジテルペン、例えばフォルスコリン、その同族物質、アナログおよび誘導体の水溶液を調製する。シクロデキストリン不在下では、いくつかのジテルペン、例えばフォルスコリンは水に約０．００１％の濃度までしか溶解しない。フォルスコリンおよび同族物質などのジテルペンを含有する医薬用、化粧用、栄養補給食品用の調製物として、かかる水溶液の局所用および全身用の適用が見出される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水に難溶性かまたは不溶性であるジテルペン、例えばフォルスコリンの、約６％までの濃度の水溶液の調製について記載する。可溶化剤として適当に置換されたシクロデキストリンを用いてこれらの溶液を調製する。シクロデキストリンの不在下では、フォルスコリンはほとんど水に不溶性であり、約０．００１％の濃度の溶液しか生じない。より多量の活性成分を含有するフォルスコリンおよび／またはその同族物質の水溶液を局所的および全身的に使用して多様な健康上の利点を提供することができる。
【背景技術】
【０００２】
特定の活性医薬用成分は水または水性ビヒクルに本質的に不溶性または難溶性である。その意図される使用に水または水性ビヒクルでの適用が必要となり得ることが頻繁にある。安定な形態でかかる水に不溶性の活性医薬用成分の治療上活性な濃度を達成することが積極的に追求されてきている。水に不溶性である活性医薬用成分の分子構造操作の技術を適用できるが、水溶性を促進する構造的特徴を組み込むことは、意図される望ましい薬理学的特性の減衰または変化に至る可能性がある。従って、その元来の構造形態で、その他の手段により活性成分を可溶化する方法を考案するのが恐らく最も望ましい。
【０００３】
薬物の水溶性は多様な角度から望ましい特徴である。標準的な技術、例えば濾過等により水性処方を滅菌し、かかる調製物を全身投与に適したものにする。水性調製物はまた皮膚科、婦人科、耳科、鼻科および粘膜への適用に好ましい。薬物の水性の眼科用調製物がとりわけ有用である。
【０００４】
フォルスコリン（ＣＡＳ番号６６５７５−２９−９）はコレウス・フォルスコリに由来する天然発生のラブダン型ジテルペンである（非特許文献１）。これはいくつかの望ましい薬理学的特性を有している。
【０００５】
フォルスコリンは陽性変力作用、抗高血圧作用、および気管支鎮痙活性を示す。（非特許文献２）
【０００６】
これは眼内圧を低下させる（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６，非特許文献７，非特許文献８，非特許文献９，非特許文献１０）。
【０００７】
アデニル酸シクラーゼの強力な非アドレナリン作動性刺激要因であるフォルスコリンの使用により、ヒトの眼におけるアデニル酸シクラーゼ刺激の効果の非侵襲性の研究が可能になった。すなわち房水動態においてサイクリックＡＭＰ生成を増加させた。眼内圧の低下、流入の低下、および流出能力の未変化の結果に基づいて、この研究の著者は、これらの観察が、活性毛様体上皮アデニル酸シクラーゼレセプター複合体が正味の水の流入を低下させることができるという考えを支持すると主張した（非特許文献１１）。
【０００８】
その他の報告は、フォルスコリンの硝子体内注射または局所投与は、流出能力を全く上昇させずに、水流入を低下させることによりウサギの眼内圧を有意に低下させることを示した。健常者ボランティアにおけるフォルスコリン懸濁液の局所適用は流出能力を変化させずに眼内圧および水流の有意な低下を引き起こした（非特許文献１２）。
【０００９】
フォルスコリン点眼剤（０．３％−０．６％−１．０％）の二重盲検個体間比較を１８人の健常男性対象（各群６人）において行った。この研究により、フォルスコリン点眼剤０．３％−０．６％−１．０％が健常男性対象の眼内圧を低下させることが実証された。眼内圧の低下は２３から２８％の間であり、そして効果の持続期間は濃度に従って３から５時間まで延長された（非特許文献１３）。
【００１０】
研究者の別のグループは開放隅角緑内障の成人患者においてフォルスコリン点眼剤を用いた２つの研究を報告した。１つの研究では２６人の患者が含まれた（プラセボ群なし）。第２の研究では、１１人の緑内障患者がフォルスコリンを投与された。研究１では、眼内圧が低下し、これは１時間から４時間まで認められた。研究２では、フォルスコリンは６時間まで眼内圧を低下させた。プラセボ群では眼内圧に変化はなかった。これらの研究では、カルボキシルメチルセルロース中のフォルスコリン１％懸濁液を使用した（非特許文献１４）。
【００１１】
ｃＡＭＰのレベルを上昇させることにより、多様な生物学的活性が観察され、そして結果的にタンパク質キナーゼが活性化された。かかる特性により、フォルスコリンの非常に多くの用途が導かれる。かかる活性のために、フォルスコリンの生理学的特性を扱う１５００以上の引用文献が２００１年のケミカルアブストラクト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｒａｃｔｓ）に登場した。しかしながら、フォルスコリンは水に非常に不溶性である。
【００１２】
水溶性であるようなフォルスコリンの誘導体を作製するために、フォルスコリンの分子操作に関して集中的な努力が為されている。かかる試みはいつも、半ば成功、半ば失敗を経験している（非特許文献１５，非特許文献１６）。
【００１３】
薬物分子構造の化学的操作の代替として、誘導体化されない薬物の水中での溶解性を増強する物理化学的技術が用いられている。注目される技術には表面活性成分を用いるミセル可溶化が含まれ、これは薬物を含有する水溶性ミセルを形成する。別の関連する技術は薬物分子とホスト分子との複合化である。ホスト分子は通常水中で良好な溶解性を有する分子である。ホスト分子は薬物分子と何ら共有結合を形成しないが、非共有結合性相互作用により弱い複合体を形成し、そして（複数の）ホスト分子が（複数の）薬物分子を水溶液中に留める。
【００１４】
シクロデキストリンは有用な医薬用賦形剤として認識されている環状オリゴ糖である。一般的なシクロデキストリンは環状オリゴ糖構造のグルコース分子の数に依存して、α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンと称されている。これらのシクロデキストリンは、比較的疎水性の中心腔および親水性の外表面を含有するα−Ｄ−グルコピラノースの（α−１，４）−連結されたオリゴ糖である。これらの分子は、糖分子単位の連結結合に関する完全な自由回転の制限のために正確に完全な円筒状ではない。これはトーラスまたは円錐台の形状をとる。２次的なヒドロキシル基が周縁のより広い縁部の線を描き、一方１次的ヒドロキシル基はトーラスの狭い側の線を描く。これらの分子の水中の溶解性および中心腔の直径は公知であり、そして公表されている（非特許文献１７，非特許文献１８）。７個のグルコース単位を含有するβ−シクロデキストリンの構造を実例として以下に示す。
【００１５】
【化１】
ベータ−シクロデキストリンの構造
【００１６】
α−シクロデキストリンは環に６個の無水グルコース分子を有する。γ−およびδ−シクロデキストリンは各々８個および９個を有する。α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンは２５℃で各々１４．５、１．８５、２３．２および８．１９（ｇ／１００ｍｌ）の水溶性を有する。α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンはしばしば天然シクロデキストリンと称され、そしてその水溶性は望ましい範囲の下端である。それにもかかわらず、それらはいくつかの水不溶性分子のための非常に良好な可溶化剤を提供する。これらの天然シクロデキストリンの水溶性を増加させるために、文献では、これらのα−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンの分子修飾が実施されている。
【００１７】
これらの修飾されたシクロデキストリンはその天然の対応物よりも非常に溶解性が高く、そしてそれらをβ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル化β−およびγ−シクロデキストリン、スルホブチル化β−シクロデキストリン、分岐シクロデキストリン、アシル化β−およびγ−シクロデキストリンのメチル化誘導体として分類することができる。
【００１８】
Ｋｕｈｎ−Ｔｒｉｓｃｈｍａｎｎメチル化法、加圧下で塩化メチルを用いるワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）工業法、およびハロゲン化メチルおよび水素化ナトリウムを用いるＨａｋａｍｏｒｉメチル化によりシクロデキストリンをメチル化することができる（非特許文献１９）。最初の２つの技術を用いて無作為にメチル化されたシクロデキストリン混合物が生成された。一方のＨａｋａｍｏｒｉメチル化により完全にメチル化されたヘプタキス２，３，６−トリ−Ｏ−メチル化シクロデキストリンが生成されることが報告されている。親β−シクロデキストリンのヒドロキシ基の水素の位置にメチル置換基を導入することにより、この無作為にメチル化されたシクロデキストリンの溶解性が劇的に改善され、本発明では親β−シクロデキストリンに対してＲＡＭＥＢＣＤと称する。
【００１９】
β−シクロデキストリンには全部で２１個のヒドロキシル基（１４個の２次的ヒドロキシル基および７個の１次的ヒドロキシル基）がある。メチル基の数が約１３−１４に達するとＲＡＭＥＢＣＤの水溶性は増加し、そしてメチル化がβ−シクロデキストリンの分子あたりメトキシ基２１個に近づくと減少する。市販により入手可能なＲＡＭＥＢＣＤ生成物の実例を列挙することができ、１つはＷａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅにより製造され、そしてＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ Ｍ Ｐｈａｒｍａ（ＣＡＳ番号１２８４４６−３６−６）の名称のもとで市販されている。かかるＲＡＭＥＢＣＤの水溶性は典型的には〜２２０ｇ／１００ｍｌ水である。かかるＲＡＭＥＢＣＤは無水グルコース単位あたり〜１．７から１．９の平均メチル化度を有している。かかるＲＡＭＥＢＣＤは上記のとおり、市販により入手可能であり、そして非常に良好な水溶性を有している。かかるＲＡＭＥＢＣＤの一般的な構造を以下に示す：
【００２０】
【化２】
ＲＡＭＥＢＣＤの構造
【００２１】
アルカリ性溶液中でシクロデキストリンをプロピレンオキシドと反応させることにより、結果的に２−ヒドロキシプロピル誘導体を伴うシクロデキストリンのヒドロキシ基の置換に至る。ヒドロキシルのプロピレンオキシドとの高度な置換もまたオリゴマーヒドロキシプロピレンオキシド側鎖形成に至る。かかる２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを本発明ではＨＰＢＣＤと称し、以下の一般的な構造に従って表される。かかる材料は市販により入手可能である。
【００２２】
【化３】
ＨＰＢＣＤの構造
【００２３】
ＨＰＢＣＤと同様に、γ−シクロデキストリンをヒドロキシプロピル化して、本発明でＨＰＧＣＤと称するヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリンを得ることができる。かかる材料は市販により入手可能である。
【００２４】
【化４】
ＨＰＧＣＤの構造
【００２５】
眼科分野でのシクロデキストリンの適用に関してレビュー論文が公表された（非特許文献２０）。特許文献１はポリビニルピロリドンおよび界面活性剤、ポリエチレングリコール・グリセリルトリリシノレアートの使用によるフォルスコリンの水可溶化について記載している。この特許で得られたフォルスコリンの最大溶解性は０．２％である。
【００２６】
特許文献２は治療上有効量の、フォルスコリン、コルフォルシンおよび多酸素化ラブダン誘導体からなる群から選択される材料の投与による緑内障の処置のための組成物および方法を記載している。ここでは局所用懸濁液として眼に投与した場合、０．１％から０．４％の活性物質濃度が生理学的に有効であると報告されている。
【００２７】
特許文献３，特許文献４，特許文献５，特許文献６は新規の１２ハロゲン化フォルスコリン誘導体、その調製の中間体および方法、並びに化合物または組成物を利用する眼内圧を低下させる方法について記載している。
【００２８】
特許文献７は新規の１２ハロゲン化フォルスコリン誘導体、中間体およびその調製方法、並びに化合物または組成物を利用する眼内圧を低下させる方法について記載している。
【特許文献１】米国特許第６３４６２７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４４７６１４０号明細書
【特許文献３】米国特許第５０７０２０９号明細書
【特許文献４】米国特許第４９７８６７８号明細書
【特許文献５】米国特許第５０２３３４４号明細書
【特許文献６】米国特許第４８７１７６４号明細書
【特許文献７】欧州特許第０２６８２５６号明細書
【非特許文献１】Ｂｈａｔ，Ｓ．Ｖ．、Ｂａｊｗａ，Ｂ．Ｓ．、Ｄｏｒｎａｕｅｒ，Ｈ．、ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｎ．Ｊ．、Ｆｅｈｌａｂａｒ，Ｈ．−Ｗ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１８：１６６９（１９７７）
【非特許文献２】Ｂｈａｔ，Ｓ．Ｖ．、Ｄｏｈａｄｗａｌｌａ，Ａ．Ｎ．、Ｂａｊｗａ，Ｂ．Ｓ．、Ｄａｄｋａｒ，Ｎ．、Ｄｏｒｎａｕｅｒ，Ｈ．、ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｎ．Ｊ．、Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：４８６（１９８３）
【非特許文献３】Ｃａｐｒｉｏｌｉ Ｊ．Ｓｅａｒｓ Ｍ．、Ｌａｎｃｅｔ １（８３３１）：９５８−９６０（１９８３年４月３０日）
【非特許文献４】Ｂａｄｉａｎ，Ｍ．ら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ １８５：５２２６（１９８４）
【非特許文献５】Ｚｅｎｇ Ｓ．ら、Ｙａｎ Ｋｅ Ｘｕｅ Ｂａｏ １１：１７３−３７６（１９９５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ，Ｐ．Ｙ．ら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０５：２４９−２５２（１９８７）
【非特許文献７】Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｈ．ら、Ｓ．Ａｆｒ．Ｍｅｄ Ｊ．７１：５７０−５７１（１９８７）
【非特許文献８】Ｓｅｔｏ Ｃ．ら、Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ３０：２３８−２４４（１９８６）
【非特許文献９】Ｂｕｒｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｉ．ら、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３９：７４５−７４９（１９８４）
【非特許文献１０】Ｂｒｕｂａｋｅｒ Ｒ．Ｆ．ら、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０５：６３７−６４１（１９８７）
【非特許文献１１】Ｓｅａｒｓ，Ｍ．Ｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１００（１）：１９４−１９８（１９８５年７月１５日）
【非特許文献１２】Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ １（８３３１）：９５８−９６０（１９８３年４月３０日）
【非特許文献１３】Ｗｉｔｔｅ Ｐ．Ｕ．：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｂｏｍｂａｙ、インド、１７５−１８２（１９８５）
【非特許文献１４】Ｐｉｎｔｏ−Ｐｅｒｅｉｒａ Ｌ．：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｂｏｍｂａｙ、インド、１８３−１９０（１９８５）
【非特許文献１５】Ｌａｌ，Ｂ．、Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．Ｋ．、Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．、Ｇｈａｔｅ，Ａ．Ｖ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（１１）：２０６１−２０７３（１９９８）
【非特許文献１６】Ｌａｌ，Ｂ．、Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．Ｋ．、Ｇｉｄｗａｎｉ，Ｒ．Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．、Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．、Ｇｈａｔｅ，Ａ．Ｖ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（１１）：２０７５−２０８３（１９９８）
【非特許文献１７】Ｌｏｆｔｓｓｏｎ，Ｔ．、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８５：１０１７（１９９６）
【非特許文献１８】Ｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．、Ｓｔｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８５：１１４２（１９９６）
【非特許文献１９】Ｓｚｅｎｔｅ，Ｌ．、Ｓｚｅｊｔｌｉ，Ｊ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ３６：１７（１９９６）
【非特許文献２０】Ｌｏｆｔｓｓｏｎａ，Ｔ．、Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｔ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３６：５９（１９９９）
【非特許文献２１】Ｂｏｎｏｍｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５（９）：７８１−４（１９７６年９月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
しかしながら、これらの先行技術の参照文献は１％またはそれ以上の濃度の透明な水溶液を得るための未修飾フォルスコリンの可溶化については記載していない。本発明はおよそ６％までの濃度の、水に難溶性かまたは不溶性のジテルペン、例えばフォルスコリンの水溶液の調製について記載する。適当に置換されたシクロデキストリンを可溶化剤として使用してこれらの溶液を調製する。シクロデキストリンの不在下では、フォルスコリンは水にほとんど不溶性であり、約０．００１％濃度の溶液しか得られない。より多量の活性成分を含有するフォルスコリンおよび／またはその同族物質の水溶液を局所的および全身的に使用して、多様な健康上の利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
フォルスコリンは以下の構造を有している：
【化５】
フォルスコリンの構造
【００３１】
非常に関連した異性体をイソフォルスコリンと称し、そしてそれは以下の構造を有している：
【化６】
イソフォルスコリンの構造
【００３２】
イソフォルスコリンはまたフォルスコリンに類似する多くの薬理学特性を有していることも報告されている。これらの６つの市販により入手可能なシクロデキストリン、すなわちα−、β−、γ−シクロデキストリンおよびその誘導生成物、例えばＲＡＭＥＢＣＤ、ＨＰＢＣＤ、ＨＰＧＣＤを用いて比較的難溶性のフォルスコリンを可溶化した。
【００３３】
シクロデキストリンを用いてフォルスコリンを可溶化するために、選択されたシクロデキストリンおよびフォルスコリンを特定の比率で水中で混合する。水溶液を濾過してすべての不溶性粒子を除去し、水中のフォルスコリンの透明な水溶液が得られた。
【００３４】
また別の方法では、特定の比率のシクロデキストリンおよびフォルスコリンを適当な溶媒、例えばエタノールまたはアセトンまたは酢酸エチルに溶解する。溶媒を除去して白色粉末を残す。実施例で説明するように、かかる粉末は水に自由に溶解する。さらに、フォルスコリンの水溶液に添加剤を加えることもできる。これらの添加剤は通常、無菌状態を維持すること、ｐＨ維持、浸透圧の維持のために用いられる。
【００３５】
かかる添加剤の選択には広く多様な選択が存在する。説明用の実施例では保存剤として塩化ベンザルコニウムを用いるが、多くのその他のもの、例えば塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、チメロサール等を同等に選択することができる。
【００３６】
抗酸化剤、例えばＥＤＴＡの二ナトリウム塩を用いて調製物を安定化する。その他の抗酸化剤、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、チオ尿素等を用いることもできる。
【００３７】
とりわけ眼科用溶液には、眼科用溶液に望ましい粘性は２５から５０ｃｐｓの範囲である。粘性増強剤、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に記載する実施例は説明用の実施例としての目的のためだけに提供され、本発明の広い範囲をいかなるようにも限定するものではない。
【実施例１】
【００３９】
フォルスコリンの水溶解性の決定。
フォルスコリン（３００ｍｇ）を１０５℃で６時間乾燥した。乾燥したフォルスコリン２００ｍｇを水１００ｍｌと共に４８時間攪拌し、環境温度での固有の溶解性を決定した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析した。ＨＰＬＣによるフォルスコリン含量は０．０１ｍｇ／ｍｌまたは０．００１（重量／容量）％、換言すれば、フォルスコリンは水中で〜０．００１（重量／容量）％の溶解性を有する。
【実施例２】
【００４０】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、２５ｍｇ）を溶解状態のヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）５００ｍｇを含有する水１ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、〜３０℃の温度で６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．３３ｍｇ／ｍｌまたは０．１３３（重量／容量）％であった。
【実施例３】
【００４１】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、５０ｍｇ）を溶解状態のヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）５００ｍｇを含有する水１ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、〜３０℃の温度で６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．５２ｍｇ／ｍｌまたは０．１５２（重量／容量）％であった。
【実施例４】
【００４２】
塩化メチレンから、および酢酸エチルから再結晶化することにより、フォルスコリンの結晶化度を「変化させる」ことにより実験を実施した。得られた「非晶性」フォルスコリンをヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）との複合化に使用した。二塩化メチレンで再結晶化したフォルスコリン（２９．３ｍｇ）（フォルスコリンアッセイ９９．０％）を、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）１．５ｇを含有する水３ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で１６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．７４ｍｇ／ｍｌまたは０．１７４（重量／容量）％であった。
【実施例５】
【００４３】
酢酸エチルで再結晶化したフォルスコリン（３０．３ｍｇ）（フォルスコリンアッセイ９８．８％）を、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）１．５ｇを含有する水３ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で１６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、３．３８ｍｇ／ｍｌまたは０．３３８（重量／容量）％であった。
【実施例６】
【００４４】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、３３０ｍｇ）をＲＡＭＥＢＣＤ ４ｇを含有する水１０ｍｌ（〜４０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で４０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、２０．４６ｍｇ／ｍｌまたは２．０４６（重量／容量）％であった。
【実施例７】
【００４５】
５から６６％にわたる、異なる濃度のＲＡＭＥＢＣＤでフォルスコリンの水中の溶解性を決定した。これらの関係はほぼ直線的であり、そしてＲＡＭＥＢＣＤの濃度の上昇に従ってフォルスコリンの溶解性が上昇することを示している。
【表１】
【実施例８】
【００４６】
シクロデキストリンを伴うフォルスコリンの典型的な水性処方を以下のように調製し、ＲＡＭＥＢＣＤをシクロデキストリンの実例として使用する。機械もしくは電磁攪拌装置の付いた１リットルフラスコにＲＡＭＥＢＣＤ（１００ｇ）を取る。フォルスコリン（５．５ｇ）をフラスコに入れた。水（４００ｍｌ）をフラスコに入れ、そして内容物を室温で振盪した。透明な溶液が得られる。何らかの未溶解のフォルスコリン粒子が認められる場合、これらを再懸濁し、そして攪拌する。塩化ベンザルコニウム（５０ｍｇ）およびＥＤＴＡ二ナトリウム（５００ｍｇ）を加え、そしてフラスコ中で溶解する。０．１Ｎ 水酸化ナトリウムの助けを借りて、内容物のｐＨを望ましい範囲まで調整することができる。（通常ｐＨ範囲は３．５から７．５である）。計算量の塩化ナトリウム溶液を加えて、０．９％の塩化ナトリウムの浸透圧に等しい、溶液の浸透圧を維持する。滅菌濾過の後、溶液の全容量を５００ｍｌにする。このようにして調製された溶液は溶解状態でおよそ１％のフォルスコリンを有する。その他のシクロデキストリンを使用することもでき、そして使用したシクロデキストリンに依存して、水中のフォルスコリンの溶解した含量は異なる。
【実施例９】
【００４７】
フォルスコリン（５０ｍｇ）をアセトン５ｍｌに溶解し、そしてＲＡＭＥＢＣＤ１ｇを別個にアセトン５ｍｌに溶解した。双方の溶液を一緒に混合し、そして溶媒アセトンを減圧下蒸発させた。残留物を乾燥し、そして水 ５ｍｌに溶解した。この残留物は１時間以内の攪拌で非常に容易に溶解し、無色透明の溶液を形成した。
【実施例１０】
【００４８】
イソフォルスコリンもまたフォルスコリンの代わりに使用することもできる。１つの調製物では、イソフォルスコリン（５０ｍｇ）を適量のシクロデキストリンを含有する水、例えば水約１００ｍｌ中にＲＡＭＥＢＣＤを２０ｇ含有する水に再懸濁した。室温で振盪した後、溶液を濾過し、そして得られた溶液をＨＰＬＣにより分析し、これによりおよそ０．５％のイソフォルスコリンの存在が示された。ＲＡＭＥＢＣＤの量を変化させることにより溶解したイソフォルスコリンの量を変化させることができる。
【実施例１１】
【００４９】
調製物の生物学的活性を説明するための実施例を提示する。フォルスコリン組成物の抗緑内障活性を白ウサギで研究した。実施例８で記載した水中にフォルスコリンを１％含有する溶液を実験に使用した。
【００５０】
試験設計：動物モデル：白ウサギ。群数：４群。各群の動物数：処置群で６匹、および対照群で２匹。
【００５１】
材料および方法：雌雄双方のニュージーランド系白ウサギ６匹、体重１．０から１．５ポンドを選択した。ウサギを清潔で、そして十分に換気されたオープンスペースで飼育した。各ウサギに標準的な食餌を毎日与え、そして試験中水を自由に与えた。
【００５２】
非特許文献２１に報告された方法により高眼圧症を誘起した。ウサギに４ｍｇ／ｍｌベタメタゾンナトリウムを含有するベトネゾールの０．３ｍｌ結膜下注射を、毎日、各眼に３週間行った（文献どおりに第３週に眼内圧（ＩＯＰ）が最大になった）。結膜下注射に先立って、局所麻酔プロプラカイン点眼剤を使用した。
【００５３】
各ウサギの左眼を緑内障の対照として残し、そして右眼をフォルスコリン、チモロール、およびプラセボを用いて緑内障に関して処置した。
【００５４】
各処置に関して、非接触型眼圧計（ＮＣＴ）を用いて３０分間隔で２１０分までＩＯＰの読みを測定した。
【００５５】
結果：
【表２】
【００５６】
統計分析：
プラセボ、フォルスコリンおよびチモロールのＩＯＰの読みをＡＮＯＶＡ（一方向）に供した。ｐ値は０．００２２であり、これは非常に有意であり、列平均の変動は偶然ではないことを示している。
【００５７】
プラセボおよびフォルスコリンのＩＯＰの読みを「ｔ」検定に供して、フォルスコリンおよびプラセボの中央値が有意に異なるかどうかを決定した。ｐ値は０．０１７７であると解り、これは有意であると考えられる。同様に、プラセボおよびチモロールのＩＯＰの読みは０．００８７のｐ値を有し、これもまた有意である。
【００５８】
フォルスコリンおよびチモロールのＩＯＰの読みもまた「ｔ」検定に供した。ｐ値は０．３９９９であると解り、これは有意ではないと考えられ、このことはフォルスコリン調製物の活性はチモロールと有意に異ならないことを意味した。
【００５９】
結論：フォルスコリン組成物はチモロールに匹敵する抗緑内障活性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は水に難溶性かまたは不溶性であるジテルペン、例えばフォルスコリンの、約６％までの濃度の水溶液の調製について記載する。可溶化剤として適当に置換されたシクロデキストリンを用いてこれらの溶液を調製する。シクロデキストリンの不在下では、フォルスコリンはほとんど水に不溶性であり、約０．００１％の濃度の溶液しか生じない。より多量の活性成分を含有するフォルスコリンおよび／またはその同族物質の水溶液を局所的および全身的に使用して多様な健康上の利点を提供することができる。
【背景技術】
【０００２】
特定の活性医薬用成分は水または水性ビヒクルに本質的に不溶性または難溶性である。その意図される使用に水または水性ビヒクルでの適用が必要となり得ることが頻繁にある。安定な形態でかかる水に不溶性の活性医薬用成分の治療上活性な濃度を達成することが積極的に追求されてきている。水に不溶性である活性医薬用成分の分子構造操作の技術を適用できるが、水溶性を促進する構造的特徴を組み込むことは、意図される望ましい薬理学的特性の減衰または変化に至る可能性がある。従って、その元来の構造形態で、その他の手段により活性成分を可溶化する方法を考案するのが恐らく最も望ましい。
【０００３】
薬物の水溶性は多様な角度から望ましい特徴である。標準的な技術、例えば濾過等により水性処方を滅菌し、かかる調製物を全身投与に適したものにする。水性調製物はまた皮膚科、婦人科、耳科、鼻科および粘膜への適用に好ましい。薬物の水性の眼科用調製物がとりわけ有用である。
【０００４】
フォルスコリン（ＣＡＳ番号６６５７５−２９−９）はコレウス・フォルスコリに由来する天然発生のラブダン型ジテルペンである（非特許文献１）。これはいくつかの望ましい薬理学的特性を有している。
【０００５】
フォルスコリンは陽性変力作用、抗高血圧作用、および気管支鎮痙活性を示す。（非特許文献２）
【０００６】
これは眼内圧を低下させる（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６，非特許文献７，非特許文献８，非特許文献９，非特許文献１０）。
【０００７】
アデニル酸シクラーゼの強力な非アドレナリン作動性刺激要因であるフォルスコリンの使用により、ヒトの眼におけるアデニル酸シクラーゼ刺激の効果の非侵襲性の研究が可能になった。すなわち房水動態においてサイクリックＡＭＰ生成を増加させた。眼内圧の低下、流入の低下、および流出能力の未変化の結果に基づいて、この研究の著者は、これらの観察が、活性毛様体上皮アデニル酸シクラーゼレセプター複合体が正味の水の流入を低下させることができるという考えを支持すると主張した（非特許文献１１）。
【０００８】
その他の報告は、フォルスコリンの硝子体内注射または局所投与は、流出能力を全く上昇させずに、水流入を低下させることによりウサギの眼内圧を有意に低下させることを示した。健常者ボランティアにおけるフォルスコリン懸濁液の局所適用は流出能力を変化させずに眼内圧および水流の有意な低下を引き起こした（非特許文献１２）。
【０００９】
フォルスコリン点眼剤（０．３％−０．６％−１．０％）の二重盲検個体間比較を１８人の健常男性対象（各群６人）において行った。この研究により、フォルスコリン点眼剤０．３％−０．６％−１．０％が健常男性対象の眼内圧を低下させることが実証された。眼内圧の低下は２３から２８％の間であり、そして効果の持続期間は濃度に従って３から５時間まで延長された（非特許文献１３）。
【００１０】
研究者の別のグループは開放隅角緑内障の成人患者においてフォルスコリン点眼剤を用いた２つの研究を報告した。１つの研究では２６人の患者が含まれた（プラセボ群なし）。第２の研究では、１１人の緑内障患者がフォルスコリンを投与された。研究１では、眼内圧が低下し、これは１時間から４時間まで認められた。研究２では、フォルスコリンは６時間まで眼内圧を低下させた。プラセボ群では眼内圧に変化はなかった。これらの研究では、カルボキシルメチルセルロース中のフォルスコリン１％懸濁液を使用した（非特許文献１４）。
【００１１】
ｃＡＭＰのレベルを上昇させることにより、多様な生物学的活性が観察され、そして結果的にタンパク質キナーゼが活性化された。かかる特性により、フォルスコリンの非常に多くの用途が導かれる。かかる活性のために、フォルスコリンの生理学的特性を扱う１５００以上の引用文献が２００１年のケミカルアブストラクト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｒａｃｔｓ）に登場した。しかしながら、フォルスコリンは水に非常に不溶性である。
【００１２】
水溶性であるようなフォルスコリンの誘導体を作製するために、フォルスコリンの分子操作に関して集中的な努力が為されている。かかる試みはいつも、半ば成功、半ば失敗を経験している（非特許文献１５，非特許文献１６）。
【００１３】
薬物分子構造の化学的操作の代替として、誘導体化されない薬物の水中での溶解性を増強する物理化学的技術が用いられている。注目される技術には表面活性成分を用いるミセル可溶化が含まれ、これは薬物を含有する水溶性ミセルを形成する。別の関連する技術は薬物分子とホスト分子との複合化である。ホスト分子は通常水中で良好な溶解性を有する分子である。ホスト分子は薬物分子と何ら共有結合を形成しないが、非共有結合性相互作用により弱い複合体を形成し、そして（複数の）ホスト分子が（複数の）薬物分子を水溶液中に留める。
【００１４】
シクロデキストリンは有用な医薬用賦形剤として認識されている環状オリゴ糖である。一般的なシクロデキストリンは環状オリゴ糖構造のグルコース分子の数に依存して、α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンと称されている。これらのシクロデキストリンは、比較的疎水性の中心腔および親水性の外表面を含有するα−Ｄ−グルコピラノースの（α−１，４）−連結されたオリゴ糖である。これらの分子は、糖分子単位の連結結合に関する完全な自由回転の制限のために正確に完全な円筒状ではない。これはトーラスまたは円錐台の形状をとる。２次的なヒドロキシル基が周縁のより広い縁部の線を描き、一方１次的ヒドロキシル基はトーラスの狭い側の線を描く。これらの分子の水中の溶解性および中心腔の直径は公知であり、そして公表されている（非特許文献１７，非特許文献１８）。７個のグルコース単位を含有するβ−シクロデキストリンの構造を実例として以下に示す。
【００１５】
【化１】
ベータ−シクロデキストリンの構造
【００１６】
α−シクロデキストリンは環に６個の無水グルコース分子を有する。γ−およびδ−シクロデキストリンは各々８個および９個を有する。α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンは２５℃で各々１４．５、１．８５、２３．２および８．１９（ｇ／１００ｍｌ）の水溶性を有する。α−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンはしばしば天然シクロデキストリンと称され、そしてその水溶性は望ましい範囲の下端である。それにもかかわらず、それらはいくつかの水不溶性分子のための非常に良好な可溶化剤を提供する。これらの天然シクロデキストリンの水溶性を増加させるために、文献では、これらのα−、β−、γ−およびδ−シクロデキストリンの分子修飾が実施されている。
【００１７】
これらの修飾されたシクロデキストリンはその天然の対応物よりも非常に溶解性が高く、そしてそれらをβ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル化β−およびγ−シクロデキストリン、スルホブチル化β−シクロデキストリン、分岐シクロデキストリン、アシル化β−およびγ−シクロデキストリンのメチル化誘導体として分類することができる。
【００１８】
Ｋｕｈｎ−Ｔｒｉｓｃｈｍａｎｎメチル化法、加圧下で塩化メチルを用いるワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）工業法、およびハロゲン化メチルおよび水素化ナトリウムを用いるＨａｋａｍｏｒｉメチル化によりシクロデキストリンをメチル化することができる（非特許文献１９）。最初の２つの技術を用いて無作為にメチル化されたシクロデキストリン混合物が生成された。一方のＨａｋａｍｏｒｉメチル化により完全にメチル化されたヘプタキス２，３，６−トリ−Ｏ−メチル化シクロデキストリンが生成されることが報告されている。親β−シクロデキストリンのヒドロキシ基の水素の位置にメチル置換基を導入することにより、この無作為にメチル化されたシクロデキストリンの溶解性が劇的に改善され、本発明では親β−シクロデキストリンに対してＲＡＭＥＢＣＤと称する。
【００１９】
β−シクロデキストリンには全部で２１個のヒドロキシル基（１４個の２次的ヒドロキシル基および７個の１次的ヒドロキシル基）がある。メチル基の数が約１３−１４に達するとＲＡＭＥＢＣＤの水溶性は増加し、そしてメチル化がβ−シクロデキストリンの分子あたりメトキシ基２１個に近づくと減少する。市販により入手可能なＲＡＭＥＢＣＤ生成物の実例を列挙することができ、１つはＷａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅにより製造され、そしてＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ Ｍ Ｐｈａｒｍａ（ＣＡＳ番号１２８４４６−３６−６）の名称のもとで市販されている。かかるＲＡＭＥＢＣＤの水溶性は典型的には〜２２０ｇ／１００ｍｌ水である。かかるＲＡＭＥＢＣＤは無水グルコース単位あたり〜１．７から１．９の平均メチル化度を有している。かかるＲＡＭＥＢＣＤは上記のとおり、市販により入手可能であり、そして非常に良好な水溶性を有している。かかるＲＡＭＥＢＣＤの一般的な構造を以下に示す：
【００２０】
【化２】
ＲＡＭＥＢＣＤの構造
【００２１】
アルカリ性溶液中でシクロデキストリンをプロピレンオキシドと反応させることにより、結果的に２−ヒドロキシプロピル誘導体を伴うシクロデキストリンのヒドロキシ基の置換に至る。ヒドロキシルのプロピレンオキシドとの高度な置換もまたオリゴマーヒドロキシプロピレンオキシド側鎖形成に至る。かかる２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを本発明ではＨＰＢＣＤと称し、以下の一般的な構造に従って表される。かかる材料は市販により入手可能である。
【００２２】
【化３】
ＨＰＢＣＤの構造
【００２３】
ＨＰＢＣＤと同様に、γ−シクロデキストリンをヒドロキシプロピル化して、本発明でＨＰＧＣＤと称するヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリンを得ることができる。かかる材料は市販により入手可能である。
【００２４】
【化４】
ＨＰＧＣＤの構造
【００２５】
眼科分野でのシクロデキストリンの適用に関してレビュー論文が公表された（非特許文献２０）。特許文献１はポリビニルピロリドンおよび界面活性剤、ポリエチレングリコール・グリセリルトリリシノレアートの使用によるフォルスコリンの水可溶化について記載している。この特許で得られたフォルスコリンの最大溶解性は０．２％である。
【００２６】
特許文献２は治療上有効量の、フォルスコリン、コルフォルシンおよび多酸素化ラブダン誘導体からなる群から選択される材料の投与による緑内障の処置のための組成物および方法を記載している。ここでは局所用懸濁液として眼に投与した場合、０．１％から０．４％の活性物質濃度が生理学的に有効であると報告されている。
【００２７】
特許文献３，特許文献４，特許文献５，特許文献６は新規の１２ハロゲン化フォルスコリン誘導体、その調製の中間体および方法、並びに化合物または組成物を利用する眼内圧を低下させる方法について記載している。
【００２８】
特許文献７は新規の１２ハロゲン化フォルスコリン誘導体、中間体およびその調製方法、並びに化合物または組成物を利用する眼内圧を低下させる方法について記載している。
【特許文献１】米国特許第６３４６２７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４４７６１４０号明細書
【特許文献３】米国特許第５０７０２０９号明細書
【特許文献４】米国特許第４９７８６７８号明細書
【特許文献５】米国特許第５０２３３４４号明細書
【特許文献６】米国特許第４８７１７６４号明細書
【特許文献７】欧州特許第０２６８２５６号明細書
【非特許文献１】Ｂｈａｔ，Ｓ．Ｖ．、Ｂａｊｗａ，Ｂ．Ｓ．、Ｄｏｒｎａｕｅｒ，Ｈ．、ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｎ．Ｊ．、Ｆｅｈｌａｂａｒ，Ｈ．−Ｗ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１８：１６６９（１９７７）
【非特許文献２】Ｂｈａｔ，Ｓ．Ｖ．、Ｄｏｈａｄｗａｌｌａ，Ａ．Ｎ．、Ｂａｊｗａ，Ｂ．Ｓ．、Ｄａｄｋａｒ，Ｎ．、Ｄｏｒｎａｕｅｒ，Ｈ．、ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｎ．Ｊ．、Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：４８６（１９８３）
【非特許文献３】Ｃａｐｒｉｏｌｉ Ｊ．Ｓｅａｒｓ Ｍ．、Ｌａｎｃｅｔ １（８３３１）：９５８−９６０（１９８３年４月３０日）
【非特許文献４】Ｂａｄｉａｎ，Ｍ．ら、Ｋｌｉｎ Ｍｏｎａｔｓｂｌ Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｄ １８５：５２２６（１９８４）
【非特許文献５】Ｚｅｎｇ Ｓ．ら、Ｙａｎ Ｋｅ Ｘｕｅ Ｂａｏ １１：１７３−３７６（１９９５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ，Ｐ．Ｙ．ら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０５：２４９−２５２（１９８７）
【非特許文献７】Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｈ．ら、Ｓ．Ａｆｒ．Ｍｅｄ Ｊ．７１：５７０−５７１（１９８７）
【非特許文献８】Ｓｅｔｏ Ｃ．ら、Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ３０：２３８−２４４（１９８６）
【非特許文献９】Ｂｕｒｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｉ．ら、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３９：７４５−７４９（１９８４）
【非特許文献１０】Ｂｒｕｂａｋｅｒ Ｒ．Ｆ．ら、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０５：６３７−６４１（１９８７）
【非特許文献１１】Ｓｅａｒｓ，Ｍ．Ｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１００（１）：１９４−１９８（１９８５年７月１５日）
【非特許文献１２】Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ １（８３３１）：９５８−９６０（１９８３年４月３０日）
【非特許文献１３】Ｗｉｔｔｅ Ｐ．Ｕ．：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｂｏｍｂａｙ、インド、１７５−１８２（１９８５）
【非特許文献１４】Ｐｉｎｔｏ−Ｐｅｒｅｉｒａ Ｌ．：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｂｏｍｂａｙ、インド、１８３−１９０（１９８５）
【非特許文献１５】Ｌａｌ，Ｂ．、Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．Ｋ．、Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．、Ｇｈａｔｅ，Ａ．Ｖ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（１１）：２０６１−２０７３（１９９８）
【非特許文献１６】Ｌａｌ，Ｂ．、Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．Ｋ．、Ｇｉｄｗａｎｉ，Ｒ．Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．、Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．、Ｇｈａｔｅ，Ａ．Ｖ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（１１）：２０７５−２０８３（１９９８）
【非特許文献１７】Ｌｏｆｔｓｓｏｎ，Ｔ．、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８５：１０１７（１９９６）
【非特許文献１８】Ｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．、Ｓｔｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８５：１１４２（１９９６）
【非特許文献１９】Ｓｚｅｎｔｅ，Ｌ．、Ｓｚｅｊｔｌｉ，Ｊ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ３６：１７（１９９６）
【非特許文献２０】Ｌｏｆｔｓｓｏｎａ，Ｔ．、Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｔ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３６：５９（１９９９）
【非特許文献２１】Ｂｏｎｏｍｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５（９）：７８１−４（１９７６年９月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
しかしながら、これらの先行技術の参照文献は１％またはそれ以上の濃度の透明な水溶液を得るための未修飾フォルスコリンの可溶化については記載していない。本発明はおよそ６％までの濃度の、水に難溶性かまたは不溶性のジテルペン、例えばフォルスコリンの水溶液の調製について記載する。適当に置換されたシクロデキストリンを可溶化剤として使用してこれらの溶液を調製する。シクロデキストリンの不在下では、フォルスコリンは水にほとんど不溶性であり、約０．００１％濃度の溶液しか得られない。より多量の活性成分を含有するフォルスコリンおよび／またはその同族物質の水溶液を局所的および全身的に使用して、多様な健康上の利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
フォルスコリンは以下の構造を有している：
【化５】
フォルスコリンの構造
【００３１】
非常に関連した異性体をイソフォルスコリンと称し、そしてそれは以下の構造を有している：
【化６】
イソフォルスコリンの構造
【００３２】
イソフォルスコリンはまたフォルスコリンに類似する多くの薬理学特性を有していることも報告されている。これらの６つの市販により入手可能なシクロデキストリン、すなわちα−、β−、γ−シクロデキストリンおよびその誘導生成物、例えばＲＡＭＥＢＣＤ、ＨＰＢＣＤ、ＨＰＧＣＤを用いて比較的難溶性のフォルスコリンを可溶化した。
【００３３】
シクロデキストリンを用いてフォルスコリンを可溶化するために、選択されたシクロデキストリンおよびフォルスコリンを特定の比率で水中で混合する。水溶液を濾過してすべての不溶性粒子を除去し、水中のフォルスコリンの透明な水溶液が得られた。
【００３４】
また別の方法では、特定の比率のシクロデキストリンおよびフォルスコリンを適当な溶媒、例えばエタノールまたはアセトンまたは酢酸エチルに溶解する。溶媒を除去して白色粉末を残す。実施例で説明するように、かかる粉末は水に自由に溶解する。さらに、フォルスコリンの水溶液に添加剤を加えることもできる。これらの添加剤は通常、無菌状態を維持すること、ｐＨ維持、浸透圧の維持のために用いられる。
【００３５】
かかる添加剤の選択には広く多様な選択が存在する。説明用の実施例では保存剤として塩化ベンザルコニウムを用いるが、多くのその他のもの、例えば塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、チメロサール等を同等に選択することができる。
【００３６】
抗酸化剤、例えばＥＤＴＡの二ナトリウム塩を用いて調製物を安定化する。その他の抗酸化剤、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、チオ尿素等を用いることもできる。
【００３７】
とりわけ眼科用溶液には、眼科用溶液に望ましい粘性は２５から５０ｃｐｓの範囲である。粘性増強剤、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に記載する実施例は説明用の実施例としての目的のためだけに提供され、本発明の広い範囲をいかなるようにも限定するものではない。
【実施例１】
【００３９】
フォルスコリンの水溶解性の決定。
フォルスコリン（３００ｍｇ）を１０５℃で６時間乾燥した。乾燥したフォルスコリン２００ｍｇを水１００ｍｌと共に４８時間攪拌し、環境温度での固有の溶解性を決定した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析した。ＨＰＬＣによるフォルスコリン含量は０．０１ｍｇ／ｍｌまたは０．００１（重量／容量）％、換言すれば、フォルスコリンは水中で〜０．００１（重量／容量）％の溶解性を有する。
【実施例２】
【００４０】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、２５ｍｇ）を溶解状態のヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）５００ｍｇを含有する水１ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、〜３０℃の温度で６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．３３ｍｇ／ｍｌまたは０．１３３（重量／容量）％であった。
【実施例３】
【００４１】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、５０ｍｇ）を溶解状態のヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）５００ｍｇを含有する水１ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、〜３０℃の温度で６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．５２ｍｇ／ｍｌまたは０．１５２（重量／容量）％であった。
【実施例４】
【００４２】
塩化メチレンから、および酢酸エチルから再結晶化することにより、フォルスコリンの結晶化度を「変化させる」ことにより実験を実施した。得られた「非晶性」フォルスコリンをヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）との複合化に使用した。二塩化メチレンで再結晶化したフォルスコリン（２９．３ｍｇ）（フォルスコリンアッセイ９９．０％）を、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）１．５ｇを含有する水３ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で１６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、１．７４ｍｇ／ｍｌまたは０．１７４（重量／容量）％であった。
【実施例５】
【００４３】
酢酸エチルで再結晶化したフォルスコリン（３０．３ｍｇ）（フォルスコリンアッセイ９８．８％）を、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）１．５ｇを含有する水３ｍｌ（〜５０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で１６０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、３．３８ｍｇ／ｍｌまたは０．３３８（重量／容量）％であった。
【実施例６】
【００４４】
フォルスコリン（９８．５％アッセイ、３３０ｍｇ）をＲＡＭＥＢＣＤ ４ｇを含有する水１０ｍｌ（〜４０％）に加えた。懸濁液を等温振盪器中、３０℃の温度で４０時間、７５ｒｐｍで振盪した。得られた溶液を０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣによりフォルスコリン含量を分析し、２０．４６ｍｇ／ｍｌまたは２．０４６（重量／容量）％であった。
【実施例７】
【００４５】
５から６６％にわたる、異なる濃度のＲＡＭＥＢＣＤでフォルスコリンの水中の溶解性を決定した。これらの関係はほぼ直線的であり、そしてＲＡＭＥＢＣＤの濃度の上昇に従ってフォルスコリンの溶解性が上昇することを示している。
【表１】
【実施例８】
【００４６】
シクロデキストリンを伴うフォルスコリンの典型的な水性処方を以下のように調製し、ＲＡＭＥＢＣＤをシクロデキストリンの実例として使用する。機械もしくは電磁攪拌装置の付いた１リットルフラスコにＲＡＭＥＢＣＤ（１００ｇ）を取る。フォルスコリン（５．５ｇ）をフラスコに入れた。水（４００ｍｌ）をフラスコに入れ、そして内容物を室温で振盪した。透明な溶液が得られる。何らかの未溶解のフォルスコリン粒子が認められる場合、これらを再懸濁し、そして攪拌する。塩化ベンザルコニウム（５０ｍｇ）およびＥＤＴＡ二ナトリウム（５００ｍｇ）を加え、そしてフラスコ中で溶解する。０．１Ｎ 水酸化ナトリウムの助けを借りて、内容物のｐＨを望ましい範囲まで調整することができる。（通常ｐＨ範囲は３．５から７．５である）。計算量の塩化ナトリウム溶液を加えて、０．９％の塩化ナトリウムの浸透圧に等しい、溶液の浸透圧を維持する。滅菌濾過の後、溶液の全容量を５００ｍｌにする。このようにして調製された溶液は溶解状態でおよそ１％のフォルスコリンを有する。その他のシクロデキストリンを使用することもでき、そして使用したシクロデキストリンに依存して、水中のフォルスコリンの溶解した含量は異なる。
【実施例９】
【００４７】
フォルスコリン（５０ｍｇ）をアセトン５ｍｌに溶解し、そしてＲＡＭＥＢＣＤ１ｇを別個にアセトン５ｍｌに溶解した。双方の溶液を一緒に混合し、そして溶媒アセトンを減圧下蒸発させた。残留物を乾燥し、そして水 ５ｍｌに溶解した。この残留物は１時間以内の攪拌で非常に容易に溶解し、無色透明の溶液を形成した。
【実施例１０】
【００４８】
イソフォルスコリンもまたフォルスコリンの代わりに使用することもできる。１つの調製物では、イソフォルスコリン（５０ｍｇ）を適量のシクロデキストリンを含有する水、例えば水約１００ｍｌ中にＲＡＭＥＢＣＤを２０ｇ含有する水に再懸濁した。室温で振盪した後、溶液を濾過し、そして得られた溶液をＨＰＬＣにより分析し、これによりおよそ０．５％のイソフォルスコリンの存在が示された。ＲＡＭＥＢＣＤの量を変化させることにより溶解したイソフォルスコリンの量を変化させることができる。
【実施例１１】
【００４９】
調製物の生物学的活性を説明するための実施例を提示する。フォルスコリン組成物の抗緑内障活性を白ウサギで研究した。実施例８で記載した水中にフォルスコリンを１％含有する溶液を実験に使用した。
【００５０】
試験設計：動物モデル：白ウサギ。群数：４群。各群の動物数：処置群で６匹、および対照群で２匹。
【００５１】
材料および方法：雌雄双方のニュージーランド系白ウサギ６匹、体重１．０から１．５ポンドを選択した。ウサギを清潔で、そして十分に換気されたオープンスペースで飼育した。各ウサギに標準的な食餌を毎日与え、そして試験中水を自由に与えた。
【００５２】
非特許文献２１に報告された方法により高眼圧症を誘起した。ウサギに４ｍｇ／ｍｌベタメタゾンナトリウムを含有するベトネゾールの０．３ｍｌ結膜下注射を、毎日、各眼に３週間行った（文献どおりに第３週に眼内圧（ＩＯＰ）が最大になった）。結膜下注射に先立って、局所麻酔プロプラカイン点眼剤を使用した。
【００５３】
各ウサギの左眼を緑内障の対照として残し、そして右眼をフォルスコリン、チモロール、およびプラセボを用いて緑内障に関して処置した。
【００５４】
各処置に関して、非接触型眼圧計（ＮＣＴ）を用いて３０分間隔で２１０分までＩＯＰの読みを測定した。
【００５５】
結果：
【表２】
【００５６】
統計分析：
プラセボ、フォルスコリンおよびチモロールのＩＯＰの読みをＡＮＯＶＡ（一方向）に供した。ｐ値は０．００２２であり、これは非常に有意であり、列平均の変動は偶然ではないことを示している。
【００５７】
プラセボおよびフォルスコリンのＩＯＰの読みを「ｔ」検定に供して、フォルスコリンおよびプラセボの中央値が有意に異なるかどうかを決定した。ｐ値は０．０１７７であると解り、これは有意であると考えられる。同様に、プラセボおよびチモロールのＩＯＰの読みは０．００８７のｐ値を有し、これもまた有意である。
【００５８】
フォルスコリンおよびチモロールのＩＯＰの読みもまた「ｔ」検定に供した。ｐ値は０．３９９９であると解り、これは有意ではないと考えられ、このことはフォルスコリン調製物の活性はチモロールと有意に異ならないことを意味した。
【００５９】
結論：フォルスコリン組成物はチモロールに匹敵する抗緑内障活性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然または合成起源の、ジテルペン、例えばフォルスコリン、イソフォルスコリン、７−デアセチルフォルスコリン、その同族物質、アナログおよび誘導体を個々にまたは混合物として水中に可溶化する方法。
【請求項２】
植物供給源、非限定例としてはコレウス・フォルスコリから得ることができる請求項１のジテルペン。
【請求項３】
使用する可溶化剤がα−、β−、γ−シクロデキストリンまたはその誘導生成物、例えば無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢＣＤ）、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）であって、好ましくは無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢＣＤ）を複合化剤として使用する請求項１の方法。
【請求項４】
０．０９％から６％のジテルペン、例えばフォルスコリン、イソフォルスコリン、そのアナログまたは誘導体を含有する透明な溶液を、その化合物を５％から７０％のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と混合することにより調製する方法。
【請求項５】
活性な化合物をエタノール、アセトン、酢酸エチル、塩化メチレンまたはその他の溶媒から選択される有機溶媒から再結晶化し、続いて水中での材料の懸濁液を形成し、次いで室温で４０から１６０時間振盪し、そして濾過することによりシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と複合化する方法。
【請求項６】
眼科用、局所用および全身用用途に適した０．０９％から６％のジテルペン、例えばフォルスコリン、そのアナログ、同族物質または誘導体を含有する溶液形態または固体形態の透明な水性処方を調製する方法。
【請求項７】
ヒトまたは獣医学的用途のためのカプセル、錠剤、食品、注射用、パッチ、軟膏、ゲル、エマルジョン、クリーム、ローション、デントリフィセス（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅｓ）、スプレー、滴剤または徐放形態を含むその他の投与形態に配合できる請求項６の処方。
【請求項８】
高眼圧症または緑内障を呈する動物またはヒト対象において眼圧を低下させる場合の単独でまたは抗酸化剤および／または抗緑内障剤と組み合わせた請求項６の処方の使用方法。
【請求項９】
ドライアイ症候群を呈する動物またはヒト対象において単独でまたはポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸および誘導体と組み合わせた請求項６の処方の使用方法。
【請求項１０】
研究および商業目的で、水に可溶性の分子およびレセプタープローブを調製する場合の請求項６の処方の使用方法。
【請求項１１】
ヒトおよび動物においてジテルペン、例えばフォルスコリン、そのアナログ、同族物質または誘導体の健康上の利益を表出するための請求項６の処方の使用方法であって、投与様式が局所、経皮、静脈内、舌下または経口であることを特徴とする使用方法。
【請求項１２】
フォルスコリンの公知の適用の中で肥満の管理、体重管理および除脂肪体重の改善、高血圧、アレルギーのためのダイエット用飲料としてフォルスコリンおよび関連するジテルペンの処方を供給するのに有用である請求項１の材料。
【請求項１３】
フォルスコリンおよび関連するジテルペンの水に可溶性の処方をエマルジョン、スプレー、溶液もしくはエアロゾル、またはコスメスーティカル（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌ）用途、例えばコラーゲン・ブースティング活性、抗しわ特性、セルライト調節、メラノサイト・モジュレータとして供給する場合に有用である請求項１の材料。
【請求項１４】
抗酸化剤、リパーゼ・インヒビター、その他の抗肥満製品、例えばヒドロキシクエン酸、ガルシノールおよびそれらの塩、血管イルリガートル（ｖａｓｏｉｒｒｉｇａｔｏｒ）、その他の公知のコラーゲン・ブースター、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ・インヒビターなどと組み合わせて使用することができる請求項１の材料。
【請求項１】
天然または合成起源の、ジテルペン、例えばフォルスコリン、イソフォルスコリン、７−デアセチルフォルスコリン、その同族物質、アナログおよび誘導体を個々にまたは混合物として水中に可溶化する方法。
【請求項２】
植物供給源、非限定例としてはコレウス・フォルスコリから得ることができる請求項１のジテルペン。
【請求項３】
使用する可溶化剤がα−、β−、γ−シクロデキストリンまたはその誘導生成物、例えば無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢＣＤ）、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）であって、好ましくは無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢＣＤ）を複合化剤として使用する請求項１の方法。
【請求項４】
０．０９％から６％のジテルペン、例えばフォルスコリン、イソフォルスコリン、そのアナログまたは誘導体を含有する透明な溶液を、その化合物を５％から７０％のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と混合することにより調製する方法。
【請求項５】
活性な化合物をエタノール、アセトン、酢酸エチル、塩化メチレンまたはその他の溶媒から選択される有機溶媒から再結晶化し、続いて水中での材料の懸濁液を形成し、次いで室温で４０から１６０時間振盪し、そして濾過することによりシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と複合化する方法。
【請求項６】
眼科用、局所用および全身用用途に適した０．０９％から６％のジテルペン、例えばフォルスコリン、そのアナログ、同族物質または誘導体を含有する溶液形態または固体形態の透明な水性処方を調製する方法。
【請求項７】
ヒトまたは獣医学的用途のためのカプセル、錠剤、食品、注射用、パッチ、軟膏、ゲル、エマルジョン、クリーム、ローション、デントリフィセス（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅｓ）、スプレー、滴剤または徐放形態を含むその他の投与形態に配合できる請求項６の処方。
【請求項８】
高眼圧症または緑内障を呈する動物またはヒト対象において眼圧を低下させる場合の単独でまたは抗酸化剤および／または抗緑内障剤と組み合わせた請求項６の処方の使用方法。
【請求項９】
ドライアイ症候群を呈する動物またはヒト対象において単独でまたはポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸および誘導体と組み合わせた請求項６の処方の使用方法。
【請求項１０】
研究および商業目的で、水に可溶性の分子およびレセプタープローブを調製する場合の請求項６の処方の使用方法。
【請求項１１】
ヒトおよび動物においてジテルペン、例えばフォルスコリン、そのアナログ、同族物質または誘導体の健康上の利益を表出するための請求項６の処方の使用方法であって、投与様式が局所、経皮、静脈内、舌下または経口であることを特徴とする使用方法。
【請求項１２】
フォルスコリンの公知の適用の中で肥満の管理、体重管理および除脂肪体重の改善、高血圧、アレルギーのためのダイエット用飲料としてフォルスコリンおよび関連するジテルペンの処方を供給するのに有用である請求項１の材料。
【請求項１３】
フォルスコリンおよび関連するジテルペンの水に可溶性の処方をエマルジョン、スプレー、溶液もしくはエアロゾル、またはコスメスーティカル（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌ）用途、例えばコラーゲン・ブースティング活性、抗しわ特性、セルライト調節、メラノサイト・モジュレータとして供給する場合に有用である請求項１の材料。
【請求項１４】
抗酸化剤、リパーゼ・インヒビター、その他の抗肥満製品、例えばヒドロキシクエン酸、ガルシノールおよびそれらの塩、血管イルリガートル（ｖａｓｏｉｒｒｉｇａｔｏｒ）、その他の公知のコラーゲン・ブースター、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ・インヒビターなどと組み合わせて使用することができる請求項１の材料。
【公表番号】特表２００７−５０５０４０（Ｐ２００７−５０５０４０Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５４４８（Ｐ２００６−５２５４４８）
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８６４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５００
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（３０６０３９６０３）
【出願人】（３０６０３９６１４）
【出願人】（３０６０３９６２５）
【出願人】（３０６０３９６３６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８６４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５００
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（３０６０３９６０３）
【出願人】（３０６０３９６１４）
【出願人】（３０６０３９６２５）
【出願人】（３０６０３９６３６）
【Ｆターム（参考）】
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