活性成分のための保護親水コロイド
（変性）イネ胚乳タンパク質が、活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤の新規な保護親水コロイドとして使用される。（変性）イネ胚乳タンパク質と少なくとも１つの活性成分とを含んでなる組成物およびそれらの製造、ならびに（変性）イネ胚乳タンパク質それ自体およびその製造が含まれる。これらの組成物は食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のため、そしてこのような（変性）イネ胚乳タンパク質およびこのような組成物をそれぞれ含有する、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物のために使用される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための新規な保護親水コロイドとしての（変性）イネ胚乳タンパク質の使用に関する。さらに本発明は、（変性）イネ胚乳タンパク質と少なくとも１つの活性成分とを含んでなる組成物、およびそれらの製造、ならびに（変性）イネ胚乳タンパク質それ自体、およびその製造に関する。本発明は、さらに食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬品組成物の富栄養化、強化および／または着色のためのこのような組成物の使用、およびこのような（変性）イネ胚乳タンパク質とこのような組成物をそれぞれ含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物に関する。
【０００２】
活性成分、特に脂溶性活性成分または着色剤は、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物に、それ自体で添加されないことが多いが、化学安定性、（水）溶解性、易流動性、および徐放などの特性を増強する理由で、ヒドロプロテクト性コロイド中の活性成分調合物の形態で添加される。既知のヒドロプロテクト性コロイドは、例えば異なる起源（家禽、ウシ、ブタ、魚）のゼラチンおよびデンプンである。動物起源のヒドロプロテクト性コロイドは、宗教上のまたはアレルゲン性の理由から所望されないことが多く、デンプンベースのヒドロプロテクト性コロイドは、グルテンおよびコーンを含まない製品に関心のある消費者に好まれないため、代案のヒドロプロテクト性コロイドに対する継続する必要性がある。
【０００３】
イネ胚乳タンパク質は、栄養的および低アレルギー性として認識され、したがって活性成分調合物のための保護親水コロイドの適切な代案の起源であることができる。しかし中性ｐＨにおけるイネ胚乳タンパク質の高い非溶解性および機能不良は、食物および医薬製品中の機能性成分としてのその産業上の利用を制限する。本発明はこれらの制限を克服し、活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤調合物のための保護親水コロイドとして（変性）イネ胚乳タンパク質を組み込む。
【０００４】
米タンパク質は、トウモロコシおよび小麦をはじめとするその他の穀類と比較して栄養価が上位にあり、したがって食物成分として莫大な潜在的用途を有すると考えられる。穀物タンパク質は、必須アミノ酸システインおよびメチオニンに富む。リジンは、穀物タンパク質中の主要な制限アミノ酸であるが、米はその他の穀物タンパク質（小麦２．３、トウモロコシ２．５ｇ／１６ｇＮ）よりも多くのリジン（３．８ｇ／１６ｇＮ）を含有する（下に引用する参考文献４を参照されたい）。米は概して一般的な穀物（小麦１０．６％、トウモロコシ９．８％、大麦１１．０％、雑穀１１．５％）中で、最も低いタンパク質含量（７．３％）を有すると見なされるが、米タンパク質の正味タンパク質利用率（７３．８％）は穀物中で最も高い（小麦５３．０％、トウモロコシ５８．０％、大麦６２．０％、雑穀５６．０％）。
【０００５】
米タンパク質の単離はその他の穀物タンパク質と比較して困難であり、したがって高価である。主要米タンパク質であるグルテリンは疎水性であり、ジスルフィド結合によって架橋している。抽出されるタンパク質は、本来高度に不溶性であり、タンパク質単離で使用される条件はそれらの溶解性をさらに低下させ、したがって機能性成分としての応用を制限してきた。高タンパク質米製品は、アルカリ抽出とそれに続くタンパク質の等電ｐＨでの沈殿によって、米粉から得ることができる。α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、およびプルラナーゼなどのデンプン加水分解酵素を使用して、デンプンを可溶化および除去することで、米粉中のタンパク質を分離することが多い。デンプン加水分解酵素に加えて、米タンパク質濃縮物中のタンパク質含量をさらに増大させるために、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素が使われている。しかし適切な抽出方法、およびこのような単離物の機能性に関する情報は限られている。認可された食品等級酵素および薬品を使用した効率的な抽出方法は、米タンパク質の商業生産および応用にとって必須である。
【０００６】
この必要性は、イネ胚乳タンパク質および活性成分を含んでなる本発明の組成物によって満たされる。
【０００７】
［背景情報］
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１６．ＡＡＣＣ．Ｍｅｔｈｏｄ４６−０８．アメリカ穀物化学者協会公認法（Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｓ），第８版，第２巻，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ．１９９０年，１〜２頁。
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２０．ピアス（Ｐｅａｒｃｅ），Ｋ．Ｎ．；キンセラ（Ｋｉｎｓｅｌｌａ），Ｊ．Ｅ．「タンパク質の乳化特性：比濁法技術の評価（Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９７８年，２６，７１６〜７２２頁。
２１．ＳＡＳ．２００２年．ＪＭＰ（登録商標）ユーザー・ガイド（Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ），バージョン５．ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ．
２２．アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），ＡＭ．，ウィルケ（Ｗｉｌｃｋｅ），ＨＬ．編、「新しいタンパク質食品（Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｏｄｓ）」．より、コラー（Ｋｏｌａｒ），Ｃ．Ｗ．；リシェール（Ｒｉｃｈｅｒｔ），Ｓ．Ｈ．；デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ），Ｃ．Ｄ．；シュテインケ（Ｓｔｅｉｎｋｅ），Ｆ．Ｈ．；バンダー（Ｖａｎｄｅｒ），Ｒ．Ｊ．、「単離大豆タンパク質（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）」．；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５年；第５巻．
２３．ビリアデリス（Ｂｉｌｉａｄｅｒｉｓ），Ｃ．Ｇ．、「食品研究における示差走査熱量測定：レビュー（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｉｎ ｆｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ）」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９８３年，１０，２３９〜２６５頁。
２４．ダモダーン（Ｄａｍｏｄａｒｎ），Ｓ．、「タンパク質安定化気泡およびエマルジョン（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｆｏａｍｓ ａｎｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００５年，７０（３），５４〜６６頁。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
［発明の組成物］
本発明の組成物は、固体組成物、すなわち安定した水溶性または水分散性粉末であっても良く、またはそれらは液体組成物、すなわち前述の粉末の水性コロイド溶液または水中油分散体であってもよい。水中油エマルジョンであってもよく、または懸濁された、すなわち固体粒子、および乳化された、すなわち液体小滴の混合物を特徴としてもよい安定化水中油分散体は、下述の方法によって、または類似した様式によって調製されてもよい。
【０００９】
より具体的には、本発明は、（変性）イネ胚乳タンパク質マトリックス中の１つ以上の（脂溶性）活性成分および／または１つ以上の着色剤を含んでなる、粉末形態の安定した組成物に関する。
【００１０】
好ましくは（変性）イネ胚乳タンパク質の量は、組成物総量を基準にして、１〜７０重量％、より好ましくは５〜５０重量％、さらにより好ましくは１０〜４０重量％、最も好ましくは１０〜２０重量％であり（２０重量％が最も好ましい量である）、および／または（脂溶性）活性成分および／または着色剤の量は０．１〜９０重量％、好ましくは１〜８０重量％、より好ましくは１〜２０重量％である。トコフェロールおよび／またはパルミチン酸アスコルビルなどの追加的アジュバントおよび／または賦形剤が存在する場合、それらは組成物総量を基準にして、０．０１〜５０重量％の量、好ましくは０．１〜３０重量％の量、より好ましくは０．５〜１０重量％の量で存在する。
【００１１】
［（変性）イネ胚乳タンパク質］
本発明の好ましい実施態様では、イネ胚乳タンパク質は、その製造について下述する変性イネ胚乳タンパク質である（１３頁２６行から１８頁２３行まで、および実施例１〜７を参照されたい）。特に好ましい米タンパク質は、アルカリ抽出、（特にアルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）での酵素変性）、遠心分離および限外濾過のステップによって得られるものである。さらなる用途のために必要ならば、このようにして得られた変性イネ胚乳タンパク質はまた、乾燥させても良い。しかし本発明は、このような製造された変性イネ胚乳タンパク質の使用に限定されない。
【００１２】
さらにより好ましいのは、≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００、さらにより好ましくは５００〜１０００のエマルジョン能力を有する（変性）イネ胚乳タンパク質である。さらに本発明の好ましい実施態様では、使用される（変性）イネ胚乳タンパク質は、≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５、さらにより好ましくは０．５〜１．０のエマルジョン活性を有する。エマルジョン能力の判定については実施例８で記載され、エマルジョン活性の判定については実施例９で記載される。本発明は、これらの（変性）イネ胚乳タンパク質それ自体についてもまた言及する。
【００１３】
本発明のさらに好ましい組成物では、（変性）イネ胚乳タンパク質は、還元糖、糖タンパク質またはグリコペプチドからなる群から選択される、少なくとも１つの化合物と架橋している。
【００１４】
［活性成分］
活性成分は、薬理学的効果のある成分、または一般にヒトまたは動物の身体に健康上の利点を提供する成分である。好ましくは、活性成分は脂溶性活性成分および／または着色剤である。
【００１５】
脂溶性活性成分および／または着色剤は、好ましくはカロテンおよび構造的に関連したポリエン化合物、脂溶性ビタミン、補酵素Ｑ１０、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの多価不飽和脂肪酸とそのエステル（（同一または異なる脂肪酸を含有する）エチルエステルまたはトリグリセリドなど）、ポリ不飽和脂肪酸に富んだモノ−、ジ−、トリグリセリド、脂溶性ＵＶ−Ａフィルター、ＵＶ−Ｂフィルター、ならびにそれらと特にＣ１〜２０炭酸とのエステルなどのそれらの生理学的に許容可能な誘導体、およびそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【００１６】
最も好ましい脂溶性ビタミンは、ビタミンＡまたはＥである。
【００１７】
カロテンおよび構造的に関連したポリエン化合物の好ましい例は、α−カロテン、β−カロテン、８’−アポ−β−カロテナール、エチルエステルなどの８’−アポ−β−カロテン酸エステル、カンタキサンチン、アスタキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、クロセチン、α−ゼアカロテン、β−ゼアカロテンなどのカロテノイド、ならびにそれらと特にＣ１〜２０炭酸とのエステルなどのそれらの生理学的に許容可能な誘導体、およびそれらの任意の混合物である。
【００１８】
最も好ましいカロテノイドはβ−カロテンである。
【００１９】
「β−カロテン」という用語は、全てのシスならびに全てのトランス異性体、および全ての可能な混合したシス−トランス−異性体を包含する。その他のカロテノイドについても同様である。
【００２０】
「ゼアキサンチン」という用語は、天然Ｒ，Ｒ−ゼアキサンチン、ならびにＳ，Ｓ−ゼアキサンチン、メソ−ゼアキサンチンおよびそれらの任意の混合物を包含する。ルテインについても同様である。
【００２１】
（脂溶性）活性成分は天然起源であってもよく、すなわち植物から単離／抽出されて純化および／または濃縮されてもよく、ならびに化学および／または微生物学的（発酵性）経路によって合成されるものであってもよい。
【００２２】
［さらなる構成要素］
活性成分および（変性）イネ胚乳タンパク質に加えて、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１つの水溶性抗酸化剤および／または脂溶性抗酸化剤をさらに含有してもよい。
【００２３】
水溶性抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸またはその塩、好ましくはアスコルビン酸ナトリウムであってもよく、ヒドロキシチロソール、およびオレウロペインアグリコンなどの水溶性ポリフェノールであっても、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）またはローズマリーまたはオリーブの抽出物であってもよい。
【００２４】
脂溶性抗酸化剤は、例えばｄｌ−α−トコフェロール（すなわち合成トコフェロール）、ｄ−α−トコフェロール（すなわち天然トコフェロール）、β−またはγ−トコフェロール、またはこれらの２つ以上の混合物などのトコフェロールと、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）と、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）と、エトキシキン、没食子酸プロピルと、ｔｅｒｔ．ブチルヒドロキシキノリンと、または６−エトキシ−１，２−ジ−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルキノリン（ＥＭＱ）、または好ましくはパルミチン酸アスコルビルまたはステアリン酸アスコルビルなどの脂肪酸のアスコルビン酸エステルであってもよい。
【００２５】
本発明の組成物は、脂肪酸のモノ−およびジグリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、レシチンと、Ｎ−アシル化アミノ酸およびそれらの誘導体、アルキルまたはアルケニルラジカルがあるＮ−アシル化ペプチド、およびそれらの塩と、硫酸アルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステル、およびそれらの誘導体および塩と、ポリオキシエチレン化アルキルまたはアルケニル脂肪エーテルまたはエステルと、ポリオキシエチレン化アルキルまたはアルケニルカルボン酸およびそれらの塩と、Ｎ−アルキルまたはＮ−アルケニルベタインと、アルキルトリメチルアンモニウムまたはアルケニルトリメチルアンモニウムおよびそれらの塩と、ポリオールアルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステルと、それらの混合物からなる群から選択される共乳化剤をさらに含有してもよい。
【００２６】
ポリオールアルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステルの好ましい例は、Ｓｅｐｐｉｃ社によりＭｏｎｔａｎｏｘ ４０ ＤＦの商品名の下に販売されるパルミチン酸ソルビタン２０ ＥＯまたはポリソルベート４０、ＩＣＩ社によりトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０の商品名の下に販売されるラウリン酸ソルビタン２０ ＥＯまたはポリソルベート２０などの少なくとも２０単位の酸化エチレンでポリオキシエチレン化されたソルビタンアルキルまたはアルケニルエステル、およびモノステアリン酸ソルビタンである。
【００２７】
本発明に従った調合物はさらに錠剤に圧搾されてもよく、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類、グリセロール、およびトリグリセリドからなる群から選択される１つ以上の賦形剤および／またはアジュバントが添加されてもよい。
【００２８】
本発明の組成物中に存在してもよいモノ−および二糖類の好ましい例は、スクロース、転化糖、キシロース、グルコース、フルクトース、乳糖、マルトース、ショ糖および糖アルコールである。
【００２９】
オリゴ糖類および多糖類の好ましい例は、デンプン、加工デンプン、およびデンプン加水分解産物である。デンプン加水分解産物の好ましい例はデキストリンおよびマルトデキストリンであり、特に５〜６５個の範囲のデキストロース同等物（ＤＥ）を有するもの、および特に２０〜９５個の範囲のＤＥを有するようなグルコースシロップである。「デキストロース同等物（ＤＥ）」という用語は加水分解度を意味し、乾燥重量を基準にしてＤ−グルコースとして計算される還元糖量の基準である。尺度は、０に近いＤＥを有する天然デンプン、および１００のＤＥを有するグルコースを基準とする。
【００３０】
トリグリセリドは、適切には、植物油または脂肪、好ましくはトウモロコシ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ベニバナ油、ナタネ油、落花生油、パーム油、パーム核油、綿実油、オリーブ油またはココナッツ油である。
【００３１】
固体組成物は、ケイ酸またはリン酸三カルシウムなどの固化防止剤、および１０重量％までで通例２〜５重量％の水をさらに含んでもよい。
【００３２】
［組成物の製造］
本発明の目的はまた、
Ｉ）（変性）イネ胚乳タンパク質の水溶液またはコロイド溶液を調製するステップと、
ＩＩ）場合によりステップＩ）で調製された溶液に、少なくとも水溶性賦形剤および／またはアジュバントを添加するステップと、
ＩＩＩ）少なくとも活性成分、好ましくは少なくとも脂溶性活性成分および／または着色剤、および場合により少なくとも脂溶性アジュバントおよび／または賦形剤の溶液または分散体を調製するステップと、
ＩＶ）ステップＩ）〜ＩＩＩ）で調製された溶液を互いに混合するステップと、
Ｖ）このようにして得られた混合物を均質化するステップと、
ＶＩ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するための架橋剤を添加するステップと、
ＶＩａ）場合によりステップＶＩ）を実施した後に得られた混合物に酵素処理または熱処理を施して（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと、
ＶＩＩ）場合によりステップＶ）および／またはＶＩ）で得られた分散体を粉末に加工するステップと、
ＶＩＩＩ）場合によりステップＶＩＩ）で得られた粉末を乾燥するステップと、
ＩＸ）場合により乾燥粉末に酵素処理または熱処理を施して（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと
を含んでなり、ただしステップＶＩ）が実施される場合、ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）の双方でなく片方のみが実施される、本発明の組成物を製造する方法である。
【００３３】
［ステップＩ］
このステップは、場合により撹拌しながら、単に水を（変性）イネ胚乳タンパク質に添加して、または（変性）イネ胚乳タンパク質を水に添加して実施される。あるいは、均質化は超音波処理によって可能であり得る。
【００３４】
好ましくは上述のような選択性のある（変性）イネ胚乳タンパク質が使用される。
【００３５】
［ステップＩＩ］
添加してもよい水溶性賦形剤および／またはアジュバントは、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類、グリセロールおよび水溶性抗酸化剤である。それらの例は上に示した。
【００３６】
［ステップＩＩＩ］
活性成分は、上述したようなものである。
【００３７】
（脂溶性）活性成分および／または着色剤および任意の脂溶性賦形剤およびアジュバント（ａｄｊｕｖｅｎｔｓ）は、それ自体として、またはトリグリセリドおよび／または（有機）溶剤に溶解または懸濁して使用される。
【００３８】
適切な有機溶剤は、ハロゲン化脂肪族炭化水素、脂肪族エーテル、脂肪族および環式炭酸塩、脂肪族エステルおよび環式エステル（ラクトン）、脂肪族および環式ケトン、脂肪族アルコール、およびそれらの混合物である。
【００３９】
ハロゲン化脂肪族炭化水素の例は、モノ−またはポリハロゲン化直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。特に好ましい例はモノ−またはポリ−塩素化または−ブロム化された直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。より好ましいのはモノ−またはポリ塩素化直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。最も好ましいのは塩化メチレンおよびクロロホルムである。
【００４０】
脂肪族エステルおよび環式エステル（ラクトン）の例は、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびｎ−酢酸ブチル、およびγ−ブチロラクトンである。
【００４１】
脂肪族および環式ケトンの例は、アセトン、ジエチルケトンおよびイソブチルメチルケトン、およびシクロペンタノンおよびイソホロンである。
【００４２】
環式炭酸塩の例は、特に炭酸エチレンおよび炭酸プロピレンおよびそれらの混合物である。
【００４３】
脂肪族エーテルの例は、アルキル部分が１〜４個の炭素原子を有するジアルキルエーテルである。好ましい一例はジメチルエーテルである。
【００４４】
脂肪族アルコールの例は、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、およびブタノールである。
【００４５】
さらに溶剤として、任意の油（トリグリセリド）、オレンジ油、リモネンなどおよび水が使用できる。
【００４６】
添加してもよい脂溶性賦形剤および／またはアジュバントは、例えばトウモロコシ油、モノ−または脂肪酸のジグリセリド、ポリグリセロール脂肪酸、および中鎖トリグリセリド（「ＭＣＴ」）である。
【００４７】
［ステップＩＶ］
本発明の代案の方法ではステップＩＩＩ）が実施されないが、活性成分および任意の脂溶性賦形剤および／またはアジュバントが、ステップＩ）またはＩＩ）の溶液に直接添加される。
【００４８】
［ステップＶ」
均質化のためには、高圧均質化、高剪断乳化（ロータ・ステータシステム）、微粒子化（ｍｉｃｒｏｎｉｓａｔｉｏｎ）、湿潤製粉、マイクロチャネル（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｅｌ）乳化、膜乳化または超音波処理などの従来の技術を応用できる。食物、飲料、動物飼料、化粧品または医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のために、（脂溶性）活性成分および／または着色剤を含有する組成物の調製のために使用されるその他の技術については、その内容を参照によって本明細書に援用するＥＰ−Ａ ０ ９３７ ４１２号明細書（特に段落［０００８］、［００１４］、［００１５］、［００２２］から［００２８］）、ＥＰ−Ａ １ ００８ ３８０号明細書（特に段落［０００５］、［０００７］、［０００８］、［００１２］、［００２２］、［００２３］から［００３９］）および米国特許第６，０９３，３４８号明細書（特に２欄２４行から３欄３２行、３欄４８行から６５行、４欄行５３行から６欄６０行）で開示される。
【００４９】
［ステップＶＩ］
架橋剤は、好ましくは還元糖、糖タンパク質、およびグリコペプチドからなる群から選択される。したがって（変性）イネ胚乳タンパク質と、糖タンパク質／グリコペプチドの糖または糖部分との分子間架橋が形成する。好ましい架橋剤の例は、グルコース、フルクトース、ショ糖、およびキシロースなどの還元糖である。
【００５０】
［ステップＶＩａ］
架橋は、上述のように架橋剤をさらに含有する混合物を熱処理してメイラード型反応において糖とタンパク質との架橋を引き起こし、すなわち好ましくは約３０〜約１６０℃の温度、より好ましくは約７０〜約１００℃の温度、最も好ましくは約８０〜約９０℃の温度で熱的に処理して達成できる。
【００５１】
（変性）イネ胚乳タンパク質と架橋剤との架橋はまた、好都合には約０〜約７０℃の温度、好ましくは約２０〜約４０℃の温度で実施される、架橋酵素（例えばトランスグルタミナーゼであるＥＣ２．３．２．１３タンパク質−グルタミン：γ−グルタミルトランスフェラーゼなどのアシル転移酵素ＥＣ２．３）での処理、すなわち酵素的処理によって達成できる。好ましくはステップＶＩａ）に従った酵素処理は架橋酵素、特にトランスグルタミナーゼによる処理である。
【００５２】
トランスグルタミナーゼの場合、酵素的架橋はε−（γ−グルタミル）−リジンイソペプチド結合の形成によって、安定したタンパク質含有多糖類網目状組織をもたらす。酵素的架橋のためには、糖タンパク質またはグリコペプチドの使用が好ましい。
【００５３】
親油性部分の組み込みのため、メイラード型反応において糖とタンパク質の架橋を引き起こす熱処理、および酵素的架橋の双方の技術が使用でき、組成物の乾燥形態（ステップＩＸ）、または水溶液または懸濁液（ステップＶＩａ）中のどちらかで実施できる。酵素的架橋は、好ましくは水溶液または懸濁液中で実施される。
【００５４】
［ステップＶＩＩ］
水中油分散体であるこのようにして得られた分散体は、噴霧乾燥、流動床顆粒化と組み合わさった噴霧乾燥（後者の技術は一般に流動化噴霧乾燥またはＦＳＤとして知られている）によって、または噴霧されたエマルジョン小滴がデンプン、ケイ酸カルシウム、および二酸化ケイ素などの吸収材の床に捕捉されて引き続いて乾燥される粉末捕捉技術などの任意の従来の技術を使用して、有機溶剤（存在する場合）の除去後に、例えば乾燥粉末などの固体組成物に転換できる。
【００５５】
噴霧乾燥は、約１００〜約２５０℃、好ましくは約１５０℃〜約２００℃、より好ましくは約１６０〜約１９０℃の入口温度、および／または約４５〜約１６０℃、好ましくは約５５〜約１１０℃、より好ましくは約６５〜約９５℃の出口温度（製品温度）で実施されてもよい。
【００５６】
［ステップＶＩＩＩ］
ステップＶＩＩで得られた粉末の乾燥は、好ましくは≦１００℃の温度、好ましくは２０〜１００℃の温度、より好ましくは６０〜７０℃の温度で実施される。乾燥が真空中で実施される場合、温度はより低い。
【００５７】
［ステップＩＸ］
熱処理を通じた架橋は、ステップＶＩａについて既に上述したようにして実施される。酵素処理についても同様であるが、好ましくは溶液／懸濁液中で実施される。
【００５８】
［（変性）イネ胚乳タンパク質の製造］
本発明はまた、
ａ）粉砕米の水溶液または懸濁液を調製し、製粉前に米糠が除去されて溶液または懸濁液が好ましくは水溶液または懸濁液総量を基準にして０．１〜３０重量％、好ましくは１０〜１５重量％の乾燥質量含量を有するステップと、
ｂ）場合により粉砕米の非タンパク質部分またはタンパク質部分を除去してイネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｃ）場合により粉砕米のタンパク質部分を変性させて変性イネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｄ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を単離するステップと、
ｅ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を固形に加工するステップと
を含んでなり、ただしステップｂ）、ｃ）、およびｄ）の少なくとも１つが実施される、粉砕米から開始して、米糠が製粉前に除去された（変性）イネ胚乳タンパク質を製造する方法にも関する。
【００５９】
本発明の文脈で「イネ胚乳タンパク質」とは、特にステップａ）とｂ）、またはステップａ）とｄ）、またはステップａ）とｂ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｄ）、またはステップａ）とｄ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｄ）とｅ）のいずれかを実施することによって得られる生成物を意味する。好ましいのはステップａ）およびｂ）（およびｄ）および／またはｅ））が実施される実施態様であり、特に好ましいのは、ステップａ）、ｂ）、およびｄ）（およびｅ））が実施される実施態様である。
【００６０】
本発明の文脈で「変性イネ胚乳タンパク質」とは、特にステップｃ）が実施される生成物、すなわちステップａ）とｃ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）、またはステップａ）とｃ）とｄ）、またはステップａ）とｃ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｄ）、またはステップａ）とｃ）とｄ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｄ）とｅ）のいずれかを実施することによって得られる生成物を意味する。
【００６１】
変性イネ胚乳タンパク質（およびその選択性）は、イネ胚乳タンパク質よりも好ましい。最も好ましいのは、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（およびｅ））を実施することによって得られる生成物である。
【００６２】
［ステップａ）］
製粉前に米糠が除去された粉砕米はまた、「米粉」の表現の下に知られている。
【００６３】
このステップは、場合により米粉が完全に分散するまで激しく（機械的撹拌機で）撹拌しながら、または米粉懸濁液をホモジナイザーで例えば室温で５分間均質化して、単に米粉に水を添加して、または水に米粉を添加して実施される。
【００６４】
［ステップｂ）］
［非タンパク質部分の除去］
ステップｂ）は、好ましくは米粉をいかなるｐＨ調節もなしに（ｐＨ６〜７）非タンパク質分解酵素により、例えば０．５％ターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）（登録商標）水性懸濁液により温度９０℃で２時間、次に０．１％セルラーゼ水性懸濁液により温度５０℃で３０分間処理して酵素を不活性化して、米粉のタンパク質部分から非タンパク質部分を分離し除去することによって行われてもよい。
【００６５】
好ましい非タンパク質分解酵素の例は、α−アミラーゼなどのデンプン分解酵素、およびセルラーゼ、すなわちセルロース分解酵素、およびそれらの混合物である。α−アミラーゼの好ましい例は、米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）から市販されるターマミル（登録商標）１２０、タイプＬである。その他の好ましい例は、米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッドから市販されるＬｉｑｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｓｕｐｒａ、日本国名古屋市（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）の天野製薬株式会社（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）から市販されるアミラーゼＳ「アマノ」３５Ｇ、米国のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ））から市販されるＭｕｌｔｉｆｅｃｔセルラーゼ、および日本国名古屋市の天野製薬株式会社から市販されるセルラーゼＴ「アマノ」４である。
【００６６】
酵素反応は、無機機酸（例えば塩酸）または有機酸（例えばクエン酸）または塩基が使用される場合は溶液または懸濁液を中性化することで、または加熱して酵素を変性させることで停止できる。
【００６７】
変性は、溶液を８０〜９５℃の温度、好ましくは８０〜８５℃の温度に１０〜１５分加熱することで達成してもよい（特に３．５〜４．５の低ｐＨで）。その後溶液を５０℃に冷却してもよい。
【００６８】
非タンパク質部分の分離は、遠心分離（５０００ｇで１５分間）（非タンパク質部分は水相中に存在する）と、それに続く脱イオン水での洗浄によって達成されてもよい。イネ胚乳タンパク質はペレットのままである。
【００６９】
［タンパク質部分の除去］
あるいは、遠心分離または濾過前にいわゆる「アルカリ抽出」またはいわゆる「塩抽出」を実施してもよい。
【００７０】
「アルカリ抽出」とは、最初に４０〜６０℃で３時間、米粉溶液または懸濁液のｐＨを７〜１２の値、好ましくは８〜１０の値、より好ましくは約９の値に、アルカリ溶液（例えばＮａＯＨ水溶液）で調節することを意味する。
【００７１】
タンパク質収率がタンパク質機能性よりも重要な場合は、ｐＨを好ましくは８〜１２、より好ましくは９〜１２、さらにより好ましくは１０〜１２の値に調節することが有利であり得る。
【００７２】
好ましくはこのような塩基は、約０．１〜５Ｍ、好ましくは約０．５〜約２Ｍの濃度を有する。塩基は無機塩基であってもよい。無機塩基の例は、水酸化ナトリウム（好ましい）、水酸化カリウム、および水酸化カルシウムなどのアルカリ（土類）水酸化物である。
【００７３】
「塩抽出」は「アルカリ抽出」に類似するが、塩基に加えて塩化ナトリウムなどの塩が使用される。好ましい本発明の実施態様では、０．０８Ｍの塩化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１１に調節）が、抽出溶剤として使用される。
【００７４】
（アルカリまたは塩抽出）どちらの場合もタンパク質部分は、水相に移動される。次に遠心分離または濾過によって、非タンパク質部分からタンパク質部分を分離してもよい。
【００７５】
［ステップｃ）］
米粉の変性は、（市販される）食品等級アルカリ性、中性および／または酸性タンパク質分解酵素で、それ（そのタンパク質部分）を処理することによって達成されてもよい。いくつかのタンパク質分解酵素について、酵素規格および最適条件を実施例で提供する。
【００７６】
タンパク質分解酵素は、細菌または真菌からのもの、ならびに果実からのもの、または動物起源であってもよい。
【００７７】
アルカリ性タンパク質分解酵素の例は、市販される米国ノースカロライナ州フランクリントン（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）のノボ・ノルディスク・バイオケムからのアルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）、米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）のＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ（登録商標）、米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからのＰｒｏｔｅｘ ６Ｌ（登録商標）（ジェネンコア（登録商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、および米国ニューヨーク州ロチェスターのジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからのジェネンコア（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ８９９である。
【００７８】
中性タンパク質分解酵素の例は、市販される米国ニューヨーク州ニューヨークのＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＢｒｏｍｅｌａｉｎ（ブロメライン）（登録商標）、米国ニューヨーク州ニューヨークのＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのリキパノール（Ｌｉｑｕｉｐａｎｏｌ）（登録商標）、および米国ニューヨーク州ロチェスターのジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからの細菌中性タンパク質分解酵素である。中性タンパク質分解酵素のさらなる例は、植物であるパパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）からの製品、すなわち果実起源酵素である、オランダ国デルフト（Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅｓから市販されるＣｏｌｌｕｐｉｌｉｎ（登録商標）である。
【００７９】
酸性タンパク質分解酵素の例は、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ））からのペプシンおよび日本国名古屋市の天野製薬株式会社からの酸性タンパク質分解酵素である。
【００８０】
本発明の方法の好ましい実施態様では、米粉のタンパク質部分は、引き続いて７〜１０の範囲のｐＨにおいて４０〜６０℃で１０〜８０分、２つの異なるアルカリ性タンパク質分解酵素によって処理される。
【００８１】
好ましくはこれらのタンパク質分解酵素の１つは、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ（登録商標）などのセリン特異的タンパク質分解酵素、またはアルカリ性タンパク質分解酵素（登録商標）であり、もう１つはリキパノール（登録商標）またはブロメライン（登録商標）などのシステイン特異的タンパク質分解酵素である。
【００８２】
ステップはまた、酵素を一度に添加せず、それらを（引き続いてまたは同時に）小分けにして添加することで、修正されてもよい。
【００８３】
ステップｃ）はまた、ステップｄ）の後に実施されてもよく、すなわち最初にイネ胚乳タンパク質を単離して次にそれを変性してもよい。
【００８４】
［ステップｄ）］
ステップｄ）は、好ましくは遠心分離および／または濾過によって、好ましくは限外濾過によって実施される。限外濾過は、先行する遠心分離なしに実施されてもよい。
【００８５】
酵素不活性化後、加水分解産物（ｈｙｄｒｏｌｙａｔｅ）を好ましくは低速で遠心分離して（１０００ｇで１０分間）、不溶性タンパク質および不純物を分離してもよい。
【００８６】
次にタンパク質加水分解産物の可溶性画分をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）４号濾紙を通して濾過し、濾液に分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧５ｋＤａの膜、好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧３０ｋＤａの膜、より好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧５０ｋＤａの膜、最も好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）５０〜７５０ｋＤａの膜で、逐次限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）を施してもよい。
【００８７】
限外濾過およびダイアフィルトレーションは、室温において２０〜２５ｐｓｉの入口圧力および１０ｐｓｉの出口圧力で実施されてもよい。次に溶液を５倍の濃縮率に限外濾過する。限外濾過直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションしてもよい。限外濾過およびダイアフィルトレーション中に、タンパク質を可溶性に保つため溶液のｐＨをｐＨ８．０〜９．０の間に維持してもよい。
【００８８】
［ステップｅ）］
例えば乾燥粉末などの固体形態への変換は、当業者に知られている任意の乾燥法によって達成できる。好ましいのは噴霧乾燥または凍結乾燥である。噴霧乾燥は好ましくは約２００℃〜約２１０℃の入口温度、および約７０℃〜約７５℃の出口温度で実施される。凍結乾燥は好ましくは約−２０℃〜約−５０℃の温度で１０〜４８時間実施される。
【００８９】
本発明の目的はまた、上述の任意の方法によって得られる（変性）イネ胚乳タンパク質でもある。
【００９０】
［産業上の利用可能性］
本発明は、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のための上述のような組成物の使用、ならびにこのような上述のような組成物を含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物それ自体に関する。
【００９１】
本発明はまた、上述のような（変性）イネ胚乳タンパク質を含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物、ならびに活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための保護親水コロイドとしての好ましくは上述のようなこのような（変性）イネ胚乳タンパク質の使用にも関する。
【００９２】
ヒトをはじめとする動物は、本発明の文脈でヒトの他に、特にヒツジ、雌牛、ウマ、家禽（ブロイラーおよび卵の着色）、エビおよび魚（特にサケおよびニジマス）などの飼育動物、ならびにネコ、イヌ、鳥（例えばフラミンゴ）、および魚などのペットを包含する。
【００９３】
本発明の組成物が、特に着色剤または機能性成分として使用できる飲料は、例えば、着香天然発泡ミネラルウォーター、清涼飲料またはミネラル飲料などの炭酸飲料、ならびに例えば着香水、果汁、フルーツポンチ、およびこれらの飲料の濃縮形態などの非炭酸飲料であることができる。それらは天然果汁または野菜汁または人工香料をベースにしてもよい。アルコール飲料および即席飲料粉末もまた含まれる。糖含有飲料の他に、ノンカロリーおよび人工甘味料を用いたダイエット飲料もまた含まれる。
【００９４】
さらに天然起源または合成から得られる乳製品は、本発明の組成物が、特に着色剤としてまたは機能性成分として使用できる食品の範囲内である。このような製品の典型的な例は、乳飲料、アイスクリーム、チーズ、ヨーグルトなどである。豆乳飲料および豆腐製品などの乳代替製品もまた、この応用範囲に含まれる。
【００９５】
菓子製品や、キャンデーや、ガムや、例えばアイスクリーム、ゼリー、プディング、即席プディング粉末などのデザートなど、本発明の組成物を着色剤としてまたは機能性成分として含有する甘み食品もまた含まれる。
【００９６】
本発明の組成物を着色剤としてまたは機能性成分として含有する、穀類、スナック、クッキー、パスタ、スープ、およびソース、マヨネーズ、サラダドレッシングなどもまた含まれる。さらに乳製品および穀類のために使用される果実調製品もまた含まれる。
【００９７】
本発明の組成物を通じて食品に添加される（脂溶性）活性成分および／または着色剤の最終濃度は、食物組成物の総重量を基準にして０．１〜５００ｐｐｍ、特に１〜５０ｐｐｍであってもよく、着色または強化される特定の食品、および意図される着色または強化の程度に左右される。
【００９８】
本発明の食物組成物は、好ましくは食品に、本発明の組成物の形態の（脂溶性）活性成分および／または着色剤を添加することによって得られる。食品または医薬品の着色または強化のために、本発明の組成物は、本発明の水分散性固体組成物の応用について知られている方法に従って使用できる。
【００９９】
一般に組成物は、特定の応用に従って、水性原液、乾燥粉末混合物、またはその他の適切な食物成分とのプレブレンドのいずれかとして添加してもよい。混合は最終応用の配合次第で、例えば乾燥粉末ブレンダー、低剪断ミキサー、高圧ホモジナイザーまたは高剪断ミキサーを使用して実施できる。容易に明らかであるように、このような専門的事項は専門家の技能の範囲内である。
【０１００】
組成物が着色剤として使用される錠剤またはカプセルなどの医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。錠剤の着色は、錠剤コーティング混合物に液体または固体着色剤組成物の形態で本発明の組成物を別々に添加する、または錠剤コーティング混合物の構成要素の１つに着色剤組成物を添加することによって達成できる。着色硬質または軟質シェルカプセルは、着色剤組成物をカプセル塊水溶液に組み込むことによって調製できる。
【０１０１】
組成物が活性成分として使用される、チュアブル錠、発泡性錠剤またはフィルム被覆錠剤などの錠剤、または硬質シェルカプセルなどのカプセルのような医薬組成物もまた本発明の範囲内である。本発明の組成物は、典型的に錠剤化混合物に粉末として添加され、またはカプセルの製造について知られている様式でカプセル内に充填される。
【０１０２】
組成物が、例えば卵黄、食用家禽、ブロイラーまたは水産動物（特にエビ、サケ、ニジマス）を着色するための着色剤として、または活性成分として使用される、栄養成分プレミックス、複合飼料、ミルク代替え品、流動食または飼料調製品などの動物飼料製品もまた、本発明の範囲内である。
【０１０３】
組成物が着色剤として、または活性成分として使用される、化粧品、洗面用品、および皮膚用製品、すなわちクリーム、ローション、バス、リップスティック、シャンプー、コンディショナー、スプレーまたはジェルなどのスキンおよびヘアケア製品をはじめとするパーソナルケア組成物は、本発明の範囲内である。
【０１０４】
本発明を次の実施例によってさらに例示する。
【０１０５】
［実施例］
次の略語が使用される。
ＵＦ＝限外濾過
ＤＦ＝ダイアフィルトレーション
ＤＨ＝加水分解度
ＤＩ水＝脱イオン水
ＭＷＣＯ＝分子量カットオフ
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
【０１０６】
米粉はアーカンソー州シュトゥットガルトのライスランド・フーズ（Ｒｉｃｅｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ＡＲ））から得られた。次の食品等級酵素をタンパク質の単離で使用した。（１）ターマミル−米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッドからの熱安定性α−アミラーゼ、（３）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔセルラーゼ−米国のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからの２，０００ＩＵ／ｇの真菌セルラーゼ。次の規格の食品等級タンパク質分解酵素を使用した（表１ａおよび１ｂ）。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
［概要］
アルカリ、塩、および酵素的方法によるイネ胚乳タンパク質単離の最適化について実験を行い、それらの抽出性および物理化学および機能特性についてそれらを評価した。目的は、改善された米タンパク質機能性のための最適抽出法を同定するために、抽出法を最適化し、抽出物の物理化学特性を評価することであった。
【０１１０】
米タンパク質単離物は、化学的および酵素的方法によって調製した。予備試験を行って、最大収率およびタンパク質含量があるタンパク質の抽出条件を最適化した。化学的および酵素的方法の手順の例として、米タンパク質単離物調製品ＲＰＡを図１に、９０℃でのターマミル（登録商標）処理とそれに続くセルラーゼ処理による米タンパク質単離物調製品（ＲＰＥＴ）を図２に示す。
【０１１１】
［濾過による（変性）イネ胚乳タンパク質単離］
１インチ径中空繊維ポリスルホン膜カートリッジを装着した米国のＫｏｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓからのＲｏｍｉｃｏｎ限外濾過システムを使用して、限外濾過実験を実施した。（変性）イネ胚乳タンパク質の可溶性画分をワットマン４号濾紙を通して濾過し、５０、３０、１０、および５ｋＤａの名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜−カートリッジを使用して、濾液に逐次限外濾過を施した。各ＭＷＣＯカートリッジ中で、溶液を５倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過の直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を体積の２倍の脱イオン水によって２回ダイアフィルトレーションした。１回目の（５０ｋＤａ）限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）の透過物をプールして、次にＭＷＣＯ（３０ｋＤａ）ＵＦおよびＤＦを施した。各ＭＷＣＯカートリッジから得られた保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を凍結乾燥し、ＤＨ、溶解性、および乳化特性について評価した。
【０１１２】
［（Ａ）タンパク質抽出］
［実施例１：アルカリ抽出（［化学抽出」）によるイネ胚乳タンパク質の単離］
［実施例１−１：（ＲＥＰ １−１）］
米国ニューヨーク州ガーディナー（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのブレンダー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内で、室温において設定６で５分間、５００グラムの米粉を４Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化した。１ＮのＮａＯＨを使用してスラリーをｐＨ１１．０に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（５，０００ｇ、２０分間）によって分離した。この手順をもう一度繰り返し、残留物からさらに抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に２時間保った。沈殿物を１０，０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で２回洗浄し、ｐＨ７．０に調節して、凍結乾燥して５℃で保存した。
【０１１３】
［代案の実施例１−２：（ＲＥＰ １−２）］
５Ｋｇの米粉を４０Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化し、３ＮのＮａＯＨを添加してスラリーのｐＨをｐＨ１１に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（５０００ｇ、１５分間）によって分離した。この手順をもう一度繰り返し、残留物からさらに抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に２時間保った。沈殿物を５０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で２回洗浄し、ｐＨ７．０に調節して５℃で保存した。
【０１１４】
［代案の実施例１−３：（ＲＥＰ １−３）］
米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内で、５分間１キログラムの米粉を８Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化した。１ＮのＮａＯＨを使用してスラリーのｐＨを１１．０に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（２０００ｇ、１５分間）によって分離した。この手順を繰り返して、残留物から追加的タンパク質を抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に１時間保った。沈殿物を５０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で洗浄し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥し（ＲＰＡ）、５℃で保存した（図１）。
【０１１５】
［実施例１−４（ＲＥＰ １−４）：塩抽出によるイネ胚乳タンパク質の単離］
米タンパク質（ＲＰＳ）の塩抽出は上のアルカリ法（ＲＥＰ １−３参照）に類似しているが、０．０８Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＯＨでｐＨ１１に調節）の合わせた溶液を抽出溶剤として使用した。
【０１１６】
［実施例２：非タンパク質部分の酵素的分解によるイネ胚乳タンパク質の単離（「酵素的抽出」）］
［実施例２−１：（ＲＥＰ ２−１）］
５００グラムの米粉を３Ｌの蒸留水（１：６、ｗ／ｖ）に分散した。米粉−水を４０℃で１５分間撹拌して、スラリーを形成した。スラリーを０．５％のα−アミラーゼで処理して温度を９０℃に徐々に上昇させて、９０℃で２時間インキュベートした。２０℃において５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、可溶化されたデンプンを除去した。残留物を１．５Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％のセルラーゼで処理して５０℃で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを３．５に低下させて、酵素を不活性化した。可溶化したデンプンおよびセルロース画分を５０００×ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。沈殿したタンパク質を温脱イオン水で２回洗浄して可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥して５℃で保存した。
【０１１７】
［代案の実施例２−２：（ＲＥＰ ２−２）］
５Ｋｇの米粉を３０Ｌ脱イオン水により均質化して、６０℃で１５分間撹拌した。スラリーを０．２％ターマミルで処理し、温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で２時間インキュベートした。可溶化したデンプンをチーズクロスで濾過して除去した。ペレットを１５Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％のペクチナーゼと共に５０℃で３０分間インキュベートし、新たな０．１％酵素ターマミルを添加した。温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを５．０に低下させて、酵素を不活性化した。可溶化した細胞壁構成要素および残留デンプンをチーズクロスで濾過して除去した。タンパク質ペレットを温脱イオン水で２回洗浄して可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して５℃で保存した。
【０１１８】
［代案の実施例２−３：（ＲＥＰ ２−３）］
１ｋｇの米粉を６Ｌの脱イオン水により均質化して、６０℃で１５分間撹拌した。スラリーを０．５％ターマミルで処理し、温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で２時間インキュベートした。可溶化したデンプンを遠心分離（５０００ｇ、１５分間）によって除去した。ペレットを３Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％セルラーゼと共に５０℃で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを４．５に低下させて酵素を不活性化した。次に可溶化したセルロース画分を遠心分離によって除去した。沈殿したタンパク質を温脱イオン水で２回洗浄して、可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥し（ＲＰＥＴ）５℃で保存した（図２）。
【０１１９】
［代案の実施例２−４：（ＲＥＰ ２−４）］
アミラーゼＳ（ＲＰＥＡ）抽出は、ターマミルの代わりにアミラーゼＳが使用されること以外は、ターマミル法（ＲＥＰ ２−３参照）と本質的に同一である。アミラーゼＳは７０℃で最適活性を有し、９０℃で作用するターマミル法よりもさらに穏和な抽出条件を提供する。タンパク質単離物の水分、タンパク質、デンプン、繊維、脂肪、および灰分含量は、アメリカ穀物化学者協会公認法，第８版，第２巻，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ．１９９０年，１〜２頁；方法４６−０８で開示されるようにして判定した。
【０１２０】
［（Ｂ）タンパク質変性］
［実施例３：タンパク質分解酵素による、アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性（ＲＥＰ ３−１〜３−８）］
［ＲＥＰ ３−１〜ＲＥＰ ３−５の調製の詳細な説明］
アルカリ抽出したイネ胚乳タンパク質単離物ＲＥＰ １−１に、タンパク質分解酵素処理を施した。タンパク質を脱イオン水と混合して（１：１２．５、ｗ／ｖ）均質化し、各酵素の最適ｐＨに調節して５０℃で１０分間撹拌した。各酵素に最適化条件下で、分散体を食品等級タンパク質分解酵素で処理した。各酵素に最適化条件を表２に示す。商業食品等級のタンパク質分解酵素（ブロメライン（ＲＥＰ ３−１）、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ（ＲＥＰ ３−２）、ペプシン（ＲＥＰ ３−３）、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（ＲＥＰ ３−４）、およびリキパノール（ＲＥＰ ３−５））を使用して、溶解および機能特性を改善した。得られた加水分解産物の加水分解度をＯＰＡ法（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１年，６６（５），６４２〜６４６頁）によって最適化し、機能特性を最大化した。各酵素の特異的不活性化条件によって、要求されるＤＨで酵素的反応を終了させた。加水分解生成物を噴霧乾燥し５℃で保存した。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
図４は加水分解時間の関数として、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質の加水分解プロフィールを示す。
【０１２３】
図７は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される米タンパク質、およびペプシン、リキパノール、およびアルカラーゼでの処理によって生成する加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
レーン１−標準マーカー、
レーン２−米タンパク質（対照）、
レーン３−ペプシン２．２％ＤＨ、
レーン４−ペプシン６．５％ＤＨ、
レーン５−リキパノール３．９％ＤＨ、
レーン６−リキパノール１０．５％ＤＨ、
レーン７−アルカラーゼ７．７％ＤＨ、
レーン８−アルカラーゼ１４．７％ＤＨ。
【０１２４】
図８は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される、アルカラーゼ処理米タンパク質加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
レーン１−標準マーカー、
レーン２−米タンパク質（対照）、
レーン３−アルカラーゼ５．２％ＤＨ、
レーン４−アルカラーゼ７．７％、
レーン５−アルカラーゼ１１．２％、
レーン６−アルカラーゼ１３．５％、
レーン７−アルカラーゼ１４．７％ＤＨ。
【０１２５】
［ＲＥＰ ３−６、３−７、および３−８の調製の詳細な説明］
実施例ＲＥＰ ３−１、ＲＥＰ ３−２、ＲＥＰ ３−３、ＲＥＰ ３−４、およびＲＥＰ ３−５のようにＲＥＰ １−１を使用する代わりに、ＲＥＰ ３−６、ＲＥＰ ３−７、およびＲＥＰ ３−８の調製ではＲＥＰ １−２を使用した。
【０１２６】
［ＲＥＰ ３−６］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより３．５分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ５．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−６）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２７】
［ＲＥＰ ３−７］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより７．５分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ５．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−７）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２８】
［ＲＥＰ ３−８］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより１１分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ６．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−８）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２９】
［実施例４：２つのタイプタンパク質分解酵素（ＲＥＰ４）によるアルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性］
アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ １）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で１５分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して５０℃で１５分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させ、変性イネ胚乳タンパク質を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１３０】
［実施例５：タンパク質分解酵素によるアルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質の限外濾過とダイアフィルトレーション（ＲＥＰ５）］
アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ １）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理による長時間加水分解を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して、５０℃で６０分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させた。このようにして変性されたイネ胚乳タンパク質をワットマン５号濾紙で濾過した。米国のＫｏｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓからの容量２〜１０ＬのＲｏｍｉｃｏｎ限外濾過システムに装着された、ＭＷＣＯが５０ｋＤａの中空繊維ポリスルホン膜カートリッジを使用して、濾液に限外濾過を施した。溶液を１０倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過直後に、残留物を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションした。得られた残留物を噴霧乾燥した。
【０１３１】
［実施例６：非タンパク質部分の酵素的分解によるイネ胚乳タンパク質の単離、タンパク質分解酵素での処理による前記イネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質限外濾過とダイアフィルトレーション（ＲＥＰ ６−１〜ＲＥＰ ６−５）］
［ＲＥＰ ６−１］
実施例２で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ ２−１）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理による長時間加水分解を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して、５０℃で９０分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させた。加水分解物（ｈｙｄｒｏｌｙａｔｅ）を低速で（１０００ｇで１０分間）遠心分離して、不溶性タンパク質および不純物を分離した。変性イネ胚乳タンパク質の可溶性部分を、ワットマン４号濾紙を通して濾過し、５０ｋＤａのＭＷＣＯで限外濾過を施した。溶液を１０倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションした。酵素的加水分解、遠心分離、および限外濾過処理において、タンパク質を可溶性に保つために（変性）イネ胚乳タンパク質のｐＨを８．０に維持した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅｓ）を噴霧乾燥した（ＲＥＰ ６−１）。
【０１３２】
［ＲＥＰ ６−２調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で８分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−２）。
【０１３３】
［ＲＥＰ ６−３調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で１２分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−３）。
【０１３４】
［ＲＥＰ ６−４調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合し、メタ重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔａｂｉｓｕｆｉｔｅ）（２０ｍｇ／ｇタンパク質）を添加して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で８分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−４）。
【０１３５】
［ＲＥＰ ６−５調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合し、メタ重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔａｂｉｓｕｆｉｔｅ）（１０ｍｇ／ｇタンパク質）を添加して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−５）。
【０１３６】
［（Ｃ）ペプシン補助米タンパク質抽出とそれに続く限外濾過］
［実施例７：酸性タンパク質分解酵素によるイネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質（ＲＥＰ７）の限外濾過］
ブレンダー内で５００グラムの米粉を３Ｌ脱イオン水（１：６、ｗ／ｖ）によって室温で５分間均質化した。３Ｎ ＨＣｌを使用して、スラリーをｐＨ２．４に調節し、懸濁液を３７℃で３０分間撹拌した。スラリーを０．４４％ペプシンで処理し、３７℃で１３０分間インキュベートした。溶液中の可溶化した変性イネ胚乳タンパク質を遠心分離（５，０００ｇ、２０分間）によって分離した。残留米粉を５００ｍｌ脱イオン水と混合して、可溶性部分を遠心分離によって分離して、残留物からより多くを抽出した。実施例５で記載されるようなＭＷＣＯが５０ｋＤａの膜を使用して、１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質に限外濾過を施した。ＵＦおよびＤＦの併用は、小型タンパク質断片およびその他の不純物を効果的に排除した。
【０１３７】
［（Ｄ）分析法］
［実施例８：エマルジョン能力の判定］
グボゴウリ（Ｇｂｏｇｏｕｒｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４年、６９巻、８号、６１５頁の方法に従って、油滴定に基づいて（変性）イネ胚乳タンパク質のエマルジョン能力を判定した。（変性）イネ胚乳タンパク質の分散体（０．１％ｗ／ｗ、５０ｍＬ、ｐＨ７．０）を脱イオン水によって調製した。米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、設定１でタンパク質溶液を均質化した。蠕動ポンプを使用して、約１７ｇ／分の流速でトウモロコシ油をタンパク質溶液に添加した。導電率計によって、エマルジョンの電導率を連続的に記録し、エマルジョンの転移点判定のためのパラメータとして使用した。転移点までに添加された油の量を使用して、乳化能力を計算した。乳化能力は、乳化油からブランクを差し引いたもののサンプル中タンパク質量に対する比率として表現される。ブランクは、５０ｍＬの脱イオン水中で相転換前に添加された油の量であった。
【０１３８】
あるいは、ビュイルマー（Ｖｕｉｌｌｅｍａｒｄ）らの方法に従って、油滴定に基づいてタンパク質加水分解産物ＲＥＰ ３−６、３−７、３−８、６−２、６−３、６−４、６−５）のエマルジョン能力を判定した。タンパク質分散体（０．５％ｗ／ｗ、４０ｍＬ、ｐＨ７．０）は、蒸留水中で調製された。
【０１３９】
米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、設定６で、タンパク質溶液を均質化した。ポンプを使用してタンパク質溶液にトウモロコシ油を約１２ｇ／分の流速で添加した。エマルジョンの導電率を導電率計によって連続的に記録し、エマルジョンの転移点判定のパラメータとして使用した。転移点になるまでに添加した油の量を使用して乳化能力を計算した。乳化能力は、サンプル中の乳化油からブランクを差し引いたものと、タンパク質量との比率として表わされた。ブランクは４０ｍＬ蒸留水中で相転換前に添加された油量であった。
【０１４０】
［実施例９：エマルジョン活性の判定］
ピアスおよびキンゼラ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄｓ Ｃｈｅｍ．１９７８年，２６：７１６〜７２２頁の比濁法によって、エマルジョンを活性を判定した。米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からの超音波処理器（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、ｐＨ ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中の０．１％（変性）イネ胚乳タンパク質溶液６ｍＬと、トウモロコシ油２ｍＬとの混合物を設定６で１分間均質化した。均質化の０および１０分後に、５０μＬの混合物を５ｍＬの０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）水溶液中に移した。日本国京都市（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の島津製作所（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）からの分光計（モデル（Ｍｏｄｅｌ）ＵＶ−１６０１）によって、５００ｎｍにおける溶液の吸光度を判定した。均質化０分後の吸光度が、（変性）イネ胚乳タンパク質のエマルジョン活性である。
【０１４１】
図９は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノール、およびペプシンで処理された米タンパク質加水分解産物の乳化特性を加水分解度の関数として示す。
【０１４２】
［実施例１０：加水分解度の判定］
ニールセンらの方法（ニールセン，Ｐ．Ｍ．，ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ），Ｄ．およびダンブマン（Ｄａｍｂｍａｎｎ），Ｃ，２００１年．「食物タンパク質加水分解度を判定するための改善された方法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６（５），６４２〜６４６頁）によってＤＨを判定した。次のようにしてｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）試薬を調製した。７．６２０ｇの四ホウ酸二ナトリウム十水和物（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）および２００ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１５０ｍＬの脱イオン水に溶解し、次に１６０ｍｇのＯＰＡ（４ｍＬのエタノールに事前溶解された９７％ＯＰＡ）および１７６ｍｇの９９％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混合した。脱イオン水で最終溶液を２００ｍＬにした。凍結乾燥されたタンパク質サンプル０．１ｇを１０ｍＬの脱イオン水に可溶化した。吸光度を測定するために、３ｍＬのＯＰＡ試薬を１０ｍＬ試験管に入れ、次に４００μＬのサンプル溶液、セリン標準（１０ｍｇ／１００ｍＬ）、および脱イオン水を４本の試験管の各サンプル、標準、およびブランクにそれぞれ添加した。この後、５秒間混合し、正確に２分間保持した。日本国京都市の島津製作所からの分光光度計（モデルＵＶ−１６０１）によって、３４０ｎｍで吸光度を読み取った。ＤＨを次のようにして計算した。
【０１４３】
ＤＨ＝ｈ／ｈｔｏｔａｌ＊１００％
式中、ｈは加水分解された結合数であり、ｈｔｏｔａｌは、タンパク質当量あたりのペプチド結合の総数である。
ｈ＝（セリン−ＮＨ２−β）／α ｅｑｕｉｖ／ｇタンパク質
式中、ｈは加水分解された結合数であり、ｈｔｏｔａｌは、タンパク質当量あたりのペプチド結合の総数であり、穀物タンパク質ではαは１．００、βは０．４０、および、ｈｔｏｔａｌは８．０である。
【０１４４】
セリン−ＮＨ２＝［（Ａ３４０ｓａｍｐｌｅ−Ａ３４０ｂｌａｎｋ）／（Ａ３４０ｓｔａｎｄａｒｄ−Ａ３４０ｂｌａｎｋ）］＊０．９５１６ｍｅｑｖ／Ｌ＊０．０１＊１００／（Ｘ＊Ｐ）
式中、セリン−ＮＨ２＝ｍｅｑｖセリンＮＨ２／ｇタンパク質；Ｘ＝ｇサンプル；Ｐ＝サンプル中の％タンパク質；０．０１は１Ｌ中のサンプル体積である。
【０１４５】
［実施例１１：タンパク質および総溶解度の判定］
タンパク質溶解度は、いくつかの修正を加えて、ベラ，Ｍ．Ｂ．；ムーカジ（ベラ，Ｍ．Ｂ．；ムーカジ，Ｒ．Ｋ．、１９８９年．「米糠タンパク質濃縮物の溶解性、乳化、および起泡特性」．Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ ５４（１）：１４２〜１４５頁）の方法によって判定した。２００ｍｇのタンパク質サンプルを１０ｍＬの脱イオン水中に分散し、１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調節した。分散体を連続的に３０分間撹拌し、米国カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）のＢｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎからの（モデルＪ２−２１）によって５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、上清中のタンパク質含量を自動ケルダール法（ＡＡＣＣ １９９０）によって判定した。タンパク質溶解度の百分率を次の式によって計算した。
【数１】
【０１４６】
タンパク質溶解度は、上清中のタンパク質と最初のサンプル中の総タンパク質との％比率として計算した。
【０１４７】
総溶解度はオーブン乾燥法によって判定し、上清中の総可溶性部分と、タンパク質単離物総重量との％比率として表した。
【数２】
【０１４８】
図６は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の溶解度を加水分解度の関数として示す。
【０１４９】
［実施例１２：分子量の判定］
ラエムリ，Ｕ．Ｋ．、「バクテリオファージＴ４の頭部のアセンブリー中の構造タンパク質の切断」．Ｎａｔｕｒｅ １９７０年，２２７，６８０〜６８６頁に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の近似分子量を判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳ−トリス−グリシン不連続の緩衝液システム中のスラブゲル（４％濃縮用ゲル、１２％分離用ゲル）上で実施した。非還元サンプル緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、および０．０５％ブロモフェノールブルー）中で、タンパク質溶液（６〜１０μｇタンパク質／μＬ）を調製した。１２μＬの溶液をゲルに充填した。電気泳動法を２００Ｖの定電圧で約４０分間実施した。ゲルを酢酸／エタノール／水溶液（１０：４０：５０、ｖ：ｖ：ｖ）中の０．１％クーマシーブリリアントブルーによって染色し、クーマシーブリリアントブルーなしの同一溶剤で脱染した。６．５〜２００ｋＤａの範囲にわたるバイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）広域分子量標準によって近似分子量を判定した。米国カリフォルニア州（ＣＡ，ＵＳＡ）のＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃからの画像分析ソフトウェア、ｗｉｎｄｏｗｓ、ＭａｃおよびＤｏｓを使用して、バンドの分子量と密度を判定した。
【０１５０】
［実施例１３：表面疎水性の判定］
ハヤカワ，Ｓ．；ナカイ、「ミルクおよび大豆タンパク質の溶解性に対する疎水性および実効電荷の関係」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．１９８５年，５０，４８６〜４９１頁によって概説される方法からの１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）の疎水性蛍光プローブによって、タンパク質単離物の表面疎水性を判定した。濃度範囲０．００８〜０．０２５％ｗ／ｖの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で４ｍＬのタンパク質溶液を作製した。１０μＬの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の８ｍＭ ＡＮＳを各タンパク質溶液に添加して、日本国京都市の島津製作所からの蛍光分光光度計（モデルＲＦ−１５０１）により、３９０ｎｍの励起および４７０ｎｍの発光で、これらの溶液の蛍光強度を測定した。蛍光強度対タンパク質濃度の傾斜として表わされる表面疎水性は、直線回帰によって計算された。
【０１５１】
図５は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の表面疎水性を加水分解度の関数として示す。
【０１５２】
［実施例１４：粘度の判定］
室温（２６℃）で、ＭＶＤＩＮ測定紡錘体（半径＝１９．３６ｍｍ、高さ＝５８．０８ｍｍ）を装着した、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨａａｋｅからの回転レオメータ（ＶＴ５５０）によって、タンパク質単離物の粘度を判定した。タンパク質単離物を脱イオン水と混合して１０％スラリーを形成し、分析前にスラリーを６０分間平衡状態に保った。サンプル（３０ｍｌ）を円柱状カップ（半径＝２１．０ｍｍ）に充填して、コンピューター制御プログラムを使用して、３分間かけて０から４００１／秒に変化する剪断速度をかけた。データを独国のＨａａｋｅ Ｍｅｓｓ ＴｅｃｈからのＲｈｅｏｗｉｎ Ｐｒｏデータ・マネージャ、バージョン２．８４によって分析した。
【０１５３】
［実施例１５：熱特性の判定］
米国コネチカット州ノーウォークのパーキン−エルマー・コーポレーション（Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．））からの熱分析ソフトウェア（バージョン４．００、Ｐｙｒｉｓ−１−ＤＳＣ）を装着した米国コネチカット州ノーウォークのパーキン−エルマー・コーポレーションからの示差走査熱量計（モデルＰｙｒｉｓ−１）を使用して、熱特性を判定した。２００ｍｇのタンパク質を適切な量の水に分散して、タンパク質含量２０％のスラリーを形成した。スラリーをよく混ぜて、分析前に６０分間平衡状態に保った。スラリー（約５０μＬ）をステンレス鋼パン（大容積カプセル）に正確に量り入れて密封し、１０℃／分の速度で２５から１４０℃への温度上昇中にスキャンした。空のパンを基準として使用した。データ処理ソフトウェアを使用して、温度記録からピーク温度およびエンタルピーを計算した。
【０１５４】
実施例９の手順を使用して、ＰｅａｒｃｅおよびＫｉｎｓｅｌｌａの比濁法によって、乳化活性および安定性を判定した。０時間における吸光度はイネ胚乳タンパク質の乳化活性として表わされ、エマルジョン安定性（ＥＳ）は次のようにして計算される。
エマルジョン安定性＝Ｔ０×Δｔ／ΔＴ
式中、ΔＴは、Δｔ（１０分間）の時間間隔中の初期吸光度（Ｔ０）の濁度（吸光度）の低下である。
【０１５５】
全ての実験は、三回行った。ノースカロライナ州ケアリーのＳＡＳインスティチュート・インコーポレーテッド（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ．））からのＪＭＰ５．１ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ）ＳＡＳ，２００２，ＪＭＰ（登録商標）ユーザー・ガイド、バージョン５によって、分散および平均値多重比較についてデータを分析した。５％の有意水準（Ｐ＜０．０５）で、チューキーＨＳＤ手順によって平均間の有意差を判定した。
【０１５６】
［（Ｅ）結果］
次の表３ａには、実施例９および８でそれぞれ記載されるような方法によって測定される、実施例１〜７に従って得られた（変性）イネ胚乳タンパク質（ＲＥＰ １−１〜ＲＥＰ７）のエマルジョン活性および能力が示される。
【０１５７】
ＲＥＰ ３については、毎回、ブロメライン、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ、ペプシン、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）またはリキパノール（登録商標）の別の酵素によって実施例を８回実施したために８つの値が示され（ＲＥＰ ３−１〜ＲＥＰ ３−８を参照されたい）、ＲＥＰ ６については、毎回、実施例６で詳細に記載されるような異なる処理条件を適用して実施例を５回実施したために５つの値が示される（ＲＥＰ ６−１〜ＲＥＰ ６−５を参照されたい）。
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
続く表３ｂおよび３ｃには、実施例１０および１１でそれぞれ記載されるような方法によって測定される、実施例３および６に従って得られたＲＥＰ ３および６の変性イネ胚乳タンパク質のタンパク質溶解度および総溶解度および加水分解度が示される。
【０１６０】
【表５】
【０１６１】
【表６】
【０１６２】
化学的および酵素的抽出手順の概要を図１および２にそれぞれ提示する。アルカリ−および塩−方法は、それぞれ６７．９および６０．３％の収率で、米粉中の総タンパク質の内、タンパク質含量８７．２および８９．４％のタンパク質単離物を抽出した。
【０１６３】
アルカリおよび塩方法では、ｐＨがタンパク質抽出に強い影響を有した。ｐＨと抽出性の正の相関はｐＨ１２まで見られた。しかし高いｐＨは、望ましくないタンパク質変性をもたらし、タンパク質と共沈殿する非タンパク質構成要素の抽出を増大して、単離物の質を低下させ得る。しかしｐＨ１０以下は、米タンパク質抽出では質の劣る溶剤である。したがって、タンパク質収率に関してはｐＨ１１が最適抽出ｐＨと判断された。タンパク質の乳化特性などのタンパク質の機能性については、より低いｐＨ（好ましくはｐＨ８〜１０）が興味の対象となり得る。さらに３分間の均質化または超音波の前処理と組み合わさったｐＨ１１でのタンパク質抽出は、タンパク質の抽出性を改善した。これらの前処理は、疎水性的に相互作用するタンパク質−タンパク質またはタンパク質−多糖類相互作用を引き離し、タンパク質抽出を容易にした可能性がある。
【０１６４】
酵素抽出では、熱安定性αアミラーゼであるターマミルと、それに続くセルラーゼ処理が８９．２％の収率で８５．８％のタンパク質含量を単離した。酵素ターマミルは９０℃で最適活性を有する。ターマミル処理中の９０℃での高度なタンパク質変性を避けるために、７０℃で最適活性を有する別の非熱安定性アミラーゼ（アミラーゼＳ）に手順を応用した。セルラーゼ処理と組み合わさったアミラーゼＳは、下の表に示すように９０．５％の収率で８１．７％のタンパク質を単離した。
【０１６５】
【表７】
【０１６６】
米タンパク質の組成物であるアルブミン、グロブリン、グルテリン、およびプロラミンが表４に提示される。米粉は７．８％のタンパク質を含有し、総タンパク質の４．１％はアルブミン、１１．８％はグロブリン、７７．４％はグルテリン、および２．１％はプロラミンであった。アルカリおよび塩抽出は、グロブリン以外は同様のタンパク質プロフィールを有した。塩抽出タンパク質は、アルカリ抽出タンパク質（３．１％）よりも高いグロブリン（６．２％）を含有した。米中の主要タンパク質はグルテリンであるので、アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質（８０．２％）よりも高い、それぞれ８７．９および８６．７％のグルテリンを含有した。対照的に、プロラミン含量はアルカリ性−（０．５％）および塩−（０．７％）抽出よりも酵素抽出でより高い（２．８％）。
【０１６７】
【表８】
【０１６８】
４つのタンパク質単離物の組成を表６に示す。ＲＰＡおよびＲＰＳの双方は同様の組成を有し、そのどちらも酵素抽出したタンパク質、ＲＰＥＴ（８４．８％）、およびＲＰＥＡ（８１．７％）より高いタンパク質含量、８７．２および８９．４％をそれぞれ有した。デンプン、脂質、繊維、灰分をはじめとする非タンパク質構成要素は、酵素−抽出タンパク質よりもアルカリ−および塩−抽出タンパク質のどちらよりも低い。
【０１６９】
【表９】
【０１７０】
米タンパク質の電気泳動法プロフィールを図３に示す。米タンパク質の分子サイズプロフィールはＳＤＳＰＡＧＥゲル電気泳動法によって判定された。
レーン１−標準標識（６．５〜２００ｋＤａ）、
レーン２−ＲＰＡ、
レーン３−ＲＰＳ、
レーン４−ＲＰＥＴ
レーン５−ＲＰＥＡ。
【０１７１】
米タンパク質は全部で６つのバンドを有し、分子サイズは７〜９７ｋＤａの範囲であった。主要バンドは９７ｋＤａ（２％）、４５ｋＤａ（３％）、３３ｋＤａ（７２％）、２１ｋＤａ（７％）、１４ｋＤａ（６％）、および７ｋＤａ（８％）で観察された。ほとんどの主要バンドは、７２％の密度で３３ｋＤａの分子サイズにおいて観察された（図３、レーン１および２）。これは主要な米タンパク質のグルテリンである。
【０１７２】
米タンパク質単離物の熱変性温度および変性のエンタルピー値を表７に提示する。
【０１７３】
【表１０】
【０１７４】
ＲＰＡ、ＲＰＳ、ＲＰＥＴ、およびＲＰＥＡの変性温度は、それぞれ８１．４、７８．９、７９．９、および７８．８℃であった。ＲＰＡ（１．８２Ｊ／ｇ）、ＲＰＳ（１．１０Ｊ／ｇ）、ＲＰＥＴ（検出不能）、およびＲＰＥＡ（０．１８Ｊ／ｇ）のエンタルピー値は有意に異なり、抽出方法が抽出条件次第で、異なる度合いにタンパク質を変性させたことが示唆された。エンタルピー変化は、タンパク質変性の程度を予測するのに使用し得る。ビリアデリス，Ｃ．Ｇ．、「食品研究における示差走査熱量測定：レビュー」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９８３年，１０，２３９〜２６５頁。タンパク質が部分的に変性するとエンタルピー変化は減少し、タンパク質が完全に変性するとエンタルピー変化はゼロである。ユー，Ｚ．Ｙ．；ヘティアラキ，Ｎ．Ｓ．；ラス，Ｎ．、「米粉タンパク質の抽出、変性、および疎水性」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００１年，６６（２），２２９〜２３２頁は、アルブミン、グロブリン、およびグルテリンについて、それぞれ２．８８、３．１４、および３．７９Ｊ／ｇのエンタルピー値を報告した。本発明者らの研究ではアルカリ抽出タンパク質（ＲＰＡ）が最も高いエンタルピー値（１．８２Ｊ／ｇ）を有し、それはユーらのアルブミン（２．８８Ｊ／ｇ）、グロブリン（３．１４Ｊ／ｇ）、およびグルテリン（３．７９Ｊ／ｇ）の値よりも顕著に低かった。アルカリおよび塩抽出中に施された物理的処理が、タンパク質をある程度変性させた可能性がある。酵素−抽出タンパク質の内、ＲＰＥＴ（ターマミル、９０℃）はいかなる検出可能なエンタルピー変化も示さず、完全なタンパク質変性が示唆された。
【０１７５】
［表面疎水性および溶解度］
米タンパク質単離物の表面疎水性、溶解度、および粘度を表８に提示する。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
米タンパク質単離物の疎水性は、５４４〜９３１の範囲にわたる。抽出方法は、これらのタンパク質の疎水性の差に寄与する。酵素−抽出タンパク質の疎水性ＲＰＥＴ（９３１．３）およびＲＰＥＡ（７９１．６）は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質（それぞれ５６３．８および５４４．２）よりも高かった。これは表面疎水性を増大させるタンパク質の変性に起因し得る。酵素−抽出タンパク質の熱誘発性アンフォールディングは、表面疎水性を増大させる。
【０１７８】
米タンパク質単離物の溶解度は、４〜１０の広いｐＨ範囲で低い（データ示さず）。アミノ酸組成物および疎水性相互作用が溶解度を決定する。テクソンら（８）による米グルテリンの細分画研究は、米グルテリンの高分子質量が、過剰な分子内および分子間ジスルフィドおよび疎水性相互作用を有して溶解度を低下させたことを示した。ウェンおよびリュース（９）もまた、米グルテリン中の最も豊富なアミノ酸がグルタミン酸／グルタミン、アスパラギン酸／アスパラギン、アルギニン、グリシン、およびアラニンであると報告した。グルタミンおよびアスパラギン側鎖中のアミド基はグルテリンの凝集を促進し、米タンパク質の溶解度を低下させた。比較すると酵素−抽出タンパク質は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質よりも低い溶解度を有し、これは抽出中の高レベル変性、高表面疎水性、および水溶性タンパク質（アルブミン）損失に起因し得る。
【０１７９】
米タンパク質単離物の乳化および発泡特性を表９に提示する。
【０１８０】
【表１２】
【０１８１】
アルカリ−および塩−抽出タンパク質の乳化および発泡特性は、酵素−抽出タンパク質よりも高かった。アルカリ−および塩−抽出タンパク質の乳化活性はそれぞれ０．２２４および０．２１６で、安定性はそれぞれ１９．６および１７．１分間であり、それは酵素−抽出タンパク質よりも有意に高かった。発泡能力および安定性でも同様の結果パターンが観察された。乳化および発泡特性を有するためには、タンパク質は水相中に可溶化して迅速にアンフォールドし、境界面に凝集性層を形成しなくてはならない。エマルジョンおよび発泡を安定化するためのタンパク質の分子および物理的要件は類似している（ダモダーン，Ｓ．、「タンパク質安定化気泡およびエマルジョン」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２０５年，７０（３），５４〜６６頁。
【０１８２】
異なる抽出方法によって得られた機能特性の相違の可能な理由は、タンパク質単離物のタンパク質純度、組成、表面疎水性、および溶解度に起因し得る。しかし出願人がこれらの理論によって拘束されることは意図されない。
【０１８３】
第１に、２つの酵素−抽出タンパク質の熱特性は、ＲＰＡおよびＲＰＳよりも高度な変性を示した。過剰な変性は、タンパク質凝集の促進、またはより多数の疎水性アミノ酸の露出のどちらかにより、乳化および発泡特性にとって有害であり得る。表面疎水性データは、酵素−抽出タンパク質の疎水性の増大を証明した。過剰な表面疎水性は、広範な疎水結合の形成を容易にし、タンパク質の溶解度および可撓性を低下させることにより、タンパク質の乳化または発泡特性にとって好ましくないことがある。
【０１８４】
第２に、高い温度またはｐＨなどの極端な抽出条件が、ジスルフィド架橋の形成を促進した可能性がある。米グルテンが過剰な結合を有することが報告されている。抽出タンパク質の極めて低い溶解度は、抽出中の熱−またはｐＨ−誘発性タンパク質アンフォールディングが、タンパク質内部のチオール基を露出させた可能性があることを示唆した。これらの露出したチオール基は、隣接するタンパク質分子とジスルフィド結合を容易に形成できる。新たに形成したジスルフィド結合が、タンパク質の分子可撓性、溶解度、および表面活性を低下させた可能性がある。タンパク質の特定セグメントの可撓性は、タンパク質の乳化および発泡特性を決定する主要特性の１つである。
【０１８５】
第３に、米タンパク質単離物の組成は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質単離物が、酵素−抽出タンパク質よりも多くのタンパク質および少ない非タンパク質を含有したことを示した。酵素抽出タンパク質単離物ＲＰＥＴおよびＲＰＥＡ中の顕著な量の繊維、灰分、脂質、および残留デンプンは、それらの乳化および発泡特性を低下させた可能性がある。これらの非タンパク質構成要素はタンパク質と相互作用してタンパク質の正味電荷および疎水性を変化させ、タンパク質の機能性に影響し得る。
【０１８６】
最後に、酵素抽出タンパク質のより低い溶解度は、乳化および発泡特性に悪影響を及ぼした。エマルジョンおよび発泡特性を有するためには、タンパク質は可溶化してアンフォールドし、境界面に凝集性層を形成しなくてはならない。これにはタンパク質溶解性および可撓性が必要とされる。これらの特性を欠いた酵素−抽出タンパク質は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質よりも乳化および発泡特性が低下する。
【０１８７】
これらの研究から、アルカリおよび塩方法はそれぞれ６７．９および６０．３％の収率で、８７．２および８９．４％のタンパク質を抽出したことが分かった。酵素的方法は、ターマミルおよびアミラーゼＳはそれぞれ、８９．２および９０．５％の収率で、８４．８および８１．８％のタンパク質を抽出した。アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質よりも高いタンパク質含量と、デンプン、脂質、繊維、および灰分をはじめとするより低い非タンパク質構成要素とを有した。比較すると、アルカリ−および塩−抽出したタンパク質のより好ましいタンパク質組成、より低い疎水性、より高い溶解度、およびより低い熱変性度が、酵素−抽出タンパク質よりも高い乳化および発泡特性に寄与した。したがってアルカリおよび塩抽出方法はより穏やかな抽出条件であり、タンパク質はより良い機能特性を保持した。
【０１８８】
米タンパク質は、ヒト消費のために栄養的で低アレルギー性であり、健康的である。認可された食品等級酵素および薬品を使用した効率的な抽出方法は、米タンパク質の商業生産および機能性成分としての応用にとって必須である。イネ胚乳タンパク質をアルカリ、塩、および酵素的方法によって単離し、抽出性および物理化学的特性について評価した。アルカリ（ＲＰＡ）および塩（ＲＰＳ）方法は、それぞれ６７．９および６０．３％の収率で、８７．２および８９．４％のタンパク質を抽出した。ターマミル（ＲＰＥＴ）およびアミラーゼＳ（ＲＰＥＡ）での酵素的方法は、それぞれ８９．２および９０．５％収率で、８４．８および８１．８％のタンパク質を抽出した。示差走査熱量計によって判定されたＲＰＡ（１．８２Ｊ／ｇ）、ＲＰＳ（１．１０Ｊ／ｇ）、ＲＰＥＴ（非検出可能な）、およびＲＰＥＡ（０．１８Ｊ／ｇ）のエンタルピー値は、抽出方法次第で変動するタンパク質変性レベルを実証した。表面疎水性データはこの観察を支持する。アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質よりも高い溶解度および乳化特性を有し、したがって、アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、増強された機能性用途、および個別に調整された（ｔａｉｌｏｒｅｄ）米タンパク質単離物を調製するための出発原料としての可能性を有することができる。
【０１８９】
熱安定性α−アミラーゼ、ターマミル（登録商標）で単離されたイネ胚乳タンパク質を中性、酸性、および／またはアルカリ性タンパク質分解酵素で処理した。加水分解産物の加水分解度をＯＰＡ方法によって最適化し、溶解度および乳化特性を最大化した。酵素不活性化後、可溶性画分を遠心分離（１０００ｇで１０分間）によって分離し、特定分子量（５０ｋＤａ）のカットオフ膜を通して可溶性加水分解産物を濾過した。５０ｋＤａを超える、得られた加水分解産物を噴霧乾燥させ、加水分解度、溶解度、エマルジョン能力、活性、および安定性について評価した。
【０１９０】
２つのタイプのタンパク質分解酵素、システイン（リキパノール）およびセリン（アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ））タンパク質分解酵素の併用処理と、それに続く遠心分離および限外濾過は、溶解度および乳化特性を顕著に改善した。得られた加水分解産物は５３．５％の溶解度、５８６．３ｍｌ／ｇのエマルジョン能力、０．６０４の活性、および２４．８分間の安定性を有し、非変性米タンパク質単離物（１１．８％の溶解度、１７７．６ｍｌ／ｇのエマルジョン能力、０．２１４の活性、および１４．７分間の安定性）よりも顕著に高かった。
【０１９１】
アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）およびリキパノールの組み合わせによる酵素的加水分解と、それに続く限外濾過は、イネ胚乳タンパク質の溶解度および乳化特性を改善した。高純度の一様な分子画分がある限外濾過されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物は、その溶解度および乳化特性を増強した。
【０１９２】
［実施例１２：β−カロテン調合物の製造］
イネ胚乳タンパク質およびβ−カロテンを含んでなる調合物は、次のようにして調製してもよい。
【０１９３】
［ａ）（油−ベースの）溶液１の調製：］
７．７ｇのトウモロコシ油および１．４ｇのｄｌ−α−トコフェロールを混合した。１６．１ｇの結晶性β−カロテンを１８０ｍｌのクロロホルム（トリクロロメタン）中に分散し、得られた分散体をトウモロコシ油とトコフェロールの混合物に添加した。混合物を穏やかに撹拌し、同時に約６０℃に加熱して溶液が得られた。
【０１９４】
［ｂ）（水性）溶液２の調製：］
実施例１に従った３５ｇのＲＥＰ １（ＲＥＰ １−１）を６０℃で撹拌して２５０ｍｌの水に再溶解した。あるいは、実施例１に従って新鮮に調製したＲＥＰ １−１を使用することもでき、すなわち凍結乾燥および保存のステップを実施せず、得られたＲＥＰ １−１溶液それ自体を使用して温度を６０℃にできる。さらに２．１ｇのパルミチン酸アスコルビルおよび４２．７ｇのスクロースを添加した。８ｍｌの水性１Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨを７．９の値に調節した。水溶液調製のために、ＲＥＰ １−１の代わりにＲＥＰ １−２が適宜使用できる。
【０１９５】
［ｃ）溶液１および２からのエマルジョン調製：］
激しく撹拌しながら、５３℃で溶液１を溶液２に添加し、分散体をさらに３０分間激しく撹拌した。撹拌される分散体を５０〜５５℃に３０分間保った。残留トリクロロメタンを５０〜５５℃で除去した。閉じこめられた気泡を遠心分離によって除去した後、エマルジョンを５０〜５５℃でしばらく穏やかに撹拌し、次に内部相の粒度に関して特性決定した。エマルジョン内部相の平均粒度（ザウター（Ｓａｕｔｅｒ）径、Ｄ［３、２］）は、レーザー回析（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｅｒｓｉｚｅｒ）による測定で３８０ｎｍであった。
【０１９６】
［ｄ）エマルジョンからの固体調合物の調製：］
エマルジョンは、予冷したコーンスターチの流動床中に噴霧してもよい。過剰なコーンスターチはふるいによって除去でき、得られた粉末は室温において気流中で乾燥できる。０．１６〜０．５０ｍｍの範囲内の粉末粒子画分は、ふるいによって収集でき、カロテノイド含量、水性分散体中の色強度および色調、コーンスターチ含量、および残留湿度について特性決定される。
【０１９７】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】化学的および酵素的方法の手順の例としての米タンパク質単離物調製品ＲＰＡである。
【図２】９０℃でのターマミル（登録商標）処理とそれに続くセルラーゼ処理による米タンパク質単離物調製品（ＲＰＥＴ）である。
【図３】米タンパク質の電気泳動法プロフィールである。
【図４】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質の加水分解プロフィールを加水分解時間の関数として示す。
【図５】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の表面疎水性を加水分解度の関数として示す。
【図６】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の溶解度を加水分解度の関数として示す。
【図７】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される米タンパク質、およびペプシン、リキパノール、およびアルカラーゼでの処理によって生成する加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
【図８】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される、アルカラーゼ処理米タンパク質加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
【図９】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノール、およびペプシンで処理された米タンパク質加水分解産物の乳化特性を加水分解度の関数として示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための新規な保護親水コロイドとしての（変性）イネ胚乳タンパク質の使用に関する。さらに本発明は、（変性）イネ胚乳タンパク質と少なくとも１つの活性成分とを含んでなる組成物、およびそれらの製造、ならびに（変性）イネ胚乳タンパク質それ自体、およびその製造に関する。本発明は、さらに食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬品組成物の富栄養化、強化および／または着色のためのこのような組成物の使用、およびこのような（変性）イネ胚乳タンパク質とこのような組成物をそれぞれ含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物に関する。
【０００２】
活性成分、特に脂溶性活性成分または着色剤は、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物に、それ自体で添加されないことが多いが、化学安定性、（水）溶解性、易流動性、および徐放などの特性を増強する理由で、ヒドロプロテクト性コロイド中の活性成分調合物の形態で添加される。既知のヒドロプロテクト性コロイドは、例えば異なる起源（家禽、ウシ、ブタ、魚）のゼラチンおよびデンプンである。動物起源のヒドロプロテクト性コロイドは、宗教上のまたはアレルゲン性の理由から所望されないことが多く、デンプンベースのヒドロプロテクト性コロイドは、グルテンおよびコーンを含まない製品に関心のある消費者に好まれないため、代案のヒドロプロテクト性コロイドに対する継続する必要性がある。
【０００３】
イネ胚乳タンパク質は、栄養的および低アレルギー性として認識され、したがって活性成分調合物のための保護親水コロイドの適切な代案の起源であることができる。しかし中性ｐＨにおけるイネ胚乳タンパク質の高い非溶解性および機能不良は、食物および医薬製品中の機能性成分としてのその産業上の利用を制限する。本発明はこれらの制限を克服し、活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤調合物のための保護親水コロイドとして（変性）イネ胚乳タンパク質を組み込む。
【０００４】
米タンパク質は、トウモロコシおよび小麦をはじめとするその他の穀類と比較して栄養価が上位にあり、したがって食物成分として莫大な潜在的用途を有すると考えられる。穀物タンパク質は、必須アミノ酸システインおよびメチオニンに富む。リジンは、穀物タンパク質中の主要な制限アミノ酸であるが、米はその他の穀物タンパク質（小麦２．３、トウモロコシ２．５ｇ／１６ｇＮ）よりも多くのリジン（３．８ｇ／１６ｇＮ）を含有する（下に引用する参考文献４を参照されたい）。米は概して一般的な穀物（小麦１０．６％、トウモロコシ９．８％、大麦１１．０％、雑穀１１．５％）中で、最も低いタンパク質含量（７．３％）を有すると見なされるが、米タンパク質の正味タンパク質利用率（７３．８％）は穀物中で最も高い（小麦５３．０％、トウモロコシ５８．０％、大麦６２．０％、雑穀５６．０％）。
【０００５】
米タンパク質の単離はその他の穀物タンパク質と比較して困難であり、したがって高価である。主要米タンパク質であるグルテリンは疎水性であり、ジスルフィド結合によって架橋している。抽出されるタンパク質は、本来高度に不溶性であり、タンパク質単離で使用される条件はそれらの溶解性をさらに低下させ、したがって機能性成分としての応用を制限してきた。高タンパク質米製品は、アルカリ抽出とそれに続くタンパク質の等電ｐＨでの沈殿によって、米粉から得ることができる。α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、およびプルラナーゼなどのデンプン加水分解酵素を使用して、デンプンを可溶化および除去することで、米粉中のタンパク質を分離することが多い。デンプン加水分解酵素に加えて、米タンパク質濃縮物中のタンパク質含量をさらに増大させるために、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素が使われている。しかし適切な抽出方法、およびこのような単離物の機能性に関する情報は限られている。認可された食品等級酵素および薬品を使用した効率的な抽出方法は、米タンパク質の商業生産および応用にとって必須である。
【０００６】
この必要性は、イネ胚乳タンパク質および活性成分を含んでなる本発明の組成物によって満たされる。
【０００７】
［背景情報］
１．フィオッキ（Ｆｉｏｃｃｈｉ），Ａ．；トラベイニ（Ｔｒａｖａｉｎｉ），Ｍ．；ダウリア（Ｄ’Ａｕｒｉａ），Ｅ．；バンデラリ（Ｂａｎｄｅｒａｌｉ），Ｇ．；ベルナルド（Ｂｅｒｎａｒｄｏ），Ｌ．；リーバ（Ｒｉｖａ），Ｅ．、「牛乳および大豆アレルギー児童の米加水分解産物配合への耐性（Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａ ｒｉｃｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｆｏｒｍｕｌａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｔｏ ｃｏｗ’ｓ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｓｏｙ）」．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２００３年，３３（１１），１５７６〜８０頁。
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３．ジュリアーノ，Ｂ．Ｏ編、「米化学と技術（Ｒｉｃｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第２版よりビーン（Ｂｅａｎ），Ｍ．Ｍ．；ニシタ（Ｎｉｓｈｉｔａ），Ｋ．Ｄ．、「ベーキング用米粉（Ｒｉｃｅ ｆｌｏｕｒｓ ｆｏｒ ｂａｋｉｎｇ）」．Ｓｔ．Ｐａｕｌ：Ａｍｅｒ Ａｓｓｏｃ．ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．１９８５年，５３９〜５５６頁。
４．ジュリアーノ，Ｂ．Ｏ．、「米：化学と技術」．Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．１９８５年。
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６．ユー，Ｚ．Ｙ．；ヘティアラキ，Ｎ．Ｓ．；ラス（Ｒａｔｈ），Ｎ．、「米粉タンパク質の抽出、変性、および疎水性（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｆｌｏｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００１年，６６（２），２２９〜２３２頁。
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１６．ＡＡＣＣ．Ｍｅｔｈｏｄ４６−０８．アメリカ穀物化学者協会公認法（Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｓ），第８版，第２巻，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ．１９９０年，１〜２頁。
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１９．ベラ（Ｂｅｒａ），Ｍ．Ｂ．；ムーカジ（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ），Ｒ．Ｋ．、「米糠タンパク質濃縮物の溶解性、乳化、および起泡特性（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ， ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ， ａｎｄ ｆｏａｍｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｒａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．１９８９年，５４（１），１４２〜１４５頁。
２０．ピアス（Ｐｅａｒｃｅ），Ｋ．Ｎ．；キンセラ（Ｋｉｎｓｅｌｌａ），Ｊ．Ｅ．「タンパク質の乳化特性：比濁法技術の評価（Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９７８年，２６，７１６〜７２２頁。
２１．ＳＡＳ．２００２年．ＪＭＰ（登録商標）ユーザー・ガイド（Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ），バージョン５．ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ．
２２．アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），ＡＭ．，ウィルケ（Ｗｉｌｃｋｅ），ＨＬ．編、「新しいタンパク質食品（Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｏｄｓ）」．より、コラー（Ｋｏｌａｒ），Ｃ．Ｗ．；リシェール（Ｒｉｃｈｅｒｔ），Ｓ．Ｈ．；デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ），Ｃ．Ｄ．；シュテインケ（Ｓｔｅｉｎｋｅ），Ｆ．Ｈ．；バンダー（Ｖａｎｄｅｒ），Ｒ．Ｊ．、「単離大豆タンパク質（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）」．；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５年；第５巻．
２３．ビリアデリス（Ｂｉｌｉａｄｅｒｉｓ），Ｃ．Ｇ．、「食品研究における示差走査熱量測定：レビュー（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｉｎ ｆｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ）」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９８３年，１０，２３９〜２６５頁。
２４．ダモダーン（Ｄａｍｏｄａｒｎ），Ｓ．、「タンパク質安定化気泡およびエマルジョン（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｆｏａｍｓ ａｎｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００５年，７０（３），５４〜６６頁。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
［発明の組成物］
本発明の組成物は、固体組成物、すなわち安定した水溶性または水分散性粉末であっても良く、またはそれらは液体組成物、すなわち前述の粉末の水性コロイド溶液または水中油分散体であってもよい。水中油エマルジョンであってもよく、または懸濁された、すなわち固体粒子、および乳化された、すなわち液体小滴の混合物を特徴としてもよい安定化水中油分散体は、下述の方法によって、または類似した様式によって調製されてもよい。
【０００９】
より具体的には、本発明は、（変性）イネ胚乳タンパク質マトリックス中の１つ以上の（脂溶性）活性成分および／または１つ以上の着色剤を含んでなる、粉末形態の安定した組成物に関する。
【００１０】
好ましくは（変性）イネ胚乳タンパク質の量は、組成物総量を基準にして、１〜７０重量％、より好ましくは５〜５０重量％、さらにより好ましくは１０〜４０重量％、最も好ましくは１０〜２０重量％であり（２０重量％が最も好ましい量である）、および／または（脂溶性）活性成分および／または着色剤の量は０．１〜９０重量％、好ましくは１〜８０重量％、より好ましくは１〜２０重量％である。トコフェロールおよび／またはパルミチン酸アスコルビルなどの追加的アジュバントおよび／または賦形剤が存在する場合、それらは組成物総量を基準にして、０．０１〜５０重量％の量、好ましくは０．１〜３０重量％の量、より好ましくは０．５〜１０重量％の量で存在する。
【００１１】
［（変性）イネ胚乳タンパク質］
本発明の好ましい実施態様では、イネ胚乳タンパク質は、その製造について下述する変性イネ胚乳タンパク質である（１３頁２６行から１８頁２３行まで、および実施例１〜７を参照されたい）。特に好ましい米タンパク質は、アルカリ抽出、（特にアルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）での酵素変性）、遠心分離および限外濾過のステップによって得られるものである。さらなる用途のために必要ならば、このようにして得られた変性イネ胚乳タンパク質はまた、乾燥させても良い。しかし本発明は、このような製造された変性イネ胚乳タンパク質の使用に限定されない。
【００１２】
さらにより好ましいのは、≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００、さらにより好ましくは５００〜１０００のエマルジョン能力を有する（変性）イネ胚乳タンパク質である。さらに本発明の好ましい実施態様では、使用される（変性）イネ胚乳タンパク質は、≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５、さらにより好ましくは０．５〜１．０のエマルジョン活性を有する。エマルジョン能力の判定については実施例８で記載され、エマルジョン活性の判定については実施例９で記載される。本発明は、これらの（変性）イネ胚乳タンパク質それ自体についてもまた言及する。
【００１３】
本発明のさらに好ましい組成物では、（変性）イネ胚乳タンパク質は、還元糖、糖タンパク質またはグリコペプチドからなる群から選択される、少なくとも１つの化合物と架橋している。
【００１４】
［活性成分］
活性成分は、薬理学的効果のある成分、または一般にヒトまたは動物の身体に健康上の利点を提供する成分である。好ましくは、活性成分は脂溶性活性成分および／または着色剤である。
【００１５】
脂溶性活性成分および／または着色剤は、好ましくはカロテンおよび構造的に関連したポリエン化合物、脂溶性ビタミン、補酵素Ｑ１０、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの多価不飽和脂肪酸とそのエステル（（同一または異なる脂肪酸を含有する）エチルエステルまたはトリグリセリドなど）、ポリ不飽和脂肪酸に富んだモノ−、ジ−、トリグリセリド、脂溶性ＵＶ−Ａフィルター、ＵＶ−Ｂフィルター、ならびにそれらと特にＣ１〜２０炭酸とのエステルなどのそれらの生理学的に許容可能な誘導体、およびそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【００１６】
最も好ましい脂溶性ビタミンは、ビタミンＡまたはＥである。
【００１７】
カロテンおよび構造的に関連したポリエン化合物の好ましい例は、α−カロテン、β−カロテン、８’−アポ−β−カロテナール、エチルエステルなどの８’−アポ−β−カロテン酸エステル、カンタキサンチン、アスタキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、クロセチン、α−ゼアカロテン、β−ゼアカロテンなどのカロテノイド、ならびにそれらと特にＣ１〜２０炭酸とのエステルなどのそれらの生理学的に許容可能な誘導体、およびそれらの任意の混合物である。
【００１８】
最も好ましいカロテノイドはβ−カロテンである。
【００１９】
「β−カロテン」という用語は、全てのシスならびに全てのトランス異性体、および全ての可能な混合したシス−トランス−異性体を包含する。その他のカロテノイドについても同様である。
【００２０】
「ゼアキサンチン」という用語は、天然Ｒ，Ｒ−ゼアキサンチン、ならびにＳ，Ｓ−ゼアキサンチン、メソ−ゼアキサンチンおよびそれらの任意の混合物を包含する。ルテインについても同様である。
【００２１】
（脂溶性）活性成分は天然起源であってもよく、すなわち植物から単離／抽出されて純化および／または濃縮されてもよく、ならびに化学および／または微生物学的（発酵性）経路によって合成されるものであってもよい。
【００２２】
［さらなる構成要素］
活性成分および（変性）イネ胚乳タンパク質に加えて、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１つの水溶性抗酸化剤および／または脂溶性抗酸化剤をさらに含有してもよい。
【００２３】
水溶性抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸またはその塩、好ましくはアスコルビン酸ナトリウムであってもよく、ヒドロキシチロソール、およびオレウロペインアグリコンなどの水溶性ポリフェノールであっても、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）またはローズマリーまたはオリーブの抽出物であってもよい。
【００２４】
脂溶性抗酸化剤は、例えばｄｌ−α−トコフェロール（すなわち合成トコフェロール）、ｄ−α−トコフェロール（すなわち天然トコフェロール）、β−またはγ−トコフェロール、またはこれらの２つ以上の混合物などのトコフェロールと、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）と、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）と、エトキシキン、没食子酸プロピルと、ｔｅｒｔ．ブチルヒドロキシキノリンと、または６−エトキシ−１，２−ジ−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルキノリン（ＥＭＱ）、または好ましくはパルミチン酸アスコルビルまたはステアリン酸アスコルビルなどの脂肪酸のアスコルビン酸エステルであってもよい。
【００２５】
本発明の組成物は、脂肪酸のモノ−およびジグリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、レシチンと、Ｎ−アシル化アミノ酸およびそれらの誘導体、アルキルまたはアルケニルラジカルがあるＮ−アシル化ペプチド、およびそれらの塩と、硫酸アルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステル、およびそれらの誘導体および塩と、ポリオキシエチレン化アルキルまたはアルケニル脂肪エーテルまたはエステルと、ポリオキシエチレン化アルキルまたはアルケニルカルボン酸およびそれらの塩と、Ｎ−アルキルまたはＮ−アルケニルベタインと、アルキルトリメチルアンモニウムまたはアルケニルトリメチルアンモニウムおよびそれらの塩と、ポリオールアルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステルと、それらの混合物からなる群から選択される共乳化剤をさらに含有してもよい。
【００２６】
ポリオールアルキルまたはアルケニルエーテルまたはエステルの好ましい例は、Ｓｅｐｐｉｃ社によりＭｏｎｔａｎｏｘ ４０ ＤＦの商品名の下に販売されるパルミチン酸ソルビタン２０ ＥＯまたはポリソルベート４０、ＩＣＩ社によりトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０の商品名の下に販売されるラウリン酸ソルビタン２０ ＥＯまたはポリソルベート２０などの少なくとも２０単位の酸化エチレンでポリオキシエチレン化されたソルビタンアルキルまたはアルケニルエステル、およびモノステアリン酸ソルビタンである。
【００２７】
本発明に従った調合物はさらに錠剤に圧搾されてもよく、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類、グリセロール、およびトリグリセリドからなる群から選択される１つ以上の賦形剤および／またはアジュバントが添加されてもよい。
【００２８】
本発明の組成物中に存在してもよいモノ−および二糖類の好ましい例は、スクロース、転化糖、キシロース、グルコース、フルクトース、乳糖、マルトース、ショ糖および糖アルコールである。
【００２９】
オリゴ糖類および多糖類の好ましい例は、デンプン、加工デンプン、およびデンプン加水分解産物である。デンプン加水分解産物の好ましい例はデキストリンおよびマルトデキストリンであり、特に５〜６５個の範囲のデキストロース同等物（ＤＥ）を有するもの、および特に２０〜９５個の範囲のＤＥを有するようなグルコースシロップである。「デキストロース同等物（ＤＥ）」という用語は加水分解度を意味し、乾燥重量を基準にしてＤ−グルコースとして計算される還元糖量の基準である。尺度は、０に近いＤＥを有する天然デンプン、および１００のＤＥを有するグルコースを基準とする。
【００３０】
トリグリセリドは、適切には、植物油または脂肪、好ましくはトウモロコシ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ベニバナ油、ナタネ油、落花生油、パーム油、パーム核油、綿実油、オリーブ油またはココナッツ油である。
【００３１】
固体組成物は、ケイ酸またはリン酸三カルシウムなどの固化防止剤、および１０重量％までで通例２〜５重量％の水をさらに含んでもよい。
【００３２】
［組成物の製造］
本発明の目的はまた、
Ｉ）（変性）イネ胚乳タンパク質の水溶液またはコロイド溶液を調製するステップと、
ＩＩ）場合によりステップＩ）で調製された溶液に、少なくとも水溶性賦形剤および／またはアジュバントを添加するステップと、
ＩＩＩ）少なくとも活性成分、好ましくは少なくとも脂溶性活性成分および／または着色剤、および場合により少なくとも脂溶性アジュバントおよび／または賦形剤の溶液または分散体を調製するステップと、
ＩＶ）ステップＩ）〜ＩＩＩ）で調製された溶液を互いに混合するステップと、
Ｖ）このようにして得られた混合物を均質化するステップと、
ＶＩ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するための架橋剤を添加するステップと、
ＶＩａ）場合によりステップＶＩ）を実施した後に得られた混合物に酵素処理または熱処理を施して（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと、
ＶＩＩ）場合によりステップＶ）および／またはＶＩ）で得られた分散体を粉末に加工するステップと、
ＶＩＩＩ）場合によりステップＶＩＩ）で得られた粉末を乾燥するステップと、
ＩＸ）場合により乾燥粉末に酵素処理または熱処理を施して（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと
を含んでなり、ただしステップＶＩ）が実施される場合、ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）の双方でなく片方のみが実施される、本発明の組成物を製造する方法である。
【００３３】
［ステップＩ］
このステップは、場合により撹拌しながら、単に水を（変性）イネ胚乳タンパク質に添加して、または（変性）イネ胚乳タンパク質を水に添加して実施される。あるいは、均質化は超音波処理によって可能であり得る。
【００３４】
好ましくは上述のような選択性のある（変性）イネ胚乳タンパク質が使用される。
【００３５】
［ステップＩＩ］
添加してもよい水溶性賦形剤および／またはアジュバントは、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類、グリセロールおよび水溶性抗酸化剤である。それらの例は上に示した。
【００３６】
［ステップＩＩＩ］
活性成分は、上述したようなものである。
【００３７】
（脂溶性）活性成分および／または着色剤および任意の脂溶性賦形剤およびアジュバント（ａｄｊｕｖｅｎｔｓ）は、それ自体として、またはトリグリセリドおよび／または（有機）溶剤に溶解または懸濁して使用される。
【００３８】
適切な有機溶剤は、ハロゲン化脂肪族炭化水素、脂肪族エーテル、脂肪族および環式炭酸塩、脂肪族エステルおよび環式エステル（ラクトン）、脂肪族および環式ケトン、脂肪族アルコール、およびそれらの混合物である。
【００３９】
ハロゲン化脂肪族炭化水素の例は、モノ−またはポリハロゲン化直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。特に好ましい例はモノ−またはポリ−塩素化または−ブロム化された直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。より好ましいのはモノ−またはポリ塩素化直鎖、分枝または環式Ｃ１〜Ｃ１５−アルカンである。最も好ましいのは塩化メチレンおよびクロロホルムである。
【００４０】
脂肪族エステルおよび環式エステル（ラクトン）の例は、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびｎ−酢酸ブチル、およびγ−ブチロラクトンである。
【００４１】
脂肪族および環式ケトンの例は、アセトン、ジエチルケトンおよびイソブチルメチルケトン、およびシクロペンタノンおよびイソホロンである。
【００４２】
環式炭酸塩の例は、特に炭酸エチレンおよび炭酸プロピレンおよびそれらの混合物である。
【００４３】
脂肪族エーテルの例は、アルキル部分が１〜４個の炭素原子を有するジアルキルエーテルである。好ましい一例はジメチルエーテルである。
【００４４】
脂肪族アルコールの例は、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、およびブタノールである。
【００４５】
さらに溶剤として、任意の油（トリグリセリド）、オレンジ油、リモネンなどおよび水が使用できる。
【００４６】
添加してもよい脂溶性賦形剤および／またはアジュバントは、例えばトウモロコシ油、モノ−または脂肪酸のジグリセリド、ポリグリセロール脂肪酸、および中鎖トリグリセリド（「ＭＣＴ」）である。
【００４７】
［ステップＩＶ］
本発明の代案の方法ではステップＩＩＩ）が実施されないが、活性成分および任意の脂溶性賦形剤および／またはアジュバントが、ステップＩ）またはＩＩ）の溶液に直接添加される。
【００４８】
［ステップＶ」
均質化のためには、高圧均質化、高剪断乳化（ロータ・ステータシステム）、微粒子化（ｍｉｃｒｏｎｉｓａｔｉｏｎ）、湿潤製粉、マイクロチャネル（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｅｌ）乳化、膜乳化または超音波処理などの従来の技術を応用できる。食物、飲料、動物飼料、化粧品または医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のために、（脂溶性）活性成分および／または着色剤を含有する組成物の調製のために使用されるその他の技術については、その内容を参照によって本明細書に援用するＥＰ−Ａ ０ ９３７ ４１２号明細書（特に段落［０００８］、［００１４］、［００１５］、［００２２］から［００２８］）、ＥＰ−Ａ １ ００８ ３８０号明細書（特に段落［０００５］、［０００７］、［０００８］、［００１２］、［００２２］、［００２３］から［００３９］）および米国特許第６，０９３，３４８号明細書（特に２欄２４行から３欄３２行、３欄４８行から６５行、４欄行５３行から６欄６０行）で開示される。
【００４９】
［ステップＶＩ］
架橋剤は、好ましくは還元糖、糖タンパク質、およびグリコペプチドからなる群から選択される。したがって（変性）イネ胚乳タンパク質と、糖タンパク質／グリコペプチドの糖または糖部分との分子間架橋が形成する。好ましい架橋剤の例は、グルコース、フルクトース、ショ糖、およびキシロースなどの還元糖である。
【００５０】
［ステップＶＩａ］
架橋は、上述のように架橋剤をさらに含有する混合物を熱処理してメイラード型反応において糖とタンパク質との架橋を引き起こし、すなわち好ましくは約３０〜約１６０℃の温度、より好ましくは約７０〜約１００℃の温度、最も好ましくは約８０〜約９０℃の温度で熱的に処理して達成できる。
【００５１】
（変性）イネ胚乳タンパク質と架橋剤との架橋はまた、好都合には約０〜約７０℃の温度、好ましくは約２０〜約４０℃の温度で実施される、架橋酵素（例えばトランスグルタミナーゼであるＥＣ２．３．２．１３タンパク質−グルタミン：γ−グルタミルトランスフェラーゼなどのアシル転移酵素ＥＣ２．３）での処理、すなわち酵素的処理によって達成できる。好ましくはステップＶＩａ）に従った酵素処理は架橋酵素、特にトランスグルタミナーゼによる処理である。
【００５２】
トランスグルタミナーゼの場合、酵素的架橋はε−（γ−グルタミル）−リジンイソペプチド結合の形成によって、安定したタンパク質含有多糖類網目状組織をもたらす。酵素的架橋のためには、糖タンパク質またはグリコペプチドの使用が好ましい。
【００５３】
親油性部分の組み込みのため、メイラード型反応において糖とタンパク質の架橋を引き起こす熱処理、および酵素的架橋の双方の技術が使用でき、組成物の乾燥形態（ステップＩＸ）、または水溶液または懸濁液（ステップＶＩａ）中のどちらかで実施できる。酵素的架橋は、好ましくは水溶液または懸濁液中で実施される。
【００５４】
［ステップＶＩＩ］
水中油分散体であるこのようにして得られた分散体は、噴霧乾燥、流動床顆粒化と組み合わさった噴霧乾燥（後者の技術は一般に流動化噴霧乾燥またはＦＳＤとして知られている）によって、または噴霧されたエマルジョン小滴がデンプン、ケイ酸カルシウム、および二酸化ケイ素などの吸収材の床に捕捉されて引き続いて乾燥される粉末捕捉技術などの任意の従来の技術を使用して、有機溶剤（存在する場合）の除去後に、例えば乾燥粉末などの固体組成物に転換できる。
【００５５】
噴霧乾燥は、約１００〜約２５０℃、好ましくは約１５０℃〜約２００℃、より好ましくは約１６０〜約１９０℃の入口温度、および／または約４５〜約１６０℃、好ましくは約５５〜約１１０℃、より好ましくは約６５〜約９５℃の出口温度（製品温度）で実施されてもよい。
【００５６】
［ステップＶＩＩＩ］
ステップＶＩＩで得られた粉末の乾燥は、好ましくは≦１００℃の温度、好ましくは２０〜１００℃の温度、より好ましくは６０〜７０℃の温度で実施される。乾燥が真空中で実施される場合、温度はより低い。
【００５７】
［ステップＩＸ］
熱処理を通じた架橋は、ステップＶＩａについて既に上述したようにして実施される。酵素処理についても同様であるが、好ましくは溶液／懸濁液中で実施される。
【００５８】
［（変性）イネ胚乳タンパク質の製造］
本発明はまた、
ａ）粉砕米の水溶液または懸濁液を調製し、製粉前に米糠が除去されて溶液または懸濁液が好ましくは水溶液または懸濁液総量を基準にして０．１〜３０重量％、好ましくは１０〜１５重量％の乾燥質量含量を有するステップと、
ｂ）場合により粉砕米の非タンパク質部分またはタンパク質部分を除去してイネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｃ）場合により粉砕米のタンパク質部分を変性させて変性イネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｄ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を単離するステップと、
ｅ）場合により（変性）イネ胚乳タンパク質を固形に加工するステップと
を含んでなり、ただしステップｂ）、ｃ）、およびｄ）の少なくとも１つが実施される、粉砕米から開始して、米糠が製粉前に除去された（変性）イネ胚乳タンパク質を製造する方法にも関する。
【００５９】
本発明の文脈で「イネ胚乳タンパク質」とは、特にステップａ）とｂ）、またはステップａ）とｄ）、またはステップａ）とｂ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｄ）、またはステップａ）とｄ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｄ）とｅ）のいずれかを実施することによって得られる生成物を意味する。好ましいのはステップａ）およびｂ）（およびｄ）および／またはｅ））が実施される実施態様であり、特に好ましいのは、ステップａ）、ｂ）、およびｄ）（およびｅ））が実施される実施態様である。
【００６０】
本発明の文脈で「変性イネ胚乳タンパク質」とは、特にステップｃ）が実施される生成物、すなわちステップａ）とｃ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）、またはステップａ）とｃ）とｄ）、またはステップａ）とｃ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｄ）、またはステップａ）とｃ）とｄ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｅ）、またはステップａ）とｂ）とｃ）とｄ）とｅ）のいずれかを実施することによって得られる生成物を意味する。
【００６１】
変性イネ胚乳タンパク質（およびその選択性）は、イネ胚乳タンパク質よりも好ましい。最も好ましいのは、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（およびｅ））を実施することによって得られる生成物である。
【００６２】
［ステップａ）］
製粉前に米糠が除去された粉砕米はまた、「米粉」の表現の下に知られている。
【００６３】
このステップは、場合により米粉が完全に分散するまで激しく（機械的撹拌機で）撹拌しながら、または米粉懸濁液をホモジナイザーで例えば室温で５分間均質化して、単に米粉に水を添加して、または水に米粉を添加して実施される。
【００６４】
［ステップｂ）］
［非タンパク質部分の除去］
ステップｂ）は、好ましくは米粉をいかなるｐＨ調節もなしに（ｐＨ６〜７）非タンパク質分解酵素により、例えば０．５％ターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）（登録商標）水性懸濁液により温度９０℃で２時間、次に０．１％セルラーゼ水性懸濁液により温度５０℃で３０分間処理して酵素を不活性化して、米粉のタンパク質部分から非タンパク質部分を分離し除去することによって行われてもよい。
【００６５】
好ましい非タンパク質分解酵素の例は、α−アミラーゼなどのデンプン分解酵素、およびセルラーゼ、すなわちセルロース分解酵素、およびそれらの混合物である。α−アミラーゼの好ましい例は、米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）から市販されるターマミル（登録商標）１２０、タイプＬである。その他の好ましい例は、米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッドから市販されるＬｉｑｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｓｕｐｒａ、日本国名古屋市（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）の天野製薬株式会社（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）から市販されるアミラーゼＳ「アマノ」３５Ｇ、米国のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ））から市販されるＭｕｌｔｉｆｅｃｔセルラーゼ、および日本国名古屋市の天野製薬株式会社から市販されるセルラーゼＴ「アマノ」４である。
【００６６】
酵素反応は、無機機酸（例えば塩酸）または有機酸（例えばクエン酸）または塩基が使用される場合は溶液または懸濁液を中性化することで、または加熱して酵素を変性させることで停止できる。
【００６７】
変性は、溶液を８０〜９５℃の温度、好ましくは８０〜８５℃の温度に１０〜１５分加熱することで達成してもよい（特に３．５〜４．５の低ｐＨで）。その後溶液を５０℃に冷却してもよい。
【００６８】
非タンパク質部分の分離は、遠心分離（５０００ｇで１５分間）（非タンパク質部分は水相中に存在する）と、それに続く脱イオン水での洗浄によって達成されてもよい。イネ胚乳タンパク質はペレットのままである。
【００６９】
［タンパク質部分の除去］
あるいは、遠心分離または濾過前にいわゆる「アルカリ抽出」またはいわゆる「塩抽出」を実施してもよい。
【００７０】
「アルカリ抽出」とは、最初に４０〜６０℃で３時間、米粉溶液または懸濁液のｐＨを７〜１２の値、好ましくは８〜１０の値、より好ましくは約９の値に、アルカリ溶液（例えばＮａＯＨ水溶液）で調節することを意味する。
【００７１】
タンパク質収率がタンパク質機能性よりも重要な場合は、ｐＨを好ましくは８〜１２、より好ましくは９〜１２、さらにより好ましくは１０〜１２の値に調節することが有利であり得る。
【００７２】
好ましくはこのような塩基は、約０．１〜５Ｍ、好ましくは約０．５〜約２Ｍの濃度を有する。塩基は無機塩基であってもよい。無機塩基の例は、水酸化ナトリウム（好ましい）、水酸化カリウム、および水酸化カルシウムなどのアルカリ（土類）水酸化物である。
【００７３】
「塩抽出」は「アルカリ抽出」に類似するが、塩基に加えて塩化ナトリウムなどの塩が使用される。好ましい本発明の実施態様では、０．０８Ｍの塩化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１１に調節）が、抽出溶剤として使用される。
【００７４】
（アルカリまたは塩抽出）どちらの場合もタンパク質部分は、水相に移動される。次に遠心分離または濾過によって、非タンパク質部分からタンパク質部分を分離してもよい。
【００７５】
［ステップｃ）］
米粉の変性は、（市販される）食品等級アルカリ性、中性および／または酸性タンパク質分解酵素で、それ（そのタンパク質部分）を処理することによって達成されてもよい。いくつかのタンパク質分解酵素について、酵素規格および最適条件を実施例で提供する。
【００７６】
タンパク質分解酵素は、細菌または真菌からのもの、ならびに果実からのもの、または動物起源であってもよい。
【００７７】
アルカリ性タンパク質分解酵素の例は、市販される米国ノースカロライナ州フランクリントン（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）のノボ・ノルディスク・バイオケムからのアルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）、米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）のＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ（登録商標）、米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからのＰｒｏｔｅｘ ６Ｌ（登録商標）（ジェネンコア（登録商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、および米国ニューヨーク州ロチェスターのジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからのジェネンコア（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ８９９である。
【００７８】
中性タンパク質分解酵素の例は、市販される米国ニューヨーク州ニューヨークのＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＢｒｏｍｅｌａｉｎ（ブロメライン）（登録商標）、米国ニューヨーク州ニューヨークのＥｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのリキパノール（Ｌｉｑｕｉｐａｎｏｌ）（登録商標）、および米国ニューヨーク州ロチェスターのジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからの細菌中性タンパク質分解酵素である。中性タンパク質分解酵素のさらなる例は、植物であるパパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）からの製品、すなわち果実起源酵素である、オランダ国デルフト（Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅｓから市販されるＣｏｌｌｕｐｉｌｉｎ（登録商標）である。
【００７９】
酸性タンパク質分解酵素の例は、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ））からのペプシンおよび日本国名古屋市の天野製薬株式会社からの酸性タンパク質分解酵素である。
【００８０】
本発明の方法の好ましい実施態様では、米粉のタンパク質部分は、引き続いて７〜１０の範囲のｐＨにおいて４０〜６０℃で１０〜８０分、２つの異なるアルカリ性タンパク質分解酵素によって処理される。
【００８１】
好ましくはこれらのタンパク質分解酵素の１つは、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ（登録商標）などのセリン特異的タンパク質分解酵素、またはアルカリ性タンパク質分解酵素（登録商標）であり、もう１つはリキパノール（登録商標）またはブロメライン（登録商標）などのシステイン特異的タンパク質分解酵素である。
【００８２】
ステップはまた、酵素を一度に添加せず、それらを（引き続いてまたは同時に）小分けにして添加することで、修正されてもよい。
【００８３】
ステップｃ）はまた、ステップｄ）の後に実施されてもよく、すなわち最初にイネ胚乳タンパク質を単離して次にそれを変性してもよい。
【００８４】
［ステップｄ）］
ステップｄ）は、好ましくは遠心分離および／または濾過によって、好ましくは限外濾過によって実施される。限外濾過は、先行する遠心分離なしに実施されてもよい。
【００８５】
酵素不活性化後、加水分解産物（ｈｙｄｒｏｌｙａｔｅ）を好ましくは低速で遠心分離して（１０００ｇで１０分間）、不溶性タンパク質および不純物を分離してもよい。
【００８６】
次にタンパク質加水分解産物の可溶性画分をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）４号濾紙を通して濾過し、濾液に分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧５ｋＤａの膜、好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧３０ｋＤａの膜、より好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）≧５０ｋＤａの膜、最も好ましくは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）５０〜７５０ｋＤａの膜で、逐次限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）を施してもよい。
【００８７】
限外濾過およびダイアフィルトレーションは、室温において２０〜２５ｐｓｉの入口圧力および１０ｐｓｉの出口圧力で実施されてもよい。次に溶液を５倍の濃縮率に限外濾過する。限外濾過直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションしてもよい。限外濾過およびダイアフィルトレーション中に、タンパク質を可溶性に保つため溶液のｐＨをｐＨ８．０〜９．０の間に維持してもよい。
【００８８】
［ステップｅ）］
例えば乾燥粉末などの固体形態への変換は、当業者に知られている任意の乾燥法によって達成できる。好ましいのは噴霧乾燥または凍結乾燥である。噴霧乾燥は好ましくは約２００℃〜約２１０℃の入口温度、および約７０℃〜約７５℃の出口温度で実施される。凍結乾燥は好ましくは約−２０℃〜約−５０℃の温度で１０〜４８時間実施される。
【００８９】
本発明の目的はまた、上述の任意の方法によって得られる（変性）イネ胚乳タンパク質でもある。
【００９０】
［産業上の利用可能性］
本発明は、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のための上述のような組成物の使用、ならびにこのような上述のような組成物を含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物それ自体に関する。
【００９１】
本発明はまた、上述のような（変性）イネ胚乳タンパク質を含有する食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物、ならびに活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための保護親水コロイドとしての好ましくは上述のようなこのような（変性）イネ胚乳タンパク質の使用にも関する。
【００９２】
ヒトをはじめとする動物は、本発明の文脈でヒトの他に、特にヒツジ、雌牛、ウマ、家禽（ブロイラーおよび卵の着色）、エビおよび魚（特にサケおよびニジマス）などの飼育動物、ならびにネコ、イヌ、鳥（例えばフラミンゴ）、および魚などのペットを包含する。
【００９３】
本発明の組成物が、特に着色剤または機能性成分として使用できる飲料は、例えば、着香天然発泡ミネラルウォーター、清涼飲料またはミネラル飲料などの炭酸飲料、ならびに例えば着香水、果汁、フルーツポンチ、およびこれらの飲料の濃縮形態などの非炭酸飲料であることができる。それらは天然果汁または野菜汁または人工香料をベースにしてもよい。アルコール飲料および即席飲料粉末もまた含まれる。糖含有飲料の他に、ノンカロリーおよび人工甘味料を用いたダイエット飲料もまた含まれる。
【００９４】
さらに天然起源または合成から得られる乳製品は、本発明の組成物が、特に着色剤としてまたは機能性成分として使用できる食品の範囲内である。このような製品の典型的な例は、乳飲料、アイスクリーム、チーズ、ヨーグルトなどである。豆乳飲料および豆腐製品などの乳代替製品もまた、この応用範囲に含まれる。
【００９５】
菓子製品や、キャンデーや、ガムや、例えばアイスクリーム、ゼリー、プディング、即席プディング粉末などのデザートなど、本発明の組成物を着色剤としてまたは機能性成分として含有する甘み食品もまた含まれる。
【００９６】
本発明の組成物を着色剤としてまたは機能性成分として含有する、穀類、スナック、クッキー、パスタ、スープ、およびソース、マヨネーズ、サラダドレッシングなどもまた含まれる。さらに乳製品および穀類のために使用される果実調製品もまた含まれる。
【００９７】
本発明の組成物を通じて食品に添加される（脂溶性）活性成分および／または着色剤の最終濃度は、食物組成物の総重量を基準にして０．１〜５００ｐｐｍ、特に１〜５０ｐｐｍであってもよく、着色または強化される特定の食品、および意図される着色または強化の程度に左右される。
【００９８】
本発明の食物組成物は、好ましくは食品に、本発明の組成物の形態の（脂溶性）活性成分および／または着色剤を添加することによって得られる。食品または医薬品の着色または強化のために、本発明の組成物は、本発明の水分散性固体組成物の応用について知られている方法に従って使用できる。
【００９９】
一般に組成物は、特定の応用に従って、水性原液、乾燥粉末混合物、またはその他の適切な食物成分とのプレブレンドのいずれかとして添加してもよい。混合は最終応用の配合次第で、例えば乾燥粉末ブレンダー、低剪断ミキサー、高圧ホモジナイザーまたは高剪断ミキサーを使用して実施できる。容易に明らかであるように、このような専門的事項は専門家の技能の範囲内である。
【０１００】
組成物が着色剤として使用される錠剤またはカプセルなどの医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。錠剤の着色は、錠剤コーティング混合物に液体または固体着色剤組成物の形態で本発明の組成物を別々に添加する、または錠剤コーティング混合物の構成要素の１つに着色剤組成物を添加することによって達成できる。着色硬質または軟質シェルカプセルは、着色剤組成物をカプセル塊水溶液に組み込むことによって調製できる。
【０１０１】
組成物が活性成分として使用される、チュアブル錠、発泡性錠剤またはフィルム被覆錠剤などの錠剤、または硬質シェルカプセルなどのカプセルのような医薬組成物もまた本発明の範囲内である。本発明の組成物は、典型的に錠剤化混合物に粉末として添加され、またはカプセルの製造について知られている様式でカプセル内に充填される。
【０１０２】
組成物が、例えば卵黄、食用家禽、ブロイラーまたは水産動物（特にエビ、サケ、ニジマス）を着色するための着色剤として、または活性成分として使用される、栄養成分プレミックス、複合飼料、ミルク代替え品、流動食または飼料調製品などの動物飼料製品もまた、本発明の範囲内である。
【０１０３】
組成物が着色剤として、または活性成分として使用される、化粧品、洗面用品、および皮膚用製品、すなわちクリーム、ローション、バス、リップスティック、シャンプー、コンディショナー、スプレーまたはジェルなどのスキンおよびヘアケア製品をはじめとするパーソナルケア組成物は、本発明の範囲内である。
【０１０４】
本発明を次の実施例によってさらに例示する。
【０１０５】
［実施例］
次の略語が使用される。
ＵＦ＝限外濾過
ＤＦ＝ダイアフィルトレーション
ＤＨ＝加水分解度
ＤＩ水＝脱イオン水
ＭＷＣＯ＝分子量カットオフ
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
【０１０６】
米粉はアーカンソー州シュトゥットガルトのライスランド・フーズ（Ｒｉｃｅｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ＡＲ））から得られた。次の食品等級酵素をタンパク質の単離で使用した。（１）ターマミル−米国のノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ・インコーポレーテッドからの熱安定性α−アミラーゼ、（３）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔセルラーゼ−米国のジェネンコア・インターナショナル・インコーポレーテッドからの２，０００ＩＵ／ｇの真菌セルラーゼ。次の規格の食品等級タンパク質分解酵素を使用した（表１ａおよび１ｂ）。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
［概要］
アルカリ、塩、および酵素的方法によるイネ胚乳タンパク質単離の最適化について実験を行い、それらの抽出性および物理化学および機能特性についてそれらを評価した。目的は、改善された米タンパク質機能性のための最適抽出法を同定するために、抽出法を最適化し、抽出物の物理化学特性を評価することであった。
【０１１０】
米タンパク質単離物は、化学的および酵素的方法によって調製した。予備試験を行って、最大収率およびタンパク質含量があるタンパク質の抽出条件を最適化した。化学的および酵素的方法の手順の例として、米タンパク質単離物調製品ＲＰＡを図１に、９０℃でのターマミル（登録商標）処理とそれに続くセルラーゼ処理による米タンパク質単離物調製品（ＲＰＥＴ）を図２に示す。
【０１１１】
［濾過による（変性）イネ胚乳タンパク質単離］
１インチ径中空繊維ポリスルホン膜カートリッジを装着した米国のＫｏｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓからのＲｏｍｉｃｏｎ限外濾過システムを使用して、限外濾過実験を実施した。（変性）イネ胚乳タンパク質の可溶性画分をワットマン４号濾紙を通して濾過し、５０、３０、１０、および５ｋＤａの名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜−カートリッジを使用して、濾液に逐次限外濾過を施した。各ＭＷＣＯカートリッジ中で、溶液を５倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過の直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を体積の２倍の脱イオン水によって２回ダイアフィルトレーションした。１回目の（５０ｋＤａ）限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）の透過物をプールして、次にＭＷＣＯ（３０ｋＤａ）ＵＦおよびＤＦを施した。各ＭＷＣＯカートリッジから得られた保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を凍結乾燥し、ＤＨ、溶解性、および乳化特性について評価した。
【０１１２】
［（Ａ）タンパク質抽出］
［実施例１：アルカリ抽出（［化学抽出」）によるイネ胚乳タンパク質の単離］
［実施例１−１：（ＲＥＰ １−１）］
米国ニューヨーク州ガーディナー（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのブレンダー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内で、室温において設定６で５分間、５００グラムの米粉を４Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化した。１ＮのＮａＯＨを使用してスラリーをｐＨ１１．０に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（５，０００ｇ、２０分間）によって分離した。この手順をもう一度繰り返し、残留物からさらに抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に２時間保った。沈殿物を１０，０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で２回洗浄し、ｐＨ７．０に調節して、凍結乾燥して５℃で保存した。
【０１１３】
［代案の実施例１−２：（ＲＥＰ １−２）］
５Ｋｇの米粉を４０Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化し、３ＮのＮａＯＨを添加してスラリーのｐＨをｐＨ１１に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（５０００ｇ、１５分間）によって分離した。この手順をもう一度繰り返し、残留物からさらに抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に２時間保った。沈殿物を５０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で２回洗浄し、ｐＨ７．０に調節して５℃で保存した。
【０１１４】
［代案の実施例１−３：（ＲＥＰ １−３）］
米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内で、５分間１キログラムの米粉を８Ｌの脱イオン水（１：８、ｗ／ｖ）により均質化した。１ＮのＮａＯＨを使用してスラリーのｐＨを１１．０に調節し、懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。溶液中の可溶化したタンパク質を遠心分離（２０００ｇ、１５分間）によって分離した。この手順を繰り返して、残留物から追加的タンパク質を抽出した。１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質をｐＨ４．５で等電点沈殿させ、４℃に１時間保った。沈殿物を５０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収し、脱イオン水（１：４、ｗ／ｖ、ｐＨ４．５）で洗浄し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥し（ＲＰＡ）、５℃で保存した（図１）。
【０１１５】
［実施例１−４（ＲＥＰ １−４）：塩抽出によるイネ胚乳タンパク質の単離］
米タンパク質（ＲＰＳ）の塩抽出は上のアルカリ法（ＲＥＰ １−３参照）に類似しているが、０．０８Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＯＨでｐＨ１１に調節）の合わせた溶液を抽出溶剤として使用した。
【０１１６】
［実施例２：非タンパク質部分の酵素的分解によるイネ胚乳タンパク質の単離（「酵素的抽出」）］
［実施例２−１：（ＲＥＰ ２−１）］
５００グラムの米粉を３Ｌの蒸留水（１：６、ｗ／ｖ）に分散した。米粉−水を４０℃で１５分間撹拌して、スラリーを形成した。スラリーを０．５％のα−アミラーゼで処理して温度を９０℃に徐々に上昇させて、９０℃で２時間インキュベートした。２０℃において５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、可溶化されたデンプンを除去した。残留物を１．５Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％のセルラーゼで処理して５０℃で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを３．５に低下させて、酵素を不活性化した。可溶化したデンプンおよびセルロース画分を５０００×ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。沈殿したタンパク質を温脱イオン水で２回洗浄して可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥して５℃で保存した。
【０１１７】
［代案の実施例２−２：（ＲＥＰ ２−２）］
５Ｋｇの米粉を３０Ｌ脱イオン水により均質化して、６０℃で１５分間撹拌した。スラリーを０．２％ターマミルで処理し、温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で２時間インキュベートした。可溶化したデンプンをチーズクロスで濾過して除去した。ペレットを１５Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％のペクチナーゼと共に５０℃で３０分間インキュベートし、新たな０．１％酵素ターマミルを添加した。温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを５．０に低下させて、酵素を不活性化した。可溶化した細胞壁構成要素および残留デンプンをチーズクロスで濾過して除去した。タンパク質ペレットを温脱イオン水で２回洗浄して可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して５℃で保存した。
【０１１８】
［代案の実施例２−３：（ＲＥＰ ２−３）］
１ｋｇの米粉を６Ｌの脱イオン水により均質化して、６０℃で１５分間撹拌した。スラリーを０．５％ターマミルで処理し、温度を９０℃に徐々に上昇させて、その温度で２時間インキュベートした。可溶化したデンプンを遠心分離（５０００ｇ、１５分間）によって除去した。ペレットを３Ｌの脱イオン水と再度混合し、０．１％セルラーゼと共に５０℃で３０分間インキュベートした。９０℃でｐＨを４．５に低下させて酵素を不活性化した。次に可溶化したセルロース画分を遠心分離によって除去した。沈殿したタンパク質を温脱イオン水で２回洗浄して、可溶性糖および残留酵素を除去し、ｐＨ７．０に調節して凍結乾燥し（ＲＰＥＴ）５℃で保存した（図２）。
【０１１９】
［代案の実施例２−４：（ＲＥＰ ２−４）］
アミラーゼＳ（ＲＰＥＡ）抽出は、ターマミルの代わりにアミラーゼＳが使用されること以外は、ターマミル法（ＲＥＰ ２−３参照）と本質的に同一である。アミラーゼＳは７０℃で最適活性を有し、９０℃で作用するターマミル法よりもさらに穏和な抽出条件を提供する。タンパク質単離物の水分、タンパク質、デンプン、繊維、脂肪、および灰分含量は、アメリカ穀物化学者協会公認法，第８版，第２巻，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ．１９９０年，１〜２頁；方法４６−０８で開示されるようにして判定した。
【０１２０】
［（Ｂ）タンパク質変性］
［実施例３：タンパク質分解酵素による、アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性（ＲＥＰ ３−１〜３−８）］
［ＲＥＰ ３−１〜ＲＥＰ ３−５の調製の詳細な説明］
アルカリ抽出したイネ胚乳タンパク質単離物ＲＥＰ １−１に、タンパク質分解酵素処理を施した。タンパク質を脱イオン水と混合して（１：１２．５、ｗ／ｖ）均質化し、各酵素の最適ｐＨに調節して５０℃で１０分間撹拌した。各酵素に最適化条件下で、分散体を食品等級タンパク質分解酵素で処理した。各酵素に最適化条件を表２に示す。商業食品等級のタンパク質分解酵素（ブロメライン（ＲＥＰ ３−１）、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ（ＲＥＰ ３−２）、ペプシン（ＲＥＰ ３−３）、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（ＲＥＰ ３−４）、およびリキパノール（ＲＥＰ ３−５））を使用して、溶解および機能特性を改善した。得られた加水分解産物の加水分解度をＯＰＡ法（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１年，６６（５），６４２〜６４６頁）によって最適化し、機能特性を最大化した。各酵素の特異的不活性化条件によって、要求されるＤＨで酵素的反応を終了させた。加水分解生成物を噴霧乾燥し５℃で保存した。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
図４は加水分解時間の関数として、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質の加水分解プロフィールを示す。
【０１２３】
図７は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される米タンパク質、およびペプシン、リキパノール、およびアルカラーゼでの処理によって生成する加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
レーン１−標準マーカー、
レーン２−米タンパク質（対照）、
レーン３−ペプシン２．２％ＤＨ、
レーン４−ペプシン６．５％ＤＨ、
レーン５−リキパノール３．９％ＤＨ、
レーン６−リキパノール１０．５％ＤＨ、
レーン７−アルカラーゼ７．７％ＤＨ、
レーン８−アルカラーゼ１４．７％ＤＨ。
【０１２４】
図８は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される、アルカラーゼ処理米タンパク質加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
レーン１−標準マーカー、
レーン２−米タンパク質（対照）、
レーン３−アルカラーゼ５．２％ＤＨ、
レーン４−アルカラーゼ７．７％、
レーン５−アルカラーゼ１１．２％、
レーン６−アルカラーゼ１３．５％、
レーン７−アルカラーゼ１４．７％ＤＨ。
【０１２５】
［ＲＥＰ ３−６、３−７、および３−８の調製の詳細な説明］
実施例ＲＥＰ ３−１、ＲＥＰ ３−２、ＲＥＰ ３−３、ＲＥＰ ３−４、およびＲＥＰ ３−５のようにＲＥＰ １−１を使用する代わりに、ＲＥＰ ３−６、ＲＥＰ ３−７、およびＲＥＰ ３−８の調製ではＲＥＰ １−２を使用した。
【０１２６】
［ＲＥＰ ３−６］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより３．５分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ５．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−６）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２７】
［ＲＥＰ ３−７］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより７．５分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ５．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−７）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２８】
［ＲＥＰ ３−８］
アルカリ抽出した米タンパク質単離物ＲＥＰ １−２をＤＩ水（８％ｗ／ｖ）によって均質化し、ｐＨ８．０に調節した。タンパク質溶液を５０℃で１％アルカラーゼにより１１分間処理した。酵素を７０℃においてｐＨ６．０で１５分間不活性化した。タンパク質加水分解物（ＲＥＰ ３−８）を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１２９】
［実施例４：２つのタイプタンパク質分解酵素（ＲＥＰ４）によるアルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性］
アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ １）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で１５分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して５０℃で１５分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させ、変性イネ胚乳タンパク質を噴霧乾燥して５℃で保存した。
【０１３０】
［実施例５：タンパク質分解酵素によるアルカリ抽出イネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質の限外濾過とダイアフィルトレーション（ＲＥＰ５）］
アルカリ抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ １）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理による長時間加水分解を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して、５０℃で６０分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させた。このようにして変性されたイネ胚乳タンパク質をワットマン５号濾紙で濾過した。米国のＫｏｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓからの容量２〜１０ＬのＲｏｍｉｃｏｎ限外濾過システムに装着された、ＭＷＣＯが５０ｋＤａの中空繊維ポリスルホン膜カートリッジを使用して、濾液に限外濾過を施した。溶液を１０倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過直後に、残留物を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションした。得られた残留物を噴霧乾燥した。
【０１３１】
［実施例６：非タンパク質部分の酵素的分解によるイネ胚乳タンパク質の単離、タンパク質分解酵素での処理による前記イネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質限外濾過とダイアフィルトレーション（ＲＥＰ ６−１〜ＲＥＰ ６−５）］
［ＲＥＰ ６−１］
実施例２で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物（ＲＥＰ ２−１）に、セリンおよびシステインタンパク質分解酵素の併用処理による長時間加水分解を施した。タンパク質を脱イオン水（１：１２．５、ｗ／ｖ）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して６０℃で１０分間撹拌した。分散体を食品等級アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）２．４Ｌ（０．５％）で処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。次にリキパノール（０．５％）を反応混合物に添加して、５０℃で９０分間インキュベートした。酵素反応を８０℃、１０分間で終了させた。加水分解物（ｈｙｄｒｏｌｙａｔｅ）を低速で（１０００ｇで１０分間）遠心分離して、不溶性タンパク質および不純物を分離した。変性イネ胚乳タンパク質の可溶性部分を、ワットマン４号濾紙を通して濾過し、５０ｋＤａのＭＷＣＯで限外濾過を施した。溶液を１０倍の濃縮率に限外濾過した。限外濾過直後に、保持物（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を２倍の体積の脱イオン水で２回ダイアフィルトレーションした。酵素的加水分解、遠心分離、および限外濾過処理において、タンパク質を可溶性に保つために（変性）イネ胚乳タンパク質のｐＨを８．０に維持した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅｓ）を噴霧乾燥した（ＲＥＰ ６−１）。
【０１３２】
［ＲＥＰ ６−２調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で８分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−２）。
【０１３３】
［ＲＥＰ ６−３調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で１２分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−３）。
【０１３４】
［ＲＥＰ ６−４調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合し、メタ重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔａｂｉｓｕｆｉｔｅ）（２０ｍｇ／ｇタンパク質）を添加して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で８分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−４）。
【０１３５】
［ＲＥＰ ６−５調製の詳細な説明］
実施例２（ＲＥＰ ２−２）で得られた酵素抽出イネ胚乳タンパク質単離物に、アルカラーゼ処理を施した。タンパク質単離物をＤＩ水（４％）と混合し、メタ重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔａｂｉｓｕｆｉｔｅ）（１０ｍｇ／ｇタンパク質）を添加して均質化し、ｐＨ９．０に調節して５０℃で１０分間撹拌した。分散体をアルカラーゼ２．４Ｌ（１％）で処理し、混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素反応をｐＨ５．０において７０℃、１５分間で終了させた。加水分解産物を低速（１０００ｒｐｍ、１分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質および不純物を除去した。加水分解産物の可溶性部分に１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜で限外濾過を施した。溶液を５倍の濃縮率で限外濾過した。得られた保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（≧１０ｋＤａ）を噴霧乾燥して５℃で保存した（ＲＥＰ ６−５）。
【０１３６】
［（Ｃ）ペプシン補助米タンパク質抽出とそれに続く限外濾過］
［実施例７：酸性タンパク質分解酵素によるイネ胚乳タンパク質の変性、および引き続く前記変性イネ胚乳タンパク質（ＲＥＰ７）の限外濾過］
ブレンダー内で５００グラムの米粉を３Ｌ脱イオン水（１：６、ｗ／ｖ）によって室温で５分間均質化した。３Ｎ ＨＣｌを使用して、スラリーをｐＨ２．４に調節し、懸濁液を３７℃で３０分間撹拌した。スラリーを０．４４％ペプシンで処理し、３７℃で１３０分間インキュベートした。溶液中の可溶化した変性イネ胚乳タンパク質を遠心分離（５，０００ｇ、２０分間）によって分離した。残留米粉を５００ｍｌ脱イオン水と混合して、可溶性部分を遠心分離によって分離して、残留物からより多くを抽出した。実施例５で記載されるようなＭＷＣＯが５０ｋＤａの膜を使用して、１回目および２回目の抽出の合わせた上清中のタンパク質に限外濾過を施した。ＵＦおよびＤＦの併用は、小型タンパク質断片およびその他の不純物を効果的に排除した。
【０１３７】
［（Ｄ）分析法］
［実施例８：エマルジョン能力の判定］
グボゴウリ（Ｇｂｏｇｏｕｒｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４年、６９巻、８号、６１５頁の方法に従って、油滴定に基づいて（変性）イネ胚乳タンパク質のエマルジョン能力を判定した。（変性）イネ胚乳タンパク質の分散体（０．１％ｗ／ｗ、５０ｍＬ、ｐＨ７．０）を脱イオン水によって調製した。米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、設定１でタンパク質溶液を均質化した。蠕動ポンプを使用して、約１７ｇ／分の流速でトウモロコシ油をタンパク質溶液に添加した。導電率計によって、エマルジョンの電導率を連続的に記録し、エマルジョンの転移点判定のためのパラメータとして使用した。転移点までに添加された油の量を使用して、乳化能力を計算した。乳化能力は、乳化油からブランクを差し引いたもののサンプル中タンパク質量に対する比率として表現される。ブランクは、５０ｍＬの脱イオン水中で相転換前に添加された油の量であった。
【０１３８】
あるいは、ビュイルマー（Ｖｕｉｌｌｅｍａｒｄ）らの方法に従って、油滴定に基づいてタンパク質加水分解産物ＲＥＰ ３−６、３−７、３−８、６−２、６−３、６−４、６−５）のエマルジョン能力を判定した。タンパク質分散体（０．５％ｗ／ｗ、４０ｍＬ、ｐＨ７．０）は、蒸留水中で調製された。
【０１３９】
米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からのホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、設定６で、タンパク質溶液を均質化した。ポンプを使用してタンパク質溶液にトウモロコシ油を約１２ｇ／分の流速で添加した。エマルジョンの導電率を導電率計によって連続的に記録し、エマルジョンの転移点判定のパラメータとして使用した。転移点になるまでに添加した油の量を使用して乳化能力を計算した。乳化能力は、サンプル中の乳化油からブランクを差し引いたものと、タンパク質量との比率として表わされた。ブランクは４０ｍＬ蒸留水中で相転換前に添加された油量であった。
【０１４０】
［実施例９：エマルジョン活性の判定］
ピアスおよびキンゼラ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄｓ Ｃｈｅｍ．１９７８年，２６：７１６〜７２２頁の比濁法によって、エマルジョンを活性を判定した。米国ニューヨーク州ガーディナーのＴｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏ．からの超音波処理器（Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ Ｔｅｍｐｅｓｔ）内において、ｐＨ ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中の０．１％（変性）イネ胚乳タンパク質溶液６ｍＬと、トウモロコシ油２ｍＬとの混合物を設定６で１分間均質化した。均質化の０および１０分後に、５０μＬの混合物を５ｍＬの０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）水溶液中に移した。日本国京都市（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の島津製作所（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）からの分光計（モデル（Ｍｏｄｅｌ）ＵＶ−１６０１）によって、５００ｎｍにおける溶液の吸光度を判定した。均質化０分後の吸光度が、（変性）イネ胚乳タンパク質のエマルジョン活性である。
【０１４１】
図９は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノール、およびペプシンで処理された米タンパク質加水分解産物の乳化特性を加水分解度の関数として示す。
【０１４２】
［実施例１０：加水分解度の判定］
ニールセンらの方法（ニールセン，Ｐ．Ｍ．，ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ），Ｄ．およびダンブマン（Ｄａｍｂｍａｎｎ），Ｃ，２００１年．「食物タンパク質加水分解度を判定するための改善された方法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６（５），６４２〜６４６頁）によってＤＨを判定した。次のようにしてｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）試薬を調製した。７．６２０ｇの四ホウ酸二ナトリウム十水和物（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）および２００ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１５０ｍＬの脱イオン水に溶解し、次に１６０ｍｇのＯＰＡ（４ｍＬのエタノールに事前溶解された９７％ＯＰＡ）および１７６ｍｇの９９％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混合した。脱イオン水で最終溶液を２００ｍＬにした。凍結乾燥されたタンパク質サンプル０．１ｇを１０ｍＬの脱イオン水に可溶化した。吸光度を測定するために、３ｍＬのＯＰＡ試薬を１０ｍＬ試験管に入れ、次に４００μＬのサンプル溶液、セリン標準（１０ｍｇ／１００ｍＬ）、および脱イオン水を４本の試験管の各サンプル、標準、およびブランクにそれぞれ添加した。この後、５秒間混合し、正確に２分間保持した。日本国京都市の島津製作所からの分光光度計（モデルＵＶ−１６０１）によって、３４０ｎｍで吸光度を読み取った。ＤＨを次のようにして計算した。
【０１４３】
ＤＨ＝ｈ／ｈｔｏｔａｌ＊１００％
式中、ｈは加水分解された結合数であり、ｈｔｏｔａｌは、タンパク質当量あたりのペプチド結合の総数である。
ｈ＝（セリン−ＮＨ２−β）／α ｅｑｕｉｖ／ｇタンパク質
式中、ｈは加水分解された結合数であり、ｈｔｏｔａｌは、タンパク質当量あたりのペプチド結合の総数であり、穀物タンパク質ではαは１．００、βは０．４０、および、ｈｔｏｔａｌは８．０である。
【０１４４】
セリン−ＮＨ２＝［（Ａ３４０ｓａｍｐｌｅ−Ａ３４０ｂｌａｎｋ）／（Ａ３４０ｓｔａｎｄａｒｄ−Ａ３４０ｂｌａｎｋ）］＊０．９５１６ｍｅｑｖ／Ｌ＊０．０１＊１００／（Ｘ＊Ｐ）
式中、セリン−ＮＨ２＝ｍｅｑｖセリンＮＨ２／ｇタンパク質；Ｘ＝ｇサンプル；Ｐ＝サンプル中の％タンパク質；０．０１は１Ｌ中のサンプル体積である。
【０１４５】
［実施例１１：タンパク質および総溶解度の判定］
タンパク質溶解度は、いくつかの修正を加えて、ベラ，Ｍ．Ｂ．；ムーカジ（ベラ，Ｍ．Ｂ．；ムーカジ，Ｒ．Ｋ．、１９８９年．「米糠タンパク質濃縮物の溶解性、乳化、および起泡特性」．Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ ５４（１）：１４２〜１４５頁）の方法によって判定した。２００ｍｇのタンパク質サンプルを１０ｍＬの脱イオン水中に分散し、１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調節した。分散体を連続的に３０分間撹拌し、米国カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）のＢｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎからの（モデルＪ２−２１）によって５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、上清中のタンパク質含量を自動ケルダール法（ＡＡＣＣ １９９０）によって判定した。タンパク質溶解度の百分率を次の式によって計算した。
【数１】
【０１４６】
タンパク質溶解度は、上清中のタンパク質と最初のサンプル中の総タンパク質との％比率として計算した。
【０１４７】
総溶解度はオーブン乾燥法によって判定し、上清中の総可溶性部分と、タンパク質単離物総重量との％比率として表した。
【数２】
【０１４８】
図６は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の溶解度を加水分解度の関数として示す。
【０１４９】
［実施例１２：分子量の判定］
ラエムリ，Ｕ．Ｋ．、「バクテリオファージＴ４の頭部のアセンブリー中の構造タンパク質の切断」．Ｎａｔｕｒｅ １９７０年，２２７，６８０〜６８６頁に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の近似分子量を判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳ−トリス−グリシン不連続の緩衝液システム中のスラブゲル（４％濃縮用ゲル、１２％分離用ゲル）上で実施した。非還元サンプル緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、および０．０５％ブロモフェノールブルー）中で、タンパク質溶液（６〜１０μｇタンパク質／μＬ）を調製した。１２μＬの溶液をゲルに充填した。電気泳動法を２００Ｖの定電圧で約４０分間実施した。ゲルを酢酸／エタノール／水溶液（１０：４０：５０、ｖ：ｖ：ｖ）中の０．１％クーマシーブリリアントブルーによって染色し、クーマシーブリリアントブルーなしの同一溶剤で脱染した。６．５〜２００ｋＤａの範囲にわたるバイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）広域分子量標準によって近似分子量を判定した。米国カリフォルニア州（ＣＡ，ＵＳＡ）のＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃからの画像分析ソフトウェア、ｗｉｎｄｏｗｓ、ＭａｃおよびＤｏｓを使用して、バンドの分子量と密度を判定した。
【０１５０】
［実施例１３：表面疎水性の判定］
ハヤカワ，Ｓ．；ナカイ、「ミルクおよび大豆タンパク質の溶解性に対する疎水性および実効電荷の関係」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．１９８５年，５０，４８６〜４９１頁によって概説される方法からの１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）の疎水性蛍光プローブによって、タンパク質単離物の表面疎水性を判定した。濃度範囲０．００８〜０．０２５％ｗ／ｖの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で４ｍＬのタンパク質溶液を作製した。１０μＬの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の８ｍＭ ＡＮＳを各タンパク質溶液に添加して、日本国京都市の島津製作所からの蛍光分光光度計（モデルＲＦ−１５０１）により、３９０ｎｍの励起および４７０ｎｍの発光で、これらの溶液の蛍光強度を測定した。蛍光強度対タンパク質濃度の傾斜として表わされる表面疎水性は、直線回帰によって計算された。
【０１５１】
図５は、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の表面疎水性を加水分解度の関数として示す。
【０１５２】
［実施例１４：粘度の判定］
室温（２６℃）で、ＭＶＤＩＮ測定紡錘体（半径＝１９．３６ｍｍ、高さ＝５８．０８ｍｍ）を装着した、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨａａｋｅからの回転レオメータ（ＶＴ５５０）によって、タンパク質単離物の粘度を判定した。タンパク質単離物を脱イオン水と混合して１０％スラリーを形成し、分析前にスラリーを６０分間平衡状態に保った。サンプル（３０ｍｌ）を円柱状カップ（半径＝２１．０ｍｍ）に充填して、コンピューター制御プログラムを使用して、３分間かけて０から４００１／秒に変化する剪断速度をかけた。データを独国のＨａａｋｅ Ｍｅｓｓ ＴｅｃｈからのＲｈｅｏｗｉｎ Ｐｒｏデータ・マネージャ、バージョン２．８４によって分析した。
【０１５３】
［実施例１５：熱特性の判定］
米国コネチカット州ノーウォークのパーキン−エルマー・コーポレーション（Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．））からの熱分析ソフトウェア（バージョン４．００、Ｐｙｒｉｓ−１−ＤＳＣ）を装着した米国コネチカット州ノーウォークのパーキン−エルマー・コーポレーションからの示差走査熱量計（モデルＰｙｒｉｓ−１）を使用して、熱特性を判定した。２００ｍｇのタンパク質を適切な量の水に分散して、タンパク質含量２０％のスラリーを形成した。スラリーをよく混ぜて、分析前に６０分間平衡状態に保った。スラリー（約５０μＬ）をステンレス鋼パン（大容積カプセル）に正確に量り入れて密封し、１０℃／分の速度で２５から１４０℃への温度上昇中にスキャンした。空のパンを基準として使用した。データ処理ソフトウェアを使用して、温度記録からピーク温度およびエンタルピーを計算した。
【０１５４】
実施例９の手順を使用して、ＰｅａｒｃｅおよびＫｉｎｓｅｌｌａの比濁法によって、乳化活性および安定性を判定した。０時間における吸光度はイネ胚乳タンパク質の乳化活性として表わされ、エマルジョン安定性（ＥＳ）は次のようにして計算される。
エマルジョン安定性＝Ｔ０×Δｔ／ΔＴ
式中、ΔＴは、Δｔ（１０分間）の時間間隔中の初期吸光度（Ｔ０）の濁度（吸光度）の低下である。
【０１５５】
全ての実験は、三回行った。ノースカロライナ州ケアリーのＳＡＳインスティチュート・インコーポレーテッド（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ．））からのＪＭＰ５．１ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ）ＳＡＳ，２００２，ＪＭＰ（登録商標）ユーザー・ガイド、バージョン５によって、分散および平均値多重比較についてデータを分析した。５％の有意水準（Ｐ＜０．０５）で、チューキーＨＳＤ手順によって平均間の有意差を判定した。
【０１５６】
［（Ｅ）結果］
次の表３ａには、実施例９および８でそれぞれ記載されるような方法によって測定される、実施例１〜７に従って得られた（変性）イネ胚乳タンパク質（ＲＥＰ １−１〜ＲＥＰ７）のエマルジョン活性および能力が示される。
【０１５７】
ＲＥＰ ３については、毎回、ブロメライン、Ｐｒｏｔｅｘ ６Ｌ、ペプシン、アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）（登録商標）またはリキパノール（登録商標）の別の酵素によって実施例を８回実施したために８つの値が示され（ＲＥＰ ３−１〜ＲＥＰ ３−８を参照されたい）、ＲＥＰ ６については、毎回、実施例６で詳細に記載されるような異なる処理条件を適用して実施例を５回実施したために５つの値が示される（ＲＥＰ ６−１〜ＲＥＰ ６−５を参照されたい）。
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
続く表３ｂおよび３ｃには、実施例１０および１１でそれぞれ記載されるような方法によって測定される、実施例３および６に従って得られたＲＥＰ ３および６の変性イネ胚乳タンパク質のタンパク質溶解度および総溶解度および加水分解度が示される。
【０１６０】
【表５】
【０１６１】
【表６】
【０１６２】
化学的および酵素的抽出手順の概要を図１および２にそれぞれ提示する。アルカリ−および塩−方法は、それぞれ６７．９および６０．３％の収率で、米粉中の総タンパク質の内、タンパク質含量８７．２および８９．４％のタンパク質単離物を抽出した。
【０１６３】
アルカリおよび塩方法では、ｐＨがタンパク質抽出に強い影響を有した。ｐＨと抽出性の正の相関はｐＨ１２まで見られた。しかし高いｐＨは、望ましくないタンパク質変性をもたらし、タンパク質と共沈殿する非タンパク質構成要素の抽出を増大して、単離物の質を低下させ得る。しかしｐＨ１０以下は、米タンパク質抽出では質の劣る溶剤である。したがって、タンパク質収率に関してはｐＨ１１が最適抽出ｐＨと判断された。タンパク質の乳化特性などのタンパク質の機能性については、より低いｐＨ（好ましくはｐＨ８〜１０）が興味の対象となり得る。さらに３分間の均質化または超音波の前処理と組み合わさったｐＨ１１でのタンパク質抽出は、タンパク質の抽出性を改善した。これらの前処理は、疎水性的に相互作用するタンパク質−タンパク質またはタンパク質−多糖類相互作用を引き離し、タンパク質抽出を容易にした可能性がある。
【０１６４】
酵素抽出では、熱安定性αアミラーゼであるターマミルと、それに続くセルラーゼ処理が８９．２％の収率で８５．８％のタンパク質含量を単離した。酵素ターマミルは９０℃で最適活性を有する。ターマミル処理中の９０℃での高度なタンパク質変性を避けるために、７０℃で最適活性を有する別の非熱安定性アミラーゼ（アミラーゼＳ）に手順を応用した。セルラーゼ処理と組み合わさったアミラーゼＳは、下の表に示すように９０．５％の収率で８１．７％のタンパク質を単離した。
【０１６５】
【表７】
【０１６６】
米タンパク質の組成物であるアルブミン、グロブリン、グルテリン、およびプロラミンが表４に提示される。米粉は７．８％のタンパク質を含有し、総タンパク質の４．１％はアルブミン、１１．８％はグロブリン、７７．４％はグルテリン、および２．１％はプロラミンであった。アルカリおよび塩抽出は、グロブリン以外は同様のタンパク質プロフィールを有した。塩抽出タンパク質は、アルカリ抽出タンパク質（３．１％）よりも高いグロブリン（６．２％）を含有した。米中の主要タンパク質はグルテリンであるので、アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質（８０．２％）よりも高い、それぞれ８７．９および８６．７％のグルテリンを含有した。対照的に、プロラミン含量はアルカリ性−（０．５％）および塩−（０．７％）抽出よりも酵素抽出でより高い（２．８％）。
【０１６７】
【表８】
【０１６８】
４つのタンパク質単離物の組成を表６に示す。ＲＰＡおよびＲＰＳの双方は同様の組成を有し、そのどちらも酵素抽出したタンパク質、ＲＰＥＴ（８４．８％）、およびＲＰＥＡ（８１．７％）より高いタンパク質含量、８７．２および８９．４％をそれぞれ有した。デンプン、脂質、繊維、灰分をはじめとする非タンパク質構成要素は、酵素−抽出タンパク質よりもアルカリ−および塩−抽出タンパク質のどちらよりも低い。
【０１６９】
【表９】
【０１７０】
米タンパク質の電気泳動法プロフィールを図３に示す。米タンパク質の分子サイズプロフィールはＳＤＳＰＡＧＥゲル電気泳動法によって判定された。
レーン１−標準標識（６．５〜２００ｋＤａ）、
レーン２−ＲＰＡ、
レーン３−ＲＰＳ、
レーン４−ＲＰＥＴ
レーン５−ＲＰＥＡ。
【０１７１】
米タンパク質は全部で６つのバンドを有し、分子サイズは７〜９７ｋＤａの範囲であった。主要バンドは９７ｋＤａ（２％）、４５ｋＤａ（３％）、３３ｋＤａ（７２％）、２１ｋＤａ（７％）、１４ｋＤａ（６％）、および７ｋＤａ（８％）で観察された。ほとんどの主要バンドは、７２％の密度で３３ｋＤａの分子サイズにおいて観察された（図３、レーン１および２）。これは主要な米タンパク質のグルテリンである。
【０１７２】
米タンパク質単離物の熱変性温度および変性のエンタルピー値を表７に提示する。
【０１７３】
【表１０】
【０１７４】
ＲＰＡ、ＲＰＳ、ＲＰＥＴ、およびＲＰＥＡの変性温度は、それぞれ８１．４、７８．９、７９．９、および７８．８℃であった。ＲＰＡ（１．８２Ｊ／ｇ）、ＲＰＳ（１．１０Ｊ／ｇ）、ＲＰＥＴ（検出不能）、およびＲＰＥＡ（０．１８Ｊ／ｇ）のエンタルピー値は有意に異なり、抽出方法が抽出条件次第で、異なる度合いにタンパク質を変性させたことが示唆された。エンタルピー変化は、タンパク質変性の程度を予測するのに使用し得る。ビリアデリス，Ｃ．Ｇ．、「食品研究における示差走査熱量測定：レビュー」．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９８３年，１０，２３９〜２６５頁。タンパク質が部分的に変性するとエンタルピー変化は減少し、タンパク質が完全に変性するとエンタルピー変化はゼロである。ユー，Ｚ．Ｙ．；ヘティアラキ，Ｎ．Ｓ．；ラス，Ｎ．、「米粉タンパク質の抽出、変性、および疎水性」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００１年，６６（２），２２９〜２３２頁は、アルブミン、グロブリン、およびグルテリンについて、それぞれ２．８８、３．１４、および３．７９Ｊ／ｇのエンタルピー値を報告した。本発明者らの研究ではアルカリ抽出タンパク質（ＲＰＡ）が最も高いエンタルピー値（１．８２Ｊ／ｇ）を有し、それはユーらのアルブミン（２．８８Ｊ／ｇ）、グロブリン（３．１４Ｊ／ｇ）、およびグルテリン（３．７９Ｊ／ｇ）の値よりも顕著に低かった。アルカリおよび塩抽出中に施された物理的処理が、タンパク質をある程度変性させた可能性がある。酵素−抽出タンパク質の内、ＲＰＥＴ（ターマミル、９０℃）はいかなる検出可能なエンタルピー変化も示さず、完全なタンパク質変性が示唆された。
【０１７５】
［表面疎水性および溶解度］
米タンパク質単離物の表面疎水性、溶解度、および粘度を表８に提示する。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
米タンパク質単離物の疎水性は、５４４〜９３１の範囲にわたる。抽出方法は、これらのタンパク質の疎水性の差に寄与する。酵素−抽出タンパク質の疎水性ＲＰＥＴ（９３１．３）およびＲＰＥＡ（７９１．６）は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質（それぞれ５６３．８および５４４．２）よりも高かった。これは表面疎水性を増大させるタンパク質の変性に起因し得る。酵素−抽出タンパク質の熱誘発性アンフォールディングは、表面疎水性を増大させる。
【０１７８】
米タンパク質単離物の溶解度は、４〜１０の広いｐＨ範囲で低い（データ示さず）。アミノ酸組成物および疎水性相互作用が溶解度を決定する。テクソンら（８）による米グルテリンの細分画研究は、米グルテリンの高分子質量が、過剰な分子内および分子間ジスルフィドおよび疎水性相互作用を有して溶解度を低下させたことを示した。ウェンおよびリュース（９）もまた、米グルテリン中の最も豊富なアミノ酸がグルタミン酸／グルタミン、アスパラギン酸／アスパラギン、アルギニン、グリシン、およびアラニンであると報告した。グルタミンおよびアスパラギン側鎖中のアミド基はグルテリンの凝集を促進し、米タンパク質の溶解度を低下させた。比較すると酵素−抽出タンパク質は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質よりも低い溶解度を有し、これは抽出中の高レベル変性、高表面疎水性、および水溶性タンパク質（アルブミン）損失に起因し得る。
【０１７９】
米タンパク質単離物の乳化および発泡特性を表９に提示する。
【０１８０】
【表１２】
【０１８１】
アルカリ−および塩−抽出タンパク質の乳化および発泡特性は、酵素−抽出タンパク質よりも高かった。アルカリ−および塩−抽出タンパク質の乳化活性はそれぞれ０．２２４および０．２１６で、安定性はそれぞれ１９．６および１７．１分間であり、それは酵素−抽出タンパク質よりも有意に高かった。発泡能力および安定性でも同様の結果パターンが観察された。乳化および発泡特性を有するためには、タンパク質は水相中に可溶化して迅速にアンフォールドし、境界面に凝集性層を形成しなくてはならない。エマルジョンおよび発泡を安定化するためのタンパク質の分子および物理的要件は類似している（ダモダーン，Ｓ．、「タンパク質安定化気泡およびエマルジョン」．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２０５年，７０（３），５４〜６６頁。
【０１８２】
異なる抽出方法によって得られた機能特性の相違の可能な理由は、タンパク質単離物のタンパク質純度、組成、表面疎水性、および溶解度に起因し得る。しかし出願人がこれらの理論によって拘束されることは意図されない。
【０１８３】
第１に、２つの酵素−抽出タンパク質の熱特性は、ＲＰＡおよびＲＰＳよりも高度な変性を示した。過剰な変性は、タンパク質凝集の促進、またはより多数の疎水性アミノ酸の露出のどちらかにより、乳化および発泡特性にとって有害であり得る。表面疎水性データは、酵素−抽出タンパク質の疎水性の増大を証明した。過剰な表面疎水性は、広範な疎水結合の形成を容易にし、タンパク質の溶解度および可撓性を低下させることにより、タンパク質の乳化または発泡特性にとって好ましくないことがある。
【０１８４】
第２に、高い温度またはｐＨなどの極端な抽出条件が、ジスルフィド架橋の形成を促進した可能性がある。米グルテンが過剰な結合を有することが報告されている。抽出タンパク質の極めて低い溶解度は、抽出中の熱−またはｐＨ−誘発性タンパク質アンフォールディングが、タンパク質内部のチオール基を露出させた可能性があることを示唆した。これらの露出したチオール基は、隣接するタンパク質分子とジスルフィド結合を容易に形成できる。新たに形成したジスルフィド結合が、タンパク質の分子可撓性、溶解度、および表面活性を低下させた可能性がある。タンパク質の特定セグメントの可撓性は、タンパク質の乳化および発泡特性を決定する主要特性の１つである。
【０１８５】
第３に、米タンパク質単離物の組成は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質単離物が、酵素−抽出タンパク質よりも多くのタンパク質および少ない非タンパク質を含有したことを示した。酵素抽出タンパク質単離物ＲＰＥＴおよびＲＰＥＡ中の顕著な量の繊維、灰分、脂質、および残留デンプンは、それらの乳化および発泡特性を低下させた可能性がある。これらの非タンパク質構成要素はタンパク質と相互作用してタンパク質の正味電荷および疎水性を変化させ、タンパク質の機能性に影響し得る。
【０１８６】
最後に、酵素抽出タンパク質のより低い溶解度は、乳化および発泡特性に悪影響を及ぼした。エマルジョンおよび発泡特性を有するためには、タンパク質は可溶化してアンフォールドし、境界面に凝集性層を形成しなくてはならない。これにはタンパク質溶解性および可撓性が必要とされる。これらの特性を欠いた酵素−抽出タンパク質は、アルカリ−および塩−抽出タンパク質よりも乳化および発泡特性が低下する。
【０１８７】
これらの研究から、アルカリおよび塩方法はそれぞれ６７．９および６０．３％の収率で、８７．２および８９．４％のタンパク質を抽出したことが分かった。酵素的方法は、ターマミルおよびアミラーゼＳはそれぞれ、８９．２および９０．５％の収率で、８４．８および８１．８％のタンパク質を抽出した。アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質よりも高いタンパク質含量と、デンプン、脂質、繊維、および灰分をはじめとするより低い非タンパク質構成要素とを有した。比較すると、アルカリ−および塩−抽出したタンパク質のより好ましいタンパク質組成、より低い疎水性、より高い溶解度、およびより低い熱変性度が、酵素−抽出タンパク質よりも高い乳化および発泡特性に寄与した。したがってアルカリおよび塩抽出方法はより穏やかな抽出条件であり、タンパク質はより良い機能特性を保持した。
【０１８８】
米タンパク質は、ヒト消費のために栄養的で低アレルギー性であり、健康的である。認可された食品等級酵素および薬品を使用した効率的な抽出方法は、米タンパク質の商業生産および機能性成分としての応用にとって必須である。イネ胚乳タンパク質をアルカリ、塩、および酵素的方法によって単離し、抽出性および物理化学的特性について評価した。アルカリ（ＲＰＡ）および塩（ＲＰＳ）方法は、それぞれ６７．９および６０．３％の収率で、８７．２および８９．４％のタンパク質を抽出した。ターマミル（ＲＰＥＴ）およびアミラーゼＳ（ＲＰＥＡ）での酵素的方法は、それぞれ８９．２および９０．５％収率で、８４．８および８１．８％のタンパク質を抽出した。示差走査熱量計によって判定されたＲＰＡ（１．８２Ｊ／ｇ）、ＲＰＳ（１．１０Ｊ／ｇ）、ＲＰＥＴ（非検出可能な）、およびＲＰＥＡ（０．１８Ｊ／ｇ）のエンタルピー値は、抽出方法次第で変動するタンパク質変性レベルを実証した。表面疎水性データはこの観察を支持する。アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、酵素−抽出タンパク質よりも高い溶解度および乳化特性を有し、したがって、アルカリ−および塩−抽出タンパク質は、増強された機能性用途、および個別に調整された（ｔａｉｌｏｒｅｄ）米タンパク質単離物を調製するための出発原料としての可能性を有することができる。
【０１８９】
熱安定性α−アミラーゼ、ターマミル（登録商標）で単離されたイネ胚乳タンパク質を中性、酸性、および／またはアルカリ性タンパク質分解酵素で処理した。加水分解産物の加水分解度をＯＰＡ方法によって最適化し、溶解度および乳化特性を最大化した。酵素不活性化後、可溶性画分を遠心分離（１０００ｇで１０分間）によって分離し、特定分子量（５０ｋＤａ）のカットオフ膜を通して可溶性加水分解産物を濾過した。５０ｋＤａを超える、得られた加水分解産物を噴霧乾燥させ、加水分解度、溶解度、エマルジョン能力、活性、および安定性について評価した。
【０１９０】
２つのタイプのタンパク質分解酵素、システイン（リキパノール）およびセリン（アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ））タンパク質分解酵素の併用処理と、それに続く遠心分離および限外濾過は、溶解度および乳化特性を顕著に改善した。得られた加水分解産物は５３．５％の溶解度、５８６．３ｍｌ／ｇのエマルジョン能力、０．６０４の活性、および２４．８分間の安定性を有し、非変性米タンパク質単離物（１１．８％の溶解度、１７７．６ｍｌ／ｇのエマルジョン能力、０．２１４の活性、および１４．７分間の安定性）よりも顕著に高かった。
【０１９１】
アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）およびリキパノールの組み合わせによる酵素的加水分解と、それに続く限外濾過は、イネ胚乳タンパク質の溶解度および乳化特性を改善した。高純度の一様な分子画分がある限外濾過されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物は、その溶解度および乳化特性を増強した。
【０１９２】
［実施例１２：β−カロテン調合物の製造］
イネ胚乳タンパク質およびβ−カロテンを含んでなる調合物は、次のようにして調製してもよい。
【０１９３】
［ａ）（油−ベースの）溶液１の調製：］
７．７ｇのトウモロコシ油および１．４ｇのｄｌ−α−トコフェロールを混合した。１６．１ｇの結晶性β−カロテンを１８０ｍｌのクロロホルム（トリクロロメタン）中に分散し、得られた分散体をトウモロコシ油とトコフェロールの混合物に添加した。混合物を穏やかに撹拌し、同時に約６０℃に加熱して溶液が得られた。
【０１９４】
［ｂ）（水性）溶液２の調製：］
実施例１に従った３５ｇのＲＥＰ １（ＲＥＰ １−１）を６０℃で撹拌して２５０ｍｌの水に再溶解した。あるいは、実施例１に従って新鮮に調製したＲＥＰ １−１を使用することもでき、すなわち凍結乾燥および保存のステップを実施せず、得られたＲＥＰ １−１溶液それ自体を使用して温度を６０℃にできる。さらに２．１ｇのパルミチン酸アスコルビルおよび４２．７ｇのスクロースを添加した。８ｍｌの水性１Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨを７．９の値に調節した。水溶液調製のために、ＲＥＰ １−１の代わりにＲＥＰ １−２が適宜使用できる。
【０１９５】
［ｃ）溶液１および２からのエマルジョン調製：］
激しく撹拌しながら、５３℃で溶液１を溶液２に添加し、分散体をさらに３０分間激しく撹拌した。撹拌される分散体を５０〜５５℃に３０分間保った。残留トリクロロメタンを５０〜５５℃で除去した。閉じこめられた気泡を遠心分離によって除去した後、エマルジョンを５０〜５５℃でしばらく穏やかに撹拌し、次に内部相の粒度に関して特性決定した。エマルジョン内部相の平均粒度（ザウター（Ｓａｕｔｅｒ）径、Ｄ［３、２］）は、レーザー回析（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｅｒｓｉｚｅｒ）による測定で３８０ｎｍであった。
【０１９６】
［ｄ）エマルジョンからの固体調合物の調製：］
エマルジョンは、予冷したコーンスターチの流動床中に噴霧してもよい。過剰なコーンスターチはふるいによって除去でき、得られた粉末は室温において気流中で乾燥できる。０．１６〜０．５０ｍｍの範囲内の粉末粒子画分は、ふるいによって収集でき、カロテノイド含量、水性分散体中の色強度および色調、コーンスターチ含量、および残留湿度について特性決定される。
【０１９７】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】化学的および酵素的方法の手順の例としての米タンパク質単離物調製品ＲＰＡである。
【図２】９０℃でのターマミル（登録商標）処理とそれに続くセルラーゼ処理による米タンパク質単離物調製品（ＲＰＥＴ）である。
【図３】米タンパク質の電気泳動法プロフィールである。
【図４】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質の加水分解プロフィールを加水分解時間の関数として示す。
【図５】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の表面疎水性を加水分解度の関数として示す。
【図６】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノールまたはペプシンで処理されたイネ胚乳タンパク質加水分解産物の溶解度を加水分解度の関数として示す。
【図７】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される米タンパク質、およびペプシン、リキパノール、およびアルカラーゼでの処理によって生成する加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
【図８】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法により判定される、アルカラーゼ処理米タンパク質加水分解産物の分子サイズプロフィールを示す。
【図９】アルカラーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ）、リキパノール、およびペプシンで処理された米タンパク質加水分解産物の乳化特性を加水分解度の関数として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ胚乳タンパク質および活性成分を含んでなる組成物。
【請求項２】
前記イネ胚乳タンパク質が変性イネ胚乳タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性成分が脂溶性活性成分および／または着色剤である、請求項１および／または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記脂溶性活性成分および／または着色剤が、カロテンまたは構造的に関連したポリエン化合物、脂肪可溶性ビタミン、多価不飽和脂肪酸に富んだトリグリセリド、油溶性ＵＶ−Ａフィルター、ＵＶ−Ｂフィルターまたはその混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記カロテンまたは構造的に関連したポリエン化合物が、α−カロテン、β−カロテン、８’−アポ−β−カロテナール、８’−アポ−β−カロテン酸エステル、カンタキサンチン、アスタキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、クロセチン、α−ゼアカロテン、β−ゼアカロテンまたはその混合物などのカロテノイドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カロテノイドがβ−カロテンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂溶性ビタミンがビタミンＡまたはＥである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、グリセロール、トリグリセリド、水溶性抗酸化剤、および脂溶性抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物がさらに存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記単糖類または二糖類が、スクロース、転化糖、キシロース、グルコース、フルクトース、乳糖、マルトース、ショ糖、および糖アルコールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴ糖類または多糖類が、デンプン、デンプン加水分解産物または加工デンプンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記デンプン加水分解産物が、デキストリン、マルトデキストリンまたはグルコースシロップである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記トリグリセリドが植物油または脂肪である、請求項４および／または８に記載の組成物。
【請求項１３】
脂肪酸のモノ−およびジグリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、レシチン、およびモノステアリン酸ソルビタンからなる群から選択される共乳化剤がさらに存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００のエマルジョン能力を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５のエマルジョン活性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物総量を基準にして、前記（変性）イネ胚乳タンパク質の量が約１〜約７０重量％、および／または前記（脂溶性）活性成分および／または着色剤の量が約０．１〜約９０重量％である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
粉末形態の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記イネ胚乳タンパク質が、還元糖、糖タンパク質またはグリコペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と架橋する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｉ）（変性）イネ胚乳タンパク質の水溶液またはコロイド溶液を調製するステップと、
ＩＩ）場合によりステップＩ）で調製された溶液に、少なくとも水溶性賦形剤および／またはアジュバントを添加するステップと、
ＩＩＩ）少なくとも活性成分、好ましくは少なくとも脂溶性活性成分および／または着色剤、および場合により少なくとも脂溶性アジュバントおよび／または賦形剤の溶液または分散体を調製するステップと、
ＩＶ）ステップＩ）〜ＩＩＩ）で調製された溶液を互いに混合するステップと、
Ｖ）このようにして得られた混合物を均質化するステップと、
ＶＩ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するための架橋剤を添加するステップと、
ＶＩａ）場合によりステップＶＩ）を実施した後に得られた混合物に酵素処理または熱処理を施して前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと、
ＶＩＩ）場合によりステップＶ）および／またはＶＩ）で得られた分散体を粉末に加工するステップと、
ＶＩＩＩ）場合によりステップＶＩＩ）で得られた粉末を乾燥するステップと、
ＩＸ）場合により前記（乾燥）粉末に酵素処理または熱処理を施して前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと
を含んでなり、ただしステップＶＩ）が実施される場合、ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）の双方でなく片方のみが実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項２０】
ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）に記載の酵素処理が、架橋酵素、特にトランスグルタミナーゼによる処理である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、請求項１４または１５に記載のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）粉砕米の水溶液または懸濁液を調製して製粉前に米糠を除去し、前記溶液または懸濁液が水溶液または懸濁液総量を基準にして好ましくは０．１〜３０重量％の乾燥質量含量を有するステップと、
ｂ）場合により粉砕米の非タンパク質部分またはタンパク質部分を除去してイネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｃ）場合により粉砕米のタンパク質部分を変性させて変性イネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｄ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を単離するステップと、
ｅ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を固形に加工するステップと
を含んでなり、ただしステップｂ）、ｃ）、およびｄ）の少なくとも１つが実施される、粉砕米から開始して、米糠が製粉前に除去された（変性）イネ胚乳タンパク質を製造する方法。
【請求項２３】
ステップｄ）が遠心分離または濾過、好ましくは限外濾過によって実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記濾過が名目上の分子量カットオフ≧５ｋＤａの膜を使用して実施される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非タンパク質部分の除去（ステップｂ）が、粉砕米を非タンパク質分解酵素で処理して酵素を不活性化し、粉砕米のタンパク質部分から非タンパク質部分を分離および除去することによって行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非タンパク質分解酵素が、デンプン分解酵素、セルロース分解酵素またはそれらの混合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記非タンパク質部分の分離が、遠心分離とそれに続くその洗い落としによって行われる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｃ）が、粉砕米のタンパク質部分をアルカリ性、中性および／または酸性タンパク質分解酵素で処理することによって行われる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記粉砕米のタンパク質部分が、２つの異なるアルカリ性タンパク質分解酵素によって引き続いて処理される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
これらのタンパク質分解酵素の１つがセリン特異的タンパク質分解酵素であり、もう１つがシステイン特異的タンパク質分解酵素である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質部分の除去（ステップｂ）が「粉砕米」溶液または懸濁液のｐＨを７〜１２の値に調節することによって行われる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｅ）が、乾燥によって、好ましくは凍結乾燥または噴霧乾燥によって行われる、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法によって得られる、（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３４】
≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００のエマルジョン能力を有する（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３５】
≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５のエマルジョン活性をさらに有する、請求項３４に記載の（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３６】
食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のための請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３７】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含有する、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の（変性）イネ胚乳タンパク質を含有する、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物。
【請求項３９】
活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための保護親水コロイドとしての好ましくは請求項３３〜３５のいずれか一項に記載されるような（変性）イネ胚乳タンパク質の使用。
【請求項１】
イネ胚乳タンパク質および活性成分を含んでなる組成物。
【請求項２】
前記イネ胚乳タンパク質が変性イネ胚乳タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性成分が脂溶性活性成分および／または着色剤である、請求項１および／または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記脂溶性活性成分および／または着色剤が、カロテンまたは構造的に関連したポリエン化合物、脂肪可溶性ビタミン、多価不飽和脂肪酸に富んだトリグリセリド、油溶性ＵＶ−Ａフィルター、ＵＶ−Ｂフィルターまたはその混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記カロテンまたは構造的に関連したポリエン化合物が、α−カロテン、β−カロテン、８’−アポ−β−カロテナール、８’−アポ−β−カロテン酸エステル、カンタキサンチン、アスタキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、クロセチン、α−ゼアカロテン、β−ゼアカロテンまたはその混合物などのカロテノイドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カロテノイドがβ−カロテンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂溶性ビタミンがビタミンＡまたはＥである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、グリセロール、トリグリセリド、水溶性抗酸化剤、および脂溶性抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物がさらに存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記単糖類または二糖類が、スクロース、転化糖、キシロース、グルコース、フルクトース、乳糖、マルトース、ショ糖、および糖アルコールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴ糖類または多糖類が、デンプン、デンプン加水分解産物または加工デンプンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記デンプン加水分解産物が、デキストリン、マルトデキストリンまたはグルコースシロップである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記トリグリセリドが植物油または脂肪である、請求項４および／または８に記載の組成物。
【請求項１３】
脂肪酸のモノ−およびジグリセリド、脂肪酸のポリグリセロールエステル、レシチン、およびモノステアリン酸ソルビタンからなる群から選択される共乳化剤がさらに存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００のエマルジョン能力を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５のエマルジョン活性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物総量を基準にして、前記（変性）イネ胚乳タンパク質の量が約１〜約７０重量％、および／または前記（脂溶性）活性成分および／または着色剤の量が約０．１〜約９０重量％である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
粉末形態の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記イネ胚乳タンパク質が、還元糖、糖タンパク質またはグリコペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と架橋する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｉ）（変性）イネ胚乳タンパク質の水溶液またはコロイド溶液を調製するステップと、
ＩＩ）場合によりステップＩ）で調製された溶液に、少なくとも水溶性賦形剤および／またはアジュバントを添加するステップと、
ＩＩＩ）少なくとも活性成分、好ましくは少なくとも脂溶性活性成分および／または着色剤、および場合により少なくとも脂溶性アジュバントおよび／または賦形剤の溶液または分散体を調製するステップと、
ＩＶ）ステップＩ）〜ＩＩＩ）で調製された溶液を互いに混合するステップと、
Ｖ）このようにして得られた混合物を均質化するステップと、
ＶＩ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するための架橋剤を添加するステップと、
ＶＩａ）場合によりステップＶＩ）を実施した後に得られた混合物に酵素処理または熱処理を施して前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと、
ＶＩＩ）場合によりステップＶ）および／またはＶＩ）で得られた分散体を粉末に加工するステップと、
ＶＩＩＩ）場合によりステップＶＩＩ）で得られた粉末を乾燥するステップと、
ＩＸ）場合により前記（乾燥）粉末に酵素処理または熱処理を施して前記（変性）イネ胚乳タンパク質を架橋するステップと
を含んでなり、ただしステップＶＩ）が実施される場合、ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）の双方でなく片方のみが実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項２０】
ステップＶＩａ）またはステップＩＸ）に記載の酵素処理が、架橋酵素、特にトランスグルタミナーゼによる処理である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記（変性）イネ胚乳タンパク質が、請求項１４または１５に記載のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）粉砕米の水溶液または懸濁液を調製して製粉前に米糠を除去し、前記溶液または懸濁液が水溶液または懸濁液総量を基準にして好ましくは０．１〜３０重量％の乾燥質量含量を有するステップと、
ｂ）場合により粉砕米の非タンパク質部分またはタンパク質部分を除去してイネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｃ）場合により粉砕米のタンパク質部分を変性させて変性イネ胚乳タンパク質を得るステップであって、米糠が製粉前に除去されるステップと、
ｄ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を単離するステップと、
ｅ）場合により前記（変性）イネ胚乳タンパク質を固形に加工するステップと
を含んでなり、ただしステップｂ）、ｃ）、およびｄ）の少なくとも１つが実施される、粉砕米から開始して、米糠が製粉前に除去された（変性）イネ胚乳タンパク質を製造する方法。
【請求項２３】
ステップｄ）が遠心分離または濾過、好ましくは限外濾過によって実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記濾過が名目上の分子量カットオフ≧５ｋＤａの膜を使用して実施される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非タンパク質部分の除去（ステップｂ）が、粉砕米を非タンパク質分解酵素で処理して酵素を不活性化し、粉砕米のタンパク質部分から非タンパク質部分を分離および除去することによって行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非タンパク質分解酵素が、デンプン分解酵素、セルロース分解酵素またはそれらの混合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記非タンパク質部分の分離が、遠心分離とそれに続くその洗い落としによって行われる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｃ）が、粉砕米のタンパク質部分をアルカリ性、中性および／または酸性タンパク質分解酵素で処理することによって行われる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記粉砕米のタンパク質部分が、２つの異なるアルカリ性タンパク質分解酵素によって引き続いて処理される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
これらのタンパク質分解酵素の１つがセリン特異的タンパク質分解酵素であり、もう１つがシステイン特異的タンパク質分解酵素である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質部分の除去（ステップｂ）が「粉砕米」溶液または懸濁液のｐＨを７〜１２の値に調節することによって行われる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｅ）が、乾燥によって、好ましくは凍結乾燥または噴霧乾燥によって行われる、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法によって得られる、（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３４】
≧２２０、好ましくは≧３５０、より好ましくは≧５００のエマルジョン能力を有する（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３５】
≧０．２、好ましくは≧０．４５、より好ましくは≧０．５のエマルジョン活性をさらに有する、請求項３４に記載の（変性）イネ胚乳タンパク質。
【請求項３６】
食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアまたは医薬組成物の富栄養化、強化および／または着色のための請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３７】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含有する、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケア、および医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の（変性）イネ胚乳タンパク質を含有する、食物、飲料、動物飼料、パーソナルケアおよび医薬組成物。
【請求項３９】
活性成分、特に脂溶性活性成分および／または着色剤のための保護親水コロイドとしての好ましくは請求項３３〜３５のいずれか一項に記載されるような（変性）イネ胚乳タンパク質の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５１９９０６（Ｐ２００９−５１９９０６Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３７４５（Ｐ２００８−５４３７４５）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１８７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５７１８
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１８７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５７１８
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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