眼球瘢痕化を抑制するための形質転換成長因子−β受容体阻害剤の使用
【課題】眼球瘢痕化を抑制するための形質転換成長因子−β受容体阻害剤の使用を提供する。
【解決手段】ＡＬＫ−５阻害剤の有効量を含む、ＧＦＳ後に生じ得る結膜下瘢痕化の予防に有用な医薬組成物。同様に開示されるものは、眼科手術又は外傷後に発現し得る角膜の濁り及びＰＶＲを含む他の眼球瘢痕化又は線維症の障害又は病気の治療方法であって、ＡＬＫ−５阻害剤を含む医薬組成物のある量を術後又は外傷部位へ適用することを含む方法である。
【解決手段】ＡＬＫ−５阻害剤の有効量を含む、ＧＦＳ後に生じ得る結膜下瘢痕化の予防に有用な医薬組成物。同様に開示されるものは、眼科手術又は外傷後に発現し得る角膜の濁り及びＰＶＲを含む他の眼球瘢痕化又は線維症の障害又は病気の治療方法であって、ＡＬＫ−５阻害剤を含む医薬組成物のある量を術後又は外傷部位へ適用することを含む方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年４月１７日に出願された米国仮出願特許第６１／１７０，１４１号への優先権を請求する。
【０００２】
この発明の進展は、米国健康支援財団（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、Ｇ２００６−０１４からの財政的支援により支持されている。政府機関は本発明に興味を持っている。
【背景技術】
【０００３】
背景
眼の線維傷害反応は、特に、緑内障のための外科的治療の結果として、視覚障害及び失明の主な原因である。緑内障は、米国における失明の主な原因であり、２０００年に２５０万人のアメリカ人及び世界中で６５００万人の人が該疾患に罹患した。緑内障は視神経頭への損傷並びに神経障害及び視力障害により特徴付けられる疾患である。緑内障の主な危険因子の一つは、房水流出路における異常の結果として生じる眼圧の上昇（ＩＯＰ）である。緑内障ろ過手術（ＧＦＳ）は通常、薬物治療がＩＯＰを的確に制御することに失敗した場合に行なわれる。
【０００４】
過度の術後瘢痕化が、しばしばＧＦＳの失敗をもたらす。結膜の抗−瘢痕化治療として、ミトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）及び５−フルオロウラシルのような代謝拮抗剤の使用が多くの患者に利益をもたらしているものの、これらは広範な細胞死を引き起こすことによって、その利益をもたらすのであって、低眼圧黄斑症及び感染症のような重度の及び潜在的な失明合併症を伴う。そのため、他の抗−瘢痕化のアプローチが調査されてきている。特に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）及びその経路が、術後の抗−瘢痕化治療のための標的として浮上した。
【発明の概要】
【０００５】
図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ且つ本明細書の一部を構成する、添付の図面は、本発明の観点の種々の実施例態様を説明する種々の実施例系、方法等を説明する。図中で説明される成分枠（例えば、四角形、四角形の群又は他の形状）は、枠の１例を表すものと理解され得る。当業者は、１種の要素は、多重要素として設計され得るか又は多重要素は１種の要素として設計され得ると理解し得る。別の要素の内部構成材として示される要素は、外部構成材として実施され得るが、その逆も同じである。更に、要素は、縮尺通りとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、緑内障ろ過手術の間のヒトの目の側面図である。
【図２】図２は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、６１６４５１の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、６０６４５２の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＤ−２０８の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５２５３３４の効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ウサギの培養結膜線維芽細胞におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の細胞毒性を示すグラフである。
【図８】図８は、被験動物におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、被験動物のＩＯＰにおけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の効果を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、被験動物のＩＯＰにおけるミトマイトシン−ｃ（ｍｉｔｏｍｙｔｏｃｉｎ−ｃ）の効果を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、被験動物のＩＯＰにおける無処理の効果を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、被験動物のＩＯＰにおける乳糖コントロール錠剤の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、被験動物の目におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示す写真である。
【図１１】図１１Ａ−Ｃは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示す写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
ここで開示されるものは、哺乳類におけるＧＦＳ後の眼球瘢痕化の予防及び治療のための方法である。好ましくは、該方法はＧＦＳ中又はその後のヒトの患者を治療するために使用され得る。ＧＦＳおいて、眼からの液体の排水を容易にするために新規なドレナージ部位が創出されると、それにより眼におけるＩＯＰが低下する。図１に示されるように、ヒトの眼は、他の構成要素中に、結膜１２、小柱網１４、虹彩１６、角膜１８、網膜２４及び水晶体２６を含む。
【０００８】
ＧＦＳの間、眼の通常のドレナージ部位（小柱網）１４中への排水の代わりに、房水が眼の結膜１２の下に創出された新規な“空間”中へ排水される。これを行うために、白眼の中に小さなフラップが作成される。その後、通路の開口部２０とろ過胞と呼ばれる貯水部２２の間に新規なドレナージルート２８が創出される。房水と呼ばれる、前房及び後房中の流体は、その後、新規なドレナージルート２８を介して胞２２中へ排水され、眼の周囲の血管中へ吸収される。胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８は、傷跡を残し得、そして、該房水が適度に流れ出るのを防ぐ経路を閉ざしてしまい、それは胞不全と呼ばれる。
【０００９】
ＴＧＦ−βは、創傷治癒反応の主要なメディエーターである。眼において、ＴＧＦ−βは、角膜外傷及びレーザー手術後の角膜の濁り及びＧＦＳ後の結膜下の瘢痕化の誘発に関与してきた。加えて、ＴＧＦ−βの上方調節は、網膜剥離手術の失敗の主原因である、増
殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に関わっている。
【００１０】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を遮断すると認識されてきており、よって、角膜外傷及びＬＡＳＩＫのようなレーザー手術後の角膜の濁り並びにＧＦＳ及び角膜手術及び硝子体網膜手術を含む眼科手術後の瘢痕化を防止するために使用され得る。同様に、ＡＬＫ−５阻害剤の使用は、ＭＭＣのような現在の抗−瘢痕化薬剤により引き起こされる組織傷害と関連する後期発症の術後感染症を含む副作用も減少し得る。他の副作用は、出血、腫脹、瘢痕化、網膜剥離、眼瞼下垂、複視、視力低下又は失明でさえ含み得る。最終的に、ＡＬＫ−５阻害剤のヒトの眼への局所適用は、緑内障と関連するＩＯＰを低下させ得る。
【００１１】
一つの態様において、ＧＦＳ処置又は眼球外傷後の眼球瘢痕化を抑制するための方法は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量で、ＡＬＫ−５の有効量及びそのための医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物並びにその組み合わせを提供することであり、それは手術後又は外傷部位への該組成物の適用は、眼球手術及び／又は眼球外傷に続く瘢痕組織の形成を抑制する。
【００１２】
当業者は、図１で示されるように、ろ過胞２２の形成がＧＦＳ処置にとって重要であることを理解するだろう。もし該胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８が損なわれるか又は閉じられた場合、房水が適度に流れ出るのを妨げ（胞不全）、ろ過手術は失敗し得る。従って、手術処置の間に使用されるＡＬＫ−５阻害剤の量は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量とすべきであり、それにより、胞不全が予防される。用語“約”は、ここで使用されるあらゆる一定数のプラス又はマイナス１０％を意味すると理解されるべきである。好ましくは、組成物は約０．３ないし約３０マイクロモル（μＭ）のＡＬＫ−５阻害剤を、より好ましくは約３ないし約１５μＭの阻害剤を含み得る。更に、当業者は、３０μＭを超えて含む組成物もまた使用され得ることを理解するだろう。
【００１３】
以下に示す化合物の１種以上が瘢痕組織の形成を抑制するためにＧＦＳ処置中に使用され得る。入手可能な所で、製造業者指定のものが提供されてきている。
【化１】
【化２】
【化３】
【００１４】
更なる化合物は、それらの製造業者名により既知であり、阻害剤、ＫＩ２６８９４、ＬＹ２１０９７６１、ＩＮ−１２３３及びＳＫＩ２１２６を含む。上述の化合物のコレクションから、以下に示すものが種々の供給元から得られた：６３１７８−９９１６，ミズーリ州，セントルイス，ピー．オー．ボックス１４５０８のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から入手可能なＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８及びＳＢ−５０５１２４；０８０２７，ニュージャージー州，ギブスタウン，Ｓ．デモクラットロード ４８０のカルビオケム（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）社（ＥＭＤケミカルス，Ｉｎｃ．）から入手可
能な６１６４５２及び６１６４５３；英国，ＴＷ８ ９ＧＳ，ミドレセックス，ブレントフォード，グレートウエストロード ９８０のグラクソスミスクライン（ＣｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社から入手可能なＧＷ７８８３８８及びＧＷ６６０４；４６２８５，インディアナ州，インディアナポリス，リリーリサーチ（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社から入手可能なＬＹ５８０２７６及び、２７７０９−４６２７，ノースカロライナ州，リサーチトライアングルパーク，デイビスドライブ ５０００，ピー．オー．ボックス１４６２７のバイオジェン アイデック（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）社から入手可能なＳＭ１６。
【００１５】
上記組成物は、ＡＬＫ−５阻害剤及びその医薬的に許容可能な塩を含み得、それらは持続放出性ポリマー、投与においてゲル形成が可能なキャリア、ハイドロゲル、クリーム、軟膏、噴霧剤、液剤又は錠剤のような、眼に適用される種々のタイプの医薬的に許容可能なビヒクルと組み合わせ得る。ビヒクルは、水性であり得、眼組織と化学的及び物理的に相溶性となるように処方される。例えば、生体内分解性の（又は生体内崩壊性の）ゲル又はコラーゲン挿入物は、胞における阻害剤の有効濃度を保持するために使用され得る。そのようなゲル又は挿入物の使用は、手術部位で活性成分の持続放出を提供する利点を有する。
【００１６】
当業者が理解するであろうように、上述の組成物は、無菌であるべきであり、敏感な眼内組織、特に、角膜／内皮細胞に対して毒性を示すどんな薬剤も含むべきでない。上述の組成物は、当業者に既知の技術に従って処方し得る。
【００１７】
上述のＡＬＫ−５阻害剤は、種々の技術の手段により手術部位へ適用し得る。例えば、該組成物は、手術の間に又は手術後直ちに、好ましくは４時間以内に注射の手段により、又は手術部位上又は手術部位周囲の眼中へ挿入し得る持続放出ポリマーと一緒に適用され得る。該組成物は、角膜の濁りを防止又は減少するために、ＬＡＳＩＫ後の局所処方で手術部位に適用され得る。
【実施例】
【００１８】
実施例１：インビトロにおけるＴＧＦ−β２の抑制の測定
試料の線維芽細胞は、ニュージーランド白ウサギの眼から得られた。該線維芽細胞は、対象者の眼から単離された結膜下組織に由来するものであった。細胞は、イーグル最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、５％子牛血清、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸及び抗生物質から構成される媒体２ｍＬを用いて２５ｃｍ2フラスコ中で保持された。該細胞がコンフルエンスに到達した時に、トリプシン処理され及び継代された。
【００１９】
６−ウェルプレート中の線維芽細胞培養物は、それぞれ種々の濃度、０．０３、０．１、０．０３、１．０、３．０及び１０．０μＭで、ＡＬＫ−５阻害剤を含む媒体２ｍＬと一緒に１時間前処理され、更に、ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された。表１に示されるように、試料１−６は、ＡＬＫ−５阻害剤６１６４５１を用いて、試料７−１２は、ＡＬＫ−５阻害剤６１６４５２を用いて、試料１３−１８は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＤ−２０８を用いて、試料１９−２４は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ５０５１２４を用いて、及び試料２５−３０は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５２５３３４を用いて処理された。
【００２０】
試料３１及び３２は、コントロールとして調製された。試料３１は、ＡＬＫ−５阻害剤又はＴＧＦ−β２で処理されなかった。試料３２は、ＴＧＦ−β２ ２ｎｇ／ｍＬで処理されたが、ＡＬＫ−５阻害剤で処理されなかった。試料は、以下の表１に示されるように調製された。
【表１】
【００２１】
阻害剤及び／又はＴＧＦ−β２を用いた処理の後、種々の試料からの細胞は採取され、定量的な評価を提供するためにウエスタンブロッティングが行われた。結膜線維芽細胞はトリトン溶解緩衝液中で溶解された。溶解物中の総タンパク質は、ブラッドフォードタンパク質分析を用いて定量された。タンパク質の等量（２０μｇ／レーン）が１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルに溶解された。タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ転写された。
【００２２】
１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、該膜は、ポリクローナルヤギ抗−結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）（１：２００、サンタクルーズ バイオテクノロジー、サンタクルーズ、ＣＡ、）でプローブされ、そして、ＨＲＰ標識−ロバ抗−ヤギＩｇＧ（１：１，０００；ジャクソン イムノリサーチ、ウエストグローブ、ＰＡ）が続いた。ＴＧＦ−βシグナルは、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォールド、ＩＬ）製のスーパーシグナル（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ）を使用する高感度化学発光（ＥＣＬ）により検出された。
濃度測定はその後、バンドの強度を測定することにより達成された。
【００２３】
濃度測定は、低下したＣＴＧＦタンパク質のバンドの強度、即ち、１μＭを超える濃度で試料は、３７−３８及び４２−４４ｋＤａを示し、ＡＬＫ−５阻害剤で処理された試料における減少したタンパク質レベルを示している。膜はまた、内部標準として、ハウスキーピング遺伝子、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのためにもプローブされた。図２−６で示されるように、最大阻害の半分の濃度（ＩＣ５０）が、ＴＧＦ−β２機能の阻害における各阻害剤の効果を評価するために計算された。阻害剤の濃度が増加するに従って、阻害されるＴＧＦ−β２のパーセンテージもまた増加した。ＴＧＦ−β発現を阻害することがＧＦＳ後の眼球瘢痕化の抑制を引き起こすことが理解され得るだろう。該成長因子の阻害のパーセンテージが、投与された各阻害剤の特定の濃度に依存することに留意すべきである。
【００２４】
一般的に、該成長因子は、阻害剤の少なくとも１μＭでの細胞への適用により、ある程度阻害された。シグナル経路の阻害を提供するのに３μＭ程度が必要な場合があった。阻害剤無しに調製されたコントロール試料は、ＴＧＦ−βシグナル経路の阻害機能を示さなかった。図２−６中、グラフの“−１”境界線は、試料３１が試験された場合に見られる、ＴＧＦ−β下流タンパク質の負の発現パーセンテージを表し、“０”境界線は、各ＡＬＫ−５阻害剤は添加されないが、ＴＧＦ−β溶液は添加されて試験される、試料３２からの試験データを表す。
【００２５】
阻害剤の低濃度を用いて調製された試料の中には、実際に、シグナル経路の活性において増加を示したものもあったが、阻害剤を用いる効果的な治療は、使用した特定の阻害剤及び手術部位へ適用した阻害剤の濃度に依存するであろうとの結論を導く。更に、長時間に亘り、手術部位において、阻害剤の一定濃度を維持するのが望ましい。従って、局所ゲル、ポリマーインプラント等を伴うような、組成物の持続放出を提供する方法を伴って阻害剤を適用することが望ましくあり得る。
【００２６】
実施例２：インビトロにおけるＡＬＫ−５阻害剤の毒性
ＧＦＳ処置後の標準治療は、眼球瘢痕化を予防するために、ミトマイシンＣ（ＭＭＣ）で手術部位を治療することである。しかしながら、ＭＭＣは、手術部位の周囲において高頻度の非−選択的な細胞死を引き起こすことが知られている。この細胞死における増加又は高い細胞毒性は、後期発症の術後感染症の比率増加を含む術後合併症を引き起こすことが知られている。従って、細胞毒性が、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５０５１２４で処理されたか又は処理されなかった線維芽細胞を用いて研究された。
【００２７】
試料の線維芽細胞は、ニュージーランド白ウサギの眼から得られた。該線維芽細胞は、対象者の眼から単離された結膜組織に由来するものであった。細胞は、イーグル最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、５％子牛血清、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸及び抗生物質から構成される媒体２ｍＬを用いて２５ｃｍ2フラスコ中で保持された。該細胞がコンフルエンスに到達した時に、トリプシン処理され及び継代された。
【００２８】
線維芽細胞の３種の試料が調製された。第一の試料である試料Ａは、ＴＧＦ−β２の２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された線維芽細胞培養物を含んでいた。第二の試料である試料Ｂは、未処理である線維芽細胞培養物を含んでいた。第三の試料は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５０５１２４の１０．０μＭを含む媒体２ｍＬと一緒に１時間前処理され、更に、付加的なＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ）２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された。
【００２９】
細胞数がトリプシン処理の後で血球計（ハウザーサイエンティフィック（Ｈａｕｓｓｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ホーシャム、ＰＣ）を用いて集計された。図７に示すように、ＡＬＫ−５で処理された試料とＴＧＦ−β２で処理されなかったか又はＴＧＦ−β２単独で処理された試料の間に、細胞数における測定可能な差異が存在しなかったことが観察された。従って、ＴＧＦ−β２の発現の抑制及びＡＬＫ−５タイプの阻害剤を用いることによる、ＧＦＳ後に結果として生じ得る眼球瘢痕化の軽減に加えて、ＡＬＫ−５阻害剤は、術後感染症を予防する手術部位の周辺の健全な細胞を破壊しないという付加された利点を有するように考えられる。
【００３０】
実施例３：インビボにおける術後の胞生存結果
ＧＦＳに続く眼球瘢痕化の発生を測定する一つの方法は、手術中に形成されるろ過胞の不全又は生存を測定することである。以前で議論したように、図１を参照し、ＧＦＳの間、眼の通常のドレナージ部位（小柱網）１４中への排水の代わりに、房水が眼の結膜１２の下に創出された新規な“空間”中へ排水される。これを行うために、眼の中に小さなフラップが作成される。その後、通路の開口部２０とろ過胞と呼ばれる貯水部２２の間に新規なドレナージルート２８が創出される。房水と呼ばれる、前房及び後房中の流体は、その後、新規なドレナージルート２８を介して胞２２中へ排水され、眼の周囲の血管中へ吸収される。胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８は、傷跡を残し得、そして、該房水が適度に流れ出るのを防ぐ経路を閉ざしてしまうが、胞不全と呼ばれる。
【００３１】
手術に続く胞不全及び眼球瘢痕化の発生を測定するために、ＧＦＳを受け及び手術部位の周辺が瘢痕化した４匹のニュージーランド白ウサギを観察した。実験のプロトコールは、ノースイースター・オハイオ大学医学薬学カレッジ（Northeaster Ohio Universities Colleges of Medicine and Pharmacy）における動物管理使用委員会 (Institutional Animal Care and Use Committee)により承認された。動物管理指針は、米国公衆衛生局（US Public Health Service）により発行されたものに匹敵している。
【００３２】
被験ウサギは、メデトミジンの約０．２５ないし０．５ｍｇ／ｋｇ及びケタミンの約１５ないし２０ｍｇ／ｋｇの組み合わせの皮下注射により麻酔された。当初の薬量の１／４ないし１／２の追加の注射がまた、麻酔を維持するために３０ないし４５分毎に与えられた。局所麻酔が０．５％プロパラカインＨＣｌ点眼薬で提供された。
【００３３】
手術は、無菌条件下で行われ、眼は１：１６希釈のプロビドン−ヨウ素 局所消毒薬及び食塩水で洗浄された。手術は、検鏡を用いる眼瞼の引き込みにより行われた。部分−厚さ角膜けん引縫合（８−０シルク、アルコン（Ａｌｃｏｎ）社、フォート ワース、ＴＸ）は、眼を下方に回転するために上部角膜中に配置された。透明な角膜穿刺管が１２時と２時の間の位置に作成され、粘弾性材料（０．１−０．２ｍＬ、ディスコビスク（Ｄｉｓｃｏｖｉｓｃ（登録商標））、アルコン）が房形態を維持するために前房中に注入された。
【００３４】
手術は、眼の前部、側頭部及び上部の部位において行われた。円蓋ベースの結膜弁が角膜輪部の後ろに上げられ、角膜間質への強膜トンネルがその後形作られた。２２−Ｇ／２５−ｍｍのベンフロン２カニューレ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社、フランクリンレイク、ＮＪ）が角膜中で目に見えるまで、強膜を通過された。前房中へのカニューレの挿入の後、該カニューレは１０−０ナイロン縫合糸（Ａｌｃｏｎ）で強膜表面へ固定された。結膜切開は、遮断され及びテーパー切断針（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）社、サマービル、ＮＪ）を用いた９−０ナイロン縫合を使用するマットレス縫合により閉じられた。１％アトロピンの１滴並びにネオマイシンとデキサメタゾンが組み合わされた軟膏の単回使用が、手術の終わりに眼表面に適用された。
【００３５】
被験対象の第一組であるＡ群は、ＧＦＳを受け、コントロールとしてＭＭＣ（ベッドフ
ォードラボラトリーズ（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より入手可能、ベッドフォード、ＯＨ）で処理された（ＭＭＣコントロール）。０．０４％ＭＭＣに浸された手術用スポンジが、円蓋ベースの結膜弁が上げられたすぐ後に、５分間手術部位の結膜下腔に適用された。該部位はその後、平衡塩類溶液５００ｍＬで洗浄された。
【００３６】
被験対象の第二組であるＢ群は、ＧＦＳを受け、ＳＢ−５０５１２４の５ｍｇ及びラクトース６５ｍｇを含んだタブレットで、圧縮技術を使用して調製された錠剤（直径６ｍｍ、厚さ１．０ｍｍ）で処理された。ＧＦＳ中の結膜切開の縫合に先立って、該ラクトース錠剤は幾つかの片に割られて、手術部位における強膜上に置かれた。
【００３７】
被験対象の第三及び第四組であるＣ及びＤ群は、それぞれ、あらゆる処理無しにＧＦＳを受け（非添加コントロール）及び阻害剤を欠いているラクトース錠剤を伴ってＧＦＳを受けた（錠剤コントロール）。
【００３８】
ＧＦＳ後、Ａ−Ｄ群における全ての動物は、ＧＦＳ後の最初の１週間の間、連日細隙灯下に置かれ、及び、胞不全が観察されるまで、又は、術後２８日までのどちらか長い方の期間、その後の少なくとも１週間当り２回、試験された。ろ過胞、前房活性及び深さ、結膜充血及び房水漏洩が試験された。胞不全は、深前房と関連した、平坦で、血管が新生された、瘢痕化した胞の外観として定義された。眼のマッサージにより促進される胞中への房水廃水の欠如が、胞不全の判断における一助となった。ろ過胞はまた、デジタルカメラで写真撮影された（ファインピックスＦ４０ｆｄ、冨士フィルム、日本）。
【００３９】
図８に示されるように、それぞれＭＭＣとＡＬＫ−５阻害剤で処理されたＡ及びＢ群の被験対象は、ＧＦＳ後の少なくとも１０日の間維持されたろ過胞を有していたが、一方、コントロール処理を受けていないか又はラクトース錠剤コントロールを受けたＣ及びＤ群の被験対象におけるろ過胞は、手術後１週間以内に損傷された。このことは、ＭＭＣと同じように、ＡＫＬ−５阻害剤は手術に続く眼球瘢痕化を予防し得ることを示す。
【００４０】
実施例４−インビボにおける術後ＩＯＰの結果
Ａ−Ｄ群における動物のためのＩＯＰは、局所麻酔が０．５％プロパラカインを用いて適用された後、各被験対象の角膜を穏やかに触れて、ＴＯＮＯ−ＰＥＮ（登録商標）（ライヘルトオフタルミックインストルメンツ（Reichert Ophthalmic Instruments）社、ニューヨーク州、デピュー）を用いて測定された。ＩＯＰ測定値は、その信頼区間が９５％未満である場合、削除された。３回の測定の平均値を推定ＩＯＰとした。
【００４１】
図９Ａは、未処理の眼４０のＩＯＰと、ＳＢ−５０５１２４阻害剤で処理した手術被験対象４２のそれとを比べる比較を示す。図９Ｂは、未処理の眼４０のＩＯＰと、ＭＭＣで処理した手術被験対象４４のそれとを比べる比較を示す。図９Ｃは、未処理の眼４０のＩＯＰと、あらゆる適用無しで処理された手術被験対象ＭＭＣで処理した手術被験対象（非添加コントロール）４６のそれとを比べる比較を示す。図９Ｄは、未処理の眼４０のＩＯＰと、１００％ラクトースの錠剤で処理した手術被験対象（錠剤コントロール）のそれとを比べる比較を示す。図９Ａ−Ｄにおいて示されるように、外科的に処理されていない眼を用いたため、処理された眼のＩＯＰは、ＳＢ−５０５１２４で処理された群において１０日間までの間、及びＭＭＣで処理されたものにおいて観察期間に亘って、低下した。ラクトースコントロール又は非添加コントロールの群のＩＯＰにおける差異は僅かであったため、阻害剤の使用はＭＭＣと同様に、手術に続いて減少されたＩＯＰを導くという結論が導かれた。
【００４２】
実施例５−イクスビボにおけるヘモトキシリン及びエオシン染色結果
手術の５日後、製造業者の説明書に従って、Ａ−Ｄ群の被験対象をフェイタル−プラス
（登録商標：Ｆａｔａｌ−ｐｌｕｓ）（ボルテックファーマシューティカル（Ｖｏｒｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）社、ミシガン州、ディアボーン）で安楽死させた。被験対象の眼が、結膜上皮及び結膜下腔を無傷に維持するために、眼瞼の角膜輪部と共に摘出された。摘出された眼は、１０％の緩衝化されたホルマリンで固定化され、５μｍ厚のパラフィン切片が調製された。該切片は組織学的試験のためにヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、写真がオリンパスＤＸ５１光学顕微鏡及びＤＰコントローラー（オリンパス、東京、日本）を用いて撮影された。
【００４３】
図１０は、ＳＢ−５０５１２４を用いた（１０Ａ）、ＭＭＣを用いた（ＭＭＣコントロール、１０Ｂ）及び何らの添加も用いない（非添加コントロール １０Ｃ）、手術５日後の眼からの組織切片におけるヘモトキシリン及びエオシン染色の写真である。２〜３の炎症細胞及び軽い瘢痕化のみの浸潤が、ＳＢ−５０５１２４を用いたＧＦＳ又はＭＭＣコントロールにおける眼の結膜下腔４８において観察されたが、一方、多くの炎症細胞及び重度の瘢痕化が、非添加コントロール（１０Ｃ）において見られた。角膜輪部浸潤が全てにおいて観察された。より薄い結膜上皮が、ＳＢ−５０５１２４を伴うＧＦＳ（１０Ａ）及び非添加コントロール（１０Ｃ）におけるものと比べて、ＭＭＣコントロール（１０Ｂ）において見られた。結膜血管５４が、概して、ＳＢ−５０５１２４を伴うＧＦＳ（１０Ａ）及び非添加コントロール（１０Ｃ）において見られたが、ＭＭＣコントロール（１０Ｂ）においては殆ど見られなかった。よって、未処理の被験対象のように、これらの写真は、ＳＢ−５０５１２４阻害剤で処理された被験対象が、組織毒性の兆候が無いか又は非常に低いを示すことを示し、実証する。従って、ＳＢ−５０５１２４による眼球瘢痕化の抑制における機構が、広範な細胞死に起因する眼球瘢痕化を抑制するＭＭＣのそれとは異なると結論付けることができる。
【００４４】
実施例５−イクスビボにおいて細胞増生を測定することによるＡＬＫ−５阻害剤の毒性
眼球瘢痕化を抑制するＡＬＫ−５阻害剤の能力がＭＭＣと同じようにその毒性と関連するものであるか否かを更に調査するために、結膜下組織線維芽細胞の増生アッセイが行われた。ＧＦＳの５日後、Ａ及びＢ群として、ＭＭＣ又はＡＬＫ−５阻害剤を用いて調製された被験対象を、上述のようにして安楽死させた。眼科手術用顕微鏡下で、結膜下組織を手術部位から切開し及び手術部位から１８０°（６時の位置）を切開した（１８０°コントロール）。各生体標本（外植片）を完全な媒体と一緒に２５ｃｍ2細胞培養フラスコ内に設置した。生体標本の取り扱いにおいて、特に、試料が乾燥しないように及び細胞の生存能力に影響しないことを確実にするために注意が払われた。各外植片の端からミリサイズで細胞増生が観察され、４つの四辺形中の増生の長さが測定された。
【００４５】
図１１Ａ−Ｃは、それぞれ、ＳＢ−５０５１２４、ＭＭＣで及びコントロール無しで処理された被験対象から取られた外植片からの細胞増生の写真である。図１１Ａで示されるように、ＳＢ−５０５１２４で処理された被験対象のための結膜下組織外植片の端からの細胞増生５６は健全であり、一方、細胞増生５６は、ＭＭＣで処理されたそれらにおいて貧弱であった。図１１Ａ及び１１Ｃにおいて示されるように、ＳＢ−５０５１２４で処理された結膜下組織と処理されなかった群における被験対象の間の細胞増生における明確な差異は存在しておらず、一方、図１１Ｂ及び１１Ｃにおいて示されるように、ＭＭＣ群と処理されなかったコントロール群の対象者の間に明確な差異が見られた。死滅細胞のように見える、２〜３の小さな丸い小片が、ＡＬＫ−５阻害剤及びＭＭＣで処理された組織からの増生の頂部において見られたが、処理されなかったコントロール群からは殆ど見られなかった。
【００４６】
図１２Ａ−Ｄは、それぞれ、ＳＢ−５０５１２４ １８０°コントロール、ＭＭＣ １８０°コントロール、ＳＢ−５０５１２４手術部位及びＭＭＣ手術部位から取られた外植片から測定された細胞増生長のグラフ表示である。図Ａ−Ｃで示される、１８日間にわた
って約７ｍｍという、外植片から測定された細胞増生の量において明確な差異は無いように見られた。しかし、ＭＭＣで処理された組織の手術部位から取られた外植片から測定された細胞増生は、１８日間にわたって２ｍｍ未満という、非常に小さいものであった。従って、処理されていない組織のように、ＳＢ−５０５１２４で処理された組織は、ＭＭＣと異なり、明確な細胞毒性を引き起こさないように見える。
【００４７】
結果の統計的有意性を評価するために、二元分散分析を実行してＧＦＳ後のＩＯＰ変化及び結膜下組織からの線維芽細胞増生を評価した。胞生存を分析するためにカプラン−マイヤー法を使用した（ＳＰＳＳ 第１６版、イリノイ州、シカゴ）。
【００４８】
当業者は、ここに開示される実施例及び方法が、基本的に例示を意図するものであり、請求された発明を限定することを意図するものでないことを認識し得る。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年４月１７日に出願された米国仮出願特許第６１／１７０，１４１号への優先権を請求する。
【０００２】
この発明の進展は、米国健康支援財団（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、Ｇ２００６−０１４からの財政的支援により支持されている。政府機関は本発明に興味を持っている。
【背景技術】
【０００３】
背景
眼の線維傷害反応は、特に、緑内障のための外科的治療の結果として、視覚障害及び失明の主な原因である。緑内障は、米国における失明の主な原因であり、２０００年に２５０万人のアメリカ人及び世界中で６５００万人の人が該疾患に罹患した。緑内障は視神経頭への損傷並びに神経障害及び視力障害により特徴付けられる疾患である。緑内障の主な危険因子の一つは、房水流出路における異常の結果として生じる眼圧の上昇（ＩＯＰ）である。緑内障ろ過手術（ＧＦＳ）は通常、薬物治療がＩＯＰを的確に制御することに失敗した場合に行なわれる。
【０００４】
過度の術後瘢痕化が、しばしばＧＦＳの失敗をもたらす。結膜の抗−瘢痕化治療として、ミトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）及び５−フルオロウラシルのような代謝拮抗剤の使用が多くの患者に利益をもたらしているものの、これらは広範な細胞死を引き起こすことによって、その利益をもたらすのであって、低眼圧黄斑症及び感染症のような重度の及び潜在的な失明合併症を伴う。そのため、他の抗−瘢痕化のアプローチが調査されてきている。特に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）及びその経路が、術後の抗−瘢痕化治療のための標的として浮上した。
【発明の概要】
【０００５】
図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ且つ本明細書の一部を構成する、添付の図面は、本発明の観点の種々の実施例態様を説明する種々の実施例系、方法等を説明する。図中で説明される成分枠（例えば、四角形、四角形の群又は他の形状）は、枠の１例を表すものと理解され得る。当業者は、１種の要素は、多重要素として設計され得るか又は多重要素は１種の要素として設計され得ると理解し得る。別の要素の内部構成材として示される要素は、外部構成材として実施され得るが、その逆も同じである。更に、要素は、縮尺通りとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、緑内障ろ過手術の間のヒトの目の側面図である。
【図２】図２は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、６１６４５１の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、６０６４５２の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＤ−２０８の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ウサギの培養結膜下線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５２５３３４の効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ウサギの培養結膜線維芽細胞におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の細胞毒性を示すグラフである。
【図８】図８は、被験動物におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、被験動物のＩＯＰにおけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４の効果を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、被験動物のＩＯＰにおけるミトマイトシン−ｃ（ｍｉｔｏｍｙｔｏｃｉｎ−ｃ）の効果を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、被験動物のＩＯＰにおける無処理の効果を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、被験動物のＩＯＰにおける乳糖コントロール錠剤の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、被験動物の目におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示す写真である。
【図１１】図１１Ａ−Ｃは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示す写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−Ｄは、被験動物の目から取られた外植片からの細胞増生におけるＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−５０５１２４及び種々のコントロールの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
ここで開示されるものは、哺乳類におけるＧＦＳ後の眼球瘢痕化の予防及び治療のための方法である。好ましくは、該方法はＧＦＳ中又はその後のヒトの患者を治療するために使用され得る。ＧＦＳおいて、眼からの液体の排水を容易にするために新規なドレナージ部位が創出されると、それにより眼におけるＩＯＰが低下する。図１に示されるように、ヒトの眼は、他の構成要素中に、結膜１２、小柱網１４、虹彩１６、角膜１８、網膜２４及び水晶体２６を含む。
【０００８】
ＧＦＳの間、眼の通常のドレナージ部位（小柱網）１４中への排水の代わりに、房水が眼の結膜１２の下に創出された新規な“空間”中へ排水される。これを行うために、白眼の中に小さなフラップが作成される。その後、通路の開口部２０とろ過胞と呼ばれる貯水部２２の間に新規なドレナージルート２８が創出される。房水と呼ばれる、前房及び後房中の流体は、その後、新規なドレナージルート２８を介して胞２２中へ排水され、眼の周囲の血管中へ吸収される。胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８は、傷跡を残し得、そして、該房水が適度に流れ出るのを防ぐ経路を閉ざしてしまい、それは胞不全と呼ばれる。
【０００９】
ＴＧＦ−βは、創傷治癒反応の主要なメディエーターである。眼において、ＴＧＦ−βは、角膜外傷及びレーザー手術後の角膜の濁り及びＧＦＳ後の結膜下の瘢痕化の誘発に関与してきた。加えて、ＴＧＦ−βの上方調節は、網膜剥離手術の失敗の主原因である、増
殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に関わっている。
【００１０】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を遮断すると認識されてきており、よって、角膜外傷及びＬＡＳＩＫのようなレーザー手術後の角膜の濁り並びにＧＦＳ及び角膜手術及び硝子体網膜手術を含む眼科手術後の瘢痕化を防止するために使用され得る。同様に、ＡＬＫ−５阻害剤の使用は、ＭＭＣのような現在の抗−瘢痕化薬剤により引き起こされる組織傷害と関連する後期発症の術後感染症を含む副作用も減少し得る。他の副作用は、出血、腫脹、瘢痕化、網膜剥離、眼瞼下垂、複視、視力低下又は失明でさえ含み得る。最終的に、ＡＬＫ−５阻害剤のヒトの眼への局所適用は、緑内障と関連するＩＯＰを低下させ得る。
【００１１】
一つの態様において、ＧＦＳ処置又は眼球外傷後の眼球瘢痕化を抑制するための方法は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量で、ＡＬＫ−５の有効量及びそのための医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物並びにその組み合わせを提供することであり、それは手術後又は外傷部位への該組成物の適用は、眼球手術及び／又は眼球外傷に続く瘢痕組織の形成を抑制する。
【００１２】
当業者は、図１で示されるように、ろ過胞２２の形成がＧＦＳ処置にとって重要であることを理解するだろう。もし該胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８が損なわれるか又は閉じられた場合、房水が適度に流れ出るのを妨げ（胞不全）、ろ過手術は失敗し得る。従って、手術処置の間に使用されるＡＬＫ−５阻害剤の量は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量とすべきであり、それにより、胞不全が予防される。用語“約”は、ここで使用されるあらゆる一定数のプラス又はマイナス１０％を意味すると理解されるべきである。好ましくは、組成物は約０．３ないし約３０マイクロモル（μＭ）のＡＬＫ−５阻害剤を、より好ましくは約３ないし約１５μＭの阻害剤を含み得る。更に、当業者は、３０μＭを超えて含む組成物もまた使用され得ることを理解するだろう。
【００１３】
以下に示す化合物の１種以上が瘢痕組織の形成を抑制するためにＧＦＳ処置中に使用され得る。入手可能な所で、製造業者指定のものが提供されてきている。
【化１】
【化２】
【化３】
【００１４】
更なる化合物は、それらの製造業者名により既知であり、阻害剤、ＫＩ２６８９４、ＬＹ２１０９７６１、ＩＮ−１２３３及びＳＫＩ２１２６を含む。上述の化合物のコレクションから、以下に示すものが種々の供給元から得られた：６３１７８−９９１６，ミズーリ州，セントルイス，ピー．オー．ボックス１４５０８のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から入手可能なＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８及びＳＢ−５０５１２４；０８０２７，ニュージャージー州，ギブスタウン，Ｓ．デモクラットロード ４８０のカルビオケム（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）社（ＥＭＤケミカルス，Ｉｎｃ．）から入手可
能な６１６４５２及び６１６４５３；英国，ＴＷ８ ９ＧＳ，ミドレセックス，ブレントフォード，グレートウエストロード ９８０のグラクソスミスクライン（ＣｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社から入手可能なＧＷ７８８３８８及びＧＷ６６０４；４６２８５，インディアナ州，インディアナポリス，リリーリサーチ（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社から入手可能なＬＹ５８０２７６及び、２７７０９−４６２７，ノースカロライナ州，リサーチトライアングルパーク，デイビスドライブ ５０００，ピー．オー．ボックス１４６２７のバイオジェン アイデック（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）社から入手可能なＳＭ１６。
【００１５】
上記組成物は、ＡＬＫ−５阻害剤及びその医薬的に許容可能な塩を含み得、それらは持続放出性ポリマー、投与においてゲル形成が可能なキャリア、ハイドロゲル、クリーム、軟膏、噴霧剤、液剤又は錠剤のような、眼に適用される種々のタイプの医薬的に許容可能なビヒクルと組み合わせ得る。ビヒクルは、水性であり得、眼組織と化学的及び物理的に相溶性となるように処方される。例えば、生体内分解性の（又は生体内崩壊性の）ゲル又はコラーゲン挿入物は、胞における阻害剤の有効濃度を保持するために使用され得る。そのようなゲル又は挿入物の使用は、手術部位で活性成分の持続放出を提供する利点を有する。
【００１６】
当業者が理解するであろうように、上述の組成物は、無菌であるべきであり、敏感な眼内組織、特に、角膜／内皮細胞に対して毒性を示すどんな薬剤も含むべきでない。上述の組成物は、当業者に既知の技術に従って処方し得る。
【００１７】
上述のＡＬＫ−５阻害剤は、種々の技術の手段により手術部位へ適用し得る。例えば、該組成物は、手術の間に又は手術後直ちに、好ましくは４時間以内に注射の手段により、又は手術部位上又は手術部位周囲の眼中へ挿入し得る持続放出ポリマーと一緒に適用され得る。該組成物は、角膜の濁りを防止又は減少するために、ＬＡＳＩＫ後の局所処方で手術部位に適用され得る。
【実施例】
【００１８】
実施例１：インビトロにおけるＴＧＦ−β２の抑制の測定
試料の線維芽細胞は、ニュージーランド白ウサギの眼から得られた。該線維芽細胞は、対象者の眼から単離された結膜下組織に由来するものであった。細胞は、イーグル最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、５％子牛血清、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸及び抗生物質から構成される媒体２ｍＬを用いて２５ｃｍ2フラスコ中で保持された。該細胞がコンフルエンスに到達した時に、トリプシン処理され及び継代された。
【００１９】
６−ウェルプレート中の線維芽細胞培養物は、それぞれ種々の濃度、０．０３、０．１、０．０３、１．０、３．０及び１０．０μＭで、ＡＬＫ−５阻害剤を含む媒体２ｍＬと一緒に１時間前処理され、更に、ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された。表１に示されるように、試料１−６は、ＡＬＫ−５阻害剤６１６４５１を用いて、試料７−１２は、ＡＬＫ−５阻害剤６１６４５２を用いて、試料１３−１８は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＤ−２０８を用いて、試料１９−２４は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ５０５１２４を用いて、及び試料２５−３０は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５２５３３４を用いて処理された。
【００２０】
試料３１及び３２は、コントロールとして調製された。試料３１は、ＡＬＫ−５阻害剤又はＴＧＦ−β２で処理されなかった。試料３２は、ＴＧＦ−β２ ２ｎｇ／ｍＬで処理されたが、ＡＬＫ−５阻害剤で処理されなかった。試料は、以下の表１に示されるように調製された。
【表１】
【００２１】
阻害剤及び／又はＴＧＦ−β２を用いた処理の後、種々の試料からの細胞は採取され、定量的な評価を提供するためにウエスタンブロッティングが行われた。結膜線維芽細胞はトリトン溶解緩衝液中で溶解された。溶解物中の総タンパク質は、ブラッドフォードタンパク質分析を用いて定量された。タンパク質の等量（２０μｇ／レーン）が１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルに溶解された。タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ転写された。
【００２２】
１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、該膜は、ポリクローナルヤギ抗−結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）（１：２００、サンタクルーズ バイオテクノロジー、サンタクルーズ、ＣＡ、）でプローブされ、そして、ＨＲＰ標識−ロバ抗−ヤギＩｇＧ（１：１，０００；ジャクソン イムノリサーチ、ウエストグローブ、ＰＡ）が続いた。ＴＧＦ−βシグナルは、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォールド、ＩＬ）製のスーパーシグナル（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ）を使用する高感度化学発光（ＥＣＬ）により検出された。
濃度測定はその後、バンドの強度を測定することにより達成された。
【００２３】
濃度測定は、低下したＣＴＧＦタンパク質のバンドの強度、即ち、１μＭを超える濃度で試料は、３７−３８及び４２−４４ｋＤａを示し、ＡＬＫ−５阻害剤で処理された試料における減少したタンパク質レベルを示している。膜はまた、内部標準として、ハウスキーピング遺伝子、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのためにもプローブされた。図２−６で示されるように、最大阻害の半分の濃度（ＩＣ５０）が、ＴＧＦ−β２機能の阻害における各阻害剤の効果を評価するために計算された。阻害剤の濃度が増加するに従って、阻害されるＴＧＦ−β２のパーセンテージもまた増加した。ＴＧＦ−β発現を阻害することがＧＦＳ後の眼球瘢痕化の抑制を引き起こすことが理解され得るだろう。該成長因子の阻害のパーセンテージが、投与された各阻害剤の特定の濃度に依存することに留意すべきである。
【００２４】
一般的に、該成長因子は、阻害剤の少なくとも１μＭでの細胞への適用により、ある程度阻害された。シグナル経路の阻害を提供するのに３μＭ程度が必要な場合があった。阻害剤無しに調製されたコントロール試料は、ＴＧＦ−βシグナル経路の阻害機能を示さなかった。図２−６中、グラフの“−１”境界線は、試料３１が試験された場合に見られる、ＴＧＦ−β下流タンパク質の負の発現パーセンテージを表し、“０”境界線は、各ＡＬＫ−５阻害剤は添加されないが、ＴＧＦ−β溶液は添加されて試験される、試料３２からの試験データを表す。
【００２５】
阻害剤の低濃度を用いて調製された試料の中には、実際に、シグナル経路の活性において増加を示したものもあったが、阻害剤を用いる効果的な治療は、使用した特定の阻害剤及び手術部位へ適用した阻害剤の濃度に依存するであろうとの結論を導く。更に、長時間に亘り、手術部位において、阻害剤の一定濃度を維持するのが望ましい。従って、局所ゲル、ポリマーインプラント等を伴うような、組成物の持続放出を提供する方法を伴って阻害剤を適用することが望ましくあり得る。
【００２６】
実施例２：インビトロにおけるＡＬＫ−５阻害剤の毒性
ＧＦＳ処置後の標準治療は、眼球瘢痕化を予防するために、ミトマイシンＣ（ＭＭＣ）で手術部位を治療することである。しかしながら、ＭＭＣは、手術部位の周囲において高頻度の非−選択的な細胞死を引き起こすことが知られている。この細胞死における増加又は高い細胞毒性は、後期発症の術後感染症の比率増加を含む術後合併症を引き起こすことが知られている。従って、細胞毒性が、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５０５１２４で処理されたか又は処理されなかった線維芽細胞を用いて研究された。
【００２７】
試料の線維芽細胞は、ニュージーランド白ウサギの眼から得られた。該線維芽細胞は、対象者の眼から単離された結膜組織に由来するものであった。細胞は、イーグル最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、５％子牛血清、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸及び抗生物質から構成される媒体２ｍＬを用いて２５ｃｍ2フラスコ中で保持された。該細胞がコンフルエンスに到達した時に、トリプシン処理され及び継代された。
【００２８】
線維芽細胞の３種の試料が調製された。第一の試料である試料Ａは、ＴＧＦ−β２の２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された線維芽細胞培養物を含んでいた。第二の試料である試料Ｂは、未処理である線維芽細胞培養物を含んでいた。第三の試料は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ−５０５１２４の１０．０μＭを含む媒体２ｍＬと一緒に１時間前処理され、更に、付加的なＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ）２ｎｇ／ｍＬで４８時間まで処理された。
【００２９】
細胞数がトリプシン処理の後で血球計（ハウザーサイエンティフィック（Ｈａｕｓｓｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ホーシャム、ＰＣ）を用いて集計された。図７に示すように、ＡＬＫ−５で処理された試料とＴＧＦ−β２で処理されなかったか又はＴＧＦ−β２単独で処理された試料の間に、細胞数における測定可能な差異が存在しなかったことが観察された。従って、ＴＧＦ−β２の発現の抑制及びＡＬＫ−５タイプの阻害剤を用いることによる、ＧＦＳ後に結果として生じ得る眼球瘢痕化の軽減に加えて、ＡＬＫ−５阻害剤は、術後感染症を予防する手術部位の周辺の健全な細胞を破壊しないという付加された利点を有するように考えられる。
【００３０】
実施例３：インビボにおける術後の胞生存結果
ＧＦＳに続く眼球瘢痕化の発生を測定する一つの方法は、手術中に形成されるろ過胞の不全又は生存を測定することである。以前で議論したように、図１を参照し、ＧＦＳの間、眼の通常のドレナージ部位（小柱網）１４中への排水の代わりに、房水が眼の結膜１２の下に創出された新規な“空間”中へ排水される。これを行うために、眼の中に小さなフラップが作成される。その後、通路の開口部２０とろ過胞と呼ばれる貯水部２２の間に新規なドレナージルート２８が創出される。房水と呼ばれる、前房及び後房中の流体は、その後、新規なドレナージルート２８を介して胞２２中へ排水され、眼の周囲の血管中へ吸収される。胞２２及び／又は新規なドレナージルート２８は、傷跡を残し得、そして、該房水が適度に流れ出るのを防ぐ経路を閉ざしてしまうが、胞不全と呼ばれる。
【００３１】
手術に続く胞不全及び眼球瘢痕化の発生を測定するために、ＧＦＳを受け及び手術部位の周辺が瘢痕化した４匹のニュージーランド白ウサギを観察した。実験のプロトコールは、ノースイースター・オハイオ大学医学薬学カレッジ（Northeaster Ohio Universities Colleges of Medicine and Pharmacy）における動物管理使用委員会 (Institutional Animal Care and Use Committee)により承認された。動物管理指針は、米国公衆衛生局（US Public Health Service）により発行されたものに匹敵している。
【００３２】
被験ウサギは、メデトミジンの約０．２５ないし０．５ｍｇ／ｋｇ及びケタミンの約１５ないし２０ｍｇ／ｋｇの組み合わせの皮下注射により麻酔された。当初の薬量の１／４ないし１／２の追加の注射がまた、麻酔を維持するために３０ないし４５分毎に与えられた。局所麻酔が０．５％プロパラカインＨＣｌ点眼薬で提供された。
【００３３】
手術は、無菌条件下で行われ、眼は１：１６希釈のプロビドン−ヨウ素 局所消毒薬及び食塩水で洗浄された。手術は、検鏡を用いる眼瞼の引き込みにより行われた。部分−厚さ角膜けん引縫合（８−０シルク、アルコン（Ａｌｃｏｎ）社、フォート ワース、ＴＸ）は、眼を下方に回転するために上部角膜中に配置された。透明な角膜穿刺管が１２時と２時の間の位置に作成され、粘弾性材料（０．１−０．２ｍＬ、ディスコビスク（Ｄｉｓｃｏｖｉｓｃ（登録商標））、アルコン）が房形態を維持するために前房中に注入された。
【００３４】
手術は、眼の前部、側頭部及び上部の部位において行われた。円蓋ベースの結膜弁が角膜輪部の後ろに上げられ、角膜間質への強膜トンネルがその後形作られた。２２−Ｇ／２５−ｍｍのベンフロン２カニューレ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社、フランクリンレイク、ＮＪ）が角膜中で目に見えるまで、強膜を通過された。前房中へのカニューレの挿入の後、該カニューレは１０−０ナイロン縫合糸（Ａｌｃｏｎ）で強膜表面へ固定された。結膜切開は、遮断され及びテーパー切断針（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）社、サマービル、ＮＪ）を用いた９−０ナイロン縫合を使用するマットレス縫合により閉じられた。１％アトロピンの１滴並びにネオマイシンとデキサメタゾンが組み合わされた軟膏の単回使用が、手術の終わりに眼表面に適用された。
【００３５】
被験対象の第一組であるＡ群は、ＧＦＳを受け、コントロールとしてＭＭＣ（ベッドフ
ォードラボラトリーズ（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より入手可能、ベッドフォード、ＯＨ）で処理された（ＭＭＣコントロール）。０．０４％ＭＭＣに浸された手術用スポンジが、円蓋ベースの結膜弁が上げられたすぐ後に、５分間手術部位の結膜下腔に適用された。該部位はその後、平衡塩類溶液５００ｍＬで洗浄された。
【００３６】
被験対象の第二組であるＢ群は、ＧＦＳを受け、ＳＢ−５０５１２４の５ｍｇ及びラクトース６５ｍｇを含んだタブレットで、圧縮技術を使用して調製された錠剤（直径６ｍｍ、厚さ１．０ｍｍ）で処理された。ＧＦＳ中の結膜切開の縫合に先立って、該ラクトース錠剤は幾つかの片に割られて、手術部位における強膜上に置かれた。
【００３７】
被験対象の第三及び第四組であるＣ及びＤ群は、それぞれ、あらゆる処理無しにＧＦＳを受け（非添加コントロール）及び阻害剤を欠いているラクトース錠剤を伴ってＧＦＳを受けた（錠剤コントロール）。
【００３８】
ＧＦＳ後、Ａ−Ｄ群における全ての動物は、ＧＦＳ後の最初の１週間の間、連日細隙灯下に置かれ、及び、胞不全が観察されるまで、又は、術後２８日までのどちらか長い方の期間、その後の少なくとも１週間当り２回、試験された。ろ過胞、前房活性及び深さ、結膜充血及び房水漏洩が試験された。胞不全は、深前房と関連した、平坦で、血管が新生された、瘢痕化した胞の外観として定義された。眼のマッサージにより促進される胞中への房水廃水の欠如が、胞不全の判断における一助となった。ろ過胞はまた、デジタルカメラで写真撮影された（ファインピックスＦ４０ｆｄ、冨士フィルム、日本）。
【００３９】
図８に示されるように、それぞれＭＭＣとＡＬＫ−５阻害剤で処理されたＡ及びＢ群の被験対象は、ＧＦＳ後の少なくとも１０日の間維持されたろ過胞を有していたが、一方、コントロール処理を受けていないか又はラクトース錠剤コントロールを受けたＣ及びＤ群の被験対象におけるろ過胞は、手術後１週間以内に損傷された。このことは、ＭＭＣと同じように、ＡＫＬ−５阻害剤は手術に続く眼球瘢痕化を予防し得ることを示す。
【００４０】
実施例４−インビボにおける術後ＩＯＰの結果
Ａ−Ｄ群における動物のためのＩＯＰは、局所麻酔が０．５％プロパラカインを用いて適用された後、各被験対象の角膜を穏やかに触れて、ＴＯＮＯ−ＰＥＮ（登録商標）（ライヘルトオフタルミックインストルメンツ（Reichert Ophthalmic Instruments）社、ニューヨーク州、デピュー）を用いて測定された。ＩＯＰ測定値は、その信頼区間が９５％未満である場合、削除された。３回の測定の平均値を推定ＩＯＰとした。
【００４１】
図９Ａは、未処理の眼４０のＩＯＰと、ＳＢ−５０５１２４阻害剤で処理した手術被験対象４２のそれとを比べる比較を示す。図９Ｂは、未処理の眼４０のＩＯＰと、ＭＭＣで処理した手術被験対象４４のそれとを比べる比較を示す。図９Ｃは、未処理の眼４０のＩＯＰと、あらゆる適用無しで処理された手術被験対象ＭＭＣで処理した手術被験対象（非添加コントロール）４６のそれとを比べる比較を示す。図９Ｄは、未処理の眼４０のＩＯＰと、１００％ラクトースの錠剤で処理した手術被験対象（錠剤コントロール）のそれとを比べる比較を示す。図９Ａ−Ｄにおいて示されるように、外科的に処理されていない眼を用いたため、処理された眼のＩＯＰは、ＳＢ−５０５１２４で処理された群において１０日間までの間、及びＭＭＣで処理されたものにおいて観察期間に亘って、低下した。ラクトースコントロール又は非添加コントロールの群のＩＯＰにおける差異は僅かであったため、阻害剤の使用はＭＭＣと同様に、手術に続いて減少されたＩＯＰを導くという結論が導かれた。
【００４２】
実施例５−イクスビボにおけるヘモトキシリン及びエオシン染色結果
手術の５日後、製造業者の説明書に従って、Ａ−Ｄ群の被験対象をフェイタル−プラス
（登録商標：Ｆａｔａｌ−ｐｌｕｓ）（ボルテックファーマシューティカル（Ｖｏｒｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）社、ミシガン州、ディアボーン）で安楽死させた。被験対象の眼が、結膜上皮及び結膜下腔を無傷に維持するために、眼瞼の角膜輪部と共に摘出された。摘出された眼は、１０％の緩衝化されたホルマリンで固定化され、５μｍ厚のパラフィン切片が調製された。該切片は組織学的試験のためにヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、写真がオリンパスＤＸ５１光学顕微鏡及びＤＰコントローラー（オリンパス、東京、日本）を用いて撮影された。
【００４３】
図１０は、ＳＢ−５０５１２４を用いた（１０Ａ）、ＭＭＣを用いた（ＭＭＣコントロール、１０Ｂ）及び何らの添加も用いない（非添加コントロール １０Ｃ）、手術５日後の眼からの組織切片におけるヘモトキシリン及びエオシン染色の写真である。２〜３の炎症細胞及び軽い瘢痕化のみの浸潤が、ＳＢ−５０５１２４を用いたＧＦＳ又はＭＭＣコントロールにおける眼の結膜下腔４８において観察されたが、一方、多くの炎症細胞及び重度の瘢痕化が、非添加コントロール（１０Ｃ）において見られた。角膜輪部浸潤が全てにおいて観察された。より薄い結膜上皮が、ＳＢ−５０５１２４を伴うＧＦＳ（１０Ａ）及び非添加コントロール（１０Ｃ）におけるものと比べて、ＭＭＣコントロール（１０Ｂ）において見られた。結膜血管５４が、概して、ＳＢ−５０５１２４を伴うＧＦＳ（１０Ａ）及び非添加コントロール（１０Ｃ）において見られたが、ＭＭＣコントロール（１０Ｂ）においては殆ど見られなかった。よって、未処理の被験対象のように、これらの写真は、ＳＢ−５０５１２４阻害剤で処理された被験対象が、組織毒性の兆候が無いか又は非常に低いを示すことを示し、実証する。従って、ＳＢ−５０５１２４による眼球瘢痕化の抑制における機構が、広範な細胞死に起因する眼球瘢痕化を抑制するＭＭＣのそれとは異なると結論付けることができる。
【００４４】
実施例５−イクスビボにおいて細胞増生を測定することによるＡＬＫ−５阻害剤の毒性
眼球瘢痕化を抑制するＡＬＫ−５阻害剤の能力がＭＭＣと同じようにその毒性と関連するものであるか否かを更に調査するために、結膜下組織線維芽細胞の増生アッセイが行われた。ＧＦＳの５日後、Ａ及びＢ群として、ＭＭＣ又はＡＬＫ−５阻害剤を用いて調製された被験対象を、上述のようにして安楽死させた。眼科手術用顕微鏡下で、結膜下組織を手術部位から切開し及び手術部位から１８０°（６時の位置）を切開した（１８０°コントロール）。各生体標本（外植片）を完全な媒体と一緒に２５ｃｍ2細胞培養フラスコ内に設置した。生体標本の取り扱いにおいて、特に、試料が乾燥しないように及び細胞の生存能力に影響しないことを確実にするために注意が払われた。各外植片の端からミリサイズで細胞増生が観察され、４つの四辺形中の増生の長さが測定された。
【００４５】
図１１Ａ−Ｃは、それぞれ、ＳＢ−５０５１２４、ＭＭＣで及びコントロール無しで処理された被験対象から取られた外植片からの細胞増生の写真である。図１１Ａで示されるように、ＳＢ−５０５１２４で処理された被験対象のための結膜下組織外植片の端からの細胞増生５６は健全であり、一方、細胞増生５６は、ＭＭＣで処理されたそれらにおいて貧弱であった。図１１Ａ及び１１Ｃにおいて示されるように、ＳＢ−５０５１２４で処理された結膜下組織と処理されなかった群における被験対象の間の細胞増生における明確な差異は存在しておらず、一方、図１１Ｂ及び１１Ｃにおいて示されるように、ＭＭＣ群と処理されなかったコントロール群の対象者の間に明確な差異が見られた。死滅細胞のように見える、２〜３の小さな丸い小片が、ＡＬＫ−５阻害剤及びＭＭＣで処理された組織からの増生の頂部において見られたが、処理されなかったコントロール群からは殆ど見られなかった。
【００４６】
図１２Ａ−Ｄは、それぞれ、ＳＢ−５０５１２４ １８０°コントロール、ＭＭＣ １８０°コントロール、ＳＢ−５０５１２４手術部位及びＭＭＣ手術部位から取られた外植片から測定された細胞増生長のグラフ表示である。図Ａ−Ｃで示される、１８日間にわた
って約７ｍｍという、外植片から測定された細胞増生の量において明確な差異は無いように見られた。しかし、ＭＭＣで処理された組織の手術部位から取られた外植片から測定された細胞増生は、１８日間にわたって２ｍｍ未満という、非常に小さいものであった。従って、処理されていない組織のように、ＳＢ−５０５１２４で処理された組織は、ＭＭＣと異なり、明確な細胞毒性を引き起こさないように見える。
【００４７】
結果の統計的有意性を評価するために、二元分散分析を実行してＧＦＳ後のＩＯＰ変化及び結膜下組織からの線維芽細胞増生を評価した。胞生存を分析するためにカプラン−マイヤー法を使用した（ＳＰＳＳ 第１６版、イリノイ州、シカゴ）。
【００４８】
当業者は、ここに開示される実施例及び方法が、基本的に例示を意図するものであり、請求された発明を限定することを意図するものでないことを認識し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼科手術処置後の眼球瘢痕化を抑制するための方法であって：
形質転換増殖因子−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量における、ＡＬＫ−５阻害剤の有効量、及びそれらの医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物を準備することを含み、ここで、前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化１】
【化２】
【化３】
及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、前記組成物の患者の眼への適用が、眼科手術処置の後の瘢痕組織の形成を抑制する方法。
【請求項２】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化４】
及びそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化５】
を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、その医薬的に許容可能な塩である請求項１
、２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、眼科手術処置の後に術後の手術部位へ局所適用の形態で適用される請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項６】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは、持続放出ポリマーキャリアを含む請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項７】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは更に、患者の眼の手術部位への投与においてゲル形成が可能なキャリア媒体を含む請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項８】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは更に、錠剤の形態にあるキャリア媒体を含む請求項８記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、約１．０ないし約３０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、約３．０ないし約１５．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項１】
眼科手術処置後の眼球瘢痕化を抑制するための方法であって：
形質転換増殖因子−βのシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量における、ＡＬＫ−５阻害剤の有効量、及びそれらの医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物を準備することを含み、ここで、前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化１】
【化２】
【化３】
及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、前記組成物の患者の眼への適用が、眼科手術処置の後の瘢痕組織の形成を抑制する方法。
【請求項２】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化４】
及びそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、
【化５】
を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、その医薬的に許容可能な塩である請求項１
、２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、眼科手術処置の後に術後の手術部位へ局所適用の形態で適用される請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項６】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは、持続放出ポリマーキャリアを含む請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項７】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは更に、患者の眼の手術部位への投与においてゲル形成が可能なキャリア媒体を含む請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項８】
前記医薬的に許容可能なビヒクルは更に、錠剤の形態にあるキャリア媒体を含む請求項８記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、約１．０ないし約３０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＬＫ−５阻害剤は、約３．０ないし約１５．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１、２又は３記載の方法。
【図１】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１０】
【図１１】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５２４０７３（Ｐ２０１２−５２４０７３Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５９７２（Ｐ２０１２−５０５９７２）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１４３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１１６２
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１０３１６６６０）スムマ ヘルス システムズ エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１４３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１１６２
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１０３１６６６０）スムマ ヘルス システムズ エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
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