肺癌の腫瘍血管を標的とするペプチドおよびその適用
本発明は、診断および治療法を含む適用に用いるための核酸、ペプチドおよび抗体を提供する。ペプチドは新生血管系を標的とし、インビボファージディスプレイによって同定された。こうしたペプチドの１つであるＳＰ５−５２は、ＳＣＩＤマウスにおける複数の腫瘍の新生血管系を認識したが、正常な血管はターゲティングしなかった。このペプチドはヒト肺癌生検試料の血管にも結合する。ＳＰ５−５２およびドキソルビシンを含むリポソームは、ＳＣＩＤマウスにおける複数のヒト癌異種移植片に対する薬物の効果を高めた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／９００，９８０号および２００７年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０８６号ならびに２００７年４月１３日に出願された米国特許出願第１１／７８３，９２６号（これらは全て、それらの全体が参考として援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍発達の間に、腫瘍細胞は老廃物を除去するためにより多くの酸素および代謝産物を必要とする。加えて、宿主脈管系への接近および腫瘍血液供給の生成は、腫瘍発達にとっての律速段階である（Ｂｅｒｇｅｒｓら、２００３）。同様に、加齢性黄斑変性などの疾患は、新たな血管の生成を伴う。（Ｎｇら、２００６）。よって、腫瘍血管は腫瘍成長を阻害するための主要な標的であり、加齢性黄斑変性に伴う血管はこの疾患を阻害するための好適な標的である。腫瘍血管は、正常な組織の血管に存在しない特異的マーカを発現する。これらの特異的マーカの多くは、腫瘍が誘導する血管新生、すなわち新たな血管の発芽に関連するタンパク質である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２）。細胞接着受容体のインテグリンαｖβ３およびαｖβ５は、腫瘍血管系中で過剰発現する（ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ、１９９９）。確かに、腫瘍ホーミングまたはターゲティングに対するインビボのファージディスプレイによって同定されたＲＧＤペプチドの１つはαｖβ３を認識する（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。これらのインテグリンに対して特異的なペプチドは、抗癌剤および抗血管新生剤のターゲティングによる送達のためのリガンドとして使用されてきた（Ａｒａｐら、１９９８）。血管系の不均一性は、ターゲティングによる治療法の送達に対する新たな機会を与えるかもしれない。
【０００３】
従来の化学療法は、その正常な組織に対する毒性によって制限される。もし化学療法薬物を腫瘍部位または腫瘍脈管に直接結合させて正常な組織から離すことができれば、治療結果は大きく改善されるだろう。大部分の小分子化学療法薬剤は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ：ｉ．ｖ．）投与における大量の分配を有する（Ｓｐｅｔｈら、１９８８）。この分配によって、正常な組織への高レベルの毒性のために治療指数がしばしば小さくなる。薬物をリポソームなどの高分子担体に封入することによって、分配の体積が顕著に低減され、腫瘍における薬物の濃度が増加する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）。封入によって、非特異的毒性の重篤度およびタイプを減少でき、腫瘍部位に有効に送達される薬物の量を増加できる（ＧａｂｉｚｏｎおよびＭａｒｔｉｎ、１９９７；Ｍａｒｔｉｎ、１９９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１）。腫瘍ターゲティングリガンドを用いて、リポソームなどの高分子担体を腫瘍部位にターゲティングできる。代替的には、薬物を腫瘍ターゲティングリガンドに結合または連結させることによって、薬物の腫瘍へのターゲティングを促進できる。
【０００４】
リポソームは、癌化学療法における薬物担体として提案された（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９７４）。そのとき以来、リポソームに対する関心は増加し、リポソーム系は現在薬物担体として広範囲に研究されている。薬物を特異的に送達するのに使用するために、リポソームには以下の３つの基本的要求が望まれる：（ｉ）血液循環を長くすること、（ｉｉ）腫瘍または他の標的組織における十分な蓄積、（ｉｉｉ）薬物の薬力学に適合する放出プロファイルを有しながら、制御された薬物放出および腫瘍細胞または他の標的組織による取込みが行なわれること。
【０００５】
最初、リポソーム薬物送達系の研究は、細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）による非常に速い血液クリアランスに苦しめられた。粒子サイズ、表面電荷（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９８４）、およびリポソーム組成物は、クリアランスプロファイルに対する影響が強い（例、ホスファチジルイノシトールまたはモノシアロガングリオシドの組込みによって、血液中のリポソーム循環が長くなる）ことが確認された（ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｎｎ、１９８７；ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８；Ｓｅｎｉｏｒ、１９８７）。漏出性毛細血管を介して優先的に循環から出て、広範囲の新血管新生を示す腫瘍に蓄積してより高濃度となり、効能を高めると予測される「ステルス」リポソームによって、この取込みは回避され得る（Ｗｕら、１９９３）。
【０００６】
しかし、合成ポリマーポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）で被覆されたリポソームが血中の半減期を有意に増加させることが発見されたときには、リポソームは単に良好な薬物送達候補としてのみ認識されていた（Ａｌｌｅｎら、１９９１；ＢｌｕｍｅおよびＣｅｖｃ、１９９０；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１；Ｓｅｎｉｏｒら、１９９１）。このペグ化リポソームは、リポソームのタンパク質吸着およびオプソニン作用を阻害する高度に水和し保護されたリポソーム表面のために、長く循環する（ＷｏｏｄｌｅおよびＬａｓｉｃ、１９９２）。速いオプソニン作用およびクリアランスの問題を解決して、血中で最大７２時間の半減期を有するリポソームを提供する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）と、次の挑戦事項は能動的ターゲティングによって腫瘍組織または他の疾患組織内にリポソームを蓄積させることだった。
【０００７】
ターゲティングリポソームの使用によって、腫瘍標的部位における薬物放出を有意に高め、治療効果を増加できる可能性があり得る（非特許文献１；非特許文献２）。薬物送達研究分野では、腫瘍組織内で蓄積する長く循環するリポソームの構築に成功しており、閉じ込められた薬物は、能動的なトリガが存在しない限り、次いで受動拡散によってリポソームの外に漏出する。疾患組織に特異的に薬物を放出できる部位特異的トリガの使用は、腫瘍標的部位における薬物の生物学的利用率を増加させる方法の１つである。薬物の生物学的利用率を最適化する別の方法は、能動的ターゲティングによってより高程度のリポソーム蓄積を得ることである。さらに、能動的ターゲティングと能動的トリガとの組合せによって、腫瘍標的部位における有意に高められた特異的な薬物放出をもたらし得る可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
ヒトの癌の９０％より多くを含む固形悪性腫瘍に対しては、免疫結合体が腫瘍組織に侵入できないため、腫瘍特異的な抗原を認識する抗体が薬物送達に与える有用性はほとんどなかった（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１；Ｓｈｏｃｋｌｅｙら、１９９１）。しかし、過去１０年間のファージディスプレイペプチドライブラリの発達は、抗体よりも有効な小さいペプチドを同定する機会をもたらした。
【０００９】
ファージディスプレイのランダムペプチドライブラリは、Ｂ細胞エピトープ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、１９９７；Ｆｕら、１９９７；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０；Ｗｕら、２００１；Ｗｕら、２００３）およびタンパク質−タンパク質接触（Ａｔｗｅｌｌら、１９９７；Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｎｏｒｄら、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、１９９９）をマッピングする機会、受容体（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｌｉら、１９９５；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）またはタンパク質（Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｃａｓｔａｎｏら、１９９５；ＤｅＬｅｏら、１９９５；Ｋｒａｆｔら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）に結合する生理活性ペプチドを選択する機会、疾患特異的な抗原模倣（Ｆｏｌｇｏｒｉら、１９９４；Ｌｉｕら、２００４；Ｐｒｅｚｚｉら、１９９６）を探索する機会、ならびに細胞特異的ペプチド（Ｂａｒｒｙら、１９９６；Ｌｅｅら、２００４；Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、１９９９）および器官特異的ペプチド（Ａｒａｐら、１９９８；ＥｓｓｌｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）を定める機会を与える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４，８００２〜８００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）８，１１７２−１１８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特定の標的組織に対してファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることは、薬物、遺伝子送達ベクターまたはその他の治療薬剤のターゲティングに用いられるペプチド配列の同定における直接的かつ迅速な方法となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はとりわけ、以下のものを単独または組合せて含む。
【００１３】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよびその変異体を提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８を含むペプチドおよびその変異体を提供する。一実施形態において、ペプチドは配列番号２またはその変異体である。別の実施形態において、ペプチドは配列番号２である。別の実施形態において、ペプチドは融合タンパク質を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の薬物に結合される。ペプチドに結合され得る薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。
【００１５】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される本発明のペプチドまたはその変異体に結合する抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むリポソームを提供する。一実施形態において、リポソームは配列番号２またはその変異体を含む。別の実施形態において、リポソームは配列番号２を含む。リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物を含んでもよい。一実施形態において、使用され得る薬物のうちの１つは、リン脂質１μｍｏｌ当り約１１０μｇから約１３０μｇの量であり得るドキソルビシンである。ある実施形態において、リポソームは約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有する。別の実施形態において、リポソーム当りのペプチド分子の数は約３００から約５００である。リポソームは医薬的に許容できる担体を含んでもよい。
【００１７】
本発明は、処置を必要とする対象に本発明のペプチドを投与する工程を含む、疾患を処置する方法を提供し、前記ペプチドは薬物に結合される。ペプチドに結合され得る薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含む。
【００１８】
本発明は、１つまたはそれ以上の薬物と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群より選択されるより多くもしくはそれ以上のペプチド、またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含む、疾患を処置する方法を提供する。この方法は、１つまたはそれ以上の薬物と、配列番号２またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含んでもよい。リポソームは１つまたはそれ以上の化学療法薬物を含んでもよい。治療薬物はドキソルビシンであってもよい。この方法は癌を処置するために用いられてもよく、癌は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌からなる群より選択される癌を含んでもよい。実施形態の１つにおいて、癌は肺癌である。別の実施形態において、癌は口腔癌である。この方法は、加齢性黄斑変性を処置するために用いられてもよい。
【００１９】
本発明は新生血管系を検出する方法を提供し、この方法は、ペプチドが新生血管系に結合できる条件下で、試料を本発明のペプチドに接触させる工程と、そのペプチドを検出する工程とを含む。ペプチドは、そのペプチドに対する抗体によって検出されてもよい。ペプチドはエピトープを含む融合タンパク質を含んでもよく、この融合タンパク質はエピトープに対する抗体によって検出される。ペプチドは標識を含んでもよく、このペプチドの標識を検出することによってペプチドが検出される。実施形態の１つにおいて、標識はＦＩＴＣを含む。別の実施形態において、標識はビオチンを含む。
【００２０】
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体分子を同定する方法を提供し、この方法は、ペプチドとリガンドとを含む複合体を形成できる条件下で本発明のペプチドを細胞抽出物に接触させる工程と、その複合体を分析してリガンドを同定する工程とを含む。
【００２１】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インビボのファージディスプレイによる、肺癌ターゲティングファージの選択を示す図である。
【図２Ａ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｂ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｃ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｄ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図３】（Ａ）ヒト肺への静脈内注射後のＰＣ５−５２ファージの免疫蛍光局在化を示す図である。（Ｂ）肺癌異種移植片の腫瘍脈管へのファージ結合の調査を示す図である。（Ｃ）ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドと肺癌異種移植片の腫瘍脈管との結合を示す図である。
【図４Ａ】異なるヒト癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスからの腫瘍ターゲティングファージＰＣ５−５２の回収を示す図である。
【図４Ｂ】異なるヒト癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスからの腫瘍ターゲティングファージＰＣ５−５２の回収を示す図である。
【図５】（Ａ）ターゲティングファージがＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣと反応することを示す図である。（Ｂ）肺腺癌試料におけるビオチン標識されたＳＰ５−５２ペプチドの免疫組織化学的局在化を示す図である。
【図６Ａ】ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【図６Ｂ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す図である。
【図６Ｃ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたマウスにおける腫瘍脈管の減少および損傷を示す図である。
【図６Ｄ】口腔癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【図６Ｅ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる口腔癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す図である。
【図７】さまざまなヒト癌の異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
表の簡単な説明
表１は、肺癌異種移植片から選択されたファージからのファージディスプレイペプチド配列を提供する。
【００２６】
癌の化学療法のほとんどは、強力な副作用および薬剤耐性の獲得を伴う。したがって当該技術分野においては、薬物を腫瘍脈管上だけでなく腫瘍細胞上の標的部位にも送達する薬物送達系が必要とされている。いくつかの試みの中には、腫瘍組織に対する１本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ｓｃＦｖ）抗体（Ｐａｒｋら、２００２）およびターゲティングペプチド（Ｌｅｅら、２００４）の使用が含まれる。最近、脈管ターゲティングが注目を集めている。なぜなら、特定の薬物または薬物担体は腫瘍の血管外遊出よりも前にまず血管系に出会うためである（Ｏｋｕら、２００２）。その概念は、血管新生が腫瘍形成の際の拡張に必要な工程だということである。同様に、血管新生は加齢性黄斑変性などの疾患を伴う。（Ｎｇら、２００６）。腫瘍血管系は正常な血管系とは異なる固有なマーカを発現する（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３）ため、これらのマーカに基づくターゲティングは癌処置に対する有望な戦略である。これらの抗血管新生療法は、効果が高く毒性が低い見込みがある。さらに、ターゲティングリガンドの親和性に基づく化学療法薬物の腫瘍組織への送達は、高い腫瘍間質液圧および薬物耐性に起因する癌治療法の障害を克服するものである。開示されるペプチドはリガンド標的療法に用いることができ、したがってこのペプチドは従来の抗癌薬よりも治療効果を改善する新たな処置に対する基礎を提供する。
【００２７】
インビボのファージディスプレイを用いて、腫瘍血管に特異的にホーミングするペプチドを同定した。表１。この出願において、「ホーミングする（ｈｏｍｅ）」、「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」、「標的（ｔａｒｇｅｔ）」および「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」という用語は相互交換可能に用いられる。ＳＰ５−５２という１つのペプチド、ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ［配列番号２］のさらなる研究から、彼のペプチドは、ヒト腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の血管系は認識するが正常な血管は認識しないことが明らかになった。ＳＰ５−５２は、動物モデルにおける複数の腫瘍からの異種移植片の腫瘍脈管だけでなく、ＶＥＧＦ刺激されたヒト脈管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺癌からの血管にも特異的に結合できることが発見された。加えて、ＳＰ５−５２ペプチドに結合された、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を有するリポソーム（ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト癌異種移植片に対する薬物の効果を高めた。これらの研究から、ＳＰ５−５２ペプチドは複数の腫瘍の血管系に特異的に結合できて、固形腫瘍を標的とする薬物送達に対する良い候補であることが示される。ＳＰ５−５２およびその他のペプチドは、腫瘍血管系のターゲティングに有用である。
【００２８】
本発明者らの研究において、インビボのバイオパニングの第５ラウンドからのファージは、肺癌異種移植片との結合活性が最初のファージライブラリのものより１５６倍高かった（図１）。特定のファージクローンは、プロリン−セリン−プロリン（ＰＳＰ）というコンセンサスペプチドモチーフを提示した（表１）。別個のインビボファージディスプレイ実験において、本発明者らはＩＶＯ−２と名付けられたファージクローンを同定し、これは口腔癌異種移植片の腫瘍組織にホーミングした。ＩＶＯ−２もＰＣ５−５２と同じアミノ酸配列を提示することを本発明者らは定めた。
【００２９】
インビボのホーミング実験から、ＰＣ５−５２は肺癌および口腔癌の異種移植片からの腫瘍組織の脈管には特異的に結合できるが、他の正常な器官、たとえば肺、心臓および脳などには結合できないことが示された（図２および図３）。ペプチド競合的阻害アッセイが行なわれたとき、ＰＣ５−５２と腫瘍組織との結合活性は、合成ペプチドＳＰ５−５２によって阻害された（図２Ｂおよび図２Ｄ）。これらの結果は、この合成ペプチドがそれぞれのファージクローンと同じ結合部位に結合することを示唆する。
【００３０】
腫瘍塊および正常な器官におけるホーミングファージの局在化を調べるために、肺癌のＳＣＩＤマウスにＰＣ５−５２を静脈内注射し、次いでこれらのマウスからの冷凍切片を、抗マウスＣＤ３１および抗Ｍ１３ ｍＡｂを用いた二重局在化に供した。その結果、ＣＤ３１およびファージ粒子はほとんどの異種移植片脈管内皮に共存しており、腫瘍細胞およびその他の正常な器官においては稀であることが明らかになった（図３）。これらの結果から、ＰＣ５−５２は腫瘍血管系の内皮細胞を特異的にターゲティングできるが、腫瘍細胞または正常な器官の血管はターゲティングできないことが示された。
【００３１】
本発明者らは調査を拡大して、ＰＣ５−５２が他のヒト腫瘍細胞、たとえばヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、前立腺癌（ＰＣ３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）細胞などに由来する異種移植片の血管系にも結合できるのかどうかを調べた。その結果、異なる癌細胞系からのこれらの異種移植片腫瘍組織は、正常な器官よりもＰＣ５−５２のタイターが高い（正常な器官に比べて１０倍より多い）ことが示された（図４）。これらのデータから、ＰＣ５−５２は８つの異なるタイプのヒト癌異種移植片からの腫瘍組織に対して、より高い結合親和性を有することが示される。この現象は、固形腫瘍の血管系が、ＳＰ５−５２ペプチドによって認識され得る未知の普遍的受容体を発現している可能性を示唆するものである。ＰＣ５−５２ファージおよびＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドはどちらも異種移植片における腫瘍脈管内皮には特異的に結合できたが、正常な血管には結合できなかったという本発明者らの実証（図３）は、この可能性をさらに支持する。
【００３２】
コンセンサスモチーフであるプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）は、表１に示される３つのクローンＰＣ５−５、ＰＣ−５２およびＰＣ−５４の提示ペプチドに存在し、このコンセンサスモチーフの役割を調べるために、本発明者らはＳＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ）中のこれら３つのアミノ酸残基を、変異ペプチドＭＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＧＧＧＲＰ）［配列番号２０］においてＧＧＧに変えた。図４Ｂに示されるとおり、ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力はＳＰ５−５２によって顕著に阻害されたが、変異ペプチドＭＰ５−５２には阻害されなかった（図４Ｂ）。
【００３３】
ヒトの癌治療法に対するＳＰ５−５２の適用可能性を評価するために、本発明者らは、ネズミ血管新生モデルにおいて選択されたペプチドがヒト腫瘍の血管系内皮に対する結合親和性を有するかどうかを調べた。本発明者らは、このペプチドがＶＥＧＦ刺激された内皮細胞およびヒト肺癌生検試料に特異的に結合できることを確認した（図５）。本発明者らの結果から、ヒト肺癌または他の癌に対するリガンド標的療法の開発に対するターゲティングリガンドとしてＳＰ５−５２を用いることができることが示される。
【００３４】
本発明者らはＳＰ５−５２に結合したリポソームを調製して、ＳＰ５−５２およびドキソルビシンを含むリポソーム、すなわちＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘと、ドキソルビシンを含むリポソーム、すなわちＬｉｐｏ−Ｄｏｘとが腫瘍成長に与える影響を比較した。その結果、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘはヒトの肺癌および口腔癌異種移植片の両方に対する薬物の効果を高めることが明らかになった（図６Ａおよび図６Ｄ）。さらに、このターゲティングリポソームはこれら２つのヒト癌動物モデルの生存率をも有意に増加した（図６Ｂおよび図６Ｅ）。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置によって、腫瘍血管系は破壊されて顕著に減少した（図６Ｃ）。
【００３５】
ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘが他の固形腫瘍に対する治療効果も高めることができるかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）を含む５タイプのヒト癌からの異種移植片を有するマウスを処置した。興味深いことに、ターゲティングリポソームＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、これら５つのヒト癌に対する治療効果の増加を示した（図７）。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘをペプチドＳＰ５−５２に結合させることによって、薬物がヒト固形腫瘍異種移植片を阻害する能力が高められることが示された。
【００３６】
よって、本明細書に記載されるものを含むこれらの新たなターゲティング戦略は、癌処置を顕著に改善する可能性を有する。
【００３７】
腫瘍血管系は、一般的に安定で薬物耐性をほとんどまたはまったく誘導しない非悪性の内皮細胞からなっているために、癌治療法に対する特に好適な標的である（Ｂｏｅｈｍら、１９９７）。加えて、これらの細胞は薬物にもっと接近でき、固有の増幅機構を有する。１個の内皮細胞の除去によって１００個の腫瘍細胞の生育を阻害できると見積もられている（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９４；Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９９３）。本発明者らの結果から、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置によって、腫瘍血管系は破壊されて顕著に減少することが証明された（図６Ｃ）。これらのデータは、このターゲティングリポソームが異種移植片動物モデルにおける化学療法の効果を改善することを明らかに示すものである。この効果は、ターゲティングリポソームが腫瘍組織内に蓄積することによるものかもしれない。固形腫瘍の腫瘍間質液圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＦＰ）が高いことは、効率的な薬物送達にとって障壁である（Ｈｅｌｄｉｎら、２００４）。ＩＦＰが増加すると、腫瘍内の経毛細管輸送が減少するために薬物の吸収が減少し、その結果治療法が最終的に失敗となる。これらの現象には、薬剤耐性および転移性疾患の発達が伴う（Ｂｏｕｃｈｅｒら、１９９０；Ｂｏｕｃｈｅｒら、１９９１；Ｇｕｔｍａｎｎら、１９９２；Ｈｅｌｄｉｎら、２００４；Ｌｅｓｓら、１９９２）。本明細書に記載されるような効果的なリガンド標的療法は、リガンドの親和性を利用して抗癌薬を腫瘍組織に運ぶものであり、腫瘍のＩＦＰが高くても薬物の蓄積を増加させることによって機能する可能性がある。
【００３８】
インビボのファージディスプレイを用いて腫瘍内皮細胞の分子上のターゲティングリガンドを単離することにより、本発明者らはＰＣ５−５２を含むいくつかのペプチドを同定し、これらのペプチドは２つのＮＳＣＬＣおよび６つのヒト腫瘍異種移植片における血管系を標的とする。このペプチドを介してターゲティングされたリポソームは、リポソームの治療効果を高めて、ヒトの肺癌および口腔癌異種移植片を有するマウスの生存率を増加させた。ＳＰ５−５２は固形腫瘍の血管系への薬物送達に対する優れた薬剤であり、臨床的な癌処置に適用可能である。
【００３９】
参考文献
【００４０】
【化１】
【００４１】
【化２】
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【００４４】
【化５】
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
定義
本明細書において用いられる用語は以下に示すとおりの通常の意味を有し、明細書の文脈においてさらに理解されてもよい。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合形をいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体もしくは誘導体を含有し得る。この用語は、変異体を含む。変異体は、挿入、付加、欠失または置換を含み得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列は５’から３’の方向にリストされる。
【００４９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのアミノ酸の重合形を示し、それは天然に発生するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾、誘導されたアミノ酸またはデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸類似体、ペプチド模倣薬およびデプシペプチド、ならびに修飾された、環状の、二環状の、デプシ環状の（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ）またはデプシ二環状の（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は１本鎖タンパク質およびマルチマーを含む。この用語は、以下のものに結合されたタンパク質も含む：たとえばＦＩＴＣ、ビオチン、ならびに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、および２４４Ｃｍを含むがこれらに限定されない放射性同位元素などの標識；検出可能な生成物を有する酵素（たとえば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光剤および蛍光標識、蛍光発光金属、たとえば１５２Ｅｕ、またはその他のランタニド系列、電気化学発光化合物、化学発光化合物、たとえばルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩など；特異的結合分子、たとえば磁性粒子、微小球、ナノ球体など。この用語は、治療薬剤に結合されたペプチドも含む。
【００５０】
この用語は融合タンパク質も含み、この融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）融合タンパク質、たとえばルシフェリンまたはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）などの生物発光タンパク質などの異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する融合タンパク質または有さない融合タンパク質、ペグ化タンパク質、ならびに免疫学的にタグ付けされたタンパク質またはｈｉｓタグ付けされたタンパク質を含むが、これらに限定されない。こうした融合タンパク質はエピトープとの融合も含む。こうした融合タンパク質は、本発明のペプチドのマルチマー、たとえばホモダイマーまたはホモマルチマー、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロマルチマーなどを含んでもよい。この用語はペプチドアプタマーも含む。
【００５１】
本発明のペプチドは、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、こうした変異体は構造が実質的に同様である。ペプチド配列の変異体は、対象のペプチドに比べて挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよい。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【００５２】
本発明のペプチドは、天然に発生するアミノ酸および天然に発生しないアミノ酸を含んでもよい。ペプチドはＤ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組合せ、およびさまざまな「デザイナー」または「合成」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含むことによって特別な特性を有してもよい。加えて、ペプチドは環状であってもよい。ペプチドは非古典的アミノ酸を含むことによって特定の立体構造モチーフを導入してもよい。あらゆる公知の非古典的アミノ酸が用いられてもよい。以下を含むがそれらに限定されないアミノ酸類似体およびペプチド模倣薬をペプチドに組み込むことによって、特定の二次構造を誘導または有利にしてもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸）、β−ターンを誘導するジペプチド類似体；β−シートを誘導する類似体；β−ターンを誘導する類似体；α−へリックスを誘導する類似体；γ−ターンを誘導する類似体；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体；アミド結合アイソスター；またはテトラゾール（ｔｒｅｔｒａｚｏｌ）など。
【００５３】
ペプチドの末端部にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込むことによって、末端アミノ基またはカルボキシル基をなくして、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、または立体構造を制限してもよい。Ｃ末端官能基は、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにそれらの低級エステル誘導体、ならびにそれらの医薬的に許容できる塩を含む。
【００５４】
「リポソーム」という用語は、内部の水性空間を囲む外側の脂質二重層または多層の膜を含む組成物をいう。この用語は多重膜リポソームを含み、これは一般的に約１マイクロメートルから約１０マイクロメートルの範囲の直径を有し、水相の層と交互になった２から数百の同心の脂質二重層を含む。この用語は、単一脂質層からなり、一般的に約２０ナノメートルから約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約３００ｎｍから約４００ｎｍ、または約１００ｎｍから約２００ｎｍの範囲の直径を有する単層膜の小胞を含む。この用語は、約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有するリポソームも含む。
【００５５】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、特定の抗原を認識して結合できる、たとえば免疫系によって、合成によって、または組換えによって生成されるものなどのタンパク質を示す。抗体は当該技術分野において一般的に公知であり、当該技術分野において公知の方法によって調製できる。
【００５６】
「エピトープ」とは抗体が結合する分子であり、それはポリペプチド中のアミノ酸残基の隣接する配列であってもなくてもよく、他の化学構造を有する糖および／または分子を含んでもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチドの状況における「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを示す。ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ両方のハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当該技術分野において広く公知であり公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣに５０％ホルムアミドを加えたものにおけるハイブリダイゼーションの後に、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣにおける１回またはそれ以上の洗浄が行なわれるものが含まれる。
【００５８】
「リガンド」という用語は、受容体を含む、別の分子に結合する分子を示す。
【００５９】
「宿主細胞」とは、あらゆる組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異および／または変化のために、必ずしも（形態または全体のＤＮＡ相補体が）元の親細胞と完全に同一でないことがある。宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれてもよい。
【００６０】
「試料」とは、患者に由来するあらゆる生体試料である；この用語は、生物学的な流体、たとえば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ、透析液、洗浄液、精液、およびその他の液体サンプルなど、ならびに生体由来の細胞および組織を含むがそれらに限定されない。この用語は細胞またはその細胞に由来する細胞およびその子孫も含み、それは培養物中の細胞、細胞上清および細胞溶解物を含む。この用語はさらに、器官または組織培養由来の流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプル、および生理学的組織から抽出された流体、ならびに固体組織から分離された細胞、組織切片、および細胞溶解物を含む。この定義は、たとえば試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどの特定の成分に対する濃縮などによって、調達後にあらゆる態様で処理されたサンプルを含む。この用語には、患者サンプルの誘導体および画分も含まれる。患者サンプルは、診断、予後またはその他のモニタリングアッセイに用いられてもよい。この用語はまた、ヒト以外の哺乳動物からの生体試料に適用される。試料はヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物からのものであってもよい。
【００６１】
本明細書において用いられる「処置」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療のあらゆる投与または適用を含み、それは、たとえば退縮をもたらすか、または機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復することなどによる疾患の阻害、疾患の進行の阻止、もしくは疾患の緩和；または非効率的なプロセスの刺激を含む。この用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを含み、ヒトを含む哺乳動物における病理学的状態または障害のあらゆる処置を含む。その効果は、障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に防ぐという観点から予防的であってもよく、ならびに／または、障害および／もしくはその障害に起因し得る悪影響に対する部分的もしくは完全な治癒という観点から治療的であってもよい。よって本発明は、処置および予防の両方を提供する。本発明は以下を含む：（１）障害を起こす可能性があるがまだ症状が出ていない対象において、障害の発生または再発を防ぐこと、（２）障害の進行を阻止するなど、障害を阻害すること、（３）障害または少なくともそれに伴う症状を停止または終結させることによって、宿主がもう障害またはその症状に苦しまないようにすること、たとえば、機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復するか、または非効率的なプロセスを刺激することなどによって、障害またはその症状の退縮をもたらすことなど、または（４）障害またはそれに伴う症状を緩和、軽減または改善すること、ここで改善とは広い意味で用いられ、少なくとも、炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの低減を示す。
【００６２】
「医薬的に許容できる担体」とは、あらゆる従来型の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）、調合補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、または賦形剤を示す。医薬的に許容できる担体は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合できる。
【００６３】
本明細書における「組成物」とは、当該技術分野において従来のものであって、かつ治療、診断または予防の目的のための対象への投与に適した、たとえば医薬的に許容できる担体または賦形剤などの担体を通常含有する混合物を示す。医薬組成物は、細胞または培養液中にポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在する細胞培養物を含んでもよい。たとえば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、口腔リンス液、または粉末を形成してもよい。
【００６４】
「疾患」とは、医療介入を必要とするか、または医療介入を行なうことが望ましいようなあらゆる状態、感染症、障害または症候群を示す。こうした医療介入は、処置、診断および／または予防を含み得る。
【００６５】
「癌」とは、あらゆる異常な細胞または組織の成長であり、たとえば悪性、前悪性または良性の腫瘍などである。癌は、細胞の無制御の増殖を特徴とし、それは周囲の組織に侵入することもしないこともあるし、新たな身体部位に転移することもしないこともある。癌は、上皮細胞の癌である癌腫を含む；癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌は、間充織由来の腫瘍である肉腫も含む；肉腫は、骨原性肉種、白血病およびリンパ腫を含む。癌は、１つまたはそれ以上の新生物細胞型を含んでもよい。癌という用語は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【００６６】
「黄斑変性」は、不適切に制御された、漏出性の血管の成長を含み、これらとしては、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げられる。
【００６７】
細胞系
有用な細胞系は、Ａ５４９、ヒト肺扁平上皮癌系、ＣＬ１−５、高転移性ヒト肺腺癌系、Ｈ２３、ヒト肺腺癌系、Ｈ４６０、ヒト肺大細胞癌系、ＰＣ１３、ヒト肺癌系、ＮＰＣ−ＴＷ０１、ヒト上咽頭癌系、ＳＡＳ、ヒト口腔扁平上皮癌系、ＰａＣａ、ヒト膵臓癌、結腸（ＨＣＴ１１６）、乳房（ＢＴ４８３）、前立腺（ＰＣ３）、肝臓（Ｍａｈｌａｖｕ）、ＮＮＭ、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４６０、ＰＣ１３、ＰａＣａ、ＨＣＴ１１６、ＰＣ３、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＡＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ＣＬ１−５およびＮＰＣ−ＴＷ０１細胞系は、それぞれ（Ｃｈｕら、１９９７）および（Ｌｉｎら、１９９０）によって樹立された。
【００６８】
ペプチドの調製
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて発現できる。本発明のペプチドを生産するためには、細胞に基づく方法および無細胞の方法が好適である。一般的に、細胞に基づく方法は、インビトロで宿主細胞に核酸構築物を導入する工程と、発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、次いで培養液もしくは（たとえば、宿主細胞を破壊することなどによって）宿主細胞のいずれかから、またはその両方からペプチドを採取する工程とを含む。本発明は、当該技術分野において周知の無細胞インビトロ転写／翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【００６９】
好適な宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含み、たとえば細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳動物の細胞などを含む。
【００７０】
典型的には、異種ペプチドは、修飾されていても修飾されていなくても、上述のとおりに単独で、または融合タンパク質として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく分泌リーダー配列を含んでもよい。本発明の分泌リーダー配列は、特定のタンパク質をＥＲに向けてもよい。ＥＲは膜結合タンパク質をその他のタンパク質から分離する。一旦ＥＲに局在化されると、タンパク質はさらに、分泌小胞を含む小胞；細胞膜、リソソーム、およびその他の小器官への分配のためにゴルジ体に向けられてもよい。
【００７１】
加えて、ペプチドにペプチド部分および／または精製タグが加えられてもよい。こうした領域は、ポリペプチドの最終的調製の前に取除かれてもよい。ポリペプチドにペプチド部分を付加することによって、特に分泌または排出を誘発したり、安定性を改善したり、精製を容易にしたりすることは、当該技術分野においてよく知られた慣用技術である。好適な精製タグは、たとえばＶ５、ポリヒスチジン、アビジンおよびビオチンなどを含む。ペプチドをビオチンなどの化合物に結合することは、当該技術分野において周知の技術を用いて達成できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて、放射性同位元素、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンにも結合できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｆａｎｏら（２００６）Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２６：７２６−３３）。毒素は当該技術分野において公知のものである。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．７：１３０１−１１（２００６）。
【００７２】
本発明における使用のために好適な融合パートナーは、たとえば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、および／またはそれらの断片の１つもしくはそれ以上などを含む。たとえばポリエチレングリコール結合体などの結合タンパク質も提供される。
【００７３】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて化学的に合成することもできる（例、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５ １１１（１９８４）；Ｇｒａｎｔ編（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．；米国特許第６，９７４，８８４号を参照）。たとえば、ペプチド合成機の使用によって、または当該技術分野において公知の固相法の使用を通じて、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成できる。
【００７４】
さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または追加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、たとえばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など、および一般的なアミノ酸類似体を含むがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｒｙ））またはＬ（左旋性（ｌｅｖｏｒｏｔａｒｙ））であってもよい。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含むがそれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製されてもよい。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。単離および／または精製の際にポリペプチドが変性したときは、タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を用いて活性の立体構造を再生してもよい。
【００７６】
本発明のペプチドまたはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、さまざまな親水性ポリマーの１つまたはそれ以上で修飾するか、またはそれと共有結合させることによって、ペプチドの可溶性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドに結合させるために好適な非タンパク質親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、たとえばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるものなど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体を含むがこれらに限定されない。一般的に、こうした親水性ポリマーの平均分子量は、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトン、約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの範囲である。ペプチドは、以下において示される方法のいずれかを用いて、こうしたポリマーによって誘導化されるか、またはそれらに結合されてもよい（Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：１５０−１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：６２−６９；米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号、またはＷＯ９５／３４３２６号）。
【００７７】
リポソームの調製
リポソームを調製するためのさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、そのいくつかはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３３巻、３３７−４６２（１９８８）に記載されている。以前に記載される薄膜水和反応（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）と、反復押出し（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）との標準的な方法の組合せによって、小単層膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）を調製できる（Ｔｓｅｎｇら、１９９９）。特にリポソームによるＤＮＡの封入を含む調製法、およびリポソーム介在型トランスフェクションへの直接適用を有する方法は、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔら（１９９１）によって記載されている。リポソームを作成する方法は、米国特許第６，３５５，２６７号および米国特許第６，６６３，８８５号にも開示されている。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆位相蒸着法によって生成できる。リポソームを定められたポアサイズのフィルタから押出すことによって、所望の直径のリポソームを得る。
【００７８】
リポソームは、たとえばＴａｉｗａｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔａｉｐｅｉ Ｔａｉｗａｎなどの供給源から商業的に入手することもできる。付加的な商業的に入手可能なリポソームは、ＴＬＣ−Ｄ９９、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｄｏｘｉｌ、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、ＡＢＥＬＣＥＴ、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）、ならびにＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む。
【００７９】
本発明のリポソームは、リン脂質から調製されることが最も多いが、疎水性および親水性部分の両方を有する類似の分子形および寸法のその他の分子が用いられてもよい。本発明の目的に対して、すべてのこうした好適なリポソーム形成分子は、本明細書において脂質と呼ばれる。リポソームの調製には、１つまたはそれ以上の天然に発生する脂質化合物および／または合成脂質化合物が用いられてもよい。
【００８０】
リポソームは、親水性基の選択によって、アニオン、カチオンまたは中性であってもよい。たとえば、リン酸基または硫酸基を有する化合物が用いられるときには、得られるリポソームはアニオンになる。アミノを含有する脂質が用いられるときには、リポソームは正電荷を有し、カチオンリポソームとなる。
【００８１】
本発明において有用な最初のリポソームを形成するための代表的な好適なリン脂質または脂質化合物は、リン脂質関連材料、たとえばホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロールなどを含むが、これらに限定されない。付加的な非リン（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールコハク酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン（正に荷電した）調製物、アニオン（負に荷電した）調製物、および中性調製物を含む。
【００８３】
化合物のリポソーム内への遠隔負荷（ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ）には、膜貫通勾配の形成が用いられる（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ、１９９５）。この方法は、リポソーム内に負荷すべき化合物とボロン酸化合物とを懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内に化合物を蓄積させる工程を含む（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９８；Ｃｅｈ Ｂ．およびＬａｓｉｃ Ｄ．Ｄ．、１９９５；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９８；米国特許第６，０５１，２５１号）。
【００８４】
リン酸塩アッセイを用いてリポソーム濃度を定めてもよい。リン酸塩アッセイの１つは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン色素との相互作用に基づくものである。主要な原理は、無機リン酸塩とモリブデン酸塩とを反応させて無色の非還元リンモリブデン酸塩複合体を形成することを含み、この複合体は酸性条件下で還元されるときに青色の複合体に変えられる。リンモリブデン酸塩はマラカイトグリーンと複合体を形成すると２０倍から３０倍多く発色する。最終生成物である還元された緑色の可溶性複合体は、６２０ｎｍにおける吸光度によって測定され、これは溶液中の無機リン酸塩の直接的な尺度である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、リポソームは、当該技術分野において多様なものが公知である医薬的に許容できる担体、賦形剤および希釈剤を有する処方物中に与えられる。これらの医薬的担体、賦形剤および希釈剤は、ＵＳＰ医薬賦形剤リストにリストされるものを含む。ＵＳＰ ａｎｄ ＮＦ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ、ｐ．２４０４−２４０６、ＵＳＰ ２４ ＮＦ １９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＩＳＢＮ１−８８９７８８−０３−１）。医薬的に許容できる賦形剤、たとえばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、医薬的に許容できる補助的物質、たとえばｐＨ調整および緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、安定剤、湿潤剤などは、一般に容易に入手可能である。
【００８６】
好適な担体は、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または処方物の効果を高めるアジュバントなどの付加的な薬剤を含有してもよい。局所的担体は、液体石油、イソプロピルパルミテート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート（５％）、または水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）を含む。必要に応じて他の材料、たとえば抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定剤、および類似の薬剤などが加えられてもよい。たとえばＡｚｏｎｅなどの経皮浸透促進剤が含まれてもよい。
【００８７】
医薬用量の形において、本発明の組成物は医薬的に許容できる塩の形で投与されてもよく、さらに単独で用いられても、または他の医薬的に活性の化合物との適切な結合および組合せにおいて用いられてもよい。対象組成物は、可能な投与のモードに従って調合される。
【００８８】
処置の方法
治療薬を含む本発明のペプチドまたはリポソームは、全身的な注射、たとえば静脈注射などによって；または関連部位への注射または適用、たとえば腫瘍への直接注射、もしくは手術中にその部位が露出しているときにはその部位への直接適用などによって；または、たとえば皮膚に障害があるときなどには局所適用によって、処置を必要とする対象に投与されてもよい。処置を必要とする被験体は、癌、加齢性黄斑変性、増殖性糖尿病性網膜症および未熟児網膜症のような、新生血管形成を伴う疾患に罹患した被験体を含む。
【００８９】
本発明のペプチドまたはリポソームは、単独療法として用いられてもよい。代替的には、本発明のペプチドまたはリポソームは、癌を処置するための標準的な化学療法または放射線療法あるいは加齢性黄斑変性のような疾患のための療法と組合せて用いられてもよい。
【００９０】
本発明のペプチドは、処置のために抗体を血管系にターゲティングするために用いられてもよい。一実施形態においては、本発明のペプチドが処置を必要とする対象に投与された後に、そのペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。ターゲティングされる抗体は、抗体依存性の細胞毒性または相補体依存性の細胞毒性を媒介してもよく、または標的分子の基礎をなす機能を変更してもよい。こうした抗体は抗体結合体の形で用いられることによって、標的組織に治療効果を有する薬剤を直接送達してもよい。こうした薬剤は、放射性核種、毒素、化学療法薬物、抗ＶＥＧＦアプタマーおよび抗血管新生化合物を含む。
【００９１】
薬剤の投与は、経口、口腔、経鼻、直腸、非経口、腹膜内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、および髄腔内投与などを含むさまざまな方法で、または移植もしくは吸入による別様で達成されてもよい。よって、対象組成物は固体、半固体、液体または気体の形の調製物、たとえば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射薬、吸入剤、およびエアロゾルなどに処方されてもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって、いかなる態様でも限定するものではない。
【００９２】
好適な賦形剤ビヒクル媒体は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ビヒクルは少量の補助的物質、たとえば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などを含有してもよい。こうした投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかになる。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象における所望の状態を達成するために適切な量の薬剤を含有する。
【００９３】
本発明のリポソームまたはペプチドは、水性溶媒または非水系溶媒、たとえば植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどに；所望であれば従来の添加剤、たとえば溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤などとともに、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に処方されてもよい。当該技術分野における従来どおりの、経口または非経口送達のためのその他の処方物が用いられてもよい。
【００９４】
本発明のリポソームまたはペプチドは、癌の処置および血管新生の阻害に用いられてきたさまざまな薬物の１つまたはそれ以上を含んでもよく、その薬物は、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｈｅｃｉｎ）（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（たとえばマイトマイシンＣなど）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、ならびに抗新生物性抗生物質、たとえばドキソルビシンおよびダウノマイシンなど、またはたとえばＤｅ Ｖｉｔａら編、２００１などに記載されるその他のものを含むが、それらに限定されない。リポソームまたはペプチドは、細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子も含んでもよい。リポソームまたはペプチドは、（Ｎｇら、２００６）に記載される抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物も含んでもよい。
【００９５】
癌療法において用いられる薬物は、癌細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制の効果を有してもよく、または悪性細胞の増殖を低減させてもよい。癌処置に用いられる薬物はペプチドであってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、放射線療法と組合されてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、（Ｄｅ Ｖｉｔａら（２００１））に記載される治療アプローチとともに付属的に用いられてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドと第２の抗癌剤とが癌細胞に対して相乗効果を及ぼすような組合せに対しては、第２の薬剤の用量は、第２の薬剤が単独で投与されるときの標準的な用量よりも減らされてもよい。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本発明のリポソームまたはペプチドを、癌細胞の感受性を高めるために有効な量の化学療法の抗癌薬と共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）工程を含む。共投与は同時投与であっても、または非同時投与であってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、処置療法の過程において他の治療薬剤とともに投与されてもよい。一実施形態において、本発明のリポソームまたはペプチドと、他の治療薬剤との投与は連続的である。適切な時間経過は、患者の病気の性質および患者の状態などの因子に従って医師によって選択されてもよい。
【００９６】
診断方法
疾患特異的バイオマーカの検出は、有効なスクリーニング戦略を提供する。早期の検出は早期の診断を与えるだけでなく、癌の場合には多形性をスクリーニングし、手術後の残余腫瘍細胞および潜在性の転移、すなわち腫瘍再発の初期指標を検出することを可能にできる。よって疾患特異的バイオマーカの早期検出は、診断前、処置の最中および寛解期の患者における生存性を改善できる。
【００９７】
本発明のペプチドは、癌および新生血管形成を伴う他の疾患を含む疾患に対する診断または予後として用いられてもよい。ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれらに限定されないいくつかの方法で、診断として用いられてもよい。
【００９８】
本発明の抗体は、血管系を検出するために本発明のペプチドと組合せて用いられてもよい。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、血管マーカに結合した本発明のペプチドと抗体との結合を検出する結合アッセイである。対象ポリペプチドまたは抗体は固定されてもよく、対象ポリペプチドおよび／または抗体は検出可能になるよう標識されてもよい。たとえば、抗体は直接標識されても、または標識された二次抗体によって検出されてもよい。すなわち、抗体に対する好適な検出可能な標識は、目的のタンパク質に対する抗体を標識する直接標識と、目的のタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接標識とを含む。別の実施形態において、ペプチドは標識を含み、ペプチドの組織への結合は標識の存在をアッセイすることによって検出される。
【００９９】
スクリーニング方法
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体リガンドを同定するための方法を提供する。
【０１００】
方法の１つにおいて、本発明のペプチドは、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ、７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）；およびＳｕｔｅｒら（２００６）を参照）における「ベイトタンパク質」として用いられることによって、本発明のペプチドと結合または相互作用する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０１】
別の方法においては、本発明のペプチドが細胞抽出物とともにインキュベートされて、本発明のペプチドに結合する分子が同定される。方法の１つにおいて、本発明のペプチドはＨＰＬＣカラムなどの固体支持上に固定され、本発明のペプチドの標的分子への結合を促進する条件下で細胞抽出物が固定ペプチドに露出される。結合した分子は溶出され、質量分析法などの標準的な技術を通じて同定される。一実施形態において、この細胞抽出物は、ＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣを含む。
【０１０２】
標的タンパク質のアフィニティ精製
肺癌細胞からタンパク質を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、１％のノニデットＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｓ；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって４℃にて３０分間抽出する。１５，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、タンパク質溶解物から．残屑を取除く。溶解物を最初に対照ペプチドを含有する１ｍｌカラム上で予め清澄にし、ＳＰ５−５２またはＳＰ５−２ペプチド固定アフィニティカラムの第２の１ｍｌカラムにフロースルーを直接添加する。カラムを洗浄して溶出する。単離されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）によってモニタし、銀染色によって視覚化する。所望のタンパク質バンドを、トリプシンによるインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）消化のためにゲルから切出す。その結果得られるポリペプチドをさらに質量分析法によって分析する。
【実施例】
【０１０３】
実施例は本発明を純粋に例示することが意図され、したがっていかなる態様でも本発明を制限すると考えられるべきでなく、さらに上記において議論した本発明の詳細な局面および実施形態をも説明するものである。
【０１０４】
実施例１．インビボのファージディスプレイバイオパニングの手順
ＣＬ１−５、Ｈ４６０およびＰＣ３を、２ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を補ったＲＰＭＩ１６４０中で、９５％の空気および５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。ＣＬ１−５はＣｈｕら（Ｃｈｕら、１９９７）によって樹立された。ＳＡＳ、ＨＣＴ１１６、ＢＴ４８３、ＭａｈｌａｖｕおよびＰａＣａを、３．７ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生育し、１０％のＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。胎盤からの分離後の臍静脈からＨＵＶＥＣを単離して、２０％のＦＣＳ、抗生物質、１５μｇ／ｍｌの内皮成長因子（ｕｐｓｔａｔｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）を補ったＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生育し、５％のＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１０５】
腫瘍組織から腫瘍ホーミングファージを単離するために、本発明者らはファージディスプレイペプチドライブラリを用いて、インビボ選択（バイオパニング）の５ラウンドに対してＮＳＣＬＣ（ＣＬ１−５）腫瘍マウスを処置した。４〜６週齢のＳＣＩＤマウスの背外側の側腹部に、ＣＬ１−５細胞を別々に皮下注射して肺癌異種移植片を生成した。サイズを合せたＣＬ１−５由来の腫瘍（約５００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈に、ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）を注射した。８分間のファージ循環後に、マウスをジエチルエーテルで処置してマウスを深い麻酔に導き、５０ｍｌのＰＢＳを灌流させて未結合ファージを洗浄した。器官（肺、心臓、脳など）および腫瘍塊を取出して重量測定し、冷たいＰＢＳで洗浄した。器官および腫瘍サンプルをホモジナイズし、ＥＲ２７３８細菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）によってファージ粒子を回収した。ファージを、１ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌの存在下で寒天プレート上で力価測定した。ＥＲ２７３８培養物中で結合ファージを増幅して力価測定した。回収されたファージを、上述のとおり肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスを用いたバイオパニングの４つの連続するラウンドに供した。第５ラウンドから溶出したファージをＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で力価測定した。腫瘍ホーミングファージクローンの候補をランダムに選択し、細胞ＥＬＩＳＡおよびインビボのホーミング実験によって同定した。
【０１０６】
選択されたファージクローンをＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。精製ファージのＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖終止法に従って決定した。配列決定は、ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’［配列番号１９］によって行なわれた。ファージディスプレイペプチド配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムを用いて翻訳およびアラインメントされた。
【０１０７】
バイオパニングの第５ラウンドの回収率は、第１ラウンドの１５６倍に増加した（図１）。これらの濃縮されたファージをランダムに選択して配列決定した。ＧＣＧソフトウェアを用いて、これら９つは一致する残基のプロリン（Ｐ）を有し、４つのクローン（ＰＣ５−１０、ＰＣ−５３、ＰＣ−５８およびＰＣ−６０）はコンセンサスアミノ酸残基のセリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することが見出され；３つのクローン（ＰＣ５−５、ＰＣ−５２およびＰＣ−５４）はコンセンサスモチーフのプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することが見出された（表１）。本発明者らのファージホーミング系でテストされたコンセンサスペプチドモチーフの中でも、ファージクローンＰＣ５−５２は、インビボのファージディスプレイによって、肺および口腔（ＩＶＯ−２と名付けられた）腫瘍マウスの両方から選択された（表１および図２Ｃ）。２つの異なるヒト癌（肺癌および口腔癌）異種移植片から同じファージクローンが単離されたことから、ＰＣ５−５２に提示されるペプチドは複数の固形腫瘍をターゲティングできることが示される。
【０１０８】
実施例２．異種移植片腫瘍脈管におけるインビボのホーミングおよびペプチド結合
ＰＣ５−５２のターゲティング能力を調べるために、ヒト肺癌細胞由来の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈にファージを注射し、灌流後に回収した。本発明者らは、腫瘍塊および他の正常な器官におけるファージの力価を定めた。ファージクローンまたは対照ヘルパーファージ（挿入なしのファージ）を、ヒト肺癌腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈（ｉ．ｖ．）に８分間または２４時間注入した。灌流後に異種移植片腫瘍および器官を取出し、回収されたファージの力価を測定した。以下に記載するペプチド競合的阻害実験においては、ファージクローンを１００μｇの合成ペプチドと同時注入した。候補または対照のファージクローンの注入後、器官および腫瘍を取出して２つの部分に分割した。１つの部分はＥＲ２７３８によって力価を測定し、別の部分はＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、ＮＬ、ＵＳＡ）に埋め込んだ。ＯＣＴに埋め込んだ冷凍組織を５ミクロンに切断し、冷たいＰＢＳ緩衝液に移した。次いでこの切片をアセトン−メタノール（１：１）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）に１時間浸漬した。次いで、ブロックされたサンプルをラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ラットＡｂ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、Ｃａｎａｄａ）とともにインキュベートし、ローダミン標識されたヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）に浸漬した。スライドをさらにマウス抗Ｍ１３ ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）とともに浸漬した。最後にスライドを洗浄し、封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって封入した。
【０１０９】
本発明者らは、ファージの代りに、ＦＩＴＣ標識された候補ペプチドおよび対照ペプチドも用いた。ペプチド結合アッセイにおいては、腫瘍異種移植片マウスの尾静脈からＦＩＴＣ標識ペプチドを注射した。灌流後、組織を取出して上述のとおりに処理した。次いでＬｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下でスライドを調べた。画像をＳｉｍｐｌｅＰＣＩ（Ｃ−ＩＭＡＧＩＮＧ、ＰＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアによってマージした。
【０１１０】
ＰＣ５−５２は腫瘍塊におけるホーミング能力を示し、腫瘍塊においては脳、肺および心臓を含む他の器官よりも８．０倍から１３５倍高い濃度を示した（図２Ａ）が、対照ヘルパーファージはこうしたホーミング能力を示さなかった（図２Ｂ）。
【０１１１】
ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力は、リガンド競合実験によっても証明された。候補ペプチドＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ（ＳＰ５−５２）および対照ペプチド（ＲＬＬＤＴＮＲＰＬＬＰＹ）［配列番号２０］を合成して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（ＣＡ、ＵＳＡ）により逆相高速液体クロマトグラフィによって＞９５％の純度にまで精製した。同じ会社によってペプチドＮＨ２末端にＦＩＴＣまたはビオチンを付加することによって、これらのペプチドとＦＩＴＣまたはビオチンとの結合を行なった。リガンド競合実験から、合成ＳＰ５−５２ペプチドとＰＣ５−５２ファージ粒子との同時注入が腫瘍組織からのＰＣ５−５２の回収を阻害することが示された（図２Ｂ）。１００μｇのＳＰ５−５２は、ＮＳＣＬＣ腫瘍塊へのＰＣ５−５２ホーミングの９７％を阻害した。同様の結果から、ＩＶＯ−２（ＰＣ５−５２によって提示されるペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドを提示する）も口腔癌異種移植片の腫瘍組織にホーミングすることが示された（図２Ｃ）。ＩＶＯ−２は腫瘍塊におけるホーミング能力を示し、腫瘍においては脳、肺および心臓を含む他の器官よりも１２倍から１２１倍高い濃度を示した（図２Ｃ）。ＩＶＯ−２の腫瘍ホーミング能力はＳＰ５−５２によって阻害できた。１００μｇのＳＰ５−５２の同時注入は、口腔癌異種移植片へのＩＶＯ−２ホーミングの９５．９％を阻害した（図２Ｄ）。対照ペプチドは腫瘍組織へのＩＶＯ−２ホーミングを阻害できなかった（図２Ｄ）。ＰＣ５−５２を２４時間注入した後に、ファージが腫瘍組織中に対照組織よりも１０倍多く蓄積したことも本発明者らは見出した。
【０１１２】
実施例３．ＰＣ５−５２およびＳＰ５−５２の局在化
ＰＣ５−５２のホーミング特異性を調べるために、本発明者らは免疫蛍光アッセイを用いて、灌流後のファージの結合活性を局在化した。上述のとおりにヒト肺腺癌冷凍切片を調製した。スライドをブロッキング緩衝液中で３０分間インキュベートし、次いでメタノール中の３％の過酸化水素と０．１％のＮａＮ３とで処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、ビオチン標識したペプチドとともにインキュベートした。スライドを慣用的な免疫組織化学染色に供した。
【０１１３】
その結果、ファージ粒子は肺癌の異種移植片腫瘍切片とは反応するが、正常な肺組織とは反応しないことが示された（図３Ａ）。しかし、ファージは癌細胞に局在化しなかった。腫瘍塊はパネル（ａ）に示され、正常な肺はパネル（ｃ）に示される。パネル（ｂ）および（ｄ）はＨ３３２５８によって核ＤＮＡを対比染色したものであり、それぞれパネル（ａ）および（ｃ）に対応する。抗Ｍ１３ ｍＡｂ（緑）およびマウス内皮細胞マーカＣＤ３１（赤）とともにインキュベートされた腫瘍組織からの冷凍切片を用いたとき、異種移植片腫瘍組織の腫瘍血管系においてＰＣ５−５２がＣＤ３１と共存することを本発明者らは見出した（図３Ｂ）。正常な心臓（図３Ｂ）、肺および脳の脈管にはファージは見出されなかった。ファージ注射後の腫瘍血管系内皮における抗ファージ免疫蛍光と抗ＣＤ３１との共存は、パネル（ｉ−ｋ）に示される。対照ファージは腫瘍脈管に結合できない（ａ）のに対し、ＰＣ５−５２は正常な心臓を認識できない（ｅ）。抗ＣＤ３１は心臓脈管（ｆおよびｇ）ならびに異種移植片腫瘍脈管（ｂ、ｃ、ｊおよびｋ）において示される。核染色は（ｄ、ｈおよびｌ）に示される。
【０１１４】
腫瘍血管系へのファージディスプレイペプチドホーミングをさらに調べるために、本発明者らはＰＣ５−５２ファージの代わりにＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドを用いてペプチドホーミング研究を行なった。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドも、肺癌異種移植片の腫瘍血管系においてマウスＣＤ３１マーカと共存することを本発明者らは見出した（図３Ｃのｉ−ｌ）。このペプチドは心臓脈管と反応しなかった（図３Ｃのｅ−ｈ）。ＦＩＴＣ標識された対照ペプチドは腫瘍血管系を認識できなかった（図３Ｃのａ−ｄ）。ローダミン−抗ＣＤ３１は、ヒト肺癌異種移植片（ｂおよびｊ）ならびに正常な心臓（ｆ）において示される。Ｈ３３２５３による核染色は（ｄ、ｈおよびｌ）に示される。（バー、２０μｍ）。
【０１１５】
実施例４．複数の癌異種移植片へのＰＣ５−５２の結合、およびＰＳＰモチーフの調査
本発明者らは、インビボのファージディスプレイによって、肺癌および口腔癌の異種移植片から腫瘍ホーミングファージＰＣ５−５２を単離した。これらの結果は、ＳＰ５−５２の標的が固形腫瘍の血管系において発現されている可能性があることを示すものである。この仮説を検証するために、本発明者らは、ヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、前立腺癌（ＰＣ３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）の異種移植片を含む、ヒト癌の別の６つの異なるタイプにおけるＰＣ５−５２のホーミング能力を調べた。ＳＣＩＤマウスにＰＣ５−５２を静脈内注射した。８分後に、ＰＢＳ緩衝液による灌流によって遊離ファージを洗い出し、異種移植片腫瘍塊を取出してファージ力価を定めた。これらのヒト癌異種移植片のすべてにおいて、ＰＣ５−５２は腫瘍組織をターゲティングしたが、脳、肺および心臓などの正常な器官はターゲティングしなかった（図４）。このターゲティングリガンドを有さない対照ファージにはこうしたホーミング能力はなかった。
【０１１６】
インビボのファージディスプレイより、３つのクローン（ＰＣ５−５、ＰＣ５−５２およびＰＣ５−５４）によって提示されるペプチドがコンセンサスモチーフのプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することを本発明者らは見出した（表１）。これら３つのアミノ酸残基は腫瘍組織へのホーミングにおける役割を有するのではないかと本発明者らは提案した。この仮説を検証するために、本発明者らはＳＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ）中のこれら３つのアミノ酸残基を、変異ペプチドＭＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＧＧＧＲＰ）（配列番号２０）においてＧＧＧに変えた。インビボのホーミングアッセイにおいて、腫瘍ホーミングファージＰＣ５−５２はＣＬ１−５由来の腫瘍にターゲティングできた（図４Ｂ）。ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力は、ＳＰ５−５２によって顕著に阻害されたが、ＭＰ５−５２の変異ペプチドには阻害されなかった（図４Ｂ）。
【０１１７】
実施例５．ＰＣ５−５２は刺激されたＨＵＶＥＣと反応し、ＳＰ５−５２はヒト肺癌生検試料に結合する
このファージがヒトの新生血管系内皮に対する親和性を有するかどうかをさらに確認するために、本発明者らはＶＥＧＦ刺激されたヒト脈管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にＰＣ５−５２ファージ粒子を適用した。ＨＵＶＥＣをカバーガラス上に蒔いて、約８０％集密になるまで生育した。細胞をＶＥＧＦ（Ｂ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）およびｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、Ｌａｎｄｏｎ、ＵＫ）で４８時間前処理した。ＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣを無血清Ｍ１９９で洗浄し、ブロッキング緩衝液（無血清Ｍ１９９に３％のＢＳＡを加えたもの）の中で４℃にて３０分間インキュベートした。次いでカバーガラスをファージとともに４℃にて１時間インキュベートし、洗浄して、３％のホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いでカバーガラスをマウス抗Ｍ１３ ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに１時間インキュベートした後に、ＦＩＴＣ標識した抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、次いでＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８とともに浸漬した。最後にカバーガラスを洗浄し、封入剤によって封入した。
【０１１８】
その結果、ＰＣ５−５２はＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣに結合することが明らかになった（図５Ａのａ）。ＶＥＧＦ刺激なしのＨＵＶＥＣにおいては、ＰＣ５−５２の結合は観察されなかった（図５Ａのｂ）。このペプチドを有さない対照ファージは結合活性を示さなかった（図５Ａのｃ）。さらに、ビオチン標識されたＳＰ５−５２ペプチドは、ヒト肺癌生検試料の腫瘍脈管に結合できたが、対照の肺の非腫瘍脈管には結合できなかった（図５Ｂ）。これらのデータから、ＳＰ５−５２はヒト血管新生内皮細胞および腫瘍新生血管系における未知の受容体を認識したことが示される。
【０１１９】
ファージの腫瘍脈管への結合が提示ペプチドに媒介されたものかどうかを定めるために、ＨＵＶＥＣ結合研究におけるファージの代わりにＦＩＴＣ標識したペプチドを用いる。カバーガラス上のＨＵＶＥＣを、ＦＩＴＣ標識したペプチドまたは対照ペプチドとともに２時間インキュベートする。次いでカバーガラスを洗浄してＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８とともに浸漬し、次いで洗浄して封入剤によって封入し、Ｌｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下で調べる。
【０１２０】
実施例６．ドキソルビシンを含有するリポソーム−ペプチドの調製および動物モデルの処置
腫瘍脈管ホーミングペプチドのＳＰ５−５２を用いて癌化学療法の治療効果を改善できるかどうかを定めるために、本発明者らはドキソルビシンを含有するリポソームにＳＰ５−５２を結合し（ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）、異種移植片を有するマウスをこのリポソームで処置した。
【０１２１】
ドキソルビシンを含有するリポソームの調製の手順は、過去の報告（Ｌｅｅら、２００４；Ｔｓｅｎｇら、１９９９）において公開される方法から適合した。簡単に述べると、Ｌ−ペプチドをＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−カルボキシル−ポリエチレングリコール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ；平均分子量、３０００）由来のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）］に１：１．５のモル比で結合した。この結合は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを生成するためのペプチドのＮ末端の固有な遊離アミン基を用いて行なった。この反応は完了し、残りのアミノ基の定量化によって確認された。アミノ基はＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホネート（Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））試薬によって測定された（ＡＦＳＡ、１９６６）。
【０１２２】
ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなるリポソームを硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ＝５．０、５３０ｍＯｓ）中で５５℃にて水和し、６０℃にて高圧押出し装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて０．１μｍおよび０．０５μｍのポアサイズのポリカーボネート膜フィルタ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から押出した；ドキソルビシンを、１０μｍｏｌのリン脂質当り１ｍｇのドキソルビシンの濃度で、遠隔負荷法によってリポソームに封入した。リン酸塩アッセイによってリポソームの最終濃度を定めた。０．２ｍｌの希釈薬物負荷リポソームに１ｍｌの酸性イソプロパノール（８１ｍＭのＨＣｌ）を加えた後、励起波長として４７０ｎｍを用い、放出波長として５８２ｎｍを用いる分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって、リポソームの内側に閉じ込められたドキソルビシンの量を定めた。サブミクロン粒子分析計（モデルＮ４プラス；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）による動的レーザ散乱によって、小胞サイズを測定した。調製後のリポソームは、リン脂質１μｍｏｌ当り１１０μｇから１３０μｇのドキソルビシンを含有し、直径６５ｎｍから７５ｎｍの範囲の粒子サイズを有した。比較のために、同じ方法を用いてＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥに対照ペプチドを結合したものを調製した。脂質二重層の遷移温度を超える温度でともにインキュベートした後に、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを予め形成されたリポソームに移した（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７）。以前に記載されたとおりに算出したところ（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９７）、リポソーム当り３００〜５００個のペプチド分子があった。
【０１２３】
ヒト肺癌（ＣＬ１−５）および口腔癌（ＳＡＳ）異種移植片をＳＣＩＤマウス中で確立した。４〜６週令のマウスの背外側の側腹部に、ヒト癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた腫瘍（腫瘍サイズ約１００ｍｍ３）を有するマウスを異なる処置群にランダムに割当てて、尾静脈を通じて、複数用量（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）のＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘによって処置した。対照群には、ＰＢＳをＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘと同じ体積およびスケジュールで静脈内投与した。マウスの体重および腫瘍サイズをノギスで週２回測定した。腫瘍体積は次の式を用いて算出した：体積＝長さ×（幅）２×０．５２。平均腫瘍体積の差をＡＮＯＶＡによって評価した。
【０１２４】
ＣＬ１−５由来の腫瘍（腫瘍サイズ約１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウスをランダムに３つの群に分けて、静脈を通じて、合計ドキソルビシン用量が７ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）のＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳで処置した。ＳＰ５−５２ペプチド−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスは、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＰＢＳで処置した場合よりも有意に小さい腫瘍サイズを示した（Ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ｄａｙ２８までにＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも１．９倍大きくなった。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも４．１倍大きかった。ターゲティングリポソームの治療効果をさらに特徴付けるために、本発明者らはＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳによって別々に処置した後の動物の生存率を比較した。ｄａｙ８１に実験を終了したとき、ＰＢＳおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群ではすべての動物（ｎ＝６）が死亡し（生存率０％）、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群では２匹の動物のみが死亡した（生存率６６．７％）（図６Ｂ）。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置マウスにおいては腫瘍脈管が顕著に減少し損傷していることも本発明者らは見出した（図６Ｃ）。
【０１２５】
ＳＰ５−５２が口腔癌に対する治療効果を増加できるかどうかをテストするために、本発明者らは動物モデルにおけるこの癌に対するリガンド標的療法も開発した。ターゲティングリポソームで処置したＳＡＳ由来口腔癌を有するＳＣＩＤマウスにおいても同様の結果が見出された。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳによる処置を、合計ドキソルビシン用量が７ｍｇ／ｋｇ（７回、１ｍｇ／ｋｇ、週２回）で静脈内投与した。ＳＰ５−５２ペプチド−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスは、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＰＢＳで処置したマウスよりも有意に小さい腫瘍サイズを示した（Ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ｄａｙ２４．５にはＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも３．６倍大きくなった。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも７．１倍大きいことが見出された（図６Ｄ）。さらに、ｄａｙ６０に実験を終了したとき、ＰＢＳ処置の群ではすべての動物（ｎ＝６）が死亡し（生存率０％）、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群では４匹の動物が死亡した（生存率３３．３％）のに対し、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群はすべてが生存した（生存率１００％）（図６Ｅ）。本発明者らはこの実験を再び繰り返し、その結果、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘはＬｉｐｏ−Ｄｏｘよりも口腔癌異種移植片の処置に効果的であることがさらに確認された。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも３．２倍大きくなった。対照ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも５．９倍大きいことが見出された。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘをターゲティングリガンドＳＰ５−５２に結合することによって、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト肺癌および口腔癌異種移植片を含む固形腫瘍異種移植片を阻害する薬物の能力が高められることが示される。
【０１２６】
表１．肺癌異種移植片から選択されたファージディスプレイペプチド配列のアラインメント
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
ａファージディスプレイされるコンセンサスアミノ酸配列を太字体で示す。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／９００，９８０号および２００７年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０８６号ならびに２００７年４月１３日に出願された米国特許出願第１１／７８３，９２６号（これらは全て、それらの全体が参考として援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍発達の間に、腫瘍細胞は老廃物を除去するためにより多くの酸素および代謝産物を必要とする。加えて、宿主脈管系への接近および腫瘍血液供給の生成は、腫瘍発達にとっての律速段階である（Ｂｅｒｇｅｒｓら、２００３）。同様に、加齢性黄斑変性などの疾患は、新たな血管の生成を伴う。（Ｎｇら、２００６）。よって、腫瘍血管は腫瘍成長を阻害するための主要な標的であり、加齢性黄斑変性に伴う血管はこの疾患を阻害するための好適な標的である。腫瘍血管は、正常な組織の血管に存在しない特異的マーカを発現する。これらの特異的マーカの多くは、腫瘍が誘導する血管新生、すなわち新たな血管の発芽に関連するタンパク質である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２）。細胞接着受容体のインテグリンαｖβ３およびαｖβ５は、腫瘍血管系中で過剰発現する（ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ、１９９９）。確かに、腫瘍ホーミングまたはターゲティングに対するインビボのファージディスプレイによって同定されたＲＧＤペプチドの１つはαｖβ３を認識する（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。これらのインテグリンに対して特異的なペプチドは、抗癌剤および抗血管新生剤のターゲティングによる送達のためのリガンドとして使用されてきた（Ａｒａｐら、１９９８）。血管系の不均一性は、ターゲティングによる治療法の送達に対する新たな機会を与えるかもしれない。
【０００３】
従来の化学療法は、その正常な組織に対する毒性によって制限される。もし化学療法薬物を腫瘍部位または腫瘍脈管に直接結合させて正常な組織から離すことができれば、治療結果は大きく改善されるだろう。大部分の小分子化学療法薬剤は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ：ｉ．ｖ．）投与における大量の分配を有する（Ｓｐｅｔｈら、１９８８）。この分配によって、正常な組織への高レベルの毒性のために治療指数がしばしば小さくなる。薬物をリポソームなどの高分子担体に封入することによって、分配の体積が顕著に低減され、腫瘍における薬物の濃度が増加する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）。封入によって、非特異的毒性の重篤度およびタイプを減少でき、腫瘍部位に有効に送達される薬物の量を増加できる（ＧａｂｉｚｏｎおよびＭａｒｔｉｎ、１９９７；Ｍａｒｔｉｎ、１９９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１）。腫瘍ターゲティングリガンドを用いて、リポソームなどの高分子担体を腫瘍部位にターゲティングできる。代替的には、薬物を腫瘍ターゲティングリガンドに結合または連結させることによって、薬物の腫瘍へのターゲティングを促進できる。
【０００４】
リポソームは、癌化学療法における薬物担体として提案された（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９７４）。そのとき以来、リポソームに対する関心は増加し、リポソーム系は現在薬物担体として広範囲に研究されている。薬物を特異的に送達するのに使用するために、リポソームには以下の３つの基本的要求が望まれる：（ｉ）血液循環を長くすること、（ｉｉ）腫瘍または他の標的組織における十分な蓄積、（ｉｉｉ）薬物の薬力学に適合する放出プロファイルを有しながら、制御された薬物放出および腫瘍細胞または他の標的組織による取込みが行なわれること。
【０００５】
最初、リポソーム薬物送達系の研究は、細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）による非常に速い血液クリアランスに苦しめられた。粒子サイズ、表面電荷（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９８４）、およびリポソーム組成物は、クリアランスプロファイルに対する影響が強い（例、ホスファチジルイノシトールまたはモノシアロガングリオシドの組込みによって、血液中のリポソーム循環が長くなる）ことが確認された（ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｎｎ、１９８７；ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８；Ｓｅｎｉｏｒ、１９８７）。漏出性毛細血管を介して優先的に循環から出て、広範囲の新血管新生を示す腫瘍に蓄積してより高濃度となり、効能を高めると予測される「ステルス」リポソームによって、この取込みは回避され得る（Ｗｕら、１９９３）。
【０００６】
しかし、合成ポリマーポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）で被覆されたリポソームが血中の半減期を有意に増加させることが発見されたときには、リポソームは単に良好な薬物送達候補としてのみ認識されていた（Ａｌｌｅｎら、１９９１；ＢｌｕｍｅおよびＣｅｖｃ、１９９０；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１；Ｓｅｎｉｏｒら、１９９１）。このペグ化リポソームは、リポソームのタンパク質吸着およびオプソニン作用を阻害する高度に水和し保護されたリポソーム表面のために、長く循環する（ＷｏｏｄｌｅおよびＬａｓｉｃ、１９９２）。速いオプソニン作用およびクリアランスの問題を解決して、血中で最大７２時間の半減期を有するリポソームを提供する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、１９９９）と、次の挑戦事項は能動的ターゲティングによって腫瘍組織または他の疾患組織内にリポソームを蓄積させることだった。
【０００７】
ターゲティングリポソームの使用によって、腫瘍標的部位における薬物放出を有意に高め、治療効果を増加できる可能性があり得る（非特許文献１；非特許文献２）。薬物送達研究分野では、腫瘍組織内で蓄積する長く循環するリポソームの構築に成功しており、閉じ込められた薬物は、能動的なトリガが存在しない限り、次いで受動拡散によってリポソームの外に漏出する。疾患組織に特異的に薬物を放出できる部位特異的トリガの使用は、腫瘍標的部位における薬物の生物学的利用率を増加させる方法の１つである。薬物の生物学的利用率を最適化する別の方法は、能動的ターゲティングによってより高程度のリポソーム蓄積を得ることである。さらに、能動的ターゲティングと能動的トリガとの組合せによって、腫瘍標的部位における有意に高められた特異的な薬物放出をもたらし得る可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
ヒトの癌の９０％より多くを含む固形悪性腫瘍に対しては、免疫結合体が腫瘍組織に侵入できないため、腫瘍特異的な抗原を認識する抗体が薬物送達に与える有用性はほとんどなかった（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１；Ｓｈｏｃｋｌｅｙら、１９９１）。しかし、過去１０年間のファージディスプレイペプチドライブラリの発達は、抗体よりも有効な小さいペプチドを同定する機会をもたらした。
【０００９】
ファージディスプレイのランダムペプチドライブラリは、Ｂ細胞エピトープ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、１９９７；Ｆｕら、１９９７；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０；Ｗｕら、２００１；Ｗｕら、２００３）およびタンパク質−タンパク質接触（Ａｔｗｅｌｌら、１９９７；Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｎｏｒｄら、１９９７；Ｓｍｉｔｈら、１９９９）をマッピングする機会、受容体（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｌｉら、１９９５；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）またはタンパク質（Ｂｏｔｔｇｅｒら、１９９６；Ｃａｓｔａｎｏら、１９９５；ＤｅＬｅｏら、１９９５；Ｋｒａｆｔら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）に結合する生理活性ペプチドを選択する機会、疾患特異的な抗原模倣（Ｆｏｌｇｏｒｉら、１９９４；Ｌｉｕら、２００４；Ｐｒｅｚｚｉら、１９９６）を探索する機会、ならびに細胞特異的ペプチド（Ｂａｒｒｙら、１９９６；Ｌｅｅら、２００４；Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、１９９９）および器官特異的ペプチド（Ａｒａｐら、１９９８；ＥｓｓｌｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）を定める機会を与える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４，８００２〜８００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）８，１１７２−１１８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特定の標的組織に対してファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることは、薬物、遺伝子送達ベクターまたはその他の治療薬剤のターゲティングに用いられるペプチド配列の同定における直接的かつ迅速な方法となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はとりわけ、以下のものを単独または組合せて含む。
【００１３】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよびその変異体を提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８を含むペプチドおよびその変異体を提供する。一実施形態において、ペプチドは配列番号２またはその変異体である。別の実施形態において、ペプチドは配列番号２である。別の実施形態において、ペプチドは融合タンパク質を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む。別の実施形態において、ペプチドは１つまたはそれ以上の薬物に結合される。ペプチドに結合され得る薬物はドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含んでもよい。
【００１５】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される本発明のペプチドまたはその変異体に結合する抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むリポソームを提供する。一実施形態において、リポソームは配列番号２またはその変異体を含む。別の実施形態において、リポソームは配列番号２を含む。リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物を含んでもよい。一実施形態において、使用され得る薬物のうちの１つは、リン脂質１μｍｏｌ当り約１１０μｇから約１３０μｇの量であり得るドキソルビシンである。ある実施形態において、リポソームは約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有する。別の実施形態において、リポソーム当りのペプチド分子の数は約３００から約５００である。リポソームは医薬的に許容できる担体を含んでもよい。
【００１７】
本発明は、処置を必要とする対象に本発明のペプチドを投与する工程を含む、疾患を処置する方法を提供し、前記ペプチドは薬物に結合される。ペプチドに結合され得る薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子を含む。
【００１８】
本発明は、１つまたはそれ以上の薬物と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群より選択されるより多くもしくはそれ以上のペプチド、またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含む、疾患を処置する方法を提供する。この方法は、１つまたはそれ以上の薬物と、配列番号２またはその変異体とを含むリポソームを対象に接触させる工程を含んでもよい。リポソームは１つまたはそれ以上の化学療法薬物を含んでもよい。治療薬物はドキソルビシンであってもよい。この方法は癌を処置するために用いられてもよく、癌は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌からなる群より選択される癌を含んでもよい。実施形態の１つにおいて、癌は肺癌である。別の実施形態において、癌は口腔癌である。この方法は、加齢性黄斑変性を処置するために用いられてもよい。
【００１９】
本発明は新生血管系を検出する方法を提供し、この方法は、ペプチドが新生血管系に結合できる条件下で、試料を本発明のペプチドに接触させる工程と、そのペプチドを検出する工程とを含む。ペプチドは、そのペプチドに対する抗体によって検出されてもよい。ペプチドはエピトープを含む融合タンパク質を含んでもよく、この融合タンパク質はエピトープに対する抗体によって検出される。ペプチドは標識を含んでもよく、このペプチドの標識を検出することによってペプチドが検出される。実施形態の１つにおいて、標識はＦＩＴＣを含む。別の実施形態において、標識はビオチンを含む。
【００２０】
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体分子を同定する方法を提供し、この方法は、ペプチドとリガンドとを含む複合体を形成できる条件下で本発明のペプチドを細胞抽出物に接触させる工程と、その複合体を分析してリガンドを同定する工程とを含む。
【００２１】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インビボのファージディスプレイによる、肺癌ターゲティングファージの選択を示す図である。
【図２Ａ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｂ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｃ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図２Ｄ】腫瘍ホーミングファージの特異性を示す図である。
【図３】（Ａ）ヒト肺への静脈内注射後のＰＣ５−５２ファージの免疫蛍光局在化を示す図である。（Ｂ）肺癌異種移植片の腫瘍脈管へのファージ結合の調査を示す図である。（Ｃ）ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドと肺癌異種移植片の腫瘍脈管との結合を示す図である。
【図４Ａ】異なるヒト癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスからの腫瘍ターゲティングファージＰＣ５−５２の回収を示す図である。
【図４Ｂ】異なるヒト癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスからの腫瘍ターゲティングファージＰＣ５−５２の回収を示す図である。
【図５】（Ａ）ターゲティングファージがＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣと反応することを示す図である。（Ｂ）肺腺癌試料におけるビオチン標識されたＳＰ５−５２ペプチドの免疫組織化学的局在化を示す図である。
【図６Ａ】ヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【図６Ｂ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたヒト肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す図である。
【図６Ｃ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置されたマウスにおける腫瘍脈管の減少および損傷を示す図である。
【図６Ｄ】口腔癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【図６Ｅ】ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる口腔癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す図である。
【図７】さまざまなヒト癌の異種移植片を有するＳＣＩＤマウスのＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘによる処置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
表の簡単な説明
表１は、肺癌異種移植片から選択されたファージからのファージディスプレイペプチド配列を提供する。
【００２６】
癌の化学療法のほとんどは、強力な副作用および薬剤耐性の獲得を伴う。したがって当該技術分野においては、薬物を腫瘍脈管上だけでなく腫瘍細胞上の標的部位にも送達する薬物送達系が必要とされている。いくつかの試みの中には、腫瘍組織に対する１本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ｓｃＦｖ）抗体（Ｐａｒｋら、２００２）およびターゲティングペプチド（Ｌｅｅら、２００４）の使用が含まれる。最近、脈管ターゲティングが注目を集めている。なぜなら、特定の薬物または薬物担体は腫瘍の血管外遊出よりも前にまず血管系に出会うためである（Ｏｋｕら、２００２）。その概念は、血管新生が腫瘍形成の際の拡張に必要な工程だということである。同様に、血管新生は加齢性黄斑変性などの疾患を伴う。（Ｎｇら、２００６）。腫瘍血管系は正常な血管系とは異なる固有なマーカを発現する（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３）ため、これらのマーカに基づくターゲティングは癌処置に対する有望な戦略である。これらの抗血管新生療法は、効果が高く毒性が低い見込みがある。さらに、ターゲティングリガンドの親和性に基づく化学療法薬物の腫瘍組織への送達は、高い腫瘍間質液圧および薬物耐性に起因する癌治療法の障害を克服するものである。開示されるペプチドはリガンド標的療法に用いることができ、したがってこのペプチドは従来の抗癌薬よりも治療効果を改善する新たな処置に対する基礎を提供する。
【００２７】
インビボのファージディスプレイを用いて、腫瘍血管に特異的にホーミングするペプチドを同定した。表１。この出願において、「ホーミングする（ｈｏｍｅ）」、「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」、「標的（ｔａｒｇｅｔ）」および「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」という用語は相互交換可能に用いられる。ＳＰ５−５２という１つのペプチド、ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ［配列番号２］のさらなる研究から、彼のペプチドは、ヒト腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の血管系は認識するが正常な血管は認識しないことが明らかになった。ＳＰ５−５２は、動物モデルにおける複数の腫瘍からの異種移植片の腫瘍脈管だけでなく、ＶＥＧＦ刺激されたヒト脈管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺癌からの血管にも特異的に結合できることが発見された。加えて、ＳＰ５−５２ペプチドに結合された、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を有するリポソーム（ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト癌異種移植片に対する薬物の効果を高めた。これらの研究から、ＳＰ５−５２ペプチドは複数の腫瘍の血管系に特異的に結合できて、固形腫瘍を標的とする薬物送達に対する良い候補であることが示される。ＳＰ５−５２およびその他のペプチドは、腫瘍血管系のターゲティングに有用である。
【００２８】
本発明者らの研究において、インビボのバイオパニングの第５ラウンドからのファージは、肺癌異種移植片との結合活性が最初のファージライブラリのものより１５６倍高かった（図１）。特定のファージクローンは、プロリン−セリン−プロリン（ＰＳＰ）というコンセンサスペプチドモチーフを提示した（表１）。別個のインビボファージディスプレイ実験において、本発明者らはＩＶＯ−２と名付けられたファージクローンを同定し、これは口腔癌異種移植片の腫瘍組織にホーミングした。ＩＶＯ−２もＰＣ５−５２と同じアミノ酸配列を提示することを本発明者らは定めた。
【００２９】
インビボのホーミング実験から、ＰＣ５−５２は肺癌および口腔癌の異種移植片からの腫瘍組織の脈管には特異的に結合できるが、他の正常な器官、たとえば肺、心臓および脳などには結合できないことが示された（図２および図３）。ペプチド競合的阻害アッセイが行なわれたとき、ＰＣ５−５２と腫瘍組織との結合活性は、合成ペプチドＳＰ５−５２によって阻害された（図２Ｂおよび図２Ｄ）。これらの結果は、この合成ペプチドがそれぞれのファージクローンと同じ結合部位に結合することを示唆する。
【００３０】
腫瘍塊および正常な器官におけるホーミングファージの局在化を調べるために、肺癌のＳＣＩＤマウスにＰＣ５−５２を静脈内注射し、次いでこれらのマウスからの冷凍切片を、抗マウスＣＤ３１および抗Ｍ１３ ｍＡｂを用いた二重局在化に供した。その結果、ＣＤ３１およびファージ粒子はほとんどの異種移植片脈管内皮に共存しており、腫瘍細胞およびその他の正常な器官においては稀であることが明らかになった（図３）。これらの結果から、ＰＣ５−５２は腫瘍血管系の内皮細胞を特異的にターゲティングできるが、腫瘍細胞または正常な器官の血管はターゲティングできないことが示された。
【００３１】
本発明者らは調査を拡大して、ＰＣ５−５２が他のヒト腫瘍細胞、たとえばヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、前立腺癌（ＰＣ３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）細胞などに由来する異種移植片の血管系にも結合できるのかどうかを調べた。その結果、異なる癌細胞系からのこれらの異種移植片腫瘍組織は、正常な器官よりもＰＣ５−５２のタイターが高い（正常な器官に比べて１０倍より多い）ことが示された（図４）。これらのデータから、ＰＣ５−５２は８つの異なるタイプのヒト癌異種移植片からの腫瘍組織に対して、より高い結合親和性を有することが示される。この現象は、固形腫瘍の血管系が、ＳＰ５−５２ペプチドによって認識され得る未知の普遍的受容体を発現している可能性を示唆するものである。ＰＣ５−５２ファージおよびＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドはどちらも異種移植片における腫瘍脈管内皮には特異的に結合できたが、正常な血管には結合できなかったという本発明者らの実証（図３）は、この可能性をさらに支持する。
【００３２】
コンセンサスモチーフであるプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）は、表１に示される３つのクローンＰＣ５−５、ＰＣ−５２およびＰＣ−５４の提示ペプチドに存在し、このコンセンサスモチーフの役割を調べるために、本発明者らはＳＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ）中のこれら３つのアミノ酸残基を、変異ペプチドＭＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＧＧＧＲＰ）［配列番号２０］においてＧＧＧに変えた。図４Ｂに示されるとおり、ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力はＳＰ５−５２によって顕著に阻害されたが、変異ペプチドＭＰ５−５２には阻害されなかった（図４Ｂ）。
【００３３】
ヒトの癌治療法に対するＳＰ５−５２の適用可能性を評価するために、本発明者らは、ネズミ血管新生モデルにおいて選択されたペプチドがヒト腫瘍の血管系内皮に対する結合親和性を有するかどうかを調べた。本発明者らは、このペプチドがＶＥＧＦ刺激された内皮細胞およびヒト肺癌生検試料に特異的に結合できることを確認した（図５）。本発明者らの結果から、ヒト肺癌または他の癌に対するリガンド標的療法の開発に対するターゲティングリガンドとしてＳＰ５−５２を用いることができることが示される。
【００３４】
本発明者らはＳＰ５−５２に結合したリポソームを調製して、ＳＰ５−５２およびドキソルビシンを含むリポソーム、すなわちＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘと、ドキソルビシンを含むリポソーム、すなわちＬｉｐｏ−Ｄｏｘとが腫瘍成長に与える影響を比較した。その結果、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘはヒトの肺癌および口腔癌異種移植片の両方に対する薬物の効果を高めることが明らかになった（図６Ａおよび図６Ｄ）。さらに、このターゲティングリポソームはこれら２つのヒト癌動物モデルの生存率をも有意に増加した（図６Ｂおよび図６Ｅ）。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置によって、腫瘍血管系は破壊されて顕著に減少した（図６Ｃ）。
【００３５】
ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘが他の固形腫瘍に対する治療効果も高めることができるかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）を含む５タイプのヒト癌からの異種移植片を有するマウスを処置した。興味深いことに、ターゲティングリポソームＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘは、これら５つのヒト癌に対する治療効果の増加を示した（図７）。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘをペプチドＳＰ５−５２に結合させることによって、薬物がヒト固形腫瘍異種移植片を阻害する能力が高められることが示された。
【００３６】
よって、本明細書に記載されるものを含むこれらの新たなターゲティング戦略は、癌処置を顕著に改善する可能性を有する。
【００３７】
腫瘍血管系は、一般的に安定で薬物耐性をほとんどまたはまったく誘導しない非悪性の内皮細胞からなっているために、癌治療法に対する特に好適な標的である（Ｂｏｅｈｍら、１９９７）。加えて、これらの細胞は薬物にもっと接近でき、固有の増幅機構を有する。１個の内皮細胞の除去によって１００個の腫瘍細胞の生育を阻害できると見積もられている（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９４；Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９９３）。本発明者らの結果から、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置によって、腫瘍血管系は破壊されて顕著に減少することが証明された（図６Ｃ）。これらのデータは、このターゲティングリポソームが異種移植片動物モデルにおける化学療法の効果を改善することを明らかに示すものである。この効果は、ターゲティングリポソームが腫瘍組織内に蓄積することによるものかもしれない。固形腫瘍の腫瘍間質液圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＦＰ）が高いことは、効率的な薬物送達にとって障壁である（Ｈｅｌｄｉｎら、２００４）。ＩＦＰが増加すると、腫瘍内の経毛細管輸送が減少するために薬物の吸収が減少し、その結果治療法が最終的に失敗となる。これらの現象には、薬剤耐性および転移性疾患の発達が伴う（Ｂｏｕｃｈｅｒら、１９９０；Ｂｏｕｃｈｅｒら、１９９１；Ｇｕｔｍａｎｎら、１９９２；Ｈｅｌｄｉｎら、２００４；Ｌｅｓｓら、１９９２）。本明細書に記載されるような効果的なリガンド標的療法は、リガンドの親和性を利用して抗癌薬を腫瘍組織に運ぶものであり、腫瘍のＩＦＰが高くても薬物の蓄積を増加させることによって機能する可能性がある。
【００３８】
インビボのファージディスプレイを用いて腫瘍内皮細胞の分子上のターゲティングリガンドを単離することにより、本発明者らはＰＣ５−５２を含むいくつかのペプチドを同定し、これらのペプチドは２つのＮＳＣＬＣおよび６つのヒト腫瘍異種移植片における血管系を標的とする。このペプチドを介してターゲティングされたリポソームは、リポソームの治療効果を高めて、ヒトの肺癌および口腔癌異種移植片を有するマウスの生存率を増加させた。ＳＰ５−５２は固形腫瘍の血管系への薬物送達に対する優れた薬剤であり、臨床的な癌処置に適用可能である。
【００３９】
参考文献
【００４０】
【化１】
【００４１】
【化２】
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【００４４】
【化５】
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
定義
本明細書において用いられる用語は以下に示すとおりの通常の意味を有し、明細書の文脈においてさらに理解されてもよい。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合形をいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体もしくは誘導体を含有し得る。この用語は、変異体を含む。変異体は、挿入、付加、欠失または置換を含み得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列は５’から３’の方向にリストされる。
【００４９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において相互交換可能に用いられて、あらゆる長さのアミノ酸の重合形を示し、それは天然に発生するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾、誘導されたアミノ酸またはデザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、アミノ酸類似体、ペプチド模倣薬およびデプシペプチド、ならびに修飾された、環状の、二環状の、デプシ環状の（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ）またはデプシ二環状の（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は１本鎖タンパク質およびマルチマーを含む。この用語は、以下のものに結合されたタンパク質も含む：たとえばＦＩＴＣ、ビオチン、ならびに６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、および２４４Ｃｍを含むがこれらに限定されない放射性同位元素などの標識；検出可能な生成物を有する酵素（たとえば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光剤および蛍光標識、蛍光発光金属、たとえば１５２Ｅｕ、またはその他のランタニド系列、電気化学発光化合物、化学発光化合物、たとえばルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩など；特異的結合分子、たとえば磁性粒子、微小球、ナノ球体など。この用語は、治療薬剤に結合されたペプチドも含む。
【００５０】
この用語は融合タンパク質も含み、この融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）融合タンパク質、たとえばルシフェリンまたはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）などの生物発光タンパク質などの異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する融合タンパク質または有さない融合タンパク質、ペグ化タンパク質、ならびに免疫学的にタグ付けされたタンパク質またはｈｉｓタグ付けされたタンパク質を含むが、これらに限定されない。こうした融合タンパク質はエピトープとの融合も含む。こうした融合タンパク質は、本発明のペプチドのマルチマー、たとえばホモダイマーまたはホモマルチマー、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロマルチマーなどを含んでもよい。この用語はペプチドアプタマーも含む。
【００５１】
本発明のペプチドは、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、こうした変異体は構造が実質的に同様である。ペプチド配列の変異体は、対象のペプチドに比べて挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよい。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【００５２】
本発明のペプチドは、天然に発生するアミノ酸および天然に発生しないアミノ酸を含んでもよい。ペプチドはＤ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組合せ、およびさまざまな「デザイナー」または「合成」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含むことによって特別な特性を有してもよい。加えて、ペプチドは環状であってもよい。ペプチドは非古典的アミノ酸を含むことによって特定の立体構造モチーフを導入してもよい。あらゆる公知の非古典的アミノ酸が用いられてもよい。以下を含むがそれらに限定されないアミノ酸類似体およびペプチド模倣薬をペプチドに組み込むことによって、特定の二次構造を誘導または有利にしてもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸）、β−ターンを誘導するジペプチド類似体；β−シートを誘導する類似体；β−ターンを誘導する類似体；α−へリックスを誘導する類似体；γ−ターンを誘導する類似体；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体；アミド結合アイソスター；またはテトラゾール（ｔｒｅｔｒａｚｏｌ）など。
【００５３】
ペプチドの末端部にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込むことによって、末端アミノ基またはカルボキシル基をなくして、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、または立体構造を制限してもよい。Ｃ末端官能基は、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにそれらの低級エステル誘導体、ならびにそれらの医薬的に許容できる塩を含む。
【００５４】
「リポソーム」という用語は、内部の水性空間を囲む外側の脂質二重層または多層の膜を含む組成物をいう。この用語は多重膜リポソームを含み、これは一般的に約１マイクロメートルから約１０マイクロメートルの範囲の直径を有し、水相の層と交互になった２から数百の同心の脂質二重層を含む。この用語は、単一脂質層からなり、一般的に約２０ナノメートルから約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約３００ｎｍから約４００ｎｍ、または約１００ｎｍから約２００ｎｍの範囲の直径を有する単層膜の小胞を含む。この用語は、約６５ｎｍから約７５ｎｍの直径を有するリポソームも含む。
【００５５】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、特定の抗原を認識して結合できる、たとえば免疫系によって、合成によって、または組換えによって生成されるものなどのタンパク質を示す。抗体は当該技術分野において一般的に公知であり、当該技術分野において公知の方法によって調製できる。
【００５６】
「エピトープ」とは抗体が結合する分子であり、それはポリペプチド中のアミノ酸残基の隣接する配列であってもなくてもよく、他の化学構造を有する糖および／または分子を含んでもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチドの状況における「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを示す。ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ両方のハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当該技術分野において広く公知であり公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃での４×ＳＳＣに５０％ホルムアミドを加えたものにおけるハイブリダイゼーションの後に、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣにおける１回またはそれ以上の洗浄が行なわれるものが含まれる。
【００５８】
「リガンド」という用語は、受容体を含む、別の分子に結合する分子を示す。
【００５９】
「宿主細胞」とは、あらゆる組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異および／または変化のために、必ずしも（形態または全体のＤＮＡ相補体が）元の親細胞と完全に同一でないことがある。宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれてもよい。
【００６０】
「試料」とは、患者に由来するあらゆる生体試料である；この用語は、生物学的な流体、たとえば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ、透析液、洗浄液、精液、およびその他の液体サンプルなど、ならびに生体由来の細胞および組織を含むがそれらに限定されない。この用語は細胞またはその細胞に由来する細胞およびその子孫も含み、それは培養物中の細胞、細胞上清および細胞溶解物を含む。この用語はさらに、器官または組織培養由来の流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプル、および生理学的組織から抽出された流体、ならびに固体組織から分離された細胞、組織切片、および細胞溶解物を含む。この定義は、たとえば試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどの特定の成分に対する濃縮などによって、調達後にあらゆる態様で処理されたサンプルを含む。この用語には、患者サンプルの誘導体および画分も含まれる。患者サンプルは、診断、予後またはその他のモニタリングアッセイに用いられてもよい。この用語はまた、ヒト以外の哺乳動物からの生体試料に適用される。試料はヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物からのものであってもよい。
【００６１】
本明細書において用いられる「処置」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療のあらゆる投与または適用を含み、それは、たとえば退縮をもたらすか、または機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復することなどによる疾患の阻害、疾患の進行の阻止、もしくは疾患の緩和；または非効率的なプロセスの刺激を含む。この用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを含み、ヒトを含む哺乳動物における病理学的状態または障害のあらゆる処置を含む。その効果は、障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に防ぐという観点から予防的であってもよく、ならびに／または、障害および／もしくはその障害に起因し得る悪影響に対する部分的もしくは完全な治癒という観点から治療的であってもよい。よって本発明は、処置および予防の両方を提供する。本発明は以下を含む：（１）障害を起こす可能性があるがまだ症状が出ていない対象において、障害の発生または再発を防ぐこと、（２）障害の進行を阻止するなど、障害を阻害すること、（３）障害または少なくともそれに伴う症状を停止または終結させることによって、宿主がもう障害またはその症状に苦しまないようにすること、たとえば、機能の欠失、欠落もしくは障害を回復もしくは修復するか、または非効率的なプロセスを刺激することなどによって、障害またはその症状の退縮をもたらすことなど、または（４）障害またはそれに伴う症状を緩和、軽減または改善すること、ここで改善とは広い意味で用いられ、少なくとも、炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの低減を示す。
【００６２】
「医薬的に許容できる担体」とは、あらゆる従来型の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）、調合補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、または賦形剤を示す。医薬的に許容できる担体は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合できる。
【００６３】
本明細書における「組成物」とは、当該技術分野において従来のものであって、かつ治療、診断または予防の目的のための対象への投与に適した、たとえば医薬的に許容できる担体または賦形剤などの担体を通常含有する混合物を示す。医薬組成物は、細胞または培養液中にポリペプチドまたはポリヌクレオチドが存在する細胞培養物を含んでもよい。たとえば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、口腔リンス液、または粉末を形成してもよい。
【００６４】
「疾患」とは、医療介入を必要とするか、または医療介入を行なうことが望ましいようなあらゆる状態、感染症、障害または症候群を示す。こうした医療介入は、処置、診断および／または予防を含み得る。
【００６５】
「癌」とは、あらゆる異常な細胞または組織の成長であり、たとえば悪性、前悪性または良性の腫瘍などである。癌は、細胞の無制御の増殖を特徴とし、それは周囲の組織に侵入することもしないこともあるし、新たな身体部位に転移することもしないこともある。癌は、上皮細胞の癌である癌腫を含む；癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌は、間充織由来の腫瘍である肉腫も含む；肉腫は、骨原性肉種、白血病およびリンパ腫を含む。癌は、１つまたはそれ以上の新生物細胞型を含んでもよい。癌という用語は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【００６６】
「黄斑変性」は、不適切に制御された、漏出性の血管の成長を含み、これらとしては、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げられる。
【００６７】
細胞系
有用な細胞系は、Ａ５４９、ヒト肺扁平上皮癌系、ＣＬ１−５、高転移性ヒト肺腺癌系、Ｈ２３、ヒト肺腺癌系、Ｈ４６０、ヒト肺大細胞癌系、ＰＣ１３、ヒト肺癌系、ＮＰＣ−ＴＷ０１、ヒト上咽頭癌系、ＳＡＳ、ヒト口腔扁平上皮癌系、ＰａＣａ、ヒト膵臓癌、結腸（ＨＣＴ１１６）、乳房（ＢＴ４８３）、前立腺（ＰＣ３）、肝臓（Ｍａｈｌａｖｕ）、ＮＮＭ、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。Ａ５４９、Ｈ２３、Ｈ４６０、ＰＣ１３、ＰａＣａ、ＨＣＴ１１６、ＰＣ３、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＡＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ＣＬ１−５およびＮＰＣ−ＴＷ０１細胞系は、それぞれ（Ｃｈｕら、１９９７）および（Ｌｉｎら、１９９０）によって樹立された。
【００６８】
ペプチドの調製
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて発現できる。本発明のペプチドを生産するためには、細胞に基づく方法および無細胞の方法が好適である。一般的に、細胞に基づく方法は、インビトロで宿主細胞に核酸構築物を導入する工程と、発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、次いで培養液もしくは（たとえば、宿主細胞を破壊することなどによって）宿主細胞のいずれかから、またはその両方からペプチドを採取する工程とを含む。本発明は、当該技術分野において周知の無細胞インビトロ転写／翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【００６９】
好適な宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含み、たとえば細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳動物の細胞などを含む。
【００７０】
典型的には、異種ペプチドは、修飾されていても修飾されていなくても、上述のとおりに単独で、または融合タンパク質として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく分泌リーダー配列を含んでもよい。本発明の分泌リーダー配列は、特定のタンパク質をＥＲに向けてもよい。ＥＲは膜結合タンパク質をその他のタンパク質から分離する。一旦ＥＲに局在化されると、タンパク質はさらに、分泌小胞を含む小胞；細胞膜、リソソーム、およびその他の小器官への分配のためにゴルジ体に向けられてもよい。
【００７１】
加えて、ペプチドにペプチド部分および／または精製タグが加えられてもよい。こうした領域は、ポリペプチドの最終的調製の前に取除かれてもよい。ポリペプチドにペプチド部分を付加することによって、特に分泌または排出を誘発したり、安定性を改善したり、精製を容易にしたりすることは、当該技術分野においてよく知られた慣用技術である。好適な精製タグは、たとえばＶ５、ポリヒスチジン、アビジンおよびビオチンなどを含む。ペプチドをビオチンなどの化合物に結合することは、当該技術分野において周知の技術を用いて達成できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて、放射性同位元素、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンにも結合できる。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｆａｎｏら（２００６）Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２６：７２６−３３）。毒素は当該技術分野において公知のものである。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．７：１３０１−１１（２００６）。
【００７２】
本発明における使用のために好適な融合パートナーは、たとえば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Ｆｃ、および／またはそれらの断片の１つもしくはそれ以上などを含む。たとえばポリエチレングリコール結合体などの結合タンパク質も提供される。
【００７３】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて化学的に合成することもできる（例、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５ １１１（１９８４）；Ｇｒａｎｔ編（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．；米国特許第６，９７４，８８４号を参照）。たとえば、ペプチド合成機の使用によって、または当該技術分野において公知の固相法の使用を通じて、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成できる。
【００７４】
さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または追加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、たとえばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸など、および一般的なアミノ酸類似体を含むがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｒｙ））またはＬ（左旋性（ｌｅｖｏｒｏｔａｒｙ））であってもよい。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含むがそれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製されてもよい。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。単離および／または精製の際にポリペプチドが変性したときは、タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を用いて活性の立体構造を再生してもよい。
【００７６】
本発明のペプチドまたはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、さまざまな親水性ポリマーの１つまたはそれ以上で修飾するか、またはそれと共有結合させることによって、ペプチドの可溶性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドに結合させるために好適な非タンパク質親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、たとえばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるものなど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体を含むがこれらに限定されない。一般的に、こうした親水性ポリマーの平均分子量は、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトン、約２，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの範囲である。ペプチドは、以下において示される方法のいずれかを用いて、こうしたポリマーによって誘導化されるか、またはそれらに結合されてもよい（Ｚａｌｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：１５０−１６５；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６：６２−６９；米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号、またはＷＯ９５／３４３２６号）。
【００７７】
リポソームの調製
リポソームを調製するためのさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、そのいくつかはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３３巻、３３７−４６２（１９８８）に記載されている。以前に記載される薄膜水和反応（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）と、反復押出し（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）との標準的な方法の組合せによって、小単層膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）を調製できる（Ｔｓｅｎｇら、１９９９）。特にリポソームによるＤＮＡの封入を含む調製法、およびリポソーム介在型トランスフェクションへの直接適用を有する方法は、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔら（１９９１）によって記載されている。リポソームを作成する方法は、米国特許第６，３５５，２６７号および米国特許第６，６６３，８８５号にも開示されている。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆位相蒸着法によって生成できる。リポソームを定められたポアサイズのフィルタから押出すことによって、所望の直径のリポソームを得る。
【００７８】
リポソームは、たとえばＴａｉｗａｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔａｉｐｅｉ Ｔａｉｗａｎなどの供給源から商業的に入手することもできる。付加的な商業的に入手可能なリポソームは、ＴＬＣ−Ｄ９９、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｄｏｘｉｌ、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、ＡＢＥＬＣＥＴ、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）、ならびにＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む。
【００７９】
本発明のリポソームは、リン脂質から調製されることが最も多いが、疎水性および親水性部分の両方を有する類似の分子形および寸法のその他の分子が用いられてもよい。本発明の目的に対して、すべてのこうした好適なリポソーム形成分子は、本明細書において脂質と呼ばれる。リポソームの調製には、１つまたはそれ以上の天然に発生する脂質化合物および／または合成脂質化合物が用いられてもよい。
【００８０】
リポソームは、親水性基の選択によって、アニオン、カチオンまたは中性であってもよい。たとえば、リン酸基または硫酸基を有する化合物が用いられるときには、得られるリポソームはアニオンになる。アミノを含有する脂質が用いられるときには、リポソームは正電荷を有し、カチオンリポソームとなる。
【００８１】
本発明において有用な最初のリポソームを形成するための代表的な好適なリン脂質または脂質化合物は、リン脂質関連材料、たとえばホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロールなどを含むが、これらに限定されない。付加的な非リン（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールコハク酸塩などを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン（正に荷電した）調製物、アニオン（負に荷電した）調製物、および中性調製物を含む。
【００８３】
化合物のリポソーム内への遠隔負荷（ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ）には、膜貫通勾配の形成が用いられる（ＣｅｈおよびＬａｓｉｃ、１９９５）。この方法は、リポソーム内に負荷すべき化合物とボロン酸化合物とを懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内に化合物を蓄積させる工程を含む（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９８；Ｃｅｈ Ｂ．およびＬａｓｉｃ Ｄ．Ｄ．、１９９５；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９８；米国特許第６，０５１，２５１号）。
【００８４】
リン酸塩アッセイを用いてリポソーム濃度を定めてもよい。リン酸塩アッセイの１つは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン色素との相互作用に基づくものである。主要な原理は、無機リン酸塩とモリブデン酸塩とを反応させて無色の非還元リンモリブデン酸塩複合体を形成することを含み、この複合体は酸性条件下で還元されるときに青色の複合体に変えられる。リンモリブデン酸塩はマラカイトグリーンと複合体を形成すると２０倍から３０倍多く発色する。最終生成物である還元された緑色の可溶性複合体は、６２０ｎｍにおける吸光度によって測定され、これは溶液中の無機リン酸塩の直接的な尺度である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、リポソームは、当該技術分野において多様なものが公知である医薬的に許容できる担体、賦形剤および希釈剤を有する処方物中に与えられる。これらの医薬的担体、賦形剤および希釈剤は、ＵＳＰ医薬賦形剤リストにリストされるものを含む。ＵＳＰ ａｎｄ ＮＦ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ、ｐ．２４０４−２４０６、ＵＳＰ ２４ ＮＦ １９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（ＩＳＢＮ１−８８９７８８−０３−１）。医薬的に許容できる賦形剤、たとえばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、医薬的に許容できる補助的物質、たとえばｐＨ調整および緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、安定剤、湿潤剤などは、一般に容易に入手可能である。
【００８６】
好適な担体は、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または処方物の効果を高めるアジュバントなどの付加的な薬剤を含有してもよい。局所的担体は、液体石油、イソプロピルパルミテート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート（５％）、または水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）を含む。必要に応じて他の材料、たとえば抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定剤、および類似の薬剤などが加えられてもよい。たとえばＡｚｏｎｅなどの経皮浸透促進剤が含まれてもよい。
【００８７】
医薬用量の形において、本発明の組成物は医薬的に許容できる塩の形で投与されてもよく、さらに単独で用いられても、または他の医薬的に活性の化合物との適切な結合および組合せにおいて用いられてもよい。対象組成物は、可能な投与のモードに従って調合される。
【００８８】
処置の方法
治療薬を含む本発明のペプチドまたはリポソームは、全身的な注射、たとえば静脈注射などによって；または関連部位への注射または適用、たとえば腫瘍への直接注射、もしくは手術中にその部位が露出しているときにはその部位への直接適用などによって；または、たとえば皮膚に障害があるときなどには局所適用によって、処置を必要とする対象に投与されてもよい。処置を必要とする被験体は、癌、加齢性黄斑変性、増殖性糖尿病性網膜症および未熟児網膜症のような、新生血管形成を伴う疾患に罹患した被験体を含む。
【００８９】
本発明のペプチドまたはリポソームは、単独療法として用いられてもよい。代替的には、本発明のペプチドまたはリポソームは、癌を処置するための標準的な化学療法または放射線療法あるいは加齢性黄斑変性のような疾患のための療法と組合せて用いられてもよい。
【００９０】
本発明のペプチドは、処置のために抗体を血管系にターゲティングするために用いられてもよい。一実施形態においては、本発明のペプチドが処置を必要とする対象に投与された後に、そのペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。ターゲティングされる抗体は、抗体依存性の細胞毒性または相補体依存性の細胞毒性を媒介してもよく、または標的分子の基礎をなす機能を変更してもよい。こうした抗体は抗体結合体の形で用いられることによって、標的組織に治療効果を有する薬剤を直接送達してもよい。こうした薬剤は、放射性核種、毒素、化学療法薬物、抗ＶＥＧＦアプタマーおよび抗血管新生化合物を含む。
【００９１】
薬剤の投与は、経口、口腔、経鼻、直腸、非経口、腹膜内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、および髄腔内投与などを含むさまざまな方法で、または移植もしくは吸入による別様で達成されてもよい。よって、対象組成物は固体、半固体、液体または気体の形の調製物、たとえば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射薬、吸入剤、およびエアロゾルなどに処方されてもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって、いかなる態様でも限定するものではない。
【００９２】
好適な賦形剤ビヒクル媒体は、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ビヒクルは少量の補助的物質、たとえば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などを含有してもよい。こうした投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかになる。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象における所望の状態を達成するために適切な量の薬剤を含有する。
【００９３】
本発明のリポソームまたはペプチドは、水性溶媒または非水系溶媒、たとえば植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどに；所望であれば従来の添加剤、たとえば溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤などとともに、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に処方されてもよい。当該技術分野における従来どおりの、経口または非経口送達のためのその他の処方物が用いられてもよい。
【００９４】
本発明のリポソームまたはペプチドは、癌の処置および血管新生の阻害に用いられてきたさまざまな薬物の１つまたはそれ以上を含んでもよく、その薬物は、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｈｅｃｉｎ）（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（たとえばマイトマイシンＣなど）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド、ならびに抗新生物性抗生物質、たとえばドキソルビシンおよびダウノマイシンなど、またはたとえばＤｅ Ｖｉｔａら編、２００１などに記載されるその他のものを含むが、それらに限定されない。リポソームまたはペプチドは、細胞毒性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素および放射性分子も含んでもよい。リポソームまたはペプチドは、（Ｎｇら、２００６）に記載される抗ＶＥＧＦアプタマーなどの化合物も含んでもよい。
【００９５】
癌療法において用いられる薬物は、癌細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制の効果を有してもよく、または悪性細胞の増殖を低減させてもよい。癌処置に用いられる薬物はペプチドであってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、放射線療法と組合されてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、（Ｄｅ Ｖｉｔａら（２００１））に記載される治療アプローチとともに付属的に用いられてもよい。本発明のリポソームまたはペプチドと第２の抗癌剤とが癌細胞に対して相乗効果を及ぼすような組合せに対しては、第２の薬剤の用量は、第２の薬剤が単独で投与されるときの標準的な用量よりも減らされてもよい。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本発明のリポソームまたはペプチドを、癌細胞の感受性を高めるために有効な量の化学療法の抗癌薬と共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）工程を含む。共投与は同時投与であっても、または非同時投与であってもよい。本発明のリポソームまたはペプチドは、処置療法の過程において他の治療薬剤とともに投与されてもよい。一実施形態において、本発明のリポソームまたはペプチドと、他の治療薬剤との投与は連続的である。適切な時間経過は、患者の病気の性質および患者の状態などの因子に従って医師によって選択されてもよい。
【００９６】
診断方法
疾患特異的バイオマーカの検出は、有効なスクリーニング戦略を提供する。早期の検出は早期の診断を与えるだけでなく、癌の場合には多形性をスクリーニングし、手術後の残余腫瘍細胞および潜在性の転移、すなわち腫瘍再発の初期指標を検出することを可能にできる。よって疾患特異的バイオマーカの早期検出は、診断前、処置の最中および寛解期の患者における生存性を改善できる。
【００９７】
本発明のペプチドは、癌および新生血管形成を伴う他の疾患を含む疾患に対する診断または予後として用いられてもよい。ペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれらに限定されないいくつかの方法で、診断として用いられてもよい。
【００９８】
本発明の抗体は、血管系を検出するために本発明のペプチドと組合せて用いられてもよい。いくつかの実施形態において、そのアッセイは、血管マーカに結合した本発明のペプチドと抗体との結合を検出する結合アッセイである。対象ポリペプチドまたは抗体は固定されてもよく、対象ポリペプチドおよび／または抗体は検出可能になるよう標識されてもよい。たとえば、抗体は直接標識されても、または標識された二次抗体によって検出されてもよい。すなわち、抗体に対する好適な検出可能な標識は、目的のタンパク質に対する抗体を標識する直接標識と、目的のタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接標識とを含む。別の実施形態において、ペプチドは標識を含み、ペプチドの組織への結合は標識の存在をアッセイすることによって検出される。
【００９９】
スクリーニング方法
本発明は、本発明のペプチドに結合する生体リガンドを同定するための方法を提供する。
【０１００】
方法の１つにおいて、本発明のペプチドは、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ、７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）；およびＳｕｔｅｒら（２００６）を参照）における「ベイトタンパク質」として用いられることによって、本発明のペプチドと結合または相互作用する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０１】
別の方法においては、本発明のペプチドが細胞抽出物とともにインキュベートされて、本発明のペプチドに結合する分子が同定される。方法の１つにおいて、本発明のペプチドはＨＰＬＣカラムなどの固体支持上に固定され、本発明のペプチドの標的分子への結合を促進する条件下で細胞抽出物が固定ペプチドに露出される。結合した分子は溶出され、質量分析法などの標準的な技術を通じて同定される。一実施形態において、この細胞抽出物は、ＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣを含む。
【０１０２】
標的タンパク質のアフィニティ精製
肺癌細胞からタンパク質を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、１％のノニデットＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｓ；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって４℃にて３０分間抽出する。１５，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、タンパク質溶解物から．残屑を取除く。溶解物を最初に対照ペプチドを含有する１ｍｌカラム上で予め清澄にし、ＳＰ５−５２またはＳＰ５−２ペプチド固定アフィニティカラムの第２の１ｍｌカラムにフロースルーを直接添加する。カラムを洗浄して溶出する。単離されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）によってモニタし、銀染色によって視覚化する。所望のタンパク質バンドを、トリプシンによるインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）消化のためにゲルから切出す。その結果得られるポリペプチドをさらに質量分析法によって分析する。
【実施例】
【０１０３】
実施例は本発明を純粋に例示することが意図され、したがっていかなる態様でも本発明を制限すると考えられるべきでなく、さらに上記において議論した本発明の詳細な局面および実施形態をも説明するものである。
【０１０４】
実施例１．インビボのファージディスプレイバイオパニングの手順
ＣＬ１−５、Ｈ４６０およびＰＣ３を、２ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を補ったＲＰＭＩ１６４０中で、９５％の空気および５％のＣＯ２（ｖ／ｖ）の加湿された環境下で３７℃にて生育した。ＣＬ１−５はＣｈｕら（Ｃｈｕら、１９９７）によって樹立された。ＳＡＳ、ＨＣＴ１１６、ＢＴ４８３、ＭａｈｌａｖｕおよびＰａＣａを、３．７ｇの重炭酸塩、１リットル当り４０ｍｇのカナマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生育し、１０％のＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。胎盤からの分離後の臍静脈からＨＵＶＥＣを単離して、２０％のＦＣＳ、抗生物質、１５μｇ／ｍｌの内皮成長因子（ｕｐｓｔａｔｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）を補ったＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で生育し、５％のＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
【０１０５】
腫瘍組織から腫瘍ホーミングファージを単離するために、本発明者らはファージディスプレイペプチドライブラリを用いて、インビボ選択（バイオパニング）の５ラウンドに対してＮＳＣＬＣ（ＣＬ１−５）腫瘍マウスを処置した。４〜６週齢のＳＣＩＤマウスの背外側の側腹部に、ＣＬ１−５細胞を別々に皮下注射して肺癌異種移植片を生成した。サイズを合せたＣＬ１−５由来の腫瘍（約５００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈に、ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）を注射した。８分間のファージ循環後に、マウスをジエチルエーテルで処置してマウスを深い麻酔に導き、５０ｍｌのＰＢＳを灌流させて未結合ファージを洗浄した。器官（肺、心臓、脳など）および腫瘍塊を取出して重量測定し、冷たいＰＢＳで洗浄した。器官および腫瘍サンプルをホモジナイズし、ＥＲ２７３８細菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）によってファージ粒子を回収した。ファージを、１ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌの存在下で寒天プレート上で力価測定した。ＥＲ２７３８培養物中で結合ファージを増幅して力価測定した。回収されたファージを、上述のとおり肺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスを用いたバイオパニングの４つの連続するラウンドに供した。第５ラウンドから溶出したファージをＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で力価測定した。腫瘍ホーミングファージクローンの候補をランダムに選択し、細胞ＥＬＩＳＡおよびインビボのホーミング実験によって同定した。
【０１０６】
選択されたファージクローンをＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。精製ファージのＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖終止法に従って決定した。配列決定は、ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’［配列番号１９］によって行なわれた。ファージディスプレイペプチド配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムを用いて翻訳およびアラインメントされた。
【０１０７】
バイオパニングの第５ラウンドの回収率は、第１ラウンドの１５６倍に増加した（図１）。これらの濃縮されたファージをランダムに選択して配列決定した。ＧＣＧソフトウェアを用いて、これら９つは一致する残基のプロリン（Ｐ）を有し、４つのクローン（ＰＣ５−１０、ＰＣ−５３、ＰＣ−５８およびＰＣ−６０）はコンセンサスアミノ酸残基のセリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することが見出され；３つのクローン（ＰＣ５−５、ＰＣ−５２およびＰＣ−５４）はコンセンサスモチーフのプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することが見出された（表１）。本発明者らのファージホーミング系でテストされたコンセンサスペプチドモチーフの中でも、ファージクローンＰＣ５−５２は、インビボのファージディスプレイによって、肺および口腔（ＩＶＯ−２と名付けられた）腫瘍マウスの両方から選択された（表１および図２Ｃ）。２つの異なるヒト癌（肺癌および口腔癌）異種移植片から同じファージクローンが単離されたことから、ＰＣ５−５２に提示されるペプチドは複数の固形腫瘍をターゲティングできることが示される。
【０１０８】
実施例２．異種移植片腫瘍脈管におけるインビボのホーミングおよびペプチド結合
ＰＣ５−５２のターゲティング能力を調べるために、ヒト肺癌細胞由来の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈にファージを注射し、灌流後に回収した。本発明者らは、腫瘍塊および他の正常な器官におけるファージの力価を定めた。ファージクローンまたは対照ヘルパーファージ（挿入なしのファージ）を、ヒト肺癌腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの尾静脈（ｉ．ｖ．）に８分間または２４時間注入した。灌流後に異種移植片腫瘍および器官を取出し、回収されたファージの力価を測定した。以下に記載するペプチド競合的阻害実験においては、ファージクローンを１００μｇの合成ペプチドと同時注入した。候補または対照のファージクローンの注入後、器官および腫瘍を取出して２つの部分に分割した。１つの部分はＥＲ２７３８によって力価を測定し、別の部分はＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、ＮＬ、ＵＳＡ）に埋め込んだ。ＯＣＴに埋め込んだ冷凍組織を５ミクロンに切断し、冷たいＰＢＳ緩衝液に移した。次いでこの切片をアセトン−メタノール（１：１）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）に１時間浸漬した。次いで、ブロックされたサンプルをラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ラットＡｂ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、Ｃａｎａｄａ）とともにインキュベートし、ローダミン標識されたヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）に浸漬した。スライドをさらにマウス抗Ｍ１３ ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともにインキュベートした後、ＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）とともに浸漬した。最後にスライドを洗浄し、封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって封入した。
【０１０９】
本発明者らは、ファージの代りに、ＦＩＴＣ標識された候補ペプチドおよび対照ペプチドも用いた。ペプチド結合アッセイにおいては、腫瘍異種移植片マウスの尾静脈からＦＩＴＣ標識ペプチドを注射した。灌流後、組織を取出して上述のとおりに処理した。次いでＬｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下でスライドを調べた。画像をＳｉｍｐｌｅＰＣＩ（Ｃ−ＩＭＡＧＩＮＧ、ＰＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアによってマージした。
【０１１０】
ＰＣ５−５２は腫瘍塊におけるホーミング能力を示し、腫瘍塊においては脳、肺および心臓を含む他の器官よりも８．０倍から１３５倍高い濃度を示した（図２Ａ）が、対照ヘルパーファージはこうしたホーミング能力を示さなかった（図２Ｂ）。
【０１１１】
ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力は、リガンド競合実験によっても証明された。候補ペプチドＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ（ＳＰ５−５２）および対照ペプチド（ＲＬＬＤＴＮＲＰＬＬＰＹ）［配列番号２０］を合成して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（ＣＡ、ＵＳＡ）により逆相高速液体クロマトグラフィによって＞９５％の純度にまで精製した。同じ会社によってペプチドＮＨ２末端にＦＩＴＣまたはビオチンを付加することによって、これらのペプチドとＦＩＴＣまたはビオチンとの結合を行なった。リガンド競合実験から、合成ＳＰ５−５２ペプチドとＰＣ５−５２ファージ粒子との同時注入が腫瘍組織からのＰＣ５−５２の回収を阻害することが示された（図２Ｂ）。１００μｇのＳＰ５−５２は、ＮＳＣＬＣ腫瘍塊へのＰＣ５−５２ホーミングの９７％を阻害した。同様の結果から、ＩＶＯ−２（ＰＣ５−５２によって提示されるペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドを提示する）も口腔癌異種移植片の腫瘍組織にホーミングすることが示された（図２Ｃ）。ＩＶＯ−２は腫瘍塊におけるホーミング能力を示し、腫瘍においては脳、肺および心臓を含む他の器官よりも１２倍から１２１倍高い濃度を示した（図２Ｃ）。ＩＶＯ−２の腫瘍ホーミング能力はＳＰ５−５２によって阻害できた。１００μｇのＳＰ５−５２の同時注入は、口腔癌異種移植片へのＩＶＯ−２ホーミングの９５．９％を阻害した（図２Ｄ）。対照ペプチドは腫瘍組織へのＩＶＯ−２ホーミングを阻害できなかった（図２Ｄ）。ＰＣ５−５２を２４時間注入した後に、ファージが腫瘍組織中に対照組織よりも１０倍多く蓄積したことも本発明者らは見出した。
【０１１２】
実施例３．ＰＣ５−５２およびＳＰ５−５２の局在化
ＰＣ５−５２のホーミング特異性を調べるために、本発明者らは免疫蛍光アッセイを用いて、灌流後のファージの結合活性を局在化した。上述のとおりにヒト肺腺癌冷凍切片を調製した。スライドをブロッキング緩衝液中で３０分間インキュベートし、次いでメタノール中の３％の過酸化水素と０．１％のＮａＮ３とで処理して内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断し、ビオチン標識したペプチドとともにインキュベートした。スライドを慣用的な免疫組織化学染色に供した。
【０１１３】
その結果、ファージ粒子は肺癌の異種移植片腫瘍切片とは反応するが、正常な肺組織とは反応しないことが示された（図３Ａ）。しかし、ファージは癌細胞に局在化しなかった。腫瘍塊はパネル（ａ）に示され、正常な肺はパネル（ｃ）に示される。パネル（ｂ）および（ｄ）はＨ３３２５８によって核ＤＮＡを対比染色したものであり、それぞれパネル（ａ）および（ｃ）に対応する。抗Ｍ１３ ｍＡｂ（緑）およびマウス内皮細胞マーカＣＤ３１（赤）とともにインキュベートされた腫瘍組織からの冷凍切片を用いたとき、異種移植片腫瘍組織の腫瘍血管系においてＰＣ５−５２がＣＤ３１と共存することを本発明者らは見出した（図３Ｂ）。正常な心臓（図３Ｂ）、肺および脳の脈管にはファージは見出されなかった。ファージ注射後の腫瘍血管系内皮における抗ファージ免疫蛍光と抗ＣＤ３１との共存は、パネル（ｉ−ｋ）に示される。対照ファージは腫瘍脈管に結合できない（ａ）のに対し、ＰＣ５−５２は正常な心臓を認識できない（ｅ）。抗ＣＤ３１は心臓脈管（ｆおよびｇ）ならびに異種移植片腫瘍脈管（ｂ、ｃ、ｊおよびｋ）において示される。核染色は（ｄ、ｈおよびｌ）に示される。
【０１１４】
腫瘍血管系へのファージディスプレイペプチドホーミングをさらに調べるために、本発明者らはＰＣ５−５２ファージの代わりにＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドを用いてペプチドホーミング研究を行なった。ＦＩＴＣ標識されたＳＰ５−５２ペプチドも、肺癌異種移植片の腫瘍血管系においてマウスＣＤ３１マーカと共存することを本発明者らは見出した（図３Ｃのｉ−ｌ）。このペプチドは心臓脈管と反応しなかった（図３Ｃのｅ−ｈ）。ＦＩＴＣ標識された対照ペプチドは腫瘍血管系を認識できなかった（図３Ｃのａ−ｄ）。ローダミン−抗ＣＤ３１は、ヒト肺癌異種移植片（ｂおよびｊ）ならびに正常な心臓（ｆ）において示される。Ｈ３３２５３による核染色は（ｄ、ｈおよびｌ）に示される。（バー、２０μｍ）。
【０１１５】
実施例４．複数の癌異種移植片へのＰＣ５−５２の結合、およびＰＳＰモチーフの調査
本発明者らは、インビボのファージディスプレイによって、肺癌および口腔癌の異種移植片から腫瘍ホーミングファージＰＣ５−５２を単離した。これらの結果は、ＳＰ５−５２の標的が固形腫瘍の血管系において発現されている可能性があることを示すものである。この仮説を検証するために、本発明者らは、ヒト肺癌（Ｈ４６０）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、乳癌（ＢＴ４８３）、前立腺癌（ＰＣ３）、肝癌（Ｍａｈｌａｖｕ）および膵癌（ＰａＣａ）の異種移植片を含む、ヒト癌の別の６つの異なるタイプにおけるＰＣ５−５２のホーミング能力を調べた。ＳＣＩＤマウスにＰＣ５−５２を静脈内注射した。８分後に、ＰＢＳ緩衝液による灌流によって遊離ファージを洗い出し、異種移植片腫瘍塊を取出してファージ力価を定めた。これらのヒト癌異種移植片のすべてにおいて、ＰＣ５−５２は腫瘍組織をターゲティングしたが、脳、肺および心臓などの正常な器官はターゲティングしなかった（図４）。このターゲティングリガンドを有さない対照ファージにはこうしたホーミング能力はなかった。
【０１１６】
インビボのファージディスプレイより、３つのクローン（ＰＣ５−５、ＰＣ５−５２およびＰＣ５−５４）によって提示されるペプチドがコンセンサスモチーフのプロリン（Ｐ）−セリン（Ｓ）−プロリン（Ｐ）を有することを本発明者らは見出した（表１）。これら３つのアミノ酸残基は腫瘍組織へのホーミングにおける役割を有するのではないかと本発明者らは提案した。この仮説を検証するために、本発明者らはＳＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ）中のこれら３つのアミノ酸残基を、変異ペプチドＭＰ５−５２（ＳＶＳＶＧＭＫＧＧＧＲＰ）（配列番号２０）においてＧＧＧに変えた。インビボのホーミングアッセイにおいて、腫瘍ホーミングファージＰＣ５−５２はＣＬ１−５由来の腫瘍にターゲティングできた（図４Ｂ）。ＰＣ５−５２の腫瘍ホーミング能力は、ＳＰ５−５２によって顕著に阻害されたが、ＭＰ５−５２の変異ペプチドには阻害されなかった（図４Ｂ）。
【０１１７】
実施例５．ＰＣ５−５２は刺激されたＨＵＶＥＣと反応し、ＳＰ５−５２はヒト肺癌生検試料に結合する
このファージがヒトの新生血管系内皮に対する親和性を有するかどうかをさらに確認するために、本発明者らはＶＥＧＦ刺激されたヒト脈管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にＰＣ５−５２ファージ粒子を適用した。ＨＵＶＥＣをカバーガラス上に蒔いて、約８０％集密になるまで生育した。細胞をＶＥＧＦ（Ｂ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）およびｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、Ｌａｎｄｏｎ、ＵＫ）で４８時間前処理した。ＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣを無血清Ｍ１９９で洗浄し、ブロッキング緩衝液（無血清Ｍ１９９に３％のＢＳＡを加えたもの）の中で４℃にて３０分間インキュベートした。次いでカバーガラスをファージとともに４℃にて１時間インキュベートし、洗浄して、３％のホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いでカバーガラスをマウス抗Ｍ１３ ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに１時間インキュベートした後に、ＦＩＴＣ標識した抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、次いでＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８とともに浸漬した。最後にカバーガラスを洗浄し、封入剤によって封入した。
【０１１８】
その結果、ＰＣ５−５２はＶＥＧＦ刺激されたＨＵＶＥＣに結合することが明らかになった（図５Ａのａ）。ＶＥＧＦ刺激なしのＨＵＶＥＣにおいては、ＰＣ５−５２の結合は観察されなかった（図５Ａのｂ）。このペプチドを有さない対照ファージは結合活性を示さなかった（図５Ａのｃ）。さらに、ビオチン標識されたＳＰ５−５２ペプチドは、ヒト肺癌生検試料の腫瘍脈管に結合できたが、対照の肺の非腫瘍脈管には結合できなかった（図５Ｂ）。これらのデータから、ＳＰ５−５２はヒト血管新生内皮細胞および腫瘍新生血管系における未知の受容体を認識したことが示される。
【０１１９】
ファージの腫瘍脈管への結合が提示ペプチドに媒介されたものかどうかを定めるために、ＨＵＶＥＣ結合研究におけるファージの代わりにＦＩＴＣ標識したペプチドを用いる。カバーガラス上のＨＵＶＥＣを、ＦＩＴＣ標識したペプチドまたは対照ペプチドとともに２時間インキュベートする。次いでカバーガラスを洗浄してＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８とともに浸漬し、次いで洗浄して封入剤によって封入し、Ｌｅｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ顕微鏡の下で調べる。
【０１２０】
実施例６．ドキソルビシンを含有するリポソーム−ペプチドの調製および動物モデルの処置
腫瘍脈管ホーミングペプチドのＳＰ５−５２を用いて癌化学療法の治療効果を改善できるかどうかを定めるために、本発明者らはドキソルビシンを含有するリポソームにＳＰ５−５２を結合し（ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ）、異種移植片を有するマウスをこのリポソームで処置した。
【０１２１】
ドキソルビシンを含有するリポソームの調製の手順は、過去の報告（Ｌｅｅら、２００４；Ｔｓｅｎｇら、１９９９）において公開される方法から適合した。簡単に述べると、Ｌ−ペプチドをＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−カルボキシル−ポリエチレングリコール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ；平均分子量、３０００）由来のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）］に１：１．５のモル比で結合した。この結合は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを生成するためのペプチドのＮ末端の固有な遊離アミン基を用いて行なった。この反応は完了し、残りのアミノ基の定量化によって確認された。アミノ基はＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホネート（Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））試薬によって測定された（ＡＦＳＡ、１９６６）。
【０１２２】
ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなるリポソームを硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ＝５．０、５３０ｍＯｓ）中で５５℃にて水和し、６０℃にて高圧押出し装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて０．１μｍおよび０．０５μｍのポアサイズのポリカーボネート膜フィルタ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から押出した；ドキソルビシンを、１０μｍｏｌのリン脂質当り１ｍｇのドキソルビシンの濃度で、遠隔負荷法によってリポソームに封入した。リン酸塩アッセイによってリポソームの最終濃度を定めた。０．２ｍｌの希釈薬物負荷リポソームに１ｍｌの酸性イソプロパノール（８１ｍＭのＨＣｌ）を加えた後、励起波長として４７０ｎｍを用い、放出波長として５８２ｎｍを用いる分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって、リポソームの内側に閉じ込められたドキソルビシンの量を定めた。サブミクロン粒子分析計（モデルＮ４プラス；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）による動的レーザ散乱によって、小胞サイズを測定した。調製後のリポソームは、リン脂質１μｍｏｌ当り１１０μｇから１３０μｇのドキソルビシンを含有し、直径６５ｎｍから７５ｎｍの範囲の粒子サイズを有した。比較のために、同じ方法を用いてＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥに対照ペプチドを結合したものを調製した。脂質二重層の遷移温度を超える温度でともにインキュベートした後に、ペプチジル−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを予め形成されたリポソームに移した（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７）。以前に記載されたとおりに算出したところ（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９７）、リポソーム当り３００〜５００個のペプチド分子があった。
【０１２３】
ヒト肺癌（ＣＬ１−５）および口腔癌（ＳＡＳ）異種移植片をＳＣＩＤマウス中で確立した。４〜６週令のマウスの背外側の側腹部に、ヒト癌細胞を皮下注射した。サイズを合せた腫瘍（腫瘍サイズ約１００ｍｍ３）を有するマウスを異なる処置群にランダムに割当てて、尾静脈を通じて、複数用量（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）のＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘによって処置した。対照群には、ＰＢＳをＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘと同じ体積およびスケジュールで静脈内投与した。マウスの体重および腫瘍サイズをノギスで週２回測定した。腫瘍体積は次の式を用いて算出した：体積＝長さ×（幅）２×０．５２。平均腫瘍体積の差をＡＮＯＶＡによって評価した。
【０１２４】
ＣＬ１−５由来の腫瘍（腫瘍サイズ約１００ｍｍ３）を有するＳＣＩＤマウスをランダムに３つの群に分けて、静脈を通じて、合計ドキソルビシン用量が７ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ、週２回）のＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳで処置した。ＳＰ５−５２ペプチド−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスは、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＰＢＳで処置した場合よりも有意に小さい腫瘍サイズを示した（Ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ｄａｙ２８までにＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも１．９倍大きくなった。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも４．１倍大きかった。ターゲティングリポソームの治療効果をさらに特徴付けるために、本発明者らはＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳによって別々に処置した後の動物の生存率を比較した。ｄａｙ８１に実験を終了したとき、ＰＢＳおよびＬｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群ではすべての動物（ｎ＝６）が死亡し（生存率０％）、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群では２匹の動物のみが死亡した（生存率６６．７％）（図６Ｂ）。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置マウスにおいては腫瘍脈管が顕著に減少し損傷していることも本発明者らは見出した（図６Ｃ）。
【０１２５】
ＳＰ５−５２が口腔癌に対する治療効果を増加できるかどうかをテストするために、本発明者らは動物モデルにおけるこの癌に対するリガンド標的療法も開発した。ターゲティングリポソームで処置したＳＡＳ由来口腔癌を有するＳＣＩＤマウスにおいても同様の結果が見出された。ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘまたはＰＢＳによる処置を、合計ドキソルビシン用量が７ｍｇ／ｋｇ（７回、１ｍｇ／ｋｇ、週２回）で静脈内投与した。ＳＰ５−５２ペプチド−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスは、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘおよびＰＢＳで処置したマウスよりも有意に小さい腫瘍サイズを示した（Ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群のマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ｄａｙ２４．５にはＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも３．６倍大きくなった。対照ＰＢＳ群のマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも７．１倍大きいことが見出された（図６Ｄ）。さらに、ｄａｙ６０に実験を終了したとき、ＰＢＳ処置の群ではすべての動物（ｎ＝６）が死亡し（生存率０％）、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置の群では４匹の動物が死亡した（生存率３３．３％）のに対し、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ処置群はすべてが生存した（生存率１００％）（図６Ｅ）。本発明者らはこの実験を再び繰り返し、その結果、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−ＤｏｘはＬｉｐｏ−Ｄｏｘよりも口腔癌異種移植片の処置に効果的であることがさらに確認された。Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘで処置したマウスの腫瘍サイズは徐々に増加して、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも３．２倍大きくなった。対照ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍サイズは、ＳＰ５−５２−Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ群よりも５．９倍大きいことが見出された。これらの結果から、Ｌｉｐｏ−ＤｏｘをターゲティングリガンドＳＰ５−５２に結合することによって、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト肺癌および口腔癌異種移植片を含む固形腫瘍異種移植片を阻害する薬物の能力が高められることが示される。
【０１２６】
表１．肺癌異種移植片から選択されたファージディスプレイペプチド配列のアラインメント
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
ａファージディスプレイされるコンセンサスアミノ酸配列を太字体で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチドまたはその変異体。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される配列を含む、ペプチドまたはその変異体。
【請求項３】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のペプチドに融合された第１のペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１のペプチドは請求項２に記載のペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２のペプチドはエピトープを含む、請求項５に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項８】
前記標識は、ＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素からなる群より選択される、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物に結合される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドを少なくとも１つ含むリポソーム。
【請求項１２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記薬物はドキソルビシンである、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記リポソームはさらに医薬的に許容できる担体を含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１７】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に請求項９に記載のペプチドの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、１つまたはそれ以上の薬物と１つ以上の請求項２に記載のペプチドを含有するペプチドとを含むリポソームの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記リポソームは、配列番号２を含むペプチドまたはその変異体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームは、配列番号２を含むペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソームは１つ以上の化学療法薬物を含み、前記１つ以上の化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学療法薬物はドキソルビシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患は癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌は、肺癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌は、口腔癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患は、加齢性黄斑変性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項２に記載のペプチドに、新生血管系に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）請求項１０に記載の抗体を用いて、前記ペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項６に記載の融合ペプチドに、新生血管系に前記融合ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記融合ペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項７に記載のペプチドに、新生血管系に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記ペプチドの標識を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
前記標識は、ＦＩＴＣおよびビオチンからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２に記載のペプチドに結合する生体分子を同定する方法であって、
ａ）細胞抽出物を請求項２に記載のペプチドに、前記ペプチドおよびリガンドを含む複合体を形成できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記複合体を分析して前記リガンドを同定する工程と
を含む、方法。
【請求項３５】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチドまたはその変異体。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される配列を含む、ペプチドまたはその変異体。
【請求項３】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のペプチドに融合された第１のペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１のペプチドは請求項２に記載のペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２のペプチドはエピトープを含む、請求項５に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは１つまたはそれ以上の標識を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項８】
前記標識は、ＦＩＴＣ、ビオチンおよび放射性同位元素からなる群より選択される、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の薬物に結合される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドを少なくとも１つ含むリポソーム。
【請求項１２】
前記ペプチドは配列番号２またはその変異体を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記ペプチドは配列番号２を含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記薬物はドキソルビシンである、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記リポソームはさらに医薬的に許容できる担体を含む、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１７】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に請求項９に記載のペプチドの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、１つまたはそれ以上の薬物と１つ以上の請求項２に記載のペプチドを含有するペプチドとを含むリポソームの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記リポソームは、配列番号２を含むペプチドまたはその変異体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームは、配列番号２を含むペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソームは１つ以上の化学療法薬物を含み、前記１つ以上の化学療法薬物は、ドキソルビシン、ビノレルビン、オリゴヌクレオチド、毒素、および抗ＶＥＧＦアプタマー、および放射性分子からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学療法薬物はドキソルビシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患は癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌は、肺癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌は、口腔癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患は、加齢性黄斑変性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項２に記載のペプチドに、新生血管系に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）請求項１０に記載の抗体を用いて、前記ペプチドの結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項６に記載の融合ペプチドに、新生血管系に前記融合ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記融合ペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
試料中の新生血管系を検出するための方法であって、
ａ）前記試料を請求項７に記載のペプチドに、新生血管系に前記ペプチドが結合できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記ペプチドの標識を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
前記標識は、ＦＩＴＣおよびビオチンからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２に記載のペプチドに結合する生体分子を同定する方法であって、
ａ）細胞抽出物を請求項２に記載のペプチドに、前記ペプチドおよびリガンドを含む複合体を形成できる条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記複合体を分析して前記リガンドを同定する工程と
を含む、方法。
【請求項３５】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５１７５７６（Ｐ２０１０−５１７５７６Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９１３６（Ｐ２００９−５４９１３６）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００４８２
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【出願人】（５０３２０９３４２）ナショナル タイワン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００４８２
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【出願人】（５０３２０９３４２）ナショナル タイワン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
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