脂肪蓄積抑制剤
【課題】ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸による動物生体内の脂肪組織減少効果が向上し、卓越した脂肪蓄積抑制効果を有する脂肪蓄積抑制剤、及び、該脂肪蓄積抑制剤を添加した組成物を提供すること。
【解決手段】ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤からなる。この脂肪蓄積抑制剤は、各種臓器重量を低下させることなく、動物生体内の脂肪組織を減少させることができ、遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のみを含有する脂肪蓄積抑制剤にくらべ、優れた効果を有する。
【解決手段】ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤からなる。この脂肪蓄積抑制剤は、各種臓器重量を低下させることなく、動物生体内の脂肪組織を減少させることができ、遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のみを含有する脂肪蓄積抑制剤にくらべ、優れた効果を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子より抽出される成分或いは該成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤、及び該脂肪蓄積抑制剤を含む食品、医薬又は動物飼料用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
共役リノール酸（幾つかの立体異性体や位置異性体がある。）は、モデル動物を使った実験で種々の生理機能を有することが確認されている。例えば、抗癌作用、免疫機能調節作用、動脈硬化の予防・退縮、抗肥満等の作用があることが知られている（非特許文献１、２）。また、ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−オクタデカジエン酸、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−オクタデカジエン酸等の共役リノール酸を肝臓脂肪蓄積抑制組成物として用いるものが開示されている（特許文献１）。この特許文献に具体的に記載されているものは、コーン油、サフラワー油、バター脂等と、ミルクホエータンパク質とを混合し、反応させて製造された９、１１−オクタデカジエン酸と１０、１２−オクタデカジエン酸等を含んだリノール酸の天然の供給源から製造されたようなものである。
【０００３】
上記のような共役リノール酸の生理機能についての実験の多くは、化学合成された脂肪酸である共役リノール酸（ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−共役リノール酸,ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の混合物）を使って行われている。一方で、共役リノール酸やリノレン酸を、リノール酸やリノレン酸を含有する油脂に、イソメラーゼを働かせて、製造する方法が開示されており、かかる共役リノール酸ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−共役リノール酸とｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子も、それぞれLactobacillus reuteri（特許文献３）Propionibacterium acnes(特許文献４)から単離されている。
【０００４】
最近、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の合成酵素遺伝子をイネに導入して、種子にその共役脂肪酸を蓄積させた遺伝子組換えイネが作出されている（非特許文献３）。また、プニカ酸のような共役トリエン型脂肪酸に関与する遺伝子をナタネ、ひまわり、パーム椰子や、トウモロコシ、イネのような植物に導入し、該植物から採取される植物油等を有効成分として、脂肪蓄積抑制剤として利用することが開示されている（特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−７９９８７号公報。
【特許文献２】特開２００５−２３９７０４号公報。
【特許文献３】ＷＯ９９／３２６０４（特表２００２−５０８９２９号公報）。
【特許文献４】ＷＯ０１／００８４６（特表２００３−５０３０６１号公報）。
【非特許文献１】池田郁男、日本油化学会誌、第４８巻、第１０号、２１―２８頁、１９９９年
【非特許文献２】菅野道廣、食品機能素材ＩＩＩ、１１０−１１２頁、シーエムシー出版、２００５年
【非特許文献３】Transgenic Res.、2006、15:95-100
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸による動物生体内の脂肪組織減少効果が向上し、卓越した脂肪蓄積抑制効果を有する脂肪蓄積抑制剤、及び、該脂肪蓄積抑制剤を添加した組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、イネにｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入することにより形質転換イネを作成し、該形質転換イネの種子からヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を含有する油脂成分を動物に投与すると、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸による動物生体内の脂肪組織減少効果を向上させ、卓越した脂肪蓄積抑制効果を得ることができ、そして各種臓器重量を低下させることなく、脂肪蓄積量を効率よく抑制できることを見い出した。本発明はこれらの知見に基いて成し遂げられたものである。
【０００８】
すなわち本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤からなる。本発明において、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料としては、コメ油或いはコメぬかを挙げることができる。
【０００９】
本発明において、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸は、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有される。該脂肪酸成分は、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であるような構造のものであることが好ましく、該ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の含有量は、０．０１重量％以上１０重量％以下であることが好ましい。
【００１０】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、これを飲食品、医薬、或いは動物飼料に添加して、脂肪蓄積抑制機能を有する飲食用、医薬用、又は動物飼料用の組成物として提供することができる。
【００１１】
すなわち具体的には本発明は、（１）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤や、（２）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料が、コメ油或いはコメぬかであることを特徴とする前記（１）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（３）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸が、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有されていることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（４）トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であることを特徴とする前記（３）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（５）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤からなる。
【００１２】
また、本発明は、（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤を添加したことを特徴とする飲食用、医薬用、又は動物飼料用組成物からなる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、卓越した脂肪蓄積抑制効果を有する脂肪蓄積抑制剤が提供される。この脂肪蓄積抑制剤は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を遊離又は脂質等の脂肪酸成分として含有し、該ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の働きにより、各種臓器重量を低下させることなく、動物生体内の脂肪組織を減少させることができる。しかも、その効果は、遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のみを含有する脂肪蓄積抑制剤、例えば、合成ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を主成分とする脂肪蓄積抑制剤と比べ、動物生体内の脂肪組織減少効果を向上させることができ、該遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸に比べて優れた効果を有する。
【００１４】
そして、本発明の脂肪蓄積抑制剤を用いることにより、優れた脂肪蓄積抑制機能を有する飲食用、医療用、又は動物飼料用の組成物を提供することができる。このように、本発明によれば、ヒト等の哺乳動物において体内に蓄積する脂肪量増加の抑制に有用な天然素材の脂肪蓄積抑制剤を提供することができ、又、該脂肪蓄積抑制剤を用いて、天然素材の安全、かつ優れた脂肪蓄積抑制機能を有する組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤からなる。本発明を実施するための最良の形態を以下に詳細に説明する。
【００１６】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−の合成に関与する酵素遺伝子］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子としては、嫌気性細菌Propionibacterium acnesから単離された遺伝子等が知られているが、本発明においては、この遺伝子以外にも、ｃｉｓ−９−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸など植物の種子に通常蓄積する脂肪酸を基質として、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を合成できる酵素の遺伝子であれば、上記ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子として使用することができる。
【００１７】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、上記嫌気性細菌等、この酵素を有する生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡから、当業者の常套手段を利用して調製できる。また、この酵素のアミノ酸配列情報に基づき、化学合成することによっても、調製できる。
【００１８】
例えば、ゲノムＤＮＡからｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を調製する場合には、上記Propionibacterium acnesを嫌気性条件下で培養増殖させ、遠心分離により菌体を回収し、回収した菌体からＣＴＡＢ法その他の定法によりゲノムＤＮＡを抽出した後、抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、この遺伝子を増幅し、単離すればよい。嫌気培養法には嫌気ジャー法、嫌気グローブボックス法、ロールストリークチューブ法などがあるが、例えば、嫌気ジャー法による場合は、合成樹脂性の上蓋つきジャーに菌体を懸濁した培地を入れ、蓋をして固定装置でとめてから、容器内部にアネロパック（三菱瓦斯化学株式会社）などの混合ガス発生装置を入れて培養する。
【００１９】
なお、ＰＣＲの際に使用するプライマーは、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子をコードしているＯＲＦ全てを含むように設計されていればよく、例えば、AX062088のシークエンスの５’用には＋１から＋３０の３０ｂｐを、３’用には＋１２４６から＋１２７５の３０ｂｐを使用することができる。またＰＣＲ条件も、特に限定されるものではないが、例えば、９４℃１分処理後、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃３分のサイクルを３０回くりかえした後、７２℃で１０分反応させることにより、この遺伝子を増幅できる。増幅した遺伝子は、ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、そのサイズを調べることにより確認できる。
【００２０】
また、ＤＮＡの化学合成には、市販のＤＮＡ合成機等が利用できる。ＤＮＡ合成機を用いれば、単に既知のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素をコードする遺伝子を取得することができるばかりではなく、植物の貯蔵タンパク質遺伝子でよく使用されるコドンを参考に、アミノ酸の縮重等を考慮して、この遺伝子を改変したＤＮＡも容易に取得することができる。例えば、イネ種子の場合には、イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子において高頻度に使用されるコドンを参考にして、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が、イネ種子でより効率良く翻訳されるように改変することができる。
【００２１】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の導入］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子のイネへの導入は、この遺伝子がイネ種子で発現可能なように組み込まれた組み換えベクターを、イネの細胞に導入して行うことができる。ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子をイネ種子で発現させるためには、この遺伝子を、イネ種子で機能し、遺伝子の発現を促進する働きを有する各種プロモーターやターミネーター等に連結して、その制御下に置かなければならない。プロモーターやターミネーター等の制御下となるように、所望のＤＮＡを配置し、連結すること等は、一般的な遺伝子工学技術を用いて実施することができる。
【００２２】
なお、本発明においてｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、脂質を合成している組織で機能するプロモーター、例えば、イネ種子で特異的に発現するプロモーターにより発現制御されることが好ましい。このようなプロモーターとしては、ナピン、クルシフェリン、グルテリン、プロラミン、グリシン、グロブリン等、種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、又は、脂質合成に関与する酵素、その他のタンパク質もしくは脂質を蓄積するオイルボディーを構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、例えば、アセチルＣｏＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターや、オレオシンをコードする遺伝子のプロモーターを例示することができる。もっとも、本発明において用いるプロモーターは、これらのプロモーターに限定されるものではなく、汎用のプロモーター、例えば、植物ウイルス由来のカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Mol.Gen.Genet、1990、220、389-392）等のプロモーターであっても構わない。
【００２３】
ターミネーターとしては、例えば、イネ種子に存在する植物貯蔵タンパク質グルテリンの遺伝子０．６ｋｂ ＧｌｕＢ−１のターミネーターを始め、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター等の汎用のターミネーター、その他ＤＮＡデーターベースに登録されている植物遺伝子のターミネーターを適宜選択して、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の３’末端に連結し、使用することができる。
【００２４】
プロモーター及びターミネーターと連結したｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を組み込み、イネの細胞に導入するためのベクターは、公知の種々のベクターから選択して使用すればよい。ベクター中に組み込まれた上記プロモーター、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子及びターミネーター等の構造を安定的に保持でき、イネ細胞のＤＮＡにこれらの構造を導入するにあたって支障を生じさせないものであれば、種類を問わず、また、発現ベクターであっても非発現ベクターであっても、使用できる。例えば、後記するように、イネ細胞へのベクター導入法として、アグロバクテリウムを介する間接導入法を採用する場合には、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Plant Cell Report、15、809-814、1995）やｐＢＩ１２１（EMBO J.、6、3901-3907、1987）等、２５ｂｐのボーダー配列を有するバイナリーベクターを、物理的手法を用いる直接導入法を採用する場合には、一連のｐＵＣシリーズのベクター等、大腸菌由来のプラスミドを使用することができる。
【００２５】
上記プロモーター、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子及びターミネーター等の構造のベクターへの組み込みは、定法に従い、制限酵素による所定の制限酵素サイトでのＤＮＡ切断と、リガーゼによるＤＮＡ結合とを適宜繰返せば、行うことができる。
【００２６】
なお、上記のようにしてｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子等の構造が組み込まれ、イネ細胞に導入されるベクターには、遺伝子導入処理後に、これらの構造がＤＮＡに導入された形質転換イネ細胞を選抜するための選抜マーカー遺伝子も、組み込んでおくことが好ましい。選抜マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）、カナマイシンまたはゲンタマイシンへの耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、および除草剤ホスフィノスリシンへの耐性を付与するアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。また、バイオサイエンスとインダストリーＶｏｌ．５５、Ｎｏ．３、１９９７、２１０−２１２等に記載のように、サイトカイニン関連遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を選抜マーカー遺伝子として、これらの選抜マーカー遺伝子を部位特異的組換え系等の脱離能を有するＤＮＡ因子と組合せて用いれば、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子等の遺伝子が導入され、かつ、その選抜の際に用いた選抜マーカー遺伝子が残存していない形質転換イネ種子を得ることができる。
【００２７】
イネ細胞への組換えベクターの導入は、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等のウイルスや、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（以下、Ａ．リゾジェネスと略す。）等の細菌を介して行う間接導入法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等の物理的手法を用いる直接導入法など、公知の方法にて行うことができる。また、この場合においてベクターが導入されるイネ細胞としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態のイネの細胞が含まれる。例えば、葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を、定法に従って、上記したそれぞれの導入法に適した状態となるように調製し、使用することができる。
【００２８】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネの作出］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネは、上記のようにして、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が組み込まれた組換えベクターが導入されたイネ細胞を、公知の方法、例えば、特開２００１-２９０７５号公報に記載の方法に従って培養することにより、作出することができる。
【００２９】
こうして得られた形質転換イネは、馴化過程を経た後、非形質転換体と同様に、つまり通常のイネと同様に育てることができ、自殖又は他殖によって、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が蓄積された種子を得ることができる。また、この形質転換イネからは、有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができ、更に、この形質転換イネ又は子孫の組織（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）から、クローンを量産することも可能である。
【００３０】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネからの脂肪蓄積抑制剤の取得］
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子から、ヘキサンにて抽出され得る成分（以下、単にヘキサン抽出画分とも記載する。）を有効成分として含む。このような成分が含まれていれば、単に、かかる形質転換イネ種子や、これを胚成分、胚乳成分、胡粉層を含む部分等に分別したものをそのまま、又は、これらをすりつぶしたり、フィルタープレス等により圧搾して得られたコメ油等を、本発明の脂肪蓄積抑制剤として使用できる。なお、ここで胡粉層とは、いわゆるコメぬかである。イネ種子のヘキサン抽出画分は、通常、コメぬかやコメ油中に多く含まれるので、上記のようにして形質転換イネから得られるコメぬかやコメ油は、本発明の脂肪蓄積抑制剤及びその原料として有用である。コメぬかやコメ油の取得方法は特に限定されず、公知の方法が採用できる。
【００３１】
また、本発明においては、形質転換イネ種子より上記のようにして得られた、コメぬかやコメ油等の脂肪蓄積抑制剤に対して、更に、有機溶媒抽出や、遠心分離等、公知の手段を組合せて抽出・分離・精製を行うことで、より高濃度・高純度のヘキサン抽出画分を含む脂肪蓄積抑制剤を得ることができる。特に、本発明の脂肪蓄積抑制剤を食品に使用する場合には、上記形質転換イネ種子より、必要な濃度のヘキサン抽出画分を含む中間製品を得た後、適宜、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭等の操作を施して精製することが好ましい。また、抽出・分離・精製操作の最終段階としてカラムクロマトグラフィー等を行い、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を単離して、医薬品等に使用することもできる。種子中の脂肪酸含量は常法により測定することができる。たとえば、葉や種子を材料としてBrowseらの方法（Anal．Biochem．、vol．152、p．141-145、1985）に従って脂肪酸のメチルエステルを調製し、これをヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーにて測定すればよい（Plant Physiol．Biochem．、vol．30、p．425-434、1992）。
【００３２】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネから取得された脂肪蓄積抑制剤の利用］
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのまま又はこれを適宜配合した医薬用組成物、飲食用組成物もしくは動物飼料用組成物として利用することができる。
【００３３】
また、本発明においては、上記のようにして得られた脂肪蓄積抑制剤を、更に加水分解したり、誘導体にしたりして、加工して利用することもできる。例えば加水分解は、本発明の形質転換イネ種子より得られたコメ油を、必要に応じて前処理した後、水酸化カリウム等のアルカリでケン化する、酸化亜鉛、酸化カルシウム、もしくは酸化マグネシウムを触媒として用い、中圧条件下で分解する（中圧触媒分解法）、又は、高圧下連続的に分解する（連続高圧分解法）等の化学的手法や、リパーゼもしくは微生物を用いる生物学的手法等により行うことができる。
【００３４】
このとき前処理は、加工するコメ油を融点以上の温度で放置して比重の大きなものを沈降させて除去したり、比重の軽いものを遠心分離して除去するといった物理的手法や、加工するコメ油に硫酸もしくはリン酸を加えて加熱攪拌し、タンパク質、有機色素類を分解した後、中和、洗浄したり、活性白土を加えて加熱処理し、分解物、着色物質、樹脂状物質等を吸着させて除去するといった化学的手法を、適宜用いることができる。得られた加水分解物は、更に、バッチ式、半連続式、連続式蒸留装置、又は精密蒸留装置を用いて蒸留精製する方法、過飽和状態の溶液又は溶融体を所定の温度に冷却し、生成した結晶を、圧搾法、Ｓｏｌｅｘｏｌ法（米国特許第２２９３６７４号）、Ｅｍｅｒｓｏｌ法（米国特許第２４２１１５７号）、Ｈｅｎｋｅｌ法（J．Ａｍ．Oil Chem．Soc．、vol．45、471、1968）等の方法を用いて分取する方法等により、分離精製することもできる。
【００３５】
上記コメ油の加水分解物は、生理学的に許容される塩、水和物並びに溶媒和物等であってもよい。生理学的に許容される塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩等があげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等があげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２,６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等との塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等との塩があげられる。
【００３６】
本発明の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として配合した組成物、例えば、医薬用組成物、飲食用組成物もしくは動物飼料用組成物は、これらの組成物の添加剤として公知の、適当な添加剤を必要に応じて配合し、定法により調製することができる。
【００３７】
医薬用組成物として利用する場合は、本発明の脂肪蓄積抑制剤を、薬理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等の製剤用添加物と共に、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、調製するのが好ましい。例えば、錠剤、カプセル剤等の調製に用いられる添加剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、又はアラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、セルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤、コーンスターチ、ゼラチン、又はアルギン酸等の膨化剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ショ糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリー等の香味剤等を例示することができる。また、錠剤は必要に応じて腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングを施す場合もある。カプセル剤については、更に油脂のような液状担体が用いられる場合もある。製剤は、打錠又は充填等の当業界で周知の方法を用いて行うことができる。
【００３８】
こうして、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤等として調製すれば、経口的に使用することができ、また、無菌の水性液もしくは油性液として注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤等として調製すれば、非経口的に使用することができる。なお、これらの医薬品組成物における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００３９】
かくして得られる、本発明の脂肪蓄積抑制剤を配合した医薬品組成物は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや、ヒト以外の哺乳動物に対して、その体内の脂肪蓄積を抑制する目的で投与することができる。この場合の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法等により差異はあるが、例えば、上記目的でヒトに経口投与する場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約５ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは約３０ｍｇ〜３ｇ、より好ましくは約３００ｍｇ〜３ｇを、１〜数回に分けて投与するとよい。ヒト以外の他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を同様に投与することができる。
【００４０】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのままでも飲食用に供することができる。しかし、各種の担体及び／又は添加剤と適宜混和して調製し、飲食用組成物として供するのが好ましい。この場合において、飲食用組成物全体に対する本発明の脂肪蓄積抑制剤の配合量は、そのヘキサン抽出画分の濃度及び純度によっても異なるが、例えば、本発明の脂肪蓄積抑制剤としてコメそのもの、コメぬかもしくはコメ油、又はこれらの加工物を使用するのであれば、固形分換算で０．０１〜１０重量％の範囲にあればよく、好ましくは０．０５〜２重量％、特に好ましくは０．０８〜０．８重量％の範囲にあればよい。また、この飲食用組成物中の脂肪分に対しては、固形分換算で０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、特に好ましくは１．２重量％以上あればよい。
【００４１】
上記飲食用組成物の担体としては、例えば、キャリアー担体、エクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、ブドウ糖、乳糖等の賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の結合剤、水、エタノール、植物油等の溶媒、溶解補助剤、重曹等の緩衝剤、溶解促進剤、ナトリウムＣＭＣ、ＨＰＭＣ、カンテン、ゼラチン等のゲル化剤、ナトリウムＣＭＣ、ナトリウムアルギネート等の懸濁化剤等を使用することができる。しかし、これらに限らず、飲食用組成物の担体として許容されるものであれば、特に制限なく使用することができる。
【００４２】
また、上記飲食用組成物の添加剤としては、例えば、グルタミン酸、イノシン酸等の可食性、嗜好性を向上させるための調味料、バニラ、ミント、ローズマリー、リナロール、天然香料等の香料、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、パントテン酸、ニコチン酸等のビタミン類、ステビア等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸等の有機酸、着色料、湿気防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、茶抽出物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、オレンジ、グレープ、アップル、モモ、パイナップル、ナシ、プラム、サクランボ、パパイア、トマト、メロン、イチゴ、ラズベリー等のフルーツ抽出物等の天然植物抽出物を使用することができる。しかし、この添加剤についても、これらに限らず、飲食用組成物の添加剤として許容されるものであれば、特に制限なく使用することができる。
【００４３】
具体的に、本発明の脂肪蓄積抑制剤が配合される飲食用組成物としては、コーヒー、紅茶、緑茶、ウーロン茶等の茶飲料類、豆乳、青汁、果物ジュース、野菜ジュース等の果実野菜飲料類、ヨーグルト等の乳酸菌飲料類、牛乳等の乳飲料類、コーラ等の炭酸飲料類、各種スポーツドリンク類、パン類等のベーカリー製品、米飯、麺類、豆腐等の大豆加工食品、ソーセージやハム等の魚畜肉加工食品、ケーキ、クッキー、饅頭、煎餅、アイスクリーム、プデイング、羊羹、キャンディー、チョコレート等の菓子類、バター、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、マーガリン、ショートニング等の加工油脂食品、マヨネーズ、ドレッシング、醤油、味噌、ソース等の調味料、コンニャク、漬け物類等が挙げられる。
【００４４】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのまま動物飼料用に供してもよいが、可食性や嗜好性を向上するための調味料、香料等の添加剤と適宜混和して調製し、動物飼料用組成物として供することもできる。このとき、一定の物性を保つため、乳化剤や安定剤を配合してもよい。また、本発明の脂肪蓄積抑制剤は、他の動物飼料用組成物に直接振りかけたり、混合したりして用いてもよく、種々の加工飼料、ペットフードの原料素材として用いてもよい。この場合において、動物飼料用組成物全体に対する本発明の脂肪蓄積抑制剤の配合量は、そのヘキサン抽出画分の濃度及び純度によっても異なるが、例えば、本発明の脂肪蓄積抑制剤としてコメそのもの、コメぬかもしくはコメ油、又はこれらの加工物を使用するのであれば、固形分換算で０．０１〜１０重量％の範囲にあればよく、好ましくは０．０５〜２重量％、特に好ましくは０．０８〜０．８重量％の範囲にあればよい。また、この動物飼料用組成物中の脂肪分に対しては、固形分換算で０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、特に好ましくは１．２重量％以上あればよい。
【００４５】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、分子生物学的手法についてはMolecular Cloning（Sambrook et. al., 1989）又は製造業者の取り扱い説明書に従い行われた。
【実施例１】
【００４６】
この実施例では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換イネを作成し、この形質転換イネ種子について脂質の分析を行った。
【００４７】
［（１）Propionibacterium acnesからのｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の単離］
Propionibacterium acnesの菌体を懸濁したアネロコロンビアウサギ血清培地３ｍｌを合成樹脂性の上蓋つきジャーに入れ、固定装置でとめた後、容器内部にアネロパック(三菱瓦斯化学株式会社)を入れて３日間培養した。この培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体に５６７μｌのＴＥと３μlの２０ｍｇ／ｍｌ proteinaseＫを加えて懸濁し、３７℃で１時間反応させた後、１００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えて撹拌し、更に、８０μlの１０％ＣＴＡＢ／０．７Ｍ ＮａＣｌを加えて６５℃で１０分間反応させてから、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４:１）溶液をこの液に加え、ボルテックスで懸濁後、分離してきた上層を新しいチューブに回収した。
【００４８】
次いで、回収した上層に等量のフェノール：クロロホルム（１：１）混合液を加えて懸濁し、遠心分離を行って再び上層を回収した後、この上層に０．６倍量のイソプロパノールを加え、１５０００回転で遠心分離を行うことにより、Propionibacterium acnesのゲノムＤＮＡを沈殿として得た。このようにして得られたPropionibacterium acnesのゲノムＤＮＡは、１ｍｌの７０％エタノールを加えて洗浄した後、遠心分離を行って回収し、乾燥させてから、５０μｌのＴＥに懸濁して保存した。
【００４９】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、上記Propionibacterium acnesのゲノムＤＮＡ懸濁液１μｌを取分けて、ＰＣＲを行なうことにより単離した。ＰＣＲ用プライマーとしては、ＡＸ０６２０８８のシークエンスの５’用に＋１から＋３０の３０ｂｐを５’側プライマーとして、３’用に＋１２４６から＋１２７５の３０ｂｐを３ ’側プライマーとして使用した。また、ＰＣＲ反応は、９４℃にて１分処理した後、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃３分のサイクルを３０回繰返してから、７２℃にて１０分処理することにより行った。目的とするｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の増幅は、ＰＣＲ反応後の試料の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、１．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることにより確認した。
【００５０】
［（２）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を含む、イネ形質転換用ベクターｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの作製］
プラスミドｐＴＬ７（H.Ebinuma et al.、Molecular Methods of Plant Analysis、22:95、2002）のＥｃｏ ＲＩ−Ｓｓｅ ８３８７Ｉ制限酵素部位間に、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＳｓｅ ８３８７Ｉで切り出した、イネオレオシンプロモーター、上記（１）にて単離したｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子、及び、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルを連結した遺伝子断片を挿入し、プラスミドｐＴＬ−Ｏ／ＰＡＩＳＯＭを得た。
【００５１】
目的とするプラスミドは、このｐＴＬ−Ｏ／ＰＡＩＳＯＭのＳｓｅ８３８７Ｉ制限酵素部位に、ｐＮＰＩ １３０Ｈｍ（ＷＯ０４／０８７９１０）より制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで切出した、酵母の部位特異的組換え系の組換え配列Ｒｓに挟まれた領域を挿入することにより得られ、これをプラスミドｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ（２００６年１２月１８日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ―２１１３６として寄託されている。）と命名した。
【００５２】
［（３）アグロバクテリウムへのｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの導入］
アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ.ツメファシエンス）ＥＨＡ１０５株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（５ｇ／ｌビーフエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌショ糖、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した後、培養液を６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体は、２０ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心することにより集菌し、この菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、プラスミド導入用菌液とした。
【００５３】
０．５ｍｌチューブ内で、上記プラスミド導入用菌液５０μｌとプラスミドｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ３μｌとを混合し、エレクトロポレーション法（ジーンパルサーIIシステム［BIORAD社］）を用いて、Ａ.ツメファシエンスＥＨＡ１０５株へのｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ導入処理を行った。ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ導入処理後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で、振とうしつつ１時間培養を行ってから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し、２８℃、２日間培養した。次いで、生じた菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して更に培養し、増殖した菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出して、これらの菌体にｐＯ／ＰＡＩＳＯＭが導入されていることを確認した。こうしてｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの導入が確認されたＡ．ツメファシエンスを、ＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）と命名した。
【００５４】
［（４）感染材料の調製］
イネ品種「日本晴」の完熟種子を、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール（ｐ９３−９８）の方法に従い殺菌した後、この完熟種子を、Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類（Chu C.C.、1978, Proc.Symp.Plant TissueCuture、Sience Press Peking、pp.43-50）、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．８）に置床し、サージカルテープでシールしてから２８℃明所で培養して発芽させ、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）による感染材料とした。
【００５５】
［（５）アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）によるイネの形質転換］
ＹＥＢ寒天培地（１５ｇ／ｌバクトアガー、他の組成は上記に同じ。）にて培養したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）を、ＹＥＢ液体培地に移植して、２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを含むＮ６液体培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、ｐＨ＝５．８）に、ＯＤ６３０＝０．１５となるように懸濁し、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。
【００５６】
（４）で調整したイネの発芽種子を５０ｍｌチューブに入れ、感染用アグロバクテリウム懸濁液を注いで１．５分間浸漬した。浸漬後、アグロバクテリウム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去してから、この種子を、共存培養培地Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．２）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃暗所で３日間培養し、次いで、Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養した。
【００５７】
上記Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地での培養開始から１週間後、発芽した芽を胚盤組織から除去して、残った胚盤組織を、Ｎ６Ｃｌ４ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、４ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）で１週間培養し、更に、ＭＳＲＣ培地（ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Murashige、T. and Skoog、F.、1962 Physiol. Plant.、15、473）、３０ｇ／ｌシュークロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養することにより、芽又は幼植物体を再分化させた。この再分化に要した期間は、ＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）との共存培養開始から１ヶ月乃至２ヶ月であった。
【００５８】
［（６）形質転換イネの作成］
（５）にて胚盤組織から再分化させた芽又は幼植物体を、発根培地に移植して背丈２０ｃｍ程度の幼苗となるまで生育させた後、この幼苗から、ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の存在を確認した。次いで、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネを馴化・栽培し、完熟種子（Ｔ１種子）を収穫して、以下の脂肪酸分析に供した。
【００５９】
［（７）形質転換イネ種子の脂肪酸分析］
ＷＯ０３/０２７２９６号公報記載の実施例２の方法に従って、（６）で得られたＴ１種子の全粒中に含まれる脂質の脂肪酸組成を分析した。すなわち、形質転換イネのＴ１種子及び非形質転換イネの種子、各１粒を乳鉢及び乳棒ですりつぶし、それぞれに１．５ｍｌの０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノールを加えて懸濁し、懸濁液をガラス管に移して５０℃で１時間メチル化処理した後、ガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ分析）を行い、両者を比較することにより、形質転換イネのＴ１種子全体に含まれる脂質の脂肪酸組成を分析した。この結果、形質転換体のＴ１種子（図１ｂ）では、非形質転換イネの種子（図１ａ）には見られない新たなピークが、化学合成された共役脂肪酸であるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のピークと同じ時間に検出され、該形質転換体Ｔ１種子中では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が生成していることが明らかになった。
【００６０】
なお、図１中、ピーク近辺に付した符号は、ダブルコロンの前に記載された数値が炭素数を、ダブルコロンの後ろに記載された数値が不飽和結合の数を、また、ｃ及びｔはそれぞれシス（ｃｉｓ）及びトランス（ｔｒａｎｓ）を示している。従って、１８：０は当該ピークがステアリン酸（stearic acid）のメチルエステルによるものであることを表し、同様に、１８：１はオレイン酸（oleic acid）、１８：２はリノール酸（linoleic acid）、１８：３はリノレン酸（α-linoleic acid）、２０：０はアラキジン酸（arachidic acid）、２０：１はエイコセン酸（eicosenoic acid）、そして１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡはｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸（conjugated linoleic acid：CLA）のメチルエステルによるものであることを表している。
【実施例２】
【００６１】
この実施例では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換イネの種子より得られるヘキサン抽出画分について、脂肪蓄積抑制効果を調査した。
【００６２】
［（１）形質転換イネ種子からのヘキサン抽出画分の分離と、その脂肪酸組成の分析］
実施例１の（６）にて収穫した形質転換イネのＴ１種子約７８０gを小型粉砕機で粉砕し、等量のヘキサンを加え、懸濁して一晩静置した後、懸濁液をフィルターでろ過してヘキサンを回収すると共に、残渣を分離した。この残渣について同様の操作を更に２度行った後、回収したヘキサンを合せ、エバポレーターにてヘキサンを飛ばして濃縮し、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分（コメ油）１７．５ｇを得た。得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分について、脂肪酸組成の分析を、以下のようにして行った。
【００６３】
すなわち、まず抽出画分一滴をガラス管に垂らし、それに１ｍｌの０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノールを加えて、５０℃で１時間、メチル化処理してから、１．５ｍｌの０．９Ｍ ＮａＣｌと１ｍｌのヘキサンを加えて攪拌し、２０００×ｇ、５分間遠心して上清を回収、真空乾燥した後、更にヘキサン２０μｌに溶解して、試料１μｌを取分け、これをＧＣ分析用試料として、ＧＣ１８Ａ（Shimadzu社）を用い、ＧＣ分析を行った。このとき、キャピラリーカラムは６０ｍ×０．２５ｍｍ、ＩＤ０．２５μｍのＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製ＴＣ−７０を用い、１５０℃から２４０℃に３℃／分で昇温させた後、２４０℃で６分間恒温に保って分析を行った。結果を表１に示す。
【００６４】
表１より明らかなように、実施例１で得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分には、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が、ヘキサン抽出画分中１．０重量％も含有されていた。
【００６５】
【表１】
【００６６】
［（２）形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分のマウスにおける脂肪蓄積抑制効果］
６週齢のＩＣＲ系ＣＤ−１雄マウス１５匹を５匹ずつ３群に分け、うち１群（試験群）には（１）で得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分を、もう１群（ブランク群）には非形質転換イネ種子のコメ油（ホーソー油脂化学社製『スーパーサラダ油コシヒカリ』）を、更に残りの１群（対照群）には化学合成ＣＬＡ ０．２５％を含有するコメ油（日清オイリオ（株）にて化学合成されたＣＬＡ(ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を含有）を、上記非形質転換イネ種子のコメ油に添加して調製）を、オリエンタル酵母（株）社製の精製飼料（マウス・ラット用標準配合ＡＩＮ−９３Ｇ）に配合した、米国国立栄養研究所（The American Institute of Nutrition：ＡＩＮ）推奨のＡＩＮ−９３Ｇ組成に基づく純化食（表２：マウスに与えた食餌の組成）を与え、１８日間自由摂食させて飼育した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
また、上記食餌中の脂肪成分の脂肪酸組成を表３（食餌中の脂肪成分の脂肪酸組成（重量％））に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
上記飼育期間中、食餌及び水は一週間に一回の頻度で交換し、２日から３日毎にマウスの摂食量と体重を測定した。飼育期間終了後のマウスは、絶食させることなく、ジエチルエーテルの吸入麻酔下で後大静脈より採血してから屠殺し、内臓組織(肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺)及び内臓脂肪組織(腎周辺と副睾丸周辺の白色脂肪組織)の重量を測定した。その結果を表４（腎臓周辺脂肪組織への影響）及び表５（副睾丸周辺脂肪組織への影響）に示す。
【００７１】
表４及び表５より明らかなように、腎臓周辺脂肪組織重量及び副睾丸周辺脂肪組織重量共に、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分を食餌に配合した試験群では、非形質転換イネ種子のコメ油を食餌に配合したブランク群に比べ低値を示し、特に、副睾丸周辺脂肪組織の重量は、著しい減少を示した。また、これらの脂肪組織重量の差はいずれも、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ ｔｅｓｔによる有意差検定（Ｐ＜０．０５）で有意差が認められ、形質転換イネ種子から得られるヘキサン抽出画分の脂肪蓄積抑制剤としての効果が実証された。
【００７２】
一方、化学合成ＣＬＡ ０．２５％を含有するコメ油を食餌に配合した対照群では、腎臓周辺脂肪組織の重量に関してはブランク群に比べて低値を示したが、その差は上記試験群とブランク群との間で認められた差よりも小さく、副睾丸周辺脂肪組織の重量に関しては、むしろブランク群よりも高値を示し、化学合成ＣＬＡの脂肪蓄積抑制剤としての効果は、形質転換イネ種子から得られるヘキサン抽出画分よりもかなり劣ることが明らかになった。表３より明らかなように、試験群及び対照群に与えた食餌中には、どちらも１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡが１．０％含まれている。にもかかわらず、試験群と対照群とで、脂肪蓄積抑制剤としての効果に大きな差が生じた理由としては、この１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡの存在形態の相違が考えられる。すなわち、対照群に与えた食餌中の１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡは、科学的に合成されたものであるため、全て遊離脂肪酸として存在しているが、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分中に存在する１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡは、全体の約７０％がリン脂質やトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）として存在しており、遊離脂肪酸として存在するのは約２８％に過ぎない（非特許文献３）。このような存在形態の相違が、１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡの脂肪蓄積抑制剤としての効果に、上記のような差をもたらしたものと考えられる。
【００７３】
なお、以上の実験において、各内臓組織自体の重量は、試験群、ブランク群及び対象群の間で有意差は存在しなかった。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の実施例において、本発明における合成酵素遺伝子を導入して作製した形質転換イネ種子の脂肪酸分析試験におけるガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ分析）の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子より抽出される成分或いは該成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤、及び該脂肪蓄積抑制剤を含む食品、医薬又は動物飼料用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
共役リノール酸（幾つかの立体異性体や位置異性体がある。）は、モデル動物を使った実験で種々の生理機能を有することが確認されている。例えば、抗癌作用、免疫機能調節作用、動脈硬化の予防・退縮、抗肥満等の作用があることが知られている（非特許文献１、２）。また、ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−オクタデカジエン酸、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−オクタデカジエン酸等の共役リノール酸を肝臓脂肪蓄積抑制組成物として用いるものが開示されている（特許文献１）。この特許文献に具体的に記載されているものは、コーン油、サフラワー油、バター脂等と、ミルクホエータンパク質とを混合し、反応させて製造された９、１１−オクタデカジエン酸と１０、１２−オクタデカジエン酸等を含んだリノール酸の天然の供給源から製造されたようなものである。
【０００３】
上記のような共役リノール酸の生理機能についての実験の多くは、化学合成された脂肪酸である共役リノール酸（ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−共役リノール酸,ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の混合物）を使って行われている。一方で、共役リノール酸やリノレン酸を、リノール酸やリノレン酸を含有する油脂に、イソメラーゼを働かせて、製造する方法が開示されており、かかる共役リノール酸ｃｉｓ−９−，ｔｒａｎｓ−１１−共役リノール酸とｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子も、それぞれLactobacillus reuteri（特許文献３）Propionibacterium acnes(特許文献４)から単離されている。
【０００４】
最近、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の合成酵素遺伝子をイネに導入して、種子にその共役脂肪酸を蓄積させた遺伝子組換えイネが作出されている（非特許文献３）。また、プニカ酸のような共役トリエン型脂肪酸に関与する遺伝子をナタネ、ひまわり、パーム椰子や、トウモロコシ、イネのような植物に導入し、該植物から採取される植物油等を有効成分として、脂肪蓄積抑制剤として利用することが開示されている（特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−７９９８７号公報。
【特許文献２】特開２００５−２３９７０４号公報。
【特許文献３】ＷＯ９９／３２６０４（特表２００２−５０８９２９号公報）。
【特許文献４】ＷＯ０１／００８４６（特表２００３−５０３０６１号公報）。
【非特許文献１】池田郁男、日本油化学会誌、第４８巻、第１０号、２１―２８頁、１９９９年
【非特許文献２】菅野道廣、食品機能素材ＩＩＩ、１１０−１１２頁、シーエムシー出版、２００５年
【非特許文献３】Transgenic Res.、2006、15:95-100
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸による動物生体内の脂肪組織減少効果が向上し、卓越した脂肪蓄積抑制効果を有する脂肪蓄積抑制剤、及び、該脂肪蓄積抑制剤を添加した組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、イネにｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入することにより形質転換イネを作成し、該形質転換イネの種子からヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を含有する油脂成分を動物に投与すると、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸による動物生体内の脂肪組織減少効果を向上させ、卓越した脂肪蓄積抑制効果を得ることができ、そして各種臓器重量を低下させることなく、脂肪蓄積量を効率よく抑制できることを見い出した。本発明はこれらの知見に基いて成し遂げられたものである。
【０００８】
すなわち本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤からなる。本発明において、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料としては、コメ油或いはコメぬかを挙げることができる。
【０００９】
本発明において、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸は、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有される。該脂肪酸成分は、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であるような構造のものであることが好ましく、該ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の含有量は、０．０１重量％以上１０重量％以下であることが好ましい。
【００１０】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、これを飲食品、医薬、或いは動物飼料に添加して、脂肪蓄積抑制機能を有する飲食用、医薬用、又は動物飼料用の組成物として提供することができる。
【００１１】
すなわち具体的には本発明は、（１）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤や、（２）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料が、コメ油或いはコメぬかであることを特徴とする前記（１）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（３）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸が、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有されていることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（４）トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であることを特徴とする前記（３）に記載の脂肪蓄積抑制剤や、（５）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤からなる。
【００１２】
また、本発明は、（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤を添加したことを特徴とする飲食用、医薬用、又は動物飼料用組成物からなる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、卓越した脂肪蓄積抑制効果を有する脂肪蓄積抑制剤が提供される。この脂肪蓄積抑制剤は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を遊離又は脂質等の脂肪酸成分として含有し、該ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸の働きにより、各種臓器重量を低下させることなく、動物生体内の脂肪組織を減少させることができる。しかも、その効果は、遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のみを含有する脂肪蓄積抑制剤、例えば、合成ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を主成分とする脂肪蓄積抑制剤と比べ、動物生体内の脂肪組織減少効果を向上させることができ、該遊離状態のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸に比べて優れた効果を有する。
【００１４】
そして、本発明の脂肪蓄積抑制剤を用いることにより、優れた脂肪蓄積抑制機能を有する飲食用、医療用、又は動物飼料用の組成物を提供することができる。このように、本発明によれば、ヒト等の哺乳動物において体内に蓄積する脂肪量増加の抑制に有用な天然素材の脂肪蓄積抑制剤を提供することができ、又、該脂肪蓄積抑制剤を用いて、天然素材の安全、かつ優れた脂肪蓄積抑制機能を有する組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤からなる。本発明を実施するための最良の形態を以下に詳細に説明する。
【００１６】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−の合成に関与する酵素遺伝子］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子としては、嫌気性細菌Propionibacterium acnesから単離された遺伝子等が知られているが、本発明においては、この遺伝子以外にも、ｃｉｓ−９−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸など植物の種子に通常蓄積する脂肪酸を基質として、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を合成できる酵素の遺伝子であれば、上記ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子として使用することができる。
【００１７】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、上記嫌気性細菌等、この酵素を有する生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡから、当業者の常套手段を利用して調製できる。また、この酵素のアミノ酸配列情報に基づき、化学合成することによっても、調製できる。
【００１８】
例えば、ゲノムＤＮＡからｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を調製する場合には、上記Propionibacterium acnesを嫌気性条件下で培養増殖させ、遠心分離により菌体を回収し、回収した菌体からＣＴＡＢ法その他の定法によりゲノムＤＮＡを抽出した後、抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、この遺伝子を増幅し、単離すればよい。嫌気培養法には嫌気ジャー法、嫌気グローブボックス法、ロールストリークチューブ法などがあるが、例えば、嫌気ジャー法による場合は、合成樹脂性の上蓋つきジャーに菌体を懸濁した培地を入れ、蓋をして固定装置でとめてから、容器内部にアネロパック（三菱瓦斯化学株式会社）などの混合ガス発生装置を入れて培養する。
【００１９】
なお、ＰＣＲの際に使用するプライマーは、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子をコードしているＯＲＦ全てを含むように設計されていればよく、例えば、AX062088のシークエンスの５’用には＋１から＋３０の３０ｂｐを、３’用には＋１２４６から＋１２７５の３０ｂｐを使用することができる。またＰＣＲ条件も、特に限定されるものではないが、例えば、９４℃１分処理後、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃３分のサイクルを３０回くりかえした後、７２℃で１０分反応させることにより、この遺伝子を増幅できる。増幅した遺伝子は、ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、そのサイズを調べることにより確認できる。
【００２０】
また、ＤＮＡの化学合成には、市販のＤＮＡ合成機等が利用できる。ＤＮＡ合成機を用いれば、単に既知のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素をコードする遺伝子を取得することができるばかりではなく、植物の貯蔵タンパク質遺伝子でよく使用されるコドンを参考に、アミノ酸の縮重等を考慮して、この遺伝子を改変したＤＮＡも容易に取得することができる。例えば、イネ種子の場合には、イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子において高頻度に使用されるコドンを参考にして、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が、イネ種子でより効率良く翻訳されるように改変することができる。
【００２１】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の導入］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子のイネへの導入は、この遺伝子がイネ種子で発現可能なように組み込まれた組み換えベクターを、イネの細胞に導入して行うことができる。ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子をイネ種子で発現させるためには、この遺伝子を、イネ種子で機能し、遺伝子の発現を促進する働きを有する各種プロモーターやターミネーター等に連結して、その制御下に置かなければならない。プロモーターやターミネーター等の制御下となるように、所望のＤＮＡを配置し、連結すること等は、一般的な遺伝子工学技術を用いて実施することができる。
【００２２】
なお、本発明においてｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、脂質を合成している組織で機能するプロモーター、例えば、イネ種子で特異的に発現するプロモーターにより発現制御されることが好ましい。このようなプロモーターとしては、ナピン、クルシフェリン、グルテリン、プロラミン、グリシン、グロブリン等、種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、又は、脂質合成に関与する酵素、その他のタンパク質もしくは脂質を蓄積するオイルボディーを構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、例えば、アセチルＣｏＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターや、オレオシンをコードする遺伝子のプロモーターを例示することができる。もっとも、本発明において用いるプロモーターは、これらのプロモーターに限定されるものではなく、汎用のプロモーター、例えば、植物ウイルス由来のカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Mol.Gen.Genet、1990、220、389-392）等のプロモーターであっても構わない。
【００２３】
ターミネーターとしては、例えば、イネ種子に存在する植物貯蔵タンパク質グルテリンの遺伝子０．６ｋｂ ＧｌｕＢ−１のターミネーターを始め、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター等の汎用のターミネーター、その他ＤＮＡデーターベースに登録されている植物遺伝子のターミネーターを適宜選択して、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の３’末端に連結し、使用することができる。
【００２４】
プロモーター及びターミネーターと連結したｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を組み込み、イネの細胞に導入するためのベクターは、公知の種々のベクターから選択して使用すればよい。ベクター中に組み込まれた上記プロモーター、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子及びターミネーター等の構造を安定的に保持でき、イネ細胞のＤＮＡにこれらの構造を導入するにあたって支障を生じさせないものであれば、種類を問わず、また、発現ベクターであっても非発現ベクターであっても、使用できる。例えば、後記するように、イネ細胞へのベクター導入法として、アグロバクテリウムを介する間接導入法を採用する場合には、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Plant Cell Report、15、809-814、1995）やｐＢＩ１２１（EMBO J.、6、3901-3907、1987）等、２５ｂｐのボーダー配列を有するバイナリーベクターを、物理的手法を用いる直接導入法を採用する場合には、一連のｐＵＣシリーズのベクター等、大腸菌由来のプラスミドを使用することができる。
【００２５】
上記プロモーター、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子及びターミネーター等の構造のベクターへの組み込みは、定法に従い、制限酵素による所定の制限酵素サイトでのＤＮＡ切断と、リガーゼによるＤＮＡ結合とを適宜繰返せば、行うことができる。
【００２６】
なお、上記のようにしてｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子等の構造が組み込まれ、イネ細胞に導入されるベクターには、遺伝子導入処理後に、これらの構造がＤＮＡに導入された形質転換イネ細胞を選抜するための選抜マーカー遺伝子も、組み込んでおくことが好ましい。選抜マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）、カナマイシンまたはゲンタマイシンへの耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、および除草剤ホスフィノスリシンへの耐性を付与するアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。また、バイオサイエンスとインダストリーＶｏｌ．５５、Ｎｏ．３、１９９７、２１０−２１２等に記載のように、サイトカイニン関連遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を選抜マーカー遺伝子として、これらの選抜マーカー遺伝子を部位特異的組換え系等の脱離能を有するＤＮＡ因子と組合せて用いれば、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子等の遺伝子が導入され、かつ、その選抜の際に用いた選抜マーカー遺伝子が残存していない形質転換イネ種子を得ることができる。
【００２７】
イネ細胞への組換えベクターの導入は、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等のウイルスや、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（以下、Ａ．リゾジェネスと略す。）等の細菌を介して行う間接導入法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等の物理的手法を用いる直接導入法など、公知の方法にて行うことができる。また、この場合においてベクターが導入されるイネ細胞としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態のイネの細胞が含まれる。例えば、葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を、定法に従って、上記したそれぞれの導入法に適した状態となるように調製し、使用することができる。
【００２８】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネの作出］
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネは、上記のようにして、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が組み込まれた組換えベクターが導入されたイネ細胞を、公知の方法、例えば、特開２００１-２９０７５号公報に記載の方法に従って培養することにより、作出することができる。
【００２９】
こうして得られた形質転換イネは、馴化過程を経た後、非形質転換体と同様に、つまり通常のイネと同様に育てることができ、自殖又は他殖によって、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が蓄積された種子を得ることができる。また、この形質転換イネからは、有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができ、更に、この形質転換イネ又は子孫の組織（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）から、クローンを量産することも可能である。
【００３０】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネからの脂肪蓄積抑制剤の取得］
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子から、ヘキサンにて抽出され得る成分（以下、単にヘキサン抽出画分とも記載する。）を有効成分として含む。このような成分が含まれていれば、単に、かかる形質転換イネ種子や、これを胚成分、胚乳成分、胡粉層を含む部分等に分別したものをそのまま、又は、これらをすりつぶしたり、フィルタープレス等により圧搾して得られたコメ油等を、本発明の脂肪蓄積抑制剤として使用できる。なお、ここで胡粉層とは、いわゆるコメぬかである。イネ種子のヘキサン抽出画分は、通常、コメぬかやコメ油中に多く含まれるので、上記のようにして形質転換イネから得られるコメぬかやコメ油は、本発明の脂肪蓄積抑制剤及びその原料として有用である。コメぬかやコメ油の取得方法は特に限定されず、公知の方法が採用できる。
【００３１】
また、本発明においては、形質転換イネ種子より上記のようにして得られた、コメぬかやコメ油等の脂肪蓄積抑制剤に対して、更に、有機溶媒抽出や、遠心分離等、公知の手段を組合せて抽出・分離・精製を行うことで、より高濃度・高純度のヘキサン抽出画分を含む脂肪蓄積抑制剤を得ることができる。特に、本発明の脂肪蓄積抑制剤を食品に使用する場合には、上記形質転換イネ種子より、必要な濃度のヘキサン抽出画分を含む中間製品を得た後、適宜、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭等の操作を施して精製することが好ましい。また、抽出・分離・精製操作の最終段階としてカラムクロマトグラフィー等を行い、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を単離して、医薬品等に使用することもできる。種子中の脂肪酸含量は常法により測定することができる。たとえば、葉や種子を材料としてBrowseらの方法（Anal．Biochem．、vol．152、p．141-145、1985）に従って脂肪酸のメチルエステルを調製し、これをヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーにて測定すればよい（Plant Physiol．Biochem．、vol．30、p．425-434、1992）。
【００３２】
［ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネから取得された脂肪蓄積抑制剤の利用］
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのまま又はこれを適宜配合した医薬用組成物、飲食用組成物もしくは動物飼料用組成物として利用することができる。
【００３３】
また、本発明においては、上記のようにして得られた脂肪蓄積抑制剤を、更に加水分解したり、誘導体にしたりして、加工して利用することもできる。例えば加水分解は、本発明の形質転換イネ種子より得られたコメ油を、必要に応じて前処理した後、水酸化カリウム等のアルカリでケン化する、酸化亜鉛、酸化カルシウム、もしくは酸化マグネシウムを触媒として用い、中圧条件下で分解する（中圧触媒分解法）、又は、高圧下連続的に分解する（連続高圧分解法）等の化学的手法や、リパーゼもしくは微生物を用いる生物学的手法等により行うことができる。
【００３４】
このとき前処理は、加工するコメ油を融点以上の温度で放置して比重の大きなものを沈降させて除去したり、比重の軽いものを遠心分離して除去するといった物理的手法や、加工するコメ油に硫酸もしくはリン酸を加えて加熱攪拌し、タンパク質、有機色素類を分解した後、中和、洗浄したり、活性白土を加えて加熱処理し、分解物、着色物質、樹脂状物質等を吸着させて除去するといった化学的手法を、適宜用いることができる。得られた加水分解物は、更に、バッチ式、半連続式、連続式蒸留装置、又は精密蒸留装置を用いて蒸留精製する方法、過飽和状態の溶液又は溶融体を所定の温度に冷却し、生成した結晶を、圧搾法、Ｓｏｌｅｘｏｌ法（米国特許第２２９３６７４号）、Ｅｍｅｒｓｏｌ法（米国特許第２４２１１５７号）、Ｈｅｎｋｅｌ法（J．Ａｍ．Oil Chem．Soc．、vol．45、471、1968）等の方法を用いて分取する方法等により、分離精製することもできる。
【００３５】
上記コメ油の加水分解物は、生理学的に許容される塩、水和物並びに溶媒和物等であってもよい。生理学的に許容される塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩等があげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等があげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２,６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等との塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等との塩があげられる。
【００３６】
本発明の脂肪蓄積抑制剤を有効成分として配合した組成物、例えば、医薬用組成物、飲食用組成物もしくは動物飼料用組成物は、これらの組成物の添加剤として公知の、適当な添加剤を必要に応じて配合し、定法により調製することができる。
【００３７】
医薬用組成物として利用する場合は、本発明の脂肪蓄積抑制剤を、薬理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等の製剤用添加物と共に、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、調製するのが好ましい。例えば、錠剤、カプセル剤等の調製に用いられる添加剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、又はアラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、セルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤、コーンスターチ、ゼラチン、又はアルギン酸等の膨化剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ショ糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリー等の香味剤等を例示することができる。また、錠剤は必要に応じて腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングを施す場合もある。カプセル剤については、更に油脂のような液状担体が用いられる場合もある。製剤は、打錠又は充填等の当業界で周知の方法を用いて行うことができる。
【００３８】
こうして、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤等として調製すれば、経口的に使用することができ、また、無菌の水性液もしくは油性液として注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤等として調製すれば、非経口的に使用することができる。なお、これらの医薬品組成物における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００３９】
かくして得られる、本発明の脂肪蓄積抑制剤を配合した医薬品組成物は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや、ヒト以外の哺乳動物に対して、その体内の脂肪蓄積を抑制する目的で投与することができる。この場合の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法等により差異はあるが、例えば、上記目的でヒトに経口投与する場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約５ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは約３０ｍｇ〜３ｇ、より好ましくは約３００ｍｇ〜３ｇを、１〜数回に分けて投与するとよい。ヒト以外の他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を同様に投与することができる。
【００４０】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのままでも飲食用に供することができる。しかし、各種の担体及び／又は添加剤と適宜混和して調製し、飲食用組成物として供するのが好ましい。この場合において、飲食用組成物全体に対する本発明の脂肪蓄積抑制剤の配合量は、そのヘキサン抽出画分の濃度及び純度によっても異なるが、例えば、本発明の脂肪蓄積抑制剤としてコメそのもの、コメぬかもしくはコメ油、又はこれらの加工物を使用するのであれば、固形分換算で０．０１〜１０重量％の範囲にあればよく、好ましくは０．０５〜２重量％、特に好ましくは０．０８〜０．８重量％の範囲にあればよい。また、この飲食用組成物中の脂肪分に対しては、固形分換算で０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、特に好ましくは１．２重量％以上あればよい。
【００４１】
上記飲食用組成物の担体としては、例えば、キャリアー担体、エクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、ブドウ糖、乳糖等の賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の結合剤、水、エタノール、植物油等の溶媒、溶解補助剤、重曹等の緩衝剤、溶解促進剤、ナトリウムＣＭＣ、ＨＰＭＣ、カンテン、ゼラチン等のゲル化剤、ナトリウムＣＭＣ、ナトリウムアルギネート等の懸濁化剤等を使用することができる。しかし、これらに限らず、飲食用組成物の担体として許容されるものであれば、特に制限なく使用することができる。
【００４２】
また、上記飲食用組成物の添加剤としては、例えば、グルタミン酸、イノシン酸等の可食性、嗜好性を向上させるための調味料、バニラ、ミント、ローズマリー、リナロール、天然香料等の香料、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、パントテン酸、ニコチン酸等のビタミン類、ステビア等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸等の有機酸、着色料、湿気防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、茶抽出物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、オレンジ、グレープ、アップル、モモ、パイナップル、ナシ、プラム、サクランボ、パパイア、トマト、メロン、イチゴ、ラズベリー等のフルーツ抽出物等の天然植物抽出物を使用することができる。しかし、この添加剤についても、これらに限らず、飲食用組成物の添加剤として許容されるものであれば、特に制限なく使用することができる。
【００４３】
具体的に、本発明の脂肪蓄積抑制剤が配合される飲食用組成物としては、コーヒー、紅茶、緑茶、ウーロン茶等の茶飲料類、豆乳、青汁、果物ジュース、野菜ジュース等の果実野菜飲料類、ヨーグルト等の乳酸菌飲料類、牛乳等の乳飲料類、コーラ等の炭酸飲料類、各種スポーツドリンク類、パン類等のベーカリー製品、米飯、麺類、豆腐等の大豆加工食品、ソーセージやハム等の魚畜肉加工食品、ケーキ、クッキー、饅頭、煎餅、アイスクリーム、プデイング、羊羹、キャンディー、チョコレート等の菓子類、バター、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、マーガリン、ショートニング等の加工油脂食品、マヨネーズ、ドレッシング、醤油、味噌、ソース等の調味料、コンニャク、漬け物類等が挙げられる。
【００４４】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのまま動物飼料用に供してもよいが、可食性や嗜好性を向上するための調味料、香料等の添加剤と適宜混和して調製し、動物飼料用組成物として供することもできる。このとき、一定の物性を保つため、乳化剤や安定剤を配合してもよい。また、本発明の脂肪蓄積抑制剤は、他の動物飼料用組成物に直接振りかけたり、混合したりして用いてもよく、種々の加工飼料、ペットフードの原料素材として用いてもよい。この場合において、動物飼料用組成物全体に対する本発明の脂肪蓄積抑制剤の配合量は、そのヘキサン抽出画分の濃度及び純度によっても異なるが、例えば、本発明の脂肪蓄積抑制剤としてコメそのもの、コメぬかもしくはコメ油、又はこれらの加工物を使用するのであれば、固形分換算で０．０１〜１０重量％の範囲にあればよく、好ましくは０．０５〜２重量％、特に好ましくは０．０８〜０．８重量％の範囲にあればよい。また、この動物飼料用組成物中の脂肪分に対しては、固形分換算で０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、特に好ましくは１．２重量％以上あればよい。
【００４５】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、分子生物学的手法についてはMolecular Cloning（Sambrook et. al., 1989）又は製造業者の取り扱い説明書に従い行われた。
【実施例１】
【００４６】
この実施例では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換イネを作成し、この形質転換イネ種子について脂質の分析を行った。
【００４７】
［（１）Propionibacterium acnesからのｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の単離］
Propionibacterium acnesの菌体を懸濁したアネロコロンビアウサギ血清培地３ｍｌを合成樹脂性の上蓋つきジャーに入れ、固定装置でとめた後、容器内部にアネロパック(三菱瓦斯化学株式会社)を入れて３日間培養した。この培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体に５６７μｌのＴＥと３μlの２０ｍｇ／ｍｌ proteinaseＫを加えて懸濁し、３７℃で１時間反応させた後、１００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えて撹拌し、更に、８０μlの１０％ＣＴＡＢ／０．７Ｍ ＮａＣｌを加えて６５℃で１０分間反応させてから、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４:１）溶液をこの液に加え、ボルテックスで懸濁後、分離してきた上層を新しいチューブに回収した。
【００４８】
次いで、回収した上層に等量のフェノール：クロロホルム（１：１）混合液を加えて懸濁し、遠心分離を行って再び上層を回収した後、この上層に０．６倍量のイソプロパノールを加え、１５０００回転で遠心分離を行うことにより、Propionibacterium acnesのゲノムＤＮＡを沈殿として得た。このようにして得られたPropionibacterium acnesのゲノムＤＮＡは、１ｍｌの７０％エタノールを加えて洗浄した後、遠心分離を行って回収し、乾燥させてから、５０μｌのＴＥに懸濁して保存した。
【００４９】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子は、上記Propionibacterium acnesのゲノムＤＮＡ懸濁液１μｌを取分けて、ＰＣＲを行なうことにより単離した。ＰＣＲ用プライマーとしては、ＡＸ０６２０８８のシークエンスの５’用に＋１から＋３０の３０ｂｐを５’側プライマーとして、３’用に＋１２４６から＋１２７５の３０ｂｐを３ ’側プライマーとして使用した。また、ＰＣＲ反応は、９４℃にて１分処理した後、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃３分のサイクルを３０回繰返してから、７２℃にて１０分処理することにより行った。目的とするｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の増幅は、ＰＣＲ反応後の試料の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、１．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることにより確認した。
【００５０】
［（２）ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を含む、イネ形質転換用ベクターｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの作製］
プラスミドｐＴＬ７（H.Ebinuma et al.、Molecular Methods of Plant Analysis、22:95、2002）のＥｃｏ ＲＩ−Ｓｓｅ ８３８７Ｉ制限酵素部位間に、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＳｓｅ ８３８７Ｉで切り出した、イネオレオシンプロモーター、上記（１）にて単離したｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子、及び、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルを連結した遺伝子断片を挿入し、プラスミドｐＴＬ−Ｏ／ＰＡＩＳＯＭを得た。
【００５１】
目的とするプラスミドは、このｐＴＬ−Ｏ／ＰＡＩＳＯＭのＳｓｅ８３８７Ｉ制限酵素部位に、ｐＮＰＩ １３０Ｈｍ（ＷＯ０４／０８７９１０）より制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで切出した、酵母の部位特異的組換え系の組換え配列Ｒｓに挟まれた領域を挿入することにより得られ、これをプラスミドｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ（２００６年１２月１８日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ―２１１３６として寄託されている。）と命名した。
【００５２】
［（３）アグロバクテリウムへのｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの導入］
アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ.ツメファシエンス）ＥＨＡ１０５株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（５ｇ／ｌビーフエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌショ糖、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した後、培養液を６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体は、２０ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心することにより集菌し、この菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、プラスミド導入用菌液とした。
【００５３】
０．５ｍｌチューブ内で、上記プラスミド導入用菌液５０μｌとプラスミドｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ３μｌとを混合し、エレクトロポレーション法（ジーンパルサーIIシステム［BIORAD社］）を用いて、Ａ.ツメファシエンスＥＨＡ１０５株へのｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ導入処理を行った。ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ導入処理後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で、振とうしつつ１時間培養を行ってから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し、２８℃、２日間培養した。次いで、生じた菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して更に培養し、増殖した菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出して、これらの菌体にｐＯ／ＰＡＩＳＯＭが導入されていることを確認した。こうしてｐＯ／ＰＡＩＳＯＭの導入が確認されたＡ．ツメファシエンスを、ＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）と命名した。
【００５４】
［（４）感染材料の調製］
イネ品種「日本晴」の完熟種子を、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール（ｐ９３−９８）の方法に従い殺菌した後、この完熟種子を、Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類（Chu C.C.、1978, Proc.Symp.Plant TissueCuture、Sience Press Peking、pp.43-50）、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．８）に置床し、サージカルテープでシールしてから２８℃明所で培養して発芽させ、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）による感染材料とした。
【００５５】
［（５）アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）によるイネの形質転換］
ＹＥＢ寒天培地（１５ｇ／ｌバクトアガー、他の組成は上記に同じ。）にて培養したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）を、ＹＥＢ液体培地に移植して、２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを含むＮ６液体培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、ｐＨ＝５．８）に、ＯＤ６３０＝０．１５となるように懸濁し、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。
【００５６】
（４）で調整したイネの発芽種子を５０ｍｌチューブに入れ、感染用アグロバクテリウム懸濁液を注いで１．５分間浸漬した。浸漬後、アグロバクテリウム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去してから、この種子を、共存培養培地Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．２）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃暗所で３日間培養し、次いで、Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養した。
【００５７】
上記Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地での培養開始から１週間後、発芽した芽を胚盤組織から除去して、残った胚盤組織を、Ｎ６Ｃｌ４ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、４ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）で１週間培養し、更に、ＭＳＲＣ培地（ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Murashige、T. and Skoog、F.、1962 Physiol. Plant.、15、473）、３０ｇ／ｌシュークロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養することにより、芽又は幼植物体を再分化させた。この再分化に要した期間は、ＥＨＡ１０５（ｐＯ／ＰＡＩＳＯＭ）との共存培養開始から１ヶ月乃至２ヶ月であった。
【００５８】
［（６）形質転換イネの作成］
（５）にて胚盤組織から再分化させた芽又は幼植物体を、発根培地に移植して背丈２０ｃｍ程度の幼苗となるまで生育させた後、この幼苗から、ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子の存在を確認した。次いで、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子が導入された形質転換イネを馴化・栽培し、完熟種子（Ｔ１種子）を収穫して、以下の脂肪酸分析に供した。
【００５９】
［（７）形質転換イネ種子の脂肪酸分析］
ＷＯ０３/０２７２９６号公報記載の実施例２の方法に従って、（６）で得られたＴ１種子の全粒中に含まれる脂質の脂肪酸組成を分析した。すなわち、形質転換イネのＴ１種子及び非形質転換イネの種子、各１粒を乳鉢及び乳棒ですりつぶし、それぞれに１．５ｍｌの０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノールを加えて懸濁し、懸濁液をガラス管に移して５０℃で１時間メチル化処理した後、ガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ分析）を行い、両者を比較することにより、形質転換イネのＴ１種子全体に含まれる脂質の脂肪酸組成を分析した。この結果、形質転換体のＴ１種子（図１ｂ）では、非形質転換イネの種子（図１ａ）には見られない新たなピークが、化学合成された共役脂肪酸であるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸のピークと同じ時間に検出され、該形質転換体Ｔ１種子中では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が生成していることが明らかになった。
【００６０】
なお、図１中、ピーク近辺に付した符号は、ダブルコロンの前に記載された数値が炭素数を、ダブルコロンの後ろに記載された数値が不飽和結合の数を、また、ｃ及びｔはそれぞれシス（ｃｉｓ）及びトランス（ｔｒａｎｓ）を示している。従って、１８：０は当該ピークがステアリン酸（stearic acid）のメチルエステルによるものであることを表し、同様に、１８：１はオレイン酸（oleic acid）、１８：２はリノール酸（linoleic acid）、１８：３はリノレン酸（α-linoleic acid）、２０：０はアラキジン酸（arachidic acid）、２０：１はエイコセン酸（eicosenoic acid）、そして１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡはｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸（conjugated linoleic acid：CLA）のメチルエステルによるものであることを表している。
【実施例２】
【００６１】
この実施例では、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換イネの種子より得られるヘキサン抽出画分について、脂肪蓄積抑制効果を調査した。
【００６２】
［（１）形質転換イネ種子からのヘキサン抽出画分の分離と、その脂肪酸組成の分析］
実施例１の（６）にて収穫した形質転換イネのＴ１種子約７８０gを小型粉砕機で粉砕し、等量のヘキサンを加え、懸濁して一晩静置した後、懸濁液をフィルターでろ過してヘキサンを回収すると共に、残渣を分離した。この残渣について同様の操作を更に２度行った後、回収したヘキサンを合せ、エバポレーターにてヘキサンを飛ばして濃縮し、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分（コメ油）１７．５ｇを得た。得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分について、脂肪酸組成の分析を、以下のようにして行った。
【００６３】
すなわち、まず抽出画分一滴をガラス管に垂らし、それに１ｍｌの０．５Ｍナトリウムメトキシド／メタノールを加えて、５０℃で１時間、メチル化処理してから、１．５ｍｌの０．９Ｍ ＮａＣｌと１ｍｌのヘキサンを加えて攪拌し、２０００×ｇ、５分間遠心して上清を回収、真空乾燥した後、更にヘキサン２０μｌに溶解して、試料１μｌを取分け、これをＧＣ分析用試料として、ＧＣ１８Ａ（Shimadzu社）を用い、ＧＣ分析を行った。このとき、キャピラリーカラムは６０ｍ×０．２５ｍｍ、ＩＤ０．２５μｍのＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製ＴＣ−７０を用い、１５０℃から２４０℃に３℃／分で昇温させた後、２４０℃で６分間恒温に保って分析を行った。結果を表１に示す。
【００６４】
表１より明らかなように、実施例１で得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分には、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸が、ヘキサン抽出画分中１．０重量％も含有されていた。
【００６５】
【表１】
【００６６】
［（２）形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分のマウスにおける脂肪蓄積抑制効果］
６週齢のＩＣＲ系ＣＤ−１雄マウス１５匹を５匹ずつ３群に分け、うち１群（試験群）には（１）で得られた形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分を、もう１群（ブランク群）には非形質転換イネ種子のコメ油（ホーソー油脂化学社製『スーパーサラダ油コシヒカリ』）を、更に残りの１群（対照群）には化学合成ＣＬＡ ０．２５％を含有するコメ油（日清オイリオ（株）にて化学合成されたＣＬＡ(ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役リノール酸を含有）を、上記非形質転換イネ種子のコメ油に添加して調製）を、オリエンタル酵母（株）社製の精製飼料（マウス・ラット用標準配合ＡＩＮ−９３Ｇ）に配合した、米国国立栄養研究所（The American Institute of Nutrition：ＡＩＮ）推奨のＡＩＮ−９３Ｇ組成に基づく純化食（表２：マウスに与えた食餌の組成）を与え、１８日間自由摂食させて飼育した。
【００６７】
【表２】
【００６８】
また、上記食餌中の脂肪成分の脂肪酸組成を表３（食餌中の脂肪成分の脂肪酸組成（重量％））に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
上記飼育期間中、食餌及び水は一週間に一回の頻度で交換し、２日から３日毎にマウスの摂食量と体重を測定した。飼育期間終了後のマウスは、絶食させることなく、ジエチルエーテルの吸入麻酔下で後大静脈より採血してから屠殺し、内臓組織(肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺)及び内臓脂肪組織(腎周辺と副睾丸周辺の白色脂肪組織)の重量を測定した。その結果を表４（腎臓周辺脂肪組織への影響）及び表５（副睾丸周辺脂肪組織への影響）に示す。
【００７１】
表４及び表５より明らかなように、腎臓周辺脂肪組織重量及び副睾丸周辺脂肪組織重量共に、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分を食餌に配合した試験群では、非形質転換イネ種子のコメ油を食餌に配合したブランク群に比べ低値を示し、特に、副睾丸周辺脂肪組織の重量は、著しい減少を示した。また、これらの脂肪組織重量の差はいずれも、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ ｔｅｓｔによる有意差検定（Ｐ＜０．０５）で有意差が認められ、形質転換イネ種子から得られるヘキサン抽出画分の脂肪蓄積抑制剤としての効果が実証された。
【００７２】
一方、化学合成ＣＬＡ ０．２５％を含有するコメ油を食餌に配合した対照群では、腎臓周辺脂肪組織の重量に関してはブランク群に比べて低値を示したが、その差は上記試験群とブランク群との間で認められた差よりも小さく、副睾丸周辺脂肪組織の重量に関しては、むしろブランク群よりも高値を示し、化学合成ＣＬＡの脂肪蓄積抑制剤としての効果は、形質転換イネ種子から得られるヘキサン抽出画分よりもかなり劣ることが明らかになった。表３より明らかなように、試験群及び対照群に与えた食餌中には、どちらも１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡが１．０％含まれている。にもかかわらず、試験群と対照群とで、脂肪蓄積抑制剤としての効果に大きな差が生じた理由としては、この１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡの存在形態の相違が考えられる。すなわち、対照群に与えた食餌中の１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡは、科学的に合成されたものであるため、全て遊離脂肪酸として存在しているが、形質転換イネ種子のヘキサン抽出画分中に存在する１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡは、全体の約７０％がリン脂質やトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）として存在しており、遊離脂肪酸として存在するのは約２８％に過ぎない（非特許文献３）。このような存在形態の相違が、１０ｔ，１２ｃ−ＣＬＡの脂肪蓄積抑制剤としての効果に、上記のような差をもたらしたものと考えられる。
【００７３】
なお、以上の実験において、各内臓組織自体の重量は、試験群、ブランク群及び対象群の間で有意差は存在しなかった。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の実施例において、本発明における合成酵素遺伝子を導入して作製した形質転換イネ種子の脂肪酸分析試験におけるガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ分析）の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料が、コメ油或いはコメぬかであることを特徴とする請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸が、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であることを特徴とする請求項３に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤を添加したことを特徴とする飲食用、医薬用、又は動物飼料用組成物。
【請求項１】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換イネ種子を原材料とし、該イネ種子よりヘキサンにて抽出されるｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料が、コメ油或いはコメぬかであることを特徴とする請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸が、トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分として含有されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
トリアシルグリセロール及び／又はリン脂質の脂肪酸成分の少なくとも１以上が、ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸であることを特徴とする請求項３に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
ｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸を含有する油脂成分或いは該油脂成分を含むイネ種子材料中のｔｒａｎｓ−１０−，ｃｉｓ−１２−共役二重結合を持つ共役リノール酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤を添加したことを特徴とする飲食用、医薬用、又は動物飼料用組成物。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１６２９２８（Ｐ２００８−１６２９２８Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３５３３３７（Ｐ２００６−３５３３３７）
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
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