血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼのモジュレータの使用を含む、神経精神疾患を治療するためのグルタミン酸受容体の調節方法
グルタミン酸受容体活性を回復するための血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼ活性の調節。さらに、神経精神疾患を発見および治療するのに有用な方法および化合物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質に、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３発現細胞を接触させることを含む、グルタミン酸受容体活性を変化させる方法。さらに、本発明は、グルタミン酸受容体のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関連する疾患の診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ニューロンは、神経伝達を維持し微調整するため、関係する神経伝達物質受容体の発現や機能、細胞内局在性を絶えず修飾している。修飾された興奮性受容体系のなかには、ＧｌｕＲ１からＧｌｕＲ４のサブユニットを含むイオンチャネル型グルタミン酸受容体のＡＭＰＡファミリーの仲間がある。ＡＭＰＡ受容体は、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびラスムッセン脳炎など、さまざまな疾患に関与している。ラスムッセン脳炎は、重篤なてんかん、片麻痺、痴呆および脳の炎症を特徴とする進行性疾患である。患者がＧｌｕＲ３に対する抗体を惹起している場合、ラスムッセン脳炎を来たすことが認められている。ＧｌｕＲ３抗体は、皮質ニューロンのＡＭＰＡ受容体を活性化することができること、自己抗体と相互作用するＧｌｕＲ３領域は、アゴニスト結合部位内にあることが証明されている（Ｔｗｙｍａｎら、１９９５年）。したがって、受容体の活性により誘発された神経興奮は、この疾患の特徴であるてんかん発作を引き起こすかもしれない。しかし、神経精神疾患を引き起こす機構を理解するには、解決されていない問題も多い。
【０００３】
グルタミン酸受容体は、中枢神経系における興奮性シグナル伝達の最も重要な伝達物質である（Ｍ Ｓｈｅｎｇ、Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ、Ｎａｔｕｒｅ ４１７、６０１、２００２年）。グルタミン酸受容体は、後シナプスニューロンの複数の生化学的経路を活性化し、最終的に後シナプス神経の可塑性を引き起こす。シナプス強度の変化は、後シナプスＡＭＰＡ受容体の活性および／または存在量を変えることで発生させることができる。海馬ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）は、長期増強作用中に活性化され、シナプスのＡＭＰＡ受容体と複合体を形成する（Ｐ．Ｐ．Ｓａｎｎａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２、３３５９頁、２００２年；Ｍ．Ｐａｓｓａｆａｒｏ、Ｖ．ＰｉｅｃｈおよびＭ．Ｓｈｅｎｇ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、４、９１７頁、２００１年；Ｈ．Ｙ．Ｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ３９、６１１頁、２００３年）。しかし、細胞膜におけるＰＩ３−ＫからＡＭＰＡ受容体が豊富な部位に至るシグナル経路についてはよくわかっていない。ＰＩ３−Ｋの下流シグナル伝達分子のなかには、プロテインキナーゼＢと、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼファミリーの、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の３つのメンバーすべてをリン酸化することにより活性化させる３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ）がある（Ｆ．Ｌａｎｇ、Ｐ．Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ．１０８、ＲＥ１７、２００１年）。ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は３つとも、細胞膜のチャネルタンパク質の存在量を増加させることにより、腎上皮型Ｎａ+チャネルＥＮａＣを調節することが示されている（Ｆ．Ｌａｎｇら、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、４１頁、２００３年；Ｄ．Ｐｅａｒｃｅ、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、１３〜２０頁、２００３年；Ｆ．Ｖｅｒｒｙ、Ｊ．Ｌｏｆｆｉｎｇ、Ｍ．Ｚｅｃｅｖｉｃ、Ｄ．Ｈｅｉｔｚｍａｎｎ、Ｏ．Ｓｔａｕｂ、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、２１頁、２００３年）。３つのキナーゼはすべて、脳に多量に発現するため（Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｐ．Ｃｏｈｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３９、３１９頁、１９９９年；Ｓ．Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ、Ｐ．Ｂａｒｔｈ、Ｊ．Ｎ．Ｊｒ．Ｆｏｒｒｅｓｔ、Ｒ．Ｇｒｅｇｅｒ、Ｆ．Ｌａｎｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９４、４４０頁、１９９７年）、本発明者らはそれらがＡＭＰＡ受容体の調節に関与しているのではないかと仮説を立てた。
【０００４】
ＳＧＫ１は、インスリン様成長因子ＩＧＦ１、インスリン、およびホスホイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）ならびにホスホイノシトール依存性キナーゼＰＤＫ１が関与するシグナルカスケードによる酸化ストレスを介して調節されることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ＆Ｃｏｈｅｎ １９９９年、Ｐａｒｋら １９９９年、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら １９９９年）。ＰＤＫ１によるＳＧＫ１の活性化は、セリン４２２のリン酸化反応が関係している。さらに、ｓｅｒ４２２からアスパラギン酸塩への変異（S422DＳＧＫ１）は、キナーゼの継続的活性をもたらすことが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら １９９９年）。
【０００５】
グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１活性を測定するには、さまざまなアッセイ法が利用可能である。シンチレーション近接アッセイ（Ｓｏｒｇら、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、７、１１〜１９頁）やフラッシュプレートアッセイでは、γＡＴＰを用いて基質であるタンパク質またはペプチドの放射性リン酸化反応が測定されるであろう。阻害化合物の存在下では、放射性シグナルは検出されないか、検出量は低下する。さらに、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）、および蛍光偏光（ＦＰ）法は、複数の検定法に有用である（Ｓｉｌｌｓら、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、１９１〜２１４頁）。他の非放射性ＥＬＩＳＡによる検定法は、特異的リン抗体（ＡＢ）を用いる。リン抗体は、リン酸化基質にのみ結合する。この結合は、ペルオキシダーゼ結合型抗ヒツジ二次抗体を用いた化学発光により検出可能である（Ｒｏｓｓら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、マニュスクリプトＢＪ２００２０７８６）。
【０００６】
先行研究の結果、ＳＧＫ１は、腎上皮型Ｎａ+チャネルの強力な刺激物質であることが明らかになった（Ｄｅ Ｌａ Ｒｏｓａら １９９９年、Ｂｏｅｈｍｅｒら ２０００年、Ｃｈｅｎら １９９９年、Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈら １９９９年、Ｌａｎｇら ２０００年、Ｓｈｉｇａｅｖら ２０００年、Ｗａｇｎｅｒら ２００１年）。
【０００７】
ＳＧＫ１に関連する別の所見は、ヌクレオチドの組み合わせが（ＣＣ／ＣＴ）であるエクソン８の一塩基多型（ＳＮＰ）、およびイントロン６の別の多型（ＣＣ）は、血圧上昇に関係しているというものであり（Ｂｕｓｊａｈｎら ２００２年）、この所見から、ＳＧＫ１は血圧調節および高血圧に重要であると考えられるという結論が示された。
【０００８】
ＳＧＫ１活性の増加は、腎臓におけるナトリウム吸収の増加により高血圧をもたらす腎上皮型Ｎａ+チャネル活性と相関しているため（Ｌｉｆｔｏｎ １９９６年；Ｓｔａｅｓｓｅｎら、２００３年；Ｗａｒｎｏｃｋ ２００１年）、ＳＧＫ１対立遺伝子多型の組み合わせによっては、腎臓におけるＮａ+吸収の増加を来たす可能性があり、それが血圧を上昇させることになると結論された（Ｂｕｓｊａｈｎら、２００２年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本出願は、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼの複数のアイソフォームが、グルタミン酸受容体の強力なモジュレータであることを図らずも示すものである。
【００１０】
グルタミン酸受容体の調節についてはほとんどわかっておらず、この発明は、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼファミリーの、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の３つのメンバーはすべて、グルタミン酸受容体調節に関与しているという予想外の結果について述べる。グルタミン酸受容体は、神経系における興奮性シグナル伝達の最も重要なメディエーターであるため、そのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、数多くの神経精神疾患で考察されてきた。したがって、本発明は、グルタミン酸受容体活性状態に関連して、組織標本および検体でのアップレギュレートされたＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３発現を測定することによる、神経精神疾患の進行、退行または発症の判定方法について述べる。
【００１１】
ＳＧＫは、輸送、シナプス可塑性および記憶の固定を与えることで知られるＡＭＰＡ受容体のＰＩ３−Ｋ依存性調節に関与していることが初めて示された。
【００１２】
ＳＧＫ３は、ＧｌｕＲ１の強力な調節因子であるのに対し、ＳＫＧ１は、ＧｌｕＲ６活性に関与している。ＳＧＫ３は、細胞膜のＧｌｕＲ１の存在量を高め、ＧｌｕＲ１によるグルタミン酸誘発電流を増加させる。ＧｌｕＲ６は、ＳＧＫ１認識部位のＲＸＲＸＸＳ／Ｔを介してＳＧＫ１と相互作用しないため、未知のアミノ酸配列に影響する新たな機構が関与している可能性がある。
【００１３】
本発明の別の所見は、ＧｌｕＲ６はカイニン酸受容体の必須サブユニットであること、およびＳＧＫ１によるＧｌｕＲ６の調節は、カイニン酸受容体の輸送、シナプス可塑性および神経細胞の興奮性の調節に関与していることである。
【００１４】
したがって、ＳＧＫ１の調節により、グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ６の活性に影響を与えることは、海馬など学習と記憶に関与する脳の領域のほか、基底核や小脳など行動の運動的側面および動機付け側面に関与する領域で多量に発現するＫＡＲを標的とする方法となりうる。
【００１５】
さらに、程度は少ないながら、ＳＧＫ１ではなくＳＧＫ２は、ラットのＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜で、ＡＭＰＡサブユニットのＧｌｕＲ１タンパク質存在量を増大させることにより、グルタミン酸誘発電流を増加させることが示されている。
【００１６】
ＳＧＫ１の調節は、ＳＧＫ１遺伝子の一塩基多型により定義される、臨床的に関連のある表現型または遺伝子型に適用した場合、特に有用である。したがって、治療を必要としている個体由来の標本における多型ＳＧＫ１ ＳＮＰ変異体を分析することは、別の適用となりうる。さらに、本発明は、ＳＧＫ１発現を測定することで、疾患の進行、退行または発症を判定する方法について述べる。疾患を有する個体由来の標本は、選択されたＳＧＫ１ ＳＮＰ変異体、および疾患の素因とのその相関を分析することをさらに可能にする。
【００１７】
別の態様は、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の関連疾患を調節する新薬候補を同定するためのスクリーニング法に関する。特に有用なモジュレータは、ＳＧＫ１機能に干渉することにより、グルタミン酸受容体活性のダウンレギュレーションを引き起こす化合物である。ＳＧＫ１阻害因子は、てんかん、卒中、外傷後行動障害、不安、統合失調症、双極性障害、うつ病、肝性脳症、新生児溶血性疾患、中毒、アルコール依存症、ＨＩＶ脳症、神経変性障害、錐体外路運動障害、運動失調、筋萎縮性側策硬化症、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される疾患症状を来たした被験者の治療に、特に有用である。この発明に従って行われた薬剤スクリーニング法は、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３をターゲットにする治療化合物の発見につながった。
【００１８】
２つの異なるクラスの化合物、アシルヒドラゾン誘導体クラスに属するものと、もう１つのピリドピリミジン誘導体に属するものが同定された。薬剤として有効なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む医薬品組成物中の選択されたＳＧＫ１阻害化合物は、前述した疾患の治療に有用である。所望の治療プロファイルを有する新薬の同定に有用なスクリーニング法は、この出願で開示された化合物に限らないことが、この発明の要となる。さらに、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３調節化合物をスクリーニングするには、一段階方式または二段階方式を適用することが有用であることは、専門家にとって明らかである。そのようなスクリーニングの第一段階には、ＳＧＫキナーゼ活性に干渉する化合物の同定がある。さまざまなアッセイ形式が利用可能であり、好ましいアッセイは、γＡＴＰ存在下での、基質であるタンパク質またはペプチドのＳＧＫにより触媒される放射性リン酸化の測定を用いる。ＳＧＫ阻害化合物の存在下では、放射性シグナルは検出されないか、検出量は低下する。第２の読み出し法では、ＳＧＫ１阻害化合物は、そのグルタミン酸受容体活性回復能をモニターされるが、他の読み出し活性の測定も同様に有用である可能性がある。
【００１９】
発明の詳細な説明
グルタミン酸受容体は、後シナプスニューロンの複数の生化学的経路を活性化し、最終的に後シナプス神経の可塑性を引き起こす。したがって、本発明の重要な態様は、どのようにグルタミン酸受容体が調節されるかを教示することである。
【００２０】
ＧｌｕＲ１調節の研究は、さまざまなＳＧＫアイソフォームとの共発現を必要とする。試験では、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３を、ＡＭＰＡ受容体サブユニットのＧｌｕＲ１と共にアフリカツメガエル卵母細胞で発現させた。非脱感作ＧｌｕＲ１変異体であるＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）（Ｙ．Ｓｔｅｒｎ−Ｂａｃｈ、Ｓ．Ｒｕｓｓｏ、Ｍ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｃ．Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ、Ｎｅｕｒｏｎ２１、９０７頁、１９８８年）が実験で用いられた。
【００２１】
図１に示した通り、タンパク質膜のＧｌｕＲ１存在量は、ＧｌｕＲ１のみを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ１タンパク質の存在量に比べ、ＳＧＫ３と共にＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞では大幅に増加する。ＧｌｕＲ１タンパク質の存在量は、ＳＧＫ２を共発現した後に上昇する傾向が認められたのに対し、ＳＧＫ１の共発現では影響は見られなかった。タンパク質の存在量は、グルタミン酸誘発電流に対する同様の影響と対応していた（図２）。グルタミン酸誘発電流は、ＧｌｕＲ１のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ３と共にＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に大きかった。ＳＧＫ２を共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞のグルタミン酸誘発電流は、ＳＧＫ３発現卵母細胞のそれに比べて有意に小さかったが、ＧｌｕＲ１のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の電流に比べて有意に大きかった。ＳＧＫ１の共発現は、ＧｌｕＲ１誘発電流を有意に変更することはなかった。
【００２２】
本観察は、ＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットの調節における新たな機構を明らかにした。ＧｌｕＲ１の神経細胞表面への伝達は、ＮＭＤＡ受容体活性により調節され、Ｃａ2+流入を導き（Ｍ．Ｓｈｅｎｇ、Ｍ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８、７７６頁、２００２年）、それに続いてＰＩ３−キナーゼが活性化される（Ｍ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎｔｏｎ、Ｊ．Ｋ．Ｉｐ、Ｇ．Ｌ．Ｗｏｏｄ、Ａ．Ｊ．Ｃｒｏｓｓｔｈｗａｉｔｅ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０、２３９頁、２００２年）。ＰＩ３−キナーゼの活性化は、シグナリングカスケードを誘発し、最終的にＳＧＫ３活性を引き起こし、その結果、細胞膜のＧｌｕＲ１タンパク質存在量を増大させる。ＳＧＫ３は、膜のＧｌｕＲ１の安定化をもたらすため、その回収とその後の分解を防止し、および／またはタンパク質の細胞膜への輸送を増大させる。したがって、本観察は、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３が実質的にＧｌｕＲ１存在量の微調整に寄与していることを初めて記述するものである。
【００２３】
本所見によれば、ＳＧＫ３は、ＧｌｕＲ１依存性神経機能に関与していると予測される。ＧｌｕＲ１は、ヘテロ二量体のＧｌｕＲ１−ＧｌｕＲ２受容体では、ＧｌｕＲ２より優位であり（Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、２２６２頁、２０００年；Ｓ．Ｓｈｉ、Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ、Ｊ．Ａ．Ｅｓｔｅｂａｎ、Ｒ．Ｍａｌｉｎｏｗ、Ｃｅｌｌ １０５、３３１頁、２００１年）、海馬ＣＡ１の長期増強に必要とされ（Ｄ．Ｚａｍａｎｉｌｌｏ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１８０５頁、１９９９年）、空間記憶の発生に関与している（Ｈ．Ｋ．Ｌｅｅ、ら、Ｃｅｌｌ １１２、６３１頁、２００３年；Ｄ．Ｒｅｉｓｅｌ、ら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５、８６８頁、２００２年）。
【００２４】
ＧｌｕＲ３の調節をＳＧＫアイソフォームにより試験するため、ＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ３を、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３のいずれか１つを共発現している、またはしていないアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた。グルタミン酸誘発電流は、ＧｌｕＲ３のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ２と共にＧｌｕＲ３を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に小さかった（図５）のに対し、関連するプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）との共発現は、有意な影響は認められなかった。ＳＧＫ１およびＳＧＫ３は、同様に電流振幅を減少させるが、ＳＧＫ２に比べ影響は小さかった。
【００２５】
既知のＳＧＫ活性化モジュレータであるデキサメタゾンを８日間または２０日間投与した結果、ＧｌｕＲ６ポリクローナル抗体で染色した脳切片で見られた通り、マウス海馬ＣＡ３ニューロンのＧｌｕＲ６タンパク質存在量に有意な増加が見られた（図６）。海馬ＣＡ３ニューロンを、シナプス部位のマーカーであるＭＡＰ２抗体で染色し、シナプスにおいて染色されている増加したＧｌｕＲ６を同定した。
【００２６】
したがって、ＧｌｕＲ６存在量は、海馬ＣＡ３ニューロンのシナプス部位で、デキサメタゾンにより増大される。しかし、ＧｌｕＲ６の前シナプスまたは後シナプスの発現を区別することはできない。星状細胞を特異的に染色するＧＦＡＰは、デキサメタゾンで処置された動物のＧｌｕＲ６存在量は、対照動物に比べて星状細胞では増大しないことを明らかにした（図６）。この結果は、ＳＧＫ１が星状細胞では発現されないことを示したｉｎ ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション試験（Ｗａｅｒｎｔｇｅｓら）に基づく予測と一致する。
【００２７】
ＳＧＫ１とＧｌｕＲ６の機能的関連を試験するため、ラットＫＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ６を、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３のいずれかを共発現している、またはしていないアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた。図４に示した通り、ＧｌｕＲ６のタンパク質存在量は、ＧｌｕＲ６のみを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ６タンパク質存在量に比べ、ＳＧＫ１と共にＧｌｕＲ６を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に増大する。ＧｌｕＲ６タンパク質存在量に対する、小さいが統計的に有意な影響は、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の共発現の後に観察されたのに対し、関連するプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）による共発現は、有意な影響は見られなかった。タンパク質存在量と同様に、グルタミン酸誘発電流は、図３で示した通り、ＧｌｕＲ６のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ１と共にＧｌｕＲ６を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に大きかった。さらに、同様に、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は電流を刺激するが、ＳＧＫ１に比べ影響は有意に低かった。
【００２８】
本観察は、ＫＡ受容体のＧｌｕＲ６サブユニットの調節における新たな機構を明らかにする。ＧｌｕＲ６サブユニットが組み合わされたカイニン酸受容体は、ＣＡ３およびＣＡ１錐体神経のカイニン酸およびドーモイ酸に対する感受性にとって重要である（Ｂｕｒｅａｕら ６５３〜６３）。ＧｌｕＲ６は、ＳＧＫ１認識部位のＲＸＲＸＸＳ／Ｔを含んでいないため、ＧｌｕＲ６がＳＧＫ１の直接の標的タンパク質であるとは考えにくい。しかし、ＳＧＫ１が、この既知のアミノ酸配列以外の部位を認識していることを除外することはできない。膜タンパク質であるスタルガジンは、ＡＭＰＡ受容体を細胞表面へ誘導し、後シナプス部位を特異的に標的にさせるうえで不可欠であることが示されている。スタルガジンは、ＳＧＫ１認識部位を含んでいる。しかし、ＫＡＲは、スタルガジンにより調節されないことが最近発表された（Ｃｈｅｎ ２００３年）。したがって、ＳＧＫ１は、スタルガジンを介してＧｌｕＲ６を調節しているとは考えられず、本発明者らは卵母細胞における混注実験によりそれを確認した（データは図示せず）。
【００２９】
同定された新たなキナーゼに関連する本発明の調節機構は、ＧｌｕＲ６の強力な調節因子である。ＳＧＫ１は、細胞膜のＧｌｕＲ６存在量を増大させ、ＧｌｕＲ６によるグルタミン酸誘発電流を増加させる。したがって、ＳＧＫ１は、カイニン酸受容体の輸送、シナプス可塑性および神経細胞の興奮性の調節に関与している。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１：ＳＧＫを共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜におけるＧｌｕＲ１サブユニットのタンパク質存在量の増加。
【００３１】
（Ａ）代表的なウエスタンブロット法。ＧｌｕＲ１の検出には、ウサギの免疫親和性精製された抗ＧｌｕＲ１一次抗体（１μｇ／μｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いた。βチューブリンの検出には、マウスモノクローナル抗βチューブリン一次抗体（１：２５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。ＧｌｕＲ１タンパク質の見かけの分子量は、〜１０５ｋＤａである。（Ｂ）棒グラフは、ＧｌｕＲ１細胞膜タンパク質の相対存在量を示している。バンド強度は、ソフトウェアＳｃｉｏｎ画像を用いて演算解析により定量化した。異なるバッチの３つの異なるブロットの値は、統計分析に用いた。有意な変化（ｐ＜０．０５）はＩで示されている。
【００３２】
図２：ＳＧＫ１およびＰＫＢではなく、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のアイソフォームによるＧｌｕＲ１電流の増加。
【００３３】
（Ａ）３００μＭグルタミン酸のＮＤ９６リンゲル溶液の灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。卵母細胞に、ＧｌｕＲ１ ｃＲＮＡ（４ｎｇ／卵母細胞）を注入、またはＳＧＫ ｃＲＮＡ（６ｎｇ／卵母細胞）と併せて注入した。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ１、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ２、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ３およびＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＰＫＢを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ１電流振幅を、ＧｌｕＲ１＋ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ電流に対して正規化した。横軸目盛は５秒を、縦軸目盛は１μＡを示す。卵母細胞数は括弧内に、有意な変化（ｐ＜０．００１）は***で示されている。
【００３４】
図３：ＰＫＢではなく、ＳＧＫアイソフォームによるＧｌｕＲ６電流の増加。
【００３５】
（ａ）３００μＭグルタミン酸を用いた灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。電流はすべて、ＣｏｎＡで卵母細胞を前処置し脱感作を最少化した後、７０ｍＶで測定した。（ｂ）ＧｌｕＲ６＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ（ｎ＝２０）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ１（ｎ＝１２）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ２（ｎ＝１０）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ３（ｎ＝９）およびＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ１（ｎ＝７）を発現している卵母細胞のＧｌｕＲ６電流振幅を測定し、ＧｌｕＲ６＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ電流に対して正規化したものを示している。有意水準ｐ＝０．００１（***）、ｐ＝０．０１（**）およびｐ＝０．０５（*）における有意な変化が示されている。
【００３６】
図４：ＳＧＫにより調節されたＧｌｕＲ６サブユニットのタンパク質発現を示すウエスタンブロット。
【００３７】
細胞膜タンパク質をビオチニルＣｏｎＡにより標識し、可溶化した後、ストレプトアビジンにより沈殿させた。未注入の卵母細胞からなる対照群を含む標本は、ＳＤＳゲル上で単離し、ウエスタンブロットを行い、免疫親和性精製されたＧｌｕＲ６のＣ末端の１６アミノ酸フラグメントに対する抗体で検出した（Ｕｐｓｔａｔｅ）。ＧｌｕＲ６タンパク質の見かけの分子量は、〜１１９ｋＤａである（Ｉ）。
【００３８】
図５：ＳＧＫ２の共発現による、ＧｌｕＲ３が媒介した電流の阻害。
【００３９】
（Ａ）３００μＭグルタミン酸を用いた灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。電流はすべて、ＣｏｎＡで卵母細胞を前処置し脱感作を最少化した後、７０ｍＶで測定した。（Ｂ）ＧｌｕＲ３＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ（ｎ＝２０）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝１２）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ３（ｎ＝１０）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝９）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ３（ｎ＝９）およびＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝７）を発現している卵母細胞のＧｌｕＲ３電流振幅を測定し、ＧｌｕＲ３＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ電流に対して正規化したものを示している。有意水準ｐ＝０．００１（***）、ｐ＝０．０１（**）およびｐ＝０．０５（*）における有意な変化が示されている。
【００４０】
図６：デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６の発現。
【００４１】
（Ａ）マウスの海馬、腎臓および心臓におけるＧｌｕＲ６発現。デキサメタゾンを８日間または２０日間投与した結果、ＧｌｕＲ６ポリクローナル抗体で染色した脳切片で見られた通り、マウス海馬ＣＡ３ニューロンのＧｌｕＲ６タンパク質存在量に有意な増加が見られた。（Ｂ）海馬ＣＡ３ニューロンを、シナプス部位のマーカーであるＭＡＰ２抗体で染色し、シナプスにおいて染色されている増加したＧｌｕＲ６を同定した。
【００４２】
さらなる方法および材料
実施例１：アフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的測定
他の文献に記載されている通り、ステージＶ〜ＶＩ期の卵母細胞を、アフリカツメガエルの卵巣より外科的に除去した（Ｓｅｅｂｏｈｍ、Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ、Ｐｕｓｃｈ、２００３年）。卵母細胞は、Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０００注射器（ＷＰＩ ｉｎｃ．、フロリダ、米国）を用いて、４ｎｇのＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３もしくはＧｌｕＲ６のｃＲＮＡのいずれかを、６ｎｇのＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３もしくはＰＫＢのｃＲＮＡのいずれかと共に注入するか、または単独で注入した。ｃＲＮＡ注入後５〜８日目に、Ｔｕｒｂｏ Ｔｅｃ ０３増幅器（ｎｐｉ、Ｔａｍｍ、ドイツ）およびＡｘｏｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのインターフェースＤＩＧＩＤＡＴＡ １３２２Ａで標準的な２電極の電圧クランプ法を行った。データ分析は、ｐＣｌａｍｐ ９．０／ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ ｉｎｃ．）、およびＯｒｉｇｉｎ ６．０ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて行った。アゴニスト溶液は、ＮＤ−９６緩衝液で調製した（単位ｍＭ、ＮａＣｌ、９６；ＣａＣｌ2、１，８；ＫＣｌ、２，０；ＭｇＣｌ2、１，０およびＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５、ＮａＯＨによりｐＨ７．２）。電流および電圧電極は、３Ｍ ＫＣｌで充填し、抵抗を０．５〜１．５ＭΩにした。卵母細胞は−７０ｍＶで保持し、アゴニスト（グルタミン酸３００μＭ）は〜１０秒間、流速１０〜１４ｍｌ／分の灌流により作用させた。脱感作を防止するため、アゴニストの適用前に卵母細胞をコンカナバリンＡで８分間培養した。
【００４３】
実施例２：ビオチニル化ＣｏｎＡによる細胞表面のタンパク質の標識
細胞膜に挿入された受容体タンパク質画分を同定するため、表面タンパク質をビオチニル化ＣｏｎＡで標識し、ビオチニル−ＣｏｎＡ／タンパク質複合体のストレプトアビジン／セファロースによる沈殿物として単離した。簡単には、無処置の卵母細胞を、１０μＭのビオチニル−ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ、ミュンヘン、ドイツ）中で３０分間、室温にてインキュベートした。通常のカエルリンゲル液で１０分間の洗浄を５回行った後、無処置の卵母細胞を、Ｈ緩衝液中でテフロンペストルによりホモジナイズし（２０μｌ／卵母細胞；１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド＋プロテイナーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）錠、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））、回転子で１時間、４℃にて保管した。１６０００×ｇで６０秒間遠心分離した後、洗浄されたストレプトアビジン−セファロースビーズ２０μｌ（Ｓｉｇｍａ、ミュンヘン、ドイツ）を上清に追加し、回転子で３時間、４℃にてインキュベートした。次に、ストレプトアビジン−セファロースビーズを、１６００×ｇで１２０秒間スピンしてペレット化し、Ｈ緩衝液で３回洗浄した。最終ペレットは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ローディングバッファー（０．８Ｍβメルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、０．１％ブロモフェノールブルー）４０μｌで煮沸し、Ｅｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて測定した。
【００４４】
実施例３：ゲル電気泳動とウエスタンブロット
ホモジナイズされた卵母細胞のタンパク質をＳＤＳ電気泳動により単離し、ニトロセルロースフィルターに移した。ブロットを、５％粉ミルクを含有する１×ＰＢＳで少なくとも１時間室温にてブロックした。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３またはＧｌｕＲ６の検出には、ウサギの免疫親和性精製されたＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３またはＧｌｕＲ６一次抗体（１μｇ／μｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ）、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ロバ抗ウサギ二次抗体（１：１０００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。タンパク質レベルの検証には、ポンソーレッド染色を行った。
【００４５】
実施例４：ＳＧＫ１調節化合物
４．１．一般式Ｉの化合物および医薬用の有用なその誘導体、塩、溶液および立体異性体（混合物を含む）
【００４６】
【化１】
【００４７】
式中、
Ｒ1、Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃまたはメチルのいずれかであり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃ、ＯＣＦ3、Ｈａｌ、ＮＯ2、ＣＦ3、Ａ、ＣＮ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＮＨ2またはＣＯＯＨのいずれかであり、
Ｒ11は、ＨまたはＣＨ3であり、
Ａは、１、２、３または４個のＣ原子を有するアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2、ＯＣＨ2または−ＣＨ（ＯＨ）−であり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００４８】
以下の化合物の群から選択された式Ｉによる化合物
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド。
フェニル酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，４−ジクロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｍ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｏ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メチルスルホニルオキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，５−ジヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−アセトキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−トリフルオロメチル−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
３−（３−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェノキシ）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ニトロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（５−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
２−ヒドロキシ−２−フェニル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ブロモ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３，５−ジフルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−６−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド
４．２．一般式ＩＩの化合物および医薬用の有用なその誘導体、塩、溶液、および立体異性体（混合物を含む）
【００４９】
【化２】
【００５０】
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、Ｈ、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、アルケニル、アルキニル、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨＡ、ＮＡ2、Ｈａｌ、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＡ、
−ＯＨｅｔ、−Ｏ−アルキレン−Ｈｅｔ、−Ｏ−アルキレン−ＮＲ8Ｒ9またはＣＯＮＲ8Ｒ9、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5から選択される２個の基、
−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、のいずれかであり、
Ｒ6、Ｒ7は、Ｈ、Ａ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＯＡまたはＣＮのいずれかであり、
Ｒ8、Ｒ9は、ＨまたはＡのいずれかであり、
Ｈｅｔは、１から４個のＮ、Ｏおよび／またはＳ原子を有する飽和または不飽和複素環であり、１つまたは複数のＨａｌ、Ａ、ＯＡ、ＣＯＯＡ、ＣＮまたはカルボニル酸素（＝Ｏ）で置換され、
Ａは、１〜７個のＨ原子がＦおよび／または塩素で置換されてもよい、１から１０個のＣ原子を有するアルキルであり、
Ｘ、Ｘ’は、ＮＨかまたは欠落しており、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００５１】
以下の化合物の群から選択された式ＩＩによる化合物
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−メチル−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジブロモ−６−フルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−６−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−メチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４−トリフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル）−３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（１−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−ピペリジン−４−イル）−フェニル］−尿素、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２，４−ジクロロベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−４−クロロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［（２−フルオロ−５−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［５−フルオロ−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−［２−（ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−クロロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素
実施例５：ＳＧＫ１の塩基多型
任意の高血圧患者のイントロン６を規定するヌクレオチド配列は、．．．ａａｔｔａｃａｔｔＣｇｃａａｃｃｃａｇ．．であるのに対し、健常集団を代表するヌクレオチド配列は、．．．．ａａｔｔａｃａｔｔＴｇｃａａｃｃｃａｇ．．．である。この配列は、アクセッション番号Ｇｌ ２４６３２００ポジション２０７１より入手可能である。
【００５２】
任意の高血圧患者のエクソン８の配列は、ホモ接合性の．．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．または．．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．またはヘテロ接合性の．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．および．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．のいずれかである。この配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００５６２７．２、ポジション７７７より入手可能である。
【００５３】
ヌクレオチドの組み合わせＴＴを有するホモ接合性の個体は、ＣＣの一塩基多型が同時にイントロン６に存在しても保護される。
【００５４】
実施例６：デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６発現
年齢と性別をマッチさせた同胞のＳｖ１２９Ｊマウスを、この試験では用いた。２〜３月齢のマウスに、あらかじめケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、Ｓｉｇｍａ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、Ｓｉｇｍａ）で麻酔して、プラセボまたはデキサメタゾンペレット（いずれもＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅｒａｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ製、サラソタ、米国）を皮下移植した。デキサメタゾンペレットは、１日あたりデキサメタゾン２３８μｇを持続放出および線形放出するもので、８日間または２０日間のいずれかにわたり用いた。脳を得るため、上述の混合物で麻酔したマウスを胸腔内出血により失血死させ、氷上に置いた後、脳を頭蓋から取り出して液体窒素で直ちに冷凍した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＳＧＫを共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜におけるＧｌｕＲ１サブユニットのタンパク質存在量の増加を示す図である。
【図２】ＳＧＫ１およびＰＫＢではなく、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のアイソフォームによるＧｌｕＲ１電流の増加を示す図である。
【図３】ＰＫＢではなく、ＳＧＫアイソフォームによるＧｌｕＲ６電流の増加を示す図である。
【図４】ＳＧＫにより調節されたＧｌｕＲ６サブユニットのタンパク質発現を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ＳＧＫ２の共発現による、ＧｌｕＲ３が媒介した電流の阻害を示す図である。
【図６】デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６の発現を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質に、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３発現細胞を接触させることを含む、グルタミン酸受容体活性を変化させる方法。さらに、本発明は、グルタミン酸受容体のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関連する疾患の診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ニューロンは、神経伝達を維持し微調整するため、関係する神経伝達物質受容体の発現や機能、細胞内局在性を絶えず修飾している。修飾された興奮性受容体系のなかには、ＧｌｕＲ１からＧｌｕＲ４のサブユニットを含むイオンチャネル型グルタミン酸受容体のＡＭＰＡファミリーの仲間がある。ＡＭＰＡ受容体は、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびラスムッセン脳炎など、さまざまな疾患に関与している。ラスムッセン脳炎は、重篤なてんかん、片麻痺、痴呆および脳の炎症を特徴とする進行性疾患である。患者がＧｌｕＲ３に対する抗体を惹起している場合、ラスムッセン脳炎を来たすことが認められている。ＧｌｕＲ３抗体は、皮質ニューロンのＡＭＰＡ受容体を活性化することができること、自己抗体と相互作用するＧｌｕＲ３領域は、アゴニスト結合部位内にあることが証明されている（Ｔｗｙｍａｎら、１９９５年）。したがって、受容体の活性により誘発された神経興奮は、この疾患の特徴であるてんかん発作を引き起こすかもしれない。しかし、神経精神疾患を引き起こす機構を理解するには、解決されていない問題も多い。
【０００３】
グルタミン酸受容体は、中枢神経系における興奮性シグナル伝達の最も重要な伝達物質である（Ｍ Ｓｈｅｎｇ、Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ、Ｎａｔｕｒｅ ４１７、６０１、２００２年）。グルタミン酸受容体は、後シナプスニューロンの複数の生化学的経路を活性化し、最終的に後シナプス神経の可塑性を引き起こす。シナプス強度の変化は、後シナプスＡＭＰＡ受容体の活性および／または存在量を変えることで発生させることができる。海馬ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）は、長期増強作用中に活性化され、シナプスのＡＭＰＡ受容体と複合体を形成する（Ｐ．Ｐ．Ｓａｎｎａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２、３３５９頁、２００２年；Ｍ．Ｐａｓｓａｆａｒｏ、Ｖ．ＰｉｅｃｈおよびＭ．Ｓｈｅｎｇ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、４、９１７頁、２００１年；Ｈ．Ｙ．Ｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ３９、６１１頁、２００３年）。しかし、細胞膜におけるＰＩ３−ＫからＡＭＰＡ受容体が豊富な部位に至るシグナル経路についてはよくわかっていない。ＰＩ３−Ｋの下流シグナル伝達分子のなかには、プロテインキナーゼＢと、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼファミリーの、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の３つのメンバーすべてをリン酸化することにより活性化させる３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ）がある（Ｆ．Ｌａｎｇ、Ｐ．Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ．１０８、ＲＥ１７、２００１年）。ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は３つとも、細胞膜のチャネルタンパク質の存在量を増加させることにより、腎上皮型Ｎａ+チャネルＥＮａＣを調節することが示されている（Ｆ．Ｌａｎｇら、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、４１頁、２００３年；Ｄ．Ｐｅａｒｃｅ、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、１３〜２０頁、２００３年；Ｆ．Ｖｅｒｒｙ、Ｊ．Ｌｏｆｆｉｎｇ、Ｍ．Ｚｅｃｅｖｉｃ、Ｄ．Ｈｅｉｔｚｍａｎｎ、Ｏ．Ｓｔａｕｂ、Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３、２１頁、２００３年）。３つのキナーゼはすべて、脳に多量に発現するため（Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｐ．Ｃｏｈｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３９、３１９頁、１９９９年；Ｓ．Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ、Ｐ．Ｂａｒｔｈ、Ｊ．Ｎ．Ｊｒ．Ｆｏｒｒｅｓｔ、Ｒ．Ｇｒｅｇｅｒ、Ｆ．Ｌａｎｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９４、４４０頁、１９９７年）、本発明者らはそれらがＡＭＰＡ受容体の調節に関与しているのではないかと仮説を立てた。
【０００４】
ＳＧＫ１は、インスリン様成長因子ＩＧＦ１、インスリン、およびホスホイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）ならびにホスホイノシトール依存性キナーゼＰＤＫ１が関与するシグナルカスケードによる酸化ストレスを介して調節されることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ＆Ｃｏｈｅｎ １９９９年、Ｐａｒｋら １９９９年、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら １９９９年）。ＰＤＫ１によるＳＧＫ１の活性化は、セリン４２２のリン酸化反応が関係している。さらに、ｓｅｒ４２２からアスパラギン酸塩への変異（S422DＳＧＫ１）は、キナーゼの継続的活性をもたらすことが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら １９９９年）。
【０００５】
グルココルチコイド誘導性キナーゼＳＧＫ１活性を測定するには、さまざまなアッセイ法が利用可能である。シンチレーション近接アッセイ（Ｓｏｒｇら、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、７、１１〜１９頁）やフラッシュプレートアッセイでは、γＡＴＰを用いて基質であるタンパク質またはペプチドの放射性リン酸化反応が測定されるであろう。阻害化合物の存在下では、放射性シグナルは検出されないか、検出量は低下する。さらに、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）、および蛍光偏光（ＦＰ）法は、複数の検定法に有用である（Ｓｉｌｌｓら、Ｊ．ｏｆ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００２年、１９１〜２１４頁）。他の非放射性ＥＬＩＳＡによる検定法は、特異的リン抗体（ＡＢ）を用いる。リン抗体は、リン酸化基質にのみ結合する。この結合は、ペルオキシダーゼ結合型抗ヒツジ二次抗体を用いた化学発光により検出可能である（Ｒｏｓｓら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、マニュスクリプトＢＪ２００２０７８６）。
【０００６】
先行研究の結果、ＳＧＫ１は、腎上皮型Ｎａ+チャネルの強力な刺激物質であることが明らかになった（Ｄｅ Ｌａ Ｒｏｓａら １９９９年、Ｂｏｅｈｍｅｒら ２０００年、Ｃｈｅｎら １９９９年、Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈら １９９９年、Ｌａｎｇら ２０００年、Ｓｈｉｇａｅｖら ２０００年、Ｗａｇｎｅｒら ２００１年）。
【０００７】
ＳＧＫ１に関連する別の所見は、ヌクレオチドの組み合わせが（ＣＣ／ＣＴ）であるエクソン８の一塩基多型（ＳＮＰ）、およびイントロン６の別の多型（ＣＣ）は、血圧上昇に関係しているというものであり（Ｂｕｓｊａｈｎら ２００２年）、この所見から、ＳＧＫ１は血圧調節および高血圧に重要であると考えられるという結論が示された。
【０００８】
ＳＧＫ１活性の増加は、腎臓におけるナトリウム吸収の増加により高血圧をもたらす腎上皮型Ｎａ+チャネル活性と相関しているため（Ｌｉｆｔｏｎ １９９６年；Ｓｔａｅｓｓｅｎら、２００３年；Ｗａｒｎｏｃｋ ２００１年）、ＳＧＫ１対立遺伝子多型の組み合わせによっては、腎臓におけるＮａ+吸収の増加を来たす可能性があり、それが血圧を上昇させることになると結論された（Ｂｕｓｊａｈｎら、２００２年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本出願は、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼの複数のアイソフォームが、グルタミン酸受容体の強力なモジュレータであることを図らずも示すものである。
【００１０】
グルタミン酸受容体の調節についてはほとんどわかっておらず、この発明は、血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼファミリーの、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の３つのメンバーはすべて、グルタミン酸受容体調節に関与しているという予想外の結果について述べる。グルタミン酸受容体は、神経系における興奮性シグナル伝達の最も重要なメディエーターであるため、そのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、数多くの神経精神疾患で考察されてきた。したがって、本発明は、グルタミン酸受容体活性状態に関連して、組織標本および検体でのアップレギュレートされたＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３発現を測定することによる、神経精神疾患の進行、退行または発症の判定方法について述べる。
【００１１】
ＳＧＫは、輸送、シナプス可塑性および記憶の固定を与えることで知られるＡＭＰＡ受容体のＰＩ３−Ｋ依存性調節に関与していることが初めて示された。
【００１２】
ＳＧＫ３は、ＧｌｕＲ１の強力な調節因子であるのに対し、ＳＫＧ１は、ＧｌｕＲ６活性に関与している。ＳＧＫ３は、細胞膜のＧｌｕＲ１の存在量を高め、ＧｌｕＲ１によるグルタミン酸誘発電流を増加させる。ＧｌｕＲ６は、ＳＧＫ１認識部位のＲＸＲＸＸＳ／Ｔを介してＳＧＫ１と相互作用しないため、未知のアミノ酸配列に影響する新たな機構が関与している可能性がある。
【００１３】
本発明の別の所見は、ＧｌｕＲ６はカイニン酸受容体の必須サブユニットであること、およびＳＧＫ１によるＧｌｕＲ６の調節は、カイニン酸受容体の輸送、シナプス可塑性および神経細胞の興奮性の調節に関与していることである。
【００１４】
したがって、ＳＧＫ１の調節により、グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ６の活性に影響を与えることは、海馬など学習と記憶に関与する脳の領域のほか、基底核や小脳など行動の運動的側面および動機付け側面に関与する領域で多量に発現するＫＡＲを標的とする方法となりうる。
【００１５】
さらに、程度は少ないながら、ＳＧＫ１ではなくＳＧＫ２は、ラットのＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜で、ＡＭＰＡサブユニットのＧｌｕＲ１タンパク質存在量を増大させることにより、グルタミン酸誘発電流を増加させることが示されている。
【００１６】
ＳＧＫ１の調節は、ＳＧＫ１遺伝子の一塩基多型により定義される、臨床的に関連のある表現型または遺伝子型に適用した場合、特に有用である。したがって、治療を必要としている個体由来の標本における多型ＳＧＫ１ ＳＮＰ変異体を分析することは、別の適用となりうる。さらに、本発明は、ＳＧＫ１発現を測定することで、疾患の進行、退行または発症を判定する方法について述べる。疾患を有する個体由来の標本は、選択されたＳＧＫ１ ＳＮＰ変異体、および疾患の素因とのその相関を分析することをさらに可能にする。
【００１７】
別の態様は、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の関連疾患を調節する新薬候補を同定するためのスクリーニング法に関する。特に有用なモジュレータは、ＳＧＫ１機能に干渉することにより、グルタミン酸受容体活性のダウンレギュレーションを引き起こす化合物である。ＳＧＫ１阻害因子は、てんかん、卒中、外傷後行動障害、不安、統合失調症、双極性障害、うつ病、肝性脳症、新生児溶血性疾患、中毒、アルコール依存症、ＨＩＶ脳症、神経変性障害、錐体外路運動障害、運動失調、筋萎縮性側策硬化症、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される疾患症状を来たした被験者の治療に、特に有用である。この発明に従って行われた薬剤スクリーニング法は、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３をターゲットにする治療化合物の発見につながった。
【００１８】
２つの異なるクラスの化合物、アシルヒドラゾン誘導体クラスに属するものと、もう１つのピリドピリミジン誘導体に属するものが同定された。薬剤として有効なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む医薬品組成物中の選択されたＳＧＫ１阻害化合物は、前述した疾患の治療に有用である。所望の治療プロファイルを有する新薬の同定に有用なスクリーニング法は、この出願で開示された化合物に限らないことが、この発明の要となる。さらに、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３調節化合物をスクリーニングするには、一段階方式または二段階方式を適用することが有用であることは、専門家にとって明らかである。そのようなスクリーニングの第一段階には、ＳＧＫキナーゼ活性に干渉する化合物の同定がある。さまざまなアッセイ形式が利用可能であり、好ましいアッセイは、γＡＴＰ存在下での、基質であるタンパク質またはペプチドのＳＧＫにより触媒される放射性リン酸化の測定を用いる。ＳＧＫ阻害化合物の存在下では、放射性シグナルは検出されないか、検出量は低下する。第２の読み出し法では、ＳＧＫ１阻害化合物は、そのグルタミン酸受容体活性回復能をモニターされるが、他の読み出し活性の測定も同様に有用である可能性がある。
【００１９】
発明の詳細な説明
グルタミン酸受容体は、後シナプスニューロンの複数の生化学的経路を活性化し、最終的に後シナプス神経の可塑性を引き起こす。したがって、本発明の重要な態様は、どのようにグルタミン酸受容体が調節されるかを教示することである。
【００２０】
ＧｌｕＲ１調節の研究は、さまざまなＳＧＫアイソフォームとの共発現を必要とする。試験では、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３を、ＡＭＰＡ受容体サブユニットのＧｌｕＲ１と共にアフリカツメガエル卵母細胞で発現させた。非脱感作ＧｌｕＲ１変異体であるＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）（Ｙ．Ｓｔｅｒｎ−Ｂａｃｈ、Ｓ．Ｒｕｓｓｏ、Ｍ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｃ．Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ、Ｎｅｕｒｏｎ２１、９０７頁、１９８８年）が実験で用いられた。
【００２１】
図１に示した通り、タンパク質膜のＧｌｕＲ１存在量は、ＧｌｕＲ１のみを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ１タンパク質の存在量に比べ、ＳＧＫ３と共にＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞では大幅に増加する。ＧｌｕＲ１タンパク質の存在量は、ＳＧＫ２を共発現した後に上昇する傾向が認められたのに対し、ＳＧＫ１の共発現では影響は見られなかった。タンパク質の存在量は、グルタミン酸誘発電流に対する同様の影響と対応していた（図２）。グルタミン酸誘発電流は、ＧｌｕＲ１のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ３と共にＧｌｕＲ１を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に大きかった。ＳＧＫ２を共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞のグルタミン酸誘発電流は、ＳＧＫ３発現卵母細胞のそれに比べて有意に小さかったが、ＧｌｕＲ１のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の電流に比べて有意に大きかった。ＳＧＫ１の共発現は、ＧｌｕＲ１誘発電流を有意に変更することはなかった。
【００２２】
本観察は、ＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットの調節における新たな機構を明らかにした。ＧｌｕＲ１の神経細胞表面への伝達は、ＮＭＤＡ受容体活性により調節され、Ｃａ2+流入を導き（Ｍ．Ｓｈｅｎｇ、Ｍ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８、７７６頁、２００２年）、それに続いてＰＩ３−キナーゼが活性化される（Ｍ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎｔｏｎ、Ｊ．Ｋ．Ｉｐ、Ｇ．Ｌ．Ｗｏｏｄ、Ａ．Ｊ．Ｃｒｏｓｓｔｈｗａｉｔｅ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０、２３９頁、２００２年）。ＰＩ３−キナーゼの活性化は、シグナリングカスケードを誘発し、最終的にＳＧＫ３活性を引き起こし、その結果、細胞膜のＧｌｕＲ１タンパク質存在量を増大させる。ＳＧＫ３は、膜のＧｌｕＲ１の安定化をもたらすため、その回収とその後の分解を防止し、および／またはタンパク質の細胞膜への輸送を増大させる。したがって、本観察は、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３が実質的にＧｌｕＲ１存在量の微調整に寄与していることを初めて記述するものである。
【００２３】
本所見によれば、ＳＧＫ３は、ＧｌｕＲ１依存性神経機能に関与していると予測される。ＧｌｕＲ１は、ヘテロ二量体のＧｌｕＲ１−ＧｌｕＲ２受容体では、ＧｌｕＲ２より優位であり（Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、２２６２頁、２０００年；Ｓ．Ｓｈｉ、Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ、Ｊ．Ａ．Ｅｓｔｅｂａｎ、Ｒ．Ｍａｌｉｎｏｗ、Ｃｅｌｌ １０５、３３１頁、２００１年）、海馬ＣＡ１の長期増強に必要とされ（Ｄ．Ｚａｍａｎｉｌｌｏ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１８０５頁、１９９９年）、空間記憶の発生に関与している（Ｈ．Ｋ．Ｌｅｅ、ら、Ｃｅｌｌ １１２、６３１頁、２００３年；Ｄ．Ｒｅｉｓｅｌ、ら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５、８６８頁、２００２年）。
【００２４】
ＧｌｕＲ３の調節をＳＧＫアイソフォームにより試験するため、ＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ３を、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３のいずれか１つを共発現している、またはしていないアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた。グルタミン酸誘発電流は、ＧｌｕＲ３のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ２と共にＧｌｕＲ３を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に小さかった（図５）のに対し、関連するプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）との共発現は、有意な影響は認められなかった。ＳＧＫ１およびＳＧＫ３は、同様に電流振幅を減少させるが、ＳＧＫ２に比べ影響は小さかった。
【００２５】
既知のＳＧＫ活性化モジュレータであるデキサメタゾンを８日間または２０日間投与した結果、ＧｌｕＲ６ポリクローナル抗体で染色した脳切片で見られた通り、マウス海馬ＣＡ３ニューロンのＧｌｕＲ６タンパク質存在量に有意な増加が見られた（図６）。海馬ＣＡ３ニューロンを、シナプス部位のマーカーであるＭＡＰ２抗体で染色し、シナプスにおいて染色されている増加したＧｌｕＲ６を同定した。
【００２６】
したがって、ＧｌｕＲ６存在量は、海馬ＣＡ３ニューロンのシナプス部位で、デキサメタゾンにより増大される。しかし、ＧｌｕＲ６の前シナプスまたは後シナプスの発現を区別することはできない。星状細胞を特異的に染色するＧＦＡＰは、デキサメタゾンで処置された動物のＧｌｕＲ６存在量は、対照動物に比べて星状細胞では増大しないことを明らかにした（図６）。この結果は、ＳＧＫ１が星状細胞では発現されないことを示したｉｎ ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション試験（Ｗａｅｒｎｔｇｅｓら）に基づく予測と一致する。
【００２７】
ＳＧＫ１とＧｌｕＲ６の機能的関連を試験するため、ラットＫＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ６を、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３のいずれかを共発現している、またはしていないアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた。図４に示した通り、ＧｌｕＲ６のタンパク質存在量は、ＧｌｕＲ６のみを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ６タンパク質存在量に比べ、ＳＧＫ１と共にＧｌｕＲ６を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に増大する。ＧｌｕＲ６タンパク質存在量に対する、小さいが統計的に有意な影響は、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の共発現の後に観察されたのに対し、関連するプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）による共発現は、有意な影響は見られなかった。タンパク質存在量と同様に、グルタミン酸誘発電流は、図３で示した通り、ＧｌｕＲ６のみを発現しているアフリカツメガエル卵母細胞に比べ、ＳＧＫ１と共にＧｌｕＲ６を発現しているアフリカツメガエル卵母細胞で有意に大きかった。さらに、同様に、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は電流を刺激するが、ＳＧＫ１に比べ影響は有意に低かった。
【００２８】
本観察は、ＫＡ受容体のＧｌｕＲ６サブユニットの調節における新たな機構を明らかにする。ＧｌｕＲ６サブユニットが組み合わされたカイニン酸受容体は、ＣＡ３およびＣＡ１錐体神経のカイニン酸およびドーモイ酸に対する感受性にとって重要である（Ｂｕｒｅａｕら ６５３〜６３）。ＧｌｕＲ６は、ＳＧＫ１認識部位のＲＸＲＸＸＳ／Ｔを含んでいないため、ＧｌｕＲ６がＳＧＫ１の直接の標的タンパク質であるとは考えにくい。しかし、ＳＧＫ１が、この既知のアミノ酸配列以外の部位を認識していることを除外することはできない。膜タンパク質であるスタルガジンは、ＡＭＰＡ受容体を細胞表面へ誘導し、後シナプス部位を特異的に標的にさせるうえで不可欠であることが示されている。スタルガジンは、ＳＧＫ１認識部位を含んでいる。しかし、ＫＡＲは、スタルガジンにより調節されないことが最近発表された（Ｃｈｅｎ ２００３年）。したがって、ＳＧＫ１は、スタルガジンを介してＧｌｕＲ６を調節しているとは考えられず、本発明者らは卵母細胞における混注実験によりそれを確認した（データは図示せず）。
【００２９】
同定された新たなキナーゼに関連する本発明の調節機構は、ＧｌｕＲ６の強力な調節因子である。ＳＧＫ１は、細胞膜のＧｌｕＲ６存在量を増大させ、ＧｌｕＲ６によるグルタミン酸誘発電流を増加させる。したがって、ＳＧＫ１は、カイニン酸受容体の輸送、シナプス可塑性および神経細胞の興奮性の調節に関与している。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１：ＳＧＫを共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜におけるＧｌｕＲ１サブユニットのタンパク質存在量の増加。
【００３１】
（Ａ）代表的なウエスタンブロット法。ＧｌｕＲ１の検出には、ウサギの免疫親和性精製された抗ＧｌｕＲ１一次抗体（１μｇ／μｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いた。βチューブリンの検出には、マウスモノクローナル抗βチューブリン一次抗体（１：２５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。ＧｌｕＲ１タンパク質の見かけの分子量は、〜１０５ｋＤａである。（Ｂ）棒グラフは、ＧｌｕＲ１細胞膜タンパク質の相対存在量を示している。バンド強度は、ソフトウェアＳｃｉｏｎ画像を用いて演算解析により定量化した。異なるバッチの３つの異なるブロットの値は、統計分析に用いた。有意な変化（ｐ＜０．０５）はＩで示されている。
【００３２】
図２：ＳＧＫ１およびＰＫＢではなく、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のアイソフォームによるＧｌｕＲ１電流の増加。
【００３３】
（Ａ）３００μＭグルタミン酸のＮＤ９６リンゲル溶液の灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。卵母細胞に、ＧｌｕＲ１ ｃＲＮＡ（４ｎｇ／卵母細胞）を注入、またはＳＧＫ ｃＲＮＡ（６ｎｇ／卵母細胞）と併せて注入した。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ１、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ２、ＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＳＧＫ３およびＧｌｕＲ１（Ｌ４７９Ｙ）＋ＰＫＢを発現している卵母細胞のＧｌｕＲ１電流振幅を、ＧｌｕＲ１＋ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ電流に対して正規化した。横軸目盛は５秒を、縦軸目盛は１μＡを示す。卵母細胞数は括弧内に、有意な変化（ｐ＜０．００１）は***で示されている。
【００３４】
図３：ＰＫＢではなく、ＳＧＫアイソフォームによるＧｌｕＲ６電流の増加。
【００３５】
（ａ）３００μＭグルタミン酸を用いた灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。電流はすべて、ＣｏｎＡで卵母細胞を前処置し脱感作を最少化した後、７０ｍＶで測定した。（ｂ）ＧｌｕＲ６＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ（ｎ＝２０）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ１（ｎ＝１２）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ２（ｎ＝１０）、ＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ３（ｎ＝９）およびＧｌｕＲ６＋ＳＧＫ１（ｎ＝７）を発現している卵母細胞のＧｌｕＲ６電流振幅を測定し、ＧｌｕＲ６＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ電流に対して正規化したものを示している。有意水準ｐ＝０．００１（***）、ｐ＝０．０１（**）およびｐ＝０．０５（*）における有意な変化が示されている。
【００３６】
図４：ＳＧＫにより調節されたＧｌｕＲ６サブユニットのタンパク質発現を示すウエスタンブロット。
【００３７】
細胞膜タンパク質をビオチニルＣｏｎＡにより標識し、可溶化した後、ストレプトアビジンにより沈殿させた。未注入の卵母細胞からなる対照群を含む標本は、ＳＤＳゲル上で単離し、ウエスタンブロットを行い、免疫親和性精製されたＧｌｕＲ６のＣ末端の１６アミノ酸フラグメントに対する抗体で検出した（Ｕｐｓｔａｔｅ）。ＧｌｕＲ６タンパク質の見かけの分子量は、〜１１９ｋＤａである（Ｉ）。
【００３８】
図５：ＳＧＫ２の共発現による、ＧｌｕＲ３が媒介した電流の阻害。
【００３９】
（Ａ）３００μＭグルタミン酸を用いた灌流に対する反応における、アフリカツメガエル卵母細胞で測定された代表的な電流トレース。電流はすべて、ＣｏｎＡで卵母細胞を前処置し脱感作を最少化した後、７０ｍＶで測定した。（Ｂ）ＧｌｕＲ３＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ（ｎ＝２０）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝１２）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ３（ｎ＝１０）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝９）、ＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ３（ｎ＝９）およびＧｌｕＲ３＋ＳＧＫ１（ｎ＝７）を発現している卵母細胞のＧｌｕＲ３電流振幅を測定し、ＧｌｕＲ３＋ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ電流に対して正規化したものを示している。有意水準ｐ＝０．００１（***）、ｐ＝０．０１（**）およびｐ＝０．０５（*）における有意な変化が示されている。
【００４０】
図６：デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６の発現。
【００４１】
（Ａ）マウスの海馬、腎臓および心臓におけるＧｌｕＲ６発現。デキサメタゾンを８日間または２０日間投与した結果、ＧｌｕＲ６ポリクローナル抗体で染色した脳切片で見られた通り、マウス海馬ＣＡ３ニューロンのＧｌｕＲ６タンパク質存在量に有意な増加が見られた。（Ｂ）海馬ＣＡ３ニューロンを、シナプス部位のマーカーであるＭＡＰ２抗体で染色し、シナプスにおいて染色されている増加したＧｌｕＲ６を同定した。
【００４２】
さらなる方法および材料
実施例１：アフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的測定
他の文献に記載されている通り、ステージＶ〜ＶＩ期の卵母細胞を、アフリカツメガエルの卵巣より外科的に除去した（Ｓｅｅｂｏｈｍ、Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ、Ｐｕｓｃｈ、２００３年）。卵母細胞は、Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０００注射器（ＷＰＩ ｉｎｃ．、フロリダ、米国）を用いて、４ｎｇのＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３もしくはＧｌｕＲ６のｃＲＮＡのいずれかを、６ｎｇのＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３もしくはＰＫＢのｃＲＮＡのいずれかと共に注入するか、または単独で注入した。ｃＲＮＡ注入後５〜８日目に、Ｔｕｒｂｏ Ｔｅｃ ０３増幅器（ｎｐｉ、Ｔａｍｍ、ドイツ）およびＡｘｏｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのインターフェースＤＩＧＩＤＡＴＡ １３２２Ａで標準的な２電極の電圧クランプ法を行った。データ分析は、ｐＣｌａｍｐ ９．０／ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ ｉｎｃ．）、およびＯｒｉｇｉｎ ６．０ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて行った。アゴニスト溶液は、ＮＤ−９６緩衝液で調製した（単位ｍＭ、ＮａＣｌ、９６；ＣａＣｌ2、１，８；ＫＣｌ、２，０；ＭｇＣｌ2、１，０およびＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５、ＮａＯＨによりｐＨ７．２）。電流および電圧電極は、３Ｍ ＫＣｌで充填し、抵抗を０．５〜１．５ＭΩにした。卵母細胞は−７０ｍＶで保持し、アゴニスト（グルタミン酸３００μＭ）は〜１０秒間、流速１０〜１４ｍｌ／分の灌流により作用させた。脱感作を防止するため、アゴニストの適用前に卵母細胞をコンカナバリンＡで８分間培養した。
【００４３】
実施例２：ビオチニル化ＣｏｎＡによる細胞表面のタンパク質の標識
細胞膜に挿入された受容体タンパク質画分を同定するため、表面タンパク質をビオチニル化ＣｏｎＡで標識し、ビオチニル−ＣｏｎＡ／タンパク質複合体のストレプトアビジン／セファロースによる沈殿物として単離した。簡単には、無処置の卵母細胞を、１０μＭのビオチニル−ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ、ミュンヘン、ドイツ）中で３０分間、室温にてインキュベートした。通常のカエルリンゲル液で１０分間の洗浄を５回行った後、無処置の卵母細胞を、Ｈ緩衝液中でテフロンペストルによりホモジナイズし（２０μｌ／卵母細胞；１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド＋プロテイナーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）錠、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））、回転子で１時間、４℃にて保管した。１６０００×ｇで６０秒間遠心分離した後、洗浄されたストレプトアビジン−セファロースビーズ２０μｌ（Ｓｉｇｍａ、ミュンヘン、ドイツ）を上清に追加し、回転子で３時間、４℃にてインキュベートした。次に、ストレプトアビジン−セファロースビーズを、１６００×ｇで１２０秒間スピンしてペレット化し、Ｈ緩衝液で３回洗浄した。最終ペレットは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ローディングバッファー（０．８Ｍβメルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、０．１％ブロモフェノールブルー）４０μｌで煮沸し、Ｅｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて測定した。
【００４４】
実施例３：ゲル電気泳動とウエスタンブロット
ホモジナイズされた卵母細胞のタンパク質をＳＤＳ電気泳動により単離し、ニトロセルロースフィルターに移した。ブロットを、５％粉ミルクを含有する１×ＰＢＳで少なくとも１時間室温にてブロックした。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３またはＧｌｕＲ６の検出には、ウサギの免疫親和性精製されたＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３またはＧｌｕＲ６一次抗体（１μｇ／μｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ）、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ロバ抗ウサギ二次抗体（１：１０００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。タンパク質レベルの検証には、ポンソーレッド染色を行った。
【００４５】
実施例４：ＳＧＫ１調節化合物
４．１．一般式Ｉの化合物および医薬用の有用なその誘導体、塩、溶液および立体異性体（混合物を含む）
【００４６】
【化１】
【００４７】
式中、
Ｒ1、Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃまたはメチルのいずれかであり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＯＡｃ、ＯＣＦ3、Ｈａｌ、ＮＯ2、ＣＦ3、Ａ、ＣＮ、ＯＳＯ2ＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＮＨ2またはＣＯＯＨのいずれかであり、
Ｒ11は、ＨまたはＣＨ3であり、
Ａは、１、２、３または４個のＣ原子を有するアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2、ＯＣＨ2または−ＣＨ（ＯＨ）−であり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００４８】
以下の化合物の群から選択された式Ｉによる化合物
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド。
フェニル酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，４−ジクロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｍ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
ｏ−トリル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−クロロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３−メチルスルホニルオキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３，５−ジヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（４−アセトキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−トリフルオロメチル−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
３−（３−メトキシ−フェニル）−プロピオン酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェノキシ）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ニトロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（５−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
２−ヒドロキシ−２−フェニル−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ブロモ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−メトキシ−フェニル）−酸性酸−［１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチリデン］−ヒドラジド、
（３，５−ジフルオロ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メトキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（４−ヒドロキシ−２−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（３−ヒドロキシ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−６−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジド、
（２−フルオロ−フェニル）−酸性酸−（２−メトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド
４．２．一般式ＩＩの化合物および医薬用の有用なその誘導体、塩、溶液、および立体異性体（混合物を含む）
【００４９】
【化２】
【００５０】
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、Ｈ、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、アルケニル、アルキニル、ＮＯ2、ＮＨ2、ＮＨＡ、ＮＡ2、Ｈａｌ、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＡ、
−ＯＨｅｔ、−Ｏ−アルキレン−Ｈｅｔ、−Ｏ−アルキレン−ＮＲ8Ｒ9またはＣＯＮＲ8Ｒ9、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5から選択される２個の基、
−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、のいずれかであり、
Ｒ6、Ｒ7は、Ｈ、Ａ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＯＡまたはＣＮのいずれかであり、
Ｒ8、Ｒ9は、ＨまたはＡのいずれかであり、
Ｈｅｔは、１から４個のＮ、Ｏおよび／またはＳ原子を有する飽和または不飽和複素環であり、１つまたは複数のＨａｌ、Ａ、ＯＡ、ＣＯＯＡ、ＣＮまたはカルボニル酸素（＝Ｏ）で置換され、
Ａは、１〜７個のＨ原子がＦおよび／または塩素で置換されてもよい、１から１０個のＣ原子を有するアルキルであり、
Ｘ、Ｘ’は、ＮＨかまたは欠落しており、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００５１】
以下の化合物の群から選択された式ＩＩによる化合物
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（４−メチル−５−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，４−ジブロモ−６−フルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−６−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−５−メチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２，３，４−トリフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル）−３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−（２−フルオロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（１−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−ピペリジン−４−イル）−フェニル］−尿素、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２，４−ジクロロベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−４−クロロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
Ｎ−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［（２−フルオロ−５−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［５−フルオロ−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−（ピペリジン−４−イルオキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−フルオロ−５−［２−（ピペリジン−１−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−フルオロ−２−［２−（モルホリン−４−イル）−エトキシ］−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［３−クロロ−４−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［４−クロロ−２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素、
１−［４−（４−アミノ−５−オキソ−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）−フェニル］−３−［２−クロロ−５−（２−ジエチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−尿素
実施例５：ＳＧＫ１の塩基多型
任意の高血圧患者のイントロン６を規定するヌクレオチド配列は、．．．ａａｔｔａｃａｔｔＣｇｃａａｃｃｃａｇ．．であるのに対し、健常集団を代表するヌクレオチド配列は、．．．．ａａｔｔａｃａｔｔＴｇｃａａｃｃｃａｇ．．．である。この配列は、アクセッション番号Ｇｌ ２４６３２００ポジション２０７１より入手可能である。
【００５２】
任意の高血圧患者のエクソン８の配列は、ホモ接合性の．．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．または．．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．またはヘテロ接合性の．ｔａｃｔｇａＣｔｔｃｇｇａｃｔ．．．．および．．．ｔａｃｔｇａＴｔｔｃｇｇａｃｔ．のいずれかである。この配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００５６２７．２、ポジション７７７より入手可能である。
【００５３】
ヌクレオチドの組み合わせＴＴを有するホモ接合性の個体は、ＣＣの一塩基多型が同時にイントロン６に存在しても保護される。
【００５４】
実施例６：デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６発現
年齢と性別をマッチさせた同胞のＳｖ１２９Ｊマウスを、この試験では用いた。２〜３月齢のマウスに、あらかじめケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、Ｓｉｇｍａ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、Ｓｉｇｍａ）で麻酔して、プラセボまたはデキサメタゾンペレット（いずれもＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅｒａｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ製、サラソタ、米国）を皮下移植した。デキサメタゾンペレットは、１日あたりデキサメタゾン２３８μｇを持続放出および線形放出するもので、８日間または２０日間のいずれかにわたり用いた。脳を得るため、上述の混合物で麻酔したマウスを胸腔内出血により失血死させ、氷上に置いた後、脳を頭蓋から取り出して液体窒素で直ちに冷凍した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＳＧＫを共発現しているアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜におけるＧｌｕＲ１サブユニットのタンパク質存在量の増加を示す図である。
【図２】ＳＧＫ１およびＰＫＢではなく、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のアイソフォームによるＧｌｕＲ１電流の増加を示す図である。
【図３】ＰＫＢではなく、ＳＧＫアイソフォームによるＧｌｕＲ６電流の増加を示す図である。
【図４】ＳＧＫにより調節されたＧｌｕＲ６サブユニットのタンパク質発現を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ＳＧＫ２の共発現による、ＧｌｕＲ３が媒介した電流の阻害を示す図である。
【図６】デキサメタゾンで処置されたマウスおよび対照マウスの海馬におけるＧｌｕＲ６の発現を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３を発現する細胞を血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質に接触させることを含む、グルタミン酸受容体活性を変化させる方法。
【請求項２】
グルタミン酸受容体のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関連する疾患を治療するための薬を調製するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項３】
前記疾患が、てんかん、卒中、外傷後行動障害、不安、統合失調症、双極性障害、うつ病、肝性脳症、新生児溶血性疾患、中毒、アルコール依存症、ＨＩＶ脳症、神経変性障害、錐体外路運動障害、運動失調、筋萎縮性側策硬化症、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織検体および標本における、アップレギュレートされたＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の発現を測定することによる、神経精神疾患の進行、退行または発症の判定方法。
【請求項５】
前記ＳＧＫ１が、選択された一塩基多型変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、てんかん、不安、統合失調症、双極性障害、精神的抑うつ、中毒、アルコール依存症、神経変性、錐体外路運動障害、神経変性障害、運動失調、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される、疾患診断のための請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
グルタミン酸受容体の調節障害により起こる障害を治療するための薬を製造するための、一般式ＩまたはＩＩを有する列挙された化合物から選択されるＳＧＫ１阻害剤の使用。
【請求項１】
ＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３を発現する細胞を血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質に接触させることを含む、グルタミン酸受容体活性を変化させる方法。
【請求項２】
グルタミン酸受容体のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関連する疾患を治療するための薬を調製するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項３】
前記疾患が、てんかん、卒中、外傷後行動障害、不安、統合失調症、双極性障害、うつ病、肝性脳症、新生児溶血性疾患、中毒、アルコール依存症、ＨＩＶ脳症、神経変性障害、錐体外路運動障害、運動失調、筋萎縮性側策硬化症、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織検体および標本における、アップレギュレートされたＳＧＫ１、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３の発現を測定することによる、神経精神疾患の進行、退行または発症の判定方法。
【請求項５】
前記ＳＧＫ１が、選択された一塩基多型変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、てんかん、不安、統合失調症、双極性障害、精神的抑うつ、中毒、アルコール依存症、神経変性、錐体外路運動障害、神経変性障害、運動失調、Ｍ．アルツハイマー、黄斑変性、難聴の群から選択される、疾患診断のための請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
グルタミン酸受容体の調節障害により起こる障害を治療するための薬を製造するための、一般式ＩまたはＩＩを有する列挙された化合物から選択されるＳＧＫ１阻害剤の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５２９４２３（Ｐ２００７−５２９４２３Ａ）
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０２２１１（Ｐ２００７−５０２２１１）
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４８２９
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４８２９
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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