農産業及び食品産業の余剰品に対する乳酸菌（ＬＡＢ）の使用によりγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を調製する方法
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４及びラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３又はこれらの関連種からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の果実汁での生産方法に関する。特に、本発明は、皮膚科分野での使用の可能性のためにビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び生きた活力のある乳酸菌をも含む、ＧＡＢＡに基づいた調製物の生産のために果実汁の成分がその組成について適切に最適化された、果実汁でのラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４及びラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３又はこれらの関連種の選択及び使用を企図する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農産業及び食品産業の余剰品に乳酸菌（ＬＡＢ）を使用してγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を調製する方法に関する。特に、本発明は、皮膚科の分野、並びに腎障害、例えば、高血圧及び糖尿病の症状によって引き起こされるものの治療で有利に使用される果実汁やバターミルクのような農産業及び食品産業の余剰品でのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産のために選択された乳酸菌の使用に関する。非天然アミノ酸と定義されるＧＡＢＡは、ＧＡＢＡのＬ−グルタミン酸塩の不可逆的脱炭酸を触媒する、ピリドキサールリン酸依存性の酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（ＥＣ ４．１．１．１５）によって合成される。酵素ＧＡＤは、真核生物及び原核生物の両方に広範に分布している（Ｕｅｎｏ、２０００、「デカルボキシラーゼにおける酵素的及び構造的側面（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｐｅｃｔ ｏｎ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ、１０：６７−７９）。ＧＡＢＡがヒトの様々な生理学的機能を発達させることができることが広く示されてきた。ＧＡＢＡは、神経伝達物質として、降圧誘導剤として、利尿薬として、及びトランキライザーとして機能することができる（Ｇｕｉｎら、２００３、「ＧＡＢＡ、γヒドロキシ酪酸及び神経疾患（ＧＡＢＡ，ｇａｍｍａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒ．、６：３−１２；Ｊａｋｏｂｓら、１９９３、「ＧＡＢＡ代謝の先天性疾患（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉ、１６：７０４−７１５）。うつ病（Ｏｋａｄａら、２０００、「経口投与による不眠症、うつ病、自律神経障害に対するＧＡＢＡ強化脱脂米胚芽の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｆａｔｔｅｄ ｒｉｃｅ ｇｅｒｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ＧＡＢＡ ｆｏｒ ｓｌｅｅｐｌｅｓｓｎｅｓｓ，ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｂｙ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ、７５：５９６−６０３）、アルコール中毒に関連した症状（Ｏｈら、２００３、「発芽玄米抽出物は慢性アルコール中毒に関連した症状の回復において栄養補助効果を示す（Ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｈｏｗｓ ａ ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ）」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄ、６：１１５−１２１）、及び免疫系の刺激（Ｏｈ及びＯｈ、２００３、「ＧＡＢの濃度が高められた玄米抽出物は免疫細胞を刺激する（Ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２：２４８−２５２）の治療が、ＧＡＢＡの投与に関連している。皮膚科分野の近年の研究から、（ｉ）紫外線に対する応答としての表皮レベルでの恒常性維持機構（Ｗａｒｓｋｕｌａｔら、２００４、「細胞恒常性の維持における正常なヒトケラチノサイトの浸透圧調節物質法（Ｔｈｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍａｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２３：５１６−５２１）、（ｉｉ）表皮の機能障害及び過増殖の症状を防止するバリア受容体の調節（Ｄｅｎｄａら、２００２、「γアミノ酪酸（Ａ）受容体作用薬は、皮膚バリアの回復を促進させ、バリア破壊によって引き起こされる表皮過形成を防止する（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｉｄ（Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｂａｒｒｉｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１９：１０４１−１０４７）、及び（ｉｉｉ）酸化ストレス後の表皮線維芽細胞の生存率の改善及びヒアルロン酸の刺激（Ｉｔｏら、「真皮線維芽細胞由来ＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤ６７：新規の皮膚機能の証拠（ＧＡＢＡ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ＧＡＤ６７，ｆｒｏｍ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｓｋｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１７７０：２９１−２９６）にＧＡＢＡが関与していることが分かった。さらに、近年、腎臓にあるＧＡＢＡの受容体の様々なサブユニットの存在、新しい受容体複合体へのサブユニットの凝集、及び腎臓近位尿細管細胞におけるＧＡＢＡＡの活性受容体が示された（Ｓａｔｉｎｄｅｒ Ｓ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３２４巻、第１版、３７６−３８２、２００８）。
【０００２】
このように広く認知されている生理的機能に基づいて、様々な機能性食品で、技術的処理及び酵素又は微生物の性質によってＧＡＢＡが濃縮又は強化されている（Ｏｋａｄａら、２０００；Ｎａｇａｏｋａ、２００５、「内在性酵素によって触媒されるＧＡＢＡ及びＩＰ６の濃度を上昇させるための発芽小麦の処理（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ａｎｄ ＩＰ６ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｚｙｍｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２１：４０５−４１０；Ｏｈら、２００３、「キトサン／Ｇｌｕ発芽溶液及びカルシウム／カルモジュリンによる玄米におけるγアミノ酪酸の合成活性の刺激（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｈｉｔｏｓａｎ／Ｇｌｕ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６：３１９−３２５）。
【０００３】
ある種の研究は、機能性ミルクチーズ誘導体の生産と、このような酵素活性の基礎となる生理的機構の理解の両方のために乳酸菌からのＧＡＢＡの合成についても考察した（Ｎｏｍｕｒａら、１９９８、「チーズの熟成中のチーズスターターによるγアミノ酪酸の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｃｈｅｅｓｅ ｓｔａｒｔｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｅｅｓｅ ｒｉｐｅｎｉｎｇ）」、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、８１：１４８６−１４９１；Ｐａｒｋ及びＯｈ、２００４、「ラクトバチルス・プランタルムからの完全長グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）」、Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．、９：３２４−３２９：Ｐａｒｋ及びＯｈ、２００７、「新規に単離した乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビスＯＰＫ−３からの新規な長グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング、配列決定、及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＯＰＫ−３）」、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、９８：３１２−３１９）。一般に、ＧＡＢＡの合成により、酸環境条件にさらされる細菌細胞に耐性が付与され（Ｃｏｔｔｅｒ及びＨｉｌｌ、２００３、「酸試験で残存：低いｐＨに対するグラム陽性細菌の応答（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｔｅｘｔ：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｌｏｗ ｐＨ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｒｅｖ．、６７：４２９−４５３）、酵素ＧＡＤによるプロセスが、乳酸菌種Ｅ１のエネルギー合成に関連している（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９７、「乳酸菌株におけるグルタミン酸塩とγアミノ酪酸の置換（Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｉｎ ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ）」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９：３３６２−３３６４）。公表された文献に属するミルクチーズ誘導値体でのＧＡＢＡの生産は、約７０ｍｇ／ｌ（約０．６７ｍＭ）の閾値を超えることはない。我々の現在の知識状態では、米胚芽及び牛乳に基づいた飲料の調製の際に、培養土ＭＲＳでの大量生産のために、「鮒寿司」から単離されたラクトバチルス・パラカゼイ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＮＦＲＩ（７４１５）の使用についての特開２００５−１０２５５９も同様である。さらに、同じ生物型のＬ．パラカゼイＮＦＲＩによる培養土ＭＲＳでのＧＡＢＡの生産が、いくつかの発酵パラメータを基準に最適化された研究が知られている（Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉら、２００５、「従来の発酵食品から単離したラクトバチルス・パラカゼイによるγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ） ｂｙ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２２：４９７−５０４）。しかしながら、周知の技術に記載されている方法によって得たＧＡＢＡの収率は満足できるものではない。
【０００４】
したがって、上記を鑑み、周知の方法の不都合を克服できるＧＡＢＡの調整のための材料及び方法が要望されていることは明らかである。
【０００５】
本発明の発明者は、いくつかの乳酸菌、特にラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３（ＤＳＭＺと共に２００７年６月２６日に出願）、これらの増殖に適した基質、特に果実汁を選択し、周知の技術により得ることができる収率よりも遥かに高い収率でＧＡＢＡを生産する方法について説明する。
【０００６】
本発明のさらなる利点は、（ｉ）微生物の増殖及びＧＡＢＡの生合成を助けるために、市販の複雑な培養土の使用を避けて低コストの天然発酵基質（例えば、果実汁やバターミルク）を利用する可能性、（ｉｉ）文献に報告されている濃度に対する食物起源の母体でのＧＡＢＡ合成の増加、（ｉｉｉ）高い生理的な値と、ＧＡＢＡ、ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び潜在的に有益な菌である生きた活力のある乳酸菌で自然に強化されていることとを特徴とする乾燥又は凍結乾燥された製品を得ることができる発酵方法、及び（ｉｖ）ＧＡＢＡに基づいた製品の適用分野を皮膚科分野及び腎障害の治療分野へ拡張する可能性である。
【０００７】
本発明による乳酸菌は、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する。これらの乳酸菌は、ＧＡＢＡで自然に強化され、且つ培養土で高濃度にＧＡＢＡを合成する能力に基づいて選択した食物母体（チーズ）から前もって単離した。本発明では、果実汁やバターミルク（リコッタ生産の副産物）のような基質から開始し、酵母水又は酵母抽出物を添加し、標準的な培養条件下で発酵させる際のＧＡＢＡの増殖及び合成能力に基づいて、ＧＡＢＡの８種類の生産株に対して選択を行った。
【０００８】
具体的には、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３を選択して、濃縮果実汁（全糖量、６１．８％）を５０：５０の割合で酵母水と水で希釈し（全糖量１％）、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加し、約６．０の初期ｐＨ値に調整して発酵させた。
【０００９】
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの生産プロトコルを標準化及び最適化した。前記プロトコルでは、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３を、３０℃で２４時間、培養土ＭＲＳで初めの増殖を行い、遠心分離及び洗浄によって細胞を回収し、酵母水で希釈した果実汁を接種し、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（ｐＨ、約６．０）を添加し、３０℃で、好ましくは７２時間〜７８時間、連続的にインキュベーションする。
【００１０】
本発明によるＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３による発酵プロセスにより、（ｉ）食品分野及び農業食物分野からの余剰物である果実汁を利用することによって基質のコストを０にすることができ、（ｉｉ）果実汁の発酵プロセスの最後に約５００ｍｇ／ｌ（約４．８ｍＭ）のＧＡＢＡの生産、又は凍結乾燥製品の乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇのＧＡＢＡの生産が可能になり、（ｉｉｉ）酵母水の使用によるビタミンＢ群及び果実汁の使用によるミネラル及びポリフェノールを用いたＧＡＢＡを含む製品の天然強化が可能となり、（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に基づいた、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の生きた活力のある細胞を用いた凍結乾燥製品の天然強化（実験室条件下、約１０１０ｕｆｃ／ｇ）により、あらゆる生菌特性を有することができ、且つ（ｖ）上記した近年の公表に示されているように、皮膚科分野における製品の潜在的な利用が可能となる。
【００１１】
本発明によるＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３は、「鮒寿司」から単離されたＬ．パラカゼイＮＦＲＩ（７４１５）によって異なる食物母体（米胚芽及び牛乳を基にした飲料）で発酵させて得た、食物起源（果実汁）の母体でのＧＡＢＡの生産量が、乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇであり、特開２００５−１０２５５９で報告されている生産量（乾燥物質１００ｇ当たり１０３．９ｍｇ）よりも格段に多いことを示している。Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３については、ＧＡＤ遺伝子の部分配列を、Ｌ．パラカゼイＮＦＲＩとは異なるようにクローニングした。このＧＡＤ遺伝子は、ＧＡＢＡの合成に関与している。
【００１２】
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３（配列番号１）の遺伝子グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の部分配列は次の通りである。
１ ｇｎａｎｇｃｔａｔｔ ｃａｎｇｃｃｔｇｎｎ ｃｃｔｇｇｃａａｃｔ ｔｔｔｔｇｔｃａｇａ ｃｃｔａｔａｔｇｇａ ａｃｃｃｇａａｇｃｃ
６１ ｇｔｔｇａａｔｔｇａ ｔｇａａｇｇａｔａｃ ｇｃｔｇｇｃｔａａｇ ａａｔｇｃｃａｔｃｇ ａｃａａａｔｃｔｇａ ｇｔａｃｃｃｃｃｇｃ
１２１ ａｃｇｇｃｃｇａｇａ ｔｔｇａａａａｔｃｇ ｇｔｇｔｇｔｇａａｃ ａｔｔａｔｔｇｃｃａ ａｔｃｔｇｔｇｇｃａ ｃｇｃａｃｃｔｇａｔ
１８１ ｇａｃｇａａｃａｃｔ ｔｔａｃｇｇｇｔａｃ ｃｔｃｔａｃｇａｔｔ ｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇ ａａｇｃｔｔｇｔａｔ ｇｔｔａｇｇｃｇｇｔ
２４１ ｔｔａｇｃａａｔｇａ ａａｔｔｃｇｃｃｔｇ ｇｃｇｔａａａｃｇｃ ｇｃｔｃａａｇｃｇｇ ｃａｇｇｔｔｔａｇａ ｔｃｔｇａａｔｇｃｃ
３０１ ｃａｔｃｇａｃｃｔａ ａｃｃｔｃｇｔｔａｔ ｔｔｃｇｇｃｔｇｇｃ ｔａｔｃａａｇｔｔｔ ｇｃｔｇｇｇａａａａ ｇｔｔｔｔｇｔｇｔｃ
３６１ ｔａｃｔｇｇｇａｃｇ ｔｔｇｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｃｃ ｃａａｔｇｇａｔｇａ ｇｃａａｃａｃｇｔｇ ｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇ
４２１ ｔｔａａａｃａｃｇｔ ｃｔａｃｇｇｃｔｔｇ ｇｇｃｃｇａｇａａｔ ｃｇｃｔｔｇｇｔａｔ ｔｔｔｔｔｔｇｔａａ ａｃａａｇｇｃｇｔｃ
４８１ ｃｃｃｔｔｔａｃｃｃ ｃｔｇｃｃｃ
【００１３】
本発明の発明者はまた、ＧＡＢＡの収率が異なる発酵プロトコルに従って利用できる果実汁及び主にバターミルクの発酵に用いることができる乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．）ＤＳＭ１９４６４（ＤＳＭＺと共に２００７年６月２６日に出願）を選択した。
【００１４】
したがって、本発明の特定の目的は、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種である。
【００１５】
本発明の別の目的は、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製にＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３又はＬＣ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４を使用することにある。
【００１６】
さらに、本発明は、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製のための方法にも関し、この方法は、以下のステップ：
ａ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種の、３０℃で２４時間の培養土、好ましくはＭＲＳ又はＭ１７での増殖、
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、果実汁又はバターミルクから選択した２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを添加した一定量の基質中での、ステップａ）で得たバイオマスの再懸濁、
ｃ）１〜４％での基質の接種、及び７２〜９６時間、好ましくは７２〜７８時間、３０〜３３℃、好ましくは３０℃の発酵
を含む。
【００１７】
好ましくは、果実汁は、酵母水で希釈するか、又は酵母を添加することができる。特に、果実汁は、酵母水及び５０／５０蒸留水で希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによって脱酸して、ｐＨ６．０〜６．５、好ましくはｐＨ約６．０まで下げることができる。対照的に、バターミルクに酵母抽出物（約０．５％）を添加することができる。さらに、果実汁又はバターミルクにピリドキサール−５−リン酸を添加することができる。
【００１８】
本発明による方法は、ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥又は凍結乾燥させるステップｄ）もさらに含むことができる。別法では、本発明による方法は、γアミノ酪酸の抽出に関連するステップｄ１）もさらに含むことができる。
【００１９】
したがって、上記に基づいて、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製の方法は、以下のステップ：
ａ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３又はＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の、３０℃で２４時間の培地、好ましくはＭＲＳ又はＭ１７での増殖、
ａ１）遠心分離（１０，０００×ｇで、４℃で１０分間）による細胞の収集、及び５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０による洗浄、並びに
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、一定量の希釈果実汁又はバターミルク中でのバイオマスの再懸濁；
ｂ１）蒸留水約３００ｍｌに市販のビール酵母約６０ｇを懸濁することによる酵母水の調製；オートクレーブでの、１２０℃で３０分間の滅菌；バイオマスの、４℃で１２時間のデカンテーション；６０，０００×ｇでの、４℃で１０分間の遠心分離；滅菌条件下での、酵母細胞の細胞質抽出物を含む上清（酵母水）の最終的な回収；
ｂ２）上記の割合に従った、水及び酵母水での濃縮果実汁の希釈（調整後の最終ｐＨは約６．０）、続いてのオートクレーブにおける１２０℃で１５分間の滅菌、又は酵母抽出物（０．５％）が添加されたバターミルク（ラクトース４．８％、タンパク質０．７９％、脂質０．４０％、ｐＨ５．９０）の使用後の１２０℃で１５分間の滅菌
ｃ）１〜４％での基質の接種、約７２〜９６時間（好ましくは７２〜７８時間）、３０℃での発酵
を含む。
【００２０】
本発明による方法は、さらに、ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥若しくは凍結乾燥させるステップｄ）、又はγアミノ酪酸を抽出するステップｄ１）を含むことができる。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上記した方法で得ることができるγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物である。生菌混合物は、好ましくは乾燥物質１００ｇ当たり少なくとも８９０ｍｇのγアミノ酪酸を含み、これに加えて、ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び生きた活力のある乳酸菌を含む。
【００２２】
この生菌混合物は、医学及び美容の分野に好都合に利用することができ、出願者が実施した、本願の実験の部分で報告する研究によると、ＧＡＢＡのみで処理した後に得られた生菌混合物に対して有利な効果を示した。したがって、本発明は、薬学的又は化粧用に許容される化合物である１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントと共に、活性成分としての、既に上記したγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物を含む医薬組成物又は化粧品組成物にも関連する。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、本発明による化粧品化合物としての、γアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の使用である。
【００２４】
さらに、本発明は、皮膚科で使用する薬物の調製のための、本発明によるγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の使用に関する。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、例えば、高血圧及び糖尿病の症状によって引き起こされる腎障害などの腎疾患の治療用の上記定義した医薬組成物である。
【００２６】
本発明を、具体的に添付の図面を参照しながら、本発明の実現のための好適な形態に従って、限定目的ではなく例示として次に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】蒸留水で希釈した、ｐＨ約４．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．パラカゼイＦＣ４４、ラクトバチルス・プランタルムＦＣ４１５、ラクトバチルス・デルブリュッキイ ＰＲ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＰＲ１）、Ｌ．プランタルムＦＣ４８、及びＬ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の酸性化動態及び増殖を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図２】５０：５０の割合で酵母水と蒸留水で希釈した、ｐＨ約４．５の果実汁（全糖量１％）でのＬ．パラカゼイＦＣ４４、Ｌ．プランタルムＦＣ４１５、Ｌ．デルブリュッキイＰＲ１、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３、Ｌ．プランタルムＦＣ４８、及びＬＣ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の酸性化動態及び増殖を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図３】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約４．５の果実汁（全糖量１％）（Ａ）；酵母抽出物（０．５％）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約４．５の水希釈果実汁（全糖量１％）（Ｂ）；Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ５．９０のバターミルク（Ｃ）；酵母抽出物（０．５％）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ５．９０のバターミルク（Ｄ）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図４】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈した果実汁（全糖量１％、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及び増殖（Ｂ）、並びにＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図５】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加し、全糖の濃度が異なる（Ａ：０．３％、Ｂ：０．５％、Ｃ：０．７％、及びＤ：１％）、ｐＨ約６．０の果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３（Ｃ）からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図６】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈した果実汁（全糖量１％、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）及びピリドキサール−５−リン酸を添加）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及び増殖（Ｂ）、並びにＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図７】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及びＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の静止細胞（増殖期でない細胞）からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｂ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図８】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産性：ｇｌ−１ｈ−１（Ａ）、収率：ΔＰ／ΔＳ（Ｂ）、及び比生産速度：１／ｘ ｄＰ／ｄｔ（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図９】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおける酵素ヒアルロン酸シンセターゼの発現を示す図である。
【図１０】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおけるフィラグリン遺伝子の発現を示す図である。
【図１１】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおけるインボルクリン遺伝子の発現を示す図である。
【００２８】
（例１）
本発明による乳酸菌の選択
イタリアのバリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｒｉ）の植物保護及び応用微生物学部の培養物の収蔵品（Ｃｏｌｌｅｚｉｏｎｅ ｄｉ Ｃｏｌｔｕｒｅ ｄｅｌ Ｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ ｄｉ ｐｒｏｔｅｚｉｏｎｅ ｄｅｌｌｅ Ｐｉａｎｔｅ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ Ａｐｐｌｉｃａｔａ ｄｅｌｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ’ ｄｅｇｌｉ Ｓｔｕｄｉ ｄｉ Ｂａｒｉ）に属し、予めチーズから単離され、培地の条件下でＧＡＢＡの合成能に基づいて選択した乳酸菌を、ＭＲＳ又はＭ１７で、３０℃で２４時間培養した（Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４）（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）。表１に、γアミノ酪酸の生産のために本発明に用いた種及び生物型のリストを示す。
表１
【表１】
【００２９】
（１）農業及び食品の母体の発酵のための乳酸菌の使用
培地で培養した後、乳酸菌細胞を遠心分離（１０，０００×ｇで、４℃で１０分間）によって収集した。次いで、乳酸菌細胞を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄し、１０９ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度で一定量の果実汁又はバターミルクに再懸濁した。
【００３０】
無水亜硫酸（ｓｕｌｐｈｕｒｏｕｓ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）が添加されていない濃縮果実汁（全糖量、５９．２％）を、蒸留水又は５０／５０の割合の蒸留水と酵母水で全糖量１％の濃度になるまで希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ約４．０〜４．５又は約６．０になるまで脱酸し、オートクレーブで、１２０℃で１５分間滅菌した。酵母水を用いる場合、酵母水は、市販のビール酵母約６０ｇを約３００ｍｌの蒸留水に懸濁し；オートクレーブで、１２０℃で３０分間滅菌し；バイオマスを４℃で１２時間デカンテーションして分離し；６，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離し；滅菌条件下で酵母細胞の細胞質抽出物を含む上清（酵母水）を最後に回収して調製した。
【００３１】
「リコッタ」の生産の副産物として得たバターミルクは、ラクトース４．８０％、タンパク質０．７９％、脂質０．４０％、ｐＨ５．０のパラメータによって特徴付けられた。前記バターミルクは、そのまま又は酵母抽出物（０．５％）を添加して発酵プロセスに用いた。
【００３２】
２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを発酵基質に添加し、実験によっては、０．１ｍＭピリドキサール−５−リン酸を添加した。
【００３３】
発酵は、４％乳酸菌（約１０７ｕｆｃ／ｍｌの初期細胞密度）を接種し、３０℃で９６時間インキュベーションして行った。
【００３４】
「静止細胞」、すなわち細胞が増殖期でない細胞を用いる場合は、約１０ｕｆｃ／ｍｌに等しい初期細胞密度を得ることができる種菌を用意した。Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３及びＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４を共に使用した場合は、これらを、それぞれ約１０７ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度に従って接種した。
【００３５】
（２）増殖動態及び酸性化
乳酸菌の細胞密度は、ＭＲＳ寒天プレートカウンティング（Ｏｘｏｉｄ）によって決定した。軟質混合物の酸性化動態を、ｐＨの測定（ｐＨ−ｍｅｔｅｒ ５０７、Ｃｒｉｓｏｎ、Ｉｔａｌｙ）によってオンラインで得た。増殖及び酸性化動態に関連したデータは、Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇらによって変更されたゴンパーツの式（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０、「細菌の増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６：１８７５−１８８１）によってモデル化した。初期の実験では、異なる基質における乳酸菌の増殖を、６２０ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．６２０）の決定によって調べた。Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の決定は、酵素キット（ＤＨＦＦ ＣＨＡＭＢ Ｉｔａｌｉａ Ｓｒｌ、Ｉｔａｌｙ）によって行った。
【００３６】
（３）ＧＡＢＡの決定
異なって発酵させた基質のＧＡＢＡ濃度を、陽イオン交換カラム（Ｎａ Ｏｘｉｄｉｓｅｄ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ、２０ｃｍ×４．６ｍｍ）を用いる「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０」（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって決定した（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００７、「非従来的な条件下で成熟させたイタリアチーズの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｔａｌｉａｎ Ｃｈｅｅｓｅｓ Ｒｉｐｅｎｅｄ Ｕｎｄｅｒ Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、９０：２６８９−２７０４）。
【００３７】
ＧＡＢＡの生産は、生産性：ｇｌ−１ｈ−１、収率：ΔＰ／ΔＳ、すなわち基質（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）の消費に対するＧＡＢＡの生産量、及び比生産速度（１／ｘ ｄＰ／ｄｔ）（ｘは、考察時の細胞密度を表す）によっても特徴付けられた。
【００３８】
（４）ビタミン、ミネラル、及びポリフェノールの含有量の決定
発酵した基質中のビタミンＢ群及びポリフェノールの含有量を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。ミネラルの濃度は、原子吸光法によって決定した。
【００３９】
（５）ラクトバクテリウム・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ１９４６３のＧＡＤ遺伝子の分子特徴付け
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＤＮＡの抽出を、Ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎによって報告された方法によって行った（Ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎら、「ラクトバチルス・ヘルベティカス特異的ＤＮＡプローブが、この種における制限酵素断片長多型を検出する（Ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ−ｓｐｅｃｆｉｃ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｄｅｔｅｃｔｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ．）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８：３４９２−３４３２）。ＧＡＤ遺伝子の高度に保存された領域によって設計されたプライマー、ＣｏｒｅＦ／ＣｏｒｅＲ（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧ−３（配列番号２）及び５’−ＴＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣ−３’（配列番号３））（ＰＲＩＭ ｓｒｌ Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を、ＧＡＤ遺伝子の増幅に用いた。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の各反応液５０μｌには、それぞれ２００μＭ ２’−デゾキシリボヌクレオシド５’−３リン酸、それぞれ１μＭ プライマー、２μＭ ＭｇＣｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２Ｕ、ＤＮＡ約５０ｎｇを含めた。ＰＣＲ増幅反応は、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）によって行った。増幅産物を、１．５％アガロースゲル上で電気泳動にかけて分離し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）によって着色した。ゲルによって溶出させたアンプリコンを、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。ＤＮＡの配列決定反応をＰＲＩＭで行った。配列の比較を、Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴデータベースによって行った。ヌクレオチド配列の翻訳を、ＯＭＩＧＡソフトウエア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）によって行った。
【００４０】
結果
（１）果実汁及びバターミルクにおける増殖及び酸性化
乳酸菌から開始するＧＡＢＡの合成のために基質として果実汁及びバターミルクを使用することに関連したバイオテクノロジー革命を考慮して、細菌の増殖及び酸性化の可能性を、２つの基質に対して初めに試験した。図１から分かるように、ｐＨを約４．０に調製した蒸留水希釈果実汁（全糖量１％）でも、乳酸菌が中程度に増殖した。図１に示す培養に関する例は、３０℃で４８時間インキュベーションした後の０．８９〜１．０６のＯＤ６２０値を示した。初期スクリーニングに用いた他の細菌も、上記の範囲のＯＤ６２０値を示した。微生物の増殖に対して、３．１１〜３．６５の範囲の様々なｐＨ値が一致した（図１）。果実汁の希釈を蒸留水ではなく酵母水（５０：５０の割合）で行った場合は、微生物の増殖が明確に上昇した（図２）。ＯＤ６２０の決定によって推定したように、細菌の増殖は、２．２８〜２．４８の範囲であることが示され、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の場合は最大値が記録された。同じ結果が、バターミルクのみ又は酵母抽出物（０．５％）を添加したバターミルクでの乳酸菌の増殖の比較によっても得られた。特に、Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４は、バターミルクで最大の増殖を示した。したがって、この第１のステップの選択の終了時に、酵母水と蒸留水（５０：５０の割合）で希釈した果実汁（全糖量１％）及び酵母抽出物（０．５％）を添加したバターミルクを基質として用いて、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３及びＬｃ．ラクティスＤＳＭ１９４６４で実験を続けることにした。
【００４１】
（２）ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３及びラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４からのＧＡＢＡの合成
図３は、様々に混合した果実汁とバターミルクでのラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成を示している。果実汁（ｐＨ約４．５）の使用に関するさらなる変更として、酵素ＧＡＤ活性のために基質としてＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加した。バターミルクのｐＨ値は、明らかに約５．９であった。増殖及び酸性化プロセスの場合に観察されたように、酵母水の添加により、ＧＡＢＡの最大の生産量が増加し、この生産量は、発酵の９６時間後に約９５ｇ／ｌ（約０．９１ｍＭ）の値に固定された。バターミルクでのＧＡＢＡの生産量は、たとえ酵母抽出物が存在しても著しく低いことが示された。
【００４２】
対照的に、Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４は、約８０ｇ／ｌ（０．７７ｍＭ）の値に固定されるバターミルクでのＧＡＢＡの最大の合成を示した。
【００４３】
このように得た結果に基づいて、唯一の基質として果実汁を用いてＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの生産を何とか最適化することにした。
【００４４】
（３）果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成の最適化
特に、発酵の変数：（ｉ）ｐＨ、（ｉｉ）果実汁中の糖の初期濃度、（ｉｉｉ）酵素ＧＡＤの補助因子としてのピリドキサール−５−リン酸の添加、（ｉｖ）「静止細胞」の使用、及び（ｖ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３とＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の組合せ使用について考慮した。
【００４５】
インキュベーションの期間中、ｐＨ値を一定に維持するためにリン酸緩衝液を使用すると、高すぎるモル濃度を使用することになり、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の増殖及び酵素活性が阻害される。インキュベーション期間中に、ｐＨ値が著しい酸性値に急速に達するのを回避するために、果実汁の初期ｐＨ値を、１Ｎ ＮａＯＨを添加して約６．０の値まで調整した。図４は、蒸留水及び酵母水で希釈され、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）が添加されたｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの酸性化、増殖、及び合成動態を示している。このような条件下で、約２５ｍＭ乳酸の合成に一致する、ΔｐＨ＝２．１２単位、Ｖｍａｘ＝０．１５１ｄｐＨ／分、及びλ＝０．８９ｈの値によって特徴付けられる強い酸性化プロセスを観察することが可能である。微生物の増殖は、このような酸性化動態に一致する。前記微生物の増殖は、Ａ＝１．７９ ｌｏｇ ｃｆｕ ｍｌ−１、μｍａｘ＝０．３１Δｌｏｇ ｃｆｕ ｍｌ−１ ｈ−１、及びλ＝０．８９ｈの値；特に、発酵の７８時間後に約５００ｍｇ／ｍｌ（約４．７９ｍＭ）の値に固定されるＧＡＢＡの合成の一定の上昇によって特徴付けられる。
【００４６】
果実汁中の初期の糖の濃度を、０．３〜１．０％の範囲に変更した（図５）。ＧＡＢＡの合成は、アミノ酸の異化反応にリンクしているが、このような合成は、糖の濃度（０．３〜１．０％）に比例して増大することが分かった（３７６〜５００ｍｇ／ｌ）。１％を超える濃度では、ＧＡＢＡの合成が有意に増大しなかった。糖１％の初期濃度で存在する場合は、微量（＜０．１％）のグルコース及びフルクトースが、発酵の７２〜９６時間後に果実汁で検出された。
【００４７】
図６に強調するように、ピリドキサール−５−リン酸（０．１ｍＭ）を添加しても、ピリドキサール５−リン酸が存在しない場合に観察された値に対してＧＡＢＡの合成が増大しなかった（図５）。明らかに、果実汁中のこのような化合物の濃度は、酵素ＧＡＤの補助因子の機能を発達させるのに十分である。予想した通り、酸性化及び増殖動態は、ピリドキサール−５−リン酸の添加による影響を受けなかった。
【００４８】
ＧＡＢＡの合成が、細菌の増殖に理論的にリンクしていない純粋な酵素反応であるため、「静止細胞」の仮想条件下、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の高いバイオマス（１０ｕｆｃ／ｍｌ）での果実汁の接種の可能性を評価した。図７は、細胞が増殖しないこのような条件下では、ＧＡＢＡの合成が、細胞が増殖する条件下（図５）で観察された値よりも低いことを示している。このような条件下でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の細胞の使用では、インキュベーションの最初の数時間の間、ＧＡＢＡの生産が僅かしか上昇しなかった。
【００４９】
ここでも、図５の発酵条件に従ってＬ．プランタルムから得られるＧＡＢＡの生産性向上の目的で、このような細菌のＬｃ．ラクティスＤＳＭ１９４６４との組合せ接種を行うことを仮定した。また、このような実験条件下では、ＧＡＢＡの合成の増加が観察されなかった。
【００５０】
（４）果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成プロセスの特徴付け
ＧＡＢＡの生産性：ｇｌ−１ｈ−１、収率：ΔＰ／ΔＳ、及び比生産速度（１／ｘ ｄＰ／ｄｔ）のような一部のバイオテクノロジーパラメータを、酵母水及び蒸留水で希釈した果実汁（５０／５０（全糖量１％）、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加）のＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の作用による発酵の際に決定した。図８から分かるように、５．７４〜５．７９ｇｌ−１ｈ−１に等しい高い生産性が、７２〜７８時間後にそれぞれ観察された。したがって、ＧＡＢＡの高い収率（０．２０６）及び比生産速度（０．６７３ １／ｘ ｄＰ／ｄｔ）の値が、３０℃での７２時間の発酵の後に観察された。
【００５１】
発酵の７２時間後、培養ブロスを回収し、そのまま凍結乾燥させた。表２は、この調製物の機能性分子及び乳酸菌についての組成、具体的には、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３による発酵及びこれに続く凍結乾燥の後の果実汁に基づいた調製物の乾燥物質１００ｇ当たりの機能性分子の濃度を示している。
表２
【表２】
【００５２】
表２から分かるように、調製物は、乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇの濃度のＧＡＢＡを含み、この濃度は、特開２００５−１０２５５９で報告されている濃度よりも８倍高い。調製物は、果実汁の希釈手段としての酵母水の使用に由来するビタミンＢ群、及び基本物質である果実汁に由来するミネラル及びポリフェノールなどの他の機能性分子も含む。最後に、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３ １ｇ当たり約１０個の細胞が調製物中に存在し、このような細胞は、予備試験から潜在的生菌活性を有する可能性が高い。
【００５３】
（例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築されたヒト表皮モデル及び次のｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築された皮膚ＦＴモデルにおける、本明細書でバイオマス又はビオ複合物と定義した、本発明に従ったＧＡＢＡを豊富にした混合物の効率の評価
この研究は、アトピー性乾皮症、皮膚及び頭皮の脂漏性皮膚炎、バリア機能及びミクロフローラに対する作用の改善に本発明による混合物を利用可能性を調べるために行った。
【００５４】
特に、本発明の目的は、まず第１に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築されたヒト表皮に対して異なる接触時間で１回塗布した後の前記バイオマスの皮膚許容度の検査、並びにバイオマスの活力のある皮膚との相互作用の検査及び皮膚バリア機能に対する検査である。
【００５５】
次いで、第２のアプローチでは、先の科学文献に従ったＧＡＢＡの効率、並びに以下に示すパラメータに対する陽性コントロールとして用いたＧＡＢＡに対するバイオマスの作用機序の確認である。
【００５６】
実験計画
試験システム：ヒト再構築表皮
（１）用いる表皮モデルは、研究室用Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ（登録商標），Ｎｉｃｅ（Ｆ）によって作製し、ロットの平均厚みが１２０μ（角質層及び生きた表皮）である分化の１７日目の０．５ｃｍサイズで用いる。
【００５７】
完全に分化した表皮は、空気と液体の境界にある多孔質ポリカーボネートから形成された不活性支持体上の化学的に限定された培地（ＭＣＤＢ１５３）（ウシ胎児血清を添加していない）にヒトケラチノサイトを入れて開始し、１７日間培養して得る。この分化段階で、形態学的解析により、生きた多層表皮及び１０以上の緻密な細胞層からなる角質層が示された。
【００５８】
（２）「完全な厚みの皮膚モデル」（ＦＴ）（Ｐｈｅｎｉｏｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、同じドナーからのケラチノサイト及び線維芽細胞からなる多層ヒト皮膚モデルである。５週間の培養期間の後、「完全な厚みの皮膚モデル」が完全に形成され、表皮、基底膜、及び真皮を含んでいた。このモデルは、表皮レベル（サイトケラチン１０、フィラグリン（ｐｈｉｌａｇｒｉｎ）、トランスグルタミナーゼ、及びインボルクリン）、真皮−表皮接合部（ラミニン及びコラーゲンＩＶ）、及び真皮レベル（エラスチン、フィブロネクチン）での分化の基本的なマーカーの発現について特徴付けられた。モデルＦＴの直径は１．３ｃｍである。
【００５９】
培地及び培養条件
組織及び培地をＧＭＰに従って作製し、特定の標準規格に対するこれらの再現性を確保した。この組織及び培地の使用は、研究目的のため、及び製品又は化学物質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価のためだけに許可されている。
【００６０】
組織ロットを、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、マイコプラズマが存在しないことを保証するために分析した。培地が滅菌されていることが保証された。培養の１７日目に、ＲＨＥインサートを、２４穴プレートの栄養アガロースゲルを含む穴に入れる。
【００６１】
プレートが研究室に到着したらすぐに、層流フード下のアガロースゲルからＲＨＥを分離する。インサートを、室温で維持培地ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ ５００μｌ又は１ｍｌをそれぞれ含む６穴又は１２穴のＦａｌｃｏｎプレートに迅速に入れる。インサートの下に泡ができないように注意を払う。組織を、飽和湿度の大気中で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃のインキュベータに入れる。土壌は、２４時間間隔で交換し、そして試験開始の少なくとも２時間前にも毎回交換する。
【００６２】
到着後、ＦＴ皮膚組織を輸送用の半個体土壌からすぐに取り出す。
【００６３】
カバーのない３枚の小さいペトリ皿を、１００ｍｍペトリ皿に置き、ＡＬＩ培地５ｍｌを、上にＦＴ組織を丁寧に配置する小さな濾紙ディスク及び２つの金属支持体と共に小さいペトリ皿のそれぞれの中に添加する。
【００６４】
次いで、組織をインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％）に入れる。
製品
【表３】
コントロール試料
【表４】
【００６５】
方法
ＴＥＥＲの測定
ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗値）は、皮膚バリアの機能性の直接的な測定値であり、その厚み及びそれ自体の構造によって生じる組織の全体的な抵抗を反映する。ＴＥＥＲは、密着接合部のレベルでの細胞内接触の完全性、及び外部の化合物の浸透を妨げる二層脂質構造の完全性を反映する。
【００６６】
ＴＥＥＲは、ＥＵが認めた、終点を角質層とバリア機能の完全性とみなす腐食性を評価するためのラット皮膚電気抵抗試験（Ｂ４０）の識別パラメータである。
【００６７】
ＴＥＥＲは、経表皮水分蒸散量（ｔｒａｎｓ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の測定値であるｉｎ ｖｉｖｏで測定されたＴＥＷＬに反比例し、ＴＥＷＬが高ければ高いほど、バリア機能のダメージが大きく、ＴＥＥＲが高ければ高いほど、バリア機能のダメージが小さい。
【００６８】
ＰＢＳ １ｍｌをインサートに添加し、経上皮電気抵抗値をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ器具で測定した（０〜２０ｋΩの範囲）。
【００６９】
各組織に対して２回測定を行った。
【００７０】
細胞傷害性試験：ＭＴＴ試験
この方法により、細胞の活力の測定によって、製品によって引き起こされる細胞傷害作用を定量することができる。細胞傷害は、未処理試料のネガティブチェックに対する細胞の活力の低下を測定することによって定量する。この試験は、異なる処理時点で製品に接触した後にテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）とミトコンドリア酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）との間で起こる代謝反応に基づいており、活力のある細胞のみが、テトラゾリム塩を不溶性誘導体（ホルマザン）に変換することができ、インサートを基にした紫の変色によって証明される反応である。
【００７１】
塩の代謝は、ポリカーボネート支持体の上のゾーンにある上皮基底細胞で起こる。紫色の誘導体の抽出を、イソプロパノールで行い、分光光度法によって５７０ｎｍで定量する。
材料
ＭＴＴテトラゾリウム塩（Ｓｉｇｍａ Ｍ２１２８）（Ｓｉｇｍａ Ｌ３７７１）
生理食塩水（ＦＵ）
イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ）
維持培地（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）
マイクロプレートオートリーダーＭ−２００ ＩＮＦＩＮＩＴＥ（ＴＥＣＡＮ）
化学天秤ＸＳ２０４ Ｍｅｔｔｌｅｒ（０．００００１）
【００７２】
プロトコル
処理時間が過ぎたら、処理した表皮の表面をＰＢＳで３回洗浄し、ＭＴＴ（培地に０．５ｍｇ／ｍｌ）溶液３００μｌを含むプレートに移す。
【００７３】
３７℃で３時間インキュベートした後、光を当てて室温で２時間ホルマザンを抽出する。Ｏ．Ｄ．値を、分光光度法によって、ブランクとして用いたイソプロパノール対して５７０ｍで測定する。
【００７４】
細胞傷害のパーセンテージを、ネガティブチェック試料のＯ．Ｄ．値に対して計算する。
【００７５】
組織学的分析
ＲＨＥの組織学的分析に必要な組織学的調製は、外部の専門機関に委託する。
【００７６】
すべての処理の終了時に、ＲＨＥをそのプラスチック支持体からランセットで取り出し、１０％ホルマリンを用いて定着処理を行う。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲ
この試験では、以下の遺伝子を用いた。
【表５】
１．ＲＮＡの抽出
２．全ＲＮＡから開始するｃＤＮＡの合成
３．ＰＣＲ
この技術は、蛍光信号を検出するためのＴａｑｍａｎプローブを用い、極めて高感度であり、核酸の特定の配列の増幅及び定量による。ＰＣＲ産物の検出をリアルタイムで行う。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの定量は、初めにＰＣＲ産物を検出できたサイクルを決定して行うのであって、反応が飽和した時点ではない。ＰＣＲ産物の定量は、各サイクルで測定した蛍光の検出によって行い、信号の強度は、増幅された産物の量に正比例する。
【００７８】
ＲＮＡの抽出
材料
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（ＡＭＢＩＯＮ）
【００７９】
この方法の原理
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓは、フィルターを用いてＲＮＡを単離する迅速な方法である。この方法は、濃縮塩溶液中の核酸に結合するガラス線維の能力に基づいている。
【００８０】
ＲＮＡの濃度は、紫外線透過性である９６穴プレートにおける２００ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の値を読み取り、式：Ａ２６０＊希釈因子＊４０＝ｇ ＲＮＡ／ｍｌを用いて決定した。
【００８１】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写
材料
高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００８２】
この方法の原理
この方法の原理は、存在するすべてのＲＮＡ分子の初めのへリックスの効率的な合成を確実にするランダムプライマーの使用に基づいている。
【００８３】
ｃＤＮＡを希釈し、−２０℃で保管する。
【００８４】
リアルタイムＰＣＲ
定量は、未処理のコントロール試料又は基準時点での試料とすることができる較正試料中の標的核酸配列に対する試料中の標的核酸配列の発現の変化を決定する。
【００８５】
相対的定量化では、内在性コントロールを、ｃＮＡ標的を標準化するために「活性基準」として用いる。
【００８６】
材料
２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
２０Ｘ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）Ｈｓ９９９９９９ｍ１
標的遺伝子（４．４の表を参照）
「ヌクレアーゼフリー」水
方法
各生体試料を３回ずつ試験して評価する。以下のプログラムを行うためにサーモサイクラーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００を用いる。
【表６】
【００８７】
器具からの一般データを内部ＳＤＳ１．３．１．ソフトウエアによって記録し、相対的定量化の「生データ」として報告する。結果は、エクセルとしてエクスポートする。
【００８８】
較正試料に対して１回で過剰に発現したか又は下方制御された場合は、値が有意であると認める。
【００８９】
プロトコル
皮膚の許容性及びバリア機能の効率
刺激の可能性を、バイオマス５０ｌ（１％−３％−３％＋保存剤０．８％）を４回（２４時間−２４時間−２４時間の回復−４８時間−７２時間）迅速に塗布した後の表皮ＳｋｉｎＥｔｈｉｃモデルに対して評価する。
【００９０】
皮膚レベルでのバイオマスの生物作用の広範囲且つ予測的な評価がこれまで実現されておらず、皮膚科学の新しい研究方法となるため、３つの相補的なパラメータを、この種の評価を定義する目的で検討した。この評価により、特定のバイオマーカーによって、許容性のモニタリングと同時に文献に記載されている生物作用のモニタリングを行うことができる。
【００９１】
皮膚の刺激の可能性を決定するＭＴＴ試験による細胞活力のモニタリング：このような場合、短期の迅速な塗布（２４時間）後の結果だけではなく、バイオマスの潜在的な生物活性を考慮する長期の効果も調べたい。
【００９２】
組織学的評価Ｈ＆Ｅ、相補性、及び細胞傷害値の確認
抗菌作用、したがって生理的抗菌保護の向上の利益とは別に、βディフェンシンは、細胞増殖及び特定のサイトカインの産生を増加させるため、皮膚レベルで先天免疫の広範囲の制御の役割を果たす。
【００９３】
ＧＡＢＡに対するＦＴ皮膚モデルにおける、酸化還元平衡時のヒアルロン酸の合成及び最終分化のマーカー（フィラグリン及びインボルクリン）に対する作用
製品（１％バイオマス及びＧＡＢＡ）５０ｌを組織の表面に塗布し、３日間＝７２時間、毎日塗布を繰り返す。処理の終了時に、組織のＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００９４】
負の刺激の非存在下での一定の「生理学的」状態での組織に対するこの種の処理により、成分に対する繰り返しの曝露及びその作用機序の生物学的効果が真皮レベルで証明される。
【００９５】
用量１ｍｍに塗布する正のＧＡＢＡコントロールは、その有効性が、ヒアルロン酸の合成と親水性非酵素的抗酸化剤であるＧＳＨの産生の増加による酸化ストレスに対する保護の両方についての文献に記載されているため選択した。
【００９６】
データの取得
器具ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００によって得た一般データを内部ＳＤＳ１．３．１．ソフトウエアによって記録し、相対的定量化の「生データ」として報告する。結果は、エクセルとしてエクスポートする。
【００９７】
較正試料に対して１回で過剰に発現したか又は下方制御された場合は、値が有意であると認める。
【００９８】
組織学的試料（スライドガラス）を顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＤＭ２５００によって分析し、そのイメージを保存し、ＬＥＩＣＡ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＳＵＩＴＥ（ＬＡＳ）ソフトウエアによって処理する。
【００９９】
組織の形態学的変化を未処理の組織と比較する。
【０１００】
結果
皮膚の許容性
ＭＴＴ試験の結果を、負のコントロール試料に対して計算した細胞活力（％）として表した。定められたあらゆる時点でのＭＴＴ試験の結果は、細胞傷害活性が、実験の化合物、すなわちＬＢ．プランタルムからのバイオマスに一切起因しないことを示している。
【０１０１】
抗菌防腐剤（イソシド（ｉｓｏｃｉｄｅ）０．８％）の存在は、細胞傷害の結果に影響を与えなかった。
【０１０２】
１％及び３％の両方のバイオマスでの処理後の細胞活力が、試験の内因性の変動の値（±１５％）を超えて増加し（２４時間＋回復及び４８時間の時）、負のコントロール試料に起因する１００％に対して４０％の増加であることに留意されたい。
【０１０３】
このような結果は、２４時間＋２４時間の回復の時が遅延性の毒性の影響を観察できるため、２４時間＋２４時間の回復が特に厳密な処理であるという事実も考慮する高い価値を有する。
【０１０４】
組織レベルでの他の毒性成分の非存在下では、このような増加は、バイオマスでの処理によって誘導された細胞増殖の刺激に相関しうる。
【０１０５】
２４時間の処理
１％では、バイオマスで処理した組織は、負のコントロール試料に対して有意な変化が一切観察されない。防腐剤の存在下、３％では、一部の基底細胞において、凝集性の喪失及び細胞質の僅かな膨張（海綿状態）が観察される。
【０１０６】
２４時間の処理＋２４時間の回復
２４時間のコントロール試料に対して有意な変化が一切観察されない。
【０１０７】
４８時間の処理
コントロール試料に対して有意な形態学的変化が一切観察されず、１％及び３％の両方で表皮の厚みが増大する。
【０１０８】
防腐剤の存在下では、僅かに厚くなった角質層が観察され、表面の小さな剥がれ（剥離層）がある。
【０１０９】
７２時間の処理
１％及び３％の両方で、コントロール試料に対して有意でない生体表皮の厚みの減少が観察されたが、これは、組織の生理的発達に関連している。
【０１１０】
ＲＴ−ＰＣＲ
試験した様々な濃度でのバイオマスでの処理の後、既に２４時間後に、βディフェンシンの発現に対する刺激作用が観察され、この刺激作用が７２時間後まで低下することなく続き、これはどう考えてもコントロール試料（ＰＢＳ）の２倍の値である。この結果は、生理的抗菌保護の向上に対する有意な刺激に一致する。
【０１１１】
抗菌防腐剤の存在は、観察パラメータ全体に影響を与え、絶対値が低下するが、バイオマスの挙動は変化せず、βディフェンシン２の発現が誘発される。
【０１１２】
ＴＥＥＲの測定
ＴＥＥＲの値は、２つの測定が行われた２つの組織の平均を指す。
【０１１３】
ＴＥＥＲの値に関しては、角質層及び一体的な密着接合部のレベルでの緻密な層状構造の存在、及び有効なバリア機能を全体的に画定する表皮の厚みが関係している。各組織は、ｔ＝０及びｔ＝有限時間での測定値をもつ適切な基準である。
【０１１４】
２４時間＋２４時間の回復では、処理した組織及びＰＢＳ＝ロットの未処理コントロール試料の両方において、ＴＥＥＲの無意味な上昇が観察された。
【０１１５】
４８時間の結果は、特に興味深く、最も興味深い組織構造は、バイオマスで処理した後（の表皮の厚みの増大）に一致する。
【０１１６】
１％の濃度で、ＴＥＥＲの有意な上昇が観察された。３％でも起こるが、このＴＥＥＲ値は、標準偏差が大きいため急激ではない。
【０１１７】
この上昇は、表皮の厚みの増大及び密着接合部のレベルでの角質層の良好な緻密性及び完全性の両方の直接的な結果である。
【０１１８】
７２時間では、パラメータに対する影響がないことが証明され、この傾向が、処理後のＴＥＥＲの減少につながり、前記減少が、組織構造で観察された厚みの減少に部分的に相関している。
【０１１９】
グルタミン酸−システイニルリガーゼ
ＧＣＬＣは、ＧＳＨ合成の酵素前駆体である。酸化還元平衡が酸化防御の第１の表皮機構であるため、ＧＣＬＣの発現の研究を、塗布（８Ｈ）後の早期の時点から開始した。
【０１２０】
選択した実験条件下では、一切の遺伝子調節が観察されなかった。
【０１２１】
グルタチオンシンテターゼ
ＧＳＳは、主に表皮レベルに存在する抗酸化性で親水性の非酵素的なグルタチオンの合成を制限する酵素である。
【０１２２】
遺伝子調節が、ＧＡＢＡ及びバイオマスの両方において、２４時間での傾向として観察されたが、発現値は極めて低く有意ではない。いずれにしても、早期の時点での有意な低発現（ｓｕｂ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、真皮又は表皮レベルでの製品とその生理作用の適合性についての間接的な正の信号であり、外部刺激（例えば、誘導された酸化ストレス）の非存在下で、ＧＳＨ合成の増加を所望しない生理的酸化還元平衡が維持されることに留意することが重要である。
【０１２３】
ヒアルロン酸シンセターゼ
ＨＡＳは、ヒアルロン酸の合成を担う酵素である。前記合成は、真皮レベルで線維芽細胞によって行われる。負の刺激の非存在下での線維芽細胞活性の刺激が、健常な皮膚に対する期待する効率及び日常使用にとって重要であるという事実に留意することが重要である。
【０１２４】
この発現は、文献に開示されているように、２４時間及び４８時間でＧＡＢＡの作用によって上昇し、コントロール試料に対する発現値が３倍である２４時間のバイオマスの処理によってより明確に裏づけられた（図９）。
【０１２５】
大きい標準偏差では、得たデータをチェックするためにさらなる試験が必要である。
【０１２６】
フィラグリン
４００ｋＤＡのフィラグリンの前駆体であるプロフィラグリン（ｐｒｏｐｈｉｌａｇｒｉｎ）は、ヒト表皮におけるケラトアヒアリン（ｋｅｒａｔｏａｈｙａｌｉｎ）顆粒の主な構成成分である。
【０１２７】
角質層の最終分化の後、プロフィラグリンは、３７ｋＤのタンパク質であるフィラグリンに変換される。
【０１２８】
フィラグリンにより、ケラチンが凝集及び緻密化して細胞骨格になり、人体の最外部である角質総包（ｈｏｒｎｙ ｉｎｖｌｕｃｒｅ）が形成される。
【０１２９】
表皮の分化のマーカーであるフィラグリンは、バリア機能の重要なタンパク質であり、ＮＭＦ形成の基本要素であるとみなされる。
【０１３０】
このバリアが分布すると、カルシウムが減少し、フィラグリンがｍＲＮＡレベルで減少する。
【０１３１】
ＧＡＢＡ及びバイオマスの両方の処理により、既に２４時間でＧＡＢＡの存在の証拠となる遺伝子の過剰発現が誘導され、７２時間からＧＡＢＡ及びバイオマスの両方でこの過剰発現が著しくなる。バイオマスは、ＧＡＢＡよりも高い遺伝子発現を誘導する（図１０）。
【０１３２】
インボルクリン
６８ｋＤの可溶性の細胞質タンパク質であって角膜実質細胞の最終分化のマーカー
インボルクリンは、ケラチノサイトのトランスグルタミナーゼの基質であり、表皮の角質総包の形成のための「足場」として機能する。
【０１３３】
この遺伝子発現は、角質層で始まり、顆粒層で維持される。
【０１３４】
バリアが分布すると、カルシウムが減少し、インボルクリンがｍＲＮＡレベルで減少する。
【０１３５】
インボルクリンも同様に、脂質（セラミド、コレステロール、及び脂肪酸）の「足場」として機能する。
【０１３６】
選択した実験条件下では、一般に、遺伝子の有意な調節は全く起こらない（図１１）。
【０１３７】
１％バイオマスでの表皮モデル（ＲＨＥ）に基づいて、フィラグリン及びインボルクリンの発現にも関連してＦＴ−皮膚で観察されたことを確認し、この結果、フィラグリンの有意な調節及びインボルクリンの僅かな調節が確認された。
【０１３８】
結論
この研究は、表皮及び真皮レベルでの異なる皮膚機構でラクトバチルス・プランタルムからバイオマスを効率的に提供する目的が達成されたことを示した。
【０１３９】
ＲＨＥに対する刺激の可能性
１％及び３％で塗布した化合物バイオマスの２４時間から７２時間まで各時点での許容性が、生体組織のレベルで、毒性の兆候が一切なく、細胞（細胞傷害）及び形態学的（Ｈ＆Ｅ）パラメータによって完全に証明された。
【０１４０】
バイオマスは、負のコントロール試料よりも高い細胞活力のデータ、生体表皮の厚みの増大、及び抗菌防御に対する刺激の生理反応も示唆するβディフェンシン２の発現に基づいて、１％及び３％の両方で細胞増殖の刺激を誘発することが分かった。
【０１４１】
ＲＨＥのバリア機能に対する作用
この結果から、ＴＥＥＲの測定値が４８時間でのＴＥＥＲの有意な増大を示し、１％及び３％の両方のバイオマスでの処理後に最も興味深い組織の応答（表皮の厚みの増大）があったため、認知されているＧＡＢＡの機能が確認された。この結果、表皮の厚みの増大及び密着接合部レベルでの角質層の良好な緻密化及び一体化の両方が直接起こる。
【０１４２】
γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対するＦＴ−皮膚モデルでのヒアルロン酸の合成及び酸化還元平衡に対する作用
１％バイオマスを３日間繰り返し塗布した後、ＧＡＢＡで得られた値よりも高い量のヒアルロン酸シンセターゼの有意な過剰発現が観察された。このデータの値は、ＧＡＢＡについての文献を裏づけ、局所的に塗布されると線維芽細胞がヒアルロン酸の新合成に早期に一定の刺激作用を与える製品としてバイオマスを定義するという事実につながる。
【０１４３】
ヒアルロン酸の合成に対する生理的刺激作用は、以下に示す皮膚科学的な結果を招くと仮定した。
・深いレベルで水を保持する皮膚線維の高い能力に相関して真皮が大きく膨張すること
・弾性繊維及びコラーゲン繊維が、若くて弾性のある皮膚（すなわち、深部に水分が多い皮膚）が特徴であるマトリックス内に覆われているため、時間が経過しても皮膚の弾性が良好であること
【０１４４】
最終分化のマーカー（ＦＴ−皮膚モデルでモニタリングしたフィラグリン及びインボルクリン）に対する作用
３日間繰り返し塗布した後、バイオマス及びＧＡＢＡの両方によって誘導されたフィラグリンの有意な発現の上昇が観察されたが、インボルクリンは調節されないことが示された。このような結果は、顆粒層レベルで合成された天然保湿因子ＮＭＦの産生機構の再開におけるバイオマスの効果を証明した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農産業及び食品産業の余剰品に乳酸菌（ＬＡＢ）を使用してγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を調製する方法に関する。特に、本発明は、皮膚科の分野、並びに腎障害、例えば、高血圧及び糖尿病の症状によって引き起こされるものの治療で有利に使用される果実汁やバターミルクのような農産業及び食品産業の余剰品でのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産のために選択された乳酸菌の使用に関する。非天然アミノ酸と定義されるＧＡＢＡは、ＧＡＢＡのＬ−グルタミン酸塩の不可逆的脱炭酸を触媒する、ピリドキサールリン酸依存性の酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（ＥＣ ４．１．１．１５）によって合成される。酵素ＧＡＤは、真核生物及び原核生物の両方に広範に分布している（Ｕｅｎｏ、２０００、「デカルボキシラーゼにおける酵素的及び構造的側面（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｐｅｃｔ ｏｎ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ、１０：６７−７９）。ＧＡＢＡがヒトの様々な生理学的機能を発達させることができることが広く示されてきた。ＧＡＢＡは、神経伝達物質として、降圧誘導剤として、利尿薬として、及びトランキライザーとして機能することができる（Ｇｕｉｎら、２００３、「ＧＡＢＡ、γヒドロキシ酪酸及び神経疾患（ＧＡＢＡ，ｇａｍｍａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒ．、６：３−１２；Ｊａｋｏｂｓら、１９９３、「ＧＡＢＡ代謝の先天性疾患（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉ、１６：７０４−７１５）。うつ病（Ｏｋａｄａら、２０００、「経口投与による不眠症、うつ病、自律神経障害に対するＧＡＢＡ強化脱脂米胚芽の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｆａｔｔｅｄ ｒｉｃｅ ｇｅｒｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ＧＡＢＡ ｆｏｒ ｓｌｅｅｐｌｅｓｓｎｅｓｓ，ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｂｙ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ、７５：５９６−６０３）、アルコール中毒に関連した症状（Ｏｈら、２００３、「発芽玄米抽出物は慢性アルコール中毒に関連した症状の回復において栄養補助効果を示す（Ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｈｏｗｓ ａ ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ）」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄ、６：１１５−１２１）、及び免疫系の刺激（Ｏｈ及びＯｈ、２００３、「ＧＡＢの濃度が高められた玄米抽出物は免疫細胞を刺激する（Ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２：２４８−２５２）の治療が、ＧＡＢＡの投与に関連している。皮膚科分野の近年の研究から、（ｉ）紫外線に対する応答としての表皮レベルでの恒常性維持機構（Ｗａｒｓｋｕｌａｔら、２００４、「細胞恒常性の維持における正常なヒトケラチノサイトの浸透圧調節物質法（Ｔｈｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍａｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２３：５１６−５２１）、（ｉｉ）表皮の機能障害及び過増殖の症状を防止するバリア受容体の調節（Ｄｅｎｄａら、２００２、「γアミノ酪酸（Ａ）受容体作用薬は、皮膚バリアの回復を促進させ、バリア破壊によって引き起こされる表皮過形成を防止する（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｉｄ（Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｂａｒｒｉｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１９：１０４１−１０４７）、及び（ｉｉｉ）酸化ストレス後の表皮線維芽細胞の生存率の改善及びヒアルロン酸の刺激（Ｉｔｏら、「真皮線維芽細胞由来ＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤ６７：新規の皮膚機能の証拠（ＧＡＢＡ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ＧＡＤ６７，ｆｒｏｍ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｓｋｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１７７０：２９１−２９６）にＧＡＢＡが関与していることが分かった。さらに、近年、腎臓にあるＧＡＢＡの受容体の様々なサブユニットの存在、新しい受容体複合体へのサブユニットの凝集、及び腎臓近位尿細管細胞におけるＧＡＢＡＡの活性受容体が示された（Ｓａｔｉｎｄｅｒ Ｓ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３２４巻、第１版、３７６−３８２、２００８）。
【０００２】
このように広く認知されている生理的機能に基づいて、様々な機能性食品で、技術的処理及び酵素又は微生物の性質によってＧＡＢＡが濃縮又は強化されている（Ｏｋａｄａら、２０００；Ｎａｇａｏｋａ、２００５、「内在性酵素によって触媒されるＧＡＢＡ及びＩＰ６の濃度を上昇させるための発芽小麦の処理（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ａｎｄ ＩＰ６ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｚｙｍｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２１：４０５−４１０；Ｏｈら、２００３、「キトサン／Ｇｌｕ発芽溶液及びカルシウム／カルモジュリンによる玄米におけるγアミノ酪酸の合成活性の刺激（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂｒｏｗｎ ｒｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｈｉｔｏｓａｎ／Ｇｌｕ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６：３１９−３２５）。
【０００３】
ある種の研究は、機能性ミルクチーズ誘導体の生産と、このような酵素活性の基礎となる生理的機構の理解の両方のために乳酸菌からのＧＡＢＡの合成についても考察した（Ｎｏｍｕｒａら、１９９８、「チーズの熟成中のチーズスターターによるγアミノ酪酸の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｃｈｅｅｓｅ ｓｔａｒｔｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｅｅｓｅ ｒｉｐｅｎｉｎｇ）」、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、８１：１４８６−１４９１；Ｐａｒｋ及びＯｈ、２００４、「ラクトバチルス・プランタルムからの完全長グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）」、Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．、９：３２４−３２９：Ｐａｒｋ及びＯｈ、２００７、「新規に単離した乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビスＯＰＫ−３からの新規な長グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング、配列決定、及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＯＰＫ−３）」、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、９８：３１２−３１９）。一般に、ＧＡＢＡの合成により、酸環境条件にさらされる細菌細胞に耐性が付与され（Ｃｏｔｔｅｒ及びＨｉｌｌ、２００３、「酸試験で残存：低いｐＨに対するグラム陽性細菌の応答（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｔｅｘｔ：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｌｏｗ ｐＨ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｒｅｖ．、６７：４２９−４５３）、酵素ＧＡＤによるプロセスが、乳酸菌種Ｅ１のエネルギー合成に関連している（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９７、「乳酸菌株におけるグルタミン酸塩とγアミノ酪酸の置換（Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｉｎ ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ）」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９：３３６２−３３６４）。公表された文献に属するミルクチーズ誘導値体でのＧＡＢＡの生産は、約７０ｍｇ／ｌ（約０．６７ｍＭ）の閾値を超えることはない。我々の現在の知識状態では、米胚芽及び牛乳に基づいた飲料の調製の際に、培養土ＭＲＳでの大量生産のために、「鮒寿司」から単離されたラクトバチルス・パラカゼイ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＮＦＲＩ（７４１５）の使用についての特開２００５−１０２５５９も同様である。さらに、同じ生物型のＬ．パラカゼイＮＦＲＩによる培養土ＭＲＳでのＧＡＢＡの生産が、いくつかの発酵パラメータを基準に最適化された研究が知られている（Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉら、２００５、「従来の発酵食品から単離したラクトバチルス・パラカゼイによるγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ） ｂｙ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２２：４９７−５０４）。しかしながら、周知の技術に記載されている方法によって得たＧＡＢＡの収率は満足できるものではない。
【０００４】
したがって、上記を鑑み、周知の方法の不都合を克服できるＧＡＢＡの調整のための材料及び方法が要望されていることは明らかである。
【０００５】
本発明の発明者は、いくつかの乳酸菌、特にラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３（ＤＳＭＺと共に２００７年６月２６日に出願）、これらの増殖に適した基質、特に果実汁を選択し、周知の技術により得ることができる収率よりも遥かに高い収率でＧＡＢＡを生産する方法について説明する。
【０００６】
本発明のさらなる利点は、（ｉ）微生物の増殖及びＧＡＢＡの生合成を助けるために、市販の複雑な培養土の使用を避けて低コストの天然発酵基質（例えば、果実汁やバターミルク）を利用する可能性、（ｉｉ）文献に報告されている濃度に対する食物起源の母体でのＧＡＢＡ合成の増加、（ｉｉｉ）高い生理的な値と、ＧＡＢＡ、ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び潜在的に有益な菌である生きた活力のある乳酸菌で自然に強化されていることとを特徴とする乾燥又は凍結乾燥された製品を得ることができる発酵方法、及び（ｉｖ）ＧＡＢＡに基づいた製品の適用分野を皮膚科分野及び腎障害の治療分野へ拡張する可能性である。
【０００７】
本発明による乳酸菌は、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する。これらの乳酸菌は、ＧＡＢＡで自然に強化され、且つ培養土で高濃度にＧＡＢＡを合成する能力に基づいて選択した食物母体（チーズ）から前もって単離した。本発明では、果実汁やバターミルク（リコッタ生産の副産物）のような基質から開始し、酵母水又は酵母抽出物を添加し、標準的な培養条件下で発酵させる際のＧＡＢＡの増殖及び合成能力に基づいて、ＧＡＢＡの８種類の生産株に対して選択を行った。
【０００８】
具体的には、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３を選択して、濃縮果実汁（全糖量、６１．８％）を５０：５０の割合で酵母水と水で希釈し（全糖量１％）、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加し、約６．０の初期ｐＨ値に調整して発酵させた。
【０００９】
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの生産プロトコルを標準化及び最適化した。前記プロトコルでは、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３を、３０℃で２４時間、培養土ＭＲＳで初めの増殖を行い、遠心分離及び洗浄によって細胞を回収し、酵母水で希釈した果実汁を接種し、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（ｐＨ、約６．０）を添加し、３０℃で、好ましくは７２時間〜７８時間、連続的にインキュベーションする。
【００１０】
本発明によるＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３による発酵プロセスにより、（ｉ）食品分野及び農業食物分野からの余剰物である果実汁を利用することによって基質のコストを０にすることができ、（ｉｉ）果実汁の発酵プロセスの最後に約５００ｍｇ／ｌ（約４．８ｍＭ）のＧＡＢＡの生産、又は凍結乾燥製品の乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇのＧＡＢＡの生産が可能になり、（ｉｉｉ）酵母水の使用によるビタミンＢ群及び果実汁の使用によるミネラル及びポリフェノールを用いたＧＡＢＡを含む製品の天然強化が可能となり、（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に基づいた、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の生きた活力のある細胞を用いた凍結乾燥製品の天然強化（実験室条件下、約１０１０ｕｆｃ／ｇ）により、あらゆる生菌特性を有することができ、且つ（ｖ）上記した近年の公表に示されているように、皮膚科分野における製品の潜在的な利用が可能となる。
【００１１】
本発明によるＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３は、「鮒寿司」から単離されたＬ．パラカゼイＮＦＲＩ（７４１５）によって異なる食物母体（米胚芽及び牛乳を基にした飲料）で発酵させて得た、食物起源（果実汁）の母体でのＧＡＢＡの生産量が、乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇであり、特開２００５−１０２５５９で報告されている生産量（乾燥物質１００ｇ当たり１０３．９ｍｇ）よりも格段に多いことを示している。Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３については、ＧＡＤ遺伝子の部分配列を、Ｌ．パラカゼイＮＦＲＩとは異なるようにクローニングした。このＧＡＤ遺伝子は、ＧＡＢＡの合成に関与している。
【００１２】
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３（配列番号１）の遺伝子グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の部分配列は次の通りである。
１ ｇｎａｎｇｃｔａｔｔ ｃａｎｇｃｃｔｇｎｎ ｃｃｔｇｇｃａａｃｔ ｔｔｔｔｇｔｃａｇａ ｃｃｔａｔａｔｇｇａ ａｃｃｃｇａａｇｃｃ
６１ ｇｔｔｇａａｔｔｇａ ｔｇａａｇｇａｔａｃ ｇｃｔｇｇｃｔａａｇ ａａｔｇｃｃａｔｃｇ ａｃａａａｔｃｔｇａ ｇｔａｃｃｃｃｃｇｃ
１２１ ａｃｇｇｃｃｇａｇａ ｔｔｇａａａａｔｃｇ ｇｔｇｔｇｔｇａａｃ ａｔｔａｔｔｇｃｃａ ａｔｃｔｇｔｇｇｃａ ｃｇｃａｃｃｔｇａｔ
１８１ ｇａｃｇａａｃａｃｔ ｔｔａｃｇｇｇｔａｃ ｃｔｃｔａｃｇａｔｔ ｇｇｃｔｃｃｔｃｔｇ ａａｇｃｔｔｇｔａｔ ｇｔｔａｇｇｃｇｇｔ
２４１ ｔｔａｇｃａａｔｇａ ａａｔｔｃｇｃｃｔｇ ｇｃｇｔａａａｃｇｃ ｇｃｔｃａａｇｃｇｇ ｃａｇｇｔｔｔａｇａ ｔｃｔｇａａｔｇｃｃ
３０１ ｃａｔｃｇａｃｃｔａ ａｃｃｔｃｇｔｔａｔ ｔｔｃｇｇｃｔｇｇｃ ｔａｔｃａａｇｔｔｔ ｇｃｔｇｇｇａａａａ ｇｔｔｔｔｇｔｇｔｃ
３６１ ｔａｃｔｇｇｇａｃｇ ｔｔｇｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｃｃ ｃａａｔｇｇａｔｇａ ｇｃａａｃａｃｇｔｇ ｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇ
４２１ ｔｔａａａｃａｃｇｔ ｃｔａｃｇｇｃｔｔｇ ｇｇｃｃｇａｇａａｔ ｃｇｃｔｔｇｇｔａｔ ｔｔｔｔｔｔｇｔａａ ａｃａａｇｇｃｇｔｃ
４８１ ｃｃｃｔｔｔａｃｃｃ ｃｔｇｃｃｃ
【００１３】
本発明の発明者はまた、ＧＡＢＡの収率が異なる発酵プロトコルに従って利用できる果実汁及び主にバターミルクの発酵に用いることができる乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．）ＤＳＭ１９４６４（ＤＳＭＺと共に２００７年６月２６日に出願）を選択した。
【００１４】
したがって、本発明の特定の目的は、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種である。
【００１５】
本発明の別の目的は、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製にＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３又はＬＣ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４を使用することにある。
【００１６】
さらに、本発明は、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製のための方法にも関し、この方法は、以下のステップ：
ａ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種の、３０℃で２４時間の培養土、好ましくはＭＲＳ又はＭ１７での増殖、
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、果実汁又はバターミルクから選択した２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを添加した一定量の基質中での、ステップａ）で得たバイオマスの再懸濁、
ｃ）１〜４％での基質の接種、及び７２〜９６時間、好ましくは７２〜７８時間、３０〜３３℃、好ましくは３０℃の発酵
を含む。
【００１７】
好ましくは、果実汁は、酵母水で希釈するか、又は酵母を添加することができる。特に、果実汁は、酵母水及び５０／５０蒸留水で希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによって脱酸して、ｐＨ６．０〜６．５、好ましくはｐＨ約６．０まで下げることができる。対照的に、バターミルクに酵母抽出物（約０．５％）を添加することができる。さらに、果実汁又はバターミルクにピリドキサール−５−リン酸を添加することができる。
【００１８】
本発明による方法は、ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥又は凍結乾燥させるステップｄ）もさらに含むことができる。別法では、本発明による方法は、γアミノ酪酸の抽出に関連するステップｄ１）もさらに含むことができる。
【００１９】
したがって、上記に基づいて、γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製の方法は、以下のステップ：
ａ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３又はＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の、３０℃で２４時間の培地、好ましくはＭＲＳ又はＭ１７での増殖、
ａ１）遠心分離（１０，０００×ｇで、４℃で１０分間）による細胞の収集、及び５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０による洗浄、並びに
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、一定量の希釈果実汁又はバターミルク中でのバイオマスの再懸濁；
ｂ１）蒸留水約３００ｍｌに市販のビール酵母約６０ｇを懸濁することによる酵母水の調製；オートクレーブでの、１２０℃で３０分間の滅菌；バイオマスの、４℃で１２時間のデカンテーション；６０，０００×ｇでの、４℃で１０分間の遠心分離；滅菌条件下での、酵母細胞の細胞質抽出物を含む上清（酵母水）の最終的な回収；
ｂ２）上記の割合に従った、水及び酵母水での濃縮果実汁の希釈（調整後の最終ｐＨは約６．０）、続いてのオートクレーブにおける１２０℃で１５分間の滅菌、又は酵母抽出物（０．５％）が添加されたバターミルク（ラクトース４．８％、タンパク質０．７９％、脂質０．４０％、ｐＨ５．９０）の使用後の１２０℃で１５分間の滅菌
ｃ）１〜４％での基質の接種、約７２〜９６時間（好ましくは７２〜７８時間）、３０℃での発酵
を含む。
【００２０】
本発明による方法は、さらに、ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥若しくは凍結乾燥させるステップｄ）、又はγアミノ酪酸を抽出するステップｄ１）を含むことができる。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上記した方法で得ることができるγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物である。生菌混合物は、好ましくは乾燥物質１００ｇ当たり少なくとも８９０ｍｇのγアミノ酪酸を含み、これに加えて、ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び生きた活力のある乳酸菌を含む。
【００２２】
この生菌混合物は、医学及び美容の分野に好都合に利用することができ、出願者が実施した、本願の実験の部分で報告する研究によると、ＧＡＢＡのみで処理した後に得られた生菌混合物に対して有利な効果を示した。したがって、本発明は、薬学的又は化粧用に許容される化合物である１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントと共に、活性成分としての、既に上記したγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物を含む医薬組成物又は化粧品組成物にも関連する。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、本発明による化粧品化合物としての、γアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の使用である。
【００２４】
さらに、本発明は、皮膚科で使用する薬物の調製のための、本発明によるγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の使用に関する。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、例えば、高血圧及び糖尿病の症状によって引き起こされる腎障害などの腎疾患の治療用の上記定義した医薬組成物である。
【００２６】
本発明を、具体的に添付の図面を参照しながら、本発明の実現のための好適な形態に従って、限定目的ではなく例示として次に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】蒸留水で希釈した、ｐＨ約４．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．パラカゼイＦＣ４４、ラクトバチルス・プランタルムＦＣ４１５、ラクトバチルス・デルブリュッキイ ＰＲ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ＰＲ１）、Ｌ．プランタルムＦＣ４８、及びＬ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の酸性化動態及び増殖を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図２】５０：５０の割合で酵母水と蒸留水で希釈した、ｐＨ約４．５の果実汁（全糖量１％）でのＬ．パラカゼイＦＣ４４、Ｌ．プランタルムＦＣ４１５、Ｌ．デルブリュッキイＰＲ１、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３、Ｌ．プランタルムＦＣ４８、及びＬＣ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の酸性化動態及び増殖を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図３】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約４．５の果実汁（全糖量１％）（Ａ）；酵母抽出物（０．５％）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約４．５の水希釈果実汁（全糖量１％）（Ｂ）；Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ５．９０のバターミルク（Ｃ）；酵母抽出物（０．５％）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ５．９０のバターミルク（Ｄ）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図４】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈した果実汁（全糖量１％、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及び増殖（Ｂ）、並びにＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図５】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加し、全糖の濃度が異なる（Ａ：０．３％、Ｂ：０．５％、Ｃ：０．７％、及びＤ：１％）、ｐＨ約６．０の果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３（Ｃ）からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図６】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈した果実汁（全糖量１％、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）及びピリドキサール−５−リン酸を添加）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及び増殖（Ｂ）、並びにＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図７】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の酸性化動態（Ａ）及びＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の静止細胞（増殖期でない細胞）からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（ｍｇ／ｌ）の生産（Ｂ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図８】酵母水及び蒸留水（５０／５０）で希釈し、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加したｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生産性：ｇｌ−１ｈ−１（Ａ）、収率：ΔＰ／ΔＳ（Ｂ）、及び比生産速度：１／ｘ ｄＰ／ｄｔ（Ｃ）を示すグラフである。発酵は、３０℃で行った。
【図９】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおける酵素ヒアルロン酸シンセターゼの発現を示す図である。
【図１０】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおけるフィラグリン遺伝子の発現を示す図である。
【図１１】本発明によるバイオマス又はＧＡＢＡでの８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の処理の後のＦＴ−皮膚モデルにおけるインボルクリン遺伝子の発現を示す図である。
【００２８】
（例１）
本発明による乳酸菌の選択
イタリアのバリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｒｉ）の植物保護及び応用微生物学部の培養物の収蔵品（Ｃｏｌｌｅｚｉｏｎｅ ｄｉ Ｃｏｌｔｕｒｅ ｄｅｌ Ｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ ｄｉ ｐｒｏｔｅｚｉｏｎｅ ｄｅｌｌｅ Ｐｉａｎｔｅ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ Ａｐｐｌｉｃａｔａ ｄｅｌｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ’ ｄｅｇｌｉ Ｓｔｕｄｉ ｄｉ Ｂａｒｉ）に属し、予めチーズから単離され、培地の条件下でＧＡＢＡの合成能に基づいて選択した乳酸菌を、ＭＲＳ又はＭ１７で、３０℃で２４時間培養した（Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４）（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）。表１に、γアミノ酪酸の生産のために本発明に用いた種及び生物型のリストを示す。
表１
【表１】
【００２９】
（１）農業及び食品の母体の発酵のための乳酸菌の使用
培地で培養した後、乳酸菌細胞を遠心分離（１０，０００×ｇで、４℃で１０分間）によって収集した。次いで、乳酸菌細胞を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄し、１０９ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度で一定量の果実汁又はバターミルクに再懸濁した。
【００３０】
無水亜硫酸（ｓｕｌｐｈｕｒｏｕｓ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）が添加されていない濃縮果実汁（全糖量、５９．２％）を、蒸留水又は５０／５０の割合の蒸留水と酵母水で全糖量１％の濃度になるまで希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ約４．０〜４．５又は約６．０になるまで脱酸し、オートクレーブで、１２０℃で１５分間滅菌した。酵母水を用いる場合、酵母水は、市販のビール酵母約６０ｇを約３００ｍｌの蒸留水に懸濁し；オートクレーブで、１２０℃で３０分間滅菌し；バイオマスを４℃で１２時間デカンテーションして分離し；６，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離し；滅菌条件下で酵母細胞の細胞質抽出物を含む上清（酵母水）を最後に回収して調製した。
【００３１】
「リコッタ」の生産の副産物として得たバターミルクは、ラクトース４．８０％、タンパク質０．７９％、脂質０．４０％、ｐＨ５．０のパラメータによって特徴付けられた。前記バターミルクは、そのまま又は酵母抽出物（０．５％）を添加して発酵プロセスに用いた。
【００３２】
２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを発酵基質に添加し、実験によっては、０．１ｍＭピリドキサール−５−リン酸を添加した。
【００３３】
発酵は、４％乳酸菌（約１０７ｕｆｃ／ｍｌの初期細胞密度）を接種し、３０℃で９６時間インキュベーションして行った。
【００３４】
「静止細胞」、すなわち細胞が増殖期でない細胞を用いる場合は、約１０ｕｆｃ／ｍｌに等しい初期細胞密度を得ることができる種菌を用意した。Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３及びＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４を共に使用した場合は、これらを、それぞれ約１０７ｕｆｃ／ｍｌの細胞密度に従って接種した。
【００３５】
（２）増殖動態及び酸性化
乳酸菌の細胞密度は、ＭＲＳ寒天プレートカウンティング（Ｏｘｏｉｄ）によって決定した。軟質混合物の酸性化動態を、ｐＨの測定（ｐＨ−ｍｅｔｅｒ ５０７、Ｃｒｉｓｏｎ、Ｉｔａｌｙ）によってオンラインで得た。増殖及び酸性化動態に関連したデータは、Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇらによって変更されたゴンパーツの式（Ｚｗｉｅｔｅｒｉｎｇら、１９９０、「細菌の増殖曲線のモデル化（Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６：１８７５−１８８１）によってモデル化した。初期の実験では、異なる基質における乳酸菌の増殖を、６２０ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．６２０）の決定によって調べた。Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸の決定は、酵素キット（ＤＨＦＦ ＣＨＡＭＢ Ｉｔａｌｉａ Ｓｒｌ、Ｉｔａｌｙ）によって行った。
【００３６】
（３）ＧＡＢＡの決定
異なって発酵させた基質のＧＡＢＡ濃度を、陽イオン交換カラム（Ｎａ Ｏｘｉｄｉｓｅｄ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ、２０ｃｍ×４．６ｍｍ）を用いる「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０」（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって決定した（Ｄｉ Ｃａｇｎｏら、２００７、「非従来的な条件下で成熟させたイタリアチーズの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｔａｌｉａｎ Ｃｈｅｅｓｅｓ Ｒｉｐｅｎｅｄ Ｕｎｄｅｒ Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、９０：２６８９−２７０４）。
【００３７】
ＧＡＢＡの生産は、生産性：ｇｌ−１ｈ−１、収率：ΔＰ／ΔＳ、すなわち基質（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）の消費に対するＧＡＢＡの生産量、及び比生産速度（１／ｘ ｄＰ／ｄｔ）（ｘは、考察時の細胞密度を表す）によっても特徴付けられた。
【００３８】
（４）ビタミン、ミネラル、及びポリフェノールの含有量の決定
発酵した基質中のビタミンＢ群及びポリフェノールの含有量を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。ミネラルの濃度は、原子吸光法によって決定した。
【００３９】
（５）ラクトバクテリウム・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ１９４６３のＧＡＤ遺伝子の分子特徴付け
Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＤＮＡの抽出を、Ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎによって報告された方法によって行った（Ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎら、「ラクトバチルス・ヘルベティカス特異的ＤＮＡプローブが、この種における制限酵素断片長多型を検出する（Ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ−ｓｐｅｃｆｉｃ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｄｅｔｅｃｔｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ．）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８：３４９２−３４３２）。ＧＡＤ遺伝子の高度に保存された領域によって設計されたプライマー、ＣｏｒｅＦ／ＣｏｒｅＲ（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧ−３（配列番号２）及び５’−ＴＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣ−３’（配列番号３））（ＰＲＩＭ ｓｒｌ Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を、ＧＡＤ遺伝子の増幅に用いた。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の各反応液５０μｌには、それぞれ２００μＭ ２’−デゾキシリボヌクレオシド５’−３リン酸、それぞれ１μＭ プライマー、２μＭ ＭｇＣｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２Ｕ、ＤＮＡ約５０ｎｇを含めた。ＰＣＲ増幅反応は、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）によって行った。増幅産物を、１．５％アガロースゲル上で電気泳動にかけて分離し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）によって着色した。ゲルによって溶出させたアンプリコンを、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。ＤＮＡの配列決定反応をＰＲＩＭで行った。配列の比較を、Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴデータベースによって行った。ヌクレオチド配列の翻訳を、ＯＭＩＧＡソフトウエア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）によって行った。
【００４０】
結果
（１）果実汁及びバターミルクにおける増殖及び酸性化
乳酸菌から開始するＧＡＢＡの合成のために基質として果実汁及びバターミルクを使用することに関連したバイオテクノロジー革命を考慮して、細菌の増殖及び酸性化の可能性を、２つの基質に対して初めに試験した。図１から分かるように、ｐＨを約４．０に調製した蒸留水希釈果実汁（全糖量１％）でも、乳酸菌が中程度に増殖した。図１に示す培養に関する例は、３０℃で４８時間インキュベーションした後の０．８９〜１．０６のＯＤ６２０値を示した。初期スクリーニングに用いた他の細菌も、上記の範囲のＯＤ６２０値を示した。微生物の増殖に対して、３．１１〜３．６５の範囲の様々なｐＨ値が一致した（図１）。果実汁の希釈を蒸留水ではなく酵母水（５０：５０の割合）で行った場合は、微生物の増殖が明確に上昇した（図２）。ＯＤ６２０の決定によって推定したように、細菌の増殖は、２．２８〜２．４８の範囲であることが示され、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の場合は最大値が記録された。同じ結果が、バターミルクのみ又は酵母抽出物（０．５％）を添加したバターミルクでの乳酸菌の増殖の比較によっても得られた。特に、Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４は、バターミルクで最大の増殖を示した。したがって、この第１のステップの選択の終了時に、酵母水と蒸留水（５０：５０の割合）で希釈した果実汁（全糖量１％）及び酵母抽出物（０．５％）を添加したバターミルクを基質として用いて、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３及びＬｃ．ラクティスＤＳＭ１９４６４で実験を続けることにした。
【００４１】
（２）ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３及びラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４からのＧＡＢＡの合成
図３は、様々に混合した果実汁とバターミルクでのラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成を示している。果実汁（ｐＨ約４．５）の使用に関するさらなる変更として、酵素ＧＡＤ活性のために基質としてＬ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加した。バターミルクのｐＨ値は、明らかに約５．９であった。増殖及び酸性化プロセスの場合に観察されたように、酵母水の添加により、ＧＡＢＡの最大の生産量が増加し、この生産量は、発酵の９６時間後に約９５ｇ／ｌ（約０．９１ｍＭ）の値に固定された。バターミルクでのＧＡＢＡの生産量は、たとえ酵母抽出物が存在しても著しく低いことが示された。
【００４２】
対照的に、Ｌｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４は、約８０ｇ／ｌ（０．７７ｍＭ）の値に固定されるバターミルクでのＧＡＢＡの最大の合成を示した。
【００４３】
このように得た結果に基づいて、唯一の基質として果実汁を用いてＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの生産を何とか最適化することにした。
【００４４】
（３）果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成の最適化
特に、発酵の変数：（ｉ）ｐＨ、（ｉｉ）果実汁中の糖の初期濃度、（ｉｉｉ）酵素ＧＡＤの補助因子としてのピリドキサール−５−リン酸の添加、（ｉｖ）「静止細胞」の使用、及び（ｖ）Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３とＬｃ．ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の組合せ使用について考慮した。
【００４５】
インキュベーションの期間中、ｐＨ値を一定に維持するためにリン酸緩衝液を使用すると、高すぎるモル濃度を使用することになり、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の増殖及び酵素活性が阻害される。インキュベーション期間中に、ｐＨ値が著しい酸性値に急速に達するのを回避するために、果実汁の初期ｐＨ値を、１Ｎ ＮａＯＨを添加して約６．０の値まで調整した。図４は、蒸留水及び酵母水で希釈され、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）が添加されたｐＨ約６．０の果実汁（全糖量１％）でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの酸性化、増殖、及び合成動態を示している。このような条件下で、約２５ｍＭ乳酸の合成に一致する、ΔｐＨ＝２．１２単位、Ｖｍａｘ＝０．１５１ｄｐＨ／分、及びλ＝０．８９ｈの値によって特徴付けられる強い酸性化プロセスを観察することが可能である。微生物の増殖は、このような酸性化動態に一致する。前記微生物の増殖は、Ａ＝１．７９ ｌｏｇ ｃｆｕ ｍｌ−１、μｍａｘ＝０．３１Δｌｏｇ ｃｆｕ ｍｌ−１ ｈ−１、及びλ＝０．８９ｈの値；特に、発酵の７８時間後に約５００ｍｇ／ｍｌ（約４．７９ｍＭ）の値に固定されるＧＡＢＡの合成の一定の上昇によって特徴付けられる。
【００４６】
果実汁中の初期の糖の濃度を、０．３〜１．０％の範囲に変更した（図５）。ＧＡＢＡの合成は、アミノ酸の異化反応にリンクしているが、このような合成は、糖の濃度（０．３〜１．０％）に比例して増大することが分かった（３７６〜５００ｍｇ／ｌ）。１％を超える濃度では、ＧＡＢＡの合成が有意に増大しなかった。糖１％の初期濃度で存在する場合は、微量（＜０．１％）のグルコース及びフルクトースが、発酵の７２〜９６時間後に果実汁で検出された。
【００４７】
図６に強調するように、ピリドキサール−５−リン酸（０．１ｍＭ）を添加しても、ピリドキサール５−リン酸が存在しない場合に観察された値に対してＧＡＢＡの合成が増大しなかった（図５）。明らかに、果実汁中のこのような化合物の濃度は、酵素ＧＡＤの補助因子の機能を発達させるのに十分である。予想した通り、酸性化及び増殖動態は、ピリドキサール−５−リン酸の添加による影響を受けなかった。
【００４８】
ＧＡＢＡの合成が、細菌の増殖に理論的にリンクしていない純粋な酵素反応であるため、「静止細胞」の仮想条件下、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の高いバイオマス（１０ｕｆｃ／ｍｌ）での果実汁の接種の可能性を評価した。図７は、細胞が増殖しないこのような条件下では、ＧＡＢＡの合成が、細胞が増殖する条件下（図５）で観察された値よりも低いことを示している。このような条件下でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の細胞の使用では、インキュベーションの最初の数時間の間、ＧＡＢＡの生産が僅かしか上昇しなかった。
【００４９】
ここでも、図５の発酵条件に従ってＬ．プランタルムから得られるＧＡＢＡの生産性向上の目的で、このような細菌のＬｃ．ラクティスＤＳＭ１９４６４との組合せ接種を行うことを仮定した。また、このような実験条件下では、ＧＡＢＡの合成の増加が観察されなかった。
【００５０】
（４）果実汁でのＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３からのＧＡＢＡの合成プロセスの特徴付け
ＧＡＢＡの生産性：ｇｌ−１ｈ−１、収率：ΔＰ／ΔＳ、及び比生産速度（１／ｘ ｄＰ／ｄｔ）のような一部のバイオテクノロジーパラメータを、酵母水及び蒸留水で希釈した果実汁（５０／５０（全糖量１％）、ｐＨ約６．０、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を添加）のＬ．プランタルムＤＳＭ１９４６３の作用による発酵の際に決定した。図８から分かるように、５．７４〜５．７９ｇｌ−１ｈ−１に等しい高い生産性が、７２〜７８時間後にそれぞれ観察された。したがって、ＧＡＢＡの高い収率（０．２０６）及び比生産速度（０．６７３ １／ｘ ｄＰ／ｄｔ）の値が、３０℃での７２時間の発酵の後に観察された。
【００５１】
発酵の７２時間後、培養ブロスを回収し、そのまま凍結乾燥させた。表２は、この調製物の機能性分子及び乳酸菌についての組成、具体的には、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３による発酵及びこれに続く凍結乾燥の後の果実汁に基づいた調製物の乾燥物質１００ｇ当たりの機能性分子の濃度を示している。
表２
【表２】
【００５２】
表２から分かるように、調製物は、乾燥物質１００ｇ当たり約８９０ｍｇの濃度のＧＡＢＡを含み、この濃度は、特開２００５−１０２５５９で報告されている濃度よりも８倍高い。調製物は、果実汁の希釈手段としての酵母水の使用に由来するビタミンＢ群、及び基本物質である果実汁に由来するミネラル及びポリフェノールなどの他の機能性分子も含む。最後に、Ｌ．プランタルムＤＳＭ１９４６３ １ｇ当たり約１０個の細胞が調製物中に存在し、このような細胞は、予備試験から潜在的生菌活性を有する可能性が高い。
【００５３】
（例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築されたヒト表皮モデル及び次のｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築された皮膚ＦＴモデルにおける、本明細書でバイオマス又はビオ複合物と定義した、本発明に従ったＧＡＢＡを豊富にした混合物の効率の評価
この研究は、アトピー性乾皮症、皮膚及び頭皮の脂漏性皮膚炎、バリア機能及びミクロフローラに対する作用の改善に本発明による混合物を利用可能性を調べるために行った。
【００５４】
特に、本発明の目的は、まず第１に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構築されたヒト表皮に対して異なる接触時間で１回塗布した後の前記バイオマスの皮膚許容度の検査、並びにバイオマスの活力のある皮膚との相互作用の検査及び皮膚バリア機能に対する検査である。
【００５５】
次いで、第２のアプローチでは、先の科学文献に従ったＧＡＢＡの効率、並びに以下に示すパラメータに対する陽性コントロールとして用いたＧＡＢＡに対するバイオマスの作用機序の確認である。
【００５６】
実験計画
試験システム：ヒト再構築表皮
（１）用いる表皮モデルは、研究室用Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ（登録商標），Ｎｉｃｅ（Ｆ）によって作製し、ロットの平均厚みが１２０μ（角質層及び生きた表皮）である分化の１７日目の０．５ｃｍサイズで用いる。
【００５７】
完全に分化した表皮は、空気と液体の境界にある多孔質ポリカーボネートから形成された不活性支持体上の化学的に限定された培地（ＭＣＤＢ１５３）（ウシ胎児血清を添加していない）にヒトケラチノサイトを入れて開始し、１７日間培養して得る。この分化段階で、形態学的解析により、生きた多層表皮及び１０以上の緻密な細胞層からなる角質層が示された。
【００５８】
（２）「完全な厚みの皮膚モデル」（ＦＴ）（Ｐｈｅｎｉｏｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、同じドナーからのケラチノサイト及び線維芽細胞からなる多層ヒト皮膚モデルである。５週間の培養期間の後、「完全な厚みの皮膚モデル」が完全に形成され、表皮、基底膜、及び真皮を含んでいた。このモデルは、表皮レベル（サイトケラチン１０、フィラグリン（ｐｈｉｌａｇｒｉｎ）、トランスグルタミナーゼ、及びインボルクリン）、真皮−表皮接合部（ラミニン及びコラーゲンＩＶ）、及び真皮レベル（エラスチン、フィブロネクチン）での分化の基本的なマーカーの発現について特徴付けられた。モデルＦＴの直径は１．３ｃｍである。
【００５９】
培地及び培養条件
組織及び培地をＧＭＰに従って作製し、特定の標準規格に対するこれらの再現性を確保した。この組織及び培地の使用は、研究目的のため、及び製品又は化学物質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価のためだけに許可されている。
【００６０】
組織ロットを、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、マイコプラズマが存在しないことを保証するために分析した。培地が滅菌されていることが保証された。培養の１７日目に、ＲＨＥインサートを、２４穴プレートの栄養アガロースゲルを含む穴に入れる。
【００６１】
プレートが研究室に到着したらすぐに、層流フード下のアガロースゲルからＲＨＥを分離する。インサートを、室温で維持培地ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ ５００μｌ又は１ｍｌをそれぞれ含む６穴又は１２穴のＦａｌｃｏｎプレートに迅速に入れる。インサートの下に泡ができないように注意を払う。組織を、飽和湿度の大気中で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃のインキュベータに入れる。土壌は、２４時間間隔で交換し、そして試験開始の少なくとも２時間前にも毎回交換する。
【００６２】
到着後、ＦＴ皮膚組織を輸送用の半個体土壌からすぐに取り出す。
【００６３】
カバーのない３枚の小さいペトリ皿を、１００ｍｍペトリ皿に置き、ＡＬＩ培地５ｍｌを、上にＦＴ組織を丁寧に配置する小さな濾紙ディスク及び２つの金属支持体と共に小さいペトリ皿のそれぞれの中に添加する。
【００６４】
次いで、組織をインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％）に入れる。
製品
【表３】
コントロール試料
【表４】
【００６５】
方法
ＴＥＥＲの測定
ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗値）は、皮膚バリアの機能性の直接的な測定値であり、その厚み及びそれ自体の構造によって生じる組織の全体的な抵抗を反映する。ＴＥＥＲは、密着接合部のレベルでの細胞内接触の完全性、及び外部の化合物の浸透を妨げる二層脂質構造の完全性を反映する。
【００６６】
ＴＥＥＲは、ＥＵが認めた、終点を角質層とバリア機能の完全性とみなす腐食性を評価するためのラット皮膚電気抵抗試験（Ｂ４０）の識別パラメータである。
【００６７】
ＴＥＥＲは、経表皮水分蒸散量（ｔｒａｎｓ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の測定値であるｉｎ ｖｉｖｏで測定されたＴＥＷＬに反比例し、ＴＥＷＬが高ければ高いほど、バリア機能のダメージが大きく、ＴＥＥＲが高ければ高いほど、バリア機能のダメージが小さい。
【００６８】
ＰＢＳ １ｍｌをインサートに添加し、経上皮電気抵抗値をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ器具で測定した（０〜２０ｋΩの範囲）。
【００６９】
各組織に対して２回測定を行った。
【００７０】
細胞傷害性試験：ＭＴＴ試験
この方法により、細胞の活力の測定によって、製品によって引き起こされる細胞傷害作用を定量することができる。細胞傷害は、未処理試料のネガティブチェックに対する細胞の活力の低下を測定することによって定量する。この試験は、異なる処理時点で製品に接触した後にテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）とミトコンドリア酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）との間で起こる代謝反応に基づいており、活力のある細胞のみが、テトラゾリム塩を不溶性誘導体（ホルマザン）に変換することができ、インサートを基にした紫の変色によって証明される反応である。
【００７１】
塩の代謝は、ポリカーボネート支持体の上のゾーンにある上皮基底細胞で起こる。紫色の誘導体の抽出を、イソプロパノールで行い、分光光度法によって５７０ｎｍで定量する。
材料
ＭＴＴテトラゾリウム塩（Ｓｉｇｍａ Ｍ２１２８）（Ｓｉｇｍａ Ｌ３７７１）
生理食塩水（ＦＵ）
イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ）
維持培地（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）
マイクロプレートオートリーダーＭ−２００ ＩＮＦＩＮＩＴＥ（ＴＥＣＡＮ）
化学天秤ＸＳ２０４ Ｍｅｔｔｌｅｒ（０．００００１）
【００７２】
プロトコル
処理時間が過ぎたら、処理した表皮の表面をＰＢＳで３回洗浄し、ＭＴＴ（培地に０．５ｍｇ／ｍｌ）溶液３００μｌを含むプレートに移す。
【００７３】
３７℃で３時間インキュベートした後、光を当てて室温で２時間ホルマザンを抽出する。Ｏ．Ｄ．値を、分光光度法によって、ブランクとして用いたイソプロパノール対して５７０ｍで測定する。
【００７４】
細胞傷害のパーセンテージを、ネガティブチェック試料のＯ．Ｄ．値に対して計算する。
【００７５】
組織学的分析
ＲＨＥの組織学的分析に必要な組織学的調製は、外部の専門機関に委託する。
【００７６】
すべての処理の終了時に、ＲＨＥをそのプラスチック支持体からランセットで取り出し、１０％ホルマリンを用いて定着処理を行う。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲ
この試験では、以下の遺伝子を用いた。
【表５】
１．ＲＮＡの抽出
２．全ＲＮＡから開始するｃＤＮＡの合成
３．ＰＣＲ
この技術は、蛍光信号を検出するためのＴａｑｍａｎプローブを用い、極めて高感度であり、核酸の特定の配列の増幅及び定量による。ＰＣＲ産物の検出をリアルタイムで行う。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡの定量は、初めにＰＣＲ産物を検出できたサイクルを決定して行うのであって、反応が飽和した時点ではない。ＰＣＲ産物の定量は、各サイクルで測定した蛍光の検出によって行い、信号の強度は、増幅された産物の量に正比例する。
【００７８】
ＲＮＡの抽出
材料
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（ＡＭＢＩＯＮ）
【００７９】
この方法の原理
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓは、フィルターを用いてＲＮＡを単離する迅速な方法である。この方法は、濃縮塩溶液中の核酸に結合するガラス線維の能力に基づいている。
【００８０】
ＲＮＡの濃度は、紫外線透過性である９６穴プレートにおける２００ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の値を読み取り、式：Ａ２６０＊希釈因子＊４０＝ｇ ＲＮＡ／ｍｌを用いて決定した。
【００８１】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写
材料
高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００８２】
この方法の原理
この方法の原理は、存在するすべてのＲＮＡ分子の初めのへリックスの効率的な合成を確実にするランダムプライマーの使用に基づいている。
【００８３】
ｃＤＮＡを希釈し、−２０℃で保管する。
【００８４】
リアルタイムＰＣＲ
定量は、未処理のコントロール試料又は基準時点での試料とすることができる較正試料中の標的核酸配列に対する試料中の標的核酸配列の発現の変化を決定する。
【００８５】
相対的定量化では、内在性コントロールを、ｃＮＡ標的を標準化するために「活性基準」として用いる。
【００８６】
材料
２Ｘ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
２０Ｘ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）Ｈｓ９９９９９９ｍ１
標的遺伝子（４．４の表を参照）
「ヌクレアーゼフリー」水
方法
各生体試料を３回ずつ試験して評価する。以下のプログラムを行うためにサーモサイクラーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００を用いる。
【表６】
【００８７】
器具からの一般データを内部ＳＤＳ１．３．１．ソフトウエアによって記録し、相対的定量化の「生データ」として報告する。結果は、エクセルとしてエクスポートする。
【００８８】
較正試料に対して１回で過剰に発現したか又は下方制御された場合は、値が有意であると認める。
【００８９】
プロトコル
皮膚の許容性及びバリア機能の効率
刺激の可能性を、バイオマス５０ｌ（１％−３％−３％＋保存剤０．８％）を４回（２４時間−２４時間−２４時間の回復−４８時間−７２時間）迅速に塗布した後の表皮ＳｋｉｎＥｔｈｉｃモデルに対して評価する。
【００９０】
皮膚レベルでのバイオマスの生物作用の広範囲且つ予測的な評価がこれまで実現されておらず、皮膚科学の新しい研究方法となるため、３つの相補的なパラメータを、この種の評価を定義する目的で検討した。この評価により、特定のバイオマーカーによって、許容性のモニタリングと同時に文献に記載されている生物作用のモニタリングを行うことができる。
【００９１】
皮膚の刺激の可能性を決定するＭＴＴ試験による細胞活力のモニタリング：このような場合、短期の迅速な塗布（２４時間）後の結果だけではなく、バイオマスの潜在的な生物活性を考慮する長期の効果も調べたい。
【００９２】
組織学的評価Ｈ＆Ｅ、相補性、及び細胞傷害値の確認
抗菌作用、したがって生理的抗菌保護の向上の利益とは別に、βディフェンシンは、細胞増殖及び特定のサイトカインの産生を増加させるため、皮膚レベルで先天免疫の広範囲の制御の役割を果たす。
【００９３】
ＧＡＢＡに対するＦＴ皮膚モデルにおける、酸化還元平衡時のヒアルロン酸の合成及び最終分化のマーカー（フィラグリン及びインボルクリン）に対する作用
製品（１％バイオマス及びＧＡＢＡ）５０ｌを組織の表面に塗布し、３日間＝７２時間、毎日塗布を繰り返す。処理の終了時に、組織のＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００９４】
負の刺激の非存在下での一定の「生理学的」状態での組織に対するこの種の処理により、成分に対する繰り返しの曝露及びその作用機序の生物学的効果が真皮レベルで証明される。
【００９５】
用量１ｍｍに塗布する正のＧＡＢＡコントロールは、その有効性が、ヒアルロン酸の合成と親水性非酵素的抗酸化剤であるＧＳＨの産生の増加による酸化ストレスに対する保護の両方についての文献に記載されているため選択した。
【００９６】
データの取得
器具ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００によって得た一般データを内部ＳＤＳ１．３．１．ソフトウエアによって記録し、相対的定量化の「生データ」として報告する。結果は、エクセルとしてエクスポートする。
【００９７】
較正試料に対して１回で過剰に発現したか又は下方制御された場合は、値が有意であると認める。
【００９８】
組織学的試料（スライドガラス）を顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＤＭ２５００によって分析し、そのイメージを保存し、ＬＥＩＣＡ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＳＵＩＴＥ（ＬＡＳ）ソフトウエアによって処理する。
【００９９】
組織の形態学的変化を未処理の組織と比較する。
【０１００】
結果
皮膚の許容性
ＭＴＴ試験の結果を、負のコントロール試料に対して計算した細胞活力（％）として表した。定められたあらゆる時点でのＭＴＴ試験の結果は、細胞傷害活性が、実験の化合物、すなわちＬＢ．プランタルムからのバイオマスに一切起因しないことを示している。
【０１０１】
抗菌防腐剤（イソシド（ｉｓｏｃｉｄｅ）０．８％）の存在は、細胞傷害の結果に影響を与えなかった。
【０１０２】
１％及び３％の両方のバイオマスでの処理後の細胞活力が、試験の内因性の変動の値（±１５％）を超えて増加し（２４時間＋回復及び４８時間の時）、負のコントロール試料に起因する１００％に対して４０％の増加であることに留意されたい。
【０１０３】
このような結果は、２４時間＋２４時間の回復の時が遅延性の毒性の影響を観察できるため、２４時間＋２４時間の回復が特に厳密な処理であるという事実も考慮する高い価値を有する。
【０１０４】
組織レベルでの他の毒性成分の非存在下では、このような増加は、バイオマスでの処理によって誘導された細胞増殖の刺激に相関しうる。
【０１０５】
２４時間の処理
１％では、バイオマスで処理した組織は、負のコントロール試料に対して有意な変化が一切観察されない。防腐剤の存在下、３％では、一部の基底細胞において、凝集性の喪失及び細胞質の僅かな膨張（海綿状態）が観察される。
【０１０６】
２４時間の処理＋２４時間の回復
２４時間のコントロール試料に対して有意な変化が一切観察されない。
【０１０７】
４８時間の処理
コントロール試料に対して有意な形態学的変化が一切観察されず、１％及び３％の両方で表皮の厚みが増大する。
【０１０８】
防腐剤の存在下では、僅かに厚くなった角質層が観察され、表面の小さな剥がれ（剥離層）がある。
【０１０９】
７２時間の処理
１％及び３％の両方で、コントロール試料に対して有意でない生体表皮の厚みの減少が観察されたが、これは、組織の生理的発達に関連している。
【０１１０】
ＲＴ−ＰＣＲ
試験した様々な濃度でのバイオマスでの処理の後、既に２４時間後に、βディフェンシンの発現に対する刺激作用が観察され、この刺激作用が７２時間後まで低下することなく続き、これはどう考えてもコントロール試料（ＰＢＳ）の２倍の値である。この結果は、生理的抗菌保護の向上に対する有意な刺激に一致する。
【０１１１】
抗菌防腐剤の存在は、観察パラメータ全体に影響を与え、絶対値が低下するが、バイオマスの挙動は変化せず、βディフェンシン２の発現が誘発される。
【０１１２】
ＴＥＥＲの測定
ＴＥＥＲの値は、２つの測定が行われた２つの組織の平均を指す。
【０１１３】
ＴＥＥＲの値に関しては、角質層及び一体的な密着接合部のレベルでの緻密な層状構造の存在、及び有効なバリア機能を全体的に画定する表皮の厚みが関係している。各組織は、ｔ＝０及びｔ＝有限時間での測定値をもつ適切な基準である。
【０１１４】
２４時間＋２４時間の回復では、処理した組織及びＰＢＳ＝ロットの未処理コントロール試料の両方において、ＴＥＥＲの無意味な上昇が観察された。
【０１１５】
４８時間の結果は、特に興味深く、最も興味深い組織構造は、バイオマスで処理した後（の表皮の厚みの増大）に一致する。
【０１１６】
１％の濃度で、ＴＥＥＲの有意な上昇が観察された。３％でも起こるが、このＴＥＥＲ値は、標準偏差が大きいため急激ではない。
【０１１７】
この上昇は、表皮の厚みの増大及び密着接合部のレベルでの角質層の良好な緻密性及び完全性の両方の直接的な結果である。
【０１１８】
７２時間では、パラメータに対する影響がないことが証明され、この傾向が、処理後のＴＥＥＲの減少につながり、前記減少が、組織構造で観察された厚みの減少に部分的に相関している。
【０１１９】
グルタミン酸−システイニルリガーゼ
ＧＣＬＣは、ＧＳＨ合成の酵素前駆体である。酸化還元平衡が酸化防御の第１の表皮機構であるため、ＧＣＬＣの発現の研究を、塗布（８Ｈ）後の早期の時点から開始した。
【０１２０】
選択した実験条件下では、一切の遺伝子調節が観察されなかった。
【０１２１】
グルタチオンシンテターゼ
ＧＳＳは、主に表皮レベルに存在する抗酸化性で親水性の非酵素的なグルタチオンの合成を制限する酵素である。
【０１２２】
遺伝子調節が、ＧＡＢＡ及びバイオマスの両方において、２４時間での傾向として観察されたが、発現値は極めて低く有意ではない。いずれにしても、早期の時点での有意な低発現（ｓｕｂ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、真皮又は表皮レベルでの製品とその生理作用の適合性についての間接的な正の信号であり、外部刺激（例えば、誘導された酸化ストレス）の非存在下で、ＧＳＨ合成の増加を所望しない生理的酸化還元平衡が維持されることに留意することが重要である。
【０１２３】
ヒアルロン酸シンセターゼ
ＨＡＳは、ヒアルロン酸の合成を担う酵素である。前記合成は、真皮レベルで線維芽細胞によって行われる。負の刺激の非存在下での線維芽細胞活性の刺激が、健常な皮膚に対する期待する効率及び日常使用にとって重要であるという事実に留意することが重要である。
【０１２４】
この発現は、文献に開示されているように、２４時間及び４８時間でＧＡＢＡの作用によって上昇し、コントロール試料に対する発現値が３倍である２４時間のバイオマスの処理によってより明確に裏づけられた（図９）。
【０１２５】
大きい標準偏差では、得たデータをチェックするためにさらなる試験が必要である。
【０１２６】
フィラグリン
４００ｋＤＡのフィラグリンの前駆体であるプロフィラグリン（ｐｒｏｐｈｉｌａｇｒｉｎ）は、ヒト表皮におけるケラトアヒアリン（ｋｅｒａｔｏａｈｙａｌｉｎ）顆粒の主な構成成分である。
【０１２７】
角質層の最終分化の後、プロフィラグリンは、３７ｋＤのタンパク質であるフィラグリンに変換される。
【０１２８】
フィラグリンにより、ケラチンが凝集及び緻密化して細胞骨格になり、人体の最外部である角質総包（ｈｏｒｎｙ ｉｎｖｌｕｃｒｅ）が形成される。
【０１２９】
表皮の分化のマーカーであるフィラグリンは、バリア機能の重要なタンパク質であり、ＮＭＦ形成の基本要素であるとみなされる。
【０１３０】
このバリアが分布すると、カルシウムが減少し、フィラグリンがｍＲＮＡレベルで減少する。
【０１３１】
ＧＡＢＡ及びバイオマスの両方の処理により、既に２４時間でＧＡＢＡの存在の証拠となる遺伝子の過剰発現が誘導され、７２時間からＧＡＢＡ及びバイオマスの両方でこの過剰発現が著しくなる。バイオマスは、ＧＡＢＡよりも高い遺伝子発現を誘導する（図１０）。
【０１３２】
インボルクリン
６８ｋＤの可溶性の細胞質タンパク質であって角膜実質細胞の最終分化のマーカー
インボルクリンは、ケラチノサイトのトランスグルタミナーゼの基質であり、表皮の角質総包の形成のための「足場」として機能する。
【０１３３】
この遺伝子発現は、角質層で始まり、顆粒層で維持される。
【０１３４】
バリアが分布すると、カルシウムが減少し、インボルクリンがｍＲＮＡレベルで減少する。
【０１３５】
インボルクリンも同様に、脂質（セラミド、コレステロール、及び脂肪酸）の「足場」として機能する。
【０１３６】
選択した実験条件下では、一般に、遺伝子の有意な調節は全く起こらない（図１１）。
【０１３７】
１％バイオマスでの表皮モデル（ＲＨＥ）に基づいて、フィラグリン及びインボルクリンの発現にも関連してＦＴ−皮膚で観察されたことを確認し、この結果、フィラグリンの有意な調節及びインボルクリンの僅かな調節が確認された。
【０１３８】
結論
この研究は、表皮及び真皮レベルでの異なる皮膚機構でラクトバチルス・プランタルムからバイオマスを効率的に提供する目的が達成されたことを示した。
【０１３９】
ＲＨＥに対する刺激の可能性
１％及び３％で塗布した化合物バイオマスの２４時間から７２時間まで各時点での許容性が、生体組織のレベルで、毒性の兆候が一切なく、細胞（細胞傷害）及び形態学的（Ｈ＆Ｅ）パラメータによって完全に証明された。
【０１４０】
バイオマスは、負のコントロール試料よりも高い細胞活力のデータ、生体表皮の厚みの増大、及び抗菌防御に対する刺激の生理反応も示唆するβディフェンシン２の発現に基づいて、１％及び３％の両方で細胞増殖の刺激を誘発することが分かった。
【０１４１】
ＲＨＥのバリア機能に対する作用
この結果から、ＴＥＥＲの測定値が４８時間でのＴＥＥＲの有意な増大を示し、１％及び３％の両方のバイオマスでの処理後に最も興味深い組織の応答（表皮の厚みの増大）があったため、認知されているＧＡＢＡの機能が確認された。この結果、表皮の厚みの増大及び密着接合部レベルでの角質層の良好な緻密化及び一体化の両方が直接起こる。
【０１４２】
γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対するＦＴ−皮膚モデルでのヒアルロン酸の合成及び酸化還元平衡に対する作用
１％バイオマスを３日間繰り返し塗布した後、ＧＡＢＡで得られた値よりも高い量のヒアルロン酸シンセターゼの有意な過剰発現が観察された。このデータの値は、ＧＡＢＡについての文献を裏づけ、局所的に塗布されると線維芽細胞がヒアルロン酸の新合成に早期に一定の刺激作用を与える製品としてバイオマスを定義するという事実につながる。
【０１４３】
ヒアルロン酸の合成に対する生理的刺激作用は、以下に示す皮膚科学的な結果を招くと仮定した。
・深いレベルで水を保持する皮膚線維の高い能力に相関して真皮が大きく膨張すること
・弾性繊維及びコラーゲン繊維が、若くて弾性のある皮膚（すなわち、深部に水分が多い皮膚）が特徴であるマトリックス内に覆われているため、時間が経過しても皮膚の弾性が良好であること
【０１４４】
最終分化のマーカー（ＦＴ−皮膚モデルでモニタリングしたフィラグリン及びインボルクリン）に対する作用
３日間繰り返し塗布した後、バイオマス及びＧＡＢＡの両方によって誘導されたフィラグリンの有意な発現の上昇が観察されたが、インボルクリンは調節されないことが示された。このような結果は、顆粒層レベルで合成された天然保湿因子ＮＭＦの産生機構の再開におけるバイオマスの効果を証明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種。
【請求項２】
γアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物又はγアミノ酪酸の調製のための、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種の使用。
【請求項３】
γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製のための方法であって、以下のステップ：
ａ）ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３又はラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の、３０℃で２４時間の培地での増殖、
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、果実汁又はバターミルクの間で選択した２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを添加した基質のアリコート中での、ステップａ）で得たバイオマスの再懸濁、
ｃ）１〜４％での基質の接種であって、３０〜３３℃の温度、好ましくは３０℃での７２〜９６発酵時間、好ましくは７２〜７８発酵時間での接種、
を含む方法。
【請求項４】
ステップａ）の培地がＭＲＳ又はｍ１７である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
果実汁を酵母水で希釈するか、又は果実汁に酵母抽出物を添加する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
果実汁を、５０：５０の酵母水及び蒸留水で希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ値６．０〜６．５、好ましくはｐＨ６．０に脱酸する、請求項３から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
バターミルクに酵母抽出物（約０．５％）を添加する、請求項３から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
果実汁又はバターミルクにピリドキサール−５−リン酸を添加する、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥又は凍結乾燥させるステップｄ）をさらに含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
γアミノ酪酸を抽出するステップｄ１）をさらに含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項３から９までのいずれか一項に記載の方法によってγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１２】
乾燥物質１００ｇ当たり少なくとも８９０ｍｇのγアミノ酪酸を含む、請求項１１に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１３】
ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び生きた活力のある乳酸菌をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１４】
１つ又は複数の薬学的又は化粧用に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと共に、活性成分としての、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物を含む医薬又は化粧用組成物。
【請求項１５】
請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物の化粧品としての使用。
【請求項１６】
請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした又は請求項１４に記載の組成物を有する混合物の、皮膚科で使用する薬物の調製のための使用。
【請求項１７】
腎障害の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種。
【請求項２】
γアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物又はγアミノ酪酸の調製のための、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３若しくはラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４又はこれらの関連種の使用。
【請求項３】
γアミノ酪酸の生産又はγアミノ酪酸を豊富にした生菌混合物の調製のための方法であって、以下のステップ：
ａ）ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ１９４６３又はラクトコッカス・ラクティス亜種ＤＳＭ１９４６４の、３０℃で２４時間の培地での増殖、
ｂ）約１０９ｕｆｃ／ｇの細胞密度に従った、果実汁又はバターミルクの間で選択した２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを添加した基質のアリコート中での、ステップａ）で得たバイオマスの再懸濁、
ｃ）１〜４％での基質の接種であって、３０〜３３℃の温度、好ましくは３０℃での７２〜９６発酵時間、好ましくは７２〜７８発酵時間での接種、
を含む方法。
【請求項４】
ステップａ）の培地がＭＲＳ又はｍ１７である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
果実汁を酵母水で希釈するか、又は果実汁に酵母抽出物を添加する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
果実汁を、５０：５０の酵母水及び蒸留水で希釈し、１Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ値６．０〜６．５、好ましくはｐＨ６．０に脱酸する、請求項３から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
バターミルクに酵母抽出物（約０．５％）を添加する、請求項３から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
果実汁又はバターミルクにピリドキサール−５−リン酸を添加する、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）で得た発酵基質を乾燥又は凍結乾燥させるステップｄ）をさらに含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
γアミノ酪酸を抽出するステップｄ１）をさらに含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項３から９までのいずれか一項に記載の方法によってγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１２】
乾燥物質１００ｇ当たり少なくとも８９０ｍｇのγアミノ酪酸を含む、請求項１１に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１３】
ビタミン、ミネラル、ポリフェノール、及び生きた活力のある乳酸菌をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物。
【請求項１４】
１つ又は複数の薬学的又は化粧用に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと共に、活性成分としての、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物を含む医薬又は化粧用組成物。
【請求項１５】
請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした混合物の化粧品としての使用。
【請求項１６】
請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のγアミノ酪酸を豊富にした又は請求項１４に記載の組成物を有する混合物の、皮膚科で使用する薬物の調製のための使用。
【請求項１７】
腎障害の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３３４８７（Ｐ２０１０−５３３４８７Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６６５７（Ｐ２０１０−５１６６５７）
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００８／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１００８
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（３０９０２０２４２）ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００８／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１００８
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（３０９０２０２４２）ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ (2)
【Ｆターム（参考）】
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