マイクロ流体デバイス
本発明は、複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスを提供し、各ウェルは、高価な個別のウェルへの試料装填の必要性も、二次汚染及び試料蒸発を防止するために個別のウェルを分離する必要性もなしに、液体でほぼ満たすことができる。ベース部材(2)は、アレイ形式の複数のウェル(4)、入口流路(6)、及び３つの出口流路(8)を備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス、及びこうしたデバイスを使用するシステム及び方法に関するものである。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用途での使用に特に適し、この用途を参照して本発明を説明することが好都合である。しかし、本発明のデバイス、システム及び方法は、他の用途にも適していることは明らかである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの完成は、並行遺伝的分析用の高処理能力プラットフォームの急速な発展のきっかけとなった。現在、２種類のＤＮＡマイクロアレイ、即ち：ゲノム規模発現プロファイリング用のマイクロアレイ、及び一塩基（単一ヌクレオチド）変異多型（ＳＮＰ）検出及び遺伝子型決定用のマイクロアレイが、高度に並行遺伝的な分析用のプラットフォームとして広く用いられている。データ分析及び解釈の方法が標準的でないことにより、マイクロアレイ結果の検証は依然として、所望されるステップである。定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が、遺伝子発現プロファイリングの研究を検証するための代替技術として、よく用いられる。さらに、マイクロアレイ技術の感度及び特異度は低く、この技術に含まれる複数のステップは、リアルタイムＰＣＲに比べると、結果に変動性を取り入れる。ＳＮＰ検出及び遺伝子型決定のためには、融解曲線技術によって、あるいはオリゴヌクレオチドプローブへの混成によって試料を分析する前に、ＰＣＲプロセスを用いてこれらの試料を増幅する。遺伝子発現プロファイリングのためには、高度に並行遺伝的な分析用の単一プラットフォームとして、リアルタイムＰＣＲの定量的で高感度の能力を、マイクロアレイの高い処理能力と統合することが望ましい。複数の遺伝子ターゲットの並行分析のためのマイクロアレイ技術に加えて、ＰＣＲをマイクロアレイ技術と統合するための多数のプラットフォームが開発されてきた。これらのプラットフォームの大部分は、固相ＰＣＲをマイクロアレイプラットフォームと組み合わせている。しかし、研究は、固相ＰＣＲは液相ＰＣＲよりも効率が低いことを示している。
【０００３】
多数の遺伝子の急速で高処理能力の分析用のＰＣＲベースのバイオチップを開発するために、多大な努力がなされてきた。こうしたバイオチップ（チップ）は一般に複数のウェルを含み、各ウェルは溶液を保持することができる。今までに開発されたデバイスに関連する問題は：ＰＣＲチップの個々の反応ウェル内へのＰＣＲ試料の面倒な手動装填；溶液をウェルに充填するための液体分注ロボットの多大な費用、あるいはゲルマトリクス内でのヌクレオチドプライマーの不動化に関連する問題を含む。さらに、高処理能力ＰＣＲチップは、製造が安価であり、使い捨て可能であり、そして、大きな反応アレイ全体を通して均一な温度を維持することが望ましい。これに加えて、チップを使って動作を行うコストを低減するために、単純かつ安価な試料装填及び反応ウェル封止（シール）方法が望まれる。
【０００４】
高処理能力ＰＣＲチップ用の２種類の構成が存在する。第１の種類は、流体マイクロチャンバのアレイまたはマトリクスから成る。こうした構成は、マイクロ流体の流路網を用いて、チャンバのアレイに液体試料を、一度のピペット操作で装填する。一般に、各チャンバには、試料装填用の入口流路、及び通気用の出口流路が接続されている。しかし、すべてのチャンバを、機械的なバルブを用いて分離して封止することは複雑である、というのは、熱サイクル中のＰＣＲ混合物の蒸発を防止し、かつ、プライマー対の二次汚染を防ぐために、各マイクロチャンバの入口流路及び出口流路を封止しなければならないからである。これに加えて、こうした構成内の流路はチップ上の空間を占め、チップ上のチャンバの密度を制限する。第２の種類の高処理能力ＰＣＲチップは、小型化されたウェルプレートから成る。この種の構成では高密度マイクロウェルが可能であり、これらのマイクロウェルは、薄型カバーまたはシーラント（封止剤）をウェル上に用いて、分離して封止することができる。しかし、試料装填及び他の液体処理操作は、高精度のロボットを使って達成され、高精度のロボットは高価であり、熟練したオペレーター（操作員）を必要とする。
【０００５】
近年、３つのウェルを含む使い捨て可能なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップが報告されている（Xing, Q,; Xu, B.; Fu, R.; Li, D. Biomed Microdevices 2005, 7, p. 273-279（非特許文献１））。このチップはＰＣＲに利用され、ここでは、ＰＣＲ混合物を手作業で（容積０．９μＬの）各ウェル内に装填すると直ちに、これらのウェルを鉱油で覆って蒸発を防止している。
【０００６】
ＰＣＲ用に開発された他のデバイスは（Chaudhari, A.M.; Woudenberg, T.M.; Albin, M.; Goodson, K.E. Journal of Microelectromechanical Systems 1998, 7, p. 345-355（非特許文献２））、微細加工した１８容器のアレイを利用し、ここでは、ＰＣＲ適合アクリルベースの接着テープを用いて、マイクロチャンバをガラスカバーで封止している。
【０００７】
Leamonらは、新規のPicoTiterPlate（登録商標）プラットフォームを報告し（Leamon, J.H.; Lee, W.L.; Tartaro, K.R.; Lanza, J.R.; Sarkis, G.J.; deWinter, A.D.; Berka, J.; Lobman, K.L. Electrophoresis 2003, 24, p.3769-3777（非特許文献３））、このプラットフォームでは、各々が３９．５ｐＬの反応容積を有する３００，０００個の容器を、固相非対称ＰＣＲ用に同時に利用している。
【０００８】
少数の研究者が、チップ上でＰＣＲを実行するために、マイクロ流体の液体分配を用いている。中でも、Mathiesらは（Lagally, E.; Simpson, P.C.; Mathies, R.A. Sensors and Actuarors B 2000, 63, 138-146（非特許文献４））、試料装填及びウェル封止用に機械的なバルブアレイを用いて、ＰＣＲ混合物のマイクロ流体分配により、複数回のＰＣＲをチップ上で実行することができることを実証している。Quakeらは、マイクロ流体技術を応用して、２，８６０個の統合型液圧弁・空気圧ポンプを用いて、２μＬの量のＰＣＲ混合物をＰＤＭＳチップ内の４００個の独立した反応容器に分配している（Liu, J.; Hansen, C.; Quake, S.R. Anal Chem 2003, 75, p. 4718-4723（非特許文献５））。同じ技術が、米国特許出願公開第２００３／０１３８８２９号明細書（特許文献１）にも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１３８８２９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Xing, Q,; Xu, B.; Fu, R.; Li, D. Biomed Microdevices 2005, 7, p. 273-279
【非特許文献２】Chaudhari, A.M.; Woudenberg, T.M.; Albin, M.; Goodson, K.E. Journal of Microelectromechanical Systems 1998, 7, p. 345-355
【非特許文献３】Leamon, J.H.; Lee, W.L.; Tartaro, K.R.; Lanza, J.R.; Sarkis, G.J.; deWinter, A.D.; Berka, J.; Lobman, K.L. Electrophoresis 2003, 24, p.3769-3777
【非特許文献４】Lagally, E.; Simpson, P.C.; Mathies, R.A. Sensors and Actuarors B 2000, 63, 138-146
【非特許文献５】Liu, J.; Hansen, C.; Quake, S.R. Anal Chem 2003, 75, p. 4718-4723
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
高価な材料及び装置の必要性なしに、多数の密集した反応容器を急速に充填して封止することを可能にする代替技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、複数のウェルを備えたマイクロ流体デバイスを提供し、高価な個別の試料充填の必要性も、二次汚染及び試料蒸発を防止するために個々のウェルを分離して封止する要求もなしに、各ウェルを液体でほぼ満たすことができる。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、複数のウェル内に液体を分配するデバイスを提供し、このデバイスは：
ａ）複数のウェルを有するベース（基部）と、
ｂ）このベース上を覆って、これらのウェル上にヘッドスペースを規定し、これらのウェルがこのヘッドスペース内に向けて開口するためのカバーと、
ｃ）上記ヘッドスペース内に上記液体を供給して、この液体をこれらのウェル内に分配するための、少なくとも１つの入口と、
ｄ）上記ヘッドスペースと流体連通して上記ヘッドスペースから過剰な液体を除去するための、及び／または、上記ヘッドスペースと流体連通して上記ヘッドスペースに減圧を加えるための、少なくとも１つの出口と
を備えている。
【００１４】
別の態様において、本発明は、複数のウェル内に液体を分配するシステムを提供し、このシステムは：
ａ）上述したデバイスと、
ｂ）分配される液体を含む容器であって、この容器から上記ヘッドスペースへの液体の流れを制御するためのバルブ手段を介して上記少なくとも１つの入口に接続された容器と、
ｃ）上記少なくとも１つの出口に減圧を加える手段と
を備えている。
【００１５】
他の態様では、本発明は、上述したデバイスまたはシステムを使用する方法を提供し、この方法は、上記出口の各々に減圧を加え、これにより、液体が上記入口の各々から上記ヘッドスペース内に引き込まれて上記ウェル内に分配されるステップを含む。
【００１６】
他の態様では、本発明は、本発明のシステムを使用する方法を提供し、この方法は、
ａ）上記少なくとも１つの出口に減圧を加えて、上記デバイスの上記ヘッドスペース及びウェル内の圧力を、上記容器の出口における液体の圧力以下にするステップと、
ｂ）上記バルブ手段を開放し、これにより、上記容器内の上記液体がこの容器を出て、上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェルに入るステップと、
ｃ）上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェル内の圧力を低減する手段を、上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェルとの流体連通から分離するステップと
を含む。
【００１７】
本発明のデバイス、システム（装置）及び方法は、複数のウェル内に液体を分配し、これらのウェルを分離して封止する手段を提供する。本発明は、免疫測定、細胞ベースの分析、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の用途に特に適しているが、これらの用途に限定されない。
【００１８】
本明細書で用いる「ウェル」とは、技術的に標準的な意味を有する。一般的意味では、ウェルは、液体を保持すべく作製された凹部である。この凹部は、固体塊の一部を除去することによって（例えば、固形体から凹部をエッチングまたは彫削して）形成することができる。この凹部は、硬化性の液体を成型（モールド）して、凹部を有する固体塊を形成することによって（例えば、事前に作製したダイを用いて相補的な形状を形成して）形成することができる。ウェルの形状は、２つ以上の面によって規定することができる。こうした形状の例は、円錐形、角錐形、角柱形、及びその先端を切り取った変形を含む。すべての場合において、ウェルを規定する形状は開口を有し、この開口を通って、液体及び／または気体がこのウェルに入り、及び／または、このウェルから出ることができる。ウェル用の開口の形状は、（正方形を含む）長方形、あるいは円形とすることができる。適切であれば、この開口は、ウェルの下面よりも寸法が大きいことが好ましい。これらのウェルは、先端を切り取った四角錐の形状であることが好ましく、最大の四角形の面がウェルの開口となる。本発明のデバイス、システム、及び方法は、低密度、中密度、及び高密度のウェルの用途に適している。低密度の用途は一般に、チップ当たり１０個未満の反応ウェルを用いる。中密度の用途は一般に、チップ当たり約１０個〜約１００個の反応ウェルを用いる。高密度の用途は一般に、チップ当たり１００以上の反応ウェルを用いる。本発明のデバイス、システム、及び方法は、各々が約０．１ｐＬ〜約３ｍＬの容積を有するウェルを利用することが好ましい。これらのウェルは、格子または規則的なアレイ形式で空間全体にわたって均等に分布することが好ましい。
【００１９】
本発明のデバイスは１回使用（使い捨て）または繰り返し使用の設計とすることができるが、これらのデバイスは、１回使用の用途に特に適している。本発明のデバイスは、比較的安価な材料で構成され、このデバイスに接触する材料に対してほぼ不活性であることが好ましい。相補的な形状の存在下で重合、交差結合（架橋）、及び／または硬化することのできる材料については、モールド（型）及びダイが本発明のベース部材の構成に特に適している。こうした材料の例は、ウレタン、ラテックス、ビニル、及びシリコーンを含む。蛍光検出ベースの分析のような特定用途では、低い自己蛍光を有するプラスチック材料を用いて、ウェル内の混合物からの蛍光を妨害し得る蛍光ノイズを低減することが好ましい。本発明は、本明細書で説明するデバイス、システム及び方法を、蛍光検出ベースの方法を用いることのできる分析（あるいは分析を実行するための準備）で利用することができることを意図している。こうした分析の例は、核酸材料のリアルタイム定量ＰＣＲ増幅である。こうした分析の一具体例では、光源からの光（狭い波長範囲内の光を提供するために、バンドパスフィルタを用いてフィルタ処理されている）がデバイスのウェルに入り、このウェル内には、この波長範囲の光に敏感な１つ以上の物質を配置することができる。この（これらの）物質は蛍光を発して、この物質が敏感である波長範囲とは異なる波長範囲の光を放出することができる。放出された光（狭い波長範囲を提供するために、バンドパスフィルタを用いてフィルタ処理されている）は、検出手段によって検出することができる。この検出手段は、デバイスの内部またはデバイスの外部に配置することができる。従って本発明のデバイスは、光がこのデバイスのウェルに入ることができるように構成されていることが好ましい。本発明のデバイスは、光がデバイスのウェルに入り、かつデバイスのウェルから出ることもできるように構成されていることが、さらに好ましい。好適例では、このデバイスは、光がデバイスのウェルに入ることを可能にする手段、及び光がデバイスのウェルから出ることを可能にする手段を提供する。こうした手段の例は、特定波長の光に対してほぼ透明であるカバーである。こうした手段の特定例は、ガラスカバープレートであり、このガラスは、低い自己蛍光を有することが好ましい。蛍光検出ベースの分析の例は、（バンドパスフィルタを通過させた）４６５ｎｍ〜４９５ｎｍの範囲の波長の光源光を使用し、かつ（バンドパスフィルタを通過させた）５１５ｎｍ〜５５５ｎｍの範囲の波長の放射光を検出することのできる検出手段を使用するものである。デバイスのヘッドスペースを（硬化した液状プレポリマーのような）ある物質で封止した本発明の好適例では、このシーラント（封止剤）も、ウェル内及びウェル外への光の透過を可能にすることが好ましい。本発明のデバイス及びシステムでの使用に適し得るプラスチックは、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、及び特定のシリコーン材料であり得る。本発明のデバイス、システム及び方法での使用に特に好適なプラスチックはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。本発明の構成要素、特にベース部材の製造に適した相補的なモールドは、マイクロマシニング技術を用いて作製することが好ましい。こうした技術の例は、マイクロ放電加工（ＥＤＭ）である。相補的なモールドとして使用することのできる材料の例は、ステンレス鋼である。
【００２０】
上記デバイス自体は、２つ以上の材料から構成することができる。この点では、１つの材料の特性を、この材料を用いて上記デバイスの特定構成要素を形成することに役立てることができる。１つの材料を、特定構成要素中に使用するのに適したものとする（この材料の）特性の例は、フレキシビリティ（可撓性、柔軟性）、表面機能性、親水性／疎水性、成型の容易性、及び材料のコストを含む。基板と反応するための適切な表面機能性を提供すべく特定材料を選択することができるが、すべての構成要素が、これらの構成要素と接触する化学薬品／反応混合物に対してほぼ不活性であることが好ましい。本発明のデバイス及びシステムの構成において使用される材料は、選定した用途の条件に適合することが好ましい。例えば、ＰＣＲの技術は、熱源／ヒートシンクと各反応ウェルとの間の効率的な熱伝達を必要とする。従って、この用途のために、材料は、なるべくなら、大きな変形または融解をすることなしに、熱を効率的に伝導し、熱サイクルに耐えることができるべきである。所定材料の特性は、厚さ等の選択を通して変更することができる。これらの点では、ＰＤＭＳは適切かつ好適な材料を代表する。デバイスの剛体構成要素を形成するための好適な材料は、金属、ガラス、及びセラミックを含む。ガラスは、本発明のデバイス、システム、及び方法で使用するのに特に好適な剛体構成要素である。本発明のデバイスが２つ以上の材料から成る場合は、これらの構成要素を、結合剤を用いて接続することがより好ましい。これらの構成要素を結合するために用いる材料は、２つの構成要素を表面全体にわたって均等に結合し、その後に変質して固化するように、ほぼ液状で塗布されることが好ましい。こうした結合剤を塗布する方法の例は、スピンコーティングである。デバイスをガラス及びＰＤＭＳで作製する場合は、これらの構成要素は、液状ＰＤＭＳプレポリマーを用いて結合することができる。この関係では、プレポリマーの硬化は、これら２つの構成要素間の半永久的な結合を形成する。本発明のベース部材の好適例では、ベース部材は、相補的なモールドから形成されたＰＤＭＳ層に、硬化したＰＤＭＳで結合されたガラスの剛体層を含み、このＰＤＭＳ層は複数のウェルを備えている。
【００２１】
本発明のデバイスは、通常はプレート形であるカバーを備え、このカバーは上記ベース上を覆ってヘッドスペースを規定し、このヘッドスペース内に向けて各ウェルが開口する。このカバーは実質的に剛体材料製であることが好ましい。このカバーは、平面ガラス製のプレート形であることが好ましい。規定されるヘッドスペースは、規則的な形状とすることができる。ヘッドスペースの境界を規定することのできる規則的な形状の例は、長方柱（長方形の角柱）（正方柱（正方形の角柱）を含む）及び円柱（この円柱の平面が上記ウェルを覆う）を含む。規則的な形状の好例は、長方形の角柱である。ヘッドスペースは不規則な形状とすることもできる。例えば、ヘッドスペースは、台形の角柱の形状を有することができ、例えば、カバープレートの内面が、ベース部材上のウェルの開口どうしをつなぐことによって作られる表面に平行でない際に規定される形状である。不規則な形状の他の例は複合形状であり、その例は、円柱にドーム（浅いドームの場合のように、幾何学的には、（この円柱と）同曲率の球面の半分以下（の高さ）に相当し得る）を結合することによって規定され、この複合形状の最深部は複数のウェルのほぼ中心上にある。ヘッドスペースを規定する不規則な形状は、ヘッドスペースの「より深い」部分を入口及び／または出口に近くに向けることが望ましい本発明の特定好適例にも、特に好適であり得る。
【００２２】
本発明の好適例では、ヘッドスペース全体が、デバイスのウェル上だけでなく、デバイスのウェル間の空間も全体的に覆う。ヘッドスペースは、分割のない空間の連続領域から成ることが好ましい。特定の好適例では、任意の２つのウェルの直上にあるヘッドスペース部分どうしの間の空間領域は、デバイスのどの固形構成要素によっても分断されない。任意の２つのウェルの開口間の最短の流体連通は、これら２つのウェルの開口間の空間内の最短距離にほぼ等しい。規定されるヘッドスペースは、本発明の方法の応用が、容器内の液体の大部分のウェル内への移動を、これに付随してヘッドスペースから排出または吸引される液体の大量損失なしに生じさせるような大きさ（特に、十分小さい容積）であることが好ましい。他方では、規定されるヘッドスペースは、本発明の方法の応用が、容器からの液体の流れの制限を実質的に生じさせないような大きさ（特に、十分大きい容積）であることが好ましい。
【００２３】
本発明のデバイスの他の好適な特徴は、好適には、液体の大部分が容器からヘッドスペース内に流れ、その後にウェルをほぼ満たさずにヘッドスペースから排出されるほど、ヘッドスペースを小さくすべきでない、ということにある。カバーがプレート形である本発明の好適例では、ヘッドスペースの寸法は、ウェルの開口とウェルの底部との間の距離が、ウェルの開口とカバープレートとの間の距離とほぼ同じである。
【００２４】
本発明は、複数のウェル上を覆うヘッドスペース内への、液体及び／または気体の移動が、ヘッドスペース及びウェルと流体連通する入口及び出口の設計の影響を受けやすいという発見に、部分的に基づいている。本発明が意図するこうした設計の態様は、入口の配向、形状、及びサイズであり、これらの入口は流路の形状であることが好ましい。一部の好適例では、デバイスが略円筒形の流路を備えている。他のより好適な好適例では、本発明のデバイスの流路は長方柱（正方柱を含む）の形状を有することができる。本発明の流路の形状は、不規則にすることができる。例えば、本発明の流路の端部を丸くするか、口広げ（フレア）加工して、いわゆる「エッジ効果」を低減することができる。従って、流路は複合形状を有することができる。例えば、長方柱と漏斗形状を組み合わせて流路の形状を形成することができる。好適には、ヘッドスペースの境界が隅部（コーナー）を有する形状（例えば、長方柱）によって実質的に規定される場合は、流路は、これらの隅部の任意の２つ以上に近接して配置される。本発明の好適例では、ヘッドスペースの境界が、長方柱（正方柱を含む）形状によって実質的に規定される。これらの好適例では、入口流路及び出口流路の各々が、この長方柱の３面の交差によって生成される隅部に近接して配置される。理論にとらわれることを望まずに、本発明の方法を実行するに当たり、こうした配置は、ウェルを液体でほぼ満たした後の、ヘッドスペースの完全な排液を手助けするものと考えられる。
【００２５】
入口及び出口を適切な方法で設けて、液体をウェルに入れ、そして適切であれば、過剰な流体をヘッドスペースから除去するための手段を提供することができる。１つの好適例では、入口及び出口は、ベース中あるいはカバー部材中に形成された流路の形状にすることができる。入口及び出口はスペーサ内に設けることもでき、一部の好適例では、このスペーサはベースとカバー部材との間に配置されている。入口は、カバー部材中に孔によって形成することができる。本発明の各入口または各出口は、独立して屈曲させ、角度付けし、あるいはほぼ直線状にすることができる。一部の好適例では、入口及び出口はほぼ直線状である。適切であれば、入口及び出口は、この入口または出口が接続されたヘッドスペースの境界を規定する形状のエッジ（縁部）に直交することが好ましい。入口及び出口は、隣接する入口と出口とが互いにほぼ直交するように配置されていることが好ましい。理論にとらわれることを望まずに、本発明の方法の実行中に、この配置が、ヘッドスペースから液体のかなりの部分が排出される前に、ウェルをほぼ満たすことを促進するものと考えられる。入口及び出口の断面積は、入口流路の方が出口流路より大きいことが好ましい。理論にとらわれることを望まずに、こうした配置は、本発明の方法の実行中に、ヘッドスペースの排液の前に、ウェルをほぼ満たすことを可能にすることができる。本発明の特に好適な例では、デバイスは単一の入口流路及び３つの出口流路を備えている。こうした好適例では、入口流路は長方柱の形状を有し、出口流路は、長方柱と漏斗形状とを複合した複合形状を有し、この流路は、ヘッドスペースに近い当該流路の端部で、その開口を広げる。
【００２６】
本発明によるデバイスは、使用中に、分配される液体を含む容器に接続させることのできる少なくとも１つの入口を含む。この容器は一般に、容器からデバイスへの液体及び／または気体の通過を制御するバルブ部材を介して、この入口に接続される。この容器も一般に開口を有し、この開口を通して、この容器が液体を充填され、この液体が開放されたバルブを通して容器からデバイス内に除去されると共に、空気のような気体、あるいは窒素のような不活性ガスが、この開口を通ることができる。このバルブの操作は、例えば栓によって手動制御することができ、あるいは、例えば電気的に制御されるソレノイドによって自動制御することができる。容器の出口はバルブに結合され、このバルブは、容器からデバイスへの液体及び／または気体の流れを制御する手段を提供する。容器からの液体及び／または気体の流れを制御するこうした手段は、容器からウェルに液体が流れる前に、デバイスのヘッドスペース及びウェル内の圧力を所定圧力に低減することができる、ということをもたらす。好適な容器の例は、その上部が実質的に開放され、バルブに結合された下部開口を有する容器であり、このバルブの操作は、容器内に含まれる液体及び／または気体の、容器から流出する流量を全体的または部分的に制御する。容器とデバイスとは互いに結合されていることが好ましい。こうした結合を提供することのできる材料の例は、ある長さの管である。これらの管は、容器から移動する液体が全部、デバイスの入口流路に入る、ということをもたらすことが好ましい。この管の外寸は、入口流路の内寸とほぼ同じであるか、少し小さいことが好ましい。容器をデバイスに結合する手段が、ある長さの管である際は、容器からデバイスへの液体及び／または気体の流れを制限する好適な手段は「ピンチ弁」である。
【００２７】
本発明のシステム及び装置は、容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段を提供する。こうした手段の例は、流体を１つの位置から他の位置に移動させることのできるポンプである。こうしたポンプは、機械的手段（例えばダイアフラム）、あるいは当業者が適切であるものと知る他の手段によって、液体の移動（例えば水流吸引器）によって機能することができる。容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段の好適例は、オイルレス（油を使用しない）ベーン真空ポンプである。本発明のシステムは、デバイスのヘッドスペース及びウェルと流体連通するポンプを意図している。容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段は、本発明のデバイスのウェル内で２０ｋＰａ以下の圧力を与えることができることが好ましく、１５ｋＰａ以下の圧力を与えることができることがより好ましく、そして、約０．２〜１．０ｋＰａの圧力を与えることができることが最も好ましい。本発明のシステムは、本発明のデバイスを、ポンプとの流体連通から分離する手段も提供することが好ましい。こうした手段の例はバルブである。こうしたバルブの操作は、ポンプとデバイスのヘッドスペースとの間の異なる圧力の潜在的な維持を可能にする。
【００２８】
本発明のシステムは、筐体（ハウジング）、チャンバ、またはコンテナを備え、その内部にデバイスを配置することができることが好ましい。従って、この筐体はデバイスよりも大きい寸法を有する。こうした筐体は、容器、及び容器の出口における圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段に接続することができる。こうした筐体は、密封されているか、少なくとも密封することができることが好ましい。本発明のシステム及び装置は、バルブが、こうしたコンテナを操作により密封したり開封したりする手段の例を与えることを意図している。この点では、容器、及びコンテナ内の圧力を低減する手段をコンテナの設計に統合し、これにより、各構成要素を、他の各構成要素との流体連通から分離することができる。こうしたコンテナは、デバイスを取り出すために容易に開放することができ、そしてコンテナを密封するために容易に閉じることができることが好ましい。こうしたコンテナは、デバイスを支持するための支持手段を備えることができる。この支持手段は、デバイスをコンテナの最下部から持ち上げ、これにより、本発明の方法を実行しながら、液体をデバイスのヘッドスペースからコンテナ内に不可逆的に排出することができる。こうしたコンテナの構成に適した材料は、金属、ガラス、セラミック、及びプラスチックを含む。これらのコンテナの構成用に特に好適な材料は、ガラス、及びほぼ透明なプラスチックである。こうした材料の例は、ポリ（アクリル酸）、またはその誘導体である。これらのコンテナは、異なる材料製のシールも備えることができることが適切である。このシールは、可撓性の固形材料製、例えばゴムのようなポリマー製であることが好ましい。本発明の好適例では、本発明のシステムは、大きな変形なしに、約０．２ｋＰａの内圧、及びこれと同時の約１０１．３ｋＰａの外圧に耐えることができるコンテナを含む。
【００２９】
本発明の方法は、容器から複数のウェル内への液体の分配は、この分配の移動を行うために液体に加わる全体的な力が存在するように、容器の出口とウェルとの間に圧力差を与えることによって達成することができる、という発見に部分的に基づいている。こうした分配は、気体の残留「バブル（泡）」がウェル内に残ることなしに、ウェルをほぼ満たすことを可能にすることが好ましい。容器の出口が、容器から出る液体及び／または気体の流れを調整するバルブのような手段に結合されている場合は、この手段を最初に閉じて、液体が容器を出ることなしに、ヘッドスペース及びウェル内の圧力を、容器の出口における液体の圧力以下に低減することが好ましい。従って、デバイスのウェル内の圧力が低減され、これにより、容器から出る液体及び／または気体の流れを調整する手段が開放されている際に、ガスの残留部分がウェル内に残ることなしに、ウェルを液体でほぼ満たすことができる。ウェルを充填しながら、ウェルを容器の出口における液体の圧力よりも低い圧力にし続けることが好ましい。この関係では、デバイスのヘッドスペース及びウェル内の圧力を低減する手段は、液体が容器からデバイスのヘッドスペース及びウェル内に流れる間に動作し続けることができる。この圧力低減手段は、全部の液体が容器を出た後にも動作し続けることができる。ウェルに液体を充填する従来の方法は、特に、ウェルの容積が小さい、及び／または、液体に比較的粘性がある場合は、ウェル内に残る気体の残留バブルを生じさせ得る。このことは、不所望な特徴であることが多い。本発明は、デバイスのウェルが、容器から分配される液体でほぼ満たされる、ということをもたらす。本明細書で用いる「ほぼ満たす」という表現は、１つのウェルがほぼその容量まで満たされたこと、または大部分のウェルが満たされたこと、あるいは両方の意味の組合せを称する。空間的に異なる複数のウェル内の液体及び／または気体に対する力は同じではないことは明らかである。従って、１つ以上のウェルを、他の１つ以上のウェルとは異なるレベルまで満たすことが可能である。好適例では、本発明の方法は、各ウェルが同じレベルまで満たされる、ということをもたらすのに対し、他の好適例では、１つ以上のウェルを、他の１つ以上のウェルと同程度まで満たさないことができる。
【００３０】
本発明の方法は、複数のウェル内への液体の分配が、結果的に、充填前にデバイスのあるウェル内に事前装填されている物質が、デバイス内の他のウェルにほとんど転移しない、ということももたらすことが好ましい。本発明のデバイス、システム、及び方法は、デバイスのウェルに複数の異なる物質が事前装填される用途に特に適している。この場合は、１つのウェルから他のあらゆるウェルへの物質の転移が存在しないことが好ましいことが多い。理論にとらわれることを望まずに、１つのウェルから他のいずれかのウェル内への物質の転移が生じるか否かに影響を与える要因は、ヘッドスペース内に入り、そしてヘッドスペースを出る液体の移動速度；ウェル内にある物質の、この液体中の混和性／溶解性；及びこの液体中で溶解する物質の性質を含む。特定の好適例では、本発明の方法は、ヘッドスペース内に入り、そしてヘッドスペースから出る液体の移動速度が、上記物質のこの液体中への拡散速度を無効にするほど十分速い、ということをもたらすことが好ましい。本発明の方法は、１つのステップで、液体がヘッドスペース及びウェル内に移動し、後続するステップで、ヘッドスペース内の液体がガスと置換される、ということをもたらすことが好ましい。本発明の方法の好適例では、容器が、デバイスのヘッドスペース及びウェルをほぼ満たすのに十分な量の液体を含む。これらの好適例では、容器内の液体を減圧下でデバイス内に引き込む。その後に、液体を排出した容器は、この容器からデバイスのヘッドスペース内に流入するガス源を提供し、これにより、ヘッドスペースの液体を置換する。好適例では、ヘッドスペースが最小時間分の液体を含み、これにより、事前装填された物質の１つのウェルから他のウェル内への移動がほとんど存在しない。本発明は、容器が、ウェルの容積を結集した容積よりも大きい体積の液体を含む、ということをもたらすが、容器が、ウェルの容積を結集した容積に等しいか、さらには、この容積以下の液体を含むことも想定している。さらに、本発明の方法を実行するに当たり、容器が、ウェルに分配される液体を完全に排出するようにしなくてもよく、ウェルが最初に充填された後のしばらくの間、ヘッドスペースが液体を充填されたままであることも想定している。こうした方法は、ウェル内に事前装填することのできる物質が、液体中への実質的な拡散または溶解しない、あるいは、恐らくは、ヘッドスペース内の液体をシーラントと置換することができることが望ましい場合に、適切であり得る。
【００３１】
本発明の方法は、ウェルが短い時間内に液体でほぼ満たされる、ということをもたらすことが好ましい。液体が最初にヘッドスペース内に入る時点から、１．０ｓ以内にほぼ満たされることが好ましく、０．５ｓ以内にほぼ満たされることがより好ましく、０．３ｓ以内にほぼ満たされることが最も好ましい。
【００３２】
容器の出口における液体の圧力は、要因の数に依存する。こうした要因の例は、容器内の液体の重量；容器の形状；及び容器の入口における大気圧を含む。容器の出口における液体の圧力は、約１０１．３ｋＰａ以上である。デバイス内の圧力に影響を与える要因の例は、デバイスに加える真空の度合いである。こうした真空をこうした期間だけ加えて、上記圧力を２０ｋＰａ以下、好適には１５ｋＰａ以下、最も好適には０．２〜１．０ｋＰａにすることができる。
【００３３】
本発明のデバイス、システム、及び方法は、水とほぼ同じ粘度の液体に特に適しているが、本発明は、より低い粘度またはより高い粘度の液体にも用いることができる。より低い粘度またはより高い粘度の液体については、本発明のデバイス及びシステムに適用される方法は、容器の出口とヘッドスペースとの間の異なる圧力差を利用することができる。例えば、水より低い粘度の液体については、１５ｋＰａ以上のデバイス内の圧力が適切であり得る。例えば、水より高い粘度の液体については、０．２ｋＰａ以下のデバイス内の圧力が適切であり得る。本発明は、水と同様の粘度であるが表面張力を変化させた液体の分配も提供する。こうした液体の例は、界面活性剤を溶かした水である。こうした液体は、気体との接触時に発泡し易いことがある。従って、本発明は、容器の出口における液体の圧力とデバイス内の圧力との差を、液体がヘッドスペースから排出される前にウェルをほぼ満たすことを、こうした発泡が妨げないような差にする、ということをもたらす。本発明のデバイス、システム、及び方法は、ＰＣＲの用途に特に適している。従って、本明細書で用いるように、ウェルをほぼ満たす液体を参照する「液体」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、酵素、蛍光染料、ｄＮＴＰ，ＰＣＲ混合物のうちの１つ以上を含む、ほぼ水性の溶液、乳液、等を記述するために使用することがある。
【００３４】
本発明の方法はさらに、デバイスのウェル間の流体連通を封止するステップを含むこともできる。こうしたステップは、デバイスのウェルをほぼ満たした後に実行することが好ましい。液状シーラントをヘッドスペース内に分配することができる。この液状シーラントは、硬化して（プレポリマーのような）固体になることのできる材料、あるいは（油のような）液体のままであることのできる材料を含むことができる。好適例では、このシーラントはＰＤＭＳプレポリマーを含むことができる。このシーラントをヘッドスペース内に導入するのに適した手段が多数存在することは明らかである。こうした手段の１つはシリンジであり、これにより、液状シーラントに正圧を加えてヘッドスペース内に押し込む。こうした好適例では、ヘッドスペース内の圧力は、正圧を加える前の液状シーラント内の圧力とほぼ同じであることが好ましい。封止する前のヘッドスペース内の圧力は、９５〜１０５ｋＰａの範囲内であることがより好ましく、約１０１．３ｋＰａであることが最も好ましい。シーラントをヘッドスペース内に供給するのに適した他の手段は、ウェル内に分配する液体上にシーラントを層状化することによるものであり、これにより、一旦、ウェル内への分配用の液体が全部容器を出ると、シーラントが容器から流出して、減圧手段の影響下でヘッドスペースを満たす。こうした効果は、減圧手段の慎重な調整によって達成することができる。例えば、一旦、シーラントの一部が容器を出てヘッドスペースを満たすと、減圧手段をヘッドスペースとの流体連通から分離することができ、従って、ヘッドスペース内のシーラントにもはや、追加的な力を加えない。
【００３５】
本発明のデバイスのカバーは、本発明の方法の実行に続いて、ベース部材から除去することが好ましい。このカバーを除去する１つの理由は、デバイスの１つ以上のウェルから試料を取り出すことができるようにするためである。本発明の一部の好適例では、ヘッドスペースに硬化ポリマーを充填する場合に、試料をウェルから除去するために、ポリマーシールに穴を開ける必要があり得る。こうした好適例では、針（ニードル）が、ポリマーシールに穴を開けるのに適切したアイテムである。この針をシリンジに結合して、ウェルから溶液を回収することができる。
【００３６】
以下、図面及びいくつかの例を参照ながら本発明を説明する。以下の説明の特異性は、本発明の以上の説明の一般性に優先するものではないことは明らかである。以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明のデバイスの透視図である。図に示すように、このデバイスは、カバー、３つの出口流路及び１つの入口流路、及び格子パターンのアレイ状に配置された、ほぼ均等な比率の１００個のウェルを備えている。
【図２】本発明のデバイスの側断面図の概略表現であり、ヘッドスペースはベース上を覆うカバープレートによって規定される。
【図３】本発明のシステムの側断面図の概略表現である。
【図４】本発明による方法の４つのステップ（ステップＡ〜ステップＤ）を概略表現する図である。
【図５】試料装填、ウェル分離、及びシールプロセスの上面画像列である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
図１は本発明のデバイス１０１の一実施例の図表示である。特に、ベース部材２は、アレイ形式の複数のウェル４、入口流路６、及び３つの出口流路８を備えている。各流路はベース部材２の樹脂内に向けて開口し、具体的には、ベース部材２を占めるウェルのアレイの隅部にある樹脂の所で開口し、各流路は、このアレイのエッジに直交し、このエッジを通ってアレイ樹脂内に入る。本発明のデバイスの一部の実施例では、入口流路６及び／または出口流路８の流路の高さは、ウェルの上を覆う空間の高さより小さくすることができる。入口流路６の断面積が、出口流路８のそれぞれの断面積よりも大きいことが好ましい。この関係は図１においてより明らかにわかる。さらに図１に見られるように、各流路の流体軸は、デバイスの対向するエッジ上の流路の入口または出口の方向性に対してオフセットしている。理論にとらわれることを望まずに、この構成は、本発明の方法の実行中に、ヘッドスペースの排液の前にウェルをほぼ満たすことを促進するものと考えられる。図１は、ベース部材２全体にわたるウェル４の好適な分布も示す。
【００３９】
図２は本発明のデバイスの好適な実施例の側断面の概略図である。この図では、入口流路６と出口流路８とが直接対向して見えるが、図に示す実際のデバイスでは、これらの流路は図１に示すようにオフセットしている。この図は、本実施例の構成要素の層状化を示すことを意図している。特に、図２は、成型したポリマー部材１６とガラス板１８との間に形成された複合ベース部材を示す。このように形成された複合ベース部材は、ポリマー部材１６自体よりも剛性がある。事前に作製したポリマーチップの１つ以上のウェル４内に、化学物質及び／または生体物質（生物材料）を装填することができる。次に、成型したポリマー部材１６及びウェル４上をカバープレート１で覆い、これによりヘッドスペースを規定する。入口流路６は、液体がデバイスの外部の空間からヘッドスペース及びウェル内に移動することを可能にする。出口流路８を真空源（図示せず）の下において、液体をヘッドスペース２４内に引き込み、過剰な液体をヘッドスペースから除去することを可能にすることができる。
【００４０】
図３は、本発明のシステムの略図である。この図では、入口３２及び出口３４を備え、液体３６を含む容器３０が、バルブ３８に結合されている。管４０は、バルブ３８を、デバイス１０１の入口６に結合する。デバイス１０１は筐体４６内に位置し、筐体４６は実質的な真空を形成することを可能にする。筐体４６はバルブ４８に結合され、バルブ４８は、真空ポンプ５０とハウジング４６との間の流体連通に対する制御を可能にする。使用中には、真空ポンプ５０はハウジング４６内に減圧領域を生成する。この減圧領域は吸引力に変換され、バルブ３８の開放時に、この吸引力は、管４０及び入口６を通して液体３６をデバイス１０１に引き込んで、ウェル４に充填する。この減圧は、過剰な液体をヘッドスペース２４から引き出すことも可能にする。
【００４１】
図４に、本発明の方法の一実施例を示す。ステップＡでは、ウェル４及びヘッドスペース２４を有するデバイス１０１が筐体４６内に含まれる。デバイスは、液体３６を含む容器３０に結合されている。この容器は、その最上端にある開口（入口）３２、及び閉じたバルブ３８に結合された開口（出口）３４を有し、バルブ３８は、容器から流出する液体及び／または気体の流れを調整することができる。筐体４６は出口バルブ４８に結合され、出口バルブ４８を用いてチャンバ内の圧力を調整し、この圧力は真空６８によって変化する。開位置にあるバルブ４８、及び閉位置にあるバルブ３８により、筐体４６内の圧力を約０．２〜１．０ｋＰａの間に低減する。ステップＢでは、容器外に流出する液体の流れを調整するバルブ３８を開放して、液体が容器から移動してウェル４及びヘッドスペース２４を満たすことを可能にする。ステップＣでは、一旦、液体が容器からほぼ排出されると、気体がアパーチャ３２から容器を通り、そして開放されたバルブを通って移動し始め、これによりデバイスのヘッドスペースに入る。ウェル内の液体３６は、ヘッドスペース内への気体の移動にほとんど影響されない。前にヘッドスペースを満たしていた液体は、チャンバ６６内に排出される。ステップＤでは、閉位置にあるバルブ４８により、第１容器を除去し、ＰＤＭＳプレポリマーのようなシーラントとして作用するのに適した材料８５を含む第２容器８４に置き換える。正圧下で、このシーラントは第２容器からヘッドスペース２４に押し出される。その後に、このデバイスをチャンバから除去し、このシーラント材料が硬化して実質的な固体材料になるのに十分な条件下に、十分な時間だけ置く。このようにして、ウェル４内の液体が、デバイスの熱サイクル中の二次汚染及び蒸発のような悪影響から保護される。
【００４２】
図５に、試料装填、ウェル分離、及び封止プロセスの上面画像列を示す。画像フレーム１〜３はステップＢのプロセスを示し、画像フレーム４〜６はステップＣのプロセスを示し、そして画像フレーム７〜９はステップＤのプロセスを示す。各画像フレームの詳細な説明は次の通りである：フレーム１：ＰＣＲ試料を装填する前に、チップが真空エンクロージャ内に配置されている。ウェルの一部には、青色染料が事前装填され、ウェルの表面上で乾燥する。フレーム２〜３：ヘッドスペース及びウェル内に確立された真空によって駆動されて、液体試料がヘッドスペース内に高速で注入され、ピンチバルブを開放した後に一瞬にして再分配され、ヘッドスペース及びウェルを満たす。フレーム４〜５：液体試料の直後に空気が後続し、過剰な液体をヘッドスペースから通気流路を通してパージ（追放）し、一瞬にして、すべてのウェルを互いに分離したままにする。その後に、真空を遮断する。フレーム６：乾燥した染料の再懸濁がウェルに青色を与え、３つの青色文字「ＮＴＵ」をウェルマトリクス内に示し、残りのウェルは透明なままである。このことは、目に見える二次汚染がウェル間に存在しないことを示す。フレーム７〜９：シーラント（ＰＤＭＳプレポリマー）を管からヘッドスペース内に注入し、すべてのウェルを封止する。
【００４３】
（例）
（例１）
ＰＣＲデバイスの構成
５×５ｃｍある最大面を有し、各々の寸法が０．５×０．５×０．５ｍｍの１００個のウェルを有するデバイスの例は、次のように用意される。ＰＤＭＳシルガード(Sylgard)（登録商標）シリコーンエラストマ１８４と、シルガード（登録商標）硬化剤１８４（米国ミシガン州ミッドランドにあるDow Coming社製）とを１０対１の割合で混合することによって、液状プレポリマー（２ｍＬ）を調合し、１５０ｒｐｍの磁性攪拌器（マグネチックスターラー）によりビーカー内で１時間攪拌して均質にする。ＰＤＭＳプレポリマーをウェル及び流路の逆形状を有する金属ダイ（マイクロ放電加工したステンレス鋼）の表面に塗布し、この液状プレポリマーを真空下で２０分脱ガス（脱気）する。その後に、平坦な表面を有する他の金属ブロックを、このＰＤＭＳプレポリマー上に配置し、このアセンブリ全体を８０℃にして２時間加熱する。ナノウェル及びマイクロ流路を有するＰＤＭＳの複製層をモールド（型）から慎重に取り外し、その後に、厚さ２μmの液状ＰＤＭＳのスピンコート層を接着層として用いて、このポリマーの平面を、酸洗浄した厚さ０．１ｍｍのホウケイ酸ガラス基板（ドイツ国ハンブルグ市にあるHerenz Medizinalbedarf社製)に接着する。このアセンブリを接着層と共に８０℃にして２時間で硬化させ、このＰＤＭＳ層を上記ガラス基板に永久的に接着する。
【００４４】
複数の遺伝子のＰＣＲ分析のために、核酸プライマー対を含むプライマー溶液を多数のウェルに手作業で装填する。次に、デバイスを８０℃で１０分間加熱して、ウェル内部に事前装填されたプライマー液から大部分の水を蒸発させる。これらのプライマー組は、凍結乾燥（フリーズドライ）プロセスによって、あるいは室温で乾燥させることもできる。最後に、厚さ０．１ｍｍの酸洗浄したホウケイ酸ガラスカバープレート（ドイツ国ハンブルグ市にあるHerenz Medizinalbedarf社製）をウェル上に配置し、液状ＰＤＭＳを用いてＰＤＭＳマトリクスチップに接着してヘッドスペースを規定し、包囲さたマイクロ流路を形成する。
【００４５】
（例２）
二次汚染（クロスコンタミネーション）
ウェルをほぼ満たすプロセス中には、ウェル内に事前装填された化学物質の二次汚染は無視できることが実証されている。この関係では、１００個の等容積のウェルを備えたデバイス内の所定数のウェルに、青色染料を含む溶液を事前装填した。その後に、この溶液をデバイスのウェルから蒸発させた。本発明の方法による真空によって駆動して、ヘッドスペースを適切に排液する前に、ウェル及びヘッドスペースに、青色染料に適した溶液である液体を充填した。基本的に青色染料の全部が、この青色染料を事前装填された各ウェル内に残っていることが観測された。
【００４６】
二次汚染が無視できることの発見をさらに検証するために、他のデバイスの選択した数のウェルに、ＦＡＭフルオロフォア（蛍光色素分子）（５’−(６ＦＡＭ)−ＴＣＧ ＴＧＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＧ）の標識を付けた塩基長２０ｍｅｒの精製されたオリゴヌクレオチド（プライマー）を事前装填した。次に、この溶液を蒸発させた。本発明の方法により、ウェルにＰＣＲ混合物を充填し、このＰＣＲ混合物は、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のTriton Ｘ−１００、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２Ｕ／μＬのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（米国マディソン市にあるPromega社製）、及びテンプレート（鋳型）としてのｐＧＥＭ−３Ｚベクター内にクローン化された０．０１ｎｇ／μＬのＳＡＲＳ ＤＮＡを含む。蛍光顕微鏡を用いて、標識を付けたオリゴヌクレオチドの、事前装填したウェルから事前装填していないウェルへの移動が存在しないだけでなく、標識を付けたオリゴヌクレオチドの拡散速度が低速であることが観測された。さらに、２７９秒間室温においた後に、標識を付けたオリゴヌクレオチドはウェル内の溶液の総体積中に拡散していなかった。
【００４７】
（例３）
リアルタイムＰＣＲ法
本発明のデバイス、システム及び方法を、リアルタイムＰＣＲの分野に適用した。合計１００個のウェルを備えた本発明のデバイスの２２個のウェルに、プライマー対を含む溶液を事前装填し、残りの７８個のウェルは空のままにした。その後に、この溶液を蒸発させ、乾燥したプライマー対を残した。フォワードプライマーとリバースプライマーのシーケンスは、５’−ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＧＴ ＴＡＣ−３’(２４ｍｅｒ)、及び５’−ＣＡＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＣＧ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＴＡ−３’（２１ｍｅｒ)とした。本発明による方法を用いて、デバイスのウェルに、固定濃度のＤＮＡテンプレート（鋳型）を含むＰＣＲ混合物を充填した。このＰＣＲ混合物は、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のTriton Ｘ−１００、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２Ｕ／μＬのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（米国マディソン市にあるPromega社製）、１．５μg/μＬのＢＳＡ、２Ｘ ＳＹＢＲ Green Ｉ（米国メイン州にあるCambrex Biosciences社製)、及びテンプレートとしてのｐＧＥＭ−３Ｚベクター中にクローン化した０．０１ｎｇ／μＬのＳＡＲＳ ＤＮＡのＢＮＩ−１フラグメント（残留物質）（１８９ｂｐ（塩基対））を含む。このＰＣＲ混合物は、上記乾燥させたプライマー対を溶解し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の０．３μＭの最終濃度を与えた。その後に、デバイスのヘッドスペースに液状ＰＤＭＳ液を充填し、デバイスのウェル間の流体連通を除去した。
【００４８】
次に、デバイスに連結した熱電加熱器（ヒータ）／冷却器（クーラ）（ＴＥＣ：Thermoelectric Heater/Cooler）（米国ニュージャージー州のトレントン市にあるMelcor社製）を用いて、デバイスに熱サイクルを施した。このＴＥＣ上にＲＴＤ（Resistive Temperature Detector：抵抗温度検出器）を装着して温度を測定し、フィードバック制御用に使用した。次の熱サイクルプロファイルを用いた：９５℃、６０秒間の初期変性に続き、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１５秒間のアニール加熱、及び７２℃、１５秒間の延長を４０サイクル行う。リアルタイムＰＣＲ機器の光学器は、ＤＮＡ挿入染料であるＳＹＢＲ Green Ｉの蛍光を測定するように設計され、ＳＹＢＲ Green Ｉ染料の蛍光は、すべてのＰＣＲサイクルの延長ステップで測定した。ＳＹＢＲ Green Ｉフルオロフォア（蛍光色素分子）は、青色ＬＥＤ（英国カンブリア州にあるMarl International社製）のアレイを使って励起し、４５°の角度でＰＣＲデバイスの平面に固定し、検出ユニットの光路上の励起光の干渉を防止する。青色ＬＥＤアレイからの励起光（４８０ｎｍで強度ピークを有する）及びチップからの放射光は共に、それぞれ４６５〜４９５ｎｍ及び５１５〜５５５ｎｍのバンドパスフィルタ（米国ブラトルバラにあるChroma Technologies社製)を用いてフィルタ処理した。チップ全体の蛍光画像は、冷却したＣＣＤカメラ（イタリアのピサ市にあるＤＴＡ社製）によって捕捉した。ＰＤＭＳデバイス内の２２個のウェルからのテンプレートの、３×１０7個のコピーを増幅するための閾値サイクル（Ｃｔ）は、約１１サイクルであるものと決定された。２２個のウェル内のテンプレートＤＮＡの３×１０7個のコピーを増幅するためのＣｔ値は、チップ全体を通して一貫している。
【００４９】
本明細書中の、先行文献（またはそれから派生した情報）あるいは既知の事項の参照は、これらの先行文献（またはそれから派生した情報）あるいは既知の事項が、本明細書に関係する試みの分野における共通の一般的知識を形成することの認識、了解、または何らかの示唆として解釈されず、また解釈すべきでない。
【００５０】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、特に断りのない限り、「備える」及び「備えている」のような変形は、記載した数またはステップ、あるいは数またはステップのグループを含むが、それ以外の数またはステップ、あるいは数またはステップのグループを排除しないことを、暗に意味する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス、及びこうしたデバイスを使用するシステム及び方法に関するものである。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用途での使用に特に適し、この用途を参照して本発明を説明することが好都合である。しかし、本発明のデバイス、システム及び方法は、他の用途にも適していることは明らかである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの完成は、並行遺伝的分析用の高処理能力プラットフォームの急速な発展のきっかけとなった。現在、２種類のＤＮＡマイクロアレイ、即ち：ゲノム規模発現プロファイリング用のマイクロアレイ、及び一塩基（単一ヌクレオチド）変異多型（ＳＮＰ）検出及び遺伝子型決定用のマイクロアレイが、高度に並行遺伝的な分析用のプラットフォームとして広く用いられている。データ分析及び解釈の方法が標準的でないことにより、マイクロアレイ結果の検証は依然として、所望されるステップである。定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が、遺伝子発現プロファイリングの研究を検証するための代替技術として、よく用いられる。さらに、マイクロアレイ技術の感度及び特異度は低く、この技術に含まれる複数のステップは、リアルタイムＰＣＲに比べると、結果に変動性を取り入れる。ＳＮＰ検出及び遺伝子型決定のためには、融解曲線技術によって、あるいはオリゴヌクレオチドプローブへの混成によって試料を分析する前に、ＰＣＲプロセスを用いてこれらの試料を増幅する。遺伝子発現プロファイリングのためには、高度に並行遺伝的な分析用の単一プラットフォームとして、リアルタイムＰＣＲの定量的で高感度の能力を、マイクロアレイの高い処理能力と統合することが望ましい。複数の遺伝子ターゲットの並行分析のためのマイクロアレイ技術に加えて、ＰＣＲをマイクロアレイ技術と統合するための多数のプラットフォームが開発されてきた。これらのプラットフォームの大部分は、固相ＰＣＲをマイクロアレイプラットフォームと組み合わせている。しかし、研究は、固相ＰＣＲは液相ＰＣＲよりも効率が低いことを示している。
【０００３】
多数の遺伝子の急速で高処理能力の分析用のＰＣＲベースのバイオチップを開発するために、多大な努力がなされてきた。こうしたバイオチップ（チップ）は一般に複数のウェルを含み、各ウェルは溶液を保持することができる。今までに開発されたデバイスに関連する問題は：ＰＣＲチップの個々の反応ウェル内へのＰＣＲ試料の面倒な手動装填；溶液をウェルに充填するための液体分注ロボットの多大な費用、あるいはゲルマトリクス内でのヌクレオチドプライマーの不動化に関連する問題を含む。さらに、高処理能力ＰＣＲチップは、製造が安価であり、使い捨て可能であり、そして、大きな反応アレイ全体を通して均一な温度を維持することが望ましい。これに加えて、チップを使って動作を行うコストを低減するために、単純かつ安価な試料装填及び反応ウェル封止（シール）方法が望まれる。
【０００４】
高処理能力ＰＣＲチップ用の２種類の構成が存在する。第１の種類は、流体マイクロチャンバのアレイまたはマトリクスから成る。こうした構成は、マイクロ流体の流路網を用いて、チャンバのアレイに液体試料を、一度のピペット操作で装填する。一般に、各チャンバには、試料装填用の入口流路、及び通気用の出口流路が接続されている。しかし、すべてのチャンバを、機械的なバルブを用いて分離して封止することは複雑である、というのは、熱サイクル中のＰＣＲ混合物の蒸発を防止し、かつ、プライマー対の二次汚染を防ぐために、各マイクロチャンバの入口流路及び出口流路を封止しなければならないからである。これに加えて、こうした構成内の流路はチップ上の空間を占め、チップ上のチャンバの密度を制限する。第２の種類の高処理能力ＰＣＲチップは、小型化されたウェルプレートから成る。この種の構成では高密度マイクロウェルが可能であり、これらのマイクロウェルは、薄型カバーまたはシーラント（封止剤）をウェル上に用いて、分離して封止することができる。しかし、試料装填及び他の液体処理操作は、高精度のロボットを使って達成され、高精度のロボットは高価であり、熟練したオペレーター（操作員）を必要とする。
【０００５】
近年、３つのウェルを含む使い捨て可能なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップが報告されている（Xing, Q,; Xu, B.; Fu, R.; Li, D. Biomed Microdevices 2005, 7, p. 273-279（非特許文献１））。このチップはＰＣＲに利用され、ここでは、ＰＣＲ混合物を手作業で（容積０．９μＬの）各ウェル内に装填すると直ちに、これらのウェルを鉱油で覆って蒸発を防止している。
【０００６】
ＰＣＲ用に開発された他のデバイスは（Chaudhari, A.M.; Woudenberg, T.M.; Albin, M.; Goodson, K.E. Journal of Microelectromechanical Systems 1998, 7, p. 345-355（非特許文献２））、微細加工した１８容器のアレイを利用し、ここでは、ＰＣＲ適合アクリルベースの接着テープを用いて、マイクロチャンバをガラスカバーで封止している。
【０００７】
Leamonらは、新規のPicoTiterPlate（登録商標）プラットフォームを報告し（Leamon, J.H.; Lee, W.L.; Tartaro, K.R.; Lanza, J.R.; Sarkis, G.J.; deWinter, A.D.; Berka, J.; Lobman, K.L. Electrophoresis 2003, 24, p.3769-3777（非特許文献３））、このプラットフォームでは、各々が３９．５ｐＬの反応容積を有する３００，０００個の容器を、固相非対称ＰＣＲ用に同時に利用している。
【０００８】
少数の研究者が、チップ上でＰＣＲを実行するために、マイクロ流体の液体分配を用いている。中でも、Mathiesらは（Lagally, E.; Simpson, P.C.; Mathies, R.A. Sensors and Actuarors B 2000, 63, 138-146（非特許文献４））、試料装填及びウェル封止用に機械的なバルブアレイを用いて、ＰＣＲ混合物のマイクロ流体分配により、複数回のＰＣＲをチップ上で実行することができることを実証している。Quakeらは、マイクロ流体技術を応用して、２，８６０個の統合型液圧弁・空気圧ポンプを用いて、２μＬの量のＰＣＲ混合物をＰＤＭＳチップ内の４００個の独立した反応容器に分配している（Liu, J.; Hansen, C.; Quake, S.R. Anal Chem 2003, 75, p. 4718-4723（非特許文献５））。同じ技術が、米国特許出願公開第２００３／０１３８８２９号明細書（特許文献１）にも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１３８８２９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Xing, Q,; Xu, B.; Fu, R.; Li, D. Biomed Microdevices 2005, 7, p. 273-279
【非特許文献２】Chaudhari, A.M.; Woudenberg, T.M.; Albin, M.; Goodson, K.E. Journal of Microelectromechanical Systems 1998, 7, p. 345-355
【非特許文献３】Leamon, J.H.; Lee, W.L.; Tartaro, K.R.; Lanza, J.R.; Sarkis, G.J.; deWinter, A.D.; Berka, J.; Lobman, K.L. Electrophoresis 2003, 24, p.3769-3777
【非特許文献４】Lagally, E.; Simpson, P.C.; Mathies, R.A. Sensors and Actuarors B 2000, 63, 138-146
【非特許文献５】Liu, J.; Hansen, C.; Quake, S.R. Anal Chem 2003, 75, p. 4718-4723
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
高価な材料及び装置の必要性なしに、多数の密集した反応容器を急速に充填して封止することを可能にする代替技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、複数のウェルを備えたマイクロ流体デバイスを提供し、高価な個別の試料充填の必要性も、二次汚染及び試料蒸発を防止するために個々のウェルを分離して封止する要求もなしに、各ウェルを液体でほぼ満たすことができる。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、複数のウェル内に液体を分配するデバイスを提供し、このデバイスは：
ａ）複数のウェルを有するベース（基部）と、
ｂ）このベース上を覆って、これらのウェル上にヘッドスペースを規定し、これらのウェルがこのヘッドスペース内に向けて開口するためのカバーと、
ｃ）上記ヘッドスペース内に上記液体を供給して、この液体をこれらのウェル内に分配するための、少なくとも１つの入口と、
ｄ）上記ヘッドスペースと流体連通して上記ヘッドスペースから過剰な液体を除去するための、及び／または、上記ヘッドスペースと流体連通して上記ヘッドスペースに減圧を加えるための、少なくとも１つの出口と
を備えている。
【００１４】
別の態様において、本発明は、複数のウェル内に液体を分配するシステムを提供し、このシステムは：
ａ）上述したデバイスと、
ｂ）分配される液体を含む容器であって、この容器から上記ヘッドスペースへの液体の流れを制御するためのバルブ手段を介して上記少なくとも１つの入口に接続された容器と、
ｃ）上記少なくとも１つの出口に減圧を加える手段と
を備えている。
【００１５】
他の態様では、本発明は、上述したデバイスまたはシステムを使用する方法を提供し、この方法は、上記出口の各々に減圧を加え、これにより、液体が上記入口の各々から上記ヘッドスペース内に引き込まれて上記ウェル内に分配されるステップを含む。
【００１６】
他の態様では、本発明は、本発明のシステムを使用する方法を提供し、この方法は、
ａ）上記少なくとも１つの出口に減圧を加えて、上記デバイスの上記ヘッドスペース及びウェル内の圧力を、上記容器の出口における液体の圧力以下にするステップと、
ｂ）上記バルブ手段を開放し、これにより、上記容器内の上記液体がこの容器を出て、上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェルに入るステップと、
ｃ）上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェル内の圧力を低減する手段を、上記デバイスの上記ヘッドスペース及び上記ウェルとの流体連通から分離するステップと
を含む。
【００１７】
本発明のデバイス、システム（装置）及び方法は、複数のウェル内に液体を分配し、これらのウェルを分離して封止する手段を提供する。本発明は、免疫測定、細胞ベースの分析、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の用途に特に適しているが、これらの用途に限定されない。
【００１８】
本明細書で用いる「ウェル」とは、技術的に標準的な意味を有する。一般的意味では、ウェルは、液体を保持すべく作製された凹部である。この凹部は、固体塊の一部を除去することによって（例えば、固形体から凹部をエッチングまたは彫削して）形成することができる。この凹部は、硬化性の液体を成型（モールド）して、凹部を有する固体塊を形成することによって（例えば、事前に作製したダイを用いて相補的な形状を形成して）形成することができる。ウェルの形状は、２つ以上の面によって規定することができる。こうした形状の例は、円錐形、角錐形、角柱形、及びその先端を切り取った変形を含む。すべての場合において、ウェルを規定する形状は開口を有し、この開口を通って、液体及び／または気体がこのウェルに入り、及び／または、このウェルから出ることができる。ウェル用の開口の形状は、（正方形を含む）長方形、あるいは円形とすることができる。適切であれば、この開口は、ウェルの下面よりも寸法が大きいことが好ましい。これらのウェルは、先端を切り取った四角錐の形状であることが好ましく、最大の四角形の面がウェルの開口となる。本発明のデバイス、システム、及び方法は、低密度、中密度、及び高密度のウェルの用途に適している。低密度の用途は一般に、チップ当たり１０個未満の反応ウェルを用いる。中密度の用途は一般に、チップ当たり約１０個〜約１００個の反応ウェルを用いる。高密度の用途は一般に、チップ当たり１００以上の反応ウェルを用いる。本発明のデバイス、システム、及び方法は、各々が約０．１ｐＬ〜約３ｍＬの容積を有するウェルを利用することが好ましい。これらのウェルは、格子または規則的なアレイ形式で空間全体にわたって均等に分布することが好ましい。
【００１９】
本発明のデバイスは１回使用（使い捨て）または繰り返し使用の設計とすることができるが、これらのデバイスは、１回使用の用途に特に適している。本発明のデバイスは、比較的安価な材料で構成され、このデバイスに接触する材料に対してほぼ不活性であることが好ましい。相補的な形状の存在下で重合、交差結合（架橋）、及び／または硬化することのできる材料については、モールド（型）及びダイが本発明のベース部材の構成に特に適している。こうした材料の例は、ウレタン、ラテックス、ビニル、及びシリコーンを含む。蛍光検出ベースの分析のような特定用途では、低い自己蛍光を有するプラスチック材料を用いて、ウェル内の混合物からの蛍光を妨害し得る蛍光ノイズを低減することが好ましい。本発明は、本明細書で説明するデバイス、システム及び方法を、蛍光検出ベースの方法を用いることのできる分析（あるいは分析を実行するための準備）で利用することができることを意図している。こうした分析の例は、核酸材料のリアルタイム定量ＰＣＲ増幅である。こうした分析の一具体例では、光源からの光（狭い波長範囲内の光を提供するために、バンドパスフィルタを用いてフィルタ処理されている）がデバイスのウェルに入り、このウェル内には、この波長範囲の光に敏感な１つ以上の物質を配置することができる。この（これらの）物質は蛍光を発して、この物質が敏感である波長範囲とは異なる波長範囲の光を放出することができる。放出された光（狭い波長範囲を提供するために、バンドパスフィルタを用いてフィルタ処理されている）は、検出手段によって検出することができる。この検出手段は、デバイスの内部またはデバイスの外部に配置することができる。従って本発明のデバイスは、光がこのデバイスのウェルに入ることができるように構成されていることが好ましい。本発明のデバイスは、光がデバイスのウェルに入り、かつデバイスのウェルから出ることもできるように構成されていることが、さらに好ましい。好適例では、このデバイスは、光がデバイスのウェルに入ることを可能にする手段、及び光がデバイスのウェルから出ることを可能にする手段を提供する。こうした手段の例は、特定波長の光に対してほぼ透明であるカバーである。こうした手段の特定例は、ガラスカバープレートであり、このガラスは、低い自己蛍光を有することが好ましい。蛍光検出ベースの分析の例は、（バンドパスフィルタを通過させた）４６５ｎｍ〜４９５ｎｍの範囲の波長の光源光を使用し、かつ（バンドパスフィルタを通過させた）５１５ｎｍ〜５５５ｎｍの範囲の波長の放射光を検出することのできる検出手段を使用するものである。デバイスのヘッドスペースを（硬化した液状プレポリマーのような）ある物質で封止した本発明の好適例では、このシーラント（封止剤）も、ウェル内及びウェル外への光の透過を可能にすることが好ましい。本発明のデバイス及びシステムでの使用に適し得るプラスチックは、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、及び特定のシリコーン材料であり得る。本発明のデバイス、システム及び方法での使用に特に好適なプラスチックはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。本発明の構成要素、特にベース部材の製造に適した相補的なモールドは、マイクロマシニング技術を用いて作製することが好ましい。こうした技術の例は、マイクロ放電加工（ＥＤＭ）である。相補的なモールドとして使用することのできる材料の例は、ステンレス鋼である。
【００２０】
上記デバイス自体は、２つ以上の材料から構成することができる。この点では、１つの材料の特性を、この材料を用いて上記デバイスの特定構成要素を形成することに役立てることができる。１つの材料を、特定構成要素中に使用するのに適したものとする（この材料の）特性の例は、フレキシビリティ（可撓性、柔軟性）、表面機能性、親水性／疎水性、成型の容易性、及び材料のコストを含む。基板と反応するための適切な表面機能性を提供すべく特定材料を選択することができるが、すべての構成要素が、これらの構成要素と接触する化学薬品／反応混合物に対してほぼ不活性であることが好ましい。本発明のデバイス及びシステムの構成において使用される材料は、選定した用途の条件に適合することが好ましい。例えば、ＰＣＲの技術は、熱源／ヒートシンクと各反応ウェルとの間の効率的な熱伝達を必要とする。従って、この用途のために、材料は、なるべくなら、大きな変形または融解をすることなしに、熱を効率的に伝導し、熱サイクルに耐えることができるべきである。所定材料の特性は、厚さ等の選択を通して変更することができる。これらの点では、ＰＤＭＳは適切かつ好適な材料を代表する。デバイスの剛体構成要素を形成するための好適な材料は、金属、ガラス、及びセラミックを含む。ガラスは、本発明のデバイス、システム、及び方法で使用するのに特に好適な剛体構成要素である。本発明のデバイスが２つ以上の材料から成る場合は、これらの構成要素を、結合剤を用いて接続することがより好ましい。これらの構成要素を結合するために用いる材料は、２つの構成要素を表面全体にわたって均等に結合し、その後に変質して固化するように、ほぼ液状で塗布されることが好ましい。こうした結合剤を塗布する方法の例は、スピンコーティングである。デバイスをガラス及びＰＤＭＳで作製する場合は、これらの構成要素は、液状ＰＤＭＳプレポリマーを用いて結合することができる。この関係では、プレポリマーの硬化は、これら２つの構成要素間の半永久的な結合を形成する。本発明のベース部材の好適例では、ベース部材は、相補的なモールドから形成されたＰＤＭＳ層に、硬化したＰＤＭＳで結合されたガラスの剛体層を含み、このＰＤＭＳ層は複数のウェルを備えている。
【００２１】
本発明のデバイスは、通常はプレート形であるカバーを備え、このカバーは上記ベース上を覆ってヘッドスペースを規定し、このヘッドスペース内に向けて各ウェルが開口する。このカバーは実質的に剛体材料製であることが好ましい。このカバーは、平面ガラス製のプレート形であることが好ましい。規定されるヘッドスペースは、規則的な形状とすることができる。ヘッドスペースの境界を規定することのできる規則的な形状の例は、長方柱（長方形の角柱）（正方柱（正方形の角柱）を含む）及び円柱（この円柱の平面が上記ウェルを覆う）を含む。規則的な形状の好例は、長方形の角柱である。ヘッドスペースは不規則な形状とすることもできる。例えば、ヘッドスペースは、台形の角柱の形状を有することができ、例えば、カバープレートの内面が、ベース部材上のウェルの開口どうしをつなぐことによって作られる表面に平行でない際に規定される形状である。不規則な形状の他の例は複合形状であり、その例は、円柱にドーム（浅いドームの場合のように、幾何学的には、（この円柱と）同曲率の球面の半分以下（の高さ）に相当し得る）を結合することによって規定され、この複合形状の最深部は複数のウェルのほぼ中心上にある。ヘッドスペースを規定する不規則な形状は、ヘッドスペースの「より深い」部分を入口及び／または出口に近くに向けることが望ましい本発明の特定好適例にも、特に好適であり得る。
【００２２】
本発明の好適例では、ヘッドスペース全体が、デバイスのウェル上だけでなく、デバイスのウェル間の空間も全体的に覆う。ヘッドスペースは、分割のない空間の連続領域から成ることが好ましい。特定の好適例では、任意の２つのウェルの直上にあるヘッドスペース部分どうしの間の空間領域は、デバイスのどの固形構成要素によっても分断されない。任意の２つのウェルの開口間の最短の流体連通は、これら２つのウェルの開口間の空間内の最短距離にほぼ等しい。規定されるヘッドスペースは、本発明の方法の応用が、容器内の液体の大部分のウェル内への移動を、これに付随してヘッドスペースから排出または吸引される液体の大量損失なしに生じさせるような大きさ（特に、十分小さい容積）であることが好ましい。他方では、規定されるヘッドスペースは、本発明の方法の応用が、容器からの液体の流れの制限を実質的に生じさせないような大きさ（特に、十分大きい容積）であることが好ましい。
【００２３】
本発明のデバイスの他の好適な特徴は、好適には、液体の大部分が容器からヘッドスペース内に流れ、その後にウェルをほぼ満たさずにヘッドスペースから排出されるほど、ヘッドスペースを小さくすべきでない、ということにある。カバーがプレート形である本発明の好適例では、ヘッドスペースの寸法は、ウェルの開口とウェルの底部との間の距離が、ウェルの開口とカバープレートとの間の距離とほぼ同じである。
【００２４】
本発明は、複数のウェル上を覆うヘッドスペース内への、液体及び／または気体の移動が、ヘッドスペース及びウェルと流体連通する入口及び出口の設計の影響を受けやすいという発見に、部分的に基づいている。本発明が意図するこうした設計の態様は、入口の配向、形状、及びサイズであり、これらの入口は流路の形状であることが好ましい。一部の好適例では、デバイスが略円筒形の流路を備えている。他のより好適な好適例では、本発明のデバイスの流路は長方柱（正方柱を含む）の形状を有することができる。本発明の流路の形状は、不規則にすることができる。例えば、本発明の流路の端部を丸くするか、口広げ（フレア）加工して、いわゆる「エッジ効果」を低減することができる。従って、流路は複合形状を有することができる。例えば、長方柱と漏斗形状を組み合わせて流路の形状を形成することができる。好適には、ヘッドスペースの境界が隅部（コーナー）を有する形状（例えば、長方柱）によって実質的に規定される場合は、流路は、これらの隅部の任意の２つ以上に近接して配置される。本発明の好適例では、ヘッドスペースの境界が、長方柱（正方柱を含む）形状によって実質的に規定される。これらの好適例では、入口流路及び出口流路の各々が、この長方柱の３面の交差によって生成される隅部に近接して配置される。理論にとらわれることを望まずに、本発明の方法を実行するに当たり、こうした配置は、ウェルを液体でほぼ満たした後の、ヘッドスペースの完全な排液を手助けするものと考えられる。
【００２５】
入口及び出口を適切な方法で設けて、液体をウェルに入れ、そして適切であれば、過剰な流体をヘッドスペースから除去するための手段を提供することができる。１つの好適例では、入口及び出口は、ベース中あるいはカバー部材中に形成された流路の形状にすることができる。入口及び出口はスペーサ内に設けることもでき、一部の好適例では、このスペーサはベースとカバー部材との間に配置されている。入口は、カバー部材中に孔によって形成することができる。本発明の各入口または各出口は、独立して屈曲させ、角度付けし、あるいはほぼ直線状にすることができる。一部の好適例では、入口及び出口はほぼ直線状である。適切であれば、入口及び出口は、この入口または出口が接続されたヘッドスペースの境界を規定する形状のエッジ（縁部）に直交することが好ましい。入口及び出口は、隣接する入口と出口とが互いにほぼ直交するように配置されていることが好ましい。理論にとらわれることを望まずに、本発明の方法の実行中に、この配置が、ヘッドスペースから液体のかなりの部分が排出される前に、ウェルをほぼ満たすことを促進するものと考えられる。入口及び出口の断面積は、入口流路の方が出口流路より大きいことが好ましい。理論にとらわれることを望まずに、こうした配置は、本発明の方法の実行中に、ヘッドスペースの排液の前に、ウェルをほぼ満たすことを可能にすることができる。本発明の特に好適な例では、デバイスは単一の入口流路及び３つの出口流路を備えている。こうした好適例では、入口流路は長方柱の形状を有し、出口流路は、長方柱と漏斗形状とを複合した複合形状を有し、この流路は、ヘッドスペースに近い当該流路の端部で、その開口を広げる。
【００２６】
本発明によるデバイスは、使用中に、分配される液体を含む容器に接続させることのできる少なくとも１つの入口を含む。この容器は一般に、容器からデバイスへの液体及び／または気体の通過を制御するバルブ部材を介して、この入口に接続される。この容器も一般に開口を有し、この開口を通して、この容器が液体を充填され、この液体が開放されたバルブを通して容器からデバイス内に除去されると共に、空気のような気体、あるいは窒素のような不活性ガスが、この開口を通ることができる。このバルブの操作は、例えば栓によって手動制御することができ、あるいは、例えば電気的に制御されるソレノイドによって自動制御することができる。容器の出口はバルブに結合され、このバルブは、容器からデバイスへの液体及び／または気体の流れを制御する手段を提供する。容器からの液体及び／または気体の流れを制御するこうした手段は、容器からウェルに液体が流れる前に、デバイスのヘッドスペース及びウェル内の圧力を所定圧力に低減することができる、ということをもたらす。好適な容器の例は、その上部が実質的に開放され、バルブに結合された下部開口を有する容器であり、このバルブの操作は、容器内に含まれる液体及び／または気体の、容器から流出する流量を全体的または部分的に制御する。容器とデバイスとは互いに結合されていることが好ましい。こうした結合を提供することのできる材料の例は、ある長さの管である。これらの管は、容器から移動する液体が全部、デバイスの入口流路に入る、ということをもたらすことが好ましい。この管の外寸は、入口流路の内寸とほぼ同じであるか、少し小さいことが好ましい。容器をデバイスに結合する手段が、ある長さの管である際は、容器からデバイスへの液体及び／または気体の流れを制限する好適な手段は「ピンチ弁」である。
【００２７】
本発明のシステム及び装置は、容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段を提供する。こうした手段の例は、流体を１つの位置から他の位置に移動させることのできるポンプである。こうしたポンプは、機械的手段（例えばダイアフラム）、あるいは当業者が適切であるものと知る他の手段によって、液体の移動（例えば水流吸引器）によって機能することができる。容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段の好適例は、オイルレス（油を使用しない）ベーン真空ポンプである。本発明のシステムは、デバイスのヘッドスペース及びウェルと流体連通するポンプを意図している。容器の出口における液体の圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段は、本発明のデバイスのウェル内で２０ｋＰａ以下の圧力を与えることができることが好ましく、１５ｋＰａ以下の圧力を与えることができることがより好ましく、そして、約０．２〜１．０ｋＰａの圧力を与えることができることが最も好ましい。本発明のシステムは、本発明のデバイスを、ポンプとの流体連通から分離する手段も提供することが好ましい。こうした手段の例はバルブである。こうしたバルブの操作は、ポンプとデバイスのヘッドスペースとの間の異なる圧力の潜在的な維持を可能にする。
【００２８】
本発明のシステムは、筐体（ハウジング）、チャンバ、またはコンテナを備え、その内部にデバイスを配置することができることが好ましい。従って、この筐体はデバイスよりも大きい寸法を有する。こうした筐体は、容器、及び容器の出口における圧力よりも小さい圧力をウェルに与える手段に接続することができる。こうした筐体は、密封されているか、少なくとも密封することができることが好ましい。本発明のシステム及び装置は、バルブが、こうしたコンテナを操作により密封したり開封したりする手段の例を与えることを意図している。この点では、容器、及びコンテナ内の圧力を低減する手段をコンテナの設計に統合し、これにより、各構成要素を、他の各構成要素との流体連通から分離することができる。こうしたコンテナは、デバイスを取り出すために容易に開放することができ、そしてコンテナを密封するために容易に閉じることができることが好ましい。こうしたコンテナは、デバイスを支持するための支持手段を備えることができる。この支持手段は、デバイスをコンテナの最下部から持ち上げ、これにより、本発明の方法を実行しながら、液体をデバイスのヘッドスペースからコンテナ内に不可逆的に排出することができる。こうしたコンテナの構成に適した材料は、金属、ガラス、セラミック、及びプラスチックを含む。これらのコンテナの構成用に特に好適な材料は、ガラス、及びほぼ透明なプラスチックである。こうした材料の例は、ポリ（アクリル酸）、またはその誘導体である。これらのコンテナは、異なる材料製のシールも備えることができることが適切である。このシールは、可撓性の固形材料製、例えばゴムのようなポリマー製であることが好ましい。本発明の好適例では、本発明のシステムは、大きな変形なしに、約０．２ｋＰａの内圧、及びこれと同時の約１０１．３ｋＰａの外圧に耐えることができるコンテナを含む。
【００２９】
本発明の方法は、容器から複数のウェル内への液体の分配は、この分配の移動を行うために液体に加わる全体的な力が存在するように、容器の出口とウェルとの間に圧力差を与えることによって達成することができる、という発見に部分的に基づいている。こうした分配は、気体の残留「バブル（泡）」がウェル内に残ることなしに、ウェルをほぼ満たすことを可能にすることが好ましい。容器の出口が、容器から出る液体及び／または気体の流れを調整するバルブのような手段に結合されている場合は、この手段を最初に閉じて、液体が容器を出ることなしに、ヘッドスペース及びウェル内の圧力を、容器の出口における液体の圧力以下に低減することが好ましい。従って、デバイスのウェル内の圧力が低減され、これにより、容器から出る液体及び／または気体の流れを調整する手段が開放されている際に、ガスの残留部分がウェル内に残ることなしに、ウェルを液体でほぼ満たすことができる。ウェルを充填しながら、ウェルを容器の出口における液体の圧力よりも低い圧力にし続けることが好ましい。この関係では、デバイスのヘッドスペース及びウェル内の圧力を低減する手段は、液体が容器からデバイスのヘッドスペース及びウェル内に流れる間に動作し続けることができる。この圧力低減手段は、全部の液体が容器を出た後にも動作し続けることができる。ウェルに液体を充填する従来の方法は、特に、ウェルの容積が小さい、及び／または、液体に比較的粘性がある場合は、ウェル内に残る気体の残留バブルを生じさせ得る。このことは、不所望な特徴であることが多い。本発明は、デバイスのウェルが、容器から分配される液体でほぼ満たされる、ということをもたらす。本明細書で用いる「ほぼ満たす」という表現は、１つのウェルがほぼその容量まで満たされたこと、または大部分のウェルが満たされたこと、あるいは両方の意味の組合せを称する。空間的に異なる複数のウェル内の液体及び／または気体に対する力は同じではないことは明らかである。従って、１つ以上のウェルを、他の１つ以上のウェルとは異なるレベルまで満たすことが可能である。好適例では、本発明の方法は、各ウェルが同じレベルまで満たされる、ということをもたらすのに対し、他の好適例では、１つ以上のウェルを、他の１つ以上のウェルと同程度まで満たさないことができる。
【００３０】
本発明の方法は、複数のウェル内への液体の分配が、結果的に、充填前にデバイスのあるウェル内に事前装填されている物質が、デバイス内の他のウェルにほとんど転移しない、ということももたらすことが好ましい。本発明のデバイス、システム、及び方法は、デバイスのウェルに複数の異なる物質が事前装填される用途に特に適している。この場合は、１つのウェルから他のあらゆるウェルへの物質の転移が存在しないことが好ましいことが多い。理論にとらわれることを望まずに、１つのウェルから他のいずれかのウェル内への物質の転移が生じるか否かに影響を与える要因は、ヘッドスペース内に入り、そしてヘッドスペースを出る液体の移動速度；ウェル内にある物質の、この液体中の混和性／溶解性；及びこの液体中で溶解する物質の性質を含む。特定の好適例では、本発明の方法は、ヘッドスペース内に入り、そしてヘッドスペースから出る液体の移動速度が、上記物質のこの液体中への拡散速度を無効にするほど十分速い、ということをもたらすことが好ましい。本発明の方法は、１つのステップで、液体がヘッドスペース及びウェル内に移動し、後続するステップで、ヘッドスペース内の液体がガスと置換される、ということをもたらすことが好ましい。本発明の方法の好適例では、容器が、デバイスのヘッドスペース及びウェルをほぼ満たすのに十分な量の液体を含む。これらの好適例では、容器内の液体を減圧下でデバイス内に引き込む。その後に、液体を排出した容器は、この容器からデバイスのヘッドスペース内に流入するガス源を提供し、これにより、ヘッドスペースの液体を置換する。好適例では、ヘッドスペースが最小時間分の液体を含み、これにより、事前装填された物質の１つのウェルから他のウェル内への移動がほとんど存在しない。本発明は、容器が、ウェルの容積を結集した容積よりも大きい体積の液体を含む、ということをもたらすが、容器が、ウェルの容積を結集した容積に等しいか、さらには、この容積以下の液体を含むことも想定している。さらに、本発明の方法を実行するに当たり、容器が、ウェルに分配される液体を完全に排出するようにしなくてもよく、ウェルが最初に充填された後のしばらくの間、ヘッドスペースが液体を充填されたままであることも想定している。こうした方法は、ウェル内に事前装填することのできる物質が、液体中への実質的な拡散または溶解しない、あるいは、恐らくは、ヘッドスペース内の液体をシーラントと置換することができることが望ましい場合に、適切であり得る。
【００３１】
本発明の方法は、ウェルが短い時間内に液体でほぼ満たされる、ということをもたらすことが好ましい。液体が最初にヘッドスペース内に入る時点から、１．０ｓ以内にほぼ満たされることが好ましく、０．５ｓ以内にほぼ満たされることがより好ましく、０．３ｓ以内にほぼ満たされることが最も好ましい。
【００３２】
容器の出口における液体の圧力は、要因の数に依存する。こうした要因の例は、容器内の液体の重量；容器の形状；及び容器の入口における大気圧を含む。容器の出口における液体の圧力は、約１０１．３ｋＰａ以上である。デバイス内の圧力に影響を与える要因の例は、デバイスに加える真空の度合いである。こうした真空をこうした期間だけ加えて、上記圧力を２０ｋＰａ以下、好適には１５ｋＰａ以下、最も好適には０．２〜１．０ｋＰａにすることができる。
【００３３】
本発明のデバイス、システム、及び方法は、水とほぼ同じ粘度の液体に特に適しているが、本発明は、より低い粘度またはより高い粘度の液体にも用いることができる。より低い粘度またはより高い粘度の液体については、本発明のデバイス及びシステムに適用される方法は、容器の出口とヘッドスペースとの間の異なる圧力差を利用することができる。例えば、水より低い粘度の液体については、１５ｋＰａ以上のデバイス内の圧力が適切であり得る。例えば、水より高い粘度の液体については、０．２ｋＰａ以下のデバイス内の圧力が適切であり得る。本発明は、水と同様の粘度であるが表面張力を変化させた液体の分配も提供する。こうした液体の例は、界面活性剤を溶かした水である。こうした液体は、気体との接触時に発泡し易いことがある。従って、本発明は、容器の出口における液体の圧力とデバイス内の圧力との差を、液体がヘッドスペースから排出される前にウェルをほぼ満たすことを、こうした発泡が妨げないような差にする、ということをもたらす。本発明のデバイス、システム、及び方法は、ＰＣＲの用途に特に適している。従って、本明細書で用いるように、ウェルをほぼ満たす液体を参照する「液体」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、酵素、蛍光染料、ｄＮＴＰ，ＰＣＲ混合物のうちの１つ以上を含む、ほぼ水性の溶液、乳液、等を記述するために使用することがある。
【００３４】
本発明の方法はさらに、デバイスのウェル間の流体連通を封止するステップを含むこともできる。こうしたステップは、デバイスのウェルをほぼ満たした後に実行することが好ましい。液状シーラントをヘッドスペース内に分配することができる。この液状シーラントは、硬化して（プレポリマーのような）固体になることのできる材料、あるいは（油のような）液体のままであることのできる材料を含むことができる。好適例では、このシーラントはＰＤＭＳプレポリマーを含むことができる。このシーラントをヘッドスペース内に導入するのに適した手段が多数存在することは明らかである。こうした手段の１つはシリンジであり、これにより、液状シーラントに正圧を加えてヘッドスペース内に押し込む。こうした好適例では、ヘッドスペース内の圧力は、正圧を加える前の液状シーラント内の圧力とほぼ同じであることが好ましい。封止する前のヘッドスペース内の圧力は、９５〜１０５ｋＰａの範囲内であることがより好ましく、約１０１．３ｋＰａであることが最も好ましい。シーラントをヘッドスペース内に供給するのに適した他の手段は、ウェル内に分配する液体上にシーラントを層状化することによるものであり、これにより、一旦、ウェル内への分配用の液体が全部容器を出ると、シーラントが容器から流出して、減圧手段の影響下でヘッドスペースを満たす。こうした効果は、減圧手段の慎重な調整によって達成することができる。例えば、一旦、シーラントの一部が容器を出てヘッドスペースを満たすと、減圧手段をヘッドスペースとの流体連通から分離することができ、従って、ヘッドスペース内のシーラントにもはや、追加的な力を加えない。
【００３５】
本発明のデバイスのカバーは、本発明の方法の実行に続いて、ベース部材から除去することが好ましい。このカバーを除去する１つの理由は、デバイスの１つ以上のウェルから試料を取り出すことができるようにするためである。本発明の一部の好適例では、ヘッドスペースに硬化ポリマーを充填する場合に、試料をウェルから除去するために、ポリマーシールに穴を開ける必要があり得る。こうした好適例では、針（ニードル）が、ポリマーシールに穴を開けるのに適切したアイテムである。この針をシリンジに結合して、ウェルから溶液を回収することができる。
【００３６】
以下、図面及びいくつかの例を参照ながら本発明を説明する。以下の説明の特異性は、本発明の以上の説明の一般性に優先するものではないことは明らかである。以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明のデバイスの透視図である。図に示すように、このデバイスは、カバー、３つの出口流路及び１つの入口流路、及び格子パターンのアレイ状に配置された、ほぼ均等な比率の１００個のウェルを備えている。
【図２】本発明のデバイスの側断面図の概略表現であり、ヘッドスペースはベース上を覆うカバープレートによって規定される。
【図３】本発明のシステムの側断面図の概略表現である。
【図４】本発明による方法の４つのステップ（ステップＡ〜ステップＤ）を概略表現する図である。
【図５】試料装填、ウェル分離、及びシールプロセスの上面画像列である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
図１は本発明のデバイス１０１の一実施例の図表示である。特に、ベース部材２は、アレイ形式の複数のウェル４、入口流路６、及び３つの出口流路８を備えている。各流路はベース部材２の樹脂内に向けて開口し、具体的には、ベース部材２を占めるウェルのアレイの隅部にある樹脂の所で開口し、各流路は、このアレイのエッジに直交し、このエッジを通ってアレイ樹脂内に入る。本発明のデバイスの一部の実施例では、入口流路６及び／または出口流路８の流路の高さは、ウェルの上を覆う空間の高さより小さくすることができる。入口流路６の断面積が、出口流路８のそれぞれの断面積よりも大きいことが好ましい。この関係は図１においてより明らかにわかる。さらに図１に見られるように、各流路の流体軸は、デバイスの対向するエッジ上の流路の入口または出口の方向性に対してオフセットしている。理論にとらわれることを望まずに、この構成は、本発明の方法の実行中に、ヘッドスペースの排液の前にウェルをほぼ満たすことを促進するものと考えられる。図１は、ベース部材２全体にわたるウェル４の好適な分布も示す。
【００３９】
図２は本発明のデバイスの好適な実施例の側断面の概略図である。この図では、入口流路６と出口流路８とが直接対向して見えるが、図に示す実際のデバイスでは、これらの流路は図１に示すようにオフセットしている。この図は、本実施例の構成要素の層状化を示すことを意図している。特に、図２は、成型したポリマー部材１６とガラス板１８との間に形成された複合ベース部材を示す。このように形成された複合ベース部材は、ポリマー部材１６自体よりも剛性がある。事前に作製したポリマーチップの１つ以上のウェル４内に、化学物質及び／または生体物質（生物材料）を装填することができる。次に、成型したポリマー部材１６及びウェル４上をカバープレート１で覆い、これによりヘッドスペースを規定する。入口流路６は、液体がデバイスの外部の空間からヘッドスペース及びウェル内に移動することを可能にする。出口流路８を真空源（図示せず）の下において、液体をヘッドスペース２４内に引き込み、過剰な液体をヘッドスペースから除去することを可能にすることができる。
【００４０】
図３は、本発明のシステムの略図である。この図では、入口３２及び出口３４を備え、液体３６を含む容器３０が、バルブ３８に結合されている。管４０は、バルブ３８を、デバイス１０１の入口６に結合する。デバイス１０１は筐体４６内に位置し、筐体４６は実質的な真空を形成することを可能にする。筐体４６はバルブ４８に結合され、バルブ４８は、真空ポンプ５０とハウジング４６との間の流体連通に対する制御を可能にする。使用中には、真空ポンプ５０はハウジング４６内に減圧領域を生成する。この減圧領域は吸引力に変換され、バルブ３８の開放時に、この吸引力は、管４０及び入口６を通して液体３６をデバイス１０１に引き込んで、ウェル４に充填する。この減圧は、過剰な液体をヘッドスペース２４から引き出すことも可能にする。
【００４１】
図４に、本発明の方法の一実施例を示す。ステップＡでは、ウェル４及びヘッドスペース２４を有するデバイス１０１が筐体４６内に含まれる。デバイスは、液体３６を含む容器３０に結合されている。この容器は、その最上端にある開口（入口）３２、及び閉じたバルブ３８に結合された開口（出口）３４を有し、バルブ３８は、容器から流出する液体及び／または気体の流れを調整することができる。筐体４６は出口バルブ４８に結合され、出口バルブ４８を用いてチャンバ内の圧力を調整し、この圧力は真空６８によって変化する。開位置にあるバルブ４８、及び閉位置にあるバルブ３８により、筐体４６内の圧力を約０．２〜１．０ｋＰａの間に低減する。ステップＢでは、容器外に流出する液体の流れを調整するバルブ３８を開放して、液体が容器から移動してウェル４及びヘッドスペース２４を満たすことを可能にする。ステップＣでは、一旦、液体が容器からほぼ排出されると、気体がアパーチャ３２から容器を通り、そして開放されたバルブを通って移動し始め、これによりデバイスのヘッドスペースに入る。ウェル内の液体３６は、ヘッドスペース内への気体の移動にほとんど影響されない。前にヘッドスペースを満たしていた液体は、チャンバ６６内に排出される。ステップＤでは、閉位置にあるバルブ４８により、第１容器を除去し、ＰＤＭＳプレポリマーのようなシーラントとして作用するのに適した材料８５を含む第２容器８４に置き換える。正圧下で、このシーラントは第２容器からヘッドスペース２４に押し出される。その後に、このデバイスをチャンバから除去し、このシーラント材料が硬化して実質的な固体材料になるのに十分な条件下に、十分な時間だけ置く。このようにして、ウェル４内の液体が、デバイスの熱サイクル中の二次汚染及び蒸発のような悪影響から保護される。
【００４２】
図５に、試料装填、ウェル分離、及び封止プロセスの上面画像列を示す。画像フレーム１〜３はステップＢのプロセスを示し、画像フレーム４〜６はステップＣのプロセスを示し、そして画像フレーム７〜９はステップＤのプロセスを示す。各画像フレームの詳細な説明は次の通りである：フレーム１：ＰＣＲ試料を装填する前に、チップが真空エンクロージャ内に配置されている。ウェルの一部には、青色染料が事前装填され、ウェルの表面上で乾燥する。フレーム２〜３：ヘッドスペース及びウェル内に確立された真空によって駆動されて、液体試料がヘッドスペース内に高速で注入され、ピンチバルブを開放した後に一瞬にして再分配され、ヘッドスペース及びウェルを満たす。フレーム４〜５：液体試料の直後に空気が後続し、過剰な液体をヘッドスペースから通気流路を通してパージ（追放）し、一瞬にして、すべてのウェルを互いに分離したままにする。その後に、真空を遮断する。フレーム６：乾燥した染料の再懸濁がウェルに青色を与え、３つの青色文字「ＮＴＵ」をウェルマトリクス内に示し、残りのウェルは透明なままである。このことは、目に見える二次汚染がウェル間に存在しないことを示す。フレーム７〜９：シーラント（ＰＤＭＳプレポリマー）を管からヘッドスペース内に注入し、すべてのウェルを封止する。
【００４３】
（例）
（例１）
ＰＣＲデバイスの構成
５×５ｃｍある最大面を有し、各々の寸法が０．５×０．５×０．５ｍｍの１００個のウェルを有するデバイスの例は、次のように用意される。ＰＤＭＳシルガード(Sylgard)（登録商標）シリコーンエラストマ１８４と、シルガード（登録商標）硬化剤１８４（米国ミシガン州ミッドランドにあるDow Coming社製）とを１０対１の割合で混合することによって、液状プレポリマー（２ｍＬ）を調合し、１５０ｒｐｍの磁性攪拌器（マグネチックスターラー）によりビーカー内で１時間攪拌して均質にする。ＰＤＭＳプレポリマーをウェル及び流路の逆形状を有する金属ダイ（マイクロ放電加工したステンレス鋼）の表面に塗布し、この液状プレポリマーを真空下で２０分脱ガス（脱気）する。その後に、平坦な表面を有する他の金属ブロックを、このＰＤＭＳプレポリマー上に配置し、このアセンブリ全体を８０℃にして２時間加熱する。ナノウェル及びマイクロ流路を有するＰＤＭＳの複製層をモールド（型）から慎重に取り外し、その後に、厚さ２μmの液状ＰＤＭＳのスピンコート層を接着層として用いて、このポリマーの平面を、酸洗浄した厚さ０．１ｍｍのホウケイ酸ガラス基板（ドイツ国ハンブルグ市にあるHerenz Medizinalbedarf社製)に接着する。このアセンブリを接着層と共に８０℃にして２時間で硬化させ、このＰＤＭＳ層を上記ガラス基板に永久的に接着する。
【００４４】
複数の遺伝子のＰＣＲ分析のために、核酸プライマー対を含むプライマー溶液を多数のウェルに手作業で装填する。次に、デバイスを８０℃で１０分間加熱して、ウェル内部に事前装填されたプライマー液から大部分の水を蒸発させる。これらのプライマー組は、凍結乾燥（フリーズドライ）プロセスによって、あるいは室温で乾燥させることもできる。最後に、厚さ０．１ｍｍの酸洗浄したホウケイ酸ガラスカバープレート（ドイツ国ハンブルグ市にあるHerenz Medizinalbedarf社製）をウェル上に配置し、液状ＰＤＭＳを用いてＰＤＭＳマトリクスチップに接着してヘッドスペースを規定し、包囲さたマイクロ流路を形成する。
【００４５】
（例２）
二次汚染（クロスコンタミネーション）
ウェルをほぼ満たすプロセス中には、ウェル内に事前装填された化学物質の二次汚染は無視できることが実証されている。この関係では、１００個の等容積のウェルを備えたデバイス内の所定数のウェルに、青色染料を含む溶液を事前装填した。その後に、この溶液をデバイスのウェルから蒸発させた。本発明の方法による真空によって駆動して、ヘッドスペースを適切に排液する前に、ウェル及びヘッドスペースに、青色染料に適した溶液である液体を充填した。基本的に青色染料の全部が、この青色染料を事前装填された各ウェル内に残っていることが観測された。
【００４６】
二次汚染が無視できることの発見をさらに検証するために、他のデバイスの選択した数のウェルに、ＦＡＭフルオロフォア（蛍光色素分子）（５’−(６ＦＡＭ)−ＴＣＧ ＴＧＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＧ）の標識を付けた塩基長２０ｍｅｒの精製されたオリゴヌクレオチド（プライマー）を事前装填した。次に、この溶液を蒸発させた。本発明の方法により、ウェルにＰＣＲ混合物を充填し、このＰＣＲ混合物は、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のTriton Ｘ−１００、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２Ｕ／μＬのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（米国マディソン市にあるPromega社製）、及びテンプレート（鋳型）としてのｐＧＥＭ−３Ｚベクター内にクローン化された０．０１ｎｇ／μＬのＳＡＲＳ ＤＮＡを含む。蛍光顕微鏡を用いて、標識を付けたオリゴヌクレオチドの、事前装填したウェルから事前装填していないウェルへの移動が存在しないだけでなく、標識を付けたオリゴヌクレオチドの拡散速度が低速であることが観測された。さらに、２７９秒間室温においた後に、標識を付けたオリゴヌクレオチドはウェル内の溶液の総体積中に拡散していなかった。
【００４７】
（例３）
リアルタイムＰＣＲ法
本発明のデバイス、システム及び方法を、リアルタイムＰＣＲの分野に適用した。合計１００個のウェルを備えた本発明のデバイスの２２個のウェルに、プライマー対を含む溶液を事前装填し、残りの７８個のウェルは空のままにした。その後に、この溶液を蒸発させ、乾燥したプライマー対を残した。フォワードプライマーとリバースプライマーのシーケンスは、５’−ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＧＴ ＴＡＣ−３’(２４ｍｅｒ)、及び５’−ＣＡＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＣＧ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＴＡ−３’（２１ｍｅｒ)とした。本発明による方法を用いて、デバイスのウェルに、固定濃度のＤＮＡテンプレート（鋳型）を含むＰＣＲ混合物を充填した。このＰＣＲ混合物は、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のTriton Ｘ−１００、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２Ｕ／μＬのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（米国マディソン市にあるPromega社製）、１．５μg/μＬのＢＳＡ、２Ｘ ＳＹＢＲ Green Ｉ（米国メイン州にあるCambrex Biosciences社製)、及びテンプレートとしてのｐＧＥＭ−３Ｚベクター中にクローン化した０．０１ｎｇ／μＬのＳＡＲＳ ＤＮＡのＢＮＩ−１フラグメント（残留物質）（１８９ｂｐ（塩基対））を含む。このＰＣＲ混合物は、上記乾燥させたプライマー対を溶解し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の０．３μＭの最終濃度を与えた。その後に、デバイスのヘッドスペースに液状ＰＤＭＳ液を充填し、デバイスのウェル間の流体連通を除去した。
【００４８】
次に、デバイスに連結した熱電加熱器（ヒータ）／冷却器（クーラ）（ＴＥＣ：Thermoelectric Heater/Cooler）（米国ニュージャージー州のトレントン市にあるMelcor社製）を用いて、デバイスに熱サイクルを施した。このＴＥＣ上にＲＴＤ（Resistive Temperature Detector：抵抗温度検出器）を装着して温度を測定し、フィードバック制御用に使用した。次の熱サイクルプロファイルを用いた：９５℃、６０秒間の初期変性に続き、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１５秒間のアニール加熱、及び７２℃、１５秒間の延長を４０サイクル行う。リアルタイムＰＣＲ機器の光学器は、ＤＮＡ挿入染料であるＳＹＢＲ Green Ｉの蛍光を測定するように設計され、ＳＹＢＲ Green Ｉ染料の蛍光は、すべてのＰＣＲサイクルの延長ステップで測定した。ＳＹＢＲ Green Ｉフルオロフォア（蛍光色素分子）は、青色ＬＥＤ（英国カンブリア州にあるMarl International社製）のアレイを使って励起し、４５°の角度でＰＣＲデバイスの平面に固定し、検出ユニットの光路上の励起光の干渉を防止する。青色ＬＥＤアレイからの励起光（４８０ｎｍで強度ピークを有する）及びチップからの放射光は共に、それぞれ４６５〜４９５ｎｍ及び５１５〜５５５ｎｍのバンドパスフィルタ（米国ブラトルバラにあるChroma Technologies社製)を用いてフィルタ処理した。チップ全体の蛍光画像は、冷却したＣＣＤカメラ（イタリアのピサ市にあるＤＴＡ社製）によって捕捉した。ＰＤＭＳデバイス内の２２個のウェルからのテンプレートの、３×１０7個のコピーを増幅するための閾値サイクル（Ｃｔ）は、約１１サイクルであるものと決定された。２２個のウェル内のテンプレートＤＮＡの３×１０7個のコピーを増幅するためのＣｔ値は、チップ全体を通して一貫している。
【００４９】
本明細書中の、先行文献（またはそれから派生した情報）あるいは既知の事項の参照は、これらの先行文献（またはそれから派生した情報）あるいは既知の事項が、本明細書に関係する試みの分野における共通の一般的知識を形成することの認識、了解、または何らかの示唆として解釈されず、また解釈すべきでない。
【００５０】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、特に断りのない限り、「備える」及び「備えている」のような変形は、記載した数またはステップ、あるいは数またはステップのグループを含むが、それ以外の数またはステップ、あるいは数またはステップのグループを排除しないことを、暗に意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェル内に液体を分配するデバイスにおいて、
ａ）前記複数のウェルを有するベースと、
ｂ）前記ベースを覆って前記ウェル上にヘッドスペースを規定し、前記ウェルが前記ヘッドスペース内に向けて開口するためのカバーと、
ｃ）前記ヘッドスペース内に前記液体を供給して、前記ウェル内に前記液体を分配するための少なくとも１つの入口と、
ｄ）前記ヘッドスペースと流体連通して前記ヘッドスペースから過剰な液体を除去するための、及び／または、前記ヘッドスペースと連通して前記ヘッドスペースに減圧を加えるための、少なくとも１つの出口と
を備えていることを特徴とする液体分配デバイス。
【請求項２】
前記出口の各々に減圧を加えることが、前記ヘッドスペースから過剰な液体を引き出すように作用するように、前記デバイスが構成されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ベースが複数の要素で構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ベースが、ポリマー材料及び実質的な剛体材料で構成されていることを特徴とする請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ポリマー材料がポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記実質的な剛体材料がガラスであることを特徴とする請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
前記カバーが実質的な剛体材料で構成されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カバーがガラス板を含むことを特徴とする請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記入口の各々が、前記ベース内に配置されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記入口の各々が、前記カバー内に配置されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１１】
前記出口の各々が、前記ベース内に配置されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記カバープレートを前記ベース上に配置する前に、前記デバイスの前記ウェルの１つ以上に、１つ以上の物質が事前装填されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１３】
前記物質が化学物質または生体物質であることを特徴とする請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記物質が核酸プライマー対を含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記デバイスは、光が前記ウェルに入ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１６】
前記デバイスは、光が前記ウェルから出ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記デバイスは、４６５ｎｍ〜４９５ｎｍの範囲内の波長の光が前記ウェルに入ることを可能にするように構成され、５１５ｎｍ〜５５５ｎｍの範囲内の波長の光が前記ウェルから出ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用され、前記ウェルの２つ以上に異なる核酸プライマー対が事前装填され、前記分配する液体が、ＤＮＡテンプレートのような核酸を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１９】
複数のウェル内に液体を分配するシステムにおいて、
ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載のデバイスと、
ｂ）分配される液体を含む容器であって、この容器から前記ヘッドスペースへの液体の流れを制御するためのバルブ手段を介して、前記入口の各々に接続された容器と、
ｃ）前記出口の各々に減圧を加える手段と
を備えていることを特徴とする液体分配システム。
【請求項２０】
さらに、封止することのできる、前記デバイス用のハウジングを備えていることを特徴とする請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記容器が、実質的に大気に向けて開放された入口を有することを特徴とする請求項１９または２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記減圧を加える手段が、ポンプを含むことを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のシステム。
【請求項２３】
さらに、前記ウェルが、前記容器に含まれる前記液体でほぼ満たされ、過剰な前記液体が前記出口の各々を通って除去された後に、前記デバイスの前記ヘッドスペース内に第２の液体を注入する手段を備えていることを特徴とする請求項１９〜２２のいずれかに記載のシステム。
【請求項２４】
前記第２の液体が、それぞれの前記ウェル内の前記液体を封止するシーラントとして作用することを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記シーラントが、液状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはその前駆物質であることを特徴とする請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれかに記載のデバイス、または請求項１９〜２５のいずれかに記載のシステムを使用する方法において、前記出口の各々に減圧を加えて、前記液体を前記入口の各々から前記ヘッドスペース内に引き込んで前記ウェル内に分配するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２５のいずれかに記載のシステムを使用する方法において、
ａ）前記出口の各々に減圧を加えて、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェル内の圧力を、前記容器の前記出口における前記液体の圧力以下にするステップと、
ｂ）前記バルブ手段を開放し、これにより、前記容器内の前記液体が前記容器を出て、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェルに入るステップと、
ｃ）前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェル内の圧力を低減する手段を、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェルとの流体連通から分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
ステップｂ）の後に、さらに、前記圧力を低減する手段の影響下で、前記ヘッドスペースから過剰な前記液体を引き出すステップを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）の後に、さらに、前記圧力を低減する手段の影響下で、前記容器から前記デバイスの前記ヘッドスペース内に気体が流入することを可能にするステップを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、
ｄ）液状シーラントを含む容器を前記デバイスの入口に結合するステップと、
ｅ）前記液状シーラントに圧力を加え、これにより、前記液状シーラントが前記容器から前記デバイスの前記ヘッドスペースに流れるステップと
を含むことを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項３２】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項１９に記載のシステム。
【請求項３３】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項２６または２７に記載のシステム。
【請求項１】
複数のウェル内に液体を分配するデバイスにおいて、
ａ）前記複数のウェルを有するベースと、
ｂ）前記ベースを覆って前記ウェル上にヘッドスペースを規定し、前記ウェルが前記ヘッドスペース内に向けて開口するためのカバーと、
ｃ）前記ヘッドスペース内に前記液体を供給して、前記ウェル内に前記液体を分配するための少なくとも１つの入口と、
ｄ）前記ヘッドスペースと流体連通して前記ヘッドスペースから過剰な液体を除去するための、及び／または、前記ヘッドスペースと連通して前記ヘッドスペースに減圧を加えるための、少なくとも１つの出口と
を備えていることを特徴とする液体分配デバイス。
【請求項２】
前記出口の各々に減圧を加えることが、前記ヘッドスペースから過剰な液体を引き出すように作用するように、前記デバイスが構成されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ベースが複数の要素で構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ベースが、ポリマー材料及び実質的な剛体材料で構成されていることを特徴とする請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ポリマー材料がポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記実質的な剛体材料がガラスであることを特徴とする請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
前記カバーが実質的な剛体材料で構成されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記カバーがガラス板を含むことを特徴とする請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記入口の各々が、前記ベース内に配置されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記入口の各々が、前記カバー内に配置されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１１】
前記出口の各々が、前記ベース内に配置されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１２】
前記カバープレートを前記ベース上に配置する前に、前記デバイスの前記ウェルの１つ以上に、１つ以上の物質が事前装填されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１３】
前記物質が化学物質または生体物質であることを特徴とする請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記物質が核酸プライマー対を含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記デバイスは、光が前記ウェルに入ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１６】
前記デバイスは、光が前記ウェルから出ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記デバイスは、４６５ｎｍ〜４９５ｎｍの範囲内の波長の光が前記ウェルに入ることを可能にするように構成され、５１５ｎｍ〜５５５ｎｍの範囲内の波長の光が前記ウェルから出ることを可能にするように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用され、前記ウェルの２つ以上に異なる核酸プライマー対が事前装填され、前記分配する液体が、ＤＮＡテンプレートのような核酸を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１９】
複数のウェル内に液体を分配するシステムにおいて、
ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載のデバイスと、
ｂ）分配される液体を含む容器であって、この容器から前記ヘッドスペースへの液体の流れを制御するためのバルブ手段を介して、前記入口の各々に接続された容器と、
ｃ）前記出口の各々に減圧を加える手段と
を備えていることを特徴とする液体分配システム。
【請求項２０】
さらに、封止することのできる、前記デバイス用のハウジングを備えていることを特徴とする請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記容器が、実質的に大気に向けて開放された入口を有することを特徴とする請求項１９または２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記減圧を加える手段が、ポンプを含むことを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のシステム。
【請求項２３】
さらに、前記ウェルが、前記容器に含まれる前記液体でほぼ満たされ、過剰な前記液体が前記出口の各々を通って除去された後に、前記デバイスの前記ヘッドスペース内に第２の液体を注入する手段を備えていることを特徴とする請求項１９〜２２のいずれかに記載のシステム。
【請求項２４】
前記第２の液体が、それぞれの前記ウェル内の前記液体を封止するシーラントとして作用することを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記シーラントが、液状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはその前駆物質であることを特徴とする請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれかに記載のデバイス、または請求項１９〜２５のいずれかに記載のシステムを使用する方法において、前記出口の各々に減圧を加えて、前記液体を前記入口の各々から前記ヘッドスペース内に引き込んで前記ウェル内に分配するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２５のいずれかに記載のシステムを使用する方法において、
ａ）前記出口の各々に減圧を加えて、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェル内の圧力を、前記容器の前記出口における前記液体の圧力以下にするステップと、
ｂ）前記バルブ手段を開放し、これにより、前記容器内の前記液体が前記容器を出て、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェルに入るステップと、
ｃ）前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェル内の圧力を低減する手段を、前記デバイスの前記ヘッドスペース及び前記ウェルとの流体連通から分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
ステップｂ）の後に、さらに、前記圧力を低減する手段の影響下で、前記ヘッドスペースから過剰な前記液体を引き出すステップを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）の後に、さらに、前記圧力を低減する手段の影響下で、前記容器から前記デバイスの前記ヘッドスペース内に気体が流入することを可能にするステップを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、
ｄ）液状シーラントを含む容器を前記デバイスの入口に結合するステップと、
ｅ）前記液状シーラントに圧力を加え、これにより、前記液状シーラントが前記容器から前記デバイスの前記ヘッドスペースに流れるステップと
を含むことを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項３２】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項１９に記載のシステム。
【請求項３３】
上述した例及び／または図面のいずれかを参照して、実質的に以上に記載されている請求項２６または２７に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５０６９９８（Ｐ２０１１−５０６９９８Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９３９２（Ｐ２０１０−５３９３９２）
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００８／０００４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７８８１２
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５１０１６８４９４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００８／０００４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７８８１２
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５１０１６８４９４）
【Ｆターム（参考）】
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