新規筋成長調節因子
本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、プロモータ配列、この配列を含んでなる構成物、および筋成長を調節し、かつ筋成長に付随する疾患を治療するための組成物を含む新規筋成長調節因子を提供する。本発明は、変化した筋肉量を有する動物の識別における本配列の使用、および変化した筋肉量を有する動物を生産する選択的繁殖プログラムをも提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、筋成長の調節に関与する新規タンパク質、および筋成長の調節または促進ならびに筋成長または筋消耗に付随する病状の治療における新規タンパク質の使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
筋組織は大きな多核細胞を含んでなる。これら細胞の大部分、およそ３分の２は筋原線維、または収縮単位である。筋原線維はミオシン細フィラメントおよびアクチン細フィラメントである。
【０００３】
筋細胞の発達は筋芽または前駆細胞で開始する。筋芽は分化および融合過程を受けて筋管を形成し、そしてそれがさらに分化して筋線維になる。
【０００４】
タンパク質ミオスタチン（または成長分化因子８）は、筋成長および発展の調節における主要な因子として同定されている。ミオスタチンは筋成長を負に調節することが示された（非特許文献１）。ミオスタチンにおける１１ｂｐの欠失が畜牛におけるベルギーブルー（またはダブル筋肉（double-muscled））表現型をもたらすことが明らかにされている。ベルギーブルー牛は２０％〜３０％の筋肉量の増加を有する。
【０００５】
ミオスタチンが筋成長を遅らせる役割を果たす正確な機序は依然として不明である。
【０００６】
長期の不使用（例えば、ベッド休養、宇宙飛行）の期間中、または筋消耗疾患（例えば、筋ジストロフィー）の場合、骨格筋は萎縮するが、これは主に筋タンパク質の増大した分解およびタンパク質合成の削減による。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは筋ジストロフィーの最も一般的な形態の１つである。筋線維は壊死し、その再生能を失う。最近、ｍｄｘマウスのデュシェンヌ型ジストロフィーモデルにおいて、線維症だからなおさら衛星細胞の完全な消耗により筋肉が再生不能であることが明らかにされている。サルコペニアは、正常な老化に付随する筋肉量および能力の減少である。
【０００７】
骨格筋は依然として自己再生能を有するが、老齢筋における環境は筋衛星細胞活性、増殖、および分化に対して支持的ではない。
【０００８】
多くの成長因子、例えばＩＧＦ、ＨＧＦ、およびＦＧＦが生後骨格筋成長および発達の調節に関与している。骨格筋の発達に対してミオスタチン（ＧＤＦ−８）よりも強力な悪影響を有する成長因子は知られていない。ミオスタチンまたは成長および分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、マウスにおいて最初に特徴づけられた。ミオスタチン−ヌルマウスは、劇的に増大した筋の発達を示し、体重が野生型マウスの２〜３倍になった。筋肉量の増加は、筋過形成および肥大によるものであることが示された。これらのデータは、ミオスタチンが筋肉量の制御において重要な役割を有し、かつミオスタチンが筋成長の強力な負の調節因子であることを示す。
【０００９】
したがって、筋成長を促進することが可能である因子を含む、筋成長の調節に関与する別の因子を同定することが有利であろう。現在まで、筋成長を調節することが可能である別の因子は同定されていない。
【非特許文献１】Kambadur et. al. 1997
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、筋成長の促進に関与するポリペプチドの同定に基づく。この筋成長プロモータは「マイティー（ｍｉｇｈｔｙ）」と呼ばれている。マイティーという語は、本発明による新規筋成長プロモータに言及する本明細書の全体を通じて使用される。
【００１１】
本発明は、マイティータンパク質をコードするＤＮＡおよび対応するマイティー遺伝子プロモータの同定にも基づく。
【００１２】
本発明は、配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をも提供する。ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３から選択される配列を含む。
【００１４】
本発明は、
ａ）配列番号１または配列番号３の相補体と、
ｂ）配列番号１または配列番号３の逆相補体と、
ｃ）配列番号１または配列番号３の逆配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドをも提供する。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、サイレント置換または結果として生じるアミノ酸における同類置換をもたらす置換の結果として配列番号１または配列番号３と異なるヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。少なくとも１つのポリペプチド、またはそれらの断片を含んでなる融合タンパク質も提供される。
【００１７】
本発明は、本発明の配列を含んでなる１つもしくはそれ以上のベクター、およびかかるベクターを有する１つもしくはそれ以上の宿主細胞をも提供する。このベクターは、５’−３’方向において、ａ）遺伝子プロモータ配列と、ｂ）本発明によるポリヌクレオチドと、ｃ）遺伝子末端配列とを含んでなる。このポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス方向でありうる。
【００１８】
本発明は、筋成長を調節するための組成物をも提供する。
【００１９】
１つの態様において、組成物は、
ａ）配列番号１または配列番号３を含んでなるポリヌクレオチドと、
ｂ）（ａ）の断片もしくは変種と、
ｃ）（ａ）との少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチドと、
ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つによってコードされたポリペプチドと、
ｈ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチドと、
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の断片もしくは変種と、
ｊ）（ｇ）または（ｈ）に関して少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチドと
のいずれか１つを含む。
【００２０】
もう１つの態様において、組成物は、配列番号５の配列、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を含むマイティー遺伝子プロモータを含んでなりうる。
【００２１】
別の態様において、組成物は、マイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質活性のモジュレータを含みうる。
【００２２】
マイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質活性のモジュレータは、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５と、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種と
のいずれか１つから選択されるポリヌクレオチドに特異的に結合しうる。
【００２３】
マイティー遺伝子発現のモジュレータはアンチセンスポリヌクレオチドでありうる。マイティー発現のモジュレータは干渉ＲＮＡ分子でもありうる。具体的には、マイティー遺伝子発現のモジュレータはＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子でありうる。
【００２４】
モジュレータはミオスタチンまたはミオスタチンの模倣剤でもありうる。模倣剤はアミノ酸位置３３０と３５０において、またはその間でＣ末端切断されたミオスタチンペプチドでありうる。切断は３３０、３３５、または３５０のいずれか１つにおいてである。
【００２５】
別の態様において、本発明の組成物は筋成長に付随する疾患の治療または予防において使用されうる。この疾患は筋萎縮をもたらしうる疾患でありうる。この疾患は、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択されうる。組成物は筋損傷後の筋再生の促進においても使用されうる。
【００２６】
本発明は、本発明による組成物を使用する、筋成長の調節または促進の方法、損傷後の筋成長または筋再生に付随する疾患の治療または予防をも提供する。この方法を使用し、増加した筋肉量を有する動物を生産しうる。
【００２７】
本発明の組成物は、筋成長を調節するための医薬品の製造、損傷後の筋成長または筋再生に付随する疾患の治療または予防においても使用されうる。
【００２８】
本発明は、本発明による組成物でトランスフェクトされたトランスジェニック動物をも提供する。トランスジェニック動物は、増加した筋肉量を有する動物をもたらしうる。トランスジェニック動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択されうる。
【００２９】
本発明は、動物における筋肉量を予測する方法であって、
ｉ）動物からサンプルを得る工程と、
ｉｉ）配列番号１または配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１または配列番号３との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定し、または配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種の量を測定する工程と、
ｉｉｉ）遺伝子発現レベルまたはポリペプチドの量を平均と比較する工程と、
ｉｖ）前記動物の筋肉量を予測する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００３０】
遺伝子発現のレベルはＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して測定されうる。ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を使用して測定されうる。
【００３１】
別の態様において、本発明はマイティーの変種を検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５と、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種と
から選択されるヌクレオチド配列の使用を含んでなり、
前記マイティーの変種に対する生物からのサンプルをスクリーニングする方法を提供する。
【００３２】
マイティーの変種は多型、特に単一ヌクレオチド多型でありうる。マイティーの変種は変化した筋表現型とも関連しうる。
【００３３】
本発明は動物の筋肉量を改善する方法であって、
ｉ）本発明による筋肉量の増加を有することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を選択する工程と、
ｉｉ）増加した筋肉量を有することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を繁殖し、改善された筋肉量を有する動物を生産する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００３４】
本発明による動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択されうる。
【００３５】
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体をも提供する。
【００３６】
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体の製造における配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチドの抗原断片の使用をも提供する。
【００３７】
本発明は、マウスマイティー遺伝子のプロモータ領域を含んでなる配列番号５の配列番号、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをも提供する。
【００３８】
断片は、マイティー開始部位の上流の少なくとも２００のヌクレオチドを含んでなり、かつマイティー開始部位の上流の２０９、２８７、３１５、４００、６００、１０００、および２１００のヌクレオチドのいずれか１つの断片を含んでなりうる。
【００３９】
本発明は、配列番号５のポリヌクレオチドを含んでなる１つもしくはそれ以上のベクター、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種、およびかかるベクターを含有する１つもしくはそれ以上の宿主細胞をも提供する。
【００４０】
本発明は、筋成長の抑制または促進において潜在的に有用である１つもしくはそれ以上の化合物のスクリーニングのための方法であって、
ｉ）配列番号５の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を適切なマーカー遺伝子に結合した適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉ）適切な宿主細胞を前記ベクターで形質転換する工程と、
ｉｉｉ）目的とする化合物を前記宿主細胞に投与する工程と、
ｉｖ）前記マーカー遺伝子発現のレベルの差異を測定する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００４１】
ベクターは、適切なベクターを含み、かつ原核細胞プラスミド、真核細胞プラスミド、またはウイルスベクターを含みうる。マーカー遺伝子は、適切なマーカー遺伝子を含み、かつ緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ酵素、またはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４２】
本発明は、筋細胞において所望のタンパク質を発現する方法であって、
ｉ）発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を単離する工程と、
ｉｉ）５’−３’方向で発現されるタンパク質のポリヌクレオチド配列に操作可能に結合された、配列番号５の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉｉ）ベクターを筋宿主細胞へ導入する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００４３】
ベクターは、真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したベクターを含みうる。
【００４４】
宿主細胞は、初代筋芽細胞系、形質転換された筋芽細胞系、またはマイティープロモータが活性である細胞系を含む。宿主細胞は、宿主動物のインビボ骨格または心筋細胞をも含みうる。
【００４５】
宿主動物は、ヒツジ、雌牛、シカ、雄牛、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトを含む。
【００４６】
定義：
「ポリヌクレオチド」という語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のポリマーを意味すると理解すべきであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、および他の既知の形態のポリヌクレオチドのすべてを含む、一本鎖および二本鎖ポリマーを含む。ポリヌクレオチドは、天然起源から単離され、組換えまたは分子生物学的方法を使用して製造され、または合成的に製造されうる。ポリヌクレオチドは、全部の遺伝子またはそれらの一部を含みうるとともに、オープンリーディングフレームを有する必要はない。
【００４７】
本発明によるすべてのポリヌクレオチドの使用は、ありとあらゆるオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームは、当技術分野で周知の方法を使用して確立されうる。これらの方法としては、既知の開始および終止コドンを識別する配列の分析が挙げられる。この機能を実行する多くのコンピュータソフトウェアプログラムが当技術分野で周知である。
【００４８】
「ポリペプチド」という語は、共有結合アミノ酸のポリマーを意味すると理解すべきである。ポリペプチドとしては、天然起源から単離されているポリペプチド、組換え方法によって製造されているポリペプチド、または合成的に製造されているポリペプチドが挙げられる。インビトロで開裂されるリーダーまたはプロ配列を含むポリペプチド、またはリンカーもしくは他の配列を含むポリペプチド、または翻訳後修飾を受けるポリペプチドが、ポリペプチドの定義に入ることが意図されていると理解すべきである。
【００４９】
「断片もしくは変種」という語は、部分的配列、または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドまたは１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失によって修飾されているが、実質的にそれと同じ活性を有する配列を意味すると理解すべきである。
【００５０】
ポリヌクレオチド断片は、厳しい条件下に配列番号３の配列番号１の配列にハイブリダイズするのに十分な長さおよび特異性のポリヌクレオチド断片をも含む。「厳しい条件」の例は、６５℃下５Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳによるプレハイブリダイゼーション、６５℃下５Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一夜のハイブリダイゼーションの実行、各々３０分間、６５℃下１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの２回の洗浄後、やはり各々３０分間、６５℃下０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのさらに２回の洗浄を含む。
【００５１】
ポリペプチド断片は、マイティータンパク質の活性を保持する断片をも含む。この断片は増大活性を有し、したがって、細胞において導入または発現されると、マイティータンパク質活性の増加をもたらす。あるいは、断片は主要な悪影響を有しうる。
【００５２】
「マイティー遺伝子」は、配列番号１または配列番号３によるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１または配列番号３との９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片と定義される。
【００５３】
「遺伝子発現」は、転写の開始、マイティー遺伝子のｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳と定義される。「マイティー遺伝子発現のモジュレータ」は、マイティー遺伝子発現の増加または減少をもたらすことが可能である化合物と定義される。
【００５４】
「マイティータンパク質」は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との９５％、９０％、または７０％の同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種と定義されうる。
【００５５】
「マイティータンパク質活性」は、マイティータンパク質の筋成長を刺激する能力と定義される。
【００５６】
「筋成長」は、筋細胞の分裂および／または分化と定義され、筋前駆細胞の分裂および／または分化を含む。
【００５７】
「マイティータンパク質活性のモジュレータ」は、マイティータンパク質活性を増加または減少させることが可能である化合物と定義される。
【００５８】
「マイティー遺伝子プロモータ」は、配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号５との９５％、９０％、または７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種と定義される。
【００５９】
本発明の別の態様は、ほんの一例として示されている、以下の図面および説明から明らかになるであろう。
【００６０】
（図面の簡単な記載）
ここで本発明を以下の図面を参照してほんの一例として説明する。
図１：ダブル筋肉ウシおよび正常な筋肉ウシからのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。
図２：（Ａ）正常な筋肉ウシ（ｗｔ、レーン１）およびダブル筋肉ウシ表現型（ＢＢ、レーン２）の心組織からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。（Ｂ）ヒツジ骨格筋（レーン４）からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。
図３：（Ａ）および（Ｂ）はマイティープロモータ配列、および同定転写因子結合部位を示す。
図４：筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞増殖におけるマイティーの発現の結果を示す。
図５：ＭＨＣ抗体による対照およびマイティー過剰発現筋管の免疫染色を示す。
図６：（Ａ）細胞領域の定量的画像分析によって測定された活発に成長するＣ２Ｃ１２クローン７および１１およびｌａｃＺ対照の測定を示す。定量的画像分析によって測定された筋管を含有する３核の（Ｂ）前角光散乱（ＦＡＬＳ）を測定するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（クローン７およびクローン１１において見られる右への移動は細胞サイズの増加を示す）および長さ（Ｃ）、幅（Ｄ）および面積（Ｅ）を示す。
【００６１】
図７：（Ａ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で４８、６０、および７２時間培養したことを示す。筋芽を固定し、抗ＭＨＣ抗体を使用して免疫染色し、ジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリンで薄く対比染色した。（Ｂ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２のウェスタンブロット分析を示す図である。筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で０、２４、４８、および７２時間培養した。細胞から抽出した総タンパク質（１５μｇ）を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロースフィルタに移し、マウスモノクローナル抗−ｐ２１、ウサギポリクローナル抗−ＭｙｏＤ、またはマウスモノクローナル抗−ＭＨＣ抗体でプローブした。フィルタもマウスモノクローナル抗−α−チューブリンでプローブし、同等の負荷を明らかにした。
図８：静止および活性化衛星細胞におけるマイティータンパク質の検出を示す図である。静止および活性化衛星細胞からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロース膜に移した。マイティータンパク質をウサギ抗−マイティー抗体で検出した。マイティータンパク質は活性化衛星細胞では検出可能であったが、静止衛星細胞では検出可能ではなかった。
【００６２】
図９：骨格筋再生中のマイティーの発現を示す。ＴＡ筋にノテキシン（Ｎｏｔｅｘｉｎ）を注射して筋損傷を誘発し、損傷後０、１、５、１４、および２８日にマイティーの免疫組織化学のために採集した。（Ａ）０日の非損傷対照ＴＡ筋。（Ｂ）損傷後１日目。（Ｃ）損傷後５日。（Ｄ）損傷後７日。（Ｇ）損傷後２８日。グリーン、マイティー、ブルー、ＤＮＡ。
図１０：梗塞後心組織におけるマイティーの発現を示す。マイティーの免疫組織化学を非梗塞（０日）および梗塞後（２および６日）心組織で行った。（Ａ）非梗塞対照心組織。（Ｂ）梗塞後２日。（Ｃ）梗塞後６日。
図１１：マイティーおよび対照トランスフェクトヒト筋芽におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒト筋芽をマイティー−ｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養した。次いで、免疫組織化学（ＩＣＣ）を筋管におけるミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現について実行した。連続非重複写真を間を置いてウェル全体にわたって撮影し、ＭＨＣ陽性筋管／ウェルの数を計算した。
【００６３】
図１２：（Ａ）筋管当たりの筋核の頻度および（Ｂ）５、６、７、８、および９個の筋核を含有する筋管の幅を示す。ヒト筋芽をマイティー−ｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養し、ＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。５、６、７、８、および９個の筋核（ｎ＝５３）を含有するＭＨＣ陽性筋管をその最も広い幅で測定した。
図１３：馴化培地処理ヒト筋芽における筋核／ＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒト筋芽をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で４８時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。筋核／ＭＨＣ発現筋管の数を顕微鏡視野当たりの５個の筋管で計算した（ｎ＝２４５筋管）。（Ａ）１−３、４−６、および７−９の筋核の筋管の数。（Ｂ）筋核／筋管の平均数。
図１４：８個の筋核を含有する馴化培地処理筋管の幅を示す。ヒト筋芽をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で４８時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。８個の筋核を含有するＭＨＣ陽性筋管（ｎ＝１００）をその最も広い幅で測定した。
【００６４】
図１５：馴化培地処理ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒトＲＤ細胞をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で７２時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。ＭＨＣ陽性筋管／ウェルの数を計算した。
図１６：マウスマイティープロモータがさまざまな細胞系において活性を有することを示す。（Ａ）Ｃ２Ｃ１２筋芽、初代ヒツジ筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）および（Ｂ）ヒトＲＤ（横紋筋肉腫）細胞を一時的に１ｋｂマイティープロモータレポーター構成物で２４時間トランスフェクトした。次いで、これらを成長または分化培地中でさらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性を測定し、共トランスフェクトｐＣＨ１１０からのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に標準化した。
図１７：マイティープロモータが用量依存的にミオスタチンによって阻害されることを示す。方法において記載されているようにＣ２Ｃ１２筋芽を一時的に１ｋｂプロモータでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を成長培地中において組換えミオスタチン４および８μｇ／ｍｌで処理した。細胞を処理の２４時間後に回収した。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。
【００６５】
図１８：ミオスタチン模倣剤がマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を回復しうることを示す。Ｘ軸は、β−ガラクトシダーゼ活性に標準化されたマイティープロモータの相対ルシフェラーゼ活性である。Ｃｔｒｌバーは対照ヒツジ筋芽を示し、ｗｔバーは野生型ミオスタチン（３μｇ）で処理したヒツジ筋芽を示し、３３５バーはミオスタチン模倣剤３３５ １５μｇで処理したヒツジ筋芽を示し、３３５＋ｗｔはミオスタチン３μｇおよびミオスタチン模倣剤１５μｇで処理したヒツジ筋芽を示す。
図１９：マイティー遺伝子の上流断片のプロモータ活性を示す。方法において記載されているように、Ｃ２Ｃ１２筋芽を一時的にプロモータ断片レポーター構成物でトランスフェクトした。次いで、これらを成長または分化培地中でさらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性を測定し、共トランスフェクトｐＣＨ１１０からのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性に標準化した。
図２０：マイティータンパク質に対する抗体の適用を示す。レーンは、Ｍ、マーカー、１、ペプチド特異的マイティー抗体によって認識された精製組換えマウスマイティータンパク質、２、ウシタンパク質抗体によって認識された精製組換えウシマイティータンパク質、３、マイティー発現（使用されたウシタンパク質抗体）に対して誘発されたマイティー発現プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのタンパク質抽出物、および４、マイティー発現プラスミド（非誘発）（使用されたウシタンパク質抗体）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのタンパク質抽出物を示す。
【００６６】
（発明の詳細な記載）
本発明は、筋の発達および再生に関与する新規タンパク質に基づく。このタンパク質は「マイティー」と呼ばれている。
【００６７】
マイティー遺伝子は、ヒツジ（配列番号１）およびウシ（配列番号３）から同定され、クローン化されている。１つの態様において、本発明は、ウシおよびヒツジから単離されたマイティーポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、ヒツジ、配列番号１、およびウシ、配列番号３からの、アンチセンスポリヌクレオチドおよび操作可能なアンチセンス断片を含む、ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００６８】
本発明は、ウシおよびヒツジから単離されたポリペプチド配列を提供する。具体的には、本発明はヒツジ、配列番号２、およびウシ配列番号４からのポリペプチド、ならびに配列番号２および配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、遺伝情報における冗長性の結果として、サイレント置換、または結果として生じるアミノ酸において同類置換をもたらす置換を含みうることが理解されるであろう。さらに、タンパク質の活性を実質的に変化させることがない本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片および変種も意図されている。
【００７０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターをも提供する。ポリヌクレオチド配列を保存、複製、および発現するベクターの使用は当技術分野で公知である。一般に、ベクターは、５’−３’方向において、遺伝子プロモータ配列、本発明によるポリヌクレオチド配列、および遺伝子末端配列を含んでなる。ベクターは、本発明による配列のプラスミドおよび／またはウイルスへの取込みを含み、宿主細胞における配列の導入および／または維持に役立つことが意図されている。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかを含みうる。真核細胞はインビボであり、または初代もしくは形質転換された細胞系でありうる。
【００７１】
マイティータンパク質は、発明者によって、ダブル筋肉ウシ（図１および図２を参照）において高度に発現され、マイティーが筋成長の促進において役割を果たすことが示すことが明らかにされている。マイティーは、筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞の成長を上方調節し、筋成長の促進におけるマイティーの役割を裏付けることも明らかにされている（図４）。マイティーを過剰発現するＣ２Ｃ１２細胞の別の調査は、マイティーが筋細胞における肥大を誘発することを示す。これはマイティーを過剰発現する細胞における核の数の増加（図５）、および細胞サイズの増加（図６）によって示されている。さらに、図７に示されているように、マイティーを過剰発現するＣ２Ｃ１２細胞は対照細胞よりも早期に分化する。初代筋芽（活性化衛星細胞）も衛星（静止細胞）よりも大きなレベルのマイティーを有することが明らかにされている。
【００７２】
これらの結果は、筋の成長および発達におけるマイティーの役割を裏付け、かつマイティーが筋成長および発達を調節または促進するために使用されうることを示す。マイティーは、農業上の利点を有しうる増加した筋肉量を有する動物を生産するための有用な手段を提供する。さらに、マイティーは筋成長に付随する疾患、特に筋萎縮に付随する疾患を治療するための組成物の開発を提供する。かかる疾患としては、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
したがって、筋成長を調節するための組成物が含まれる。「筋成長の調節」は、筋成長および／または発達の速度のあらゆる変化を含むことが意図されており、筋前駆細胞の成長および／または分化を含む。これは、前駆筋細胞が分裂する速度の変化、および／または前駆筋細胞が分化する速度のあらゆる変化を含む。その変化は増加または減少のいずれかでありうる。
【００７４】
かかる組成物は、ヒツジ配列番号１またはウシ配列番号３からの配列、配列番号１または配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種を含む、マイティー遺伝子配列に基づく。この配列は、プロモータ、マイティープロモータ（配列番号５）、または他の適切なプロモータのいずれかの調節下、適切なベクターへの取込みによって細胞へ導入されうる。このプロモータを使用し、マイティータンパク質の発現を誘発し、それによって細胞内の遺伝子発現およびマイティータンパク質活性を増大させることができる。
【００７５】
この組成物は、本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有する配列をも含みうる。配列同一性は、配列を整列し、同一のヌクレオチドの数を測定することによって判定されうる。多くのコンピュータアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムが配列同一性を測定するために周知である。
【００７６】
この組成物は、本発明によるポリヌクレオチドの相補体、逆相補体、またはアンチセンスヌクレオチドをも含みうる。
【００７７】
この組成物は、本発明によるマイティーポリペプチドをも含んでなりうる。このポリペプチドはヒツジ、配列番号２、またはウシ、配列番号４、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種からのものでありうる。
【００７８】
この組成物は、本発明のポリペプチド配列との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有する配列をも含んでなりうる。配列同一性は、配列を整列し、かつ同一の残基の数を測定することによって判定されうる。多くのコンピュータアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムが配列同一性を測定するために当技術分野で周知である。
【００７９】
この筋成長を調節するための組成物は、マイティー遺伝子発現のモジュレータをも含んでなりうる。
【００８０】
この筋成長を調節するための組成物は、マイティータンパク質活性のモジュレータをも含みうる。
【００８１】
マイティー遺伝子発現のモジュレータは、特に本発明によるポリヌクレオチドに結合しうる化合物でありうる。具体的には、かかるマイティー遺伝子発現のモジュレータはマイティー遺伝子プロモータに結合し、それによって遺伝子転写が開始または維持される速度に影響を及ぼしうる。あるいは、それらのプロモータまたは断片を使用し、細胞の天然のプロモータへ特定の変化を導入し、野生型のマイティー遺伝子発現を増強または抑制しうる。変化としては、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含みうる。
【００８２】
マイティー遺伝子発現の別のモジュレータは、遺伝子が発現される速度を直接影響を及ぼすマイティー遺伝子にも結合しうる。
【００８３】
マイティー遺伝子発現の別のモジュレータは、マイティー遺伝子に結合し、変化を配列へ導入することによって、例えば、遺伝子が発現される速度に影響を及ぼし、またはマイティータンパク質活性を変化しうる相同的組換えによって機能しうる。配列の変化としては、ヌクレオチドの変化、挿入、または欠失が挙げられるが、これらは結果として生じるポリペプチドにおけるアミノ酸の変化、挿入、または欠失をもたらす場合ももたらさない場合もある。変化の例としては、切断ポリペプチドが製造されるように末端コドンの挿入、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が変化するように１つもしくはそれ以上のコドンの変化を挙げることができる。あるいは、野生型マイティー遺伝子の部分を削除し、または部分をマイティー野生型遺伝子へ導入する変動がありうる。かかる変化を引き起こす方法が当技術分野で公知である。さらに、かかる変化をマイティー遺伝子へ導入し、次いでマイティー活性における変化を、例えば実施例４に記載されている筋芽増殖アッセイを使用して検査することは当業者の技術範囲内であろう。
【００８４】
マイティー遺伝子発現は、転写および／または翻訳を妨げるポリヌクレオチドを導入することによっても変化されうる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドが導入されうるが、アンチセンス発現ベクター、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド、アンチセンスホスホチオエートオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスポリヌクレオチドの効率を増強する化学的修飾の使用を含む、当技術分野で周知である他の手段を挙げることができる。
【００８５】
アンチセンスポリペプチドが問題のポリヌクレオチドと１００％相補的である必要はないが、アンチセンスポリヌクレオチドが遺伝子に結合し、またはｍＲＮＡが遺伝子発現を阻止するが、実質的に他の遺伝子の発現を阻止することがないことを可能にするのに十分な同一性を有する必要だけはあることが理解されるであろう。５’非翻訳領域を含む、遺伝子に対して相補的であるポリヌクレオチドを使用し、マイティータンパク質の翻訳も阻止しうることも理解されるであろう。同様に、これらの相補的ポリヌクレオチドは１００％相補的である必要はないが、十分にｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻止するが、実質的に他の遺伝子の翻訳を阻止しない必要がある。
【００８６】
遺伝子発現の変調は、当技術分野で周知であるように干渉ＲＮＡ分子の使用をも含んでなり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含みうる。
【００８７】
遺伝子発現の変調は、触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムの使用によっても達成されうる。かかるリボザイムが特定標的ＲＮＡ分子とペアを組むように設計されることは当技術分野で周知である。
【００８８】
遺伝子発現を調節する当技術分野で周知の他の方法を使用し、マイティー遺伝子発現を調節することもできる。
【００８９】
この組成物は、マイティー活性のモジュレータをも含みうる。マイティーのモジュレータはマイティータンパク質の優性阻害突然変異体を含みうる。優性阻害効果は、変異体が野生型タンパク質の生理活動を遮断するように作用する場合に生じる。これは、活性化ではなく、受容体と結合すると同時に、野生型タンパク質を結合から防ぐことによって起こりうる。あるいは、優性阻害は、野生型タンパク質に直接結合し、かつこれを不活性化することによって作用しうる。
【００９０】
したがって、本発明のポリヌクレオチドを使用して適切な組成物を作り出すことができ、またはこれを使用してマイティー遺伝子発現を調節し、それによって筋成長を調節する適切は組成物を設計することができる。かかる方法を使用し、細胞内、例えば、初代または形質転換された細胞系内のマイティー遺伝子発現を調節し、または動物内の筋成長を調節しうる。
【００９１】
本発明の組成物の１つの可能な用途は、筋細胞成長および／または分化を促進または阻害することである。筋細胞は初代または形質転換された細胞系のいずれかであり、または細胞は宿主動物のインビボ細胞でありうる。適切な宿主動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。
【００９２】
本発明の組成物は、筋組織に付随する疾患の治療にも使用されうる。かかる疾患または損傷は、筋ジストロフィー、筋失調、または心筋成長に付随する疾患を含みうる。同様に、この組成物を使用して筋損傷後の筋再生を促進することもできる。
【００９３】
図９に示されているように、マイティー発現は筋損傷後、筋再生中の細胞において増加する。さらに、マイティー発現はヒツジにおける心組織における梗塞後に増加することが明らかにされている（図１０）。これらの結果は、マイティーが筋再生にも関与することを示す。したがって、この組成物は、筋成長に付随する疾患の治療に有用であるだけではなく、損傷後の筋損傷の治療において有用でもある。
【００９４】
図１１〜１５における結果は、本発明の組成物を使用してヒト筋の成長および分化を刺激することができ、さらに本発明のヒト用医学的応用の可能性を裏付けることを示す。
【００９５】
同様に、この組成物を使用してトランスジェニック動物を製造することができうる。この組成物を使用して筋肉量の増加を有するトランスジェニック動物を製造することができうる。適切な動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。多くの方法が、トランスジェニック動物を製造するために当技術分野で周知であり、かつ適切な方法が使用されうる。
【００９６】
本発明の別の用途は動物の筋肉量を予測することでありうる。これを行うために、サンプルが動物から得られる。次いで、サンプルはマイティー遺伝子発現、またはマイティータンパク質のレベルについて分析される。多くの方法が、遺伝子発現またはタンパク質量を測定するために当技術分野で周知である。例えば、遺伝子発現は定量的ＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して分析されうる。タンパク質含量は、ＥＬＩＳＡ［酵素免疫吸着アッセイ］またはウェスタンブロット分析を使用して測定されうる。
【００９７】
次いで、マイティー遺伝子発現、またはマイティータンパク質の量のレベルは平均と比較される。マイティー遺伝子発現の平均レベルは、平均筋肉量の動物のサンプルから得られた平均レベルである。同様に、マイティータンパク質の平均量は平均筋肉量の動物のサンプルにおいて得られたタンパク質の量である。
【００９８】
平均と比較されたマイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質の増加レベルは、動物の筋肉量が平均以上の筋肉量を有することが予測されることを意味する。平均と比較されたマイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質の減少レベルは、筋肉量が平均以下であることが予測されることを意味する。
【００９９】
マイティー遺伝子の自然発生変種が存在しうることが理解されるであろう。かかる変種は、多型、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含みうる。当業者は、本発明の配列を使用し、かかる変種をスクリーニングすることができるであろう。例えば、これらの配列を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用に適切なプライマーを設計し、マイティー遺伝子、またはマイティー遺伝子の断片を増幅し、さまざまな生物におけるかかる変種についてスクリーニングしうる。スクリーニングは、直接シーケンスまたは一本鎖立体構造多型分析（ＳＳＣＰ）などの方法を含みうる。マイティーの変種が生物の変化した筋肉量と関連しうることも理解されるであろう。
【０１００】
マイティー発現のレベルを測定し、または変化した筋肉量と関連したマイティーの変種を検出するための上記の方法を使用し、繁殖プログラムに関与する動物を選定し、増加または減少した筋肉量を有する子孫を生産することができる。
【０１０１】
本発明は、マイティータンパク質に対する抗体をも提供する。本明細書に開示された配列を前提として、当業者はマイティータンパク質に対する抗体を製造することができるであろう。ハイブリドーマ細胞の製造を含む、いかにして抗体が製造されうるかの例は、Ｅｒｙｌ ＬｉｄｄｅｌｌとＣｒｙｅｒ（１９９６年）またはＪａｖｏｉｓ（１９９９年）において見出されうる。抗体の結合ドメインが抗体の定義に含まれることも理解されるであろう。
【０１０２】
実施例１６において概要が示され、かつ図２０に示されているように、ポリクローナル抗体は適切な動物におけるマイティータンパク質の全体に対して生じうる。あるいは、抗原断片を使用し、ペプチドを特異的に生成することができる。これは、本発明による抗体が当技術分野で周知の方法を使用していかに生成されるかを示す。
【０１０３】
かかる抗体を使用し、サンプルにおけるマイティータンパク質を検出、および／または定量化しうる。あるいは、本発明による抗体を使用し、マイティー活性を結合および調節しうる。
【０１０４】
他の型の抗体および結合タンパク質が製造されうること、かつこれらが本発明の一部であることが意図されていることが理解されるであろう。これらは、非哺乳類抗体、例えばサメからのＩｇＮＡＲクラスの抗体、細菌性免疫タンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＩＭＭ７免疫タンパク質、または当技術分野で周知の他のクラスの結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。本明細書に開示された配列を前提として、当業者は、かかるポリペプチドを製造し、あるいは既知の結合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、本発明のポリペプチドに優先的に結合するポリペプチドを得ることができるであろう。
【０１０５】
マウスマイティープロモータも単離され、クローン化されており（配列番号５）、これが本発明の一部をも形成する。本発明は、マウスマイティープロモータを含んでなる１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドをも提供する。マイティープロモータは、配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは誘導体である。
【０１０６】
プロモータ配列の分析、図３は、既知の転写因子結合部位を示す。
【０１０７】
マイティー遺伝子プロモータを含有するベクターは周知の方法を使用して製造されうる。ベクターは、ポリヌクレオチドのプラスミドおよび／またはウイルスへの取込みを含み、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの導入および／または維持を補助することが意図されている。宿主細胞は原核細胞または真核細胞、インビボまたは初代もしくは形質転換された細胞系でありうる。
【０１０８】
図１６に示されているように、マイティープロモータを使用し、ヒトを含むさまざまな細胞系における遺伝子の発現を推進することができる。さらに、図１９に示されているように、マイティー開始部位の上流の２００ヌクレオチドほどの断片が遺伝子発現を推進する能力がある。
【０１０９】
マイティー遺伝子プロモータを使用し、マイティー遺伝子発現の調節に有用でありうる化合物についてスクリーニングすることができ、したがって筋成長の調節に有用でありうる。これを行うには、マイティープロモータを適切なマーカー遺伝子を有する適切な発現ベクターへ配置されうる。「マーカー遺伝子」は、その発現産物が同定かつ定量化されうる遺伝子である。多くの適切なマーカー遺伝子が周知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼを含みうる。
【０１１０】
次いで、ベクターは周知のトランスフェクション方法を使用して適切な宿主細胞へ配置される。適切な宿主細胞は、マイティー遺伝子プロモータが活性化され、発現されるマーカー遺伝子をもたらされる細胞を含んでなり、かつマーカー遺伝子発現産物のレベルが検出されうる。次いで、目的とする化合物は宿主細胞へ適用され、マーカー遺伝子における変化が測定される。
【０１１１】
基線と比較されたマーカー遺伝子発現産物の量における増加は、化合物がマイティー遺伝子プロモータを介して遺伝子発現を増強しており、したがって筋成長の促進に有用でありうることを示す。基線と比較されたマーカー遺伝子産物の量における減少は、マイティー遺伝子プロモータを介して遺伝子発現を阻害しており、したがって筋成長の阻害に有用でありうることを示す。
【０１１２】
図１７に示されているように、この方法を使用し、マイティープロモータがミオスタチンによって調節されることを示しうる。ミオスタチンは筋の既知の負の調節因子であるため、この結果により、さらに筋成長および発達の促進および調節におけるマイティーの活性が裏付けられる。ミオスタチンの優性阻害模倣剤も周知である。国際公開第０１／５３３５０号パンフレット、Ｃ末端切断（位置３３０と３５０との間）ミオスタチンペプチドは結果として、優性阻害効果を有するミオスタチン模倣剤が生じる。図１８に示されているように、ミオスタチン模倣剤３３５（位置３３５で切断）はマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を救うことが可能である。図１７および図１８を組合せて、ミオスタチンおよびミオスタチン模倣剤を使用し、マイティー発現をそれぞれ下方調節または上方調節することができ、したがって本発明による組成物において使用されうるがことが示されている。
【０１１３】
マイティー遺伝子プロモータを使用し、筋細胞における指定遺伝子を発現することもできる。指定遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなり、または他のポリヌクレオチド、例えば、ミオスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドでありうる。これを達成するには、マイティー遺伝子プロモータは、目的とする遺伝子とともに適切なベクターへ挿入される。多くの適切なベクターが当技術分野で周知であり、真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したすべてのベクターを含みうる。
【０１１４】
次いで、ベクターは周知のトランスフェクション方法を使用して適切な宿主細胞へ導入されうる。
【０１１５】
適切な宿主細胞は、マイティープロモータが活性化される筋細胞または哺乳動物細胞でありうる。宿主細胞は、例えば、宿主動物の初代もしくは筋芽細胞系、または形質転換された筋芽細胞、または骨格もしくは心筋細胞を含みうる。
【０１１６】
マイティープロモータが活性であるいかなる宿主動物も使用されうるが、これは例えばヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。
【０１１７】
実施例１：マイティーｃＤＮＡの単離
ＲＮＡ精製：メーカーのプロトコールに従いＴＲＩＺＯＬ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してヒツジおよびウシ骨格筋および心組織サンプルからＲＮＡを精製した。
【０１１８】
マイティーｃＤＮＡの増幅：マイティーｃＤＮＡの増幅を複合型逆転写ＰＣＲにおいて行った。ファーストストランドｃＤＮＡを、メーカーの説明書に従いスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）前増幅キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、５μｇの総ＲＮＡからの逆転写反応混合液２０μｌ中で合成した。増幅に使用されたＰＣＲ条件および特定のプライマーは以下の通りである。
【０１１９】
ヒツジおよび畜牛骨格筋マイティーｃＤＮＡおよびウシ心マイティーｃＤＮＡの増幅をプライマー、すなわち、
順方向プライマー５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ３’ （配列番号６）
逆方向プライマー５’ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴ ３’ （配列番号７）
を使用して行った。
【０１２０】
ＰＣＲを９４℃下に１分間、初期変性とともにＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））存在下に行った。その後、以下の工程、９４℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、および最終延長７２℃で５分間の１サイクルを行った。
【０１２１】
ベルギーブルーおよび正常な筋肉ウシからのマイティー断片のＰＣＲ増幅（図１）。
使用プライマー：
ｂｃｏｏ３２９１ Ｆｗｄ ５’ＴＧＡＡＧＣＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣ３’ （配列番号８）
ｂｃｏｏ３２９１ Ｒｅｖ２ ５’ＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣ３’ （配列番号９）
【０１２２】
ＰＣＲを９４℃下に１分間、初期変性とともにＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））およびＴａｑポリメラーゼの存在下に行った後、９４℃で１５秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の３５サイクル、および最終延長７２℃で５分間の１サイクルを行った。
【０１２３】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で実行し、エチジウムブロマイドで染色し、視覚化した。図１における結果は、マイティーが正常な筋肉ウシと比べダブル筋肉ウシにおいて過剰発現されることを示す。この結果は、マイティーが筋成長の促進に役割を有することを示す。図２の部分Ａは、マイティー遺伝子発現もダブル筋肉ウシの心組織において上方調節されることを示し、マイティーが心筋成長および発達ならびに骨格筋成長および発達を調節することも可能であることを示す。図２の部分Ｂは、ヒツジ骨格筋におけるマイティー発現の存在を示す。
【０１２４】
ＰＣＲ産物の精製：ＰＣＲ反応を０．８％低融点アガロースゲル上で実行し、所望のバンドを含有するゲルを除外した。ゲルからのＤＮＡをウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ調製（ｐｒｅｐｓ）ＤＮＡ精製系（（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製した。
【０１２５】
実施例２：マイティーｃＤＮＡのクローニング
精製ｃＤＮＡをメーカーのプロトコール（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従いｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクターにライゲートした。ライゲーション反応物をメーカーのプロトコールに従いコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファ細菌（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ形質転換した。形質転換された細菌をアンシピリン（５０ｍｇ／リットル）、ＩＰＴＧ、およびＸ−ｇａｌを含有するレノックス（Ｌｅｎｎｏｘ）Ｌブロス（ＬＢ）寒天プレート上にプレーティングした。白色コロニーをＬＢ＋アンピシリン培地に播種し、培養菌を一夜成長させた。プラスミドＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプラスミドキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して培養菌から精製した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で分析した。陽性クローンを正しいサイズの断片によって同定した。陽性クローンをさらなる確認の配列決定のために送った。ヒツジマイティーポリヌクレオチド配列は配列番号１で示されており、対応するポリペプチド配列は配列番号２で示されている。ウシマイティーポリヌクレオチド配列は配列番号３で、対応するポリペプチド配列は配列番号４として示されている。
【０１２６】
実施例３：マウスマイティー安定細胞系の生成
マウスマイティーのＯＲＦを以下のプライマーでＰＣＲ増幅した。
Ｆｗｄ ５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ３’ （配列番号６）
Ｒｅｖ ５’ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴ３’ （配列番号７）
【０１２７】
Ｐｗｏポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、Ｑ溶液（（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、およびマウスＥＳＴクローン（レスジーン（Ｒｅｓｇｅｎｅ））をテンプレートとして、メーカーの推奨に従いＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。すなわち、９４℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、および７２℃で５分間の１サイクル。
【０１２８】
マウスマイティー遺伝子のｃＤＮＡをウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ調製ＤＮＡ精製系（（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって精製し、メーカーのプロトコールによりｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５ＨｉｓＴＯＰＯベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＴＯＰＯ部位へクローン化した。組換えを制限消化によって分析し、陽性組換えを配列決定した。
【０１２９】
マウスマイティー構成物によるＣ２Ｃ１２の安定トランスフェクションのために、Ｃ２Ｃ１２筋芽（１×１０７）を２回、良く冷えた１×ＨＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．７７ｍＭ Ｎａ２ＨＰ４、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（７．１））中で洗浄し、良く冷えた１×ＨＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁し、予冷キュベットギャップ０．４ｃｍ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）に移した。１０μｇの線形化プラスミドＤＮＡを添加した（Ｓｃａ Ｉで線形化）。氷上で５分後、細胞を攪拌によって混合し、２００Ωで設定した抵抗による静電容量９６０μＦでキュベットを０．２４ｋＶでパルスし、時定数は平均３６ｍｓであった。細胞を氷上で１０分間インキュベートし、１０ｃｍ皿上のＤＭＥＭ１０ｍｌの１０％ＦＢＳに移し、上下に粉砕して細胞破片に解体した。次いで、細胞をジェネテシン（６００μｇ／ｍｌ）で選択し、個々のクローンを選択した。トランス遺伝子を発現するクローンをプラスミドにおけるＶ５タグのウェスタンブロットによって同定した。
【０１３０】
実施例４：筋芽増殖アッセイ
アッセイ前に、Ｃ２Ｃ１２細胞（ＹａｆｆｅとＳａｘｅｌ）およびトランスフェクトＣ２Ｃ１２クローンを、ＮａＨＣＯ３（４１．９ｍｍｏｌ／ｌ、シグマ・セル・カルチャー株式会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｔｄ）、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ）、米国）および気体ＣＯ２で緩衝したＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州（ＮＹ）、米国）中で成長させた。フェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をｐＨ指示薬として使用した。ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、１０％胎仔ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ株式会社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）もそうであるように規定通りに培地に添加した。
【０１３１】
細胞増殖アッセイを非コート９６ウェルヌンク（Ｎｕｎｃ）マイクロタイタープレートで行った。Ｃ２Ｃ１２培養物を増殖培地中に３×１０３細胞／ｃｍ２で播種した。２４時間の付着期間後、培地を傾斜し、添加した新鮮増殖培地をプレートに戻した。
【０１３２】
次いで、プレートを３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下にインキュベートした。試験プレートを培地変更後０、２４、４８、および７２時間の時点で固定し、Oliver et al.（1989）の方法によって増殖についてのアッセイを行った。手短に言えば、成長培地を傾斜し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、次いで３０分間、１０％ホルモル食塩水中に固定した。次いで、固定細胞を３０分間、０．０１Ｍホウ酸塩バッファー（ｐＨ８．５）中メチレンブルー１０ｇ／ｌで染色した。過剰染料をホウ酸塩バッファー中での連続４回の洗浄によって除去した。次いで、メチレンブルーを１：１（ｖ／ｖ）のエタノールと１００ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌの添加によって固定細胞から溶出した。次いで、プレートを静かに振り、マイクロプレート光度計（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）モデル３５５０マイクロプレートリーダー、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）によって各ウェルについて６５５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１３３】
図４における結果は、マイティー遺伝子でトランスフェクタした細胞は高い吸光度を有し、正常Ｃ２Ｃ１２細胞と比べより速い成長速度を示したことを示す。この結果は、マイティーが筋芽細胞の成長を上方調節するように作用することを示す。
【０１３４】
実施例５：マイティー誘発肥大
筋形成の促進におけるマイティーの機能を評価するために、マイティーを安定に発現する筋芽を低血清培地で分化させた。ＭＨＣの免疫染色を行って筋管の形態を評価した。
【０１３５】
ＤＭＥＭ２％ウマ血清中で７２時間分化したマイティー過剰発現細胞および親細胞系、Ｃ２Ｃ１２を１回、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで７０％エタノール：ホルムアルデヒド：氷酢酸（２０：２：１）で３０秒間固定し、次いで３回ＰＢＳでリンスした。次いで細胞を１％正常ヒツジ血清（ＮＳＳ）を含有するＴＢＳ中４℃で一夜遮断した。細胞をＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で１時間、初代抗体、１：１００希釈抗ＭＨＣでインキュベートした。細胞を（３×５分）ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で３０分間、二次抗体、１：１００希釈ヒツジ抗マウスＩｇＧでインキュベートした。細胞を前述同様に洗浄し、ＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で３０分間、三次抗体、１：１００希釈ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＲＰＮ１０５１、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））でインキュベートした。次いで、細胞を前述同様に再度洗浄した。ＭＨＣ免疫染色を０．０３７５％ＣｏＣｌ２で強化した３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して視覚化し、次いでジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリンで対比染色し、マウンティングし、写真撮影した。
【０１３６】
図５に示されているように、マイティーの発現は筋核数における増加をもたらし、マイティーが筋細胞における肥大をも促進することを示す。
【０１３７】
実施例６：マイティー誘発肥大の分析
方法：
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２細胞または２つのマイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン、クローン７およびクローン１１を、活発に成長する細胞の分析には１５，０００細胞／ｃｍ２、分化試験の分析には２５，０００細胞／ｃｍ２でパーマノックス（ｐｅｒｍａｎｏｘ）カバースリップ（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上にプレーティングした。
【０１３８】
５％ＣＯ２／３７℃の雰囲気下の２４時間の付着期間後、培地を成長培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）またはＤＭＥＭ／２％ＨＳ（分化培地）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のいずれかに変更し、細胞を６０および７２時間分化させた。細胞を視覚化するために、７０％エタノール２０部／４０％ホルムアルデヒド２部／氷酢酸１部で適切な時点で培養を固定し、次いでジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリン（１：１）で５分間染色した後、１％エオシンで１分間染色した。次いで、カバースリップを１００％エタノール中で脱水し、清掃し、スライドガラス上でＤＰＸを使用して恒久的にマウンティングした。
【０１３９】
ヒト筋芽培養
ヒト骨格筋筋芽をクロネチックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、ケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ニュージャージー州（ＮＪ）、米国から入手した。細胞をメーカーの説明書によりｒｈＥＧＦ、デキサメタゾン、ＦＢＳ、グルチミン、ＧＡ−１０００を含有するＳｋＧＭ−２培地中で規定通りに成長させた。
【０１４０】
トランスフェクションおよび馴化培地実験のために、３０，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞をプレーティングした。２４時間の付着期間後、培養物をマイティー−ｐＣＤＮＡ３および対照ベクターでトランスフェクトし、または馴化培地を受けた。馴化培地は、マイティークローン１１または対照細胞による４８時間の馴化にかけられていたＤＭＥＭ／２％ＨＳで構成された。
トランスフェクションの２４時間後、培地をＤＭＥＭ／２％ＨＳに変更した。培養物を１２、２４、３６、４８時間に２０：２：１の固定剤で固定した。
【０１４１】
Ｃ２Ｃ１２クローンにおける肥大の定量化
オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡に取付けたＳＰＯＴ ＲＴカメラで、ウィンドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）およびマック（Ｍａｃ）用に設計されたＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．５を使用して画像を収集した。活発に成長する細胞については、細胞系当たり４０の無作為に選択された細胞の面積を４０倍の倍率で測定した。筋管については、細胞系当たり４０の無作為に選択された筋管の面積、幅、および長さを測定し、３および４個の核については、それぞれ、やはり４０倍の倍率で測定した。データは平均＋／−標準偏差で表されている。
【０１４２】
ＦＡＣＳ分析
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１、ならびにｌａｃＺ対照Ｃ２Ｃ１２筋芽をＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で１０ｃｍ皿において培養した。細胞をトリプシンを使用して回収した後、遠心分離し、７０％エタノール／ＰＢＳ ８００ｍｌ中に固定した。次いで、固定細胞をＰＢＳ ５０μｌ＋ＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭクエン酸）５００μｌ中に１０分間、室温下に再懸濁した。ＤＮＡ抽出バッファーをＤＮＡ染色バッファー（プロピジウムアイオダイド５０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中ＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅ Ａ５０μｇ／ｍｌ）で置換し、再懸濁細胞に短くボルテックスし、暗所で室温下、３０分間インキュベートした。次いで、べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用するプロピジウムアイオダイド蛍光および前方角光散乱について検査し、細胞周期分析のために、細胞サイズ、およびＤＮＡ含量の測定を、セルフィット（ＣｅｌｌＦｉｔ）ソフトウェア（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【０１４３】
ウェスタンブロット法
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１、ならびにｌａｃＺ発現Ｃ２Ｃ１２筋芽をＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で１０ｃｍ皿において、０、２４、４８、７２、および９６時間の分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）へ変更される前の２４時間培養した。細胞をトリプシン化によって回収し、溶解バッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ−４０、１×プロテアーゼ阻害剤（コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））３００μｌ中に再懸濁した。細胞抽出物を０．５ｍｍの注射針に１０回通過させ、遠心分離し（１０分間１４，０００ｇ）、細胞破片にペレット化し、上清をウェスタンブロット法のために使用した。バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用してタンパク質濃度を測定し、タンパク質１５μｇを４５ｍＡでプレキャストＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−トリスゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で電気泳動させた。次いで、５０−６０Ｖで２時間、Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩ転写系（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用してタンパク質ゲルをトランス・ブロット転写膜（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に移した。次いで、膜を一夜、ＴＢＳＴ中５％ミルク中で遮断した。初代抗体を以下の通りＴＢＳＴ中５％ミルク中で希釈し、すなわち、ｐ２１、精製マウスモノクローナル抗−ｐ２１抗体（ＳＸ１１８、ファルミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の１：４００希釈、ＭｙｏＤ、精製ウサギポリクローナル抗−ＭｙｏＤ抗体（ｓｃ−３０４、サンタ・クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の１：２００希釈、ＭＨＣ、精製マウスモノクローナル抗−ＭＨＣ抗体（ＭＦ−２０、ドナルド・フィッシュマン（Ｄｏｎａｌｄ Ｆｉｓｃｈｍａｎ）博士からの寄贈）、α−チューブリン、精製マウスモノクローナル抗−α−チューブリン抗体（ＤＭ１Ａ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の１：４０００希釈、かつ室温下に３時間インキュベートした。膜を５回、ＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、さらに１時間、室温下に、１：２０００の希釈で抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Ｐ０４４７、ダコ（Ｄａｋｏ））または抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Ｐ０４４８、ダコ（Ｄａｋｏ））を含有するＴＢＳＴ中５％ミルク中でインキュベートした。次いで、膜を５回、ＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、ウェスタン・ライトニング化学発光試薬プラス（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用してＨＲＰ活性を検出した。
【０１４４】
結果：
マイティー過剰発現筋芽および筋管は対照細胞と比べ肥大を示す。
活発に成長するマイティー過剰発現クローンは、対照細胞と比べると肥大していると思われる。定量画像分析を使用すると、活発に成長するマイティー過剰発現クローンは対照細胞よりも著しく大きな面積を有する（図６Ａ）。この結果を裏付けるために、筋芽肥大、または相対細胞サイズを前方角光散乱を使用するフローサイトメトリーによって測定した。この分析により、クローン１１およびクローン７のそれぞれ対照細胞と比べ細胞サイズの増加が明らかにされた（図６Ｂ）。
【０１４５】
分化マイティー過剰発現クローンも対照細胞と比べると肥大していると思われる。肥大に対する説明が筋管により融合された細胞の数の増加でありうるということから、筋管のサイズをマイティー過剰発現クローンと対照細胞との間の同じ数の核と比較する分析を行った。定量画像分析を使用すると、筋管肥大がマイティー過剰発現クローンにおいて明らかであった。３および４個の核を有する筋管の筋管の面積、幅、および長さを比較した。マイティー過剰発現クローンは、３個および４個の核を有する筋管において対照細胞と比べ面積、幅、および長さにおける増加を明らかに示した（図６Ｃ−６Ｅ）。
【０１４６】
マイティー過剰発現クローンは対照細胞よりも早く分化する
マイティー過剰発現クローンの分化表現型は、ＭＨＣに対する免疫細胞化学を使用し、筋管形成を視覚化することによって判定された。マイティー過剰発現クローンを分化培地へ切り替えると、多核筋管が６０時間までにマイティー過剰発現クローンにおいて明らかであると同時に、７２時間まで対照培養において多核筋管が明らかにならない。７２時間までにマイティー過剰発現はほぼ完全に分化したように思われるが、対照細胞は新生筋管のみを形成しているように思われる（図７Ａ）。これらの結果は分化マーカーに対するウェスタンブロット法を使用して裏付けられた。早期、中期、および後期分化マーカーｐ２１、ｍｙｏＤおよびＭＨＣをそれぞれ使用し、筋分化遺伝子発現を調査した（図７Ｂ）。ｐ２１発現はすべての時点で増加し、ｐ２１発現が早期に、かつマイティー過剰発現クローンにおいて相当に発生することを示した。ＭｙｏＤ発現はマイティー過剰発現クローンにおいて早期に増加し、ＭｙｏＤ発現は分化の０、２４、および４８時間の時点で対照細胞と比べ増大した。ＭｙｏＤレベルはすべての細胞系において７２時間までに同等に高かった。ＭＨＣ発現はクローン１１において２４時間までに発生し、４８時間の時点で両方のクローンにおいて高いレベルに発現される。この発現はすべての細胞系において７２時間までに同等である。筋分化マーカーの早期および増加した発現は組織化学的結果と一致している。これらの結果は、マイティーの過剰発現が結果として増強した分化表現型をもたらすことを示す。
【０１４７】
実施例７：筋発達におけるマイティー
方法：
衛星細胞（静止）の単離
衛星細胞（ＳＣ）を４週齢野生型マウスの後肢筋から単離した（パーコール密度遠心分離）。筋を細分化し、０．２％コラゲナーゼ型１Ａで９０分間消化した。細胞を軽度の粉砕によって基底膜より下で放出させ、次いでろ過した（７０μｍ）。次いで、細胞懸濁液を７０％／４０％パーコール勾配ヘオーバーレイし、１，６００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。衛星細胞を含有する７０％と４０％のパーコール溶液間の接触面を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄した。ウェスタンブロット法のためのタンパク質を抽出するために、細胞を溶解バッファーに再懸濁し、０．４５ｍｍゲージ針に通して細胞を溶解した。細胞破片を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、結果として生じるタンパク質溶液を−８０℃で保存した。
【０１４８】
初代筋芽（活性化衛星細胞）の単離
後肢筋を４週齢マウスから除去し、完全に細分化し、ＤＭＥＭ（非血清）中０．２％コラゲナーゼ１Ａで３７℃下、震盪（７０ｒｐｍ）させながら９０分間、消化した。消化物を塊が見えなくなるまで繰り返し１０ｍｌピペットで粉砕した。次いで、懸濁液を１００μｍおよびさらに７０μｍフィルタを通じてろ過した。次いで、ろ過懸濁液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを加熱増殖培地［ＤＭＥＭ、２０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ），１０％ウマ血清（ＨＳ）、１％ニワトリ胚抽出液（ＣＥＥ）］８ｍｌに再懸濁した。この細胞懸濁液を非コート１０ｃｍプレートへ１．５時間、前プレーティングし、次いで１０％マトリゲルプレートに移し、４８時間、３７℃でインキュベートした。４８時間後、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳのいずれかに変更した。細胞を２４時間後に活発に成長する条件下に収集した。ウェスタンブロット法のためのタンパク質を抽出するために、細胞を溶解バッファーに再懸濁し、０．４５ｍｍゲージ針に通して細胞を溶解した。細胞破片を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、結果として生じるタンパク質溶液を−８０℃で保存した。
【０１４９】
マイティーのウェスタン分析
プレキャストポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮｕＰａｇｅ４−１２％Ｂｉｓ−トリス）をタンパク質分離のために使用した。タンパク質１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％）によって分離し、エレクトロブロット法によってニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜上に存在するタンパク質をポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓ染料を使用して検出し、負荷でも確実に発生させた。膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中で３時間、室温（ＲＴ）でインキュベートし、非特異的抗体結合を遮断した。次いで、膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中ウサギ抗体１：５０００希釈で４℃下に一夜、静かに震盪させながらインキュベートした。抗体インキュベーション間に膜を５回それぞれ５分ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、ニトロセルロース膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））１：２０００希釈にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギで１時間インキュベートした。ＨＲＰ活性をＥＣＬ試薬（ウェスタン・ライトニング・ケミルミネセンス試薬プラス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ）で検出した。
【０１５０】
結果：
マウス衛星細胞におけるマイティーの発現
マイティータンパク質発現のパターンを判定するために、総タンパク質を静止衛星細胞、活発に成長する筋芽から抽出した。マイティータンパク質発現レベルをウェスタンブロット法によって分析した（図８）。静止衛星細胞ではマイティータンパク質発現が検出されなかった。しかし、活発に成長する筋芽（活性化衛星細胞）ではマイティータンパク質が検出された。
【０１５１】
実施例８：筋再生におけるマイティー
方法：
ノテキシン誘発再生
６週齢野生型マウスをケタミン／ロンプン（塩酸ケタミン１００ｍｇ／ｍｌ、塩酸キシラジン２０ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ／６ｇｍ体重）で腹腔内注射によって麻酔した。毛皮を右前脛骨（ＴＡ）筋上部位から切取り、小切開を筋上で行った。１００μｌ注射器（ハミルトン社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．）を使用し、１０μｌ中ノテキシン（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ ｓｃｕｔａｔｕｓ ｓｃｕｔａｔｕｓ）（ベノム・サプライズ（Ｖｅｎｏｍ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ Ｐｔｙ株式会社（Ｌｔｄ．）、Ｔａｎｕｎｄａ、南オーストラリア州（Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔ）０．１μｌを右ＴＡへ注射した。切開をミシェル（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ）クリップで閉鎖した。ＣＯ２窒息による損傷後各々の日にマウスを安楽死させた後、頸椎脱臼を行った。左右のＴＡ筋を注意深く別々にし、秤量して免疫組織化学分析用に処理した。
【０１５２】
マイティーの免疫組織化学
マウスＴＡ筋およびヒツジ心組織を単離し、ＯＣＴ中に埋込み、液体窒素で冷蔵したイソペタン中に凍結した。低温切開片を１０μｍで切断し、スライドを使用するまで−２０℃で凍結した。切片をＰＢＳ、０．１％トリトンＸ−１００中に３０分間、室温で透過化し、ＰＢＳ、１０％正常ロバ血清、１％ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００中１：１００希釈における初代抗マイティー抗体で一夜、４℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回４分の洗浄後、スライドをＰＢＳ、５％正常ロバ血清、１％ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００中で１時間インキュベートし、二次抗体の非特異的結合を削減した。切片をビオチニル化抗ウサギ二次抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国）で１：３００希釈で１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片を最後にストレプトアビジン−コンジュゲートアレクサ フルオル（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）４８８標識三次抗体（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、米国）で１時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩素酸塩、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、米国）で対比染色し、ＤＡＫＯ蛍光マウント培地にマウンティングし、マイティー発現について分析した。対照片を初代抗体またはウサギ対照ＩｇＧのいずれかでインキュベートし、次いで上述した通り処理した。
【０１５３】
結果：
マウスＴＡ筋再生中のマイティーの発現
野生型マウスにおける筋再生中のマイティーの発現を調査するために、ノテキシンの右前脛骨（ＴＡ）筋への注射によって損傷を誘発した。注射後さまざな日にマウスを安楽死させ、ＴＡ筋を収集した。マイティー発現のパターンを判定するために、免疫組織化学を行った（図９）。損傷後１日目、筋線維の完全性への広範囲の損傷が認められたが、マイティー発現のレベルにおける変化は確認されなかった。５日までにマイティー発現レベルは０日と比べ実質的に増加し、レベルのピークは損傷後７日目であった。２８日までのマイティー発現のレベルは、対照、非損傷筋と同等であった。
【０１５４】
実施例９：ヒツジにおける梗塞後心組織におけるマイティーの発現
方法：
ヒツジ心における心筋梗塞をＳｈａｒｍａら、１９９９年に記載された公開された方法によって誘発した。心組織を０日（非梗塞）、および梗塞後２日、および６日に収集した。マイティー発現のパターンを判定するために、筋再生実施例（実施例８）に記載されている通り心組織切片で免疫組織化学を行った。
【０１５５】
結果：
非梗塞心組織ではマイティーの発現は一様であり、心筋細胞を取囲む間質内に位置した細胞に限定されていた。マイティーは心筋細胞によって発現されるようにも思われなかった。梗塞後２日のマイティーの発現は、対照心臓におけるものと類似していた。梗塞後６日までに主に梗塞域内の浸潤細胞の数における実質的な増加が認められた。マイティーの発現は壊死性心筋の部位に最も近く位置した浸潤細胞に限定されていた。浸潤細胞が生存心筋に隣接した場合、発現レベルは対照と同様に残存した。梗塞部位より遠位の浸潤細胞はマイティーを発現することはなかった（図１０）。
【０１５６】
壊死性心筋における間質線維芽細胞および浸潤細胞のマイティーの存在により、マイティーが治癒の過程に関与していることが裏付けられる。
【０１５７】
実施例１０：ヒト筋芽の分化および肥大に対するマイティーの効果
結果：
マイティーでトランスフェクされたヒト筋芽における分化の増加
ヒト筋芽における分化に対するマイティー過剰発現の効果を判定するために、ヒト筋芽をマイティーｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化培地で１２時間培養した。分化筋管の数を測定するために、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）特異的抗体を使用する免疫組織化学を行った。分化条件下の１２時間後、ＭＨＣ陽性筋管の数は、対照筋芽と比べマイティートランスフェクトヒト筋芽において多かった（図１１）。
【０１５８】
マイティーでトランスフェクトされたヒト筋芽の肥大
ヒト筋芽をマイティーｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養した。肥大を判定するために、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）特異的抗体を使用する免疫組織化学を行い、ＭＨＣ陽性筋管当たりの筋核の数を計算した（図１２Ａ）。結果は、少数のマイティーでトランスフェクトされたヒト筋管が１−３個のみの筋核を含有し、対照と比べ多数の筋管が４−９個の筋核を含有した。ＭＨＣ発現筋管の肥大も５−９個の筋核を含有する筋管の幅を測定することによって評価した（図１２Ｂ）。マイティートランスフェクト筋管の平均幅は対照筋管と比べ大きかった（図１２Ｂ）。
【０１５９】
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理したヒト筋芽の肥大
マイティーによって誘発された加速分化および肥大の現象を明らかにするために、ヒト筋芽を分化条件下、マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞およびＬａｃＺ（対照）Ｃ２Ｃ１２細胞から馴化培地で４８時間培養した。肥大のレベルを上記の通り評価した。マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で培養したヒト筋芽は、対照処理筋芽と比べ、１−５個の筋管のみを有する少数の筋管、および１６−２５個の筋核を有する多数の筋管を含有した（図１３Ａ）。筋核の平均数は、対照と比べマイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理したヒト筋芽において多かった（図１３Ｂ）。
【０１６０】
ＭＨＣ発現筋管の肥大もまた筋管の幅を測定することによって評価した。８個の筋核を含有するＭＨＣ発現筋管を測定した（図１３）。マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理された筋管の平均幅は、対照筋管と比べ大きかった。
【０１６１】
マイティーからの馴化培地で処理されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）における分化の増加
方法：
ヒトＲＤ（横紋筋肉腫）細胞をＡＴＣＣ（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））から得た。ＲＤ細胞を、４１．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３（シグマ・セル・カルチャー株式会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｔｄ）および５％気体ＣＯ２で緩衝したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））におけるアッセイ前に成長させた。７．２２ｎＭフェノールレッド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をｐＨ指示薬として使用した。１×１０５ＩＵ／Ｌペニシリン（シグマ（Ｓｉｇａｍ））１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇａｍ））および１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を培地に添加した。ＲＤ細胞を３０，０００細胞／ｃｍの密度でパーマノックスチャンバースライド上にプレーティングした。２４時間後、それらをヒト筋芽について言及された通り馴化培地（マイティークローン１１）で処理し、細胞を７２時間後に固定した。ＭＨＣの免疫細胞化学を行った。
【０１６２】
結果：
ヒトＲＤ細胞をマイティー馴化培地および対照培地で処理し、７２時間分化させた。細胞をＭＨＣに対して免疫染色し、分化の程度を評価した。ＭＨＣ陽性筋管の数は対照細胞と比べ処理細胞で高く、マイティー過剰発現クローンからの馴化培地が分化を加速しうることを示した（図１５）。
【０１６３】
実施例１１：マウスマイティープロモータのクローニング
方法：
２．１ｋｂの５’上流配列をマウスゲノムＤＮＡおよび以下のプライマーを使用して増幅した。すなわち、
Ｒｅｖ ５’ＡＧＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＴＡ Ｃ ３’ （配列番号１０）
Ｆｗｄ ５’ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ３’ （配列番号１１）
ＰＣＲをＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））およびエキスパンドロングＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、メーカーのプロトコールに従い行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、６８℃で３分間の３５サイクル、および６８℃で７分間の最終伸長の１サイクルであった。
【０１６４】
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分析し、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）精製カラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により精製した。精製ＤＮＡ断片を上述した通りｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクターへクローン化した。陽性組換えを選択し、制限消化およびシークエンシングによって分析した。２．１ｋｂ断片をｐＧＥＭ−ＴイージーベクターからＢｇｌＩＩおよびＮｈｅｌ酵素によってルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３Ｂへのクローニングのために切断した。ｐＧＬ３ＢをＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＬで消化し、２．１ｋｂマイティープライマー断片を、Ｔ４リガーゼを使用してライゲートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファをライゲーション反応物で形質転換し、ＬＢ寒天＋アンピシリンプレート上にプレーティングした。培養物をＬＢ＋アンピシリン培地で成長させ、プラスミドＤＮＡを前述した通り精製した。プラスミドＤＮＡを制限消化によって分析し、陽性組換えを識別した。陽性組換え（２．１構成物）をシークエンシング（配列番号５）によって確認した。トランスフェクション実験のために、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。
【０１６５】
マイティープロモータ配列は配列番号５で示されている。マイティープロモータ配列も既知の転写因子結合部位について分析した（図３）。これらの部位はプロモータ配列の決定的な役割を担っていることを示す。
【０１６６】
実施例１２：ヒトを含むさまざまな細胞系におけるマイティープロモータ活性の実施例
方法：
１ｋｂのマイティー上流配列（２．１ｋｂマイティープロモータの断片）をルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））ヘクローン化した。１ｋｂマイティープロモータ断片を２．１ｋｂプロモータ配列から制限消化によって得た。Ｓｃａ１、ＢｇｌＩＩ消化を２．１マイティープロモータ構成物で行い、〜１ｋｂ断片を切除した。次いで、この断片をルシフェラーゼ発現を推進する正確な方向で多重クローニング部位内のＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ部位へクローン化した。
【０１６７】
このプロモータ構成物２μｇおよびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）発現プラスミドｐＣＨ１１０（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））０．５または１μｇでトランスフェクション効率の標準化のためにトランスフェクションを行った。Ｃ２Ｃ１２筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＲＤ（ヒト横紋筋肉腫細胞系）および初代ヒツジ筋芽をリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００試薬（ＬＦ２０００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、メーカーのプロトコールに従って上記のベクターでトランスフェクトした。手短に言えば、細胞系を適切な成長培地中１５，０００細胞／ｃｍ２で６ウェル細胞培養皿（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上にプレーティングし、トランスフェクション前に５％ＣＯ２中で一夜、３７℃でインキュベートした。構成物をウェル当たり血清を有さないＤＭＥＭ ２５０μｌ中で希釈した。ＬＦ２０００をウェル当たり血清を有さないＤＭＥＭ ２５０μｌ中５−８μｌで希釈した。次いで、希釈ＤＮＡおよびＬＦ２０００を混合し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ＬＦ２０００混合物を適切な成長培地２ｍｌ中細胞を含有するウェルに添加した。細胞系をトランスフェクション混合物で３７℃下、５％ＣＯ２で一夜インキュベートし、その後に培地を成長または分化培地のいずれかで置換した。次いで、細胞をウェル当たりＰＢＳ５ｍｌ中で２回リンスし、レポーター溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））３００−５００μｌで溶解した。細胞溶解物１０μｌを使用し、メーカーのプロトコールによりルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してルシフェラーゼ活性を検出した。細胞溶解物５０μｌを使用し、メーカーのプロトコールによりレポーター溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））とともにβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステムを使用してβ−ｇａｌアッセイを行った。ルシフェラーゼ値をβ−ｇａｌ値に標準化し、トランスフェクション効率のために標準化した。
【０１６８】
結果：
マウスマイティー上流配列１ｋｂをさまざまな細胞系へトランスフェクトした。これらにはＣ２Ｃ１２筋芽、初代ヒツジ筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（図１６Ａ）およびヒトＲＤ細胞（図１６Ｂ）が含まれる。マウスマイティープロモータは、これら細胞系のすべてにおいて強い活性を示した。したがって、マイティープロモータは、異なる組織型およびヒトを含む種由来の細胞系において強い発現を示す。
【０１６９】
実施例１３：ミオスタチンによるマイティープロモータの用量依存阻害。
方法：
Ｃ２Ｃ１２筋芽におけるマイティープロモータのトランスフェクションの方法は、ミオスタチンタンパク質でトランスフェクトされた細胞の処理を除き上述した通りであった。トランスフェクションの２４時間後、成長培地中組換えミオスタチン４および８μｇ／ｍｌで細胞を処理した。細胞を処理の２４時間に回収した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を上記の通り判定した。
【０１７０】
結果：
１ｋｂマウスマイティープロモータをＣ２Ｃ１２筋芽へトランスフェクトし、４および８μｇ／ｍｌの増加する濃度の組換えミオスタチンタンパク質で処理した。１ｋｂマイティープロモータの活性は、ミオスタチンタンパク質４および８μｇ／ｍｌ（それぞれ、３９．２３＋／−０．９９％および５８．２２＋／−１．００％）の存在下に阻害される。さらにミオスタチンの濃度を増加することによりマイティープロモータは増加範囲に阻害された（図１７）。したがって、ミオスタチンは用量依存的にマイティープロモータを阻害する。
【０１７１】
実施例１４：ミオスタチン模倣剤（３３５）はマイティープロモータに対するミオスタチンの効果を救援する
ヒツジ衛星細胞のトランスフェクト
ヒツジ衛星細胞を上述した通りＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで成長させた。細胞を２４ウェルプレートにおいて１ｋｂマウスマイティープロモータ構成物０．４μｇおよびｐＣＨ１１０（ＳＶ４０β−ガラクトシダーゼ対照ベクター、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））０．１μｇでリポフェクタミン２０００を使用し、メーカーの説明書（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従いトランスフェクトした。２４時間後、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋３μｇ／ｍｌ野生型組換えミオスタチンまたは３３５（１５ｍｇ）もしくはミオスタチンおよび３３５に変更した。培地変更の２４時間後、細胞抽出物を作り、ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を確立されたプロトコールに従い行った。β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイをプロトコール（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従い行った。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。
【０１７２】
結果
ヒツジ芽を１ｋｂマイティープロモータおよびβ−ガラクトシダーゼベクターでトランスフェクトし、ミオスタチンまたはミオスタチン模倣剤もしくは両方で処理した。図１８に示されているように、野生型ミオスタチンによる治療とともにマイティープロモータ活性の３３％の阻害が確認された。細胞をミオスタチンと５モル過剰の３３５で処理した場合、ミオスタチンの優性阻害模倣剤のマイティープロモータ活性のわずか１９％の阻害が確認された。したがって、優性阻害ミオスタチン模倣剤３３５は、マイティープロモータのミオスタチン介在阻害を救援しうる。
【０１７３】
実施例１５：マイティープロモータの切断分析
方法：
マイティー０．６ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．４ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＣＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．３１５ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．２８７ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．２０９ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。これらの切断をルシフェラーゼ発現を推進させる正しい方向でｐＧＬ３ｂのＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位へクローン化した。
【０１７４】
結果
マイティープロモータ断片（０．２ｋｂ〜２．１ｋｂ）をＣ２Ｃ１２筋芽へトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。図１９（ＡおよびＢ）に示されている結果は、プロモータ活性が３００ｂｐ〜１ｋｂのマイティープロモータで最大であることを示す。１ｋｂ〜２．１ｋｂのプロモータ活性におけるわずかな減少があるように思われる。
【０１７５】
実施例１６：マイティー抗体製造
方法
完全長ウシマイティータンパク質に対するポリクローナル抗体がウサギにおいて引き起こす。メーカーのプロトコールに従い、最初にウシマイティーｃＤＮＡをｐＲＳＥＴ Ｂベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化し、最後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ｓｔａｒ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ形質転換した。組換えタンパク質の発現を０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、インキュベーションを２時間半継続することによって誘発した。細菌を遠心分離によって収集し、溶解バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭトリスｐＨ８．１、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）４０ｍｌ中に再懸濁し、次いで超音波で分解した。溶解物を１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、組換えタンパク質をＮｉ−アガロース親和性プロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して上清から精製した。断片をプールし、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５％グリセロールを含有する５０ｍＭトリスｐＨ８．０の２つの変更に対し９０分間４℃で透析した。精製マイティータンパク質をフロイントアジュバントで乳化し、各ウサギ（３４１ ｇ／ウサギ）へ注射した。その後、１７０ ｇマイティータンパク質／注射を含有する２つの追加抗原投与量を各ウサギに投与した。
【０１７６】
接種ラビットからの血液を収集し、４℃で１５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を血塊から分離した。プロテインＡアガロース２．５ｍｌを使用し、カラムをパックして抗体のＩｇＧ画分を精製した。１００ｍＭトリスｐＨ８．０ ２５ｍｌでカラムを洗浄した。血清のｐＨを１／１０容積の１．０Ｍトリス（ｐＨ８．０）および血清５．５ｍｌで調整し、カラムに通した。回収画分をカラムに再び通した。次に、カラムを１００ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）２５ｍｌで洗浄した。第２の洗浄を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）２５ｍｌを使用して行った。抗体を１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を使用して溶出した。溶出物を１Ｍトリス（ｐＨ８．０）５０μｌを含有する管に収集し、静かに混合した。免疫グロブリン含有画分をタンパク質推定用のブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を使用して同定した。
【０１７７】
ペプチド特異的マイティー抗体
１８マーマイティーペプチド（１７３−１９０ＡＡ）に対する抗体がＱＥＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社（Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国によって発明者の規格で生じた。
【０１７８】
ウェスタンブロット法
ウェスタンブロット分析を行い、完全長ウシマイティータンパク質および１８マーマイティーペプチド（１７３−１９０）に対して生じた抗体を検証した。具体的には、組換えウシマイティータンパク質または精製組換えマイティータンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質抽出物を、メーカーの説明書に従い、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ゲルで分解した。マイティータンパク質抗体をウェスタンブロット法には１：１０，０００で使用したが、ペプチド抗体には１：５０００希釈を使用した。
【０１７９】
結果
ペプチドとマイティータンパク質抗体の両方は、具体的には、ウェスタンブロットでの３５ｋＤａタンパク質バンドである予想サイズを認識し、これらの抗体がマイティータンパク質に特異的であることを裏付けた（図２０）。
【０１８０】
前記の説明では参照が整数または既知の等効物を有する成分に行われており、かつかかる等効物は本明細書で個別に記載されたように組込まれている。
【０１８１】
本発明は実施例として、かつその可能な実施形態を参照して説明されているが、その改良および修正がその範囲を逸脱することなく行われうることを理解すべきである。
【０１８２】
文献：
Eryl Liddell, J. and Cryer, A. (1996) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies. Wiley.
Javois, Lorette C. (1999) Immunocytochemical Methods and Protocols. Humana Press.
Kambadur, R., Sharma, M., Smith, T.P.L. and Bass, J.J. (1997) Mutations in myostatin (GDF-8) in doubled muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle. Genome Res. 7. 910 916.
Michael P. Spiller, Ravi Kambadur, Ferenc Jeanplong, Mark Thomas, Julie K.
Martyn,,John J. Bass and Mridula Sharma (2002). Myostatin is a downstream target gene of basic helix loop helix transcription factor, MyoD. Mol & Cellular Biology 22: 7066-7082.
Oliver, M. H., Harrison, N. K., Bishop, J. E., Cole, P. J. and Laurent, G. J. (1989). A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. Journal of Cell Science 92, 513-518.
Yaffe, D. and Saxel, O. (1977). Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 270, 725-727.
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】ダブル筋肉ウシおよび正常な筋肉ウシからのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図２】（Ａ）正常な筋肉ウシ（ｗｔ、レーン１）およびダブル筋肉ウシ表現型（ＢＢ、レーン２）の心組織からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。（Ｂ）ヒツジ骨格筋（レーン４）からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図３】（Ａ）および（Ｂ）はマイティープロモータ配列、および同定転写因子結合部位を示す図である。
【図４】筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞増殖におけるマイティーの発現の結果を示す図である。
【図５】ＭＨＣ抗体による対照およびマイティー過剰発現筋管の免疫染色を示す図である。
【図６】（Ａ）細胞領域の定量的画像分析によって測定された活発に成長するＣ２Ｃ１２クローン７および１１およびｌａｃＺ対照の測定を示す図である。定量的画像分析によって測定された筋管を含有する３核の（Ｂ）前角光散乱（ＦＡＬＳ）を測定するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（クローン７およびクローン１１において見られる右への移動は細胞サイズの増加を示す）および長さ（Ｃ）、幅（Ｄ）および面積（Ｅ）を示す図である。
【図７】（Ａ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で４８、６０、および７２時間培養したことを示す図である。（Ｂ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図８】静止および活性化衛星細胞におけるマイティータンパク質の検出を示す図である。
【図９】骨格筋再生中のマイティーの発現を示す図である。
【図１０】梗塞後心組織におけるマイティーの発現を示す図である。
【図１１】マイティーおよび対照トランスフェクトヒト筋芽におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１２】（Ａ）筋管当たりの筋核の頻度および（Ｂ）５、６、７、８、および９個の筋核を含有する筋管の幅を示す図である。
【図１３】馴化培地処理ヒト筋芽における筋核／ＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１４】８個の筋核を含有する馴化培地処理筋管の幅を示す図である。
【図１５】馴化培地処理ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１６】マウスマイティープロモータがさまざまな細胞系において活性を有することを示す図である。
【図１７】マイティープロモータが用量依存的にミオスタチンによって阻害されることを示す図である。
【図１８】ミオスタチン模倣剤がマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を回復しうることを示す図である。
【図１９】マイティー遺伝子の上流断片のプロモータ活性を示す図である。
【図２０】マイティータンパク質に対する抗体の適用を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、筋成長の調節に関与する新規タンパク質、および筋成長の調節または促進ならびに筋成長または筋消耗に付随する病状の治療における新規タンパク質の使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
筋組織は大きな多核細胞を含んでなる。これら細胞の大部分、およそ３分の２は筋原線維、または収縮単位である。筋原線維はミオシン細フィラメントおよびアクチン細フィラメントである。
【０００３】
筋細胞の発達は筋芽または前駆細胞で開始する。筋芽は分化および融合過程を受けて筋管を形成し、そしてそれがさらに分化して筋線維になる。
【０００４】
タンパク質ミオスタチン（または成長分化因子８）は、筋成長および発展の調節における主要な因子として同定されている。ミオスタチンは筋成長を負に調節することが示された（非特許文献１）。ミオスタチンにおける１１ｂｐの欠失が畜牛におけるベルギーブルー（またはダブル筋肉（double-muscled））表現型をもたらすことが明らかにされている。ベルギーブルー牛は２０％〜３０％の筋肉量の増加を有する。
【０００５】
ミオスタチンが筋成長を遅らせる役割を果たす正確な機序は依然として不明である。
【０００６】
長期の不使用（例えば、ベッド休養、宇宙飛行）の期間中、または筋消耗疾患（例えば、筋ジストロフィー）の場合、骨格筋は萎縮するが、これは主に筋タンパク質の増大した分解およびタンパク質合成の削減による。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは筋ジストロフィーの最も一般的な形態の１つである。筋線維は壊死し、その再生能を失う。最近、ｍｄｘマウスのデュシェンヌ型ジストロフィーモデルにおいて、線維症だからなおさら衛星細胞の完全な消耗により筋肉が再生不能であることが明らかにされている。サルコペニアは、正常な老化に付随する筋肉量および能力の減少である。
【０００７】
骨格筋は依然として自己再生能を有するが、老齢筋における環境は筋衛星細胞活性、増殖、および分化に対して支持的ではない。
【０００８】
多くの成長因子、例えばＩＧＦ、ＨＧＦ、およびＦＧＦが生後骨格筋成長および発達の調節に関与している。骨格筋の発達に対してミオスタチン（ＧＤＦ−８）よりも強力な悪影響を有する成長因子は知られていない。ミオスタチンまたは成長および分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、マウスにおいて最初に特徴づけられた。ミオスタチン−ヌルマウスは、劇的に増大した筋の発達を示し、体重が野生型マウスの２〜３倍になった。筋肉量の増加は、筋過形成および肥大によるものであることが示された。これらのデータは、ミオスタチンが筋肉量の制御において重要な役割を有し、かつミオスタチンが筋成長の強力な負の調節因子であることを示す。
【０００９】
したがって、筋成長を促進することが可能である因子を含む、筋成長の調節に関与する別の因子を同定することが有利であろう。現在まで、筋成長を調節することが可能である別の因子は同定されていない。
【非特許文献１】Kambadur et. al. 1997
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、筋成長の促進に関与するポリペプチドの同定に基づく。この筋成長プロモータは「マイティー（ｍｉｇｈｔｙ）」と呼ばれている。マイティーという語は、本発明による新規筋成長プロモータに言及する本明細書の全体を通じて使用される。
【００１１】
本発明は、マイティータンパク質をコードするＤＮＡおよび対応するマイティー遺伝子プロモータの同定にも基づく。
【００１２】
本発明は、配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をも提供する。ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３から選択される配列を含む。
【００１４】
本発明は、
ａ）配列番号１または配列番号３の相補体と、
ｂ）配列番号１または配列番号３の逆相補体と、
ｃ）配列番号１または配列番号３の逆配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドをも提供する。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、サイレント置換または結果として生じるアミノ酸における同類置換をもたらす置換の結果として配列番号１または配列番号３と異なるヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。少なくとも１つのポリペプチド、またはそれらの断片を含んでなる融合タンパク質も提供される。
【００１７】
本発明は、本発明の配列を含んでなる１つもしくはそれ以上のベクター、およびかかるベクターを有する１つもしくはそれ以上の宿主細胞をも提供する。このベクターは、５’−３’方向において、ａ）遺伝子プロモータ配列と、ｂ）本発明によるポリヌクレオチドと、ｃ）遺伝子末端配列とを含んでなる。このポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス方向でありうる。
【００１８】
本発明は、筋成長を調節するための組成物をも提供する。
【００１９】
１つの態様において、組成物は、
ａ）配列番号１または配列番号３を含んでなるポリヌクレオチドと、
ｂ）（ａ）の断片もしくは変種と、
ｃ）（ａ）との少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチドと、
ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つによってコードされたポリペプチドと、
ｈ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチドと、
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の断片もしくは変種と、
ｊ）（ｇ）または（ｈ）に関して少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチドと
のいずれか１つを含む。
【００２０】
もう１つの態様において、組成物は、配列番号５の配列、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を含むマイティー遺伝子プロモータを含んでなりうる。
【００２１】
別の態様において、組成物は、マイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質活性のモジュレータを含みうる。
【００２２】
マイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質活性のモジュレータは、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５と、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種と
のいずれか１つから選択されるポリヌクレオチドに特異的に結合しうる。
【００２３】
マイティー遺伝子発現のモジュレータはアンチセンスポリヌクレオチドでありうる。マイティー発現のモジュレータは干渉ＲＮＡ分子でもありうる。具体的には、マイティー遺伝子発現のモジュレータはＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子でありうる。
【００２４】
モジュレータはミオスタチンまたはミオスタチンの模倣剤でもありうる。模倣剤はアミノ酸位置３３０と３５０において、またはその間でＣ末端切断されたミオスタチンペプチドでありうる。切断は３３０、３３５、または３５０のいずれか１つにおいてである。
【００２５】
別の態様において、本発明の組成物は筋成長に付随する疾患の治療または予防において使用されうる。この疾患は筋萎縮をもたらしうる疾患でありうる。この疾患は、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択されうる。組成物は筋損傷後の筋再生の促進においても使用されうる。
【００２６】
本発明は、本発明による組成物を使用する、筋成長の調節または促進の方法、損傷後の筋成長または筋再生に付随する疾患の治療または予防をも提供する。この方法を使用し、増加した筋肉量を有する動物を生産しうる。
【００２７】
本発明の組成物は、筋成長を調節するための医薬品の製造、損傷後の筋成長または筋再生に付随する疾患の治療または予防においても使用されうる。
【００２８】
本発明は、本発明による組成物でトランスフェクトされたトランスジェニック動物をも提供する。トランスジェニック動物は、増加した筋肉量を有する動物をもたらしうる。トランスジェニック動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択されうる。
【００２９】
本発明は、動物における筋肉量を予測する方法であって、
ｉ）動物からサンプルを得る工程と、
ｉｉ）配列番号１または配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１または配列番号３との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定し、または配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種の量を測定する工程と、
ｉｉｉ）遺伝子発現レベルまたはポリペプチドの量を平均と比較する工程と、
ｉｖ）前記動物の筋肉量を予測する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００３０】
遺伝子発現のレベルはＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して測定されうる。ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を使用して測定されうる。
【００３１】
別の態様において、本発明はマイティーの変種を検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５と、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体と、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体と、
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種と
から選択されるヌクレオチド配列の使用を含んでなり、
前記マイティーの変種に対する生物からのサンプルをスクリーニングする方法を提供する。
【００３２】
マイティーの変種は多型、特に単一ヌクレオチド多型でありうる。マイティーの変種は変化した筋表現型とも関連しうる。
【００３３】
本発明は動物の筋肉量を改善する方法であって、
ｉ）本発明による筋肉量の増加を有することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を選択する工程と、
ｉｉ）増加した筋肉量を有することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を繁殖し、改善された筋肉量を有する動物を生産する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００３４】
本発明による動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択されうる。
【００３５】
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体をも提供する。
【００３６】
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体の製造における配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチドの抗原断片の使用をも提供する。
【００３７】
本発明は、マウスマイティー遺伝子のプロモータ領域を含んでなる配列番号５の配列番号、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをも提供する。
【００３８】
断片は、マイティー開始部位の上流の少なくとも２００のヌクレオチドを含んでなり、かつマイティー開始部位の上流の２０９、２８７、３１５、４００、６００、１０００、および２１００のヌクレオチドのいずれか１つの断片を含んでなりうる。
【００３９】
本発明は、配列番号５のポリヌクレオチドを含んでなる１つもしくはそれ以上のベクター、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種、およびかかるベクターを含有する１つもしくはそれ以上の宿主細胞をも提供する。
【００４０】
本発明は、筋成長の抑制または促進において潜在的に有用である１つもしくはそれ以上の化合物のスクリーニングのための方法であって、
ｉ）配列番号５の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を適切なマーカー遺伝子に結合した適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉ）適切な宿主細胞を前記ベクターで形質転換する工程と、
ｉｉｉ）目的とする化合物を前記宿主細胞に投与する工程と、
ｉｖ）前記マーカー遺伝子発現のレベルの差異を測定する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００４１】
ベクターは、適切なベクターを含み、かつ原核細胞プラスミド、真核細胞プラスミド、またはウイルスベクターを含みうる。マーカー遺伝子は、適切なマーカー遺伝子を含み、かつ緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ酵素、またはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４２】
本発明は、筋細胞において所望のタンパク質を発現する方法であって、
ｉ）発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を単離する工程と、
ｉｉ）５’−３’方向で発現されるタンパク質のポリヌクレオチド配列に操作可能に結合された、配列番号５の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種を適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉｉ）ベクターを筋宿主細胞へ導入する工程と
を含んでなる方法をも提供する。
【００４３】
ベクターは、真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したベクターを含みうる。
【００４４】
宿主細胞は、初代筋芽細胞系、形質転換された筋芽細胞系、またはマイティープロモータが活性である細胞系を含む。宿主細胞は、宿主動物のインビボ骨格または心筋細胞をも含みうる。
【００４５】
宿主動物は、ヒツジ、雌牛、シカ、雄牛、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトを含む。
【００４６】
定義：
「ポリヌクレオチド」という語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のポリマーを意味すると理解すべきであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、および他の既知の形態のポリヌクレオチドのすべてを含む、一本鎖および二本鎖ポリマーを含む。ポリヌクレオチドは、天然起源から単離され、組換えまたは分子生物学的方法を使用して製造され、または合成的に製造されうる。ポリヌクレオチドは、全部の遺伝子またはそれらの一部を含みうるとともに、オープンリーディングフレームを有する必要はない。
【００４７】
本発明によるすべてのポリヌクレオチドの使用は、ありとあらゆるオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームは、当技術分野で周知の方法を使用して確立されうる。これらの方法としては、既知の開始および終止コドンを識別する配列の分析が挙げられる。この機能を実行する多くのコンピュータソフトウェアプログラムが当技術分野で周知である。
【００４８】
「ポリペプチド」という語は、共有結合アミノ酸のポリマーを意味すると理解すべきである。ポリペプチドとしては、天然起源から単離されているポリペプチド、組換え方法によって製造されているポリペプチド、または合成的に製造されているポリペプチドが挙げられる。インビトロで開裂されるリーダーまたはプロ配列を含むポリペプチド、またはリンカーもしくは他の配列を含むポリペプチド、または翻訳後修飾を受けるポリペプチドが、ポリペプチドの定義に入ることが意図されていると理解すべきである。
【００４９】
「断片もしくは変種」という語は、部分的配列、または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドまたは１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失によって修飾されているが、実質的にそれと同じ活性を有する配列を意味すると理解すべきである。
【００５０】
ポリヌクレオチド断片は、厳しい条件下に配列番号３の配列番号１の配列にハイブリダイズするのに十分な長さおよび特異性のポリヌクレオチド断片をも含む。「厳しい条件」の例は、６５℃下５Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳによるプレハイブリダイゼーション、６５℃下５Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一夜のハイブリダイゼーションの実行、各々３０分間、６５℃下１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの２回の洗浄後、やはり各々３０分間、６５℃下０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのさらに２回の洗浄を含む。
【００５１】
ポリペプチド断片は、マイティータンパク質の活性を保持する断片をも含む。この断片は増大活性を有し、したがって、細胞において導入または発現されると、マイティータンパク質活性の増加をもたらす。あるいは、断片は主要な悪影響を有しうる。
【００５２】
「マイティー遺伝子」は、配列番号１または配列番号３によるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１または配列番号３との９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片と定義される。
【００５３】
「遺伝子発現」は、転写の開始、マイティー遺伝子のｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳と定義される。「マイティー遺伝子発現のモジュレータ」は、マイティー遺伝子発現の増加または減少をもたらすことが可能である化合物と定義される。
【００５４】
「マイティータンパク質」は、配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との９５％、９０％、または７０％の同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種と定義されうる。
【００５５】
「マイティータンパク質活性」は、マイティータンパク質の筋成長を刺激する能力と定義される。
【００５６】
「筋成長」は、筋細胞の分裂および／または分化と定義され、筋前駆細胞の分裂および／または分化を含む。
【００５７】
「マイティータンパク質活性のモジュレータ」は、マイティータンパク質活性を増加または減少させることが可能である化合物と定義される。
【００５８】
「マイティー遺伝子プロモータ」は、配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号５との９５％、９０％、または７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種と定義される。
【００５９】
本発明の別の態様は、ほんの一例として示されている、以下の図面および説明から明らかになるであろう。
【００６０】
（図面の簡単な記載）
ここで本発明を以下の図面を参照してほんの一例として説明する。
図１：ダブル筋肉ウシおよび正常な筋肉ウシからのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。
図２：（Ａ）正常な筋肉ウシ（ｗｔ、レーン１）およびダブル筋肉ウシ表現型（ＢＢ、レーン２）の心組織からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。（Ｂ）ヒツジ骨格筋（レーン４）からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す。
図３：（Ａ）および（Ｂ）はマイティープロモータ配列、および同定転写因子結合部位を示す。
図４：筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞増殖におけるマイティーの発現の結果を示す。
図５：ＭＨＣ抗体による対照およびマイティー過剰発現筋管の免疫染色を示す。
図６：（Ａ）細胞領域の定量的画像分析によって測定された活発に成長するＣ２Ｃ１２クローン７および１１およびｌａｃＺ対照の測定を示す。定量的画像分析によって測定された筋管を含有する３核の（Ｂ）前角光散乱（ＦＡＬＳ）を測定するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（クローン７およびクローン１１において見られる右への移動は細胞サイズの増加を示す）および長さ（Ｃ）、幅（Ｄ）および面積（Ｅ）を示す。
【００６１】
図７：（Ａ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で４８、６０、および７２時間培養したことを示す。筋芽を固定し、抗ＭＨＣ抗体を使用して免疫染色し、ジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリンで薄く対比染色した。（Ｂ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２のウェスタンブロット分析を示す図である。筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で０、２４、４８、および７２時間培養した。細胞から抽出した総タンパク質（１５μｇ）を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロースフィルタに移し、マウスモノクローナル抗−ｐ２１、ウサギポリクローナル抗−ＭｙｏＤ、またはマウスモノクローナル抗−ＭＨＣ抗体でプローブした。フィルタもマウスモノクローナル抗−α−チューブリンでプローブし、同等の負荷を明らかにした。
図８：静止および活性化衛星細胞におけるマイティータンパク質の検出を示す図である。静止および活性化衛星細胞からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロース膜に移した。マイティータンパク質をウサギ抗−マイティー抗体で検出した。マイティータンパク質は活性化衛星細胞では検出可能であったが、静止衛星細胞では検出可能ではなかった。
【００６２】
図９：骨格筋再生中のマイティーの発現を示す。ＴＡ筋にノテキシン（Ｎｏｔｅｘｉｎ）を注射して筋損傷を誘発し、損傷後０、１、５、１４、および２８日にマイティーの免疫組織化学のために採集した。（Ａ）０日の非損傷対照ＴＡ筋。（Ｂ）損傷後１日目。（Ｃ）損傷後５日。（Ｄ）損傷後７日。（Ｇ）損傷後２８日。グリーン、マイティー、ブルー、ＤＮＡ。
図１０：梗塞後心組織におけるマイティーの発現を示す。マイティーの免疫組織化学を非梗塞（０日）および梗塞後（２および６日）心組織で行った。（Ａ）非梗塞対照心組織。（Ｂ）梗塞後２日。（Ｃ）梗塞後６日。
図１１：マイティーおよび対照トランスフェクトヒト筋芽におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒト筋芽をマイティー−ｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養した。次いで、免疫組織化学（ＩＣＣ）を筋管におけるミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現について実行した。連続非重複写真を間を置いてウェル全体にわたって撮影し、ＭＨＣ陽性筋管／ウェルの数を計算した。
【００６３】
図１２：（Ａ）筋管当たりの筋核の頻度および（Ｂ）５、６、７、８、および９個の筋核を含有する筋管の幅を示す。ヒト筋芽をマイティー−ｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養し、ＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。５、６、７、８、および９個の筋核（ｎ＝５３）を含有するＭＨＣ陽性筋管をその最も広い幅で測定した。
図１３：馴化培地処理ヒト筋芽における筋核／ＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒト筋芽をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で４８時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。筋核／ＭＨＣ発現筋管の数を顕微鏡視野当たりの５個の筋管で計算した（ｎ＝２４５筋管）。（Ａ）１−３、４−６、および７−９の筋核の筋管の数。（Ｂ）筋核／筋管の平均数。
図１４：８個の筋核を含有する馴化培地処理筋管の幅を示す。ヒト筋芽をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で４８時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。８個の筋核を含有するＭＨＣ陽性筋管（ｎ＝１００）をその最も広い幅で測定した。
【００６４】
図１５：馴化培地処理ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す。ヒトＲＤ細胞をマイティー安定トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞またはＬａｃＺ（対照）トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理した。細胞を馴化培地で７２時間培養し、次いでＭＨＣ発現についてＩＣＣを実行した。ＭＨＣ陽性筋管／ウェルの数を計算した。
図１６：マウスマイティープロモータがさまざまな細胞系において活性を有することを示す。（Ａ）Ｃ２Ｃ１２筋芽、初代ヒツジ筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）および（Ｂ）ヒトＲＤ（横紋筋肉腫）細胞を一時的に１ｋｂマイティープロモータレポーター構成物で２４時間トランスフェクトした。次いで、これらを成長または分化培地中でさらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性を測定し、共トランスフェクトｐＣＨ１１０からのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に標準化した。
図１７：マイティープロモータが用量依存的にミオスタチンによって阻害されることを示す。方法において記載されているようにＣ２Ｃ１２筋芽を一時的に１ｋｂプロモータでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を成長培地中において組換えミオスタチン４および８μｇ／ｍｌで処理した。細胞を処理の２４時間後に回収した。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。
【００６５】
図１８：ミオスタチン模倣剤がマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を回復しうることを示す。Ｘ軸は、β−ガラクトシダーゼ活性に標準化されたマイティープロモータの相対ルシフェラーゼ活性である。Ｃｔｒｌバーは対照ヒツジ筋芽を示し、ｗｔバーは野生型ミオスタチン（３μｇ）で処理したヒツジ筋芽を示し、３３５バーはミオスタチン模倣剤３３５ １５μｇで処理したヒツジ筋芽を示し、３３５＋ｗｔはミオスタチン３μｇおよびミオスタチン模倣剤１５μｇで処理したヒツジ筋芽を示す。
図１９：マイティー遺伝子の上流断片のプロモータ活性を示す。方法において記載されているように、Ｃ２Ｃ１２筋芽を一時的にプロモータ断片レポーター構成物でトランスフェクトした。次いで、これらを成長または分化培地中でさらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性を測定し、共トランスフェクトｐＣＨ１１０からのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性に標準化した。
図２０：マイティータンパク質に対する抗体の適用を示す。レーンは、Ｍ、マーカー、１、ペプチド特異的マイティー抗体によって認識された精製組換えマウスマイティータンパク質、２、ウシタンパク質抗体によって認識された精製組換えウシマイティータンパク質、３、マイティー発現（使用されたウシタンパク質抗体）に対して誘発されたマイティー発現プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのタンパク質抽出物、および４、マイティー発現プラスミド（非誘発）（使用されたウシタンパク質抗体）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からのタンパク質抽出物を示す。
【００６６】
（発明の詳細な記載）
本発明は、筋の発達および再生に関与する新規タンパク質に基づく。このタンパク質は「マイティー」と呼ばれている。
【００６７】
マイティー遺伝子は、ヒツジ（配列番号１）およびウシ（配列番号３）から同定され、クローン化されている。１つの態様において、本発明は、ウシおよびヒツジから単離されたマイティーポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、ヒツジ、配列番号１、およびウシ、配列番号３からの、アンチセンスポリヌクレオチドおよび操作可能なアンチセンス断片を含む、ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００６８】
本発明は、ウシおよびヒツジから単離されたポリペプチド配列を提供する。具体的には、本発明はヒツジ、配列番号２、およびウシ配列番号４からのポリペプチド、ならびに配列番号２および配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、遺伝情報における冗長性の結果として、サイレント置換、または結果として生じるアミノ酸において同類置換をもたらす置換を含みうることが理解されるであろう。さらに、タンパク質の活性を実質的に変化させることがない本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片および変種も意図されている。
【００７０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターをも提供する。ポリヌクレオチド配列を保存、複製、および発現するベクターの使用は当技術分野で公知である。一般に、ベクターは、５’−３’方向において、遺伝子プロモータ配列、本発明によるポリヌクレオチド配列、および遺伝子末端配列を含んでなる。ベクターは、本発明による配列のプラスミドおよび／またはウイルスへの取込みを含み、宿主細胞における配列の導入および／または維持に役立つことが意図されている。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかを含みうる。真核細胞はインビボであり、または初代もしくは形質転換された細胞系でありうる。
【００７１】
マイティータンパク質は、発明者によって、ダブル筋肉ウシ（図１および図２を参照）において高度に発現され、マイティーが筋成長の促進において役割を果たすことが示すことが明らかにされている。マイティーは、筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞の成長を上方調節し、筋成長の促進におけるマイティーの役割を裏付けることも明らかにされている（図４）。マイティーを過剰発現するＣ２Ｃ１２細胞の別の調査は、マイティーが筋細胞における肥大を誘発することを示す。これはマイティーを過剰発現する細胞における核の数の増加（図５）、および細胞サイズの増加（図６）によって示されている。さらに、図７に示されているように、マイティーを過剰発現するＣ２Ｃ１２細胞は対照細胞よりも早期に分化する。初代筋芽（活性化衛星細胞）も衛星（静止細胞）よりも大きなレベルのマイティーを有することが明らかにされている。
【００７２】
これらの結果は、筋の成長および発達におけるマイティーの役割を裏付け、かつマイティーが筋成長および発達を調節または促進するために使用されうることを示す。マイティーは、農業上の利点を有しうる増加した筋肉量を有する動物を生産するための有用な手段を提供する。さらに、マイティーは筋成長に付随する疾患、特に筋萎縮に付随する疾患を治療するための組成物の開発を提供する。かかる疾患としては、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
したがって、筋成長を調節するための組成物が含まれる。「筋成長の調節」は、筋成長および／または発達の速度のあらゆる変化を含むことが意図されており、筋前駆細胞の成長および／または分化を含む。これは、前駆筋細胞が分裂する速度の変化、および／または前駆筋細胞が分化する速度のあらゆる変化を含む。その変化は増加または減少のいずれかでありうる。
【００７４】
かかる組成物は、ヒツジ配列番号１またはウシ配列番号３からの配列、配列番号１または配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種を含む、マイティー遺伝子配列に基づく。この配列は、プロモータ、マイティープロモータ（配列番号５）、または他の適切なプロモータのいずれかの調節下、適切なベクターへの取込みによって細胞へ導入されうる。このプロモータを使用し、マイティータンパク質の発現を誘発し、それによって細胞内の遺伝子発現およびマイティータンパク質活性を増大させることができる。
【００７５】
この組成物は、本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有する配列をも含みうる。配列同一性は、配列を整列し、同一のヌクレオチドの数を測定することによって判定されうる。多くのコンピュータアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムが配列同一性を測定するために周知である。
【００７６】
この組成物は、本発明によるポリヌクレオチドの相補体、逆相補体、またはアンチセンスヌクレオチドをも含みうる。
【００７７】
この組成物は、本発明によるマイティーポリペプチドをも含んでなりうる。このポリペプチドはヒツジ、配列番号２、またはウシ、配列番号４、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種からのものでありうる。
【００７８】
この組成物は、本発明のポリペプチド配列との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有する配列をも含んでなりうる。配列同一性は、配列を整列し、かつ同一の残基の数を測定することによって判定されうる。多くのコンピュータアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムが配列同一性を測定するために当技術分野で周知である。
【００７９】
この筋成長を調節するための組成物は、マイティー遺伝子発現のモジュレータをも含んでなりうる。
【００８０】
この筋成長を調節するための組成物は、マイティータンパク質活性のモジュレータをも含みうる。
【００８１】
マイティー遺伝子発現のモジュレータは、特に本発明によるポリヌクレオチドに結合しうる化合物でありうる。具体的には、かかるマイティー遺伝子発現のモジュレータはマイティー遺伝子プロモータに結合し、それによって遺伝子転写が開始または維持される速度に影響を及ぼしうる。あるいは、それらのプロモータまたは断片を使用し、細胞の天然のプロモータへ特定の変化を導入し、野生型のマイティー遺伝子発現を増強または抑制しうる。変化としては、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含みうる。
【００８２】
マイティー遺伝子発現の別のモジュレータは、遺伝子が発現される速度を直接影響を及ぼすマイティー遺伝子にも結合しうる。
【００８３】
マイティー遺伝子発現の別のモジュレータは、マイティー遺伝子に結合し、変化を配列へ導入することによって、例えば、遺伝子が発現される速度に影響を及ぼし、またはマイティータンパク質活性を変化しうる相同的組換えによって機能しうる。配列の変化としては、ヌクレオチドの変化、挿入、または欠失が挙げられるが、これらは結果として生じるポリペプチドにおけるアミノ酸の変化、挿入、または欠失をもたらす場合ももたらさない場合もある。変化の例としては、切断ポリペプチドが製造されるように末端コドンの挿入、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が変化するように１つもしくはそれ以上のコドンの変化を挙げることができる。あるいは、野生型マイティー遺伝子の部分を削除し、または部分をマイティー野生型遺伝子へ導入する変動がありうる。かかる変化を引き起こす方法が当技術分野で公知である。さらに、かかる変化をマイティー遺伝子へ導入し、次いでマイティー活性における変化を、例えば実施例４に記載されている筋芽増殖アッセイを使用して検査することは当業者の技術範囲内であろう。
【００８４】
マイティー遺伝子発現は、転写および／または翻訳を妨げるポリヌクレオチドを導入することによっても変化されうる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドが導入されうるが、アンチセンス発現ベクター、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド、アンチセンスホスホチオエートオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスポリヌクレオチドの効率を増強する化学的修飾の使用を含む、当技術分野で周知である他の手段を挙げることができる。
【００８５】
アンチセンスポリペプチドが問題のポリヌクレオチドと１００％相補的である必要はないが、アンチセンスポリヌクレオチドが遺伝子に結合し、またはｍＲＮＡが遺伝子発現を阻止するが、実質的に他の遺伝子の発現を阻止することがないことを可能にするのに十分な同一性を有する必要だけはあることが理解されるであろう。５’非翻訳領域を含む、遺伝子に対して相補的であるポリヌクレオチドを使用し、マイティータンパク質の翻訳も阻止しうることも理解されるであろう。同様に、これらの相補的ポリヌクレオチドは１００％相補的である必要はないが、十分にｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻止するが、実質的に他の遺伝子の翻訳を阻止しない必要がある。
【００８６】
遺伝子発現の変調は、当技術分野で周知であるように干渉ＲＮＡ分子の使用をも含んでなり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含みうる。
【００８７】
遺伝子発現の変調は、触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムの使用によっても達成されうる。かかるリボザイムが特定標的ＲＮＡ分子とペアを組むように設計されることは当技術分野で周知である。
【００８８】
遺伝子発現を調節する当技術分野で周知の他の方法を使用し、マイティー遺伝子発現を調節することもできる。
【００８９】
この組成物は、マイティー活性のモジュレータをも含みうる。マイティーのモジュレータはマイティータンパク質の優性阻害突然変異体を含みうる。優性阻害効果は、変異体が野生型タンパク質の生理活動を遮断するように作用する場合に生じる。これは、活性化ではなく、受容体と結合すると同時に、野生型タンパク質を結合から防ぐことによって起こりうる。あるいは、優性阻害は、野生型タンパク質に直接結合し、かつこれを不活性化することによって作用しうる。
【００９０】
したがって、本発明のポリヌクレオチドを使用して適切な組成物を作り出すことができ、またはこれを使用してマイティー遺伝子発現を調節し、それによって筋成長を調節する適切は組成物を設計することができる。かかる方法を使用し、細胞内、例えば、初代または形質転換された細胞系内のマイティー遺伝子発現を調節し、または動物内の筋成長を調節しうる。
【００９１】
本発明の組成物の１つの可能な用途は、筋細胞成長および／または分化を促進または阻害することである。筋細胞は初代または形質転換された細胞系のいずれかであり、または細胞は宿主動物のインビボ細胞でありうる。適切な宿主動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。
【００９２】
本発明の組成物は、筋組織に付随する疾患の治療にも使用されうる。かかる疾患または損傷は、筋ジストロフィー、筋失調、または心筋成長に付随する疾患を含みうる。同様に、この組成物を使用して筋損傷後の筋再生を促進することもできる。
【００９３】
図９に示されているように、マイティー発現は筋損傷後、筋再生中の細胞において増加する。さらに、マイティー発現はヒツジにおける心組織における梗塞後に増加することが明らかにされている（図１０）。これらの結果は、マイティーが筋再生にも関与することを示す。したがって、この組成物は、筋成長に付随する疾患の治療に有用であるだけではなく、損傷後の筋損傷の治療において有用でもある。
【００９４】
図１１〜１５における結果は、本発明の組成物を使用してヒト筋の成長および分化を刺激することができ、さらに本発明のヒト用医学的応用の可能性を裏付けることを示す。
【００９５】
同様に、この組成物を使用してトランスジェニック動物を製造することができうる。この組成物を使用して筋肉量の増加を有するトランスジェニック動物を製造することができうる。適切な動物は、ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。多くの方法が、トランスジェニック動物を製造するために当技術分野で周知であり、かつ適切な方法が使用されうる。
【００９６】
本発明の別の用途は動物の筋肉量を予測することでありうる。これを行うために、サンプルが動物から得られる。次いで、サンプルはマイティー遺伝子発現、またはマイティータンパク質のレベルについて分析される。多くの方法が、遺伝子発現またはタンパク質量を測定するために当技術分野で周知である。例えば、遺伝子発現は定量的ＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して分析されうる。タンパク質含量は、ＥＬＩＳＡ［酵素免疫吸着アッセイ］またはウェスタンブロット分析を使用して測定されうる。
【００９７】
次いで、マイティー遺伝子発現、またはマイティータンパク質の量のレベルは平均と比較される。マイティー遺伝子発現の平均レベルは、平均筋肉量の動物のサンプルから得られた平均レベルである。同様に、マイティータンパク質の平均量は平均筋肉量の動物のサンプルにおいて得られたタンパク質の量である。
【００９８】
平均と比較されたマイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質の増加レベルは、動物の筋肉量が平均以上の筋肉量を有することが予測されることを意味する。平均と比較されたマイティー遺伝子発現またはマイティータンパク質の減少レベルは、筋肉量が平均以下であることが予測されることを意味する。
【００９９】
マイティー遺伝子の自然発生変種が存在しうることが理解されるであろう。かかる変種は、多型、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含みうる。当業者は、本発明の配列を使用し、かかる変種をスクリーニングすることができるであろう。例えば、これらの配列を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用に適切なプライマーを設計し、マイティー遺伝子、またはマイティー遺伝子の断片を増幅し、さまざまな生物におけるかかる変種についてスクリーニングしうる。スクリーニングは、直接シーケンスまたは一本鎖立体構造多型分析（ＳＳＣＰ）などの方法を含みうる。マイティーの変種が生物の変化した筋肉量と関連しうることも理解されるであろう。
【０１００】
マイティー発現のレベルを測定し、または変化した筋肉量と関連したマイティーの変種を検出するための上記の方法を使用し、繁殖プログラムに関与する動物を選定し、増加または減少した筋肉量を有する子孫を生産することができる。
【０１０１】
本発明は、マイティータンパク質に対する抗体をも提供する。本明細書に開示された配列を前提として、当業者はマイティータンパク質に対する抗体を製造することができるであろう。ハイブリドーマ細胞の製造を含む、いかにして抗体が製造されうるかの例は、Ｅｒｙｌ ＬｉｄｄｅｌｌとＣｒｙｅｒ（１９９６年）またはＪａｖｏｉｓ（１９９９年）において見出されうる。抗体の結合ドメインが抗体の定義に含まれることも理解されるであろう。
【０１０２】
実施例１６において概要が示され、かつ図２０に示されているように、ポリクローナル抗体は適切な動物におけるマイティータンパク質の全体に対して生じうる。あるいは、抗原断片を使用し、ペプチドを特異的に生成することができる。これは、本発明による抗体が当技術分野で周知の方法を使用していかに生成されるかを示す。
【０１０３】
かかる抗体を使用し、サンプルにおけるマイティータンパク質を検出、および／または定量化しうる。あるいは、本発明による抗体を使用し、マイティー活性を結合および調節しうる。
【０１０４】
他の型の抗体および結合タンパク質が製造されうること、かつこれらが本発明の一部であることが意図されていることが理解されるであろう。これらは、非哺乳類抗体、例えばサメからのＩｇＮＡＲクラスの抗体、細菌性免疫タンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＩＭＭ７免疫タンパク質、または当技術分野で周知の他のクラスの結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。本明細書に開示された配列を前提として、当業者は、かかるポリペプチドを製造し、あるいは既知の結合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、本発明のポリペプチドに優先的に結合するポリペプチドを得ることができるであろう。
【０１０５】
マウスマイティープロモータも単離され、クローン化されており（配列番号５）、これが本発明の一部をも形成する。本発明は、マウスマイティープロモータを含んでなる１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドをも提供する。マイティープロモータは、配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは誘導体である。
【０１０６】
プロモータ配列の分析、図３は、既知の転写因子結合部位を示す。
【０１０７】
マイティー遺伝子プロモータを含有するベクターは周知の方法を使用して製造されうる。ベクターは、ポリヌクレオチドのプラスミドおよび／またはウイルスへの取込みを含み、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの導入および／または維持を補助することが意図されている。宿主細胞は原核細胞または真核細胞、インビボまたは初代もしくは形質転換された細胞系でありうる。
【０１０８】
図１６に示されているように、マイティープロモータを使用し、ヒトを含むさまざまな細胞系における遺伝子の発現を推進することができる。さらに、図１９に示されているように、マイティー開始部位の上流の２００ヌクレオチドほどの断片が遺伝子発現を推進する能力がある。
【０１０９】
マイティー遺伝子プロモータを使用し、マイティー遺伝子発現の調節に有用でありうる化合物についてスクリーニングすることができ、したがって筋成長の調節に有用でありうる。これを行うには、マイティープロモータを適切なマーカー遺伝子を有する適切な発現ベクターへ配置されうる。「マーカー遺伝子」は、その発現産物が同定かつ定量化されうる遺伝子である。多くの適切なマーカー遺伝子が周知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼを含みうる。
【０１１０】
次いで、ベクターは周知のトランスフェクション方法を使用して適切な宿主細胞へ配置される。適切な宿主細胞は、マイティー遺伝子プロモータが活性化され、発現されるマーカー遺伝子をもたらされる細胞を含んでなり、かつマーカー遺伝子発現産物のレベルが検出されうる。次いで、目的とする化合物は宿主細胞へ適用され、マーカー遺伝子における変化が測定される。
【０１１１】
基線と比較されたマーカー遺伝子発現産物の量における増加は、化合物がマイティー遺伝子プロモータを介して遺伝子発現を増強しており、したがって筋成長の促進に有用でありうることを示す。基線と比較されたマーカー遺伝子産物の量における減少は、マイティー遺伝子プロモータを介して遺伝子発現を阻害しており、したがって筋成長の阻害に有用でありうることを示す。
【０１１２】
図１７に示されているように、この方法を使用し、マイティープロモータがミオスタチンによって調節されることを示しうる。ミオスタチンは筋の既知の負の調節因子であるため、この結果により、さらに筋成長および発達の促進および調節におけるマイティーの活性が裏付けられる。ミオスタチンの優性阻害模倣剤も周知である。国際公開第０１／５３３５０号パンフレット、Ｃ末端切断（位置３３０と３５０との間）ミオスタチンペプチドは結果として、優性阻害効果を有するミオスタチン模倣剤が生じる。図１８に示されているように、ミオスタチン模倣剤３３５（位置３３５で切断）はマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を救うことが可能である。図１７および図１８を組合せて、ミオスタチンおよびミオスタチン模倣剤を使用し、マイティー発現をそれぞれ下方調節または上方調節することができ、したがって本発明による組成物において使用されうるがことが示されている。
【０１１３】
マイティー遺伝子プロモータを使用し、筋細胞における指定遺伝子を発現することもできる。指定遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなり、または他のポリヌクレオチド、例えば、ミオスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドでありうる。これを達成するには、マイティー遺伝子プロモータは、目的とする遺伝子とともに適切なベクターへ挿入される。多くの適切なベクターが当技術分野で周知であり、真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したすべてのベクターを含みうる。
【０１１４】
次いで、ベクターは周知のトランスフェクション方法を使用して適切な宿主細胞へ導入されうる。
【０１１５】
適切な宿主細胞は、マイティープロモータが活性化される筋細胞または哺乳動物細胞でありうる。宿主細胞は、例えば、宿主動物の初代もしくは筋芽細胞系、または形質転換された筋芽細胞、または骨格もしくは心筋細胞を含みうる。
【０１１６】
マイティープロモータが活性であるいかなる宿主動物も使用されうるが、これは例えばヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、魚、ウマ、マウス、ラット、またはヒトを含みうる。
【０１１７】
実施例１：マイティーｃＤＮＡの単離
ＲＮＡ精製：メーカーのプロトコールに従いＴＲＩＺＯＬ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してヒツジおよびウシ骨格筋および心組織サンプルからＲＮＡを精製した。
【０１１８】
マイティーｃＤＮＡの増幅：マイティーｃＤＮＡの増幅を複合型逆転写ＰＣＲにおいて行った。ファーストストランドｃＤＮＡを、メーカーの説明書に従いスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）前増幅キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、５μｇの総ＲＮＡからの逆転写反応混合液２０μｌ中で合成した。増幅に使用されたＰＣＲ条件および特定のプライマーは以下の通りである。
【０１１９】
ヒツジおよび畜牛骨格筋マイティーｃＤＮＡおよびウシ心マイティーｃＤＮＡの増幅をプライマー、すなわち、
順方向プライマー５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ３’ （配列番号６）
逆方向プライマー５’ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴ ３’ （配列番号７）
を使用して行った。
【０１２０】
ＰＣＲを９４℃下に１分間、初期変性とともにＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））存在下に行った。その後、以下の工程、９４℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、および最終延長７２℃で５分間の１サイクルを行った。
【０１２１】
ベルギーブルーおよび正常な筋肉ウシからのマイティー断片のＰＣＲ増幅（図１）。
使用プライマー：
ｂｃｏｏ３２９１ Ｆｗｄ ５’ＴＧＡＡＧＣＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣ３’ （配列番号８）
ｂｃｏｏ３２９１ Ｒｅｖ２ ５’ＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣ３’ （配列番号９）
【０１２２】
ＰＣＲを９４℃下に１分間、初期変性とともにＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））およびＴａｑポリメラーゼの存在下に行った後、９４℃で１５秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の３５サイクル、および最終延長７２℃で５分間の１サイクルを行った。
【０１２３】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で実行し、エチジウムブロマイドで染色し、視覚化した。図１における結果は、マイティーが正常な筋肉ウシと比べダブル筋肉ウシにおいて過剰発現されることを示す。この結果は、マイティーが筋成長の促進に役割を有することを示す。図２の部分Ａは、マイティー遺伝子発現もダブル筋肉ウシの心組織において上方調節されることを示し、マイティーが心筋成長および発達ならびに骨格筋成長および発達を調節することも可能であることを示す。図２の部分Ｂは、ヒツジ骨格筋におけるマイティー発現の存在を示す。
【０１２４】
ＰＣＲ産物の精製：ＰＣＲ反応を０．８％低融点アガロースゲル上で実行し、所望のバンドを含有するゲルを除外した。ゲルからのＤＮＡをウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ調製（ｐｒｅｐｓ）ＤＮＡ精製系（（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製した。
【０１２５】
実施例２：マイティーｃＤＮＡのクローニング
精製ｃＤＮＡをメーカーのプロトコール（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従いｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクターにライゲートした。ライゲーション反応物をメーカーのプロトコールに従いコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファ細菌（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ形質転換した。形質転換された細菌をアンシピリン（５０ｍｇ／リットル）、ＩＰＴＧ、およびＸ−ｇａｌを含有するレノックス（Ｌｅｎｎｏｘ）Ｌブロス（ＬＢ）寒天プレート上にプレーティングした。白色コロニーをＬＢ＋アンピシリン培地に播種し、培養菌を一夜成長させた。プラスミドＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプラスミドキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して培養菌から精製した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で分析した。陽性クローンを正しいサイズの断片によって同定した。陽性クローンをさらなる確認の配列決定のために送った。ヒツジマイティーポリヌクレオチド配列は配列番号１で示されており、対応するポリペプチド配列は配列番号２で示されている。ウシマイティーポリヌクレオチド配列は配列番号３で、対応するポリペプチド配列は配列番号４として示されている。
【０１２６】
実施例３：マウスマイティー安定細胞系の生成
マウスマイティーのＯＲＦを以下のプライマーでＰＣＲ増幅した。
Ｆｗｄ ５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ３’ （配列番号６）
Ｒｅｖ ５’ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴ３’ （配列番号７）
【０１２７】
Ｐｗｏポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、Ｑ溶液（（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、およびマウスＥＳＴクローン（レスジーン（Ｒｅｓｇｅｎｅ））をテンプレートとして、メーカーの推奨に従いＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。すなわち、９４℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、および７２℃で５分間の１サイクル。
【０１２８】
マウスマイティー遺伝子のｃＤＮＡをウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ調製ＤＮＡ精製系（（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって精製し、メーカーのプロトコールによりｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５ＨｉｓＴＯＰＯベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＴＯＰＯ部位へクローン化した。組換えを制限消化によって分析し、陽性組換えを配列決定した。
【０１２９】
マウスマイティー構成物によるＣ２Ｃ１２の安定トランスフェクションのために、Ｃ２Ｃ１２筋芽（１×１０７）を２回、良く冷えた１×ＨＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．７７ｍＭ Ｎａ２ＨＰ４、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（７．１））中で洗浄し、良く冷えた１×ＨＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁し、予冷キュベットギャップ０．４ｃｍ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）に移した。１０μｇの線形化プラスミドＤＮＡを添加した（Ｓｃａ Ｉで線形化）。氷上で５分後、細胞を攪拌によって混合し、２００Ωで設定した抵抗による静電容量９６０μＦでキュベットを０．２４ｋＶでパルスし、時定数は平均３６ｍｓであった。細胞を氷上で１０分間インキュベートし、１０ｃｍ皿上のＤＭＥＭ１０ｍｌの１０％ＦＢＳに移し、上下に粉砕して細胞破片に解体した。次いで、細胞をジェネテシン（６００μｇ／ｍｌ）で選択し、個々のクローンを選択した。トランス遺伝子を発現するクローンをプラスミドにおけるＶ５タグのウェスタンブロットによって同定した。
【０１３０】
実施例４：筋芽増殖アッセイ
アッセイ前に、Ｃ２Ｃ１２細胞（ＹａｆｆｅとＳａｘｅｌ）およびトランスフェクトＣ２Ｃ１２クローンを、ＮａＨＣＯ３（４１．９ｍｍｏｌ／ｌ、シグマ・セル・カルチャー株式会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｔｄ）、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ）、米国）および気体ＣＯ２で緩衝したＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州（ＮＹ）、米国）中で成長させた。フェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をｐＨ指示薬として使用した。ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、１０％胎仔ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ株式会社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）もそうであるように規定通りに培地に添加した。
【０１３１】
細胞増殖アッセイを非コート９６ウェルヌンク（Ｎｕｎｃ）マイクロタイタープレートで行った。Ｃ２Ｃ１２培養物を増殖培地中に３×１０３細胞／ｃｍ２で播種した。２４時間の付着期間後、培地を傾斜し、添加した新鮮増殖培地をプレートに戻した。
【０１３２】
次いで、プレートを３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下にインキュベートした。試験プレートを培地変更後０、２４、４８、および７２時間の時点で固定し、Oliver et al.（1989）の方法によって増殖についてのアッセイを行った。手短に言えば、成長培地を傾斜し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、次いで３０分間、１０％ホルモル食塩水中に固定した。次いで、固定細胞を３０分間、０．０１Ｍホウ酸塩バッファー（ｐＨ８．５）中メチレンブルー１０ｇ／ｌで染色した。過剰染料をホウ酸塩バッファー中での連続４回の洗浄によって除去した。次いで、メチレンブルーを１：１（ｖ／ｖ）のエタノールと１００ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌの添加によって固定細胞から溶出した。次いで、プレートを静かに振り、マイクロプレート光度計（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）モデル３５５０マイクロプレートリーダー、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）によって各ウェルについて６５５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１３３】
図４における結果は、マイティー遺伝子でトランスフェクタした細胞は高い吸光度を有し、正常Ｃ２Ｃ１２細胞と比べより速い成長速度を示したことを示す。この結果は、マイティーが筋芽細胞の成長を上方調節するように作用することを示す。
【０１３４】
実施例５：マイティー誘発肥大
筋形成の促進におけるマイティーの機能を評価するために、マイティーを安定に発現する筋芽を低血清培地で分化させた。ＭＨＣの免疫染色を行って筋管の形態を評価した。
【０１３５】
ＤＭＥＭ２％ウマ血清中で７２時間分化したマイティー過剰発現細胞および親細胞系、Ｃ２Ｃ１２を１回、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで７０％エタノール：ホルムアルデヒド：氷酢酸（２０：２：１）で３０秒間固定し、次いで３回ＰＢＳでリンスした。次いで細胞を１％正常ヒツジ血清（ＮＳＳ）を含有するＴＢＳ中４℃で一夜遮断した。細胞をＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で１時間、初代抗体、１：１００希釈抗ＭＨＣでインキュベートした。細胞を（３×５分）ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で３０分間、二次抗体、１：１００希釈ヒツジ抗マウスＩｇＧでインキュベートした。細胞を前述同様に洗浄し、ＴＢＳ／１％ＮＳＳ中で３０分間、三次抗体、１：１００希釈ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＲＰＮ１０５１、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））でインキュベートした。次いで、細胞を前述同様に再度洗浄した。ＭＨＣ免疫染色を０．０３７５％ＣｏＣｌ２で強化した３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して視覚化し、次いでジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリンで対比染色し、マウンティングし、写真撮影した。
【０１３６】
図５に示されているように、マイティーの発現は筋核数における増加をもたらし、マイティーが筋細胞における肥大をも促進することを示す。
【０１３７】
実施例６：マイティー誘発肥大の分析
方法：
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２細胞または２つのマイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン、クローン７およびクローン１１を、活発に成長する細胞の分析には１５，０００細胞／ｃｍ２、分化試験の分析には２５，０００細胞／ｃｍ２でパーマノックス（ｐｅｒｍａｎｏｘ）カバースリップ（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上にプレーティングした。
【０１３８】
５％ＣＯ２／３７℃の雰囲気下の２４時間の付着期間後、培地を成長培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）またはＤＭＥＭ／２％ＨＳ（分化培地）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のいずれかに変更し、細胞を６０および７２時間分化させた。細胞を視覚化するために、７０％エタノール２０部／４０％ホルムアルデヒド２部／氷酢酸１部で適切な時点で培養を固定し、次いでジルス（Ｇｉｌｌｓ）ヘマトキシリン（１：１）で５分間染色した後、１％エオシンで１分間染色した。次いで、カバースリップを１００％エタノール中で脱水し、清掃し、スライドガラス上でＤＰＸを使用して恒久的にマウンティングした。
【０１３９】
ヒト筋芽培養
ヒト骨格筋筋芽をクロネチックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、ケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ニュージャージー州（ＮＪ）、米国から入手した。細胞をメーカーの説明書によりｒｈＥＧＦ、デキサメタゾン、ＦＢＳ、グルチミン、ＧＡ−１０００を含有するＳｋＧＭ−２培地中で規定通りに成長させた。
【０１４０】
トランスフェクションおよび馴化培地実験のために、３０，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞をプレーティングした。２４時間の付着期間後、培養物をマイティー−ｐＣＤＮＡ３および対照ベクターでトランスフェクトし、または馴化培地を受けた。馴化培地は、マイティークローン１１または対照細胞による４８時間の馴化にかけられていたＤＭＥＭ／２％ＨＳで構成された。
トランスフェクションの２４時間後、培地をＤＭＥＭ／２％ＨＳに変更した。培養物を１２、２４、３６、４８時間に２０：２：１の固定剤で固定した。
【０１４１】
Ｃ２Ｃ１２クローンにおける肥大の定量化
オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡に取付けたＳＰＯＴ ＲＴカメラで、ウィンドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）およびマック（Ｍａｃ）用に設計されたＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．５を使用して画像を収集した。活発に成長する細胞については、細胞系当たり４０の無作為に選択された細胞の面積を４０倍の倍率で測定した。筋管については、細胞系当たり４０の無作為に選択された筋管の面積、幅、および長さを測定し、３および４個の核については、それぞれ、やはり４０倍の倍率で測定した。データは平均＋／−標準偏差で表されている。
【０１４２】
ＦＡＣＳ分析
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１、ならびにｌａｃＺ対照Ｃ２Ｃ１２筋芽をＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で１０ｃｍ皿において培養した。細胞をトリプシンを使用して回収した後、遠心分離し、７０％エタノール／ＰＢＳ ８００ｍｌ中に固定した。次いで、固定細胞をＰＢＳ ５０μｌ＋ＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭクエン酸）５００μｌ中に１０分間、室温下に再懸濁した。ＤＮＡ抽出バッファーをＤＮＡ染色バッファー（プロピジウムアイオダイド５０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中ＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅ Ａ５０μｇ／ｍｌ）で置換し、再懸濁細胞に短くボルテックスし、暗所で室温下、３０分間インキュベートした。次いで、べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用するプロピジウムアイオダイド蛍光および前方角光散乱について検査し、細胞周期分析のために、細胞サイズ、およびＤＮＡ含量の測定を、セルフィット（ＣｅｌｌＦｉｔ）ソフトウェア（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【０１４３】
ウェスタンブロット法
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１、ならびにｌａｃＺ発現Ｃ２Ｃ１２筋芽をＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で１０ｃｍ皿において、０、２４、４８、７２、および９６時間の分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）へ変更される前の２４時間培養した。細胞をトリプシン化によって回収し、溶解バッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ−４０、１×プロテアーゼ阻害剤（コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））３００μｌ中に再懸濁した。細胞抽出物を０．５ｍｍの注射針に１０回通過させ、遠心分離し（１０分間１４，０００ｇ）、細胞破片にペレット化し、上清をウェスタンブロット法のために使用した。バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイ試薬（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用してタンパク質濃度を測定し、タンパク質１５μｇを４５ｍＡでプレキャストＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−トリスゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で電気泳動させた。次いで、５０−６０Ｖで２時間、Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩ転写系（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用してタンパク質ゲルをトランス・ブロット転写膜（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に移した。次いで、膜を一夜、ＴＢＳＴ中５％ミルク中で遮断した。初代抗体を以下の通りＴＢＳＴ中５％ミルク中で希釈し、すなわち、ｐ２１、精製マウスモノクローナル抗−ｐ２１抗体（ＳＸ１１８、ファルミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の１：４００希釈、ＭｙｏＤ、精製ウサギポリクローナル抗−ＭｙｏＤ抗体（ｓｃ−３０４、サンタ・クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の１：２００希釈、ＭＨＣ、精製マウスモノクローナル抗−ＭＨＣ抗体（ＭＦ−２０、ドナルド・フィッシュマン（Ｄｏｎａｌｄ Ｆｉｓｃｈｍａｎ）博士からの寄贈）、α−チューブリン、精製マウスモノクローナル抗−α−チューブリン抗体（ＤＭ１Ａ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の１：４０００希釈、かつ室温下に３時間インキュベートした。膜を５回、ＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、さらに１時間、室温下に、１：２０００の希釈で抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Ｐ０４４７、ダコ（Ｄａｋｏ））または抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Ｐ０４４８、ダコ（Ｄａｋｏ））を含有するＴＢＳＴ中５％ミルク中でインキュベートした。次いで、膜を５回、ＴＢＳＴ中で５分間洗浄し、ウェスタン・ライトニング化学発光試薬プラス（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用してＨＲＰ活性を検出した。
【０１４４】
結果：
マイティー過剰発現筋芽および筋管は対照細胞と比べ肥大を示す。
活発に成長するマイティー過剰発現クローンは、対照細胞と比べると肥大していると思われる。定量画像分析を使用すると、活発に成長するマイティー過剰発現クローンは対照細胞よりも著しく大きな面積を有する（図６Ａ）。この結果を裏付けるために、筋芽肥大、または相対細胞サイズを前方角光散乱を使用するフローサイトメトリーによって測定した。この分析により、クローン１１およびクローン７のそれぞれ対照細胞と比べ細胞サイズの増加が明らかにされた（図６Ｂ）。
【０１４５】
分化マイティー過剰発現クローンも対照細胞と比べると肥大していると思われる。肥大に対する説明が筋管により融合された細胞の数の増加でありうるということから、筋管のサイズをマイティー過剰発現クローンと対照細胞との間の同じ数の核と比較する分析を行った。定量画像分析を使用すると、筋管肥大がマイティー過剰発現クローンにおいて明らかであった。３および４個の核を有する筋管の筋管の面積、幅、および長さを比較した。マイティー過剰発現クローンは、３個および４個の核を有する筋管において対照細胞と比べ面積、幅、および長さにおける増加を明らかに示した（図６Ｃ−６Ｅ）。
【０１４６】
マイティー過剰発現クローンは対照細胞よりも早く分化する
マイティー過剰発現クローンの分化表現型は、ＭＨＣに対する免疫細胞化学を使用し、筋管形成を視覚化することによって判定された。マイティー過剰発現クローンを分化培地へ切り替えると、多核筋管が６０時間までにマイティー過剰発現クローンにおいて明らかであると同時に、７２時間まで対照培養において多核筋管が明らかにならない。７２時間までにマイティー過剰発現はほぼ完全に分化したように思われるが、対照細胞は新生筋管のみを形成しているように思われる（図７Ａ）。これらの結果は分化マーカーに対するウェスタンブロット法を使用して裏付けられた。早期、中期、および後期分化マーカーｐ２１、ｍｙｏＤおよびＭＨＣをそれぞれ使用し、筋分化遺伝子発現を調査した（図７Ｂ）。ｐ２１発現はすべての時点で増加し、ｐ２１発現が早期に、かつマイティー過剰発現クローンにおいて相当に発生することを示した。ＭｙｏＤ発現はマイティー過剰発現クローンにおいて早期に増加し、ＭｙｏＤ発現は分化の０、２４、および４８時間の時点で対照細胞と比べ増大した。ＭｙｏＤレベルはすべての細胞系において７２時間までに同等に高かった。ＭＨＣ発現はクローン１１において２４時間までに発生し、４８時間の時点で両方のクローンにおいて高いレベルに発現される。この発現はすべての細胞系において７２時間までに同等である。筋分化マーカーの早期および増加した発現は組織化学的結果と一致している。これらの結果は、マイティーの過剰発現が結果として増強した分化表現型をもたらすことを示す。
【０１４７】
実施例７：筋発達におけるマイティー
方法：
衛星細胞（静止）の単離
衛星細胞（ＳＣ）を４週齢野生型マウスの後肢筋から単離した（パーコール密度遠心分離）。筋を細分化し、０．２％コラゲナーゼ型１Ａで９０分間消化した。細胞を軽度の粉砕によって基底膜より下で放出させ、次いでろ過した（７０μｍ）。次いで、細胞懸濁液を７０％／４０％パーコール勾配ヘオーバーレイし、１，６００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。衛星細胞を含有する７０％と４０％のパーコール溶液間の接触面を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄した。ウェスタンブロット法のためのタンパク質を抽出するために、細胞を溶解バッファーに再懸濁し、０．４５ｍｍゲージ針に通して細胞を溶解した。細胞破片を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、結果として生じるタンパク質溶液を−８０℃で保存した。
【０１４８】
初代筋芽（活性化衛星細胞）の単離
後肢筋を４週齢マウスから除去し、完全に細分化し、ＤＭＥＭ（非血清）中０．２％コラゲナーゼ１Ａで３７℃下、震盪（７０ｒｐｍ）させながら９０分間、消化した。消化物を塊が見えなくなるまで繰り返し１０ｍｌピペットで粉砕した。次いで、懸濁液を１００μｍおよびさらに７０μｍフィルタを通じてろ過した。次いで、ろ過懸濁液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを加熱増殖培地［ＤＭＥＭ、２０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ），１０％ウマ血清（ＨＳ）、１％ニワトリ胚抽出液（ＣＥＥ）］８ｍｌに再懸濁した。この細胞懸濁液を非コート１０ｃｍプレートへ１．５時間、前プレーティングし、次いで１０％マトリゲルプレートに移し、４８時間、３７℃でインキュベートした。４８時間後、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳのいずれかに変更した。細胞を２４時間後に活発に成長する条件下に収集した。ウェスタンブロット法のためのタンパク質を抽出するために、細胞を溶解バッファーに再懸濁し、０．４５ｍｍゲージ針に通して細胞を溶解した。細胞破片を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、結果として生じるタンパク質溶液を−８０℃で保存した。
【０１４９】
マイティーのウェスタン分析
プレキャストポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮｕＰａｇｅ４−１２％Ｂｉｓ−トリス）をタンパク質分離のために使用した。タンパク質１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％）によって分離し、エレクトロブロット法によってニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜上に存在するタンパク質をポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓ染料を使用して検出し、負荷でも確実に発生させた。膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中で３時間、室温（ＲＴ）でインキュベートし、非特異的抗体結合を遮断した。次いで、膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中ウサギ抗体１：５０００希釈で４℃下に一夜、静かに震盪させながらインキュベートした。抗体インキュベーション間に膜を５回それぞれ５分ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、ニトロセルロース膜を０．３％ＢＳＡ／１％ＰＶＰ／１％ＰＥＧ／ＴＢＳ−Ｔ中ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））１：２０００希釈にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギで１時間インキュベートした。ＨＲＰ活性をＥＣＬ試薬（ウェスタン・ライトニング・ケミルミネセンス試薬プラス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ）で検出した。
【０１５０】
結果：
マウス衛星細胞におけるマイティーの発現
マイティータンパク質発現のパターンを判定するために、総タンパク質を静止衛星細胞、活発に成長する筋芽から抽出した。マイティータンパク質発現レベルをウェスタンブロット法によって分析した（図８）。静止衛星細胞ではマイティータンパク質発現が検出されなかった。しかし、活発に成長する筋芽（活性化衛星細胞）ではマイティータンパク質が検出された。
【０１５１】
実施例８：筋再生におけるマイティー
方法：
ノテキシン誘発再生
６週齢野生型マウスをケタミン／ロンプン（塩酸ケタミン１００ｍｇ／ｍｌ、塩酸キシラジン２０ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ／６ｇｍ体重）で腹腔内注射によって麻酔した。毛皮を右前脛骨（ＴＡ）筋上部位から切取り、小切開を筋上で行った。１００μｌ注射器（ハミルトン社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．）を使用し、１０μｌ中ノテキシン（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ ｓｃｕｔａｔｕｓ ｓｃｕｔａｔｕｓ）（ベノム・サプライズ（Ｖｅｎｏｍ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ Ｐｔｙ株式会社（Ｌｔｄ．）、Ｔａｎｕｎｄａ、南オーストラリア州（Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔ）０．１μｌを右ＴＡへ注射した。切開をミシェル（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ）クリップで閉鎖した。ＣＯ２窒息による損傷後各々の日にマウスを安楽死させた後、頸椎脱臼を行った。左右のＴＡ筋を注意深く別々にし、秤量して免疫組織化学分析用に処理した。
【０１５２】
マイティーの免疫組織化学
マウスＴＡ筋およびヒツジ心組織を単離し、ＯＣＴ中に埋込み、液体窒素で冷蔵したイソペタン中に凍結した。低温切開片を１０μｍで切断し、スライドを使用するまで−２０℃で凍結した。切片をＰＢＳ、０．１％トリトンＸ−１００中に３０分間、室温で透過化し、ＰＢＳ、１０％正常ロバ血清、１％ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００中１：１００希釈における初代抗マイティー抗体で一夜、４℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回４分の洗浄後、スライドをＰＢＳ、５％正常ロバ血清、１％ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００中で１時間インキュベートし、二次抗体の非特異的結合を削減した。切片をビオチニル化抗ウサギ二次抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国）で１：３００希釈で１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片を最後にストレプトアビジン−コンジュゲートアレクサ フルオル（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）４８８標識三次抗体（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、米国）で１時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩素酸塩、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、米国）で対比染色し、ＤＡＫＯ蛍光マウント培地にマウンティングし、マイティー発現について分析した。対照片を初代抗体またはウサギ対照ＩｇＧのいずれかでインキュベートし、次いで上述した通り処理した。
【０１５３】
結果：
マウスＴＡ筋再生中のマイティーの発現
野生型マウスにおける筋再生中のマイティーの発現を調査するために、ノテキシンの右前脛骨（ＴＡ）筋への注射によって損傷を誘発した。注射後さまざな日にマウスを安楽死させ、ＴＡ筋を収集した。マイティー発現のパターンを判定するために、免疫組織化学を行った（図９）。損傷後１日目、筋線維の完全性への広範囲の損傷が認められたが、マイティー発現のレベルにおける変化は確認されなかった。５日までにマイティー発現レベルは０日と比べ実質的に増加し、レベルのピークは損傷後７日目であった。２８日までのマイティー発現のレベルは、対照、非損傷筋と同等であった。
【０１５４】
実施例９：ヒツジにおける梗塞後心組織におけるマイティーの発現
方法：
ヒツジ心における心筋梗塞をＳｈａｒｍａら、１９９９年に記載された公開された方法によって誘発した。心組織を０日（非梗塞）、および梗塞後２日、および６日に収集した。マイティー発現のパターンを判定するために、筋再生実施例（実施例８）に記載されている通り心組織切片で免疫組織化学を行った。
【０１５５】
結果：
非梗塞心組織ではマイティーの発現は一様であり、心筋細胞を取囲む間質内に位置した細胞に限定されていた。マイティーは心筋細胞によって発現されるようにも思われなかった。梗塞後２日のマイティーの発現は、対照心臓におけるものと類似していた。梗塞後６日までに主に梗塞域内の浸潤細胞の数における実質的な増加が認められた。マイティーの発現は壊死性心筋の部位に最も近く位置した浸潤細胞に限定されていた。浸潤細胞が生存心筋に隣接した場合、発現レベルは対照と同様に残存した。梗塞部位より遠位の浸潤細胞はマイティーを発現することはなかった（図１０）。
【０１５６】
壊死性心筋における間質線維芽細胞および浸潤細胞のマイティーの存在により、マイティーが治癒の過程に関与していることが裏付けられる。
【０１５７】
実施例１０：ヒト筋芽の分化および肥大に対するマイティーの効果
結果：
マイティーでトランスフェクされたヒト筋芽における分化の増加
ヒト筋芽における分化に対するマイティー過剰発現の効果を判定するために、ヒト筋芽をマイティーｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化培地で１２時間培養した。分化筋管の数を測定するために、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）特異的抗体を使用する免疫組織化学を行った。分化条件下の１２時間後、ＭＨＣ陽性筋管の数は、対照筋芽と比べマイティートランスフェクトヒト筋芽において多かった（図１１）。
【０１５８】
マイティーでトランスフェクトされたヒト筋芽の肥大
ヒト筋芽をマイティーｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３のみ（対照）でトランスフェクトし、分化条件下に１２時間培養した。肥大を判定するために、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）特異的抗体を使用する免疫組織化学を行い、ＭＨＣ陽性筋管当たりの筋核の数を計算した（図１２Ａ）。結果は、少数のマイティーでトランスフェクトされたヒト筋管が１−３個のみの筋核を含有し、対照と比べ多数の筋管が４−９個の筋核を含有した。ＭＨＣ発現筋管の肥大も５−９個の筋核を含有する筋管の幅を測定することによって評価した（図１２Ｂ）。マイティートランスフェクト筋管の平均幅は対照筋管と比べ大きかった（図１２Ｂ）。
【０１５９】
マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理したヒト筋芽の肥大
マイティーによって誘発された加速分化および肥大の現象を明らかにするために、ヒト筋芽を分化条件下、マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞およびＬａｃＺ（対照）Ｃ２Ｃ１２細胞から馴化培地で４８時間培養した。肥大のレベルを上記の通り評価した。マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で培養したヒト筋芽は、対照処理筋芽と比べ、１−５個の筋管のみを有する少数の筋管、および１６−２５個の筋核を有する多数の筋管を含有した（図１３Ａ）。筋核の平均数は、対照と比べマイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理したヒト筋芽において多かった（図１３Ｂ）。
【０１６０】
ＭＨＣ発現筋管の肥大もまた筋管の幅を測定することによって評価した。８個の筋核を含有するＭＨＣ発現筋管を測定した（図１３）。マイティー過剰発現Ｃ２Ｃ１２細胞からの馴化培地で処理された筋管の平均幅は、対照筋管と比べ大きかった。
【０１６１】
マイティーからの馴化培地で処理されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）における分化の増加
方法：
ヒトＲＤ（横紋筋肉腫）細胞をＡＴＣＣ（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））から得た。ＲＤ細胞を、４１．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３（シグマ・セル・カルチャー株式会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｔｄ）および５％気体ＣＯ２で緩衝したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））におけるアッセイ前に成長させた。７．２２ｎＭフェノールレッド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をｐＨ指示薬として使用した。１×１０５ＩＵ／Ｌペニシリン（シグマ（Ｓｉｇａｍ））１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ（Ｓｉｇａｍ））および１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を培地に添加した。ＲＤ細胞を３０，０００細胞／ｃｍの密度でパーマノックスチャンバースライド上にプレーティングした。２４時間後、それらをヒト筋芽について言及された通り馴化培地（マイティークローン１１）で処理し、細胞を７２時間後に固定した。ＭＨＣの免疫細胞化学を行った。
【０１６２】
結果：
ヒトＲＤ細胞をマイティー馴化培地および対照培地で処理し、７２時間分化させた。細胞をＭＨＣに対して免疫染色し、分化の程度を評価した。ＭＨＣ陽性筋管の数は対照細胞と比べ処理細胞で高く、マイティー過剰発現クローンからの馴化培地が分化を加速しうることを示した（図１５）。
【０１６３】
実施例１１：マウスマイティープロモータのクローニング
方法：
２．１ｋｂの５’上流配列をマウスゲノムＤＮＡおよび以下のプライマーを使用して増幅した。すなわち、
Ｒｅｖ ５’ＡＧＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＴＡ Ｃ ３’ （配列番号１０）
Ｆｗｄ ５’ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ３’ （配列番号１１）
ＰＣＲをＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））およびエキスパンドロングＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、メーカーのプロトコールに従い行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５秒間、５２℃で３０秒間、６８℃で３分間の３５サイクル、および６８℃で７分間の最終伸長の１サイクルであった。
【０１６４】
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分析し、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）精製カラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により精製した。精製ＤＮＡ断片を上述した通りｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクターへクローン化した。陽性組換えを選択し、制限消化およびシークエンシングによって分析した。２．１ｋｂ断片をｐＧＥＭ−ＴイージーベクターからＢｇｌＩＩおよびＮｈｅｌ酵素によってルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３Ｂへのクローニングのために切断した。ｐＧＬ３ＢをＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＬで消化し、２．１ｋｂマイティープライマー断片を、Ｔ４リガーゼを使用してライゲートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファをライゲーション反応物で形質転換し、ＬＢ寒天＋アンピシリンプレート上にプレーティングした。培養物をＬＢ＋アンピシリン培地で成長させ、プラスミドＤＮＡを前述した通り精製した。プラスミドＤＮＡを制限消化によって分析し、陽性組換えを識別した。陽性組換え（２．１構成物）をシークエンシング（配列番号５）によって確認した。トランスフェクション実験のために、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。
【０１６５】
マイティープロモータ配列は配列番号５で示されている。マイティープロモータ配列も既知の転写因子結合部位について分析した（図３）。これらの部位はプロモータ配列の決定的な役割を担っていることを示す。
【０１６６】
実施例１２：ヒトを含むさまざまな細胞系におけるマイティープロモータ活性の実施例
方法：
１ｋｂのマイティー上流配列（２．１ｋｂマイティープロモータの断片）をルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））ヘクローン化した。１ｋｂマイティープロモータ断片を２．１ｋｂプロモータ配列から制限消化によって得た。Ｓｃａ１、ＢｇｌＩＩ消化を２．１マイティープロモータ構成物で行い、〜１ｋｂ断片を切除した。次いで、この断片をルシフェラーゼ発現を推進する正確な方向で多重クローニング部位内のＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ部位へクローン化した。
【０１６７】
このプロモータ構成物２μｇおよびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）発現プラスミドｐＣＨ１１０（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））０．５または１μｇでトランスフェクション効率の標準化のためにトランスフェクションを行った。Ｃ２Ｃ１２筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＲＤ（ヒト横紋筋肉腫細胞系）および初代ヒツジ筋芽をリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００試薬（ＬＦ２０００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、メーカーのプロトコールに従って上記のベクターでトランスフェクトした。手短に言えば、細胞系を適切な成長培地中１５，０００細胞／ｃｍ２で６ウェル細胞培養皿（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上にプレーティングし、トランスフェクション前に５％ＣＯ２中で一夜、３７℃でインキュベートした。構成物をウェル当たり血清を有さないＤＭＥＭ ２５０μｌ中で希釈した。ＬＦ２０００をウェル当たり血清を有さないＤＭＥＭ ２５０μｌ中５−８μｌで希釈した。次いで、希釈ＤＮＡおよびＬＦ２０００を混合し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ＬＦ２０００混合物を適切な成長培地２ｍｌ中細胞を含有するウェルに添加した。細胞系をトランスフェクション混合物で３７℃下、５％ＣＯ２で一夜インキュベートし、その後に培地を成長または分化培地のいずれかで置換した。次いで、細胞をウェル当たりＰＢＳ５ｍｌ中で２回リンスし、レポーター溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））３００−５００μｌで溶解した。細胞溶解物１０μｌを使用し、メーカーのプロトコールによりルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してルシフェラーゼ活性を検出した。細胞溶解物５０μｌを使用し、メーカーのプロトコールによりレポーター溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））とともにβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステムを使用してβ−ｇａｌアッセイを行った。ルシフェラーゼ値をβ−ｇａｌ値に標準化し、トランスフェクション効率のために標準化した。
【０１６８】
結果：
マウスマイティー上流配列１ｋｂをさまざまな細胞系へトランスフェクトした。これらにはＣ２Ｃ１２筋芽、初代ヒツジ筋芽、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（図１６Ａ）およびヒトＲＤ細胞（図１６Ｂ）が含まれる。マウスマイティープロモータは、これら細胞系のすべてにおいて強い活性を示した。したがって、マイティープロモータは、異なる組織型およびヒトを含む種由来の細胞系において強い発現を示す。
【０１６９】
実施例１３：ミオスタチンによるマイティープロモータの用量依存阻害。
方法：
Ｃ２Ｃ１２筋芽におけるマイティープロモータのトランスフェクションの方法は、ミオスタチンタンパク質でトランスフェクトされた細胞の処理を除き上述した通りであった。トランスフェクションの２４時間後、成長培地中組換えミオスタチン４および８μｇ／ｍｌで細胞を処理した。細胞を処理の２４時間に回収した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を上記の通り判定した。
【０１７０】
結果：
１ｋｂマウスマイティープロモータをＣ２Ｃ１２筋芽へトランスフェクトし、４および８μｇ／ｍｌの増加する濃度の組換えミオスタチンタンパク質で処理した。１ｋｂマイティープロモータの活性は、ミオスタチンタンパク質４および８μｇ／ｍｌ（それぞれ、３９．２３＋／−０．９９％および５８．２２＋／−１．００％）の存在下に阻害される。さらにミオスタチンの濃度を増加することによりマイティープロモータは増加範囲に阻害された（図１７）。したがって、ミオスタチンは用量依存的にマイティープロモータを阻害する。
【０１７１】
実施例１４：ミオスタチン模倣剤（３３５）はマイティープロモータに対するミオスタチンの効果を救援する
ヒツジ衛星細胞のトランスフェクト
ヒツジ衛星細胞を上述した通りＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで成長させた。細胞を２４ウェルプレートにおいて１ｋｂマウスマイティープロモータ構成物０．４μｇおよびｐＣＨ１１０（ＳＶ４０β−ガラクトシダーゼ対照ベクター、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））０．１μｇでリポフェクタミン２０００を使用し、メーカーの説明書（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従いトランスフェクトした。２４時間後、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋３μｇ／ｍｌ野生型組換えミオスタチンまたは３３５（１５ｍｇ）もしくはミオスタチンおよび３３５に変更した。培地変更の２４時間後、細胞抽出物を作り、ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を確立されたプロトコールに従い行った。β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイをプロトコール（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従い行った。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。
【０１７２】
結果
ヒツジ芽を１ｋｂマイティープロモータおよびβ−ガラクトシダーゼベクターでトランスフェクトし、ミオスタチンまたはミオスタチン模倣剤もしくは両方で処理した。図１８に示されているように、野生型ミオスタチンによる治療とともにマイティープロモータ活性の３３％の阻害が確認された。細胞をミオスタチンと５モル過剰の３３５で処理した場合、ミオスタチンの優性阻害模倣剤のマイティープロモータ活性のわずか１９％の阻害が確認された。したがって、優性阻害ミオスタチン模倣剤３３５は、マイティープロモータのミオスタチン介在阻害を救援しうる。
【０１７３】
実施例１５：マイティープロモータの切断分析
方法：
マイティー０．６ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．４ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＣＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．３１５ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．２８７ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。マイティー０．２０９ｋｂプロモータをＮｈｅＩ制限部位５’−ＧＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’を有する順方向プライマーおよびＢｇｌＩＩ制限部位５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ−３’を有する逆方向プライマーを使用して増幅させた。これらの切断をルシフェラーゼ発現を推進させる正しい方向でｐＧＬ３ｂのＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位へクローン化した。
【０１７４】
結果
マイティープロモータ断片（０．２ｋｂ〜２．１ｋｂ）をＣ２Ｃ１２筋芽へトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性アッセイを行った。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。図１９（ＡおよびＢ）に示されている結果は、プロモータ活性が３００ｂｐ〜１ｋｂのマイティープロモータで最大であることを示す。１ｋｂ〜２．１ｋｂのプロモータ活性におけるわずかな減少があるように思われる。
【０１７５】
実施例１６：マイティー抗体製造
方法
完全長ウシマイティータンパク質に対するポリクローナル抗体がウサギにおいて引き起こす。メーカーのプロトコールに従い、最初にウシマイティーｃＤＮＡをｐＲＳＥＴ Ｂベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化し、最後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ｓｔａｒ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ形質転換した。組換えタンパク質の発現を０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、インキュベーションを２時間半継続することによって誘発した。細菌を遠心分離によって収集し、溶解バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭトリスｐＨ８．１、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）４０ｍｌ中に再懸濁し、次いで超音波で分解した。溶解物を１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、組換えタンパク質をＮｉ−アガロース親和性プロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して上清から精製した。断片をプールし、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５％グリセロールを含有する５０ｍＭトリスｐＨ８．０の２つの変更に対し９０分間４℃で透析した。精製マイティータンパク質をフロイントアジュバントで乳化し、各ウサギ（３４１ ｇ／ウサギ）へ注射した。その後、１７０ ｇマイティータンパク質／注射を含有する２つの追加抗原投与量を各ウサギに投与した。
【０１７６】
接種ラビットからの血液を収集し、４℃で１５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を血塊から分離した。プロテインＡアガロース２．５ｍｌを使用し、カラムをパックして抗体のＩｇＧ画分を精製した。１００ｍＭトリスｐＨ８．０ ２５ｍｌでカラムを洗浄した。血清のｐＨを１／１０容積の１．０Ｍトリス（ｐＨ８．０）および血清５．５ｍｌで調整し、カラムに通した。回収画分をカラムに再び通した。次に、カラムを１００ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）２５ｍｌで洗浄した。第２の洗浄を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）２５ｍｌを使用して行った。抗体を１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を使用して溶出した。溶出物を１Ｍトリス（ｐＨ８．０）５０μｌを含有する管に収集し、静かに混合した。免疫グロブリン含有画分をタンパク質推定用のブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を使用して同定した。
【０１７７】
ペプチド特異的マイティー抗体
１８マーマイティーペプチド（１７３−１９０ＡＡ）に対する抗体がＱＥＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社（Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国によって発明者の規格で生じた。
【０１７８】
ウェスタンブロット法
ウェスタンブロット分析を行い、完全長ウシマイティータンパク質および１８マーマイティーペプチド（１７３−１９０）に対して生じた抗体を検証した。具体的には、組換えウシマイティータンパク質または精製組換えマイティータンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質抽出物を、メーカーの説明書に従い、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ゲルで分解した。マイティータンパク質抗体をウェスタンブロット法には１：１０，０００で使用したが、ペプチド抗体には１：５０００希釈を使用した。
【０１７９】
結果
ペプチドとマイティータンパク質抗体の両方は、具体的には、ウェスタンブロットでの３５ｋＤａタンパク質バンドである予想サイズを認識し、これらの抗体がマイティータンパク質に特異的であることを裏付けた（図２０）。
【０１８０】
前記の説明では参照が整数または既知の等効物を有する成分に行われており、かつかかる等効物は本明細書で個別に記載されたように組込まれている。
【０１８１】
本発明は実施例として、かつその可能な実施形態を参照して説明されているが、その改良および修正がその範囲を逸脱することなく行われうることを理解すべきである。
【０１８２】
文献：
Eryl Liddell, J. and Cryer, A. (1996) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies. Wiley.
Javois, Lorette C. (1999) Immunocytochemical Methods and Protocols. Humana Press.
Kambadur, R., Sharma, M., Smith, T.P.L. and Bass, J.J. (1997) Mutations in myostatin (GDF-8) in doubled muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle. Genome Res. 7. 910 916.
Michael P. Spiller, Ravi Kambadur, Ferenc Jeanplong, Mark Thomas, Julie K.
Martyn,,John J. Bass and Mridula Sharma (2002). Myostatin is a downstream target gene of basic helix loop helix transcription factor, MyoD. Mol & Cellular Biology 22: 7066-7082.
Oliver, M. H., Harrison, N. K., Bishop, J. E., Cole, P. J. and Laurent, G. J. (1989). A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. Journal of Cell Science 92, 513-518.
Yaffe, D. and Saxel, O. (1977). Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 270, 725-727.
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】ダブル筋肉ウシおよび正常な筋肉ウシからのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図２】（Ａ）正常な筋肉ウシ（ｗｔ、レーン１）およびダブル筋肉ウシ表現型（ＢＢ、レーン２）の心組織からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。（Ｂ）ヒツジ骨格筋（レーン４）からのマイティーのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図３】（Ａ）および（Ｂ）はマイティープロモータ配列、および同定転写因子結合部位を示す図である。
【図４】筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞増殖におけるマイティーの発現の結果を示す図である。
【図５】ＭＨＣ抗体による対照およびマイティー過剰発現筋管の免疫染色を示す図である。
【図６】（Ａ）細胞領域の定量的画像分析によって測定された活発に成長するＣ２Ｃ１２クローン７および１１およびｌａｃＺ対照の測定を示す図である。定量的画像分析によって測定された筋管を含有する３核の（Ｂ）前角光散乱（ＦＡＬＳ）を測定するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（クローン７およびクローン１１において見られる右への移動は細胞サイズの増加を示す）および長さ（Ｃ）、幅（Ｄ）および面積（Ｅ）を示す図である。
【図７】（Ａ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２筋芽を分化培地（ＤＭＥＭ２％ＨＳ）中で４８、６０、および７２時間培養したことを示す図である。（Ｂ）Ｃ２Ｃ１２クローン７および１１を過剰発現するマイティー、および対照Ｃ２Ｃ１２のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図８】静止および活性化衛星細胞におけるマイティータンパク質の検出を示す図である。
【図９】骨格筋再生中のマイティーの発現を示す図である。
【図１０】梗塞後心組織におけるマイティーの発現を示す図である。
【図１１】マイティーおよび対照トランスフェクトヒト筋芽におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１２】（Ａ）筋管当たりの筋核の頻度および（Ｂ）５、６、７、８、および９個の筋核を含有する筋管の幅を示す図である。
【図１３】馴化培地処理ヒト筋芽における筋核／ＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１４】８個の筋核を含有する馴化培地処理筋管の幅を示す図である。
【図１５】馴化培地処理ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞におけるＭＨＣ陽性筋管の数を示す図である。
【図１６】マウスマイティープロモータがさまざまな細胞系において活性を有することを示す図である。
【図１７】マイティープロモータが用量依存的にミオスタチンによって阻害されることを示す図である。
【図１８】ミオスタチン模倣剤がマイティープロモータのミオスタチン介在阻害を回復しうることを示す図である。
【図１９】マイティー遺伝子の上流断片のプロモータ活性を示す図である。
【図２０】マイティータンパク質に対する抗体の適用を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１または配列番号３から選択される請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ａ）配列番号１または配列番号３の相補体と、
ｂ）配列番号１または配列番号３の逆相補体と、
ｃ）配列番号１または配列番号３の逆配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
サイレント置換または結果として生じるアミノ酸における同類置換をもたらす置換の結果として配列番号１または配列番号３と異なるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１または請求項６に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはそれらの断片を含んでなる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項９】
５’−３’方向において
ａ）遺伝子プロモータ配列と、
ｂ）請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列と、
ｃ）遺伝子末端配列と
を含んでなるベクター。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
ａ）配列番号１または配列番号３を含んでなるポリヌクレオチド、
ｂ）（ａ）の断片もしくは変種、
ｃ）（ａ）との少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、
ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチド、
ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つによってコードされたポリペプチド、
ｈ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド、
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の断片もしくは変種、および
ｊ）（ｇ）または（ｈ）に関して少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチド
のいずれか１つを含んでなる、筋成長を調節するための組成物。
【請求項１４】
ａ）配列番号５の配列、
ｂ）配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片もしくは変種
のいずれか１つを含んでなる、筋成長を調節するための組成物。
【請求項１５】
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、および
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種
のいずれか１つから選択されるポリヌクレオチドに結合可能な化合物を含んでなるマイティー（ｍｉｇｈｔｙ）遺伝子発現を調節するための組成物。
【請求項１６】
前記化合物がアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が干渉ＲＮＡ分子である、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記干渉ＲＮＡ分子がＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化合物がミオスタチンである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化合物がミオスタチン模倣剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ミオスタチン模倣剤がアミノ酸位置３３０と３５０において、またはその間でＣ末端切断されたミオスタチンペプチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ミオスタチン模倣剤がアミノ酸位置３３０、３３５、および３５０のいずれか１つにおいてＣ末端切断されたミオスタチンペプチドである、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記化合物が抗体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
筋損傷後の筋再生を促進するための請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
生物の筋成長を調節する方法であって、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物を前記生物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２９】
増加した筋肉量を有する動物を生産するための請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
筋損傷後の筋再生を促進するための請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
筋成長を調節するための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３６】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項３５または請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
筋損傷後の筋再生を促進するための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるトランスジェニック動物。
【請求項４０】
前記動物が増加した筋肉量を有する、請求項３９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、またはヒトから選択される、請求項３９または請求項４０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４２】
動物における筋肉量を予測する方法であって、
ｉ）前記動物からサンプルを得る工程と、
ｉｉｉ）配列番号１または配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１または配列番号３との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定するか、または配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種の量を測定する工程と、
ｉｖ）遺伝子発現レベルまたはポリペプチドの量を平均と比較する工程と、
ｖ）前記動物の筋肉量を予測する工程と
を含んでなる方法。
【請求項４３】
前記遺伝子発現のレベルがＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して測定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドの量がＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を使用して測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
マイティーの変種を検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、または
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片または変種
から選択されるヌクレオチド配列の使用を含んでなり、
生物由来のサンプルを前記マイティーの変種についてスクリーニングする方法。
【請求項４６】
前記変種が多型である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記多型が単一ヌクレオチド多型である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイティーの変種が変化した筋表現型と関連している、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
改善された筋肉量を有する動物を繁殖させる方法であって、
ｉ）請求項４２〜４４または４８のいずれか一項に記載の方法を使用する筋肉量の増加することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を選択する工程と、
ｉｉ）筋肉量の増加が予測される１つもしくはそれ以上の動物を繁殖させ、改善された筋肉量を有する動物を生産する工程と
を含んでなる方法。
【請求項５０】
前記動物がヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体。
【請求項５２】
−
配列番号２または配列番号４の配列に、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体の製造における配列番号２または配列番号４の配列を含んでなるポリペプチドの抗原断片。
【請求項５３】
ａ）配列番号５の配列、
ｂ）配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または
ｃ）プロモータ活性を有するそれらの断片もしくは変種
のいずれか１つを含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
マイティー開始部位の上流の少なくとも２００のヌクレオチドを含んでなる、請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
マイティー開始部位の上流の２０９、２８７、３１５、４００、６００、１０００、および２１００のヌクレオチドのいずれか１つの断片を含んでなる、請求項５４または請求項５５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項５７】
請求項５７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項５８】
筋成長の抑制または促進において潜在的に有用である１つもしくはそれ以上の化合物についてスクリーニングする方法であって、
ｉ）請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを適切なマーカー遺伝子に結合した適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉ）適切な宿主細胞を前記ベクターで形質転換する工程と、
ｉｉｉ）目的とする化合物を前記宿主細胞に投与する工程と、
ｉｖ）前記マーカー遺伝子発現のレベルの差異を測定する工程と
を含んでなる方法。
【請求項５９】
前記ベクターが、原核細胞プラスミド、真核細胞プラスミド、またはウイルスベクターのいずれか１つである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６０】
前記マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ酵素、またはβ−ガラクトシダーゼ酵素のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドのいずれか１つである、請求項５９または請求項６０に記載の方法。
【請求項６１】
筋細胞において所望のタンパク質を発現する方法であって、
ｉ）発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を単離する工程と、
ｉｉ）５’−３’方向で発現されるタンパク質のポリヌクレオチド配列に操作可能に結合された請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉｉ）前記ベクターを筋宿主細胞へ導入する工程と
を含んでなる方法。
【請求項６２】
前記ベクターが真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したベクターのいずれか１つである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６３】
前記宿主細胞が、初代筋芽細胞系、形質転換された筋芽細胞系、またはマイティープロモータが活性である細胞系のいずれか１つである、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項６４】
前記宿主細胞が宿主動物のインビボ骨格または心筋細胞である、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記宿主動物がヒツジ、雌牛、シカ、雄牛、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトのいずれか１つである、請求項６５に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２または配列番号４から選択される配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１または配列番号３から選択される請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ａ）配列番号１または配列番号３の相補体と、
ｂ）配列番号１または配列番号３の逆相補体と、
ｃ）配列番号１または配列番号３の逆配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
サイレント置換または結果として生じるアミノ酸における同類置換をもたらす置換の結果として配列番号１または配列番号３と異なるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１または請求項６に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはそれらの断片を含んでなる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項９】
５’−３’方向において
ａ）遺伝子プロモータ配列と、
ｂ）請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列と、
ｃ）遺伝子末端配列と
を含んでなるベクター。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
ａ）配列番号１または配列番号３を含んでなるポリヌクレオチド、
ｂ）（ａ）の断片もしくは変種、
ｃ）（ａ）との少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、
ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチド、
ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つによってコードされたポリペプチド、
ｈ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド、
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の断片もしくは変種、および
ｊ）（ｇ）または（ｈ）に関して少なくとも９５％、９０％、もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチド
のいずれか１つを含んでなる、筋成長を調節するための組成物。
【請求項１４】
ａ）配列番号５の配列、
ｂ）配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片もしくは変種
のいずれか１つを含んでなる、筋成長を調節するための組成物。
【請求項１５】
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、および
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片もしくは変種
のいずれか１つから選択されるポリヌクレオチドに結合可能な化合物を含んでなるマイティー（ｍｉｇｈｔｙ）遺伝子発現を調節するための組成物。
【請求項１６】
前記化合物がアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が干渉ＲＮＡ分子である、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記干渉ＲＮＡ分子がＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化合物がミオスタチンである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化合物がミオスタチン模倣剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ミオスタチン模倣剤がアミノ酸位置３３０と３５０において、またはその間でＣ末端切断されたミオスタチンペプチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ミオスタチン模倣剤がアミノ酸位置３３０、３３５、および３５０のいずれか１つにおいてＣ末端切断されたミオスタチンペプチドである、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記化合物が抗体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
筋損傷後の筋再生を促進するための請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
生物の筋成長を調節する方法であって、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物を前記生物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２９】
増加した筋肉量を有する動物を生産するための請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
筋損傷後の筋再生を促進するための請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
筋成長を調節するための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
筋成長に付随する疾患の治療または予防のための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３６】
前記疾患が筋萎縮に付随している、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記疾患が、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮、肥大、筋消耗関連性癌またはＨＩＶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または梗塞を含む心筋成長に付随する疾患から選択される、請求項３５または請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
筋損傷後の筋再生を促進するための医薬品の製造における請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるトランスジェニック動物。
【請求項４０】
前記動物が増加した筋肉量を有する、請求項３９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
ヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、またはヒトから選択される、請求項３９または請求項４０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４２】
動物における筋肉量を予測する方法であって、
ｉ）前記動物からサンプルを得る工程と、
ｉｉｉ）配列番号１または配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１または配列番号３との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片もしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定するか、または配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変種の量を測定する工程と、
ｉｖ）遺伝子発現レベルまたはポリペプチドの量を平均と比較する工程と、
ｖ）前記動物の筋肉量を予測する工程と
を含んでなる方法。
【請求項４３】
前記遺伝子発現のレベルがＲＴＰＣＲまたはノーザン分析を使用して測定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドの量がＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を使用して測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
マイティーの変種を検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号５、
ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）（ａ）または（ｂ）との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体、
ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの逆相補体、または
ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの断片または変種
から選択されるヌクレオチド配列の使用を含んでなり、
生物由来のサンプルを前記マイティーの変種についてスクリーニングする方法。
【請求項４６】
前記変種が多型である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記多型が単一ヌクレオチド多型である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイティーの変種が変化した筋表現型と関連している、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
改善された筋肉量を有する動物を繁殖させる方法であって、
ｉ）請求項４２〜４４または４８のいずれか一項に記載の方法を使用する筋肉量の増加することが予測される１つもしくはそれ以上の動物を選択する工程と、
ｉｉ）筋肉量の増加が予測される１つもしくはそれ以上の動物を繁殖させ、改善された筋肉量を有する動物を生産する工程と
を含んでなる方法。
【請求項５０】
前記動物がヒツジ、雌牛、雄牛、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号２または配列番号４の配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体。
【請求項５２】
−
配列番号２または配列番号４の配列に、もしくは配列番号２または配列番号４との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリペプチドに優先的に結合する抗体の製造における配列番号２または配列番号４の配列を含んでなるポリペプチドの抗原断片。
【請求項５３】
ａ）配列番号５の配列、
ｂ）配列番号５との少なくとも９５％、９０％、または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または
ｃ）プロモータ活性を有するそれらの断片もしくは変種
のいずれか１つを含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
マイティー開始部位の上流の少なくとも２００のヌクレオチドを含んでなる、請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
マイティー開始部位の上流の２０９、２８７、３１５、４００、６００、１０００、および２１００のヌクレオチドのいずれか１つの断片を含んでなる、請求項５４または請求項５５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項５７】
請求項５７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項５８】
筋成長の抑制または促進において潜在的に有用である１つもしくはそれ以上の化合物についてスクリーニングする方法であって、
ｉ）請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを適切なマーカー遺伝子に結合した適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉ）適切な宿主細胞を前記ベクターで形質転換する工程と、
ｉｉｉ）目的とする化合物を前記宿主細胞に投与する工程と、
ｉｖ）前記マーカー遺伝子発現のレベルの差異を測定する工程と
を含んでなる方法。
【請求項５９】
前記ベクターが、原核細胞プラスミド、真核細胞プラスミド、またはウイルスベクターのいずれか１つである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６０】
前記マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ酵素、またはβ−ガラクトシダーゼ酵素のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドのいずれか１つである、請求項５９または請求項６０に記載の方法。
【請求項６１】
筋細胞において所望のタンパク質を発現する方法であって、
ｉ）発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を単離する工程と、
ｉｉ）５’−３’方向で発現されるタンパク質のポリヌクレオチド配列に操作可能に結合された請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを適切なベクターへ挿入する工程と、
ｉｉｉ）前記ベクターを筋宿主細胞へ導入する工程と
を含んでなる方法。
【請求項６２】
前記ベクターが真核細胞ベクター、ウイルスベクター、または遺伝子療法に適したベクターのいずれか１つである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６３】
前記宿主細胞が、初代筋芽細胞系、形質転換された筋芽細胞系、またはマイティープロモータが活性である細胞系のいずれか１つである、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項６４】
前記宿主細胞が宿主動物のインビボ骨格または心筋細胞である、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記宿主動物がヒツジ、雌牛、シカ、雄牛、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、魚、またはヒトのいずれか１つである、請求項６５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５０７２５１（Ｐ２００８−５０７２５１Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１０７３（Ｐ２００６−５４１０７３）
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１９９３
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０７１０３４００）オリコ・リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＩＣＯ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１９９３
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０７１０３４００）オリコ・リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＩＣＯ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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