本態性動脈性高血圧症を発症する危険度を測定する方法とキット
高血圧症（ＨＴ）に対する疾患感受性や素因と関連する遺伝子、ＳＮＰマーカー及びハプロタイプを開示する。ＨＴリスク遺伝子に存在する多型を用いた診断方法、及び臨床経過やＨＴに対する治療の効果を予測するための方法も開示する。本発明の遺伝子、遺伝子産物及び薬剤は、ＨＴの予防や治療の効果をモニタリングするのにも有用である。ＨＴの診断、治療の選択及び予後判定を行うためのキットも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈性高血圧症（ＨＴ）などの心血管障害（ＣＶＤ）の診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＨＴの素因、発症傾向や感受性を診断又は判定するための方法を提供する。特に本発明は、試験する対象生物から得た生物学的サンプルを提供し、そして生物学的サンプルから、ゲノム上の１種又は数種の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーの存在又は不存在を検出することを包含する方法に焦点を当てたものである。更に本発明は、ＨＴを発症する確率を提供するスコアを構築するために、遺伝的情報及び表現型の情報に加えて、アンケートで得られた情報をも使用する。また、本発明は、この方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、治療的及び予防的介入（例えば、食事についての助言）を行う対象を決めるためのみならず、治験薬や他の介入方法に関する臨床試験の対象を層化するための、病因論に基づくＨＴの診断に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
公衆衛生におけるＣＶＤとＨＴの重要性
心血管障害（ＣＶＤ）（ＩＣＤ／１０コード Ｉ００−Ｉ９９、Ｑ２０−Ｑ２８）には、他の疾患と共に、虚血性（冠動脈）心疾患（ＩＨＤ、ＣＨＤ）、高血圧症、脳血管性疾患（脳卒中）及びリュウマチ熱／リュウマチ性心疾患が含まれる（AHA, 2004）。ＨＴ（ＩＣＤ／１０ Ｉ１０−Ｉ１５）は、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投薬を受けている状態と定義する（AHA, 2004）。ＣＶＤそのものを発症していなくとも、ＨＴは、ＩＨＤ、脳卒中や鬱血性心不全（ＣＨＦ）などのＣＶＤの危険因子である。１回目の心臓麻痺を発症したヒトの約半数と１回目の脳卒中を発症したヒトの３分の２の血圧（ＢＰ）は、１６０／９５ｍｍＨｇよりも高い。症例の９１％において、ＨＴはＣＨＦに先んじて発症する。
【０００３】
ＨＴ患者の９０〜９５％は、その根本的病因が未だ分らない本態性ＨＴである。異質な遺伝的及び環境的要因による持続的な血圧の上昇を本態性ＨＴと呼ぶ。その有病率は、診断に用いるＢＰの測定法や実行閾値に関係なく、年齢と共に上昇する。ＨＴは、腹部肥満度、脂質代謝異常、グルコース不耐性、高インスリン血症や高尿酸血症などと共に心血管障害危険因子とされているが、これは根本的病因が共通するためかもしれない（Salonen JT et al, 1981, 1998、Staessen JA et al, 2003）。
【０００４】
２００１年には、推定１，６６０万人 −即ち地球上の全死亡者数の三分の一− が色々な形のＣＶＤ（７２０万人がＨＴ、５５０万人が脳血管障害、そして更に３９０万人が高血圧性の又は他の心臓の病態）によって死亡した。少なくとも年間２千万人が心臓麻痺や脳卒中から生還し、その中のかなりの人数が高額な臨床介護を必要とし、長期介護財源に大きな負担を課す。ＣＶＤは男性、女性そして子供にとって、破壊的な疾患であることを認識する必要がある（AHA, 2004）。
【０００５】
全世界のＣＶＤ死亡者の約８０％が、発展途上の低所得国及び中所得国で生じた。２０１０年までには、ＣＶＤは先進国と発展途上国の両方で主な死因となることが推定される。ＣＶＤ発症率の上昇は、工業化、都市化、経済発展及び食糧市場のグローバリゼーションに伴う、世界中での食習慣、運動量及びタバコ消費量の著しい変化を反映している（WHO, 2004）。これにより、比較的最近の環境危険因子及び行動危険因子の役割が強調される。しかし、人種間に見られるＣＶＤの発病率と罹患率の差及び家系間に見られるＣＶＤ発症率の偏りは、遺伝性の危険因子が主要な役割を担うことを示唆している。
【０００６】
障害調整生存年数（ＤＡＬＹ）によって障害を計測すると、ＣＶＤは、全世界のＤＡＬＹの９．７％、先進国のＤＡＬＹの２０．４％、そして発展途上国のＤＡＬＹの８．３％をもたらした。ＨＴは、全世界のＤＡＬＹの１．４％、先進国のＤＡＬＹの４．７％、そして発展途上国のＤＡＬＹの０．９％をもたらした（Murray CJL and Lopez AD, 1997）。
【０００７】
ＮＨＡＮＥＳ III 研究（１９８８〜１９９４）からのデータに基づくと、２００１年には、何らかの形態のＣＶＤ罹患者数はアメリカ人で６，４４０万人と推定され、これは有病率２２．６％（男性が２１．５％、女性が２２．４％）に相当する。このうち、５，０００万人がＨＴを発症していた（有病率は２０％）。ＨＴを患う患者のうち、３０％はＨＴの自覚がなく、３４％は治療によってＨＴを抑制しており、２５％は治療中であるがＨＴは抑制されておらず、１１％は治療を受けていない（AHA, 2004）。ＨＴは発展途上国においても公衆衛生問題であり、このような国では、有病率が１０％以上であることが珍しくなく、多くの場合は、ＨＴの自覚、治療、及び血圧抑制のレベルの低さと関連している（Fuentes RM et al, 2000）。
【０００８】
アメリカ合衆国において２００４年にＣＶＤに係った費用は、推定３，６８４億ドル（ＨＴが１，３３２億ドル、脳卒中が５３６億ドル、高血圧症が５５５億ドル）である。この額には、健康維持に係った費用（直接損害額）及び疾病と死亡に伴う生産性の低下（間接損害額）が含まれている（AHA, 2004）。
【０００９】
本態性ＨＴの病態生理学
循環器内の血液を動かすのに必要な圧力は、心臓のポンプ機能［心拍出量（ＣＯ）］と動脈の柔軟性［末梢抵抗（ＰＲ）］によって供給される。一方、血圧（ＢＰ）を決めるこのような一次決定因子は、いずれも複雑な一連の因子の間の相互作用によって決まる。
【００１０】
心拍出量に影響を与える因子
心拍出量（ＣＯ）の増加は、過動循環を示すことのある、境界域高血圧症の若年患者の一部で見られる症状である。これがＨＴの原因であるならば、論理的には、以下の２つの過程のいずれかによってＣＯの増加が生じたと考えられる： 体液量（前負荷）の増加又は心臓の神経刺激による収縮性の増加。しかし、ＣＯの増加がＨＴの発症に関与していたとしても、ＣＯの増加が持続するとは考えられない。慢性的なＨＴにおける典型的な血行動態的所見は、上昇したＰＲと正常なＣＯである（Cowley AW, 1992）。
【００１１】
心拍数の増加は、単純に過動循環を反映したり、交感神経性活動の増加の指標となったりするものではないが、心拍数の増加は、ＨＴ発症の独立した予測因子であることが複数の疫学的調査によって示されている（Palatini P and Julius S, 1999）。
【００１２】
左室肥大は、血管抵抗の増加に対する代償機構と一般的に考えられている。しかしながら、繰り返される神経刺激に対する一次応答を反映するものとも考えられ、それ故に、ＨＴ発症メカニズム（Julius S et al., 1991c）のみならず、動脈硬化によるＢＰ上昇を補うためにＣＯを増幅させる現象（Segers P et al., 2000）とも考えられる。
【００１３】
ＣＯ増加によってＨＴを誘導する他のメカニズムとしては、循環体液量（前負荷）の増加が挙げられる。しかし、大部分の研究において、ＢＰの高い対象生物の血液量と総交換性ナトリウム量は正常対象生物よりも低い（Harrap SB et al., 2000）。血液総量が増大していなくとも、より大きな末梢血管収縮によって、より多くの血液が中央領域又は心肺領域に行き渡るように血液を再分配することができる（Schobel HP et al., 1993）。その結果、心臓への静脈還流量は増加し、ＣＯの増加を仲介することが可能となる。
【００１４】
過剰なナトリウム摂取は、体液量と前負荷を増加することでＣＯを増加し、その結果、ＨＴを誘導する（Chobanian AV and Hill M, 2000）。実験データ（Tobian L, 1991）と疫学的証拠（Stamler J et al., 1997）の両方が、ヒトにおけるＨＴと高ナトリウム／カリウム比との密接な関連性を支持している。工業社会におけるほぼ全員が高ナトリウム食を摂取しているものの、その約半数のみがＨＴを発症するという事実は、ナトリウムに対するＢＰの感受性の程度の多様性を示唆している（Weinberger MH, 1996）。
【００１５】
健常者においては、ＢＰが上昇すると、腎臓によるナトリウムと水分の排泄が増加して体液量が低下し、ＢＰが正常値に戻る。この現象を、圧依存性利尿という。動物実験とコンピューターモデルによると、腎臓による体液量の調節は、ＢＰの長期制御において支配的な機構であると考えられる（Guyton AC 1961, 1992）。従って、ＨＴを発症した場合、圧依存性利尿（pressure-natriuresis）による調節機構に何らかの異常があるはずであり、そうでなければＢＰは正常に戻るはずである（Cowley AW and Roman RJ, 1996）。一次ＨＴの患者においては、血圧−ナトリウム排泄曲線をリセットすることは、ＢＰが正常値に戻ることを妨げる（Palmer BF, 2001）。体液バランスを維持するための圧依存性利尿への転換には、ＢＰの上昇が必要である。血圧と利尿作用との関係は、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）、交換神経活動、心房性ナトリウム利尿因子、アラキドン酸代謝産物や腎内酸化窒素などの神経性因子や液性因子によって変えることができる（Moreno C et al., 2001、Majid DS et al., 2001）。主な調節因子はＲＡＳ（Hall JE et al., 1999; van Paassen P et al., 2000）である可能性が高く、これは末梢血管収縮に必要なよりもはるかに低い濃度のアンジオテンシンIIによって、腎臓によるナトリウム再吸収を増加させる。アンジオテンシンIIは血管平滑筋と副腎皮質に作用するのみならず、心臓、腎臓、中枢神経系と自律神経系にも作用する。これらの作用は、アンジオテンシンIIの抹消血管系に対する体液量貯留効果と血管収縮効果を増幅するので、ＣＯとＰＲの両方に影響を与える。更にアンジオテンシンIIは、ＢＰに対する効果とは独立して、細胞増殖と肥大を誘導する（Su EJ et al., 1998）。又、アンジオテンシンIIは、転写因子κ−Ｂ（Luft FC, 2001）と接着分子−１の発現（Tummala PE et al., 1999）の活性化によって、血管平滑筋細胞の炎症性応答（Kranzhofer R et al., 1999）を誘導するとも考えられ、これはアテローム性動脈硬化症への直接的な連鎖となる可能性がある。
【００１６】
ストレスは交感神経系（ＳＮＳ）を直接活性化することができ、一方、ＳＮＳの過剰活性は、高ナトリウム摂取、ＲＡＳやインシュリン抵抗性を含む他の可能なメカニズムと相互作用することができる。相当な量の証拠によって、初期ＨＴにおけるＳＮＳ活性の増加が裏付けられており（Esler M et al., 2001）、更に印象的なことに、このことは高血圧症の親を持つ子において見受けられ、また、正常血圧を維持していても、高血圧症の親を持つ子の大部分がＨＴを発症する可能性が高い。ＨＴの病因論におけるＳＮＳ活性の特定の役割が何であれ、ＳＮＳ活性は、高血圧患者において心血管に関する疾病率と死亡率が早朝の時間帯に増加する現象に関与すると考えられる。目覚めと共にエピネフリンレベルの上昇が開始し、起き上がるとノルエピネフリンが急激に上昇する（Dodt C et al., 1997）。増加したＳＮＳ活性の結果として、ＢＰが突然に著しく上昇し、このＢＰ上昇が、早朝の突然死、心臓麻痺及び脳卒中の原因の少なくとも一部を担っている。交感神経活性の増加は、以前は心血管疾病率に関連すると思われていた、高血圧症患者の多くに見られる心拍数の増加にも関与するであろう。
【００１７】
末梢抵抗に影響を与える因子
ＨＴは、主として動脈の管腔の大きさ（即ち半径）の低下によるＰＲの増加によって維持される。ポアズイユの法則によると、血管抵抗は、血液の粘度と動脈系の長さの両方に比例し、管腔の半径の三乗に反比例する。血液の粘度と動脈系の長さは変化したとしてもわずかであり、管腔の半径の小さな変化でさえ大きな効果をもたらすので、慢性的なＨＴに見られる血管抵抗の増加は、抵抗値の小さな動脈や小動脈の内径の変化を反映していることは明らかである（Folkow B et al., 1970）。血管壁の厚みと管腔直径の比が増加しているために、抵抗性静脈が刺激されると、高い血管壁圧力と管腔内圧力が発生する。
【００１８】
ＨＴにおいては、小さな動脈は機能的、構造的且つ機械的な変化生じ、その結果、管腔の大きさが低下し、抹消抵抗が増加する（Mulvany MJ, 2002、Intengan HD and Schiffrin EL, 2001）。機能的変化には、反応性の増加と応力緩和性（relaxation）の減退が含まれ、興奮収縮連関の変化、血管平滑筋細胞の電気的性質の変化、又は内皮系の機能不全を反映する（Johns DG et al, 2000、Feldman RD and Gros R, 1998）。主な構造変化には細胞増殖の増加による再構築、細胞外マトリックスの沈着と炎症が含まれる（Mulvany MJ, 2002、Intengan HD and Schiffrin EL, 2001、Brasier AR, 2002）。血管平滑筋細胞はこれら事象の中心にあり、ＨＴで生じる変化の基となる動的なプロセスにおいて基礎的な役割を担う。
【００１９】
ＨＴにおける血管の変化は、シグナル伝達を調節する液性因子と機械的因子に関連し、その結果、中膜の細胞成分の機能と成長の異常をもたらす（Touyz RM, 2000、Koller A, 2002）。ＨＴにおいて動脈を調節する液性因子としては、アンジオテンシンII、エンドセリン−１、カテコールアミン、バソプレシンなどの血管収縮作用物質；酸化窒素、内皮由来過分極因子、ナトリウム利尿ペプチドなどの血管拡張作用物質；インシュリン様増殖因子−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子などの増殖因子；及びトランスフォーミング成長因子β、腫瘍壊死因子、インターロイキンなどのサイトカインが挙げられる（Touyz RM, 2000）。ＨＴにおいて脈管構造に影響を与える機械的因子としては、ずり応力、壁体応力、と圧力そのものによる直接的な作用が挙げられる（Touyz RM, 2000、Koller A, 2002）。これら因子の他には、細胞内及び細胞間伝達分子として機能する活性酸素種（ＲＯＳ）も血管の柔軟性と構造を調節するという証拠があり、証拠は増加している（Wilcox CS, 2002; Berry C et al, 2001）。
【００２０】
アンジオテンシンIIのシグナル伝達に関する分野における最近の発展は、その血管収縮特性に加えて、アンジオテンシンIIは、強力な分裂促進様及び炎症誘発様の特性を有するという報告がある。これらの作用は、非受容体型チロシンキナーゼと受容体型チロシンキナーゼの両方のリン酸化によって仲介される（Touyz RM, 2003）。ＨＴにおける異常な血管機能の基となる多くのシグナル伝達事象は、細胞内酸化還元状態の変化の影響を受けるということがますます明らかになってきた。特に、ＲＯＳの生物学的利用率の増加は、増殖性シグナル伝達経路を刺激し、炎症誘発遺伝子の発現を誘導し、興奮収縮連関を変化させ、内皮の機能を妨害する（Touyz RM, 2003）。
【００２１】
ＨＴの原因となる種々の機能及び構造変化と協調して、動脈は硬くなる、即ち、弾性が低下する。血管の硬化は年齢と共に進行的に増加し（Slotwiner DJ et al., 2001）、拡張期血圧と比較して収縮期血圧の進行的な増加をもたらし、今では心血管性危険度の主な決定因子と認識されている、脈圧の典型的な上昇をもたらす（Beltran A et al., 2001）。硬さと弾性の測定値は、ＨＴ発症に関する独立した予測因子（Liao D et al., 1999）及びＨＴ患者における心血管性危険度のマーカー（Blacher J et al., 1999）であることが示されている。ＢＰ脈波形に反映される大動脈の物理的特徴の変化は、ＢＰと脈圧のみならず、心筋の運動と性能を変化させる。
【００２２】
ＢＰの上昇に繋がる病態生理学的メカニズムは複雑であるため、いかなる高血圧患者においても、選択的な、メカニズムに基づく抗高血圧治療がほとんど不可能である。ＨＴは中年と高齢者の間で広く蔓延しており、これら個体におけるＢＰ制御の成功率は低い。治療のための現行のガイドラインでは、通常、ＨＴを治療するための一般的な治療を推奨しており、ＢＰ上昇の裏に潜んだ病態生理学に基づく治療の選択についてはわずかな重点しか置かれていない（Chobanian AV et al, 2003、ESH/ESC, 2003）。特定の原因に関する認識の増加と共に、副作用の少ない、個別の病態生理学的メカニズムに対して選択的な治療法の開発が可能となり、それによってＢＰのより効果的な低下がもたらされる。遺伝学、ジェノミクス及びプロテオミクスの強力な新技術を応用生理学と集団研究と統合して使用することにより、今後数十年の内に、ＨＴの治療や更には予防のためのより選択的且つ効果的な取り組みが可能となる（Oparil S et al, 2003）。
【００２３】
本態性ＨＴ： 多遺伝子性疾患
核家族の研究によって、家族内の方が家族間よりもＢＰの類似性が高いことが示され、遺伝率推定値は０．２０〜０．４６の範囲内である（Fuentes RM, 2003）。双子に関する研究は、二卵性双生児よりも一卵性双生児においてＢＰの一致性が高いことを示し、最も高い遺伝率推定値は０．４８〜０．６４である（Fuentes RM, 2003）。養子研究は、同じ家庭に暮らす養子を含む兄弟よりも生物学的な兄弟においてＢＰの一致性が高いことを示し、遺伝率推定値は０．４５〜０．６１である（Fuentes RM, 2003）。
【００２４】
高血圧と低血圧がメンデル遺伝学的な形を取ることは稀であるため、単一遺伝子がＢＰに主要な効果をもたらすことも考えられる（Lifton RP et al, 2001）。同定可能な単一遺伝子変異が原因となるＨＴはわずか数パーセントであるが、このような稀な疾患の研究は、より一般的な形のＨＴにかかりやすくする病態生理学的メカニズムを解明し、新規な治療的手法を示唆するかもしれない（Lifton RP et al, 2001）。今日までに、メンデル型のヒトＨＴをもたらす１０個の遺伝子の変異と低血圧症をもたらす９個の遺伝子の変異が報告されている（Lifton RP et al, 2001、Wilson FH et al, 2001）。これらの変異は、腎臓による塩分の処理を変化させることでＢＰに影響を与えるが、これはＨＴの発症が、塩・水分貯留をもたらす、遺伝的に決定された腎臓の機能不全に依存するという仮説を強化するものである（Guyton AC, 1991）。重要なことに、今日までに同定された全ての単遺伝子性ＨＴ症候群は、腎性塩貯留をもたらす障害によるものであり、一方、全ての低血圧症候群は、腎臓の過剰な塩排泄という機構を共有している（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。
【００２５】
ＨＴの単一遺伝子性の原因の中で最も良く研究されているのはリドル症候群である。リドル症候群は、上皮ナトリウムチャンネルの構成的な活性化が、重症且つ治療耐性的なＨＴを発症しやすくする、稀であるが臨床的に重要な疾患である（Shimkets RA et al, 1994）。上皮ナトリウムチャンネルの活性化は、チャンネルのβ又はγサブユニットの変異に遡ることができ、この変異の結果として、腎臓の集合管の段階での不適切な塩貯留が起こる。リドル症候群の患者は典型的な症状として、容量依存性の、低レニン・低アルドステロン性ＨＴを発症する。
【００２６】
大部分の症例において、ＨＴは遺伝因子、環境因子及び人口統計学的因子の複雑な相互作用の結果である。遺伝子解析方法、特に候補遺伝子関連研究とゲノムワイドな連鎖研究（ゲノムワイドスキャン、ＧＷＳ）、の技術発展は、一次ＨＴの発症に寄与する遺伝子を集団から探索することを可能にした。
【００２７】
これまでのところ、候補遺伝子アプローチは、連鎖アプローチよりも多くの、ＢＰに影響を与えると見られる変異型遺伝子の例を提供してきた。考慮するに値する候補遺伝子には、ＢＰの調節に関与することが知られる生理学的システムに関与する遺伝子と、マウスモデルにおいてＢＰに影響を与えることが知られる遺伝子が含まれる。今日までに、８０以上の候補遺伝子がＨＴについて評価されている（Fuentes RM, 2004、未出版の報告）。しかし、ＨＴとの関連が広く再現されている遺伝子は次の３種のみである： アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＧＴ）、アデューシン１（ＡＤＤ１）とグアニンヌクレオチド結合タンパク質β−３サブユニット（ＧＮＢ３）（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。ＨＴ治療に影響を与える遺伝子−環境相互作用が、ＡＧＴ、ＡＤＤ１と塩摂取の低下との間（Hunt SC et al, 1998、Hunt SC et al, 1999、Cusi D et al, 1997）及びＡＤＤ１、ＧＮＢ３と利尿薬治療との間（Cusi D et al, 1997、Turner ST et al, 2001）で見られた。ＨＴ危険度の発生に影響を与える遺伝子−遺伝子相互作用が、ＡＤＤ１とＡＣＥ遺伝子のＩ／Ｄ多型との間に見られた（Staessen JA et al, 2001）。候補遺伝子研究から今日までに明らかになった問題点としては、多くの研究において統計処理能力の限界によって生じた解析不足、集団間に見られる予想通りの多様性、研究対象生物のより詳細なフェノタイピングの必要性、集団のＨＴ有病率に対して研究遺伝子の影響が比較的小さいこと、そして遺伝型に基づいて治療法を推奨するにたる充分な確実性がこれまでの遺伝子研究で得られた因果関係には欠けていることが挙げられる（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。
【００２８】
これまでに、ＢＰ／ＨＴの遺伝子座を特定するために、３０件を超えるＧＷＳ研究が報告されている（Fuentes RM, 2004、未出版の報告）。いくつかの研究は家族を使用し、その他の研究は共に発症した兄弟／姉妹又は一方だけが発症した兄弟／姉妹を用いていた。少なくとも暗示的なＬＯＤスコアを示す、ＢＰ／ＨＴと連鎖した遺伝子座が、全ての染色体に見られた。しかし、最も驚くべきことは、一貫して連鎖を示す遺伝子座がないことである。Koivukoski L et al, 2004 は、出版済みの、白色人種に関する９件のゲノムワイドスキャン（ＢＰに関するもの５件とＨＴに関するもの４件）に対してゲノムサーチ・メタ解析（ＧＳＭＡ）を行い、個別の研究においては連鎖の程度が中庸か有意ではないと判断された染色体 2p12-q22.1と3p14.1-q12.3 が、ＢＰ／ＨＴ感受性領域である証拠を見つけた。この結果は、ヒトＨＴの不均質性に加えて、異なる方法を用いた研究を比較するという試みに存在しうる問題を説明している。
【００２９】
集団遺伝学の機会
ＨＴの遺伝的病因学に関連した過去の医学的研究は、その大部分が後向きの対照研究とヒトの家族研究、及び遺伝子組み換え動物に関する研究に基づいている。つい最近になって分ったことであるが、後向きの対照研究は生存率と選択率の偏りが起きやすく、このような研究は、多数の候補遺伝子に関して無数の偏った知見を生み出した。一般的に用いられる手法は、罹患したヒトと罹患していないヒトとの間で遺伝子発現を比較することである。しかし、大部分が横断研究による遺伝子発現研究では、原因と結果を分けることはできない。ヒトの病態生理学は独特なので、ＨＴについて動物モデルから得られた知見をヒトに対して一般化することはできない。ヒト疾病の遺伝的病因学を明確にするための最も重要な手法が遺伝的疫学的研究である理由は、動物研究が不適切であるためである。
【００３０】
ヒトにおける前向きコホート研究はこのような問題を解決する。ＧＷＳ、シークエンシング技術及びデータ解析方法の発展によって、複雑且つ多因子性の性質に係る罹病性遺伝子を特定し、この疾病における遺伝的素因及び環境／生活習慣因子の役割を新たな精密さをもって分析する試みが今では可能となった。遺伝的効果及び環境効果は一生の間に変化し、遺伝子情報データセットにおける縦断研究のみがこのような効果の研究を可能にする。疾病遺伝子の発見において集団遺伝学的手法が他の方法よりも優れる主な利点は、ヒトにおいて有効な診断マーカーが得られる点である。
【００３１】
ＨＴのような主要な公衆衛生問題を引き起こす遺伝子の同定は、以下に示す分子生物学、集団遺伝学及びバイオインフォマティクスにおける最近の発展によって、今では可能になった： １．操作コストの低下とスループットの増加に劇的な変化をもたらす、新しいジェノタイピング・プラットフォームの入手可能性； ２．高密度マーカー地図を用いたゲノムスキャンの応用； ３．ハプロタイプ共有分析を用いた、連鎖不平衡を試験するための新しい強力な統計学的手法によるデータ解析；そして ４．遺伝的に均一な集団におけるゲノムスキャンには、従来考えられていたよりも少数の遺伝子マーカーで充分であるという認識。
【００３２】
マイクロサテライトマーカーと連鎖解析を用いた古典的なＧＷＳは、一般的な疾病の原因となる遺伝子の発見には成功していない。失敗の一因はＧＷＳに用いた遺伝子マーカーの数があまりにも少なかったことであり、他の一因は研究した集団があまりにも不均一だったことである。ヒトゲノムプロジェクトとジェノタイピング技術の発展により、全ヒトゲノムのマッピングのために、初めての高密度マーカー地図が最近入手可能となった。ユリラブ社（Jurilab）の使用したマイクロアレイは１００，０００個以上の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーのためのプローブを含有する。これらのＳＮＰは、ＨＴの原因となる疾病遺伝子の大部分を発見するのに充分に密集した、全ゲノムを網羅するマーカー地図を始めて形成する。
【００３３】
東フィンランド創始者集団における遺伝的均一性
フィンランド人は、約４，０００年前と約２，０００年前に起きた２つのヒト移民群を先祖とする。Ｙ−染色体ハプロタイプとミトコンドリア配列の両方が、フィンランド人の遺伝的多様性は他のヨーロッパ集団と比べて低いことを示し、フィンランドが長い間孤立していたことを裏付ける（Sajantila A et al, 1996）。４００年以上前のグスタヴ・ヴァーサ王の時代（１５２３年〜１５６０年）には、後期移住地域（late settlements）と呼ばれる、地域的な孤立集団（regional subisolates）が内部移住によって形成された（Peltonen L et al, 1999）。この中でも最も孤立していた地域が東フィンランドである。
【００３４】
東フィンランドの人口は、効果的な遺伝子発見プログラムを実施するのに充分な大きさを有する、現在知られる遺伝的に最も均一な隔離集団である。均一性の理由は、人口の年齢が若いこと（世代数が少ない）；創始者が少ないこと；長期に渡る地理的な隔離；そして戦争、飢餓と致死病の流行のよる人口増加の妨害が生じたことである。
【００３５】
東フィンランド人口の遺伝的均一性故に、重要な疾病素因遺伝子に含まれる変異は少なく、罹患した個体は類似した遺伝的背景を共有している。より強力な連鎖不平衡（ＬＤ）故に、他の集団と比べてＧＷＳに必要なＳＮＰと対象者はより少数である。
【００３６】
発明の概要
本発明は、ＨＴに対する危険度の変化に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカー、これらマーカーの組み合わせ及びハプロタイプ、並びに該マーカーやハプロタイプが位置する遺伝子座が内部又は近傍に存在する、ＨＴに関連する遺伝子に関する。該ＳＮＰマーカーは、ＨＴを発症する危険度の上昇又はＨＴを発症する危険度の低下、即ち、ＨＴに対する防御、のいずれかに関連する。ここで「予測」又は危険度とは、危険度の上昇又は低下を含意する。
【００３７】
従って本発明は、ＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、ＨＴ関連遺伝子領域に含まれるハプロタイプ、公知の遺伝子ではあるがＨＴとの関連は知られていない遺伝子、そしてＨＴリスク遺伝子に存在する多型を用いた、ＨＴに対する疾患感受性又は素因を推定するための方法のみならず、ＨＴの治療の臨床経過及び効果を予測するための方法を提供する。更に本発明は、本願で開示するＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、ハプロタイプ及び遺伝子に基づく、新規な方法及び組成物を提供する。
【００３８】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法であって、ＳＮＰマーカーとハプロタイプの存在を検出するか、表２〜８に示したＨＴリスク遺伝子の発現の変化や、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの変化を検出することを包含する方法に関する。変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
【００３９】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法に関する。ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための該方法は、個体の核酸配列に存在する、危険性を示すハプロタイプの検出を包含する。
【００４０】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性を推定するためのキットであって、その全体又は一部として、ＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を増幅するための増幅試薬、ＳＮＰマーカーのジェノタイピング用の検出試薬、及びデータ解析と危険度の評価のためのソフトウエアを包含する試験キットに関する。
【００４１】
１つの態様において本発明は、ＨＴに対する素因を診断するための方法に関する。ＨＴに対する個体の素因を診断するための該方法には、ＨＴを予測するＳＮＰマーカーの存在の検出みならず、該マーカーに関連する遺伝子の発現の変化の検出も含まれる。変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
【００４２】
本発明の更なる目的は、対象生物の生物学的サンプルからＳＮＰマーカーを検出することで、ＨＴに対する危険度を同定するための方法である。この方法によって得られた情報は、個体に関する他の情報、例えば、血液検査の結果、臨床検査の結果及びアンケートの結果、と組み合わせることができる。血液検査の結果としては、血漿又は血清のコレステロール値及び高比重リポタンパク質コレステロール値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アンケートによって集める情報には、性別、年齢、家族歴や病歴、例えばＨＴと糖尿病の家族歴に関する情報が含まれる。検査によって集める臨床情報には、例えば、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、収縮期と拡張期のＢＰ及び心拍数が含まれる。
【００４３】
本発明の方法は、疾病発症前又は発症後のＨＴの正確な診断を可能とし、ＨＴによる衰弱効果を減少又は最小化する。この方法は、臨床症状やＨＴの兆候を示さない者、ＨＴを既に発症した者、ＨＴの家族歴を有する者、あるいはＨＴに対する危険因子のレベルが上昇している者に適用することができる。
【００４４】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性を診断するための方法を提供する。この方法は、一般的な集団と比べてＨＴ感受性の個体により高頻度で存在する、ＨＴを予測するための危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを行うことを包含し、危険性を示すハプロタイプの存在をＨＴに対する疾患感受性の指標とする。「危険性を示すハプロタイプ」は、ＨＴに対する危険度の上昇ではなく、危険度の低下と関連してもよい。「危険性を示すハプロタイプ」は、ＨＴと高い関連性を示すマーカーと共に、本願で開示するハプロタイプの１種又は組み合わせを包含する。ＨＴに対する個体の疾患感受性を診断するためのキットも開示する。
【００４５】
当業者は、個体の核酸配列に存在する、１種又は数種の本発明のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドの解析は、多型部位に存在するヌクレオチドを決定することのできる方法や技術によって行うことができることを容易に理解する。当業界では明らかなように、ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドは、いずれかの核酸鎖又は両方の核酸鎖から検出することができる。
【００４６】
本発明の主な利用法には、ＨＴを発症する危険性の高い者を予測することが含まれる。ＨＴに寄与する遺伝的因子を特定する診断試験は、単独で使用するか、又は一般的な集団に対する個体の危険度を定義するための公知の臨床危険因子と組み合わせて使用することができる。ＨＴを発症する危険性を有する個体を同定するためのより良い方法は、より良い予防的及び治療的な養生法につながると考えられ、養生法には、以下に示す、ＨＴの余病に関する現在の臨床危険因子に対するより積極的な管理が含まれる：喫煙、高コレステロール血症、上昇したＬＤＬコレステロール値、低いＨＤＬコレステロール値、ＨＴとＢＰ上昇、糖尿病、グルコース不耐性、インシュリン耐性、メタボリック症候群、肥満、運動不足、及びＣ反応性タンパク質レベルや他の炎症性マーカーの上昇によって反映される炎症性成分。遺伝的危険度に関する情報は、特定の患者に生活習慣の調整（例えば、禁煙、カロリー摂取量の削減、運動量の増加）を医師が説得するために使用することもできる。最後に、体重、塩分摂取量やアルコール摂取量の減少といった、血圧低下を目標とした予防的処置の実施に関して、ＨＴの分子副診断に基づいて患者の意欲を高めたり、具体的な方法を選択したりすることができる。
【００４７】
本発明の更なる目的は、薬物の抗高血圧効果を試験するための対象となるヒトを選択するための方法を提供することにある。
【００４８】
本発明の更なる目的は、抗高血圧薬を試験するための臨床試験の対象を選択するための方法を提供することにある。
【００４９】
本発明の更なる目的は、ＨＴリスク遺伝子に存在する多型を用いた、ＨＴの治療の臨床経過及び効果を予測するための方法を提供することにある。本発明の遺伝子、遺伝子産物及び薬物は、ＨＴの治療、治療効果のモニタリング、及び薬物の開発にも有用である。ＨＴの診断、治療及び予後判定のためのキットも提供する。
【００５０】
発明の詳細な説明
典型的な標的集団
ＨＴを発症する危険がある個体とは、例えば以下に挙げるＨＴ危険因子の少なくとも１つを有する個体である：ＨＴの家族歴、中心性肥満や他の肥満、運動不足、高いナトリウム摂取量、高い飽和脂肪酸摂取量、低いカリウム及び／又はマグネシウム摂取量、低いＨＤＬコレステロール値、糖尿病、ブドウ糖不耐性、インシュリン耐性、メタボリック症候群、炎症性マーカーの上昇、及び１種又は数種のＨＴリスクＳＮＰマーカーを含む、危険性を示すアレルやハプロタイプ。
【００５１】
本発明の別の態様において、ＨＴを発症する危険性がある個体とは、ＨＴリスク遺伝子内にリスク増加アレルが存在する個体であり、多型の存在は、ＨＴ感受性が高いことを示す。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチドコード配列内のエレメントのみならず、その上流と下流に位置する調節エレメントの両方を含み、更にｍＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域と、遺伝子の全てのエクソン配列とイントロン配列（更に選択的スプライシングが行われるエクソンとイントロン）を含有する全長ポリペプチドコード配列を含む全体の総称である。
【００５２】
危険性を示すアレルと危険性を示すハプロタイプの評価
遺伝子マーカーは、ＨＴと関連する「多型部位」に存在する特定の「アレル」である。集団の中に複数の配列をもたらしうるヌクレオチドの位置を、本明細書では「多型部位」と称する。多型部位の長さが１ヌクレオチドの場合は、ＳＮＰと称する。例えば、特定の染色体位置のヌクレオチドが、集団に属するある個体ではアデニンであり、同じ集団の別の個体ではチミンの場合、この位置は多型部位であり、より詳細には、この多型部位はＳＮＰである。多型部位は、挿入、欠失、変換又は転座によってその長さが数ヌクレオチドであってもよい。多型部位に見られる各種の配列を、本明細書では、多型部位の「アレル」と称する。従って、上記の例では、ＳＮＰとしてアデニンアレルとチミンアレルの両方が存在する。
【００５３】
典型的には、特定の遺伝子について参照ヌクレオチド配列に参照する。参照配列と異なるアレルを、「変異型（variant）」アレルと称する。参照ヌクレオチド配列のコードするポリペプチドは、特定の参照アミノ酸配列を有する「参照」ポリペプチドであり、変異型アレルのコードするポリペプチドを、変異型アミノ酸配列を有する「変異型」ポリペプチドと称する。
【００５４】
変異型ヌクレオチド配列は、ポリペプチドの特性に作用する変化をもたらすことがある。参照ヌクレオチド配列との比較により示されるこうした配列差としては、挿入、欠失、変換及び置換が挙げられ、具体例としては、変異型ポリペプチドを生成するフレームシフトをもたらすことのある、挿入、欠失又は変換；中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングをもたらすことがある、少なくとも１つのヌクレオチドの置換；ヌクレオチドのコードする１種又は数種のアミノ酸の欠失をもたらすことがある、いくつかのヌクレオチドの欠失；読み枠中のコード配列の中断をもたらすことがある、不均等な組み換えや遺伝子変換などの、いくつかのヌクレオチドの挿入；配列の全て又は一部の重複；トランスポジション；又は詳しく上記したような、ヌクレオチド配列の再編成が挙げられる。このような配列の変化は、ＨＴ感受性遺伝子のコードするポリペプチドを変化させる。例えば、対応するポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらす遺伝子内のヌクレオチドの変化は、ポリペプチドの生理学的特性を変化させ、その結果、生物学的活性／機能、分布又は安定性の変化したポリペプチドをもたらすことができる。
【００５５】
あるいはまた、変異型ヌクレオチド配列は、遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響する変化をもたらすことがある。遺伝子の調節領域に存在する多型部位は、組織特異性、転写率、転写因子への応答などの変化によって、遺伝子の転写に変化をもたらすことがある。ｍＲＮＡに対応する遺伝子領域に存在する多型部位は、安定した二次構造をｍＲＮＡに誘導し、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることなどによって、ｍＲＮＡの翻訳に変化をもたらすことがある。こうした配列の変化は、ＨＴ感受性遺伝子の発現を変化させることがある。
【００５６】
本明細書に記載する「ハプロタイプ」とは、例えば、表３、４、５、７及び８に示したような、遺伝子マーカー（「アレル」）の全ての組み合わせを意味する。またハプロタイプは、２個以上のアレルを含んでいてもよい。
【００５７】
当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、本明細書に記載したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（A T C C）は、全てのアレルをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（T A G G）や、１番目のアレルのみをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（T T C C）と同じである。
【００５８】
例えば、表３、４、５、７及び８に示したような、本発明で開示するハプロタイプは、ＨＴではない個体よりも、ＨＴの個体においてより頻繁に見られるものである。従って、これらのハプロタイプは、個体におけるＨＴ又はＨＴ感受性を検出するための予測力を有する。多型部位に存在する配列を検出するための公知の方法によって、ハプロタイプの検出を行うことができる。
【００５９】
本発明で開示する、危険性を示すＨＴ関連アレルと危険性を示すＨＴ関連ハプロタイプは、本発明のＨＴ関連遺伝子に存在する他の「多型部位」と関連してもよいことが理解されよう。こうした他のＨＴ関連多型部位は、遺伝子マーカーと同等に有用か、あるいは危険性を示す本発明のアレルとハプロタイプについて観察されるＨＴとの関連を説明する、原因性変異型（causative variations）としてより有用である。
【００６０】
本明細書で説明したいくつかの方法においては、ＨＴを発症する危険性のある個体とは、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプが同定された個体である。１つの態様においては、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、ＨＴの有意な危険度を示すものである。１つの態様においては、アレル又はハプロタイプと関連する有意性はオッズ比で測定する。更に別の態様においては、有意性は百分率で測定する。１つの態様においては、有意な危険度を示すオッズ比は少なくとも約１．２であり、具体的にはオッズ比が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０の場合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加と低下は少なくとも約２０％であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加は少なくとも約５０％である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む、多様な因子にも依存し得ることが理解されよう。
【００６１】
ＨＴリスク遺伝子又はその所定の部位に存在する、リスクを示すハプロタイプとは、健康な個体（対照者）に存在する頻度と比べて、ＨＴを発症する危険性のある個体（ＨＴ感受性保持者（affected））に存在する頻度の方がより高いハプロタイプであり、ハプロタイプの存在が、ＨＴの存在又はＨＴに対する疾患感受性の指標となるものである。
【００６２】
好ましい態様においては、この方法は、ＨＴリスク遺伝子又はその所定の部位におけるＳＮＰの存在又は出現頻度を個体について検出することを包含し、健常対照個体と比べて、過剰なＳＮＰ又はその出現頻度の上昇は、ＨＴを発症しているかＨＴ感受性が高いことを示す。スクリーニング用のツールとして使用することのできるハプロタイプを構成することのできるＳＮＰについては、例えば、表３、４、５、７及び８を参照。危険性を示すハプロタイプからこのようなＳＮＰマーカーを同定することができる。例えば、危険性を示すハプロタイプには、表３、４、５、７及び８に示したようなマイクロサテライトマーカー及び／又はＳＮＰが含まれる。ハプロタイプの存在は、ＨＴの存在又は、ＨＴに対する疾患感受性が高いことを示すので、本明細書で説明する治療法の標的集団に該当する個体の指標となる。
【００６３】
従って、本発明の方法は特に、ＨＴの指標となる、危険性を示す以下のハプロタイプを定義する、１種又は数種のＳＮＰマーカーの検出に関するものである。
【００６４】
1) ハプロタイプ“ACG”を定義する、rs4845303 (A/T) (配列番号９８０)、
rs6428195 (C/G) (配列番号１０３０) と rs1935659 (A/G) (配列番号６３７)；
2) ハプロタイプ“AGC”を定義する、rs1997454 (A/G) (配列番号６５６)、
rs2139502 (A/G) (配列番号７０９) と rs1519991 (A/C) (配列番号５４２)；
3) ハプロタイプ“ACT”を定義する、rs1521409 (A/G) (配列番号５４４)、
rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366 (C/T) (配列番号３１７)；
4) ハプロタイプ“CGA”を定義する、rs7679959 (C/G) (配列番号１１７８)、
rs10517338 (C/G) (配列番号３８１) と rs959297 (A/T) (配列番号１３３８)；
5) ハプロタイプ“GCAGG”を定義する、rs2278677 (A/G) (配列番号７４９)、
rs3886091 (C/G) (配列番号８９９)、rs1998167 (A/G) (配列番号６５７)、
rs1998168 (A/G) (配列番号６５８) と rs2235280 (A/G) (配列番号７４０)；
【００６５】
6) ハプロタイプ“AACG”を定義する、rs10521062 (A/C) (配列番号４０４)、
rs10512296 (A/G) (配列番号３３１)、rs1924001 (C/G) (配列番号６３３) と
rs2417359 (A/G) (配列番号７８４)；
7) ハプロタイプ“GGA”を定義する、rs10508933 (C/G) (配列番号２８９)、
rs10509071 (A/G) (配列番号２９５) と rs10490967 (A/G) (配列番号９４)；
8) ハプロタイプ“TCCC”を定義する、rs10508771 (A/T) (配列番号２８６)、
rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T) (配列番号２８７) と
rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
9) ハプロタイプ“CAGT”を定義する、rs1386486 (C/T) (配列番号４７２)、
rs1386485 (A/C) (配列番号４７１)、rs1386483 (A/G) (配列番号４７０) と
rs7977245 (C/T) (配列番号１２１２)；
10) ハプロタイプ“AA”を定義する、rs276002 (A/G) (配列番号８１４) と
rs274460 (A/G) (配列番号８１０)；
【００６６】
11) ハプロタイプ“GCTTC”を定義する、rs1245383 (A/G) (配列番号４３０)、
rs2133829 (C/T) (配列番号７０７)、rs2173738 (C/T) (配列番号７２２)、
rs2050528 (C/T) (配列番号６７７) と rs202970 (C/T) (配列番号６７１)；
12) ハプロタイプ“TAC”を定義する、rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)、
rs931850 (A/G) (配列番号１３０３) と rs1522722 (C/T) (配列番号５４７)；
13) ハプロタイプ“ATCC”を定義する、rs2221511 (A/G) (配列番号７３３)、
rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T) (配列番号５４８) と
rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；及び
14) ハプロタイプ“ATGGA”を定義する、rs2825555 (A/G) (配列番号８１９)、
rs2825583 (C/T) (配列番号８２０)、rs2825601 (A/G) (配列番号８２１)、
rs2825610 (G/T) (配列番号８２２) と rs1489734 (A/G) (配列番号５３２)。
【００６７】
治療の経過のモニタリング
本発明は、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現（例えば、相対的又は絶対的な発現）に対する、ＨＴ治療の効果をモニタリングするための方法に関する。ＨＴ感受性遺伝子のｍＲＮＡ、それがコードするポリペプチド、又はコードするポリペプチドの生物活性は、末梢血又はそこから誘導した細胞のサンプルから測定することができる。ポリペプチドの発現や生物活性のレベルは、ＨＴ治療剤による治療を行う前と治療中に評価することができる。
【００６８】
また、ＨＴ治療の効果は、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連する生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路のモニタリングによって追跡することができる。生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路のモニタリングは、例えば、治療開始の前と後に、血漿プロテオーム中の１種又は数種のポリペプチドの測定、及び／又は血漿メタボローム中の１種又は数種の代謝産物の測定によって行うことができる。ＨＴ治療薬による処置に続く生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の変化を観察した結果を、入手可能な健常対象者に関するデータと比較することで治療の効果を評価する。
【００６９】
例えば、本発明の１つの態様においては、標的集団の一員である個体について、ＨＴ阻害剤による治療に対する応答を評価する。評価は、末梢血、あるいは末梢血中の総細胞副画分又は特定の細胞副画分、あるいは細胞副画分の組み合わせにおける、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの生物活性、あるいはＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチド又はｍＲＮＡの絶対的及び／又は相対的なレベルを測定することで行う。
【００７０】
更に、ＨＴリスク遺伝子の内部又は近傍（１〜数百ｋｂの範囲内）に見られるハプロタイプや変異などの変異型は、ＨＴやその合併症を予防したり治療したりするための医薬製剤（pharmaceutical agent）に関して行う臨床試験の効力や効率を高めるために、ＨＴを発症する危険性の高い個体を同定するのに用いることができる。ハプロタイプやその他の変異型は、他の経路が関与するＨＴを発症している患者を排除するか分別することで、試験する治療法に適した経路の関与する患者を集め、臨床試験の効力と感受性を増加させるために用いることもできる。このような変異型は、個体のための医薬製剤の選択を手引きする薬理遺伝学的試験（pharmacogenetic test）に用いることもできる。
【００７１】
プライマー、プローブ及び核酸分子
「プローブ」や「プライマー」は、塩基特異的な形式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。「塩基特異的な形式」とは、プライマーやプローブがハイブリダイズするのに十分な程度のヌクレオチド相補性を２つの配列が有していることを意味する。従って、プライマーやプローブの配列は、テンプレートの配列に対して完全に相補的である必要はない。塩基置換がハイブリダイゼーションを阻害しない限り、非相補的な塩基や修飾塩基がプライマーやプローブ中に散在していてもよい。核酸テンプレートは、プライマーやプローブに対して種々の相補性を示す「非特異的プライミング配列」又は「非特異的配列」を更に包含してもよい。このようなプローブとプライマーとしては、ポリペプチド核酸（polypeptide nucleic acid）が挙げられる（Nielsen PE et al, 1991）。
【００７２】
プローブやプライマーは、本発明の核酸の中の連なった少なくとも約１５ヌクレオチド、例えば約２０〜２５ヌクレオチド、特定の態様においては約４０、５０又は７５ヌクレオチド（例えば、連続した核酸の配列）にハイブリダイズする核酸領域を包含する。
【００７３】
好ましい態様においては、プローブやプライマーは、１００個以下のヌクレオチドを包含し、特定の態様においては６〜５０ヌクレオチド、例えば１２〜３０ヌクレオチドを包含する。別の態様においては、プローブやプライマーは、連続した核酸の配列又はその相補鎖と少なくとも７０％同一であり、例えば、少なくとも８０％同一、特定の態様においては少なくとも９０％同一、別の態様においては少なくとも９５％同一である。あるいはプローブやプライマーは、連続した核酸配列又はその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることさえ可能である。プローブやプライマーは、屡々、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素又は酵素の補因子などの標識を更に包含する。
【００７４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、公知のヌクレオチド配列、例えば、表６に示した、ジーンバンク（GenBank）データベースのＨＴ関連遺伝子や、表２〜５と７〜１１に列挙した多型部位を含有するヌクレオチド配列、に基づいて設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の方法を用いて、化学合成及び酵素による連結反応によって構築することができる。例えば、アンチセンス核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、自然界に見られるヌクレオチドや、もしくは、分子の生物学的安定性の増加や、アンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される２本鎖の物理的安定性の増加を目的として設計された種々の修飾ヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体やアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学合成することができる。また、アンチセンス核酸分子は、アンチセンスの方向に核酸分子がサブクローニングされた（つまり、挿入した核酸分子から転写したＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの方向になるようにした）発現ベクターを用いて生物学的に製造することもできる。
【００７５】
本発明で開示する表６のＨＴ関連遺伝子の核酸配列は、患者の内在性ＤＮＡ配列と比較することで遺伝的障害（ＨＴ素因又は感受性など）を同定するために用いることができ、また、プローブとして用い、関連するＤＮＡ配列とハイブリダイズして発見したり、公知の配列をサンプルから抽出したりすることができる。核酸配列は更に、遺伝子フィンガープリント法のためのプライマーの誘導、ＤＮＡ免疫法を用いた抗ポリペプチド抗体の産生、及び抗ＤＮＡ抗体の産生や免疫応答の誘発のための抗原として用いることができる。本願で同定したヌクレオチド配列（及び対応する完全な遺伝子配列）の一部、即ち断片は、ポリヌクレオチド試薬として種々の用途に用いることができる。例えば、これらの配列は、（ｉ）各配列に対応する遺伝子を染色体上にマッピングすることによる、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域の位置の特定；（ii）微小な生物学的サンプルからの個体の同定（組織タイピング）；そして（iii）生物学的サンプルの法医学的な同定の補助に用いることができる。加えて、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴づけ又は治療用途に用いるための組み換えポリペプチドの同定と発現に用いたり、対応するポリペプチドが恒常的に、又は組織分化の際に、又は疾患状態で発現される組織のためのマーカーとして使用したりすることができる。加えて核酸配列は、本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイのための試薬として用いることができ、また本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイに使用するキット（例えば試薬キット）の構成成分として含めることができる。
【００７６】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
遺伝子産物の１つの形態には特異的に結合するが、遺伝子産物の他の形態には結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を提供する。変異型遺伝子産物又は参照遺伝子産物のいずれかの、１種又は数種の多型部位を含む部分に結合する抗体も提供する。本明細書に記載される「抗体」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位（即ち、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）の総称である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドやその断片には結合するが、サンプル（例えば、天然に該ポリペプチドを含む生物学的サンプル）の中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位の例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって得られるＦ(ａｂ) 断片とＦ(ａｂ’)断片が挙げられる。本発明は、本発明のポリペプチドと結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書に記載される「モノクローナル抗体」や「モノクローナル抗体組成物」とは、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位の内の１種のみを含む一群の抗体分子の総称である。従って、典型的なモノクローナル抗体組成物は、この組成物が免疫反応を示す特定の本発明のポリペプチドに対して、１つの結合親和性のみを提示する。
【００７７】
ポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法、即ち、適切な対象生物を所望の免疫原（例えば、本発明のポリペプチド又はその断片）で免疫することによって製造することができる。免疫した対象生物における抗体力価は、例えば、固定したポリペプチドを用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な方法で、経時的にモニタリングすることができる。所望であれば、ポリペプチドに対する抗体分子を哺乳動物（例えば、その血液）から単離し、更にプロテインＡクロマトグラフィー法などの公知の処理方法で精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適当な時点（例えば、抗体力価が最大値に達した時点）で抗体産生細胞を対象生物から採取し、それを用いて、ハイブリドーマ法（Kohler G and Milstein C, 1975）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor D et al, 1982）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole SP et al, 1994）又はトリオーマ法（Hering S et al, 1988）などの標準的な技術でモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマを製造するためには、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記の免疫原で免疫した哺乳動物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清のスクリーニングを行って、本発明のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００７８】
リンパ球と不死化細胞株の融合に用いる公知のプロトコルのどれでも、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生に適用することができる（Bierer B et al, 2002）。更に、当業者であれば、同じように有用な、上記の方法のバリエーションがたくさん存在することを理解できよう。
【００７９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、ポリペプチドで組み換え免疫グロブリンコンビナトリアルライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）のスクリーニングを行い、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することで、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定して単離することができる（Hayashi N et al, 1995；Hay BN et al, 1992；Huse WD et al, 1989；Griffiths AD et al, 1993）。ファージディスプレーライブラリーを産生し、スクリーニングするためのキットは市販されている。
【００８０】
加えて、通常の組み換えＤＮＡ法を用いた製造が可能な、ヒト化キメラモノクローナル抗体などの、ヒト由来の部分とヒトに由来しない部分を包含する組み換え抗体も本発明の範囲内に含まれる。こうしたヒト化キメラモノクローナル抗体は、公知の組み換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【００８１】
一般的に、本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー法又は免疫沈降法などの標準的な技術で本発明のポリペプチドを単離するために用いることができる。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然ポリペプチドの精製と、宿主細胞で発現される、組み換えによって産生されたポリペプチドの精製を容易にする。更に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの発現量と発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物、細胞上清又は組織サンプル中の）ポリペプチドの検出に用いることができる。抗体は、ＨＴ感受性を予測するための試験の一部、あるいは臨床試験の手順の一部（例えば、養生法の有効性を決めるための手順）として、組織（例えば血液）に存在するタンパク質のレベルを診断目的でモニタリングするために用いることができる。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングさせることによって容易になる。検出可能物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料及び放射性材料が挙げられる。好適な酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の具体例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光材料の具体例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ；好適な発光材料としては、ルミノールが挙げられ；好適な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ；好適な放射性材料としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ及び3Ｈが挙げられる。
【００８２】
診断アッセイ
本発明で開示するプローブ、プライマー及び抗体は、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断方法のみならず、ＨＴ、ＨＴ感受性やＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断に有用なキットにも用いることができる。
【００８３】
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示す１種又は数種のアレル、ハプロタイプ、又はそれらの組み合わせを、本発明で開示するように、対象生物の核酸から検出することによって、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断（もしくはＨＴ関連疾患や病態又はＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断）を行う。
【００８４】
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示すアレル及び／又はハプロタイプに関連する１種又は数種の多型部位を対象生物の核酸から検出することによって、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断（もしくはＨＴ関連疾患や病態又はＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断）を行う。診断において最も有用な多型部位は、フレームシフト、中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングによって、ＨＴ関連遺伝子のポリペプチド構造を変化させる多型部位である。多くの場合、対応するポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらす遺伝子内のヌクレオチドの変化は、生物学的活性／機能、分布又は安定性が変化したポリペプチドをもたらすことによって、ポリペプチドの生理学的特性を変化させることができる。診断において有用な他の多型部位としては、組織特異性の変化、転写率の変化、生理学的状態に対する応答の変化、ｍＲＮＡの翻訳効率の変化、及びｍＲＮＡの安定性の変化によって、ＨＴ関連遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響を与える多型部位である。ＨＴ関連遺伝子のポリペプチド構造の変化や、ＨＴ関連遺伝子の発現の変化を伴う変異型ヌクレオチド配列の存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８５】
診断用途においては、機能的多型と連鎖不平衡の状態にある、疾患危険度を予測するための有益な多型を用いてもよい。こうした機能的多型は、スプライシング部位の変化や、ｍＲＮＡの安定性又は輸送の変化を伴うか、あるいは核酸の転写と翻訳の変化を伴う。機能的多型に関連する変異型ヌクレオチド配列の存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８６】
我々は限られた数のＳＮＰマーカーについてジェノタイピングを行い、それらを本願の実施例に記載したが、本発明で同定したＨＴリスク遺伝子のいずれかにおいて、上述したような機能的変異、調節的変異又は他の変異のいずれかが見られる場合、ＨＴ危険度の予測が可能であると期待される。
【００８７】
診断アッセイにおいては、１種又は数種の本発明のＨＴ関連ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドのみならず、本発明のＨＴ関連ＳＮＰマーカーと関連する多型部位も個体の核酸から検出するが、この検出は、多型部位に存在するヌクレオチドを正確に検出することが可能ないかなる方法や技術で行ってもよい。数多くの好適な方法が当業界では報告されており（Kwok P-Y, 2001；Syvanen A-C, 2001）、そのような方法としては、ハイブリダイゼーションアッセイ、連結反応アッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素開裂アッセイ、化学的開裂アッセイ及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アッセイは、ＰＣＲ、固相固定工程、修飾オリゴヌクレオチド、標識プローブ又は標識ヌクレオチドを含んでいても、含んでいなくてもよく、アッセイはマルチプレックスでもシングルプレックスでもかまわない。当業界では自明であるように、多型部位に存在するヌクレオチドは、核酸の２本鎖の内の１本又は両方から検出することができる。
【００８８】
本発明の別の態様においては、ＨＴ感受性の診断を、１種又は数種のＨＴ関連遺伝子の転写の検査によって行うことが可能である。転写の変化は、ハイブリダイゼーション法、酵素開裂アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及びマイクロアレイなどの、当業界で報告されている多様な方法で解析することができる。個体から試験サンプルを採取し、サンプル中に含まれるＲＮＡからＨＴ関連遺伝子の転写の変化を評価する。転写の変化によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８９】
本発明の別の態様においては、ＨＴ感受性の診断は、ＨＴ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の検査によっても行うことが可能である。個体から得た試験サンプルについて、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化の存在、あるいはＨＴリスク遺伝子のコードする特定の変異型ポリペプチド（例えばイソフォーム）の存在のいずれかを評価する。ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化とは、例えば、ポリペプチド発現の量的変化（即ち、産生ポリペプチド量の変化）であり、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの構造及び／又は機能の変化とは、ポリペプチド発現の質的変化（例えば、変異型ＨＴ感受性ポリペプチド、異なるスプライシング変異体やイソフォームの発現）である。好ましい態様においては、ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体、又はスプライシング変異体の特定のパターンの検出によって、ＨＴに関連する疾患や病態、又はＨＴに関連する疾患や病態に対する感受性を診断することが可能となる。
【００９０】
ＨＴ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化は、当業界でよく知られる多様な方法、例えば、クロマトグラフィー法、分光法、比色分析法、電気泳動法、等電点電気泳動法、特異的開裂法、免疫学的手法、及び生物活性の測定に基づくアッセイや、種々のアッセイの組み合わせによって測定することができる。本明細書において、ポリペプチドの発現又は組成における「変化」とは、対照サンプルにおけるＨＴリスク遺伝子によるポリペプチドの発現や、ポリペプチドの組成と比較した際に、試験サンプルに見られる発現と組成の変化である。対照サンプルとは、試験サンプルに対応するサンプル（即ち、同じ種類の細胞から得たもの）であって、ＨＴを発症していない（not affected）個体から得たものである。対照サンプルと比べて変化した、試験サンプルにおけるポリペプチドの発現と組成は、ＨＴに対する感受性が高いことを示す。
【００９１】
変異型ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する上記の抗体、変異していない遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法によって、試験サンプルにおける、特定のスプライシング変異体やイソフォーム、又は多型ＨＴリスク遺伝子や変異型ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの存在、あるいは特定のスプライシング変異体やイソフォーム、又は多型ではない遺伝子や変異していない遺伝子のコードするポリペプチドの不存在を検出することができる。ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体の存在（又は不存在）と同様に、多型遺伝子や変異型遺伝子のコードするポリペプチドの存在、又は多型でない遺伝子や変異していない遺伝子のコードするポリペプチドの不存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００９２】
上記方法の１つの態様においては、試験サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル又は量を、対照サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル又は量と比較する。試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量が、対照サンプル中のポリペプチドのレベル又は量よりも高いか低く、この差が統計的に有意である場合には、試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量は、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化を示し、これによってＨＴ感受性を有すると診断することができる。上記方法に代わる方法としては、試験サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成を、対照サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成（例えば、種々のスプライシング変異体の存在）と比較する。試験サンプル中のポリペプチドの組成と対照サンプル中のポリペプチドの組成の違いによって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。更に別の態様においては、ポリペプチドのレベルや量と組成の両方を試験サンプルと対照サンプルにおいて評価することができる。試験サンプルと対照サンプルとの比較から明らかなポリペプチドの量やレベルの違い、組成の違い、又は量やレベルの違いと組成の違いの両方が、ＨＴに対する感受性が高いことを示す。
【００９３】
別の態様においては、ＨＴリスク遺伝子の多型又は変異型がコードするポリペプチドのスプライシング変異体やイソフォームを評価することができる。この評価は、直接的に（例えば、ポリペプチドそのものの検査によって）又は間接的に（例えば、ｍＲＮＡのプロファイリングなどによる、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検査によって）行うことができる。例えば、本発明で開示するプローブやプライマーは、標準的な方法によって、ＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡがどのスプライシング変異体やイソフォームをコードしているのかを決定することができる。
【００９４】
ＨＴ又はＨＴ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在、又はＨＴ又はＨＴ危険度と関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在によって、ＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態、又はＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有すると診断することができる。同様に、ＨＴ又はＨＴ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在、又はＨＴ又はＨＴ危険度に関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在によって、ＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態ではない、又はＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有していないと診断することができる。
【００９５】
更に本発明は、ＨＴリスク遺伝子に存在する危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプを同定することによって、個体におけるＨＴ感受性の診断と同定を行うための方法に関する。１つの態様においては、この危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、ハプロタイプの存在によってＨＴの危険度が有意に増加するアレル又はハプロタイプである。危険度が有意か否かの判定は、特定の疾患、ハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存すると理解すべきであるが、有意性はオッズ比又は百分率で求めることができる。更に別の態様においては、有意性は百分率で求める。１つの態様においては、有意な危険度とはオッズ比が０．８以下又は少なくとも約１．２の場合であり、具体的にはオッズ比が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０の場合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも１．２の場合を有意とする。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも約１．５の場合を有意とする。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下とは、オッズ比が少なくとも約１．７の場合である。更に別の態様においては、危険度の有意な増加とは少なくとも約２０％の増加であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％の増加が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下は少なくとも約５０％の変化である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存することが理解されよう。
【００９６】
本発明はまた、個体におけるＨＴ又はＨＴ感受性を診断する方法であって、健常個体（対照）と比較して、ＨＴに対して感受性の高い（発症している（affected））個体において存在頻度が高まっている、ＨＴリスク遺伝子に含まれる危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを包含し、ハプロタイプの存在が、ＨＴ又はＨＴに対する感受性を意味することを特徴とする方法に関する。スクリーニング用のツールとして使用することのできるハプロタイプを構成するＳＮＰマーカーについては、例えば、表３、４、６、７及び８を参照。これ等の表に列挙したＳＮＰマーカーは危険性を示すハプロタイプを表し、ＨＴに対する感受性を決定するための診断試験の設計に用いることができる。
【００９７】
診断方法に有用なキット（試薬キットなど）は、本明細書で説明したいかなる方法においても有用な構成成分を包含しており、そのような成分としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＰＣＲプライマー、本明細書で説明したハイブリダイゼーション用のプローブやプライマー（標識したプローブやプライマーなど）、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングのための試薬、標識分子を検出するための試薬、（ＲＦＬＰ分析などのための）制限酵素、アレル特異的なオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、標識用酵素、変化した又は変化していない（天然の）ＨＴ感受性ポリペプチドと結合する抗体、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子を包含する核酸を増幅する手段、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の核酸配列を分析するための手段、又は１種又は数種のＨＴ感受性ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段。１つの態様においては、ＨＴに対する感受性を診断するためのキットは、ＨＴに対する感受性の高い個体において存在頻度が高まっている、危険性を示すハプロタイプを含むＨＴリスク遺伝子領域の核酸増幅を行うためのプライマーを包含してもよい。このようなプライマーは、ＨＴの指標となるＳＮＰに隣接する核酸の一部を用いて設計することができる。
【００９８】
本発明は、１回又は少数回のジェノタイピングを行い、ＨＴを予測する能力に基づいて、タイピングする変異型配列を選択するという原理に基づいている。従って、ゲノムＤＮＡサンプル中の変異型配列のジェノタイピングはいかなる方法を用いてもよい。
【００９９】
本発明の検出方法は、検出工程で得られた指標を確認するために、本発明の方法（クレーム１参照）の工程ｂ）で得られた結果を、対象生物の年齢；性別；ＨＴ、糖尿病や高コレステロール血症に関する家族歴、及びＣＶＤや糖尿病の治療歴に関する情報と組み合わせる工程を更に包含してもよい。このような情報には、家族内での高コレステロール血症、喫煙状況、家族内でのＨＴ、ＣＶＤの家族歴、家族内での肥満、及びウエスト/ヒップ比（waist-to-hip circumference ratio）（ｃｍ／ｃｍ）が含まれていてもよい。
【０１００】
本発明の検出方法は、血液、血清又は血漿中の、コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパクＢとＡＩ、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、あるいは血清又は血漿インシュリン濃度を測定する工程を更に包含してもよい。
【０１０１】
ＨＴを発症する確率を予測するスコアは、多変量故障時間モデル（multivariate failure time model）又はロジスティック回帰式を用いて計算することができる。上述した、本発明の方法に付加する更なる工程で得られる結果によって、ＨＴを発症する確率を以下のロジスティック回帰式で計算する工程が可能となる。
【０１０２】
ＨＴを発症する確率 ＝１／［１＋ｅ(−(−ａ＋Σ(ｂi×Ｘi))］
式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＨＴに関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項であるが、但し、ａ値とｂi値は、この方法を実施する対象の属する集団から求められる値であることが好ましく、Ｘi値は、この方法を実施する対象の属する集団で測定した変数から選ばれる値であることが好ましい。ｂi値は−２０と２０の間であることが好ましく、ｉ値は０（ゼロ）と１００，０００の間であることが好ましい。ｂi値が負の係数であるということは、このマーカーが危険度の低下を示すことを意味し、正の係数であるということは、このマーカーが危険度の増加を示すことを意味する。
【０１０３】
Ｘi値は、ＳＮＰマーカーのように０又は１と表されるかコード化される２値変数である。加えてこのモデルには、変数Ｘiのいかなる相互作用（積）や項（例えば、ｂiＸi）が含まれてもよい。１年、２年、５年、１０年又は２０年以内にＨＴを発症する危険度を百分率で示す単純な予測を行うために、情報を組み合わせるアルゴリズムも開発されている。
【０１０４】
これに代わる統計学的モデルとしては、コックスの比例ハザードモデル、他の反復モデル及びニューラルネットワークモデルなどの故障時間モデルが挙げられる。
【０１０５】
この試験は、スクリーニング又は素因の試験として、ＨＴを発症する危険度を試験するために健常者に実施することもできるし、また高リスク患者（即ち、ＨＴの家族歴、中心性肥満や他の肥満、運動不足、高いナトリウム摂取量、高い飽和脂肪酸摂取量、低いカリウム及び／又はマグネシウム摂取量、低いＨＤＬコレステロール値、糖尿病、グルコース不耐性、インシュリン耐性及びメタボリック症候群、炎症性マーカーの上昇、あるいはこれらの組み合わせ、あるいは他のＨＴリスク因子の上昇のいずれかを示す者）に実施することもできる。
【０１０６】
この方法は、成人におけるＨＴの予測又は早期診断、臨床試験のための対象者の層化と選択、及び／又は予防的及び治療的な集中介入を行う対象者の層化と選択に用いることができる。その目的は、治験薬の臨床試験及び健康管理のコスト削減である。
【０１０７】
医薬組成物
本発明は、本願に記載した薬剤（agent）、特にＨＴリスク遺伝子内のヌクレオチド及び／又はＨＴリスク遺伝子のコードする他のスプライシング変異体を包含する薬剤；及び／又は本願に記載したように、ＨＴリスク遺伝子の発現又はＨＴ感受性遺伝子ポリペプチドの活性を変化（例えば、増強又は阻害）する薬剤を包含する医薬組成物に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質（例えば、受容体）、ＨＴリスク遺伝子の発現を変化させる薬剤、ＨＴ感受性ポリペプチド結合性物質や結合パートナー、それらの断片、融合タンパク質やプロドラッグ、あるいは本発明のヌクレオチドを包含するヌクレオチド又は核酸構築物（ベクター）、あるいはＨＴ感受性遺伝子ポリペプチド活性を変化させる薬剤を、生理的に許容される担体や賦形剤と共に処方し、医薬組成物を調製することができる。担体と組成物は滅菌することができる。処方は投与方法に適したものでなければならない。
【０１０８】
好ましい態様においては、医薬組成物は、本発明のＨＴ関連遺伝子（表６）に関連した生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路における、ＨＴに関連した変化の少なくとも一部を逆転させる薬剤を包含する。
【０１０９】
本発明に適した薬学的に許容される担体に特に限定はなく、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（乳糖、アミロース、デンプンなど）、デキストロース、マグネシウムステアレート、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンや、これ等の組み合わせなどが挙げられる。所望により医薬組成物は、有効成分と有害な反応を起こさない付加的な成分、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩類、緩衝剤、着色剤、調味料及び／又は香料などと混合してもかまわない。
【０１１０】
所望により組成物は更に、微量の浸潤剤か乳化剤又はｐＨ調節剤を含有してもよい。組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉剤とすることができる。組成物は、古典的なバインダーや担体であるトリグリセリドなどと共に、座薬として処方することもできる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬用のマニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでいてもよい。
【０１１１】
上記の組成物を生体に導入する方法に特に限定はなく、皮内、筋肉内、腹膜内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内への投与が挙げられる。他の適した導入方法としては、（以下で説明する）遺伝子療法、再充填可能か生体分解可能な機構、粒子加速化装置（“ジーンガン”）及び薬物徐放型高分子機構が挙げられる。本発明の医薬組成物は、他の成分と共に、コンビナトリアル療法の一部として投与することもできる。
【０１１２】
医薬組成物は、慣例的な手順に従って処方し、ヒトへの投与に適合した医薬組成物とすることができる。例えば、典型的な静脈注射用の組成物は、滅菌済みの等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、医薬組成物は更に可溶化剤と、注射する部位の痛みを低減するための局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、処方材料はそれぞれ個別に供給するか、投与単位形式に混合したもの（例えば、有効成分の量を表示したアンプルや小袋などの容器に密封した、凍結乾燥品の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物）として供給する。医薬組成物を点滴で投与する場合には、医薬組成物は、医薬用の滅菌水、生理食塩水又はデキストロース／水の入った点滴用ビンに分配することができる。医薬組成物を注射によって投与する場合には、投与前に処方材料を混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水の入ったアンプルを提供することができる。
【０１１３】
局所投与のためには、局所投与に適合し、好ましくは水よりも力学的粘性率の高い担体を包含する、非スプレー形態あるいは粘性〜半固体又は固体の形態を用いることができる。適当な処方に特に限定はないが、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、塗布剤、膏薬、エアゾールなどが挙げられ、これらは、所望により、滅菌してもよいし、また補助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、浸透圧を調整するための塩類や緩衝剤など）と混合してもかまわない。薬剤は化粧品処方剤に導入してもよい。局所投与にはスプレー可能なエアゾール製剤も適しており、この場合は有効成分を、好ましくは固体状又は液状の不活性担体と共にスクィーズボトルに梱包したり、加圧した揮発性の、通常は気体状の噴射剤（例えば、圧縮空気）と更に混合して梱包したりすることも好適である。
【０１１４】
本願に記載した薬剤は、中性の形態でも、塩の形態でも処方することができる。薬学的に許容される塩類としては、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導した、遊離アミノ基を有するもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導した、遊離カルボキシル基を有するものが挙げられる。
【０１１５】
薬剤は、治療効果を発揮する量を投与する。特定の疾患又は病態を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患や病態の性質に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及びＨＴの病状の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な投与量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
【０１１６】
治療方法
本発明は、ＨＴ治療剤を用いた、ＨＴ又はＨＴに対する感受性を有する個体、例えば、本願明細書で開示した標的集団に属する個体、を治療するための方法（予防法及び／又は療法）を包含する。「ＨＴ治療剤」とは、ＨＴリスク作用性のポリペプチド（の酵素活性又は量）及び／又は本願明細書で開示したＨＴリスク遺伝子の発現を変化（例えば、増加又は低下）させる薬剤（例えば、ＨＴのアゴニスト又はアンタゴニスト）である。ＨＴ治療剤は、以下に例示する種々の方法でＨＴ感受性ポリペプチドの活性又はＨＴ核酸の発現を変化させることができる：付加的なＨＴ感受性ポリペプチドの提供、あるいはＨＴリスク遺伝子の転写又は翻訳の上方制御；ＨＴ感受性ポリペプチドの翻訳後プロセシングの変更；ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写の変更；ＨＴ感受性ポリペプチド活性への（例えば、ＨＴ感受性ポリペプチドに結合することによる）干渉；ＨＴリスク遺伝子の転写又は翻訳の下方制御；あるいはＨＴ感受性ポリペプチドの排除の阻害又は向上。
【０１１７】
特に本発明は、ＨＴ又はＨＴに対する感受性（例えば、本願明細書で開示した、危険性を示す集団に属する個体）を治療する方法のみならず、ＨＴの症状発現やサブタイプの治療方法に関する。
【０１１８】
ＨＴ治療剤の代表例としては、以下のものが挙げられる：
本願で開示した核酸、その断片又は誘導体、特に本願で開示したポリペプチドをコードするヌクレオチドや、このような核酸（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡ；２本鎖干渉ＲＮＡ；ＨＴ感受性ポリペプチド、その活性断片や誘導体、又はオリゴヌクレオチド、例えば、表２〜８、をコードする核酸）を包含するベクター；
他のポリペプチド（例えば、ＨＴ感受性受容体）；ＨＴ感受性ポリペプチドに対する結合性物質；模倣ペプチド；上記ポリペプチドの融合タンパク質やプロドラッグ、抗体（例えば、上述したような、ＨＴ感受性ポリペプチド変異体に対する抗体、変異体ではないＨＴ感受性ポリペプチドに対する抗体、ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体に対する抗体）；リボザイム；他の低分子；
ＨＴリスク遺伝子の発現又はポリペプチドの活性を変える（例えば、阻害又は拮抗する）薬剤、ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写を調節する薬剤（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響を与える薬剤や、発現されるそれぞれのスプライシング変異体の量に影響を与える薬剤）などの他の薬剤；及び
ＨＴリスク遺伝子の発現又はポリペプチドの活性を変える（例えば、誘導又はアゴナイズする）薬剤、ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写を調節する薬剤（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響を与える薬剤や、発現されるそれぞれのスプライシング変異体の量に影響を与える薬剤）などの他の薬剤。
【０１１９】
所望により、１種を超えるＨＴ治療剤を同時に使用することもできる。
【０１２０】
核酸であるＨＴ治療剤は、ＨＴの治療に用いられる。本願において「治療」という用語は、疾患に関連した症状を改善することだけでなく、疾患の発症を予防又は遅らせることも意味し、更には、疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させること、疾患又は病態の再発を予防又は遅らせること及び／又は疾患又は病態に伴う症状の重症度や頻度を減少させることも意味する。アテローム性動脈硬化症の場合、「治療」は、更にプラーク発生の最小化又は退縮も意味する。治療法は、個体におけるＨＴポリペプチドの活性を変化（例えば、阻害又は増加）、置換又は補足するように設計する。例えば、ＨＴ治療剤は、ＨＴリスク遺伝子やＨＴ感受性遺伝子の特定のスプライシング変異体の発現や存在量を上方制御又は増加させるために投与することができ、あるいはそれとは反対に、ＨＴリスク遺伝子やＨＴリスク遺伝子の特定のスプライシング変異体の発現や存在量を下方制御又は低下させるために投与することもできる。本来のＨＴリスク遺伝子やその特定のスプライシング変異体の発現や存在量の上方制御又は増加は、欠陥遺伝子や別のスプライシング変異体の発現や活性に干渉したり、補ったりすることができる。又、本来のＨＴリスク遺伝子やその特定のスプライシング変異体の発現や存在量の下方制御又は低下は、欠陥遺伝子や別のスプライシング変異体の発現や活性を最小化することで、欠陥遺伝子や特定のスプライシング変異体の影響を最小化することができる。
【０１２１】
ＨＴ治療剤は、治療効果を発揮する量（即ち、疾患に関連した症状を改善する、疾患の発症を予防又は遅らせる、及び／又は疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させたりすることで、疾患を治療するのに充分な量）を投与する。特定の個体の有する障害又は病状を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患に伴う病状や重症度に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及び疾患又は障害の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
【０１２２】
１つの態様においては、本発明の核酸（例えば、表６の、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸であり、所望により表２〜１１に示した少なくとも１種の多型を包含するもの）；又はＨＴ感受性ポリペプチドをコードする他の核酸、そのスプライシング変異体、誘導体又は断片を、それぞれ単独で、又は上述した医薬組成物として用いることができる。例えば、ＨＴリスク遺伝子又はＨＴ感受性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、単独で又はベクターに入れた形態で細胞に（in vitro又はin vivoで）導入し、細胞に本来のＨＴ感受性ポリペプチドを産生させる。必要であれば、遺伝子、ｃＤＮＡ、又は遺伝子かｃＤＮＡを含むベクターで形質転換した細胞を、疾患に罹患した個体に導入（又は再導入）することができる。こうすることで、天然では本来のＨＴリスク遺伝子の発現及び活性を失っているか、ＨＴリスク遺伝子変異体の発現又は活性を有するか、又は疾患関連ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体を発現する細胞を、ＨＴ感受性ポリペプチド、あるいはＨＴ感受性ポリペプチド（又はＨＴ感受性ポリペプチドの別の変異型）の活性断片を発現するように操作することができる。好ましい態様においては、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸、その活性断片又は誘導体を発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）に導入し、得られたベクターを動物内の適切な細胞に導入することができる。ウイルス性導入システムと非ウイルス性導入システムを含む他の遺伝子導入システムも用いることができる。また、リン酸カルシウム共沈殿法や機械的技法（例えば、マイクロインジェクション）などの非ウイルス性導入システム、膜融合リポソームによる導入（membrane fusion-mediated transfer）、又はＤＮＡの直接取り込みも用いることができる。
【０１２３】
本発明の他の態様においては、上記方法の代わりに、本発明の核酸、本発明の核酸に相補的な核酸、又はこのような核酸の一部（例えば、後述するオリゴヌクレオチド）を「アンチセンス」療法に使用する。この場合は、ＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与するか又はin situで産生する。ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳及び／又は転写を阻害することで、ＨＴ感受性ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、型どおりの相補的塩基対の結合によるものでもよいし、あるいは、例えば、２本鎖ＤＮＡへの結合のように、二重らせんの主溝との特異的な相互作用によるものでもよい。
【０１２４】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上述した発現プラスミドとして送達することができる。細胞内でプラスミドが転写されると、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡのＨＴ感受性ポリペプチドをコードする部分と相補的なＲＮＡを産生する。また、アンチセンス構築物は、ex vivoで作製して細胞に導入したオリゴヌクレオチドプローブでもよく、これはＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることで発現を阻害する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、in vivoで安定になるように、内在性のヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ）に耐性の修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いる核酸分子の具体例としては、ＤＮＡのホスホロアミデートアナログ、ホスホチオエートアナログ及びメチルホスホネートアナログが挙げられる。更に、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築するための一般的な方法が、van der Krol AR et al, 1988とStein CA and Cohen JS, 1988に記載されている。アンチセンスＤＮＡについては、翻訳開始部位（例えば、ＨＴリスク遺伝子配列の−１０〜＋１０の領域）から誘導したオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２５】
アンチセンス療法を実施するために、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）を設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴ感受性のｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を防止する。絶対的な相補性が好ましいものの、必ずしも必要ない。本明細書で述べるような、ＲＮＡのある部分に「相補的」な配列とは、ＲＮＡにハイブリダイズし、安定な２本鎖を形成するのに充分な相補性を有している配列である。２本鎖アンチセンス核酸の場合には、２本鎖ＤＮＡの１本鎖を試験するか、又は３本鎖の形成をアッセイする。ハイブリダイズする能力は、上記で詳細に説明したようなアンチセンス核酸の有する相補性の程度と長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、そこに含まれる、ＲＮＡに対してミスマッチな塩基の数が増えても、安定な２本鎖（場合によっては３本鎖）を形成することができる。当業者は、標準的な方法を用いて許容されるミスマッチの程度を確認することができる。
【０１２６】
アンチセンス療法に用いるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのキメラ混合物、誘導体又は修飾したものであり、１本鎖でも２本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子やハイブリダイゼーションの安定性を高めるために、その塩基成分、糖成分又はリン酸骨格が修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドには、他の付加的な基が含まれていてもよく、（例えば、in vivoで宿主細胞の受容体のターゲティングを行うための）ペプチドや、細胞膜の通過を容易にする物質（Letsinger RL et al, 1989; Lemaitre M et al, 1987）や血液脳関門の通過を容易にする物質（Jaeger LB and Banks WA, 2004）、更にはハイブリダイゼーションに伴って開裂を引き起こす試薬（hybridization-triggered cleavage agent）（van der Krol AR et al, 1988）やインターカレーション試薬（Zon G, 1988）が含まれていてもよい。そのためにオリゴヌクレオチドは他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションに伴って架橋を引き起こす試薬（hybridization triggered cross-linking agent）、輸送試薬、又はハイブリダイゼーションに伴って開裂を引き起こす試薬）に結合していてもよい。
【０１２７】
アンチセンス分子は、in vivoでＨＴリスク遺伝子を発現する細胞に送達される。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への送達には数々の方法を用いることができ、例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射したり、目的の細胞を標的とするように修飾したアンチセンス分子（例えば、標的細胞の表面に発現されている受容体や抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に連結したアンチセンス分子）を全身に投与したりすることができる。又、好ましい態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、pol III又はpol II）の制御下におかれている組み換えＤＮＡ構築物を利用する。患者の中の標的細胞をトランスフェクトするためにこのような構築物を使用すると、内在性ＨＴリスク遺伝子転写産物と相補的な塩基対を形成するのに充分な量の１本鎖ＲＮＡが転写され、ＨＴ感受性ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、細胞がベクターを取り込み、アンチセンスＲＮＡの転写を誘導するように、ベクターをin vivoで導入することもできる。このようなベクターは、転写されて目的アンチセンスＲＮＡを産生する限り、エピソームのままでも、染色体に組み込まれてもかまわない。このようなベクターは、上述した標準的な組み換えＤＮＡ工学的手法で構築することができる。例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを用いて組み換えＤＮＡ構築物を調製し、調製した構築物を組織部位に直接導入することができる。又、目的の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いて、他の投与経路（例えば、全身的な投与経路）で投与を達成することもできる。
【０１２８】
標的化相同組み換えによってＨＴリスク遺伝子又はそのプロモーターを不活化又は「ノックアウト」することで、内在性のＨＴリスク遺伝子の発現を減少させることもできる（Smithies O et al, 1985； Thomas KR and Capecchi MR, 1987；Thompson S et al, 1989）。例えば、内在性ＨＴリスク遺伝子（即ち、ＨＴリスク遺伝子のコード領域又は調節領域）に相同なＤＮＡが隣接した、非機能的なＨＴリスク遺伝子の変異体（又は全く関係のないＤＮＡ配列）を、単独あるいは選択マーカー及び／又は負の選択マーカーと共に用い、ＨＴリスク遺伝子をin vivoで発現する細胞にトランスフェクトする。標的化相同組み換えによるＤＮＡ構築物の挿入は、ＨＴリスク遺伝子の不活化をもたらす。組み換えＤＮＡ構築物は、直接投与するか、又は上述したような適切なベクターを用いることで、必要な部位にin vivoでターゲティングすることができる。代わりに、以下の類似した方法を用いて、変異体ではないＨＴリスク遺伝子の発現を増加させることもできる： 変異体ではない機能的なＨＴリスク遺伝子（例えば、表６に示したいずれかの遺伝子であって、所望により、表２〜１１に示した少なくとも１種の多型を包含するもの）又はその部分配列を包含するＤＮＡ構築物を、標的化相同組み換えを用いて、上述したような細胞の有するＨＴリスク遺伝子変異体と置き換わるように挿入する。他の態様においては、細胞に存在するものとは異なる変異型ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸を包含するＤＮＡ構築物を、標的化相同組み換えを用いて挿入する。
【０１２９】
又、ＨＴリスク遺伝子の調節領域（即ち、ＨＴリスク遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列のターゲティングを行い、体内の標的細胞において、ＨＴリスク遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することで、内在性ＨＴリスク遺伝子の発現を減少することもできる（Helene C, 1991；Helene C et al, 1992；Maher LJ, 1992）。同様に、本願明細書に開示したアンチセンス構築物は、ＨＴタンパク質の１つの正常な生物活性と拮抗することで、in vivoの組織とex vivoの培養組織の両方において、組織の操作（例えば、組織分化）に用いることができる。更にアンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、又は転写産物がＨＴｍＲＮＡ又は遺伝子配列のアンチセンスとなるプラスミドのトランスフェクション）は、成体組織におけるＨＴリスク遺伝子の正常細胞機能のみならず、発生段階におけるＨＴリスク遺伝子の役割を研究するために用いることができる。このような技術は、細胞培養に利用することができ、トランスジェニック動物の作製にも使用することができる。
【０１３０】
本発明の別の態様においては、本明細書に開示した他のＨＴ治療剤もＨＴの治療又は予防に用いることができる。治療剤は、上述したような組成物の形態で送達するか、又は治療剤そのものを送達することができる。治療剤は全身的に投与するか、又は特定の組織にターゲティングすることができる。治療剤は、化学合成、組み換え体による産生、in vivoでの産生（例えば、トランスジェニック動物による産生（Meade H et al, 1990））などの種々の方法で製造し、本願明細書に記載したような標準的な方法で単離することができる。
【０１３１】
上記の治療方法のいかなる組み合わせ（例えば、変異体ではないＨＴ感受性ポリペプチドの投与と、ＨＴ感受性ｍＲＮＡ変異体を標的とするアンチセンス療法の組み合わせ；又はＨＴリスク遺伝子のコードする第１のスプライシング変異体の投与と、ＨＴリスク遺伝子のコードする第２のスプライシング変異体を標的とするアンチセンス療法の組み合わせ）も使用することができる。
【０１３２】
本発明を、以下の実施例によって更に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。本明細書で参照する文献の教示の全てが、参照することによって組み込まれたものとする。
【０１３３】
実施例
フィンランド東部のＨＴ患者とその表現型の特徴づけ
クオピオ虚血性心疾患危険因子研究（Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study；ＫＩＨＤ）、即ち、ＨＴやＣＶＤを含む、中年男性に見られる慢性疾患の危険因子を調査するために進行中の、前方視的な集団群研究（prospective population-based study）の参加者を被験者とした（Salonen JT 1988、Salonen JT et al 1998, 1999、Tuomainen T-P et al 1999）。研究対象となる集団は、基礎検査を実施した１９８４年〜１９８９年の時点で４２歳、４８歳、５４歳又は６０歳であったフィンランド東部在住の男性から無作為に抽出した年齢別サンプルである。１９８４年〜１９８９年の間に合計２６８２人の男性を検査した。男性コホートの１１年目の追跡調査期間に当たる１９９８年〜２００１年に最初の検査を実施した、人口から無作為に抽出した９２０人の女性によって、男性コホートを補完した。被験者の募集と検査方法については、既に詳細に報告した（Salonen JT 1988）。この研究は、クオピオ大学研究倫理委員会（University of Kuopio Research Ethics Committee）の承認済みである。全ての参加者から書面による同意を得ている。
【０１３４】
解析は、同じＫＩＨＤコホートから選んだ、ＨＴ（ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上、ＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態）を発症しており、兄弟／姉妹又は親がＨＴ患者である８１人からなる症例群と、ＨＴもＨＴの家族歴もない８２人からなる対照群に関するロジスティックモデリングに基づく。対象者の内の３人（２人は症例群、１人は対象群）は女性で、１６０人は男性だった。症例群の８１人中３８人は、ＫＩＨＤ基礎検査におけるＢＰ測定時には、抗高血圧薬を投薬していた。
【０１３５】
ＨＴは、収縮期ＢＰ（ＳＢＰ）が１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期ＢＰ（ＤＢＰ）が９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態と定義した。いずれのＢＰも、朝に看護師によってランダムゼロ水銀血圧計で測定した。測定用プロトコルには、あおむけの状態で３回、立った状態で１回、座った状態で２回の測定を５分間隔で行うことが含まれる。６回の測定の平均値をＳＢＰとＤＢＰとして使用した（Salonen JT et al, 1998）。研究対象者の父親、母親、兄弟／姉妹のいずれかが高血圧症の病歴又は高血圧症状を報告した場合に、ＨＴの家族歴を陽性とした。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に症例群と対照群について選択した特徴をまとめた。年齢と喫煙量は、インタビューワーの監督下で、自己記入式のアンケートに記入されたものである。空腹時血糖値は、トリクロロ酢酸でタンパク質を沈殿させた後にグルコースデヒドロゲナーゼ法を用いて測定した。血清インシュリンはNovo Biolabsラジオイムノアッセイキット（Novo Nordisk製）で測定した。ＨＤＬ画分は、超遠心分離と沈殿の組み合わせによって新鮮血清から分離した。リポタンパク質画分のコレステロール含量と血清トリグリセリドは、酵素を用いて測定した。フィブリノーゲンは、希釈血漿の過剰トロンビンによる凝固に基づいて測定した。
【０１３８】
成人期の社会経済状況（ＳＥＳ）は、教育、職業、収入及び物質的な生活状態の評価を包含する指標である。この基準は逆関数であり、低いスコアが高いＳＥＳに対応する。これらのデータは自己記入式のアンケートで集めた。
【０１３９】
血清フェリチンは、市販の２重抗体ラジオイムノアッセイ（英国、アマシャム、Amersham International製）で測定した。高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）と低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）を含むリポタンパク質は、新鮮血清サンプルから、超遠心分離とそれに続く超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の直接的な除去とＬＤＬ沈殿によって分離した（Salonen et al 1991）。その後、酵素を用いてコレステロール濃度を測定した。血清Ｃ反応性タンパク質は、市販の高感度イムノメトリックアッセイ（Immulite 高感度ＣＲアッセイ；ロサンジェルス、DPC製）で測定した。
【０１４０】
ゲノムＤＮＡの単離と質的試験
高分子量ゲノムＤＮＡサンプルを、凍結した静脈全血から標準的な方法を用いて抽出し、標準的なＴＥバッファーに溶解した。各ＤＮＡサンプルの量と純度は、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定することで評価し、単離したＤＮＡサンプルの完全性は、０．９％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって評価した。Ａ２６０／Ａ２８０比が１．７以上であり、アガロースゲル電気泳動で得た単離ＤＮＡの平均サイズが２０ｋｂを超えた場合に、サンプルはゲノムワイドスキャン（ＧＷＳ）に使用可能であると判断した。ＧＷＳ解析の前には、サンプルの濃度が５０ｎｇ／μｌとなるように還元型ＥＤＴＡ−ＴＥバッファー（TEKnova）で希釈した。
【０１４１】
ゲノムワイドスキャン
Affymetrix GeneChipR ヒト マッピング１００Ｋシステム（Affymetrix GeneChipR human mapping 100k system）の技術アクセスバージョンを用いて、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。このアッセイは２つのアレイ、即ち、XbaとHindからなり、これらを用いて各ＤＮＡサンプルから１２６，０００個を超えるＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。アッセイは、製造者の提供する説明書に従って実施した。合計２５０ｎｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのアッセイに付した。ＤＮＡサンプルは、Xba I又はHind III（New England Biolabs（ＮＥＢ）製）で消化した。具体的には、ＮＥバッファー２（１×；ＮＥＢ製）、ウシ血清アルブミン（１×；ＮＥＢ製）、及びXba I又はHind III（０．５Ｕ／μｌ；ＮＥＢ製）からなる混合溶液中で消化反応を＋３７℃で２時間行い、続いて酵素の不活化を＋７０℃で２０分間行った。Xba Ｉアダプター又はHind IIIアダプター（０．２５μＭ；Affymetrix製）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（１×；ＮＥＢ製）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ；ＮＥＢ製）を消化したＤＮＡサンプルに加えることで、Xba Iアダプター又はHind IIIアダプターをサンプルに連結した。連結反応を＋１６℃で２時間行い、続いて＋７０℃で２０分間インキュベートした。連結したＤＮＡサンプルを７５μｌの分子生物学用の水（BioWhittaker Molecular Applications／Cambrex製）で希釈した。
【０１４２】
１０μｌ等量のＤＮＡサンプルをPfx 増幅バッファー（Pfx Amplification Buffer）（１×；Invitrogen製）、ＰＣＲエンハンサー（１×；Invitrogen製）、ＭｇＳＯ4（１ｍＭ；Invitrogen製）、ｄＮＴＰ（各３００μＭ；Takara製）、ＰＣＲプライマー（1μＭ；Affymetrix製）及びPfx ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μｌ；Invitrogen製）と共に使用することで、希釈した連結ＤＮＡサンプルを１００μｌ容のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に同じ条件下で４回付した。ＰＣＲを＋９４℃で３分間進行させた後に、＋９４℃で１５秒、＋６０℃で３０秒、＋６８℃で６０秒のサイクルを３０回行い、そして＋６８℃で７分の最後の伸長反応を実施した。ＰＣＲの性能は、１×ＴＢＥバッファー中での標準的な２％アガロースゲル電気泳動を１２０Ｖで１時間行うことで確認した。
【０１４３】
ＰＣＲ産物の精製は、Affymetrixのマニュアルに従い、MinElute 96 UF ＰＣＲ精製キット（MinElute 96 UF PCR Purification kit）（Qiagen製）を用い、それぞれのサンプルについて得られた４個のＰＣＲ産物をまとめて１回の精製反応に付すことで行った。精製したＰＣＲ産物は、４０μｌのＥＢバッファー（Qiagen製）で溶出し、産物の収率を２６０ｎｍの吸光度で測定した。合計４０μｇの各ＰＣＲ産物を、０．２Ｕ／μｌの断片化試薬（Affymetrix製）と１×断片化バッファー（Fragmentation Buffer）からなる断片化反応に付した。断片化反応は＋３７℃で３５分間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートすることで酵素を不活化した。断片化したＰＣＲ産物について、１×ＴＢＥバッファー中での４％アガロースゲル電気泳動（BMA Reliant製のプレキャストゲル使用）を１２０Ｖで３０〜４５分間行うことで、断片化が完全であるかどうかを確認した。
【０１４４】
断片化したＰＣＲ産物は、次に１×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Terminal Deoxinucleotidyl Transferase）（TdT）バッファー（Affymetrix製）、GeneChip ＤＮＡ標識試薬（GeneChip DNA Labeling Reagent）（０．２１４ｍＭ； Affymetrix製）とＴｄＴ（１．５Ｕ／μｌ； Affymetrix製）を用いて、標識反応を＋３７℃で２時間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートした。標識したＤＮＡサンプルを、０．０５６ＭのＭＥＳ溶液（Sigma製）、５％のＤＭＳＯ（Sigma製）、２．５×デンハルト溶液（Sigma製）、５．７７ｍＭのＥＤＴＡ（Ambion製）、０．１１５ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Promega製）、１×オリゴヌクレオチドコントロール試薬（Oligonucleotide Control reagent）（Affymetrix製）、１１．５μｇ／ｍｌのヒトＣｏｔ−１（Invitrogen製）、０．０１１５％のTween-20（Pierce製）及び２．６９Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（Sigma製）からなるハイブリダイゼーションバッファーと混合した。ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションバッファー混合物は、対応するXba又はHind GeneChipRアレイとのハイブリダイゼーションを行う前に、＋９５℃で１０分間変性処理し、１０秒間氷冷してから、＋４８℃で２分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションは、６０ｒｐｍ、＋４８℃の Affymetrix GeneChip ハイブリダイゼーションオーブンに１６〜１８時間入れることで完了した。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイの染色と洗浄をGeneChip Fluidics Station 450の中で、推奨されるプロトコルであるMapping 10Kv1_450に従って行った。アレイはGeneChip 3000スキャナーでスキャンし、アレイ上の各ＳＮＰマーカーに対するジェノタイプコール（genotype call）は、Affymetrix ジェノタイピングツール（Genotyping Tools）（GTT）ソフトウエアを用いて作製した。ＳＮＰコールアルゴリズムにおける信頼スコアを０．２０に調整した。
【０１４５】
統計解析のためのＳＮＰの初期選択
統計解析を行う前に、ＳＮＰの質を次の３つの値に基づいて判定した：コール頻度（call rate）（ＣＲ）、マイナーアレル頻度（minor allele frequency）（ＭＡＦ）及びハーディワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）（Ｈ−Ｗ）。コール頻度は、ジェノタイピングの成功したサンプルの比率を示す。この値は、遺伝型が正しいかどうかは考慮しない。コール頻度は、以下の式で求めた：ＣＲ＝ジェノタイプコールが得られたサンプルの数／サンプルの合計数。マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）は、研究対象サンプルにより低い頻度で出現するアレルの頻度である。ＭＡＦは以下の式で求めた：ＭＡＦ＝min(p, q)［但し、ｐはＳＮＰアレル‘Ａ’の頻度であり、ｑはＳＮＰアレル‘Ｂ’の頻度であり、ｐ＝（遺伝型‘ＡＡ’を有するサンプルの数＋０．５×遺伝型‘ＡＢ’を有するサンプルの数）／ジェノタイプコールが得られたサンプルの数であり、ｑ＝１−ｐである］。ホモ接合型（ＭＡＦ＝０）のＳＮＰは遺伝子解析に用いることができないので取り除いた。ハーディワインバーグ（Ｈ−Ｗ）平衡は、対照のために試験した。この試験は、適合度を求めるための標準的なχ二乗検定に基づいている。観察された遺伝型の分布を、Ｈ−Ｗ平衡の元で予想される遺伝型分布と比較する。２つのアレルの場合、‘ＡＡ’、‘ＡＢ’と‘ＢＢ’という遺伝型に対する分布はそれぞれｐ2、２ｐｑとｑ2である。ＳＮＰがＨ−Ｗ平衡にない場合には、それはジェノタイピングの誤り又は未知のポピュレーションダイナミクス（例えば、機会的浮動や選択）によるものと考えられる。
【０１４６】
ＣＲ＞５０％であり、ＭＡＦ＞１％であり、更にＨ−Ｗ平衡にある（χ二乗検定の統計値＜２３．９３である）ＳＮＰのみを統計解析に使用した。合計で１０７，８９５個のＳＮＰが上記の基準を満たし、統計解析に含まれた。
【０１４７】
統計的手法
単一ＳＮＰ解析
発症例と対照例との間のアレル分布の差を、全１０７，８９５個のＳＮＰについてスクリーニングした。スクリーニングは、ｄｆ＝１とした標準的なχ二乗独立検定（アレル分布、２×２のテーブル）で行った。Ｐ値が０．００５未満（ｄｆ＝１のχ2分布が７．８８以上）のＳＮＰを統計的に有意とみなし、更なる解析のために選択した。この条件を満たすＳＮＰが５２９個あった。
【０１４８】
ハプロタイプ解析
データのセットは、ＨＰＭ−Ｇソフトウエア（Sevon P et al, 2004）又はＨＰＭソフトウエア（Toivonen HT et al, 2000）を用いた、ハプロタイプパターンマイニング（pattern mining）のアルゴリズムて解析した。ＨＰＭソフトウエアを用いる場合には、ジェノタイプのフェーズが分っていなければならない、即ち、母から受け継いだアレルと父から受け継いだアレルを判別しなければならない。家族データがない場合は、フェーズを集団データに基づいて推定しなければならない。我々は、フェーズを推定するためにHaploRecプログラム（Eronen L et al, 2004）を用いた。ＨＰＭ−ＧとＨＰＭは非常に高速で、１回の処理で大量のＳＮＰを扱うことができる。
【０１４９】
ＨＰＭとＨＰＭ−Ｇとの違いは、ＨＰＭ−Ｇはフェーズの分らないジェノタイプデータを扱うことが可能であり、ＨＰＭはフェーズの分っている（又はHaploRecや同様のプログラムでフェーズを推定した）データを用いる点である。ＨＰＭ−Ｇは、遺伝型構造（genotype configuration）の一致する全てのハプロタイプパターンを検出する。フェーズの分っているデータについて、ＨＰＭは、フェーズ構造（phase configuration）の合致する全てのハプロタイプパターンを検出する。ハプロタイプパターンの長さは色々ある。例えば、４個のＳＮＰがあり、個体がＳＮＰ１についてアレルはA／T、ＳＮＰ２についてアレルはC／C、ＳＮＰ３についてアレルはC／G、そしてＳＮＰ４についてアレルはA／Cの場合、ＨＰＭ−Ｇは、（長さが４個のＳＮＰの）ハプロタイプパターンは： ACCA、TCGC、TCCA、ACGC、ACGA、TCCC、TCGA、ACCCと判定する。一方、ＨＰＭは（HaploRecで）推定したフェーズと合致するハプロタイプパターンのみを考慮する。推定したフェーズが（母／父からの）ACGAと（父／母からの）TCCCの場合、ＨＰＭは、（長さが４個のＳＮＰの）たった２つのハプロタイプパターン：ACGA とTCCCを考慮する。
【０１５０】
ＳＮＰのスコア付けは、症例群と対照群との間で異なるハプロタイプパターンにＳＮＰが含まれる回数に基づいて行われる（χ二乗値の閾値はユーザーが選択することができる）。スコア値の有意性は、順列検定に基づいて評価する。
【０１５１】
ＨＰＭ−ＧプログラムとＨＰＭプログラムにおいて変更することのできるパラメーターとしては、χ二乗閾値（−ｘ）、最大ハプロタイプパターン長さ（−ｌ）、ハプロタイプパターンに含めることのできるワイルドカードの最大数（−ｗ）、及びＰ値を推定するための順列検定の回数（−ｐ）が挙げられる。ワイルドカードはハプロタイプ内にギャップが存在することを可能にする。ＨＰＭ−Ｇプログラムは、パラメーターを次のように設定して実行した：５個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ５ −ｗ１ −ｐ１００００）。HaploRec＋ＨＰＭプログラムは、パラメーターを次のように設定して実行した：５個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ５ −ｗ１ −ｐ１００００）。ＨＰＭ−Ｇ解析は、ｄｂＳＮＰ１２２に示されたＳＮＰの順番に基づき、そしてHaploRec＋ＨＰＭは、ｄｂＳＮＰ１２３に示されたＳＮＰの順番に基づいていた。１０，０００回の反復（−ｐ１００００）に基づき、ＨＰＭ−Ｇは、Ｐ値が０．００５未満の時に５７０個のＳＮＰが有意であると解析し、ＨＰＭ解析では６４２個のＳＮＰが有意であるという結果が得られた。
【０１５２】
ハプロタイプ解析結果で使用する用語の定義
「ハプロタイプゲノム領域」や「ハプロタイプ領域」という用語は、ハプロタイプ解析（ＨＰＭ、ＨＰＭＧ又は同様の統計的方法／プログラム）によって、有意であると判定されたゲノム領域である。ハプロタイプ領域は、統計解析（ハプロタイプ解析）に含まれた、最初／最後のＳＮＰの物理的な位置から１００Ｋｂｐ上流／下流の領域であり、統計的に有意と判定された領域と定義する。この領域は、ゲノムビルド（genome build）に基づく塩基対、例えば、ＮＣＢＩのヒトゲノムビルド３５（NCBI Human Genome Build 35）に従ったＳＮＰの物理的位置（塩基対の位置）として得られる。
【０１５３】
本明細書に記載される「ハプロタイプ」という用語は、任意のアレルの組み合わせを意味し、例えば、ある遺伝子マーカー（例えば、rs2221511, rs4940595, rs1522723, rs1395266）に存在するA T C C である。定義したハプロタイプは遺伝子マーカー（ＳＮＰのｄｂＳＮＰ ｒｓ−ｉｄ）とそのアレルに名前を与える。当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、本明細書に記載したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (A T C C) は、全てのアレルをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (T A G G) や、１番目のアレルのみをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (T T C C) と同じである。
【０１５４】
本願に記載したハプロタイプ、例えば、表３、４、５、７と８に示したマーカーを有するものは、ＨＴに罹患していない個体よりも、ＨＴに罹患している個体においてより頻繁に見出される。従ってこれらのハプロタイプは、個体からＨＴやＨＴに対する感受性を検出する上で予測的な価値を有する。ハプロタイプの検出は、多型部位に存在する配列を検出するために当業界で使用される方法で実施することができる。
【０１５５】
本発明で開示した、ＨＴ関連リスクを示すアレルとハプロタイプは、本発明のＨＴ関連遺伝子に位置する他の「多型部位」と関連してもよい。他のＨＴ関連多型部位は、遺伝子マーカーとして同等に有用であるか、あるいはリスク示す本発明のアレルやハプロタイプとＨＴとの間に見られる関連性を説明する、病因となる変異としてより有用である。
【０１５６】
多変量モデリング
２値の結果を得る高血圧症のモデリングを行うために、個別のＳＮＰ解析で得られた最も強力な予測性ＳＮＰマーカー７３４個とＨＰＭ解析で得られた最も強力なハプロタイプ１４個をモデルへのエントリーのために検定した。これらを、メジャーアレルのホモ接合体の場合は０、ヘテロ接合体の場合は１、そしてマイナーアレルのホモ接合体を２を記録した。多変量２値ロジスティック回帰分析は、ａ）ＨＴの予測性が最も高いＳＮＰを発見し、そしてｂ）最も強力にＨＴを予測する多変量モデルを構築するために用いた。前向きのステップアップモデル構築体（forward step-up model construction）を、入力するｐ値を０．０１、モデルから除外するｐ値を０．０２として使用した。モデルの予測性は、以下の２つの方法で推定した： NagelkerkeのＲ2値と、構築したロジスティックモデルに基づく、症例群と対照群に含まれる対象者の再分類。カットオフ値として使用した予測確率は０．５だった。データ還元解析は、ステップダウン及びステップアップロジスティックモデルで実施した。
【０１５７】
平均収縮期血圧及び平均拡張期血圧を定量的性質とした時に、それらと最も強力な関連性を示すＳＮＰマーカーを同定するために、多変量最小二乗直線回帰モデリングを用いた。前向きのステップアップモデル構築体は、入力するｐ値を０．００１、モデルから除外するｐ値を０．００５として使用した。
【０１５８】
使用した統計処理ソフトウエアはウインドウズ用のＳＰＳＳ、バージョン１１．５である。
【０１５９】
結果
表２には、個別のマーカー解析（ｎ＝５２９）において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたＳＮＰマーカーの特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベース ビルド１２４（NCBI db SNP database build 124）に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩ ヒト ゲノム ビルド３５（NCBI Human Genome Build 35）に基づく。遺伝子座は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４で報告されたものである。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイル（Affymetrix “csv” commercial access Human Mapping 100K array annotation files）の提供するものである。
【０１６０】
表３には、５個のＳＮＰを用いたＨＰＭ−Ｇ解析において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づく。関連遺伝子は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づいて、ＮＣＢＩマップビューワー（NCBI MapViewer）で見出したハプロタイプゲノム領域の両側に位置するＳＮＰの物理的位置から、１００Ｋｂｐ上流／下流の領域内に位置する遺伝子である。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイルの提供するものである。
【０１６１】
表４には、５個のＳＮＰを用いたHaploRec＋ＨＰＭ解析において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づく。関連遺伝子は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づいて、ＮＣＢＩマップビューワーで見出したハプロタイプゲノム領域の両側に位置するＳＮＰの物理的位置から、１００Ｋｂｐ上流／下流の領域内に位置する遺伝子である。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイルの提供するものである。
【０１６２】
表５には、HaploRec＋ＨＰＭ解析（ｎ＝１４）において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプブロックを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。
【０１６３】
表６には、点別の解析及びハプロタイプ解析（ｎ＝７２２）によって、ＨＴとの関連性が見出された全ての遺伝子を列挙した。遺伝子の名称は、ＨＵＧＯの遺伝子専門用語委員会（HUGO Gene Nomenclature Committee）（ＨＧＮＣ）に従った。
【０１６４】
表７には、多変量ロジスティックモデルにおいて、家族性ＨＴの危険度を最も確実に予測するＳＮＰマーカーとハプロタイプを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。８変量モデルは家族性ＨＴの９１．４％を正しく予測する。統計は、ＫＩＨＤ基礎検査において高血圧症（ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上、ＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態）と診断され、兄弟／姉妹又は親がＨＴである８１人のＫＩＨＤ参加者と、ＫＩＨＤ基準値のＨＴもＨＴの家族歴もない８２人のＫＩＨＤ参加者に基づいている。対照群は、年齢が症例群と一致するようにした。
【０１６５】
表８には、多変量ロジスティックモデルにおいて、家族性ＨＴの危険度を最も確実に予測するＳＮＰマーカー、ハプロタイプと表現型のデータを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。２個のハプロタイプ、５個のＳＮＰマーカーと２つの表現型変数を含む１２変量モデルは、家族性ＨＴの８７．１％を正しく予測した。多変量ロジスティックモデルにおいて特定された最も強力な遺伝子座は、SERPINのB3、B4、B7とB11及びEPC1、OR1J4、並びにLOC401406、439953、441550と441551である。
【０１６６】
表９には、平均収縮期血圧と平均拡張期血圧を予測する最も強力なＳＮＰマーカーの多変量回帰モデルを示した。表１０と１１には、単変量単一ＳＮＰ解析、ハプロタイプ解析及び多変量解析の全てにおいて最も強力にＢＰを予測した最も強力なＳＮＰマーカーの遺伝型に対する、平均収縮期血圧（表１０）と平均拡張期血圧（表１１）のそれぞれの平均値と標準偏差を示した。マーカーの順位付けは、拡張期血圧との関連性の強度に基づいている。定量的特性としてのＢＰに関連する遺伝子の中で、最も強力な遺伝子として特定されたものは、SERPINのB3、B7とB11、A100A7、S100A6、FARS1、SPOCK3とTLL1である。
【０１６７】
推測と考察
我々は、家族性の症例群と家族歴のない健康な対照群からなる、集団に基づく集合体において、ＨＴ及び／又は血圧の危険度と関連する１３６５個のＳＮＰマーカーを見出した。これらの内、５２９個を個別のＳＮＰの解析で同定し、１０８０個をハプロタイプパターンマイニング又はハプロタイプ解析で同定した。１３６５個のマーカーの内、２４４個は両方の統計解析でＨＴを予測した。我々は更に多変量ロジスティックモデルにおいて、実質的に完全にＨＴの発症を予測するＳＮＰマーカーを同定した。
【０１６８】
点別の解析とハプロタイプ解析の結果によって、ＨＴと関連する合計７２２個の遺伝子が同定され、この内、３３０個の遺伝子には、１３６５個のＳＮＰマーカーの内の少なくとも１個が物理的に結合していた。
【０１６９】
こうして我々は、その遺伝子マーカーがいずれもＨＴの予測に用いることのできる、合計７２２個のＨＴ遺伝子を同定した。従って、これらのマーカーは、ＨＴ素因に対する分子診断試験の一部として用いることができる。更に我々は、ＨＴ予測性の１３６５個のＳＮＰマーカーのセットを開示した。これらマーカーは、抗高血圧性の薬剤や化合物の効果や副作用を予測する薬理遺伝学試験の一部として用いることができる。発見した遺伝子は、新しいＨＴ治療法、例えば薬物、の標的となる。他の治療法としては、遺伝子導入を含む分子導入が挙げられる。新しい遺伝子は、抗高血圧性の薬剤や化合物を研究するための新規なトランスジェニック動物の開発と製造にも使用することができる。
【０１７０】
本発明をその好ましい態様に参照しながら具体的に開示し説明したが、当業者は、請求の範囲で定義した本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の形態及びその細部に変更を加えることが可能であることを理解するであろう。
【０１７１】
【表２−１】
【０１７２】
【表２−２】
【０１７３】
【表２−３】
【０１７４】
【表２−４】
【０１７５】
【表２−５】
【０１７６】
【表２−６】
【０１７７】
【表２−７】
【０１７８】
【表２−８】
【０１７９】
【表２−９】
【０１８０】
【表２−１０】
【０１８１】
【表３−１】
【０１８２】
【表３−２】
【０１８３】
【表３−３】
【０１８４】
【表３−４】
【０１８５】
【表３−５】
【０１８６】
【表３−６】
【０１８７】
【表３−７】
【０１８８】
【表３−８】
【０１８９】
【表３−９】
【０１９０】
【表３−１０】
【０１９１】
【表３−１１】
【０１９２】
【表３−１２】
【０１９３】
【表３−１３】
【０１９４】
【表３−１４】
【０１９５】
【表３−１５】
【０１９６】
【表３−１６】
【０１９７】
【表３−１７】
【０１９８】
【表３−１８】
【０１９９】
【表３−１９】
【０２００】
【表３−２０】
【０２０１】
【表３−２１】
【０２０２】
【表４−１】
【０２０３】
【表４−２】
【０２０４】
【表４−３】
【０２０５】
【表４−４】
【０２０６】
【表４−５】
【０２０７】
【表４−６】
【０２０８】
【表４−７】
【０２０９】
【表４−８】
【０２１０】
【表４−９】
【０２１１】
【表４−１０】
【０２１２】
【表４−１１】
【０２１３】
【表４−１２】
【０２１４】
【表４−１３】
【０２１５】
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【０２１６】
【表４−１５】
【０２１７】
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【表４−１７】
【０２１９】
【表４−１８】
【０２２０】
【表４−１９】
【０２２１】
【表４−２０】
【０２２２】
【表４−２１】
【０２２３】
【表４−２２】
【０２２４】
【表４−２３】
【０２２５】
【表４−２４】
【０２２６】
【表４−２５】
【０２２７】
【表５−１】
【０２２８】
【表５−２】
【０２２９】
【表６−１】
【０２３０】
【表６−２】
【０２３１】
【表６−３】
【０２３２】
【表６−４】
【０２３３】
【表６−５】
【０２３４】
【表６−６】
【０２３５】
【表６−７】
【０２３６】
【表６−８】
【０２３７】
【表６−９】
【０２３８】
【表６−１０】
【０２３９】
【表６−１１】
【０２４０】
【表６−１２】
【０２４１】
【表７−１】
【０２４２】
【表７−２】
【０２４３】
【表８−１】
【０２４４】
【表８−２】
【０２４５】
【表９】
【０２４６】
【表１０−１】
【０２４７】
【表１０−２】
【０２４８】
【表１１−１】
【０２４９】
【表１１−２】
【０２５０】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈性高血圧症（ＨＴ）などの心血管障害（ＣＶＤ）の診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＨＴの素因、発症傾向や感受性を診断又は判定するための方法を提供する。特に本発明は、試験する対象生物から得た生物学的サンプルを提供し、そして生物学的サンプルから、ゲノム上の１種又は数種の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーの存在又は不存在を検出することを包含する方法に焦点を当てたものである。更に本発明は、ＨＴを発症する確率を提供するスコアを構築するために、遺伝的情報及び表現型の情報に加えて、アンケートで得られた情報をも使用する。また、本発明は、この方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、治療的及び予防的介入（例えば、食事についての助言）を行う対象を決めるためのみならず、治験薬や他の介入方法に関する臨床試験の対象を層化するための、病因論に基づくＨＴの診断に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
公衆衛生におけるＣＶＤとＨＴの重要性
心血管障害（ＣＶＤ）（ＩＣＤ／１０コード Ｉ００−Ｉ９９、Ｑ２０−Ｑ２８）には、他の疾患と共に、虚血性（冠動脈）心疾患（ＩＨＤ、ＣＨＤ）、高血圧症、脳血管性疾患（脳卒中）及びリュウマチ熱／リュウマチ性心疾患が含まれる（AHA, 2004）。ＨＴ（ＩＣＤ／１０ Ｉ１０−Ｉ１５）は、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投薬を受けている状態と定義する（AHA, 2004）。ＣＶＤそのものを発症していなくとも、ＨＴは、ＩＨＤ、脳卒中や鬱血性心不全（ＣＨＦ）などのＣＶＤの危険因子である。１回目の心臓麻痺を発症したヒトの約半数と１回目の脳卒中を発症したヒトの３分の２の血圧（ＢＰ）は、１６０／９５ｍｍＨｇよりも高い。症例の９１％において、ＨＴはＣＨＦに先んじて発症する。
【０００３】
ＨＴ患者の９０〜９５％は、その根本的病因が未だ分らない本態性ＨＴである。異質な遺伝的及び環境的要因による持続的な血圧の上昇を本態性ＨＴと呼ぶ。その有病率は、診断に用いるＢＰの測定法や実行閾値に関係なく、年齢と共に上昇する。ＨＴは、腹部肥満度、脂質代謝異常、グルコース不耐性、高インスリン血症や高尿酸血症などと共に心血管障害危険因子とされているが、これは根本的病因が共通するためかもしれない（Salonen JT et al, 1981, 1998、Staessen JA et al, 2003）。
【０００４】
２００１年には、推定１，６６０万人 −即ち地球上の全死亡者数の三分の一− が色々な形のＣＶＤ（７２０万人がＨＴ、５５０万人が脳血管障害、そして更に３９０万人が高血圧性の又は他の心臓の病態）によって死亡した。少なくとも年間２千万人が心臓麻痺や脳卒中から生還し、その中のかなりの人数が高額な臨床介護を必要とし、長期介護財源に大きな負担を課す。ＣＶＤは男性、女性そして子供にとって、破壊的な疾患であることを認識する必要がある（AHA, 2004）。
【０００５】
全世界のＣＶＤ死亡者の約８０％が、発展途上の低所得国及び中所得国で生じた。２０１０年までには、ＣＶＤは先進国と発展途上国の両方で主な死因となることが推定される。ＣＶＤ発症率の上昇は、工業化、都市化、経済発展及び食糧市場のグローバリゼーションに伴う、世界中での食習慣、運動量及びタバコ消費量の著しい変化を反映している（WHO, 2004）。これにより、比較的最近の環境危険因子及び行動危険因子の役割が強調される。しかし、人種間に見られるＣＶＤの発病率と罹患率の差及び家系間に見られるＣＶＤ発症率の偏りは、遺伝性の危険因子が主要な役割を担うことを示唆している。
【０００６】
障害調整生存年数（ＤＡＬＹ）によって障害を計測すると、ＣＶＤは、全世界のＤＡＬＹの９．７％、先進国のＤＡＬＹの２０．４％、そして発展途上国のＤＡＬＹの８．３％をもたらした。ＨＴは、全世界のＤＡＬＹの１．４％、先進国のＤＡＬＹの４．７％、そして発展途上国のＤＡＬＹの０．９％をもたらした（Murray CJL and Lopez AD, 1997）。
【０００７】
ＮＨＡＮＥＳ III 研究（１９８８〜１９９４）からのデータに基づくと、２００１年には、何らかの形態のＣＶＤ罹患者数はアメリカ人で６，４４０万人と推定され、これは有病率２２．６％（男性が２１．５％、女性が２２．４％）に相当する。このうち、５，０００万人がＨＴを発症していた（有病率は２０％）。ＨＴを患う患者のうち、３０％はＨＴの自覚がなく、３４％は治療によってＨＴを抑制しており、２５％は治療中であるがＨＴは抑制されておらず、１１％は治療を受けていない（AHA, 2004）。ＨＴは発展途上国においても公衆衛生問題であり、このような国では、有病率が１０％以上であることが珍しくなく、多くの場合は、ＨＴの自覚、治療、及び血圧抑制のレベルの低さと関連している（Fuentes RM et al, 2000）。
【０００８】
アメリカ合衆国において２００４年にＣＶＤに係った費用は、推定３，６８４億ドル（ＨＴが１，３３２億ドル、脳卒中が５３６億ドル、高血圧症が５５５億ドル）である。この額には、健康維持に係った費用（直接損害額）及び疾病と死亡に伴う生産性の低下（間接損害額）が含まれている（AHA, 2004）。
【０００９】
本態性ＨＴの病態生理学
循環器内の血液を動かすのに必要な圧力は、心臓のポンプ機能［心拍出量（ＣＯ）］と動脈の柔軟性［末梢抵抗（ＰＲ）］によって供給される。一方、血圧（ＢＰ）を決めるこのような一次決定因子は、いずれも複雑な一連の因子の間の相互作用によって決まる。
【００１０】
心拍出量に影響を与える因子
心拍出量（ＣＯ）の増加は、過動循環を示すことのある、境界域高血圧症の若年患者の一部で見られる症状である。これがＨＴの原因であるならば、論理的には、以下の２つの過程のいずれかによってＣＯの増加が生じたと考えられる： 体液量（前負荷）の増加又は心臓の神経刺激による収縮性の増加。しかし、ＣＯの増加がＨＴの発症に関与していたとしても、ＣＯの増加が持続するとは考えられない。慢性的なＨＴにおける典型的な血行動態的所見は、上昇したＰＲと正常なＣＯである（Cowley AW, 1992）。
【００１１】
心拍数の増加は、単純に過動循環を反映したり、交感神経性活動の増加の指標となったりするものではないが、心拍数の増加は、ＨＴ発症の独立した予測因子であることが複数の疫学的調査によって示されている（Palatini P and Julius S, 1999）。
【００１２】
左室肥大は、血管抵抗の増加に対する代償機構と一般的に考えられている。しかしながら、繰り返される神経刺激に対する一次応答を反映するものとも考えられ、それ故に、ＨＴ発症メカニズム（Julius S et al., 1991c）のみならず、動脈硬化によるＢＰ上昇を補うためにＣＯを増幅させる現象（Segers P et al., 2000）とも考えられる。
【００１３】
ＣＯ増加によってＨＴを誘導する他のメカニズムとしては、循環体液量（前負荷）の増加が挙げられる。しかし、大部分の研究において、ＢＰの高い対象生物の血液量と総交換性ナトリウム量は正常対象生物よりも低い（Harrap SB et al., 2000）。血液総量が増大していなくとも、より大きな末梢血管収縮によって、より多くの血液が中央領域又は心肺領域に行き渡るように血液を再分配することができる（Schobel HP et al., 1993）。その結果、心臓への静脈還流量は増加し、ＣＯの増加を仲介することが可能となる。
【００１４】
過剰なナトリウム摂取は、体液量と前負荷を増加することでＣＯを増加し、その結果、ＨＴを誘導する（Chobanian AV and Hill M, 2000）。実験データ（Tobian L, 1991）と疫学的証拠（Stamler J et al., 1997）の両方が、ヒトにおけるＨＴと高ナトリウム／カリウム比との密接な関連性を支持している。工業社会におけるほぼ全員が高ナトリウム食を摂取しているものの、その約半数のみがＨＴを発症するという事実は、ナトリウムに対するＢＰの感受性の程度の多様性を示唆している（Weinberger MH, 1996）。
【００１５】
健常者においては、ＢＰが上昇すると、腎臓によるナトリウムと水分の排泄が増加して体液量が低下し、ＢＰが正常値に戻る。この現象を、圧依存性利尿という。動物実験とコンピューターモデルによると、腎臓による体液量の調節は、ＢＰの長期制御において支配的な機構であると考えられる（Guyton AC 1961, 1992）。従って、ＨＴを発症した場合、圧依存性利尿（pressure-natriuresis）による調節機構に何らかの異常があるはずであり、そうでなければＢＰは正常に戻るはずである（Cowley AW and Roman RJ, 1996）。一次ＨＴの患者においては、血圧−ナトリウム排泄曲線をリセットすることは、ＢＰが正常値に戻ることを妨げる（Palmer BF, 2001）。体液バランスを維持するための圧依存性利尿への転換には、ＢＰの上昇が必要である。血圧と利尿作用との関係は、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）、交換神経活動、心房性ナトリウム利尿因子、アラキドン酸代謝産物や腎内酸化窒素などの神経性因子や液性因子によって変えることができる（Moreno C et al., 2001、Majid DS et al., 2001）。主な調節因子はＲＡＳ（Hall JE et al., 1999; van Paassen P et al., 2000）である可能性が高く、これは末梢血管収縮に必要なよりもはるかに低い濃度のアンジオテンシンIIによって、腎臓によるナトリウム再吸収を増加させる。アンジオテンシンIIは血管平滑筋と副腎皮質に作用するのみならず、心臓、腎臓、中枢神経系と自律神経系にも作用する。これらの作用は、アンジオテンシンIIの抹消血管系に対する体液量貯留効果と血管収縮効果を増幅するので、ＣＯとＰＲの両方に影響を与える。更にアンジオテンシンIIは、ＢＰに対する効果とは独立して、細胞増殖と肥大を誘導する（Su EJ et al., 1998）。又、アンジオテンシンIIは、転写因子κ−Ｂ（Luft FC, 2001）と接着分子−１の発現（Tummala PE et al., 1999）の活性化によって、血管平滑筋細胞の炎症性応答（Kranzhofer R et al., 1999）を誘導するとも考えられ、これはアテローム性動脈硬化症への直接的な連鎖となる可能性がある。
【００１６】
ストレスは交感神経系（ＳＮＳ）を直接活性化することができ、一方、ＳＮＳの過剰活性は、高ナトリウム摂取、ＲＡＳやインシュリン抵抗性を含む他の可能なメカニズムと相互作用することができる。相当な量の証拠によって、初期ＨＴにおけるＳＮＳ活性の増加が裏付けられており（Esler M et al., 2001）、更に印象的なことに、このことは高血圧症の親を持つ子において見受けられ、また、正常血圧を維持していても、高血圧症の親を持つ子の大部分がＨＴを発症する可能性が高い。ＨＴの病因論におけるＳＮＳ活性の特定の役割が何であれ、ＳＮＳ活性は、高血圧患者において心血管に関する疾病率と死亡率が早朝の時間帯に増加する現象に関与すると考えられる。目覚めと共にエピネフリンレベルの上昇が開始し、起き上がるとノルエピネフリンが急激に上昇する（Dodt C et al., 1997）。増加したＳＮＳ活性の結果として、ＢＰが突然に著しく上昇し、このＢＰ上昇が、早朝の突然死、心臓麻痺及び脳卒中の原因の少なくとも一部を担っている。交感神経活性の増加は、以前は心血管疾病率に関連すると思われていた、高血圧症患者の多くに見られる心拍数の増加にも関与するであろう。
【００１７】
末梢抵抗に影響を与える因子
ＨＴは、主として動脈の管腔の大きさ（即ち半径）の低下によるＰＲの増加によって維持される。ポアズイユの法則によると、血管抵抗は、血液の粘度と動脈系の長さの両方に比例し、管腔の半径の三乗に反比例する。血液の粘度と動脈系の長さは変化したとしてもわずかであり、管腔の半径の小さな変化でさえ大きな効果をもたらすので、慢性的なＨＴに見られる血管抵抗の増加は、抵抗値の小さな動脈や小動脈の内径の変化を反映していることは明らかである（Folkow B et al., 1970）。血管壁の厚みと管腔直径の比が増加しているために、抵抗性静脈が刺激されると、高い血管壁圧力と管腔内圧力が発生する。
【００１８】
ＨＴにおいては、小さな動脈は機能的、構造的且つ機械的な変化生じ、その結果、管腔の大きさが低下し、抹消抵抗が増加する（Mulvany MJ, 2002、Intengan HD and Schiffrin EL, 2001）。機能的変化には、反応性の増加と応力緩和性（relaxation）の減退が含まれ、興奮収縮連関の変化、血管平滑筋細胞の電気的性質の変化、又は内皮系の機能不全を反映する（Johns DG et al, 2000、Feldman RD and Gros R, 1998）。主な構造変化には細胞増殖の増加による再構築、細胞外マトリックスの沈着と炎症が含まれる（Mulvany MJ, 2002、Intengan HD and Schiffrin EL, 2001、Brasier AR, 2002）。血管平滑筋細胞はこれら事象の中心にあり、ＨＴで生じる変化の基となる動的なプロセスにおいて基礎的な役割を担う。
【００１９】
ＨＴにおける血管の変化は、シグナル伝達を調節する液性因子と機械的因子に関連し、その結果、中膜の細胞成分の機能と成長の異常をもたらす（Touyz RM, 2000、Koller A, 2002）。ＨＴにおいて動脈を調節する液性因子としては、アンジオテンシンII、エンドセリン−１、カテコールアミン、バソプレシンなどの血管収縮作用物質；酸化窒素、内皮由来過分極因子、ナトリウム利尿ペプチドなどの血管拡張作用物質；インシュリン様増殖因子−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子などの増殖因子；及びトランスフォーミング成長因子β、腫瘍壊死因子、インターロイキンなどのサイトカインが挙げられる（Touyz RM, 2000）。ＨＴにおいて脈管構造に影響を与える機械的因子としては、ずり応力、壁体応力、と圧力そのものによる直接的な作用が挙げられる（Touyz RM, 2000、Koller A, 2002）。これら因子の他には、細胞内及び細胞間伝達分子として機能する活性酸素種（ＲＯＳ）も血管の柔軟性と構造を調節するという証拠があり、証拠は増加している（Wilcox CS, 2002; Berry C et al, 2001）。
【００２０】
アンジオテンシンIIのシグナル伝達に関する分野における最近の発展は、その血管収縮特性に加えて、アンジオテンシンIIは、強力な分裂促進様及び炎症誘発様の特性を有するという報告がある。これらの作用は、非受容体型チロシンキナーゼと受容体型チロシンキナーゼの両方のリン酸化によって仲介される（Touyz RM, 2003）。ＨＴにおける異常な血管機能の基となる多くのシグナル伝達事象は、細胞内酸化還元状態の変化の影響を受けるということがますます明らかになってきた。特に、ＲＯＳの生物学的利用率の増加は、増殖性シグナル伝達経路を刺激し、炎症誘発遺伝子の発現を誘導し、興奮収縮連関を変化させ、内皮の機能を妨害する（Touyz RM, 2003）。
【００２１】
ＨＴの原因となる種々の機能及び構造変化と協調して、動脈は硬くなる、即ち、弾性が低下する。血管の硬化は年齢と共に進行的に増加し（Slotwiner DJ et al., 2001）、拡張期血圧と比較して収縮期血圧の進行的な増加をもたらし、今では心血管性危険度の主な決定因子と認識されている、脈圧の典型的な上昇をもたらす（Beltran A et al., 2001）。硬さと弾性の測定値は、ＨＴ発症に関する独立した予測因子（Liao D et al., 1999）及びＨＴ患者における心血管性危険度のマーカー（Blacher J et al., 1999）であることが示されている。ＢＰ脈波形に反映される大動脈の物理的特徴の変化は、ＢＰと脈圧のみならず、心筋の運動と性能を変化させる。
【００２２】
ＢＰの上昇に繋がる病態生理学的メカニズムは複雑であるため、いかなる高血圧患者においても、選択的な、メカニズムに基づく抗高血圧治療がほとんど不可能である。ＨＴは中年と高齢者の間で広く蔓延しており、これら個体におけるＢＰ制御の成功率は低い。治療のための現行のガイドラインでは、通常、ＨＴを治療するための一般的な治療を推奨しており、ＢＰ上昇の裏に潜んだ病態生理学に基づく治療の選択についてはわずかな重点しか置かれていない（Chobanian AV et al, 2003、ESH/ESC, 2003）。特定の原因に関する認識の増加と共に、副作用の少ない、個別の病態生理学的メカニズムに対して選択的な治療法の開発が可能となり、それによってＢＰのより効果的な低下がもたらされる。遺伝学、ジェノミクス及びプロテオミクスの強力な新技術を応用生理学と集団研究と統合して使用することにより、今後数十年の内に、ＨＴの治療や更には予防のためのより選択的且つ効果的な取り組みが可能となる（Oparil S et al, 2003）。
【００２３】
本態性ＨＴ： 多遺伝子性疾患
核家族の研究によって、家族内の方が家族間よりもＢＰの類似性が高いことが示され、遺伝率推定値は０．２０〜０．４６の範囲内である（Fuentes RM, 2003）。双子に関する研究は、二卵性双生児よりも一卵性双生児においてＢＰの一致性が高いことを示し、最も高い遺伝率推定値は０．４８〜０．６４である（Fuentes RM, 2003）。養子研究は、同じ家庭に暮らす養子を含む兄弟よりも生物学的な兄弟においてＢＰの一致性が高いことを示し、遺伝率推定値は０．４５〜０．６１である（Fuentes RM, 2003）。
【００２４】
高血圧と低血圧がメンデル遺伝学的な形を取ることは稀であるため、単一遺伝子がＢＰに主要な効果をもたらすことも考えられる（Lifton RP et al, 2001）。同定可能な単一遺伝子変異が原因となるＨＴはわずか数パーセントであるが、このような稀な疾患の研究は、より一般的な形のＨＴにかかりやすくする病態生理学的メカニズムを解明し、新規な治療的手法を示唆するかもしれない（Lifton RP et al, 2001）。今日までに、メンデル型のヒトＨＴをもたらす１０個の遺伝子の変異と低血圧症をもたらす９個の遺伝子の変異が報告されている（Lifton RP et al, 2001、Wilson FH et al, 2001）。これらの変異は、腎臓による塩分の処理を変化させることでＢＰに影響を与えるが、これはＨＴの発症が、塩・水分貯留をもたらす、遺伝的に決定された腎臓の機能不全に依存するという仮説を強化するものである（Guyton AC, 1991）。重要なことに、今日までに同定された全ての単遺伝子性ＨＴ症候群は、腎性塩貯留をもたらす障害によるものであり、一方、全ての低血圧症候群は、腎臓の過剰な塩排泄という機構を共有している（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。
【００２５】
ＨＴの単一遺伝子性の原因の中で最も良く研究されているのはリドル症候群である。リドル症候群は、上皮ナトリウムチャンネルの構成的な活性化が、重症且つ治療耐性的なＨＴを発症しやすくする、稀であるが臨床的に重要な疾患である（Shimkets RA et al, 1994）。上皮ナトリウムチャンネルの活性化は、チャンネルのβ又はγサブユニットの変異に遡ることができ、この変異の結果として、腎臓の集合管の段階での不適切な塩貯留が起こる。リドル症候群の患者は典型的な症状として、容量依存性の、低レニン・低アルドステロン性ＨＴを発症する。
【００２６】
大部分の症例において、ＨＴは遺伝因子、環境因子及び人口統計学的因子の複雑な相互作用の結果である。遺伝子解析方法、特に候補遺伝子関連研究とゲノムワイドな連鎖研究（ゲノムワイドスキャン、ＧＷＳ）、の技術発展は、一次ＨＴの発症に寄与する遺伝子を集団から探索することを可能にした。
【００２７】
これまでのところ、候補遺伝子アプローチは、連鎖アプローチよりも多くの、ＢＰに影響を与えると見られる変異型遺伝子の例を提供してきた。考慮するに値する候補遺伝子には、ＢＰの調節に関与することが知られる生理学的システムに関与する遺伝子と、マウスモデルにおいてＢＰに影響を与えることが知られる遺伝子が含まれる。今日までに、８０以上の候補遺伝子がＨＴについて評価されている（Fuentes RM, 2004、未出版の報告）。しかし、ＨＴとの関連が広く再現されている遺伝子は次の３種のみである： アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＧＴ）、アデューシン１（ＡＤＤ１）とグアニンヌクレオチド結合タンパク質β−３サブユニット（ＧＮＢ３）（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。ＨＴ治療に影響を与える遺伝子−環境相互作用が、ＡＧＴ、ＡＤＤ１と塩摂取の低下との間（Hunt SC et al, 1998、Hunt SC et al, 1999、Cusi D et al, 1997）及びＡＤＤ１、ＧＮＢ３と利尿薬治療との間（Cusi D et al, 1997、Turner ST et al, 2001）で見られた。ＨＴ危険度の発生に影響を与える遺伝子−遺伝子相互作用が、ＡＤＤ１とＡＣＥ遺伝子のＩ／Ｄ多型との間に見られた（Staessen JA et al, 2001）。候補遺伝子研究から今日までに明らかになった問題点としては、多くの研究において統計処理能力の限界によって生じた解析不足、集団間に見られる予想通りの多様性、研究対象生物のより詳細なフェノタイピングの必要性、集団のＨＴ有病率に対して研究遺伝子の影響が比較的小さいこと、そして遺伝型に基づいて治療法を推奨するにたる充分な確実性がこれまでの遺伝子研究で得られた因果関係には欠けていることが挙げられる（Hopkins PN and Hunt SC, 2003）。
【００２８】
これまでに、ＢＰ／ＨＴの遺伝子座を特定するために、３０件を超えるＧＷＳ研究が報告されている（Fuentes RM, 2004、未出版の報告）。いくつかの研究は家族を使用し、その他の研究は共に発症した兄弟／姉妹又は一方だけが発症した兄弟／姉妹を用いていた。少なくとも暗示的なＬＯＤスコアを示す、ＢＰ／ＨＴと連鎖した遺伝子座が、全ての染色体に見られた。しかし、最も驚くべきことは、一貫して連鎖を示す遺伝子座がないことである。Koivukoski L et al, 2004 は、出版済みの、白色人種に関する９件のゲノムワイドスキャン（ＢＰに関するもの５件とＨＴに関するもの４件）に対してゲノムサーチ・メタ解析（ＧＳＭＡ）を行い、個別の研究においては連鎖の程度が中庸か有意ではないと判断された染色体 2p12-q22.1と3p14.1-q12.3 が、ＢＰ／ＨＴ感受性領域である証拠を見つけた。この結果は、ヒトＨＴの不均質性に加えて、異なる方法を用いた研究を比較するという試みに存在しうる問題を説明している。
【００２９】
集団遺伝学の機会
ＨＴの遺伝的病因学に関連した過去の医学的研究は、その大部分が後向きの対照研究とヒトの家族研究、及び遺伝子組み換え動物に関する研究に基づいている。つい最近になって分ったことであるが、後向きの対照研究は生存率と選択率の偏りが起きやすく、このような研究は、多数の候補遺伝子に関して無数の偏った知見を生み出した。一般的に用いられる手法は、罹患したヒトと罹患していないヒトとの間で遺伝子発現を比較することである。しかし、大部分が横断研究による遺伝子発現研究では、原因と結果を分けることはできない。ヒトの病態生理学は独特なので、ＨＴについて動物モデルから得られた知見をヒトに対して一般化することはできない。ヒト疾病の遺伝的病因学を明確にするための最も重要な手法が遺伝的疫学的研究である理由は、動物研究が不適切であるためである。
【００３０】
ヒトにおける前向きコホート研究はこのような問題を解決する。ＧＷＳ、シークエンシング技術及びデータ解析方法の発展によって、複雑且つ多因子性の性質に係る罹病性遺伝子を特定し、この疾病における遺伝的素因及び環境／生活習慣因子の役割を新たな精密さをもって分析する試みが今では可能となった。遺伝的効果及び環境効果は一生の間に変化し、遺伝子情報データセットにおける縦断研究のみがこのような効果の研究を可能にする。疾病遺伝子の発見において集団遺伝学的手法が他の方法よりも優れる主な利点は、ヒトにおいて有効な診断マーカーが得られる点である。
【００３１】
ＨＴのような主要な公衆衛生問題を引き起こす遺伝子の同定は、以下に示す分子生物学、集団遺伝学及びバイオインフォマティクスにおける最近の発展によって、今では可能になった： １．操作コストの低下とスループットの増加に劇的な変化をもたらす、新しいジェノタイピング・プラットフォームの入手可能性； ２．高密度マーカー地図を用いたゲノムスキャンの応用； ３．ハプロタイプ共有分析を用いた、連鎖不平衡を試験するための新しい強力な統計学的手法によるデータ解析；そして ４．遺伝的に均一な集団におけるゲノムスキャンには、従来考えられていたよりも少数の遺伝子マーカーで充分であるという認識。
【００３２】
マイクロサテライトマーカーと連鎖解析を用いた古典的なＧＷＳは、一般的な疾病の原因となる遺伝子の発見には成功していない。失敗の一因はＧＷＳに用いた遺伝子マーカーの数があまりにも少なかったことであり、他の一因は研究した集団があまりにも不均一だったことである。ヒトゲノムプロジェクトとジェノタイピング技術の発展により、全ヒトゲノムのマッピングのために、初めての高密度マーカー地図が最近入手可能となった。ユリラブ社（Jurilab）の使用したマイクロアレイは１００，０００個以上の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーのためのプローブを含有する。これらのＳＮＰは、ＨＴの原因となる疾病遺伝子の大部分を発見するのに充分に密集した、全ゲノムを網羅するマーカー地図を始めて形成する。
【００３３】
東フィンランド創始者集団における遺伝的均一性
フィンランド人は、約４，０００年前と約２，０００年前に起きた２つのヒト移民群を先祖とする。Ｙ−染色体ハプロタイプとミトコンドリア配列の両方が、フィンランド人の遺伝的多様性は他のヨーロッパ集団と比べて低いことを示し、フィンランドが長い間孤立していたことを裏付ける（Sajantila A et al, 1996）。４００年以上前のグスタヴ・ヴァーサ王の時代（１５２３年〜１５６０年）には、後期移住地域（late settlements）と呼ばれる、地域的な孤立集団（regional subisolates）が内部移住によって形成された（Peltonen L et al, 1999）。この中でも最も孤立していた地域が東フィンランドである。
【００３４】
東フィンランドの人口は、効果的な遺伝子発見プログラムを実施するのに充分な大きさを有する、現在知られる遺伝的に最も均一な隔離集団である。均一性の理由は、人口の年齢が若いこと（世代数が少ない）；創始者が少ないこと；長期に渡る地理的な隔離；そして戦争、飢餓と致死病の流行のよる人口増加の妨害が生じたことである。
【００３５】
東フィンランド人口の遺伝的均一性故に、重要な疾病素因遺伝子に含まれる変異は少なく、罹患した個体は類似した遺伝的背景を共有している。より強力な連鎖不平衡（ＬＤ）故に、他の集団と比べてＧＷＳに必要なＳＮＰと対象者はより少数である。
【００３６】
発明の概要
本発明は、ＨＴに対する危険度の変化に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカー、これらマーカーの組み合わせ及びハプロタイプ、並びに該マーカーやハプロタイプが位置する遺伝子座が内部又は近傍に存在する、ＨＴに関連する遺伝子に関する。該ＳＮＰマーカーは、ＨＴを発症する危険度の上昇又はＨＴを発症する危険度の低下、即ち、ＨＴに対する防御、のいずれかに関連する。ここで「予測」又は危険度とは、危険度の上昇又は低下を含意する。
【００３７】
従って本発明は、ＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、ＨＴ関連遺伝子領域に含まれるハプロタイプ、公知の遺伝子ではあるがＨＴとの関連は知られていない遺伝子、そしてＨＴリスク遺伝子に存在する多型を用いた、ＨＴに対する疾患感受性又は素因を推定するための方法のみならず、ＨＴの治療の臨床経過及び効果を予測するための方法を提供する。更に本発明は、本願で開示するＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ＳＮＰマーカーの組み合わせ、ハプロタイプ及び遺伝子に基づく、新規な方法及び組成物を提供する。
【００３８】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法であって、ＳＮＰマーカーとハプロタイプの存在を検出するか、表２〜８に示したＨＴリスク遺伝子の発現の変化や、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの変化を検出することを包含する方法に関する。変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
【００３９】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための方法に関する。ＨＴに対する個体の疾患感受性や素因を推定するための該方法は、個体の核酸配列に存在する、危険性を示すハプロタイプの検出を包含する。
【００４０】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性を推定するためのキットであって、その全体又は一部として、ＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を増幅するための増幅試薬、ＳＮＰマーカーのジェノタイピング用の検出試薬、及びデータ解析と危険度の評価のためのソフトウエアを包含する試験キットに関する。
【００４１】
１つの態様において本発明は、ＨＴに対する素因を診断するための方法に関する。ＨＴに対する個体の素因を診断するための該方法には、ＨＴを予測するＳＮＰマーカーの存在の検出みならず、該マーカーに関連する遺伝子の発現の変化の検出も含まれる。変化は、量的変化、質的変化又はその両方である。
【００４２】
本発明の更なる目的は、対象生物の生物学的サンプルからＳＮＰマーカーを検出することで、ＨＴに対する危険度を同定するための方法である。この方法によって得られた情報は、個体に関する他の情報、例えば、血液検査の結果、臨床検査の結果及びアンケートの結果、と組み合わせることができる。血液検査の結果としては、血漿又は血清のコレステロール値及び高比重リポタンパク質コレステロール値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アンケートによって集める情報には、性別、年齢、家族歴や病歴、例えばＨＴと糖尿病の家族歴に関する情報が含まれる。検査によって集める臨床情報には、例えば、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、収縮期と拡張期のＢＰ及び心拍数が含まれる。
【００４３】
本発明の方法は、疾病発症前又は発症後のＨＴの正確な診断を可能とし、ＨＴによる衰弱効果を減少又は最小化する。この方法は、臨床症状やＨＴの兆候を示さない者、ＨＴを既に発症した者、ＨＴの家族歴を有する者、あるいはＨＴに対する危険因子のレベルが上昇している者に適用することができる。
【００４４】
更に本発明は、ＨＴに対する個体の疾患感受性を診断するための方法を提供する。この方法は、一般的な集団と比べてＨＴ感受性の個体により高頻度で存在する、ＨＴを予測するための危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを行うことを包含し、危険性を示すハプロタイプの存在をＨＴに対する疾患感受性の指標とする。「危険性を示すハプロタイプ」は、ＨＴに対する危険度の上昇ではなく、危険度の低下と関連してもよい。「危険性を示すハプロタイプ」は、ＨＴと高い関連性を示すマーカーと共に、本願で開示するハプロタイプの１種又は組み合わせを包含する。ＨＴに対する個体の疾患感受性を診断するためのキットも開示する。
【００４５】
当業者は、個体の核酸配列に存在する、１種又は数種の本発明のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドの解析は、多型部位に存在するヌクレオチドを決定することのできる方法や技術によって行うことができることを容易に理解する。当業界では明らかなように、ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドは、いずれかの核酸鎖又は両方の核酸鎖から検出することができる。
【００４６】
本発明の主な利用法には、ＨＴを発症する危険性の高い者を予測することが含まれる。ＨＴに寄与する遺伝的因子を特定する診断試験は、単独で使用するか、又は一般的な集団に対する個体の危険度を定義するための公知の臨床危険因子と組み合わせて使用することができる。ＨＴを発症する危険性を有する個体を同定するためのより良い方法は、より良い予防的及び治療的な養生法につながると考えられ、養生法には、以下に示す、ＨＴの余病に関する現在の臨床危険因子に対するより積極的な管理が含まれる：喫煙、高コレステロール血症、上昇したＬＤＬコレステロール値、低いＨＤＬコレステロール値、ＨＴとＢＰ上昇、糖尿病、グルコース不耐性、インシュリン耐性、メタボリック症候群、肥満、運動不足、及びＣ反応性タンパク質レベルや他の炎症性マーカーの上昇によって反映される炎症性成分。遺伝的危険度に関する情報は、特定の患者に生活習慣の調整（例えば、禁煙、カロリー摂取量の削減、運動量の増加）を医師が説得するために使用することもできる。最後に、体重、塩分摂取量やアルコール摂取量の減少といった、血圧低下を目標とした予防的処置の実施に関して、ＨＴの分子副診断に基づいて患者の意欲を高めたり、具体的な方法を選択したりすることができる。
【００４７】
本発明の更なる目的は、薬物の抗高血圧効果を試験するための対象となるヒトを選択するための方法を提供することにある。
【００４８】
本発明の更なる目的は、抗高血圧薬を試験するための臨床試験の対象を選択するための方法を提供することにある。
【００４９】
本発明の更なる目的は、ＨＴリスク遺伝子に存在する多型を用いた、ＨＴの治療の臨床経過及び効果を予測するための方法を提供することにある。本発明の遺伝子、遺伝子産物及び薬物は、ＨＴの治療、治療効果のモニタリング、及び薬物の開発にも有用である。ＨＴの診断、治療及び予後判定のためのキットも提供する。
【００５０】
発明の詳細な説明
典型的な標的集団
ＨＴを発症する危険がある個体とは、例えば以下に挙げるＨＴ危険因子の少なくとも１つを有する個体である：ＨＴの家族歴、中心性肥満や他の肥満、運動不足、高いナトリウム摂取量、高い飽和脂肪酸摂取量、低いカリウム及び／又はマグネシウム摂取量、低いＨＤＬコレステロール値、糖尿病、ブドウ糖不耐性、インシュリン耐性、メタボリック症候群、炎症性マーカーの上昇、及び１種又は数種のＨＴリスクＳＮＰマーカーを含む、危険性を示すアレルやハプロタイプ。
【００５１】
本発明の別の態様において、ＨＴを発症する危険性がある個体とは、ＨＴリスク遺伝子内にリスク増加アレルが存在する個体であり、多型の存在は、ＨＴ感受性が高いことを示す。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチドコード配列内のエレメントのみならず、その上流と下流に位置する調節エレメントの両方を含み、更にｍＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域と、遺伝子の全てのエクソン配列とイントロン配列（更に選択的スプライシングが行われるエクソンとイントロン）を含有する全長ポリペプチドコード配列を含む全体の総称である。
【００５２】
危険性を示すアレルと危険性を示すハプロタイプの評価
遺伝子マーカーは、ＨＴと関連する「多型部位」に存在する特定の「アレル」である。集団の中に複数の配列をもたらしうるヌクレオチドの位置を、本明細書では「多型部位」と称する。多型部位の長さが１ヌクレオチドの場合は、ＳＮＰと称する。例えば、特定の染色体位置のヌクレオチドが、集団に属するある個体ではアデニンであり、同じ集団の別の個体ではチミンの場合、この位置は多型部位であり、より詳細には、この多型部位はＳＮＰである。多型部位は、挿入、欠失、変換又は転座によってその長さが数ヌクレオチドであってもよい。多型部位に見られる各種の配列を、本明細書では、多型部位の「アレル」と称する。従って、上記の例では、ＳＮＰとしてアデニンアレルとチミンアレルの両方が存在する。
【００５３】
典型的には、特定の遺伝子について参照ヌクレオチド配列に参照する。参照配列と異なるアレルを、「変異型（variant）」アレルと称する。参照ヌクレオチド配列のコードするポリペプチドは、特定の参照アミノ酸配列を有する「参照」ポリペプチドであり、変異型アレルのコードするポリペプチドを、変異型アミノ酸配列を有する「変異型」ポリペプチドと称する。
【００５４】
変異型ヌクレオチド配列は、ポリペプチドの特性に作用する変化をもたらすことがある。参照ヌクレオチド配列との比較により示されるこうした配列差としては、挿入、欠失、変換及び置換が挙げられ、具体例としては、変異型ポリペプチドを生成するフレームシフトをもたらすことのある、挿入、欠失又は変換；中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングをもたらすことがある、少なくとも１つのヌクレオチドの置換；ヌクレオチドのコードする１種又は数種のアミノ酸の欠失をもたらすことがある、いくつかのヌクレオチドの欠失；読み枠中のコード配列の中断をもたらすことがある、不均等な組み換えや遺伝子変換などの、いくつかのヌクレオチドの挿入；配列の全て又は一部の重複；トランスポジション；又は詳しく上記したような、ヌクレオチド配列の再編成が挙げられる。このような配列の変化は、ＨＴ感受性遺伝子のコードするポリペプチドを変化させる。例えば、対応するポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらす遺伝子内のヌクレオチドの変化は、ポリペプチドの生理学的特性を変化させ、その結果、生物学的活性／機能、分布又は安定性の変化したポリペプチドをもたらすことができる。
【００５５】
あるいはまた、変異型ヌクレオチド配列は、遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響する変化をもたらすことがある。遺伝子の調節領域に存在する多型部位は、組織特異性、転写率、転写因子への応答などの変化によって、遺伝子の転写に変化をもたらすことがある。ｍＲＮＡに対応する遺伝子領域に存在する多型部位は、安定した二次構造をｍＲＮＡに誘導し、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることなどによって、ｍＲＮＡの翻訳に変化をもたらすことがある。こうした配列の変化は、ＨＴ感受性遺伝子の発現を変化させることがある。
【００５６】
本明細書に記載する「ハプロタイプ」とは、例えば、表３、４、５、７及び８に示したような、遺伝子マーカー（「アレル」）の全ての組み合わせを意味する。またハプロタイプは、２個以上のアレルを含んでいてもよい。
【００５７】
当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、本明細書に記載したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（A T C C）は、全てのアレルをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（T A G G）や、１番目のアレルのみをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266（T T C C）と同じである。
【００５８】
例えば、表３、４、５、７及び８に示したような、本発明で開示するハプロタイプは、ＨＴではない個体よりも、ＨＴの個体においてより頻繁に見られるものである。従って、これらのハプロタイプは、個体におけるＨＴ又はＨＴ感受性を検出するための予測力を有する。多型部位に存在する配列を検出するための公知の方法によって、ハプロタイプの検出を行うことができる。
【００５９】
本発明で開示する、危険性を示すＨＴ関連アレルと危険性を示すＨＴ関連ハプロタイプは、本発明のＨＴ関連遺伝子に存在する他の「多型部位」と関連してもよいことが理解されよう。こうした他のＨＴ関連多型部位は、遺伝子マーカーと同等に有用か、あるいは危険性を示す本発明のアレルとハプロタイプについて観察されるＨＴとの関連を説明する、原因性変異型（causative variations）としてより有用である。
【００６０】
本明細書で説明したいくつかの方法においては、ＨＴを発症する危険性のある個体とは、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプが同定された個体である。１つの態様においては、危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、ＨＴの有意な危険度を示すものである。１つの態様においては、アレル又はハプロタイプと関連する有意性はオッズ比で測定する。更に別の態様においては、有意性は百分率で測定する。１つの態様においては、有意な危険度を示すオッズ比は少なくとも約１．２であり、具体的にはオッズ比が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０の場合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加と低下は少なくとも約２０％であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加は少なくとも約５０％である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む、多様な因子にも依存し得ることが理解されよう。
【００６１】
ＨＴリスク遺伝子又はその所定の部位に存在する、リスクを示すハプロタイプとは、健康な個体（対照者）に存在する頻度と比べて、ＨＴを発症する危険性のある個体（ＨＴ感受性保持者（affected））に存在する頻度の方がより高いハプロタイプであり、ハプロタイプの存在が、ＨＴの存在又はＨＴに対する疾患感受性の指標となるものである。
【００６２】
好ましい態様においては、この方法は、ＨＴリスク遺伝子又はその所定の部位におけるＳＮＰの存在又は出現頻度を個体について検出することを包含し、健常対照個体と比べて、過剰なＳＮＰ又はその出現頻度の上昇は、ＨＴを発症しているかＨＴ感受性が高いことを示す。スクリーニング用のツールとして使用することのできるハプロタイプを構成することのできるＳＮＰについては、例えば、表３、４、５、７及び８を参照。危険性を示すハプロタイプからこのようなＳＮＰマーカーを同定することができる。例えば、危険性を示すハプロタイプには、表３、４、５、７及び８に示したようなマイクロサテライトマーカー及び／又はＳＮＰが含まれる。ハプロタイプの存在は、ＨＴの存在又は、ＨＴに対する疾患感受性が高いことを示すので、本明細書で説明する治療法の標的集団に該当する個体の指標となる。
【００６３】
従って、本発明の方法は特に、ＨＴの指標となる、危険性を示す以下のハプロタイプを定義する、１種又は数種のＳＮＰマーカーの検出に関するものである。
【００６４】
1) ハプロタイプ“ACG”を定義する、rs4845303 (A/T) (配列番号９８０)、
rs6428195 (C/G) (配列番号１０３０) と rs1935659 (A/G) (配列番号６３７)；
2) ハプロタイプ“AGC”を定義する、rs1997454 (A/G) (配列番号６５６)、
rs2139502 (A/G) (配列番号７０９) と rs1519991 (A/C) (配列番号５４２)；
3) ハプロタイプ“ACT”を定義する、rs1521409 (A/G) (配列番号５４４)、
rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366 (C/T) (配列番号３１７)；
4) ハプロタイプ“CGA”を定義する、rs7679959 (C/G) (配列番号１１７８)、
rs10517338 (C/G) (配列番号３８１) と rs959297 (A/T) (配列番号１３３８)；
5) ハプロタイプ“GCAGG”を定義する、rs2278677 (A/G) (配列番号７４９)、
rs3886091 (C/G) (配列番号８９９)、rs1998167 (A/G) (配列番号６５７)、
rs1998168 (A/G) (配列番号６５８) と rs2235280 (A/G) (配列番号７４０)；
【００６５】
6) ハプロタイプ“AACG”を定義する、rs10521062 (A/C) (配列番号４０４)、
rs10512296 (A/G) (配列番号３３１)、rs1924001 (C/G) (配列番号６３３) と
rs2417359 (A/G) (配列番号７８４)；
7) ハプロタイプ“GGA”を定義する、rs10508933 (C/G) (配列番号２８９)、
rs10509071 (A/G) (配列番号２９５) と rs10490967 (A/G) (配列番号９４)；
8) ハプロタイプ“TCCC”を定義する、rs10508771 (A/T) (配列番号２８６)、
rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T) (配列番号２８７) と
rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
9) ハプロタイプ“CAGT”を定義する、rs1386486 (C/T) (配列番号４７２)、
rs1386485 (A/C) (配列番号４７１)、rs1386483 (A/G) (配列番号４７０) と
rs7977245 (C/T) (配列番号１２１２)；
10) ハプロタイプ“AA”を定義する、rs276002 (A/G) (配列番号８１４) と
rs274460 (A/G) (配列番号８１０)；
【００６６】
11) ハプロタイプ“GCTTC”を定義する、rs1245383 (A/G) (配列番号４３０)、
rs2133829 (C/T) (配列番号７０７)、rs2173738 (C/T) (配列番号７２２)、
rs2050528 (C/T) (配列番号６７７) と rs202970 (C/T) (配列番号６７１)；
12) ハプロタイプ“TAC”を定義する、rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)、
rs931850 (A/G) (配列番号１３０３) と rs1522722 (C/T) (配列番号５４７)；
13) ハプロタイプ“ATCC”を定義する、rs2221511 (A/G) (配列番号７３３)、
rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T) (配列番号５４８) と
rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；及び
14) ハプロタイプ“ATGGA”を定義する、rs2825555 (A/G) (配列番号８１９)、
rs2825583 (C/T) (配列番号８２０)、rs2825601 (A/G) (配列番号８２１)、
rs2825610 (G/T) (配列番号８２２) と rs1489734 (A/G) (配列番号５３２)。
【００６７】
治療の経過のモニタリング
本発明は、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現（例えば、相対的又は絶対的な発現）に対する、ＨＴ治療の効果をモニタリングするための方法に関する。ＨＴ感受性遺伝子のｍＲＮＡ、それがコードするポリペプチド、又はコードするポリペプチドの生物活性は、末梢血又はそこから誘導した細胞のサンプルから測定することができる。ポリペプチドの発現や生物活性のレベルは、ＨＴ治療剤による治療を行う前と治療中に評価することができる。
【００６８】
また、ＨＴ治療の効果は、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連する生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路のモニタリングによって追跡することができる。生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路のモニタリングは、例えば、治療開始の前と後に、血漿プロテオーム中の１種又は数種のポリペプチドの測定、及び／又は血漿メタボローム中の１種又は数種の代謝産物の測定によって行うことができる。ＨＴ治療薬による処置に続く生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路の変化を観察した結果を、入手可能な健常対象者に関するデータと比較することで治療の効果を評価する。
【００６９】
例えば、本発明の１つの態様においては、標的集団の一員である個体について、ＨＴ阻害剤による治療に対する応答を評価する。評価は、末梢血、あるいは末梢血中の総細胞副画分又は特定の細胞副画分、あるいは細胞副画分の組み合わせにおける、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの生物活性、あるいはＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチド又はｍＲＮＡの絶対的及び／又は相対的なレベルを測定することで行う。
【００７０】
更に、ＨＴリスク遺伝子の内部又は近傍（１〜数百ｋｂの範囲内）に見られるハプロタイプや変異などの変異型は、ＨＴやその合併症を予防したり治療したりするための医薬製剤（pharmaceutical agent）に関して行う臨床試験の効力や効率を高めるために、ＨＴを発症する危険性の高い個体を同定するのに用いることができる。ハプロタイプやその他の変異型は、他の経路が関与するＨＴを発症している患者を排除するか分別することで、試験する治療法に適した経路の関与する患者を集め、臨床試験の効力と感受性を増加させるために用いることもできる。このような変異型は、個体のための医薬製剤の選択を手引きする薬理遺伝学的試験（pharmacogenetic test）に用いることもできる。
【００７１】
プライマー、プローブ及び核酸分子
「プローブ」や「プライマー」は、塩基特異的な形式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。「塩基特異的な形式」とは、プライマーやプローブがハイブリダイズするのに十分な程度のヌクレオチド相補性を２つの配列が有していることを意味する。従って、プライマーやプローブの配列は、テンプレートの配列に対して完全に相補的である必要はない。塩基置換がハイブリダイゼーションを阻害しない限り、非相補的な塩基や修飾塩基がプライマーやプローブ中に散在していてもよい。核酸テンプレートは、プライマーやプローブに対して種々の相補性を示す「非特異的プライミング配列」又は「非特異的配列」を更に包含してもよい。このようなプローブとプライマーとしては、ポリペプチド核酸（polypeptide nucleic acid）が挙げられる（Nielsen PE et al, 1991）。
【００７２】
プローブやプライマーは、本発明の核酸の中の連なった少なくとも約１５ヌクレオチド、例えば約２０〜２５ヌクレオチド、特定の態様においては約４０、５０又は７５ヌクレオチド（例えば、連続した核酸の配列）にハイブリダイズする核酸領域を包含する。
【００７３】
好ましい態様においては、プローブやプライマーは、１００個以下のヌクレオチドを包含し、特定の態様においては６〜５０ヌクレオチド、例えば１２〜３０ヌクレオチドを包含する。別の態様においては、プローブやプライマーは、連続した核酸の配列又はその相補鎖と少なくとも７０％同一であり、例えば、少なくとも８０％同一、特定の態様においては少なくとも９０％同一、別の態様においては少なくとも９５％同一である。あるいはプローブやプライマーは、連続した核酸配列又はその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることさえ可能である。プローブやプライマーは、屡々、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素又は酵素の補因子などの標識を更に包含する。
【００７４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、公知のヌクレオチド配列、例えば、表６に示した、ジーンバンク（GenBank）データベースのＨＴ関連遺伝子や、表２〜５と７〜１１に列挙した多型部位を含有するヌクレオチド配列、に基づいて設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の方法を用いて、化学合成及び酵素による連結反応によって構築することができる。例えば、アンチセンス核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、自然界に見られるヌクレオチドや、もしくは、分子の生物学的安定性の増加や、アンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される２本鎖の物理的安定性の増加を目的として設計された種々の修飾ヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体やアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学合成することができる。また、アンチセンス核酸分子は、アンチセンスの方向に核酸分子がサブクローニングされた（つまり、挿入した核酸分子から転写したＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの方向になるようにした）発現ベクターを用いて生物学的に製造することもできる。
【００７５】
本発明で開示する表６のＨＴ関連遺伝子の核酸配列は、患者の内在性ＤＮＡ配列と比較することで遺伝的障害（ＨＴ素因又は感受性など）を同定するために用いることができ、また、プローブとして用い、関連するＤＮＡ配列とハイブリダイズして発見したり、公知の配列をサンプルから抽出したりすることができる。核酸配列は更に、遺伝子フィンガープリント法のためのプライマーの誘導、ＤＮＡ免疫法を用いた抗ポリペプチド抗体の産生、及び抗ＤＮＡ抗体の産生や免疫応答の誘発のための抗原として用いることができる。本願で同定したヌクレオチド配列（及び対応する完全な遺伝子配列）の一部、即ち断片は、ポリヌクレオチド試薬として種々の用途に用いることができる。例えば、これらの配列は、（ｉ）各配列に対応する遺伝子を染色体上にマッピングすることによる、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域の位置の特定；（ii）微小な生物学的サンプルからの個体の同定（組織タイピング）；そして（iii）生物学的サンプルの法医学的な同定の補助に用いることができる。加えて、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴づけ又は治療用途に用いるための組み換えポリペプチドの同定と発現に用いたり、対応するポリペプチドが恒常的に、又は組織分化の際に、又は疾患状態で発現される組織のためのマーカーとして使用したりすることができる。加えて核酸配列は、本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイのための試薬として用いることができ、また本発明で開示するスクリーニング及び／又は診断アッセイに使用するキット（例えば試薬キット）の構成成分として含めることができる。
【００７６】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
遺伝子産物の１つの形態には特異的に結合するが、遺伝子産物の他の形態には結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を提供する。変異型遺伝子産物又は参照遺伝子産物のいずれかの、１種又は数種の多型部位を含む部分に結合する抗体も提供する。本明細書に記載される「抗体」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位（即ち、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）の総称である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドやその断片には結合するが、サンプル（例えば、天然に該ポリペプチドを含む生物学的サンプル）の中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位の例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって得られるＦ(ａｂ) 断片とＦ(ａｂ’)断片が挙げられる。本発明は、本発明のポリペプチドと結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書に記載される「モノクローナル抗体」や「モノクローナル抗体組成物」とは、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位の内の１種のみを含む一群の抗体分子の総称である。従って、典型的なモノクローナル抗体組成物は、この組成物が免疫反応を示す特定の本発明のポリペプチドに対して、１つの結合親和性のみを提示する。
【００７７】
ポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法、即ち、適切な対象生物を所望の免疫原（例えば、本発明のポリペプチド又はその断片）で免疫することによって製造することができる。免疫した対象生物における抗体力価は、例えば、固定したポリペプチドを用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な方法で、経時的にモニタリングすることができる。所望であれば、ポリペプチドに対する抗体分子を哺乳動物（例えば、その血液）から単離し、更にプロテインＡクロマトグラフィー法などの公知の処理方法で精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適当な時点（例えば、抗体力価が最大値に達した時点）で抗体産生細胞を対象生物から採取し、それを用いて、ハイブリドーマ法（Kohler G and Milstein C, 1975）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor D et al, 1982）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole SP et al, 1994）又はトリオーマ法（Hering S et al, 1988）などの標準的な技術でモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマを製造するためには、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記の免疫原で免疫した哺乳動物に由来するリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清のスクリーニングを行って、本発明のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００７８】
リンパ球と不死化細胞株の融合に用いる公知のプロトコルのどれでも、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生に適用することができる（Bierer B et al, 2002）。更に、当業者であれば、同じように有用な、上記の方法のバリエーションがたくさん存在することを理解できよう。
【００７９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、ポリペプチドで組み換え免疫グロブリンコンビナトリアルライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）のスクリーニングを行い、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することで、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定して単離することができる（Hayashi N et al, 1995；Hay BN et al, 1992；Huse WD et al, 1989；Griffiths AD et al, 1993）。ファージディスプレーライブラリーを産生し、スクリーニングするためのキットは市販されている。
【００８０】
加えて、通常の組み換えＤＮＡ法を用いた製造が可能な、ヒト化キメラモノクローナル抗体などの、ヒト由来の部分とヒトに由来しない部分を包含する組み換え抗体も本発明の範囲内に含まれる。こうしたヒト化キメラモノクローナル抗体は、公知の組み換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【００８１】
一般的に、本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー法又は免疫沈降法などの標準的な技術で本発明のポリペプチドを単離するために用いることができる。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然ポリペプチドの精製と、宿主細胞で発現される、組み換えによって産生されたポリペプチドの精製を容易にする。更に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの発現量と発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物、細胞上清又は組織サンプル中の）ポリペプチドの検出に用いることができる。抗体は、ＨＴ感受性を予測するための試験の一部、あるいは臨床試験の手順の一部（例えば、養生法の有効性を決めるための手順）として、組織（例えば血液）に存在するタンパク質のレベルを診断目的でモニタリングするために用いることができる。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングさせることによって容易になる。検出可能物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料及び放射性材料が挙げられる。好適な酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の具体例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光材料の具体例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ；好適な発光材料としては、ルミノールが挙げられ；好適な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ；好適な放射性材料としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ及び3Ｈが挙げられる。
【００８２】
診断アッセイ
本発明で開示するプローブ、プライマー及び抗体は、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断方法のみならず、ＨＴ、ＨＴ感受性やＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断に有用なキットにも用いることができる。
【００８３】
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示す１種又は数種のアレル、ハプロタイプ、又はそれらの組み合わせを、本発明で開示するように、対象生物の核酸から検出することによって、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断（もしくはＨＴ関連疾患や病態又はＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断）を行う。
【００８４】
本発明の１つの態様においては、本発明で開示する危険性を示すアレル及び／又はハプロタイプに関連する１種又は数種の多型部位を対象生物の核酸から検出することによって、ＨＴ又はＨＴ感受性の診断（もしくはＨＴ関連疾患や病態又はＨＴ関連疾患や病態に対する感受性の診断）を行う。診断において最も有用な多型部位は、フレームシフト、中途終止コドン、アミノ酸の変化又は異常なｍＲＮＡスプライシングによって、ＨＴ関連遺伝子のポリペプチド構造を変化させる多型部位である。多くの場合、対応するポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらす遺伝子内のヌクレオチドの変化は、生物学的活性／機能、分布又は安定性が変化したポリペプチドをもたらすことによって、ポリペプチドの生理学的特性を変化させることができる。診断において有用な他の多型部位としては、組織特異性の変化、転写率の変化、生理学的状態に対する応答の変化、ｍＲＮＡの翻訳効率の変化、及びｍＲＮＡの安定性の変化によって、ＨＴ関連遺伝子の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳に影響を与える多型部位である。ＨＴ関連遺伝子のポリペプチド構造の変化や、ＨＴ関連遺伝子の発現の変化を伴う変異型ヌクレオチド配列の存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８５】
診断用途においては、機能的多型と連鎖不平衡の状態にある、疾患危険度を予測するための有益な多型を用いてもよい。こうした機能的多型は、スプライシング部位の変化や、ｍＲＮＡの安定性又は輸送の変化を伴うか、あるいは核酸の転写と翻訳の変化を伴う。機能的多型に関連する変異型ヌクレオチド配列の存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８６】
我々は限られた数のＳＮＰマーカーについてジェノタイピングを行い、それらを本願の実施例に記載したが、本発明で同定したＨＴリスク遺伝子のいずれかにおいて、上述したような機能的変異、調節的変異又は他の変異のいずれかが見られる場合、ＨＴ危険度の予測が可能であると期待される。
【００８７】
診断アッセイにおいては、１種又は数種の本発明のＨＴ関連ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドのみならず、本発明のＨＴ関連ＳＮＰマーカーと関連する多型部位も個体の核酸から検出するが、この検出は、多型部位に存在するヌクレオチドを正確に検出することが可能ないかなる方法や技術で行ってもよい。数多くの好適な方法が当業界では報告されており（Kwok P-Y, 2001；Syvanen A-C, 2001）、そのような方法としては、ハイブリダイゼーションアッセイ、連結反応アッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素開裂アッセイ、化学的開裂アッセイ及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アッセイは、ＰＣＲ、固相固定工程、修飾オリゴヌクレオチド、標識プローブ又は標識ヌクレオチドを含んでいても、含んでいなくてもよく、アッセイはマルチプレックスでもシングルプレックスでもかまわない。当業界では自明であるように、多型部位に存在するヌクレオチドは、核酸の２本鎖の内の１本又は両方から検出することができる。
【００８８】
本発明の別の態様においては、ＨＴ感受性の診断を、１種又は数種のＨＴ関連遺伝子の転写の検査によって行うことが可能である。転写の変化は、ハイブリダイゼーション法、酵素開裂アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及びマイクロアレイなどの、当業界で報告されている多様な方法で解析することができる。個体から試験サンプルを採取し、サンプル中に含まれるＲＮＡからＨＴ関連遺伝子の転写の変化を評価する。転写の変化によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００８９】
本発明の別の態様においては、ＨＴ感受性の診断は、ＨＴ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の検査によっても行うことが可能である。個体から得た試験サンプルについて、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化の存在、あるいはＨＴリスク遺伝子のコードする特定の変異型ポリペプチド（例えばイソフォーム）の存在のいずれかを評価する。ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化とは、例えば、ポリペプチド発現の量的変化（即ち、産生ポリペプチド量の変化）であり、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの構造及び／又は機能の変化とは、ポリペプチド発現の質的変化（例えば、変異型ＨＴ感受性ポリペプチド、異なるスプライシング変異体やイソフォームの発現）である。好ましい態様においては、ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体、又はスプライシング変異体の特定のパターンの検出によって、ＨＴに関連する疾患や病態、又はＨＴに関連する疾患や病態に対する感受性を診断することが可能となる。
【００９０】
ＨＴ感受性ポリペプチドの発現及び／又は構造及び／又は機能の変化は、当業界でよく知られる多様な方法、例えば、クロマトグラフィー法、分光法、比色分析法、電気泳動法、等電点電気泳動法、特異的開裂法、免疫学的手法、及び生物活性の測定に基づくアッセイや、種々のアッセイの組み合わせによって測定することができる。本明細書において、ポリペプチドの発現又は組成における「変化」とは、対照サンプルにおけるＨＴリスク遺伝子によるポリペプチドの発現や、ポリペプチドの組成と比較した際に、試験サンプルに見られる発現と組成の変化である。対照サンプルとは、試験サンプルに対応するサンプル（即ち、同じ種類の細胞から得たもの）であって、ＨＴを発症していない（not affected）個体から得たものである。対照サンプルと比べて変化した、試験サンプルにおけるポリペプチドの発現と組成は、ＨＴに対する感受性が高いことを示す。
【００９１】
変異型ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する上記の抗体、変異していない遺伝子のコードするポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法によって、試験サンプルにおける、特定のスプライシング変異体やイソフォーム、又は多型ＨＴリスク遺伝子や変異型ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの存在、あるいは特定のスプライシング変異体やイソフォーム、又は多型ではない遺伝子や変異していない遺伝子のコードするポリペプチドの不存在を検出することができる。ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体の存在（又は不存在）と同様に、多型遺伝子や変異型遺伝子のコードするポリペプチドの存在、又は多型でない遺伝子や変異していない遺伝子のコードするポリペプチドの不存在によって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。
【００９２】
上記方法の１つの態様においては、試験サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル又は量を、対照サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル又は量と比較する。試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量が、対照サンプル中のポリペプチドのレベル又は量よりも高いか低く、この差が統計的に有意である場合には、試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量は、ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの発現の変化を示し、これによってＨＴ感受性を有すると診断することができる。上記方法に代わる方法としては、試験サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成を、対照サンプル中のＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの組成（例えば、種々のスプライシング変異体の存在）と比較する。試験サンプル中のポリペプチドの組成と対照サンプル中のポリペプチドの組成の違いによって、ＨＴ感受性を有すると診断することができる。更に別の態様においては、ポリペプチドのレベルや量と組成の両方を試験サンプルと対照サンプルにおいて評価することができる。試験サンプルと対照サンプルとの比較から明らかなポリペプチドの量やレベルの違い、組成の違い、又は量やレベルの違いと組成の違いの両方が、ＨＴに対する感受性が高いことを示す。
【００９３】
別の態様においては、ＨＴリスク遺伝子の多型又は変異型がコードするポリペプチドのスプライシング変異体やイソフォームを評価することができる。この評価は、直接的に（例えば、ポリペプチドそのものの検査によって）又は間接的に（例えば、ｍＲＮＡのプロファイリングなどによる、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検査によって）行うことができる。例えば、本発明で開示するプローブやプライマーは、標準的な方法によって、ＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡがどのスプライシング変異体やイソフォームをコードしているのかを決定することができる。
【００９４】
ＨＴ又はＨＴ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在、又はＨＴ又はＨＴ危険度と関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在によって、ＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態、又はＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有すると診断することができる。同様に、ＨＴ又はＨＴ危険度に関連する特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける不存在、又はＨＴ又はＨＴ危険度に関連のない特定のスプライシング変異体やイソフォームの試験サンプルにおける存在によって、ＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態ではない、又はＨＴリスク遺伝子に関連する疾患や病態に対する感受性を有していないと診断することができる。
【００９５】
更に本発明は、ＨＴリスク遺伝子に存在する危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプを同定することによって、個体におけるＨＴ感受性の診断と同定を行うための方法に関する。１つの態様においては、この危険性を示すアレル又は危険性を示すハプロタイプは、ハプロタイプの存在によってＨＴの危険度が有意に増加するアレル又はハプロタイプである。危険度が有意か否かの判定は、特定の疾患、ハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存すると理解すべきであるが、有意性はオッズ比又は百分率で求めることができる。更に別の態様においては、有意性は百分率で求める。１つの態様においては、有意な危険度とはオッズ比が０．８以下又は少なくとも約１．２の場合であり、具体的にはオッズ比が０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０の場合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも１．２の場合を有意とする。更に別の態様においては、オッズ比が少なくとも約１．５の場合を有意とする。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下とは、オッズ比が少なくとも約１．７の場合である。更に別の態様においては、危険度の有意な増加とは少なくとも約２０％の増加であり、具体的には、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％の増加が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に別の態様においては、危険度の有意な増加又は低下は少なくとも約５０％の変化である。しかし、危険度が医学的に有意か否かの判定は、特定の疾患、アレルやハプロタイプ、そして屡々環境因子を含む多様な因子に依存することが理解されよう。
【００９６】
本発明はまた、個体におけるＨＴ又はＨＴ感受性を診断する方法であって、健常個体（対照）と比較して、ＨＴに対して感受性の高い（発症している（affected））個体において存在頻度が高まっている、ＨＴリスク遺伝子に含まれる危険性を示すハプロタイプのスクリーニングを包含し、ハプロタイプの存在が、ＨＴ又はＨＴに対する感受性を意味することを特徴とする方法に関する。スクリーニング用のツールとして使用することのできるハプロタイプを構成するＳＮＰマーカーについては、例えば、表３、４、６、７及び８を参照。これ等の表に列挙したＳＮＰマーカーは危険性を示すハプロタイプを表し、ＨＴに対する感受性を決定するための診断試験の設計に用いることができる。
【００９７】
診断方法に有用なキット（試薬キットなど）は、本明細書で説明したいかなる方法においても有用な構成成分を包含しており、そのような成分としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＰＣＲプライマー、本明細書で説明したハイブリダイゼーション用のプローブやプライマー（標識したプローブやプライマーなど）、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングのための試薬、標識分子を検出するための試薬、（ＲＦＬＰ分析などのための）制限酵素、アレル特異的なオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、標識用酵素、変化した又は変化していない（天然の）ＨＴ感受性ポリペプチドと結合する抗体、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子を包含する核酸を増幅する手段、１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の核酸配列を分析するための手段、又は１種又は数種のＨＴ感受性ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段。１つの態様においては、ＨＴに対する感受性を診断するためのキットは、ＨＴに対する感受性の高い個体において存在頻度が高まっている、危険性を示すハプロタイプを含むＨＴリスク遺伝子領域の核酸増幅を行うためのプライマーを包含してもよい。このようなプライマーは、ＨＴの指標となるＳＮＰに隣接する核酸の一部を用いて設計することができる。
【００９８】
本発明は、１回又は少数回のジェノタイピングを行い、ＨＴを予測する能力に基づいて、タイピングする変異型配列を選択するという原理に基づいている。従って、ゲノムＤＮＡサンプル中の変異型配列のジェノタイピングはいかなる方法を用いてもよい。
【００９９】
本発明の検出方法は、検出工程で得られた指標を確認するために、本発明の方法（クレーム１参照）の工程ｂ）で得られた結果を、対象生物の年齢；性別；ＨＴ、糖尿病や高コレステロール血症に関する家族歴、及びＣＶＤや糖尿病の治療歴に関する情報と組み合わせる工程を更に包含してもよい。このような情報には、家族内での高コレステロール血症、喫煙状況、家族内でのＨＴ、ＣＶＤの家族歴、家族内での肥満、及びウエスト/ヒップ比（waist-to-hip circumference ratio）（ｃｍ／ｃｍ）が含まれていてもよい。
【０１００】
本発明の検出方法は、血液、血清又は血漿中の、コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパクＢとＡＩ、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、あるいは血清又は血漿インシュリン濃度を測定する工程を更に包含してもよい。
【０１０１】
ＨＴを発症する確率を予測するスコアは、多変量故障時間モデル（multivariate failure time model）又はロジスティック回帰式を用いて計算することができる。上述した、本発明の方法に付加する更なる工程で得られる結果によって、ＨＴを発症する確率を以下のロジスティック回帰式で計算する工程が可能となる。
【０１０２】
ＨＴを発症する確率 ＝１／［１＋ｅ(−(−ａ＋Σ(ｂi×Ｘi))］
式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＨＴに関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項であるが、但し、ａ値とｂi値は、この方法を実施する対象の属する集団から求められる値であることが好ましく、Ｘi値は、この方法を実施する対象の属する集団で測定した変数から選ばれる値であることが好ましい。ｂi値は−２０と２０の間であることが好ましく、ｉ値は０（ゼロ）と１００，０００の間であることが好ましい。ｂi値が負の係数であるということは、このマーカーが危険度の低下を示すことを意味し、正の係数であるということは、このマーカーが危険度の増加を示すことを意味する。
【０１０３】
Ｘi値は、ＳＮＰマーカーのように０又は１と表されるかコード化される２値変数である。加えてこのモデルには、変数Ｘiのいかなる相互作用（積）や項（例えば、ｂiＸi）が含まれてもよい。１年、２年、５年、１０年又は２０年以内にＨＴを発症する危険度を百分率で示す単純な予測を行うために、情報を組み合わせるアルゴリズムも開発されている。
【０１０４】
これに代わる統計学的モデルとしては、コックスの比例ハザードモデル、他の反復モデル及びニューラルネットワークモデルなどの故障時間モデルが挙げられる。
【０１０５】
この試験は、スクリーニング又は素因の試験として、ＨＴを発症する危険度を試験するために健常者に実施することもできるし、また高リスク患者（即ち、ＨＴの家族歴、中心性肥満や他の肥満、運動不足、高いナトリウム摂取量、高い飽和脂肪酸摂取量、低いカリウム及び／又はマグネシウム摂取量、低いＨＤＬコレステロール値、糖尿病、グルコース不耐性、インシュリン耐性及びメタボリック症候群、炎症性マーカーの上昇、あるいはこれらの組み合わせ、あるいは他のＨＴリスク因子の上昇のいずれかを示す者）に実施することもできる。
【０１０６】
この方法は、成人におけるＨＴの予測又は早期診断、臨床試験のための対象者の層化と選択、及び／又は予防的及び治療的な集中介入を行う対象者の層化と選択に用いることができる。その目的は、治験薬の臨床試験及び健康管理のコスト削減である。
【０１０７】
医薬組成物
本発明は、本願に記載した薬剤（agent）、特にＨＴリスク遺伝子内のヌクレオチド及び／又はＨＴリスク遺伝子のコードする他のスプライシング変異体を包含する薬剤；及び／又は本願に記載したように、ＨＴリスク遺伝子の発現又はＨＴ感受性遺伝子ポリペプチドの活性を変化（例えば、増強又は阻害）する薬剤を包含する医薬組成物に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質（例えば、受容体）、ＨＴリスク遺伝子の発現を変化させる薬剤、ＨＴ感受性ポリペプチド結合性物質や結合パートナー、それらの断片、融合タンパク質やプロドラッグ、あるいは本発明のヌクレオチドを包含するヌクレオチド又は核酸構築物（ベクター）、あるいはＨＴ感受性遺伝子ポリペプチド活性を変化させる薬剤を、生理的に許容される担体や賦形剤と共に処方し、医薬組成物を調製することができる。担体と組成物は滅菌することができる。処方は投与方法に適したものでなければならない。
【０１０８】
好ましい態様においては、医薬組成物は、本発明のＨＴ関連遺伝子（表６）に関連した生物学的ネットワーク及び／又は代謝経路における、ＨＴに関連した変化の少なくとも一部を逆転させる薬剤を包含する。
【０１０９】
本発明に適した薬学的に許容される担体に特に限定はなく、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（乳糖、アミロース、デンプンなど）、デキストロース、マグネシウムステアレート、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンや、これ等の組み合わせなどが挙げられる。所望により医薬組成物は、有効成分と有害な反応を起こさない付加的な成分、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩類、緩衝剤、着色剤、調味料及び／又は香料などと混合してもかまわない。
【０１１０】
所望により組成物は更に、微量の浸潤剤か乳化剤又はｐＨ調節剤を含有してもよい。組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉剤とすることができる。組成物は、古典的なバインダーや担体であるトリグリセリドなどと共に、座薬として処方することもできる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬用のマニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでいてもよい。
【０１１１】
上記の組成物を生体に導入する方法に特に限定はなく、皮内、筋肉内、腹膜内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内への投与が挙げられる。他の適した導入方法としては、（以下で説明する）遺伝子療法、再充填可能か生体分解可能な機構、粒子加速化装置（“ジーンガン”）及び薬物徐放型高分子機構が挙げられる。本発明の医薬組成物は、他の成分と共に、コンビナトリアル療法の一部として投与することもできる。
【０１１２】
医薬組成物は、慣例的な手順に従って処方し、ヒトへの投与に適合した医薬組成物とすることができる。例えば、典型的な静脈注射用の組成物は、滅菌済みの等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、医薬組成物は更に可溶化剤と、注射する部位の痛みを低減するための局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、処方材料はそれぞれ個別に供給するか、投与単位形式に混合したもの（例えば、有効成分の量を表示したアンプルや小袋などの容器に密封した、凍結乾燥品の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物）として供給する。医薬組成物を点滴で投与する場合には、医薬組成物は、医薬用の滅菌水、生理食塩水又はデキストロース／水の入った点滴用ビンに分配することができる。医薬組成物を注射によって投与する場合には、投与前に処方材料を混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水の入ったアンプルを提供することができる。
【０１１３】
局所投与のためには、局所投与に適合し、好ましくは水よりも力学的粘性率の高い担体を包含する、非スプレー形態あるいは粘性〜半固体又は固体の形態を用いることができる。適当な処方に特に限定はないが、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、塗布剤、膏薬、エアゾールなどが挙げられ、これらは、所望により、滅菌してもよいし、また補助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、浸透圧を調整するための塩類や緩衝剤など）と混合してもかまわない。薬剤は化粧品処方剤に導入してもよい。局所投与にはスプレー可能なエアゾール製剤も適しており、この場合は有効成分を、好ましくは固体状又は液状の不活性担体と共にスクィーズボトルに梱包したり、加圧した揮発性の、通常は気体状の噴射剤（例えば、圧縮空気）と更に混合して梱包したりすることも好適である。
【０１１４】
本願に記載した薬剤は、中性の形態でも、塩の形態でも処方することができる。薬学的に許容される塩類としては、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導した、遊離アミノ基を有するもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導した、遊離カルボキシル基を有するものが挙げられる。
【０１１５】
薬剤は、治療効果を発揮する量を投与する。特定の疾患又は病態を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患や病態の性質に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及びＨＴの病状の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な投与量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
【０１１６】
治療方法
本発明は、ＨＴ治療剤を用いた、ＨＴ又はＨＴに対する感受性を有する個体、例えば、本願明細書で開示した標的集団に属する個体、を治療するための方法（予防法及び／又は療法）を包含する。「ＨＴ治療剤」とは、ＨＴリスク作用性のポリペプチド（の酵素活性又は量）及び／又は本願明細書で開示したＨＴリスク遺伝子の発現を変化（例えば、増加又は低下）させる薬剤（例えば、ＨＴのアゴニスト又はアンタゴニスト）である。ＨＴ治療剤は、以下に例示する種々の方法でＨＴ感受性ポリペプチドの活性又はＨＴ核酸の発現を変化させることができる：付加的なＨＴ感受性ポリペプチドの提供、あるいはＨＴリスク遺伝子の転写又は翻訳の上方制御；ＨＴ感受性ポリペプチドの翻訳後プロセシングの変更；ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写の変更；ＨＴ感受性ポリペプチド活性への（例えば、ＨＴ感受性ポリペプチドに結合することによる）干渉；ＨＴリスク遺伝子の転写又は翻訳の下方制御；あるいはＨＴ感受性ポリペプチドの排除の阻害又は向上。
【０１１７】
特に本発明は、ＨＴ又はＨＴに対する感受性（例えば、本願明細書で開示した、危険性を示す集団に属する個体）を治療する方法のみならず、ＨＴの症状発現やサブタイプの治療方法に関する。
【０１１８】
ＨＴ治療剤の代表例としては、以下のものが挙げられる：
本願で開示した核酸、その断片又は誘導体、特に本願で開示したポリペプチドをコードするヌクレオチドや、このような核酸（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡ；２本鎖干渉ＲＮＡ；ＨＴ感受性ポリペプチド、その活性断片や誘導体、又はオリゴヌクレオチド、例えば、表２〜８、をコードする核酸）を包含するベクター；
他のポリペプチド（例えば、ＨＴ感受性受容体）；ＨＴ感受性ポリペプチドに対する結合性物質；模倣ペプチド；上記ポリペプチドの融合タンパク質やプロドラッグ、抗体（例えば、上述したような、ＨＴ感受性ポリペプチド変異体に対する抗体、変異体ではないＨＴ感受性ポリペプチドに対する抗体、ＨＴリスク遺伝子のコードする特定のスプライシング変異体に対する抗体）；リボザイム；他の低分子；
ＨＴリスク遺伝子の発現又はポリペプチドの活性を変える（例えば、阻害又は拮抗する）薬剤、ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写を調節する薬剤（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響を与える薬剤や、発現されるそれぞれのスプライシング変異体の量に影響を与える薬剤）などの他の薬剤；及び
ＨＴリスク遺伝子の発現又はポリペプチドの活性を変える（例えば、誘導又はアゴナイズする）薬剤、ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体の転写を調節する薬剤（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響を与える薬剤や、発現されるそれぞれのスプライシング変異体の量に影響を与える薬剤）などの他の薬剤。
【０１１９】
所望により、１種を超えるＨＴ治療剤を同時に使用することもできる。
【０１２０】
核酸であるＨＴ治療剤は、ＨＴの治療に用いられる。本願において「治療」という用語は、疾患に関連した症状を改善することだけでなく、疾患の発症を予防又は遅らせることも意味し、更には、疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させること、疾患又は病態の再発を予防又は遅らせること及び／又は疾患又は病態に伴う症状の重症度や頻度を減少させることも意味する。アテローム性動脈硬化症の場合、「治療」は、更にプラーク発生の最小化又は退縮も意味する。治療法は、個体におけるＨＴポリペプチドの活性を変化（例えば、阻害又は増加）、置換又は補足するように設計する。例えば、ＨＴ治療剤は、ＨＴリスク遺伝子やＨＴ感受性遺伝子の特定のスプライシング変異体の発現や存在量を上方制御又は増加させるために投与することができ、あるいはそれとは反対に、ＨＴリスク遺伝子やＨＴリスク遺伝子の特定のスプライシング変異体の発現や存在量を下方制御又は低下させるために投与することもできる。本来のＨＴリスク遺伝子やその特定のスプライシング変異体の発現や存在量の上方制御又は増加は、欠陥遺伝子や別のスプライシング変異体の発現や活性に干渉したり、補ったりすることができる。又、本来のＨＴリスク遺伝子やその特定のスプライシング変異体の発現や存在量の下方制御又は低下は、欠陥遺伝子や別のスプライシング変異体の発現や活性を最小化することで、欠陥遺伝子や特定のスプライシング変異体の影響を最小化することができる。
【０１２１】
ＨＴ治療剤は、治療効果を発揮する量（即ち、疾患に関連した症状を改善する、疾患の発症を予防又は遅らせる、及び／又は疾患に伴う症状の重症度や頻度を減少させたりすることで、疾患を治療するのに充分な量）を投与する。特定の個体の有する障害又は病状を治療する上で治療効果を発揮する量は、疾患に伴う病状や重症度に依存し、標準的な臨床技術で決定することができる。更に、最適投与範囲の同定を助けるために、in vitro又はin vivoのアッセイを所望により用いてもよい。製剤に用いる厳密な量は投与経路及び疾患又は障害の重症度にも依存するので、医療従事者の判断と各患者の状況とに基づいて決定しなければならない。効果的な量は、in vitroの試験システム又は動物モデルの試験システムから得られた用量−反応曲線から外挿することもできる。
【０１２２】
１つの態様においては、本発明の核酸（例えば、表６の、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸であり、所望により表２〜１１に示した少なくとも１種の多型を包含するもの）；又はＨＴ感受性ポリペプチドをコードする他の核酸、そのスプライシング変異体、誘導体又は断片を、それぞれ単独で、又は上述した医薬組成物として用いることができる。例えば、ＨＴリスク遺伝子又はＨＴ感受性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、単独で又はベクターに入れた形態で細胞に（in vitro又はin vivoで）導入し、細胞に本来のＨＴ感受性ポリペプチドを産生させる。必要であれば、遺伝子、ｃＤＮＡ、又は遺伝子かｃＤＮＡを含むベクターで形質転換した細胞を、疾患に罹患した個体に導入（又は再導入）することができる。こうすることで、天然では本来のＨＴリスク遺伝子の発現及び活性を失っているか、ＨＴリスク遺伝子変異体の発現又は活性を有するか、又は疾患関連ＨＴリスク遺伝子のスプライシング変異体を発現する細胞を、ＨＴ感受性ポリペプチド、あるいはＨＴ感受性ポリペプチド（又はＨＴ感受性ポリペプチドの別の変異型）の活性断片を発現するように操作することができる。好ましい態様においては、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸、その活性断片又は誘導体を発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）に導入し、得られたベクターを動物内の適切な細胞に導入することができる。ウイルス性導入システムと非ウイルス性導入システムを含む他の遺伝子導入システムも用いることができる。また、リン酸カルシウム共沈殿法や機械的技法（例えば、マイクロインジェクション）などの非ウイルス性導入システム、膜融合リポソームによる導入（membrane fusion-mediated transfer）、又はＤＮＡの直接取り込みも用いることができる。
【０１２３】
本発明の他の態様においては、上記方法の代わりに、本発明の核酸、本発明の核酸に相補的な核酸、又はこのような核酸の一部（例えば、後述するオリゴヌクレオチド）を「アンチセンス」療法に使用する。この場合は、ＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与するか又はin situで産生する。ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳及び／又は転写を阻害することで、ＨＴ感受性ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、型どおりの相補的塩基対の結合によるものでもよいし、あるいは、例えば、２本鎖ＤＮＡへの結合のように、二重らせんの主溝との特異的な相互作用によるものでもよい。
【０１２４】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上述した発現プラスミドとして送達することができる。細胞内でプラスミドが転写されると、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡのＨＴ感受性ポリペプチドをコードする部分と相補的なＲＮＡを産生する。また、アンチセンス構築物は、ex vivoで作製して細胞に導入したオリゴヌクレオチドプローブでもよく、これはＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることで発現を阻害する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、in vivoで安定になるように、内在性のヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ）に耐性の修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いる核酸分子の具体例としては、ＤＮＡのホスホロアミデートアナログ、ホスホチオエートアナログ及びメチルホスホネートアナログが挙げられる。更に、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築するための一般的な方法が、van der Krol AR et al, 1988とStein CA and Cohen JS, 1988に記載されている。アンチセンスＤＮＡについては、翻訳開始部位（例えば、ＨＴリスク遺伝子配列の−１０〜＋１０の領域）から誘導したオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２５】
アンチセンス療法を実施するために、ＨＴ感受性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）を設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴ感受性のｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を防止する。絶対的な相補性が好ましいものの、必ずしも必要ない。本明細書で述べるような、ＲＮＡのある部分に「相補的」な配列とは、ＲＮＡにハイブリダイズし、安定な２本鎖を形成するのに充分な相補性を有している配列である。２本鎖アンチセンス核酸の場合には、２本鎖ＤＮＡの１本鎖を試験するか、又は３本鎖の形成をアッセイする。ハイブリダイズする能力は、上記で詳細に説明したようなアンチセンス核酸の有する相補性の程度と長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、そこに含まれる、ＲＮＡに対してミスマッチな塩基の数が増えても、安定な２本鎖（場合によっては３本鎖）を形成することができる。当業者は、標準的な方法を用いて許容されるミスマッチの程度を確認することができる。
【０１２６】
アンチセンス療法に用いるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのキメラ混合物、誘導体又は修飾したものであり、１本鎖でも２本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子やハイブリダイゼーションの安定性を高めるために、その塩基成分、糖成分又はリン酸骨格が修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドには、他の付加的な基が含まれていてもよく、（例えば、in vivoで宿主細胞の受容体のターゲティングを行うための）ペプチドや、細胞膜の通過を容易にする物質（Letsinger RL et al, 1989; Lemaitre M et al, 1987）や血液脳関門の通過を容易にする物質（Jaeger LB and Banks WA, 2004）、更にはハイブリダイゼーションに伴って開裂を引き起こす試薬（hybridization-triggered cleavage agent）（van der Krol AR et al, 1988）やインターカレーション試薬（Zon G, 1988）が含まれていてもよい。そのためにオリゴヌクレオチドは他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションに伴って架橋を引き起こす試薬（hybridization triggered cross-linking agent）、輸送試薬、又はハイブリダイゼーションに伴って開裂を引き起こす試薬）に結合していてもよい。
【０１２７】
アンチセンス分子は、in vivoでＨＴリスク遺伝子を発現する細胞に送達される。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への送達には数々の方法を用いることができ、例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射したり、目的の細胞を標的とするように修飾したアンチセンス分子（例えば、標的細胞の表面に発現されている受容体や抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に連結したアンチセンス分子）を全身に投与したりすることができる。又、好ましい態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、pol III又はpol II）の制御下におかれている組み換えＤＮＡ構築物を利用する。患者の中の標的細胞をトランスフェクトするためにこのような構築物を使用すると、内在性ＨＴリスク遺伝子転写産物と相補的な塩基対を形成するのに充分な量の１本鎖ＲＮＡが転写され、ＨＴ感受性ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、細胞がベクターを取り込み、アンチセンスＲＮＡの転写を誘導するように、ベクターをin vivoで導入することもできる。このようなベクターは、転写されて目的アンチセンスＲＮＡを産生する限り、エピソームのままでも、染色体に組み込まれてもかまわない。このようなベクターは、上述した標準的な組み換えＤＮＡ工学的手法で構築することができる。例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを用いて組み換えＤＮＡ構築物を調製し、調製した構築物を組織部位に直接導入することができる。又、目的の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いて、他の投与経路（例えば、全身的な投与経路）で投与を達成することもできる。
【０１２８】
標的化相同組み換えによってＨＴリスク遺伝子又はそのプロモーターを不活化又は「ノックアウト」することで、内在性のＨＴリスク遺伝子の発現を減少させることもできる（Smithies O et al, 1985； Thomas KR and Capecchi MR, 1987；Thompson S et al, 1989）。例えば、内在性ＨＴリスク遺伝子（即ち、ＨＴリスク遺伝子のコード領域又は調節領域）に相同なＤＮＡが隣接した、非機能的なＨＴリスク遺伝子の変異体（又は全く関係のないＤＮＡ配列）を、単独あるいは選択マーカー及び／又は負の選択マーカーと共に用い、ＨＴリスク遺伝子をin vivoで発現する細胞にトランスフェクトする。標的化相同組み換えによるＤＮＡ構築物の挿入は、ＨＴリスク遺伝子の不活化をもたらす。組み換えＤＮＡ構築物は、直接投与するか、又は上述したような適切なベクターを用いることで、必要な部位にin vivoでターゲティングすることができる。代わりに、以下の類似した方法を用いて、変異体ではないＨＴリスク遺伝子の発現を増加させることもできる： 変異体ではない機能的なＨＴリスク遺伝子（例えば、表６に示したいずれかの遺伝子であって、所望により、表２〜１１に示した少なくとも１種の多型を包含するもの）又はその部分配列を包含するＤＮＡ構築物を、標的化相同組み換えを用いて、上述したような細胞の有するＨＴリスク遺伝子変異体と置き換わるように挿入する。他の態様においては、細胞に存在するものとは異なる変異型ＨＴ感受性ポリペプチドをコードする核酸を包含するＤＮＡ構築物を、標的化相同組み換えを用いて挿入する。
【０１２９】
又、ＨＴリスク遺伝子の調節領域（即ち、ＨＴリスク遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列のターゲティングを行い、体内の標的細胞において、ＨＴリスク遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することで、内在性ＨＴリスク遺伝子の発現を減少することもできる（Helene C, 1991；Helene C et al, 1992；Maher LJ, 1992）。同様に、本願明細書に開示したアンチセンス構築物は、ＨＴタンパク質の１つの正常な生物活性と拮抗することで、in vivoの組織とex vivoの培養組織の両方において、組織の操作（例えば、組織分化）に用いることができる。更にアンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、又は転写産物がＨＴｍＲＮＡ又は遺伝子配列のアンチセンスとなるプラスミドのトランスフェクション）は、成体組織におけるＨＴリスク遺伝子の正常細胞機能のみならず、発生段階におけるＨＴリスク遺伝子の役割を研究するために用いることができる。このような技術は、細胞培養に利用することができ、トランスジェニック動物の作製にも使用することができる。
【０１３０】
本発明の別の態様においては、本明細書に開示した他のＨＴ治療剤もＨＴの治療又は予防に用いることができる。治療剤は、上述したような組成物の形態で送達するか、又は治療剤そのものを送達することができる。治療剤は全身的に投与するか、又は特定の組織にターゲティングすることができる。治療剤は、化学合成、組み換え体による産生、in vivoでの産生（例えば、トランスジェニック動物による産生（Meade H et al, 1990））などの種々の方法で製造し、本願明細書に記載したような標準的な方法で単離することができる。
【０１３１】
上記の治療方法のいかなる組み合わせ（例えば、変異体ではないＨＴ感受性ポリペプチドの投与と、ＨＴ感受性ｍＲＮＡ変異体を標的とするアンチセンス療法の組み合わせ；又はＨＴリスク遺伝子のコードする第１のスプライシング変異体の投与と、ＨＴリスク遺伝子のコードする第２のスプライシング変異体を標的とするアンチセンス療法の組み合わせ）も使用することができる。
【０１３２】
本発明を、以下の実施例によって更に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。本明細書で参照する文献の教示の全てが、参照することによって組み込まれたものとする。
【０１３３】
実施例
フィンランド東部のＨＴ患者とその表現型の特徴づけ
クオピオ虚血性心疾患危険因子研究（Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study；ＫＩＨＤ）、即ち、ＨＴやＣＶＤを含む、中年男性に見られる慢性疾患の危険因子を調査するために進行中の、前方視的な集団群研究（prospective population-based study）の参加者を被験者とした（Salonen JT 1988、Salonen JT et al 1998, 1999、Tuomainen T-P et al 1999）。研究対象となる集団は、基礎検査を実施した１９８４年〜１９８９年の時点で４２歳、４８歳、５４歳又は６０歳であったフィンランド東部在住の男性から無作為に抽出した年齢別サンプルである。１９８４年〜１９８９年の間に合計２６８２人の男性を検査した。男性コホートの１１年目の追跡調査期間に当たる１９９８年〜２００１年に最初の検査を実施した、人口から無作為に抽出した９２０人の女性によって、男性コホートを補完した。被験者の募集と検査方法については、既に詳細に報告した（Salonen JT 1988）。この研究は、クオピオ大学研究倫理委員会（University of Kuopio Research Ethics Committee）の承認済みである。全ての参加者から書面による同意を得ている。
【０１３４】
解析は、同じＫＩＨＤコホートから選んだ、ＨＴ（ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上、ＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態）を発症しており、兄弟／姉妹又は親がＨＴ患者である８１人からなる症例群と、ＨＴもＨＴの家族歴もない８２人からなる対照群に関するロジスティックモデリングに基づく。対象者の内の３人（２人は症例群、１人は対象群）は女性で、１６０人は男性だった。症例群の８１人中３８人は、ＫＩＨＤ基礎検査におけるＢＰ測定時には、抗高血圧薬を投薬していた。
【０１３５】
ＨＴは、収縮期ＢＰ（ＳＢＰ）が１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期ＢＰ（ＤＢＰ）が９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態と定義した。いずれのＢＰも、朝に看護師によってランダムゼロ水銀血圧計で測定した。測定用プロトコルには、あおむけの状態で３回、立った状態で１回、座った状態で２回の測定を５分間隔で行うことが含まれる。６回の測定の平均値をＳＢＰとＤＢＰとして使用した（Salonen JT et al, 1998）。研究対象者の父親、母親、兄弟／姉妹のいずれかが高血圧症の病歴又は高血圧症状を報告した場合に、ＨＴの家族歴を陽性とした。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に症例群と対照群について選択した特徴をまとめた。年齢と喫煙量は、インタビューワーの監督下で、自己記入式のアンケートに記入されたものである。空腹時血糖値は、トリクロロ酢酸でタンパク質を沈殿させた後にグルコースデヒドロゲナーゼ法を用いて測定した。血清インシュリンはNovo Biolabsラジオイムノアッセイキット（Novo Nordisk製）で測定した。ＨＤＬ画分は、超遠心分離と沈殿の組み合わせによって新鮮血清から分離した。リポタンパク質画分のコレステロール含量と血清トリグリセリドは、酵素を用いて測定した。フィブリノーゲンは、希釈血漿の過剰トロンビンによる凝固に基づいて測定した。
【０１３８】
成人期の社会経済状況（ＳＥＳ）は、教育、職業、収入及び物質的な生活状態の評価を包含する指標である。この基準は逆関数であり、低いスコアが高いＳＥＳに対応する。これらのデータは自己記入式のアンケートで集めた。
【０１３９】
血清フェリチンは、市販の２重抗体ラジオイムノアッセイ（英国、アマシャム、Amersham International製）で測定した。高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）と低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）を含むリポタンパク質は、新鮮血清サンプルから、超遠心分離とそれに続く超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の直接的な除去とＬＤＬ沈殿によって分離した（Salonen et al 1991）。その後、酵素を用いてコレステロール濃度を測定した。血清Ｃ反応性タンパク質は、市販の高感度イムノメトリックアッセイ（Immulite 高感度ＣＲアッセイ；ロサンジェルス、DPC製）で測定した。
【０１４０】
ゲノムＤＮＡの単離と質的試験
高分子量ゲノムＤＮＡサンプルを、凍結した静脈全血から標準的な方法を用いて抽出し、標準的なＴＥバッファーに溶解した。各ＤＮＡサンプルの量と純度は、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定することで評価し、単離したＤＮＡサンプルの完全性は、０．９％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって評価した。Ａ２６０／Ａ２８０比が１．７以上であり、アガロースゲル電気泳動で得た単離ＤＮＡの平均サイズが２０ｋｂを超えた場合に、サンプルはゲノムワイドスキャン（ＧＷＳ）に使用可能であると判断した。ＧＷＳ解析の前には、サンプルの濃度が５０ｎｇ／μｌとなるように還元型ＥＤＴＡ−ＴＥバッファー（TEKnova）で希釈した。
【０１４１】
ゲノムワイドスキャン
Affymetrix GeneChipR ヒト マッピング１００Ｋシステム（Affymetrix GeneChipR human mapping 100k system）の技術アクセスバージョンを用いて、ＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。このアッセイは２つのアレイ、即ち、XbaとHindからなり、これらを用いて各ＤＮＡサンプルから１２６，０００個を超えるＳＮＰマーカーのジェノタイピングを行った。アッセイは、製造者の提供する説明書に従って実施した。合計２５０ｎｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのアッセイに付した。ＤＮＡサンプルは、Xba I又はHind III（New England Biolabs（ＮＥＢ）製）で消化した。具体的には、ＮＥバッファー２（１×；ＮＥＢ製）、ウシ血清アルブミン（１×；ＮＥＢ製）、及びXba I又はHind III（０．５Ｕ／μｌ；ＮＥＢ製）からなる混合溶液中で消化反応を＋３７℃で２時間行い、続いて酵素の不活化を＋７０℃で２０分間行った。Xba Ｉアダプター又はHind IIIアダプター（０．２５μＭ；Affymetrix製）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（１×；ＮＥＢ製）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ；ＮＥＢ製）を消化したＤＮＡサンプルに加えることで、Xba Iアダプター又はHind IIIアダプターをサンプルに連結した。連結反応を＋１６℃で２時間行い、続いて＋７０℃で２０分間インキュベートした。連結したＤＮＡサンプルを７５μｌの分子生物学用の水（BioWhittaker Molecular Applications／Cambrex製）で希釈した。
【０１４２】
１０μｌ等量のＤＮＡサンプルをPfx 増幅バッファー（Pfx Amplification Buffer）（１×；Invitrogen製）、ＰＣＲエンハンサー（１×；Invitrogen製）、ＭｇＳＯ4（１ｍＭ；Invitrogen製）、ｄＮＴＰ（各３００μＭ；Takara製）、ＰＣＲプライマー（1μＭ；Affymetrix製）及びPfx ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μｌ；Invitrogen製）と共に使用することで、希釈した連結ＤＮＡサンプルを１００μｌ容のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に同じ条件下で４回付した。ＰＣＲを＋９４℃で３分間進行させた後に、＋９４℃で１５秒、＋６０℃で３０秒、＋６８℃で６０秒のサイクルを３０回行い、そして＋６８℃で７分の最後の伸長反応を実施した。ＰＣＲの性能は、１×ＴＢＥバッファー中での標準的な２％アガロースゲル電気泳動を１２０Ｖで１時間行うことで確認した。
【０１４３】
ＰＣＲ産物の精製は、Affymetrixのマニュアルに従い、MinElute 96 UF ＰＣＲ精製キット（MinElute 96 UF PCR Purification kit）（Qiagen製）を用い、それぞれのサンプルについて得られた４個のＰＣＲ産物をまとめて１回の精製反応に付すことで行った。精製したＰＣＲ産物は、４０μｌのＥＢバッファー（Qiagen製）で溶出し、産物の収率を２６０ｎｍの吸光度で測定した。合計４０μｇの各ＰＣＲ産物を、０．２Ｕ／μｌの断片化試薬（Affymetrix製）と１×断片化バッファー（Fragmentation Buffer）からなる断片化反応に付した。断片化反応は＋３７℃で３５分間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートすることで酵素を不活化した。断片化したＰＣＲ産物について、１×ＴＢＥバッファー中での４％アガロースゲル電気泳動（BMA Reliant製のプレキャストゲル使用）を１２０Ｖで３０〜４５分間行うことで、断片化が完全であるかどうかを確認した。
【０１４４】
断片化したＰＣＲ産物は、次に１×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Terminal Deoxinucleotidyl Transferase）（TdT）バッファー（Affymetrix製）、GeneChip ＤＮＡ標識試薬（GeneChip DNA Labeling Reagent）（０．２１４ｍＭ； Affymetrix製）とＴｄＴ（１．５Ｕ／μｌ； Affymetrix製）を用いて、標識反応を＋３７℃で２時間行い、続いて＋９５℃で１５分間インキュベートした。標識したＤＮＡサンプルを、０．０５６ＭのＭＥＳ溶液（Sigma製）、５％のＤＭＳＯ（Sigma製）、２．５×デンハルト溶液（Sigma製）、５．７７ｍＭのＥＤＴＡ（Ambion製）、０．１１５ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Promega製）、１×オリゴヌクレオチドコントロール試薬（Oligonucleotide Control reagent）（Affymetrix製）、１１．５μｇ／ｍｌのヒトＣｏｔ−１（Invitrogen製）、０．０１１５％のTween-20（Pierce製）及び２．６９Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（Sigma製）からなるハイブリダイゼーションバッファーと混合した。ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションバッファー混合物は、対応するXba又はHind GeneChipRアレイとのハイブリダイゼーションを行う前に、＋９５℃で１０分間変性処理し、１０秒間氷冷してから、＋４８℃で２分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションは、６０ｒｐｍ、＋４８℃の Affymetrix GeneChip ハイブリダイゼーションオーブンに１６〜１８時間入れることで完了した。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイの染色と洗浄をGeneChip Fluidics Station 450の中で、推奨されるプロトコルであるMapping 10Kv1_450に従って行った。アレイはGeneChip 3000スキャナーでスキャンし、アレイ上の各ＳＮＰマーカーに対するジェノタイプコール（genotype call）は、Affymetrix ジェノタイピングツール（Genotyping Tools）（GTT）ソフトウエアを用いて作製した。ＳＮＰコールアルゴリズムにおける信頼スコアを０．２０に調整した。
【０１４５】
統計解析のためのＳＮＰの初期選択
統計解析を行う前に、ＳＮＰの質を次の３つの値に基づいて判定した：コール頻度（call rate）（ＣＲ）、マイナーアレル頻度（minor allele frequency）（ＭＡＦ）及びハーディワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）（Ｈ−Ｗ）。コール頻度は、ジェノタイピングの成功したサンプルの比率を示す。この値は、遺伝型が正しいかどうかは考慮しない。コール頻度は、以下の式で求めた：ＣＲ＝ジェノタイプコールが得られたサンプルの数／サンプルの合計数。マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）は、研究対象サンプルにより低い頻度で出現するアレルの頻度である。ＭＡＦは以下の式で求めた：ＭＡＦ＝min(p, q)［但し、ｐはＳＮＰアレル‘Ａ’の頻度であり、ｑはＳＮＰアレル‘Ｂ’の頻度であり、ｐ＝（遺伝型‘ＡＡ’を有するサンプルの数＋０．５×遺伝型‘ＡＢ’を有するサンプルの数）／ジェノタイプコールが得られたサンプルの数であり、ｑ＝１−ｐである］。ホモ接合型（ＭＡＦ＝０）のＳＮＰは遺伝子解析に用いることができないので取り除いた。ハーディワインバーグ（Ｈ−Ｗ）平衡は、対照のために試験した。この試験は、適合度を求めるための標準的なχ二乗検定に基づいている。観察された遺伝型の分布を、Ｈ−Ｗ平衡の元で予想される遺伝型分布と比較する。２つのアレルの場合、‘ＡＡ’、‘ＡＢ’と‘ＢＢ’という遺伝型に対する分布はそれぞれｐ2、２ｐｑとｑ2である。ＳＮＰがＨ−Ｗ平衡にない場合には、それはジェノタイピングの誤り又は未知のポピュレーションダイナミクス（例えば、機会的浮動や選択）によるものと考えられる。
【０１４６】
ＣＲ＞５０％であり、ＭＡＦ＞１％であり、更にＨ−Ｗ平衡にある（χ二乗検定の統計値＜２３．９３である）ＳＮＰのみを統計解析に使用した。合計で１０７，８９５個のＳＮＰが上記の基準を満たし、統計解析に含まれた。
【０１４７】
統計的手法
単一ＳＮＰ解析
発症例と対照例との間のアレル分布の差を、全１０７，８９５個のＳＮＰについてスクリーニングした。スクリーニングは、ｄｆ＝１とした標準的なχ二乗独立検定（アレル分布、２×２のテーブル）で行った。Ｐ値が０．００５未満（ｄｆ＝１のχ2分布が７．８８以上）のＳＮＰを統計的に有意とみなし、更なる解析のために選択した。この条件を満たすＳＮＰが５２９個あった。
【０１４８】
ハプロタイプ解析
データのセットは、ＨＰＭ−Ｇソフトウエア（Sevon P et al, 2004）又はＨＰＭソフトウエア（Toivonen HT et al, 2000）を用いた、ハプロタイプパターンマイニング（pattern mining）のアルゴリズムて解析した。ＨＰＭソフトウエアを用いる場合には、ジェノタイプのフェーズが分っていなければならない、即ち、母から受け継いだアレルと父から受け継いだアレルを判別しなければならない。家族データがない場合は、フェーズを集団データに基づいて推定しなければならない。我々は、フェーズを推定するためにHaploRecプログラム（Eronen L et al, 2004）を用いた。ＨＰＭ−ＧとＨＰＭは非常に高速で、１回の処理で大量のＳＮＰを扱うことができる。
【０１４９】
ＨＰＭとＨＰＭ−Ｇとの違いは、ＨＰＭ−Ｇはフェーズの分らないジェノタイプデータを扱うことが可能であり、ＨＰＭはフェーズの分っている（又はHaploRecや同様のプログラムでフェーズを推定した）データを用いる点である。ＨＰＭ−Ｇは、遺伝型構造（genotype configuration）の一致する全てのハプロタイプパターンを検出する。フェーズの分っているデータについて、ＨＰＭは、フェーズ構造（phase configuration）の合致する全てのハプロタイプパターンを検出する。ハプロタイプパターンの長さは色々ある。例えば、４個のＳＮＰがあり、個体がＳＮＰ１についてアレルはA／T、ＳＮＰ２についてアレルはC／C、ＳＮＰ３についてアレルはC／G、そしてＳＮＰ４についてアレルはA／Cの場合、ＨＰＭ−Ｇは、（長さが４個のＳＮＰの）ハプロタイプパターンは： ACCA、TCGC、TCCA、ACGC、ACGA、TCCC、TCGA、ACCCと判定する。一方、ＨＰＭは（HaploRecで）推定したフェーズと合致するハプロタイプパターンのみを考慮する。推定したフェーズが（母／父からの）ACGAと（父／母からの）TCCCの場合、ＨＰＭは、（長さが４個のＳＮＰの）たった２つのハプロタイプパターン：ACGA とTCCCを考慮する。
【０１５０】
ＳＮＰのスコア付けは、症例群と対照群との間で異なるハプロタイプパターンにＳＮＰが含まれる回数に基づいて行われる（χ二乗値の閾値はユーザーが選択することができる）。スコア値の有意性は、順列検定に基づいて評価する。
【０１５１】
ＨＰＭ−ＧプログラムとＨＰＭプログラムにおいて変更することのできるパラメーターとしては、χ二乗閾値（−ｘ）、最大ハプロタイプパターン長さ（−ｌ）、ハプロタイプパターンに含めることのできるワイルドカードの最大数（−ｗ）、及びＰ値を推定するための順列検定の回数（−ｐ）が挙げられる。ワイルドカードはハプロタイプ内にギャップが存在することを可能にする。ＨＰＭ−Ｇプログラムは、パラメーターを次のように設定して実行した：５個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ５ −ｗ１ −ｐ１００００）。HaploRec＋ＨＰＭプログラムは、パラメーターを次のように設定して実行した：５個のＳＮＰによるハプロタイプ解析（−ｘ９ −ｌ５ −ｗ１ −ｐ１００００）。ＨＰＭ−Ｇ解析は、ｄｂＳＮＰ１２２に示されたＳＮＰの順番に基づき、そしてHaploRec＋ＨＰＭは、ｄｂＳＮＰ１２３に示されたＳＮＰの順番に基づいていた。１０，０００回の反復（−ｐ１００００）に基づき、ＨＰＭ−Ｇは、Ｐ値が０．００５未満の時に５７０個のＳＮＰが有意であると解析し、ＨＰＭ解析では６４２個のＳＮＰが有意であるという結果が得られた。
【０１５２】
ハプロタイプ解析結果で使用する用語の定義
「ハプロタイプゲノム領域」や「ハプロタイプ領域」という用語は、ハプロタイプ解析（ＨＰＭ、ＨＰＭＧ又は同様の統計的方法／プログラム）によって、有意であると判定されたゲノム領域である。ハプロタイプ領域は、統計解析（ハプロタイプ解析）に含まれた、最初／最後のＳＮＰの物理的な位置から１００Ｋｂｐ上流／下流の領域であり、統計的に有意と判定された領域と定義する。この領域は、ゲノムビルド（genome build）に基づく塩基対、例えば、ＮＣＢＩのヒトゲノムビルド３５（NCBI Human Genome Build 35）に従ったＳＮＰの物理的位置（塩基対の位置）として得られる。
【０１５３】
本明細書に記載される「ハプロタイプ」という用語は、任意のアレルの組み合わせを意味し、例えば、ある遺伝子マーカー（例えば、rs2221511, rs4940595, rs1522723, rs1395266）に存在するA T C C である。定義したハプロタイプは遺伝子マーカー（ＳＮＰのｄｂＳＮＰ ｒｓ−ｉｄ）とそのアレルに名前を与える。当業者には認知されているように、ハプロタイプを定義するアレルを異なる鎖から求めることによって、同じハプロタイプであっても、異なった形で記載されることがある。例えば、本明細書に記載したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (A T C C) は、全てのアレルをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (T A G G) や、１番目のアレルのみをもう一方の鎖から決定したハプロタイプ rs2221511、rs4940595、rs1522723、rs1395266 (T T C C) と同じである。
【０１５４】
本願に記載したハプロタイプ、例えば、表３、４、５、７と８に示したマーカーを有するものは、ＨＴに罹患していない個体よりも、ＨＴに罹患している個体においてより頻繁に見出される。従ってこれらのハプロタイプは、個体からＨＴやＨＴに対する感受性を検出する上で予測的な価値を有する。ハプロタイプの検出は、多型部位に存在する配列を検出するために当業界で使用される方法で実施することができる。
【０１５５】
本発明で開示した、ＨＴ関連リスクを示すアレルとハプロタイプは、本発明のＨＴ関連遺伝子に位置する他の「多型部位」と関連してもよい。他のＨＴ関連多型部位は、遺伝子マーカーとして同等に有用であるか、あるいはリスク示す本発明のアレルやハプロタイプとＨＴとの間に見られる関連性を説明する、病因となる変異としてより有用である。
【０１５６】
多変量モデリング
２値の結果を得る高血圧症のモデリングを行うために、個別のＳＮＰ解析で得られた最も強力な予測性ＳＮＰマーカー７３４個とＨＰＭ解析で得られた最も強力なハプロタイプ１４個をモデルへのエントリーのために検定した。これらを、メジャーアレルのホモ接合体の場合は０、ヘテロ接合体の場合は１、そしてマイナーアレルのホモ接合体を２を記録した。多変量２値ロジスティック回帰分析は、ａ）ＨＴの予測性が最も高いＳＮＰを発見し、そしてｂ）最も強力にＨＴを予測する多変量モデルを構築するために用いた。前向きのステップアップモデル構築体（forward step-up model construction）を、入力するｐ値を０．０１、モデルから除外するｐ値を０．０２として使用した。モデルの予測性は、以下の２つの方法で推定した： NagelkerkeのＲ2値と、構築したロジスティックモデルに基づく、症例群と対照群に含まれる対象者の再分類。カットオフ値として使用した予測確率は０．５だった。データ還元解析は、ステップダウン及びステップアップロジスティックモデルで実施した。
【０１５７】
平均収縮期血圧及び平均拡張期血圧を定量的性質とした時に、それらと最も強力な関連性を示すＳＮＰマーカーを同定するために、多変量最小二乗直線回帰モデリングを用いた。前向きのステップアップモデル構築体は、入力するｐ値を０．００１、モデルから除外するｐ値を０．００５として使用した。
【０１５８】
使用した統計処理ソフトウエアはウインドウズ用のＳＰＳＳ、バージョン１１．５である。
【０１５９】
結果
表２には、個別のマーカー解析（ｎ＝５２９）において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたＳＮＰマーカーの特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベース ビルド１２４（NCBI db SNP database build 124）に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩ ヒト ゲノム ビルド３５（NCBI Human Genome Build 35）に基づく。遺伝子座は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４で報告されたものである。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイル（Affymetrix “csv” commercial access Human Mapping 100K array annotation files）の提供するものである。
【０１６０】
表３には、５個のＳＮＰを用いたＨＰＭ−Ｇ解析において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づく。関連遺伝子は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づいて、ＮＣＢＩマップビューワー（NCBI MapViewer）で見出したハプロタイプゲノム領域の両側に位置するＳＮＰの物理的位置から、１００Ｋｂｐ上流／下流の領域内に位置する遺伝子である。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイルの提供するものである。
【０１６１】
表４には、５個のＳＮＰを用いたHaploRec＋ＨＰＭ解析において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプゲノム領域の特徴をまとめた。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。ＳＮＰマーカーの物理的位置は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づく。関連遺伝子は、ＮＣＢＩヒトゲノム ビルド３５に基づいて、ＮＣＢＩマップビューワーで見出したハプロタイプゲノム領域の両側に位置するＳＮＰの物理的位置から、１００Ｋｂｐ上流／下流の領域内に位置する遺伝子である。ＳＮＰ隣接配列は、Affymetrix “csv” 一般アクセス可能なヒトマッピング１００Ｋアレイ アノテーションファイルの提供するものである。
【０１６２】
表５には、HaploRec＋ＨＰＭ解析（ｎ＝１４）において、ＨＴと最も強力な関連性が見出されたハプロタイプブロックを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。
【０１６３】
表６には、点別の解析及びハプロタイプ解析（ｎ＝７２２）によって、ＨＴとの関連性が見出された全ての遺伝子を列挙した。遺伝子の名称は、ＨＵＧＯの遺伝子専門用語委員会（HUGO Gene Nomenclature Committee）（ＨＧＮＣ）に従った。
【０１６４】
表７には、多変量ロジスティックモデルにおいて、家族性ＨＴの危険度を最も確実に予測するＳＮＰマーカーとハプロタイプを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。８変量モデルは家族性ＨＴの９１．４％を正しく予測する。統計は、ＫＩＨＤ基礎検査において高血圧症（ＳＢＰが１４０ｍｍＨｇ以上、ＤＢＰが９０ｍｍＨｇ以上、又は抗高血圧薬の投与を受けている状態）と診断され、兄弟／姉妹又は親がＨＴである８１人のＫＩＨＤ参加者と、ＫＩＨＤ基準値のＨＴもＨＴの家族歴もない８２人のＫＩＨＤ参加者に基づいている。対照群は、年齢が症例群と一致するようにした。
【０１６５】
表８には、多変量ロジスティックモデルにおいて、家族性ＨＴの危険度を最も確実に予測するＳＮＰマーカー、ハプロタイプと表現型のデータを列挙した。ＳＮＰ登録番号は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ データベース ビルド１２４に基づく。２個のハプロタイプ、５個のＳＮＰマーカーと２つの表現型変数を含む１２変量モデルは、家族性ＨＴの８７．１％を正しく予測した。多変量ロジスティックモデルにおいて特定された最も強力な遺伝子座は、SERPINのB3、B4、B7とB11及びEPC1、OR1J4、並びにLOC401406、439953、441550と441551である。
【０１６６】
表９には、平均収縮期血圧と平均拡張期血圧を予測する最も強力なＳＮＰマーカーの多変量回帰モデルを示した。表１０と１１には、単変量単一ＳＮＰ解析、ハプロタイプ解析及び多変量解析の全てにおいて最も強力にＢＰを予測した最も強力なＳＮＰマーカーの遺伝型に対する、平均収縮期血圧（表１０）と平均拡張期血圧（表１１）のそれぞれの平均値と標準偏差を示した。マーカーの順位付けは、拡張期血圧との関連性の強度に基づいている。定量的特性としてのＢＰに関連する遺伝子の中で、最も強力な遺伝子として特定されたものは、SERPINのB3、B7とB11、A100A7、S100A6、FARS1、SPOCK3とTLL1である。
【０１６７】
推測と考察
我々は、家族性の症例群と家族歴のない健康な対照群からなる、集団に基づく集合体において、ＨＴ及び／又は血圧の危険度と関連する１３６５個のＳＮＰマーカーを見出した。これらの内、５２９個を個別のＳＮＰの解析で同定し、１０８０個をハプロタイプパターンマイニング又はハプロタイプ解析で同定した。１３６５個のマーカーの内、２４４個は両方の統計解析でＨＴを予測した。我々は更に多変量ロジスティックモデルにおいて、実質的に完全にＨＴの発症を予測するＳＮＰマーカーを同定した。
【０１６８】
点別の解析とハプロタイプ解析の結果によって、ＨＴと関連する合計７２２個の遺伝子が同定され、この内、３３０個の遺伝子には、１３６５個のＳＮＰマーカーの内の少なくとも１個が物理的に結合していた。
【０１６９】
こうして我々は、その遺伝子マーカーがいずれもＨＴの予測に用いることのできる、合計７２２個のＨＴ遺伝子を同定した。従って、これらのマーカーは、ＨＴ素因に対する分子診断試験の一部として用いることができる。更に我々は、ＨＴ予測性の１３６５個のＳＮＰマーカーのセットを開示した。これらマーカーは、抗高血圧性の薬剤や化合物の効果や副作用を予測する薬理遺伝学試験の一部として用いることができる。発見した遺伝子は、新しいＨＴ治療法、例えば薬物、の標的となる。他の治療法としては、遺伝子導入を含む分子導入が挙げられる。新しい遺伝子は、抗高血圧性の薬剤や化合物を研究するための新規なトランスジェニック動物の開発と製造にも使用することができる。
【０１７０】
本発明をその好ましい態様に参照しながら具体的に開示し説明したが、当業者は、請求の範囲で定義した本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の形態及びその細部に変更を加えることが可能であることを理解するであろう。
【０１７１】
【表２−１】
【０１７２】
【表２−２】
【０１７３】
【表２−３】
【０１７４】
【表２−４】
【０１７５】
【表２−５】
【０１７６】
【表２−６】
【０１７７】
【表２−７】
【０１７８】
【表２−８】
【０１７９】
【表２−９】
【０１８０】
【表２−１０】
【０１８１】
【表３−１】
【０１８２】
【表３−２】
【０１８３】
【表３−３】
【０１８４】
【表３−４】
【０１８５】
【表３−５】
【０１８６】
【表３−６】
【０１８７】
【表３−７】
【０１８８】
【表３−８】
【０１８９】
【表３−９】
【０１９０】
【表３−１０】
【０１９１】
【表３−１１】
【０１９２】
【表３−１２】
【０１９３】
【表３−１３】
【０１９４】
【表３−１４】
【０１９５】
【表３−１５】
【０１９６】
【表３−１６】
【０１９７】
【表３−１７】
【０１９８】
【表３−１８】
【０１９９】
【表３−１９】
【０２００】
【表３−２０】
【０２０１】
【表３−２１】
【０２０２】
【表４−１】
【０２０３】
【表４−２】
【０２０４】
【表４−３】
【０２０５】
【表４−４】
【０２０６】
【表４−５】
【０２０７】
【表４−６】
【０２０８】
【表４−７】
【０２０９】
【表４−８】
【０２１０】
【表４−９】
【０２１１】
【表４−１０】
【０２１２】
【表４−１１】
【０２１３】
【表４−１２】
【０２１４】
【表４−１３】
【０２１５】
【表４−１４】
【０２１６】
【表４−１５】
【０２１７】
【表４−１６】
【０２１８】
【表４−１７】
【０２１９】
【表４−１８】
【０２２０】
【表４−１９】
【０２２１】
【表４−２０】
【０２２２】
【表４−２１】
【０２２３】
【表４−２２】
【０２２４】
【表４−２３】
【０２２５】
【表４−２４】
【０２２６】
【表４−２５】
【０２２７】
【表５−１】
【０２２８】
【表５−２】
【０２２９】
【表６−１】
【０２３０】
【表６−２】
【０２３１】
【表６−３】
【０２３２】
【表６−４】
【０２３３】
【表６−５】
【０２３４】
【表６−６】
【０２３５】
【表６−７】
【０２３６】
【表６−８】
【０２３７】
【表６−９】
【０２３８】
【表６−１０】
【０２３９】
【表６−１１】
【０２４０】
【表６−１２】
【０２４１】
【表７−１】
【０２４２】
【表７−２】
【０２４３】
【表８−１】
【０２４４】
【表８−２】
【０２４５】
【表９】
【０２４６】
【表１０−１】
【０２４７】
【表１０−２】
【０２４８】
【表１１−１】
【０２４９】
【表１１−２】
【０２５０】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血圧症（ＨＴ）を発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性が変化した個体を同定するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）該個体の個人情報及び臨床情報を集め、
ｃ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰ（一塩基多型）マーカーに関するデータを得、そして
ｄ）ＳＮＰマーカーに関するデータを個人情報及び臨床情報と組み合わせて、個体がＨＴを発症する危険度を評価する
ことを包含する方法。
【請求項２】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の上昇であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の低下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多型部位が、表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプに存在するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＴを発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性が変化した個体を同定するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体がＨＴを発症する危険度を評価する
ことを包含する方法。
【請求項９】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の上昇であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の低下であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
多型部位が、表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプに存在するものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該１種又は数種の多型部位が、表６に示したＨＴリスク遺伝子内に存在するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＴリスク遺伝子が、ハプロタイプパターンマイニングによって定義されるゲノム領域に存在し、該遺伝子は、表３、４、５、７及び８に示したものであるすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプ及び個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｂ）ハプロタイプ“TCCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508771
(A/T) (配列番号２８６)、rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T)
(配列番号２８７) と rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
ｃ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；
ｄ）リスクアレル“G”を定義する、rs1992906 (A/G) (配列番号６５５)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs10270360 (A/G) (配列番号１０)；
ｆ）リスクアレル“G”を定義する、rs1318392 (A/G) (配列番号４３８)；
ｇ）リスクアレル“A”を定義する、rs2209672 (A/G) (配列番号７３０)；及び
ｈ）リスクアレル“G”を定義する、rs503208 (C/G) (配列番号９８９)。
【請求項２１】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプ及び個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｂ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；
ｃ）リスクアレル“G”を定義する、rs1997454 (A/G) (配列番号６５６)；
ｄ）リスクアレル“G”を定義する、rs10270360 (A/G) (配列番号１０)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs1318392 (A/G) (配列番号４３８)：
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs2209672 (A/G) (配列番号７３０)；及び
ｇ）リスクアレル“G”を定義する、rs503208 (C/G) (配列番号９８９)。
【請求項２２】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs4845303
(A/T) (配列番号９８０)、rs6428195 (C/G) (配列番号１０３０) と rs1935659
(A/G) (配列番号６３７)；
ｂ）ハプロタイプ“AGC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1997454
(A/G) (配列番号６５６)、rs2139502 (A/G) (配列番号７０９) と rs1519991 (A/C)
(配列番号５４２)；
ｃ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｄ）ハプロタイプ“CGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs7679959
(C/G) (配列番号１１７８)、rs10517338 (C/G) (配列番号３８１) と rs959297
(A/T) (配列番号１３３８)；
ｅ）ハプロタイプ“GCAGG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2278677
(A/G) (配列番号７４９)、rs3886091 (C/G) (配列番号８９９)、rs1998167 (A/G)
(配列番号６５７)、rs1998168 (A/G) (配列番号６５８) と rs2235280 (A/G)
(配列番号７４０)；
ｆ）ハプロタイプ“AACG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10521062
(A/C) (配列番号４０４)、rs10512296 (A/G) (配列番号３３１)、rs1924001 (C/G)
(配列番号６３３) と rs2417359 (A/G) (配列番号７８４)；
ｇ）ハプロタイプ“GGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508933
(C/G) (配列番号２８９)、rs10509071 (A/G) (配列番号２９５) と rs10490967
(A/G) (配列番号９４)；
ｈ）ハプロタイプ“TCCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508771
(A/T) (配列番号２８６)、rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T)
(配列番号２８７) と rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
ｉ）ハプロタイプ“CAGT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1386486
(C/T) (配列番号４７２)、rs1386485 (A/C) (配列番号４７１)、rs1386483 (A/G)
(配列番号４７０) と rs7977245 (C/T) (配列番号１２１２)；
ｊ）ハプロタイプ“AA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs276002 (A/G)
(配列番号８１４) と rs274460 (A/G) (配列番号８１０)；
ｋ）ハプロタイプ“GCTTC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1245383
(A/G) (配列番号４３０)、rs2133829 (C/T) (配列番号７０７)、rs2173738 (C/T)
(配列番号７２２)、rs2050528 (C/T) (配列番号６７７) と rs202970 (C/T)
(配列番号６７１)；
ｌ）ハプロタイプ“TAC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1395266
(C/T) (配列番号４７６)、rs931850 (A/G) (配列番号１３０３) と rs1522722 (C/T)
(配列番号５４７)；
ｍ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；及び
ｎ）ハプロタイプ“ATGGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2825555
(A/G) (配列番号８１９)、rs2825583 (C/T) (配列番号８２０)、rs2825601 (A/G)
(配列番号８２１)、rs2825610 (G/T) (配列番号８２２) と rs1489734 (A/G)
(配列番号５３２)。
【請求項２３】
個体が有する、ＨＴに対する疾患感受性や素因を評価するための方法であって、表６に示した１種又は数種の遺伝子について、個体における発現レベルの変化を検出することを包含し、発現レベルの変化を、ＨＴに対する疾患感受性の指標として評価することを特徴とする方法。
【請求項２４】
表６に示した１種又は数種の遺伝子について、個体における転写レベルを評価することによって、遺伝子発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードするｍＲＮＡについて、個体における翻訳を評価することによって、遺伝子発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
個体が有する、ＨＴに対する疾患感受性や素因を評価するための方法であって、表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードする１種又は数種のポリペプチドについて、個体における生物活性の変化を検出することを包含し、１種又は数種のポリペプチドの生物活性の変化を、ＨＴに対する疾患感受性の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２７】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードする１種又は数種のポリペプチドについて、その構造を個体から求めることによって、生物活性の変化を検出することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードするポリペプチドの１種又は数種の代謝産物について、個体に存在する量を評価することによって、生物活性の変化を検出することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該個体の個人情報及び臨床情報、即ち、非遺伝学的情報が、年齢；性別；行動パターンと習慣；生化学検査の結果；臨床検査の結果；肥満度；ＨＴ、脳血管障害、他の心血管障害、高コレステロール血症、肥満及び糖尿病の家族歴；ウエスト/ヒップ比（ｃｍ／ｃｍ)；社会経済的状態；精神的性向と精神状態；並びに対象生物の治療歴に関するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
該行動パターンと習慣に、喫煙；運動；食事による栄養摂取、アルコール摂取とその消費パターン；並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該生化学検査の結果に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ又は総コレステロール又はトリグリセリド、アポリポタンパク（Ａ）、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、グルコース、あるいはインシュリンの血液、血清又は血漿濃度が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
非遺伝学的情報が、表８に示したものであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
非遺伝学的情報に、対象生物のＢＭＩとその家族における肥満の病歴が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
下記ロジスティック回帰式を用いて、ＨＴの危険度を計算する工程を更に包含する、請求項２９に記載の方法。
ＨＴの危険度 ＝［１＋ｅ-(a+Σ(bi×Xi)］-1
式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＨＴの危険度に関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項である。
【請求項３５】
ａ値とｂi値が、この方法を実施する集団から求められる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｘi値が、この方法を実施する集団で測定した変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
Ｘi値が、表２〜５及び７〜１１のＳＮＰマーカー、表３、４、５、７及び８のハプロタイプ領域とハプロタイプ、及び本発明の非遺伝学的変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
下記条件の少なくとも一方を満足することを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
ｂi値が−２０〜２０の範囲内である、及び
Ｘi値が、−９９９９９〜９９９９９の範囲以内であるか、０（ゼロ）又は１（一）とコード化される変数である。
【請求項３９】
ｉ値が０（即ち、なし）〜１００，０００の範囲内であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
対象生物がＨＴを発症する短期危険度、中期危険度及び長期危険度の少なくとも１つを予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
生存細胞において、化合物が、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に及ぼす影響を測定することを包含する、ＨＴの予防や治療に有用な化合物を同定するための方法であって、生体ネットワーク及び代謝経路から選ばれる１種又は数種の活性を変化させる化合物を、ＨＴの予防や治療に有用な化合物と評価する方法。
【請求項４２】
生存細胞における化合物の影響を、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性に及ぼす影響として測定し、ポリペプチドの生物活性を変化させる化合物を、ＨＴの予防や治療に有用な化合物と評価することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＴを予防又は治療するための方法であって、
表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性を増強又は減退させる化合物、及び
該ポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路から選ばれる１種又は数種の活性を増強又は減退させる化合物
からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする方法。
【請求項４４】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現を増強又は減退させる化合物、及び
該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子の発現を増強又は減退させる化合物
からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
心血管障害に関与し、且つ表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連する１種又は数種の病態生理学的経路について、その活性を増強又は減退させる化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）遺伝子発現及び生物活性の少なくとも一方の変化に関連し、且つ、表６に示したＨＴリスク遺伝子に存在する、１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出してジェノタイプデータを得、そして
ｃ）多型部位のジェノタイプデータを組み合わせて、対象生物にとって効果的なＨＴの治療法を選択する
ことを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現、及び表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性の少なくとも一方を、該個体の生物学的サンプルから検出し、そして
ｃ）発現と生物活性の少なくとも一方について得られたデータを組み合わせて、対象生物にとって効果的なＨＴの治療法を選択する
ことを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
該治療が、遺伝子治療又は遺伝子導入であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
該治療が、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体の導入を包含することを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
表６に示したＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体が、ＨＴの危険度の低下と関連することを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
該治療が、対象生物の体細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
該治療が、幹細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
該治療が、心血管障害を発症した組織中の幹細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該化合物が、表６に示したＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体のコードする組み換えポリペプチドであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
該治療が、表６に示したＨＴリスク遺伝子に対するｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズするｓｉＲＮＡに基づくことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
該治療が、ｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズするｓｉＲＮＡに基づき、ｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡは、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子に対するものであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
該治療方法が、食餌療法又は予防接種であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性について、ＨＴを発症していない健常対象生物と比べた時に見られる変化を、少なくとも部分的に修復する療法を包含することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現について、ＨＴを発症していない健常対象生物と比べた時に見られる変化を、少なくとも部分的に修復する療法を包含することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６０】
対象生物となるヒトにおけるＨＴ治療の効果を追跡するための方法であって、
対象生物から得た生物学的試料について、表６に示したＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡレベル、該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル、及び該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの生物活性からなる群より選ばれる少なくとも１種を測定し、そして
治療後のｍＲＮＡレベル、ポリペプチドレベル又はポリペプチドの生物活性の変化を、治療効果の指標として評価する
ことを包含する方法。
【請求項６１】
特定の個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測するための方法であって、請求項１５で定義したＨＴリスク遺伝子の１種又は数種の内に、ＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ハプロタイプ又はハプロタイプ領域が存在するか否かをスクリーニングすることを包含する方法。
【請求項６２】
特定の個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測する
ことを包含する方法。
【請求項６３】
ＨＴを発症した個体について、ＨＴのサブタイプを診断するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体のＨＴのサブタイプを評価する
ことを包含する方法。
【請求項６４】
該１種又は数種のＳＮＰマーカーが、表６に示したＨＴリスク遺伝子内に存在するものであることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＨＴリスク遺伝子が、ハプロタイプパターンマイニングによって定義されるゲノム領域に存在し、該遺伝子と領域は、表３、４、５、７及び８に示したものであることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
非遺伝学的情報を、請求項４４〜６８のいずれかの方法で得られた結果と組み合わせる工程を更に包含する、請求項４３と６０〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
該非遺伝学的情報が、年齢；性別；行動パターンと習慣；生化学検査の結果；臨床検査の結果；肥満度；ＨＴ、脳血管障害、他の心血管障害、高コレステロール血症、肥満及び糖尿病の家族歴；ウエスト/ヒップ比（ｃｍ／ｃｍ)；社会経済的状態；精神的性向と精神状態；並びに対象の治療歴に関するものであることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該行動パターンと習慣に、喫煙；運動；食事による栄養摂取、アルコール摂取とその消費パターン；並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
該生化学検査の結果に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ又は総コレステロール又はトリグリセリド、アポリポタンパク（Ａ）、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、グルコース、あるいはインシュリンの血液、血清又は血漿濃度の検査が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
非遺伝学的情報が、表８に示したものであることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
非遺伝学的情報に、対象生物のＢＭＩとその家族における肥満の病歴が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
対象生物から得た生物学的サンプルについて、ＨＴリスク遺伝子産物であるタンパク質の発現、産生又は濃度を測定するための方法であって、
ａ）個体から得た、試験に付すための生物学的サンプルを提供し、そして
ｂ）該サンプルにおける該タンパク質の発現、産生又は濃度を検出し、発現、産生又は濃度の変化を該対象生物が心血管障害を発症する危険度の変化の指標とする
ことを包含し、該ＨＴリスク遺伝子は表６に示したものであることを特徴とする方法。
【請求項７６】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性の変化を検出するための、請求項１の方法に基づく試験キット。
【請求項７７】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度の変化を検出するために、表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出するための試験キット。
【請求項７８】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度の変化を検出するために、表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出するための試験キットであって、
ａ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを検出するための試薬及び材料、並びに
ｂ）検出結果を解析するためのソフトウエア
を包含する試験キット。
【請求項７９】
表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸配列から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを更に包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８０】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴ関連マーカー及びハプロタイプ領域に存在する１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８１】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８２】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８３】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを生物学的サンプルから検出するための試験キットであって、該ＳＮＰマーカーは、ＨＴに対する疾患感受性を示さない対象生物から得た生物学的サンプルよりも、ＨＴに対する疾患感受性を示す対象生物から得た生物学的サンプルにおいて、より高頻度で存在するものであり、
ａ）表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを検出するための試薬及び材料、並びに
ｂ）検出結果を解析するためのソフトウエア
を包含する試験キット。
【請求項８４】
表６に示したＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを更に包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８５】
表６に示したＨＴリスク遺伝子内の１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを更に包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８６】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８７】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８８】
請求項４６、４７、６０〜６３及び７５のいずれかの方法に基づく試験キット。
【請求項８９】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９０】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴリスク遺伝子内の１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９１】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９２】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９３】
個体の家系を評価するためのマーカーのセットを更に包含する、請求項７６、８３又は８８に記載の試験キット。
【請求項９４】
個体の家系を評価するためのＳＮＰマーカーのセットを包含する、請求項９３に記載の試験キット。
【請求項９５】
個体の家系を評価するためのマイクロサテライトマーカーのセットを包含する、請求項９３に記載の試験キット。
【請求項９６】
個体の家系を評価するためのマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９７】
個体の家系を評価するためのＳＮＰマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９８】
個体の家系を評価するためのマイクロサテライトマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９９】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下の個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）リスクアレル“A”を定義する、rs1860933 (AT) (配列番号１３６６)；
ｂ）リスクアレル“C”を定義する、rs4236780 (CG) (配列番号１３６７)；
ｃ）リスクアレル“C”を定義する、rs2000112 (CT) (配列番号６６０)；
ｄ）リスクアレル“A”を定義する、rs931850 (AG) (配列番号１３０３)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs2192947 (AG) (配列番号７２８)；
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs9328292 (AG) (配列番号１３１６)；
ｇ）リスクアレル“C”を定義する、rs1409367 (CT) (配列番号４９０)；
ｈ）リスクアレル“T”を定義する、rs1893814 (CT) (配列番号６２２)；
ｉ）リスクアレル“T”を定義する、rs2263356 (CT) (配列番号７４６)；
ｊ）リスクアレル“C”を定義する、rs6826647 (CT) (配列番号１３６８)；及び
ｋ）リスクアレル“C”を定義する、rs1913157 (CG) (配列番号６３０)。
【請求項１００】
対象生物の高血圧薬治療に関する情報を対象生物の遺伝学的情報と組み合わせる工程を更に包含する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下の個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）リスクアレル“C”を定義する、rs6826647 (CT) (配列番号１３６８)；
ｂ）リスクアレル“C”を定義する、rs1409367 (CT) (配列番号４９０)；
ｃ）リスクアレル“A”を定義する、rs9328292 (AG) (配列番号１３１６)；
ｄ）リスクアレル“T”を定義する、rs1395266 (CT) (配列番号４７６)；
ｅ）リスクアレル“T”を定義する、rs1893814 (CT) (配列番号６２２)；
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs931850 (AG) (配列番号１３０３)；
ｇ）リスクアレル“A”を定義する、rs1860933 (AT) (配列番号１３６６)；
ｈ）リスクアレル“A”を定義する、rs1386483 (AG) (配列番号４７０)；
ｉ）リスクアレル“C”を定義する、rs4236780 (CG) (配列番号１３６７)；
ｊ）リスクアレル“C”を定義する、rs1913157 (CG) (配列番号６３０)；
ｋ）リスクアレル“T”を定義する、rs2263356 (CT) (配列番号７４６)；及び
ｌ）リスクアレル“C”を定義する、rs2000112 (CT) (配列番号６６０)。
【請求項１】
高血圧症（ＨＴ）を発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性が変化した個体を同定するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）該個体の個人情報及び臨床情報を集め、
ｃ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰ（一塩基多型）マーカーに関するデータを得、そして
ｄ）ＳＮＰマーカーに関するデータを個人情報及び臨床情報と組み合わせて、個体がＨＴを発症する危険度を評価する
ことを包含する方法。
【請求項２】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の上昇であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の低下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多型部位が、表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプに存在するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＴを発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性が変化した個体を同定するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体がＨＴを発症する危険度を評価する
ことを包含する方法。
【請求項９】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の上昇であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
危険度の変化が、ＨＴを発症する危険度の低下であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
多型部位が、表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプに存在するものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
多型部位が、表２〜５及び７〜１１に示したＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該１種又は数種の多型部位が、表６に示したＨＴリスク遺伝子内に存在するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＴリスク遺伝子が、ハプロタイプパターンマイニングによって定義されるゲノム領域に存在し、該遺伝子は、表３、４、５、７及び８に示したものであるすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプ及び個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｂ）ハプロタイプ“TCCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508771
(A/T) (配列番号２８６)、rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T)
(配列番号２８７) と rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
ｃ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；
ｄ）リスクアレル“G”を定義する、rs1992906 (A/G) (配列番号６５５)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs10270360 (A/G) (配列番号１０)；
ｆ）リスクアレル“G”を定義する、rs1318392 (A/G) (配列番号４３８)；
ｇ）リスクアレル“A”を定義する、rs2209672 (A/G) (配列番号７３０)；及び
ｈ）リスクアレル“G”を定義する、rs503208 (C/G) (配列番号９８９)。
【請求項２１】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプ及び個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｂ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；
ｃ）リスクアレル“G”を定義する、rs1997454 (A/G) (配列番号６５６)；
ｄ）リスクアレル“G”を定義する、rs10270360 (A/G) (配列番号１０)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs1318392 (A/G) (配列番号４３８)：
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs2209672 (A/G) (配列番号７３０)；及び
ｇ）リスクアレル“G”を定義する、rs503208 (C/G) (配列番号９８９)。
【請求項２２】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下のハプロタイプからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）ハプロタイプ“ACG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs4845303
(A/T) (配列番号９８０)、rs6428195 (C/G) (配列番号１０３０) と rs1935659
(A/G) (配列番号６３７)；
ｂ）ハプロタイプ“AGC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1997454
(A/G) (配列番号６５６)、rs2139502 (A/G) (配列番号７０９) と rs1519991 (A/C)
(配列番号５４２)；
ｃ）ハプロタイプ“ACT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1521409
(A/G) (配列番号５４４)、rs10511365 (C/T) (配列番号３１６) と rs10511366
(C/T) (配列番号３１７)；
ｄ）ハプロタイプ“CGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs7679959
(C/G) (配列番号１１７８)、rs10517338 (C/G) (配列番号３８１) と rs959297
(A/T) (配列番号１３３８)；
ｅ）ハプロタイプ“GCAGG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2278677
(A/G) (配列番号７４９)、rs3886091 (C/G) (配列番号８９９)、rs1998167 (A/G)
(配列番号６５７)、rs1998168 (A/G) (配列番号６５８) と rs2235280 (A/G)
(配列番号７４０)；
ｆ）ハプロタイプ“AACG”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10521062
(A/C) (配列番号４０４)、rs10512296 (A/G) (配列番号３３１)、rs1924001 (C/G)
(配列番号６３３) と rs2417359 (A/G) (配列番号７８４)；
ｇ）ハプロタイプ“GGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508933
(C/G) (配列番号２８９)、rs10509071 (A/G) (配列番号２９５) と rs10490967
(A/G) (配列番号９４)；
ｈ）ハプロタイプ“TCCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs10508771
(A/T) (配列番号２８６)、rs3006608 (C/T) (配列番号８５４)、rs10508773 (C/T)
(配列番号２８７) と rs950132 (C/T) (配列番号１３２５)；
ｉ）ハプロタイプ“CAGT”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1386486
(C/T) (配列番号４７２)、rs1386485 (A/C) (配列番号４７１)、rs1386483 (A/G)
(配列番号４７０) と rs7977245 (C/T) (配列番号１２１２)；
ｊ）ハプロタイプ“AA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs276002 (A/G)
(配列番号８１４) と rs274460 (A/G) (配列番号８１０)；
ｋ）ハプロタイプ“GCTTC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1245383
(A/G) (配列番号４３０)、rs2133829 (C/T) (配列番号７０７)、rs2173738 (C/T)
(配列番号７２２)、rs2050528 (C/T) (配列番号６７７) と rs202970 (C/T)
(配列番号６７１)；
ｌ）ハプロタイプ“TAC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs1395266
(C/T) (配列番号４７６)、rs931850 (A/G) (配列番号１３０３) と rs1522722 (C/T)
(配列番号５４７)；
ｍ）ハプロタイプ“ATCC”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2221511
(A/G) (配列番号７３３)、rs4940595 (G/T) (配列番号９８６)、rs1522723 (C/T)
(配列番号５４８) と rs1395266 (C/T) (配列番号４７６)；及び
ｎ）ハプロタイプ“ATGGA”（又はその相補鎖のヌクレオチド）を定義する、rs2825555
(A/G) (配列番号８１９)、rs2825583 (C/T) (配列番号８２０)、rs2825601 (A/G)
(配列番号８２１)、rs2825610 (G/T) (配列番号８２２) と rs1489734 (A/G)
(配列番号５３２)。
【請求項２３】
個体が有する、ＨＴに対する疾患感受性や素因を評価するための方法であって、表６に示した１種又は数種の遺伝子について、個体における発現レベルの変化を検出することを包含し、発現レベルの変化を、ＨＴに対する疾患感受性の指標として評価することを特徴とする方法。
【請求項２４】
表６に示した１種又は数種の遺伝子について、個体における転写レベルを評価することによって、遺伝子発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードするｍＲＮＡについて、個体における翻訳を評価することによって、遺伝子発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
個体が有する、ＨＴに対する疾患感受性や素因を評価するための方法であって、表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードする１種又は数種のポリペプチドについて、個体における生物活性の変化を検出することを包含し、１種又は数種のポリペプチドの生物活性の変化を、ＨＴに対する疾患感受性の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２７】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードする１種又は数種のポリペプチドについて、その構造を個体から求めることによって、生物活性の変化を検出することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
表６に示した１種又は数種の遺伝子がコードするポリペプチドの１種又は数種の代謝産物について、個体に存在する量を評価することによって、生物活性の変化を検出することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該個体の個人情報及び臨床情報、即ち、非遺伝学的情報が、年齢；性別；行動パターンと習慣；生化学検査の結果；臨床検査の結果；肥満度；ＨＴ、脳血管障害、他の心血管障害、高コレステロール血症、肥満及び糖尿病の家族歴；ウエスト/ヒップ比（ｃｍ／ｃｍ)；社会経済的状態；精神的性向と精神状態；並びに対象生物の治療歴に関するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
該行動パターンと習慣に、喫煙；運動；食事による栄養摂取、アルコール摂取とその消費パターン；並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該生化学検査の結果に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ又は総コレステロール又はトリグリセリド、アポリポタンパク（Ａ）、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、グルコース、あるいはインシュリンの血液、血清又は血漿濃度が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
非遺伝学的情報が、表８に示したものであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
非遺伝学的情報に、対象生物のＢＭＩとその家族における肥満の病歴が含まれることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
下記ロジスティック回帰式を用いて、ＨＴの危険度を計算する工程を更に包含する、請求項２９に記載の方法。
ＨＴの危険度 ＝［１＋ｅ-(a+Σ(bi×Xi)］-1
式中、ｅはネーピアの定数であり、ＸiはＨＴの危険度に関連した変数であり、ｂiは上記変数のロジスティック関数における係数であり、ａはロジスティック関数の定数項である。
【請求項３５】
ａ値とｂi値が、この方法を実施する集団から求められる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｘi値が、この方法を実施する集団で測定した変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
Ｘi値が、表２〜５及び７〜１１のＳＮＰマーカー、表３、４、５、７及び８のハプロタイプ領域とハプロタイプ、及び本発明の非遺伝学的変数から選ばれる値であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
下記条件の少なくとも一方を満足することを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
ｂi値が−２０〜２０の範囲内である、及び
Ｘi値が、−９９９９９〜９９９９９の範囲以内であるか、０（ゼロ）又は１（一）とコード化される変数である。
【請求項３９】
ｉ値が０（即ち、なし）〜１００，０００の範囲内であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
対象生物がＨＴを発症する短期危険度、中期危険度及び長期危険度の少なくとも１つを予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
生存細胞において、化合物が、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に及ぼす影響を測定することを包含する、ＨＴの予防や治療に有用な化合物を同定するための方法であって、生体ネットワーク及び代謝経路から選ばれる１種又は数種の活性を変化させる化合物を、ＨＴの予防や治療に有用な化合物と評価する方法。
【請求項４２】
生存細胞における化合物の影響を、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性に及ぼす影響として測定し、ポリペプチドの生物活性を変化させる化合物を、ＨＴの予防や治療に有用な化合物と評価することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＴを予防又は治療するための方法であって、
表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性を増強又は減退させる化合物、及び
該ポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路から選ばれる１種又は数種の活性を増強又は減退させる化合物
からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする方法。
【請求項４４】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現を増強又は減退させる化合物、及び
該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子の発現を増強又は減退させる化合物
からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
心血管障害に関与し、且つ表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連する１種又は数種の病態生理学的経路について、その活性を増強又は減退させる化合物の有効量を、薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする哺乳類である対象生物に投与することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）遺伝子発現及び生物活性の少なくとも一方の変化に関連し、且つ、表６に示したＨＴリスク遺伝子に存在する、１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出してジェノタイプデータを得、そして
ｃ）多型部位のジェノタイプデータを組み合わせて、対象生物にとって効果的なＨＴの治療法を選択する
ことを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現、及び表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性の少なくとも一方を、該個体の生物学的サンプルから検出し、そして
ｃ）発現と生物活性の少なくとも一方について得られたデータを組み合わせて、対象生物にとって効果的なＨＴの治療法を選択する
ことを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
該治療が、遺伝子治療又は遺伝子導入であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
該治療が、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体の導入を包含することを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
表６に示したＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体が、ＨＴの危険度の低下と関連することを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
該治療が、対象生物の体細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
該治療が、幹細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
該治療が、心血管障害を発症した組織中の幹細胞の有する遺伝子調節領域及び遺伝子含有領域の少なくとも一方の処置を包含し、該遺伝子は、表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該化合物が、表６に示したＨＴリスク遺伝子、その変異体、断片又は誘導体のコードする組み換えポリペプチドであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
該治療が、表６に示したＨＴリスク遺伝子に対するｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズするｓｉＲＮＡに基づくことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
該治療が、ｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡの少なくとも一方とハイブリダイズするｓｉＲＮＡに基づき、ｍＲＮＡ及びｈｎＲＮＡは、表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドに関連した生体ネットワーク及び代謝経路の少なくとも一方に含まれる１種又は数種の遺伝子に対するものであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
該治療方法が、食餌療法又は予防接種であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
表６に示したＨＴリスク遺伝子のコードする１種又は数種のポリペプチドの生物活性について、ＨＴを発症していない健常対象生物と比べた時に見られる変化を、少なくとも部分的に修復する療法を包含することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子の発現について、ＨＴを発症していない健常対象生物と比べた時に見られる変化を、少なくとも部分的に修復する療法を包含することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６０】
対象生物となるヒトにおけるＨＴ治療の効果を追跡するための方法であって、
対象生物から得た生物学的試料について、表６に示したＨＴリスク遺伝子のｍＲＮＡレベル、該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドのレベル、及び該ＨＴリスク遺伝子のコードするポリペプチドの生物活性からなる群より選ばれる少なくとも１種を測定し、そして
治療後のｍＲＮＡレベル、ポリペプチドレベル又はポリペプチドの生物活性の変化を、治療効果の指標として評価する
ことを包含する方法。
【請求項６１】
特定の個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測するための方法であって、請求項１５で定義したＨＴリスク遺伝子の１種又は数種の内に、ＨＴ関連ＳＮＰマーカー、ハプロタイプ又はハプロタイプ領域が存在するか否かをスクリーニングすることを包含する方法。
【請求項６２】
特定の個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種の多型部位に含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体において特定の療法がＨＴを予防又は治療する効果を予測する
ことを包含する方法。
【請求項６３】
ＨＴを発症した個体について、ＨＴのサブタイプを診断するための方法であって、
ａ）個体から得た生物学的サンプルを提供し、
ｂ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを該個体の核酸配列から検出して、ＳＮＰマーカーに関するデータを得、そして
ｃ）ＳＮＰマーカーに関するデータを組み合わせて、個体のＨＴのサブタイプを評価する
ことを包含する方法。
【請求項６４】
該１種又は数種のＳＮＰマーカーが、表６に示したＨＴリスク遺伝子内に存在するものであることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＨＴリスク遺伝子が、ハプロタイプパターンマイニングによって定義されるゲノム領域に存在し、該遺伝子と領域は、表３、４、５、７及び８に示したものであることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーに関連することを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
多型部位が、ハプロタイプ領域、ハプロタイプ、又は表３、４、５、７及び８に示したハプロタイプを定義するＳＮＰマーカーと完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
多型部位が、該方法を実施する集団において完全な連鎖不平衡状態にあることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
非遺伝学的情報を、請求項４４〜６８のいずれかの方法で得られた結果と組み合わせる工程を更に包含する、請求項４３と６０〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
該非遺伝学的情報が、年齢；性別；行動パターンと習慣；生化学検査の結果；臨床検査の結果；肥満度；ＨＴ、脳血管障害、他の心血管障害、高コレステロール血症、肥満及び糖尿病の家族歴；ウエスト/ヒップ比（ｃｍ／ｃｍ)；社会経済的状態；精神的性向と精神状態；並びに対象の治療歴に関するものであることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該行動パターンと習慣に、喫煙；運動；食事による栄養摂取、アルコール摂取とその消費パターン；並びにコーヒーの消費量とその質が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
該生化学検査の結果に、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ又は総コレステロール又はトリグリセリド、アポリポタンパク（Ａ）、フィブリノーゲン、フェリチン、トランスフェリン受容体、Ｃ反応性タンパク質、グルコース、あるいはインシュリンの血液、血清又は血漿濃度の検査が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
非遺伝学的情報が、表８に示したものであることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
非遺伝学的情報に、対象生物のＢＭＩとその家族における肥満の病歴が含まれることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
対象生物から得た生物学的サンプルについて、ＨＴリスク遺伝子産物であるタンパク質の発現、産生又は濃度を測定するための方法であって、
ａ）個体から得た、試験に付すための生物学的サンプルを提供し、そして
ｂ）該サンプルにおける該タンパク質の発現、産生又は濃度を検出し、発現、産生又は濃度の変化を該対象生物が心血管障害を発症する危険度の変化の指標とする
ことを包含し、該ＨＴリスク遺伝子は表６に示したものであることを特徴とする方法。
【請求項７６】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度やＨＴに対する疾患感受性の変化を検出するための、請求項１の方法に基づく試験キット。
【請求項７７】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度の変化を検出するために、表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出するための試験キット。
【請求項７８】
対象生物における、ＨＴを発症する危険度の変化を検出するために、表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを、該個体の核酸配列から検出するための試験キットであって、
ａ）表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーに含まれるヌクレオチドを検出するための試薬及び材料、並びに
ｂ）検出結果を解析するためのソフトウエア
を包含する試験キット。
【請求項７９】
表２〜５及び７〜１１に示した１種又は数種のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸配列から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを更に包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８０】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴ関連マーカー及びハプロタイプ領域に存在する１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８１】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８２】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項７６に記載の試験キット。
【請求項８３】
表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを生物学的サンプルから検出するための試験キットであって、該ＳＮＰマーカーは、ＨＴに対する疾患感受性を示さない対象生物から得た生物学的サンプルよりも、ＨＴに対する疾患感受性を示す対象生物から得た生物学的サンプルにおいて、より高頻度で存在するものであり、
ａ）表６に示した１種又は数種のＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを検出するための試薬及び材料、並びに
ｂ）検出結果を解析するためのソフトウエア
を包含する試験キット。
【請求項８４】
表６に示したＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを更に包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８５】
表６に示したＨＴリスク遺伝子内の１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを更に包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８６】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８７】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項８３に記載の試験キット。
【請求項８８】
請求項４６、４７、６０〜６３及び７５のいずれかの方法に基づく試験キット。
【請求項８９】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴリスク遺伝子内のＳＮＰマーカーを含有する核酸断片を、対象生物の核酸から増幅するためのＰＣＲプライマーのセットを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９０】
表２〜５及び７〜１１に示したＨＴリスク遺伝子内の１種又は数種のＳＮＰマーカーに特異的に結合する捕捉用核酸プローブのセットを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９１】
ジェノタイプを評価するためのマイクロアレイ又はマルチウエルプレートを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９２】
年齢、性別、身長、体重、ウエストとヒップのサイズ、皮下脂肪や脂肪組織の厚み、体脂肪率、肥満や糖尿病に関する家族歴、及びＨＴの治療歴に関する個体情報及び臨床情報を集めるためのアンケートを包含する、請求項８８に記載の試験キット。
【請求項９３】
個体の家系を評価するためのマーカーのセットを更に包含する、請求項７６、８３又は８８に記載の試験キット。
【請求項９４】
個体の家系を評価するためのＳＮＰマーカーのセットを包含する、請求項９３に記載の試験キット。
【請求項９５】
個体の家系を評価するためのマイクロサテライトマーカーのセットを包含する、請求項９３に記載の試験キット。
【請求項９６】
個体の家系を評価するためのマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９７】
個体の家系を評価するためのＳＮＰマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９８】
個体の家系を評価するためのマイクロサテライトマーカーのセットを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９９】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下の個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）リスクアレル“A”を定義する、rs1860933 (AT) (配列番号１３６６)；
ｂ）リスクアレル“C”を定義する、rs4236780 (CG) (配列番号１３６７)；
ｃ）リスクアレル“C”を定義する、rs2000112 (CT) (配列番号６６０)；
ｄ）リスクアレル“A”を定義する、rs931850 (AG) (配列番号１３０３)；
ｅ）リスクアレル“G”を定義する、rs2192947 (AG) (配列番号７２８)；
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs9328292 (AG) (配列番号１３１６)；
ｇ）リスクアレル“C”を定義する、rs1409367 (CT) (配列番号４９０)；
ｈ）リスクアレル“T”を定義する、rs1893814 (CT) (配列番号６２２)；
ｉ）リスクアレル“T”を定義する、rs2263356 (CT) (配列番号７４６)；
ｊ）リスクアレル“C”を定義する、rs6826647 (CT) (配列番号１３６８)；及び
ｋ）リスクアレル“C”を定義する、rs1913157 (CG) (配列番号６３０)。
【請求項１００】
対象生物の高血圧薬治療に関する情報を対象生物の遺伝学的情報と組み合わせる工程を更に包含する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
１種又は数種のＳＮＰマーカーが、以下の個々のＳＮＰからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ａ）リスクアレル“C”を定義する、rs6826647 (CT) (配列番号１３６８)；
ｂ）リスクアレル“C”を定義する、rs1409367 (CT) (配列番号４９０)；
ｃ）リスクアレル“A”を定義する、rs9328292 (AG) (配列番号１３１６)；
ｄ）リスクアレル“T”を定義する、rs1395266 (CT) (配列番号４７６)；
ｅ）リスクアレル“T”を定義する、rs1893814 (CT) (配列番号６２２)；
ｆ）リスクアレル“A”を定義する、rs931850 (AG) (配列番号１３０３)；
ｇ）リスクアレル“A”を定義する、rs1860933 (AT) (配列番号１３６６)；
ｈ）リスクアレル“A”を定義する、rs1386483 (AG) (配列番号４７０)；
ｉ）リスクアレル“C”を定義する、rs4236780 (CG) (配列番号１３６７)；
ｊ）リスクアレル“C”を定義する、rs1913157 (CG) (配列番号６３０)；
ｋ）リスクアレル“T”を定義する、rs2263356 (CT) (配列番号７４６)；及び
ｌ）リスクアレル“C”を定義する、rs2000112 (CT) (配列番号６６０)。
【公表番号】特表２００８−５２１３９２（Ｐ２００８−５２１３９２Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４２０２６（Ｐ２００７−５４２０２６）
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００５／０５０４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３９５５
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（５０２１３４５８０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００５／０５０４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３９５５
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（５０２１３４５８０）
【Ｆターム（参考）】
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