細胞死でのカスパーゼ−２活性を予防し、阻止し／沈黙させるための阻害剤。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死、特にはニューロンの細胞死を予防または治療するための手段、方法および産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロンの細胞死は、胚形成の間に、過剰のニューロンを取り除いて適切な前シナプス結合および後シナプス結合を確実にし、機能的な成人脳の形成を可能にするために起こる。
【０００３】
通常の加齢に関連する後分裂（post-mitotic）死の他に、急性の損傷（例えば低酸素症−虚血（hypoxia-ishemia）、脳卒中、脊髄損傷（spinal cord injury）、外傷）または慢性の神経変性疾患の際に、環境上または遺伝子の突然変異の因子が成人のヒトにおいてニューロン死を誘発し得る。
【０００４】
これらの疾患に伴う細胞死は、形態学的および生化学的特徴を示す、ネクローシス、オートファジー（autophagy）またはアポトーシスの３つの異なった機構によって発生し得る。生理学的かつ病理学的なニューロン死は、しばしば、欠陥のあるアポトーシス調節と関連し、この活性な細胞自殺機構に通じるシグナリング経路は、哺乳動物細胞において、システイン−アスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）−依存性経路とカスパーゼ非依存性経路とに分けられ得る。
【０００５】
ニューロンのアポトーシスは、開始、決定、実行および分解を含む一連の期に分けられ得る活性な細胞自殺機構である。この事象のカスケードは、特定の機構の活性化によって駆動される。この特定の機構は、システイン依存性アスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化および決定的（または増幅）調節オルガネラとして作用し得るミトコンドリアの両方を含む。実際に、ミトコンドリアの変化は、ミトコンドリア内膜の電気化学的勾配（ΔΨ_ｍ）の損失およびアポトーシス発生因子、例えばシトクロムｃ、Smac/Diabloおよびアポトーシス誘導因子（Apoptosis Inducing Factor）の放出を含む。一旦ミトコンドリアから放出されると、これらのエフェクターは、カスパーゼ依存性および／またはカスパーゼ非依存性の細胞質および核の解体の引き金となる。それ故に、カスパーゼに結び付けられるミトコンドリアの因子は、アポトーシスの分解期に関与し、結果として、細胞収縮（cell shrinkage）、核凝縮（nuclear condensation）、アポトーシス体の放出および「eat-me」シグナル、例えば、ホスファチジル−セリンの細胞質膜の外側小葉状部（leaflet）への転座の発生をもたらす。食細胞（phagocyte）の不存在下では、細胞はアポトーシスに束縛され、最終的には、二次的ネクローシスと呼ばれる非特異的な細胞質膜の破壊を経る。
【０００６】
ニューロンのアポトーシスの間のミトコンドリア、カスパーゼおよび他の事象のそれぞれの寄与は依然として、特に、所与の死の誘導物質／細胞型の連動に関して解明されていない。
【０００７】
最近になるまで、ニューロン細胞のアポトーシスおよびネクローシスは、主として、２タイプのアプローチによって調査されていた。第一群の（生化学的な）技術は、一般的にミトコンドリア・スクシナートデヒドロゲナーゼ活性の比色評価（ＭＴＴアッセイ）またはラクターゼデヒドロゲナーゼ活性の細胞外放出（ＬＤＨアッセイ）によるニューロンの死の末期の事象を評価する。これらの通常のモノパラメトリックなパラメータ定量技術は、細胞死の機構に関する情報を与えず、他の生化学過程の検出に結び付けられ得ない。
【０００８】
より最近になって、いくつかのニューロンに適合型細胞分画プロトコルが、蛍光発生基質を用いる免疫ブロット法およびカスパーゼ活性化によるシトクロムｃ転座の生化学的評価に関して公表された。このような最近の方法は、ニューロンの個体数についての半定量的情報を与えるが、マルチパラメトリックでかつ実時間の分析を除外する。第二群の技術は、蛍光顕微鏡法（fluorescence microscopy：ＦＭ）の読み出しを用いて、オルガネラの改変またはアポトーシスが関連するタンパク質を検出する。これらのＦＭ研究の大部分は、クロマチンの形態の視覚化（ヘキスト（登録商標）染色）を含む末期の核変化および／またはＤＮＡ断片化の生化学的検出（TUNELアッセイ）に焦点が当てられている。ニューロンについての最新のＦＭ研究では、シトクロムｃの（固定された細胞での）免疫局在化（immuno-localization）が報告されているが、細胞生物学の他の分野とは対照的に、ミトコンドリアの変化およびカスパーゼ活性化の現場（in situ）検出を用いるニューロンについての研究数は限定される。培養された一次ニューロン（primary neuron）に適用される場合、ＦＭをベースとする分析は、時間を消費し、面倒であり、定量化は、細胞体凝集物および重畳する神経突起（neurite）ネットワークによって阻害される。さらに、高感度蛍光プローブのフォトブリーチング（photo-bleaching）は、劇的なミスリーディング解釈につながり得、かつ、早期の死に関連する事象の実時間の追跡調査を除外し得る。このため、キーとなるアポトーシス事象の細胞生物学的特徴は、一次ニューロンにおいて十分に証明されたわけでも秩序立てられたわけでもなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは、特に一次皮質ニューロンまたはニューロン細胞系または非ニューロン細胞系のために有用なアポトーシス現象の動力学を分析するための補完的でかつ定量的なアプローチを開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このようなアプローチにより、本発明者らは、アポトーシスに関連する分子レベルの事象を系統立ておよび分析する新しい方法を開発した。この方法によりアポトーシスに関連する事象の変遷（chronology）および階層性（hierarchy）をニューロン細胞において評価するために、本発明者らは、実験上の急性死モデルを精妙に作り上げて、アポトーシス過程に介入するより基部に近い（proximal）可逆性のチェックポイントを決定し、前記方法をこのモデルに適用した。都合の良いことに、この評価は、ニューロン細胞、ニューロン細胞系並びに非ニューロン細胞および非ニューロン細胞系について行われ得る。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、細胞死を予防するための細胞内チェックポイントを識別するためのマルチパラメトリックな分析および画像化プレートフォーム（plateform）方法および細胞死を阻止および予防するためのその使用を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、本発明者らがニューロンまたは細胞系における１以上のアポトーシスのホールマーク（hallmark）の実時間追跡方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、カスパーゼ−２（Nedd-2；Ich-1とも呼ばれる）遺伝子のサイレンシングを誘導するか、または後アポトーシス（post-apoptotic）カスパーゼ−２活性を阻害する（または下流のカスパーゼ−２依存性過程に干渉する）新規化合物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、カスパーゼー２に関係する疾患および損傷の医薬組成物および治療方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１つの局面によると、本発明は、細胞死を予防するための方法であって、所与の誘導方法に応じて、所与の細胞タイプにおいて、アポトーシス関連事象の階層性を決定する工程と、アポトーシス過程に干渉するためにより基部に近い可逆性のチェックポイントを阻止する工程とを包含する方法に関する。
【００１６】
この方法は、有利には、迅速な定量フローサイトメトリーおよび定量／定性蛍光顕微鏡法分析をニューロンにおいて併せて行うことによって行われる。この方法はまた、有利には、非ニューロン細胞において行われる。前記方法はまた、ニューロン細胞系について用いられ得る。
【００１７】
両技術の使用は、アポトーシスの決定、実行、早期および末期の分解期の同時検出を可能にする。
【００１８】
実施例により説明されるように、本発明は、ＭＰＴＰ処理を含む神経毒性障害に応答したΔΨ_ｍおよび形質膜、核および細胞形態の粒状度および細胞サイズ変化の信頼性のある実時間フローサイトメトリーによるモニタリングを生じさせる手段を提供する。
【００１９】
特定の非オーバーラップ（non-overlapping）蛍光プローブおよび／または特定の抗体および／または薬理学的試剤を用いて、本発明は、アポトーシスの細胞生物学を研究し、新しい保護性分子を特徴付けることを可能にする有用な手段を提供する。
【００２０】
ニューロン死経路を研究し、かつ上流のチェックポイントを識別するための実験モデルとして、ニューロン培養における血清欠乏（serum deprivation）が本発明者らによって用いられた。ニューロンの発生および病的状態である際、適切なターゲットまたは代謝物（酸素、グルコース、カリウム、神経栄養性または成長因子、栄養素）およびターゲットにより誘導された神経栄養性因子の供給源を見つけ損なったニューロンは、アポトーシスの細胞死を経る（Deckwerthら,1996;Deshmuckら,1996および1998;Liptonら,1999;Plenislaら,2001;Changら,2002）。
【００２１】
前記マルチパラメトリックでかつ画像化分析的なプレートフォームを用い、かつ、急性血清欠乏（ＳＤ）誘導性のニューロン細胞死の関連でカスパーゼの選択的な役割（薬理学的な阻害；小さい干渉性のＲＮＡ遺伝子ノックダウン）を研究することにより、本発明者らは、カスパーゼ−２がＢａｘ依存性ＭＭＰの上流の制御因子であること見出した。したがって、本発明は、チェックポイントがカスパーゼ−２である方法に特に関する。本明細書および請求の範囲において用いられた用語「カスパーゼ」は、選択的スプライシングによって得られる種々の形態を包含する。
【００２２】
本発明者らによって示されるように、早期のカスパーゼ−２の活性化は、ミトコンドリアのＢａｘ転座、ミトコンドリア膜電位（ΔΨ_ｍ）の崩壊（disruption）、カスパーゼ−９／カスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性の活性化、核変化（alteration）、ホスファチジルセリンの露出および最終的な形質膜の透過性能（permeabilization of the plasma membrane：ＰＭＰ）に必要とされる。
【００２３】
本発明の別の実施形態によると、前記チェックポイントはカスパーゼである。
【００２４】
さらに別の実施形態によると、前記チェックポイントは、関連性のないカスパーゼ活性化である。
【００２５】
このため、本発明はまた、カスパーゼ−２発現を沈黙させるためにカスパーゼ−２活性（および／またはカスパーゼ−２／ｂａｘ相互作用）を予防または防止することが可能な分子、カスパーゼ−２に関係する疾患および損傷を治療するため、特には、（低酸素症−）虚血損傷を治療するために有用な医薬組成物に関する。
【００２６】
別の局面では、本発明は、カスパーゼ−２阻害剤およびニューロン細胞死においてカスパーゼ−２を阻害する／沈黙させる方法に関する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、カスパーゼ−２阻害剤は、カスパーゼ−２発現を低減させるまたは抑制するようにカスパーゼ−２ ｍＲＮＡを特異的にターゲットにすることが可能な単離された二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００２８】
本発明は、特にマウスおよびヒト起源の一次ニューロンまたはニューロン細胞系におけるカスパーゼ−２活性の低減または抑制に特に関する。
【００２９】
本発明はまた、前記阻害剤による、腫瘍細胞を含む非ニューロン細胞におけるカスパーゼ−２活性の低減または抑制に関する。
【００３０】
カスパーゼ−２発現を沈黙させるために用いられる二本鎖ＲＮＡ分子は、１５〜２５ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチドの相補鎖からなる二本鎖分子（duplex）である。好ましくは、鎖の終端部を小さく干渉している（interfering）と、分解に対して安定化される。
【００３１】
カスパーゼ−２のサイレンシングのための有利なｓｉＲＮＡは、相補的な配列番号１および配列番号２の二本鎖分子からなる。他の有利なｓｉＲＮＡは、相補的な配列番号６および配列番号７の二本鎖分子からなる。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、カスパーゼ−２阻害剤はｓｈＲＮＡである。このため、本発明は、細胞内、特にはニューロンおよび細胞系におけるカスパーゼ−２の細胞内（in cellula）サイレンシングにつながる、上記に定義されたｓｉＲＮＡの配列をベースとするあらゆるｓｈＲＮＡ構成体に関する。
【００３３】
好ましいｓｈＲＮＡ構築物（construct）は、配列番号１および配列番号２の両方または配列番号６および配列番号７の両方、配列番号８および配列番号９の両方、または配列番号１０および配列番号１１の両方の挿入断片を含む。
【００３４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、合成によって得られるかまたは細胞の二本鎖において生成される。
【００３５】
実施例によって説明されるように、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ遺伝子のノックダウンは、血清欠乏誘導性皮質ニューロン死を完全に予防する。
【００３６】
本発明はまた、各ＲＮＡ鎖の合成に関し、二重鎖分子を形成するこの鎖の組み合わせは、ｍＲＮＡ カスパーゼ−２を特異的にターゲットにすることが細胞内で可能である二本鎖分子を形成する。
【００３７】
合成されたＲＮＡ分子は、阻害性のカスパーゼ−２発現の条件下に、ヒトまたは動物またはヒト原細胞（human origin）に導入される。導入工程は、適切な担体を使用することを包含するか、または、注入によって行われる。
【００３８】
あるいは、前記ＲＮＡの発現についての遺伝情報を含むベクターが用いられる。このようなベクターも本発明の範囲内にある。
【００３９】
本発明の阻害剤は、アポトーシスまたはネクローシスまたはオートファジータイプいずれかの細胞死を阻止する。
【００４０】
本発明者らはまた、カスパーゼ−２が介在する細胞死をインビトロで減弱させる薬理学的（特定のペプチド（優先的ではあるが排他的ではないペンタペプチド）によるカスパーゼ−２活性の直接阻害）ツールを開発した。前記ツールは、米国仮係属出願に開示されている。
【００４１】
Ｂａｘ切断およびカスパーゼ−２活性は、血清欠乏によって死に誘導される皮質ニューロンにおいてミトコンドリア上流で起こり、カスパーゼ−２活性の阻害はＢａｘ切断の阻害を通じて生き残りにつながるので、この調節工程が、細胞を死に対して保護することが可能な新しい分子を開発するために本発明者らによって用いられた。
【００４２】
上記のように、本発明者らは、カスパーゼ−２依存性経路がインビトロのニューロン死およびインビボの脳卒中の急性モデルにおいて必要とされることを証明した。本発明者らは、広範なスペクトルのカスパーゼ阻害と比較して、カスパーゼ−２特異的阻害がインビボのニューロンを保護するのにより効果的であることも示した。実施例に示すように、カスパーゼ−２は、定酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）損傷を含むインビボの病的状況におけるニューロン細胞死（特にアポトーシス）を阻害するための上流の主要なチェックポイントである。
【００４３】
したがって、本発明は、配列番号５を有する分子を用いるカスパーゼ−２活性のインビトロ阻害に関する。本発明はまた、配列番号５を有する分子を用いるカスパーゼ−活性のインビボ阻害に関する。
【００４４】
特に、本発明は、Ｂａｘおよびカスパーゼ−２間の相互作用を妨害するか、または、カスパーゼ−２依存性Ｂａｘ切断を妨げることが可能な分子に関する。
【００４５】
好ましいペプチドは、配列番号（例えば配列番号１２〜２３）を含む３〜４０のアミノ酸の長さを有するＢａｘ配列から誘導される。特に好ましい配列は、下記を含む：
配列番号１２：ＫＴＧＡＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１３：ＧＡＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１４：ＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１５：ＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１６：ＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１７：ＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１８：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１９：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥ
配列番号２０：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡ
配列番号２１：ＩＱＤＲＡＧＲ
配列番号２２：ＩＱＤＲＡ
配列番号２３：ＩＱＤＲ
本発明はまた、Ｂａｘおよびカスパーゼ−２間の相互作用を妨害するか、または、カスパーゼ−２依存性Ｂａｘ切断を妨げることが可能であり、Ｎ末端またはＣ末端において、（特異的な認識に続くまたは続かないで）細胞に入りカスパーゼ−２およびＢａｘ間の相互作用を妨害することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性の分子と結合されたあらゆる分子を含む。
【００４６】
本発明はまた、Ｎ末端またはＣ末端において、（特異的な認識に続くまたは続かずに）細胞に入りアポトーシスを予防または治療するか、またはミトコンドリア保護性の細胞保護効果を提供することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性の分子と結合された分子を含む。
【００４７】
Ｂａｘおよびカスパーゼ−２間の相互作用を妨害することまたはカスパーゼ−２依存性Ｂａｘ切断を妨げることが可能な分子に由来する他のペプチド分子は、前記配列番号を含む３〜１０個のアミノ酸の長さを有し、該配列番号は、Ｎ末端またはＣ末端においてマーカー（例えば、蛍光発光性（ＡＭＣ、ＡＦＣ、ＰＥ．．．）、比色性（ｐＮＡ．．．）または生物発光性基質、放射性同位体．．．）と結合されている。
【００４８】
これは、特異的なカスパーゼ−２阻害剤を含む医薬組成物を提供するための本発明の別の目的である。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、治療上の有効量の、上記に定義された少なくとも１種のカスパーゼ−２阻害剤を、医薬上受容可能な担体（carrier）と共に含む。
【００５０】
本発明は、上記に定義されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を含む医薬組成物に特に関する。
【００５１】
本発明はまた、有効量の配列番号５を含む医薬組成物に関する。
【００５２】
医薬組成物は、有効量の、Ｂａｘおよびカスパーゼ−２の相互作用を妨害することまたはカスパーゼ−２依存性Ｂａｘの切断を妨げることが可能な少なくとも１種の分子、特には、上記に定義のＢａｘ配列から誘導されるペプチド、特には、配列番号１２〜配列番号２３の配列を有するものおよびそれらから誘導される分子を含む。
【００５３】
本発明による医薬組成物は、有利には、細胞死を低減させるために、経口、局所（例えば、大脳室内（intracerebroventicular）、化合物または医薬組成物で含浸されたゲルホーム（登録商標）の大脳内移植、機械的送達用器械の大脳内移植）または全身（例えば、腹膜組織内、静脈内．．．）投与による投与用に意図される。
【００５４】
ＲＮＡ二本鎖分子を含む阻害剤の投与は、有利には、ターゲット細胞内に核酸を導入するための古典的な方法に従って行われる。
【００５５】
カスパーゼ−２特異的阻害剤の腹膜組織内投与は、一時的な低酸素虚血脳損傷に付された子ラットでの梗塞サイズを大幅に低減させる。
【００５６】
前記医薬組成物は、低酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷を含む病的状態および卒中様状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）の治療に特に有用である。
【００５７】
それらはまた、大脳の低酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷を含む病的状態および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）の治療にとって非常に興味深い。
【００５８】
本発明の医薬組成物はまた、ニューロン死、特には全身性または病巣性（focal）Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）の治療に有用である。
【００５９】
それらはまた、特には成人または新生児のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療に特に有利である。
【００６０】
それらはまた、特には、一時的または恒常的Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療に用いられ得る。
【００６１】
前記医薬組成物はまた、特に、再灌流（reperfusion）状態を伴うまたは伴わない、Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態の脳損傷（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療に有用である。
【００６２】
それらは、特には中大脳動脈閉塞症（Middle Cerebral Artery Occlusion：ＭＣＡＯ）におけるニューロン死の治療に用いられ得る。
【００６３】
上記定義の医薬組成物は、特に、下記病的事象の少なくとも１つが併発される場合のニューロン死の治療にとって非常に興味深い：再灌流を伴うまたは伴わない大脳レベルまたは体全体のレベルでの、全身性または病巣性、一時的または恒常的、成人または新生児のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）。
【００６４】
本発明の医薬組成物の他の適用は、
・慢性変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症（Multiple sclerosis）、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、脊髄延髄萎縮症（spinobulbar atrophy）、プリオン病を含む神経変性疾患の際のアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・脊髄損傷の際のアポトーシスを予防および／または治療する、または、外傷性脳損傷（traumatic brain injury）の結果として生じるアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・ニューロン保護（neuroprotection）効果を提供する、または、
・脳保護効果を提供する、または、
・自己免疫疾患および移植拒絶反応に伴う、細胞毒性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞が介在するアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・心不全（heart failure）、心筋症（cardiomyopathy）、心臓のウイルス感染または細菌感染、心筋虚血、心筋梗塞（myocardial infarct）、および心筋虚血、冠動脈バイパス移植（coronary artery bypass graft）を含む心臓細胞の細胞死を予防する、または、
・例えば化学療法またはＨＩＶ治療の結果としてのミトコンドリアの薬物毒性を予防および／または治療する、または、
・ウイルス感染または細菌感染の際の細胞死を予防する、または、
・炎症または炎症性疾患、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）、敗血症（sepsis）および敗血症性ショックを予防および／または治療する、または、
・卵胞（follicule）から卵母細胞（ovocyte）への段階、卵母細胞から成熟卵への段階および精子の細胞死を予防する（例えば、卵巣組織、人工授精卵を凍結させおよび移植する方法）、または、
・化学療法後の女性および男性の受精能力を保護する、または、
・雌および雄の動物の受精能力を保護する、または、
・黄斑変性（macular degenerescence）および緑内障（glaucoma）を予防および／または治療する、または、急性肝炎（acute hepatitis）、慢性活動性肝炎（chronic active hepatitis）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を予防および／または治療する、または、
・男性型禿頭症（male-pattern baldness）、放射線、化学療法または環境上のストレスに起因する髪の喪失を予防する、または
・（高レベルの放射線への露出、熱、火傷、化学薬品、太陽および自己免疫疾患に起因する）皮膚の損傷を治療または改善する、または、
・脊髄形成異常性症候群（myelodysplastic symdrome：ＭＤＳ）における骨髄細胞の細胞死を予防する、または、
・膵臓炎（pancreatitis）を治療する、または、
・呼吸器系症候群（respiratory symdrome）を治療する、または、
・骨関節炎（osteoarthitis）、変形関節炎（rheumatoid arthritis）、乾癬（psoriasis）、糸球体腎炎（glomerulonephritis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）移植片対被移植体の疾患（graft versus host disease）を治療する、または、
・網膜周皮細胞（retinal pericyte）のアポトーシス、網膜ニューロンアポトーシス緑内障、虚血の結果として生じる網膜損傷、糖尿病性網膜症を治療する、または、
・アポトーシスの増加と関係する疾病状態を治療する、または、
・植物（例えば、草木、草花、葉状植物（キノコ、海草）．．．）の細胞死を予防する
ためのそれらの使用を含む。
【００６５】
さらに別の局面によると、本発明は、インビトロで細胞死を阻止または予防する、または、細胞死、特にアポトーシスに対して治療のために分子をスクリーニングする工程を包含する方法に関する。
【００６６】
本発明の他の特徴および利点は、以下のデータにおいて、図面を参照しながら与えられる。
【００６７】
実施例１
チェックポイントを識別する方法；固定時間および実時間のサイトフローメトリーによるニューロンのアポトーシスのマルチパラメトリックでかつダイナミックな分析
最近になるまで、ニューロン細胞のアポトーシスおよびネクローシスは、主として、２タイプのアプローチによって調査されていた：第１の群の（生化学的）技術は、一般的には、ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の比色評価（ＭＴＴアッセイ）または乳酸デヒドロゲナーゼ活性の細胞外放出（ＬＤＨアッセイ）（Johnson,1995）によりニューロン死の末期の事象を評価する。これらの型どおりのモノパラメトリックな定量技術は、細胞死の機構に関する情報を与えず、他の生化学過程の検出に結び付けられ得ない。より最近になって、いくつかのニューロンに適合する細胞分画プロトコルが、免疫ブロット法によるシトクロムｃ転座および蛍光発生基質を用いるカスパーゼ活性化の生化学評価について発表された（EthellおよびGreen,2002）。このような最近の方法は、ニューロン個体群に関する半定量的な情報を与えるが、マルチパラメトリックでかつ実時間の分析を除外する。第２の群の技術は、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）の読み出しを用いて、オルガネラの改変またはアポトーシスが関連するタンパク質を検出する。これらのＦＭ研究のうちの大部分は、クロマチン形態の視覚化（ヘキスト（登録商標）染色）および／またはＤＮＡ断片化の生化学的検出（ＴＵＮＥＬアッセイ）を含む末期の核変化に焦点が当てられる。ニューロンに関する最新のＦＭ研究では、（固定された細胞における）シトクロムｃの免疫局在性（immunolocalization）が報告されたが、細胞生物学の他の領域とは対照的に、ミトコンドリア変化およびカスパーゼ活性化の現場内検出を用いたニューロンに関する研究数は制限される。培養された一次ニューロンに適用される場合、ＦＭベースの分析は、時間を消費しかつ面倒であり、定量化は、細胞体の凝集物および重畳している神経突起のネットワークによって妨げられる。さらに、高感度の蛍光プローブのフォトブリーチングは、劇的なミスリーディング解釈につながり得、かつ、早期の死が関連する事象の実時間の追跡調査を除外することがあり得る。このため、現在知られるところでは、キーとなるアポトーシス事象の細胞生物学の特徴は、一次ニューロンにおいて十分に証明されたわけでも秩序立てられたわけでもなかった。
【００６８】
フローサイトメトリー（ＦＣ）は広範囲の用途を提供し、細胞生物学およびアポトーシスのための主要なツールとなった。一次血球（primary blood cell）および癌細胞系に広く適用されているが、この技術は、神経科学においては著しくは活用されないままであり、概して、固定細胞における末期のＤＮＡ含有量の損失を証明するために制限されていた（Yanら,1999;FallおよびBennet,1999）。適切なフローサイトメトリーの適用がないのは、おそらく、必要とされる基質からのニューロンの分離が形質膜の完全性を改変し、神経突起を壊し、かつ／または、アノイキス（anoikis）の引き金となり得、このために、アポトーシスの信頼性のある分析を妨げるという仮定に起因する。これらの（ニューロンに）特異的な制限を克服するために、ニューロンの完全性を維持し、かつ、それらの神経突起を高比率で保持する一次ニューロンの非侵襲性分離のための簡単なトリプシン処理法を用いた。そして、定量的ＦＣを詳細なＦＭ分析に結び付け、アポトーシスの決定（decision）、実行（effector）、早期および末期分解期の同時検出を可能にする方法を開発した。選択された蛍光（生命に係わる（vital））プローブを用いると、この二重読み出しによって、トリプシン処理の前（ＦＭによる）および後（ＦＣによる）に、ミトコンドリアの膜電位（transmembrane potential）（ΔΨ_ｍ）の状態、現場内でのカスパーゼ活性化、ホスファチジルセリン残渣の表面露出および形質膜の完全性の損失を検出することができる。
【００６９】
血清欠乏により死に誘導されたマウスの一次皮質ニューロンをシステムモデルとして用いると、ＦＣがＦＭと単に調和するだけではなく、ニューロンのアポトーシスの事象の年代順を確立するための迅速、高感度かつ定量的な技術でもあることが証明される。さらに、ＦＣ分析の領域は、ミトコンドリア活性化合物の添加後数分内の早期のニューロンのΔΨ_ｍ改変および形質膜透過性（plasma membrane permeabilization：ＰＭＰ）の革新的な実時間モニタリングに広げられる。固定時間および実時間の両方のＦＣにより、ＦＭの制限を克服することが可能になり、ニューロンアポトーシスの細胞生物学を証明および開発する助けになるだろう。
【００７０】
（生存するまたは死滅した一次ニューロンの細胞蛍光強度分析）
グルコース、ウマ血清およびウシ胎仔血清の混合物を含有するアドホック（ad hoc）培地においてポリエチレンイミンでコーティングされたウェル上で培養された場合、生後１４日胎児マウスから単離された一次皮質ニューロンは、１０日を超えて生存した状態で維持され得る（KawamotoおよびBarrett,1986）。
【００７１】
これらの実験条件において、クロマチン凝縮（ヘキスト（登録商標）３３３４２；青色蛍光）および細胞不透過蛍光ＤＮＡインターカレート性の７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いる形質膜の完全性（赤色蛍光）の両方の蛍光顕微鏡法（ＦＭ）評価は、血清欠乏により、培養されたニューロンの形質膜が徐々に透過性（ＰＭＰ）に至ることを示す（図１Ａ）。このＰＭＰは、クロマチン凝縮および神経突起の解体を伴う収縮したニューロンにおいてのみ起こるので、後アポトーシス事象である（図１Ａ）。対照的に、一次的なＰＭＰ（すなわち、ネクローシス）が低濃度のトリトンによって誘導される場合、細胞収縮もクロマチン凝縮も検出されないが（位相差およびヘキスト（登録商標）蛍光）、７−ＡＡＤは、ニューロンに迅速に入り、核をラベリングする（図１Ｂ）。細胞死の間のあらゆる選択された時間において明白なニューロン収縮およびＰＭＰを定量化するために、７−ＡＡＤによる染色および非毒性のCellTracker（登録商標）緑色蛍光染料の安定なニューロン保持の両方を欠く場合に匹敵するニューロンの完全性を維持することを可能にするトリプシン処理の条件が確立された（図１Ｂ、Ｃ）。このため、ニューロンは、最初に、それらの基質上でラベリングされ、かつＦＭによって観察され、第２に、安全にトリプシン処理され、そして、第３に、直後に、フローサイトメトリー（ＦＣ）分析に付され得る（図１Ｄ−Ｇ）。対照サンプルでの完全な７−ＡＡＤ陰性（トリプシン処理された）ニューロン（８８．４％±７．６）と比べて、２４時間の血清欠乏ニューロンの４７．１％（±１８．１）が、ＰＭＰ（７−ＡＡＤ＋）を示し、トリプシン処理前の顕微鏡観察および計数と相関している（図１Ｅ−Ｇ）。
【００７２】
（アポトーシスの一次皮質ニューロンにおける分解および実行期の検出）
ＦＭベースのＰＭＰ（７−ＡＡＤ染色）およびアポトーシスが関連するホスファチジル−セリン（ＰＳ）露出（ＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ；緑色蛍光）の同時検出は、血清欠乏ニューロンでは３の細胞群：７−ＡＡＤおよびＦＩＴＣ−アネキシンＶ染色の両方を有するサブセット（サブセット２；図２Ａ）、７−ＡＡＤ染色（サブセット３）またはＦＩＴＣ−アネキシンＶ染色（サブセット１）のいずれかを有する２つのサブセットが出現することを示す。同一のサブセットはまた、トリプシン処理後にＦＣにより検出され、速度論追跡調査は、サブセット１は、サブセット２より先に起こり、このサブセット２は、サブセット３より先に起こることを示し（図２Ｂ、Ｃ）、この結果、ＰＳ露出はＰＭＰの前に起こるという結論に至る。最初の検出可能な核事象は、ニューロンサイズの改変より先に起こるらしい相当連続的な核縮小（境界部（perimeter））である（図２Ｄ、Ｅ）。このニューロンのＦＣ固定時間分析は、カスパーゼ活性化に広げられ得る（図３）。実際に、緑色蛍光ラベルされたカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＣＡ、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）を用いるカスパーゼ−３様活性およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ染色）の現場内の同時検出はＦＭ（トリプシン処理前）およびＦＣ（トリプシン処理後）と同様の結果を与え、カスパーゼ−３様活性がＰＭＰ前に検出可能であることを示す（図３Ａ、Ｂ）。同様の結果は、ＦＬＩＣＡベースのカスパーゼ−３活性の検出が、現場内の抗体ベースの活性化されたカスパーゼ−３の検出によって置き換えられた場合に観察される（不図示）。血清欠乏の開始時にニューロンに加えられた場合、新しい広スペクトルのカスパーゼ阻害剤であるキノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）（Melnikovら,2002）およびミトコンドリア・アデニンヌクレオチド・トランスロケータ（ＡＮＴ）阻害剤であるボンクレキン酸（ＢＡ）の両方は、カスパーゼ活性化、ＰＭＰおよび核アポトーシスを強く妨げる（図３Ｃ、Ｄ）。ＦＣ定量化は、汎（pan）セリン・プロテアーゼ阻害剤である４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル フルオリド（ＡＥＢＳＦ，ペファブロック）とは対照的に、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨが、血清欠乏によって誘導されるカスパーゼ様活性の９５．３±５．６％およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ）の９３．９±３．８％を阻害することを示す（図３Ｄ）。些細でない問題は、所与の細胞死モデルにおいて、カスパーゼ活性化およびＰＳ露出間の階層性を測定することである。スルホロダミン（sulforhodamine）結合型ＦＬＩＣＡ（赤色蛍光）を用いるカスパーゼ−３様活性およびＦＩＴＣ−アネキシンＶを用いるＰＳ露出（緑色蛍光）の現場内ＦＭ（トリプシン処理前）およびＦＣ（トリプシン処理後）同時検出は一致し、血清欠乏後、カスパーゼ−３活性は一次ニューロンにおいてＰＳ露出より先に起こることを立証する（図３Ｅ、Ｆ）。ＦＭによるクロマチン状態（ヘキスト（登録商標）；青色蛍光）の同時の分析は、早期のカスパーゼ−３活性が一時的に核凝縮の第１の段階（Susinらの分類による段階I;Susinら,1999）に関係することを示したが、最終の別々のアポトーシス体への核断片化（段階II形態,Susinら,1999）はＰＳ露出の開始後に起こることに留意されるべきである（図３Ｅ、４Ｅ）。興味深いことに、基準となる汎カスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびより特定されたカスパーゼ−３様阻害剤であるｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋの両方は、カスパーゼ−３活性化を強く阻害するが、ニューロンのアポトーシスの分解期（すなわち、PS露出、核凝縮およびPMP）を阻害せず（図３Ｄ）、このため、これは、カスパーゼ−３が関連する活性は、これらの実験条件におけるニューロン死にとって必須でないことを示す。これに対して、カスパーゼ−９阻害剤であるｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋの存在下または不存在下でのクロマチン状態（ヘキスト（登録商標））および緑色蛍光ラベルされたカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＣＡ，ＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）を用いるカスパーゼ−９様活性の現場内同時検出は、カスパーゼ−９様活性の破壊が核アポトーシスの中間表現型につながり、ここでは、大抵の核が核凝縮の第１工程（段階Ｉ；図３Ｇ）に抑えられることを示す。さらに、ＦＭおよびＦＣ分析の両方は一致してカスパーゼ−９阻害は、ＰＳ露出およびＰＭＰを廃止することを示す（図３Ｇ、Ｈ）。このため、ＢＡがカスパーゼ−９様活性化を妨げる（図３Ｈ）ので、二重の読み出しアプローチは、この実験モデルにおけるカスパーゼ−９の実行ポイントがミトコンドリアの下流かつＰＳ露出および段階ＩＩの核アポトーシスの上流にあることを強く示唆する。
【００７３】
（ニューロンのアポトーシスのミトコンドリア／決定期の検出）
ＦＭ分析によって続けられる培養された一次ニューロンのΔΨ_ｍ高感度染料ＪＣ−１による染色は、徐々にΔΨ_ｍが損失することを示す。このため、血清欠乏前には、ニューロンからのミトコンドリアは、高ΔΨ_ｍ（オレンジ色のＪＣ−１蛍光；図４Ａ）を持つが、これに対して、８〜２４時間の血清欠乏がなされたニューロンからのミトコンドリアは、低ΔΨ_ｍ（緑色のＪＣ−１蛍光；図４Ａ）を有する。ΔΨ_ｍ損失は、明確な地理的階層性を全く示すことなく不均一に進行し、同一のニューロンにおいて不均一性が検出可能である一過性の中間表現型を生じさせた（図４Ａ；Ｄｅｃ）。これは、少なくともこの実験系では同時の調和されたΔΨ_ｍはなく、むしろ、崩壊シグナルがミトコンドリアからミトコンドリアへ徐々に伝わったことを示唆する。ヘキスト（登録商標）染色によって観察されるような核アポトーシスのあらゆる徴候の前に完全なΔΨ_ｍ崩壊が観察される（図４Ａ；青色蛍光）。予想されるように、ＦＭおよびＦＣベースのΔΨ_ｍ損失（ＪＣ−１）およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ染色）の同時定量化は一致して血清欠乏ニューロンではΔΨ_ｍ損失がＢＡによって阻害され、ＰＭＰより先に起こることを立証する（図４Ｂ−Ｅ）。（ΔΨ_ｍ高感度染料ＣＭＸ−Ｒｏｓを用いる）ΔΨ_ｍおよびカスパーゼ−３様活性（ＦＬＩＣＡ，ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）の同時検出をベースとする速度論実験は、ΔΨ_ｍ損失はカスパーゼ−３活性化より先に起こることを示唆する（不図示）。したがって、カスパーゼ活性のｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋによる阻害は、ＳＤ誘導ΔΨ_ｍ損失に関して効果を持たない（図４Ｅ）。
【００７４】
（ΔΨ_ｍの実時間検出）
ニューロンのアポトーシスにおけるミトコンドリアの早期の関与は、薬物曝露に対する迅速なΔΨ_ｍ応答のモニタリングを必要とする。ΔΨ_ｍのＦＭによる実時間検出は分析を歪曲し得る。繰り返しの取得が（ＪＣ−１オレンジ色蛍光の降下として検出される）プローブの劇的なフォトブリーチングを引き起こし、これは、アポトーシス関連のΔΨ_ｍ損失に誤って帰し得るからである（図５Ａ、Ｂ）。この機械的な欠点を解決するために、実時間ＦＣアプローチが開発された。この実時間ＦＣアプローチでは、固定時間ＦＣプロトコルとは対照的に、ニューロンは、最初にトリプシン処理され、第２に、経時的にΔΨ_ｍ（ＪＣ−１）およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ）を検出するようにラベリングされる（図５Ｃ）。これらの条件では、ＦＭ観察は、トリプシン処理されたニューロンがＰＭＰを提示せず、３時間に至るまで高ΔΨ_ｍを維持することを明らかにする（図５Ｃ）。トリプシン処理後の最初の５時間の間アノイキスの徴候が検出可能でないことに留意されるべきである。２０分間にわたるＦＣ記録は、トリプシン処理されたニューロンが依然として安定な高いΔΨ_ｍを有し、７−ＡＡＤに対して不透過である、すなわち、完全な形質膜を維持することを確認する（図５Ｄ２−３）。呼吸鎖脱共役剤（respiratory chain uncoupler）であるカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ｍＣｌＣＣＰ）の非トリプシン処理ニューロンへの添加は、ΔΨ_ｍ崩壊を誘導する（図５Ｄ−１）。実時間ＦＣモニタリングは、ｍＣｌＣＣＰによる処理の２分後でニューロン個体群のΔΨ_ｍ損失が最大であることを明らかにする（図５Ｄ−２，３）。ミトコンドリア毒素である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）により処理された非トリプシン処理ニューロン培養のＰＭＰ（７−ＡＡＤ）およびΔΨ_ｍ（ＪＣ−１）のＦＭ同時検出は、４５分後に大抵のニューロンが低ΔΨ_ｍであるがＰＭＰの徴候が全くないことを示す（図６Ａ−１）。対照的に、一酸化窒素誘発物質ＳＮＰにより処理されたまたは処理されない皮質ニューロンは、高いΔΨ_ｍを維持する（図６）。予想されるように、エタノールは、培養されたニューロンにおける大規模な７−ＡＡＤの組み込みに匹敵するような迅速なＰＭＰを誘導する（図６Ａ−１）。実時間ＦＣが皮質ニューロンのＰＭＰ、ΔΨ_ｍ、細胞サイズおよび粒状度の同時評価に適用される場合、この技術は、１５分後に、ＭＰＴＰ処理ニューロンの４９．６％（±８．２；ｎ＝４）が低ΔΨ_ｍであり、これに対して、未処理ニューロンの１６．２％（±１．２）および１５．０％（±６．２）のＳＮＰ処理ニューロンが低ΔΨ_ｍであることを示す。実時間ＦＣは、ＭＰＴＰおよびＳＮＰとは対照的に、エタノール処理が一次的なネクローシスを誘導することを明らかにする。実際に、エタノールは、非常に迅速なＰＭＰ（５分後に９８％）の引き金となり、これは、ΔΨ_ｍ損失（５分後に７５％）より先に起こる（図６）。興味深いことに、ＭＰＴＰ誘導ΔΨ損失は、不均一である。これは、迅速なΔΨ_ｍ降下を経るニューロンが大きな粒状度増大を示し、これに対して、わずかなΔΨ_ｍ減少を経るニューロンは、形態学上の改変を示さないからである（図６）。
【００７５】
要約すると、これらの結果は、実時間ＦＣ分析が、ニューロン単位を基礎とする短期間のＰＭＰ事象およびΔΨ_ｍ改変を定量的に追跡するための簡単なアプローチであることを示す。
【００７６】
血清欠乏マウスの一次皮質ニューロンをシステムモデルとして用いると、次のことが示される：１）ニューロンサンプルがアポトーシス関連プローブによりマルチラベリングされ、続いて、ＦＭによって分析され、それらの支持体から安全に分離され、固定化なしでＦＣによって定量的に研究され得る、２）この二重読み出し方法により得られる速度論および薬理学的情報により、ニューロンアポトーシスの主要な期（決定、実行および分解）を記載し、かつこれを明白に秩序立てることが可能になる、３）ニューロンはまた、最初に、それらの支持体から分離され、次いで、活力のあるプローブによりラベリングされ、そして、実時間ＦＣによって３時間にわたり分析され得、これにより、一次的ネクローシス（すなわち、ＰＭＰがΔΨ_ｍ損失より先に起こる場合）と所与の刺激に対するアポトーシス関連の細胞応答との間の区別を含むニューロン死の短期間の事象を評価する可能性を提供する。
【００７７】
ＦＣは、いくつかの特有の利点を提供する（表１）。第１に、培養中のニューロンの凝集の当初レベルがどうであれ、ＦＣは、大多数のニューロン（この研究ではサンプル当たり４０，０００）に関するアポトーシスおよび関連する事象の典型的な定量化を迅速に得ることを可能にする。第２に、ＦＣは、蛍光が低レベルであり、ＦＭによってほとんど明示され得なかった細胞内プローブを検出し得る。この利点は、電荷結合デバイス（charge coupled device：ＣＣＤ）カメラ（ＦＭ）と比較して、弱い蛍光細胞を識別するためのサイトメータ光電子増倍管（cytometer photomultiplier tube）（ＦＣ）のより良好な能力に原因があるとし得る。第３に、ＦＣはまた、プローブフォトブリーチング（ＪＣ−１によるΔΨ_ｍ検出のような場合）、長い過剰蛍光照射（epifluorescence illumination）および／または輻射熱（photothermal）効果によって誘発される細胞損傷を含むＦＭ観察の間の古典的に誘発される問題を解決する。例えば、ＦＭ（５ワット，多色波長）に比較して弱いニューロン照射（１５ミリワット，単色波長）およびレーザビームを通しての極度に短い（かつ唯一の）細胞通過のため、ＪＣ−１フォトブリーチングはＦＣにより最小限である。第４に、実時間ＦＣは、あらゆる神経活性薬物の添加に続く非常に短い期間の形質膜およびミトコンドリア内膜の改変の数分内の定量分析を是認する。第５に、マルチパラメトリックな分析が、１４の別個のパラメータまで調査し得るより強力なサイトメータの使用によって拡大され得る。
【００７８】
ＳＤニューロンが、下記のルール（図７）に従うアポトーシス過程を経ることも立証される。第１に、ＳＤニューロンは、ＡＮＴが関連する依存性の過程を通じてΔΨ_ｍ消失の徴候を表す。第２に、ΔΨｍ消失がカスパーゼ３およびカスパーゼ９の上流で発生する。第３に、ＰＳ露出および完全な核凝縮（段階ＩＩ）がカスパーゼ−９様活性の下流にあるが、カスパーゼ−３様活性に依存しない。逆説的には、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ処理された２４時間ＳＤ−ニューロンは、カスパーゼ−３様活性を示さないが、ＰＳ露出、段階ＩＩの核アポトーシスおよび最終的なＰＭＰを経、これに対して、全てのこの事象は、第３世代の汎カスパーゼ阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰＨによって完全に阻止される。したがって、上記結果は、血清抜き出しによって誘導されるアポトーシス中に一次皮質ニューロンにおいて活性化される通常でないミトコンドリア依存性カスパーゼ経路を明らかにする。
【００７９】
この細胞蛍光強度（cytofluorometric）技術はまた、セラミド、β−アミロイドペプチド、３−ニトロプロピオン酸、グルタミン酸塩およびウイルスタンパク質を含む他の刺激物に応答するニューロンのアポトーシスの動力学を調査するために用いられる。分析はまた、ニューロンのアポトーシスに伴われる他のカスパーゼの活性化を検出するように拡張された。これらの細胞蛍光強度分析はまた、未だ乏しくしか知られていないタイプの死、例えば、サブスタンスＰによって処理された皮質、線条体（striatal）および海馬（hippocampal）の一次ニューロンの非アポトーシスの形態のプログラム死のより良好な特色付けを可能にし得、かつ、両方が共存するモデル、例えば虚血傷害においてネクローシス様の死およびアポトーシスを区別することを可能にする。
【００８０】
したがって、本発明により開発された技術は、ニューロンアポトーシスの細胞生物学を調査するために強力であり、ニューロン毒およびニューロン保護化合物のスクリーニングおよび特色付けのためのマルチパラメトリックな定量的ツールを提供する。
【００８１】
（実験手順）
（皮質ニューロンの単離および培養）
一次皮質ニューロンは、生後１４日胎児スイスマウス（Janvier,Le Genest-Sr-Isle,フランス）の新皮質（neocortices）から単離された。ニューロンは、５％のウマ血清（HS,Eurobio）および２．５％のウシ胎仔血清（FCS,Eurobio）により補充された５００μｌのイーグルの基本培地（EBM,Eurobio,Les Ulis,フランス）中にｃｍ^２当たり７×１０^５の生細胞の密度で、２４ウェルプレート（sarstede,Orsay，フランス）またはポリエチレンイミン（PEI,1mg/mL,Sigma,St Quentin Fallavier,フランス）によりコーティングされたLab-Tek（登録商標）カバーグラスチェンバー（chambered coverglass）（Nalge Nunc International,Naperville,IL,米国）上に塗布された。２日後、培地が、１８０ｍｇ／Ｌのグルコース、５％のＨＳおよび１％のＦＣＳおよび３μＭのシトシン β−Ｄ−アラビノフラノシド（Ara C,Sigma）および１μＭの５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾシクロヘプテン−５，１０−イミン マレイン酸塩（MK-801,Research Biochemicals International）（Knuselら,1990）を含有するＮ５培地（KawamotoおよびBarrett,1986）により交換され、毎日変えられた。アポトーシスは、５日齢培養において血清抜き出しによって誘導された（Macleodら,2001）。培養の純度（＞９５％）は、抗微小管結合タンパク質（anti-Microtubule Associated Protein）２モノクローナル抗体（MAP-2,Sigma）および抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（anti-Glial Fibrillary Acidic Protein）ポリクローナル抗体（GEAP,Dako）により評価された。
【００８２】
（皮質ニューロンのトリプシン処理）
血清不含有Ｎ５培地での１回の注意深い洗浄および２５０μｌの３７℃トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco BRL，英国）による１５分にわたる３７℃でのインキュベーション後にニューロンの酵素分離が行われた。細胞分離は、１０００μｌのチップ（tip）（Gilson）を用いる５回の丁寧な洗い流しによって行われた。残りのニューロン凝集体は、２００μｌチップを通じて１０回の５００μｌのＮ５培地での注意深い洗い流しによって分離された。トリプシン処理手順の確認のために、付着性のニューロンが１０μＭのCelltracker Green（登録商標）（Molecular Probes,Eugene,OR）によって１５分にわたり３７℃で染色され、Ｎ５培地で洗浄され、そして、トリプシン処理に付された。ニューロン分析は、フローサイトメトリー（ＦＬ−１チャネル）および顕微鏡法（励起のためにＢＰ ４８０／４０および発光のためにＢＰ ５２７／３０）によって行われた。トリトンＸ−１００（Sigma）処理（０．０２％）が形質膜崩壊についての陽性対照として用いられた。
【００８３】
（器械）
蛍光標示式細胞分取（Fluorescence-Activated Cell Sorting）が、１５ｍＷの空冷４８８ｎｍアルゴンレーザを備えた３色FACSCaliburサイトメータ（Becton Dickinson,San Jose,CA）を用いて行われた。各サンプルについて、４０，０００のニューロンからのデータが登録され、CellQuest Pro（登録商標）ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析された。サンプルの流量は、実時間分析のために１２μｌ±３μｌ／分に、固定時間実験のために６０μｌ±３μｌ／分に設定された。蛍光顕微鏡法（ＦＭ）は、１００Ｗの水銀ショートアークランプおよびa×40 N PLAN L対物レンズまたは水浸 × 100N PLAN対物レンズ（Leica,Wetzlar，ドイツ）を備えたDM IRB挿入型蛍光顕微鏡（Leica,Rueil-Malmaison，フランス）を用いて行われた。写真は、ＣＣＤカラーカメラ（Leica DC 300F,Leica,フランス）により１３００×１０３０画素の分解能で取得され、Leica QFluoroソフトウェア（Leica,Microsystem AG，スイス）によって制御された。データは、Leica QFluoroソフトウェアを用いて行われるIM1000ソフトウェア（Leica Microsystem AG）によるオフライン分析のために保存された。
【００８４】
（７−アミノアクチノマイシンＤの取り込みを通じてのアポトーシスの分解期の検出）
形質膜の完全性の損失は、７−アミノアクチノマイシンＤ（7-AAD,Sigma)に対する上昇した透過性を通じて検出された(Schmidら,1992;Carpenterら,1997;Lecoeurら,2002）。２０μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤが培養されたニューロンに１５分にわたり３７℃で加えられた。ＦＭ分析がＢＰ ５１５−５６０フィルタを用いる１００ｍｓの励起を通じて行われ、７−ＡＡＤ蛍光がＬＰ ５９０ロングパスフィルタを通じて検出された。細胞は、トリプシン処理され、その直後に、フローサイトメータ（Ｆ１−３チャネル，λ＞６５０ｎｍ，ＰＭＴ＝３３３）上で分析された。アポトーシス体／残さは、懸濁液での細胞生育について記載されたように分析から廃棄された（Lecoeurら,1997）。
【００８５】
（ＦＩＴＣアネキシンＶおよび７−ＡＡＤを用いる早期および末期の分解期の検出）
形質膜の外層へのホスファチジルセリン露出（ＰＳ）は、ＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ（アポトーシス検出キット，R&D System）の固定を通じて検出された。２０μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤおよび１Ｘ アネキシンＶが、２００μｌのＣａ^２＋豊富緩衝液（アポトーシス検出キット）に２０分にわたり室温で加えられた。ＦＭ実験のために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣが、ＢＰ ４８０／４０フィルターを通じて励起され、放射光は、ＢＰ５２７／３０フィルターを用いて集められた。ＦＩＴＣ−アネキシンＶ蛍光のＦＣ検出は、Ｆ１−１チャネル（５３０±１５ｎｍ）で行われ、リニアアンプモード（linear amplifier mode）で分析された（ＰＭＴボルト＝８６７，増幅ゲイン＝９．００）。スペクトルのオーバーラップは、以下のように補償回路網（compensation network）を調整することによって回避された：ＦＬ２−２２．９％ ＦＬ１およびＦＬ２−４１．７％ ＦＬ３。
【００８６】
（ＦＬＩＣＡ、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤを用いる実行および分解期の組み合わせ検出）
活性化されたカスパーゼ−３およびカスパーゼ９は、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫおよびＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（両者とも蛍光ラベリングされたカスパーゼ阻害剤（Fluorochrome Labeled Inhibitors of Caspase：ＦＬＩＣＡ）である）（CaspaTag(登録商標)フルオレセインカスパーゼ活性キット，Intergen,NY)を用いて検出された(Lecoeurら,2002;Smolewskiら,2002)。ニューロンは、ＦＬＩＣＡのＤＭＳＯ貯蔵液の１／１５０により１時間にわたり３７℃でインキュベートされた。最後の１５分の間に７−ＡＡＤおよびヘキスト（登録商標）が加えられた。その後、ニューロンは、洗浄バッファ（CaspaTag（登録商標）キット）で３回洗浄された。ＦＭ画像化のために、ＦＬＩＣＡがＢＰ ４８０／４０フィルタを通じて励起され、放射光は、ＢＰ ５２７／３０フィルタを通じて集められた。ＦＣ分析のために、ＦＬＩＣＡ蛍光は、Ｆ１−１チャネルを通じて集められた（ＰＭＴボルト＝５０１、補償回路網：ＦＬ１−７．８％ ＦＬ２，ＦＬ２−４０．８％ ＦＬ１およびＦＬ２−４５．４％ ＦＬ３）。切断されたカスパーゼ−３は、フィコエリトリン（phycoerythriｎ：ＰＥ）結合型ポリクローナル抗体（Beckton Dickinson）を用いる免疫検出（immunodetection）によって細胞内（in cellula）明示された。ニューロンは、７−ＡＡＤによって染色され、トリプシン処理され、そして、１％のＰＦＡおよび２０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡＤ）を含むＰＢＳに２０分にわたり固定された。その後、ニューロンは、１００μＭのＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌのＡＤ、０．０５％のサポニンキラヤバーク（Quillqja bark）（Sigma）および２０μｌの抗カスパーゼ−３抗体に３０分にわたり室温で再懸濁させられた（Lecoerら,2001）。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＥが関連する蛍光がサイトメータ（Ｆ１−２チャネル）を用いて分析された。Ｚ−ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ｆｍｋ，ＩＣＮ）およびＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（Ｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ）（全てICN（Orsay，フランス）から購入された）および４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル フルオリド（AEBSF,Pefabloc SC,Roche,Meylan，フランス）が１００μＭで血清欠乏の当初に加えられた。スルホロダミン−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（CaspaTag(登録商標)Red Activity Kit）により、活性化されたカスパーゼ−３およびＦＩＴＣ−アネキシンＶを検出することができた。ニューロンは、ＦＬＩＣＡのＤＭＳＯ貯蔵液の１／９００および２００μｌのアネキシンバッファ中の１Ｘ ＦＩＴＣ−アネキシンＶにより３０分にわたり３７℃でインキュベートされた。その後、ニューロンは、５０％の洗浄バッファおよび５０％のアネキシンバッファからなるバッファで３回洗浄された。カスパーゼ−３活性は、Ｆ１−２チャネルにおいて検出された（５８５±２１ｎｍ）。ＦＭのために、ＦＬＩＣＡがＢＰ５１５−５６０フィルタを通じて励起され、その蛍光が、ＬＰ５９０ロングパス発光フィルタを通じて集められた。
【００８７】
（ＪＣ−１および７−ＡＡＤを用いるアポトーシスの決定期の固定時間検出）
ミトコンドリアの膜電位（ΔΨ_ｍ）は、５，５’−６，６’−テトラクロロ−１，１，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾール カルボシアニド ヨージド（JC-1,Molecular Probes,Eugene,OR）の取り込みによって評価された。ニューロンは、１μＭのＪＣ−１および７−ＡＡＤにより１５分にわたり３７℃で同時染色された。ＪＣ−１モノマーが、ＦＣによってＦ１−１チャネル（ＰＭＴボルト＝６４４）において検出された。Ｊ−凝集体は、Ｆ１−２チャネルを通じて検出された（ＰＭＴボルト＝４５１）（Reersら,1991）。７−ＡＡＤ検出についてのＰＭＴボルトは３２６であった。補償回路網：ＦＬ１−０．０％ ＦＬ２、ＦＬ２−２２．９％ ＦＬ１、ＦＬ２−４１．７％ ＦＬ３およびＦＬ３−０．７％ ＦＬ２。ＦＭ分析のために、緑色およびオレンジ色の蛍光が、１．２ｓの励起（ＢＰ ４５０−４９０励起／ＬＰ ５１５ロングパス発光フィルタ）後に同時に記録された。フォトブリーチングは、Ｎ２０濃度フィルタ（neutral density filter）による当初の入射光の５％までの照射の減衰によって回避された。ボンクレキン酸（BIOMOL,）が２５μＭで試験された。
【００８８】
（ミトコンドリア膜電位ΔΨ_ｍおよびニューロンの形態の実時間検出）
実時間実験が５日齢の培養ニューロンについてトリプシン処理直後に行われた。ニューロンは、Ｎ５培地に再懸濁させられ、０．７×１０^６細胞／ｍｌに調整され、そして、８００ｎＭのＪＣ−１により１５分にわたり３７℃で負荷がかけられた。次いで、サンプルは、Ｎ５培地で１／８に希釈され、２０μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤが加えられた。基礎形態およびΔΨ_ｍおよび膜透過性が５分にわたり記録され、薬物；１００μＭのカルボニル シアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ｍＣｌＣＣＰ，Sigma）、１μＭの１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ，Sigma）および０．６μＭのニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ，Sigma）が加えられた。ＭＰＴＰは、ミトコンドリア複合体Ｉ毒物であり、インビボでマウスおよび霊長類にパーキソニズムを再現するために用いられるアポトーシス誘発物質である（Speciale,2002）。全パラメータの変動が続く１５分にわたり記録された。マイクロソフトのエクセルソフトウェアを用いて曲線が描かれた。
【００８９】
（ヘキスト（登録商標）３３３４２による核染色および核の境界の測定）
ニューロンは、１５分にわたり１μＭのヘキスト（登録商標）３３３４２（ヘキスト（登録商標）３４２，Sigma）と共にインキュベートされ、ＦＭによって分析された（５ミリ秒の露出（ＢＰ３４０−３８０励起フィルタ／ＬＰ４２５ロングパスフィルタ））。核の境界が、Leica Q Fluoroソフトウェアを用いて任意のユニットで発現されるように興味のあるプロセシングマスクの個々の領域を形成することによって測定された。
【００９０】
（統計分析）
マイクロソフトのエクセルソフトウェアを用いて統計が行われた。線形回帰解析（linear regression analysis）によって相関関係が計算された。各解析について、Ｒ^２が示された。異なるアポトーシスの段階にある細胞の百分率を比較するために、対応のないｔ検定（Unpaired Student’s t test）が実行された。ｐ値＜０．０５は有意であるとみなされた。
【００９１】
実施例２
ニューロンのインビトロおよびインビボの細胞死におけるカスパーゼ−２阻害／サイレンシング
汎カスパーゼ阻害は、血清欠乏によって死に誘導された一次皮質ニューロン培養の生き残りを促進する。
【００９２】
ニューロンの発生および病的状態の間、適切な栄養性のサポートおよびターゲット由来の栄養性因子の供給源を見出すことができないニューロンは、アポトーシス細胞死を経る。一次皮質ニューロンの血清欠乏（ＳＤ）（急性ニューロン損傷のためのインビトロモデル）は、アポトーシス細胞死につながる。ＳＤ中のアポトーシスのホールマークの階層性を研究し、かつこれを経時的に順序付けして、固有的経路が記載された。この固有的経路では、ミトコンドリア膜電位（ΔΨ_ｍ）崩壊が核アポトーシス（ＮＡ）（アポトーシス体への凝縮／断片化）、外側の形質膜リーフレットへのホスファチジルセリン（ＰＳ）露出および形質膜の終端の透過性（ＰＭＰ）の上流に起こる。上記結果は、５０時間のＳＤを通してのこのようなアポトーシスのホールマークについての時間−応答を立証する（図８Ａ）。明確化のため、低ΔΨ_ｍ、ＮＡ、ＰＳ異所曝露（ecto-exposition）またはＰＭＰによるニューロンの様相の速度論は、徐々に変化する全ての中間の部分集合を反映する。これらの実験条件において、大抵のニューロンは、同時に各過程に係わる。
【００９３】
いくつかのアポトーシスの系統（paradigm）でのカスパーゼの重要な役割のため、カスパーゼの必要性が、ＳＤ中に皮質ニューロンにおいて評価された。血清抜き出しの初期に加えられる場合、ＳＤ−ニューロンは、キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）（新世代の広域スペクトルカスパーゼ阻害剤）による連続的な処理によって大抵の場合救われるが、これは、ΔΨ_ｍおよび核形態の高い保存、完全な形質膜の並びにＰＳ露出がないことによる結果である（図８Ｂ）。対照的に、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ（ＢＯＣ−Ｄ）のいずれもＳＤ関連細胞死を遅らせるまたは排除することができない（図１Ｂ）。核形態並びに神経突起の完全性および神経突起ネットワークの両方が、２４時間でＱ−ＶＤ−ＯＰＨによって救われたニューロンにおいて十分に保護されるようであることが留意されるべきである（図８Ｃ）。それにもかかわらず、それらの細胞体は、わずかにより小さい。特異的な蛍光基質を用いて、細胞内カスパーゼ−２様、カスパーゼ−３様、カスパーゼ−８様およびカスパーゼ−９様の活性が２４時間ＳＤにおいて検出された（図８Ｄ）。ＳＤ中の低レベルのカスパーゼ−８様活性化は、このモデルでは外来的経路が優勢でないことを示唆する。全てのこれらのカスパーゼ活性は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨによる同時処理によって完全に不活性化される（図８Ｄ）。他の無関係なカスパーゼ依存性神経変性刺激：Ｃａ^２＋イオノフォアであるイオノマイシン（刺激毒性（excitotoxicity））、ＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、β−アミロイド（２５−３５）ペプチド（βＡ）およびミトコンドリア毒素（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）または３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）等）による試みの間にＱ−ＶＤ−ＯＰＨによって生き残りが向上させられる得るのかどうかを測定するための調査が行われた。これらの薬物は、アポトーシスを誘導する（ＮＡおよびＰＭＰがモニタリングされる）が、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫまたはＱ−ＶＤ−ＯＰＨのいずれかによる付随した処理は、以前の報告と一致して、β−アミロイドを除き、保護を提供することができない（図８Ｅ）。これらの所見は、ＳＤ中の皮質ニューロンにおけるカスパーゼの特異的な関与を強化する。
【００９４】
試験された系モデルにおける一次的なカスパーゼ活性化の重要性を保証するために、種々のシグナリングおよび代謝経路の薬理学的な阻害が、以下の化合物ファミリー（表１）を用いて行われた：ミトコンドリア−および透過性遷移孔（permeability transition pore：ＰＴＰ）−ターゲッティング剤、ミトコンドリアのカルシウム取り込みモジュレーター、細胞質カルシウムキレート化剤、プロテアーゼ阻害剤（カルパイン、セリンプロテアーゼ、プロテオソームまたはリソソームカテプシン）、細胞周期阻害剤、シグナル伝達経路に必要とされるキナーゼおよびホスファターゼ阻害剤、エンドサイトーシスおよびオートファジー過程に干渉する薬剤、抗酸化剤、タンパク質核外輸送の阻害剤。ほとんど全ての試験された化合物は、ＳＤによって引き起こされる細胞死を妨げることができない。また、多面的薬剤であるシクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤ（形質導入および翻訳を阻害した）は、ＳＤに付された皮質ニューロンの生き残りを促進する（表１）。
【００９５】
（前ミトコンドリア・カスパーゼ−２活性は、血清欠乏によって誘導される皮質ニューロンのアポトーシス細胞死に必要とされる）
早期の事象、例えばΔΨ_ｍ損失がＱ−ＶＤ−ＯＰＨによって妨げられるという事実は、本発明のモデルにおける（前ミトコンドリア）カスパーゼ（単数または複数）の重要性およびＱ−ＶＤ−ＯＰＨの特異性の両方の問題を提議する。ＳＤモデルにおける細胞死の原因となるより基部に近いカスパーゼ活性を識別するために、より選択的なカスパーゼ阻害剤のパネルが用いられ、それらの影響がいくつかの細胞死パラメータに基づいて分析された（図９Ａ）：Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫおよびＺ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ（これらは、それぞれ、カスパーゼ−３、−９、−２および−８様活性を阻害する）。効果的なカスパーゼ−２様活性阻害剤（図９Ｄ）であるＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫのみがΔΨ_ｍ損失並びにアポトーシスの他のホールマーク（ＮＡ、ＰＭＰ、ＰＳ露出）を廃止することおよび死に対してニューロンを保護することの両方が可能であるようである（図９Ａおよび９Ｂ）。Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫの阻害プロファイルをより良好に特徴付けるために、ニューロン保護のための最良のパターンが決定された。アポトーシスは、濃度依存性の方法ではＱ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって阻害され、これは、ＳＤの間にカスパーゼ・カスケードが皮質ニューロンにおいて活性化されることを強化する（図１０）。高密度の培養（７×１０^５／ｃｍ^２）を考慮すると、１００μＭの各阻害剤（これは、この研究で用いられる濃度である）によってより高い保護効果が提供される。血清抜き出し後２〜６時間に遅らせられる阻害剤による処理があまり効率的でないので、ＳＤの当初におけるこれらの阻害剤（１００μＭ）の添加は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ誘導型ニューロン保護のための最良のパターンである（補充物質；図１０）。さらに、カスパーゼ−２様活性化は、ＳＤの２時間から検出され、ΔΨ_ｍ降下の最初の徴候（８時間）およびさらなる核変化の両方より先に起こる（図９Ｃ）。要するに、これらの所見は、前ミトコンドリア・カスパーゼ−２様活性が、皮質ニューロンにおけるＳＤ誘導型アポトーシスに必要とされる最も基部に近いカスパーゼ活性であることを示している。カスパーゼ−２様活性は、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって破壊されるが、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫまたはＺ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫによって破壊されない（図９Ｄ）。対照的に、カスパーゼ−３様およびカスパーゼ−９様活性は、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって阻害され、その結果、これは、カスパーゼ−２様活性がカスパーゼ−３様およびカスパーゼ−９様活性の両方の上流にあることを立証する（図９Ｄ）。それぞれカスパーゼ−３様およびカスパーゼ−８様活性を廃止する一方で（図９Ｄ）、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫおよびＺ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫは、ニューロンをＳＤから保護することができなかった（図９Ａおよび９Ｂ）、この結果、これは、カスパーゼ−３が活性に関連し、かつ、カスパーゼ８の増加がニューロン分解に必須でないことを示す。さらに、カスパーゼ−８阻害剤も、カスパーゼ−２、−３または−９の活性化を阻止することができなかった（図９Ｄ）。カスパーゼ−９阻害剤であるＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫは、ΔΨ_ｍ降下を減じないが、これに対して、これは、アポトーシス体形成を遅らせかつ妨げたが、段階Ｉの凝縮（ＮＡ）、ＰＳ露出およびＰＭＰを遅らせかつ妨げることはなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。
【００９６】
これらのデータは、ＳＤの間、カスパーゼ−２がＭＭＰの上流で作用し、カスパーゼ−９がＭＭＰの下流で作用することを示す。
【００９７】
この評価を確認するために、ＳＤによって誘導されるカスパーゼー２活性が介在するアポトーシスについての遺伝子の証明が調査された。マウスのカスパーゼ−２の配列分析により、マウスのカスパーゼ−２に対して指令された、特定の小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ）の設計に至った。この干渉ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット法によって評価されるように、カスパーゼ−２発現のノックダウンを特異的に誘導する（図１１Ａ）。対照として、４の突然変異を有する無関係なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍ）が設計された。
【００９８】
ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ二本鎖分子は：
配列番号１ ５’−ｃａｃｃｕｃｃｕａｇａｇａａｇｇａｃａｄＴｄＴ−３’
配列番号２ ５’−ｕｇｕｃｃｕｕｃｕｃｕａｇｇａｇｇｕｇｄＴｄＴ−３’
である。
【００９９】
ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍ二本鎖分子は：
配列番号３ ５’−ｃａｕｃｕａｃｕｃｇａｇａｃｇｇａｃａｄＴｄＴ−３’
配列番号４ ５’−ｕｇｕｃｃｇｕｃｕｃｇａｇｕａｇａｕｇｄＴｄＴ−３’
である。
【０１００】
全てのニューロンにおいてｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔがカスパーゼ−２発現を減少させるので、現場内抗体ベースの検出はマウスのカスパーゼ−２の高い遺伝子サイレンシングを確認する（図１１Ｂ）。死滅は注入後２４時間で最大であり、７２時間でカスパーゼ−２発現は徐々に回復する（図１１Ｂ）。驚くべき事に、ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによるカスパーゼ−２のノックダウンの結果、カスパーゼ−２不活性化（図１１Ｃおよび１１Ｄ）並びにΔΨ_ｍ、ＮＡ、ＰＳ調和、形質膜の完全性および神経突起ネットワークの保護（図１１Ｃ−Ｅ）により細胞内評価されたように、ＳＤ後に皮質ニューロンが生き残ることとなった。極めて対照的に、皮質のｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍは、遺伝子／タンパク質発現（図１１Ａ）およびこれらのアポトーシスのホールマークの出現のいずれも妨げない（図３Ｃおよび３Ｄ）。さらに、イオノマイシン処理されたニューロンが細胞死に対して保護されないので、細胞の生き残りに関するカスパーゼ−２阻害または消滅の影響はＳＤ特異的である（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。このため、カスパーゼ−２が活性化されず（下記参照）、かつ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔが保護効果を提供しないので、このＣａ^２＋イオノフォアによる処理は、ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔの特異性を探るための有用なカスパーゼ２非依存性対照である（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。
【０１０１】
これらの結果は、このモデルにおいてカスパーゼ−２活性が重大な前ミトコンドリアのチェックポイントであることを立証する。
【０１０２】
（カスパーゼ−２は、シトクロムｃ放出およびミトコンドリアへのＢａｘ転座の両方を制御する）
ＭＭＰ依存性の事象、例えばシトクロムｃ放出がカスパーゼ−２阻害またはノックダウンによって妨げられるかどうかを決定するための調査が行われた。ＳＤはミトコンドリアからの細胞質シトクロムｃ放出の引き金となり、これは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによって効果的に阻止される（図１２Ａ）。同様に、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、カスパーゼ−２活性化を完全に破壊し、下流のカスパーゼ９およびカスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性活性化を妨げる（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。イオノマイシンによって誘導される細胞死は、皮質ニューロンにおけるカスパーゼ−２活性化に依存せず（図１２Ｂ）、これは、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによる他のアポトーシスのホールマークについての保護効果がないことに一致する（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。（Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫによる）カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫによる）のようなより末端のカスパーゼの阻害はシトクロムｃ放出を妨げることができなかった（図１２Ａ）のに対して、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫは、核凝縮の予備段階（段階Ｉ）でのより高頻度の阻止によって観察されるように末期のアポトーシスの特徴を遅らせ得る（図１２Ａ）ことに留意されるべきである。Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫがΔΨ_ｍ降下に損なわないのに対してこれがカスパーゼ−９活性化およびアポトーシスの末端の特徴、すなわち、ＰＳ露出、ＮＡおよびＰＭＰを妨げるという事実（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｄ）をまとめると、これらの結果は、シトクロムｃ、カスパーゼ−９およびこれに続くカスパーゼ−３活性化に影響を及ぼす古典的なアポトソーム（apoptosome）の形成を支持する。
【０１０３】
次いで、カスパーゼ−２に対するＢａｘの相対的な役割が研究された。このＢｃｌ−２ファミリーの後アポトーシスタンパク質がニューロン発生の間に必要とされ、かつ、栄養性因子後にニューロンにおいてミトコンドリアのシトクロムｃ放出および細胞死を促進するために重大でもあるかもしれないからである。Ｂａｘの現場内抗体ベースの検出がＳＤニューロンにおいて行われ、サイトゾル（拡散パターン）からミトコンドリア様区画（点状）へのＢａｘ転座を示し（図１２Ｄ）、これは、Ｂａｘも細胞死の開始に参加している可能性を立証する。重要なことに、カスパーゼ−２活性化対Ｂａｘ転座を位置付けることは、（ｉ）Ｂａｘ転座がカスパーゼ−２に依存するかどうか；（ｉｉ）カスパーゼ−２活性がＢａｘに依存するかどうか；（ｉｉｉ）両方がＳＤ誘導型細胞死の前ミトコンドリア制御に無関係に含まれているかどうか、を理解するために重大である。
【０１０４】
ＢａｘはＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって処理されたＳＤニューロンのサイトゾルに拡散したままであることが観察され、この結果、これは、細胞死を促進するためにカスパーゼ−２がＢａｘ転座を制御しているかもしれないことを示唆する（図１３Ａ）。逆に、カスパーゼ−９（ミトコンドリアの下流で活性化されるより近いカスパーゼ）に作用するＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫは、ミトコンドリアのＢａｘ再配置を妨げない。したがって、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによるカスパーゼ−２ノックダウンによる処理は、ミトコンドリアへのＢａｘ転座を損ない（図１２Ｄ）、これは、カスパーゼ−２は、細胞死を促進するためにＢａｘの上流の制御を行使するかもしれないことを確認する。Ｂａｘおよびカスパーゼ−２間の推定される関係をより良好に特徴付けるため、ＳＤにより死に誘導された一次皮質ニューロンは、塩素チャネル阻害剤であるフロセミドにより処理された。実際に、Ｂａｘ転座は、ｐＨおよびイオン強度感受性の配座変化を必要とするようであり、フロセミドは、スタウロスポリン（staurosporine）、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor）−αまたはエトポシド（etoposide）により処理された細胞内のＢａｘ転座を減少させるために示された。Ｂａｘ転座に干渉することによって（図１３Ａおよび１３Ｂ）、フロセミド（Ｂａｘのレベルまたはその上流で作用し得る）は、ＳＤニューロンにおいてアポトーシスのホールマーク（すなわち、ΔΨ_ｍ損失、シトクロムｃ放出、ＮＡ、ＰＭＰ）を減少させる（図１３Ｃ）。さらに、精密な速度論観察は、ミトコンドリアへの部分的なＢａｘ再配置が５時間のＳＤにおいて起こり（カスパーゼ−２活性化にほぼ一致する；図９Ｃ）、その後に、８時間にΔΨ_ｍ損失および１５時間にミトコンドリアからのシトクロムｃ放出がある（データ不図示）ことを明らかにし、これは、ＳＤ系統においてＢａｘがＭＭＰを仲介することを示唆する。重要なことに、フロセミドはＢａｘ転座を阻止するものの、それはＳＤについてのミトコンドリアのＢａｘ再配置を部分的に妨げるが、カスパーゼ−２活性を損なわない（図１３Ｂ）。フロセミドは、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔと比較して部分的な保護のみを提供し、このことは、用量制限（３ｍＭ超が皮質ニューロンに毒性である）およびフロセミドが直接的なＢａｘ干渉剤でないという事実に原因があるとし得るかもしれないことが注意されるべきである。
【０１０５】
カスパーゼ−２活性は、核に対するものではなく、ＳＤニューロンの細胞体および神経突起並びにフロセミドにより処理されたものに拡散したままであり、これは、オルガネラ特異的カスパーゼ−２活性を有さないことを示唆する。Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、Ｂａｘ転座およびカスパーゼ−２活性の両方を損なわないので、この観察は重大である（図１３Ｂ）。要するに、これらのデータは、ΔΨ_ｍ損失、下流のカスパーゼ−９およびカスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性活性化、ＮＡ、ＰＳ露出および最終的なＰＭＰが起こる直線的な事象の配列を順番に開始される、上流のカスパーゼ−２依存性の、サイトゾルからミトコンドリアへのＢａｘ再分布を示唆する。しかしながら、ニューロンにおけるミトコンドリア膜上のカスパーゼ−２の推定される直接的または間接的Ｂａｘ非依存性作用は、細胞を含まない系（cell-free system）において示唆されるように、除外され得ない。
【０１０６】
（ＳＤ誘導型Ｂａｘ切断は、細胞質カスパーゼ−２に依存するが、カルパイン非依存性である）
Ｂａｘおよびカスパーゼ−２間の結び付きを精密に確立するために、ＳＤニューロンにおけるカスパーゼ−２およびＢａｘの発現がｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおいてチェックされ、ＳＤを通しての活性なカスパーゼ−２の精密な細胞局在性に調査は焦点が当てられた。
【０１０７】
Ｂａｘに関して、ｍＲＮＡのアップ／ダウンレギュレーション（図１４Ａ）もｐ２２ Ｂａｘタンパク質の含有量増加も２４時間のＳＤに続いて検出されない（図１４Ｂ）。驚くべきことに、生来の完全な長さのｐ２２ Ｂａｘに加えて、２４時間のＳＤを通して、カルボニル末端の２１アミノ酸を欠失した全体的なマウスＢａｘαに対して生じさせられたポリクローナル抗体（Δ２１）を用いるウェスタンブロット法によって検出される場合に、１８ｋＤａのタンパク質に対応する第２のバンドが徐々に現れるのが観察された（図１４Ｂにおける時間過程を参照のこと）。ｐ２２およびｐ１８ Ｂａｘ関連バンドの比較上の免疫ブロット法が、Δ２１抗体およびＢａｘαのアミノ末端にマッピングするペプチドに対して生じさせられたポリクローナル抗体Ｎ２０を用いて行われた（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。Ｎ２０により、ｐ１８バンドを検出することはできず（図１４Ｃ）、これは、ｐ２２ ＢａｘがそのＮ末端部分で切断されて１８ｋＤａ体になったことを示唆している。この早期の切断（図１４Ｂ）がカスパーゼ−２活性と同様の速度論により起こることに留意されるべきである（図９Ｃ）。驚くべきことに、カスパーゼ−２阻害またはそのｓｉＲＮＡベースの遺伝子消失がＢａｘ切断を廃止するのに対して、ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍは効果を全く有さず（図１４Ｄ）、これは、カスパーゼ−２活性化がＳＤに続くＢａｘ切断に必要とされることを立証する。
【０１０８】
次いで、ＳＤ中のＢａｘ誘導型細胞死が、主に、カスパーゼ−２活性化に関連付けられるのかどうかを識別し、皮質ニューロンにおいてＢａｘがミトコンドリアの膜に集積してΔΨ_ｍ降下およびシトクロムｃ放出を促進するのかをチェックするために細胞分画が行われた。Ｂａｘ含有量は、ウェスタンブロット法によって、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔを伴ってまたは伴わずに２４時間のＳＤに付された皮質ニューロンから得られた可溶性のサイトゾル画分およびミトコンドリアに富む重い膜画分の両方において分析された。生来のｐ２２ Ｂａｘは、２４時間ＳＤにおける可溶性画分およびミトコンドリア豊富な画分の両方において見出されるのに対し、ｐ１８ Ｂａｘは、もっぱらミトコンドリア豊富な画分に検出される（図１４Ｅ）。生来のＢａｘはまた、（外側の）ミトコンドリア膜により小さい範囲で挿入された（図１４Ｅ）。前記データは、Ｂａｘの両方の形態が、ＳＤによって引き起こされる細胞死に参加し得ることを示す。次いで、カスパーゼ−２依存性Ｂａｘ切断が、他の刺激に応答して皮質ニューロンにおいて起こり得るのかどうかを決定するための調査が行われた。事実上、Ｂａｘ切断はまた、スタウロスポリンまたはイオノマイシンによる処理の間に起こるが、これらの状況では、ｐ１８ Ｂａｘは、カスパーゼ−２非依存性の様式で発生し（図１４Ｆ）、これは、他のプロテアーゼがこれらのモデルにおいてＢａｘ切断の原因となり得ることを確認する（Woodら,1998;Choiら,2001）。したがって、スタウロスポリンまたはイオノマイシンによって誘導される細胞死（図３Ｄ）は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって妨げられない。
【０１０９】
Ｂａｘが他のシステインプロテアーゼであるカルパインによってまたはカスパーゼ依存性カルパイン活性化を通じて直接的に切断されるかもしれない（Choiら,2001）ので、Ｂａｘ切断のプロテアーゼ阻害プロファイルはより精密に問題にされた。カルパインがニューロンにおいてＳＤ中のＢａｘ切断の原因であるかどうかチェックするために、カルパイン阻害剤（ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭおよびＥ６４Ｄ）のＢａｘ切断についての効果がウェスタンブロット法によって調査された。Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨとは対照的に、カルパイン活性の阻害はＢａｘ切断を妨げず、これは、Ｂａｘ切断がＳＤ中カルパインによって直接的または間接的に仲介されないこと立証する（図１４Ｇ）。興味深いことに、ｐ１８ Ｂａｘは、ラクタシスチン（Lactacystin）およびエポキソマイシン（Epoxomycin）によりプロテアソーム活性の阻害によって安定化されるようであり（図１４Ｈ）、これは、ｐ１８ Ｂａｘの従来のアポトーシスに記録された効果を強化する。
【０１１０】
全てのこれらのデータは、カスパーゼ−２活性により活性体へのＢａｘ切断の結果となるモデルと一致する。
【０１１１】
前記結果は、カスパーゼ−２が処理されることをＢａｘが必要とすることを示した。このため、ＳＤを通してのカスパーゼ−２の生化学的状態および細胞分布を決定するための調査が行われた。ＳＤに続くカスパーゼ−２ ｍＲＮＡの上向き調節はないようである（図１４Ｉ）。対照的に、前カスパーゼ−２タンパク質の含有量は、未処理のニューロンに比較してＳＤ−ニューロンにおいて減少し、この減少は、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ処理がこれを妨げるので、カスパーゼ−２の自己切断の結果であるようである（図１４Ｊ）。実際に、カスパーゼ−２の処理されたｐ１４体は、ＳＤニューロンにおいて免疫検出されるが、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ処理されたＳＤニューロンでは免疫検出されない（図１４Ｊ）。切断の中間生成物も、３３ｋＤａに検出され得る。ＳＤ中のカスパーゼ−２局在性の速度論分析は、末期段階においてさえもカスパーゼ−２が厳密に細胞質にあることを示し、この結果、ＳＤ細胞死におけるカスパーゼ−２の核機能を妨げる（図１４Ｋ）。対照的に、いくつかのアポトーシス薬物、例えば、Ｃａ^２＋イオノフォアであるイオノマイシン、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテシンは、カスパーゼ−２の部分的または完全な核局在化の引き金となる（図１４Ｌ）。
【０１１２】
このため、ニューロンにおけるカスパーゼ−２の細胞質分布は、刺激依存性であり、これは、ＳＤニューロンの細胞質におけるカスパーゼ−２の特有の機能であることを立証する。
【０１１３】
（特異的カスパーゼ−２阻害は、新生児の虚血脳損傷の際に強いニューロン保護を提供する）
上記結果は、上流および早期のカスパーゼ−２活性が前記インビトロモデルにおいて重大なチェックポイントであることを立証する。このような経路が急性のニューロンのストレスの間にインビボで効果的にターゲットにされ得るのかどうかを決定するための実験が行われた。処理のために、細胞透過性および阻害ポテンシャルの両方を増大させ得る、アミノ末端のキノリン基およびカルボキシ末端のＯ−フェニロキシ基と結合されたペンタペプチドＶＤＶＡＤを基礎として、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨと名付けられた新しい細胞透過性のカスパーゼ−２阻害剤プロトタイプのカスタム合成が行われた。
【０１１４】
配列番号５、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ：キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）２，６−ジフルオロフェニルエステル
Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨの特異性が組み換えカスパーゼ−２に対して試験され（図１５Ａ）、カスパーゼ−２によるインビトロのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ切断は、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨによって阻止される。この効果は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよび特異的カスパーゼ−２可逆阻害剤（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−Ｃｈｏ）または不可逆阻害剤（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）と同等である。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫによる切断阻害がそれほど重要でない一方で、ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫは、カスパーゼ−２に対して完全に不活性であり、この結果、これは、通常の汎カスパーゼ阻害剤のカスパーゼ−２に対するより低い作用強度を立証する。カスパーゼ−２は、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−３様阻害剤）またはＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−３／９／８様阻害剤）それぞれによって強くは不活性化されない（図１５Ａ）。Ｅ６４ｄ、ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭ、他のシステインプロテアーゼ阻害剤であるカルパインは、切断活性を損なうことができない（図１６）。ＳＤ系統（しかしイオノマイシン誘導型の死ではない）において試験される場合、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔが行った（図８Ｂ、９Ａおよび１１Ｄおよび１１Ｂ）ように皮質ニューロンの生き残りを促進し（図１５Ｂ）、この結果、これは、インビボ実験のための特異的カスパーゼ−２阻害剤を提供する。対照的に、ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、ＳＤ誘導型ニューロン細胞死に対して非効率であった（図８Ａ）。次いで、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨが、細胞死がどちらかと言えばアポトーシスにより発生する発育中の脳内の低酸素症−虚血損傷（hypoxic-ishemic injury）の急性モデルにおいて試験された。この一過性の片側病巣虚血モデル（unilateral focal ischemia model）では、子ラット（rat pups）は、再灌流を伴う左頸動脈の一過性の閉塞と関連して恒常的な左中大脳動脈閉塞を経た。次いで、この周産期（perinatal）虚血モデルに投与される時の汎カスパーゼ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）およびカスパーゼ−２特異的（Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ）阻害剤のニューロン保護効果が検討された。Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨまたはＱ−ＶＤ−ＶＡＤ−ＯＰＨの１回の用量（１００μ
ｇ／動物）または賦形剤が、虚血開始前に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。次いで、大きな浮腫（oedema）（１．５％以下）なく梗塞が安定化される時間ポイントである４８時間後に脳が分析された。虚血は、５５．０±３．４ｍｍ^３の梗塞容積を誘導した。これは傷害同側半球（lesioned ipsilateral hemisphere）において２２．１±１．４％の損傷を示す。梗塞容積は、通常に分布されるようであった（１５〜２６％）（図１５Ｃおよび１５Ｄ）。虚血前に与えられるＱ−ＶＤ−ＯＰＨの単回の用量は、４４％まで梗塞容積を大きく低減させ（Newman-Keul’s検定における対照群と比較して１２．４±２．６％，ｐ＜０．０５）、容積は、０〜３１に分布された（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨは、同一用量で、梗塞容積において非常に大きい７４％の減少を誘導した（Newmann-Keul’検定において対照およびＱ−ＶＤ−ＯＰＨ群と比較して５．７±２．３％，ｐ＜０．０１）（図１５Ｃおよび１５Ｄ）。１２の研究された動物に関して、８が、虚血対照動物と比較してＭＣＡ閉塞のレベル（プレート１２および１３に対応するレベル）で可視の非常に著しくより小さい梗塞（０．５％の中央値）を示したが、脊椎（dorsal）および海馬（dorsal hippocampus）のレベル（プレート２１）で示さなかった（図１５Ｃおよび１５Ｅ）。他の４つは、１６．５±１．３２％の平均で梗塞を示し、虚血対照動物において得られたものより低い値であった。結論として、我々のデータは、初発因子であるカスパーゼ−２の特異的な阻止が強いニューロン保護を提供し、これは虚血脳障害に対して汎カスパーゼ阻害より効果的であることを立証する。
【０１１５】
（議論）
（前ミトコンドリア・カスパーゼ−２活性は、ニューロンアポトーシスに必要とされる）
本発明は、上記のように、一次皮質ニューロンのＳＤ誘導型アポトーシスが、上流の初発因子であるカスパーゼ−２の活性化に依存し、Ｂａｘ誘導型ミトコンドリアの機能不全およびこれに続くカスパーゼ依存性のニューロンの破壊の制御を通して進行する新規な固有経路サブタイプを記載する（図１７）。
【０１１６】
このモデルは、以下に列挙する証拠によって支持される。
【０１１７】
（ｉ）アポトーシスの階層性および時間順序は、サイトゾルのＢａｘが転座しかつ外側のミトコンドリア膜に集積してΔΨ_ｍ降下を誘導し、シトクロムｃ放出およびカスパーゼ−９／カスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性活性化、核凝縮／断片化、ＰＳ露出およぶ終端のＰＭＰのような下流の事象を促進する固有的様式を示した。
【０１１８】
本発明により得られた結果は、シトクロムｃおよびカスパーゼ−９を有する古典的なアポトソームの形成を支持し得る。しかしながら、カスパーゼ−３阻害がアポトーシスの終端ホールマークを妨げないので、カスパーゼ−９は、識別されないままにある別の下流の実行カスパーゼの活性化にも含まれ得る。
【０１１９】
（ｉｉ）Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫは、カスパーゼ−３、−８、−９の選択的阻害剤よりも高いＳＤによって死に誘導されたニューロンの生き残りを促進する。
【０１２０】
（ｉｉｉ）早期のカスパーゼ−２活性化は、ＭＭＰより前でかつ他のカスパーゼと無関係に検出される。前ミトコンドリアカスパーゼ−２活性化は、ＳＤ誘導型細胞死に必要とされる。特異的なｓｉＲＮＡによるカスパーゼ−２のノックダウンまたはカスパーゼ−２活性の薬理学的阻害（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）が、全てのアポトーシスのホールマークを廃止するからである。
【０１２１】
（ｉｖ）カスパーゼ−２活性の阻害は、ニューロン保護を提供するためにＳＤの当初に行われるべきであり、これは、カスパーゼ−２によって果たされる早期の重大な役割を強化する。
【０１２２】
（ｖ）ＳＤ誘導型アポトーシスはＢａｘ依存性でもあるので、カスパーゼ−２活性化は、生来のＢａｘのｐ１８フラグメントへの切断を可能にすることによって、カルパインとは無関係に上流のＢａｘの制御を仲介し得る。しかしながら、カスパーゼ−２に依存する様式で生来のＢａｘおよび切断されたＢａｘの両方が転座し、かつ外部のミトコンドリア膜に集積して、ΔΨ_ｍ降下を誘導し、シトクロムｃ放出および下流の事象を促進する。
【０１２３】
（ｖｉ）カスパーゼ−２は自己切断の結果としてｐ１４体に処理され、ＳＤの間細胞質中に厳密に拡散されたまま残り、この結果、カスパーゼ−２のオルガネラ特有の機能または核機能を禁止する。長いＳＤを通してのカスパーゼ−２の限定的な細胞質局在性は、ＳＤの間の特有の活性化機構の証拠を示す。
【０１２４】
（カスパーゼ依存性対カスパーゼ非依存ニューロン細胞死）
試験された３つの広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤の中で、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨのみが、皮質ＳＤ−ニューロンにおいて有意なカスパーゼ阻害および生き残りを提供する。この第３世代の汎カスパーゼ阻害剤は、増大した抗アポトーシス特性を示し、ニューロンに限定されない。これは、最良の細胞透過性（アミノ末端のキノリン基）、カルボキシ末端のＯ−フェニロキシ基の特異性および効率性（古典的なフルオロメチル／クロロメチル ケトンを超える）に起因するようである。このため、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨが古い世代の阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫより多大に神経生物学のために使用されるようである。ニューロン培養モデルにおけるマルチ−カスパーゼ阻害は、一般的に、全てのアポトーシスを保存するわけではなく一過性または部分的な保護を提供した。この理由は、ミトコンドリアチェックポイントの下流に含まれるカスパーゼ（単数または複数）の阻害がシトクロムｃ放出を妨げず、むしろ死への傾倒を拡張する、部分的なミトコンドリアのカスパーゼ非依存性経路または（上流のカスパーゼ非依存性の）ミトコンドリア経路の活性化に起因するようである。例えば、神経成長因子（nerve growth factor：ＮＧＦ）由来のＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫが保護する交感神経ニューロンは、タンパク質合成および電気生理学的形質膜特性を回復することなく形態学的保存を示した。逆に、特異的カスパーゼ−２の不活性またはノックダウンが前ミトコンドリアレベルで起こり、この結果、シトクロムｃ放出および下流の依存性の事象を妨げれば、ＳＤニューロンは、ほぼ保存された形態（細胞体および神経突起ネットワーク）を示すようである。
【０１２５】
カスパーゼ活性化に対立するものとして、急性および慢性神経変性疾患での細胞死の調節におけるＭＭＰの役割が報告された。それにもかかわらず、表１から参照されるように、ミトコンドリアまたはＰＴＰとの直接的な干渉はどれも、ＳＤ−ニューロンにおいて有意な生き残りを提供しない。上記化合物による有意な保護の欠如は、ミトコンドリアがＳＤ系統においてより上流のチェックポイントになる可能性がないことを示す。本発明により得られたデータは、いくつかの急性のニューロン死モデルにおいて、カスパーゼ−２がミトコンドリアの上流で作用し、実行体であるカスパーゼ−３および−９がミトコンドリア下流で作用することを支持する。
【０１２６】
さらに、他のシグナリングおよび代謝の主要な経路の薬理学的阻害は、ＳＤにより引き起こされる細胞死を妨げることができない（表１を参照のこと）。化合物全体の効果が回避されることおよび精巧な組み合わせが細胞保護を提供し得ることは除外され得ない。最後に、予想されるように、アクチノマイシンＤおよびシクロヘキサミドのみが、ＳＤに付された皮質ニューロンの生き残りを促進し、これは、後−転写／翻訳事象がこの死モデルに含まれ得ること示唆する。実際に、巨大分子の新規（de novo）転写および翻訳は、いくつかのニューロンアポトーシスモデルにおける細胞死に不可欠である：シクロヘキサミドは、ＮＧＦが欠乏した交感神経におけるΔΨ_ｍ損失およびシトクロムｃ放出の両方を妨げ、アクチノマイシンＤは、特定の処理を施していない区別された、ＮＧＦ／血清が欠乏したＰＣ１２細胞の細胞死を阻止した。
【０１２７】
（ＳＤ皮質ニューロンにおける前ミトコンドリア・カスパーゼ−２活性化）
本発明は、不活性化される（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）またはサイレンシングされる（ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ）場合に高いニューロンの生き残りを促進する前ミトコンドリア・カスパーゼ−２の初期の要求のためのモデルを支持する（図８）。
【０１２８】
注目すべきことに、カスパーゼ−２ マウスは生存可能であり、（新生児段階での促進的アポトーシスによって引き起こされ、ニューロン形成の減少によって引き起こされない）顔の運動ニューロンの数の減少を除き異常なニューロンの表現型を示さない。驚くべきことに、交感神経ニューロンがＮＧＦ抜き出しに応じてアポトーシスを経、アンチセンス・カスパーゼ−２によって保護される一方で、カスパーゼ−２が欠乏した交感神経ニューロンは、野生型ニューロンより効率的にアポトーシスを経る。さらに、これらのマウスからの海馬ニューロンは、μ−アミロイドに対して抵抗性であった。
【０１２９】
ＲＮＡ干渉による皮質ニューロンにおける一過性のカスパーゼ−２のノックダウンの誘導は、補償機構を妨げ、これは、ニューロン死におけるカスパーゼ−２の関与を明瞭に立証することを可能にした。
【０１３０】
カスパーゼ−２の細胞下の局在性が、見通しをその活性化の機構に与え得る一方で、その精密な細胞下の分配は未だに問題が多い（ゴルジ複合体、ミトコンドリア、核および細胞質）。これは、細胞型の相違、死刺激、ＧＦＰ融合タンパク質の過剰発現およびカスパーゼ−２を検出するために用いられた抗血清（antisera）に起因するようである。驚くべきことに、カスパーゼ−２は、長いＳＤの間でさえ、皮質ニューロンにおいて、拡散プールおよび細胞質プールの両方として構成性に検出され、この結果、皮質ニューロンにおけるＳＤ細胞死でのカスパーゼ−２の核またはオルガネラ特異的な機能を禁止する。ＳＤの間の核におけるカスパーゼ−２の再分布の欠如および皮質ニューロンにおけるカスパーゼ−２の細胞質分配事実の両方は、刺激依存性であり、これは、ＳＤニューロンの細胞質におけるカスパーゼ−２の活性化の特有の機構を示唆する。興味深いことに、カスパーゼ−２が海馬ニューロンの細胞質および核の両方において検出されるモデルである発作誘導型ニューロン死も、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによって低減させられる。カスパーゼ−２染色も、主として、ＰＣ１２細胞の多くの核において１〜２の病巣を有する細胞質性であった。このパターンは、ＮＧＦ欠乏型細胞において実質的に変わらない。ＳＤ系統について要約すると、これらのデータは、サイトゾルからアポトーシスを誘導するためのカスパーゼ−２によって果たされる役割を支持しており、このことは、核レベルからのカスパーゼ−２介在型細胞死の活性化についての実際のコンセンサスに疑問を呈する。
【０１３１】
高感度ΔΨ_ｍ染料を用いて、細胞内カスパーゼ−２活性は、ＳＤニューロンにおいてΔΨｍ崩壊およびシトクロムｃ放出より先に起こることが示され、これは、後アポトーシスＢｃｌ−２メンバーによって果たされる役割に矛盾しない。前記データは、ニューロンの発生際にＢａｘが必要とされ、かつ、栄養性因子欠乏後のニューロンにおいてミトコンドリアのシトクロムｃ放出および細胞死を促進するために重大であり得ることを示す従来の結果に一致する。
【０１３２】
（インビボ虚血の間のターゲットとしてのカスパーゼ−２）
ｓｉＲＮＡを脳内に送達する困難性を考慮して、第１のＯ−フェニロキシベースおよびキノリンベースの、特異的にカスパーゼ−２を阻害し得るペプチドが、カスパーゼ−２レベルのインビボの治療的な介入についての概念を証明するために設計された。
【０１３３】
最近導入された（Melnikovら,2002;Casertaら,2003;Lecoeurら;2004）Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨは、唯一のＯ−フェニロキシおよびキノリンベースの入手可能な阻害剤であるが、選択的ではない。ＳＤ系統におけるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫによるニューロン保護の欠如は、インビトロでカスパーゼ−２切断活性を阻止したという事実と結び付けられて、アミノ末端のキノリン基によって提供される細胞透過性おける利得を際だたせる。本発明者らによって用いられるテンプレートであるＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨは、カスパーゼ−２活性をインビトロおよび細胞内で良好に阻止し、この結果、ＳＤニューロンの生き残りを促進する。
【０１３４】
ＳＤ、低酸素症またはグルコース欠乏は、インビボの大脳または心筋虚血の構成要素である。低酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）の新生児モデルにおいて、ネクローシスよりもむしろコアおよび周縁での広範囲のアポトーシスについての証拠がある。新生児大脳虚血は、ＤＮＡ損傷を伴う後発的細胞死および細胞死のアポトーシス機構に至る。Ｐ７ 子ラットにおける再灌流を伴う一過性の病巣虚血は、ＤＭＡの断片化、アポトーシスの形態学的特特徴およびミトコンドリア経路の活性化に至る。
【０１３５】
本発明者らは、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ（高有効性および細胞透過性のカスパーゼ−２阻害剤）の５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与が、上記の実験的な新生児の一過性のＨ−Ｉ傷害に付された子ラットにおいて梗塞サイズを大きく減少させる（７４％）ことを立証した。Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨの最大の有効性は、このモデルにおいて得られた、汎−カスパーゼ阻害剤（ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ）が梗塞容積においてこのような有意な減少を誘導しなかったことを示す従来の結果と厳密に対照をなす。このＨ−Ｉモデルは、カスパーゼ−２依存性であるようなので、これらの所見は、ＳＤ−ニューロンにおけるＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫの相対的な非有効性についておよび組み換えカスパーゼ−２のインビトロＶＤＶＡＤアーゼ活性に対する我々の観察と一致しているかもしれない。さらに、この化合物は、ライス−バヌーチ（Rice-Vannucci）モデルにおいて低酸素症−虚血に続く有意な保護を立証する従来の研究にも係わらずニューロン保護性でない。実際に、ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫは、むしろ、Renolleau’sモデルの動物の６０％において悪化を示した。（ｉ）シナプス可塑性に包含されるいくつかのタンパク質（ＧｌｕＲ１−４ ＡＭＰＡ−レセプターサブユニット、Ｃａｍキナーゼ、ＰＫＣ相互作用タンパク質、ＭＡＰおよびチロシンキナーゼ）は、カスパーゼのための基質でもあり、（ｉｉ）Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ処理されたマウスは、損なわれた記憶を示したので、証拠は生理学的および非致死のカスパーゼ活性化が軸索誘導（axon guidance）およびシナプス・リモデリングに寄与することを示唆する。生体系における汎カスパーゼ阻害は、アポトーシスからネクローシス、腫瘍形成または細胞のホメオスタシスの崩壊に切り替えることができ、これは、損傷の悪化、癌または自己免疫疾患の結果として生じ得た。このため、汎カスパーゼ阻害剤の長期投与を起因とする生理学的なカスパーゼ活性化の変化、毒性および副作用はまた、慢性神経変性の治療におけるそれらの使用を制限し得、この結果、これは、急性および慢性の両方の疾患のための（初発因子）カスパーゼの優先的な選択阻害の必要性を強化する。汎カスパーゼ阻害によってＨ−Ｉ病変の部分的な減少が提供され得るのであれば、それが後アポトーシスまたは後炎症カスパーゼまたはその両方の阻害に起因するかどうかは明らかでない。興味深いことに、再灌流を伴う新生児脳卒中のこのモデルは、出生時新生児ヒト低酸素症−虚血脳症（encephalopathy）と特に臨床的に関連するので、小さいペプチド性阻害剤によるカスパーゼ−２阻害は、汎カスパーゼ阻害の際に起こり得る副作用なく新生児脳卒中においてニューロンを保持するためにいくつかの治療的な変更を提供し得る。さらに、ＩＬ−１βおよびポリ（ＡＤＰ−リボース）シンターゼ（ＰＡＲＳ）の後炎症カスパーゼ−１介在プロセシングの特異的な阻害は虚血傷害後の細胞死も適度に低減させるので、これは、カスパーゼ−１またはＰＡＲＳ阻害剤をカスパーゼ−２阻害と結び付ける合理性を提供し得る。
【０１３６】
本発明者らによって得られた結果からみて、前ミトコンドリアカスパーゼ−２との選択的な干渉は、ニューロン細胞死を減らすための関連ツールであるようである。これらの結果は、少なくともニューロン細胞死系統において固有の経路を孤立したカスパーゼ−２活性化と調和させることおよび初発因子カスパーゼと固有のミトコンドリア経路との間の新しい関係を詳細に描写することを可能にする。急性ニューロンアポトーシスは、Ｂａｘ誘導型ミトコンドリア機能不全の制御を通して進行する上流の初発因子であるカスパーゼ−２活性化およびこれに続くカスパーゼ依存性ニューロン破壊に依存するかもしれない。インビボでのカスパーゼ−２の不活性化により、結果として、一過性の病巣虚血中の梗塞容積の大きな減少を生じるので、カスパーゼ−２が新生児脳卒中において良好なニューロン保護予後を有する関連したターゲットでもあることが証明された。
【０１３７】
（実験手順）
（一次皮質ニューロンの単離および培養）
一次皮質ニューロンは、Ｅ１４スイスマウス胎児（embryos）（Janvier）から培養された。マウスは、頚部脱臼によって殺され、胎児は帝王切開によって取り除かれた。大脳皮質が抽出され、組織がＬ１５培地（Gibco BRL）において１０００μｌチップ（Eppendorf）を用いることによって１５回機械的にすり潰され、次いで、残さが取り除かれ、そして、細胞懸濁液は、８５０ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離された。ニューロンは、２日にわたり、１％グルタミン、５％ウマ血清（HS,Eurobio）および２．５％ウシ胎仔血清（FCS,Eurobio）により補充されたイーグルの基本培地（Eurobio）中に高密度（７×１０^５生細胞／ｃｍ^２）で、１ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（Polyethyl-enimine）（Sigma）により事前にコーティングされた、６または２４ウェル−プレート（Sarstedt）または４−ウェル−Lab-Tek（登録商標）カバーグラスチェンバー（4-well-Lab-Tek chambered coverglass）（Nalge Nunc International）上に塗布された。ＤＩＶ３で、培地は毎日交換され、ニューロンは、１８０ｍｇ／ｌのグルコース、５％のＨＳおよび１％のＦＣＳおよび３μＭのシトシン β−Ｄ−アラビノフラノシド（Sigma）および１μＭの５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾシクロヘプテン−５，１０−イミン マレアート（MK-801,Sigma）を含むＮ５完全培地に維持された。培養の純度（＞９５％）は、抗微小管結合タンパク質２モノクローナル抗体（ＭＡＰ−２，Sigma）および抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質ポリクローナル抗体（GEAP,Dako）により制御された。ニューロンは、ＤＩＶ６−ＤＩＶ９の間で用いられた。
【０１３８】
（薬理学的試剤によるアポトーシス誘導およびニューロン保護アッセイ）
細胞死は、ＤＩＶ６において血清欠乏（ＳＤ）によって誘導された。簡単には、以下のように血清抜き出しが行われた：Ｎ５完全培地において培養されたニューロンが、ＨＳおよびＦＣＳの両方を欠くＮ５において迅速に３回洗浄され、薬理学的試剤の不存在下または存在下に血清のないＮ５培地において２４時間にわたりインキュベートされた。あるいは、細胞死はまた、２４〜４８時間にわたるイオノマイシン、スタウロスポリン、カンプトテシン、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）、３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰＡ）、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）（全てSigmaから購入された）またはβ−アミロイドペプチド（２５−３５）（Bachem）による処理によって導入された。ニューロン保護アッセイのための試剤がＳＤまたは薬品処理の当初に（Ｎ５完全培地において）加えられた。それらは、それら自体によって細胞毒作用を誘導しない濃度で用いられた。シクロスポリンＡ、４，４’−ジイソチオシアナスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩（ＤＩＤＳ）、ルテニウムレッド、デシルユビキノン、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸のアセトキシメチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）、３−メチルアデニン、バフィロマイシン（bafilomycin）Ａ１、ラパマイシン、レプトマイシン（leptomycin）Ｂ、Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＦＦ−ＦＭＫ）、ペプスタチン、オカダ酸、ミクロシスチン（microcystin）ＬＲ、Ｈ−７、アスピリン、ウォルトマンニン、ゲニステイン（genistein）、ラクタシスチン（lactacystin）、エポキソマイシン、トロロックス（登録商標）（Trolox）、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、アクチノマイシンＤ、シクロヘキサミドがSigmaから購入され；Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ）、キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）、Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＦＡ−ＦＭＫ）、
Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）、Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）、Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ）、Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）はICNから購入され；キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ（Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ）のカスタム合成がICNによって行われ；４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦまたはペファブロックＳＣ）は、Rocheから購入され；Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｏｒｌｅｕ−ａｌ（カルパイン阻害剤ＩまたはＡＬＬＮ）、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ａｌ（カルパイン阻害剤ＩＩまたはＡＬＬＭ）、ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジン）ブタン（Ｅ６４ｄ）、ＭＤＬ−２８１７０、ＳＢ ２０２１９０、ＰＤ ９８０５９、ＳＰ ６００１２５がMerck/VWRから購入された。
【０１３９】
（一次皮質ニューロンにおけるアポトーシスの動力学分析のための器械）
マルチプローブ蛍光顕微鏡法（ＦＭ）が、事前に染色されたニューロンについて、１００Ｗの水銀ショートアークランプおよびａ×４０Ｎ ＰＬＡＮ Ｌ対物レンズまたは水浸（immersion） ×１００ Ｎ ＰＬＡＮ対物レンズを備えたＤＭ ＩＲＢ反転（inverted）蛍光顕微鏡（Leica）を用いて行われた。通常、定量研究は、実験当たり５〜１０の無作為に選択された領域を計測することによる約２００〜６００細胞／領域についてのＦＭおよびより高いサンプルスループットのためのフローサイトメトリー（ＦＣ）の両方によって行われた。この後者のために、既に記載されたように（Lecoeurら,2004）染色されたニューロンのトリプシン処理後にアポトーシスおよび関連する事象のマルチパラメトリックな分析が行われた。ＦＣは、１５ｍＷ空冷４８８ｎｍアルゴンレーザ（Becton Dickinson）を備えた３色FACSCaliburサイトメータを用いて行われた。
【０１４０】
（ΔΨ_ｍ、カスパーゼ活性化、ＰＳ露出、ＰＭＰおよびＮＡのマルチプローブ分析）
既に記載されているように（Lecoeurら,2004）、ＦＣおよびＦＭの両方によって測定が行われた。ミトコンドリアの膜電位（ΔΨ_ｍ）は、ΔΨ_ｍ高感度染料である５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニン ヨージド（JC-1,Molecular Probes）の取り込みによって評価された（Sileyら,1991）。ニューロンは、１μＭのＪＣ−１により３０分にわたり３７℃で負荷がかけられた。ＦＭについては、緑色（モノマー，低ΔΨ_ｍ）およびオレンジ色（Ｊ−凝集体，高ΔΨ_ｍ）蛍光が同時に取得された（ＢＰ ４５０−４９０励起／ＬＰ ５１５ロングパス発光フィルタ）。ＪＣ−１モノマーは、Ｆ１−１チャネルにおいてＦＣによって検出された。Ｊ−凝集体は、Ｆ１−２チャネルを通して検出された（Lecoeurら,2004）。あるいは、ΔΨ_ｍはまた、６０ｎＭのMitoTracker（登録商標）Red（CMXRos；分子プローブ）によって評価され、ＦＭ（ＢＰ ５１５−５６０励起フィルタ／ＬＰ ５９０発光フィルタ）によって検出された。ΔΨ_ｍ崩壊のための陽性対照は、カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ｍＣｌＣＣＰ，１００μＭ，４５分）により行われた。活性化されたカスパーゼ−２、−３、−８および−９は、特異的なＦＡＭ結合ペプチド（蛍光色素がラベリングされたカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＣＡ）と呼ばれる）：CaspaTag（登録商標）フルオレセインカスパーゼ活性キット，Q-Biogen,Illkirch，フランス；ApoFluor（登録商標）カスパーゼ検出キット，ICN,Orsay，フランス；ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、ＦＭＫ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、ＦＡＭ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫおよびＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫをそれぞれ用いて検出された。ニューロンは、ＦＬＩＣＡと共に（１：１５０，CaspaTag（登録商標）または１：５００，ApoFluor（登録商標））１時間にわたり３７℃でインキュベートされ、次いで、３回洗浄バッファで洗浄された。ＦＭのために、ＦＡＭ結合ペプチドが、ＢＰ ４８０／４０フィルタを通して励起され、発光された光は、ＢＰ ５２７／３０フィルタを通して集められた。ＦＣ分析は、Ｆ１−１チャネルにおいて行われた（Lecoeurら,2004）。形質膜の外側のリーフレットへのホスファチジルセリン（ＰＳ）露出は、ＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ（Immunotech）の固定を通して検出された。形質膜透過性（ＰＭＰ）は、核ＤＮＡへの７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ，Sigma）の増加した結合を通して検出された。染色およびＦＭおよびＦＣによる分析は、既出（Lecourら,2004）のように行われた。核は、１μＭのヘキスト（登録商標）３３３４２により染色され（３０分）、ＦＭによって分析された（ＢＰ ３４０−３８０励起フィルタ／ＬＰ ４２５ ロングパスフィルタ）。核アポトーシス（ＮＡ）は、ニューロンにおいて既に規定されたように（Lecourら,2004）評価された。
【０１４１】
（シトクロムｃ、Ｂａｘ、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−３の免疫検出）
Lab-tek（登録商標）チャンバスライドでのニューロンの生育は、２０分にわたり４％のパラホルムアルデヒド／０．１９％のピクリン酸に固定され、ＰＢＳ中の０．０１％のトリトン−Ｘ１００により５分にわたり透過性化され、次いで、ＰＢＳ中の１０％のＦＣＳにより３０〜４５分にわたり遮断された。全ての免疫染色は室温で行われた。抗体は、ＰＢＳ中の１％のウシ血清アルブミン（Sigma）で希釈された。次いで、ニューロンは、マウスのモノクローナルＩｇＧ１抗シトクロムｃ（1時間；1:200；クローン 6H2.B4，BD，Pharmingen）および第２の抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧのAlexa Fluor（登録商標）５９４ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（1時間，1:200；Molecular Probes）を用いて染色された。同様に、Ｂａｘ転座は、カルボニル末端の２１アミノ酸を欠失したマウスのＢａｘαに対して生じさせられたウサギのポリクローナル抗体（1時間，1:100；Δ21，Santa Cruz Biotechnology）を用いて調査され、ＦＩＴＣ−ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（1時間，1:100；Molecular Probes）により検出された。拡散した細胞質シトクロムｃまたはＢａｘ点状ラベリングのいずれかを示す細胞が、ＦＭの下で、条件当たりおよび実験当たり１５０〜３００の無作為に選ばれた細胞に対応する約１０の領域についてカウントされた。カスパーゼ−２は、ラットのモノクローナル抗マウスカスパーゼ−２抗体（10C6，Alexis Biochemicals，San Diego，CA，米国；1：100，1時間）および第２の抗体としてのヤギ抗ラットＩｇＧのＡlexa Fluor（登録商標）５９４ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（1時間，1：100，Molecular Probes）を用いることによって細胞内検出された。活性化されたカスパーゼ−３は、ＦＣによって細胞内評価された（Lecoeurら,2004）。進行のため、ニューロンはトリプシン処理され、１％のＰＦＡおよび２０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Sigma）を含むＰＢＳに２０分にわたり固定された。次いで、ニューロンは、２０μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤおよび２０μｌのフィコエリトリン結合型ポリクローナル・ウサギ抗カスパーゼ−３抗体（BD Pharmingen）の両方を含む１００μＬのＰＢＳ／１％のＢＳＡ／０．０５％のサポニンキラヤバーク（Sigma）に３０分にわたり再懸濁させられた。
【０１４２】
（ＲＮＡ干渉）
二本鎖ｓｉＲＮＡは、マウスカスパーゼ−２遺伝子の配列（ＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＡＧ ＡＧＡＡＧＧＡＣＡ；ヌクレオチド１８５−２０３；ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ）に対応する。同じ配列の４箇所の突然変異により不活性なｓｉＲＮＡが設計された（ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＣＧ ＡＧＡＣＧＧＡＣＡ；ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍ）。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔの配列は、その特異性を保証するためにＢＬＡＳＴに提出された。アニーリングされたｓｉＲＮＡ二本鎖化合物（ＲＰ−ＨＰＬＣ精製される）は、Proligoから購入された。ＤＩＶ６での２４ウェル−プレート（７×１０^６／ウェル）またはLab-Tek（登録商標）４−カバーグラスチャンバー（１．３３×１０^６／ウェル）におけるニューロンの培養は、６時間にわたりｓｉＲＮＡ（３．８μｇ）によりリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いてトランスフェクトされた。次いで、ニューロンは、洗浄され、完全Ｎ５培地にさらに１６時間にわたり戻され、その後に、２４時間ＳＤまたはイオノマイシン処理に付されたかまたは付されなかった。
【０１４３】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
ＲＮＡ抽出は、２４ウェル（１．３３×１０^６ニューロン）または６ウェル（７×１０^６ニューロン）プレートにおいて、製造者の推薦によるRNeasy（登録商標）mini Kit（Qiagen）を用いて直接的に行われた。逆転写は、Supercript（登録商標）II RNアーゼ Ｈ⁻逆転写酵素（Invitrogen）を用いて行われた。ＰＣＲプライマー：Ｂａｘフォワードプライマー ５’−ＡＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’、Ｂａｘリバースプライマー ５’−ＡＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧ−３’；カスパーゼ−２フォワードプライマー ５’−ＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＧ−３’、カスパーゼ−２リバースプライマー ５−ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧ−３’、カスパーゼ−９フォワードプライマー ５’−ＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＧＣＣ−３’、カスパーゼ−９リバースプライマー ５’−ＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＴＧＴＣＣ−３’；ＧＡＰＤＨフォワードプライマー ５’−ＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ−３’、ＧＡＤＰＨリバースプライマー ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’ は、Proligoから購入された。 増幅条件は、９４℃１分に続いて：Ｂａｘについて、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分、次いで、７２℃１５分を３０サイクル；９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分、次いで７２℃１５分の１サイクルをカスパーゼ−２およびカスパーゼ−９について３５サイクルまたはＧＡＤＰＨについて２５サイクルである。ＰＣＲの後、２０μｌが１．５％のアガロースゲルを用いる電気泳動に付され、バンドはエチジウムブロミド（ethidium bromide）染色をＵＶ照射することにより視覚化され、これを写真撮影した。ＧＡＰＤＨは、増幅の内部対照として用いられる。
【０１４４】
（サイトゾル製造および細胞レベル以下の分画）
ニューロン（６ウェルプレート中７×１０^６）が、４℃で、完全プロテアーゼ阻害剤反応混液（Roche）により補充された５０μｌのＣＳＦバッファ（２２０ｍＭのマンニトール、６８ｍＭのスクロース、５ｍＭのピルビン酸塩、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭのジチオトレイトール、２０μＭのサイトカラシンＢおよび１０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５）において採取され、次いで、５回の液体窒素中の凍結溶解法サイクルで破壊された。サンプルは、核および未破壊の細胞を除くために９００Ｇで５分にわたり４℃で遠心分離され、続いて、ミトコンドリアに富む重い膜画分を得るために１０，０００Ｇで３０分にわたり４℃で遠心分離された。その後、サンプルは、ミクロソームをペレット状にするために１００，０００Ｇで１０分にわたり４℃で遠心分離された。物質は、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００に再懸濁させられ、その後に、ブラッドフォードアッセイ法によってタンパク質濃度が測定された。各画分の１０μｇがウェスタンブロット分析に用いられた。
【０１４５】
（タンパク質抽出およびウェスタンブロット分析）
ニューロンは、完全プロテアーゼ阻害剤反応混液（Roche）によって補充された２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００に室温で溶解させられた。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキットを用いて測定された。タンパク質（カスパーゼ−２については３０μｇ；Ｂａｘについては１０μｇ）は、１２．５％のポリアクリルアミドゲルを用いて分離され、ＰＶＤＦ膜（Amersham）に移された。免疫染色は、ＦＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて示された。モノクローナル抗マウスカスパーゼ−２抗体（11B4，Alexis Biochemicals）は１：１０００の希釈度で用いられ；カルボキシ末端の２１アミノ酸を欠失したマウスＢａｘαに対して生じさせられたポリクローナル抗体（Δ21，Santa Cruz Biotechnology）は１：２００の希釈度で用いられ、（残渣１１〜３０を認識する）Ｂａｘαのアミノ末端に対して生じさせられたポリクローナル抗体（N20，Santa Cruz Biotechnology）は１：１０００の希釈度で用いられた。アクチン（４２ｋＤａ；Sigma；１：５０００）は、等価な負荷対照として用いられた。ヒート−ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）のマウスモノクローナル抗ＨＳＰ（Sigma；１：４００）による免疫ブロット法は、ミトコンドリアに富む重い膜画分の純度をチェックするために用いられた。
【０１４６】
（組み換えカスパーゼ−２によるインビトロＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ切断）
ヒト組み換えカスパーゼ−２（BIOMOL Quantizyme(登録商標)Assay System）の活性は、１００μｌのアッセイバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）において評価された。５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣの組み換えカスパーゼ−２（１２５Ｕ）による切断は、３０分後に３７℃で、蛍光マイクロプレートレーダを用い４０５ｎｍで励起する５１０ｎｍの蛍光放射をモニタリングすることによって測定された。ＶＤＶＡＤアーゼ活性の阻害のために、阻害剤（２μＭ）は、カスパーゼ−２の存在下に３０分にわたり３７℃で事前にインキュベートされ、その後に続いて、５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（３０分，３７℃）によりインキュベートされた。ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ単独により顕著な蛍光バックグランドは観察されなかった。
【０１４７】
（周産期虚血）
新生児ウィスターラット（Wistar rat）（雌親プラスその９匹の仔ラット）が、仔ラットが３〜４日齢である時に、Janvier（Le Genest-St-Isle,フランス）から得られた。仔ラットは、食物および水が自由に利用可能な１２：１２時間の明暗サイクルの元でそれら雌親と共に収容された。動物実験は、実験動物の注意および使用のためのフランスおよび欧州共同体のガイドラインに従って行われた。虚血は、既に記載される（Renolleauら，1998）ように７日齢のラット（１７〜２１ｇ）に実施された。仔ラットは、抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔をかけられた。麻酔をかけられたラットは仰向けに置かれ、首に正中切開がなされて左総頸動脈を露出させた。次いで、ラットは、右側を下にする横向きに置かれ、耳と目との間に斜位（oblique）皮膚切開がなされた。側頭筋（temporal muscle）の切除の後、頭蓋骨（cranial bone）が額縫合線（frontal suture）から頬骨弓（zygomatic arch）より下の高さ位置にかけて除かれた。次いで、鼻の裂け目の上のその出現のすぐ後に露出される左中大脳動脈は、大脳静脈より下方の高さ位置で凝固させられた。この手順の後、左総頸動脈を塞ぐためにクリップが置かれた。次いで、ラットは、低体温を回避するためにインキュベータ内に置かれた。５０分後、クリップが取り除かれた。頸動脈血流回復が顕微鏡を用いて検査された。次いで、首および頭蓋の皮膚が閉じられた。外科手順の間、体温は３７〜３８℃に維持された。仔ラットは、回復するまでインキュベータ（３２℃）に移され、次いで、その後にそれらの雌親の元（dam）に移された。
【０１４８】
カスパーゼ阻害剤が、虚血開始の５分前に（１００μｌ中）１０ｇ重量当たり５０μｇの用量で腹空内投与された（Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨについてはｎ＝１５、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨについてはｎ＝１４）。対照動物は、等価容量の１０％ＤＭＳＯ含有０．９％食塩水（カスパーゼ阻害剤を可溶化するために必要とされる媒質）を受け入れた（媒質処理群）。虚血の間すなわち殺害前の死亡率は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ処理群、Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ処理群および媒質処理群の間で異ならなかった（＜４％）。ラットは、再灌流の４８時間後に殺害され、脳が取り出された。梗塞病変（薄色ゾーン）は、動物の処理が知らされていない観察者によって視覚的に計測された。明らかな虚血の薄色ゾーンのない脳は、拡大鏡の下で観察された。明らかでないＭＣＡ閉塞を示すものは廃棄された（Ｑ−ＶＤ−ＶＡＤ処理群における２匹の動物）。次いで、脳は、４％の緩衝ホルムアルデヒドに２日固定された。５０μｍの環状脳切片（coronal brain section）が凍結切片作製機（cryostat）を用いて切り取られ、ゼラチン・コーティングされたスライドグラス上に集められた。前方線条体（anterior striatum）から後方海馬（posterior hippocampus）にわたる１６の切片（Paxinosのラット脳アトラスにおけるプレート９〜２７に対応する）が選ばれ、同じスペースの０．５ｍｍ間隔で取られた。病変域は、クレジルバイオレット染色された切片について画像解析装置（ＮＩＨ画像ソフトウェア）を用いて測定され、各環状切片間の距離は、梗塞容積を計算するために用いられた。
【０１４９】
統計分析は、次のようにして行われた。０．２のベータリスクおよび０．０５のアルファリスクを仮定して、各群において１５〜１６の動物が、２群の間で５０％の梗塞容積減少を検出するために必要とされることが推定された。データは以前の研究（Ducroqら,2000）から引き出された。３つの群の動物が実験で比較されるため、これらの値は情報を与えるのみである。６匹の動物のブロックを有する所定のリストが、３群の中の動物を無作為化するために用いられた。処理条件を知らない調査者が全ての測定を行った。平均値間の相違は、クルスカル・ウォーリス（Kruskall-Wallis）のノンパラメトリックな多重比較検定、およびこれに続くノンパラメトリックな値に対するニューマン・クール検定（Newman-Keul’s test）によって評価された。我々は、５％レベルで相違が有意であると考える（ｐ＜０．０５）。
【０１５０】
実施例４
ヒトカスパーゼ−２サイレンシングに対して特異的なｓｉＲＮＡの設計
ヒトカスパーゼ−２遺伝子ノックダウンに特異的なｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ）が、ヒト（虚血およびその他）傷害および疾患へのさらなる適用ために設計された。このｓｉＲＮＡ二本鎖化合物は、下記の相補的配列から構成される：
配列番号６ ５’−ｃａｕｃｕｕｃｕｇｇａｇａａｇｇａｃａｄＴｄＴ−３’
配列番号７ ５’−ｕｇｕｃｃｕｕｃｕｃｃａｇａａｇａｕｇｄＴｄＴ−３’
実験アプローチが、Robertsonモデルに基づく前記ｓｉＲＮＡを試験するために開発され（Robertsonら,2002）、これは、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによるカスパーゼ−２阻害が、ジャーカットＴ細胞（Jurkat T cell）においてシトクロムｃ放出およびホスファチジルセリン残渣露出を部分的に減少させたことを示した。
【０１５１】
次いで、ＶＰ−１６処理されたジャーカット細胞における薬理学的なカスパーゼ−２阻害（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ；全てICNから）またはカスパーゼ−２遺伝子ノックダウン（ｓｉＲＮＡ）が行われた。
【０１５２】
（ヒト細胞におけるｓｉＲＮＡの検証）
汎カスパーゼ阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰＨ（２５〜１００μＭ）または選択的カスパーゼ−２阻害剤であるＺ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ（２５〜１００μＭ）による事前処理は、ＤＮＡ−損傷およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるＶＰ−１６によって誘導される細胞死を妨げる（図１８）。７〜８時間での生き残りがＶＰ１６の広範囲の濃度に対して得られた（図１８）。Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫがΔΨ_ｍ損失を阻止したという事実は、この系統においてカスパーゼ−２活性がミトコンドリアの上流で起こることを示唆する。したがって、図１９では、データは、
（ｉ）徐々のΔΨ_ｍ損失は、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫによって廃止されず、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫまたはＱ−ＶＤ−ＯＰＨのみによって廃止される；
（ｉｉ）Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫは、カスパーゼ−２活性を損なわず、これは、カスパーゼ−２は、研究されたより上流のカスパーゼを示唆する；
（ｉｉｉ）カスパーゼ−９阻害はカスパーゼ−３活性化を妨げるが、カスパーゼ−３阻害はカスパーゼ−９活性化を妨げず、これは、カスパーゼ−３がカスパーゼ−９を通じて活性化されることを示す；
（ｉｖ）終端の核変化およびＰＭＰは、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨによって大部分妨げられ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫによってより小さい範囲で妨げられる；
（ｖ）ＡＮＴブロッカーであるＢＡは、ΔΨ_ｍ損失およびＰＭＰを減少させ、これは、活性化されたカスパーゼ−２の後アポトーシス作用を仲介する際のミトコンドリアの役割を確認する；
（ｖｉ）ＣＨＸおよびＡｃｔＤがΔΨ_ｍ損失およびＰＭＰのいずれも妨げないので、ＶＰ１６−カスパーゼ−２依存性細胞死は翻訳および転写に依存しない；
（ｖｉｉ）Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫがΔΨ_ｍ損失、カスパーゼ−２および−３の活性化、核変化およびＰＭＰを妨げることができないため、カスパーゼ−８依存性の経路はこのモデルにおいて重要でない
ことを示す。最後に、データ全体は、前ミトコンドリア・カスパーゼ−２活性化がΔΨ_ｍ降下を誘導し、カスパーゼ−９／カスパーゼ−３の活性化、核凝縮／断片化および終端のＰＭＰのような下流の事象を促進するモデルの証拠となる。
【０１５３】
この系統は、カスパーゼ−２を指令するヒトｓｉＲＮＡを試験および検証することを可能とした。最初に、ｈｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、（図２０Ａにおけるウェスタンブロット分析に示されるように）ＨｅＬａおよびジャーカット細胞それぞれにおいて後カスパーゼ−２タンパク質発現を減少させることが可能である。全細胞は、フローサイトメトリーによるｓｉＲＮＡ−ＦＩＴＣの蛍光検出によって細胞内評価されるようにトランスフェクトされる。一旦これらの細胞がトランスフェクトされると、それらはまた、続くＶＰ１６による７時間処理に対して保護され（図２１Ａ−Ｂ）、これは、ｈｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔの有効性を立証する。
【０１５４】
（実験の部）
（細胞培養）
ジャーカット細胞は、ATCCから購入され（クローンＥ６−１）、１０％のウシ胎仔血清により補充されたＲＭＰＩ １６４０（Glutamax rich）培地中１０００００〜１２００００細胞／ウェル（２４ウェルプレート）の密度で培養された。ジャーカット Ｅ６−１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１５２）は、ジャーカット−ＦＨＣＲＣのクローン（（Schneiderら(1977)により１４年齢の年老いた雄の末梢血から以前に確立され、オリジナルに設計されたＪＭである）ジャーカット細胞系の誘導体）である。細胞は、実験のために７〜１４の継代で用いられた。
【０１５５】
（アポトーシス誘導および細胞保護アッセイ）
細胞は、種々の薬理学的試剤により３０分〜１時間にわたり予備処理され、その後に続いて、ＶＰ１６（ＶＰ１６またはエトポシド；Sigma）処理（１０〜２０μＭ）が７〜８時間にわたり行われた。ｓｉＲＮＡ実験のために、ＶＰ１６処理の前に、細胞は２４時間にわたり３．８μｇのｓｉＲＮＡ（Proligo）／２μＬのリポフェクタミン ２０００（５００μＬ中）により処理された。マウス・カスパーゼ−２（配列番号１−２または配列番号３−４）が陰性対照のために用いられた。トランスフェクトの収率は、ｓｉＲＮＡ−ＦＩＴＣ（配列番号１−２、配列番号３−４または配列番号６−７）の蛍光検出（フローサイトメトリー，ＦＬ−１）によって細胞内チェックされた。
【０１５６】
（フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法によるアポトーシスパラメータ研究）
（フローサイトメトリー）
二重のＪＣ−１／７−ＡＡＤ染色：ミトコンドリア膜電位（ΔΨ_ｍ）は、ＤＹ_ｍ高感度染料である５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリル カルボシアニン ヨージド（ＪＣ−１，Molecular Probes，１μＭ）の取り込みによって評価された。緑色（低ΔΨ_ｍ）およびオレンジ色（高ΔΨ_ｍ）の蛍光がそれぞれＦＬ−１およびＦＬ−２チャネルにおいてそれぞれ取得された。ＰＭＰは、７−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；０．０２ｍｇ；Sigma）の取り込みによって検出された（ＦＬ−３チャネル）。あるいは、二重のＤｉｏＣ６（０．１μＭ）／ＰＩ（５×１０^−３ｍｇ）染色が行われ、ＦＬ−１およびＦＬ−２チャネルにおいてそれぞれ検出された。７０００の事象が各条件のために少なくとも取得される。
【０１５７】
（蛍光顕微鏡法）
活性化されたカスパーゼ−２、−３および−９が、特異的なＦＡＭ結合ペプチド（蛍光ラベリングされたカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＣＡ）：CaspTag（登録商標）フルオレセインCaspase Activity Kits，Q-Biogen，Illkirch，フランス；ApoFluor（登録商標）Caspase Detection Kits，ICN，Orsay，フランスと呼ばれる）：ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、ＦＡＭ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫおよびＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫを用いてそれぞれ検出された。細胞は、ＦＬＩＣＡ（１：１５０（CaspaTag（登録商標））または１：５００（ApoFluor（登録商標）））と共に１時間にわたり３７℃でインキュベートされ、次いで、洗浄バッファで３回洗浄された。ＦＭのために、ＦＡＭ結合ペプチドがＢＰ ４８０／４０フィルタを通じて励起され、放射光がＢＰ ５２７／３０フィルタを通じて集められた。形質膜透過性（ＰＭＰ）は、７−アミノアクチノマイシンＤ（０．０２ｍｇ，７−ＡＡＤ，Sigma）の核ＤＮＡへの増加した結合を通じて検出された（ＢＰ５１５−５６０フィルタを通じて励起され、蛍光はＬＰ５９０ロングパス発光フィルタを通じて集められる）。核は、１μＭのヘキスト（登録商標）３３３４２により染色され（３０分）、分析された（ＢＰ ３４０−３８０励起フィルタ／ＬＰ４２５ロングパスフィルタ）。ミトコンドリア膜電位は、ＪＣ−１（１μＭ；３０分）によって評価された：緑色およびオレンジ色の蛍光が、１．２秒の励起後に同時に記録された（ＢＰ４５０−４９０励起／ＬＰ ５１５ロングパス発光フィルタ）。
【０１５８】
実施例５
（ｓｈＲＮＡ）
（ｓｈＲＮＡの構築および検証）
ｓｉＲＮＡが血液脳関門を越えることが可能であったとしても、それらは、生物学的流体中で不安定であり、このため、克服することが困難な傷害は、インビボの細胞内送達であるだろう。最近になって、いくつかの進展は、ｓｉＲＮＡ送達のための優れた伝達手段としてウイルスを強調する。例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス（多くの実験的な遺伝子治療研究のための特段上等の導入遺伝子送達ベクター）が、治療のｓｉＲＮＡを細胞内に送達しかつ安定的にこれを発現させるためにインビトロおよびインビボの両方において設計された。実際に、ｓｉＲＮＡの組み換えバージョン：スモール・ヘアピン（small hairpin：ｓｈ）ＲＮＡ（スモールＲＮＡプロモータの制御の下でのヘアピンループバージョンしての構成性のｓｉＲＮＡ発現）がこの問題を回避するために製造された。ｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルスの主鎖（これは、局所的な脳投与（例えば脳内−脳室（intracerebro-venticular）注射）によってインビボでニューロンを安定にトランスフェクトするために用いられ得る）において誘導され得、これは、恒常的なターゲット遺伝子のサイレンシングに導くはずである。
【０１５９】
短い配列によって連結されかつポルＩＩＩポリメラーゼの終止シグナル（ＴＴＴＴＴ）が続くｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列の発現からなる、安定なｓｉＲＮＡ構造を細胞内発生させるためのＳＩｎオーダー（スモールヘアピン構造の概念）が創出された。この配列は、Ｈ１ ＲｎアーゼＰまたはＵ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子のいずれかからのポルＩＩＩプロモータの制御下にあり、トランスフェクトされた細胞において大量のスモールへアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現に導く。間違いなくＤＩＣＥＲによるループ部分の迅速なプロセシングは、機能的ｓｉＲＮＡの形成につながる。最近、プラスミド（ｐＧＥ−１）が開発され（Stratagene）、我々は、ターゲット遺伝子の効果的な長期の抑制を提供するためにこのｓｈＲＮＡ哺乳類発現ベクターを用いた。ｓｈＲＮＡは、ループ配列によって分離されたセンスおよびアンチセンス鎖からなる（Ｕ６プロモータによって制御された）ＲＮＡ転写物から発生させられた。ＲＮＡ転写物は、それ自体の上に折り重なってヘアピンを形成する。ｐＧＥ−１発現ベクターは、哺乳類細胞においてターゲット遺伝子の発現を抑制するように最適化された。マウス・カスパーゼ−２に特異的なｓｈＲＮＡを含む発現ベクターを得るために、ループ配列によって分離された２つの逆方向反復およびこれに続く、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写ターミネーターとして機能する６ヌクレオチド・ポリ（Ｔ）ストリング（string）からなる２つのオリゴヌクレオチドが設計された（図２２Ａ）。
【０１６０】
配列番号８ ５’−ＧＡＴＣＣＣｇｃａｃｃｔｃｃｔａｇａｇａａｇｇａｃａＧＡＡＧＣＴＴＧｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔａｇｇａｇｇｔｇＴＴＴＴＴＴ−３’
配列番号９ ５’−ＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡｃａｃｃｔｃｃｔａｇａｇａａｇｇａｃａＣＡＡＧＣＴＴＣｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔａｇｇａｇｇｔｇＣＧＧ−３’
２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて、我々は、ｐＧＥ−１ベクターのＢａｍＨ ＩおよびＸｂａ Ｉ部位にクローニングされたｓｈ−挿入断片を得た（図２２Ｂ）。ＰＣＲによる陽性コロニーのスクリーニングの後、我々は、２つのクローンを選択した（ｓｈＲＮＡ６およびｓｈＲＮＡ９）。これらのクローンは、配列決定され、Ｕ６プロモータの制御下のｓｈ配列の正しい挿入を示した。
【０１６１】
カスパーゼ−２のダウンレギュレーションのためのツールとしてのこれらのｓｈＲＮＡ構築物（construct）を検証するために、３Ｔ３細胞（マウス細胞）が、ベクターｓｈＲＮＡ６およびｓｈＲＮＡ９によりトランスフェクトされ、トランスフェクションの２４および４８時間後に３Ｔ３細胞の抽出物全体においてカスパーゼ−２のウェスタンブロットにより発現レベルをチェックした（図２３）。
【０１６２】
ｓｈＲＮＡ６およびｓｈＲＮＡ９構築物の両方が、トランスフェクションから４８時間後に３Ｔ３細胞においてカスパーゼ−２の発現をダウンレギュレートすることが可能であるようである。この結果は、ｓｈＲＮＡ戦略が、カスパーゼ−２発現のインビボサイレンシングのためのツールとして有用であることを示す。実際に、カスパーゼ−２ ｍＲＮＡをターゲットにするｓｈ−挿入断片は、いくつかのウイルスの主鎖（レチノウイルス、アデノウイルス、Semlikiウイルスまたは治療上の適用領域を有する任意のウイルス主鎖）に導入され得、この結果、効果的なインビボ送達およびカスパーゼ−２発現の効果的かつ長期のサイレンシングが可能である。
【０１６３】
さらに、特異的なｓｈＲＮＡ構築物がヒトへの適用のために得られた：
配列番号１０ ５’−ＧＡＴＣＣＣＧｃａｔｃｔｔｃｔｇｇａｇａａｇｇａｃａＧＡＡＧＣＴＴＧｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇａａｇａｔｇＴＴＴＴＴＴ−３’
配列番号１１ ５’−ＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡｃａｔｃｔｔｃｔｇｇａｇａａｇｇａｃａＣＡＡＧＣＴＴＣｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇａａｇａｔｇＣＧＧ−３’
（実験の部）
５’ ＢａｍＨ Ｉおよび３’ Ｘｂａ Ｉオーバーハング（overhang）を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドが合成された（Proligo）。アニーリング工程の後、これらのオリゴヌクレオチドは、予備処理された（ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ）ｐＧＥ−１ベクター（Stratagene）にクローニングされた。挿入断片を含む陽性クローンのＰＣＲ選択に続いて、２つのクローンが増幅され、それらの配列が検証された（ｓｈＲＮＡ６およびｓｈＲＮＡ９）。
【０１６４】
３Ｔ３細胞は、６ウェルディッシュに塗布された次の日に、リポフェクタミン（lipofectamine）２０００試薬および０．８μｇのｓｈＲＮＡ６またはｓｈＲＮＡ９プラスミドを用いて６時間にわたりトランスフェクトされた。トランスフェクションレベルは、ＧＦＰベクターを用いてモニタリングされた。トランスフェクション２４および４８時間後に、溶解バッファ（２５μＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００）において細胞が採取され、タンパク質濃度がBradford Reagent（BioRad）を用いて測定された。タンパク質（サンプル当たり２０μｇ）は、１２．５％のポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）を用いて分離され、ＰＶＤＦ膜（Ameesham）上に移された。カスパーゼ−２に特異的な抗マウスモノクローナル抗体（１１Ｂ４，Alexis Biochemicals，１：１０００の希釈度で用いた）を用いるプローブ探査の後、免疫反応性が化学発光キット（ECL，Amersham）を用いて検出された。
【表１Ａ】

【表１Ｂ】

（略語）：７−ＡＡＤ，７−アミノ アクチノマイシンＤ；フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル，ＡＥＢＳＦ，ペファブロック；ＡＮＴ，アデニンヌクレオチド・トランスロケータ；ＢＡ，ボンクレキン酸；ｍＣｌＣＣＰ，カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン；ΔΨ_ｍ，ミトコンドリア膜電位（transmembrane potential）；ＦＡＣＳ（Fluoroscence-Activated Cell sorting），蛍光活性型細胞選別；ＦＬＩＣＡ（Fluorochrome-Labeled Inhibitor of Caspase），カスパーゼの蛍光色素ラベル阻害剤；ＦＳＣ，順方向散乱；ＦＣ，フローサイトメトリー；ＦＭ，蛍光顕微鏡法；ＪＣ−１， ５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾールカルボシアニン ヨージド；ＭＦＩ，平均蛍光強度；ＰＭＴ，光電子増幅管（photo-multiplicator tube）；ＳＤ，血清欠乏；ＳＳＣ（side scatter），側方向散乱；ＭＰＴＰ，１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン；ＰＳ，ホスファチジル−セリン；ＰＴＰ（permeability transition pore），透過性遷移孔；Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ （ＯＭｅ）−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐｈ，Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ；ＳＮＰ，ニトロプルシドナトリウム；ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ，Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチル ケトン；ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，Ｎ−ベンジロキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン。
【０１６５】
（参照）
Caserta, T. M. , Smith, A. N. , Gultice, A. D. , Reedy, M. A. , and Brown, T. L. (2003). Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis 8, 345-352.
Chang, L. K. , and Johnson, E. M. Jr. (2002). Cyclosporin A inhibits caspase-independent death of NGF-deprived sympathetic neurons: a potential role for mitochondrial permeability transition. J. Cell Biol. 157,771-781.
Choi, W. S. , Lee, E. H. , Chung, C. W. , Jung, Y. K. , Jin, B. K., Kim, S. U. , Oh, T. H. , Saido, T. C. , and Oh, Y. J. (2001). Cleavage of Bax is mediated by caspase-dependent or- independent calpain activation in dopaminergic neuronal cells: protective role of Bcl-2. J. Neurochem. 77,1531-1541.
Deckwerth, T. L. , Elliott, J. L. , Knudson, C. M. , Johnson, E. M. Jr, Snider, W. D. , and Korsmeyer, S. J. (1996). BAX is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. 17,401-411.
Deshmukh, M. , Vasilakos, J. , Deckwerth, T. L. , Lampe, P. A., Shivers, B. D. , and Johnson, E. M. Jr. (1996). Genetic and metabolic status of NGF-deprived sympathetic neurons saved by an inhibitor of ICE family proteases. J. Cell Biol. 135,1341- 1354.
Deshmukh, M. , and Johnson, E. M. Jr. (1998). Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence- to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron 21, 695-705.
Ethell DW and Green DR (2002) Assessing Cytochrome-c release from mitochondria. In: Apoptosis techniques and protocols. (Humana Press), pp 21-34
Johnson EJ (1995) Methods for studying cell death and viability in primary neurons. Meth Cell Biol 46 243-276.
Kawamoto JC, and Barrett JN (1986) Cryopreservation of primary neurons for tissue culture. Brain Res 384: 84-93.
Knusel B, Michel PP, Schwaber JS, and Hefti F (1990) Selective and nonselective stimulation of central cholinergic and dopaminergic development in vitro by nerve growth factor, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin and the insulin-like growth factors I and II. J Neurosci 10 : 558-570.
Lecoeur H, de Oliveira Pinto L, and Gougeon ML (2002) Multiparametric flow cytometric analysis of biochemical and functional events associated with apoptosis and oncosis using the 7-aminoactinomycin D assay. J Immunol Methods 265 : 81-96.
Lecoeur H, Fevrier M, Garcia S, Riviere Y and Gougeon ML (2001) A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods 253 : 177-187.
Lecoeur, H. , Chauvier, D., Langonne, A. , Rebouillat, D., Brugg, B. , Mariani, J. , Edelman, L. , and Jacotot, E. (2004). Fixed-and real-time cytofluorometric technologies for dynamic analysis of apoptosis in primary cortical neurons. Apoptosis 9,157-169.
Lipton, P. (1999). Ischemic cell death in brain neurons. Physiol. Rev. 79,1431-1568.
Melnikov, V. Y. , Faubel, S. , Siegmund, B. , Lucia, M. S., Ljubanovic, D. , and Edelstein, C. L. (2002). Neutrophil- independent mechanisms of caspase-1-and IL-18-mediated ischemic acute tubular necrosis in mice. J. Clin. Invest. 110,1083-1091.
Plesnila N, Zinkel S, Le DA, Amin-Hanjani S, Wu Y, Qiu J, Chiarugi A, Thomas SS, Kohane, DS, Korsmeyer SJ, and Moskowitz MA (2001) BID mediates neuronal cell death after oxygen/ glucose deprivation and focal cerebral ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 : 15318-15323.
Robertson, J. D. , Enoksson, M. , Suomela, M. , Zhivotovsky, B., and Orrenius, S. (2002). Caspase-2 acts upstream of mitochondria to promote cytochrome c release during etoposide- induced apoptosis. J. Biol. Chem. 277,29803-29809.
Schneider U, Schwenk HU, Bornkamm G. Characterization of EBV- genome negative"null"and"T"cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 1977,19 : 621- 626.
Smolewski P, Grabarek J, Halicka HD, and Darzynkiewicz Z (2002) Assay of caspase activation in situ combined with probing plasma membrane integrity to detect three distinct stages of apoptosis. J Immunol Methods 265 : 111-121.
Susin, S. A. , Lorenzo, H. , Zamzami, N. , Marzo, I., Snow, B. E., Brothers, G. M. , Mangion, J. , Jacotot, E. , Costantini, P., Loeffler, M. , Larochette, N. , Goodlett, D. R. , Aebersold, R., Siderovski, D. P. , Penninger, J. M. , and Kroemer, G. (1999a). Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 397,441-446.
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】血清欠乏一次ニューロンのアポトーシス中の形質膜透過性能（plasma membrane permeabilization：ＰＭＰ）の合同型蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー検出。（Ａ）２４時間の血清欠乏（ＳＤ）に付されたまたは付されなかった（Co.）培養された皮質ニューロンの位相差および蛍光顕微鏡写真。細胞は、細胞透過性蛍光ＤＮＡリガンド・ヘキスト（登録商標）３３３４２（Ｈｏ．３４２，青色蛍光）および細胞不透過性蛍光ＤＮＡ挿入型７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；赤色蛍光）により染色された。優性表現型を示す一次皮質ニューロン（ＳＤに付された細胞の＞６０％）が示される。ＳＤ−ニューロンでは、紫色の蛍光（赤および青の混色）が７−ＡＡＤおよびヘキスト（登録商標）３３３４２が凝縮核（condensed nuclei）中に共存することを示し（併合における紫色蛍光）、したがって、ＰＭＰは、核アポトーシスに関係している。（Ｂ）ＰＭＰについてのトリトンの効果および培養されたニューロンのクロマチンの状態。培養されたニューロンは、７−ＡＡＤ、ヘキスト（登録商標）３３３４２および非毒性CellTracker（登録商標）グリーン蛍光染料により染色された。ニューロンの代表的な顕微鏡写真は、不存在下（Ｃｏ．）または０．０２％のトリトン（登録商標）による５分の処理後の、ヘキスト（登録商標）３３３４２および７−ＡＡＤの両方の併合（上側のパネル）によるかまたはCellTracker（登録商標）グリーンのみによる（下側のパネル）かのいずれかの位相差を示す。（Ｃ）ニューロンのトリプシン処理後のＰＭＰの欠如。７−ＡＡＤ、ヘキスト（登録商標）３３３４２およびCellTracker（登録商標）グリーンにより染色された培養されたニューロンが、注意深い分離トリプシンベース・プロトコルに付された（材料および方法の部に記載される）。（Ｂ）におけるようなトリプシン処理されたニューロン分析の代表的な顕微鏡写真が、トリプシン処理後０、１、３および４時間でのニューロンが関連するCellTracker（登録商標）グリーン蛍光のＦＣ定量化と共に示されている。（Ｄ）ＳＤ後のニューロンのＰＭＰおよび核濃縮のＦＭ分析。２４時間のＳＤに付された培養されたニューロンの代表的な顕微鏡写真は、ヘキスト（登録商標）３３３４２および７−ＡＡＤの両方による位相差の併合を示す。ＰＭＰ陽性ニューロン（紫色の核を有する）の百分率が示される。（Ｅ）ＰＭＰのＦＣ分析。（Ｄ）で分析されたニューロンのサンプルは、続いて、トリプシン処理され、直後に、ＰＭＰのＦＣ定量化に付される。代表的な点状プロット（ＦＳＣ／ＦＬ３）が示される。ＰＭＰ陽性ニューロンの百分率が計算されたＦＣが示される。挿入は、トリプシン処理された皮質ニューロンの代表的な位相差顕微鏡写真を示す。（Ｆ）ＦＭを用いたＰＭＰの相対的定量化（ｎ＝３０）（トリプシン処理前の光学的計数）およびＦＣ（トリプシン処理後の自動計数）。（Ｇ）ＦＭおよびＦＣベースのＰＭＰ定量化間の直線相関。
【図２】ニューロンアポトーシス中のＰＭＰ、ＰＳ露出および核改変の合同検出。（Ａ）２４時間のＳＤに付された培養された皮質ニューロンの蛍光顕微鏡写真。細胞は、７−ＡＡＤ（赤色蛍光）およびＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ（緑色蛍光）で染色された。一次皮質ニューロンは、３の主要なアポトーシスサブセットに分けられた：早期アポトーシス（アネキシンＶ^＋，７−ＡＡＤ⁻，サブセット１）、末期アポトーシス（アネキシンＶ^＋，７−ＡＡＤ^＋，サブセット２）、および終了段階のアポトーシス（アネキシンＶ⁻，７−ＡＡＤ^＋，サブセット３）。（Ｂ）ＰＭＰおよびＰＳ露出のＦＣ検出。ニューロンサブセット１、２および３の代表的な点状プロット分析。生きているニューロンは、ＰＳ転座を示さず（ＭＦＩアネキシンＶ＝８１．４±１７．９）、７−ＡＡＤに対して不透過性である（二重陰性のニューロン，サブセットＬ）。（Ｃ）ＳＤを通じてのアポトーシスサブセット出現のＦＣ速度論（ｎ＝４；±標準偏差）。（Ｄ）アポトーシスサブセット内のニューロンのサイズのＦＣベース分析（ＦＳＣ）と合わせて行われた核の境界のＦＭベースの測定。２４時間のＳＤに付された培養された皮質ニューロンは、ヘキスト（登録商標）３３３４２、７−ＡＡＤおよびＦＩＴＣ結合型アネキシンＶにより染色された。ＦＭ観察の間に複数の領域が取得され、次いで、順方向散乱（foward scatter）（ＦＳＣ）パラメータを用いてサンプルが細胞サイズのＦＣ分析に進められた。核の境界（ｎ＝１５；±標準偏差）およびＦＳＣ（ｎ＝７；±標準偏差）の同時評価がサブセット毎を基礎として提示される。（Ｅ）生きているニューロン（サブセットＬ）および死滅ニューロン（サブセット１、２、３）のＦＳＣ、ＳＳＣおよび核特性の詳細な分析。アステリスクは、非常に有意であること（ｐ＜０．０００１）を示し、§は、以前のサブセットと比較して有意な（ｐ＜０．０５）効果を示す。
【図３】活性化されたカスパーゼ−９、カスパーゼ−３、ＰＳ露出およびＰＭＰの検出および分子レベルの順序付け。（Ａ）２４時間のＳＤに付された培養された皮質ニューロンの蛍光顕微鏡写真。細胞はＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（ＦＬＩＣＡ；緑色蛍光）、７−ＡＤＤ（赤色蛍光）およびヘキスト（登録商標）（青色蛍光）により染色された。４つの明瞭な表現型が検出される：生きているニューロン（カスパーゼ−３⁻，７−ＡＡＤ⁻，サブセットＬ）、早期アポトーシスのニューロン（カスパーゼ−３^＋，７−ＡＡＤ⁻，サブセット１）、末期アポトーシスのニューロン（カスパーゼ−３^＋，７−ＡＡＤ^＋，サブセット２）および終了段階のアポトーシスのニューロン（カスパーゼ−３⁻，７−ＡＡＤ^＋，サブセット３）。（Ｂ）ＰＭＰおよびカスパーゼ−３様活性のＦＣ同時検出。ニューロンサブセットＬ（青色）、１（緑色）、２（黄色）および３（赤色）の代表的なＦＣ点状プロット分析。（Ｃ）汎（pan）カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨの存在下のニューロン保護。培養された皮質ニューロンの蛍光顕微鏡写真が作成され、「Ａ」として標識付けされた。（Ｄ）カスパーゼ−３活性化およびＰＭＰについてのアポトーシス調節化合物の効果。ニューロンは、セリンプロテアーゼ阻害剤ペファブロック、ＡＮＴ阻害剤ＢＡまたは示されたカスパーゼ阻害剤（ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）により処理され、２４時間の血清欠乏に付された。細胞は、７−ＡＡＤ（赤色蛍光）により染色され、活性化されたカスパーゼ−３に対して抗体染色され、そして、ＦＣ分析に付された。結果は、３の別個の実験の平均値（±標準偏差）である。（ＥおよびＦ）血清欠乏を通じてのカスパーゼ−３活性およびＰＳ露出のＦＭおよびＦＣ速度論分析。細胞は、スルホロダミン結合型ＦＬＩＣＡ（赤色蛍光）、ＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ（緑色蛍光）およびヘキスト（青色蛍光）により染色された。（Ｅ）に提示された蛍光顕微鏡写真は、点状プロット（Ｆ）に示されたサブセット「ａ」〜「ｄ」に対応する。（Ｇ）カスパーゼ−９阻害剤ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋの不存在下（ＳＤ）または存在下（＋ＬＥＨＤ）での２４時間の血清抜き出しに付された培養された皮質ニューロンの蛍光顕微鏡写真。細胞は、ヘキスト（登録商標）（青色蛍光）により染色され、および、パネル１ではＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（ＦＬＩＣＡ；緑色蛍光）により同時染色され、または、パネル２ではＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ（緑色蛍光）により同時染色された。（Ｈ）ＡＮＴ様チェック・ポイント、カスパーゼ−９様活性およびＰＭＰ間の階層性。ニューロンは、ＡＮＴブロッカーであるＢＡまたはｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋにより処理され、２４時間のＳＤに付された。細胞は、７−ＡＡＤ（赤色蛍光）により染色され、ＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋにより同時染色され、次いで、ＦＭ分析に付された。結果は、３の別個の実験の平均値（±標準偏差）である。
【図４】ニューロンにおけるΔΨ_ｍおよびＰＭＰの合同検出。（Ａ）指定された期間にわたり、血清の不存在下または存在下（２４時間−対照；Ｃｏ）に培養された一次ニューロンの蛍光顕微鏡写真。細胞は、ヘキスト（登録商標）３３３４２（青色蛍光）およびΔΨ_ｍ−高感度染料ＪＣ−１（オレンジ色蛍光：高ΔΨ_ｍのミトコンドリア，緑色蛍光：低ΔΨ_ｍのミトコンドリア）により染色された。優性表現型を示すニューロンが示される（＞５０％）。Ｄｅｃ，決定期；Ｅｆｆ，実行期；Ｄｅｇ，分解期。（Ｂ）ΔΨ_ｍおよびＰＭＰのＦＣ点状プロット分析。ＳＤ−ニューロンは、７−ＡＡＤおよびＪＣ−１により染色され、トリプシン処理され、直後に、ＦＣ分析に付された。ＦＬ２（ＪＣ−１）／ＦＬ３（７−ＡＤＤ）の点状プロットは、２つの低ΔΨ_ｍニューロンサブセット：７−ＡＡＤに対して非透過性のサブセットＩＩ’およびＩＩ”（７−ＡＡＤ陽性）を示した。（Ｃ）ΔΨ_ｍ（ＪＣ−１）および形質膜透過性能（７−ＡＡＤ）の同時検出を介するサブセットＩ、ＩＩ’、ＩＩ”のＦＭ視覚化。（Ｄ）血清欠乏ニューロンにおけるサブセットＩＩ’およびＩＩ”のＦＣ経時モニタリング。（Ｅ）ＦＣによって評価されたＢＡによるがｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋによらないニューロン保護。ヒストグラムは、ＢＡまたはｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋの不存在下または存在下におけるＳＤの２４時間後の低ΔΨ_ｍニューロン（サブセットＩＩ’＋ＩＩ”，青色ヒストグラム）の百分率または７−ＡＡＤ陽性ニューロン（サブセットＩＩ”，黒色ヒストグラム）の百分率のいずれかを示す。結果は、３の別個の実験の平均である（平均±標準偏差）。
【図５】一次皮質ニューロンにおけるΔΨ_ｍ変動の実時間検出。（Ａ）ＦＭ反復照射により誘発されるＪＣ−１フォトブリーチング（photobleaching）。１、３、５、１０および１５照射（１．２秒；５ワット）後のＪＣ−１染色ニューロンの蛍光顕微鏡写真。２の照射の間のインターバルは１分であった。オレンジ色の蛍光が徐々に消失することに留意のこと。（Ｂ）照射範囲（field）により評価されたＪＣ−１オレンジ色蛍光強度の対数回帰（logarithmic regression）。（Ｃ）ＪＣ−１および７−ＡＡＤプローブを用いるΔΨ_ｍおよびＰＭＰの実時間ＦＣモニタリングのためのプロトコル。挿入された蛍光顕微鏡写真は、トリプシン処理後にヘキスト（登録商標）、ＪＣ−１および７−ＡＤＤにより同時染色された一次ニューロンの代表的な視覚化を示す。これらの実験条件ではＰＭＰも、ΔΨ_ｍ損失（神経突起（neurite）および細胞体）も、核凝縮も検出不能であることに留意のこと。（Ｄ）一次ニューロンへの適用。（Ｄ１）ｍＣｌＣＣＰ（１００μＭ；３０分）により処理されたまたはされない（Ｃｏ．）ニューロンの蛍光顕微鏡写真。（Ｄ２）ＪＣ−１オレンジ色およびＪＣ−１緑色蛍光の実時間ＦＣモニタリング。白色線は、ニューロンの平均蛍光に対応する。（Ｄ３）同一サンプルで得られたミトコンドリア脱分極（ＪＣ−１オレンジ色）、ＰＭＰ（７−ＡＡＤ）およびサイズ（ＦＳＣ）／粒状度（ＳＳＣ）変異の時間過程（対照（波線）およびｍＣｌＣＣＰ処理（実線））。
【図６】種々のニューロン毒性（neurotoxic）分子によるΔΨ_ｍ改変およびＰＭＰ誘導の実時間ＦＣ分析。（Ａ−１）ΔΨ_ｍおよび形質膜状態の固定時間のＦＭ。ニューロンは、０．６ｍＭのＳＮＰまたは１ｍＭのＭＰＴＰまたは２０ｍＭのエタノール（ｅｔＯＨ）により４５分にわたり処理された（または処理されない；Ｃｏ．）。細胞は、ＪＣ−１（オレンジ色蛍光：高ΔΨ_ｍのミトコンドリア、緑色蛍光：高ΔΨ_ｍのミトコンドリア）、ヘキスト（登録商標）（青色蛍光）および７−ＡＡＤ（赤色蛍光）により染色された。（Ａ−２）１５分間にわたる培地のみ（Ｃｏ．）、０．６ｍＭのＳＮＰ、１ｍＭのＭＰＴＰまたは２０ｍＭのｅｔＯＨによる処理のΔΨ_ｍの実時間ＦＣ分析（ＪＣ−１オレンジ色蛍光）。オレンジ色の事象は、高ΔΨ_ｍニューロンに対応し、緑色事象は、低ΔΨ_ｍニューロンに対応する。（Ａ−３）ＰＭＰの実時間ＦＣ分析（７−ＡＡＤ蛍光）。（Ｂ）実時間ＦＣによる定量化。（Ｂ−１）ＭＰＴＰ処理ニューロンのＦＳＣ／ＳＳＣ比の分析。赤色線は、高ΔΨ_ｍニューロンについてのＦＳＣ／ＳＳＣ比の平均値に対応し、緑色破線は、低ΔΨ_ｍニューロンについてのＦＳＣ／ＳＳＣ比の平均値に対応する（Ａ−２と同義）。黒色実線は、ニューロン個体群全体についてのＦＳＣ／ＳＳＣ比の平均値に対応する。（Ｂ−２）ＭＰＴＰ処理ニューロンにおけるＪＣ−１オレンジ色平均蛍光強度（ＭＦＩ）の分析。赤色実線および緑色波線は、高ΔΨ_ｍおよび低ΔΨ_ｍニューロン中のＪＣ−１オレンジ色ＭＦＩにそれぞれ対応する。黒色実線は、ニューロン固体群全体についてのＪＣ−１オレンジ色ＭＦＩに対応する。（Ｂ−３）ｅｔＯＨ処理ニューロンにおける７−ＡＡＤ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の分析。
【図７】ＳＤによって誘導されるニューロン死の間のアポトーシス関連事象の階層性。アポトーシスの主要な期が、それらの対応する細胞下の事象と共に示される。細胞死の間のニューロンの挙動の美的な描写が提示される。生きているニューロンは、青色の核（ヘキスト（登録商標）ラベリング）および赤色のミトコンドリア（ＪＣ−１ラベリング；高ΔΨ_ｍ）により描かれる。決定期の間、緑色のミトコンドリアも現れる（ＪＣ−１ラベリング；低ΔΨ_ｍ）。実行期は、核収縮およびカスパーゼ−３活性の拡散（ピンク色のサイトゾルの拡散）と関連する。分解期は、神経突起の破壊、ＰＳ露出（緑色の形質膜）および不連続のサイトゾルの活性化されたカスパーゼ−３と関連する。分解の終了段階は、核の７−ＡＡＤ混合（赤色の収縮した核）に至る最終的な形質膜透過性能（ＰＭＰ）と関連する。Ｂａｘ切断および転座は、ミトコンドリアの上流ではあるが、カスパーゼ−２活性の下流に現れた。特異的阻害剤の作用点が示される。
【図８】汎カスパーゼ阻害は、血清欠乏により死に誘導された一次皮質ニューロンの生き残りを促進する。（Ａ）４８時間の血清欠乏（ＳＤ）皮質ニューロン培養（ＤＩＶ６）を通じてのアポトーシスの特徴に対する経時応答。低ΔΨ_ｍのニューロンの出現の速度論（ｎ＝３０）、核アポトーシス（ＮＡ）（ｎ＝３０）、形質膜の透過性能（ＰＭＰ）（ｎ＝３０）またはホスファチジルセリン残渣（phosphatidylserine residue）の外部の小葉状部（leaflet）露出（ＰＳ）（ｎ＝７）が、ＪＣ−１、ヘキスト（登録商標）３３３４２、７−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）またはＦＩＴＣ結合型アネキシンＶによりそれぞれラベリングされたニューロンの蛍光顕微鏡法およびサイトメトリー分析の両方によって測定される（Lecoerら(2004)に既に記載されている）。低ΔΨ_ｍ／ＮＡ^＋／７−ＡＡＤ^＋／ＦＩＴＣ−アネキシンＶ^＋サブセットの終期の低ΔΨ_ｍ／ＮＡ^＋／７−ＡＡＤ^＋／ＦＩＴＣ−アネキシンＶ⁻サブセットへの移行を示しているので、２４時間後のＰＳ陽性ニューロンが徐々に減少していることに留意のこと（Lecoeurら（２００４））。（Ｂ）ニューロン保護についての種々の汎カスパーゼ阻害剤の比較分析。ニューロンは、広範なスペクトルを有するカスパーゼ阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）またはＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ（ＢＯＣ−Ｄ）（すべて１００μＭ）に付随してＳＤに付される。ヒストグラムは、対照（Ｃｏ．）レベル近くのままで残る、低ΔΨ_ｍ（ｎ＝１２）、ＮＡ（ｎ＝１２）、ＰＳ露出（ｎ＝７）およびＰＭＰ（ｎ＝１２）のニューロンの百分率を示す。（Ｃ）Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨは、２４時間のＳＤ後の核形態および神経突起の完全性の両方を高度に保護した。対照（Ｃｏ．）、ＳＤおよびＱ−ＶＤ−ＯＰＨ処理ニューロン（１００μＭ）についての代表的な範囲：上側パネル，位相差顕微鏡写真；下側パネル，位相差および青色の核ヘキスト（登録商標）蛍光が併合される。汎カスパーゼ阻害剤の存在下に顕著な神経突起完全性崩壊および核凝縮／断片化の両方がみられないことに留意のこと。（Ｄ）２４時間のＳＤの間に４種のカスパーゼが少なくとも活性化される。カスパーゼ−２（ｎ＝１４）、カスパーゼ−８（ｎ＝３）、カスパーゼ−９（ｎ＝８）の活性化がＦＬＩＣＡ、ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、ＦＡＭ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫおよびＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫを用いることによってそれぞれ検出された。カスパーゼ−３の活性化は、フィコエリトリン（phycoerythrin）結合型抗切断（cleaved）カスパーゼ−３ポリクローナル抗体（ｎ＝５）またはＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（ｎ＝１２）いずれかにより検出された。２つのアプローチはよく相関する。ＳＤの間のカスパーゼ−８活性化は低レベルであることに留意のこと。これら全てのカスパーゼは、１００μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰＨによって完全に不活性化される。（Ｅ）広範なスペクトルのカスパーゼ阻害剤は、皮質ニューロンを、β−アミロイド（２５−３５）（βＡ）、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）またはイオノマイシン（ionomycin：Ｉｏｎｏ．）によって誘導されるＮＡおよびＰＭＰから有意に妨げることができない。皮質ニューロンは、１００μＭのＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）またはＱ−ＶＤ−ＯＰＨ（ＱＶＤＯＰＨ）の不存在下または存在下に、２４時間にわたりイオノマイシン（６μＭ）またはβＡ２５−３５（６０μＭ）により；４８時間にわたりＭＰＴＰ（２μＭ）、３−ＮＰＡ（１００μＭ）またはＳＮＰ（５００μＭ）により処理される。（Ａ）のようにＮＡおよびＰＭＰの両方を示すニューロンがカウントされる。対応のないｔ検定（Unpaired Student’s test）が行われた：＃，ｐ＝０．０１。
【図９】前ミトコンドリアカスパーゼ−２様活性が、血清欠乏により誘導される皮質ニューロンのアポトーシス細胞死に必要とされる。（Ａ）カスパーゼ−２様活性が、ＳＤ誘導細胞死中に検出される最も早期の事象である。カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−２の特異的な阻害剤がＳＤの初期に、それぞれ１００μＭで加えられる：Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（ＤＥＶＤ）（ｎ＝８）、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ＬＥＨＤ）（ｎ＝６）、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ＬＥＴＤ）（ｎ＝４）、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ（ＶＤＶＡＤ）（ｎ＝１０）。ΔΨ_ｍ降下、ＮＡ、ＰＳ露出およびＰＭＰがＪＣ−１、ヘキスト（登録商標）３３３４２、７−ＡＡＤおよびＦＩＴＣ結合型アネキシンＶの染色の２４時間後にそれぞれ測定される。ＶＤＶＡＤは、ＤＥＶＤおよびＬＥＴＤとは逆に、これらのアポトーシスのホールマークを完全に破壊した。ＰＳ露出、ＮＡおよびＰＭＰを妨げるものの、ＬＥＨＤは、ΔΨ_ｍの降下を損なわない。アスタリスクは、図２Ｂに示されるようなＬＥＨＤ処理されたニューロンにおける特定の核表現型を表す。結果は、阻害効果の％として表現される。（Ｂ）特異的なカスパーゼ阻害剤により処理されたニューロンの核についての代表的な蛍光顕微鏡写真。ＤＥＶＤおよびＬＥＴＤとは対照的に、ＶＤＶＡＤ処理されたニューロンのヘキスト（登録商標）３３３４２染色核は対照と類似の形態を示す。ＬＥＨＤ処理されたニューロンの核は、段階Ｉの凝縮（Susinの分類による(Susinら(1999))）に対応する縮小されたサイズを有する。（Ｃ）ＳＤニューロンにおいてカスパーゼ−２様活性化はΔΨ_ｍ降下より先に起こる。カスパーゼ−２活性化およびΔΨ_ｍ変化の速度論は、ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＡＭ（緑色）およびΔΨ_ｍ高感度染料ＣＭＸＲｏｓ（赤色）の両方による同時染色後の蛍光顕微鏡法によって評価される。カスパーゼ−２様活性（２時間）は、ΔΨ_ｍが徐々に降下する（８．５時間）前に検出される。ｍＣｌＣＣＰ（１００μＭ，４５分）が完全なミトコンドリア膜の脱分極についての陽性対照として用いられる。（Ｄ）カスパーゼ−２、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９間の階層性の評価。それぞれに示されるカスパーゼ阻害剤（１００μＭ）およびセリンプロテアーゼ阻害剤であるペファブロック（Pefabloc）（１００μＭ）がＳＤの開始時に加えられ、カスパーゼ様活性が２４時間後に特異的なＦＬＩＣＡを用いることによって検出される。ヒストグラムは、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９（ｎ＝４）についての阻害の％を示す。
【図１０】ＱＶＤＯＰＨまたはＶＤＶＡＤ誘導ニューロン保護の最良パターンの測定。ニューロン細胞死は、阻害剤を欠くＳＤ培養への記録されたカスパーゼ阻害剤の存在下での２４時間のＳＤ後に低ΔΨ_ｍ（ＪＣ−１緑色）、ＮＡ表現型（ヘキスト（登録商標３３３４２））およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ赤色蛍光の混合）を同時に示すニューロンに相当する。左側パネルは、ＳＤ初期に加えられた各阻害剤についての用量−応答を示し、最適の生き残りには１００μＭが必要とされることを確認する。さらに、１００μＭのＶＤＶＡＤまたはＱＶＤＯＰＨのいずれかの保護効果（ｔ＝２４時間での）は、ＳＤの開始後２、４または６時間経過した時に徐々に低下する（右側のパネル）。ニューロンは、蛍光顕微鏡法によってカウントされる（ｎ＝３）。
【図１１】血清欠乏によって誘導されるカスパーゼ−２媒介アポトーシスについての遺伝子の証明：ＲＮＡ干渉アプローチによるカスパーゼ−２のノックダウン。（Ａ）小さい干渉ＲＮＡによるマウスカスパーゼ−２の遺伝子サイレンシング。ＤＩＶ６にあるニューロンは、実験の部において記載されるように６時間にわたりｓｉＲＮＡによりトランスフェクト（transfect）され、その後にＮ５媒体においてさらにインキュベーションされる。上側パネル：トランスフェクション後２４時間の内因性カスパーゼ−２遺伝子発現がＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、他の遺伝子（カスパーゼ−９、ＧＡＰＤＨ）に対する副作用が全くなくカスパーゼー２発現を減少させることに留意のこと。下側パネル：ＳｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによる対照ニューロンにおける後カスパーゼ−２のノックダウンがウェスタンブロット法によって評価された。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍは、遺伝子サイレンシングについての陰性対照である。ＧＡＤＰＨが等価な負荷対照として用いられる。（Ｂ）抗体染色（１０Ｃ６）によるカスパーゼ−２ノックダウンの細胞内モニタリング。蛍光強度は、７０％においてｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによるトランスフェクション後２４時間の間に減少し、７２時間において徐々に回復する。続いて、ＦＭ（条件毎および実施毎に１５０の無作為に選択された細胞に対応する５つの領域）の下で、Leica Q FluoroソフトウェアのProbemeterオプションを用いることにより蛍光吸光が行われた。ノックダウンは全てのニューロンに起こることに留意のこと。（Ｃ）ＳＤニューロンでのＲＮＡ干渉後にカスパーゼ−２活性および細胞死のパラメータが完全に破壊される。ＤＩＶ６において６時間にわたりｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたニューロンは、血清が豊富な培地において１６時間にわたり再培養され、その後、さらに２４時間、血清がない培地条件とされる。代表的な蛍光顕微鏡写真：核凝縮／断片化（ヘキスト（登録商標）；青色）、カスパーゼ−２活性（ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ，緑色；サブセット１）およびＰＭＰ（７−ＡＡＤ；赤色；サブセット３）；サブセット２は、カスパーゼ−２および７−ＡＡＤの両方が陽性のニューロンを表す。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｍとは異なり、ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、カスパーゼ−２活性化を妨げる（ｎ＝５）。（Ｄ）カスパーゼ−２活性は、ＳＤ誘導型ニューロン細胞死にとって重大であるが、イオノマイシン誘導型ニューロン細胞死にとっては重大ではない。ＲＮＡ干渉は、ＳＤ細胞死の他のホールマークを妨げる。示された阻害剤（１００μＭ）またはｓｉＲＮＡの不存在下または存在下の細胞死パラメータの定量化（ｎ＝５）。ニューロンは、ＲＮＡ干渉のために（Ｃ）のように処理される。ΔΨ_ｍ降下、ＮＡ、ＰＳ露出およびＰＭＰが、ＪＣ−１、ヘキスト（登録商標）３３３４２、７−ＡＡＤおよびＦＩＴＣ結合型アネキシンＶ染色によってそれぞれ測定される。２４時間にわたる６μＭのＣａ^２＋イオノフォアによる処理によって誘導される細胞死経路は、カスパーゼ−２とは無関係である：ＶＤＶＡＤまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによる保護は存在しないことに留意のこと（ｎ＝３）。（Ｅ）イオノマイシン処理（６μＭ，２４時間）と対比したＳＤ後のＰＭＰ（７−ＡＡＤ混合）、核（ヘキスト（登録商標）；青色）および神経突起形態に関するｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔの保護効果を示す立体写真（anaglyph）；ピンク色の蛍光は、ヘキスト（登録商標）および７−ＡＡＤの併合の結果による。蛍光は、位相差画像と併合された。
【図１２】カスパーゼ−２は、２４時間の血清欠乏ニューロンにおいて後ミトコンドリア・シトクロムｃ放出および前ミトコンドリアＢａｘ転座の両方に必要とされる。（Ａ）ＶＤＶＡＤおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、後ミトコンドリア・シトクロムｃ放出を減少させる。左側パネル：選択的カスパーゼ阻害剤（１００μＭ）の効果に対応する蛍光顕微鏡写真。２４時間の血清抜き出し中に阻害剤によって処理されたまたは処理されないニューロンが、ヘキスト（登録商標）３３３４２（青色）およびシトクロムｃを認識するモノクローナル抗体（６Ｈ２．Ｂ４）（赤色）により染色される。ＳＤは、ミトコンドリア（明確な染色）からの細胞質のシトクロムｃの放出（染色の拡散）の引き金となる。右側パネル：ＦＭによるシトクロムｃ放出についての対応する定量化（ｎ＝４）。ｓｉＲＮＡアッセイのために、ＤＩＶ６におけるニューロンは、６時間にわたりｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされ、次いで、Ｎ５完全培地において培養され、その後、さらに２４時間のＳＤに付される。ペファブロック（１００μＭ）、カスパーゼ−９阻害剤であるＬＥＨＤおよびカスパーゼ−３阻害剤であるＤＥＶＤは、シトクロムｃの放出を損なうことができないことに留意のこと。（Ｂ）ＲＮＡ干渉は、カスパーゼ−２活性化を完全に破壊し、下流のカスパーゼ−９およびカスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性の活性化を妨げる。ニューロンは、Ａのように、または１００μＭのＱＶＤＯＰＨまたはＶＤＶＡＤにより処理され、ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫおよびＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫにより染色される（ｎ＝４）。２４時間にわたるイオノマイシン（６μM）により誘導される細胞死経路は、皮質ニューロンにおけるカスパーゼ−２活性化とは無関係であることに留意のこと（他のカスパーゼ活性化は試験されていない）。（C）ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによる細胞内カスパーゼ−３不活性化についての代表的な顕微鏡写真：上側パネル、青色の核のヘキスト（登録商標）蛍光およびカスパーゼ−３（細胞質）緑色蛍光が併合される；下側パネル、ＰＭＰの結果による赤色の７−ＡＡＤの核の蛍光および細胞質のカスパーゼ−３の緑色蛍光が併合される。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、カスパーゼ−３活性化、ＮＡおよびＰＭＰを完全に破壊した。（Ｄ）ＶＤＶＡＤおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、前ミトコンドリアのＢａｘ転座を減少させる。選択的カスパーゼ阻害剤（１００μＭ）およびｓｉＲＮＡの効果の蛍光顕微鏡写真（左側パネル）および対応する定量化（右側パネル）。未処理のニューロンおよびＡのように阻害剤またはｓｉＲＮＡのいずれかにより処理されたニューロンは、２４時間の血清抜き出し時にヘキスト（登録商標）３３３４２（青色）およびＢａｘを認識するポリクローナルΔ２１抗体（緑色）により染色され、その後に、ＦＭ（条件毎および実施毎に１５０〜３００の無作為に選択された細胞に対応する１０領域）の下に得点が付けられる（ｎ＝４）。細胞質（拡散染色）からミトコンドリア（明確な染色）へのＢａｘの再配置は、ＶＤＶＡＤ、ＱＶＤＯＰＨおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔによって妨げられる。ペファブロック、ＬＥＨＤおよびＤＥＶＤは、Ｂａｘ再配置を損なうことができないことに留意のこと。
【図１３】Ｂａｘ転座およびカスパーゼ−２活性の両方についてのＶＤＶＡＤ対フロセミドの保護効果の位置づけ。（Ａ）カスパーゼ活性は、Ｂａｘ転座の上流である。ニューロンは、２４時間のＳＤの当初において２ｍＭのフロセミド（Ｆｕｒｏ．）または１００μＭのＶＤＶＡＤと共にインキュベートされる。ニューロンは、ヘキスト（登録商標）３３３４２（青色）によりラベリングされ、かつ、Ｂａｘに対してＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによりΔ２１抗体により抗体染色される（上側パネル；緑色）か、または、ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫによりラベリングされる（下側パネル；緑色）。代表的な蛍光顕微鏡写真は、ＳＤ上のミトコンドリアＢａｘ再配置は、カスパーゼ−２活性を損なうことなくフロセミドによって部分的に妨げられることを示す。対照的に、ＶＤＶＡＤは、カスパーゼ−２活性化およびＢａｘ再配置の両方を阻止する。（Ｂ）（Ａ）のような処理後のＢａｘ再配置またはカスパーゼ−２活性を示すニューロンのＦＭによる定量化（ｎ＝４）。ペファブロックは陰性対照である。（Ｃ）フロセミドによるＢａｘ転座の阻害は、ΔΨ_ｍ降下、ＮＡ、ＰＭＰおよびシトクロムｃ放出を損なった結果として生じる。２４時間のＳＤの当初に２ｍＭのフロセミドまたは１００μＭのＶＤＶＡＤにより処理されたニューロンは、ＪＣ−１、ヘキスト（登録商標）３３３４２、７−ＡＡＤおよびシトクロムｃを認識するモノクローナル抗体（６Ｈ２．Ｂ４）によりラベリングされる。細胞は、ＦＭにより計測される（ｎ＝３〜８）。
【図１４】Ｂａｘα切断は、ＳＤの間には細胞質カスパーゼ−２依存性およびカルパイン非依存性の両方である。（Ａ）カスパーゼ−２ ｍＲＮＡは、２４時間ＳＤのニューロンにおけるＲＴ−ＰＣＲによって分析され、これはＲＮＡレベルの変動を示さない。ＧＡＰＤＨ発現が負荷対照（loading control）として用いられる。（Ｂ）カスパーゼ−２が介在するＢａｘ切断の特徴。ニューロンは、２、５、８、１５および２４時間にわたりＳＤに付され、Ｂａｘ切断の経時過程が、カルボキシ末端の２１アミノ酸を欠失をしたマウスのＢａｘαに対して生じさせられたウサギのポリクローナル抗体（Δ２１）を用いるウェスタンブロット法によって分析される。未変性のｐ２２ Ｂａｘは、ｐ１８ Ｂａｘとして早期かつ徐々に切断される。（Ｃ）１８ｋＤａ体へのＢａｘ切断がＳＤ中にＮ末端において起こる。右側パネル：カルボキシ末端２１のアミノ酸を欠失したマウスのＢａｘαに対して生じさせられたウサギのポリクローナル抗体（Δ２１）およびＢａｘαのアミノ末端にマッピングしたペプチドに対して生じさせられたウサギのポリクローナル抗体（Ｎ２０）を用いることによる同一サンプル（対照およびＳＤニューロン）のウェスタンブロット分析の比較。両抗体は、未変性Ｂａｘを認識するが、切断されたＢａｘは、Δ２１により検出されるのみである。（Ｄ）プロテアーゼ阻害剤のＢａｘ切断のプロファイルは、１００μＭのＶＤＶＡＤまたはｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔ（３．８μｇ）の存在下での２４時間にわたるＳＤで特徴付けられる。ＶＤＶＡＤおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔは、Ｂａｘ切断を妨げる。Ｂａｘ切断は、カスパーゼ−２の存在およびカスパーゼ−２の活性の両方に依存する。ウェスタンブロット法は、Δ２１抗体を用いることによって行われる。（Ｅ）血清欠乏は、切断されたｐ１８ ＢａｘのＢａｘ転座をミトコンドリアに誘導するが、これは、ｐ１８ Ｂａｘがさらなるミトコンドリアの変化を促進するための活性形であることを示唆する。ミトコンドリアのフラクションおよびＳＤニューロンのサイトゾルが単離され、Ｂａｘの転座がΔ２１抗Ｂａｘ抗体を用いることによるウェスタンブロット法によって検出される。マウスの抗ＨＳＰ６０抗体がミトコンドリアのフラクションをチェックするために用いられる。ｐ２２ Ｂａｘが２４時間ＳＤのニューロンのサイトゾル中に存在する。しかしながら、Ｂａｘは、２４時間のＳＤにおいて、サイトゾルからミトコンドリアに非局在化するｐ１８の形態で部分的に切断される。ｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔまたはＶＤＶＡＤは、ｐ１８ Ｂａｘのミトコンドリア膜への集積を妨げる。（Ｆ）カスパーゼ−２が介在するＢａｘ切断は、皮質ニューロンにおいて刺激特異的である。ニューロンは、ＶＤＶＡＤ（１００μＭ）の存在下または不存在下に８、１５または２４時間にわたりスタウロスポリン（ＳＴＳ，１０μＭ）またはイオノマイシンによって処理され、その後に、Δ２１抗体を用いる免疫ブロット法分析が行われる。ＳＴＳおよびイオノマイシンは、皮質ニューロンにおいてカスパーゼ−２非依存性のＢａｘ切断を誘導する。（Ｇ）Ｂａｘ切断は、カルパインによって介在されない。特異的（カルパインＩについて２５μＭのＡＬＬＮ；カルパインＩＩについて２５μＭのＡＬＬＭ）および広スペクトル（２５〜５０μＭのＥ６４ｄ）のカルパイン阻害剤の２４時間ＳＤが誘導するＢａｘ切断を阻止する能力は、Ｂのように検査される。これらの阻害剤は、１００μＭのＱＶＤＯＰＨとは対照的にＢａｘ切断を妨げることが不可能である。ウェスタンブロット法が、Δ２１抗体を用いることによって行われる。（Ｈ）プロテアソーム活性の阻害によるｐ１８ Ｂａｘの安定化。ニューロンは、プロテアソーム阻害剤：ラクタシスチン（Lactacystin）１−１０μＭ（Ｌａｃｔ．）およびエポキソマイシン（Epoxomycin）１０μＭ（Ｅｐｏｘ．）の不存在下または存在下に血清不含有培地において２４時間にわたり培養される。ウェスタンブロット法が、Δ２１抗体を用いることによって行われる。（Ｉ−Ｊ）２４時間ＳＤニューロンにおけるカスパーゼ−２の状態：ラットのモノクローナル抗マウスカスパーゼ−２抗体（１１Ｂ４）を用いるＲＴ−ＰＣＲ（Ｉ）およびウェスタンブロット法（Ｊ）による分析。ＶＤＶＡＤ（１００μＭ）がＳＤの当初に加えられる。後カスパーゼ−２タンパク質の含有量は、カスパーゼ−２ ｍＲＮＡレベルを変化させることなくＳＤの間に減少する。ＧＡＤＰＨが、等価な負荷対照として用いられる。後カスパーゼ−２タンパク質は、アップレギュレーションもダウンレギュレーションもされないが、後カスパーゼ−２は、むしろ、ＶＤＶＡＤアーゼ依存性の方法でｐ１４体として処理される。（Ｋ）ＳＤの間の典型的なカスパーゼ−２局在化：カスパーゼ−２は、ＳＤの間マウスの一次皮質ニューロンの細胞質中に拡散したままである。ＤＩＶ６におけるニューロンは、血清不含有の培地において８、１６および２４時間にわたり培養され、その後、ラットのモノクローナル抗マウスカスパーゼ−２抗体（１０Ｃ６；赤色）により染色される。核は、１μＭのヘキスト（登録商標）３３３４２（青色）により対比染色される。（Ｌ）損傷中のカスパーゼ−２の細胞質の分布は刺激依存性である。ニューロンは、細胞毒性濃度のＣａ^２＋イオノフォアであるイオノマイシン（６μＭ）、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（ＳＴＳ，１０μＭ）、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテシン（ＣＰＴ，１０μＭ）によって処理されるか、血清不含有培地において２４時間にわたり培養され、その後に、（Ｊ）のように染色される。ＳＤとは異なり、カスパーゼ−２の完全な核の再配置が、イオノマイシンおよびＳＴＳによる処理の間に起こる。核の再配置は、ＣＰＴについて部分的である。
【図１５】Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨによる特異的なカスパーゼ−２阻害は、新生児の虚血脳損傷に対して、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨによる汎カスパーゼ阻害より良好なニューロン保護を提供する。（Ａ）組み換えカスパーゼ−２によるインビトロのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ切断。組み換えヒト・カスパーゼ−２（１２５Ｕ）による５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣの切断が、３０分後に３７℃で測定され、その後に、選択的カスパーゼ阻害剤または汎カスパーゼ阻害剤と共にインキュベートされた（２μＭ）（ｎ≧２）。カスパーゼ−２切断活性は、原型化合物であるＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨによって阻止され、これは、特異的カスパーゼ−２阻害剤（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−Ｃｈｏ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）およびＱ−ＶＤ−ＯＰＨと効果が同等である。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫによる切断阻害はそれほど重要ではないが、ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫは、カスパーゼ−２に対して完全に不活性である。カスパーゼ−３様阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）は、カスパーゼ−２活性に大きくは干渉しない。カルパイン阻害剤であるＥ６４ｄは、陰性対照として用いられる。（Ｂ）Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨは、ＳＤ−皮質ニューロン培養の生き残りを促進する。Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨは、ＤＩＶ６におけるニューロンに２４時間にわたるＳＤの当初に投与される。カスパーゼ−２活性、ΔΨ_ｍ損失、ＮＡおよびＰＭＰは、ＦＬＩＣＡ、ＪＣ−１、ヘキスト（登録商標）３３３４２および７−ＡＡＤ染色によってそれぞれ測定される（ｎ＝２）。（Ｃ−Ｅ）カスパーゼ−２阻害は、新生児のインビボ虚血脳損傷に対してニューロン保護を提供する：虚血４８時間後に測定される梗塞容積についてのＱ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨの効果。薬物は、虚血開始の５分前に与えられ、阻害剤の単回の腹腔内注射（intrapeprritoneal injection）（１００μｇ／１０ｇ（１０％ＤＭＳＯ），それぞれｎ＝１６および１２）からなる。対照の虚血ラット（ｎ＝１５）も調査された。（Ｃ）背側の海馬（dorsal hippocampus）（プレート２１）および前交連（anterior commissure）（プレート１２）レベルにおける代表的な環状縫合切断（coronal section）が虚血対照およびＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ処理動物から得られ、クレジル−バイオレットによって染色された。処理されたラット（２％の梗塞容積を有する動物）における梗塞が著しく減少したことに留意のこと。矢印は、同一の虚血またはＱ−ＶＤＶＡＤ処理された動物における梗塞の存在および不存在をそれぞれ示す。棒線は、１３０μｍを示す。（Ｄ）種々の群における平均梗塞容積。データは、平均±ＳＥＭである。Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＱ−ＶＤ−ＶＡＤ−ＯＰＨは、それぞれ、４４および７４％の減少を誘導した（＊＊＊＝ｐ＜０．００１，クルスカル・ウォリス（Kruskall-Wallis）検定）。（Ｅ）Ｑ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨおよびＱ−ＶＤ−ＯＰＨ処理が、高い／全体的または低い保護レベルのいずれか示す動物を有する２つの群を提供する。単一の梗塞容積データがプロットされる。太いおよび薄い横棒線は、群の中間および平均をそれぞれ示す。それぞれＱ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨ処理後に４および８の動物は梗塞を示さなかったことに留意のこと。
【図１６】ヒト組み換えカスパーゼ−２によるインビトロのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ切断。組み換えヒト・カスパーゼ−２（１２５Ｕ）による５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣの切断が、３０分後に３７℃で測定され、その後に、選択的カスパーゼ阻害剤または汎カスパーゼ阻害剤（２μＭ）と共にインキュベートされた（ｎ≧２）。カスパーゼ−２切断活性は、原型化合物であるＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨによって阻止され、その効果は特異的カスパーゼ−２阻害剤（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−Ｃｈｏ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）および汎カスパーゼ阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰＨと同等である。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫによる切断阻害はそれほど重要ではないが、ＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫは、カスパーゼ−２に対して完全に不活性である。カスパーゼ−３についての（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−９についての（Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）およびカスパーゼ−８についての（Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ）他の特異的阻害剤は、カスパーゼ−２活性に大きくは干渉しない。カルパインを阻害するＥ６４ｄ、ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭは、陰性対照として用いられる。
【図１７】前ミトコンドリアカスパーゼ−２依存性経路についての仮説モデル。カスパーゼ−２の前ミトコンドリア活性化が皮質ニューロンにおいてアポトーシスを促進するために必要とする新しい固有の経路を記載した。血清抜き出しは、アポトーシス経路の引き金となることが可能であり、この経路では、カスパーゼ−２の活性化が、上流の、ｂｃｌ−２ファミリーの後アポトーシスメンバーであるＢａｘの制御を仲介し得る。Ｂａｘは転座し、かつ、外側のミトコンドリア膜に集積して、カスパーゼ−２依存性の方法でΔΨ_ｍ降下を誘導し、シトクロムｃ放出を促進する。したがって、カスパーゼ−２の不活性化はまた、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３のシトクロムｃ放出依存性活性化、核形態変化、ホスファチジルセリン露出および末端の形質膜の透過性化のような下流の事象を廃止する。長期の血清欠乏を通じての活性なカスパーゼ−２の排他的な細胞質局在化は、活性化の特有の機構の証拠となる。
【図１８】カスパーゼ−２は、ＤＮＡ損傷が誘導する細胞死の際に必要とされ、ΔΨ_ｍ損失およびＰＭＰより先に起こる。カスパーゼ阻害剤の不存在下または存在下のＶＰ１６の用量−応答：ＡおよびＢは、特異的カスパーゼ−２阻害剤（ＶＤＶＡＤ＝Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）によるカスパーゼ−２様阻害の保護効果を示した。汎カスパーゼ阻害剤（ＯＰＨ＝Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ）の効果も調査された。（Ａ）ｎ＝３，ＪＣ−１／７ＡＡＤ染色；（Ｂ）ｎ＝１，ＤｉｏＣ６／ＰＩ。
【図１９】カスパーゼ−２活性化は、ΔΨ_ｍ損失および続くカスパーゼ活性化より先に起こる。（Ａ）左側パネルは、ＶＰ１６処理されたジャーカット細胞（Jurkat cell）（１０μＭ，７時間）におけるΔΨ_ｍ損失（ＪＣ−１）および核変化（ヘキスト（登録商標））についての特徴的なアポトーシスの特色を示す。右側パネルは、汎カスパーゼ阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰＨまたは特異的カスパーゼ−２様（ＶＤＶＡＤ＝Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−３様（ＤＥＶＤ＝Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−９様（ＬＥＨＤ＝Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８様（ＬＥＴＤ＝Ｚ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ）阻害剤のΔΨ_ｍ損失（ＪＣ−１）、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−３活性化（ＦＬＩＣＡｓ）、ＰＭＰおよび核変化についての効果をそれぞれ示す。全ての阻害剤は、５０μＭで試験される。（Ｂ）ΔΨ_ｍ損失（ＪＣ−１）およびＰＭＰ（７ＡＡＤ）についてのこれらの阻害剤の効果のフローサイトメトリーによる定量化（８時間）。シクロヘキサミド；ＢＡ＝ボンクレキン酸（bongkrekic acid）；ＤＩＤＳ＝４，４’−ジイソチオシアナスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩；ＡｃｔＤ＝アクチノマイシンＤ（ｎ＝２〜４）。
【図２０】特異的ｓｉＲＮＡによるカスパーゼ−２遺伝子ノックダウン。（Ａ）左側および右側パネルは、ｈｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔが、ヒーラ（HeLa）およびジャーカット細胞における前カスパーゼ−２タンパク質プールを減少させることが可能であることをそれぞれ示す（ウェスタンブロット分析；カスパーゼ−２検出のための１１Ｂ４クローン）。（Ｂ）トランスフェクションの収率は、ｓｉＲＮＡ−ＦＩＴＣの蛍光検出（フローサイトメトリー，ＦＬ−１）によって細胞内（in cellula）チェックされた：ほぼ１００％がｓｉＲＮＡを取り込んだ（２４時間）。
【図２１】特異的ｓｉＲＮＡによるカスパーゼ−２遺伝子ノックダウンにより、ＶＰ１６処理されたジャーカット細胞が生き残る結果となった。（Ａ）（ヒト）ｓｉＲＮＡのＶＰ１６処理されたジャーカットについての保護効果（７〜８時間−１０μＭ）（ｎ＝３）。Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫおよびｓｉＲＮＡ Ｃ２ ｗｔが救った細胞は形態を保持し（順方向散乱）、これらの細胞は、生存可能である（７ＡＡＤ排除）ことを示すフローサイトメトリープロファイル。Ｌｉｐｏ＝リポフェクタミン（lipofectamine）２０００単独。
【図２２】マウスＣ２ ｓｉＲＮＡ配列由来のｓｈ−挿入断片の配列および構造。（Ａ）フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドは、互いの間でアニーリングするために設計された。下の場合の配列は、マウスのＣ２ ｍＲＮＡに対して指令されたｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列を示す。ｐＧＥ−１ベクターにおけるクローニングを改良するためにＢａｍＨ ＩおよびＸｂａ Ｉ オーバーハング（overhang）が５’および３’末端にそれぞれ加えられる。（Ｂ）アニーリングされたｓｈＲＮＡの構造には、ｓｈＲＮＡ挿入断片の種々の機能領域が明示される。
【図２３】ｓｈＲＮＡ−６およびｓｈＲＮＡ−９構成物の注入後の３Ｔ３細胞におけるカスパーゼ−２の発現レベル。対照としての空のｐＧＥ−１（レーンｐＧＥ−１）またはｓｈＲＮＡ挿入断片を含むｐＧＥ−１ベクター（クローンｓｈＲＮＡ−６およびｓｈＲＮＡ−９，レーンｓｈＲＮＡ６およびｓｈＲＮＡ９）の注入して２４または４８時間後の３Ｔ３全抽出物（レーン当たり１５μｇ）のウェスタンブロット分析。リポフェクタミンのみを有する対照が行われた（レーンｌｉｐｏ）。ＮＴレーンは、処理されていない細胞を示す。
【図２４】ヒトＣ２ ｓｉＲＮＡ配列から誘導されたｓｈ−挿入断片の配列および構造。（Ａ）フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドが、互いの間でアニーリングするために設計された。下部の場合における配列は、ヒトＣ２ ｍＲＮＡに対して指令されたｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列を示す。ｐＧＥ−１ベクターにおけるクローニングを向上させるためにＢａｍＨ ＩおよびＸｂａ Ｉオーバーハングが５’および３’末端にそれぞれ加えられる。（Ｂ）アニーリングされたｓｈＲＮＡの構造には、ｓｈＲＮＡ挿入断片の種々の機能領域が明示される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞死におけるカスパーゼ−２活性を妨げ、阻止し／沈黙させるための阻害剤。
【請求項２】
前記細胞はニューロンである、請求項１に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項３】
前記細胞はニューロン細胞系である、請求項１に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項４】
前記細胞は非ニューロン細胞系である、請求項１に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項５】
カスパーゼ−２阻害剤は、カスパーゼ−２ ｍＲＮＡを特異的にターゲットにしてカスパーゼ−２の発現を減少させるかまたは抑制することが可能な単離された二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項１〜４のいずれか１つに記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項６】
ニューロンにおいてカスパーゼ−２の発現を沈黙させる、請求項５に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項７】
ニューロン細胞系においてカスパーゼ−２の発現を沈黙させる、請求項５に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項８】
非ニューロン細胞系においてカスパーゼ−２の発現を沈黙させる、請求項５に記載のカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項９】
１５〜２５ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチドの相補鎖からなる二本鎖体を含む、請求項５〜８のいずれか１つによるＲＮＡ分子。
【請求項１０】
相補的な配列番号１および配列番号２の二本鎖体または相補的な配列番号６および配列番号７の二本鎖体を含む、請求項５〜９のいずれか１つによるＲＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか１つによるｓｉＲＮＡの配列をベースとするｓｈＲＮＡ構築物を含み、該構築物は、細胞内カスパーゼ−２サイレンシングにつながる、請求項５によるＲＮＡ分子。
【請求項１２】
配列番号１および配列番号２の両方または配列番号６および配列番号７の両方または配列番号８および配列番号９の両方または配列番号１０および配列番号１１の両方の挿入断片を含む、請求項１１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１３】
ニューロンまたはニューロン細胞系において細胞内カスパーゼ−２サイレンシングにつながる、請求項１１または１２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１４】
非ニューロン細胞系において細胞内カスパーゼ−２サイレンシングにつながる、請求項１１または１２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１５】
配列番号５を有する分子によるカスパーゼ−２活性のインビトロ阻害。
【請求項１６】
配列番号５を有する分子によるカスパーゼ−２活性のインビボ阻害。
【請求項１７】
Ｂａｘとカスパーゼ−２との間の相互作用を妨害するかまたはカスパーゼ−２依存性Ｂａｘ切断を妨げることが可能な分子。
【請求項１８】
配列番号（例えば、配列番号１２〜２３）を含む３〜４０のアミノ酸の長さを有するＢａｘ配列由来であり、Ｂａｘにおけるカスパーゼ−２切断の推定部位と競争し得るペプチド。
配列番号１２：ＫＴＧＡＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１３：ＧＡＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１４：ＦＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１５：ＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１６：ＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１７：ＦＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１８：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥＴＰ
配列番号１９：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡＧＥ
配列番号２０：ＩＱＤＲＡＧＲＭＡ
配列番号２１：ＩＱＤＲＡＧＲ
配列番号２２：ＩＱＤＲＡ
配列番号２３：ＩＱＤＲ
【請求項１９】
Ｎ末端またはＣ末端において、（特異的な認識に続いてまたは続かないで）細胞に入りカスパーゼ−２とＢａｘとの間の相互作用を妨害することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性分子と結合された、請求項１６による分子。
【請求項２０】
Ｎ末端またはＣ末端において、（特異的な認識に続いてまたは続かないで）細胞に入りアポトーシスを予防または治療するかまたはミトコンドリア保護性の細胞保護効果を提供することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性分子に結合された、請求項１６による分子。
【請求項２１】
前記配列番号を含む３〜１０のアミノ酸の長さを有し、該配列番号はＮ末端またはＣ末端において、マーカー（例えば、蛍光発光性（ＡＭＣ、ＡＦＣ、ＰＥ．．．）、比色性（ｐＮＡ．．．）または生物発光性基質、放射性同位体．．．）と結合されている、請求項１６による分子。
【請求項２２】
治療上の有効量の、請求項１〜２１のいずれか１つによる少なくとも１種のカスパーゼ−２阻害剤を医薬的に受け入れ可能な担体と共に含む医薬組成物。
【請求項２３】
有効量の、請求項５〜１０のいずれか１つによる少なくとも１種の化合物を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
有効量の、請求項１１〜１４のいずれか１つによる少なくとも１種の化合物を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
有効量の配列番号５を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
有効量の、請求項１７〜２０のいずれか１つによる少なくとも１種の分子を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
細胞死を低減させるための、経口投与、局所（例えば、大脳室内、化合物または医薬組成物により含浸されたゲルホーム（登録商標）の大脳内移植、機械的送達用器械の大脳内移植）または全身（例えば、腹膜組織内、静脈内．．．）投与用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
低酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）を含む病的状態の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
大脳の低酸素症−虚血（Ｈ−Ｉ）（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）を含む病的状態の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
特に、全身性または病巣性Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中用の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
特に、成人または新生児Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３２】
特に、成人または新生児Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３３】
特に、一時的または恒常的Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様の状態（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３４】
特に、再灌流状態を伴うまたは伴わない、Ｈ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）損傷および卒中様状態の脳損傷（例えば、大脳、腎臓、心臓の不全）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３５】
特に、中大脳動脈閉塞症（ＭＣＡＯ）におけるニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３６】
特に、以下の少なくとも１つの病理的事象が併発された場合のニューロン死の治療用の請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物：再灌流を伴うまたは伴わない、大脳レベルまたは体全体のレベルでの、全身性または病巣性、一時的または恒常的、成人または新生児のＨ−Ｉ（低酸素症／低血糖症を伴うまたは伴わない虚血）。
【請求項３７】
・慢性変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄延髄萎縮症、プリオン病を含む神経変性疾患の際のアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・脊髄損傷の際のアポトーシスを予防および／または治療する、または、外傷性脳損傷の結果として生じるアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・ニューロン保護効果を提供する、または、
・脳保護効果を提供する、または、
・自己免疫疾患および移植拒絶反応に伴う、細胞毒性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞が介在するアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・心不全、心筋症、心臓のウイルス感染または細菌感染、心筋虚血、心筋梗塞および心筋虚血、冠動脈バイパス移植を含む心臓細胞の細胞死を予防する、または、
・例えば化学療法またはＨＩＶ治療の結果としてのミトコンドリアの薬物毒性を予防および／または治療する、または、
・ウイルス感染または細菌感染の際の細胞死を予防する、または、
・炎症または炎症性疾患、炎症性腸疾患、敗血症および敗血症性ショックを予防および／または治療する、または、
・卵胞から卵母細胞への段階、卵母細胞から成熟卵への段階および精子の細胞死を予防する（例えば、卵巣組織、人口受精卵を凍結させおよび移植する方法）、または、
・化学療法後の女性および男性の受精能力を保護する、または、
・雌および雄の動物の受精能力を保護する、または、
・黄班変性および緑内障を予防および／または治療する、または、急性肝炎、慢性活動性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を予防および／または治療する、または、
・男性型禿頭、放射線、化学療法または環境上のストレスに起因する髪の喪失を予防する、または、
・（高レベルの放射線への露出、熱、火傷、化学薬品、太陽および自己免疫疾患に起因する）皮膚損傷を治療または改善する、または、
・脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）における骨髄細胞の細胞死を予防する、または、
・膵臓炎を治療する、または、
・呼吸器系症候群を治療する、または、
・骨関節炎、変形関節炎、乾癬、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、移植片対被移植体の疾患を治療する、または、
・網膜周皮細胞のアポトーシス、網膜ニューロンアポトーシス緑内障、虚血の結果として生じる網膜損傷、糖尿病性網膜症を治療する、または、
・アポトーシスの増加と関係する疾病状態を治療する、または、
・植物（例えば、草木、草花、葉状植物（キノコ、海草）．．．）の細胞死を予防する
ための請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
細胞死を阻止または予防する、または、細胞死、特にアポトーシスに対して治療のためにインビトロで分子をスクリーニングする工程を包含する方法。
【請求項３９】
細胞死を予防する方法であって、
所与の誘導様式に応じて、所与の細胞タイプにおいて、アポトーシスが関連する事象の階層性を決定する工程と、
より基部に近い可逆的なチェックポイントを阻止してアポトーシス過程に干渉する工程と
を包含する方法。
【請求項４０】
ニューロンにおいて迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的／定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
非ニューロン細胞において迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的／定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ニューロン細胞系において迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的／定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記チェックポイントはカスパーゼ−２である、請求項３９または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記チェックポイントはカスパーゼである、請求項３９または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記チェックポイントは関連のないカスパーゼ活性化である、請求項３９または４２に記載の方法。
【請求項４６】
ＭＰＴＰ処理を含む毒性傷害または保護処理に応答した、ΔΨ_ｍおよび形質膜の完全性の信頼性のある実時間フローサイトメトリーによるモニタリングを生じさせるための請求項３９〜４２のいずれか１つの方法の使用。
【請求項４７】
ＭＰＴＰ処理を含むニューロン毒性傷害またはニューロン保護処理に応答した、ΔΨ_ｍおよび形質膜の完全性の信頼性のある実時間フローサイトメトリーによるモニタリングを生じさせるための、請求項３９〜４２のいずれか１つに記載の方法の使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【公表番号】特表２００７−５２３６２６（Ｐ２００７−５２３６２６Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２９９５５（Ｐ２００６−５２９９５５）
【出願日】平成１６年５月２４日（２００４．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６２８８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０３３８９
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０５４３４１４６）
【Ｆターム（参考）】