細菌及び細菌構成成分とのプロアントシアニジンの結合相互作用
【解決手段】 組成物であって、プロアントシアニジンと、このプロアントシアニジンを固定化する高分子、高分子の集合体、半固体或いは固体表面と、を有する組成物。少なくとも約６の平均重合度を持つプロアントシアニジン化合物を有する組成物。免疫抑制された患者、若しくは敗血症或いは敗血症性ショックと診断された患者に、プロアントシアニジンを有する組成物を投与する方法。グラム陰性細菌感染と診断された患者に、少なくとも約６の平均重合度を持つプロトシアニジン化合物を有する組成物を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年７月９日付けに出願の米国仮出願番号第６０／８２４，７９４号に対して優先権を主張した、２００７年２月８日付け出願の米国特許第１１／８３２，８３４号及び第１１／８３２，８５２号に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、主にプロアントシアニジンに関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノール化合物は、高等植物に広く分布し、人の食事の一部にも含まれている。ポリフェノール化合物に対する興味は、それらの抗酸化活性に起因するそれらの潜在的な健康効果によって促進されてきた（Ｃｒｏｆｔ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５４，４３５（１９９８）；Ｂｒａｖｏ，Ｎｕｔｒｉ．Ｒｅｖ．，５６，３１７（１９９８））。フラボノイドの抗酸化活性は、非常に詳細に研究されてきた（Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０，９３３（１９９６）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，６７，５１５（２００１）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６１，７６（１９９８）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｒｍａｎ，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（２０００））。タンニンは、３つの主要なグループ、１）加水分解性、２）複合体、及び３）凝集タンニン或いはプロアントシアニジン（ＰＡＣｓ）、に分類されるポリフェノール化合物の重要なグループである。ＰＡＣｓは主に、単量体フラバンサブユニット（＋）−カテキン及び（−）−エピカテキン、及びそれぞれが様々なヒドロキシル置換基を有する３つのフェニル環（図１）から成る構造であるそれらの誘導体で構成された、高分子ポリマーである。「タイプＢ」として分類されるＰＡＣｓは、単一結合フラバニルユニットによって特徴付けされ、一方「タイプＡ」ＰＡＣｓは、フラバニルサブユニット間の付加的なエーテル結合を含む。ＰＡＣｓの典型的な植物源は、果実、葉及び樹皮を含む。それらの抗酸化活性に加えて、ＰＡＣｓは、抗癌活性（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０，１７３７（１９９９）；Ｂｏｍｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１２７，４５（２０００））、抗炎症活性（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２８，２３３４（１９９８）；Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６，１（２００１））及び心保護特性（Ｒｅｅｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．，４２Ｓ，３０１（２００２））を含む多くの他の有用な健康効果を有することが示されている。近年では、緑茶（Ｄｕｆｒｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２，４０４（２００１））、ブドウ（ワイン、ジュース、及びブドウ種抽出物）（Ｂａｇｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．，５２３，８７（２０００））、及びクランベリージュース（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２０００））からのＰＡＣｓの健康効果に対して大きな注目が集まっている。特にアメリカンクランベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）からのＰＡＣｓは、尿路疾患性細菌の粘着に対して尿路を保護するそれらの能力がよく記載されており、クランベリージュースを飲むことは様々な尿路感染及び前立腺炎に対して推奨されている治療法である。クランベリーＰＡＣｓは、尿路の上皮細胞のものと同じα−Ｇａｌ（１→４）β−Ｇａｌ受容体配列を有する細胞表面へのＰ−線毛大腸菌の粘着を阻害することが示された（Ｆｏｏ）。このような効果の大部分は、尿路上皮細胞上の細胞表面受容体と相互作用するための能力を損なう、線毛タンパク質内のＡタイプＰＡＣ誘導性立体構造変化を介して仲介されるものである（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２００５））。さらに最近では、クランベリージュースは、Ｐ−線毛大腸菌及びシリコンニトリドプローブ表面の間の粘着力を有効的に減少することが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７（２００６））。
【０００４】
細菌及び細菌構成成分を濾過及び／若しくは濃縮するための現在の方法では、サイズ除去及び静電気的相互作用などのような非選択的手段を介して溶液からそのような物質を除去することを目的とすることが多い。サイズ除去ベース及び静電気的ベースフィルター装置の例としては、０．２２μｍの孔サイズを有するＣｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．のセルロース酢酸フィルター（サイズベース）であり、これは、サイズカットオフ値より大きな粒子及び正味陰性表面電荷を有する物質（例えば細菌及びウイルス）に非特異的に結合するＡｒｇｏｎｉｄｅ Ｃｏｒｐ．のＮＡＮＯＣＥＲＡＭ（登録商標）陽性ナノメーター酸化アルミニウムファイバー（表面電荷ベース）より大きな粒子を除去する。より特異的な濾過及び濃縮レジメは、細菌物質上及び内に含まれる物質に特異的に結合するための特異的な認識要素（抗体、ペプチド、アプタマーなど）を利用するものである。これらの技術のそれぞれは、それら自身に固有な制限がある。サイズ排除及び電荷ベースフィルターは、高価な製造施設を必要とし、しばしば一度特定の結合能力に達した場合は再利用不可能である。特異的な認識要素に基づいたフィルター及び濃縮器は、適切な結合特性での分子の単離、及びその後のそれらの大規模調合及び精製が必要となる。
【０００５】
宿主生物体（例えばヒト及び家畜）からの細菌及び細菌構成成分を中和及び／若しくは除去するための現在の治療法の大部分は、抗生物質の使用に基づいている。１９４０年代における導入から、抗生物質は多くの細菌関連疾患の治療に対する有効性が示されてきた。しかしながら、それらの頻繁な誤用は、さらに強力な薬剤の開発及び実行を必要とする抗生物質耐性細菌株を生じてきた。さらに、抗生物質が細菌複製を効果的に阻害する一方、それらは有害な細菌毒を中和する際にはしばしば無効である。例えば、グラム陰性細菌の外細胞膜の外葉の主な抗生物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、細菌感染の間の合併症の主な原因である。「内毒素（エンドトキシン）」として一般的に言及されるＬＰＳは、感染に対する身体の正常炎症反応を刺激することに関与している。しかしながら、無検査のままのＬＰＳ過剰刺激は、全身性炎症反応症候群（敗血症）として知られている、生命を脅かす炎症カスケードの活性化過剰を生じるであろう。
【０００６】
ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜の外葉の主要部分を構成する複雑な糖脂質である（Ｒｅａｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９−１７０（１９９０））。これは２つの主要なドメイン：１）Ｔｏｌｌ−様受容体４（ＴＬＲ−４）とのその相互作用を通じて免疫系を刺激することに関与しているリピドＡコア、及び２）伸長分岐ポリ多糖尾部から成る。強力な免疫反応は、サイトカインの産生及び放出、補体の活性化、及び病原体の殺傷及び排除を生じる様々な他の効果を含む、哺乳類細胞によるＬＰＳの認識の後に続く。ＬＰＳに対する非制御過剰免疫宿主反応は、敗血症ショック、多臓器不全、及び死などの生命を脅かす合併症を導くであろう。ポリミキシンＢ（ＰＢ）は、ＬＰＳ−結合及び外側膜−解体能力を示す最も効果的な化合物の１つとなることが示された環状陰イオン性抗菌デカペプチドである（Ｄａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ．，３３，１４２８（１９８９））。ＰＢは、リピドＡ部位への高親和性結合を介してＬＰＳの生物学的活性を阻害すると考えられている（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ．，２９，４９６（１９８６））。
【０００７】
細菌及び細菌構成成分の濾過及び治療上の中和に対する現在の技術に関連するコスト及び制限の観点から、これらの同じ課題を達成するための安価な代替物は好都合である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、プロアントシアニジン及びプロアントシアニジンを固定化する高分子、高分子の集合体、半固体或いは固体表面を有する組成物を有するものである。
【０００９】
本発明はさらに、プロアントシアニジン化合物を有する組成物を有するものであって、前記組成物において全てのプロアントシアニジンの平均重合度は少なくとも約６である。
【００１０】
本発明はさらに、免疫抑制された患者、若しくは敗血症或いは敗血症性ショックと診断された患者にプロアントシアニジンを有する組成物を投与する工程を有する方法を有するものである。
【００１１】
本発明はさらに、グラム陰性細菌感染と診断された患者へプロアントシアニジン化合物を有する組成物を投与する工程を有する方法であって、前記組成物における全てのプロアントシアニジンの平均重合度は少なくとも約６である、方法を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明のより完全な理解は、以下の実施形態及び付随する図面の詳細な説明を参照することによって容易に得られるであろう。
【図１】図１は、更なるプロアントシアニジンの構造を示したものである。ＰＡＣｓはカテキン及びエピカテキンなどのサブユニットから成る。ＢタイプＰＡＣｓは、炭素４と８との間若しくは炭素４と６との間に１つの分子間結合を含むものであり、一方ＡタイプＰＡＣｓは、炭素４と８との間、及び炭素２と炭素７の酸素との間に２つの分子間結合を含むものである（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ．，６３，１２２５（２０００））。
【図２】図２は、非特異的接着におけるクランベリージュースの影響を示したものである。背景強度は、平均蛍光シグナル強度に対する平均背景強度の比として示した。クランベリージュース（▲）及び透析濾過クランベリージュース（○）の細菌サンプルの固定（ｓｐｉｋｉｎｇ）は、バックグラウンドシグナルにおいて同様な改善を示した。
【図３】図３は、アガロース−ＰＢビーズプルダウンアッセイの図式的にを示したものである。アガロースビーズに固定化されたＰＢは、蛍光標識ＬＰＳと共にインキュベートした。遠心分離及び洗浄後、ビーズに関連した蛍光量は、ＰＢに結合したＬＰＳの量に比例した。
【図４Ａ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ａ）データは、クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣＳとのＬＰＳの共インキュベーション後の固定化ポリミキシンＢへ結合したＬＰＳのパーセンテージを示したものである。全３種類の供給源からのＰＡＣｓのＬＰＳ−結合活性は、濃度依存性であった。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図４Ｂ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ｂ）（Ａ）におけるデータをパーセント阻害で示したものである。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図４Ｃ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ｃ）クランベリーＰＡＣｓに対して、ほとんどのＬＰＳ−結合活性は、６，０００ＭＷＣＯ透析膜（２１の平均重合度）によって保持されたポリマーから成る分画内に含まれていた。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図５Ａ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２を安定して発現するＨＥＫ ２９３細胞は、２５ｎＭ ＬＰＳ及び０．５μＭクランベリーＰＡＣと１．５時間インキュベートした。細胞は、固定化する（Ａ）或いは固定化し透過処理し（Ｂ）、蛍光と共役させたヤギ抗ＬＰＳ抗体とインキュベーションし、ＬＰＳを可視化させた。インキュベーションにおいて、ＬＰＳ結合は、リピドＡ或いは抗ＴＬＲ４、及び抗ＣＤ１４抗体との共インキュベーションによって機能的に阻止された。（Ａ）ＰＡＣｓは前記細胞表面へのＬＰＳの結合をわずかに阻害する。
【図５Ｂ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２を安定して発現するＨＥＫ ２９３細胞は、２５ｎＭ ＬＰＳ及び０．５μＭクランベリーＰＡＣと１．５時間インキュベートした。細胞は、固定化する（Ａ）或いは固定化し透過処理し（Ｂ）、蛍光と共役させたヤギ抗ＬＰＳ抗体とインキュベーションし、ＬＰＳを可視化させた。インキュベーションにおいて、ＬＰＳ結合は、リピドＡ或いは抗ＴＬＲ４、及び抗ＣＤ１４抗体との共インキュベーションによって機能的に阻止された。（Ｂ）ＰＡＣｓはＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に抑制する。矢印は、内部移行したＬＰＳの領域を示すものである。核はＤＡＰＩで染色した。
【図５Ｃ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＬＰＳ膜結合及びＬＰＳエンドサイトーシスの定量解析は、それぞれ（Ｃ）及び（Ｄ）に示した。記号はコントロールに相対的な有意差のレベルに対応したものである（スチューデントｔ検定によって決定した）：（＊）ｐ<０．１、（◆）ｐ<０．０５、（§）ｐ<０．０１、（∞）ｐ<０．００１。
【図５Ｄ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＬＰＳ膜結合及びＬＰＳエンドサイトーシスの定量解析は、それぞれ（Ｃ）及び（Ｄ）に示した。記号はコントロールに相対的な有意差のレベルに対応したものである（スチューデントｔ検定によって決定した）：（＊）ｐ<０．１、（◆）ｐ<０．０５、（§）ｐ<０．０１、（∞）ｐ<０．００１。
【図６Ａ】図６は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳのエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスは阻害しないことを示したものである。細胞結合アッセイは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンを培養液へ添加し、エンドソームコンパートメントを標識することを除いて図２に記載されたように実行した。前記細胞の固定化及び透過処理の後、ＬＰＳは蛍光を共役したヤギ抗ＬＰＳ抗体で検出した。データは、ＰＡＣの非存在下において（パネルＡ）、エンドサイトーシスされたＬＰＳは大部分トランスフェリンと共存している（合併された画像において矢印で示した）ことが示された。
【図６Ｂ】図６は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳのエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスは阻害しないことを示したものである。細胞結合アッセイは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンを培養液へ添加し、エンドソームコンパートメントを標識することを除いて図２に記載されたように実行した。前記細胞の固定化及び透過処理の後、ＬＰＳは蛍光を共役したヤギ抗ＬＰＳ抗体で検出した。しかしながらＰＡＣの存在下において（パネルＢ）、ＬＰＳは大部分細胞膜に存在している（ＰＡＣによるＬＰＳエンドサイトーシスの阻害を示している）。しかしながら、エンドソームコンパートメントのトランスフェリン染色は、ＰＡＣの非存在下で見られたものと同じであった。従って、ＰＡＣはＬＰＳエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスを阻害するものではない。
【図７Ａ】図７は、クランベリーＰＡＣｓがＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を阻害するが、ＬＢＰとの相互作用は阻害しない事を示したものである。（Ａ）ＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２を固定化し大腸菌ＬＰＳの結合を完全に阻害し（黒三角形）、ＣＤ１４を固定化しＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合を部分的に阻害した（白四角形）。ＬＰＳ：ＬＢＰ相互作用の阻害は見られなかった（黒丸）。
【図７Ｂ】図７は、クランベリーＰＡＣｓがＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を阻害するが、ＬＢＰとの相互作用は阻害しない事を示したものである。（Ｂ）ＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ−ＦＩＴＣの直接結合及びＣＤ１４−仲介性結合の両者を阻害する。２５ｎＭ ＣＤ１４の存在下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２を固定化するためのＬＰＳの結合は、可溶性ＣＤ１４非存在の場合（黒三角形）に対して、約４倍（白三角形）増強された。挿入図は、コントロールのパーセントでプロットした両データセットを示したものである。両者の場合において、固定化ＴＬＲ４／ＭＤ２に対する阻害度は同程度である。データは、２つの代表実験の平均±標準偏差である。
【図８Ａ】図８は、ＬＰＳ−反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ａ）クランベリーＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【図８Ｂ】図８は、ＬＰＳ反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ｂ）ＰＡＣｓの阻害効果は過剰ＬＰＳによって打ち消されなかった。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、以下の濃度：０ｎＭ（黒丸）、０．５ｎＭ（黒三角形）或いは１０ｎＭ（白三角形）でのクランベリーＰＡＣの存在下において指示濃度のＬＰＳによって刺激された。
【図８Ｃ】図８は、ＬＰＳ反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ｃ）ＰＡＣｓは、ＮＦ−κＢ活性を阻害するのと同じ濃度範囲に対してＬＰＳ−反応性細胞に対して毒性を有しておらず、ＰＡＣｓはＬＰＳと比べて１００分の１未満の毒性であった。
【図９】図９は、固定化プロアントシアニジンによるＦＩＴＣ−ＬＰＳの捕獲を示したものである。クランベリー（白四角形）及びお茶（黒丸）からのセファロース固定化ＰＡＣｓは、プルダウンアッセイにおける蛍光強度の増加によって示されたように、溶液中でＬＰＳと結合した。捕獲分子濃度は、お茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭで、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭであった。
【図１０】図１０は、溶液からのＬＰＳの固定化ＰＡＣ捕獲に対する可溶性ＰＡＣ存在の影響を示したものである。Ａ．溶液中のＰＡＣｓの存在は、ＰＡＣ濃度の増加に対する蛍光強度の減少によって示されたように、セファロースビーズへのＬＰＳの結合を阻害した。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は、７１μｇ／ｍＬであり、捕獲分子濃度はお茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭ（黒丸）で、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭ（白四角形）であった。
【図１１】図１１は、固定化ＰＡＣｓによるＬＰＳの捕獲に対する可溶性リピドＡ存在の影響を示したものである。ＦＩＴＣ−ＬＰＳの存在に対するプルダウンアッセイの完了前のＰＡＣビーズへのリピドＡの添加は、得られた蛍光強度の減少を生じた。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は７１μｇ／ｍＬで、捕獲分子濃度はお茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭ（黒丸）で、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭ（白四角形）であった。
【図１２】図１２は、ＬＰＳのプロアントシアニジン捕獲のポリミキシンＢの捕獲との比較を示したものである。固定化ＰＭＢ（黒三角形）、及びお茶からのＰＡＣｓ（黒丸）及びクランベリーからのＰＡＣｓ（白四角形）は、サイドバイサイドアッセイで比較した場合、ＦＩＴＣ−ＬＰＳに対して類似の結合親和性を示した。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は１４５μｇ／ｍＬであった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
限定するためではなく説明を目的として、本発明全体にわたる理解を提供するために、以下の記載において、具体的に詳細について説明する。しかしながら、本分野の当業者であれば、本発明がこのような具体的な詳細なものとは異なる他の実施形態においても実行されることが理解される。他の例において周知の方法及び装置の詳細な記載は、不必要な詳細説明によって本発明の記載を不明瞭にしない程度に省略される。
【００１４】
ブドウの種（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）及びホワイトパイン（Ｐｉｎｕｓ ｍａｒｉｔｉｍａ）は、プロアントシアニジンの供給源であるが、その化合物は２、３例挙げると、お茶、コーヒー、チョコレート、リンゴ、ベリー及びオオムギなどの食品にも見出されている。ＰＡＣｓは、様々な数のモノマーサブユニットから成る不均一混合物に見出されている。カテキン及びエピカテキンは、最も一般的なサブユニットである。サブユニット間の結合は通常、炭素原子間の１つの分子間結合を介しているが、いくつかの種においてサブユニットは２つの分子間結合：１つの炭素−炭素結合及び炭素−酸素結合によって結合されている（図２）（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｙｎ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．，６２，５００（２００４）；Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１７３（２０００））。これらはそれぞれ、Ｂタイプ及びＡタイププロアントシアニジンと称する。Ａタイプ及びＢタイププロアントシアニジンでは、異なる生物活性、さらには異なるサブユニット組成物及び異なる重合度を有することが示されていた（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，９，４１０（１９９５）；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２００５））。
【００１５】
クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓは、様々な細菌種からＬＰＳへ効率的に結合する。クランベリーに対しては、最も潜在的なＬＰＳ結合活性は、２１の平均重合度を有するポリマーの混合物から構成されるＰＡＣ分画内に含まれることが示された。この分画はＬＰＳ受容体（ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−様受容体４）／ＭＤ２及びＣＤ１４）の完全補体を発現しているＨＥＫ ２９３細胞の表面へのＬＰＳの結合を穏やかに阻害する一方、ＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に抑制する。このＰＡＣ分画はさらに、過剰ＬＰＳによって打ち消されない方法によりＬＰＳ誘導性核内因子−κＢ活性化も阻害する。この効果は、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用の阻害、及びＣＤ１４とのＬＰＳ相互作用の部分的抑制を通じて仲介される。重要なことは、効果的なＬＰＳ中和を仲介するＰＡＣ濃度は、最小限のインビトロ細胞毒性を誘発する。この結果は、強力なＬＰＳ結合及びＰＡＣｓの中和特性を示すものであり、内毒素除去及び敗血症のインビボ治療における潜在的な有用性を有する新しいクラスのＬＰＳアンタゴニストとしてＰＡＣｓを同定するものである。
【００１６】
血中のＬＰＳは、単核マクロファージ上の膜アンカー型受容体であるＣＤ１４へＬＰＳを転移する、ＬＰＳ結合タンパク質と結合する（Ｔｏｂｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１０８６７−１０８７１（１９８９））。次にＣＤ１４は、二分（二つの領域に分かれている）受容体複合体であるＴｏｌｌ様受容体４／ＭＤ２（ＴＬＲ４／ＭＤ２）とのＬＰＳの相互作用を仲介し、その結果細胞間シグナリング及び核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）−活性化炎症性サイトカインの産生を生じる（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，１７７７−１７８２（１９９９））。これらのサイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）及びインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）を含む。従って、敗血症に対する治療戦略は、サイトカインの中和（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７３，９３４−９４１（１９９５））或いはそれらの受容体（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７１，１８３６−１８４３（１９９４））に向けられていた。付加的なアプローチは、陽イオン性化合物（Ａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１２，２６１−２７７（２００６））或いはリピドＡ様物質（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１８７３−１８８０（２００１）；Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））でのＬＰＳの中和に焦点が当てられていた。不幸にも、これらの戦略手段に対する臨床的結果は、残念なもののままであった。
【００１７】
プロアントシアニジン（ＰＡＣｓ）は、フラボノイドサブユニットから成る植物由来のポリフェノール化合物であり、それらは最近いくつかの潜在的な優れた健康効果と関連しているとされた。詳細な研究によって、この活性は、１つの炭素−炭素及び１つの炭素−酸素結合（Ａタイプ結合として言及されている）（Ｆｏｏ）から成る少なくとも１つの独自のフラバン間サブユニット結合を含む４から５の重合度を有するＰＡＣｓによるものであると考えられた。より最近では、ＰＡＣｓは上皮細胞表面受容体に対するそれらの接着力を減少させる、細菌Ｐ−線毛タンパク質における構造変化を誘導することが示された（Ｌｉｕ）。最近の研究では、タンパク質機能化免疫センサー表面への細菌の非特異的接着を阻害する、クランベリージュースからの高分子量ポリマー（２１の平均重合度）間のさらなる相互作用が指摘された（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８，８５３−８５７（２００６））。この証拠に基づいて、以前記載されていなかった細菌細胞表面とのクランベリージュース構成成分の相互作用に対する潜在性を研究した。
【００１８】
クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓのＬＰＳ結合特性は、本明細書で報告する。クランベリーからのＰＡＣｓにより注目すると、第一にリピドＡ部位との相互作用を通じた、複数の細菌種からのＬＰＳに結合するそれらの能力が示された。ＬＰＳ受容体の完全補体を発現している細胞とのＬＰＳの相互作用を阻害するＰＡＣｓの能力が決定された。ＰＡＣｓは、大部分、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化の阻害も仲介する活性である、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用の抑制を介して、哺乳類細胞とのＬＰＳ相互作用を阻害する。
【００１９】
タンパク質への細菌細胞接着の阻止に対する細菌細胞とのＰＡＣｓの相互作用は、免疫アッセイ技術において使用されるガラス表面上で示された。さらにここでは、記載されていなかった細菌細胞表面構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ：細菌内毒素としても知られている）とのクランベリーＰＡＣｓの相互作用も示された。大腸菌のＰ−タイプ線毛とのクランベリーＰＡＣｓの相互作用は、哺乳類尿路及び消化管の細胞へのＰ−線毛を発現している細菌細胞の接着を阻害することが以前記載されていた。リポ多糖とのＰＡＣｓの相互作用は、以前記載されていなかった。この活性に基づいて、ＰＡＣｓは、細菌内毒素、細菌細胞及び細菌細胞構成成分の濾過、濃縮及び中和において潜在的に使用できる。加えて、ＰＡＣｓは、細菌及び細菌細胞構成成分の中和及び／若しくは除去が保証されなくてはならない治療上の適用において使用できる。
【００２０】
ＰＡＣｓは、それらを現在の濾過、濃縮及び中和適用に対する適切な置換物或いは代替物とする多くの優れた新しい特徴を提供する。ＰＡＣｓは高等植物によって産生される天然産物である。従って、理論的には「無制限な」供給が自然によって産出される。それらは、製造された濾過及び濃縮装置と同様に産生するための高価な製造或いは機械施設を必要としない。それらの利益を利用するために必要とされる全てとしては、天然物質の抽出及び精製だけである。
【００２１】
治療上の適用に対して、ＰＡＣｓは、抗生物質及び現在の毒素−中和化合物の広範囲の使用に対する魅力的な代替物となるであろう。例えば、抗生物質は、尿路感染に対する最も一般的な治療法であり、抗生物質はこれらの感染症を治療するために合計年間１６億ドル以上費やされている。抗生物質−耐性細菌種の増加に対する増大する懸念を考慮して、抗生物質への依存を軽減する代替治療測定法が探索されている。ポリミキシンＢ及びその誘導体などの化合物での細菌毒素のインビボの中和は、細菌感染中の免疫過刺激の発生を軽減するために現在推奨されている治療コースである。しかしながら、そのような化合物の固有の毒性は、それらの使用を制限し、効果は保持している毒性の少ない誘導体の開発を必要とするものであった。本明細書に記載されたポリミキシンＢの親和性に匹敵する相対親和性を有するＰＡＣ物質は、毒素中和に対する適切な代替物を提供する。
【００２２】
細胞表面のＰ線毛とのＰＡＣｓの相互作用について、細胞接着の減少に対して開示されている。様々な細胞表面構成成分との他の潜在的なＰＡＣｓの相互作用は、細菌細胞の中和に対する潜在的なメカニズムを提供する。細胞表面タンパク質抗原及びグルコース転移酵素などのタンパク質は、コロニー形成に関与している。他のタンパク質は、様々なシグナル伝達経路及びクオラムセンシングに関与している。細胞表面上の糖も情報交換及びアンカーに関与しており、受容体として働く。それらはしばしば、ウイルスなどの病原体が細胞に位置し相互作用するための経路となる。他のジュースからのＰＡＣｓでは観察されなかった、大腸菌及びクランベリーからのＰＡＣｓの間の相互作用は、様々なＰＡＣ種の機能における特異性を示唆するものであり、未だ完全には調査されていなかった細胞表面構成成分との様々な相互作用に対する潜在能力を示唆するものである。
【００２３】
ＰＡＣｓは、濾過、検出、除去或いは細菌及び／若しくはＬＰＳと相互作用する他の事象において有用な組成物、装置或いは構成成分に使用される。そのような組成物において、ＰＡＣは、高分子、高分子の集合体、半固体或いは固体表面へ固定化される。固定化されたＰＡＣは、ＬＰＳ、リピドＡ、或いはＬＰＳ或いはリピドＡを産生する細菌を含むと考えられているサンプルへ曝される。高分子の場合において、前記ＰＡＣは、共有結合、若しくは結合或いは力のあらゆる他の形態によって、前記高分子に固定化されている。前記高分子或いは高分子の集合体は、例えば、前記ＰＡＣを生物体における目的地へ輸送することを助ける、若しくはセンサーの一部となるであろう。適切な高分子には、限定されるものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、脂質、或いは糖を有する高分子が含まれる。適切な高分子の集合体には、限定されるものではないが、多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、ナノ粒子、ナノ結晶、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有するものが含まれる。固体及び半固体表面は、例えばセンサー及びフィルターにおいて有用である。半流動体は、ハイドロゲルなどの物質を含む。適切な固体或いは半固体表面には、限定されるものではないが、複数のビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管が含まれる。
【００２４】
前記ＰＡＣの重合度は、特定の適用に依存して選択される。組成物における全てのＰＡＣの適切な平均重合度は、限定されるものではないが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０を含む。前記ＰＡＣは、カテキン及びエピカテキンユニットのみを含む、若しくは他のフラボノイドユニットを含むものである。
【００２５】
前記ＰＡＣｓは、濾過装置に使用される。そのような装置は、入口及び出口を持つハウジングを有し、これによって前記ハウジング及び前記固定化ＰＡＣを通じた液体の流れが可能となるものである。前記固定化ＰＡＣは、液体が前記ハウジングを通って流れる場合、前記ハウジング内に維持される。これは、血液などの液体から細菌及び／若しくはＬＰＳを除去する際に有用である。感染した患者の血液は、前記フィルターを通り、その患者へ注入して戻される。前記フィルターはさらに、除染及び精製にも有用である。
【００２６】
前記ＰＡＣｓは、センサー装置に使用される。そのような装置は、流体装置、固定化ＰＡＣ、及び前記ＰＡＣに対するＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌の結合を検出するメカニズムを有する。前記メカニズムは、これに限定されるものではないが、光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、屈折率における変化、音響メカニズム、表面音波装置、水晶振動子マイクロバランス装置、電気化学メカニズム、若しくは電流測定法、電位差測定法或いは伝導度測定法を含む、結合事象を検出するためのセンサーにおいて使用されるあらゆるメカニズムである。
【００２７】
濾過或いはセンシング装置は、限定されるものではないが、臨床サンプル、血液、血漿、血清、リンパ液、髄液、薬学的調合物（除染が必要である）、若しくは幼児或いは免疫抑制された個人向けの食品或いは飲料を含む、様々なサンプルで使用される。
【００２８】
ＰＡＣｓの固定化に対するいくつかの例示的戦略は、本明細書に記載されている。
【００２９】
（１）ＰＡＣヒドロキシルの直接的反応性
ＰＡＣｓ内のヒドロキシルは、脱離基と置換する炭素を求核試薬が攻撃する活性化アシル基を含む化合物である、アシル化剤に対してアミノ基と同様に反応する。アシル化剤には、これに限定されるものではないが、酸無水物、イソシアン酸、イソチオシアン酸、イミドエステル、酸ハロゲン化物、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル、及び他の活性化エステルを含む。従って、一端におけるこれらアシル化基の１つ（ＰＡＣヒドロキシルに向けられた）及び別の機能基（標的化表面或いは高分子上の反応基に向けられた）を有するクロスリンク剤は、ＰＡＣｓの固定化に適している。多数のそのようなクロスリンク剤は、商業的に利用可能である（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍを参照のこと）。直接的反応性の３つの例を以下に記載する。
【００３０】
（１Ａ）スルフヒドリルを有する高分子上のポリアントシアニジンの固定化。精製ＰＡＣｓは、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸（ＰＭＰＩ、Ｐｉｅｒｃｅ）の使用を通じて、タンパク質或いは他のスルフヒドリルを有する高分子及び表面へ固定化される。ｐＨ８．５で１０ｍＭ ホウ酸緩衝液におけるモル比１：１０でのＰＭＰＩとのＰＡＣｓのインキュベーション（４５分室温）によって、ＰＡＣｓのヒドロキシル基とのＰＭＰＩのイソシアン酸基の反応を生じ、カルバミン酸結合を生じる。スルフヒドリルを有する化合物及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、最終濃度５０ｍＭ）の添加によって、前記タンパク質或いは他の高分子のスルフヒドリル基とのＰＭＰＩのマレイミド基の反応を生じる。前記高分子の濃度は、各分子に結合するＰＡＣｓの数に影響を及ぼすように変えることができる。
【００３１】
（１Ｂ）アミンを有する高分子上へのプロアントシアニジンの固定化。精製ＰＡＣｓは、４−（クロロスルホニル）フェニルイソシアン酸（ＣＳＰＩ）の使用を通じて、タンパク質或いは他のアミンを有する高分子及び表面上へ固定化され得る。ｐＨ８．５でのホウ酸緩衝液における等モル濃度でのＣＳＰＩとのＰＡＣｓのインキュベーション（４５℃室温）は、ＰＡＣｓのヒドロキシル基とのＣＳＰＩのイソシアン酸基の反応を生じ、カルバミン酸結合を産生した。次に、アミンを有する高分子を添加することによって、表面アミン基とのＣＳＰＩの塩化硫酸基の反応が、Ｈｉｎｓｂｅｒｇテストによって使用されたメカニズムを介してスルホンアミンを産生するように進行することが可能となった。
【００３２】
（１Ｃ）アミン或いはカルボキシルを有する高分子上でのプロアントシアニジンの固定化。アミン或いはカルボキシルを有する高分子は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）の存在下での３−［（２−アミノエチル）ジチオ］プロピオン酸・ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）の使用を通じて修飾され得る。トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）或いは２−メルカプトエチルアミンなどの還元剤の使用は、スルフヒドリル基を産生するＡＥＤＰのＳ−Ｓ結合を切断する。次に、ＰＭＰＩクロスリンク剤は、上記（１Ａ）で記載したように、このスルフヒドリル基にプロアントシアニジンを結合するために使用され得る。
【００３３】
（２）代替機能基へのヒドロキシルの変換
（２Ａ）アルデヒドへのヒドロキシルの変換。ＰＡＣｓの隣接ヒドロキシル基は、過ヨウ素酸、ナトリウム或いはカリウム過ヨウ素酸での酸化の影響を受けやすい。過ヨウ素酸酸化は、近接ヒドロキシルを有するＣ−Ｃ結合を切断し、それらをジアルデヒドへ変換する（Ｂｏｂｂｉｔ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．，１１，１（１９５６））。過ヨウ素酸処理の後、形成されたジアルデヒドを様々な試薬、特にアミン基と反応させ、シッフ塩基のイミンを形成することができる。
【００３４】
（２Ｂ）スルフヒドリルへのヒドロキシルの変換。ＰＡＣヒドロキシルは、スルフヒドリル基へと変換され得る。ヒドロキシル基は、ジオキサン或いはピリジンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８から９）における塩化トシル（塩化トルエンスルホニル）で活性化され得る。その後のエステル転移反応は、ｐＨ５．５での０．５Ｍチオ酢酸溶液において達成される。遊離チオールを産生するための前記チオエステルの加水分解は、０．５Ｎメタン酸で実行された。
【００３５】
本明細書で記載された特性によって、ＰＡＣは、グラム陰性細菌感染或いは敗血症と診断された患者、若しくは免疫抑制された患者を治療するのに有用であることが示される。ＰＡＣを有する組成物を用いたあらゆる薬学的に許容可能な治療が使用される。その治療は、抗生物質、化学療法、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療との併用療法を行う場合に、より有効である。前記ＰＡＣはさらに、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤とも共役される。
【００３６】
１つの例示的適用は、それらを除去するための、ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。様々な高分子、高分子の集合体、或いは表面へのＰＡＣｓの固定化は、それらの存在が望まれていない溶液からのリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌細胞の１）除去、２）濃縮、及び３）精製のためにＰＡＣｓを認識要素として使用されることを可能にする。この結合は、２つの形態：直接的或いは間接的、をとることができる。直接的結合実施形態は、ＰＡＣｓが固体及び／若しくは半固体表面（ビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管を有する）へ固定化される場合に適用される。ここにおいて、ビーズ固定化ＰＡＣｓは、標的リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌細胞を捕獲し、結果生じた複合体は、上清が容易に除去され、その結果、固体支持体−結合ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞を生じるように遠心分離或いは磁気的に濃縮される。或いは、この方法で固定化されたＰＡＣｓは、カラム型式に使用され、ここにおいてＰＡＣ−機能化支持体の充填カラムは、ＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌細胞を含む溶液に曝される。間接的実施形態は、高分子及び高分子の集合体へのＰＡＣｓの固定化に関与する。これらは、溶液中のＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌細胞を結合するために使用される。結合後、ＰＡＣｓが結合した前記高分子或いは高分子の集合体へ向けられた固体−支持体−固定化認識要素の添加によって、前記複合体の捕獲及び溶液からのそれらの除去が可能となる。この状況において、使用される前記高分子は、以下：アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、脂質、或いは糖のいずれかで構成され得る。前記高分子の集合体は、以下：多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、或いはナノ粒子のいずれかで構成され得る。前記ナノ粒子は、ナノクラスター、ナノ粒子、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有することができる。
【００３７】
別の例示的適用は、それらを検出するための、ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞へ結合するＰＡＣｓの能力はさらに、一度結合されたＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の検出を達成するためにも使用され得る。本来、固定化ＰＡＣｓに基づいたセンサーは、（上述されたような）固定化ＰＡＣｓ、流体装置、及び結合されたＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の検出を達成するためのメカニズムを有する。検出は、以下の方法：光学（ＵＶ或いは赤外線吸収、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、屈折率における変化）、音響（表面音波、水晶振動子マイクロバランス）、電気化学（電流測定、電位差測定、伝導度測定）を有することができる。
【００３８】
別の例示的適用は、治療上の適用に対するＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。ＰＡＣｓの想定される治療上の適用は、インビボ及びエックスビボの両方である。前記インビボ適用は、細菌感染のリスクがある或いは疑われている患者へのＰＡＣｓの投与（食事を通じて受動的に、或いはボーラス丸剤形態或いは注射を通じて能動的に）を有する。他の従来の抗菌、抗ウイルス、及び抗真菌法との組み合わせでのＰＡＣｓの使用も想定される。そのような併用療法は、従来の抗菌、抗真菌或いは抗ウイルス薬物療法とのＰＡＣｓの同時投与を有する。これらのタイプの薬物療法に対するＰＡＣｓの直接的固定化（上述した方法を介した）。
【００３９】
前記エックスビボ適用は、たくさんの型式におけるＰＡＣｓの使用を有する。これらには、細菌感染が疑われる皮膚領域へのＰＡＣｓの局所的適用を含む。これらはさらに、血漿分離交換適用におけるＰＡＣｓの使用も含み、ここにおいて患者の血漿は、除去され、ＬＰＳ、リピドＡ及び細菌細胞を除去するためにＰＡＣｓとインキュベーションされ、次にその血漿は前記患者へ戻される。
【００４０】
細菌感染間のＬＰＳの存在は、有効な治療にまだ制限がある、重症な炎症状態である敗血症の第一の原因である。ＬＰＳの中和に対するより最近の戦略の間では、天然及び合成陽イオン化合物及びリピドＡ−様物質が使用される。天然ＬＰＳ−結合タンパク質の結合ドメインに基づいたペプチド及び抗菌性ペプチドを含む陽イオン化合物は、ナノモル範囲でのＬＰＳへの親和性を示した（Ａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．，１２，２６１−２７７（２００６））。ＬＰＳのリピドＡ部位へ結合する環状ナノペプチドポリミキシンＢは、その強力なＬＰＳ中和活性に対してかなりの注目を集めていた（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１６５，１４７−１５２（１９９２））。しかしながら、その臨床有用性は、そのかなりの毒性によって妨害されていた。保存リピドＡ部位を真似したリピドＡ−様物質は、その受容体とのＬＰＳの相互作用を妨害することによって機能する。例えば、Ｅ５５６４は、ＴＬＲ４／ＭＤ２受容体とのＬＰＳ相互作用を抑制するように設計された第二世代合成リポ二糖である（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１８７３−１８８０（２００１）；Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））。それらの強力なＬＰＳ中和活性にも関わらず、陽イオン化合物及びリピドＡ−様物質は、それらの毒性或いは高ＬＰＳ濃度によって打ち消されるそれらの能力によってしばしば制限されていた（Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１９４９０−１９４９８（１９９１））。これらの欠点を克服するＬＰＳ結合化合物が必要とされている。
【００４１】
天然由来植物ＰＡＣｓの以前報告されていない生物学的活性：細菌ＬＰＳの効果的な結合及び中和は、本明細書に記載されている。その結果から、クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳと結合することが示された。さらに、クランベリーＰＡＣｓの場合において、より大きなポリマー（２１の平均重合度を有する）は、最も強力なＬＰＳ結合活性を示す。
【００４２】
以前の研究では、細菌細胞表面の構成成分とのＰＡＣ相互作用の重要な役割が明らかになった。Ｆｏｏらは、クランベリーからのＬＨ２０−精製ＰＡＣｓは、α−Ｇａｌ（１→４）β−Ｇａｌ受容体配列を含む表面へのＰ−線毛大腸菌の接着を阻害したことを示した（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１７３−１８１（２０００））。この活性は、４から５の重合度を有し、少なくとも１つのＡタイプ結合を有するＰＡＣｓと関連していた。Ｈｏｗｅｌｌらは後に、この効果は実はＡタイプ結合に特異的なものであり、様々な供給源からのＢ−タイプ結合ＰＡＣｓはこの効果を仲介しないことを報告した（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１−２２９１（２００５））。より最近では、Ｌｉｕ及びその同僚らは、細菌接着のＰＡＣ−仲介性減少に対するメカニズムを提案した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）研究によって、ＰＡＣｓはＰ線毛タンパク質の短縮を誘導し、その結果細菌及びＡＦＭプローブチップの間の接着力の減少を生じることが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７−３０５（２００６））。
【００４３】
Ｐ線毛タンパク質との天然のＰＡＣｓの相互作用と比較して、本発明の発見は、ＬＰＳの天然のＰＡＣｓの認識に関していくつかの違いを指摘する。第一に、ＬＰＳ結合は、Ａタイプフラバン間結合に特異的ではない。クランベリーからのＰＡＣｓは、Ａ及びＢタイプフラバン間サブユニット結合を含む一方、お茶及びブドウＰＡＣｓはもっぱらＢタイプフラバン間結合を含む。それでも、３つの供給源全てからのＰＡＣｓは有効的にＬＰＳに結合する。第二に、クランベリーＰＡＣｓから得られたデータによって、より大きなポリマー（２１の重合度を持つ分画）は、最も高いＬＰＳ結合活性を持つことが示された。最終的に、ＰＡＣｓの抗−細菌接着特性に対する他の研究では尿路疾患系大腸菌に対するＰＡＣｓの効果にほとんど注目していたが、本発明のデータでは明らかに、クランベリーＰＡＣｓは複数のグラム陰性細菌種からのＬＰＳへ結合することが示された。さらに、結合研究によって、クランベリーＰＡＣｓは変異ＬＰＳを有する短リポ多糖鎖、さらには天然ＬＰＳに匹敵する親和性を有するジホスホリルリピドＡを認識することが示された。従って、リピドＡ部位は、ＬＰＳのＰＡＣｓによる認識において有力な役割を果たしている。
【００４４】
クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性は、ＬＰＳ反応性細胞とのＬＰＳの相互作用に著しい影響を与えることができる。ＬＰＳとの細胞内相互作用の現在のモデルにおいて、血清中に存在するＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）は、二分受容体複合体ＴＬＲ４／ＭＤ２へＬＰＳを次々に転移させる膜−常在受容体ＣＤ１４に結合しＬＰＳを提示する（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１７７７−１７８２（１９９９））。ＭＤ２は、受容体のＬＰＳ−結合ユニットである一方、ＴＬＲ４はシグナル伝達構成成分として働く（Ｓｈｉｍａｚｕ；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，６６７−６７２（２００２）；Ｓｃｈｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４，７９−８８（２００１）。ＴＬＲ４／ＭＤ２−ＬＰＳ複合体は最終的に、ＬＰＳ誘導性受容体ダウンレギュレーションの一部としてのカベオラ依存的取り込みメカニズムに関連するエンドサイトーシスを受ける（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））。ＴＬＲ４は物理的にＬＰＳと接触するかという議論が現在存在する一方、ＴＬＲ４／ＭＤ２及びＬＰＳは細胞表面上に安定的複合体を形成し、ＭＤ２に結合したＬＰＳは、ＴＬＲ４シグナル伝達活性化（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））及びＬＰＳエンドサイトーシス（Ｈｕｓｅｂｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ．Ｊ．，２５，６８３−６９２（２００６）；Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））に対して必須であるということは明らかである。
【００４５】
ＬＰＳ受容体の完全補体を発現しているＨＥＫ ２９３細胞において、クランベリーＰＡＣｓは前記細胞表面へのＬＰＳの結合を中程度に減少した一方、それらはＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害した。膜結合実験において、クランベリーＰＡＣｓは、ＭＤ２受容体アゴニスト及びＬＰＳアンタゴニストとして知られているジホスホリルリピドＡと比較して、細胞膜とのＬＰＳ相互作用の抑制においてわずかに強力であった（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，５４８４−５４９１（２００６））。ＰＡＣｓは、ＬＰＳ結合の抑制においてＣＤ１４機能撹乱抗体よりは効果的ではなかった。これは、ＬＰＳに対する膜相互作用の第一ポイント（ｉｎｉｔｉａｌ ｐｏｉｎｔ）として達成されたＣＤ１４の役割と一致する。リピドＡの阻害効果とほとんど同じであった、ＬＰＳのエンドサイトーシスに対するクランベリーＰＡＣｓの阻害効果は、内部移行アッセイにおいて記載しした。これらの結果及びＭＤ２との効果的なＬＰＳ相互作用へのＬＰＳエンドサイトーシスの既知依存性に基づいて（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））、クランベリーＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２受容体複合体とのＬＰＳ相互作用を抑制する場合に重要な役割を担っていたということは合理的なことである。実は、受容体結合実験によって、ＰＡＣｓは、ＣＤ１４とのＬＰＳ相互作用の最大４０％阻害を達成した一方、それらは同じ濃度範囲で、ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ結合を完全に阻害したということが示された。さらに、ＰＡＣｓは、ＰＡＣｓに対して６倍モル過剰で存在するような場合などの、高ＬＰＳ濃度では打ち消されないやり方でＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【００４６】
他の報告では、ＰＡＣｓによる炎症性サイトカインのＬＰＳ誘導性産生の阻害が記載されていた。Ｂｏｄｅｔらは、クランベリージュース濃縮物からのＰＡＣ濃縮分画は、歯肉線維芽細胞におけるＩＬ−６、ＩＬ−８、プロスタグランジンＥ２（Ｂｏｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｓｃｉ．，１１５，６４−７０（２００７））、及びマクロファージにおけるＴＮＦα及びランテス（ＲＡＮＴＥＳ：Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（Ｂｏｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，８５，２３５−２３９（２００６））のＬＰＳ−誘導性産生を阻害したことを示した。この分画は細胞内シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を阻害することが示された一方、シグナル伝達阻害の正確なメカニズムは解明されていなかった。しかしながら、本発明の発見は、ＰＡＣｓが直接的に結合し、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのその相互作用を阻止することによってＬＰＳを中和する、ＬＰＳ阻害のメカニズムに向けられている。さらに、他のＬＰＳ結合物質と比較して、ＬＰＳとのこの相互作用は、ＬＰＳの過剰濃度によって容易に打ち消されることはない。これは、敗血症に対する治療試薬としての他のＬＰＳ結合物質の開発における欠点となっていた。従ってその結果より、ＰＡＣポリマー構造の多価特性は、ＬＰＳのポリ多糖鎖との他の安定化相互作用を可能にすることが示唆された。
【００４７】
ＰＡＣｓは、ポリミキシンＢ或いはリピドＡ−様物質などの他の以前記載されたＬＰＳスカベンジャー或いはＬＰＳ受容体アンタゴニストとは構造的に非常に異なる。さらに、それらＬＰＳ結合特性は、それらは敗血症のインビボ治療に対する新しい治療法の開発が期待できることを示唆している。最低でも、それらの強力なＬＰＳ結合活性、低コスト、及び天然供給源からの幅広い利用可能性によって、それらは、内毒素の除去及び精製を必要とするバイオテクノロジー適用において有用となるであろう。
【００４８】
本発明を記載するに当たり、以下の実施例は本発明の特定の適用を説明するために記載されるものである。これらの特定の実施例は、この明細書に記載された本発明の観点を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００４９】
プロアントシアニジンの精製。透析クランベリージュース濃縮物（ＤＣＣ）は、水（６，０００ＭＷＣＯ希釈チューブ）で透析し、０．２μｍフィルターを濾過させることによって、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｓｕｎ ｐｕｒｅ無糖クランベリージュース（１００％強度、Ｃｅｌｅｓｔｉａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）から製造した。ＰＡＣｓ（非特異的ポリフェノールは除去されている）は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラム（Ｈａｇｅｒｍａｎ，"Ｔｈｅ ｔａｎｎｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｅｒｓ．ｍｕｏｈｉｏ．ｅｄｕ／ｈａｇｅｒｍａｅ／ｔａｎｎｉｎ．ｐｄｆ（２００２））を用いた疎水性吸着クロマトグラフィーによって精製された、完全クランベリージュース、ウェルチ１００％赤ブドウジュース、或いはリプトン紅茶から得た。完全ジュースは、最小容積まで回転蒸発によって減少させ、７０％アセトンで元の容積になるように再懸濁し、３０分間超音波処理し、Ｗｈａｔｍａｎ＃３フィルター紙で濾過した。不溶性物質の再懸濁、超音波処理、及び濾過は２回以上行い、全ての液体を組み合わせた。この溶液は、回転蒸発によって減少させ、全てのアセトンを除去し、元の容積の２倍になるように７５％エタノールに再溶解させた。お茶は、２０分間（３回繰り返した）２００ｍＬの７０％アセトン中に、１つのファミリーサイズのティーバッグの超音波処理によって抽出した。各調合において、前記溶液を組み合わせ、回転蒸発によって減少させ、２００ｍＬの７５％エタノールに再溶解した。この溶液は、総容積と同等のバッチにおけるＳｅｐｈａｅｘ ＬＨ２０カラムへ適用した。少量のフェノール類は、総容積の５倍と同等のエタノールで溶出することで除去した。ＰＡＣｓは、アセトンで溶出し、最小容積まで回転蒸発によって減少させた。完全クランベリージュースから回収されたＰＡＣは次に、さらなる特徴付けのために、２５％エタノールを含む水に対して分画透析によって分画させた。分画は、２，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；Ｄｉａｌ<２ｋ）を通った分画；２，０００ＭＷＣＯ（Ｄｉａｌ２−３ｋ）では保持されたが３，５００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ＣＥ）を通った分画；３，５００ＭＷＣＯチューブ（Ｄｉａｌ３−６ｋ）では保持されたが６，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ６−８０００）を通った分画；及び６，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｄｉａｌ６ｋ）で保持された分画、として回収した。全ての物質は貯蔵用に、窒素気流下で粉末になるまで乾燥させた。精製物質は、結合実験に使用するために３３％エタノール／Ｈ２Ｏに溶解した。各精製化合物の重合度は、酸ブタノールアッセイと組み合わせた修飾バニリンアッセイによって決定した。ＰＡＣ濃度は、標準としてタンニン酸を用いた放射状拡散アッセイによって決定した（Ｈａｇｅｒｍａｎ，"Ｔｈｅ ｔａｎｎｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｅｒｓ．ｍｕｏｈｉｏ．ｅｄｕ／ｈａｇｅｒｍａｅ／ｔａｎｎｉｎ．ｐｄｆ（２００２）；Ｈａｇｅｒｍａｎ，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｃｏｌ．１９８７，１３，４３７）。チオ開裂及びＨＰＬＣによる精製した物質の解析によって、ＬＨ２０分離後に低分子種は残っていなかったことが示された（Ｈａｍｍｅｒｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．（２０００）１３０：２０８６Ｓ−２０９２Ｓ；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（２００２）５０：４８５２−４８６０；Ｐｒｉｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３６：７８１−７８４；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（１９９８）４６：１３９０−１３９６）。これらの解析に基づいて、ＰＡＣｓは糖、酸及び低分子量混入物がないと考えられた。
【００５０】
【表１】
【実施例２】
【００５１】
大腸菌の非特異的接着−新規研究ラボアレイバイオセンサー（Ｔｈｅ Ｎａｖａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）は、目的物の解析を検出するためにタンパク質コーティングガラス導波管を用いるものである（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，４３３（１９９９）；Ｔａｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｅｃｏｌ．，４７，１７５（２００４）；Ｇｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ，６５，１０７８（２００５））。前記導波管の表面は、前記表面の他の領域をコーティングするために、非特異的不動態化分子での捕獲分子のパターンアレイを有している（Ｓａｐｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４，１０６１（２００２）；Ｎｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７，１４８（２００５）；Ｓｈｒｉｖｅｒ−Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７，２４３１（１９９５））。標的の蛍光ベース検出は、捕獲分子領域の識別に依存している。前記表面の予想外な領域への標的の非特異的接着は、検出の制限、さらには前記アレイバイオセンサーに対する仮性ポジティブ／ネガティブ比に対して負に影響を及ぼす。
【００５２】
非病原性大腸菌種（ＡＴＣＣ３５２１８）及び低親和性抗体（大腸菌に対するウサギポリクローナル抗体；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州）の組み合わせは、バックグラウンド強度からシグナルを識別することを困難にする非特異的結合度を作ることが見出された（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８，８５３（２００６））。細菌細胞は、表面タンパク質及び／若しくはリポ多糖（ＬＰＳ）に関連した相互作用を通じて接着する。非特異的結合の減少に対する従来のアプローチ（例えば、導波管表面をブロッキングする、若しくはタンパク質或いは糖でサンプルを追加添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）する）は成功しなかった。尿路における細菌細胞接着に対するクランベリージュースの影響に基づいて、前記ジュースは前記アレイバイオセンサーにおける接着の潜在的メディエーターとして検討した。図２は、様々な濃度のクランベリージュースでアッセイしたサンプルのシグナル強度に対するバックグラウンド強度の割合に対するデータを示している。Ｏｃｅａｎ Ｓｐｒａｙ１００％クランベリー及び２７％クランベリージュースを含むＣｏｎｃｏｒｄブドウジュースブレンドを使用した。ジュースの非存在下で、バックグラウンド強度は総シグナルの６７％であった。５０％ジュースブレンド（１３．５％クランベリージュースと同程度）の添加は、総シグナルの１％未満まで前記バックグラウンド強度を減少した（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ）。ブドウジュースでのサンプルの追加添加は、前記バックグラウンドシグナルに対してこのような影響を及ぼすことが見出されなかった（ウェルチのＰｕｒｐｌｅ１００％ブドウジュース）。アップルジュース、オレンジジュース及び白クランベリージュース（Ｏｃｅａｎ Ｓｐｒａｙ１００％ジュースブレンド）でのサンプルの追加添加も、バックグラウンドシグナルの減少は生じなかった。白クランベリージュースは、赤い色及び酸っぱい味が形成される前に収穫されたクランベリーから製造された。使用された前記白クランベリージュースブレンドは、１３．５％クランベリージュースを含む。濃度におけるこの違いは、赤クランベリージュースで使用されたものと同様な濃度が検討されるような、サンプルを追加添加した場合の要因となっていた。
【００５３】
いくつかのメカニズムが、クランベリージュースによる細菌細胞接着の阻害に対して記載されていた（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，５４，８６（２００４）；Ｂｒｕｍｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，１８６（１９６２）；Ｋｌｅｐｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．，６，１（２００３））。前記ジュースの酸性度、希少Ｄ−マンノース化合物を含む糖含有量、及び希少ポリフェノール化合物の存在は、寄与因子として提案された。サンプルに追加添加された前記ジュースのｐＨを調節することによって、原因となる因子としての酸性度が排除された。前記ジュースの糖含有量は、同濃度でフルコース、グルコース及びマンノースを大腸菌サンプルへ追加添加することによって、因子から排除された。導波管表面不動態化も、前進接触角に対するサンプル追加添加の影響に関する研究を介して、潜在的なメカニズムとして排除された。標準細菌細胞調合が追加添加された場合、前記接触角は汚れていないガラススライドに強く影響を及ぼすが、前記アレイバイオセンサーで使用されたタンパク質コーティングスライドに対しては目立つ影響を与えなかった。
【００５４】
尿路におけるヒト上皮細胞との大腸菌の相互作用は、細菌細胞表面上のｐ−線毛タンパク質の阻害を通じて、クランベリージュースからのＡタイププロアントシアニジンによって阻害された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７（２００６）；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆａｓｅｂ Ｊ．，１５，Ａ２８４（２００１））。ガラス導波管への接着に対するＰＡＣｓの潜在的影響を検討するために、糖及び他の小分子は、水に対する透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ６−８０００）を通じてクランベリージュース（Ｌａｎｇｅｒ’ｓクランベリー濃縮物）から排除した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，５４，８６（２００４））。コロイド粒子は、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＰＦ；Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ミシガン州）を用いて、前記透析物質の濾過を通じて除去した。前記透析物質は窒素下で、２７％クランベリージュース当量になるまで再濃縮し、アレイバイオセンサーアッセイのサンプルに追加添加するために使用した。この透析され濾過されたクランベリージュースは、サンプルにクランベリージュースブレンドを追加添加した場合に観察された結果と同じ結果を示した。
【実施例３】
【００５５】
ＬＰＳ結合アッセイ−ＰＢとのＬＰＳの相互作用を阻害する両ＰＡＣｓの能力は、アガロースビーズベースプルダウンアッセイを用いて評価した（図３、４）。ポリミキシンＢ（１０μＭ、アガロースビーズへ共役（シグマ））は、最終容積２５０μＬの０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）におけるＤＣＣ、非透析ＬＨ２０ ＰＡＣ、或いはサイズ分画ＬＨ２０ ＰＡＣの非存在下或いは存在下で、１００ｎＭ ＬＰＳ−ＦＩＴＣ（大腸菌セロタイプＢ５：０５５、シグマ）とインキュベーションした。反応物は暗所にて１時間２５℃でかき混ぜた。非結合ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、３ラウンドの遠心分離及び２５０μＬの０．０５Ｍトリス緩衝液での洗浄によって除去し、その後２００μＬのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。各サンプルの一連の希釈は、ヌクレアーゼを含まない水で調合し、蛍光は、Ｓａｐｈｉｒｅ蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ノースカロライナ州）を用いて、４９５±２．５ｎｍでの励起、及び５３５±２．５ｎｍでの発光によって測定した。比較実験は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからのＬＰＳ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（Ｒｃ変異）及び大腸菌ＥＨ１００（Ｒａ変異）の変異種からのＬＰＳで実行した。後者２つの種は、野生ＬＰＳに対して様々な長さのポリ多糖鎖を含む。結合実験は、ジホスホリルリピドＡでも行った。リピドＡ及びＬＰＳの共役は、製造者の取扱説明書に従ってフルオレセインイソチオシアン酸（シグマ）で行い、物質は非結合色素から分離するためにＰＢＳに対する透析へ供した。全ての場合において、共役度は、標識種のモル当たり約２から３フルオレセインになるように、分光法によって決定した。
【００５６】
固体相結合アッセイを用いて、ＬＰＳに結合するＡ及びＢタイプＰＡＣｓ両者の能力は、固定化ポリミキシンＢとの大腸菌ＬＰＳの相互作用を阻害するそれらの能力を決定することによって評価した。お茶及びブドウ（もっぱらＢタイプ結合を有する）からのＰＡＣｓに対してクランベリー（Ａ及びＢタイプ結合両者を有する）からのＰＡＣｓを比較する結合実験によって、両結合を有するＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳに効果的に結合したことが示された（図４（Ａ））。これらのデータをパーセント阻害でプロットした場合、高分子量のポリマーを含むように透析を介して濃縮されたクランベリーＰＡＣｓは、０．７μＭのＩＣ５０を有する最も強力なＬＰＳ結合活性を示した（図４（Ｂ））。お茶（非透析）からのＰＡＣｓは、１．１μＭのＩＣ５０を有する次に最も有効であった。ブドウ及びクランベリーからの非透析ＰＡＣｓは、ＬＰＳに対して同程度の相対親和性を示した（ＩＣ５０＝３．０μＭ）。透析クランベリー濃縮物（ＰＡＣｓは濃縮されていない）は、ＬＰＳに対して最も低い相対親和性を示した（ＩＣ５０＝１０．５μＭ）。分画透析によって産生されたクランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性を比較した場合、ＬＰＳに対する相対親和性及びＰＡＣ分子量の間に正の相関性が観察された。実は、より大きな分子量ポリマーは、より低い分子量ＰＡＣｓと相対して、より高いＬＰＳ結合活性を示した（図４（Ｃ））。従って、全てのその後の実験は、２１の平均重合度を有するクランベリーからのＰＡＣ分画（今後「クランベリーＰＡＣｓ」と言及する）を用いて実行した。
【００５７】
クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＰｄｅｕｄｏｍｏｎａｓからのＬＰＳに同程度の親和性を有して結合するそれらの能力が証明されたので、大腸菌ＬＰＳに限定しなかった。さらに、クランベリーＰＡＣｓは、野生型ＬＰＳに対して３分の１以下の親和性のみを有して、様々な長さの短ポリ多糖鎖を有する２つのＬＰＳ変異体（大腸菌からのＲａ変異体及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａからのＲｃ変異体）に結合した。これらの結果は、表２にまとめた。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ポリミキシンＢはＬＰＳのリピドＡ部位へ結合することが知られているので（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１６５，１４７−１５２（１９９２）））、リピドＡ部位との相互作用は、ＬＰＳのクランベリーＰＡＣｓ認識において主要な役割を担っていることは道理にかなっていた。実は、クランベリーＰＡＣｓは、無傷大腸菌ＬＰＳに対するその親和性よりも２倍以上もの相対親和性である、見かけ上０．３μＭのＩＣ５０を有して、ポリミキシンＢへの大腸菌リピドＡの結合を効果的に阻害した（表２）。この結果は、ＬＰＳに対するクランベリーＰＡＣｓ結合におけるリピドＡ部位の重要性を確認するものである。
【実施例４】
【００６０】
ＬＰＳ膜結合及びエンドサイトーシスの解析。ヒトＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２（ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を安定的に発現しているヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）は、チャンバーウェルで増殖させ、０．５μＭ ＬＨ２０ ＰＡＣ（Ｄｉａｌ>６Ｋ）の非存在下或いは存在下で、１．５時間３７℃にて２５ｎＭ ＬＰＳ（大腸菌セロタイプＯ５５：Ｂ５５、シグマ）とインキュベーションした。コントロール実験において、ＴＬＲ４或いはＣＤ１４は、抗ＴＬＲ４或いは抗ＣＤ１４モノクローナル抗体（結合部位において５００ｎＭ、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．）或いはリピドＡ（シグマ）との共インキュベーションによって機能的にブロクされた。インキュベーション後、前記細胞はＰＢＳで２回洗浄し（１０分）、ＬＰＳ膜結合を評価するために（３．７％パラホルムアルデヒドで）固定した、若しくはＬＰＳ内部移行を決定するために（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で）固定し透過処理した。１％正常ヤギ血清でブロッキングした後、膜結合或いは内部移行ＬＰＳは、フルオロセインと共役したヤギ抗−ＬＰＳ抗体（Ｏ／Ｋセロタイプ特異的、Ａｂｃａｍ）を用いて検出した。核はＤＡＰＩで対比染色した。画像化は、オリンパスＩＸ−７１顕微鏡を用いて実行した。膜関連或いは細胞内蛍光の相対量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ，Ｖ．１．３７）を用いて画像解析することによって定量化した。データは、膜関連或いは内部移行ＬＰＳからの平均チャネル蛍光として報告し、各サンプルから１０から２０細胞の解析（各細胞当たり最低１０測定）を示した。合併画像はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２（バージョン９）を用いて作った。
【００６１】
ＰＡＣｓはＬＰＳの膜結合をわずかに阻害し、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害する。ＬＰＳのわずかな結合に対して、ＬＰＳ−結合化合物の望ましい特性は、ＬＰＳ−反応性哺乳類細胞とのＬＰＳ相互作用を阻害する能力である。それらの強力なＬＰＳ−結合活性に基づいて、クランベリーＰＡＣｓは、ＬＰＳ受容体の完全補体を発現した細胞とのＬＰＳ相互作用を潜在的に阻害することができるというのは道理にかなっている。細胞結合研究は、ＣＤ１４及びＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体４／ＭＤ２を発現したＨＥＫ ２９３細胞（ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２）において実行し、最小非特異的結合（図５（Ａ）、フレーム「ＬＰＳなし」）を有する膜結合ＬＰＳ（図５（Ａ）、フレーム「ＬＰＳ」）に対応する区別できる染色パターンを明らかにした。リピドＡとのＬＰＳの共インキュベーションは、ＬＰＳ膜結合を有意に減少させない一方、クランベリーＰＡＣの存在は、膜結合ＬＰＳの量において中程度だが有意な減少（１５％以下）を生じた（図５（Ｃ））。抗−ＴＬＲ４機能−撹乱抗体も、ＬＰＳ結合において中程度の減少を引き起こした（２３％以下）一方、クランベリーＰＡＣとの組み合わせにおけるこの同じ抗体は、さらなるＬＰＳ撹乱には影響を及ぼさなかった。抗−ＣＤ１４機能−撹乱抗体は、最大度のＬＰＳ結合阻害を仲介する（８４％阻害以下）ことが見出され、これはＬＰＳ膜結合におけるＣＤ１４の非常に重要な役割を示すものである。ＬＰＳ内部移行の解析によって、リピドＡ及びクランベリーＰＡＣは、それぞれ８４％及び７６％の阻害度で（図５（Ｄ））、ＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に阻害した（図５（Ｂ））。抗−ＴＬＲ４抗体は、ＬＰＳエンドサイトーシスの５０％以下の阻害を仲介した一方、クランベリーＰＡＣとの前記抗体の共インキュベーションは、この阻害をさらに６２％以下まで増加した。抗−ＣＤ１４抗体はＬＰＳエンドサイトーシスの約８０％阻害を仲介した。コントロール実験において、ＰＡＣｓ及びＬＰＳを含む培養液への、エンドサイトーシス経路のマーカーであるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンの添加によって、エンドソームコンパートメントの強い染色がＰＡＣｓの存在及び非存在下両方で観察されたが、ＰＡＣｓは正常エンドサイトーシスに対して阻害効果を持たなかったことが示された。従って、ＰＡＣｓは、全体的なエンドサイトーシスに対して阻害効果を有さない一方、ＬＰＳのエンドサイトーシスを特に阻害した（図６）。
【００６２】
ＬＳＰとの細胞相互作用の現在のモデルにおいて、血清に存在するＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ）は、ＬＰＳと結合し、ＬＰＳを二分受容体複合体であるＴＬＲ４／ＭＤ２へ順に転移させる、膜−常在受容体ＣＤ１４へＬＰＳを提示する（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９，１７７７−１７８２）。ＭＤ２は、受容体のＬＰＳ−結合ユニットである一方、ＴＬＲ４はシグナル伝達構成成分として働く（Ｓｈｉｍａｚｕ；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，３，６６７−６７２；Ｓｃｈｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，１９４，７９−８８）。ＴＬＲ４／ＭＤ２−ＬＰＳ複合体は、ＬＰＳ−誘導性受容体ダウンレギュレーションの一部として、カベオラ−依存性取り込みメカニズムに関連したエンドサイトーシスを最終的に受ける（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏ．，２００５，３３８，１４０２−１４０９）。ＴＬＲ４が物理的にＬＰＳを接触するか否かなどの議論が現在あるが、ＴＬＲ４／ＭＤ２及びＬＰＳは、細胞表面上で安定複合体を形成し、ＭＤ２に結合するＬＰＳはＴＬＲ４シグナル伝達活性（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７５，６４６５−６４７２）及びＬＰＳエンドサイトーシス（Ｓｈｕｔｏ；Ｈｕｓｅｂｙｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００６，２５，６８３−６９２）に必須であるということは明らかである。従って、クランベリーＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体とのＬＰＳ相互作用を阻害することによってＬＰＳエンドサイトーシスを阻害するという仮説が立てられた。
【００６３】
ＬＢＰ、ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤへの２ＬＰＳ結合のＰＡＣ阻害。ヒトＣＤ１４（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、４℃で一晩、ＰＢＳにおいてＥＬＩＳＡプレートへ吸収させた。ヒスチジン−タグ化−ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）或いはヒトＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ、Ｂｉｏｍｅｔｅｃ）は、抗−ポリヒスチジンモノクローナル抗体（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の受動的吸収によって調合したＥＬＩＳＡプレートへ、４℃で一晩捕獲させた。ウェルは３０分間３７℃にて、ＰＢＳにおける１％正常ヤギ血清でブロッキングした。５ｎＭ大腸菌ＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合は、３０分間３７℃にて、ＬＨ２０ ＰＡＣの存在下或いは非存在下でのＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清において実行した。存在する場合、可溶化ＣＤ１４は、最終濃度２５ｎＭであった。結合ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、ヤギ抗フルオレセイン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ共役体（Ａｂｃａｍ）及びテトラ−メチルベンジジン基質（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）を用いて検出した。血清の非存在下で、ＣＤ１４或いはＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合は、検出限度以下であった。
【００６４】
ＰＡＣｓは、ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を抑制するが、ＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ）との相互作用は抑制しない。結合研究は、その同族受容体とのＬＰＳ相互作用に対するクランベリーＰＡＣｓの効果を提案するために実行した。図７（Ａ）は、固定化ＬＢＰ、ＣＤ１４或いはＴＬＲ４／ＭＤ２への大腸菌ＬＰＳの結合を阻害するクランベリーＰＡＣｓの能力を測定するために行った結合実験の結果を示したものである。クランベリーＰＡＣｓはＬＢＰとのＬＰＳ相互作用に対して優位な効果を示さなかったが、テストした最高ＰＡＣ濃度（５００ｎＭ）でＣＤ１４へのＬＰＳ結合の３８％の最高阻害を達成したことが明らかとなった。同じ濃度範囲において、クランベリーＰＡＣｓは、ＩＣ５０が２０ｎＭ ＰＡＣ以下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を完全に阻害した。さらに、可溶化ＣＤ１４の存在下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２によって結合したＬＰＳの量は約４倍に増加し、これはＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳの転移を仲介する場合におけるＣＤ１４の立証された役割と一致するものであることが見出された（Ａｄｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０６，７８２−７８７；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１，１３５−１４５）。しかしながら、クランベリーＰＡＣがＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ結合を阻害する程度は変わらないままであり、これは固定化ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳのＣＤ１４仲介性転移を阻害するＰＡＣｓの能力を示すものである（図７（Ｂ）、挿入図）。
【００６５】
ＮＦ−κＢ活性化の定量化。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、５ｘＮＦ−κＢ−誘導性プロモーターの制御下で分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコード化した、ＮＦ−κＢ−誘導性受容体プラスミドであるｐＮｉＦｔｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で一過性に形質移入した。細胞は、９６ウェルプレートのウェルへ播種し（４ｘ１０４細胞／ウェル）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の取扱説明書に従って形質移入した。４８時間後、前記細胞は、クランベリーＰＡＣｓの存在下或いは非存在下、２ｎＭ ＬＰＳで１６時間刺激した。ＳＥＡＰ活性は、比色定量性ＳＥＡＰアッセイキット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って、組織培養上清で測定した。
【００６６】
ＰＡＣｓは、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性、及び細胞表面受容体とのＬＰＳ相互作用のそれらの抑制に基づいて、ＰＡＣｓは、転写因子ＮＦ−κＢのＬＰＳ−誘導性活性化も阻害することができるというのは道理にかなっていた。ＬＰＳによるＮＦ−κＢ活性化は、炎症誘発性サイトカインの発現を導き、敗血症を含む病的状態を最終的に導く代謝性及び生理学的変化を生じる（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１２，１４１−１７９）。図８（Ａ）に示したように、クランベリーＰＡＣｓは、２５ｎＭ ＰＡＣのＩＣ５０を有して、２ｎＭ ＬＰＳで刺激されたＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞において用量依存的にＮＦ−κＢの活性化を、阻害した。さらに、図８（Ｂ）におけるデータから、この阻害はＬＰＳの過剰量によって容易に超えられなかったことが示された。クランベリーＰＡＣの非存在下で、ＬＰＳにおける増加は、ＮＦ−κＢ反応において対応する増加を生じた。ＬＰＳの濃度が２ｎＭ以上に増加した場合、主としてＬＰＳ−誘導性細胞毒性が原因で、その反応におけるわずかな減少が見られた（以下を参照）。０．５ｎＭクランベリーＰＡＣ存在下で、ＮＦ−κＢ反応における一致した減少は、全てのＬＰＳ濃度において観察された。ＬＰＳが３ｎＭ（ＰＡＣの６倍モル過剰）で存在した場合でさえ、ＮＦ−κＢ活性化は、コントロールレベルまで戻らなかった。クランベリーＰＡＣが１０ｎＭで存在した場合、ＮＦ−κＢ反応における一致した減少（全てのＬＰＳ濃度において約５０％）は、コントロールと相対して観察された。
【実施例５】
【００６７】
細胞毒性アッセイ−細胞毒性は、比色定量細胞増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、９６ウェルプレートのウェルへ播種し（１ｘ１０４細胞／ウェル）、製造者の取扱説明書に従って、アッセイ前４８時間テスト化合物の用量範囲で培養した。ＰＡＣｓの細胞毒性の検査は、７００ｎＭの毒性に対するＩＣ５０で明らかになり、１００ｎＭ以下の濃度では毒性効果は観察されなかった（図８（Ｃ））。ＬＰＳ（６ｎＭ以下の毒性に対するＩＣ５０）と比較した場合、ＰＡＣｓは１００分の１未満の毒性であった。野生ＬＰＳとの比較において、リピドＡのジホスホリル形態は、３μＭ以下の濃度で毒性を誘発しなかった。
【実施例６】
【００６８】
ＰＡＣｓの固定化及びＬＰＳ結合アッセイ−固体支持体に固定化された細菌及び細菌細胞構成成分に効果的に結合するためのＰＡＣ物質の能力を決定するために、クランベリー及びブドウジュースからのＰＡＣｓは、タンパク質固定化に使用された一般的な技術（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，３８４６（１９９９））の改訂版を用いて、ガラス顕微鏡スライド（導波管）の表面へ共有結合的に接着させた。カテキンモノマー及び緩衝液のみの領域もコントロールとして含めた。簡潔には、前記導波管、ガラス顕微鏡スライド（Ｄａｉｇｇｅｒ，Ｗｈｅｅｌｉｎｇ、イリノイ州）は、水酸化カリウム／メタノール溶液（Ｃｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１４，６８３（１９９９））への液浸によって洗浄し、次にすすぎ乾燥させた。洗浄された導波管は次に、４５分間トルエン中の２％（３−メルカプトプロピル）トリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）とインキュベーションし、その後すすぎ乾燥させた。前記スライドは、エタノール中の１．８ｍＭ Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸（ＰＭＰＩ）に１時間液浸させた。ＰＭＰＩのマレイミド基は、イソシアン酸基を遊離させＰＡＣｓのヒドロキシ基と反応させるシラン反応によって提供されたスルフヒドリル基と反応する。ＰＭＰＩ固定化の後、導波管は脱イオン化水ですすぎ、乾燥させ、以前記載されたＰＤＭＳパターン化鋳型に乗せた（Ｒｏｗｅ）。クランベリー或いはブドウジュースからの１０ｍｇ／ｍＬ ＰＡＣｓの溶液、１０％メタノールを有する１０ｍＭ ＰＢＳにおけるカテキン、及び１０％メタノールを有するＰＢＳ（ネガティブコントロール）は、４℃で一晩、ＰＤＭＳ鋳型のレーンにおいてインキュベーションさせた。パターン化溶液はＰＢＳを用いてＰＤＭＳレーンから流し、前記スライドは脱イオン化水ですすぎ、乾燥させ、使用するまで４℃で保存した。
【００６９】
ＬＰＳへ結合する固定化ＰＡＣｓの能力は、定常アッセイを用いて検討した。チャネルを有するＰＤＭＳフローセルは、各サンプルレーンが各パターン列に曝されるように、パターン化鋳型のフローセルに垂直に取り付けた。サンプルレーンは、ＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の様々な濃度のＬＰＳ−ＦＩＴＣ（大腸菌０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）を注入した。前記ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、１時間レーンにおいてインキュベーションさせ、ＰＢＳ及び脱イオン化水ですすいだ。スライドは、４９６ｎｍでの励起、及び５１５ｎｍ以上で回収された発光を、エバネッセント光蛍光分光測定を用いて画像化した。ＬＰＳ−ＦＩＴＣの濃度範囲での曝露に対して、クランベリー及びブドウジュースからのＰＡＣｓは、ＬＰＳ−ＦＩＴＣへ特異的に結合する一方、カテキン及び緩衝液コントロールは、テストした最も高濃度でさえ結合しなかったことが明らかとなった。従って、ＰＡＣｓは、固体支持体へ固定化されたＬＰＳへ結合する能力を保持していた。
【実施例７】
【００７０】
ＰＡＣ及びカテキン固定化−精製ＰＡＣｓ及びカテキン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、（Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸）（ＰＭＰＩ；Ｐｉｅｒｃｅ）クロスリンク剤を介して、活性化チオール−セファロース（登録商標）４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）へ固定化した。セファロース（登録商標）は、脱イオン化水で１時間膨張させた（１５ｍＬＨ２Ｏにおいて１ｇ乾燥物質）。前記物質は次に、５回の懸濁／遠心分離／デカントサイクルで、新鮮なｄＩ−Ｈ２Ｏを用いて洗浄した（１グラム乾燥開始物質当たり総５０ｍＬ）。懸濁はボルテックスを用いて行い、遠心分離工程は５分間３，０００ｇで行った。セファロース（登録商標）物質（１グラム開始物質当たり総容量５ｍＬ）は次に、エタノールで３回洗浄した（１グラム開始物質当たり総容量３０ｍＬ）。前記ＰＭＰＩクロスリンク剤は、エタノール中の３％ジメチルスルホキシドでの（１グラム開始物質当たり１０ｍＬ）、チオール基濃度を超えるＰＭＰＩの１０倍モル過剰を用いた定常撹拌下で、洗浄したセファロース（登録商標）物質と１時間室温でインキュベーションした。インキュベーション後に、遠心分離、デカント及び５０％エタノールでのすすぎを３サイクル続けた。セファロース（登録商標）は次に、５０％エタノールにおける分析物の１０倍モル過剰（１グラム開始物質当たり１０ｍＬ）を用いて、ＰＡＣ或いはカテキンと共にエタノール中において４℃で一晩インキュベーションした。最終工程として、前記セファロース（登録商標）は５０％エタノール（１グラム開始物質当たり４０ｍＬ総量）を用いて４サイクルすすぎ、Ｈ２Ｏ中の０．０２％アジドナトリウムに再懸濁させた（１グラム開始物質当たり１６ｍＬ最終容量）。前記物質は、使用するまで４℃暗所で保存した。ビーズセットに対するＰＡＣ濃度は、プルシアンブルーアッセイによって決定した。
【実施例８】
【００７１】
リポ多糖（ＬＰＳ）に対する蛍光ベールプルダウンアッセイは、セファロース−固定化ＰＡＣｓ及びアガロース−固定化ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を用いて、ｐＨ８．０での５０ｍＭ トリスにおいて行った。固定化捕獲分子及びＬＰＳは、室温で１時間、定常撹拌でインキュベーションし、すすぎ、９６ウェルプレートへ移した。ＦＩＴＣ−標識ＬＰＳ（大腸菌０５５：Ｂ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の蛍光は、４９５ｎｍ励起及び５２０ｎｍ発光（５ｎｍバンド幅）にて、Ｔｅｃａｎ ＸＳａｆｉｒｅモノクロメータ−ベースミクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００７２】
プルダウンアッセイで使用するＰＡＣビーズは、クランベリー、クランベリージュース、お茶及びブドウジュースからのプロアントシアニジンをセファロースビーズへ固定化することによって産生した。付加的なビーズセットは、分子量６，０００以上を有する、クランベリーからのＰＡＣｓの分画をセファロースビーズへ固定化することによって産生した。これらのビーズを用いて行われたアッセイによって、全ての５ビーズセットは、溶液（５０ｍＭトリスｐＨ８）からのＦＩＴＣ−標識ＬＰＳを結合するために使用され得ると示された。お茶及びクランベリーからの固定化ＰＡＣｓを有するビーズに対する濃度依存曲線は、図９に示した。カテキンでコーティングしたビーズは、セファロース及びクロスリンク剤へのＦＩＴＣ−ＬＰＳの低度の非特異的結合を検証するために使用した。セファロースビーズへのＬＰＳの結合が固定化ＰＡＣとの特異的相互作用を介していることをさらに検証するために、アッセイ中に可溶化ＰＡＣを前記サンプル溶液に添加する競合アッセイを用いた。可溶化ＰＡＣの濃度が増加するにつれて蛍光強度の減少が見られ、これは予想されたようにプルダウンアッセイに起因するものである（図１０）。
【００７３】
図１０において、お茶からの可溶化ＰＡＣｓは、お茶からの固定化ＰＡＣｓで行われたアッセイへ添加された一方、クランベリーからの可溶化ＰＡＣｓはクランベリーからの固定化ＰＡＣｓで行われたアッセイへ添加された。ＰＡＣ−お茶ビーズによるＬＰＳ結合の５０％阻害は、６．５μＭで生じた一方、クランベリーからのＰＡＣｓによる結合の５０％阻害は、９．８μＭで生じた。２つのアッセイタイプにおける捕獲分子濃度は、ＰＡＣ−お茶ビーズに対しては５．５μＭであり、ＰＡＣ−クランベリービーズに対しては６．０μＭであった。捕獲分子濃度及び５０％阻害が生じるレベルの間の矛盾は、いくつかの考察が考えられた。捕獲分子濃度は、同じ供給源からの可溶化ＰＡＣｓに行ったプルシアンブルーアッセイと比較して、プルシアンブルーアッセイを用いて推測された。この研究によって、固定化ポリフェノールの全ての構成成分は、溶液中と類似したやり方で利用できると推測された。解析によってさらに、セファロース上で達成された重合度が溶液中で観察されたものと類似しているので、全ての重合度は同等に固定化されたとも推測された。比較的低い可溶化ＰＡＣ濃度ではＦＩＴＣ−ＬＰＳの蛍光をクエンチしないことが見出されたが、固定化ＰＡＣｓは、局所的に高濃度を示していた。この影響は、図９に見ることができる。標的濃度の増加に伴った蛍光強度における増加は、簡単なモデルでは記載できなかった。加えて、目的の波長範囲におけるＰＡＣ吸光度が１０，０００オーダーでのモル吸光計数を有して低いにも関わらず、ＰＡＣｓの局所的な高濃度は、ＦＩＣＴ−ＬＰＳで利用可能な励起強度を減少する。これら因子の全ては、固定化ＰＡＣｓによるＬＰＳ結合の５０％阻害を得るために必要な可溶化ＰＡＣｓの予想濃度における、プルシアンブルーアッセイと同様に実際の差異に、若しくはクエンチングと同様に観察された差異に寄与するであろう。
【００７４】
ＰＭＢ−ＬＰＳ相互作用の阻害（実施例３）によって、ＰＭＢ結合を阻害するやり方でのＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用が示唆されたが、これは、ＬＰＳのリピドＡ部位とのＰＡＣｓの相互作用を保証するものではなかった。この潜在的な相互作用をさらに検討するために、ＰＡＣ−ビーズを用いたＦＩＴＣ−ＬＰＳの存在に対するアッセイを、リピドＡの様々な濃度でのＰＡＣビーズの平衡後に実行した（図１１）。アッセイは、３μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−ＬＰＳ（約３ｎＭ）で行った。リピドＡの存在は、お茶及びクランベリーからのＰＡＣｓに対してそれぞれ１００ｎＭ及び５００ｎＭのＩＣ５０値を有して、固定化ＰＡＣｓによるＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合を阻害することが見出された。しかしながら、１００μＭという高い濃度のリピドＡの添加は、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合の８０％以上の阻害を生じることに失敗した。これは、より高い濃度でミセル或いは沈殿を形成するというリピドＡの利用不可能性の結果なのか、或いはＬＰＳ及び固定化ＰＡＣｓの間の結合相互作用がＬＰＳのリピドＡ部位に限定されなかったという事実の結果なのか不明である。
【００７５】
ＬＰＳ捕獲に対するセファロース−固定化プロアントシアニジンの有用性を評価するために、商業的に利用可能なアガロース−固定化ポリミキシンＢに対してサイドバイサイド比較を行った。図１２は、ＰＭＢ、及びお茶及びクランベリーからのＰＡＣｓに対する捕獲分子の濃縮物の分画として捕獲されたパーセントＬＰＳを示したものである。固定化ＰＡＣに結合した場合、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ蛍光強度のクエンチングは、前記捕獲物質の直接比較が難しいことが示された。この問題は、前記捕獲物質とのインキュベーション後、溶液中に残存するＦＩＴＣ−ＬＰＳの蛍光強度を測定することによって取り組んだ。パーセント捕獲値は、同じように操作した捕獲分子を含まないサンプルに対して、捕獲物質とのインキュベーション後に残存する蛍光を比較することに基づいていた。両タイプのＰＡＣビーズは、ＰＭＢビーズよりもわずかにより良く実施された。これは、プロアントシアニジンによるＬＰＳのポリミキシンＢ結合の阻害（実施例３）に基づくものであることが推測された。
【００７６】
本発明における様々な変更及び変形例は明らかに上記教示の観点において可能である。従って、請求されている発明は、具体的に記載されていない限りにおいては実施可能であることが理解される。単数形、例えば冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」或いは「ｓａｉｄ」などにおける請求の構成要素に対するあらゆる参照は、その要素を単数形に制限するものとして解釈されるものではない。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年７月９日付けに出願の米国仮出願番号第６０／８２４，７９４号に対して優先権を主張した、２００７年２月８日付け出願の米国特許第１１／８３２，８３４号及び第１１／８３２，８５２号に対して優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、主にプロアントシアニジンに関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノール化合物は、高等植物に広く分布し、人の食事の一部にも含まれている。ポリフェノール化合物に対する興味は、それらの抗酸化活性に起因するそれらの潜在的な健康効果によって促進されてきた（Ｃｒｏｆｔ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５４，４３５（１９９８）；Ｂｒａｖｏ，Ｎｕｔｒｉ．Ｒｅｖ．，５６，３１７（１９９８））。フラボノイドの抗酸化活性は、非常に詳細に研究されてきた（Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０，９３３（１９９６）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，６７，５１５（２００１）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６１，７６（１９９８）；Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｒｍａｎ，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（２０００））。タンニンは、３つの主要なグループ、１）加水分解性、２）複合体、及び３）凝集タンニン或いはプロアントシアニジン（ＰＡＣｓ）、に分類されるポリフェノール化合物の重要なグループである。ＰＡＣｓは主に、単量体フラバンサブユニット（＋）−カテキン及び（−）−エピカテキン、及びそれぞれが様々なヒドロキシル置換基を有する３つのフェニル環（図１）から成る構造であるそれらの誘導体で構成された、高分子ポリマーである。「タイプＢ」として分類されるＰＡＣｓは、単一結合フラバニルユニットによって特徴付けされ、一方「タイプＡ」ＰＡＣｓは、フラバニルサブユニット間の付加的なエーテル結合を含む。ＰＡＣｓの典型的な植物源は、果実、葉及び樹皮を含む。それらの抗酸化活性に加えて、ＰＡＣｓは、抗癌活性（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０，１７３７（１９９９）；Ｂｏｍｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１２７，４５（２０００））、抗炎症活性（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２８，２３３４（１９９８）；Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６，１（２００１））及び心保護特性（Ｒｅｅｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．，４２Ｓ，３０１（２００２））を含む多くの他の有用な健康効果を有することが示されている。近年では、緑茶（Ｄｕｆｒｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２，４０４（２００１））、ブドウ（ワイン、ジュース、及びブドウ種抽出物）（Ｂａｇｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．，５２３，８７（２０００））、及びクランベリージュース（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２０００））からのＰＡＣｓの健康効果に対して大きな注目が集まっている。特にアメリカンクランベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）からのＰＡＣｓは、尿路疾患性細菌の粘着に対して尿路を保護するそれらの能力がよく記載されており、クランベリージュースを飲むことは様々な尿路感染及び前立腺炎に対して推奨されている治療法である。クランベリーＰＡＣｓは、尿路の上皮細胞のものと同じα−Ｇａｌ（１→４）β−Ｇａｌ受容体配列を有する細胞表面へのＰ−線毛大腸菌の粘着を阻害することが示された（Ｆｏｏ）。このような効果の大部分は、尿路上皮細胞上の細胞表面受容体と相互作用するための能力を損なう、線毛タンパク質内のＡタイプＰＡＣ誘導性立体構造変化を介して仲介されるものである（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２００５））。さらに最近では、クランベリージュースは、Ｐ−線毛大腸菌及びシリコンニトリドプローブ表面の間の粘着力を有効的に減少することが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７（２００６））。
【０００４】
細菌及び細菌構成成分を濾過及び／若しくは濃縮するための現在の方法では、サイズ除去及び静電気的相互作用などのような非選択的手段を介して溶液からそのような物質を除去することを目的とすることが多い。サイズ除去ベース及び静電気的ベースフィルター装置の例としては、０．２２μｍの孔サイズを有するＣｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．のセルロース酢酸フィルター（サイズベース）であり、これは、サイズカットオフ値より大きな粒子及び正味陰性表面電荷を有する物質（例えば細菌及びウイルス）に非特異的に結合するＡｒｇｏｎｉｄｅ Ｃｏｒｐ．のＮＡＮＯＣＥＲＡＭ（登録商標）陽性ナノメーター酸化アルミニウムファイバー（表面電荷ベース）より大きな粒子を除去する。より特異的な濾過及び濃縮レジメは、細菌物質上及び内に含まれる物質に特異的に結合するための特異的な認識要素（抗体、ペプチド、アプタマーなど）を利用するものである。これらの技術のそれぞれは、それら自身に固有な制限がある。サイズ排除及び電荷ベースフィルターは、高価な製造施設を必要とし、しばしば一度特定の結合能力に達した場合は再利用不可能である。特異的な認識要素に基づいたフィルター及び濃縮器は、適切な結合特性での分子の単離、及びその後のそれらの大規模調合及び精製が必要となる。
【０００５】
宿主生物体（例えばヒト及び家畜）からの細菌及び細菌構成成分を中和及び／若しくは除去するための現在の治療法の大部分は、抗生物質の使用に基づいている。１９４０年代における導入から、抗生物質は多くの細菌関連疾患の治療に対する有効性が示されてきた。しかしながら、それらの頻繁な誤用は、さらに強力な薬剤の開発及び実行を必要とする抗生物質耐性細菌株を生じてきた。さらに、抗生物質が細菌複製を効果的に阻害する一方、それらは有害な細菌毒を中和する際にはしばしば無効である。例えば、グラム陰性細菌の外細胞膜の外葉の主な抗生物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、細菌感染の間の合併症の主な原因である。「内毒素（エンドトキシン）」として一般的に言及されるＬＰＳは、感染に対する身体の正常炎症反応を刺激することに関与している。しかしながら、無検査のままのＬＰＳ過剰刺激は、全身性炎症反応症候群（敗血症）として知られている、生命を脅かす炎症カスケードの活性化過剰を生じるであろう。
【０００６】
ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜の外葉の主要部分を構成する複雑な糖脂質である（Ｒｅａｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９−１７０（１９９０））。これは２つの主要なドメイン：１）Ｔｏｌｌ−様受容体４（ＴＬＲ−４）とのその相互作用を通じて免疫系を刺激することに関与しているリピドＡコア、及び２）伸長分岐ポリ多糖尾部から成る。強力な免疫反応は、サイトカインの産生及び放出、補体の活性化、及び病原体の殺傷及び排除を生じる様々な他の効果を含む、哺乳類細胞によるＬＰＳの認識の後に続く。ＬＰＳに対する非制御過剰免疫宿主反応は、敗血症ショック、多臓器不全、及び死などの生命を脅かす合併症を導くであろう。ポリミキシンＢ（ＰＢ）は、ＬＰＳ−結合及び外側膜−解体能力を示す最も効果的な化合物の１つとなることが示された環状陰イオン性抗菌デカペプチドである（Ｄａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ．，３３，１４２８（１９８９））。ＰＢは、リピドＡ部位への高親和性結合を介してＬＰＳの生物学的活性を阻害すると考えられている（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ．，２９，４９６（１９８６））。
【０００７】
細菌及び細菌構成成分の濾過及び治療上の中和に対する現在の技術に関連するコスト及び制限の観点から、これらの同じ課題を達成するための安価な代替物は好都合である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、プロアントシアニジン及びプロアントシアニジンを固定化する高分子、高分子の集合体、半固体或いは固体表面を有する組成物を有するものである。
【０００９】
本発明はさらに、プロアントシアニジン化合物を有する組成物を有するものであって、前記組成物において全てのプロアントシアニジンの平均重合度は少なくとも約６である。
【００１０】
本発明はさらに、免疫抑制された患者、若しくは敗血症或いは敗血症性ショックと診断された患者にプロアントシアニジンを有する組成物を投与する工程を有する方法を有するものである。
【００１１】
本発明はさらに、グラム陰性細菌感染と診断された患者へプロアントシアニジン化合物を有する組成物を投与する工程を有する方法であって、前記組成物における全てのプロアントシアニジンの平均重合度は少なくとも約６である、方法を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明のより完全な理解は、以下の実施形態及び付随する図面の詳細な説明を参照することによって容易に得られるであろう。
【図１】図１は、更なるプロアントシアニジンの構造を示したものである。ＰＡＣｓはカテキン及びエピカテキンなどのサブユニットから成る。ＢタイプＰＡＣｓは、炭素４と８との間若しくは炭素４と６との間に１つの分子間結合を含むものであり、一方ＡタイプＰＡＣｓは、炭素４と８との間、及び炭素２と炭素７の酸素との間に２つの分子間結合を含むものである（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ．，６３，１２２５（２０００））。
【図２】図２は、非特異的接着におけるクランベリージュースの影響を示したものである。背景強度は、平均蛍光シグナル強度に対する平均背景強度の比として示した。クランベリージュース（▲）及び透析濾過クランベリージュース（○）の細菌サンプルの固定（ｓｐｉｋｉｎｇ）は、バックグラウンドシグナルにおいて同様な改善を示した。
【図３】図３は、アガロース−ＰＢビーズプルダウンアッセイの図式的にを示したものである。アガロースビーズに固定化されたＰＢは、蛍光標識ＬＰＳと共にインキュベートした。遠心分離及び洗浄後、ビーズに関連した蛍光量は、ＰＢに結合したＬＰＳの量に比例した。
【図４Ａ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ａ）データは、クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣＳとのＬＰＳの共インキュベーション後の固定化ポリミキシンＢへ結合したＬＰＳのパーセンテージを示したものである。全３種類の供給源からのＰＡＣｓのＬＰＳ−結合活性は、濃度依存性であった。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図４Ｂ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ｂ）（Ａ）におけるデータをパーセント阻害で示したものである。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図４Ｃ】図４は、ＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用を示したものである。（Ｃ）クランベリーＰＡＣｓに対して、ほとんどのＬＰＳ−結合活性は、６，０００ＭＷＣＯ透析膜（２１の平均重合度）によって保持されたポリマーから成る分画内に含まれていた。ＡからＣにおけるデータは、平均±標準偏差であり、３つ組実験の代表データである。ＰＡＣ濃度は、タンニン酸等量で報告されている。
【図５Ａ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２を安定して発現するＨＥＫ ２９３細胞は、２５ｎＭ ＬＰＳ及び０．５μＭクランベリーＰＡＣと１．５時間インキュベートした。細胞は、固定化する（Ａ）或いは固定化し透過処理し（Ｂ）、蛍光と共役させたヤギ抗ＬＰＳ抗体とインキュベーションし、ＬＰＳを可視化させた。インキュベーションにおいて、ＬＰＳ結合は、リピドＡ或いは抗ＴＬＲ４、及び抗ＣＤ１４抗体との共インキュベーションによって機能的に阻止された。（Ａ）ＰＡＣｓは前記細胞表面へのＬＰＳの結合をわずかに阻害する。
【図５Ｂ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２を安定して発現するＨＥＫ ２９３細胞は、２５ｎＭ ＬＰＳ及び０．５μＭクランベリーＰＡＣと１．５時間インキュベートした。細胞は、固定化する（Ａ）或いは固定化し透過処理し（Ｂ）、蛍光と共役させたヤギ抗ＬＰＳ抗体とインキュベーションし、ＬＰＳを可視化させた。インキュベーションにおいて、ＬＰＳ結合は、リピドＡ或いは抗ＴＬＲ４、及び抗ＣＤ１４抗体との共インキュベーションによって機能的に阻止された。（Ｂ）ＰＡＣｓはＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に抑制する。矢印は、内部移行したＬＰＳの領域を示すものである。核はＤＡＰＩで染色した。
【図５Ｃ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＬＰＳ膜結合及びＬＰＳエンドサイトーシスの定量解析は、それぞれ（Ｃ）及び（Ｄ）に示した。記号はコントロールに相対的な有意差のレベルに対応したものである（スチューデントｔ検定によって決定した）：（＊）ｐ<０．１、（◆）ｐ<０．０５、（§）ｐ<０．０１、（∞）ｐ<０．００１。
【図５Ｄ】図５は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳの膜結合をわずかに減少させ、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害することを示したものである。ＬＰＳ膜結合及びＬＰＳエンドサイトーシスの定量解析は、それぞれ（Ｃ）及び（Ｄ）に示した。記号はコントロールに相対的な有意差のレベルに対応したものである（スチューデントｔ検定によって決定した）：（＊）ｐ<０．１、（◆）ｐ<０．０５、（§）ｐ<０．０１、（∞）ｐ<０．００１。
【図６Ａ】図６は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳのエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスは阻害しないことを示したものである。細胞結合アッセイは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンを培養液へ添加し、エンドソームコンパートメントを標識することを除いて図２に記載されたように実行した。前記細胞の固定化及び透過処理の後、ＬＰＳは蛍光を共役したヤギ抗ＬＰＳ抗体で検出した。データは、ＰＡＣの非存在下において（パネルＡ）、エンドサイトーシスされたＬＰＳは大部分トランスフェリンと共存している（合併された画像において矢印で示した）ことが示された。
【図６Ｂ】図６は、クランベリーＰＡＣｓがＬＰＳのエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスは阻害しないことを示したものである。細胞結合アッセイは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンを培養液へ添加し、エンドソームコンパートメントを標識することを除いて図２に記載されたように実行した。前記細胞の固定化及び透過処理の後、ＬＰＳは蛍光を共役したヤギ抗ＬＰＳ抗体で検出した。しかしながらＰＡＣの存在下において（パネルＢ）、ＬＰＳは大部分細胞膜に存在している（ＰＡＣによるＬＰＳエンドサイトーシスの阻害を示している）。しかしながら、エンドソームコンパートメントのトランスフェリン染色は、ＰＡＣの非存在下で見られたものと同じであった。従って、ＰＡＣはＬＰＳエンドサイトーシスを阻害するが、全体的なエンドサイトーシスを阻害するものではない。
【図７Ａ】図７は、クランベリーＰＡＣｓがＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を阻害するが、ＬＢＰとの相互作用は阻害しない事を示したものである。（Ａ）ＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２を固定化し大腸菌ＬＰＳの結合を完全に阻害し（黒三角形）、ＣＤ１４を固定化しＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合を部分的に阻害した（白四角形）。ＬＰＳ：ＬＢＰ相互作用の阻害は見られなかった（黒丸）。
【図７Ｂ】図７は、クランベリーＰＡＣｓがＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を阻害するが、ＬＢＰとの相互作用は阻害しない事を示したものである。（Ｂ）ＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ−ＦＩＴＣの直接結合及びＣＤ１４−仲介性結合の両者を阻害する。２５ｎＭ ＣＤ１４の存在下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２を固定化するためのＬＰＳの結合は、可溶性ＣＤ１４非存在の場合（黒三角形）に対して、約４倍（白三角形）増強された。挿入図は、コントロールのパーセントでプロットした両データセットを示したものである。両者の場合において、固定化ＴＬＲ４／ＭＤ２に対する阻害度は同程度である。データは、２つの代表実験の平均±標準偏差である。
【図８Ａ】図８は、ＬＰＳ−反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ａ）クランベリーＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【図８Ｂ】図８は、ＬＰＳ反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ｂ）ＰＡＣｓの阻害効果は過剰ＬＰＳによって打ち消されなかった。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、以下の濃度：０ｎＭ（黒丸）、０．５ｎＭ（黒三角形）或いは１０ｎＭ（白三角形）でのクランベリーＰＡＣの存在下において指示濃度のＬＰＳによって刺激された。
【図８Ｃ】図８は、ＬＰＳ反応性ＨＥＫ ２９３細胞におけるＰＡＣｓの細胞毒性によるＮＦ−κＢ活性化の阻害を示したものである。（Ｃ）ＰＡＣｓは、ＮＦ−κＢ活性を阻害するのと同じ濃度範囲に対してＬＰＳ−反応性細胞に対して毒性を有しておらず、ＰＡＣｓはＬＰＳと比べて１００分の１未満の毒性であった。
【図９】図９は、固定化プロアントシアニジンによるＦＩＴＣ−ＬＰＳの捕獲を示したものである。クランベリー（白四角形）及びお茶（黒丸）からのセファロース固定化ＰＡＣｓは、プルダウンアッセイにおける蛍光強度の増加によって示されたように、溶液中でＬＰＳと結合した。捕獲分子濃度は、お茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭで、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭであった。
【図１０】図１０は、溶液からのＬＰＳの固定化ＰＡＣ捕獲に対する可溶性ＰＡＣ存在の影響を示したものである。Ａ．溶液中のＰＡＣｓの存在は、ＰＡＣ濃度の増加に対する蛍光強度の減少によって示されたように、セファロースビーズへのＬＰＳの結合を阻害した。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は、７１μｇ／ｍＬであり、捕獲分子濃度はお茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭ（黒丸）で、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭ（白四角形）であった。
【図１１】図１１は、固定化ＰＡＣｓによるＬＰＳの捕獲に対する可溶性リピドＡ存在の影響を示したものである。ＦＩＴＣ−ＬＰＳの存在に対するプルダウンアッセイの完了前のＰＡＣビーズへのリピドＡの添加は、得られた蛍光強度の減少を生じた。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は７１μｇ／ｍＬで、捕獲分子濃度はお茶からのＰＡＣｓでは５．５μＭ（黒丸）で、クランベリーからのＰＡＣｓでは６．０μＭ（白四角形）であった。
【図１２】図１２は、ＬＰＳのプロアントシアニジン捕獲のポリミキシンＢの捕獲との比較を示したものである。固定化ＰＭＢ（黒三角形）、及びお茶からのＰＡＣｓ（黒丸）及びクランベリーからのＰＡＣｓ（白四角形）は、サイドバイサイドアッセイで比較した場合、ＦＩＴＣ−ＬＰＳに対して類似の結合親和性を示した。ＦＩＴＣ−ＬＰＳ濃度は１４５μｇ／ｍＬであった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
限定するためではなく説明を目的として、本発明全体にわたる理解を提供するために、以下の記載において、具体的に詳細について説明する。しかしながら、本分野の当業者であれば、本発明がこのような具体的な詳細なものとは異なる他の実施形態においても実行されることが理解される。他の例において周知の方法及び装置の詳細な記載は、不必要な詳細説明によって本発明の記載を不明瞭にしない程度に省略される。
【００１４】
ブドウの種（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）及びホワイトパイン（Ｐｉｎｕｓ ｍａｒｉｔｉｍａ）は、プロアントシアニジンの供給源であるが、その化合物は２、３例挙げると、お茶、コーヒー、チョコレート、リンゴ、ベリー及びオオムギなどの食品にも見出されている。ＰＡＣｓは、様々な数のモノマーサブユニットから成る不均一混合物に見出されている。カテキン及びエピカテキンは、最も一般的なサブユニットである。サブユニット間の結合は通常、炭素原子間の１つの分子間結合を介しているが、いくつかの種においてサブユニットは２つの分子間結合：１つの炭素−炭素結合及び炭素−酸素結合によって結合されている（図２）（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｙｎ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．，６２，５００（２００４）；Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１７３（２０００））。これらはそれぞれ、Ｂタイプ及びＡタイププロアントシアニジンと称する。Ａタイプ及びＢタイププロアントシアニジンでは、異なる生物活性、さらには異なるサブユニット組成物及び異なる重合度を有することが示されていた（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，９，４１０（１９９５）；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１（２００５））。
【００１５】
クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓは、様々な細菌種からＬＰＳへ効率的に結合する。クランベリーに対しては、最も潜在的なＬＰＳ結合活性は、２１の平均重合度を有するポリマーの混合物から構成されるＰＡＣ分画内に含まれることが示された。この分画はＬＰＳ受容体（ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−様受容体４）／ＭＤ２及びＣＤ１４）の完全補体を発現しているＨＥＫ ２９３細胞の表面へのＬＰＳの結合を穏やかに阻害する一方、ＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に抑制する。このＰＡＣ分画はさらに、過剰ＬＰＳによって打ち消されない方法によりＬＰＳ誘導性核内因子−κＢ活性化も阻害する。この効果は、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用の阻害、及びＣＤ１４とのＬＰＳ相互作用の部分的抑制を通じて仲介される。重要なことは、効果的なＬＰＳ中和を仲介するＰＡＣ濃度は、最小限のインビトロ細胞毒性を誘発する。この結果は、強力なＬＰＳ結合及びＰＡＣｓの中和特性を示すものであり、内毒素除去及び敗血症のインビボ治療における潜在的な有用性を有する新しいクラスのＬＰＳアンタゴニストとしてＰＡＣｓを同定するものである。
【００１６】
血中のＬＰＳは、単核マクロファージ上の膜アンカー型受容体であるＣＤ１４へＬＰＳを転移する、ＬＰＳ結合タンパク質と結合する（Ｔｏｂｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１０８６７−１０８７１（１９８９））。次にＣＤ１４は、二分（二つの領域に分かれている）受容体複合体であるＴｏｌｌ様受容体４／ＭＤ２（ＴＬＲ４／ＭＤ２）とのＬＰＳの相互作用を仲介し、その結果細胞間シグナリング及び核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）−活性化炎症性サイトカインの産生を生じる（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，１７７７−１７８２（１９９９））。これらのサイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）及びインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）を含む。従って、敗血症に対する治療戦略は、サイトカインの中和（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７３，９３４−９４１（１９９５））或いはそれらの受容体（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．２７１，１８３６−１８４３（１９９４））に向けられていた。付加的なアプローチは、陽イオン性化合物（Ａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１２，２６１−２７７（２００６））或いはリピドＡ様物質（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１８７３−１８８０（２００１）；Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））でのＬＰＳの中和に焦点が当てられていた。不幸にも、これらの戦略手段に対する臨床的結果は、残念なもののままであった。
【００１７】
プロアントシアニジン（ＰＡＣｓ）は、フラボノイドサブユニットから成る植物由来のポリフェノール化合物であり、それらは最近いくつかの潜在的な優れた健康効果と関連しているとされた。詳細な研究によって、この活性は、１つの炭素−炭素及び１つの炭素−酸素結合（Ａタイプ結合として言及されている）（Ｆｏｏ）から成る少なくとも１つの独自のフラバン間サブユニット結合を含む４から５の重合度を有するＰＡＣｓによるものであると考えられた。より最近では、ＰＡＣｓは上皮細胞表面受容体に対するそれらの接着力を減少させる、細菌Ｐ−線毛タンパク質における構造変化を誘導することが示された（Ｌｉｕ）。最近の研究では、タンパク質機能化免疫センサー表面への細菌の非特異的接着を阻害する、クランベリージュースからの高分子量ポリマー（２１の平均重合度）間のさらなる相互作用が指摘された（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８，８５３−８５７（２００６））。この証拠に基づいて、以前記載されていなかった細菌細胞表面とのクランベリージュース構成成分の相互作用に対する潜在性を研究した。
【００１８】
クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓのＬＰＳ結合特性は、本明細書で報告する。クランベリーからのＰＡＣｓにより注目すると、第一にリピドＡ部位との相互作用を通じた、複数の細菌種からのＬＰＳに結合するそれらの能力が示された。ＬＰＳ受容体の完全補体を発現している細胞とのＬＰＳの相互作用を阻害するＰＡＣｓの能力が決定された。ＰＡＣｓは、大部分、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化の阻害も仲介する活性である、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用の抑制を介して、哺乳類細胞とのＬＰＳ相互作用を阻害する。
【００１９】
タンパク質への細菌細胞接着の阻止に対する細菌細胞とのＰＡＣｓの相互作用は、免疫アッセイ技術において使用されるガラス表面上で示された。さらにここでは、記載されていなかった細菌細胞表面構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ：細菌内毒素としても知られている）とのクランベリーＰＡＣｓの相互作用も示された。大腸菌のＰ−タイプ線毛とのクランベリーＰＡＣｓの相互作用は、哺乳類尿路及び消化管の細胞へのＰ−線毛を発現している細菌細胞の接着を阻害することが以前記載されていた。リポ多糖とのＰＡＣｓの相互作用は、以前記載されていなかった。この活性に基づいて、ＰＡＣｓは、細菌内毒素、細菌細胞及び細菌細胞構成成分の濾過、濃縮及び中和において潜在的に使用できる。加えて、ＰＡＣｓは、細菌及び細菌細胞構成成分の中和及び／若しくは除去が保証されなくてはならない治療上の適用において使用できる。
【００２０】
ＰＡＣｓは、それらを現在の濾過、濃縮及び中和適用に対する適切な置換物或いは代替物とする多くの優れた新しい特徴を提供する。ＰＡＣｓは高等植物によって産生される天然産物である。従って、理論的には「無制限な」供給が自然によって産出される。それらは、製造された濾過及び濃縮装置と同様に産生するための高価な製造或いは機械施設を必要としない。それらの利益を利用するために必要とされる全てとしては、天然物質の抽出及び精製だけである。
【００２１】
治療上の適用に対して、ＰＡＣｓは、抗生物質及び現在の毒素−中和化合物の広範囲の使用に対する魅力的な代替物となるであろう。例えば、抗生物質は、尿路感染に対する最も一般的な治療法であり、抗生物質はこれらの感染症を治療するために合計年間１６億ドル以上費やされている。抗生物質−耐性細菌種の増加に対する増大する懸念を考慮して、抗生物質への依存を軽減する代替治療測定法が探索されている。ポリミキシンＢ及びその誘導体などの化合物での細菌毒素のインビボの中和は、細菌感染中の免疫過刺激の発生を軽減するために現在推奨されている治療コースである。しかしながら、そのような化合物の固有の毒性は、それらの使用を制限し、効果は保持している毒性の少ない誘導体の開発を必要とするものであった。本明細書に記載されたポリミキシンＢの親和性に匹敵する相対親和性を有するＰＡＣ物質は、毒素中和に対する適切な代替物を提供する。
【００２２】
細胞表面のＰ線毛とのＰＡＣｓの相互作用について、細胞接着の減少に対して開示されている。様々な細胞表面構成成分との他の潜在的なＰＡＣｓの相互作用は、細菌細胞の中和に対する潜在的なメカニズムを提供する。細胞表面タンパク質抗原及びグルコース転移酵素などのタンパク質は、コロニー形成に関与している。他のタンパク質は、様々なシグナル伝達経路及びクオラムセンシングに関与している。細胞表面上の糖も情報交換及びアンカーに関与しており、受容体として働く。それらはしばしば、ウイルスなどの病原体が細胞に位置し相互作用するための経路となる。他のジュースからのＰＡＣｓでは観察されなかった、大腸菌及びクランベリーからのＰＡＣｓの間の相互作用は、様々なＰＡＣ種の機能における特異性を示唆するものであり、未だ完全には調査されていなかった細胞表面構成成分との様々な相互作用に対する潜在能力を示唆するものである。
【００２３】
ＰＡＣｓは、濾過、検出、除去或いは細菌及び／若しくはＬＰＳと相互作用する他の事象において有用な組成物、装置或いは構成成分に使用される。そのような組成物において、ＰＡＣは、高分子、高分子の集合体、半固体或いは固体表面へ固定化される。固定化されたＰＡＣは、ＬＰＳ、リピドＡ、或いはＬＰＳ或いはリピドＡを産生する細菌を含むと考えられているサンプルへ曝される。高分子の場合において、前記ＰＡＣは、共有結合、若しくは結合或いは力のあらゆる他の形態によって、前記高分子に固定化されている。前記高分子或いは高分子の集合体は、例えば、前記ＰＡＣを生物体における目的地へ輸送することを助ける、若しくはセンサーの一部となるであろう。適切な高分子には、限定されるものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、脂質、或いは糖を有する高分子が含まれる。適切な高分子の集合体には、限定されるものではないが、多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、ナノ粒子、ナノ結晶、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有するものが含まれる。固体及び半固体表面は、例えばセンサー及びフィルターにおいて有用である。半流動体は、ハイドロゲルなどの物質を含む。適切な固体或いは半固体表面には、限定されるものではないが、複数のビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管が含まれる。
【００２４】
前記ＰＡＣの重合度は、特定の適用に依存して選択される。組成物における全てのＰＡＣの適切な平均重合度は、限定されるものではないが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０を含む。前記ＰＡＣは、カテキン及びエピカテキンユニットのみを含む、若しくは他のフラボノイドユニットを含むものである。
【００２５】
前記ＰＡＣｓは、濾過装置に使用される。そのような装置は、入口及び出口を持つハウジングを有し、これによって前記ハウジング及び前記固定化ＰＡＣを通じた液体の流れが可能となるものである。前記固定化ＰＡＣは、液体が前記ハウジングを通って流れる場合、前記ハウジング内に維持される。これは、血液などの液体から細菌及び／若しくはＬＰＳを除去する際に有用である。感染した患者の血液は、前記フィルターを通り、その患者へ注入して戻される。前記フィルターはさらに、除染及び精製にも有用である。
【００２６】
前記ＰＡＣｓは、センサー装置に使用される。そのような装置は、流体装置、固定化ＰＡＣ、及び前記ＰＡＣに対するＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌の結合を検出するメカニズムを有する。前記メカニズムは、これに限定されるものではないが、光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、屈折率における変化、音響メカニズム、表面音波装置、水晶振動子マイクロバランス装置、電気化学メカニズム、若しくは電流測定法、電位差測定法或いは伝導度測定法を含む、結合事象を検出するためのセンサーにおいて使用されるあらゆるメカニズムである。
【００２７】
濾過或いはセンシング装置は、限定されるものではないが、臨床サンプル、血液、血漿、血清、リンパ液、髄液、薬学的調合物（除染が必要である）、若しくは幼児或いは免疫抑制された個人向けの食品或いは飲料を含む、様々なサンプルで使用される。
【００２８】
ＰＡＣｓの固定化に対するいくつかの例示的戦略は、本明細書に記載されている。
【００２９】
（１）ＰＡＣヒドロキシルの直接的反応性
ＰＡＣｓ内のヒドロキシルは、脱離基と置換する炭素を求核試薬が攻撃する活性化アシル基を含む化合物である、アシル化剤に対してアミノ基と同様に反応する。アシル化剤には、これに限定されるものではないが、酸無水物、イソシアン酸、イソチオシアン酸、イミドエステル、酸ハロゲン化物、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル、及び他の活性化エステルを含む。従って、一端におけるこれらアシル化基の１つ（ＰＡＣヒドロキシルに向けられた）及び別の機能基（標的化表面或いは高分子上の反応基に向けられた）を有するクロスリンク剤は、ＰＡＣｓの固定化に適している。多数のそのようなクロスリンク剤は、商業的に利用可能である（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍを参照のこと）。直接的反応性の３つの例を以下に記載する。
【００３０】
（１Ａ）スルフヒドリルを有する高分子上のポリアントシアニジンの固定化。精製ＰＡＣｓは、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸（ＰＭＰＩ、Ｐｉｅｒｃｅ）の使用を通じて、タンパク質或いは他のスルフヒドリルを有する高分子及び表面へ固定化される。ｐＨ８．５で１０ｍＭ ホウ酸緩衝液におけるモル比１：１０でのＰＭＰＩとのＰＡＣｓのインキュベーション（４５分室温）によって、ＰＡＣｓのヒドロキシル基とのＰＭＰＩのイソシアン酸基の反応を生じ、カルバミン酸結合を生じる。スルフヒドリルを有する化合物及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、最終濃度５０ｍＭ）の添加によって、前記タンパク質或いは他の高分子のスルフヒドリル基とのＰＭＰＩのマレイミド基の反応を生じる。前記高分子の濃度は、各分子に結合するＰＡＣｓの数に影響を及ぼすように変えることができる。
【００３１】
（１Ｂ）アミンを有する高分子上へのプロアントシアニジンの固定化。精製ＰＡＣｓは、４−（クロロスルホニル）フェニルイソシアン酸（ＣＳＰＩ）の使用を通じて、タンパク質或いは他のアミンを有する高分子及び表面上へ固定化され得る。ｐＨ８．５でのホウ酸緩衝液における等モル濃度でのＣＳＰＩとのＰＡＣｓのインキュベーション（４５℃室温）は、ＰＡＣｓのヒドロキシル基とのＣＳＰＩのイソシアン酸基の反応を生じ、カルバミン酸結合を産生した。次に、アミンを有する高分子を添加することによって、表面アミン基とのＣＳＰＩの塩化硫酸基の反応が、Ｈｉｎｓｂｅｒｇテストによって使用されたメカニズムを介してスルホンアミンを産生するように進行することが可能となった。
【００３２】
（１Ｃ）アミン或いはカルボキシルを有する高分子上でのプロアントシアニジンの固定化。アミン或いはカルボキシルを有する高分子は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）の存在下での３−［（２−アミノエチル）ジチオ］プロピオン酸・ＨＣｌ（ＡＥＤＰ）の使用を通じて修飾され得る。トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）或いは２−メルカプトエチルアミンなどの還元剤の使用は、スルフヒドリル基を産生するＡＥＤＰのＳ−Ｓ結合を切断する。次に、ＰＭＰＩクロスリンク剤は、上記（１Ａ）で記載したように、このスルフヒドリル基にプロアントシアニジンを結合するために使用され得る。
【００３３】
（２）代替機能基へのヒドロキシルの変換
（２Ａ）アルデヒドへのヒドロキシルの変換。ＰＡＣｓの隣接ヒドロキシル基は、過ヨウ素酸、ナトリウム或いはカリウム過ヨウ素酸での酸化の影響を受けやすい。過ヨウ素酸酸化は、近接ヒドロキシルを有するＣ−Ｃ結合を切断し、それらをジアルデヒドへ変換する（Ｂｏｂｂｉｔ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．，１１，１（１９５６））。過ヨウ素酸処理の後、形成されたジアルデヒドを様々な試薬、特にアミン基と反応させ、シッフ塩基のイミンを形成することができる。
【００３４】
（２Ｂ）スルフヒドリルへのヒドロキシルの変換。ＰＡＣヒドロキシルは、スルフヒドリル基へと変換され得る。ヒドロキシル基は、ジオキサン或いはピリジンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８から９）における塩化トシル（塩化トルエンスルホニル）で活性化され得る。その後のエステル転移反応は、ｐＨ５．５での０．５Ｍチオ酢酸溶液において達成される。遊離チオールを産生するための前記チオエステルの加水分解は、０．５Ｎメタン酸で実行された。
【００３５】
本明細書で記載された特性によって、ＰＡＣは、グラム陰性細菌感染或いは敗血症と診断された患者、若しくは免疫抑制された患者を治療するのに有用であることが示される。ＰＡＣを有する組成物を用いたあらゆる薬学的に許容可能な治療が使用される。その治療は、抗生物質、化学療法、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療との併用療法を行う場合に、より有効である。前記ＰＡＣはさらに、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤とも共役される。
【００３６】
１つの例示的適用は、それらを除去するための、ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。様々な高分子、高分子の集合体、或いは表面へのＰＡＣｓの固定化は、それらの存在が望まれていない溶液からのリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌細胞の１）除去、２）濃縮、及び３）精製のためにＰＡＣｓを認識要素として使用されることを可能にする。この結合は、２つの形態：直接的或いは間接的、をとることができる。直接的結合実施形態は、ＰＡＣｓが固体及び／若しくは半固体表面（ビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管を有する）へ固定化される場合に適用される。ここにおいて、ビーズ固定化ＰＡＣｓは、標的リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌細胞を捕獲し、結果生じた複合体は、上清が容易に除去され、その結果、固体支持体−結合ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞を生じるように遠心分離或いは磁気的に濃縮される。或いは、この方法で固定化されたＰＡＣｓは、カラム型式に使用され、ここにおいてＰＡＣ−機能化支持体の充填カラムは、ＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌細胞を含む溶液に曝される。間接的実施形態は、高分子及び高分子の集合体へのＰＡＣｓの固定化に関与する。これらは、溶液中のＬＰＳ、リピドＡ或いは細菌細胞を結合するために使用される。結合後、ＰＡＣｓが結合した前記高分子或いは高分子の集合体へ向けられた固体−支持体−固定化認識要素の添加によって、前記複合体の捕獲及び溶液からのそれらの除去が可能となる。この状況において、使用される前記高分子は、以下：アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、脂質、或いは糖のいずれかで構成され得る。前記高分子の集合体は、以下：多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、或いはナノ粒子のいずれかで構成され得る。前記ナノ粒子は、ナノクラスター、ナノ粒子、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有することができる。
【００３７】
別の例示的適用は、それらを検出するための、ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。ＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞へ結合するＰＡＣｓの能力はさらに、一度結合されたＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の検出を達成するためにも使用され得る。本来、固定化ＰＡＣｓに基づいたセンサーは、（上述されたような）固定化ＰＡＣｓ、流体装置、及び結合されたＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の検出を達成するためのメカニズムを有する。検出は、以下の方法：光学（ＵＶ或いは赤外線吸収、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、屈折率における変化）、音響（表面音波、水晶振動子マイクロバランス）、電気化学（電流測定、電位差測定、伝導度測定）を有することができる。
【００３８】
別の例示的適用は、治療上の適用に対するＬＰＳ、リピドＡ、或いは細菌細胞の結合である。ＰＡＣｓの想定される治療上の適用は、インビボ及びエックスビボの両方である。前記インビボ適用は、細菌感染のリスクがある或いは疑われている患者へのＰＡＣｓの投与（食事を通じて受動的に、或いはボーラス丸剤形態或いは注射を通じて能動的に）を有する。他の従来の抗菌、抗ウイルス、及び抗真菌法との組み合わせでのＰＡＣｓの使用も想定される。そのような併用療法は、従来の抗菌、抗真菌或いは抗ウイルス薬物療法とのＰＡＣｓの同時投与を有する。これらのタイプの薬物療法に対するＰＡＣｓの直接的固定化（上述した方法を介した）。
【００３９】
前記エックスビボ適用は、たくさんの型式におけるＰＡＣｓの使用を有する。これらには、細菌感染が疑われる皮膚領域へのＰＡＣｓの局所的適用を含む。これらはさらに、血漿分離交換適用におけるＰＡＣｓの使用も含み、ここにおいて患者の血漿は、除去され、ＬＰＳ、リピドＡ及び細菌細胞を除去するためにＰＡＣｓとインキュベーションされ、次にその血漿は前記患者へ戻される。
【００４０】
細菌感染間のＬＰＳの存在は、有効な治療にまだ制限がある、重症な炎症状態である敗血症の第一の原因である。ＬＰＳの中和に対するより最近の戦略の間では、天然及び合成陽イオン化合物及びリピドＡ−様物質が使用される。天然ＬＰＳ−結合タンパク質の結合ドメインに基づいたペプチド及び抗菌性ペプチドを含む陽イオン化合物は、ナノモル範囲でのＬＰＳへの親和性を示した（Ａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．，１２，２６１−２７７（２００６））。ＬＰＳのリピドＡ部位へ結合する環状ナノペプチドポリミキシンＢは、その強力なＬＰＳ中和活性に対してかなりの注目を集めていた（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１６５，１４７−１５２（１９９２））。しかしながら、その臨床有用性は、そのかなりの毒性によって妨害されていた。保存リピドＡ部位を真似したリピドＡ−様物質は、その受容体とのＬＰＳの相互作用を妨害することによって機能する。例えば、Ｅ５５６４は、ＴＬＲ４／ＭＤ２受容体とのＬＰＳ相互作用を抑制するように設計された第二世代合成リポ二糖である（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１８７３−１８８０（２００１）；Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））。それらの強力なＬＰＳ中和活性にも関わらず、陽イオン化合物及びリピドＡ−様物質は、それらの毒性或いは高ＬＰＳ濃度によって打ち消されるそれらの能力によってしばしば制限されていた（Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１９４９０−１９４９８（１９９１））。これらの欠点を克服するＬＰＳ結合化合物が必要とされている。
【００４１】
天然由来植物ＰＡＣｓの以前報告されていない生物学的活性：細菌ＬＰＳの効果的な結合及び中和は、本明細書に記載されている。その結果から、クランベリー、お茶及びブドウからのＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳと結合することが示された。さらに、クランベリーＰＡＣｓの場合において、より大きなポリマー（２１の平均重合度を有する）は、最も強力なＬＰＳ結合活性を示す。
【００４２】
以前の研究では、細菌細胞表面の構成成分とのＰＡＣ相互作用の重要な役割が明らかになった。Ｆｏｏらは、クランベリーからのＬＨ２０−精製ＰＡＣｓは、α−Ｇａｌ（１→４）β−Ｇａｌ受容体配列を含む表面へのＰ−線毛大腸菌の接着を阻害したことを示した（Ｆｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，１７３−１８１（２０００））。この活性は、４から５の重合度を有し、少なくとも１つのＡタイプ結合を有するＰＡＣｓと関連していた。Ｈｏｗｅｌｌらは後に、この効果は実はＡタイプ結合に特異的なものであり、様々な供給源からのＢ−タイプ結合ＰＡＣｓはこの効果を仲介しないことを報告した（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６，２２８１−２２９１（２００５））。より最近では、Ｌｉｕ及びその同僚らは、細菌接着のＰＡＣ−仲介性減少に対するメカニズムを提案した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）研究によって、ＰＡＣｓはＰ線毛タンパク質の短縮を誘導し、その結果細菌及びＡＦＭプローブチップの間の接着力の減少を生じることが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７−３０５（２００６））。
【００４３】
Ｐ線毛タンパク質との天然のＰＡＣｓの相互作用と比較して、本発明の発見は、ＬＰＳの天然のＰＡＣｓの認識に関していくつかの違いを指摘する。第一に、ＬＰＳ結合は、Ａタイプフラバン間結合に特異的ではない。クランベリーからのＰＡＣｓは、Ａ及びＢタイプフラバン間サブユニット結合を含む一方、お茶及びブドウＰＡＣｓはもっぱらＢタイプフラバン間結合を含む。それでも、３つの供給源全てからのＰＡＣｓは有効的にＬＰＳに結合する。第二に、クランベリーＰＡＣｓから得られたデータによって、より大きなポリマー（２１の重合度を持つ分画）は、最も高いＬＰＳ結合活性を持つことが示された。最終的に、ＰＡＣｓの抗−細菌接着特性に対する他の研究では尿路疾患系大腸菌に対するＰＡＣｓの効果にほとんど注目していたが、本発明のデータでは明らかに、クランベリーＰＡＣｓは複数のグラム陰性細菌種からのＬＰＳへ結合することが示された。さらに、結合研究によって、クランベリーＰＡＣｓは変異ＬＰＳを有する短リポ多糖鎖、さらには天然ＬＰＳに匹敵する親和性を有するジホスホリルリピドＡを認識することが示された。従って、リピドＡ部位は、ＬＰＳのＰＡＣｓによる認識において有力な役割を果たしている。
【００４４】
クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性は、ＬＰＳ反応性細胞とのＬＰＳの相互作用に著しい影響を与えることができる。ＬＰＳとの細胞内相互作用の現在のモデルにおいて、血清中に存在するＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）は、二分受容体複合体ＴＬＲ４／ＭＤ２へＬＰＳを次々に転移させる膜−常在受容体ＣＤ１４に結合しＬＰＳを提示する（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１７７７−１７８２（１９９９））。ＭＤ２は、受容体のＬＰＳ−結合ユニットである一方、ＴＬＲ４はシグナル伝達構成成分として働く（Ｓｈｉｍａｚｕ；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，６６７−６７２（２００２）；Ｓｃｈｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４，７９−８８（２００１）。ＴＬＲ４／ＭＤ２−ＬＰＳ複合体は最終的に、ＬＰＳ誘導性受容体ダウンレギュレーションの一部としてのカベオラ依存的取り込みメカニズムに関連するエンドサイトーシスを受ける（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））。ＴＬＲ４は物理的にＬＰＳと接触するかという議論が現在存在する一方、ＴＬＲ４／ＭＤ２及びＬＰＳは細胞表面上に安定的複合体を形成し、ＭＤ２に結合したＬＰＳは、ＴＬＲ４シグナル伝達活性化（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５，６４６５−６４７２（２００５））及びＬＰＳエンドサイトーシス（Ｈｕｓｅｂｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ．Ｊ．，２５，６８３−６９２（２００６）；Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））に対して必須であるということは明らかである。
【００４５】
ＬＰＳ受容体の完全補体を発現しているＨＥＫ ２９３細胞において、クランベリーＰＡＣｓは前記細胞表面へのＬＰＳの結合を中程度に減少した一方、それらはＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害した。膜結合実験において、クランベリーＰＡＣｓは、ＭＤ２受容体アゴニスト及びＬＰＳアンタゴニストとして知られているジホスホリルリピドＡと比較して、細胞膜とのＬＰＳ相互作用の抑制においてわずかに強力であった（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，５４８４−５４９１（２００６））。ＰＡＣｓは、ＬＰＳ結合の抑制においてＣＤ１４機能撹乱抗体よりは効果的ではなかった。これは、ＬＰＳに対する膜相互作用の第一ポイント（ｉｎｉｔｉａｌ ｐｏｉｎｔ）として達成されたＣＤ１４の役割と一致する。リピドＡの阻害効果とほとんど同じであった、ＬＰＳのエンドサイトーシスに対するクランベリーＰＡＣｓの阻害効果は、内部移行アッセイにおいて記載しした。これらの結果及びＭＤ２との効果的なＬＰＳ相互作用へのＬＰＳエンドサイトーシスの既知依存性に基づいて（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１４０２−１４０９（２００５））、クランベリーＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２受容体複合体とのＬＰＳ相互作用を抑制する場合に重要な役割を担っていたということは合理的なことである。実は、受容体結合実験によって、ＰＡＣｓは、ＣＤ１４とのＬＰＳ相互作用の最大４０％阻害を達成した一方、それらは同じ濃度範囲で、ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ結合を完全に阻害したということが示された。さらに、ＰＡＣｓは、ＰＡＣｓに対して６倍モル過剰で存在するような場合などの、高ＬＰＳ濃度では打ち消されないやり方でＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【００４６】
他の報告では、ＰＡＣｓによる炎症性サイトカインのＬＰＳ誘導性産生の阻害が記載されていた。Ｂｏｄｅｔらは、クランベリージュース濃縮物からのＰＡＣ濃縮分画は、歯肉線維芽細胞におけるＩＬ−６、ＩＬ−８、プロスタグランジンＥ２（Ｂｏｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｓｃｉ．，１１５，６４−７０（２００７））、及びマクロファージにおけるＴＮＦα及びランテス（ＲＡＮＴＥＳ：Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（Ｂｏｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，８５，２３５−２３９（２００６））のＬＰＳ−誘導性産生を阻害したことを示した。この分画は細胞内シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を阻害することが示された一方、シグナル伝達阻害の正確なメカニズムは解明されていなかった。しかしながら、本発明の発見は、ＰＡＣｓが直接的に結合し、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのその相互作用を阻止することによってＬＰＳを中和する、ＬＰＳ阻害のメカニズムに向けられている。さらに、他のＬＰＳ結合物質と比較して、ＬＰＳとのこの相互作用は、ＬＰＳの過剰濃度によって容易に打ち消されることはない。これは、敗血症に対する治療試薬としての他のＬＰＳ結合物質の開発における欠点となっていた。従ってその結果より、ＰＡＣポリマー構造の多価特性は、ＬＰＳのポリ多糖鎖との他の安定化相互作用を可能にすることが示唆された。
【００４７】
ＰＡＣｓは、ポリミキシンＢ或いはリピドＡ−様物質などの他の以前記載されたＬＰＳスカベンジャー或いはＬＰＳ受容体アンタゴニストとは構造的に非常に異なる。さらに、それらＬＰＳ結合特性は、それらは敗血症のインビボ治療に対する新しい治療法の開発が期待できることを示唆している。最低でも、それらの強力なＬＰＳ結合活性、低コスト、及び天然供給源からの幅広い利用可能性によって、それらは、内毒素の除去及び精製を必要とするバイオテクノロジー適用において有用となるであろう。
【００４８】
本発明を記載するに当たり、以下の実施例は本発明の特定の適用を説明するために記載されるものである。これらの特定の実施例は、この明細書に記載された本発明の観点を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００４９】
プロアントシアニジンの精製。透析クランベリージュース濃縮物（ＤＣＣ）は、水（６，０００ＭＷＣＯ希釈チューブ）で透析し、０．２μｍフィルターを濾過させることによって、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｓｕｎ ｐｕｒｅ無糖クランベリージュース（１００％強度、Ｃｅｌｅｓｔｉａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）から製造した。ＰＡＣｓ（非特異的ポリフェノールは除去されている）は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０カラム（Ｈａｇｅｒｍａｎ，"Ｔｈｅ ｔａｎｎｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｅｒｓ．ｍｕｏｈｉｏ．ｅｄｕ／ｈａｇｅｒｍａｅ／ｔａｎｎｉｎ．ｐｄｆ（２００２））を用いた疎水性吸着クロマトグラフィーによって精製された、完全クランベリージュース、ウェルチ１００％赤ブドウジュース、或いはリプトン紅茶から得た。完全ジュースは、最小容積まで回転蒸発によって減少させ、７０％アセトンで元の容積になるように再懸濁し、３０分間超音波処理し、Ｗｈａｔｍａｎ＃３フィルター紙で濾過した。不溶性物質の再懸濁、超音波処理、及び濾過は２回以上行い、全ての液体を組み合わせた。この溶液は、回転蒸発によって減少させ、全てのアセトンを除去し、元の容積の２倍になるように７５％エタノールに再溶解させた。お茶は、２０分間（３回繰り返した）２００ｍＬの７０％アセトン中に、１つのファミリーサイズのティーバッグの超音波処理によって抽出した。各調合において、前記溶液を組み合わせ、回転蒸発によって減少させ、２００ｍＬの７５％エタノールに再溶解した。この溶液は、総容積と同等のバッチにおけるＳｅｐｈａｅｘ ＬＨ２０カラムへ適用した。少量のフェノール類は、総容積の５倍と同等のエタノールで溶出することで除去した。ＰＡＣｓは、アセトンで溶出し、最小容積まで回転蒸発によって減少させた。完全クランベリージュースから回収されたＰＡＣは次に、さらなる特徴付けのために、２５％エタノールを含む水に対して分画透析によって分画させた。分画は、２，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；Ｄｉａｌ<２ｋ）を通った分画；２，０００ＭＷＣＯ（Ｄｉａｌ２−３ｋ）では保持されたが３，５００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ＣＥ）を通った分画；３，５００ＭＷＣＯチューブ（Ｄｉａｌ３−６ｋ）では保持されたが６，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ６−８０００）を通った分画；及び６，０００ＭＷＣＯチューブ（Ｄｉａｌ６ｋ）で保持された分画、として回収した。全ての物質は貯蔵用に、窒素気流下で粉末になるまで乾燥させた。精製物質は、結合実験に使用するために３３％エタノール／Ｈ２Ｏに溶解した。各精製化合物の重合度は、酸ブタノールアッセイと組み合わせた修飾バニリンアッセイによって決定した。ＰＡＣ濃度は、標準としてタンニン酸を用いた放射状拡散アッセイによって決定した（Ｈａｇｅｒｍａｎ，"Ｔｈｅ ｔａｎｎｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｅｒｓ．ｍｕｏｈｉｏ．ｅｄｕ／ｈａｇｅｒｍａｅ／ｔａｎｎｉｎ．ｐｄｆ（２００２）；Ｈａｇｅｒｍａｎ，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｃｏｌ．１９８７，１３，４３７）。チオ開裂及びＨＰＬＣによる精製した物質の解析によって、ＬＨ２０分離後に低分子種は残っていなかったことが示された（Ｈａｍｍｅｒｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．（２０００）１３０：２０８６Ｓ−２０９２Ｓ；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（２００２）５０：４８５２−４８６０；Ｐｒｉｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３６：７８１−７８４；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（１９９８）４６：１３９０−１３９６）。これらの解析に基づいて、ＰＡＣｓは糖、酸及び低分子量混入物がないと考えられた。
【００５０】
【表１】
【実施例２】
【００５１】
大腸菌の非特異的接着−新規研究ラボアレイバイオセンサー（Ｔｈｅ Ｎａｖａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）は、目的物の解析を検出するためにタンパク質コーティングガラス導波管を用いるものである（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，４３３（１９９９）；Ｔａｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｅｃｏｌ．，４７，１７５（２００４）；Ｇｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ，６５，１０７８（２００５））。前記導波管の表面は、前記表面の他の領域をコーティングするために、非特異的不動態化分子での捕獲分子のパターンアレイを有している（Ｓａｐｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４，１０６１（２００２）；Ｎｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７，１４８（２００５）；Ｓｈｒｉｖｅｒ−Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７，２４３１（１９９５））。標的の蛍光ベース検出は、捕獲分子領域の識別に依存している。前記表面の予想外な領域への標的の非特異的接着は、検出の制限、さらには前記アレイバイオセンサーに対する仮性ポジティブ／ネガティブ比に対して負に影響を及ぼす。
【００５２】
非病原性大腸菌種（ＡＴＣＣ３５２１８）及び低親和性抗体（大腸菌に対するウサギポリクローナル抗体；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州）の組み合わせは、バックグラウンド強度からシグナルを識別することを困難にする非特異的結合度を作ることが見出された（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８，８５３（２００６））。細菌細胞は、表面タンパク質及び／若しくはリポ多糖（ＬＰＳ）に関連した相互作用を通じて接着する。非特異的結合の減少に対する従来のアプローチ（例えば、導波管表面をブロッキングする、若しくはタンパク質或いは糖でサンプルを追加添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）する）は成功しなかった。尿路における細菌細胞接着に対するクランベリージュースの影響に基づいて、前記ジュースは前記アレイバイオセンサーにおける接着の潜在的メディエーターとして検討した。図２は、様々な濃度のクランベリージュースでアッセイしたサンプルのシグナル強度に対するバックグラウンド強度の割合に対するデータを示している。Ｏｃｅａｎ Ｓｐｒａｙ１００％クランベリー及び２７％クランベリージュースを含むＣｏｎｃｏｒｄブドウジュースブレンドを使用した。ジュースの非存在下で、バックグラウンド強度は総シグナルの６７％であった。５０％ジュースブレンド（１３．５％クランベリージュースと同程度）の添加は、総シグナルの１％未満まで前記バックグラウンド強度を減少した（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ）。ブドウジュースでのサンプルの追加添加は、前記バックグラウンドシグナルに対してこのような影響を及ぼすことが見出されなかった（ウェルチのＰｕｒｐｌｅ１００％ブドウジュース）。アップルジュース、オレンジジュース及び白クランベリージュース（Ｏｃｅａｎ Ｓｐｒａｙ１００％ジュースブレンド）でのサンプルの追加添加も、バックグラウンドシグナルの減少は生じなかった。白クランベリージュースは、赤い色及び酸っぱい味が形成される前に収穫されたクランベリーから製造された。使用された前記白クランベリージュースブレンドは、１３．５％クランベリージュースを含む。濃度におけるこの違いは、赤クランベリージュースで使用されたものと同様な濃度が検討されるような、サンプルを追加添加した場合の要因となっていた。
【００５３】
いくつかのメカニズムが、クランベリージュースによる細菌細胞接着の阻害に対して記載されていた（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，５４，８６（２００４）；Ｂｒｕｍｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，１８６（１９６２）；Ｋｌｅｐｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．，６，１（２００３））。前記ジュースの酸性度、希少Ｄ−マンノース化合物を含む糖含有量、及び希少ポリフェノール化合物の存在は、寄与因子として提案された。サンプルに追加添加された前記ジュースのｐＨを調節することによって、原因となる因子としての酸性度が排除された。前記ジュースの糖含有量は、同濃度でフルコース、グルコース及びマンノースを大腸菌サンプルへ追加添加することによって、因子から排除された。導波管表面不動態化も、前進接触角に対するサンプル追加添加の影響に関する研究を介して、潜在的なメカニズムとして排除された。標準細菌細胞調合が追加添加された場合、前記接触角は汚れていないガラススライドに強く影響を及ぼすが、前記アレイバイオセンサーで使用されたタンパク質コーティングスライドに対しては目立つ影響を与えなかった。
【００５４】
尿路におけるヒト上皮細胞との大腸菌の相互作用は、細菌細胞表面上のｐ−線毛タンパク質の阻害を通じて、クランベリージュースからのＡタイププロアントシアニジンによって阻害された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，２９７（２００６）；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆａｓｅｂ Ｊ．，１５，Ａ２８４（２００１））。ガラス導波管への接着に対するＰＡＣｓの潜在的影響を検討するために、糖及び他の小分子は、水に対する透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ６−８０００）を通じてクランベリージュース（Ｌａｎｇｅｒ’ｓクランベリー濃縮物）から排除した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，５４，８６（２００４））。コロイド粒子は、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＰＦ；Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ミシガン州）を用いて、前記透析物質の濾過を通じて除去した。前記透析物質は窒素下で、２７％クランベリージュース当量になるまで再濃縮し、アレイバイオセンサーアッセイのサンプルに追加添加するために使用した。この透析され濾過されたクランベリージュースは、サンプルにクランベリージュースブレンドを追加添加した場合に観察された結果と同じ結果を示した。
【実施例３】
【００５５】
ＬＰＳ結合アッセイ−ＰＢとのＬＰＳの相互作用を阻害する両ＰＡＣｓの能力は、アガロースビーズベースプルダウンアッセイを用いて評価した（図３、４）。ポリミキシンＢ（１０μＭ、アガロースビーズへ共役（シグマ））は、最終容積２５０μＬの０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）におけるＤＣＣ、非透析ＬＨ２０ ＰＡＣ、或いはサイズ分画ＬＨ２０ ＰＡＣの非存在下或いは存在下で、１００ｎＭ ＬＰＳ−ＦＩＴＣ（大腸菌セロタイプＢ５：０５５、シグマ）とインキュベーションした。反応物は暗所にて１時間２５℃でかき混ぜた。非結合ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、３ラウンドの遠心分離及び２５０μＬの０．０５Ｍトリス緩衝液での洗浄によって除去し、その後２００μＬのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。各サンプルの一連の希釈は、ヌクレアーゼを含まない水で調合し、蛍光は、Ｓａｐｈｉｒｅ蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ノースカロライナ州）を用いて、４９５±２．５ｎｍでの励起、及び５３５±２．５ｎｍでの発光によって測定した。比較実験は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからのＬＰＳ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（Ｒｃ変異）及び大腸菌ＥＨ１００（Ｒａ変異）の変異種からのＬＰＳで実行した。後者２つの種は、野生ＬＰＳに対して様々な長さのポリ多糖鎖を含む。結合実験は、ジホスホリルリピドＡでも行った。リピドＡ及びＬＰＳの共役は、製造者の取扱説明書に従ってフルオレセインイソチオシアン酸（シグマ）で行い、物質は非結合色素から分離するためにＰＢＳに対する透析へ供した。全ての場合において、共役度は、標識種のモル当たり約２から３フルオレセインになるように、分光法によって決定した。
【００５６】
固体相結合アッセイを用いて、ＬＰＳに結合するＡ及びＢタイプＰＡＣｓ両者の能力は、固定化ポリミキシンＢとの大腸菌ＬＰＳの相互作用を阻害するそれらの能力を決定することによって評価した。お茶及びブドウ（もっぱらＢタイプ結合を有する）からのＰＡＣｓに対してクランベリー（Ａ及びＢタイプ結合両者を有する）からのＰＡＣｓを比較する結合実験によって、両結合を有するＰＡＣｓは、用量依存的にＬＰＳに効果的に結合したことが示された（図４（Ａ））。これらのデータをパーセント阻害でプロットした場合、高分子量のポリマーを含むように透析を介して濃縮されたクランベリーＰＡＣｓは、０．７μＭのＩＣ５０を有する最も強力なＬＰＳ結合活性を示した（図４（Ｂ））。お茶（非透析）からのＰＡＣｓは、１．１μＭのＩＣ５０を有する次に最も有効であった。ブドウ及びクランベリーからの非透析ＰＡＣｓは、ＬＰＳに対して同程度の相対親和性を示した（ＩＣ５０＝３．０μＭ）。透析クランベリー濃縮物（ＰＡＣｓは濃縮されていない）は、ＬＰＳに対して最も低い相対親和性を示した（ＩＣ５０＝１０．５μＭ）。分画透析によって産生されたクランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性を比較した場合、ＬＰＳに対する相対親和性及びＰＡＣ分子量の間に正の相関性が観察された。実は、より大きな分子量ポリマーは、より低い分子量ＰＡＣｓと相対して、より高いＬＰＳ結合活性を示した（図４（Ｃ））。従って、全てのその後の実験は、２１の平均重合度を有するクランベリーからのＰＡＣ分画（今後「クランベリーＰＡＣｓ」と言及する）を用いて実行した。
【００５７】
クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＰｄｅｕｄｏｍｏｎａｓからのＬＰＳに同程度の親和性を有して結合するそれらの能力が証明されたので、大腸菌ＬＰＳに限定しなかった。さらに、クランベリーＰＡＣｓは、野生型ＬＰＳに対して３分の１以下の親和性のみを有して、様々な長さの短ポリ多糖鎖を有する２つのＬＰＳ変異体（大腸菌からのＲａ変異体及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａからのＲｃ変異体）に結合した。これらの結果は、表２にまとめた。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ポリミキシンＢはＬＰＳのリピドＡ部位へ結合することが知られているので（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１６５，１４７−１５２（１９９２）））、リピドＡ部位との相互作用は、ＬＰＳのクランベリーＰＡＣｓ認識において主要な役割を担っていることは道理にかなっていた。実は、クランベリーＰＡＣｓは、無傷大腸菌ＬＰＳに対するその親和性よりも２倍以上もの相対親和性である、見かけ上０．３μＭのＩＣ５０を有して、ポリミキシンＢへの大腸菌リピドＡの結合を効果的に阻害した（表２）。この結果は、ＬＰＳに対するクランベリーＰＡＣｓ結合におけるリピドＡ部位の重要性を確認するものである。
【実施例４】
【００６０】
ＬＰＳ膜結合及びエンドサイトーシスの解析。ヒトＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２（ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を安定的に発現しているヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）は、チャンバーウェルで増殖させ、０．５μＭ ＬＨ２０ ＰＡＣ（Ｄｉａｌ>６Ｋ）の非存在下或いは存在下で、１．５時間３７℃にて２５ｎＭ ＬＰＳ（大腸菌セロタイプＯ５５：Ｂ５５、シグマ）とインキュベーションした。コントロール実験において、ＴＬＲ４或いはＣＤ１４は、抗ＴＬＲ４或いは抗ＣＤ１４モノクローナル抗体（結合部位において５００ｎＭ、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．）或いはリピドＡ（シグマ）との共インキュベーションによって機能的にブロクされた。インキュベーション後、前記細胞はＰＢＳで２回洗浄し（１０分）、ＬＰＳ膜結合を評価するために（３．７％パラホルムアルデヒドで）固定した、若しくはＬＰＳ内部移行を決定するために（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で）固定し透過処理した。１％正常ヤギ血清でブロッキングした後、膜結合或いは内部移行ＬＰＳは、フルオロセインと共役したヤギ抗−ＬＰＳ抗体（Ｏ／Ｋセロタイプ特異的、Ａｂｃａｍ）を用いて検出した。核はＤＡＰＩで対比染色した。画像化は、オリンパスＩＸ−７１顕微鏡を用いて実行した。膜関連或いは細胞内蛍光の相対量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ，Ｖ．１．３７）を用いて画像解析することによって定量化した。データは、膜関連或いは内部移行ＬＰＳからの平均チャネル蛍光として報告し、各サンプルから１０から２０細胞の解析（各細胞当たり最低１０測定）を示した。合併画像はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２（バージョン９）を用いて作った。
【００６１】
ＰＡＣｓはＬＰＳの膜結合をわずかに阻害し、ＬＰＳエンドサイトーシスを有意に阻害する。ＬＰＳのわずかな結合に対して、ＬＰＳ−結合化合物の望ましい特性は、ＬＰＳ−反応性哺乳類細胞とのＬＰＳ相互作用を阻害する能力である。それらの強力なＬＰＳ−結合活性に基づいて、クランベリーＰＡＣｓは、ＬＰＳ受容体の完全補体を発現した細胞とのＬＰＳ相互作用を潜在的に阻害することができるというのは道理にかなっている。細胞結合研究は、ＣＤ１４及びＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体４／ＭＤ２を発現したＨＥＫ ２９３細胞（ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２）において実行し、最小非特異的結合（図５（Ａ）、フレーム「ＬＰＳなし」）を有する膜結合ＬＰＳ（図５（Ａ）、フレーム「ＬＰＳ」）に対応する区別できる染色パターンを明らかにした。リピドＡとのＬＰＳの共インキュベーションは、ＬＰＳ膜結合を有意に減少させない一方、クランベリーＰＡＣの存在は、膜結合ＬＰＳの量において中程度だが有意な減少（１５％以下）を生じた（図５（Ｃ））。抗−ＴＬＲ４機能−撹乱抗体も、ＬＰＳ結合において中程度の減少を引き起こした（２３％以下）一方、クランベリーＰＡＣとの組み合わせにおけるこの同じ抗体は、さらなるＬＰＳ撹乱には影響を及ぼさなかった。抗−ＣＤ１４機能−撹乱抗体は、最大度のＬＰＳ結合阻害を仲介する（８４％阻害以下）ことが見出され、これはＬＰＳ膜結合におけるＣＤ１４の非常に重要な役割を示すものである。ＬＰＳ内部移行の解析によって、リピドＡ及びクランベリーＰＡＣは、それぞれ８４％及び７６％の阻害度で（図５（Ｄ））、ＬＰＳのエンドサイトーシスを有意に阻害した（図５（Ｂ））。抗−ＴＬＲ４抗体は、ＬＰＳエンドサイトーシスの５０％以下の阻害を仲介した一方、クランベリーＰＡＣとの前記抗体の共インキュベーションは、この阻害をさらに６２％以下まで増加した。抗−ＣＤ１４抗体はＬＰＳエンドサイトーシスの約８０％阻害を仲介した。コントロール実験において、ＰＡＣｓ及びＬＰＳを含む培養液への、エンドサイトーシス経路のマーカーであるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−標識トランスフェリンの添加によって、エンドソームコンパートメントの強い染色がＰＡＣｓの存在及び非存在下両方で観察されたが、ＰＡＣｓは正常エンドサイトーシスに対して阻害効果を持たなかったことが示された。従って、ＰＡＣｓは、全体的なエンドサイトーシスに対して阻害効果を有さない一方、ＬＰＳのエンドサイトーシスを特に阻害した（図６）。
【００６２】
ＬＳＰとの細胞相互作用の現在のモデルにおいて、血清に存在するＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ）は、ＬＰＳと結合し、ＬＰＳを二分受容体複合体であるＴＬＲ４／ＭＤ２へ順に転移させる、膜−常在受容体ＣＤ１４へＬＰＳを提示する（Ｓｈｉｍａｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９，１７７７−１７８２）。ＭＤ２は、受容体のＬＰＳ−結合ユニットである一方、ＴＬＲ４はシグナル伝達構成成分として働く（Ｓｈｉｍａｚｕ；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，３，６６７−６７２；Ｓｃｈｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，１９４，７９−８８）。ＴＬＲ４／ＭＤ２−ＬＰＳ複合体は、ＬＰＳ−誘導性受容体ダウンレギュレーションの一部として、カベオラ−依存性取り込みメカニズムに関連したエンドサイトーシスを最終的に受ける（Ｓｈｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏ．，２００５，３３８，１４０２−１４０９）。ＴＬＲ４が物理的にＬＰＳを接触するか否かなどの議論が現在あるが、ＴＬＲ４／ＭＤ２及びＬＰＳは、細胞表面上で安定複合体を形成し、ＭＤ２に結合するＬＰＳはＴＬＲ４シグナル伝達活性（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７５，６４６５−６４７２）及びＬＰＳエンドサイトーシス（Ｓｈｕｔｏ；Ｈｕｓｅｂｙｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００６，２５，６８３−６９２）に必須であるということは明らかである。従って、クランベリーＰＡＣｓは、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体とのＬＰＳ相互作用を阻害することによってＬＰＳエンドサイトーシスを阻害するという仮説が立てられた。
【００６３】
ＬＢＰ、ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤへの２ＬＰＳ結合のＰＡＣ阻害。ヒトＣＤ１４（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、４℃で一晩、ＰＢＳにおいてＥＬＩＳＡプレートへ吸収させた。ヒスチジン−タグ化−ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）或いはヒトＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ、Ｂｉｏｍｅｔｅｃ）は、抗−ポリヒスチジンモノクローナル抗体（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の受動的吸収によって調合したＥＬＩＳＡプレートへ、４℃で一晩捕獲させた。ウェルは３０分間３７℃にて、ＰＢＳにおける１％正常ヤギ血清でブロッキングした。５ｎＭ大腸菌ＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合は、３０分間３７℃にて、ＬＨ２０ ＰＡＣの存在下或いは非存在下でのＰＢＳにおける１％ウシ胎児血清において実行した。存在する場合、可溶化ＣＤ１４は、最終濃度２５ｎＭであった。結合ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、ヤギ抗フルオレセイン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ共役体（Ａｂｃａｍ）及びテトラ−メチルベンジジン基質（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）を用いて検出した。血清の非存在下で、ＣＤ１４或いはＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ−ＦＩＴＣの結合は、検出限度以下であった。
【００６４】
ＰＡＣｓは、ＣＤ１４及びＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を抑制するが、ＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ）との相互作用は抑制しない。結合研究は、その同族受容体とのＬＰＳ相互作用に対するクランベリーＰＡＣｓの効果を提案するために実行した。図７（Ａ）は、固定化ＬＢＰ、ＣＤ１４或いはＴＬＲ４／ＭＤ２への大腸菌ＬＰＳの結合を阻害するクランベリーＰＡＣｓの能力を測定するために行った結合実験の結果を示したものである。クランベリーＰＡＣｓはＬＢＰとのＬＰＳ相互作用に対して優位な効果を示さなかったが、テストした最高ＰＡＣ濃度（５００ｎＭ）でＣＤ１４へのＬＰＳ結合の３８％の最高阻害を達成したことが明らかとなった。同じ濃度範囲において、クランベリーＰＡＣｓは、ＩＣ５０が２０ｎＭ ＰＡＣ以下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２とのＬＰＳ相互作用を完全に阻害した。さらに、可溶化ＣＤ１４の存在下で、ＴＬＲ４／ＭＤ２によって結合したＬＰＳの量は約４倍に増加し、これはＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳの転移を仲介する場合におけるＣＤ１４の立証された役割と一致するものであることが見出された（Ａｄｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０６，７８２−７８７；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１，１３５−１４５）。しかしながら、クランベリーＰＡＣがＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳ結合を阻害する程度は変わらないままであり、これは固定化ＴＬＲ４／ＭＤ２へのＬＰＳのＣＤ１４仲介性転移を阻害するＰＡＣｓの能力を示すものである（図７（Ｂ）、挿入図）。
【００６５】
ＮＦ−κＢ活性化の定量化。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、５ｘＮＦ−κＢ−誘導性プロモーターの制御下で分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコード化した、ＮＦ−κＢ−誘導性受容体プラスミドであるｐＮｉＦｔｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で一過性に形質移入した。細胞は、９６ウェルプレートのウェルへ播種し（４ｘ１０４細胞／ウェル）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の取扱説明書に従って形質移入した。４８時間後、前記細胞は、クランベリーＰＡＣｓの存在下或いは非存在下、２ｎＭ ＬＰＳで１６時間刺激した。ＳＥＡＰ活性は、比色定量性ＳＥＡＰアッセイキット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って、組織培養上清で測定した。
【００６６】
ＰＡＣｓは、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。クランベリーＰＡＣｓのＬＰＳ結合活性、及び細胞表面受容体とのＬＰＳ相互作用のそれらの抑制に基づいて、ＰＡＣｓは、転写因子ＮＦ−κＢのＬＰＳ−誘導性活性化も阻害することができるというのは道理にかなっていた。ＬＰＳによるＮＦ−κＢ活性化は、炎症誘発性サイトカインの発現を導き、敗血症を含む病的状態を最終的に導く代謝性及び生理学的変化を生じる（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１２，１４１−１７９）。図８（Ａ）に示したように、クランベリーＰＡＣｓは、２５ｎＭ ＰＡＣのＩＣ５０を有して、２ｎＭ ＬＰＳで刺激されたＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞において用量依存的にＮＦ−κＢの活性化を、阻害した。さらに、図８（Ｂ）におけるデータから、この阻害はＬＰＳの過剰量によって容易に超えられなかったことが示された。クランベリーＰＡＣの非存在下で、ＬＰＳにおける増加は、ＮＦ−κＢ反応において対応する増加を生じた。ＬＰＳの濃度が２ｎＭ以上に増加した場合、主としてＬＰＳ−誘導性細胞毒性が原因で、その反応におけるわずかな減少が見られた（以下を参照）。０．５ｎＭクランベリーＰＡＣ存在下で、ＮＦ−κＢ反応における一致した減少は、全てのＬＰＳ濃度において観察された。ＬＰＳが３ｎＭ（ＰＡＣの６倍モル過剰）で存在した場合でさえ、ＮＦ−κＢ活性化は、コントロールレベルまで戻らなかった。クランベリーＰＡＣが１０ｎＭで存在した場合、ＮＦ−κＢ反応における一致した減少（全てのＬＰＳ濃度において約５０％）は、コントロールと相対して観察された。
【実施例５】
【００６７】
細胞毒性アッセイ−細胞毒性は、比色定量細胞増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＨＥＫ−ＣＤ１４−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞は、９６ウェルプレートのウェルへ播種し（１ｘ１０４細胞／ウェル）、製造者の取扱説明書に従って、アッセイ前４８時間テスト化合物の用量範囲で培養した。ＰＡＣｓの細胞毒性の検査は、７００ｎＭの毒性に対するＩＣ５０で明らかになり、１００ｎＭ以下の濃度では毒性効果は観察されなかった（図８（Ｃ））。ＬＰＳ（６ｎＭ以下の毒性に対するＩＣ５０）と比較した場合、ＰＡＣｓは１００分の１未満の毒性であった。野生ＬＰＳとの比較において、リピドＡのジホスホリル形態は、３μＭ以下の濃度で毒性を誘発しなかった。
【実施例６】
【００６８】
ＰＡＣｓの固定化及びＬＰＳ結合アッセイ−固体支持体に固定化された細菌及び細菌細胞構成成分に効果的に結合するためのＰＡＣ物質の能力を決定するために、クランベリー及びブドウジュースからのＰＡＣｓは、タンパク質固定化に使用された一般的な技術（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，３８４６（１９９９））の改訂版を用いて、ガラス顕微鏡スライド（導波管）の表面へ共有結合的に接着させた。カテキンモノマー及び緩衝液のみの領域もコントロールとして含めた。簡潔には、前記導波管、ガラス顕微鏡スライド（Ｄａｉｇｇｅｒ，Ｗｈｅｅｌｉｎｇ、イリノイ州）は、水酸化カリウム／メタノール溶液（Ｃｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１４，６８３（１９９９））への液浸によって洗浄し、次にすすぎ乾燥させた。洗浄された導波管は次に、４５分間トルエン中の２％（３−メルカプトプロピル）トリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）とインキュベーションし、その後すすぎ乾燥させた。前記スライドは、エタノール中の１．８ｍＭ Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸（ＰＭＰＩ）に１時間液浸させた。ＰＭＰＩのマレイミド基は、イソシアン酸基を遊離させＰＡＣｓのヒドロキシ基と反応させるシラン反応によって提供されたスルフヒドリル基と反応する。ＰＭＰＩ固定化の後、導波管は脱イオン化水ですすぎ、乾燥させ、以前記載されたＰＤＭＳパターン化鋳型に乗せた（Ｒｏｗｅ）。クランベリー或いはブドウジュースからの１０ｍｇ／ｍＬ ＰＡＣｓの溶液、１０％メタノールを有する１０ｍＭ ＰＢＳにおけるカテキン、及び１０％メタノールを有するＰＢＳ（ネガティブコントロール）は、４℃で一晩、ＰＤＭＳ鋳型のレーンにおいてインキュベーションさせた。パターン化溶液はＰＢＳを用いてＰＤＭＳレーンから流し、前記スライドは脱イオン化水ですすぎ、乾燥させ、使用するまで４℃で保存した。
【００６９】
ＬＰＳへ結合する固定化ＰＡＣｓの能力は、定常アッセイを用いて検討した。チャネルを有するＰＤＭＳフローセルは、各サンプルレーンが各パターン列に曝されるように、パターン化鋳型のフローセルに垂直に取り付けた。サンプルレーンは、ＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の様々な濃度のＬＰＳ−ＦＩＴＣ（大腸菌０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）を注入した。前記ＬＰＳ−ＦＩＴＣは、１時間レーンにおいてインキュベーションさせ、ＰＢＳ及び脱イオン化水ですすいだ。スライドは、４９６ｎｍでの励起、及び５１５ｎｍ以上で回収された発光を、エバネッセント光蛍光分光測定を用いて画像化した。ＬＰＳ−ＦＩＴＣの濃度範囲での曝露に対して、クランベリー及びブドウジュースからのＰＡＣｓは、ＬＰＳ−ＦＩＴＣへ特異的に結合する一方、カテキン及び緩衝液コントロールは、テストした最も高濃度でさえ結合しなかったことが明らかとなった。従って、ＰＡＣｓは、固体支持体へ固定化されたＬＰＳへ結合する能力を保持していた。
【実施例７】
【００７０】
ＰＡＣ及びカテキン固定化−精製ＰＡＣｓ及びカテキン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、（Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸）（ＰＭＰＩ；Ｐｉｅｒｃｅ）クロスリンク剤を介して、活性化チオール−セファロース（登録商標）４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）へ固定化した。セファロース（登録商標）は、脱イオン化水で１時間膨張させた（１５ｍＬＨ２Ｏにおいて１ｇ乾燥物質）。前記物質は次に、５回の懸濁／遠心分離／デカントサイクルで、新鮮なｄＩ−Ｈ２Ｏを用いて洗浄した（１グラム乾燥開始物質当たり総５０ｍＬ）。懸濁はボルテックスを用いて行い、遠心分離工程は５分間３，０００ｇで行った。セファロース（登録商標）物質（１グラム開始物質当たり総容量５ｍＬ）は次に、エタノールで３回洗浄した（１グラム開始物質当たり総容量３０ｍＬ）。前記ＰＭＰＩクロスリンク剤は、エタノール中の３％ジメチルスルホキシドでの（１グラム開始物質当たり１０ｍＬ）、チオール基濃度を超えるＰＭＰＩの１０倍モル過剰を用いた定常撹拌下で、洗浄したセファロース（登録商標）物質と１時間室温でインキュベーションした。インキュベーション後に、遠心分離、デカント及び５０％エタノールでのすすぎを３サイクル続けた。セファロース（登録商標）は次に、５０％エタノールにおける分析物の１０倍モル過剰（１グラム開始物質当たり１０ｍＬ）を用いて、ＰＡＣ或いはカテキンと共にエタノール中において４℃で一晩インキュベーションした。最終工程として、前記セファロース（登録商標）は５０％エタノール（１グラム開始物質当たり４０ｍＬ総量）を用いて４サイクルすすぎ、Ｈ２Ｏ中の０．０２％アジドナトリウムに再懸濁させた（１グラム開始物質当たり１６ｍＬ最終容量）。前記物質は、使用するまで４℃暗所で保存した。ビーズセットに対するＰＡＣ濃度は、プルシアンブルーアッセイによって決定した。
【実施例８】
【００７１】
リポ多糖（ＬＰＳ）に対する蛍光ベールプルダウンアッセイは、セファロース−固定化ＰＡＣｓ及びアガロース−固定化ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を用いて、ｐＨ８．０での５０ｍＭ トリスにおいて行った。固定化捕獲分子及びＬＰＳは、室温で１時間、定常撹拌でインキュベーションし、すすぎ、９６ウェルプレートへ移した。ＦＩＴＣ−標識ＬＰＳ（大腸菌０５５：Ｂ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の蛍光は、４９５ｎｍ励起及び５２０ｎｍ発光（５ｎｍバンド幅）にて、Ｔｅｃａｎ ＸＳａｆｉｒｅモノクロメータ−ベースミクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００７２】
プルダウンアッセイで使用するＰＡＣビーズは、クランベリー、クランベリージュース、お茶及びブドウジュースからのプロアントシアニジンをセファロースビーズへ固定化することによって産生した。付加的なビーズセットは、分子量６，０００以上を有する、クランベリーからのＰＡＣｓの分画をセファロースビーズへ固定化することによって産生した。これらのビーズを用いて行われたアッセイによって、全ての５ビーズセットは、溶液（５０ｍＭトリスｐＨ８）からのＦＩＴＣ−標識ＬＰＳを結合するために使用され得ると示された。お茶及びクランベリーからの固定化ＰＡＣｓを有するビーズに対する濃度依存曲線は、図９に示した。カテキンでコーティングしたビーズは、セファロース及びクロスリンク剤へのＦＩＴＣ−ＬＰＳの低度の非特異的結合を検証するために使用した。セファロースビーズへのＬＰＳの結合が固定化ＰＡＣとの特異的相互作用を介していることをさらに検証するために、アッセイ中に可溶化ＰＡＣを前記サンプル溶液に添加する競合アッセイを用いた。可溶化ＰＡＣの濃度が増加するにつれて蛍光強度の減少が見られ、これは予想されたようにプルダウンアッセイに起因するものである（図１０）。
【００７３】
図１０において、お茶からの可溶化ＰＡＣｓは、お茶からの固定化ＰＡＣｓで行われたアッセイへ添加された一方、クランベリーからの可溶化ＰＡＣｓはクランベリーからの固定化ＰＡＣｓで行われたアッセイへ添加された。ＰＡＣ−お茶ビーズによるＬＰＳ結合の５０％阻害は、６．５μＭで生じた一方、クランベリーからのＰＡＣｓによる結合の５０％阻害は、９．８μＭで生じた。２つのアッセイタイプにおける捕獲分子濃度は、ＰＡＣ−お茶ビーズに対しては５．５μＭであり、ＰＡＣ−クランベリービーズに対しては６．０μＭであった。捕獲分子濃度及び５０％阻害が生じるレベルの間の矛盾は、いくつかの考察が考えられた。捕獲分子濃度は、同じ供給源からの可溶化ＰＡＣｓに行ったプルシアンブルーアッセイと比較して、プルシアンブルーアッセイを用いて推測された。この研究によって、固定化ポリフェノールの全ての構成成分は、溶液中と類似したやり方で利用できると推測された。解析によってさらに、セファロース上で達成された重合度が溶液中で観察されたものと類似しているので、全ての重合度は同等に固定化されたとも推測された。比較的低い可溶化ＰＡＣ濃度ではＦＩＴＣ−ＬＰＳの蛍光をクエンチしないことが見出されたが、固定化ＰＡＣｓは、局所的に高濃度を示していた。この影響は、図９に見ることができる。標的濃度の増加に伴った蛍光強度における増加は、簡単なモデルでは記載できなかった。加えて、目的の波長範囲におけるＰＡＣ吸光度が１０，０００オーダーでのモル吸光計数を有して低いにも関わらず、ＰＡＣｓの局所的な高濃度は、ＦＩＣＴ−ＬＰＳで利用可能な励起強度を減少する。これら因子の全ては、固定化ＰＡＣｓによるＬＰＳ結合の５０％阻害を得るために必要な可溶化ＰＡＣｓの予想濃度における、プルシアンブルーアッセイと同様に実際の差異に、若しくはクエンチングと同様に観察された差異に寄与するであろう。
【００７４】
ＰＭＢ−ＬＰＳ相互作用の阻害（実施例３）によって、ＰＭＢ結合を阻害するやり方でのＬＰＳとのＰＡＣｓの相互作用が示唆されたが、これは、ＬＰＳのリピドＡ部位とのＰＡＣｓの相互作用を保証するものではなかった。この潜在的な相互作用をさらに検討するために、ＰＡＣ−ビーズを用いたＦＩＴＣ−ＬＰＳの存在に対するアッセイを、リピドＡの様々な濃度でのＰＡＣビーズの平衡後に実行した（図１１）。アッセイは、３μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−ＬＰＳ（約３ｎＭ）で行った。リピドＡの存在は、お茶及びクランベリーからのＰＡＣｓに対してそれぞれ１００ｎＭ及び５００ｎＭのＩＣ５０値を有して、固定化ＰＡＣｓによるＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合を阻害することが見出された。しかしながら、１００μＭという高い濃度のリピドＡの添加は、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合の８０％以上の阻害を生じることに失敗した。これは、より高い濃度でミセル或いは沈殿を形成するというリピドＡの利用不可能性の結果なのか、或いはＬＰＳ及び固定化ＰＡＣｓの間の結合相互作用がＬＰＳのリピドＡ部位に限定されなかったという事実の結果なのか不明である。
【００７５】
ＬＰＳ捕獲に対するセファロース−固定化プロアントシアニジンの有用性を評価するために、商業的に利用可能なアガロース−固定化ポリミキシンＢに対してサイドバイサイド比較を行った。図１２は、ＰＭＢ、及びお茶及びクランベリーからのＰＡＣｓに対する捕獲分子の濃縮物の分画として捕獲されたパーセントＬＰＳを示したものである。固定化ＰＡＣに結合した場合、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ蛍光強度のクエンチングは、前記捕獲物質の直接比較が難しいことが示された。この問題は、前記捕獲物質とのインキュベーション後、溶液中に残存するＦＩＴＣ−ＬＰＳの蛍光強度を測定することによって取り組んだ。パーセント捕獲値は、同じように操作した捕獲分子を含まないサンプルに対して、捕獲物質とのインキュベーション後に残存する蛍光を比較することに基づいていた。両タイプのＰＡＣビーズは、ＰＭＢビーズよりもわずかにより良く実施された。これは、プロアントシアニジンによるＬＰＳのポリミキシンＢ結合の阻害（実施例３）に基づくものであることが推測された。
【００７６】
本発明における様々な変更及び変形例は明らかに上記教示の観点において可能である。従って、請求されている発明は、具体的に記載されていない限りにおいては実施可能であることが理解される。単数形、例えば冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」或いは「ｓａｉｄ」などにおける請求の構成要素に対するあらゆる参照は、その要素を単数形に制限するものとして解釈されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
プロアントシアニジンと、
前記プロアントシアニジンを固定化する、高分子、高分子集合体、半固体、或いは固体表面と、
を有する、組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、前記高分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、脂質或いは糖を有するものである。
【請求項３】
請求項１記載の組成物において、前記高分子集合体は、多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、或いはナノ粒子を有するものである。
【請求項４】
請求項３記載の組成物において、前記ナノ粒子は、ナノクラスター、ナノ結晶、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有するものである。
【請求項５】
請求項１記載の組成物において、前記半固体或いは固体表面は、複数のビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管を有するものである。
【請求項６】
フィルターであって、
入口及び出口を有するハウジングであって、前記ハウジング通過して液体が流れるものである、ハウジングと、
請求項１記載の組成物と
を有するフィルターであって、
前記ハウジングを通過して液体が流れる場合、前記組成物は前記ハウジング内に維持されるものである、フィルター。
【請求項７】
センサーであって、
請求項１記載の組成物と、
流体装置と、
前記ポリアントシアニジンに対するリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌の結合を検出するメカニズムと
を有する、センサー。
【請求項８】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、或いは屈折率の変化を介して達成されるものである。
【請求項９】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、音響メカニズム、表面音波装置、或いは水晶振動子マイクロバランス装置を介して達成されるものである。
【請求項１０】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、電気化学メカニズム、若しくは電流測定法、電位差測定法、或いは伝導度測定法を介して達成されるものである。
【請求項１１】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全アントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項１２】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全てのアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項１３】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全てのアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項１４】
請求項１記載の組成物において、ポリアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項１５】
方法であって、
請求項１記載の組成物を提供する工程と、
リポ多糖、リピドＡ、若しくはリポ多糖或いはリピドＡを産生する細菌を含むとされるサンプルに前記組成物を曝露する工程と
を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記組成物は、前記ハウジングを通過する流体に対する入口と出口を有するハウジング内に配置されるものである。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法において、前記組成物は、前記ポリアントシアニジンに対するリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌の結合を検出することが可能である流体装置内に配置されるものである。
【請求項１８】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、或いは屈折率の変化を介して、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌への前記プロアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項１９】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
音響メカニズム、表面音波装置、或いは水晶振動子マイクロバランス装置を通じて、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌に対する前記ポリアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項２０】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
電気化学メカニズム、若しくは電流測定、電位差測定或いは伝導度測定検出器を通じて、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌に対する前記ポリアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項２１】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項２２】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項２３】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項２４】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、臨床サンプルである。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記臨床サンプルは、血液、血漿、血清、リンパ液、或いは髄液を含むものである。
【請求項２６】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、薬学的調合物である。
【請求項２７】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、幼児或いは免疫抑制された個人向けの食品或いは飲料である。
【請求項２８】
組成物であって、
プロアントシアニジン化合物を有し、
前記組成物中の全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である、組成物。
【請求項２９】
請求項２８記載の組成物において、前記組成物中の前記全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項３０】
請求項２８記載の組成物において、前記組成物中の前記全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項３１】
請求項２８記載の組成物において、プロアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項３２】
方法であって、
プロアントシアニジンを含む組成物を、免疫抑制された患者、或いは敗血症或いは敗血症性ショックと診断された患者に投与する工程を有する、方法、
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項３５】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項３６】
請求項３２記載の方法において、ポリアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項３７】
請求項３２記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法剤、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療、或いはそれらの組み合わせとの併用療法において投与されるものである。
【請求項３８】
請求項３２記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤と結合するものである。
【請求項３９】
方法であって、
プロアントシアニジン化合物を含む組成物を、グラム陰性細菌感染と診断された患者に投与する工程を有するものであり、
前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である、方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項４１】
請求項３９記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項４２】
請求項３９記載の方法において、プロアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項４３】
請求項３９記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法剤、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療、或いはそれらの組み合わせとの併用療法において投与されるものである。
【請求項４４】
請求項３９記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤と結合するものである
【請求項１】
組成物であって、
プロアントシアニジンと、
前記プロアントシアニジンを固定化する、高分子、高分子集合体、半固体、或いは固体表面と、
を有する、組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、前記高分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、脂質或いは糖を有するものである。
【請求項３】
請求項１記載の組成物において、前記高分子集合体は、多タンパク質複合体、ウイルス、デンドリマー、或いはナノ粒子を有するものである。
【請求項４】
請求項３記載の組成物において、前記ナノ粒子は、ナノクラスター、ナノ結晶、ナノロッド、ナノ粒子、或いはナノチューブを有するものである。
【請求項５】
請求項１記載の組成物において、前記半固体或いは固体表面は、複数のビーズ、粒子、ロッド、線維、フィラメント、毛細管、チューブ、平面層、或いは導波管を有するものである。
【請求項６】
フィルターであって、
入口及び出口を有するハウジングであって、前記ハウジング通過して液体が流れるものである、ハウジングと、
請求項１記載の組成物と
を有するフィルターであって、
前記ハウジングを通過して液体が流れる場合、前記組成物は前記ハウジング内に維持されるものである、フィルター。
【請求項７】
センサーであって、
請求項１記載の組成物と、
流体装置と、
前記ポリアントシアニジンに対するリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌の結合を検出するメカニズムと
を有する、センサー。
【請求項８】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、或いは屈折率の変化を介して達成されるものである。
【請求項９】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、音響メカニズム、表面音波装置、或いは水晶振動子マイクロバランス装置を介して達成されるものである。
【請求項１０】
請求項７記載のセンサーにおいて、検出は、電気化学メカニズム、若しくは電流測定法、電位差測定法、或いは伝導度測定法を介して達成されるものである。
【請求項１１】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全アントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項１２】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全てのアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項１３】
請求項１記載の組成物において、前記組成物における全てのアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項１４】
請求項１記載の組成物において、ポリアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項１５】
方法であって、
請求項１記載の組成物を提供する工程と、
リポ多糖、リピドＡ、若しくはリポ多糖或いはリピドＡを産生する細菌を含むとされるサンプルに前記組成物を曝露する工程と
を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記組成物は、前記ハウジングを通過する流体に対する入口と出口を有するハウジング内に配置されるものである。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法において、前記組成物は、前記ポリアントシアニジンに対するリポ多糖、リピドＡ、或いは細菌の結合を検出することが可能である流体装置内に配置されるものである。
【請求項１８】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
光学メカニズム、紫外線吸光度、可視光吸光度、赤外線吸光度、蛍光、発光、化学発光、偏光、表面プラズモン共鳴、或いは屈折率の変化を介して、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌への前記プロアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項１９】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
音響メカニズム、表面音波装置、或いは水晶振動子マイクロバランス装置を通じて、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌に対する前記ポリアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項２０】
請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、
電気化学メカニズム、若しくは電流測定、電位差測定或いは伝導度測定検出器を通じて、前記リポ多糖、リピドＡ、或いは細菌に対する前記ポリアントシアニジンの結合を検出する工程を有するものである。
【請求項２１】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項２２】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項２３】
請求項１５記載の方法において、全ポリアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項２４】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、臨床サンプルである。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記臨床サンプルは、血液、血漿、血清、リンパ液、或いは髄液を含むものである。
【請求項２６】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、薬学的調合物である。
【請求項２７】
請求項１５記載の方法において、前記サンプルは、幼児或いは免疫抑制された個人向けの食品或いは飲料である。
【請求項２８】
組成物であって、
プロアントシアニジン化合物を有し、
前記組成物中の全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である、組成物。
【請求項２９】
請求項２８記載の組成物において、前記組成物中の前記全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項３０】
請求項２８記載の組成物において、前記組成物中の前記全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項３１】
請求項２８記載の組成物において、プロアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項３２】
方法であって、
プロアントシアニジンを含む組成物を、免疫抑制された患者、或いは敗血症或いは敗血症性ショックと診断された患者に投与する工程を有する、方法、
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項３５】
請求項３２記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項３６】
請求項３２記載の方法において、ポリアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項３７】
請求項３２記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法剤、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療、或いはそれらの組み合わせとの併用療法において投与されるものである。
【請求項３８】
請求項３２記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤と結合するものである。
【請求項３９】
方法であって、
プロアントシアニジン化合物を含む組成物を、グラム陰性細菌感染と診断された患者に投与する工程を有するものであり、
前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、少なくとも約６である、方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約６から約４０である。
【請求項４１】
請求項３９記載の方法において、前記組成物における全プロアントシアニジンの平均重合度は、約２０から約２２である。
【請求項４２】
請求項３９記載の方法において、プロアントシアニジンは、カテキン及びエピカテキンユニットから成るものである。
【請求項４３】
請求項３９記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法剤、放射線核種、免疫抑制剤、血漿分離交換治療、或いはそれらの組み合わせとの併用療法において投与されるものである。
【請求項４４】
請求項３９記載の方法において、前記プロアントシアニジンは、抗生物質、化学療法、放射線核種、或いは免疫抑制剤と結合するものである
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５０５０９０（Ｐ２０１０−５０５０９０Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７５７４（Ｐ２００９−５２７５７４）
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１００４
【国際公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【出願人】（５００２３８７９０）アメリカ合衆国 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１００４
【国際公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【出願人】（５００２３８７９０）アメリカ合衆国 (13)
【Ｆターム（参考）】
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