肺の炎症および線維症の予防および／または治療のための尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用
本発明は、ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療のための、特に、慢性線維症、ＣＯＰＤ、および間質性線維症などの肺炎症、ならびに自己免疫由来の肺病態を含むその他のＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための、哺乳類の尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用に関する。尿酸レベルを低下させる能力を有する好ましい化合物は、アロプリノールなどのキサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え酵素ウリカーゼ、およびプロベネシドなどの尿酸排泄促進することができる尿酸排泄性化合物からなる群より選択される。本発明はさらに、患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、若しくはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発症するリスクを有するかをインビトロで同定する方法、またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための化合物のスクリーニング方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療のための、特に、慢性線維症、ＣＯＰＤ、および間質性線維症などの肺炎症、ならびに自己免疫由来の肺病態を含むその他のＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための、哺乳類の尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用に関する。尿酸レベルを低下させることができる好ましい化合物は、アロプリノールなどのキサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え酵素ウリカーゼ、およびプロベネシドなどの尿酸排泄を促進することができる尿酸排泄性化合物からなる群より選択される。本発明はさらに、患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、若しくはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発達させるリスクを有するかをインビトロで同定する方法、または治療を必要とする患者においてＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための化合物のスクリーニングのための方法に関する。
【０００２】
微生物成分および細胞の損傷は、危険シグナルを提示し、自然免疫を誘発して、炎症および修復をもたらす（４）。死につつある細胞は、免疫系に警告を発して自然免疫および獲得免疫を刺激する危険シグナルを放出する（５、６）。死につつある細胞から放出される危険シグナルは、ＴＬＲなどの膜受容体（７、８、９、３９）、またはＮＬＲなどのサイトゾル受容体（１０〜１４、３６）を介して細胞レベルで認識される。傷害細胞からの核酸は急速に分解され、プリンが尿酸に変換される。プリンの異化反応生成物である尿酸は、死につつある細胞中で識別され、樹状細胞の成熟化および抗原提示機能を誘発する（１６）。大量の尿酸が、腫瘍化学療法の後に傷害組織からインビボで産生され、高尿酸血症を引き起こす（１７）。尿酸は、局所濃度が高いと析出し、臨床的痛風で見られる炎症を引き起こす結晶を形成する（５７）。尿酸結晶は、カスパーゼ‐１を含有するＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、活性インターロイキン（ＩＬ）‐１βの産生がもたらされる（１０）。
【０００３】
痛風を含む高尿酸血症候群は、尿酸産生の阻害、分解または尿排泄の促進によって効果的に治療することができる（プリン代謝を示す図９のスキームを参照）。
【０００４】
間質性肺線維症は、死を伴う呼吸不全を引き起こすことが多い急性肺傷害の再発性エピソードを伴う慢性疾患である。重要なことには、効果的な治療法が存在しない（１）。間質性肺線維症をもたらす再発性肺炎症の原因はほとんど分かっていない。しかし、汚染物質による慢性的な気道刺激、放射線照射、またはブレオマイシンによる腫瘍化学療法が、類似の線維性肺病態を引き起こす場合がある。ブレオマイシンは、実験的環境において酸化障害および細胞死を引き起こし、これが肺炎症および間質性肺線維症に類似する線維症を誘発する（２、３８）。この実験モデルでは、炎症、修復、および線維症がＩＬ‐１β産生およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８シグナル伝達に依存すること、ならびにブレオマイシン誘発性の炎症にはインフラマソーム複合体の活性化が必要であることが実証された（３）。これらの公開された知見を図１に概略し、図７に図式的に示す。
【０００５】
従って、肺炎症および肺線維症の予防および／または治療のための方法を提供するために、ＩＬ‐１βがどのようにして産生されるかを理解することが依然として望まれている。
【０００６】
これが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、本明細書でブレオマイシン誘発性の炎症がＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化に依存することを報告する。本発明者らは、本明細書で組織傷害の際に尿酸が肺の中で局所的に産生され、炎症性サイトカインＩＬ‐１βの産生を介して炎症および線維症を引き起こすことを実証した。鼻腔内の経路で与えられた尿酸結晶は、用量依存的なＮＡＬＰ３‐ＩＬ‐１Ｒ１依存性の炎症を引き起こした（図８に概略する）。
【０００８】
尿酸の代謝は十分に明らかにされており、関連する点のみを紹介する：キサンチンオキシダーゼが、ヒポキサンチンを酸化してキサンチンおよび尿酸とし、これがウリカーゼによってアラントインへと分解され、腎臓によって排出される。腎臓内では、有機アニオントランスポーター、ＵＲＡＴ１を遮断して尿細管再吸収を阻害することにより、尿酸の排出が促進される。
【０００９】
尿酸レベルを低下させる引用した各メカニズムに対して阻害剤が当業者に公知であり、そのいくつかは臨床使用されている：
例えば、
・ アロプリノールは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤であり、尿酸の形成を低減する。
・ 組換えウリカーゼは、尿酸を分解し、それによって高尿酸血症を低減する。
・ プロベネシドは、尿細管有機アニオントランスポーターを阻害し、それによって腎臓の排出を増加させる。
【００１０】
従って、尿酸レベルを低下させる治療ツールは、傷害誘発性の細胞死並びに肺炎症および肺線維症を低減するために用いることができる。
【００１１】
確かに、驚くべきことに、そして重要なことに、本発明者らは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールの投与による尿酸レベルの低下が、ＩＬ‐１β産生および肺炎症を阻害したことを実証した。加えて、組換え酵素ウリカーゼによる尿酸レベルの低下は、肺炎症に対して同等の阻害効果を有していた。
【００１２】
これは、尿酸が肺炎症および肺線維症に決定的に関与していることを示す初めての報告であり、本発明者らは、尿酸の低下がＩＬ‐１βの産生を阻害し、それによって肺の炎症および線維症が阻止されるという強い証拠を提示する。
【００１３】
細胞／組織の傷害および壊死が尿酸の産生をもたらすという事実に基づき、本発明者らは、傷害部位で形成される尿酸結晶が、インフラマソームを活性化してＩＬ‐１βを放出させ、炎症性肺病態を引き起こす重要な危険シグナルを表すのではないかという仮説を立てた（図８に図式的に示す）。
【００１４】
本発明者らは、尿酸がブレオマイシン肺傷害で放出されることを特に実証し、プロＩＬ‐１βを開裂して成熟ＩＬ‐１βとし、続いて肺の炎症および線維症を引き起こすカスパーゼ‐１の活性化をもたらすＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化に、尿酸が決定的に関与している強い証拠を提示する（図８）。
【００１５】
本発明は、ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療を意図する組成物の調製のための、哺乳類において尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、予防および／または治療を必要とする哺乳類、特にヒトにおけるＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療のための方法であって、そのような哺乳類に対して血清中の尿酸を低下させる有効量の治療化合物を投与することによる方法を含んでなる。
【発明の具体的説明】
【００１７】
好ましい態様では、前記ＩＬ‐１β駆動性肺病態は、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される。
【００１８】
好ましい慢性閉塞性肺疾患は、喘息、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、およびアレルギーを含むいずれかの炎症性肺疾患からなる群より選択される。
【００１９】
より好ましい態様では、前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態は、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症からなる群より選択される。
【００２０】
別の好ましい態様では、尿酸レベルを低下させることができる化合物は：
‐ 尿酸の産生を阻害することによって尿酸濃度を低下させることができるキサンチンオキシダーゼ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩；
‐ 尿酸のより容易に排泄されるアラントインへの変換を触媒するウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片；および、
‐ 尿酸の排泄を促進する能力を有し、腎臓の尿酸の排出を増加させる尿酸排泄性化合物、若しくは、尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤、またはそれらの薬学的に許容可能な塩、
からなる群より選択される。
【００２１】
以下からなる群より選択されるキサンチンオキシダーゼ阻害化合物がより好ましい：
‐ アロプリノール、
‐ 構造的にアロプリノールと関連する、ピラゾール［３，４‐ｄ］ピリミジン。その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Gupta et al., Eur J Med Chem. 2008; 43(4):771-80）、
‐ アザプロパゾン（３‐ジメチルアミノ‐７‐メチル‐１，２‐（ｎ‐プロピルマロニル）‐１，２‐ジヒドロ‐１，２，４‐ベンゾトリアジン二水和物（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Thiele et al.、１９８１年１２月１５日、米国特許第４，３０５，９４２号を参照）、
‐ 置換チアゾロピリミジン（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Yoshida et al.、２００７年８月７日、米国特許第７，２５３，１５４号を参照）、
‐ １位、２位、若しくは４位にて置換アルキル基で置換されていてよく、かつ、３位および５位に芳香族環を有する１，２，４‐トリアゾール化合物、その水和物、または塩（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Nakamura et al.、２００６年７月１１日、米国特許第７，０７４，８１６号を参照）、ならびに、
‐ ２‐［３‐シアノ‐４‐（２‐メチルプロポキシ）フェニル］‐４‐メチルチアゾール‐５‐カルボン酸（高尿酸血症および痛風の患者に対するアロプリノールの考え得る代替薬であり、キサンチンオキシダーゼの非プリン選択性阻害剤である、フェブキソスタット（Becker, et al., N. Engl. J. Med., Volume 353:2450-2461, 2005, Number 23）。
【００２２】
同様に、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）から抽出された尿酸オキシダーゼ（Uricozyme（商標）として知られる）などの精製されたウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、好ましくはラスブリカーゼ（サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で発現させたアスペルギルスフラバス由来の組換え尿酸オキシダーゼ）などの組換えウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片がより好ましい。
【００２３】
ウリカーゼよりも抗原性が低く、血清中尿酸濃度を迅速に低下させることができる、ペグ化ウリカーゼ（Bomalaski et al., Curr. Rheumatol. Rep 2004; 6:240-247）がより好ましい。ペグ化ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼとは、ポリ（エチレングリコール）若しくはポリ（エチレンオキシド）（共にＰＥＧと称する）と共有結合した天然または組換えウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）を示すことを意図しており、特に、平均で２〜１０のＰＥＧ鎖が各ウリカーゼサブユニットとコンジュゲート（conjugate）しており、好ましくは、ＰＥＧは約５ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を有する。得られたＰＥＧ‐ウリカーゼコンジュゲートは、実質的に非免疫原性であり、および未修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％を保持することが示された（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、２００３年６月６日公開の米国特許第６，５７６，２３５号を参照）。
【００２４】
以下からなる群より選択される尿酸排泄性化合物もまた、尿酸レベルを低下させることができるより好ましい化合物である：
‐ プロベネシド（アニオントランスポーター阻害剤である、４‐［（ジプロピルアミノ）スルホニル］安息香酸）、
‐ ベンズブロマロン（３，５‐ジブロモ‐４‐ヒドロキシフェニル‐２‐エチル‐３‐ベンゾフラニルケトン）、
‐ スルフィンピラゾン（１，２‐ジフェニル‐４‐（２‐フェニルスルフィニルエチル）ピラゾリジン‐３，５‐ジオン）、および、
‐ トロンボキサンシンターゼ阻害剤および／またはトロンボキサン受容体拮抗剤（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Piraino et al.、１９９１年６月４日、米国特許第５，０２１，４４８号を参照）。
【００２５】
好ましい態様では、前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射により、または経口で投与される。
【００２６】
活性成分の１日の用量は、治療のために選択される投与経路に依存する。用量はまた、検査される患者の生物サンプル中に見られる尿酸の量にも依存するであろう。年齢、体重、ならびに治療前および／または治療中に測定された血清中、血漿中、または尿中濃度に関連して得られたデータの関数として最適用量を決定する方法が当業者に公知である。
【００２７】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、キサンチンオキシダーゼ阻害成分である活性アロプリノールまたはフェブキソスタットを、約１５００ｍｇ／ｄまで、好ましくは約１０００ｍｇ／ｇまで、約４０〜約７５０ｍｇ／ｄの１日量で、より好ましくは８０〜５００ｍｇ／ｄ、および１２０〜４００ｍｇ／ｄの範囲の１日量で、そのような病態に罹患している対象へ数日間にわたって投与してよい。
【００２８】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、経口経路での活性プロベニシド成分は、約１週間は１日２回で１００〜２５０ｍｇ、その後数週間は１日２回で２００〜５００ｍｇであってよい。
【００２９】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、活性ウリカーゼ成分を、約２ｍｇ／ｋｇ／ｄまで、好ましくは約０．７５、０．５０、および０．３５ｍｇ／ｋｇ／ｄまで、好ましくは約０．１０〜０．３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、より好ましくは約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲の１日量で、好ましくは静脈内注射によって、そのような病態に罹患している対象へ数日間にわたって投与してよい。例えば、ウリカーゼ成分は、４‐および８‐ｍｇの用量で２週間ごとに、または８‐若しくは１２‐ｍｇの用量で４週間ごとに、１２週間にわたって静脈内注射として投与してよい。血清／血漿中のウリカーゼ濃度、血清／血漿中の尿酸若しくは尿酸塩、および所望される場合は血清／血漿中の抗体抗ウリカーゼを、治療をより良く調節するために治療中に測定してよい（seng Yue et al., The Journal of Clinical Pharmacology 2008; 48:708）。当業者には、年齢、体重、ならびに前記血清／血漿中濃度に関連して得られたデータの関数として最適用量を決定する方法が公知である。
【００３０】
別の側面では、本発明は、患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発症するリスクを有するかをインビトロで同定する方法であって、以下の工程：
ａ） 検査される患者から、生体液サンプル、特に血清、血漿、または尿サンプルを採取する工程；
ｂ） 尿酸または尿酸塩のレベルを測定する工程；および
ｃ） 検査される患者について得られた尿酸レベルを、正常患者および／またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示す患者について得られた血液サンプル中の尿酸若しくは尿酸塩のレベルと比較することによって、前記患者がそのような病態を示しているか、またはそのような病態を発症するリスクを有するかを同定する工程
を含んでなる方法である。
【００３１】
好ましくは、検査される患者は、肺炎症などの肺病態の症状を示す。
【００３２】
好ましくは、生物サンプルは、血清、血漿、または尿サンプルである。
【００３３】
検査される患者から採取可能である場合は、気管支肺胞洗浄液サンプルを用いてもよい。
【００３４】
好ましくは、血清または血漿サンプル中の７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０、９０、および１００ｍｇ／Ｌの尿酸を超える尿酸コントロールの測定は、そのような肺病態を発症する、またはそのような病態を示すリスクの上昇を意味する。
【００３５】
血清または血漿サンプルなどの生体液サンプル中の尿酸を測定するための方法は、当業者に公知である。それらは、例えば、酵素ウリカーゼを用いる酵素による方法、尿酸がアルカリ性リンタングステン酸塩を還元する能力に基づく方法、またはその他の化学的比色法であってよい。これらは、現時点で尿酸または尿酸塩アッセイのために今日使用されている広範囲にわたる種々の方法である。例えば、血清中尿酸レベルを蛍光法または比色法を用いて測定することができる、バイオビジョン（バイオビジョンリサーチプロダクツ（Bio Vision Research Products）、９８０ リンダビスタアベニュー（Linda Vista Avenue），マウンテンビュー，カリフォルニア州 ９４０４３ 米国）の尿酸アッセイキット（カタログ番号Ｋ６０８‐１００）、またはモレキュラープローブズ（Molecular Probes）（２９８５１ ウイロークリークロード（Willow Creek Road），ユージーン，オレゴン州 ９７４０２，米国）のＡｍｐｌｅｘ（商標）赤色尿酸／ウリカーゼアッセイキット（Ａ２２１８１）を挙げることができる。
【００３６】
別の側面では、本発明は、ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態（「ＩＬ‐１β駆動性の肺病態」）の治療のための化合物をスクリーニングする方法であって、試験される前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、ウリカーゼ活性、若しくは尿酸オキシダーゼ活性を有するか、または尿酸排泄性化合物であるか、若しくは腎臓の尿酸の排出の増加をもたらす尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【００３７】
好ましくは、治療される前記ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態は、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される。
【００３８】
より好ましくは、治療される前記ＩＬ‐１β経路に関連する前記肺病態は、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症である。
【００３９】
本発明のその他の特徴および利点は、実施例、およびその説明が以下に示される図面により、その記載の続きに示される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症および線維症がＩＬ‐１βに依存することを示す図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、肺におけるブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生がインフラマソーム活性化に依存することを示す図である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、ブレオマイシン投与によって尿酸が肺で産生されること、およびアロプリノールによる尿酸合成の阻害が肺炎症を阻止することを示す図である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ウリカーゼによる尿酸の分解が、ブレオマイシン誘発性の肺炎症を阻害することを示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、外来性尿酸結晶が、炎症およびＩＬ‐１β産生を引き起こすことを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｈは、外来性尿酸結晶誘発性の炎症が、ＮＡＬＰ３インフラマソーム活性化に依存することを示す図である。
【図７】図７は、ブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生、炎症、および線維症に関する本発明者らの発表済みデータの図式的な概略である。
【図８】図８は、新規データ：ブレオマイシン肺傷害による肺での尿酸産生が、ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、肺炎症および線維症をもたらすことを示す図である。
【図９】図９は、尿酸の合成と代謝：アロプリノールおよび関連するキサンチンオキシダーゼ阻害剤ならびにウリカーゼによる尿酸の低下を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症およびリモデリングがＮＡＬＰ３およびＡＳＣタンパク質に依存することを示す図である。野生型、ＮＡＬＰ３、ＩＬ‐１Ｒ１、またはＡＳＣ欠損マウスにブレオマイシン（ＢＬＭ、１０ｍｇ／ｋｇ）の鼻腔内滴下（ｉ．ｎ．）滴下の２４時間後における、（Ａ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、（Ｂ）肺ホモジネート中のＭＰＯ活性、（Ｃ）ＫＣ、（Ｄ）ＩＬ‐６、（Ｅ）ＩＬ‐１β、および（Ｆ）肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１の濃度。本実験では、４回のみの戻し交配を行ったＡＳＣ−／−を、その同腹仔ＡＳＣ＋／＋と比較した。これらのデータは、Ｃ５７ＢＬ／６へ１０世代にわたり戻し交配を行ったＡＳＣ−／−で再現された。データは、４つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｅは、ブレオマイシン誘発性の炎症が、カスパーゼ‐１に依存することを示す図である。ＢＬＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｎ．滴下の２４時間後における、野生型マウス、またはカスパーゼ‐１（Ｃａｓｐ‐１）欠損マウスのＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ａ）。ＢＬＭ投与の直前、４および８時間後に、媒体、またはＣａｓｐ‐１の阻害剤Ｚ‐ｙｖａｄ‐ｆｍｋ（１０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射した野生型マウスのＢＬＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｎ．滴下の２４時間後における、ＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ｂ）、肺ホモジネート中のＩＬ‐１β（Ｃ）、ＫＣ（Ｄ）、およびＴＩＭＰ‐１（Ｅ）の濃度。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値として表される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｄは、遅発型炎症およびリモデリングがＮＡＬＰ３インフラマソームに依存することを示す図である。遅発型炎症および組織リモデリングを、野生型および欠損マウスにてブレオマイシン投与（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｎ．）の１４日後に評価した。（Ａ）ＢＡＬＦ中のリンパ球として測定した遅発型炎症。（Ｂ）ＢＡＬＦ中のプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐ＭＭＰ‐２（７１Ｋｄ）、および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）ゼラチナーゼの活性を、酵素電気泳動で分析した。（Ｃ）線維症プロセスの指標としての肺中のＴＩＭＰ‐１を、ＥＬＩＳＡで測定した。（Ｄ）肺中の全コラーゲンをＳｉｒｃｏｌアッセイによって分析した。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｇは、ブレオマイシン誘発性の炎症が尿酸合成の阻害によって低減することを示す図である。（Ａ）生理食塩水またはブレオマイシン（ＢＬＭの鼻腔内滴下（１０ｍｇ／ｋｇ）の６時間後におけるマウスのＢＡＬＦ中の尿酸レベル。（Ｂ）生理食塩水またはＢＬＭ処理の２４時間後におけるマウスの肺中の尿酸レベル。マウスは、ＢＬＭ滴下の前ならびに６および９時間後に、媒体またはアロプリノール（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射を受けた。媒体またはアロプリノールのｓ．ｃ．注射、および生理食塩水またはＢＬＭ滴下の後における、ＢＡＬＦ中の（Ｃ）全細胞カウント、ならびに（Ｄ）好中球カウント。媒体またはアロプリノールのｓ．ｃ．注射、およびＢＬＭ滴下の２４時間後における、肺中のＫＣ（Ｅ）、ＩＬ‐１β産生（Ｆ）、または２４時間後における肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１（Ｇ）産生。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ブレオマイシン誘発性の炎症が尿酸の中和によって低減することを示す図である。ＢＬＭ滴下（１０ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後における、肺中の尿酸レベル（Ａ）、ＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ｂ）、および肺中のＩＬ‐１産生（Ｃ）。マウスは、ＢＬＭによる滴下の直前ならびに６および９時間後に、媒体またはウリカーゼ（０．２ｍｇ／ｋｇ）によるｉ．ｐ．注射を受けた。データは、４つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｆは、ブレオマイシン誘発性の修復および線維症が、尿酸によって媒介されることを示す図である。ＢＬＭ滴下（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｎ．）の０、６および９時間後に、アロプリノール（１５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）、ウリカーゼ（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、または生理食塩水を第０日に、ならびに８または１４日間にわたって１日おきに注射して、リモデリングおよび線維症を評価した。（Ａ）第８日におけるＢＡＬＦ中のリンパ球および好中球として測定した遅発型炎症。（Ｂ）酵素電気泳動により分析したプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）ゼラチナーゼの活性は、第１４日に、媒体処理マウスのＢＡＬＦ中では上方制御されたが、アロプリノールまたはウリカーゼ処理マウスのＢＡＬＦ中では、より少なかった。（Ｃ）線維症プロセスの指標としての肺中のＴＩＭＰ‐１は、ＢＬＭ投与の８日後に生理食塩水処理マウスで上方制御されたが、アロプリノール処理マウスでは上方制御されなかった。（Ｄ）ＢＬＭ投与の１４日後のウリカーゼまたはアロプリノール処理の後に、肺中のアルファ（Ｉ）コラーゲンＩ ｍＲＮＡを、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により分析した。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。（Ｅ）肺の顕微鏡切片は、生理食塩水対照マウスと比較して、ＢＬＭで処理した野生型マウスでは、第１４日にて、コラーゲン沈着を伴う広範囲の線維症領域を示した。ＢＬＭで誘発された線維症は、アロプリノールにより有意に低減した。クロモトロープアニリンブルー（ＣＡＢ）染色、２０×および２００×の拡大倍率。（Ｆ）ブレオマイシンにより誘発された傷害部を、２人の病理学者により記述した通りに半定量的に評価した（材料と方法、を参照）。肺の破壊、肺胞隔壁の肥厚、および線維症が、ウリカーゼまたはアロプリノールで処理したマウスで低減した。結果は、平均肺線維症スコア±ＳＤとして表される。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６）。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｅは、外来性尿酸結晶が急性肺炎症およびリモデリングを引き起こすことを示す図である。（Ａ）肺胞マクロファージ（ＡＭ）による尿酸（ＵＡ）結晶の、ＵＡ結晶滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）の６時間後における取り込み。（Ｂ）ＢＡＬＦ中のＵＡ結晶誘発性の細胞動員の用量反応。（Ｃ）ＵＡまたはアロプリノール結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）の６時間後におけるＢＡＬＦ中の好中球カウント。（Ｄ）ＵＡ結晶滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）によるＢＡＬＦ中の細胞動員の動態。（Ｅ）用量を増加させたときのＵＡ結晶のｉ．ｎ．投与後の肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｊは、外来性尿酸（ＵＡ）結晶による肺炎症が、ＮＡＬＰ３インフラマソームおよびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８経路に依存することを示す図である。外来性ＵＡ結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ）の６時間後に、アナキンラ（１０ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．により前処理した、（Ａ）ＮＡＬＰ３、（Ｃ）ＡＳＣ、（Ｅ）ＩＬ‐１Ｒ１またはＭｙＤ８８の欠損マウスからのＢＡＬＦ中、および（Ｆ）野生型マウスからの、ＢＡＬＦ中の好中球カウント。野生型マウスと比較した、（Ｂ）ＮＡＬＰ３、（Ｄ）ＡＳＣ、（Ｆ）ＩＬ‐１Ｒ１またはＭｙＤ８８の欠損マウスに対する、外来性ＵＡ結晶投与の６時間後における肺ホモジネート中のＩＬ‐１β用量。野生型、またはＩＬ‐１Ｒ１若しくはＭｙＤ８８遺伝子欠損マウスへの外来性ＵＡ結晶投与の６時間後における、肺ホモジネート中の（Ｇ）ＩＬ‐６、（Ｈ）ＫＣ、（Ｉ）ＴＩＭＰ‐１およびＩＬ‐１β用量。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｄは、外来性尿酸（ＵＡ）結晶による肺炎症が、ＩＬ‐１８Ｒには依存しないが、最適な炎症にはＴＬＲ２またはＴＬＲ４が必要であることを示す図である。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ２／ＴＬＲ４欠損マウスにおける（Ａ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、および（Ｂ）肺ホモジネート中のＩＬ‐１β。ＩＬ‐１８Ｒ欠損マウスにおける（Ｃ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、および（Ｄ）肺ホモジネート中のＩＬ‐１β。マウスは、外来性ＵＡ結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ）の６時間後に屠殺した。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ブレオマイシン誘発性の肺傷害の後（Ａ）または外来性尿酸結晶への肺の曝露後（Ｂ）における、具体的なカスケードおよびシグナル伝達経路を示す概略図である。（Ａ）本発明者らはまず、肺細胞、恐らくは上皮細胞のブレオマイシン誘発性の傷害が、肺のＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングを引き起こし、これらが、ＮＡＬＰ３受容体、ＡＳＣアダプター、およびＣａｓｐ‐１エフェクター分子に依存することを示す。第二に、発明者らは、肺へのブレオマイシン投与が、傷害によって死につつある肺細胞から発生すると考えられる危険／ストレスシグナルを表す肺での尿酸の放出を誘発することを示す。ＮＡＬＰ３タンパク質の活性化は、ＰＹＲ‐ＰＹＲおよびＣＡＲＤ‐ＣＡＲＤホモタイプ相互作用を介して相互作用を起こすことが公知であるＡＳＣおよびＣａｓｐ‐１の動員を引き起こす。局所濃度の上昇は、恐らく尿酸の結晶化を誘発する。インビボで尿酸合成を抑制するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールによる処理、または尿酸を可溶性アラントインへと迅速に分解するウリカーゼによる処理を行うことで、ブレオマイシン投与による肺中の尿酸濃度の上昇が阻止され、ＩＬ‐１β産生、炎症、リモデリング、および線維症の減少がもたらされる。（Ｂ）肺が外来性尿酸結晶へ曝露されると、ＴＩＭＰ‐１の蓄積を伴う線維症への発展に特徴的な炎症およびリモデリングが誘発される。尿酸結晶が誘発するＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。ＩＬ‐１β産生および細胞流入には、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４の存在が必要である。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４は、結晶誘発性のプロ‐ＩＬ‐１βの産生、または肺胞マクロファージおよび／または常在細胞（resident cells）による尿酸結晶の取り込みに関与している可能性がある。
【実施例】
【００４１】
実施例１：材料と方法
マウス
マウスは、販売元から購入するか、または研究所由来のものを入手し、過去の報告（３）および（４０）の通りに飼育する。動物実験はすべて、フランス政府による倫理および動物実験に関する法規制（French Government's ethical and animal experiment regulations）に従った。本研究では、以下のＭｙＤ８８（１９）、ＩＬ‐１Ｒ１（２０）、ＩＬ‐１８Ｒ（２１）、Ｃａｓｐ‐１（２２）、ＴＬＲ４（２３）、ＴＬＲ２（２４）、ＮＡＬＰ３（１０）、またはＡＳＣ（２５）の欠損マウスを用いた。４回のみの戻し交配を行ったＡＳＣ−／−をそのＡＳＣ＋／＋同腹仔と比較した図１を除き、ＭｙＤ８８−／−、Ｃａｓｐ‐１−／−、ＴＬＲ２−／−、ＡＳＣ−／− ＴＬＲ４−／−、二重欠損ＴＬＲ２−／−ＴＬＲ４−／−、およびＩＬ‐１８Ｒを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景へ１０回にわたり戻し交配を行った。ＩＬ‐１Ｒ１−／−マウスは、７回の戻し交配を行い、ＮＡＬＰ３−／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景に直接作出した。対照Ｃ５７ＢＬ／６を含むすべてのマウスは、トランスゲノス研究所（Transgenose Institute）（ＣＮＲＳ、オルレアン）の本発明者らの動物施設で飼育した。実験のために、成体動物（６〜１０週齢）を、滅菌した換気付隔離ケージで飼育した。動物実験はすべて、フランス政府による倫理および動物実験に関する法規制に従った。
【００４２】
ブレオマイシン−、尿酸またはアロプリノール結晶−誘発性の炎症
ベロンラボラトリーズ（Bellon Laboratories）（モンルージュ、フランス）製の硫酸ブレオマイシン（２００〜３００μｇまたは１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、尿酸若しくはアロプリノール結晶（１００〜１０００μｇまたは５〜５０ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、または生理食塩水単独を４０μＬの容量で、軽いケタミン‐キシラジン麻酔下で、経鼻滴下により気道を通して投与する。気管支肺胞腔中および肺中の細胞数、ケモカイン、サイトカイン、およびＴＩＭＰ‐１を、報告された通りに評価した（３）。ブレオマイシンの投与時並びに６および９時間にて、０．１ｍｌの滅菌ＮａＣｌ中の５００μｇまたは２５ｍｇ／ｋｇのアロプリノール（シグマ‐アルドリッチ）を皮下注射し、４０μＬ中の４μｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのウリカーゼ（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ、サノフィシンセラボ（Sanofi Synthelabo））を経鼻滴下によって投与した。いくつかの実験では、０．１ｍｌの滅菌ＮａＣｌ中の２００μｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ‐１Ｒａ（アナキンラ、アムジェン）を、ＭＳＵ結晶の投与時並びに２および４時間に皮下注射した。
【００４３】
‐尿酸またはアロプリノール結晶の調製
尿酸またはアロプリノール結晶は、予め７０℃に加熱し、ｐＨを７．１と７．２の間に維持するように添加された０．０１ＭのＮａＯＨへ１．６８ｍｇの粉末を溶解することで得た。この溶液をろ過し、結晶が形成するまでゆっくり連続的に攪拌した状態で室温にてインキュベートした。結晶を１００％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、オートクレーブにかけ、滅菌状態を維持した。乾燥結晶の重量を滅菌条件下にて測定し、結晶を超音波処理によってＰＢＳ中に懸濁させ、位相差顕微鏡で観察した。
【００４４】
‐肺炎症モデルの実験設計
ベロンラボラトリーズ製の硫酸ブレオマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）、尿酸若しくはアロプリノール結晶（５〜５０ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、または媒体単独を、軽いケタミン‐キシラジン麻酔下で、鼻腔内滴下によって投与し、６時間後（尿酸結晶の場合）または２４時間後（ブレオマイシンの場合）に、細胞動員および特に好中球流入、ＫＣ、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１βを含むケモカインならびにサイトカインレベルを含む炎症のマーカーについて、そして１４日後に、ゼラチナーゼＭＭＰ９およびＭＭＰ２、ならびにこれらの阻害剤であるＴＩＭＰ‐１などの組織リモデリングのマーカーについて、ＢＡＬおよび肺組織のアッセイを行った。いくつかの実験では、類似の効力を有する２５ｍｇ／ｋｇのアロプリノール（シグマ‐アルドリッチ）を皮下注射し、０．２ｍｇ／ｋｇのウリカーゼ（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ、サノフィシンセラボ）を腹腔内投与または鼻腔内投与した。１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ‐１Ｒａ（アナキンラ、アムジェン）を皮下注射した。アロプリノールまたはウリカーゼの最適用量を試験し、用量を上げるよりも、繰り返し投与するほうがより効果的であった（データ省略）。
【００４５】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
気管の切除後、プラスチック製カニューレを挿入し、３７℃に加温した０．３ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて気腔を洗浄した。次に、胸郭部を緩やかにマッサージして細胞回収を最大とした。液を注意深く吸引して回収した。この手順を１０回行い、全洗浄液の回収率は９５％超であった。回収したサンプルを２つの画分に分け：第一の画分（最初の２回の洗浄に相当する１ｍｌ）はメディエーターの測定に用い、第二の画分は細胞測定に用いた（４ｍｌ）。第一の画分を遠心分離し（６００ｇ、１０分間）、上清を分別してメディエーター測定まで−８０℃で保存した。次に、細胞ペレットを０．４ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、第二の画分と共にプールし、細胞測定まで４℃で維持した。
【００４６】
肺の均質化
ＢＡＬの実施後、肺全体を摘出し、１ｍｌのＰＢＳと共にマイクロチューブ内（ライジングマトリックスＤ、Ｑバイオジーン（Q Bio Gene），イルクリッシュ（Illkrich），フランス ）に投入し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ（商標）システム（ＦＰ１２０、Ｑバイオジーン，イルクリッシュ，フランス ）を用いて全肺組織抽出物を調製し、続いてこの抽出物を遠心分離し、上清を、メディエーター測定、ＭＰＯ、またはＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（フランスバイオケムディビジョン（France Biochem Division），フランス）によるコラーゲンアッセイまで−８０℃で保存した。
【００４７】
肺中のミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）
肺組織ＭＰＯ活性を報告された通りに評価した（３）。簡潔に述べると、右心室を生理食塩水で灌流して血管内容物を洗い流し、使用するまで肺を−２０℃で凍結した。肺をポリトロンで均質化し、遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）および５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳ１ｍＬ中に再懸濁した。遠心分離に続いて、上清５０μｌを、２００μＬ ＰＢＳ‐ＨＴＡＢ‐ＥＤＴＡ、２ｍＬ ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、１００μＬ ｏ‐ジアニシジン二塩酸塩（１．２５ｍｇ／ｍＬ）、および１００μＬ Ｈ２Ｏ２ ０．０５％と共に試験管へ投入した。攪拌機中３７℃での１５分間のインキュベーションの後、１００μＬ ＮａＮ３ １％で反応を停止させた。ＭＰＯ活性を、媒体に対する４６０ｎｍでの吸光度として測定した。
【００４８】
細胞カウントおよび測定
粒子カウンター（Ｚ２コールター、ベックマンコールター（Beckman Coulter））を用いてＢＡＬ液中の全細胞カウントを測定した。メイグリュンワルド染色液（ＭＧ‐１Ｌ、シグマケミカル，セントルイス，米国）で４分間、９５％ギムザ染色液（ＧＳ‐５００、シグマケミカル，セントルイス，米国）で８分間の染色後、細胞別カウントをサイトスピンプレパラート（サイトスピン３、サーモシャンドン（Thermo Shandon））上で行った。細胞別カウントは、標準的な形態学的基準を用いて１００個の細胞で行った。
【００４９】
メディエーター測定
ＢＡＬ液中または肺ホモジネート中のＩＬ‐１β、ＫＣ、ＩＬ‐６、およびＴＩＭＰ‐１のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用い、製造元の説明書に従って測定した（マウスＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄシステム，ミネアポリス，米国）。天然および組換えマウスＩＬ‐１βに特異的であるＩＬ‐１β ＥＬＩＳＡアッセイキット（マウスＩＬ‐１β／ＩＬ‐１Ｆ２）は、組換えマウスＩＬ‐１α、ＩＬ‐１ｒａ、ＩＬ‐１ＲＩ／Ｆｃキメラ、またはＩＬ‐１ＲＩＩ／Ｆｃキメラとの交差反応性も干渉も示さなかった（マウスＩＬ‐１特異的ポリクローナルヤギＩｇＧおよびモノクローナルラットＩｇＧ１、クローン番号３０３１１）。
【００５０】
尿酸測定
気管支肺胞洗浄液中および肺ホモジネート中の尿酸濃度を、Ａｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ尿酸／ウリカーゼアッセイキット（モレキュラープローブ、ユージーン）を用いて測定した。簡潔に述べると、ウリカーゼは、尿酸の、アラントニン、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、および二酸化炭素への変換を触媒する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下、Ｈ２Ｏ２はＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬と化学量論的に反応して赤色蛍光酸化生成物であるレゾルフィンを生成し、これが分光光度測定される。
【００５１】
ＭＭＰの酵素電気泳動分析
ＭＭＰ‐２およびＭＭＰ‐９のレベルをゼラチン酵素電気泳動法で測定した。簡潔に述べると、ＢＡＬ液の非還元上清サンプル（１５μｌ）および標準液（１６１‐０３０５、バイオラッド，ハーキュリーズ，米国）を、０．１％（重量／体積）ゼラチン基材を組み込んだ７％ポリアクリルアミドゲル（重量／体積）上に充填した。ゼラチン分解バンド中のＭＭＰを、レファレンスとして組換えマウスプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）および組換えマウスプロ‐ＭＭＰ‐２（７２Ｋｄ）を用いて評価した。タンパク質を、２０〜３０ｍＡにて３時間電気泳動にかけた。次にゲルを２．５％トリトン（体積／体積）で２回洗浄し、蒸留水で素早く３回リンスし、蒸留水中への２０分間の浸漬を３回行った。各々の異なる方法での洗浄は、ゆっくり攪拌しながら行なった。ゲルを、５０ｍＭのトリスバッファー（５ｍＭ ＣａＣｌ２および２μＭ ＺｎＣＬ２を含有）中にて３７℃で一晩インキュベートした。最後に、クーマシーブルーでゲルを染色し、続いてゲル中の溶解のバンド（酵素活性）がネガティブ染色の領域として出現するまで、徐々に脱色した。ゲル中の溶解領域をデンシトメトリーアナライザー（バイオプロフィル（Bioprofil）、ビルベールロルネ（Vilbert Lournet），マルヌラバレ（Marne la vallee），フランス）を用いて分析し、イメージを撮影し、バンド密度を測定した。ブレオマイシンによる処理後、本発明者らは、プロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐ＭＭＰ２（７２Ｋｄ）、および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）の活性の上昇を観測した。これらのＭＭＰのみを定量した。
【００５２】
全肺コラーゲン測定
次に、肺ホモジネートの一部分（５０μｌ）を、肺コラーゲンレベルについて分析し、製造元の説明書に従ってＳｉｒｃｏｌコラーゲン色素結合アッセイを用い（バイオカラー（Biocolor Ltd），北アイルランド）、ウシ皮膚から調製した標準曲線と比較した。
【００５３】
アルファ‐ＩコラーゲンｍＲＮＡ測定
アルファ‐Ｉコラーゲンの定量は過去に報告されている（２６）。簡潔に述べると、凍結肺サンプルを微粉末に粉砕し、２ｍｌのトリゾール試薬中（インビトロジェンライフテクノロジー（In vitrogen Life technology），ペイズリー，英国）でホモジナイズした。激しく振とうした後、クロロホルムを添加し、サンプルを１２，０００ｇにて２０分間遠心分離した。全ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＲＮＡｓｅフリー水に溶解した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ (インビトロジェンライフテクノロジー，ペイズリー，英国)を用いてＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）および装置ＡＢＩプリズム７０００装置（パーキンエルマー、フォスターシティ，カリフォルニア州，米国）を用い、蛍光色素ＳＹＢＲグリーン法によって実施した。標的ｍＲＮＡレベルの定常状態の相対的定量を、活性レファレンスであるＧＡＰＤＨにより算出した。
【００５４】
組織学
ＢＡＬおよび肺の灌流後、標準的な顕微鏡分析のために、大葉を４％の緩衝ホルムアルデヒド中で固定した。過去の報告（３）の通りに、３μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、またはクロマトロープアニリンブルー（ＣＡＢ）で染色した。形態学的変化の激しさ（好中球および単核細胞による浸潤、肺胞隔壁の破壊および肥厚、ならびに線維症）を、数値による線維症スケール（アシュクロフトスコア（Ashcroft score））を用いて半定量的に評価した（２７）。２人の別々の観察者による平均スコアを線維症スコア（０〜８）と見なした（ＩＣ、ＢＲ）。
【００５５】
統計分析
実験グループ間の違いの統計的評価は、プリズムソフトウェアを用いたマンホイットニー検定によって行った。＜０．０５のＰ値を統計的に有意と見なした。
【００５６】
実施例２：ブレオマイシン誘発性の肺炎症および線維症はＩＬ‐１βに依存する
気道にブレオマイシンを投与すると、ＩＬ‐１β産生と共に炎症を伴う急性肺傷害、これに続く慢性炎症および線維症が引き起こされる（図１Ａ〜１Ｆ）。炎症および線維症は、ＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスでは抑止され、重要なことには、ＩＬ‐１受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐Ｒａ）アナキンラが肺炎症を軽減したことから、ＩＬ‐１Ｒ１依存性である。病態生理学のこの部分は新規であり、発表されている（３）。
【００５７】
従って、本発明者らのデータは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症がＩＬ‐１βによって媒介されることを示している。しかし、ＩＬ‐１βがどのようにして産生されるかに関する情報は存在しない。
【００５８】
肺におけるブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生はインフラマソーム活性化に依存する
従って、本発明者らは、ＩＬ‐１βの放出を引き起こす上流のメカニズム、特にインフラマソーム、ＮＡＬＰ３受容体から構成されるサイトゾル複合体、ＡＳＣアダプター、およびプロＩＬ‐１βをＩＬ‐１βへと開裂するシステインプロテアーゼの役割について研究した（２８）。本明細書にて、本発明者らは、ＢＡＬおよび肺における好中球の動員、ならびに炎症メディエーターＫＣおよびＩＬ‐６（図２Ａ〜２Ｄ）、およびＩＬ‐１βおよび線維症性メディエーターＴＩＭＰ‐１（図２Ｅ、２Ｆ）の産生が、ＮＡＬＰ３およびＡＳＣ欠損マウスで有意に減少したことを見出す。従って、このデータは、ブレオマイシン組織傷害が起こるとＮＡＬＰ３インフラマソームが活性化され、これがＩＬ‐１βの成熟およびこれに続く炎症をもたらすことを示している。
【００５９】
実施例３：ブレオマイシンの投与で尿酸が肺で産生され、尿酸の阻害が肺炎症を阻止する
ａ）どのメディエーターがＮＡＬＰ３インフラマソーム活性化を引き起こすか、および尿酸に焦点を当てる
本発明者らは、生理食塩水と比較してブレオマイシン後に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）（図３Ａ）および肺中（図３Ｂ）の尿酸産生が高められたことを示した。
【００６０】
ｂ）尿酸レベルの阻害が炎症を低減するかどうか
第一に、本発明者らは、尿酸合成を阻害するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールの全身投与が、ブレオマイシンによる肺中の尿酸の増加を阻止したことを示した（図３Ｂ）。
【００６１】
第二に、本発明者らは、アロプリノールがブレオマイシン誘発性の炎症を大きく阻害し、結果としてＢＡＬＦ中の全細胞（図３Ｃ）および好中球動員（図３Ｄ）が減少したことを示した。
【００６２】
さらに、修復プロセスに関与し、線維症への発展に特徴的な炎症性および線維症性サイトカインＩＬ‐１βの産生、好中球ケモカインＫＣ、および組織メタロプロテアーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ‐１）の産生が、アロプリノールにより肺で減少し（図３Ｅ〜３Ｆ）、アロプリノールによりＢＡＬＦで減少した（データ省略）。
【００６３】
さらに、尿酸を可溶性のアラントインへ迅速に分解するウリカーゼによる処理もまた、ブレオマイシン誘発性の肺中の尿酸の増加（図４Ａ）、肺ＩＬ‐１β産生、および好中球流入（図４Ｂ、４Ｃ）を低減した。
【００６４】
これらのデータは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症および修復が、尿酸によって媒介されることを示している。最も重要なことは、アロプリノールまたはウリカーゼの投与が、尿酸レベルおよび炎症を抑えるということである。従って、尿酸は、傷害の際に死につつある肺細胞から放出されると考えられる主たる危険シグナルであり、この尿酸は、肺傷害による炎症を制御するための新しい標的である。
【００６５】
実施例４：外来性尿酸結晶が炎症およびＩＬ‐１β産生を引き起こす
ブレオマイシン傷害によって肺から放出される尿酸は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発しうる。従って、本発明者らは、結晶として投与された外来性尿酸が肺炎症を引き起こし得るかを課題とした。鼻腔内投与された尿酸結晶は、気道内にて肺胞マクロファージによって包み込まれることが分かり（図５Ａ）、およびＢＡＬＦにおいて用量依存的な細胞動員を誘発したが（図示せず）、これは一時的で、マクロファージおよび好中球は６時間で最大に達し、２４時間で減少しており；ならびに、炎症は第１４日に消散した（図５Ｂ）。化学的および構造的に類似しているアロプリノール結晶は、ＢＡＬへの好中球の僅かな動員を引き起こしただけであった（図５Ｃ）。さらに、尿酸結晶は、線維症への発展に特徴な肺ＴＩＭＰ‐１発現を誘発した（図５Ｄ）。ヒトとは対照的に、マウスではその機能的ウリカーゼによって迅速な尿酸の分解が起こる可能性があり（３７）、肺線維症の発症には、尿酸を繰り返し投与する必要があり得る。これらのデータは、尿酸結晶がブレオマイシンに類似の肺での炎症および修復を誘発することを初めて示すものである。
【００６６】
実施例５：外来性尿酸結晶誘発性の炎症はＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する
ａ）ＮＡＬＰ３インフラマソームは尿酸結晶に誘発される肺炎症に関与している
外来性尿酸結晶誘発性の急性肺好中球動員およびＩＬ‐１β産生は、ＮＡＬＰ３受容体およびインフラマソームのＡＳＣアダプターが欠損したマウスで有意に減少した（図６Ａ、６Ｂ）。さらに、尿酸結晶に対する炎症反応は、ＢＡＬへの好中球の流入の減少によって示されるように、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスにおいて、並びにＩＬ‐１Ｒａの投与後に、劇的に減少した（図６Ｃ、６Ｄ）。炎症メディエーターであるＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＫＣ、およびＴＩＭＰ‐１が（図６Ｅ〜６Ｈ）、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスにて減少した。ＭｙＤ８８欠損マウスの肺でＩＬ‐１βが有意に減少したことは（図６Ｅ）、ＴＬＲまたはＩＬ‐１８Ｒなどの共通のＭｙＤ８８アダプターを用いるその他の受容体が関与していることを示唆している。過去の研究では、尿酸結晶がＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体を活性化することが示唆されているが（３１）、また、これらの受容体が尿酸結晶誘発性の痛風性炎症に関与していないことを示す研究もある（１１）。
【００６７】
ｂ）尿酸結晶のＴＬＲ認識の役割
本発明者らは、ＴＬＲ２‐４の二重欠損が炎症を軽減したことを見出しており、このことは、最適な炎症にはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の活性の組み合わせが必要であり得ることを示している（３１）。従って、尿酸結晶誘発性の炎症は、ＴＬＲ２‐４に依存しているがＩＬ‐１８Ｒには依存していないと考えられ、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８を介してシグナルを発する。
【００６８】
実施例６：ブレオマイシンはインフラマソームＮＡＬＰ３を活性化し、肺においてＩＬ‐１β産生および炎症を引き起こす
ブレオマイシンの単一用量を鼻腔内投与すると、２４時間以内に気道の急速な炎症が誘発され、続いて１４日以内に組織リモデリングおよび肺線維症が誘発される。本発明者らは、ブレオマイシン誘発性の肺傷害がＩＬ‐１Ｒ１およびＩＬ‐１βに依存する炎症を引き起こすことを示したことから（３）、ＩＬ‐１βの放出に繋がる上流のメカニズム、特に受容体、アダプター、およびプロＩＬ‐１βをＩＬ‐１βへ開裂するシステインプロテアーゼから構成されるサイトゾル多タンパク質複合体であるインフラマソームの役割について研究した（２８）。本明細書にて、本発明者らは、ブレオマイシン投与の２４時間後、ＢＡＬＦおよび肺での好中球動員（図１０Ａおよび１０Ｂ）、炎症性ケモカインＫＣを引き寄せる好中球および炎症メディエーターＩＬ‐６の産生（図１０Ｃおよび１０Ｄ）、並びに線維症性メディエーターＩＬ‐１β（プロＩＬ‐１βプラス成熟ＩＬ‐１β）および組織メタロプロテアーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ‐１）の産生（図１０Ｅおよび１０Ｆ）が、ＮＡＬＰ３およびＡＳＣ欠損マウスで有意に減少したことを示す。この時点でのブレオマイシン誘発性の炎症は、カスパーゼ‐１欠損マウス（図１１Ａ）またはカスパーゼ‐１の阻害剤ｚ‐ＹＶＡＤ‐ｆｍｋで処理した野生型マウスでも低減し、ＢＡＬＦでの好中球動員（図１１Ｂ）、肺でのＩＬ‐１β（図１１Ｃ）、ＫＣ（図１１Ｄ）、およびＴＩＭＰ‐１（図１１Ｅ）の産生の減少を伴っていた。ブレオマイシン後の、野生型マウスの肺とＣａｓｐ‐１欠損マウスまたはカスパーゼ‐１の阻害剤ｚ‐ＹＶＡＤ‐ｆｍｋで処理した野生型マウスの肺とで測定されたＩＬ‐１βの違いは、カスパーゼ‐１プロテアーゼによるＩＬ‐１βの成熟を示していると考えられる。従って、このデータは、ＮＡＬＰ３インフラマソームがブレオマイシン肺傷害によって活性化され、ＩＬ‐１βの産生の促進、およびこれに続く炎症をもたらすことを示している。
【００６９】
実施例７：ＮＡＬＰ３インフラマソームはブレオマイシン媒介遅発型炎症および組織リモデリングにとって極めて重要である
ＮＡＬＰ３インフラマソームがブレオマイシンによって誘発される肺での遅発型炎症および組織リモデリングへ関与していることを評価するために、本発明者らは、ブレオマイシンの１回のｉ．ｎ．投与の１４日後に、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ‐９またはゼラチナーゼＡ）およびマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ‐２またはゼラチナーゼＢ）をＢＡＬＦの酵素電気泳動によって測定することで、細胞動員およびゼラチナーゼ活性を分析した。ブレオマイシンは、野生型マウスのＢＡＬＦへのリンパ球動員を促進したが、これは、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは大きく減少した（図１２Ａ）。ＭＭＰ‐９は、主として好中球によって産生されることが示され、その活性は好中球動員と関連していたが、一方ＭＭＰ２は、線維芽細胞によって産生され、線維症と関連していた（２９）。ブレオマイシン投与の１４日後、プロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）およびプロ‐ＭＭＰ‐２（７１Ｋｄ）の活性を活性化後に測定し、活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）の活性は、野生型マウスのＢＡＬＦでは上方制御されていたが、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは有意に低下していた（図１２Ｂ）。ＴＩＭＰおよびＭＭＰのバランスが線維症プロセスでは重要な因子であることから、本発明者らは、線維症への発展に特徴的なＴＩＭＰ‐１の後期の産生を分析し（２６）、ＴＩＭＰ‐１は、野生型マウスの肺ホモジネート中にて第１４日に上方制御されたが、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは減少したことを示した（図１２Ｃ）。ブレオマイシンによる全肺コラーゲン含有量の増加は、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは軽減された（図１２Ｄ）。従って、遅発型炎症および修復のプロセスは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。
【００７０】
実施例８：ブレオマイシン誘発性の炎症は尿酸によって媒介される
本発明者らは、次に、ブレオマイシン肺傷害による、ＩＬ‐１βの成熟および肺炎症を引き起こすＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化のきっかけとなる危険シグナルを課題とした。特にＮＡＬＰ３は、痛風関節炎モデルにおいて尿酸によって活性化される主たる炎症性危険受容体（danger receptor）である（１０）。尿酸が、傷害細胞から放出される主要な内在性危険シグナルとして同定されたことから、本発明者らは、尿酸が、肺傷害後の免疫の誘発において重要であり得るという仮説を立てた（１６）。本発明者らは、まず尿酸がマウスにおけるブレオマイシン誘発性の肺傷害によって放出されるかどうかを評価した。尿酸産生は、ブレオマイシン鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）の２４時間後にＢＡＬＦ（図１３Ａ）および肺（図１３Ｂ）において増加した。本発明者らは次に、マウスの気道における肺尿酸レベルの調節がＢＬＭ誘発性の炎症およびリモデリングに影響を及ぼし得るかを分析した。本発明者らは、尿酸合成を減退させるキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールのｓ．ｃ．投与が、ブレオマイシン投与による肺中の尿酸の増加を阻止したことを示した（図１３Ｂ）。アロプリノールは、ブレオマイシン誘発性の急性炎症を大きく阻害し、結果としてＢＡＬＦにおける全細胞（図１３Ｃ）および好中球の動員（図１３Ｄ）を減少させ、肺でのＫＣの産生を減少させた（図１３Ｅ）。修復プロセスに関与し線維症への発展に特徴的な線維症性サイトカインＩＬ‐１β（図１３Ｆ）およびＴＩＭＰ‐１が、アロプリノール処理によって肺（図１３Ｇ）およびＢＡＬＦ（データ省略）で減少した。さらに、本発明者らは、癌の化学療法と関連して腫瘍溶解症候群における高尿酸血症の治療に用いられるウリカーゼをマウスに投与した（１７）。尿酸を可溶性のアラントインへ迅速に分解するウリカーゼの腹腔内または鼻腔内投与もまた、ブレオマイシン誘発性の肺尿酸の増加（図１４Ａ）、好中球流入（図１４Ｂ）、および肺ＩＬ‐１β産生（１４Ｃ）を低減した。従って、ブレオマイシン誘発性の肺炎症およびリモデリングを主として媒介するのは尿酸であり、これが、傷害によって死につつある肺細胞から放出されると考えられる主たる危険シグナルであり、肺傷害による炎症を制御するための新しい標的である。
【００７１】
実施例９：ブレオマイシン誘発性の修復および線維症は尿酸によって媒介される
本発明者らは研究を広げ、尿酸合成の阻害がブレオマイシン誘発性の修復および線維症を低減するかどうかの試験を行った。アロプリノール（ｓ．ｃ．）の投与は、第８日におけるＢＡＬＦでのブレオマイシン誘発性のリンパ球および好中球の後期の動員を低減した（図１５Ａ）。ＭＭＰ‐９（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ‐２（ゼラチナーゼＢ）を酵素電気泳動で測定することにより、ゼラチナーゼ活性を評価した。ブレオマイシン投与の１４日後にＢＡＬＦで上方制御されたプロ‐ＭＭＰ‐９および活性ＭＭＰ‐２の活性は、アロプリノールまたはウリカーゼ処理によって有意に低下した（図１５Ｂ）。本発明者らは次に、ＴＩＭＰ‐１の後期の産生を分析し、ＴＩＭＰ‐１が、ブレオマイシン処理マウスの肺ホモジネート（図１５Ｃ）およびＢＡＬＦ（データ省略）で第８日に上方制御されていたが、アロプリノール投与で阻害されたことを示した。肺のアルファＩコラーゲンｍＲＮＡ含有量は、ＢＬＭ投与の１４日後に増加したが、ウリカーゼまたはアロプリノール処理によって阻害された（図１５Ｄ）。さらに、肺切片は、尿酸合成を阻害した場合、またはウリカーゼ投与後、ＢＬＭ誘発性の肺胞壁の破壊、コラーゲン沈着、および肺線維症が第１４日に有意に低減したことを示した（図１５Ｅ）。ブレオマイシンによって誘発された線維症を半定量的に評価した。肺胞隔壁の肥厚化および炎症を伴う線維症は、Ｂ６マウスと比較して、ウリカーゼまたはアロプリノールで処理したマウスにおいて有意に低減した（図１５Ｆ）。従って、炎症だけでなく修復プロセスおよび線維症も、初期のイベントと後期の病態の発症との橋渡しをする危険シグナル尿酸に依存している。
【００７２】
実施例１０：外来性尿酸が急性肺炎症およびリモデリングを引き起こす
ブレオマイシン傷害によって肺から放出される尿酸は（図１５Ａ）、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発する可能性がある。この点を確認するために、本発明者らは次に、気道への外来性尿酸の投与が類似の肺炎症を引き起こすかどうかを課題とした。鼻腔内投与された尿酸結晶は、肺胞マクロファージによって包み込まれたことが分かった（図１６Ａ）。これらは、マクロファージ、および好中球、および少量のリンパ球と共に、ＢＡＬＦ中で用量依存的な細胞動員を誘発したが（図１６Ｂ）、一方化学的および構造的に類似のアロプリノール結晶は、ＢＡＬＦへの好中球動員を僅かに引き起こしただけであった（図１６Ｃ）。炎症は一時的であり、６時間で最大に達し、第１日で低減し、第１４日に消散した（図１６Ｄ）。さらに、尿酸結晶は、初発線維症のマーカーである肺ＴＩＭＰ‐１を用量依存的に誘発し（図１６Ｅ）、これは、外来性ＩＬ‐１βを追跡して報告されたように、第１４日に基底レベルに戻ったが（データ省略）、一方ブレオマイシンの投与は、長期間にわたるＴＩＭＰ‐１の産生を誘発した（３）。ヒトとは対照的に、マウスではその機能的ウリカーゼによって迅速な尿酸の分解が起こり（３０）、肺線維症の発症には、尿酸結晶を繰り返し投与する必要があり得る。従って、尿酸結晶の局所投与は、ブレオマイシンと同様に、肺の炎症および修復を誘発する。
【００７３】
実施例１１：尿酸誘発性の急性肺炎症はインフラマソームおよびＭｙＤ８８／ＩＬ‐１Ｒ１に依存する
本発明者らは次に、ＮＡＬＰ３インフラマソームが、尿酸結晶によって誘発される肺炎症に関与しているかどうかの研究を行った。外来性尿酸結晶の投与の６時間後に誘発された急性肺好中球動員（図１７Ａおよび１７Ｃ）ならびにＩＬ‐１β産生（図１７Ｂおよび１７Ｄ）が、野生型マウスと比較して、インフラマソームＮＡＬＰ３受容体またはＡＳＣアダプターが欠損したマウスにおいて有意に低減した。さらに、尿酸結晶に対する炎症反応は、ＢＡＬＦ中の好中球流入の減少によって示されるように、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウス（図１７Ｅ）またはＩＬ‐１Ｒａの投与によるＩＬ‐１の中和後（図１７Ｆ）において、劇的に低減された。尿酸結晶によって誘発された炎症メディエーターＩＬ‐６（図１７Ｇ）およびＫＣ（図１７Ｈ）、ならびに線維症メディエーターＴＩＭＰ‐１（図１７Ｉ）は、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスの肺で減少した。ＩＬ‐１βは、ＭｙＤ８８欠損マウスの肺で有意に減少したが、ＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスの肺ではそうではなく（図１７Ｊ）、このことは、ＴＬＲまたはＩＬ‐１８Ｒなどの共通のＭｙＤ８８アダプターを用いるその他の受容体が関与している可能性を示唆している。過去の研究では、尿酸結晶がＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体を活性化することが提案されたが（３１）、一方、他の研究では、これらの受容体は尿酸結晶誘発性の炎症には関与しないことを示した（１１）。本発明者らは本明細書にて、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４が欠損したマウスが、ＩＬ‐１８Ｒ欠損マウスと同様に（図１８Ｃおよび１８Ｄ）、尿酸結晶に反応して炎症を起こしたことを示す（図１８Ａおよび１８Ｂ）。しかし、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の両方が欠損したマウスは軽減された炎症反応を示し（図１８Ａおよび１８Ｂ）、このことは、尿酸結晶に反応した最適な炎症には、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を組み合わせた作用が必要であり得ることを示している。従って、尿酸結晶誘発性の炎症は、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４に依存するが、ＩＬ‐１８Ｒには依存しておらず、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８を介してシグナルを発する。
【００７４】
本明細書にて、ブレオマイシンによって誘発される肺傷害を用いて、本発明者らは、尿酸が局所的に放出され、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化してＩＬ‐１βの産生をもたらすことの証拠を提示する。本発明者らは、ＩＬ‐１βの産生およびこれに続く炎症をもたらすブレオマイシン誘発性の肺傷害が、インフラマソームＮＡＬＰ３およびＡＳＣに依存することを示す。ブレオマイシン後、野生型マウスに対してＮＡＬＰ３欠損マウスの肺でＩＬ‐１βの部分的な減少が測定されたことは、ＮＡＬＰ３インフラマソームによるＩＬ‐１βの成熟化の直接の障害、またはいくつかの間接的な影響を表している可能性がある。確かに、ＮＡＬＰ３インフラマソームに対して独立であることが公知であるプロ‐ＩＬ‐１βの産生、インフラマソームの活性化に依存するＩＬ‐１βの成熟化、および成熟ＩＬ‐１βの分泌は、別々のプロセスであり、これによって、そのような強力な炎症性サイトカインの産生を厳密に制御することが可能となる。本発明者らは、ブレオマイシン誘発性の炎症におけるカスパーゼ‐１の持つ意味を検証し、この病態におけるＮＡＬＰ３インフラマソームの役割を確認した。本発明者らは、肺傷害の結果、恐らくはＮＡＬＰ３炎症を活性化してＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすと考えられる内在性危険シグナルとして作用する尿酸が局所的に蓄積されることを実証するものである。本明細書にて、本発明者らは、アロプリノールによるキサンチンオキシダーゼの阻害、またはウリカーゼによる尿酸の分解によって尿酸レベルを制御することにより、ブレオマイシン誘発性の肺傷害による炎症が抑止され、リモデリングおよび線維症が低減されることを示す。ウリカーゼによる処理により、尿酸の局所レベルを低下させることが炎症およびリモデリングを軽減することが確認される。炎症もそうであるが、修復プロセスおよび線維症もまた、危険シグナルである尿酸に依存しており、これは初期のイベントとさらなる病理学的発症とを繋ぐものである。本発明者らのデータは、ＮＡＬＰ３インフラマソームが尿酸によって活性化されることの証拠を提供している。ウリカーゼおよびアロプリノールがブレオマイシン誘発性の炎症および線維症を阻害するという事実は、ブレオマイシン誘発性の肺病態において尿酸が極めて重要な役割を担っていることの強い証拠を示している。
【００７５】
外来性尿酸結晶は、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、これが腹膜腔内におけるＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすことが示されている（１０、１１）。本明細書にて、本発明者らは、気道から投与された外来性尿酸結晶が、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化、ＩＬ‐１βの産生、ＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８依存性肺炎症、および線維症への発展に特徴的なＴＩＭＰ‐１発現を引き起こすことを実証する（２６）。ＩＬ‐１８Ｒ、ＴＬＲ２、およびＴＬＲ４は、外来性尿酸結晶に対する炎症には重要ではない。しかしながら、本発明者らは、死につつある細胞の気道からの投与によって肺炎症が引き起こされたことで示される様に、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の組み合わせの作用が、尿酸結晶に反応する最適な炎症に必要であることに気づいた（３４）。このＴＬＲ２またはＴＬＲ４に対する必要性はまた、同一のグループによって報告されるように（１６）、恐らくは尿酸を放出すると考えられる死につつある細胞の腹膜投与に対する反応でも示された（１５）。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、尿酸結晶の刺激によるプロ‐ＩＬ‐１βの産生に関与している可能性があり、尿酸結晶が媒介するＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化の後に成熟し得る（１０）。本発明者らのデータは、合成または代謝のレベルで尿酸産生を制御することが、慢性肺炎症、修復、および線維症の制限に特に有用であり得るという可能性を示している。実際、アロプリノールは、痛風の治療に現在用いられており、ウリカーゼは、急性痛風関節炎（３５）または高尿酸血症候群（１７）の代替療法である。自分たちのデータをまとめる試みとして、本発明者らは、図１０に示すモデルを提案する。肺細胞、恐らくは上皮細胞のブレオマイシン誘発性の傷害は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発し、肺のＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングを引き起こす。ブレオマイシン誘発性の細胞傷害は、傷害によって死につつある肺細胞から発生すると考えられる主要な危険／ストレスシグナルである尿酸の放出をもたらす。局所的な増加は、恐らくは尿酸の結晶化を誘発する。尿酸合成を抑制するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノール、または尿酸を可溶性アラントインへと迅速に分解するウリカーゼは、ブレオマイシンによる肺中の尿酸放出を阻止し、ＩＬ‐１β産生、炎症、リモデリング、および線維症を低減するが、このことは、尿酸結晶がＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、プロ‐ＩＬ‐１βの生物学的に活性なＩＬ‐１βへのプロセッシングおよび成熟化を引き起こすことを示唆している。外来性尿酸結晶の投与は、ＴＩＭＰ‐１の蓄積を伴う線維症への発展に特徴的な肺炎症およびリモデリングが誘発される。尿酸結晶によるＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の二重欠損は、尿酸結晶によるＩＬ‐１β産生および細胞流入を減じ、これらは、結晶誘発性のプロ‐ＩＬ‐１βの産生、または肺胞マクロファージおよび／または常在細胞による尿酸結晶の取り込みに関与している可能性がある。
【００７６】
従って、本発明者らの発見は、組織傷害、炎症、および肺線維症を繋げる分子メカニズムへの識見を提供するものである。
【００７７】
本発明者らの発見は、由来が未知である間質性肺線維症においてＮＡＬＰ３インフラマソームが極めて重要な役割を有することを支持するものである。本発明者らは、尿酸形成が、組織の損傷と関連する特発性肺線維症によるＮＡＬＰ３活性化において中心的な役割を果たし得る別のメカニズムを提案する。従って、尿酸の局所的蓄積は、ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラソームを活性化し、肺炎症、修復、および線維症を引き起こす内在性危険シグナルとして作用し得る。
【００７８】
これらの結果は、細胞死が局所的な尿酸産生を介してＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を引き起こし、これがＩＬ‐１β依存性の炎症に繋がることの明確な証拠を示している。さらに、アロプリノールによるキサンチンオキシダーゼの阻害またはウリカーゼによる尿酸の分解による尿酸レベルの制御が、ブレオマイシン誘発性の肺傷害による炎症およびリモデリングを抑止した。従って、尿酸は、肺傷害、ＮＡＬＰ３活性化、およびＩＬ‐１β依存性炎症の間の極めて重要なリンクであることを示している。外来性尿酸結晶は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化因子であり、ＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすことが公知である（１１、４０）。本発明者らは、本明細書にて、気道中の外来性尿酸結晶が、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化、成熟ＩＬ‐１βの産生、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８依存性肺炎症、ならびに線維症への発展の特徴であるＴＩＭＰ‐１発現を誘発することを示す。
【００７９】
これらのデータは、アロプリノールにより合成のレベルにて、または代謝のレベルにて尿酸産生を制御することが、慢性肺炎症、修復、および線維症の制限に特に有用であることを示している。アロプリノールおよびウリカーゼは、現在、痛風関節炎の臨床治療に用いられている。キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるアロプリノールおよびウリカーゼの作用モードを図９に概略的に示す。従って、尿酸レベルを治療的介入によって低下させることは、慢性肺炎症および線維症において有益であり得る。
【００８０】
最近の研究から、組織傷害が無菌性炎症を引き起こし得ることが示唆されており（１５、３７、３２）、いくつかのメディエーターが同定されている（３３、１６）。本明細書にて、ブレオマイシンによって誘発される肺傷害を用いて、本発明者らは、尿酸が局所的に産生され、ＩＬ‐１βの成熟化と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化することに関する強い証拠を初めて示した。これまでの研究では、死につつある細胞の気管内（３４）または腹腔内投与が炎症を引き起こし、これはインフラマソーム／カスパーゼ１の活性化には依存しないことを示していた（１５）。
【００８１】
結論として、成熟ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、肺の炎症、修復、および線維症を引き起こす内在性危険シグナルとして作用する尿酸が、肺傷害によって局所的に蓄積される。アロプリノールまたはウリカーゼなどのキサンチンオキシダーゼ阻害化合物によって尿酸レベルを低下させることで、間質性肺線維症を引き起こす炎症が阻害される。このことは、炎症病態において尿酸が中心的役割を有することの強い証拠であり、間質性肺線維症の新規な治療手段を開くものである。
参考文献
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療のための、特に、慢性線維症、ＣＯＰＤ、および間質性線維症などの肺炎症、ならびに自己免疫由来の肺病態を含むその他のＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための、哺乳類の尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用に関する。尿酸レベルを低下させることができる好ましい化合物は、アロプリノールなどのキサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え酵素ウリカーゼ、およびプロベネシドなどの尿酸排泄を促進することができる尿酸排泄性化合物からなる群より選択される。本発明はさらに、患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、若しくはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発達させるリスクを有するかをインビトロで同定する方法、または治療を必要とする患者においてＩＬ‐１β駆動性の肺病態を治療するための化合物のスクリーニングのための方法に関する。
【０００２】
微生物成分および細胞の損傷は、危険シグナルを提示し、自然免疫を誘発して、炎症および修復をもたらす（４）。死につつある細胞は、免疫系に警告を発して自然免疫および獲得免疫を刺激する危険シグナルを放出する（５、６）。死につつある細胞から放出される危険シグナルは、ＴＬＲなどの膜受容体（７、８、９、３９）、またはＮＬＲなどのサイトゾル受容体（１０〜１４、３６）を介して細胞レベルで認識される。傷害細胞からの核酸は急速に分解され、プリンが尿酸に変換される。プリンの異化反応生成物である尿酸は、死につつある細胞中で識別され、樹状細胞の成熟化および抗原提示機能を誘発する（１６）。大量の尿酸が、腫瘍化学療法の後に傷害組織からインビボで産生され、高尿酸血症を引き起こす（１７）。尿酸は、局所濃度が高いと析出し、臨床的痛風で見られる炎症を引き起こす結晶を形成する（５７）。尿酸結晶は、カスパーゼ‐１を含有するＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、活性インターロイキン（ＩＬ）‐１βの産生がもたらされる（１０）。
【０００３】
痛風を含む高尿酸血症候群は、尿酸産生の阻害、分解または尿排泄の促進によって効果的に治療することができる（プリン代謝を示す図９のスキームを参照）。
【０００４】
間質性肺線維症は、死を伴う呼吸不全を引き起こすことが多い急性肺傷害の再発性エピソードを伴う慢性疾患である。重要なことには、効果的な治療法が存在しない（１）。間質性肺線維症をもたらす再発性肺炎症の原因はほとんど分かっていない。しかし、汚染物質による慢性的な気道刺激、放射線照射、またはブレオマイシンによる腫瘍化学療法が、類似の線維性肺病態を引き起こす場合がある。ブレオマイシンは、実験的環境において酸化障害および細胞死を引き起こし、これが肺炎症および間質性肺線維症に類似する線維症を誘発する（２、３８）。この実験モデルでは、炎症、修復、および線維症がＩＬ‐１β産生およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８シグナル伝達に依存すること、ならびにブレオマイシン誘発性の炎症にはインフラマソーム複合体の活性化が必要であることが実証された（３）。これらの公開された知見を図１に概略し、図７に図式的に示す。
【０００５】
従って、肺炎症および肺線維症の予防および／または治療のための方法を提供するために、ＩＬ‐１βがどのようにして産生されるかを理解することが依然として望まれている。
【０００６】
これが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、本明細書でブレオマイシン誘発性の炎症がＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化に依存することを報告する。本発明者らは、本明細書で組織傷害の際に尿酸が肺の中で局所的に産生され、炎症性サイトカインＩＬ‐１βの産生を介して炎症および線維症を引き起こすことを実証した。鼻腔内の経路で与えられた尿酸結晶は、用量依存的なＮＡＬＰ３‐ＩＬ‐１Ｒ１依存性の炎症を引き起こした（図８に概略する）。
【０００８】
尿酸の代謝は十分に明らかにされており、関連する点のみを紹介する：キサンチンオキシダーゼが、ヒポキサンチンを酸化してキサンチンおよび尿酸とし、これがウリカーゼによってアラントインへと分解され、腎臓によって排出される。腎臓内では、有機アニオントランスポーター、ＵＲＡＴ１を遮断して尿細管再吸収を阻害することにより、尿酸の排出が促進される。
【０００９】
尿酸レベルを低下させる引用した各メカニズムに対して阻害剤が当業者に公知であり、そのいくつかは臨床使用されている：
例えば、
・ アロプリノールは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤であり、尿酸の形成を低減する。
・ 組換えウリカーゼは、尿酸を分解し、それによって高尿酸血症を低減する。
・ プロベネシドは、尿細管有機アニオントランスポーターを阻害し、それによって腎臓の排出を増加させる。
【００１０】
従って、尿酸レベルを低下させる治療ツールは、傷害誘発性の細胞死並びに肺炎症および肺線維症を低減するために用いることができる。
【００１１】
確かに、驚くべきことに、そして重要なことに、本発明者らは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールの投与による尿酸レベルの低下が、ＩＬ‐１β産生および肺炎症を阻害したことを実証した。加えて、組換え酵素ウリカーゼによる尿酸レベルの低下は、肺炎症に対して同等の阻害効果を有していた。
【００１２】
これは、尿酸が肺炎症および肺線維症に決定的に関与していることを示す初めての報告であり、本発明者らは、尿酸の低下がＩＬ‐１βの産生を阻害し、それによって肺の炎症および線維症が阻止されるという強い証拠を提示する。
【００１３】
細胞／組織の傷害および壊死が尿酸の産生をもたらすという事実に基づき、本発明者らは、傷害部位で形成される尿酸結晶が、インフラマソームを活性化してＩＬ‐１βを放出させ、炎症性肺病態を引き起こす重要な危険シグナルを表すのではないかという仮説を立てた（図８に図式的に示す）。
【００１４】
本発明者らは、尿酸がブレオマイシン肺傷害で放出されることを特に実証し、プロＩＬ‐１βを開裂して成熟ＩＬ‐１βとし、続いて肺の炎症および線維症を引き起こすカスパーゼ‐１の活性化をもたらすＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化に、尿酸が決定的に関与している強い証拠を提示する（図８）。
【００１５】
本発明は、ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療を意図する組成物の調製のための、哺乳類において尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、予防および／または治療を必要とする哺乳類、特にヒトにおけるＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療のための方法であって、そのような哺乳類に対して血清中の尿酸を低下させる有効量の治療化合物を投与することによる方法を含んでなる。
【発明の具体的説明】
【００１７】
好ましい態様では、前記ＩＬ‐１β駆動性肺病態は、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される。
【００１８】
好ましい慢性閉塞性肺疾患は、喘息、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、およびアレルギーを含むいずれかの炎症性肺疾患からなる群より選択される。
【００１９】
より好ましい態様では、前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態は、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症からなる群より選択される。
【００２０】
別の好ましい態様では、尿酸レベルを低下させることができる化合物は：
‐ 尿酸の産生を阻害することによって尿酸濃度を低下させることができるキサンチンオキシダーゼ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩；
‐ 尿酸のより容易に排泄されるアラントインへの変換を触媒するウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片；および、
‐ 尿酸の排泄を促進する能力を有し、腎臓の尿酸の排出を増加させる尿酸排泄性化合物、若しくは、尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤、またはそれらの薬学的に許容可能な塩、
からなる群より選択される。
【００２１】
以下からなる群より選択されるキサンチンオキシダーゼ阻害化合物がより好ましい：
‐ アロプリノール、
‐ 構造的にアロプリノールと関連する、ピラゾール［３，４‐ｄ］ピリミジン。その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Gupta et al., Eur J Med Chem. 2008; 43(4):771-80）、
‐ アザプロパゾン（３‐ジメチルアミノ‐７‐メチル‐１，２‐（ｎ‐プロピルマロニル）‐１，２‐ジヒドロ‐１，２，４‐ベンゾトリアジン二水和物（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Thiele et al.、１９８１年１２月１５日、米国特許第４，３０５，９４２号を参照）、
‐ 置換チアゾロピリミジン（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Yoshida et al.、２００７年８月７日、米国特許第７，２５３，１５４号を参照）、
‐ １位、２位、若しくは４位にて置換アルキル基で置換されていてよく、かつ、３位および５位に芳香族環を有する１，２，４‐トリアゾール化合物、その水和物、または塩（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Nakamura et al.、２００６年７月１１日、米国特許第７，０７４，８１６号を参照）、ならびに、
‐ ２‐［３‐シアノ‐４‐（２‐メチルプロポキシ）フェニル］‐４‐メチルチアゾール‐５‐カルボン酸（高尿酸血症および痛風の患者に対するアロプリノールの考え得る代替薬であり、キサンチンオキシダーゼの非プリン選択性阻害剤である、フェブキソスタット（Becker, et al., N. Engl. J. Med., Volume 353:2450-2461, 2005, Number 23）。
【００２２】
同様に、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）から抽出された尿酸オキシダーゼ（Uricozyme（商標）として知られる）などの精製されたウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、好ましくはラスブリカーゼ（サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で発現させたアスペルギルスフラバス由来の組換え尿酸オキシダーゼ）などの組換えウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片がより好ましい。
【００２３】
ウリカーゼよりも抗原性が低く、血清中尿酸濃度を迅速に低下させることができる、ペグ化ウリカーゼ（Bomalaski et al., Curr. Rheumatol. Rep 2004; 6:240-247）がより好ましい。ペグ化ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼとは、ポリ（エチレングリコール）若しくはポリ（エチレンオキシド）（共にＰＥＧと称する）と共有結合した天然または組換えウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）を示すことを意図しており、特に、平均で２〜１０のＰＥＧ鎖が各ウリカーゼサブユニットとコンジュゲート（conjugate）しており、好ましくは、ＰＥＧは約５ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を有する。得られたＰＥＧ‐ウリカーゼコンジュゲートは、実質的に非免疫原性であり、および未修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％を保持することが示された（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、２００３年６月６日公開の米国特許第６，５７６，２３５号を参照）。
【００２４】
以下からなる群より選択される尿酸排泄性化合物もまた、尿酸レベルを低下させることができるより好ましい化合物である：
‐ プロベネシド（アニオントランスポーター阻害剤である、４‐［（ジプロピルアミノ）スルホニル］安息香酸）、
‐ ベンズブロマロン（３，５‐ジブロモ‐４‐ヒドロキシフェニル‐２‐エチル‐３‐ベンゾフラニルケトン）、
‐ スルフィンピラゾン（１，２‐ジフェニル‐４‐（２‐フェニルスルフィニルエチル）ピラゾリジン‐３，５‐ジオン）、および、
‐ トロンボキサンシンターゼ阻害剤および／またはトロンボキサン受容体拮抗剤（その開示事項すべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Piraino et al.、１９９１年６月４日、米国特許第５，０２１，４４８号を参照）。
【００２５】
好ましい態様では、前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射により、または経口で投与される。
【００２６】
活性成分の１日の用量は、治療のために選択される投与経路に依存する。用量はまた、検査される患者の生物サンプル中に見られる尿酸の量にも依存するであろう。年齢、体重、ならびに治療前および／または治療中に測定された血清中、血漿中、または尿中濃度に関連して得られたデータの関数として最適用量を決定する方法が当業者に公知である。
【００２７】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、キサンチンオキシダーゼ阻害成分である活性アロプリノールまたはフェブキソスタットを、約１５００ｍｇ／ｄまで、好ましくは約１０００ｍｇ／ｇまで、約４０〜約７５０ｍｇ／ｄの１日量で、より好ましくは８０〜５００ｍｇ／ｄ、および１２０〜４００ｍｇ／ｄの範囲の１日量で、そのような病態に罹患している対象へ数日間にわたって投与してよい。
【００２８】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、経口経路での活性プロベニシド成分は、約１週間は１日２回で１００〜２５０ｍｇ、その後数週間は１日２回で２００〜５００ｍｇであってよい。
【００２９】
例えば、肺炎症、肺線維症、および自己免疫由来の肺病態などの前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防または治療のためには、活性ウリカーゼ成分を、約２ｍｇ／ｋｇ／ｄまで、好ましくは約０．７５、０．５０、および０．３５ｍｇ／ｋｇ／ｄまで、好ましくは約０．１０〜０．３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、より好ましくは約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲の１日量で、好ましくは静脈内注射によって、そのような病態に罹患している対象へ数日間にわたって投与してよい。例えば、ウリカーゼ成分は、４‐および８‐ｍｇの用量で２週間ごとに、または８‐若しくは１２‐ｍｇの用量で４週間ごとに、１２週間にわたって静脈内注射として投与してよい。血清／血漿中のウリカーゼ濃度、血清／血漿中の尿酸若しくは尿酸塩、および所望される場合は血清／血漿中の抗体抗ウリカーゼを、治療をより良く調節するために治療中に測定してよい（seng Yue et al., The Journal of Clinical Pharmacology 2008; 48:708）。当業者には、年齢、体重、ならびに前記血清／血漿中濃度に関連して得られたデータの関数として最適用量を決定する方法が公知である。
【００３０】
別の側面では、本発明は、患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発症するリスクを有するかをインビトロで同定する方法であって、以下の工程：
ａ） 検査される患者から、生体液サンプル、特に血清、血漿、または尿サンプルを採取する工程；
ｂ） 尿酸または尿酸塩のレベルを測定する工程；および
ｃ） 検査される患者について得られた尿酸レベルを、正常患者および／またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示す患者について得られた血液サンプル中の尿酸若しくは尿酸塩のレベルと比較することによって、前記患者がそのような病態を示しているか、またはそのような病態を発症するリスクを有するかを同定する工程
を含んでなる方法である。
【００３１】
好ましくは、検査される患者は、肺炎症などの肺病態の症状を示す。
【００３２】
好ましくは、生物サンプルは、血清、血漿、または尿サンプルである。
【００３３】
検査される患者から採取可能である場合は、気管支肺胞洗浄液サンプルを用いてもよい。
【００３４】
好ましくは、血清または血漿サンプル中の７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０、９０、および１００ｍｇ／Ｌの尿酸を超える尿酸コントロールの測定は、そのような肺病態を発症する、またはそのような病態を示すリスクの上昇を意味する。
【００３５】
血清または血漿サンプルなどの生体液サンプル中の尿酸を測定するための方法は、当業者に公知である。それらは、例えば、酵素ウリカーゼを用いる酵素による方法、尿酸がアルカリ性リンタングステン酸塩を還元する能力に基づく方法、またはその他の化学的比色法であってよい。これらは、現時点で尿酸または尿酸塩アッセイのために今日使用されている広範囲にわたる種々の方法である。例えば、血清中尿酸レベルを蛍光法または比色法を用いて測定することができる、バイオビジョン（バイオビジョンリサーチプロダクツ（Bio Vision Research Products）、９８０ リンダビスタアベニュー（Linda Vista Avenue），マウンテンビュー，カリフォルニア州 ９４０４３ 米国）の尿酸アッセイキット（カタログ番号Ｋ６０８‐１００）、またはモレキュラープローブズ（Molecular Probes）（２９８５１ ウイロークリークロード（Willow Creek Road），ユージーン，オレゴン州 ９７４０２，米国）のＡｍｐｌｅｘ（商標）赤色尿酸／ウリカーゼアッセイキット（Ａ２２１８１）を挙げることができる。
【００３６】
別の側面では、本発明は、ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態（「ＩＬ‐１β駆動性の肺病態」）の治療のための化合物をスクリーニングする方法であって、試験される前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、ウリカーゼ活性、若しくは尿酸オキシダーゼ活性を有するか、または尿酸排泄性化合物であるか、若しくは腎臓の尿酸の排出の増加をもたらす尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【００３７】
好ましくは、治療される前記ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態は、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される。
【００３８】
より好ましくは、治療される前記ＩＬ‐１β経路に関連する前記肺病態は、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症である。
【００３９】
本発明のその他の特徴および利点は、実施例、およびその説明が以下に示される図面により、その記載の続きに示される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症および線維症がＩＬ‐１βに依存することを示す図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、肺におけるブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生がインフラマソーム活性化に依存することを示す図である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、ブレオマイシン投与によって尿酸が肺で産生されること、およびアロプリノールによる尿酸合成の阻害が肺炎症を阻止することを示す図である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ウリカーゼによる尿酸の分解が、ブレオマイシン誘発性の肺炎症を阻害することを示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、外来性尿酸結晶が、炎症およびＩＬ‐１β産生を引き起こすことを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｈは、外来性尿酸結晶誘発性の炎症が、ＮＡＬＰ３インフラマソーム活性化に依存することを示す図である。
【図７】図７は、ブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生、炎症、および線維症に関する本発明者らの発表済みデータの図式的な概略である。
【図８】図８は、新規データ：ブレオマイシン肺傷害による肺での尿酸産生が、ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、肺炎症および線維症をもたらすことを示す図である。
【図９】図９は、尿酸の合成と代謝：アロプリノールおよび関連するキサンチンオキシダーゼ阻害剤ならびにウリカーゼによる尿酸の低下を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症およびリモデリングがＮＡＬＰ３およびＡＳＣタンパク質に依存することを示す図である。野生型、ＮＡＬＰ３、ＩＬ‐１Ｒ１、またはＡＳＣ欠損マウスにブレオマイシン（ＢＬＭ、１０ｍｇ／ｋｇ）の鼻腔内滴下（ｉ．ｎ．）滴下の２４時間後における、（Ａ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、（Ｂ）肺ホモジネート中のＭＰＯ活性、（Ｃ）ＫＣ、（Ｄ）ＩＬ‐６、（Ｅ）ＩＬ‐１β、および（Ｆ）肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１の濃度。本実験では、４回のみの戻し交配を行ったＡＳＣ−／−を、その同腹仔ＡＳＣ＋／＋と比較した。これらのデータは、Ｃ５７ＢＬ／６へ１０世代にわたり戻し交配を行ったＡＳＣ−／−で再現された。データは、４つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｅは、ブレオマイシン誘発性の炎症が、カスパーゼ‐１に依存することを示す図である。ＢＬＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｎ．滴下の２４時間後における、野生型マウス、またはカスパーゼ‐１（Ｃａｓｐ‐１）欠損マウスのＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ａ）。ＢＬＭ投与の直前、４および８時間後に、媒体、またはＣａｓｐ‐１の阻害剤Ｚ‐ｙｖａｄ‐ｆｍｋ（１０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射した野生型マウスのＢＬＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｎ．滴下の２４時間後における、ＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ｂ）、肺ホモジネート中のＩＬ‐１β（Ｃ）、ＫＣ（Ｄ）、およびＴＩＭＰ‐１（Ｅ）の濃度。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値として表される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｄは、遅発型炎症およびリモデリングがＮＡＬＰ３インフラマソームに依存することを示す図である。遅発型炎症および組織リモデリングを、野生型および欠損マウスにてブレオマイシン投与（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｎ．）の１４日後に評価した。（Ａ）ＢＡＬＦ中のリンパ球として測定した遅発型炎症。（Ｂ）ＢＡＬＦ中のプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐ＭＭＰ‐２（７１Ｋｄ）、および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）ゼラチナーゼの活性を、酵素電気泳動で分析した。（Ｃ）線維症プロセスの指標としての肺中のＴＩＭＰ‐１を、ＥＬＩＳＡで測定した。（Ｄ）肺中の全コラーゲンをＳｉｒｃｏｌアッセイによって分析した。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｇは、ブレオマイシン誘発性の炎症が尿酸合成の阻害によって低減することを示す図である。（Ａ）生理食塩水またはブレオマイシン（ＢＬＭの鼻腔内滴下（１０ｍｇ／ｋｇ）の６時間後におけるマウスのＢＡＬＦ中の尿酸レベル。（Ｂ）生理食塩水またはＢＬＭ処理の２４時間後におけるマウスの肺中の尿酸レベル。マウスは、ＢＬＭ滴下の前ならびに６および９時間後に、媒体またはアロプリノール（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射を受けた。媒体またはアロプリノールのｓ．ｃ．注射、および生理食塩水またはＢＬＭ滴下の後における、ＢＡＬＦ中の（Ｃ）全細胞カウント、ならびに（Ｄ）好中球カウント。媒体またはアロプリノールのｓ．ｃ．注射、およびＢＬＭ滴下の２４時間後における、肺中のＫＣ（Ｅ）、ＩＬ‐１β産生（Ｆ）、または２４時間後における肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１（Ｇ）産生。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ブレオマイシン誘発性の炎症が尿酸の中和によって低減することを示す図である。ＢＬＭ滴下（１０ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後における、肺中の尿酸レベル（Ａ）、ＢＡＬＦ中の好中球カウント（Ｂ）、および肺中のＩＬ‐１産生（Ｃ）。マウスは、ＢＬＭによる滴下の直前ならびに６および９時間後に、媒体またはウリカーゼ（０．２ｍｇ／ｋｇ）によるｉ．ｐ．注射を受けた。データは、４つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｆは、ブレオマイシン誘発性の修復および線維症が、尿酸によって媒介されることを示す図である。ＢＬＭ滴下（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｎ．）の０、６および９時間後に、アロプリノール（１５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）、ウリカーゼ（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、または生理食塩水を第０日に、ならびに８または１４日間にわたって１日おきに注射して、リモデリングおよび線維症を評価した。（Ａ）第８日におけるＢＡＬＦ中のリンパ球および好中球として測定した遅発型炎症。（Ｂ）酵素電気泳動により分析したプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）ゼラチナーゼの活性は、第１４日に、媒体処理マウスのＢＡＬＦ中では上方制御されたが、アロプリノールまたはウリカーゼ処理マウスのＢＡＬＦ中では、より少なかった。（Ｃ）線維症プロセスの指標としての肺中のＴＩＭＰ‐１は、ＢＬＭ投与の８日後に生理食塩水処理マウスで上方制御されたが、アロプリノール処理マウスでは上方制御されなかった。（Ｄ）ＢＬＭ投与の１４日後のウリカーゼまたはアロプリノール処理の後に、肺中のアルファ（Ｉ）コラーゲンＩ ｍＲＮＡを、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により分析した。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。（Ｅ）肺の顕微鏡切片は、生理食塩水対照マウスと比較して、ＢＬＭで処理した野生型マウスでは、第１４日にて、コラーゲン沈着を伴う広範囲の線維症領域を示した。ＢＬＭで誘発された線維症は、アロプリノールにより有意に低減した。クロモトロープアニリンブルー（ＣＡＢ）染色、２０×および２００×の拡大倍率。（Ｆ）ブレオマイシンにより誘発された傷害部を、２人の病理学者により記述した通りに半定量的に評価した（材料と方法、を参照）。肺の破壊、肺胞隔壁の肥厚、および線維症が、ウリカーゼまたはアロプリノールで処理したマウスで低減した。結果は、平均肺線維症スコア±ＳＤとして表される。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤを表す（グループあたりのマウスｎ＝６）。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｅは、外来性尿酸結晶が急性肺炎症およびリモデリングを引き起こすことを示す図である。（Ａ）肺胞マクロファージ（ＡＭ）による尿酸（ＵＡ）結晶の、ＵＡ結晶滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）の６時間後における取り込み。（Ｂ）ＢＡＬＦ中のＵＡ結晶誘発性の細胞動員の用量反応。（Ｃ）ＵＡまたはアロプリノール結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）の６時間後におけるＢＡＬＦ中の好中球カウント。（Ｄ）ＵＡ結晶滴下（１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｎ．）によるＢＡＬＦ中の細胞動員の動態。（Ｅ）用量を増加させたときのＵＡ結晶のｉ．ｎ．投与後の肺ホモジネート中のＴＩＭＰ‐１。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｊは、外来性尿酸（ＵＡ）結晶による肺炎症が、ＮＡＬＰ３インフラマソームおよびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８経路に依存することを示す図である。外来性ＵＡ結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ）の６時間後に、アナキンラ（１０ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．により前処理した、（Ａ）ＮＡＬＰ３、（Ｃ）ＡＳＣ、（Ｅ）ＩＬ‐１Ｒ１またはＭｙＤ８８の欠損マウスからのＢＡＬＦ中、および（Ｆ）野生型マウスからの、ＢＡＬＦ中の好中球カウント。野生型マウスと比較した、（Ｂ）ＮＡＬＰ３、（Ｄ）ＡＳＣ、（Ｆ）ＩＬ‐１Ｒ１またはＭｙＤ８８の欠損マウスに対する、外来性ＵＡ結晶投与の６時間後における肺ホモジネート中のＩＬ‐１β用量。野生型、またはＩＬ‐１Ｒ１若しくはＭｙＤ８８遺伝子欠損マウスへの外来性ＵＡ結晶投与の６時間後における、肺ホモジネート中の（Ｇ）ＩＬ‐６、（Ｈ）ＫＣ、（Ｉ）ＴＩＭＰ‐１およびＩＬ‐１β用量。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｄは、外来性尿酸（ＵＡ）結晶による肺炎症が、ＩＬ‐１８Ｒには依存しないが、最適な炎症にはＴＬＲ２またはＴＬＲ４が必要であることを示す図である。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ２／ＴＬＲ４欠損マウスにおける（Ａ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、および（Ｂ）肺ホモジネート中のＩＬ‐１β。ＩＬ‐１８Ｒ欠損マウスにおける（Ｃ）ＢＡＬＦ中の好中球カウント、および（Ｄ）肺ホモジネート中のＩＬ‐１β。マウスは、外来性ＵＡ結晶の滴下（１５ｍｇ／ｋｇ）の６時間後に屠殺した。データは、３つの独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される（グループあたりのマウスｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意性なし）。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ブレオマイシン誘発性の肺傷害の後（Ａ）または外来性尿酸結晶への肺の曝露後（Ｂ）における、具体的なカスケードおよびシグナル伝達経路を示す概略図である。（Ａ）本発明者らはまず、肺細胞、恐らくは上皮細胞のブレオマイシン誘発性の傷害が、肺のＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングを引き起こし、これらが、ＮＡＬＰ３受容体、ＡＳＣアダプター、およびＣａｓｐ‐１エフェクター分子に依存することを示す。第二に、発明者らは、肺へのブレオマイシン投与が、傷害によって死につつある肺細胞から発生すると考えられる危険／ストレスシグナルを表す肺での尿酸の放出を誘発することを示す。ＮＡＬＰ３タンパク質の活性化は、ＰＹＲ‐ＰＹＲおよびＣＡＲＤ‐ＣＡＲＤホモタイプ相互作用を介して相互作用を起こすことが公知であるＡＳＣおよびＣａｓｐ‐１の動員を引き起こす。局所濃度の上昇は、恐らく尿酸の結晶化を誘発する。インビボで尿酸合成を抑制するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールによる処理、または尿酸を可溶性アラントインへと迅速に分解するウリカーゼによる処理を行うことで、ブレオマイシン投与による肺中の尿酸濃度の上昇が阻止され、ＩＬ‐１β産生、炎症、リモデリング、および線維症の減少がもたらされる。（Ｂ）肺が外来性尿酸結晶へ曝露されると、ＴＩＭＰ‐１の蓄積を伴う線維症への発展に特徴的な炎症およびリモデリングが誘発される。尿酸結晶が誘発するＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。ＩＬ‐１β産生および細胞流入には、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４の存在が必要である。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４は、結晶誘発性のプロ‐ＩＬ‐１βの産生、または肺胞マクロファージおよび／または常在細胞（resident cells）による尿酸結晶の取り込みに関与している可能性がある。
【実施例】
【００４１】
実施例１：材料と方法
マウス
マウスは、販売元から購入するか、または研究所由来のものを入手し、過去の報告（３）および（４０）の通りに飼育する。動物実験はすべて、フランス政府による倫理および動物実験に関する法規制（French Government's ethical and animal experiment regulations）に従った。本研究では、以下のＭｙＤ８８（１９）、ＩＬ‐１Ｒ１（２０）、ＩＬ‐１８Ｒ（２１）、Ｃａｓｐ‐１（２２）、ＴＬＲ４（２３）、ＴＬＲ２（２４）、ＮＡＬＰ３（１０）、またはＡＳＣ（２５）の欠損マウスを用いた。４回のみの戻し交配を行ったＡＳＣ−／−をそのＡＳＣ＋／＋同腹仔と比較した図１を除き、ＭｙＤ８８−／−、Ｃａｓｐ‐１−／−、ＴＬＲ２−／−、ＡＳＣ−／− ＴＬＲ４−／−、二重欠損ＴＬＲ２−／−ＴＬＲ４−／−、およびＩＬ‐１８Ｒを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景へ１０回にわたり戻し交配を行った。ＩＬ‐１Ｒ１−／−マウスは、７回の戻し交配を行い、ＮＡＬＰ３−／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景に直接作出した。対照Ｃ５７ＢＬ／６を含むすべてのマウスは、トランスゲノス研究所（Transgenose Institute）（ＣＮＲＳ、オルレアン）の本発明者らの動物施設で飼育した。実験のために、成体動物（６〜１０週齢）を、滅菌した換気付隔離ケージで飼育した。動物実験はすべて、フランス政府による倫理および動物実験に関する法規制に従った。
【００４２】
ブレオマイシン−、尿酸またはアロプリノール結晶−誘発性の炎症
ベロンラボラトリーズ（Bellon Laboratories）（モンルージュ、フランス）製の硫酸ブレオマイシン（２００〜３００μｇまたは１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、尿酸若しくはアロプリノール結晶（１００〜１０００μｇまたは５〜５０ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、または生理食塩水単独を４０μＬの容量で、軽いケタミン‐キシラジン麻酔下で、経鼻滴下により気道を通して投与する。気管支肺胞腔中および肺中の細胞数、ケモカイン、サイトカイン、およびＴＩＭＰ‐１を、報告された通りに評価した（３）。ブレオマイシンの投与時並びに６および９時間にて、０．１ｍｌの滅菌ＮａＣｌ中の５００μｇまたは２５ｍｇ／ｋｇのアロプリノール（シグマ‐アルドリッチ）を皮下注射し、４０μＬ中の４μｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのウリカーゼ（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ、サノフィシンセラボ（Sanofi Synthelabo））を経鼻滴下によって投与した。いくつかの実験では、０．１ｍｌの滅菌ＮａＣｌ中の２００μｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ‐１Ｒａ（アナキンラ、アムジェン）を、ＭＳＵ結晶の投与時並びに２および４時間に皮下注射した。
【００４３】
‐尿酸またはアロプリノール結晶の調製
尿酸またはアロプリノール結晶は、予め７０℃に加熱し、ｐＨを７．１と７．２の間に維持するように添加された０．０１ＭのＮａＯＨへ１．６８ｍｇの粉末を溶解することで得た。この溶液をろ過し、結晶が形成するまでゆっくり連続的に攪拌した状態で室温にてインキュベートした。結晶を１００％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、オートクレーブにかけ、滅菌状態を維持した。乾燥結晶の重量を滅菌条件下にて測定し、結晶を超音波処理によってＰＢＳ中に懸濁させ、位相差顕微鏡で観察した。
【００４４】
‐肺炎症モデルの実験設計
ベロンラボラトリーズ製の硫酸ブレオマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）、尿酸若しくはアロプリノール結晶（５〜５０ｍｇ／ｋｇ）の生理食塩水、または媒体単独を、軽いケタミン‐キシラジン麻酔下で、鼻腔内滴下によって投与し、６時間後（尿酸結晶の場合）または２４時間後（ブレオマイシンの場合）に、細胞動員および特に好中球流入、ＫＣ、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１βを含むケモカインならびにサイトカインレベルを含む炎症のマーカーについて、そして１４日後に、ゼラチナーゼＭＭＰ９およびＭＭＰ２、ならびにこれらの阻害剤であるＴＩＭＰ‐１などの組織リモデリングのマーカーについて、ＢＡＬおよび肺組織のアッセイを行った。いくつかの実験では、類似の効力を有する２５ｍｇ／ｋｇのアロプリノール（シグマ‐アルドリッチ）を皮下注射し、０．２ｍｇ／ｋｇのウリカーゼ（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ、サノフィシンセラボ）を腹腔内投与または鼻腔内投与した。１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ‐１Ｒａ（アナキンラ、アムジェン）を皮下注射した。アロプリノールまたはウリカーゼの最適用量を試験し、用量を上げるよりも、繰り返し投与するほうがより効果的であった（データ省略）。
【００４５】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
気管の切除後、プラスチック製カニューレを挿入し、３７℃に加温した０．３ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて気腔を洗浄した。次に、胸郭部を緩やかにマッサージして細胞回収を最大とした。液を注意深く吸引して回収した。この手順を１０回行い、全洗浄液の回収率は９５％超であった。回収したサンプルを２つの画分に分け：第一の画分（最初の２回の洗浄に相当する１ｍｌ）はメディエーターの測定に用い、第二の画分は細胞測定に用いた（４ｍｌ）。第一の画分を遠心分離し（６００ｇ、１０分間）、上清を分別してメディエーター測定まで−８０℃で保存した。次に、細胞ペレットを０．４ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、第二の画分と共にプールし、細胞測定まで４℃で維持した。
【００４６】
肺の均質化
ＢＡＬの実施後、肺全体を摘出し、１ｍｌのＰＢＳと共にマイクロチューブ内（ライジングマトリックスＤ、Ｑバイオジーン（Q Bio Gene），イルクリッシュ（Illkrich），フランス ）に投入し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ（商標）システム（ＦＰ１２０、Ｑバイオジーン，イルクリッシュ，フランス ）を用いて全肺組織抽出物を調製し、続いてこの抽出物を遠心分離し、上清を、メディエーター測定、ＭＰＯ、またはＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（フランスバイオケムディビジョン（France Biochem Division），フランス）によるコラーゲンアッセイまで−８０℃で保存した。
【００４７】
肺中のミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）
肺組織ＭＰＯ活性を報告された通りに評価した（３）。簡潔に述べると、右心室を生理食塩水で灌流して血管内容物を洗い流し、使用するまで肺を−２０℃で凍結した。肺をポリトロンで均質化し、遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）および５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳ１ｍＬ中に再懸濁した。遠心分離に続いて、上清５０μｌを、２００μＬ ＰＢＳ‐ＨＴＡＢ‐ＥＤＴＡ、２ｍＬ ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、１００μＬ ｏ‐ジアニシジン二塩酸塩（１．２５ｍｇ／ｍＬ）、および１００μＬ Ｈ２Ｏ２ ０．０５％と共に試験管へ投入した。攪拌機中３７℃での１５分間のインキュベーションの後、１００μＬ ＮａＮ３ １％で反応を停止させた。ＭＰＯ活性を、媒体に対する４６０ｎｍでの吸光度として測定した。
【００４８】
細胞カウントおよび測定
粒子カウンター（Ｚ２コールター、ベックマンコールター（Beckman Coulter））を用いてＢＡＬ液中の全細胞カウントを測定した。メイグリュンワルド染色液（ＭＧ‐１Ｌ、シグマケミカル，セントルイス，米国）で４分間、９５％ギムザ染色液（ＧＳ‐５００、シグマケミカル，セントルイス，米国）で８分間の染色後、細胞別カウントをサイトスピンプレパラート（サイトスピン３、サーモシャンドン（Thermo Shandon））上で行った。細胞別カウントは、標準的な形態学的基準を用いて１００個の細胞で行った。
【００４９】
メディエーター測定
ＢＡＬ液中または肺ホモジネート中のＩＬ‐１β、ＫＣ、ＩＬ‐６、およびＴＩＭＰ‐１のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用い、製造元の説明書に従って測定した（マウスＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄシステム，ミネアポリス，米国）。天然および組換えマウスＩＬ‐１βに特異的であるＩＬ‐１β ＥＬＩＳＡアッセイキット（マウスＩＬ‐１β／ＩＬ‐１Ｆ２）は、組換えマウスＩＬ‐１α、ＩＬ‐１ｒａ、ＩＬ‐１ＲＩ／Ｆｃキメラ、またはＩＬ‐１ＲＩＩ／Ｆｃキメラとの交差反応性も干渉も示さなかった（マウスＩＬ‐１特異的ポリクローナルヤギＩｇＧおよびモノクローナルラットＩｇＧ１、クローン番号３０３１１）。
【００５０】
尿酸測定
気管支肺胞洗浄液中および肺ホモジネート中の尿酸濃度を、Ａｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ尿酸／ウリカーゼアッセイキット（モレキュラープローブ、ユージーン）を用いて測定した。簡潔に述べると、ウリカーゼは、尿酸の、アラントニン、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、および二酸化炭素への変換を触媒する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下、Ｈ２Ｏ２はＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬と化学量論的に反応して赤色蛍光酸化生成物であるレゾルフィンを生成し、これが分光光度測定される。
【００５１】
ＭＭＰの酵素電気泳動分析
ＭＭＰ‐２およびＭＭＰ‐９のレベルをゼラチン酵素電気泳動法で測定した。簡潔に述べると、ＢＡＬ液の非還元上清サンプル（１５μｌ）および標準液（１６１‐０３０５、バイオラッド，ハーキュリーズ，米国）を、０．１％（重量／体積）ゼラチン基材を組み込んだ７％ポリアクリルアミドゲル（重量／体積）上に充填した。ゼラチン分解バンド中のＭＭＰを、レファレンスとして組換えマウスプロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）および組換えマウスプロ‐ＭＭＰ‐２（７２Ｋｄ）を用いて評価した。タンパク質を、２０〜３０ｍＡにて３時間電気泳動にかけた。次にゲルを２．５％トリトン（体積／体積）で２回洗浄し、蒸留水で素早く３回リンスし、蒸留水中への２０分間の浸漬を３回行った。各々の異なる方法での洗浄は、ゆっくり攪拌しながら行なった。ゲルを、５０ｍＭのトリスバッファー（５ｍＭ ＣａＣｌ２および２μＭ ＺｎＣＬ２を含有）中にて３７℃で一晩インキュベートした。最後に、クーマシーブルーでゲルを染色し、続いてゲル中の溶解のバンド（酵素活性）がネガティブ染色の領域として出現するまで、徐々に脱色した。ゲル中の溶解領域をデンシトメトリーアナライザー（バイオプロフィル（Bioprofil）、ビルベールロルネ（Vilbert Lournet），マルヌラバレ（Marne la vallee），フランス）を用いて分析し、イメージを撮影し、バンド密度を測定した。ブレオマイシンによる処理後、本発明者らは、プロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）、プロ‐ＭＭＰ２（７２Ｋｄ）、および活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）の活性の上昇を観測した。これらのＭＭＰのみを定量した。
【００５２】
全肺コラーゲン測定
次に、肺ホモジネートの一部分（５０μｌ）を、肺コラーゲンレベルについて分析し、製造元の説明書に従ってＳｉｒｃｏｌコラーゲン色素結合アッセイを用い（バイオカラー（Biocolor Ltd），北アイルランド）、ウシ皮膚から調製した標準曲線と比較した。
【００５３】
アルファ‐ＩコラーゲンｍＲＮＡ測定
アルファ‐Ｉコラーゲンの定量は過去に報告されている（２６）。簡潔に述べると、凍結肺サンプルを微粉末に粉砕し、２ｍｌのトリゾール試薬中（インビトロジェンライフテクノロジー（In vitrogen Life technology），ペイズリー，英国）でホモジナイズした。激しく振とうした後、クロロホルムを添加し、サンプルを１２，０００ｇにて２０分間遠心分離した。全ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＲＮＡｓｅフリー水に溶解した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ (インビトロジェンライフテクノロジー，ペイズリー，英国)を用いてＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）および装置ＡＢＩプリズム７０００装置（パーキンエルマー、フォスターシティ，カリフォルニア州，米国）を用い、蛍光色素ＳＹＢＲグリーン法によって実施した。標的ｍＲＮＡレベルの定常状態の相対的定量を、活性レファレンスであるＧＡＰＤＨにより算出した。
【００５４】
組織学
ＢＡＬおよび肺の灌流後、標準的な顕微鏡分析のために、大葉を４％の緩衝ホルムアルデヒド中で固定した。過去の報告（３）の通りに、３μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、またはクロマトロープアニリンブルー（ＣＡＢ）で染色した。形態学的変化の激しさ（好中球および単核細胞による浸潤、肺胞隔壁の破壊および肥厚、ならびに線維症）を、数値による線維症スケール（アシュクロフトスコア（Ashcroft score））を用いて半定量的に評価した（２７）。２人の別々の観察者による平均スコアを線維症スコア（０〜８）と見なした（ＩＣ、ＢＲ）。
【００５５】
統計分析
実験グループ間の違いの統計的評価は、プリズムソフトウェアを用いたマンホイットニー検定によって行った。＜０．０５のＰ値を統計的に有意と見なした。
【００５６】
実施例２：ブレオマイシン誘発性の肺炎症および線維症はＩＬ‐１βに依存する
気道にブレオマイシンを投与すると、ＩＬ‐１β産生と共に炎症を伴う急性肺傷害、これに続く慢性炎症および線維症が引き起こされる（図１Ａ〜１Ｆ）。炎症および線維症は、ＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスでは抑止され、重要なことには、ＩＬ‐１受容体アンタゴニスト（ＩＬ‐Ｒａ）アナキンラが肺炎症を軽減したことから、ＩＬ‐１Ｒ１依存性である。病態生理学のこの部分は新規であり、発表されている（３）。
【００５７】
従って、本発明者らのデータは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症がＩＬ‐１βによって媒介されることを示している。しかし、ＩＬ‐１βがどのようにして産生されるかに関する情報は存在しない。
【００５８】
肺におけるブレオマイシン誘発性のＩＬ‐１β産生はインフラマソーム活性化に依存する
従って、本発明者らは、ＩＬ‐１βの放出を引き起こす上流のメカニズム、特にインフラマソーム、ＮＡＬＰ３受容体から構成されるサイトゾル複合体、ＡＳＣアダプター、およびプロＩＬ‐１βをＩＬ‐１βへと開裂するシステインプロテアーゼの役割について研究した（２８）。本明細書にて、本発明者らは、ＢＡＬおよび肺における好中球の動員、ならびに炎症メディエーターＫＣおよびＩＬ‐６（図２Ａ〜２Ｄ）、およびＩＬ‐１βおよび線維症性メディエーターＴＩＭＰ‐１（図２Ｅ、２Ｆ）の産生が、ＮＡＬＰ３およびＡＳＣ欠損マウスで有意に減少したことを見出す。従って、このデータは、ブレオマイシン組織傷害が起こるとＮＡＬＰ３インフラマソームが活性化され、これがＩＬ‐１βの成熟およびこれに続く炎症をもたらすことを示している。
【００５９】
実施例３：ブレオマイシンの投与で尿酸が肺で産生され、尿酸の阻害が肺炎症を阻止する
ａ）どのメディエーターがＮＡＬＰ３インフラマソーム活性化を引き起こすか、および尿酸に焦点を当てる
本発明者らは、生理食塩水と比較してブレオマイシン後に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）（図３Ａ）および肺中（図３Ｂ）の尿酸産生が高められたことを示した。
【００６０】
ｂ）尿酸レベルの阻害が炎症を低減するかどうか
第一に、本発明者らは、尿酸合成を阻害するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールの全身投与が、ブレオマイシンによる肺中の尿酸の増加を阻止したことを示した（図３Ｂ）。
【００６１】
第二に、本発明者らは、アロプリノールがブレオマイシン誘発性の炎症を大きく阻害し、結果としてＢＡＬＦ中の全細胞（図３Ｃ）および好中球動員（図３Ｄ）が減少したことを示した。
【００６２】
さらに、修復プロセスに関与し、線維症への発展に特徴的な炎症性および線維症性サイトカインＩＬ‐１βの産生、好中球ケモカインＫＣ、および組織メタロプロテアーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ‐１）の産生が、アロプリノールにより肺で減少し（図３Ｅ〜３Ｆ）、アロプリノールによりＢＡＬＦで減少した（データ省略）。
【００６３】
さらに、尿酸を可溶性のアラントインへ迅速に分解するウリカーゼによる処理もまた、ブレオマイシン誘発性の肺中の尿酸の増加（図４Ａ）、肺ＩＬ‐１β産生、および好中球流入（図４Ｂ、４Ｃ）を低減した。
【００６４】
これらのデータは、ブレオマイシン誘発性の肺炎症および修復が、尿酸によって媒介されることを示している。最も重要なことは、アロプリノールまたはウリカーゼの投与が、尿酸レベルおよび炎症を抑えるということである。従って、尿酸は、傷害の際に死につつある肺細胞から放出されると考えられる主たる危険シグナルであり、この尿酸は、肺傷害による炎症を制御するための新しい標的である。
【００６５】
実施例４：外来性尿酸結晶が炎症およびＩＬ‐１β産生を引き起こす
ブレオマイシン傷害によって肺から放出される尿酸は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発しうる。従って、本発明者らは、結晶として投与された外来性尿酸が肺炎症を引き起こし得るかを課題とした。鼻腔内投与された尿酸結晶は、気道内にて肺胞マクロファージによって包み込まれることが分かり（図５Ａ）、およびＢＡＬＦにおいて用量依存的な細胞動員を誘発したが（図示せず）、これは一時的で、マクロファージおよび好中球は６時間で最大に達し、２４時間で減少しており；ならびに、炎症は第１４日に消散した（図５Ｂ）。化学的および構造的に類似しているアロプリノール結晶は、ＢＡＬへの好中球の僅かな動員を引き起こしただけであった（図５Ｃ）。さらに、尿酸結晶は、線維症への発展に特徴な肺ＴＩＭＰ‐１発現を誘発した（図５Ｄ）。ヒトとは対照的に、マウスではその機能的ウリカーゼによって迅速な尿酸の分解が起こる可能性があり（３７）、肺線維症の発症には、尿酸を繰り返し投与する必要があり得る。これらのデータは、尿酸結晶がブレオマイシンに類似の肺での炎症および修復を誘発することを初めて示すものである。
【００６６】
実施例５：外来性尿酸結晶誘発性の炎症はＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する
ａ）ＮＡＬＰ３インフラマソームは尿酸結晶に誘発される肺炎症に関与している
外来性尿酸結晶誘発性の急性肺好中球動員およびＩＬ‐１β産生は、ＮＡＬＰ３受容体およびインフラマソームのＡＳＣアダプターが欠損したマウスで有意に減少した（図６Ａ、６Ｂ）。さらに、尿酸結晶に対する炎症反応は、ＢＡＬへの好中球の流入の減少によって示されるように、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスにおいて、並びにＩＬ‐１Ｒａの投与後に、劇的に減少した（図６Ｃ、６Ｄ）。炎症メディエーターであるＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＫＣ、およびＴＩＭＰ‐１が（図６Ｅ〜６Ｈ）、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスにて減少した。ＭｙＤ８８欠損マウスの肺でＩＬ‐１βが有意に減少したことは（図６Ｅ）、ＴＬＲまたはＩＬ‐１８Ｒなどの共通のＭｙＤ８８アダプターを用いるその他の受容体が関与していることを示唆している。過去の研究では、尿酸結晶がＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体を活性化することが示唆されているが（３１）、また、これらの受容体が尿酸結晶誘発性の痛風性炎症に関与していないことを示す研究もある（１１）。
【００６７】
ｂ）尿酸結晶のＴＬＲ認識の役割
本発明者らは、ＴＬＲ２‐４の二重欠損が炎症を軽減したことを見出しており、このことは、最適な炎症にはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の活性の組み合わせが必要であり得ることを示している（３１）。従って、尿酸結晶誘発性の炎症は、ＴＬＲ２‐４に依存しているがＩＬ‐１８Ｒには依存していないと考えられ、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８を介してシグナルを発する。
【００６８】
実施例６：ブレオマイシンはインフラマソームＮＡＬＰ３を活性化し、肺においてＩＬ‐１β産生および炎症を引き起こす
ブレオマイシンの単一用量を鼻腔内投与すると、２４時間以内に気道の急速な炎症が誘発され、続いて１４日以内に組織リモデリングおよび肺線維症が誘発される。本発明者らは、ブレオマイシン誘発性の肺傷害がＩＬ‐１Ｒ１およびＩＬ‐１βに依存する炎症を引き起こすことを示したことから（３）、ＩＬ‐１βの放出に繋がる上流のメカニズム、特に受容体、アダプター、およびプロＩＬ‐１βをＩＬ‐１βへ開裂するシステインプロテアーゼから構成されるサイトゾル多タンパク質複合体であるインフラマソームの役割について研究した（２８）。本明細書にて、本発明者らは、ブレオマイシン投与の２４時間後、ＢＡＬＦおよび肺での好中球動員（図１０Ａおよび１０Ｂ）、炎症性ケモカインＫＣを引き寄せる好中球および炎症メディエーターＩＬ‐６の産生（図１０Ｃおよび１０Ｄ）、並びに線維症性メディエーターＩＬ‐１β（プロＩＬ‐１βプラス成熟ＩＬ‐１β）および組織メタロプロテアーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ‐１）の産生（図１０Ｅおよび１０Ｆ）が、ＮＡＬＰ３およびＡＳＣ欠損マウスで有意に減少したことを示す。この時点でのブレオマイシン誘発性の炎症は、カスパーゼ‐１欠損マウス（図１１Ａ）またはカスパーゼ‐１の阻害剤ｚ‐ＹＶＡＤ‐ｆｍｋで処理した野生型マウスでも低減し、ＢＡＬＦでの好中球動員（図１１Ｂ）、肺でのＩＬ‐１β（図１１Ｃ）、ＫＣ（図１１Ｄ）、およびＴＩＭＰ‐１（図１１Ｅ）の産生の減少を伴っていた。ブレオマイシン後の、野生型マウスの肺とＣａｓｐ‐１欠損マウスまたはカスパーゼ‐１の阻害剤ｚ‐ＹＶＡＤ‐ｆｍｋで処理した野生型マウスの肺とで測定されたＩＬ‐１βの違いは、カスパーゼ‐１プロテアーゼによるＩＬ‐１βの成熟を示していると考えられる。従って、このデータは、ＮＡＬＰ３インフラマソームがブレオマイシン肺傷害によって活性化され、ＩＬ‐１βの産生の促進、およびこれに続く炎症をもたらすことを示している。
【００６９】
実施例７：ＮＡＬＰ３インフラマソームはブレオマイシン媒介遅発型炎症および組織リモデリングにとって極めて重要である
ＮＡＬＰ３インフラマソームがブレオマイシンによって誘発される肺での遅発型炎症および組織リモデリングへ関与していることを評価するために、本発明者らは、ブレオマイシンの１回のｉ．ｎ．投与の１４日後に、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ‐９またはゼラチナーゼＡ）およびマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ‐２またはゼラチナーゼＢ）をＢＡＬＦの酵素電気泳動によって測定することで、細胞動員およびゼラチナーゼ活性を分析した。ブレオマイシンは、野生型マウスのＢＡＬＦへのリンパ球動員を促進したが、これは、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは大きく減少した（図１２Ａ）。ＭＭＰ‐９は、主として好中球によって産生されることが示され、その活性は好中球動員と関連していたが、一方ＭＭＰ２は、線維芽細胞によって産生され、線維症と関連していた（２９）。ブレオマイシン投与の１４日後、プロ‐ＭＭＰ‐９（１００Ｋｄ）およびプロ‐ＭＭＰ‐２（７１Ｋｄ）の活性を活性化後に測定し、活性ＭＭＰ‐２（６５Ｋｄ）の活性は、野生型マウスのＢＡＬＦでは上方制御されていたが、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは有意に低下していた（図１２Ｂ）。ＴＩＭＰおよびＭＭＰのバランスが線維症プロセスでは重要な因子であることから、本発明者らは、線維症への発展に特徴的なＴＩＭＰ‐１の後期の産生を分析し（２６）、ＴＩＭＰ‐１は、野生型マウスの肺ホモジネート中にて第１４日に上方制御されたが、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは減少したことを示した（図１２Ｃ）。ブレオマイシンによる全肺コラーゲン含有量の増加は、ＮＡＬＰ３およびＣａｓｐ‐１欠損マウスでは軽減された（図１２Ｄ）。従って、遅発型炎症および修復のプロセスは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。
【００７０】
実施例８：ブレオマイシン誘発性の炎症は尿酸によって媒介される
本発明者らは、次に、ブレオマイシン肺傷害による、ＩＬ‐１βの成熟および肺炎症を引き起こすＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化のきっかけとなる危険シグナルを課題とした。特にＮＡＬＰ３は、痛風関節炎モデルにおいて尿酸によって活性化される主たる炎症性危険受容体（danger receptor）である（１０）。尿酸が、傷害細胞から放出される主要な内在性危険シグナルとして同定されたことから、本発明者らは、尿酸が、肺傷害後の免疫の誘発において重要であり得るという仮説を立てた（１６）。本発明者らは、まず尿酸がマウスにおけるブレオマイシン誘発性の肺傷害によって放出されるかどうかを評価した。尿酸産生は、ブレオマイシン鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）の２４時間後にＢＡＬＦ（図１３Ａ）および肺（図１３Ｂ）において増加した。本発明者らは次に、マウスの気道における肺尿酸レベルの調節がＢＬＭ誘発性の炎症およびリモデリングに影響を及ぼし得るかを分析した。本発明者らは、尿酸合成を減退させるキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノールのｓ．ｃ．投与が、ブレオマイシン投与による肺中の尿酸の増加を阻止したことを示した（図１３Ｂ）。アロプリノールは、ブレオマイシン誘発性の急性炎症を大きく阻害し、結果としてＢＡＬＦにおける全細胞（図１３Ｃ）および好中球の動員（図１３Ｄ）を減少させ、肺でのＫＣの産生を減少させた（図１３Ｅ）。修復プロセスに関与し線維症への発展に特徴的な線維症性サイトカインＩＬ‐１β（図１３Ｆ）およびＴＩＭＰ‐１が、アロプリノール処理によって肺（図１３Ｇ）およびＢＡＬＦ（データ省略）で減少した。さらに、本発明者らは、癌の化学療法と関連して腫瘍溶解症候群における高尿酸血症の治療に用いられるウリカーゼをマウスに投与した（１７）。尿酸を可溶性のアラントインへ迅速に分解するウリカーゼの腹腔内または鼻腔内投与もまた、ブレオマイシン誘発性の肺尿酸の増加（図１４Ａ）、好中球流入（図１４Ｂ）、および肺ＩＬ‐１β産生（１４Ｃ）を低減した。従って、ブレオマイシン誘発性の肺炎症およびリモデリングを主として媒介するのは尿酸であり、これが、傷害によって死につつある肺細胞から放出されると考えられる主たる危険シグナルであり、肺傷害による炎症を制御するための新しい標的である。
【００７１】
実施例９：ブレオマイシン誘発性の修復および線維症は尿酸によって媒介される
本発明者らは研究を広げ、尿酸合成の阻害がブレオマイシン誘発性の修復および線維症を低減するかどうかの試験を行った。アロプリノール（ｓ．ｃ．）の投与は、第８日におけるＢＡＬＦでのブレオマイシン誘発性のリンパ球および好中球の後期の動員を低減した（図１５Ａ）。ＭＭＰ‐９（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ‐２（ゼラチナーゼＢ）を酵素電気泳動で測定することにより、ゼラチナーゼ活性を評価した。ブレオマイシン投与の１４日後にＢＡＬＦで上方制御されたプロ‐ＭＭＰ‐９および活性ＭＭＰ‐２の活性は、アロプリノールまたはウリカーゼ処理によって有意に低下した（図１５Ｂ）。本発明者らは次に、ＴＩＭＰ‐１の後期の産生を分析し、ＴＩＭＰ‐１が、ブレオマイシン処理マウスの肺ホモジネート（図１５Ｃ）およびＢＡＬＦ（データ省略）で第８日に上方制御されていたが、アロプリノール投与で阻害されたことを示した。肺のアルファＩコラーゲンｍＲＮＡ含有量は、ＢＬＭ投与の１４日後に増加したが、ウリカーゼまたはアロプリノール処理によって阻害された（図１５Ｄ）。さらに、肺切片は、尿酸合成を阻害した場合、またはウリカーゼ投与後、ＢＬＭ誘発性の肺胞壁の破壊、コラーゲン沈着、および肺線維症が第１４日に有意に低減したことを示した（図１５Ｅ）。ブレオマイシンによって誘発された線維症を半定量的に評価した。肺胞隔壁の肥厚化および炎症を伴う線維症は、Ｂ６マウスと比較して、ウリカーゼまたはアロプリノールで処理したマウスにおいて有意に低減した（図１５Ｆ）。従って、炎症だけでなく修復プロセスおよび線維症も、初期のイベントと後期の病態の発症との橋渡しをする危険シグナル尿酸に依存している。
【００７２】
実施例１０：外来性尿酸が急性肺炎症およびリモデリングを引き起こす
ブレオマイシン傷害によって肺から放出される尿酸は（図１５Ａ）、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発する可能性がある。この点を確認するために、本発明者らは次に、気道への外来性尿酸の投与が類似の肺炎症を引き起こすかどうかを課題とした。鼻腔内投与された尿酸結晶は、肺胞マクロファージによって包み込まれたことが分かった（図１６Ａ）。これらは、マクロファージ、および好中球、および少量のリンパ球と共に、ＢＡＬＦ中で用量依存的な細胞動員を誘発したが（図１６Ｂ）、一方化学的および構造的に類似のアロプリノール結晶は、ＢＡＬＦへの好中球動員を僅かに引き起こしただけであった（図１６Ｃ）。炎症は一時的であり、６時間で最大に達し、第１日で低減し、第１４日に消散した（図１６Ｄ）。さらに、尿酸結晶は、初発線維症のマーカーである肺ＴＩＭＰ‐１を用量依存的に誘発し（図１６Ｅ）、これは、外来性ＩＬ‐１βを追跡して報告されたように、第１４日に基底レベルに戻ったが（データ省略）、一方ブレオマイシンの投与は、長期間にわたるＴＩＭＰ‐１の産生を誘発した（３）。ヒトとは対照的に、マウスではその機能的ウリカーゼによって迅速な尿酸の分解が起こり（３０）、肺線維症の発症には、尿酸結晶を繰り返し投与する必要があり得る。従って、尿酸結晶の局所投与は、ブレオマイシンと同様に、肺の炎症および修復を誘発する。
【００７３】
実施例１１：尿酸誘発性の急性肺炎症はインフラマソームおよびＭｙＤ８８／ＩＬ‐１Ｒ１に依存する
本発明者らは次に、ＮＡＬＰ３インフラマソームが、尿酸結晶によって誘発される肺炎症に関与しているかどうかの研究を行った。外来性尿酸結晶の投与の６時間後に誘発された急性肺好中球動員（図１７Ａおよび１７Ｃ）ならびにＩＬ‐１β産生（図１７Ｂおよび１７Ｄ）が、野生型マウスと比較して、インフラマソームＮＡＬＰ３受容体またはＡＳＣアダプターが欠損したマウスにおいて有意に低減した。さらに、尿酸結晶に対する炎症反応は、ＢＡＬＦ中の好中球流入の減少によって示されるように、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウス（図１７Ｅ）またはＩＬ‐１Ｒａの投与によるＩＬ‐１の中和後（図１７Ｆ）において、劇的に低減された。尿酸結晶によって誘発された炎症メディエーターＩＬ‐６（図１７Ｇ）およびＫＣ（図１７Ｈ）、ならびに線維症メディエーターＴＩＭＰ‐１（図１７Ｉ）は、ＭｙＤ８８およびＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスの肺で減少した。ＩＬ‐１βは、ＭｙＤ８８欠損マウスの肺で有意に減少したが、ＩＬ‐１Ｒ１欠損マウスの肺ではそうではなく（図１７Ｊ）、このことは、ＴＬＲまたはＩＬ‐１８Ｒなどの共通のＭｙＤ８８アダプターを用いるその他の受容体が関与している可能性を示唆している。過去の研究では、尿酸結晶がＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体を活性化することが提案されたが（３１）、一方、他の研究では、これらの受容体は尿酸結晶誘発性の炎症には関与しないことを示した（１１）。本発明者らは本明細書にて、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４が欠損したマウスが、ＩＬ‐１８Ｒ欠損マウスと同様に（図１８Ｃおよび１８Ｄ）、尿酸結晶に反応して炎症を起こしたことを示す（図１８Ａおよび１８Ｂ）。しかし、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の両方が欠損したマウスは軽減された炎症反応を示し（図１８Ａおよび１８Ｂ）、このことは、尿酸結晶に反応した最適な炎症には、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を組み合わせた作用が必要であり得ることを示している。従って、尿酸結晶誘発性の炎症は、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４に依存するが、ＩＬ‐１８Ｒには依存しておらず、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８を介してシグナルを発する。
【００７４】
本明細書にて、ブレオマイシンによって誘発される肺傷害を用いて、本発明者らは、尿酸が局所的に放出され、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化してＩＬ‐１βの産生をもたらすことの証拠を提示する。本発明者らは、ＩＬ‐１βの産生およびこれに続く炎症をもたらすブレオマイシン誘発性の肺傷害が、インフラマソームＮＡＬＰ３およびＡＳＣに依存することを示す。ブレオマイシン後、野生型マウスに対してＮＡＬＰ３欠損マウスの肺でＩＬ‐１βの部分的な減少が測定されたことは、ＮＡＬＰ３インフラマソームによるＩＬ‐１βの成熟化の直接の障害、またはいくつかの間接的な影響を表している可能性がある。確かに、ＮＡＬＰ３インフラマソームに対して独立であることが公知であるプロ‐ＩＬ‐１βの産生、インフラマソームの活性化に依存するＩＬ‐１βの成熟化、および成熟ＩＬ‐１βの分泌は、別々のプロセスであり、これによって、そのような強力な炎症性サイトカインの産生を厳密に制御することが可能となる。本発明者らは、ブレオマイシン誘発性の炎症におけるカスパーゼ‐１の持つ意味を検証し、この病態におけるＮＡＬＰ３インフラマソームの役割を確認した。本発明者らは、肺傷害の結果、恐らくはＮＡＬＰ３炎症を活性化してＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすと考えられる内在性危険シグナルとして作用する尿酸が局所的に蓄積されることを実証するものである。本明細書にて、本発明者らは、アロプリノールによるキサンチンオキシダーゼの阻害、またはウリカーゼによる尿酸の分解によって尿酸レベルを制御することにより、ブレオマイシン誘発性の肺傷害による炎症が抑止され、リモデリングおよび線維症が低減されることを示す。ウリカーゼによる処理により、尿酸の局所レベルを低下させることが炎症およびリモデリングを軽減することが確認される。炎症もそうであるが、修復プロセスおよび線維症もまた、危険シグナルである尿酸に依存しており、これは初期のイベントとさらなる病理学的発症とを繋ぐものである。本発明者らのデータは、ＮＡＬＰ３インフラマソームが尿酸によって活性化されることの証拠を提供している。ウリカーゼおよびアロプリノールがブレオマイシン誘発性の炎症および線維症を阻害するという事実は、ブレオマイシン誘発性の肺病態において尿酸が極めて重要な役割を担っていることの強い証拠を示している。
【００７５】
外来性尿酸結晶は、ＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、これが腹膜腔内におけるＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすことが示されている（１０、１１）。本明細書にて、本発明者らは、気道から投与された外来性尿酸結晶が、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化、ＩＬ‐１βの産生、ＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８依存性肺炎症、および線維症への発展に特徴的なＴＩＭＰ‐１発現を引き起こすことを実証する（２６）。ＩＬ‐１８Ｒ、ＴＬＲ２、およびＴＬＲ４は、外来性尿酸結晶に対する炎症には重要ではない。しかしながら、本発明者らは、死につつある細胞の気道からの投与によって肺炎症が引き起こされたことで示される様に、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の組み合わせの作用が、尿酸結晶に反応する最適な炎症に必要であることに気づいた（３４）。このＴＬＲ２またはＴＬＲ４に対する必要性はまた、同一のグループによって報告されるように（１６）、恐らくは尿酸を放出すると考えられる死につつある細胞の腹膜投与に対する反応でも示された（１５）。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、尿酸結晶の刺激によるプロ‐ＩＬ‐１βの産生に関与している可能性があり、尿酸結晶が媒介するＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化の後に成熟し得る（１０）。本発明者らのデータは、合成または代謝のレベルで尿酸産生を制御することが、慢性肺炎症、修復、および線維症の制限に特に有用であり得るという可能性を示している。実際、アロプリノールは、痛風の治療に現在用いられており、ウリカーゼは、急性痛風関節炎（３５）または高尿酸血症候群（１７）の代替療法である。自分たちのデータをまとめる試みとして、本発明者らは、図１０に示すモデルを提案する。肺細胞、恐らくは上皮細胞のブレオマイシン誘発性の傷害は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を誘発し、肺のＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングを引き起こす。ブレオマイシン誘発性の細胞傷害は、傷害によって死につつある肺細胞から発生すると考えられる主要な危険／ストレスシグナルである尿酸の放出をもたらす。局所的な増加は、恐らくは尿酸の結晶化を誘発する。尿酸合成を抑制するキサンチンオキシダーゼ阻害剤アロプリノール、または尿酸を可溶性アラントインへと迅速に分解するウリカーゼは、ブレオマイシンによる肺中の尿酸放出を阻止し、ＩＬ‐１β産生、炎症、リモデリング、および線維症を低減するが、このことは、尿酸結晶がＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、プロ‐ＩＬ‐１βの生物学的に活性なＩＬ‐１βへのプロセッシングおよび成熟化を引き起こすことを示唆している。外来性尿酸結晶の投与は、ＴＩＭＰ‐１の蓄積を伴う線維症への発展に特徴的な肺炎症およびリモデリングが誘発される。尿酸結晶によるＩＬ‐１β産生、炎症、およびリモデリングは、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の二重欠損は、尿酸結晶によるＩＬ‐１β産生および細胞流入を減じ、これらは、結晶誘発性のプロ‐ＩＬ‐１βの産生、または肺胞マクロファージおよび／または常在細胞による尿酸結晶の取り込みに関与している可能性がある。
【００７６】
従って、本発明者らの発見は、組織傷害、炎症、および肺線維症を繋げる分子メカニズムへの識見を提供するものである。
【００７７】
本発明者らの発見は、由来が未知である間質性肺線維症においてＮＡＬＰ３インフラマソームが極めて重要な役割を有することを支持するものである。本発明者らは、尿酸形成が、組織の損傷と関連する特発性肺線維症によるＮＡＬＰ３活性化において中心的な役割を果たし得る別のメカニズムを提案する。従って、尿酸の局所的蓄積は、ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラソームを活性化し、肺炎症、修復、および線維症を引き起こす内在性危険シグナルとして作用し得る。
【００７８】
これらの結果は、細胞死が局所的な尿酸産生を介してＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化を引き起こし、これがＩＬ‐１β依存性の炎症に繋がることの明確な証拠を示している。さらに、アロプリノールによるキサンチンオキシダーゼの阻害またはウリカーゼによる尿酸の分解による尿酸レベルの制御が、ブレオマイシン誘発性の肺傷害による炎症およびリモデリングを抑止した。従って、尿酸は、肺傷害、ＮＡＬＰ３活性化、およびＩＬ‐１β依存性炎症の間の極めて重要なリンクであることを示している。外来性尿酸結晶は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化因子であり、ＩＬ‐１β依存性炎症を引き起こすことが公知である（１１、４０）。本発明者らは、本明細書にて、気道中の外来性尿酸結晶が、ＮＡＬＰ３インフラマソームの活性化、成熟ＩＬ‐１βの産生、およびＩＬ‐１Ｒ１／ＭｙＤ８８依存性肺炎症、ならびに線維症への発展の特徴であるＴＩＭＰ‐１発現を誘発することを示す。
【００７９】
これらのデータは、アロプリノールにより合成のレベルにて、または代謝のレベルにて尿酸産生を制御することが、慢性肺炎症、修復、および線維症の制限に特に有用であることを示している。アロプリノールおよびウリカーゼは、現在、痛風関節炎の臨床治療に用いられている。キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるアロプリノールおよびウリカーゼの作用モードを図９に概略的に示す。従って、尿酸レベルを治療的介入によって低下させることは、慢性肺炎症および線維症において有益であり得る。
【００８０】
最近の研究から、組織傷害が無菌性炎症を引き起こし得ることが示唆されており（１５、３７、３２）、いくつかのメディエーターが同定されている（３３、１６）。本明細書にて、ブレオマイシンによって誘発される肺傷害を用いて、本発明者らは、尿酸が局所的に産生され、ＩＬ‐１βの成熟化と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化することに関する強い証拠を初めて示した。これまでの研究では、死につつある細胞の気管内（３４）または腹腔内投与が炎症を引き起こし、これはインフラマソーム／カスパーゼ１の活性化には依存しないことを示していた（１５）。
【００８１】
結論として、成熟ＩＬ‐１βの産生と共にＮＡＬＰ３インフラマソームを活性化し、肺の炎症、修復、および線維症を引き起こす内在性危険シグナルとして作用する尿酸が、肺傷害によって局所的に蓄積される。アロプリノールまたはウリカーゼなどのキサンチンオキシダーゼ阻害化合物によって尿酸レベルを低下させることで、間質性肺線維症を引き起こす炎症が阻害される。このことは、炎症病態において尿酸が中心的役割を有することの強い証拠であり、間質性肺線維症の新規な治療手段を開くものである。
参考文献
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療を意図する組成物の調製のための、哺乳類において尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用。
【請求項２】
前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態が、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態が、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、ウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、若しくはそれらの機能断片、または、尿酸排泄性化合物若しくは腎臓による尿酸排出を増加させる尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記キサンチンオキシダーゼ阻害化合物が、アロプリノール、アザプロパゾン（３‐ジメチルアミノ‐７‐メチル‐１，２‐（ｎ‐プロピルマロニル）‐１，２‐ジヒドロ‐１，２，４‐ベンゾトリアジン二水和物、置換チアゾロピリミジン、１位、２位、若しくは４位にて置換アルキル基で置換されていてよく、かつ、３位および５位に芳香族環を有する１，２，４‐トリアゾール化合物、フェブキソスタット、またはそれらの水和物若しくは塩からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼが、ラスブリカーゼなどの組換えウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼがペグ化されている、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記の尿酸排泄性化合物若しくは腎臓による尿酸の排出を増加させる尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤が、プロベネシド、ベンズブロマロン、スルフィンピラゾン、トロンボキサンシンターゼ阻害剤および／またはトロンボキサン受容体拮抗剤からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、静脈内注射、筋肉内注射、または経口によって投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発症するリスクを有するかをインビトロで同定する方法であって、以下の工程：
ａ） 検査される患者から、血清または血漿サンプルを採取する工程；
ｂ） 尿酸のレベルを測定する工程；および
ｃ） 検査される患者について得られた尿酸レベルを、正常患者および／またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示す患者について得られた血液サンプル中の尿酸レベルと比較することによって、前記患者がそのような病態を示しているか、またはそのような病態を発症するリスクを有するかを同定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態（「ＩＬ‐１β駆動性の肺病態」）の治療のための化合物をスクリーニングする方法であって、試験される前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、ウリカーゼ活性、若しくは尿酸オキシダーゼ活性を有するかどうか、または尿酸排泄性化合物であるか、若しくは尿酸の腎臓による排出の増加をもたらす尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１】
ＩＬ‐１β駆動性の肺病態の予防および／または治療を意図する組成物の調製のための、哺乳類において尿酸レベルを低下させることができる化合物の使用。
【請求項２】
前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態が、肺炎症、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および間質性線維症などの肺線維症、ならびに自己免疫由来の肺病態からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩＬ‐１β駆動性の肺病態が、線維症および呼吸不全を引き起こす肺炎症である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、ウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、若しくはそれらの機能断片、または、尿酸排泄性化合物若しくは腎臓による尿酸排出を増加させる尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記キサンチンオキシダーゼ阻害化合物が、アロプリノール、アザプロパゾン（３‐ジメチルアミノ‐７‐メチル‐１，２‐（ｎ‐プロピルマロニル）‐１，２‐ジヒドロ‐１，２，４‐ベンゾトリアジン二水和物、置換チアゾロピリミジン、１位、２位、若しくは４位にて置換アルキル基で置換されていてよく、かつ、３位および５位に芳香族環を有する１，２，４‐トリアゾール化合物、フェブキソスタット、またはそれらの水和物若しくは塩からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼが、ラスブリカーゼなどの組換えウリカーゼ若しくは尿酸オキシダーゼ、またはそれらの機能断片である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記ウリカーゼまたは尿酸オキシダーゼがペグ化されている、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記の尿酸排泄性化合物若しくは腎臓による尿酸の排出を増加させる尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤が、プロベネシド、ベンズブロマロン、スルフィンピラゾン、トロンボキサンシンターゼ阻害剤および／またはトロンボキサン受容体拮抗剤からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、静脈内注射、筋肉内注射、または経口によって投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
患者がＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示しているか、またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を発症するリスクを有するかをインビトロで同定する方法であって、以下の工程：
ａ） 検査される患者から、血清または血漿サンプルを採取する工程；
ｂ） 尿酸のレベルを測定する工程；および
ｃ） 検査される患者について得られた尿酸レベルを、正常患者および／またはＩＬ‐１β駆動性の肺病態を示す患者について得られた血液サンプル中の尿酸レベルと比較することによって、前記患者がそのような病態を示しているか、またはそのような病態を発症するリスクを有するかを同定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
ＩＬ‐１β経路に関連する肺病態（「ＩＬ‐１β駆動性の肺病態」）の治療のための化合物をスクリーニングする方法であって、試験される前記化合物が、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、ウリカーゼ活性、若しくは尿酸オキシダーゼ活性を有するかどうか、または尿酸排泄性化合物であるか、若しくは尿酸の腎臓による排出の増加をもたらす尿細管有機アニオントランスポーターの阻害剤であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｆ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１７Ｇ】
【図１７Ｈ】
【図１７Ｉ】
【図１７Ｊ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１５Ｅ】
【図１６Ａ】
【図１９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｆ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１７Ｇ】
【図１７Ｈ】
【図１７Ｉ】
【図１７Ｊ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１５Ｅ】
【図１６Ａ】
【図１９】
【公表番号】特表２０１２−５０２９６２（Ｐ２０１２−５０２９６２Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７３４２（Ｐ２０１１−５２７３４２）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６２１５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１８５９
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６２１５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１８５９
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]