関節病を治療するためのＰＡＫ阻害剤の使用
本発明は、関節病、例えば変形性関節症またはリウマチ様関節炎を治療するための、または、関節痛を治療するための、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用、および、関節病を治療するための医薬品としてのＰＡＫ阻害剤を発見するための標的タンパク質としての、ＰＡＫの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症またはリウマチ様関節炎のような関節病を治療するための、または関節痛を治療するためのｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用、および、ＰＡＫの、関節病の治療のための医薬品としてのＰＡＫ阻害剤を発見するための標的タンパク質としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋において、人間の最もありふれた身体障害状態は、変形性関節症である。人々の加齢のために、我々は、増加の一途をたどる患者群と直面しなければならず、彼等の生活の質はひどく影響を受けている。加えて、この病気は、高い直接的および間接的なコストを伴う莫大な社会経済的な重荷を含む。現在の治療法は、変形性関節症に関連する痛みの制御に注意を向けているが、それでもなお、我々にとって、病気の経過を遅くする、停止させる、または、元に戻すことも可能な薬理学的な治療法がまったく欠落している。
【０００３】
変形性関節症は、滑膜性の連結の構造的および機能的な破損を引き起こす各種障害の臨床的および病理学的な結果とみなすことができる。変形性関節症は、関節組織の破壊と修復との動的平衡が崩れた場合に発生する。関節の軟骨の構造的な破損は、健康な軟骨を傷つける異常な機械的歪、同様に、生理学的な機械的歪の影響下で変性する病理学的に機能が損なわれた軟骨の破損に起因する可能性がある。変形性関節症で観察された形態学的な変化としては、軟骨のびらん、同様に、様々な程度の滑膜の炎症が挙げられる。これらの変化の原因は、軟骨の高分子の破壊を引き起こすタンパク質分解酵素などの生化学的要因の複雑なネットワークにある。活性化滑膜細胞、単核細胞または関節の軟骨そのものによって生産されるＩＬ−１およびＴＮＦαのようなサイトカインは、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、および、サイトカイン遺伝子発現を著しくアップレギュレートし、代償的な合成経路を鈍らせる。例えば、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）経路を介したシグナル伝達による、ＩＬ−１および／またはＴＮＦαによるＡＰ１−転写因子複合体の活性化は、変形性関節症に関連するマーカー遺伝子の発現の調節に重要な役割を果たす。
【０００４】
炎症性の痛みの、軟骨の代謝と形成に関与するさらなる生化学的な要因は、ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）である。ＰＧＥ２とは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１および−２によって合成されたエイコサノイドのことであり、これは、ＩＬ−１介在プロテオグリカン分解に関与しており、ＰＧＥ２を意識のあるラットまたはマウスに投与すると、痛覚過敏を誘発する。ヒトの変形性関節症の関節において、ＩＬ−１βの内因性発現により、ＣＯＸ−２の誘導が引き起こされる。
【０００５】
従って、変形性関節症は、関節の軟骨の進行の遅い変性を特徴とする。変形性関節症の正確な原因論はまだわかっていないが、一般的に、軟骨基質成分の分解は、細胞外プロテイナーゼ、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ、および、変性性のプロセスを増幅させるサイトカインの大量の合成と活性化による事象と一致する。変形性関節症を治療するための新規のアプローチが必要であり、軟骨の障害に関する生物学の理解を進めることにより、軟骨の修復を刺激するか、軟骨基質の破壊を阻害する産物を生産する遺伝子の使用をもたらした。数種の研究により、例えば、変形性関節症における構造変化の進行を遅くする手段として、ＩＬ−１活性を調節することの可能性のある重要性が説明されている。
【０００６】
それゆえに、本発明の目的は、軟骨に害を与える要因の作用を回避または減少させるための新しい治療法を見出すことである。
【０００７】
驚くべきことに、変形性関節症に関連するマーカー遺伝子発現のアップレギュレーションを引き起こすシグナル伝達経路の、ＩＬ−１によって誘導された活性化の重要な媒介物質として、ＰＡＫ、特にＰＡＫ１が同定された。
【０００８】
ＰＡＫ１は、細胞の形態形成、運動性、生存、有糸分裂および血管新生などの多種多様な細胞機能に重要なセリン／スレオニンキナーゼの進化上保存されたファミリーの構成要素の一つである。ＰＡＫは、Ｓｔｅ２０プロテインキナーゼの大規模なファミリーに属する。Ｓｔｅ２０ｐは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における交配経路に関与する推定上の酵母のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ４Ｋ）である。哺乳動物、ショウジョウバエ、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびその他の生物におけるそのホモログは、ヒトにおけるホモログの構成員も含む大規模な新しいプロテインキナーゼのグループを構成する。Ｓｔｅ２０グループのキナーゼはさらに、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）と、胚中心のキナーゼ（ＧＣＫ）ファミリーに分類される。これらは、保存されたキナーゼドメインと、キナーゼと様々なシグナル伝達分子および細胞骨格の調節タンパク質とを相互作用させる大きな構造的多様性を有する非触媒領域の存在を特徴とする。
【０００９】
数種の文献により、哺乳動物細胞におけるＭＡＰＫ活性の調節におけるＰＡＫの役割が説明されている（例えば、Ｄａｎ，Ｃ．等（２００２年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２２，５６７〜５７７を参照）。ＭＡＰＫカスケードは、多様な細胞性の事象、細胞外の刺激、例えば成長因子、サイトカインおよび環境ストレスからのシグナル伝達において重要であり、それにより、転写因子を活性化し、遺伝子発現の調節が起こる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．およびＬａｐａｄａｔ，Ｒ．（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９８，１９１１〜１９１２）。シグナル伝達は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ）およびＭＡＰＫからなる三重のキナーゼ単位の直線状の連続的なリン酸化が介在する。三重のキナーゼ単位およびその活性化メカニズムは、酵母から哺乳動物への真核性の進化において高度に保存されている。
【００１０】
哺乳動物細胞において、ＰＡＫは、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１の下流エフェクターの標的と同定されており、ＧＴＰアーゼがＰａｋ１へ結合することにより、そのキナーゼ活性が自己リン酸化によって刺激される。ＰＡＫは、活性化された（ＧＴＰ結合）ｐ２１と特異的に複合体を形成し、ｐ２１ＧＴＰアーゼ活性を阻害し、キナーゼの自己リン酸化と活性化を起こす。ＰＡＫファミリーキナーゼは、酵母からヒトに至るまで保存されており、これは、Ｃｄｃ４２またはＲａｃ１によって、保存されたＮ末端モチーフ（ＰＡＫの残基７１〜１３７に対応する）との相互作用を介して直接的に活性化される。自己リン酸化されたキナーゼは、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１の親和性を減少させ、さらなる刺激性の活性、または、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質によるダウンレギュレーションのためにｐ２１を遊離させる（Ｍａｎｓｅｒ，Ｅ．等（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ，３６７，４０〜４６）。Ｒａｃ１やＣｄｃ４２に加えて、新たに同定されたＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのホモログ（例えばＷｒｃｈ−１およびＣｈｐ）もまた、ＰＡＫを活性化し、糸状仮足の形成とストレスファイバー溶解を誘導することができる（Ａｒｏｎｈｅｉｍ，Ａ．等（１９９８年）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８，１１２５〜１１２８）。グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、および、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）は、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのＧＴＰ−ＧＤＰ結合状態を調節するものであり、これらは、ＰＡＫ１キナーゼによって活性化される下流のシグナル伝達の重要な決定因子である（Ｚｈｏｕ，Ｋ．等（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６７８２〜１６７８６）。
【００１１】
配列番号１および２に、ＰＡＫ１の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｃｄｃ４２およびＲａｃへの強固な結合に必要なＰＡＫ１の配列が、短縮されたフラグメント、および、部位特異的突然変異体の特性を解析すること、同様に、Ｃｄｃ４２とＷＡＳＰの相同セグメントとの複合体の解離構造を決定することによって研究されている（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．等（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９０７１〜２９０７４；Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．Ｇ．等（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１８０６７〜１８０７６；Ａｂｄｕｌ−Ｍａｎａｎ，Ｎ．等（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ，３９９，３７９〜３８３）。ＰＡＫ１のＰＢＤ（ｐ２１結合ドメイン）とオーバーラップするが完全一致ではない部分は、自己阻害に関与するセグメントである（Ｚｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１８，２１５３〜２１６３；Ｌｅｉ，Ｍ．等（２０００年）Ｃｅｌｌ，１０２，３８７〜３９７）。この自己調節的な領域は、阻害スイッチ、および、キナーゼの自己活性化に干渉するキナーゼ阻害ドメインを含む（Ｌｅｉ，Ｍ．等（２０００年）Ｃｅｌｌ １０２，３８７〜３９７）。自己調節的な領域内の突然変異により、構成的に活性な突然変異体が生じる（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）；上記のＬｅｉ，Ｍ．等（２０００年））。哺乳動物細胞におけるＰＡＫ１のアミノ酸８３〜１４９（ＰＡＫ阻害ドメインのＰＩＤ）を含む自己調節的ドメインの発現は、ＰＡＫ１を介する下流エフェクターの活性化を妨害する。従って、このＰＡＫ阻害剤の、構成的に活性なＧＴＰアーゼＣｄｃ４２G12V、ＰＡＫ１のアクチベーターとの共発現により、例えば、末梢のアクチンの微小突起の形成、それに付随するストレスファイバー（通常はこのｐ２１−タンパク質により誘導される）の損失が防がれる（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年の報告によれば、乳ガン細胞におけるＰＡＫ１活性の阻害は、乳ガンの浸潤に関与することがわかっているｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ活性における減少、転写因子ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性の阻害、および、インビボでのＡＰ−１プロモーターによって駆動する転写の抑制に関連している（Ａｄａｍ，Ｌ．等（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１２０４１〜１２０５０）。その上、淋病の病原体であるＮｇｏは、低分子量ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーからのシグナルをＪＮＫおよびＡＰ−１活性化に方向付けるＰＡＫを含む細胞性ストレス応答キナーゼのカスケードを介して、前炎症性サイトカインの活性化を誘導する（Ｎａｕｍａｎｎ，Ｍ．等（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，１２７７〜１２８６）。しかしながら、ＰＡＫファミリーキナーゼが、変形性関節症のような関節病において可能性のある役割を有するという報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の一つの主題は、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症および／または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎の治療のための、ＰＡＫ阻害剤の使用である。また、本ＰＡＫ阻害剤は、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するのに用いることもできる。加えて、ＰＡＫ阻害剤は、上記で述べたように、関節病を治療するための、および／または、上記のような関節痛を治療するための医薬品を製造するのに用いることができる。
【００１４】
本発明に係る用語「阻害剤」は、好ましくは、ＰＡＫのセリン／スレオニンキナーゼ活性、または、ＰＡＫ遺伝子の発現、または、ＰＡＫの細胞中での局在化を阻害するか、または、減少させる、生化学的な物質または化学的な物質を意味し、例えば、Ｋｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．等（２００２年）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２年４月５日，６９７〜７０２で説明されている。セリン／スレオニンキナーゼ活性は、標準的なプロトコールに従って測定することができ、例えばアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），フォスターシティー，カリフォルニア州，米国の、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒTMセリン／スレオニンキナーゼ分析を用いて測定することができる。ＰＡＫ遺伝子の発現は、本発明の実施例で説明されているようなＲＴ−ＰＣＴまたはウェスタンブロット解析によって測定することができる。
【００１５】
用語「ＰＡＫ」は、セリン／スレオニンｐ２１活性化キナーゼのファミリーを意味し、例えば、これらに限定されないが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３および／またはＰＡＫ４が挙げられる。これらのタンパク質は、好ましくは、上述のような低分子量のＧＴＰ結合タンパク質Ｃｄｃ４２やＲａｃの標的として役立つ。特に、用語「ＰＡＫ」は、ヒトＰＡＫ、特にヒトＰＡＫ１を意味する。配列番号１および２は、ヒトＰＡＫ１の核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列番号３、４および５は、ヒトＰＡＫ２、３および４のアミノ酸配列をそれぞれ示す。これらのヒトＰＡＫをコードする遺伝子配列は、遺伝子コードを用いることによって容易に誘導することができる。ヒトＰＡＫ１、２、３および４の遺伝子バンクの登録番号は、それぞれＮＰ＿００２５６７、Ｑ１３１７７、ＮＰ＿００２５６９およびＮＰ＿００５８７５である。非ヒトホモログは、ヒトＰＡＫ１、２、３または４の遺伝子配列を用いて、当業者既知の方法で、例えば、標準的な実験方法に従って、例えばヒトＰＡＫ配列から誘導された適切なプローブを用いたＰＣＲ増幅、または、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション（例えば６０℃で２.５×ＳＳＣ緩衝液、続いて、３７℃で、より低い緩衝液濃度中での洗浄工程を数回）によって単離することができる。
【００１６】
このようなＰＡＫ阻害剤の例は、アミノ酸配列ＨＴＩＨＶＧＦＤＡＶ ＴＧＥＦＴＧＭＰＥＱ ＷＡＲＬＬＱＴＳＮＩ ＴＫＳＥＱＫＫＮＰＱ ＡＶＬＤＶＬＥＦＹＮ ＳＫＫＴＳＮＳＱＫＹ ＭＳＦＴＤＫＳ（配列番号６）を有するＰＡＫ１阻害ドメイン、アミノ酸配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴ ＳＴＭ（配列番号７）を有するＰＡＫ１ペプチド、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ ＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲ ＮＴＳＴＭ（配列番号８）を有するＴａｔ−ＰＡＫ融合ペプチド、ＰＡＫに対して、特に、ＰＡＫの活性部位に対して向けられた結合タンパク質または結合ペプチド、ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫそのものに対して向けられた核酸、化学分子、好ましくは低分子物質、および／または、天然産物の抽出物である。
【００１７】
本発明に係る用語「化学分子」は、非高分子の有機化合物、脂質、炭水化物、ペプチド、好ましくは、約１０〜約８０個のアミノ酸、特に１０〜２５個のアミノ酸を有するペプチド、および、オリゴヌクレオチド、好ましくは約１０〜約９０個のヌクレオチド、特に１５〜２５個のヌクレオチドを包含する。特に好ましくは、低分子量の化学分子、特に非高分子の有機化合物であり、これらは、実験室で合成されたか、または自然界で発見されたかのいずれでもよく、好ましい分子量は、約２００ｇ／モル〜約１５００ｇ／モル、特に４００ｇ／モル〜１０００ｇ／モルである。
【００１８】
あるいは、本発明の阻害剤は、天然産物の抽出物の形態が可能であり、これらは未精製の形態または精製した形態のいずれでもよい。このような抽出物は、水および／またはアルコールおよび／または有機溶媒抽出、および／または、カラムクロマトグラフィー、および／または、動物、植物または微生物源、例えばヘビ毒、葉または微生物の発酵液からの沈殿のような標準的な手法に従って製造することができる。
【００１９】
用語「結合タンパク質」または「結合ペプチド」は、ＰＡＫに結合し、かつ阻害するタンパク質またはペプチドのクラスを意味し、例えば、これらに限定されないが、ＰＡＫに対して向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、および、タンパク質の足場、例えばＰＡＫに対して向けられたアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられる。
【００２０】
抗体または抗体フラグメントの製造手順は、当業者周知の方法に従って、例えば、哺乳動物（例えばウサギ）をＰＡＫで免疫化することによって、必要に応じて、例えば、フロインドアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で行われる（例えばＤｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．等（１９８１年）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４〜１３４９を参照）。その後、免疫反応の結果として動物中で形成されたポリクローナル抗体は、周知の方法を用いて血液から単離することができ、さらに、例えばカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法に従って製造することもできる（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜２９９）。
【００２１】
また、本発明に係る用語「抗体」または「抗体フラグメント」は、組換えによって製造され、必要に応じて改変された、抗体またはそれらの抗原結合部を意味するものとも理解され、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性または多重特異性抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ）、または、Ｆ（ａｂ）2フラグメントである（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３６８６８４、ＵＳ４,８１６,５６７、ＵＳ４,８１６,３９７、ＷＯ８８／０１６４９、ＷＯ９３／０６２１３、または、ＷＯ９８／２４８８４を参照）。
【００２２】
典型的な抗体の代わりに、例えば、ＰＡＫに対するタンパク質の足場を用いることも可能であり、このようなタンパク質としては、例えば、リポカリンに基づくアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられる（Ｂｅｓｔｅ等（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１８９８〜１９０３）。リポカリン（例えばレチノール結合タンパク質またはビリン結合タンパク質）の天然のリガンド結合部位は、例えば「コンビナトリアルタンパク質設計」アプローチによって改変でき、この方法では、上記結合部位は、選択されたハプテン、ここにおいてはＰＡＫに結合する（Ｓｋｅｒｒａ，２０００年，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８２，３３７〜５０）。分子を認識するための抗体の代わりとなるその他の既知のタンパク質の足場がわかっている（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１３，１６７〜１８７）。
【００２３】
用語「ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫそのものに対する核酸」は、例えばＰＡＫ遺伝子発現またはＰＡＫ活性を阻害する二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、例えば、これらに限定されないが、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）およびリボザイムが挙げられる。
【００２４】
このような核酸（例えばアンチセンス核酸）は、例えば、ホスホトリエステル方法に従って化学合成できる（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３〜５８４を参照）。アプタマーとは、ポリペプチド（ここにおいてはＰＡＫ）に高い親和性で結合する核酸である。アプタマーは、ＳＥＬＥＸのような選択方法によって、様々な一本鎖ＲＮＡ分子の大規模なプールから単離することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５，１６２８〜５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ（１９９４年）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２０，９７〜１０７；ＵＳ５,５８２,９８１を参照）。また、アプタマーは、合成し、それらの鏡像体の形態で（例えばＬ−リボヌクレオチドとして）選択することもできる（Ｎｏｌｔｅ等（１９９６年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１１１６〜９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ等（１９９６年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１１１２〜５）。この方法で単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼによって分解されないため、より大きい安定性を有するという利益を享受する。
【００２５】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって、特に、細胞中に存在し得るＤＮアーゼおよびＲＮアーゼによって分解する可能性もある。従って、核酸を改変して、それらを分解に対して安定化し、それにより長時間にわたり細胞中で高濃度の核酸が維持されるようにすることが有利である（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９８９〜９４；ＷＯ９５／１１９１０；ＷＯ９８／３７２４０；ＷＯ９７／２９１１６）。典型的には、このような安定化は、１またはそれ以上のインターヌクレオチドのリン基を導入すること、または、１またはそれ以上のリン以外のインターヌクレオチドを導入することにより得ることができる。
【００２６】
適切な改変されたインターヌクレオチドは、上記のＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０年）によって編纂されている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９８９〜９４；ＷＯ９５／１１９１０；ＷＯ９８／３７２４０；ＷＯ９７／２９１１６も参照）。本発明に係る使用のいずれか一つで用いることができる核酸中の、改変されたインターヌクレオチドのリン酸基および／または以外の架橋としては、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、および／または、リン酸エステルが挙げられ、それに対して、リン以外のインターヌクレオチド類似体としては、例えば、シロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート架橋、および／または、チオエーテル架橋が挙げられる。また、このような改変の形態は、本発明に係る使用のいずれか一つで用いることができる医薬組成物の耐久性を改善するとも言える。
【００２７】
適切なアンチセンス核酸の使用が、例えば、ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ（１９９５年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１００，３８０〜２；ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ（１９９３年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８，４１９〜２３，Ｓｔｅｉｎ（１９９２年）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，６，６９７〜７４、または、Ｙａｃｙｓｈｙｎ，Ｂ．Ｒ．等（１９９８年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１４，１１４２）でさらに説明されている。
【００２８】
遺伝子発現（ここにおいてはＰＡＫ遺伝子発現）をダウンレギュレートまたはスイッチオフするプロセスにおけるＲＮＡ干渉のためのツールとしての、ｓｉＲＮＡの生産および使用が、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．等（２００１年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８、または、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．等（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４で説明されている。
【００２９】
また、リボザイムは、ｍＲＮＡに特異的に結合し、切断することができるため、これも核酸（ここではＲＡＫ遺伝子）の翻訳を阻害するための適当なツールである。リボザイムは、例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ等（１９９８年）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５４，１１７５〜２０２；Ｖａｉｓｈ等（１９９８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，５２３７〜４２；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ（１９９７年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，９２１〜２、または、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１２，５１０〜５で説明されている。
【００３０】
従って、上述の核酸を、インビボおよびインビトロの両方で、細胞中のＰＡＫ遺伝子の発現を阻害する、または減少させるのに用いることができ、その結果、本発明の意味でＰＡＫ阻害剤として作用させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムそれぞれとして使用するには、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。医薬品製造のために、本発明のＰＡＫ阻害剤は通常、１種またはそれ以上の製薬上許容できる添加剤または補助剤を用いて製剤化され、このような添加剤または補助剤としては、投与の形態に応じて、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸もしくはペプスタチンＡ、または、金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィン、および／または、黄色ワックスなどが挙げられる。
【００３１】
適切な追加の添加剤としては、例えば、界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００、または、デオキシコール酸ナトリウム、それに加えて、ポリオール、例えばポリエチレングリコールまたはグリセロール、糖類、例えばスクロースまたはグルコース、両性イオン性化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、または、特にタウリンまたはベタイン、および／または、タンパク質、例えばウシまたはヒト血清アルブミンが挙げられる。界面活性剤、ポリオール、および／または、両性イオン性化合物が好ましい。
【００３２】
好ましくは、生理緩衝溶液のｐＨは、約６.０〜８.０、特に約６.８〜７.８、特に約７.４であり、および／または、浸透圧モル濃度は、約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルである。一般的に、本医薬品のｐＨは、適切な有機または無機緩衝液を用いて、例えば、好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）、または、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調節される。一般的に、それぞれの緩衝液の選択は、望ましい緩衝液のモル濃度に依存する。例えば、注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。
【００３３】
本医薬品は、従来の方式で投与することができ、例えば、経口投薬形態（例えば錠剤またはカプセル）によって、粘膜（例えば鼻または口腔）によって、皮下への埋め込みの形態で、本発明に係る医薬品を含む注射、輸液またはゲルによって投与することができる。さらに、上述のような特定の関節病を治療するために、本医薬品を、場合により、リポソーム複合体の形態で、局所的および局在的に投与することが可能である。その上、治療は、本医薬品の一時的な制御放出を可能にする経皮吸収型製剤（ＴＴＳ）によって行うことができる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９７２３Ａ１、または、ＥＰ０８５２４９３Ａ１に記載されている。
【００３４】
一般的に、体に比較的少量の溶液または懸濁液（例えば約１〜約２０ｍｌ）だけを投与する場合、注射液が用いられる。一般的に、それより多い量の溶液または懸濁液（例えば１リットルまたはそれ以上）を投与する場合、輸液が用いられる。輸液用溶液に対して、注射液の場合はほんの２〜３ミリリットルしか投与されないため、注射の際の血液または組織内の流体のｐＨおよび浸透圧とのわずかな差は、痛みの感覚に関して、それ自身重要性を生じないか、または、有意な程の重要性を生じない。それゆえに、一般的に、本発明に係る製剤を使用前に希釈する必要はない。しかしながら、比較的大量を投与する場合、本発明に係る製剤は、投与前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に、一時的に希釈されると予想される。等張溶液の例は、０.９％濃度の塩化ナトリウム溶液である。輸液の場合、希釈は、例えば滅菌水を用いて行うことができ、一方で、投与は、例えばいわゆるバイパスを経由して行うことができる。
【００３５】
上述の核酸は、裸の形態、遺伝子トランスファーベクターの形態、またはリポソームまたは金粒子との複合体の形態で用いることができる。
【００３６】
遺伝子トランスファーベクターの例は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、または、レトロウイルスベクター（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ等（１９９７年），Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３，４６６〜７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２，５４９〜５８）である。リポソームとの複合体は通常、特に皮膚細胞で極めて高効率のトランスフェクションを達成する（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，１９９５年，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９〜８５）。リポフェクションにおいて、カチオン脂質で構成される小型の単層の小胞は、リポソーム懸濁液を超音波処理することによって製造される。ＤＮＡは、正味の正電荷が残存し、全てのプラスミドＤＮＡがリポソームと複合体形成するような割合で、リポソームの表面にイオン結合する。Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．等（１９８７年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８４，７４１３〜７４１４によって用いられているＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム臭化物）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）脂質混合物に加えて、これまで、多数の脂質配合物が合成されており、多種多様な細胞系をトランスフェクトする効率に関して試験されている（Ｂｅｈｒ等（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２〜６９８６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ（１９９１年），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１８９，１９５〜２０３；Ｆｅｌｇｎｅｒ等（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５５０〜２５６１）。脂質配合物の例は、ＤＯＴＡＰ Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、または、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。
【００３７】
核酸の細胞へのトランスファーを高める補助剤としては、例えば、核酸が細胞の細胞核に輸送されるようにするＤＮＡに結合するタンパク質もしくはペプチド、または、合成ペプチド−ＤＮＡ分子が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ等（１９９９年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２８２；Ｂｒａｎｄｅｎ等（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７，７８４）。また、補助剤としては、核酸が細胞の細胞質に放出されるようにする分子も挙げられる（Ｐｌａｎｃｋ等（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒ等（１９９７年）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，２１３）、または、例えばリポソーム（上記のＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０年））。
【００３８】
その他の特に適した形態は、上述の核酸を金粒子に塗布し、これらの粒子を、いわゆる「ジーンガン」を用いて組織または細胞に発射することにより得ることができる（Ｗａｎｇ等（１９９９年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：７７５〜８１，Ｔｕｔｉｎｇ等（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１８３〜８）。
【００３９】
本発明のその他の主題は、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎を治療するための、および／または、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するための、ＰＡＫ阻害剤を発見するための標的としての、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子の使用である。好ましくは、ＰＡＫ阻害剤は、上述のような医薬品の形態で用いることができる。
【００４０】
従って、本発明はまた、ＰＡＫ阻害剤をスクリーニングする方法にも言及し、前記方法は：
（ａ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、および、
（ｃ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する工程、を含む。
【００４１】
一般的に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子は、例えば分析システム中で提供され、試験化合物、特に生化学的または化学的な試験化合物に、例えば化学物質ライブラリーの形態で、直接的にまたは間接的に接触させる。次に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する。その後、適切な阻害剤を解析および／または単離することができる。化学物質ライブラリーのスクリーニングには、当業者既知の、または市販のハイスループット分析の使用が好ましい。
【００４２】
本発明に係る用語「化学物質ライブラリー」は、化学合成された分子や天然産物などの複数の源のいずれかより集められた、または、コンビナトリアルケミストリー技術によって生成した複数の化学物質を意味する。
【００４３】
一般的に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスアッセイで測定または検出される。本発明で用いられるように、ヘテロジニアスアッセイは、１またはそれ以上の洗浄工程を含む分析であり、それに対して、ホモジニアスアッセイでは、このような洗浄工程は必要ない。試薬および化合物を混合するだけで測定される。
【００４４】
適切な機能分析は、ＰＡＫの遺伝子発現、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１またはＣｈｐのようなＧＴＰアーゼによるＰＡＫの直接的な活性化、または、活性化（ＧＴＰ結合型）ｐ２１との複合体形成に基づいていてもよい。ＰＡＫの阻害剤として試験しようとする生化学的な物質または化学物質の存在下で、遺伝子発現、直接的な活性化、または、例えば上述したような細胞タンパク質のような他のタンパク質との複合体形成は、一般的に当業者既知の手段によって、基準となり得る。一般的に、市販のキナーゼ分析システムは、基質に取り込まれたリン酸塩の量を定量的に検出する。
【００４５】
例えば、末梢のアクチンの微小突起形成の予防と、それに付随するストレスファイバーの損失は、上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）で説明されているように測定することができる。
【００４６】
ヘテロジニアスアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＦＩＡ、ＳＰＡおよびフラッシュプレート分析である。
【００４７】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）に基づく分析は、様々な会社から提供されている。この分析は、ＰＡＫのようなキナーゼによってリン酸化可能なランダムペプチドを用いている。通常、キナーゼを含むサンプルは、例えばＡＴＰと必要なカチオンを含む反応緩衝液に希釈し、次に、プレートのウェルに添加する。単に混合物を除去することによって反応を止める。その後、プレートを洗浄する。例えばビオチン化基質をキナーゼに添加することによって、反応を開始させる。反応後、特異的抗体を添加する。通常、サンプルを、予めブロックされたタンパク質−Ｇプレートにトランスファーし、洗浄後に、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰを添加する。その後、未結合のストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を除去し、ペルオキシダーゼ基質の添加によってペルオキシダーゼ染色反応を開始させ、適切なデンシトメーターで光学密度を測定する。
【００４８】
ＤＥＬＦＩＡ（解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ）に基づく分析は、固相分析である。通常、その抗体は、ユーロピウムまたはその他のランタニドで標識されており、未結合のユーロピウム標識抗体を洗浄して除いた後に、ユーロピウム蛍光が検出される。
【００４９】
通常、ＳＰＡ（シンチレーション近接分析）、および、フラッシュプレート分析は、放射標識基質を捕捉するためにビオチン／アビジン相互作用を利用している。一般的に、反応混合物は、キナーゼ、ビオチン化ペプチド基質、および、γ−［Ｐ33］ＡＴＰを含む。反応後に、ビオチン化ペプチドはストレプトアビジンによって捕捉される。ＳＰＡ検出において、ストレプトアビジンは、シンチラントを含むビーズに結合し、それに対して、フラッシュプレート検出では、ストレプトアビジンは、シンチラントを含むマイクロプレートのウェル内部に結合する。一度固定されれば、放射標識基質は、光の発光を刺激するのに十分な程度にシンチラントに近接する。
【００５０】
その代わりとして、ホモジニアスアッセイは、例えば、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＦＰ、ＡＬＰＨＡ、および、遺伝子分析である。
【００５１】
ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）に基づく分析は、通常、ユーロピウムと、ＡＰＣ、改変されたアロフィコシアニン、または、スペクトルがオーバーラップするその他の色素、例えばＣｙ３／Ｃｙ５またはＣｙ５／Ｃｙ７との間の蛍光共鳴エネルギーの移動を利用する分析である（Ｓｃｈｏｂｅｌ，Ｕ．等（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０，１１０７〜１１１４）。例えば３３７ｎｍの光によるユーロピウムの励起の後に、分子は、６２０ｎｍで蛍光を発する。しかしながら、このフルオロフォアがＡＰＣと十分に近接している場合、ユーロピウムは、その励起エネルギーを、６６５ｎｍで蛍光を発するＡＰＣに移動させると予想される。通常、キナーゼ基質はビオチンで標識された基質である。キナーゼ反応後に、ユーロピウムで標識された（Ｐ）特異的抗体を、ストレプトアビジン−ＡＰＣと共に添加する。リン酸化ペプチドは、ユーロピウムで標識された抗体とストレプトアビジン−ＡＰＣを近接させて接触させる。ＡＰＣのユーロピウムフルオロフォアへの近接は、ＡＰＣ蛍光（ＦＲＥＴ）によるユーロピウム蛍光の消光を引き起こすと予想される。
【００５２】
蛍光偏光（ＦＰ）に基づく分析は、偏光を用いて、溶液中で蛍光性の基質ペプチドを励起させる分析である。これらの蛍光性のペプチドは、溶液中で遊離して、崩壊しており、放出された光の偏光解消を引き起こす。しかしながら、基質ペプチドがそれより大きい分子に結合する場合、このような（Ｐ）−Ｔｙｒは、その崩壊速度は大きく減少し、および、放出された光は高度に偏光したままになる。キナーゼ分析のためには、一般的に２つの選択肢がある：
（ａ）蛍光ホスホペプチドトレーサーが、（Ｐ）−特異的抗体に結合する。リン酸化産物は、抗体からの蛍光ホスホペプチドと競合し、偏光の高から低への変化を引き起こすと予想される。
（ｂ）リン酸化基質ペプチドが、リン酸特異的な抗体に結合し、偏光の低から高への変化を引き起こす。
【００５３】
ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアス）に基づく分析は、リン酸化ペプチドによって近接に運ばれたドナービーズとアクセプタービーズ間の一重項酸素の移動に依存する分析である。６８０ｎｍでの励起の際、ドナービーズ中の光線感作物質が、雰囲気酸素を一重項状の酸素に変換し、これが、２００ｎｍの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、ビーズ内の蛍光性のアクセプターにエネルギーを移動させ、その結果、約６００ｎｍで光を放出する。
【００５４】
特に化合物のハイスループットスクリーニングのためには、ＥＦＣ（酵素断片コンプリメンテーション）に基づく分析、またはそれと同等の分析を用いることができる。ＥＦＣ分析は、２つのフラグメント、すなわち酵素アクセプター（ＥＡ）と酵素ドナー（ＥＤ）からなる加工されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づく。フラグメントが分離されている場合、β−ガラクトシダーゼ活性は生じないが、フラグメントが一緒になると、それらは会合して（補って）、活性酵素を形成する。ＥＦＣ分析は、ＥＤ−分析物結合体を利用しており、ここにおいて、分析物は、抗体または受容体のような特異的結合タンパク質によって認識され得る。特異的結合タンパク質の非存在下では、ＥＤ−分析物結合体は、ＥＡを補うことができ、それにより、活性β−ガラクトシダーゼが形成され、陽性の発光シグナルが生産される。ＥＤ−分析物結合体が、特異的結合タンパク質によって結合する場合、ＥＡで補うことが阻害され、シグナルは生じない。遊離の分析物が提供される場合（サンプル中に）、特異的結合タンパク質への結合に関して、ＥＤ−分析物結合体と競合することが予想される。遊離の分析物は、ＥＡで補うためにＥＤ−分析物結合体を放出し、サンプル中に存在する遊離の分析物の量に応じたシグナルを生産すると予想される。
【００５５】
遺伝子分析の例は、２ハイブリッドシステム分析である（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｍｇｌａｎｚ（１９９４年）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，２８６〜２９２；ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ（１９９８年）ＴＩＢＴＥＣＨ，１６，３５５〜３６３）。この試験において、細胞は、本発明に係るポリペプチドと、転写因子のＤＮＡ−結合ドメイン（例えばＧａｌ４またはＬｅｘＡ）からなる融合タンパク質を発現する発現ベクターで形質転換される。形質転換された細胞は加えて、レポーター遺伝子（そのプロモーターは、対応するＤＮＡ−結合ドメインのための結合部位を含む）を含む。既知または未知のポリペプチドと、活性化ドメイン（例えばＧａｌ４または単純疱疹ウイルス ＶＰ１６由来）からなる第二の融合タンパク質を発現するその他の発現ベクターで形質転換することによって、第二の融合タンパク質がそのポリペプチドと相互作用する場合、レポーター遺伝子の発現を大きく高めることができる。その結果として、この試験システムは、ＰＡＫと、例えばＧＴＰアーゼ、例えばＣｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１またはＣｈｐ、または、活性化された（ＧＴＰ結合型）ｐ２１との相互作用を阻害する生化学的な物質または化学物質のスクリーニングに用いることができる（例えばＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３７４〜８１を参照）。この方法によって、関節病を治療するのに用いることができる新規の活性化合物を迅速に同定することが可能である。
【００５６】
その代わりに、試験化合物が、タンパク質またはペプチドである場合、この試験化合物と、ＰＡＫの存在下におけるＰＡＫのアクチベーターとして、ＧＴＰアーゼ、例えばＲａｃ１、Ｗｒｃｈ−１、Ｃｈｐまたは構成的に活性なＣｄｃ４２との共発現を用いて、例えば上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）で説明されているようにして、ＰＡＫに対する試験化合物の影響を測定または検出することができる。
【００５７】
その他の遺伝子分析の例は、機能分析であり、この場合、キナーゼの活性が、機能的な細胞の反応、例えば増殖、増殖の停止、分化またはアポトーシスに変換される。このタイプのスクリーニングのためには、酵母が、特に適切なモデル系である。例えばＰＡＫ１−酵母における機能分析において、グルコースを含む培地で培養した場合、例えばＰＡＫ１−酵母細胞は、正常な酵母細胞と同様に増殖する。しかしながら、ガラクトースと接触させた場合、ＰＡＫ１の細胞内発現が誘導され、酵母細胞に死をもたらす；この場合、ＰＡＫ１活性を阻害する化合物は、細胞死を防ぐ。
【００５８】
その他の分析は、固相結合ポリペプチド、例えばＰＡＫ、ＧＴＰアーゼ、例えばＣｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１もしくはＣｈｐ、または活性化（ＧＲＰ結合型）ｐ２１、および、試験しようとする化合物での干渉に基づく。従って、試験化合物は、例えば、検出可能なマーカーを含み、例えば、すでに上述したように、化合物を、放射標識、蛍光標識または発光標識することができる。その上、化合物は、タンパク質にカップリングさせることができ、それによって、例えば、クロモジェニック基質を用いるペルオキシダーゼ分析を用いた酵素による触媒作用によって、または、検出可能な抗体の結合によって間接的な検出が可能である。その他の可能性は、マススペクトロメトリーによって固相結合タンパク質複合体を調査することである（ＳＥＬＤＩ）。試験物質との相互作用の結果としての、例えば上述のＰＡＣまたは他方のタンパク質のコンフォメーション変化は、例えば、ポリペプチドの内因性トリプトファン残基の蛍光変化によって検出することができる。
【００５９】
また、固相結合ポリペプチドは、アレイの一部であってもよい。このようなアレイを固相化学と光不安定性の保護基を用いて製造する方法が、例えばＵＳ５,７４４,３０５に開示されている。これらのアレイはまた、試験化合物または化合物ライブラリーと接触させ
、相互作用、例えば結合またはコンフォメーション変化に関して試験することもできる。
【００６０】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、細胞全体を用いて行われる。通常、マルチウェルプレートの底部で増殖させた細胞を、固定し、膜透過させ、ブロッキングし、例えば対象の基質に対する一次（Ｐ）−特異的抗体とインキュベートする。次に、例えばユーロピウムで標識した、または、ＨＲＰに接合させた二次抗体を、例えば上述のような特異的な化学発光物質または比色物質と併せて利用して、シグナルを発生させる。顕微鏡を併用することによって、（Ｐ）−特異的抗体の量を単細胞レベルで定量することができ、加えて、リン酸化で誘導された基質の転位、または、細胞の形態学的な変化も定量することができる。
【００６１】
有利には、本発明の方法は、ロボットシステムで行われ、このようなシステムとしては、例えば、ロボット式プレーティングや、ロボット利用の液体移動システム、例えば、マイクロフルイディクスを用いた、すなわち流体を導く構造（ｃｈａｎｎｅｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）のシステムが挙げられる。
【００６２】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利には、スクリーニング方法は自動化され、小型化されており、特に小型化されたウェルを用いており、マイクロフルイディクスはロボット制御される。
【００６３】
その他の実施形態において、本発明はまた、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎を治療するための医薬品、および／または、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するための医薬品を製造する方法にも言及し、本方法は：
（ａ）請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法を行う工程、
（ｂ）測定または検出された、関節病および／または関節痛を治療するのに適した試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）例えば上述したように、測定または検出された試験化合物を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤を用いて製剤化する工程、
を含む。
【００６４】
以下の図、配列および実施例は、本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
図１Ａ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞の抽出物、および、ヒト一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１の発現を示す。
【００６６】
ヒトＨＥＫ２９３細胞の抽出物、同様に、変形性関節症の患者の軟骨由来の、およびコントロールの軟骨由来のヒト一次軟骨細胞を、二次元ゲル電気泳動によって分離した。ウェスタンブロッティングによってタンパク質をＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、特異的抗体によってＰＡＫ１を検出した。
【００６７】
図２は、ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現を抑制したことを示す。
【００６８】
ＰＡＫ１阻害ドメインを、ｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングし、ＳＷ１３５３細胞にトランスフェクションした。適宜、ＩＬ−１βを、濃度１０ｎｇ／ｍｌで２４時間の刺激として用いた。上清を回収し、ＭＭＰ１３タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値は任意単位で示し、少なくとも３つの独立した結果±ＳＤを示す。格子縞のカラムは、ベクターｐＣＥＰ４（空のベクター）を用いた実験を示し、黒いカラムは、ベクターｐＣＥＰ４＿ＰＡＫ１−１Ｄを用いた実験を示す。
【００６９】
図３は、ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現を抑制したことを示す。
【００７０】
ＰＡＫ１阻害ドメインを、ｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングし、ＳＷ１３５３細胞にトランスフェクションした。ＩＬ−１βとＴＮＦαの両方を組み合わせて、濃度１０ｎｇ／ｍｌで２４時間、細胞を刺激した。上清を回収し、ＭＭＰ１３タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値（任意単位）は、２回の実験の平均を示す。点描のカラムは、ベクターを用いず、ＩＬ−１βとＴＮＦαを用いた実験を示す。格子縞のカラムは、ベクターｐＣＥＰ４（空のベクター）と、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを用いた実験を示す。黒いカラムは、ベクターｐＣＥＰ４＿ＰＡＫ１−ＩＤと、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを用いた実験を示す。
【００７１】
図４は、ヒトＨＥＫ２９３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＩＬ−８の発現を抑制したことを示す。
【００７２】
ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングされたＰＡＫ１阻害ドメインを、ＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクションした。細胞を、ＩＬ−１βで、濃度１０ｎｇ／ｍｌで所定時間刺激した。上清を回収し、ＩＬ−８タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値（任意単位）は、２回の実験の平均を示す。丸は、ベクターｐＣＤＮＡ３.１＿ＰＡＫ１−ＩＤと、ＩＬ−１βを用いた実験を示し、四角は、ベクターｐＣＤＮＡ３.１（空のベクター）と、ＩＬ−１βを用いた実験を示す。
【００７３】
配列の説明
配列番号１は、ＰＡＫ１の核酸配列を示す。
配列番号２は、ＰＡＫ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＰＡＫ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＰＡＫ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＰＡＫ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＰＡＫ１阻害ドメイン（ＰＡＫ１−ＩＤ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、上記のＫｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．（２００２年）に記載のＰＡＫ１のプロリンリッチな阻害剤の配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、上記のＫｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．（２００２年）に記載のＨＩＶ ｔａｔタンパク質由来の多塩基性の配列に融合したＰＡＫ１のプロリンリッチな配列を含む合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的化するための第一のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１０は、ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的化するための第二のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１１は、ＰＡＫ１−ＩＤを増幅するための第一のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１２は、ＰＡＫ１−ＩＤを増幅するための第二のＰＣＲプライマーを示す。
【実施例】
【００７４】
１．方法
１．１：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
まず、ゲノムＤＮＡによる汚染を防ぐために、トータルＲＮＡ（１μｇ）を、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼＩ（１ユニット）で消化した。次に、ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡを、製造元が提供した手順に従って、サーモスクリプト（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、オリゴ（ｄＴ）２０で開始させてｃＤＮＡに逆転写させた。ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的とする５’−ＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣＡ−３’（配列番号９）と、５’−ＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１０）（ＭＷＧバイオテク社（ＭＷＧ，Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ），ドイツ）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、エキスパンド・ハイ・フィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ），ドイツ）を５０μｌの反応液あたり２.６ユニットを用いて、９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、および、７２℃／４５秒を２５サイクルであった。
【００７５】
１．２：ベクターコンストラクトの設計
ＰＡＫ１の自己阻害的ドメインと同定されたＰＡＫ１の残基８３〜１４９をコードするポリペプチド（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年））を、ＰＣＲで増幅した。増幅に用いられたプライマーは、
５’ＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１１）
（コザック配列は下線で示し、血球凝集素（ＨＡ）タグは太字で示した）、および、
５’−ＡＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１２）（ＭＷＧバイオテク社，ドイツ）であった。ＰＣＲ条件は、エキスパンド・ハイ・フィデリティＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）を５０μｌの反応液あたり２.６ユニットを用いて、９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、および、７２℃／３０秒を２５サイクルであった。そのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−ＴＯＰＯ２.１ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ），ドイツ）にサブクローニングした。ＨＡタグを有するＰＡＫ１を、哺乳動物ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン社，ドイツ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に導入した。ＰＡＫ１−ＩＤを、５’ＨｉｎｄＩＩＩ、および、３’ＮｏｔＩ制限部位を介してｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン社，ドイツ）に挿入した。全てのプラスミドは、配列解析で確認された。
【００７６】
１．３：細胞培養
ヒトＳＷ１３５３軟骨肉腫の培養物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）とペニシリン／ストレプトマイシン（３７℃、５％ＣＯ2）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。トランスフェクションのために、６×１０4／ウェルを一晩培養し、次の日、ＤＮＡ（２μｇ）とＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲTMトランスフェクション試薬（ジーン・セラピー・システムズ社（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）（１０μｌ）でトランスフェクションさせた。３時間後に、２０％ＦＣＳを含む等量の培地を添加し、一晩インキュベートした。ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン社，ドイツ）を用いた過剰発現の場合、トランスフェクションの２日後に、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社，ドイツ）を用いて細胞を選択した。トランスフェクション効率を、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），マウンテンビュー，カリフォルニア州，米国）を用いて、倒立蛍光顕微鏡上で試験した。ほとんどの実験で、６００００個の細胞を、３５ｍｍの６ウェルプレートの各ウェルにトランスファーした。刺激の前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＣＳ非含有ＤＭＥＭで３０分間培養した。実験のために、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１β（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）含有または非含有、および、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）含有または非含有の血清非含有ＤＭＥＭ（１ｍｌ）中に２４時間置いた。
【００７７】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３を、１０％ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。トランスフェクション実験のために、トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、６ウェルの培養皿に５×１０5細胞／ウェルで植えた。ウェルあたりリポフェクトアミン(R)（ライフテクノロジーズ社，米国）２０μｌと、トータルＤＮＡ５.０μｇを含む無血清培地（１.０ｍＬ）中で、細胞を４時間インキュベートした（ｐｃＤＮＡ３.１−ＰＡＫ１（８３〜１４９）プラスミドまたはｐｃＤＮＡ．１の空のベクターが、コントロールとして用いられた）。細胞を未処理のままにするか、または、回収期間（１６時間）の後、１０％ウシ胎児を含む培地中で、インターロイキン−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），ミネアポリス，ミネソタ州，米国）で刺激した。培養上清を除去し、ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄシステムズ社，ミネアポリス，ミネソタ州，米国）、ＰＧＥ２（ＳｐｉＢｉｏｍ Ｉｎｃ．）、および、ＭＭＰ−１３（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）の発現を、ＥＬＩＳＡで製造元が提供した手順に従ってモニターした。
【００７８】
１．４：ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡ
ＨＡタグを有するＰＡＫ183-149ペプチドの発現を評価するために、細胞を、完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）が追加された溶解緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０，５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０（１００μｌ）に溶解させ、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質分析キット（ピアース・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．），ロックフォード，イリノイ州，米国）を用いて決定した。タンパク質を、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社，米国）にトランスファーする前に、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン社，ドイツ）によって分離した。
【００７９】
変形性関節症に罹った患者の組織由来のヒト一次軟骨細胞、同様に、正常な組織由来のヒト一次軟骨細胞から、タンパク質抽出物を、標準的な技術に従って製造した。ＰＡＫ１の発現を、タンパク質３０μｇを用いた二次元ゲル電気泳動と免疫ブロッティングで調査した。二次元ゲル電気泳動には、等電点分画法を、直線状の７ｃｍの固定されたｐＨ３〜１０勾配のＩＰＧストリップ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．），米国）を用いて、タンパク質ＩＥＦ細胞（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社，米国）で行った。最終的な焦点合わせの工程は、４０００Ｖで８時間であった。二次元ゲル電気泳動を、ＮｕＰＡＧＥノヴェックス４〜１２％ＺＯＯＭゲル（インビトロジェン社，ドイツ）で行い、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社，米国）にトランスファーした。
【００８０】
免疫ブロッティングのために、ＨＡタグを有するＰＡＫ183-149とＰＡＫ１タンパク質を、それぞれＨＡタグポリクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），パロアルト，カリフォルニア州，米国）と、αＰＡＫ（Ｎ−２０）ポリクローナル抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））を用いて検出した。簡単に言えば、メンブレンを、ＴＢＳ−Ｔ（５％の無脂肪の粉乳を含む、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.６、０.１％トゥイーン２０９）で、室温で１時間ブロックした；１／５００希釈したＨＡタグ抗体または１／５０希釈したαＰＡＫ（Ｎ−２０）抗体のいずれかを含むＴＢＳ−Ｔ中で、室温で１時間インキュベートし、最終的に、１／１００００の抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（ピアース）を含むＴＢＳ−Ｔ中で、１時間インキュベートした。メンブレンを、ＥＣＬを製造元の説明書（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）に従って用いて加工した。
【００８１】
ＭＭＰ１３、ＩＬ−８およびＰＧＥ２タンパク質レベルを解析するために、細胞培養の上清を、ＥＬＩＳＡで、ＭＭＰ１３（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）、ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄシステムズ社，ミネアポリス，ミネソタ州，米国）およびＰＧＥ２（ＳｐｉＢｉｏ）に関して供給元により説明されているようにして決定した。
【００８２】
２．結果
２．１：ヒト軟骨肉腫細胞系、および、マウス一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１発現
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、レチノイン酸で刺激した、または刺激されていないヒトＳＷ１３５３軟骨細胞系、同様にマウス一次細胞におけるＰＡＫ１の発現を解析した。
この実験で得られた結果から、ヒトＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞系、同様にマウス一次軟骨細胞で、ＰＡＫ１が発現されることがはっきりと実証された。さらなる一連の実験で、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒトＣＨ８軟骨細胞系におけるＰＡＫ１の発現を確認した。
また、ＲＮＡレベルで示された結果は、ＰＡＫ１に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析を用いることによってタンパク質レベルでも確認された（図１）。
総合すると、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでの結果により、ヒトおよびマウスの、軟骨細胞系および一次軟骨細胞において、ＰＡＫ１が発現されることが確認された。
【００８３】
２．２：ＩＬ−１シグナル伝達によるＰＡＫ１の阻害ドメイン発現の干渉：
ＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ１３）は、変形性関節症に関連するタンパク質のＩＬ−１により誘導された発現に関する重要なマーカータンパク質の代表である。ＩＬ−１からＭＭＰ１３発現の誘導をもたらすシグナル伝達のためのＰＡＫ１に関する必要条件を研究するために、ヒト軟骨肉腫細胞系ＳＷ１３５３において、ＰＡＫ１阻害ドメイン（ＰＡＫ１−ＩＤ）を過剰発現させた（図２）。
【００８４】
トランスフェクションされた、同様に、トランスフェクションされていないＳＷ１３５３細胞において、ＩＬ−１βへの接触により、ＭＭＰ１３の発現と、培地への放出が大幅に増加した。この実験の結果により、ヒトＳＷ１３５３軟骨細胞系において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現により、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現が約５５％まで阻害されることがはっきりと実証された。その上、トランスフェクションされた、同様に、トランスフェクションされていないＳＷ１３５３細胞において、培地へのＭＭＰ１３分泌の基底レベルを観察することができた。上記の刺激されていない細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの発現により、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現が、８０％を超過して阻害され得る。総合すると、これらの結果より、ＰＡＫ１が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現に必要であることが確認される。
【００８５】
その他の重要なマーカー遺伝子は、プロスタグランジンＰＧＥ２である。ＳＷ１３５３細胞におけるＰＧＥ２発現の調節を、それぞれＰＡＫ１−ＩＤの存在下および非存在下で解析した（図３）。
【００８６】
ＭＭＰ１３発現の阻害で観察されたように、これらの結果により、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現によるＰＡＫ１の阻害は、ＩＬ−１βにより誘導されたシグナル伝達経路の顕著なダウンレギュレーションを引き起こすことが確認された。ＳＷ１３５３細胞系において、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現は、５０％を超えて阻害された。その上、ＰＧＥ２の調節は、変形性関節症における痛みに関連するプロセスにＰＡＫ１が関与することを示す。
【００８７】
ＳＷ１３５３細胞におけるそれらの作用に加えて、我々は、さらにヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞系においても、ＰＡＫ１−ＩＤの作用、すなわちその生物学的な阻害剤によるＰＡＫ１活性の干渉を調査した（図４）。
【００８８】
この実験の結果により、ＳＷ１３５３細胞における研究で得られた発見が確認された。ＰＡＫ１は、ＩＬ−１βにより誘導され、ＩＬ−１Ｒの活性化に始まり、転写因子の活性化を引き起こし、変形性関節症と痛みに関連するマーカー遺伝子の発現、例えばＭＭＰ１３、ＩＬ−８、および、ＰＧＥ２をアップレギュレーションするシグナル伝達カスケードの調節において、必須の役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】１Ａ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞の抽出物、および、ヒト一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１の発現を示す。
【図２】ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現を抑制したことを示す。
【図３】ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現を抑制したことを示す。
【図４】ヒトＨＥＫ２９３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＩＬ−８の発現を抑制したことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症またはリウマチ様関節炎のような関節病を治療するための、または関節痛を治療するためのｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用、および、ＰＡＫの、関節病の治療のための医薬品としてのＰＡＫ阻害剤を発見するための標的タンパク質としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋において、人間の最もありふれた身体障害状態は、変形性関節症である。人々の加齢のために、我々は、増加の一途をたどる患者群と直面しなければならず、彼等の生活の質はひどく影響を受けている。加えて、この病気は、高い直接的および間接的なコストを伴う莫大な社会経済的な重荷を含む。現在の治療法は、変形性関節症に関連する痛みの制御に注意を向けているが、それでもなお、我々にとって、病気の経過を遅くする、停止させる、または、元に戻すことも可能な薬理学的な治療法がまったく欠落している。
【０００３】
変形性関節症は、滑膜性の連結の構造的および機能的な破損を引き起こす各種障害の臨床的および病理学的な結果とみなすことができる。変形性関節症は、関節組織の破壊と修復との動的平衡が崩れた場合に発生する。関節の軟骨の構造的な破損は、健康な軟骨を傷つける異常な機械的歪、同様に、生理学的な機械的歪の影響下で変性する病理学的に機能が損なわれた軟骨の破損に起因する可能性がある。変形性関節症で観察された形態学的な変化としては、軟骨のびらん、同様に、様々な程度の滑膜の炎症が挙げられる。これらの変化の原因は、軟骨の高分子の破壊を引き起こすタンパク質分解酵素などの生化学的要因の複雑なネットワークにある。活性化滑膜細胞、単核細胞または関節の軟骨そのものによって生産されるＩＬ−１およびＴＮＦαのようなサイトカインは、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、および、サイトカイン遺伝子発現を著しくアップレギュレートし、代償的な合成経路を鈍らせる。例えば、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）経路を介したシグナル伝達による、ＩＬ−１および／またはＴＮＦαによるＡＰ１−転写因子複合体の活性化は、変形性関節症に関連するマーカー遺伝子の発現の調節に重要な役割を果たす。
【０００４】
炎症性の痛みの、軟骨の代謝と形成に関与するさらなる生化学的な要因は、ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）である。ＰＧＥ２とは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１および−２によって合成されたエイコサノイドのことであり、これは、ＩＬ−１介在プロテオグリカン分解に関与しており、ＰＧＥ２を意識のあるラットまたはマウスに投与すると、痛覚過敏を誘発する。ヒトの変形性関節症の関節において、ＩＬ−１βの内因性発現により、ＣＯＸ−２の誘導が引き起こされる。
【０００５】
従って、変形性関節症は、関節の軟骨の進行の遅い変性を特徴とする。変形性関節症の正確な原因論はまだわかっていないが、一般的に、軟骨基質成分の分解は、細胞外プロテイナーゼ、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ、および、変性性のプロセスを増幅させるサイトカインの大量の合成と活性化による事象と一致する。変形性関節症を治療するための新規のアプローチが必要であり、軟骨の障害に関する生物学の理解を進めることにより、軟骨の修復を刺激するか、軟骨基質の破壊を阻害する産物を生産する遺伝子の使用をもたらした。数種の研究により、例えば、変形性関節症における構造変化の進行を遅くする手段として、ＩＬ−１活性を調節することの可能性のある重要性が説明されている。
【０００６】
それゆえに、本発明の目的は、軟骨に害を与える要因の作用を回避または減少させるための新しい治療法を見出すことである。
【０００７】
驚くべきことに、変形性関節症に関連するマーカー遺伝子発現のアップレギュレーションを引き起こすシグナル伝達経路の、ＩＬ−１によって誘導された活性化の重要な媒介物質として、ＰＡＫ、特にＰＡＫ１が同定された。
【０００８】
ＰＡＫ１は、細胞の形態形成、運動性、生存、有糸分裂および血管新生などの多種多様な細胞機能に重要なセリン／スレオニンキナーゼの進化上保存されたファミリーの構成要素の一つである。ＰＡＫは、Ｓｔｅ２０プロテインキナーゼの大規模なファミリーに属する。Ｓｔｅ２０ｐは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における交配経路に関与する推定上の酵母のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ４Ｋ）である。哺乳動物、ショウジョウバエ、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびその他の生物におけるそのホモログは、ヒトにおけるホモログの構成員も含む大規模な新しいプロテインキナーゼのグループを構成する。Ｓｔｅ２０グループのキナーゼはさらに、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）と、胚中心のキナーゼ（ＧＣＫ）ファミリーに分類される。これらは、保存されたキナーゼドメインと、キナーゼと様々なシグナル伝達分子および細胞骨格の調節タンパク質とを相互作用させる大きな構造的多様性を有する非触媒領域の存在を特徴とする。
【０００９】
数種の文献により、哺乳動物細胞におけるＭＡＰＫ活性の調節におけるＰＡＫの役割が説明されている（例えば、Ｄａｎ，Ｃ．等（２００２年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２２，５６７〜５７７を参照）。ＭＡＰＫカスケードは、多様な細胞性の事象、細胞外の刺激、例えば成長因子、サイトカインおよび環境ストレスからのシグナル伝達において重要であり、それにより、転写因子を活性化し、遺伝子発現の調節が起こる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．およびＬａｐａｄａｔ，Ｒ．（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９８，１９１１〜１９１２）。シグナル伝達は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ）およびＭＡＰＫからなる三重のキナーゼ単位の直線状の連続的なリン酸化が介在する。三重のキナーゼ単位およびその活性化メカニズムは、酵母から哺乳動物への真核性の進化において高度に保存されている。
【００１０】
哺乳動物細胞において、ＰＡＫは、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１の下流エフェクターの標的と同定されており、ＧＴＰアーゼがＰａｋ１へ結合することにより、そのキナーゼ活性が自己リン酸化によって刺激される。ＰＡＫは、活性化された（ＧＴＰ結合）ｐ２１と特異的に複合体を形成し、ｐ２１ＧＴＰアーゼ活性を阻害し、キナーゼの自己リン酸化と活性化を起こす。ＰＡＫファミリーキナーゼは、酵母からヒトに至るまで保存されており、これは、Ｃｄｃ４２またはＲａｃ１によって、保存されたＮ末端モチーフ（ＰＡＫの残基７１〜１３７に対応する）との相互作用を介して直接的に活性化される。自己リン酸化されたキナーゼは、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１の親和性を減少させ、さらなる刺激性の活性、または、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質によるダウンレギュレーションのためにｐ２１を遊離させる（Ｍａｎｓｅｒ，Ｅ．等（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ，３６７，４０〜４６）。Ｒａｃ１やＣｄｃ４２に加えて、新たに同定されたＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのホモログ（例えばＷｒｃｈ−１およびＣｈｐ）もまた、ＰＡＫを活性化し、糸状仮足の形成とストレスファイバー溶解を誘導することができる（Ａｒｏｎｈｅｉｍ，Ａ．等（１９９８年）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８，１１２５〜１１２８）。グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）、および、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）は、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのＧＴＰ−ＧＤＰ結合状態を調節するものであり、これらは、ＰＡＫ１キナーゼによって活性化される下流のシグナル伝達の重要な決定因子である（Ｚｈｏｕ，Ｋ．等（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６７８２〜１６７８６）。
【００１１】
配列番号１および２に、ＰＡＫ１の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｃｄｃ４２およびＲａｃへの強固な結合に必要なＰＡＫ１の配列が、短縮されたフラグメント、および、部位特異的突然変異体の特性を解析すること、同様に、Ｃｄｃ４２とＷＡＳＰの相同セグメントとの複合体の解離構造を決定することによって研究されている（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．等（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９０７１〜２９０７４；Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．Ｇ．等（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１８０６７〜１８０７６；Ａｂｄｕｌ−Ｍａｎａｎ，Ｎ．等（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ，３９９，３７９〜３８３）。ＰＡＫ１のＰＢＤ（ｐ２１結合ドメイン）とオーバーラップするが完全一致ではない部分は、自己阻害に関与するセグメントである（Ｚｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１８，２１５３〜２１６３；Ｌｅｉ，Ｍ．等（２０００年）Ｃｅｌｌ，１０２，３８７〜３９７）。この自己調節的な領域は、阻害スイッチ、および、キナーゼの自己活性化に干渉するキナーゼ阻害ドメインを含む（Ｌｅｉ，Ｍ．等（２０００年）Ｃｅｌｌ １０２，３８７〜３９７）。自己調節的な領域内の突然変異により、構成的に活性な突然変異体が生じる（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）；上記のＬｅｉ，Ｍ．等（２０００年））。哺乳動物細胞におけるＰＡＫ１のアミノ酸８３〜１４９（ＰＡＫ阻害ドメインのＰＩＤ）を含む自己調節的ドメインの発現は、ＰＡＫ１を介する下流エフェクターの活性化を妨害する。従って、このＰＡＫ阻害剤の、構成的に活性なＧＴＰアーゼＣｄｃ４２G12V、ＰＡＫ１のアクチベーターとの共発現により、例えば、末梢のアクチンの微小突起の形成、それに付随するストレスファイバー（通常はこのｐ２１−タンパク質により誘導される）の損失が防がれる（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年の報告によれば、乳ガン細胞におけるＰＡＫ１活性の阻害は、乳ガンの浸潤に関与することがわかっているｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ活性における減少、転写因子ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性の阻害、および、インビボでのＡＰ−１プロモーターによって駆動する転写の抑制に関連している（Ａｄａｍ，Ｌ．等（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１２０４１〜１２０５０）。その上、淋病の病原体であるＮｇｏは、低分子量ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーからのシグナルをＪＮＫおよびＡＰ−１活性化に方向付けるＰＡＫを含む細胞性ストレス応答キナーゼのカスケードを介して、前炎症性サイトカインの活性化を誘導する（Ｎａｕｍａｎｎ，Ｍ．等（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，１２７７〜１２８６）。しかしながら、ＰＡＫファミリーキナーゼが、変形性関節症のような関節病において可能性のある役割を有するという報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の一つの主題は、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症および／または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎の治療のための、ＰＡＫ阻害剤の使用である。また、本ＰＡＫ阻害剤は、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するのに用いることもできる。加えて、ＰＡＫ阻害剤は、上記で述べたように、関節病を治療するための、および／または、上記のような関節痛を治療するための医薬品を製造するのに用いることができる。
【００１４】
本発明に係る用語「阻害剤」は、好ましくは、ＰＡＫのセリン／スレオニンキナーゼ活性、または、ＰＡＫ遺伝子の発現、または、ＰＡＫの細胞中での局在化を阻害するか、または、減少させる、生化学的な物質または化学的な物質を意味し、例えば、Ｋｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．等（２００２年）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２年４月５日，６９７〜７０２で説明されている。セリン／スレオニンキナーゼ活性は、標準的なプロトコールに従って測定することができ、例えばアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），フォスターシティー，カリフォルニア州，米国の、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒTMセリン／スレオニンキナーゼ分析を用いて測定することができる。ＰＡＫ遺伝子の発現は、本発明の実施例で説明されているようなＲＴ−ＰＣＴまたはウェスタンブロット解析によって測定することができる。
【００１５】
用語「ＰＡＫ」は、セリン／スレオニンｐ２１活性化キナーゼのファミリーを意味し、例えば、これらに限定されないが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３および／またはＰＡＫ４が挙げられる。これらのタンパク質は、好ましくは、上述のような低分子量のＧＴＰ結合タンパク質Ｃｄｃ４２やＲａｃの標的として役立つ。特に、用語「ＰＡＫ」は、ヒトＰＡＫ、特にヒトＰＡＫ１を意味する。配列番号１および２は、ヒトＰＡＫ１の核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列番号３、４および５は、ヒトＰＡＫ２、３および４のアミノ酸配列をそれぞれ示す。これらのヒトＰＡＫをコードする遺伝子配列は、遺伝子コードを用いることによって容易に誘導することができる。ヒトＰＡＫ１、２、３および４の遺伝子バンクの登録番号は、それぞれＮＰ＿００２５６７、Ｑ１３１７７、ＮＰ＿００２５６９およびＮＰ＿００５８７５である。非ヒトホモログは、ヒトＰＡＫ１、２、３または４の遺伝子配列を用いて、当業者既知の方法で、例えば、標準的な実験方法に従って、例えばヒトＰＡＫ配列から誘導された適切なプローブを用いたＰＣＲ増幅、または、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション（例えば６０℃で２.５×ＳＳＣ緩衝液、続いて、３７℃で、より低い緩衝液濃度中での洗浄工程を数回）によって単離することができる。
【００１６】
このようなＰＡＫ阻害剤の例は、アミノ酸配列ＨＴＩＨＶＧＦＤＡＶ ＴＧＥＦＴＧＭＰＥＱ ＷＡＲＬＬＱＴＳＮＩ ＴＫＳＥＱＫＫＮＰＱ ＡＶＬＤＶＬＥＦＹＮ ＳＫＫＴＳＮＳＱＫＹ ＭＳＦＴＤＫＳ（配列番号６）を有するＰＡＫ１阻害ドメイン、アミノ酸配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴ ＳＴＭ（配列番号７）を有するＰＡＫ１ペプチド、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ ＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲ ＮＴＳＴＭ（配列番号８）を有するＴａｔ−ＰＡＫ融合ペプチド、ＰＡＫに対して、特に、ＰＡＫの活性部位に対して向けられた結合タンパク質または結合ペプチド、ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫそのものに対して向けられた核酸、化学分子、好ましくは低分子物質、および／または、天然産物の抽出物である。
【００１７】
本発明に係る用語「化学分子」は、非高分子の有機化合物、脂質、炭水化物、ペプチド、好ましくは、約１０〜約８０個のアミノ酸、特に１０〜２５個のアミノ酸を有するペプチド、および、オリゴヌクレオチド、好ましくは約１０〜約９０個のヌクレオチド、特に１５〜２５個のヌクレオチドを包含する。特に好ましくは、低分子量の化学分子、特に非高分子の有機化合物であり、これらは、実験室で合成されたか、または自然界で発見されたかのいずれでもよく、好ましい分子量は、約２００ｇ／モル〜約１５００ｇ／モル、特に４００ｇ／モル〜１０００ｇ／モルである。
【００１８】
あるいは、本発明の阻害剤は、天然産物の抽出物の形態が可能であり、これらは未精製の形態または精製した形態のいずれでもよい。このような抽出物は、水および／またはアルコールおよび／または有機溶媒抽出、および／または、カラムクロマトグラフィー、および／または、動物、植物または微生物源、例えばヘビ毒、葉または微生物の発酵液からの沈殿のような標準的な手法に従って製造することができる。
【００１９】
用語「結合タンパク質」または「結合ペプチド」は、ＰＡＫに結合し、かつ阻害するタンパク質またはペプチドのクラスを意味し、例えば、これらに限定されないが、ＰＡＫに対して向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、および、タンパク質の足場、例えばＰＡＫに対して向けられたアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられる。
【００２０】
抗体または抗体フラグメントの製造手順は、当業者周知の方法に従って、例えば、哺乳動物（例えばウサギ）をＰＡＫで免疫化することによって、必要に応じて、例えば、フロインドアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で行われる（例えばＤｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．等（１９８１年）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４〜１３４９を参照）。その後、免疫反応の結果として動物中で形成されたポリクローナル抗体は、周知の方法を用いて血液から単離することができ、さらに、例えばカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法に従って製造することもできる（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜２９９）。
【００２１】
また、本発明に係る用語「抗体」または「抗体フラグメント」は、組換えによって製造され、必要に応じて改変された、抗体またはそれらの抗原結合部を意味するものとも理解され、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性または多重特異性抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ）、または、Ｆ（ａｂ）2フラグメントである（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３６８６８４、ＵＳ４,８１６,５６７、ＵＳ４,８１６,３９７、ＷＯ８８／０１６４９、ＷＯ９３／０６２１３、または、ＷＯ９８／２４８８４を参照）。
【００２２】
典型的な抗体の代わりに、例えば、ＰＡＫに対するタンパク質の足場を用いることも可能であり、このようなタンパク質としては、例えば、リポカリンに基づくアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）が挙げられる（Ｂｅｓｔｅ等（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１８９８〜１９０３）。リポカリン（例えばレチノール結合タンパク質またはビリン結合タンパク質）の天然のリガンド結合部位は、例えば「コンビナトリアルタンパク質設計」アプローチによって改変でき、この方法では、上記結合部位は、選択されたハプテン、ここにおいてはＰＡＫに結合する（Ｓｋｅｒｒａ，２０００年，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８２，３３７〜５０）。分子を認識するための抗体の代わりとなるその他の既知のタンパク質の足場がわかっている（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１３，１６７〜１８７）。
【００２３】
用語「ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫそのものに対する核酸」は、例えばＰＡＫ遺伝子発現またはＰＡＫ活性を阻害する二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、例えば、これらに限定されないが、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）およびリボザイムが挙げられる。
【００２４】
このような核酸（例えばアンチセンス核酸）は、例えば、ホスホトリエステル方法に従って化学合成できる（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３〜５８４を参照）。アプタマーとは、ポリペプチド（ここにおいてはＰＡＫ）に高い親和性で結合する核酸である。アプタマーは、ＳＥＬＥＸのような選択方法によって、様々な一本鎖ＲＮＡ分子の大規模なプールから単離することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５，１６２８〜５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ（１９９４年）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２０，９７〜１０７；ＵＳ５,５８２,９８１を参照）。また、アプタマーは、合成し、それらの鏡像体の形態で（例えばＬ−リボヌクレオチドとして）選択することもできる（Ｎｏｌｔｅ等（１９９６年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１１１６〜９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ等（１９９６年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１１１２〜５）。この方法で単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼによって分解されないため、より大きい安定性を有するという利益を享受する。
【００２５】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって、特に、細胞中に存在し得るＤＮアーゼおよびＲＮアーゼによって分解する可能性もある。従って、核酸を改変して、それらを分解に対して安定化し、それにより長時間にわたり細胞中で高濃度の核酸が維持されるようにすることが有利である（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９８９〜９４；ＷＯ９５／１１９１０；ＷＯ９８／３７２４０；ＷＯ９７／２９１１６）。典型的には、このような安定化は、１またはそれ以上のインターヌクレオチドのリン基を導入すること、または、１またはそれ以上のリン以外のインターヌクレオチドを導入することにより得ることができる。
【００２６】
適切な改変されたインターヌクレオチドは、上記のＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０年）によって編纂されている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９８９〜９４；ＷＯ９５／１１９１０；ＷＯ９８／３７２４０；ＷＯ９７／２９１１６も参照）。本発明に係る使用のいずれか一つで用いることができる核酸中の、改変されたインターヌクレオチドのリン酸基および／または以外の架橋としては、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、および／または、リン酸エステルが挙げられ、それに対して、リン以外のインターヌクレオチド類似体としては、例えば、シロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート架橋、および／または、チオエーテル架橋が挙げられる。また、このような改変の形態は、本発明に係る使用のいずれか一つで用いることができる医薬組成物の耐久性を改善するとも言える。
【００２７】
適切なアンチセンス核酸の使用が、例えば、ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ（１９９５年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１００，３８０〜２；ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ（１９９３年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８，４１９〜２３，Ｓｔｅｉｎ（１９９２年）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，６，６９７〜７４、または、Ｙａｃｙｓｈｙｎ，Ｂ．Ｒ．等（１９９８年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１４，１１４２）でさらに説明されている。
【００２８】
遺伝子発現（ここにおいてはＰＡＫ遺伝子発現）をダウンレギュレートまたはスイッチオフするプロセスにおけるＲＮＡ干渉のためのツールとしての、ｓｉＲＮＡの生産および使用が、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．等（２００１年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８、または、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．等（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４で説明されている。
【００２９】
また、リボザイムは、ｍＲＮＡに特異的に結合し、切断することができるため、これも核酸（ここではＲＡＫ遺伝子）の翻訳を阻害するための適当なツールである。リボザイムは、例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ等（１９９８年）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５４，１１７５〜２０２；Ｖａｉｓｈ等（１９９８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，５２３７〜４２；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ（１９９７年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，９２１〜２、または、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１２，５１０〜５で説明されている。
【００３０】
従って、上述の核酸を、インビボおよびインビトロの両方で、細胞中のＰＡＫ遺伝子の発現を阻害する、または減少させるのに用いることができ、その結果、本発明の意味でＰＡＫ阻害剤として作用させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムそれぞれとして使用するには、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。医薬品製造のために、本発明のＰＡＫ阻害剤は通常、１種またはそれ以上の製薬上許容できる添加剤または補助剤を用いて製剤化され、このような添加剤または補助剤としては、投与の形態に応じて、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸もしくはペプスタチンＡ、または、金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィン、および／または、黄色ワックスなどが挙げられる。
【００３１】
適切な追加の添加剤としては、例えば、界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００、または、デオキシコール酸ナトリウム、それに加えて、ポリオール、例えばポリエチレングリコールまたはグリセロール、糖類、例えばスクロースまたはグルコース、両性イオン性化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、または、特にタウリンまたはベタイン、および／または、タンパク質、例えばウシまたはヒト血清アルブミンが挙げられる。界面活性剤、ポリオール、および／または、両性イオン性化合物が好ましい。
【００３２】
好ましくは、生理緩衝溶液のｐＨは、約６.０〜８.０、特に約６.８〜７.８、特に約７.４であり、および／または、浸透圧モル濃度は、約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルである。一般的に、本医薬品のｐＨは、適切な有機または無機緩衝液を用いて、例えば、好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）、または、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調節される。一般的に、それぞれの緩衝液の選択は、望ましい緩衝液のモル濃度に依存する。例えば、注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。
【００３３】
本医薬品は、従来の方式で投与することができ、例えば、経口投薬形態（例えば錠剤またはカプセル）によって、粘膜（例えば鼻または口腔）によって、皮下への埋め込みの形態で、本発明に係る医薬品を含む注射、輸液またはゲルによって投与することができる。さらに、上述のような特定の関節病を治療するために、本医薬品を、場合により、リポソーム複合体の形態で、局所的および局在的に投与することが可能である。その上、治療は、本医薬品の一時的な制御放出を可能にする経皮吸収型製剤（ＴＴＳ）によって行うことができる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９７２３Ａ１、または、ＥＰ０８５２４９３Ａ１に記載されている。
【００３４】
一般的に、体に比較的少量の溶液または懸濁液（例えば約１〜約２０ｍｌ）だけを投与する場合、注射液が用いられる。一般的に、それより多い量の溶液または懸濁液（例えば１リットルまたはそれ以上）を投与する場合、輸液が用いられる。輸液用溶液に対して、注射液の場合はほんの２〜３ミリリットルしか投与されないため、注射の際の血液または組織内の流体のｐＨおよび浸透圧とのわずかな差は、痛みの感覚に関して、それ自身重要性を生じないか、または、有意な程の重要性を生じない。それゆえに、一般的に、本発明に係る製剤を使用前に希釈する必要はない。しかしながら、比較的大量を投与する場合、本発明に係る製剤は、投与前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に、一時的に希釈されると予想される。等張溶液の例は、０.９％濃度の塩化ナトリウム溶液である。輸液の場合、希釈は、例えば滅菌水を用いて行うことができ、一方で、投与は、例えばいわゆるバイパスを経由して行うことができる。
【００３５】
上述の核酸は、裸の形態、遺伝子トランスファーベクターの形態、またはリポソームまたは金粒子との複合体の形態で用いることができる。
【００３６】
遺伝子トランスファーベクターの例は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、または、レトロウイルスベクター（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ等（１９９７年），Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３，４６６〜７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２，５４９〜５８）である。リポソームとの複合体は通常、特に皮膚細胞で極めて高効率のトランスフェクションを達成する（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，１９９５年，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９〜８５）。リポフェクションにおいて、カチオン脂質で構成される小型の単層の小胞は、リポソーム懸濁液を超音波処理することによって製造される。ＤＮＡは、正味の正電荷が残存し、全てのプラスミドＤＮＡがリポソームと複合体形成するような割合で、リポソームの表面にイオン結合する。Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．等（１９８７年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８４，７４１３〜７４１４によって用いられているＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム臭化物）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）脂質混合物に加えて、これまで、多数の脂質配合物が合成されており、多種多様な細胞系をトランスフェクトする効率に関して試験されている（Ｂｅｈｒ等（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２〜６９８６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ（１９９１年），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１８９，１９５〜２０３；Ｆｅｌｇｎｅｒ等（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５５０〜２５６１）。脂質配合物の例は、ＤＯＴＡＰ Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、または、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。
【００３７】
核酸の細胞へのトランスファーを高める補助剤としては、例えば、核酸が細胞の細胞核に輸送されるようにするＤＮＡに結合するタンパク質もしくはペプチド、または、合成ペプチド−ＤＮＡ分子が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ等（１９９９年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２８２；Ｂｒａｎｄｅｎ等（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７，７８４）。また、補助剤としては、核酸が細胞の細胞質に放出されるようにする分子も挙げられる（Ｐｌａｎｃｋ等（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒ等（１９９７年）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，２１３）、または、例えばリポソーム（上記のＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０年））。
【００３８】
その他の特に適した形態は、上述の核酸を金粒子に塗布し、これらの粒子を、いわゆる「ジーンガン」を用いて組織または細胞に発射することにより得ることができる（Ｗａｎｇ等（１９９９年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：７７５〜８１，Ｔｕｔｉｎｇ等（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１８３〜８）。
【００３９】
本発明のその他の主題は、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎を治療するための、および／または、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するための、ＰＡＫ阻害剤を発見するための標的としての、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子の使用である。好ましくは、ＰＡＫ阻害剤は、上述のような医薬品の形態で用いることができる。
【００４０】
従って、本発明はまた、ＰＡＫ阻害剤をスクリーニングする方法にも言及し、前記方法は：
（ａ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、および、
（ｃ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する工程、を含む。
【００４１】
一般的に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子は、例えば分析システム中で提供され、試験化合物、特に生化学的または化学的な試験化合物に、例えば化学物質ライブラリーの形態で、直接的にまたは間接的に接触させる。次に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する。その後、適切な阻害剤を解析および／または単離することができる。化学物質ライブラリーのスクリーニングには、当業者既知の、または市販のハイスループット分析の使用が好ましい。
【００４２】
本発明に係る用語「化学物質ライブラリー」は、化学合成された分子や天然産物などの複数の源のいずれかより集められた、または、コンビナトリアルケミストリー技術によって生成した複数の化学物質を意味する。
【００４３】
一般的に、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスアッセイで測定または検出される。本発明で用いられるように、ヘテロジニアスアッセイは、１またはそれ以上の洗浄工程を含む分析であり、それに対して、ホモジニアスアッセイでは、このような洗浄工程は必要ない。試薬および化合物を混合するだけで測定される。
【００４４】
適切な機能分析は、ＰＡＫの遺伝子発現、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１またはＣｈｐのようなＧＴＰアーゼによるＰＡＫの直接的な活性化、または、活性化（ＧＴＰ結合型）ｐ２１との複合体形成に基づいていてもよい。ＰＡＫの阻害剤として試験しようとする生化学的な物質または化学物質の存在下で、遺伝子発現、直接的な活性化、または、例えば上述したような細胞タンパク質のような他のタンパク質との複合体形成は、一般的に当業者既知の手段によって、基準となり得る。一般的に、市販のキナーゼ分析システムは、基質に取り込まれたリン酸塩の量を定量的に検出する。
【００４５】
例えば、末梢のアクチンの微小突起形成の予防と、それに付随するストレスファイバーの損失は、上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）で説明されているように測定することができる。
【００４６】
ヘテロジニアスアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＦＩＡ、ＳＰＡおよびフラッシュプレート分析である。
【００４７】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）に基づく分析は、様々な会社から提供されている。この分析は、ＰＡＫのようなキナーゼによってリン酸化可能なランダムペプチドを用いている。通常、キナーゼを含むサンプルは、例えばＡＴＰと必要なカチオンを含む反応緩衝液に希釈し、次に、プレートのウェルに添加する。単に混合物を除去することによって反応を止める。その後、プレートを洗浄する。例えばビオチン化基質をキナーゼに添加することによって、反応を開始させる。反応後、特異的抗体を添加する。通常、サンプルを、予めブロックされたタンパク質−Ｇプレートにトランスファーし、洗浄後に、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰを添加する。その後、未結合のストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を除去し、ペルオキシダーゼ基質の添加によってペルオキシダーゼ染色反応を開始させ、適切なデンシトメーターで光学密度を測定する。
【００４８】
ＤＥＬＦＩＡ（解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ）に基づく分析は、固相分析である。通常、その抗体は、ユーロピウムまたはその他のランタニドで標識されており、未結合のユーロピウム標識抗体を洗浄して除いた後に、ユーロピウム蛍光が検出される。
【００４９】
通常、ＳＰＡ（シンチレーション近接分析）、および、フラッシュプレート分析は、放射標識基質を捕捉するためにビオチン／アビジン相互作用を利用している。一般的に、反応混合物は、キナーゼ、ビオチン化ペプチド基質、および、γ−［Ｐ33］ＡＴＰを含む。反応後に、ビオチン化ペプチドはストレプトアビジンによって捕捉される。ＳＰＡ検出において、ストレプトアビジンは、シンチラントを含むビーズに結合し、それに対して、フラッシュプレート検出では、ストレプトアビジンは、シンチラントを含むマイクロプレートのウェル内部に結合する。一度固定されれば、放射標識基質は、光の発光を刺激するのに十分な程度にシンチラントに近接する。
【００５０】
その代わりとして、ホモジニアスアッセイは、例えば、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＦＰ、ＡＬＰＨＡ、および、遺伝子分析である。
【００５１】
ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）に基づく分析は、通常、ユーロピウムと、ＡＰＣ、改変されたアロフィコシアニン、または、スペクトルがオーバーラップするその他の色素、例えばＣｙ３／Ｃｙ５またはＣｙ５／Ｃｙ７との間の蛍光共鳴エネルギーの移動を利用する分析である（Ｓｃｈｏｂｅｌ，Ｕ．等（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０，１１０７〜１１１４）。例えば３３７ｎｍの光によるユーロピウムの励起の後に、分子は、６２０ｎｍで蛍光を発する。しかしながら、このフルオロフォアがＡＰＣと十分に近接している場合、ユーロピウムは、その励起エネルギーを、６６５ｎｍで蛍光を発するＡＰＣに移動させると予想される。通常、キナーゼ基質はビオチンで標識された基質である。キナーゼ反応後に、ユーロピウムで標識された（Ｐ）特異的抗体を、ストレプトアビジン−ＡＰＣと共に添加する。リン酸化ペプチドは、ユーロピウムで標識された抗体とストレプトアビジン−ＡＰＣを近接させて接触させる。ＡＰＣのユーロピウムフルオロフォアへの近接は、ＡＰＣ蛍光（ＦＲＥＴ）によるユーロピウム蛍光の消光を引き起こすと予想される。
【００５２】
蛍光偏光（ＦＰ）に基づく分析は、偏光を用いて、溶液中で蛍光性の基質ペプチドを励起させる分析である。これらの蛍光性のペプチドは、溶液中で遊離して、崩壊しており、放出された光の偏光解消を引き起こす。しかしながら、基質ペプチドがそれより大きい分子に結合する場合、このような（Ｐ）−Ｔｙｒは、その崩壊速度は大きく減少し、および、放出された光は高度に偏光したままになる。キナーゼ分析のためには、一般的に２つの選択肢がある：
（ａ）蛍光ホスホペプチドトレーサーが、（Ｐ）−特異的抗体に結合する。リン酸化産物は、抗体からの蛍光ホスホペプチドと競合し、偏光の高から低への変化を引き起こすと予想される。
（ｂ）リン酸化基質ペプチドが、リン酸特異的な抗体に結合し、偏光の低から高への変化を引き起こす。
【００５３】
ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアス）に基づく分析は、リン酸化ペプチドによって近接に運ばれたドナービーズとアクセプタービーズ間の一重項酸素の移動に依存する分析である。６８０ｎｍでの励起の際、ドナービーズ中の光線感作物質が、雰囲気酸素を一重項状の酸素に変換し、これが、２００ｎｍの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、ビーズ内の蛍光性のアクセプターにエネルギーを移動させ、その結果、約６００ｎｍで光を放出する。
【００５４】
特に化合物のハイスループットスクリーニングのためには、ＥＦＣ（酵素断片コンプリメンテーション）に基づく分析、またはそれと同等の分析を用いることができる。ＥＦＣ分析は、２つのフラグメント、すなわち酵素アクセプター（ＥＡ）と酵素ドナー（ＥＤ）からなる加工されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づく。フラグメントが分離されている場合、β−ガラクトシダーゼ活性は生じないが、フラグメントが一緒になると、それらは会合して（補って）、活性酵素を形成する。ＥＦＣ分析は、ＥＤ−分析物結合体を利用しており、ここにおいて、分析物は、抗体または受容体のような特異的結合タンパク質によって認識され得る。特異的結合タンパク質の非存在下では、ＥＤ−分析物結合体は、ＥＡを補うことができ、それにより、活性β−ガラクトシダーゼが形成され、陽性の発光シグナルが生産される。ＥＤ−分析物結合体が、特異的結合タンパク質によって結合する場合、ＥＡで補うことが阻害され、シグナルは生じない。遊離の分析物が提供される場合（サンプル中に）、特異的結合タンパク質への結合に関して、ＥＤ−分析物結合体と競合することが予想される。遊離の分析物は、ＥＡで補うためにＥＤ−分析物結合体を放出し、サンプル中に存在する遊離の分析物の量に応じたシグナルを生産すると予想される。
【００５５】
遺伝子分析の例は、２ハイブリッドシステム分析である（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｍｇｌａｎｚ（１９９４年）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，２８６〜２９２；ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ（１９９８年）ＴＩＢＴＥＣＨ，１６，３５５〜３６３）。この試験において、細胞は、本発明に係るポリペプチドと、転写因子のＤＮＡ−結合ドメイン（例えばＧａｌ４またはＬｅｘＡ）からなる融合タンパク質を発現する発現ベクターで形質転換される。形質転換された細胞は加えて、レポーター遺伝子（そのプロモーターは、対応するＤＮＡ−結合ドメインのための結合部位を含む）を含む。既知または未知のポリペプチドと、活性化ドメイン（例えばＧａｌ４または単純疱疹ウイルス ＶＰ１６由来）からなる第二の融合タンパク質を発現するその他の発現ベクターで形質転換することによって、第二の融合タンパク質がそのポリペプチドと相互作用する場合、レポーター遺伝子の発現を大きく高めることができる。その結果として、この試験システムは、ＰＡＫと、例えばＧＴＰアーゼ、例えばＣｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１またはＣｈｐ、または、活性化された（ＧＴＰ結合型）ｐ２１との相互作用を阻害する生化学的な物質または化学物質のスクリーニングに用いることができる（例えばＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３７４〜８１を参照）。この方法によって、関節病を治療するのに用いることができる新規の活性化合物を迅速に同定することが可能である。
【００５６】
その代わりに、試験化合物が、タンパク質またはペプチドである場合、この試験化合物と、ＰＡＫの存在下におけるＰＡＫのアクチベーターとして、ＧＴＰアーゼ、例えばＲａｃ１、Ｗｒｃｈ−１、Ｃｈｐまたは構成的に活性なＣｄｃ４２との共発現を用いて、例えば上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年）で説明されているようにして、ＰＡＫに対する試験化合物の影響を測定または検出することができる。
【００５７】
その他の遺伝子分析の例は、機能分析であり、この場合、キナーゼの活性が、機能的な細胞の反応、例えば増殖、増殖の停止、分化またはアポトーシスに変換される。このタイプのスクリーニングのためには、酵母が、特に適切なモデル系である。例えばＰＡＫ１−酵母における機能分析において、グルコースを含む培地で培養した場合、例えばＰＡＫ１−酵母細胞は、正常な酵母細胞と同様に増殖する。しかしながら、ガラクトースと接触させた場合、ＰＡＫ１の細胞内発現が誘導され、酵母細胞に死をもたらす；この場合、ＰＡＫ１活性を阻害する化合物は、細胞死を防ぐ。
【００５８】
その他の分析は、固相結合ポリペプチド、例えばＰＡＫ、ＧＴＰアーゼ、例えばＣｄｃ４２、Ｒａｃ１、Ｗｒｃｈ−１もしくはＣｈｐ、または活性化（ＧＲＰ結合型）ｐ２１、および、試験しようとする化合物での干渉に基づく。従って、試験化合物は、例えば、検出可能なマーカーを含み、例えば、すでに上述したように、化合物を、放射標識、蛍光標識または発光標識することができる。その上、化合物は、タンパク質にカップリングさせることができ、それによって、例えば、クロモジェニック基質を用いるペルオキシダーゼ分析を用いた酵素による触媒作用によって、または、検出可能な抗体の結合によって間接的な検出が可能である。その他の可能性は、マススペクトロメトリーによって固相結合タンパク質複合体を調査することである（ＳＥＬＤＩ）。試験物質との相互作用の結果としての、例えば上述のＰＡＣまたは他方のタンパク質のコンフォメーション変化は、例えば、ポリペプチドの内因性トリプトファン残基の蛍光変化によって検出することができる。
【００５９】
また、固相結合ポリペプチドは、アレイの一部であってもよい。このようなアレイを固相化学と光不安定性の保護基を用いて製造する方法が、例えばＵＳ５,７４４,３０５に開示されている。これらのアレイはまた、試験化合物または化合物ライブラリーと接触させ
、相互作用、例えば結合またはコンフォメーション変化に関して試験することもできる。
【００６０】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、細胞全体を用いて行われる。通常、マルチウェルプレートの底部で増殖させた細胞を、固定し、膜透過させ、ブロッキングし、例えば対象の基質に対する一次（Ｐ）−特異的抗体とインキュベートする。次に、例えばユーロピウムで標識した、または、ＨＲＰに接合させた二次抗体を、例えば上述のような特異的な化学発光物質または比色物質と併せて利用して、シグナルを発生させる。顕微鏡を併用することによって、（Ｐ）−特異的抗体の量を単細胞レベルで定量することができ、加えて、リン酸化で誘導された基質の転位、または、細胞の形態学的な変化も定量することができる。
【００６１】
有利には、本発明の方法は、ロボットシステムで行われ、このようなシステムとしては、例えば、ロボット式プレーティングや、ロボット利用の液体移動システム、例えば、マイクロフルイディクスを用いた、すなわち流体を導く構造（ｃｈａｎｎｅｌｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）のシステムが挙げられる。
【００６２】
その他の本発明の実施形態において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利には、スクリーニング方法は自動化され、小型化されており、特に小型化されたウェルを用いており、マイクロフルイディクスはロボット制御される。
【００６３】
その他の実施形態において、本発明はまた、関節病、特に変性関節病、例えば変形性関節症または炎症性関節病、例えばリウマチ様関節炎を治療するための医薬品、および／または、特に、変性関節病における関節痛を減少させることによって関節痛を治療するための医薬品を製造する方法にも言及し、本方法は：
（ａ）請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法を行う工程、
（ｂ）測定または検出された、関節病および／または関節痛を治療するのに適した試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）例えば上述したように、測定または検出された試験化合物を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤を用いて製剤化する工程、
を含む。
【００６４】
以下の図、配列および実施例は、本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
図１Ａ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞の抽出物、および、ヒト一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１の発現を示す。
【００６６】
ヒトＨＥＫ２９３細胞の抽出物、同様に、変形性関節症の患者の軟骨由来の、およびコントロールの軟骨由来のヒト一次軟骨細胞を、二次元ゲル電気泳動によって分離した。ウェスタンブロッティングによってタンパク質をＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、特異的抗体によってＰＡＫ１を検出した。
【００６７】
図２は、ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現を抑制したことを示す。
【００６８】
ＰＡＫ１阻害ドメインを、ｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングし、ＳＷ１３５３細胞にトランスフェクションした。適宜、ＩＬ−１βを、濃度１０ｎｇ／ｍｌで２４時間の刺激として用いた。上清を回収し、ＭＭＰ１３タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値は任意単位で示し、少なくとも３つの独立した結果±ＳＤを示す。格子縞のカラムは、ベクターｐＣＥＰ４（空のベクター）を用いた実験を示し、黒いカラムは、ベクターｐＣＥＰ４＿ＰＡＫ１−１Ｄを用いた実験を示す。
【００６９】
図３は、ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現を抑制したことを示す。
【００７０】
ＰＡＫ１阻害ドメインを、ｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングし、ＳＷ１３５３細胞にトランスフェクションした。ＩＬ−１βとＴＮＦαの両方を組み合わせて、濃度１０ｎｇ／ｍｌで２４時間、細胞を刺激した。上清を回収し、ＭＭＰ１３タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値（任意単位）は、２回の実験の平均を示す。点描のカラムは、ベクターを用いず、ＩＬ−１βとＴＮＦαを用いた実験を示す。格子縞のカラムは、ベクターｐＣＥＰ４（空のベクター）と、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを用いた実験を示す。黒いカラムは、ベクターｐＣＥＰ４＿ＰＡＫ１−ＩＤと、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを用いた実験を示す。
【００７１】
図４は、ヒトＨＥＫ２９３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＩＬ−８の発現を抑制したことを示す。
【００７２】
ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングされたＰＡＫ１阻害ドメインを、ＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクションした。細胞を、ＩＬ−１βで、濃度１０ｎｇ／ｍｌで所定時間刺激した。上清を回収し、ＩＬ−８タンパク質の量をＥＬＩＳＡで決定した。値（任意単位）は、２回の実験の平均を示す。丸は、ベクターｐＣＤＮＡ３.１＿ＰＡＫ１−ＩＤと、ＩＬ−１βを用いた実験を示し、四角は、ベクターｐＣＤＮＡ３.１（空のベクター）と、ＩＬ−１βを用いた実験を示す。
【００７３】
配列の説明
配列番号１は、ＰＡＫ１の核酸配列を示す。
配列番号２は、ＰＡＫ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＰＡＫ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＰＡＫ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＰＡＫ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＰＡＫ１阻害ドメイン（ＰＡＫ１−ＩＤ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、上記のＫｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．（２００２年）に記載のＰＡＫ１のプロリンリッチな阻害剤の配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、上記のＫｉｏｓｓｅｓ，Ｗ．Ｂ．（２００２年）に記載のＨＩＶ ｔａｔタンパク質由来の多塩基性の配列に融合したＰＡＫ１のプロリンリッチな配列を含む合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的化するための第一のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１０は、ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的化するための第二のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１１は、ＰＡＫ１−ＩＤを増幅するための第一のＰＣＲプライマーを示す。
配列番号１２は、ＰＡＫ１−ＩＤを増幅するための第二のＰＣＲプライマーを示す。
【実施例】
【００７４】
１．方法
１．１：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
まず、ゲノムＤＮＡによる汚染を防ぐために、トータルＲＮＡ（１μｇ）を、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼＩ（１ユニット）で消化した。次に、ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡを、製造元が提供した手順に従って、サーモスクリプト（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、オリゴ（ｄＴ）２０で開始させてｃＤＮＡに逆転写させた。ヒトＰＡＫ１ｃＤＮＡとマウスＰＡＫ１ｃＤＮＡとの間で保存された配列を標的とする５’−ＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣＡ−３’（配列番号９）と、５’−ＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１０）（ＭＷＧバイオテク社（ＭＷＧ，Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ），ドイツ）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、エキスパンド・ハイ・フィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ），ドイツ）を５０μｌの反応液あたり２.６ユニットを用いて、９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、および、７２℃／４５秒を２５サイクルであった。
【００７５】
１．２：ベクターコンストラクトの設計
ＰＡＫ１の自己阻害的ドメインと同定されたＰＡＫ１の残基８３〜１４９をコードするポリペプチド（上記のＺｈａｏ，Ｚ．Ｓ．等（１９９８年））を、ＰＣＲで増幅した。増幅に用いられたプライマーは、
５’ＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１１）
（コザック配列は下線で示し、血球凝集素（ＨＡ）タグは太字で示した）、および、
５’−ＡＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１２）（ＭＷＧバイオテク社，ドイツ）であった。ＰＣＲ条件は、エキスパンド・ハイ・フィデリティＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）を５０μｌの反応液あたり２.６ユニットを用いて、９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、および、７２℃／３０秒を２５サイクルであった。そのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−ＴＯＰＯ２.１ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ），ドイツ）にサブクローニングした。ＨＡタグを有するＰＡＫ１を、哺乳動物ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン社，ドイツ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に導入した。ＰＡＫ１−ＩＤを、５’ＨｉｎｄＩＩＩ、および、３’ＮｏｔＩ制限部位を介してｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン社，ドイツ）に挿入した。全てのプラスミドは、配列解析で確認された。
【００７６】
１．３：細胞培養
ヒトＳＷ１３５３軟骨肉腫の培養物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）とペニシリン／ストレプトマイシン（３７℃、５％ＣＯ2）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。トランスフェクションのために、６×１０4／ウェルを一晩培養し、次の日、ＤＮＡ（２μｇ）とＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲTMトランスフェクション試薬（ジーン・セラピー・システムズ社（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）（１０μｌ）でトランスフェクションさせた。３時間後に、２０％ＦＣＳを含む等量の培地を添加し、一晩インキュベートした。ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン社，ドイツ）を用いた過剰発現の場合、トランスフェクションの２日後に、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社，ドイツ）を用いて細胞を選択した。トランスフェクション効率を、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），マウンテンビュー，カリフォルニア州，米国）を用いて、倒立蛍光顕微鏡上で試験した。ほとんどの実験で、６００００個の細胞を、３５ｍｍの６ウェルプレートの各ウェルにトランスファーした。刺激の前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＣＳ非含有ＤＭＥＭで３０分間培養した。実験のために、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１β（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）含有または非含有、および、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）含有または非含有の血清非含有ＤＭＥＭ（１ｍｌ）中に２４時間置いた。
【００７７】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３を、１０％ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。トランスフェクション実験のために、トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、６ウェルの培養皿に５×１０5細胞／ウェルで植えた。ウェルあたりリポフェクトアミン(R)（ライフテクノロジーズ社，米国）２０μｌと、トータルＤＮＡ５.０μｇを含む無血清培地（１.０ｍＬ）中で、細胞を４時間インキュベートした（ｐｃＤＮＡ３.１−ＰＡＫ１（８３〜１４９）プラスミドまたはｐｃＤＮＡ．１の空のベクターが、コントロールとして用いられた）。細胞を未処理のままにするか、または、回収期間（１６時間）の後、１０％ウシ胎児を含む培地中で、インターロイキン−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），ミネアポリス，ミネソタ州，米国）で刺激した。培養上清を除去し、ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄシステムズ社，ミネアポリス，ミネソタ州，米国）、ＰＧＥ２（ＳｐｉＢｉｏｍ Ｉｎｃ．）、および、ＭＭＰ−１３（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）の発現を、ＥＬＩＳＡで製造元が提供した手順に従ってモニターした。
【００７８】
１．４：ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡ
ＨＡタグを有するＰＡＫ183-149ペプチドの発現を評価するために、細胞を、完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ドイツ）が追加された溶解緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０，５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０（１００μｌ）に溶解させ、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質分析キット（ピアース・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．），ロックフォード，イリノイ州，米国）を用いて決定した。タンパク質を、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社，米国）にトランスファーする前に、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン社，ドイツ）によって分離した。
【００７９】
変形性関節症に罹った患者の組織由来のヒト一次軟骨細胞、同様に、正常な組織由来のヒト一次軟骨細胞から、タンパク質抽出物を、標準的な技術に従って製造した。ＰＡＫ１の発現を、タンパク質３０μｇを用いた二次元ゲル電気泳動と免疫ブロッティングで調査した。二次元ゲル電気泳動には、等電点分画法を、直線状の７ｃｍの固定されたｐＨ３〜１０勾配のＩＰＧストリップ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．），米国）を用いて、タンパク質ＩＥＦ細胞（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社，米国）で行った。最終的な焦点合わせの工程は、４０００Ｖで８時間であった。二次元ゲル電気泳動を、ＮｕＰＡＧＥノヴェックス４〜１２％ＺＯＯＭゲル（インビトロジェン社，ドイツ）で行い、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社，米国）にトランスファーした。
【００８０】
免疫ブロッティングのために、ＨＡタグを有するＰＡＫ183-149とＰＡＫ１タンパク質を、それぞれＨＡタグポリクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），パロアルト，カリフォルニア州，米国）と、αＰＡＫ（Ｎ−２０）ポリクローナル抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））を用いて検出した。簡単に言えば、メンブレンを、ＴＢＳ−Ｔ（５％の無脂肪の粉乳を含む、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.６、０.１％トゥイーン２０９）で、室温で１時間ブロックした；１／５００希釈したＨＡタグ抗体または１／５０希釈したαＰＡＫ（Ｎ−２０）抗体のいずれかを含むＴＢＳ−Ｔ中で、室温で１時間インキュベートし、最終的に、１／１００００の抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（ピアース）を含むＴＢＳ−Ｔ中で、１時間インキュベートした。メンブレンを、ＥＣＬを製造元の説明書（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）に従って用いて加工した。
【００８１】
ＭＭＰ１３、ＩＬ−８およびＰＧＥ２タンパク質レベルを解析するために、細胞培養の上清を、ＥＬＩＳＡで、ＭＭＰ１３（アマシャム・ファルマシ・アバイオテク社）、ＩＬ−８（Ｒ＆Ｄシステムズ社，ミネアポリス，ミネソタ州，米国）およびＰＧＥ２（ＳｐｉＢｉｏ）に関して供給元により説明されているようにして決定した。
【００８２】
２．結果
２．１：ヒト軟骨肉腫細胞系、および、マウス一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１発現
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、レチノイン酸で刺激した、または刺激されていないヒトＳＷ１３５３軟骨細胞系、同様にマウス一次細胞におけるＰＡＫ１の発現を解析した。
この実験で得られた結果から、ヒトＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞系、同様にマウス一次軟骨細胞で、ＰＡＫ１が発現されることがはっきりと実証された。さらなる一連の実験で、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒトＣＨ８軟骨細胞系におけるＰＡＫ１の発現を確認した。
また、ＲＮＡレベルで示された結果は、ＰＡＫ１に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析を用いることによってタンパク質レベルでも確認された（図１）。
総合すると、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでの結果により、ヒトおよびマウスの、軟骨細胞系および一次軟骨細胞において、ＰＡＫ１が発現されることが確認された。
【００８３】
２．２：ＩＬ−１シグナル伝達によるＰＡＫ１の阻害ドメイン発現の干渉：
ＭＭＰ１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ１３）は、変形性関節症に関連するタンパク質のＩＬ−１により誘導された発現に関する重要なマーカータンパク質の代表である。ＩＬ−１からＭＭＰ１３発現の誘導をもたらすシグナル伝達のためのＰＡＫ１に関する必要条件を研究するために、ヒト軟骨肉腫細胞系ＳＷ１３５３において、ＰＡＫ１阻害ドメイン（ＰＡＫ１−ＩＤ）を過剰発現させた（図２）。
【００８４】
トランスフェクションされた、同様に、トランスフェクションされていないＳＷ１３５３細胞において、ＩＬ−１βへの接触により、ＭＭＰ１３の発現と、培地への放出が大幅に増加した。この実験の結果により、ヒトＳＷ１３５３軟骨細胞系において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現により、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現が約５５％まで阻害されることがはっきりと実証された。その上、トランスフェクションされた、同様に、トランスフェクションされていないＳＷ１３５３細胞において、培地へのＭＭＰ１３分泌の基底レベルを観察することができた。上記の刺激されていない細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの発現により、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現が、８０％を超過して阻害され得る。総合すると、これらの結果より、ＰＡＫ１が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現に必要であることが確認される。
【００８５】
その他の重要なマーカー遺伝子は、プロスタグランジンＰＧＥ２である。ＳＷ１３５３細胞におけるＰＧＥ２発現の調節を、それぞれＰＡＫ１−ＩＤの存在下および非存在下で解析した（図３）。
【００８６】
ＭＭＰ１３発現の阻害で観察されたように、これらの結果により、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現によるＰＡＫ１の阻害は、ＩＬ−１βにより誘導されたシグナル伝達経路の顕著なダウンレギュレーションを引き起こすことが確認された。ＳＷ１３５３細胞系において、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現は、５０％を超えて阻害された。その上、ＰＧＥ２の調節は、変形性関節症における痛みに関連するプロセスにＰＡＫ１が関与することを示す。
【００８７】
ＳＷ１３５３細胞におけるそれらの作用に加えて、我々は、さらにヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞系においても、ＰＡＫ１−ＩＤの作用、すなわちその生物学的な阻害剤によるＰＡＫ１活性の干渉を調査した（図４）。
【００８８】
この実験の結果により、ＳＷ１３５３細胞における研究で得られた発見が確認された。ＰＡＫ１は、ＩＬ−１βにより誘導され、ＩＬ−１Ｒの活性化に始まり、転写因子の活性化を引き起こし、変形性関節症と痛みに関連するマーカー遺伝子の発現、例えばＭＭＰ１３、ＩＬ−８、および、ＰＧＥ２をアップレギュレーションするシグナル伝達カスケードの調節において、必須の役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】１Ａ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞の抽出物、および、ヒト一次軟骨細胞におけるＰＡＫ１の発現を示す。
【図２】ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＭＭＰ１３の発現を抑制したことを示す。
【図３】ヒトＳＷ１３５３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＰＧＥ２の発現を抑制したことを示す。
【図４】ヒトＨＥＫ２９３細胞において、ＰＡＫ１−ＩＤの過剰発現が、ＩＬ−１βにより誘導されたＩＬ−８の発現を抑制したことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節病を治療する医薬品を製造するための、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用。
【請求項２】
関節病は、変性関節病または炎症性関節病である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
変性関節病は、変形性関節症である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
炎症性関節病は、リウマチ様関節炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
関節痛を治療する医薬品を製造するための、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用。
【請求項６】
関節痛は、変性関節病に関連する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ＰＡＫは、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３またはＰＡＫ４であり、好ましくはヒトＰＡＫ１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ＰＡＫ阻害剤は、アミノ酸配列ＨＴＩＨＶＧＦＤＡＶ ＴＧＥＦＴＧＭＰＥＱ ＷＡＲＬＬＱＴＳＮＩ ＴＫＳＥＱＫＫＮＰＱ ＡＶＬＤＶＬＥＦＹＮ ＳＫＫＴＳＮＳＱＫＹ ＭＳＦＴＤＫＳ（配列番号６）を有するＰＡＫ１阻害ドメイン、アミノ酸配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴ ＳＴＭ（配列番号７）を有するＰＡＫ１ペプチド、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ ＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲ ＮＴＳＴＭ（配列番号８）を有するＴａｔ−ＰＡＫ融合ペプチド、ＰＡＫに対して向けられた結合タンパク質または結合ペプチド、ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫに対して向けられた核酸、化学分子および／または天然産物の抽出物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
結合タンパク質または結合ペプチドは、ＰＡＫに対する抗体、抗体の抗原結合部、または、タンパク質の足場、好ましくはアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
核酸は、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
関節病または関節痛を治療するための医薬品としてのＰＡＫ阻害剤を発見するための標的タンパク質としてのＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子の使用。
【請求項１２】
ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を、試験化合物に直接的または間接的に接触させ、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１３】
（ａ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、および
（ｃ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定またはを検出する工程、
を含む、ＰＡＫ阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスアッセイで測定または検出される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘテロジニアスアッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、ＤＥＬＦＩＡ（解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ）、ＳＰＡ（シンチレーション近接分析）、または、フラッシュプレート分析である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホモジニアスアッセイは、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）分析、ＦＰ（蛍光偏光）分析、ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法）、ＥＦＣ（酵素断片コンプリメンテーション）分析、または、遺伝子分析である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
方法は、アレイで行われる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法は、細胞全体を用いて行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法は、ロボットシステムで行われる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
方法は、マイクロフルイディクスを用いて行われる、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法は、ＰＡＫ阻害剤をハイスループットスクリーニングする方法である、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法を行う工程、
（ｂ）測定または検出された、関節病および／または関節痛を治療するのに適した試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）測定または検出された試験化合物を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤を用いて製剤化する工程、
を含む、関節病および／または関節痛を治療するための医薬品を製造する方法。
【請求項１】
関節病を治療する医薬品を製造するための、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用。
【請求項２】
関節病は、変性関節病または炎症性関節病である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
変性関節病は、変形性関節症である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
炎症性関節病は、リウマチ様関節炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
関節痛を治療する医薬品を製造するための、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤の使用。
【請求項６】
関節痛は、変性関節病に関連する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ＰＡＫは、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３またはＰＡＫ４であり、好ましくはヒトＰＡＫ１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ＰＡＫ阻害剤は、アミノ酸配列ＨＴＩＨＶＧＦＤＡＶ ＴＧＥＦＴＧＭＰＥＱ ＷＡＲＬＬＱＴＳＮＩ ＴＫＳＥＱＫＫＮＰＱ ＡＶＬＤＶＬＥＦＹＮ ＳＫＫＴＳＮＳＱＫＹ ＭＳＦＴＤＫＳ（配列番号６）を有するＰＡＫ１阻害ドメイン、アミノ酸配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴ ＳＴＭ（配列番号７）を有するＰＡＫ１ペプチド、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ ＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲ ＮＴＳＴＭ（配列番号８）を有するＴａｔ−ＰＡＫ融合ペプチド、ＰＡＫに対して向けられた結合タンパク質または結合ペプチド、ＰＡＫ遺伝子またはＰＡＫに対して向けられた核酸、化学分子および／または天然産物の抽出物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
結合タンパク質または結合ペプチドは、ＰＡＫに対する抗体、抗体の抗原結合部、または、タンパク質の足場、好ましくはアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
核酸は、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
関節病または関節痛を治療するための医薬品としてのＰＡＫ阻害剤を発見するための標的タンパク質としてのＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子の使用。
【請求項１２】
ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を、試験化合物に直接的または間接的に接触させ、ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定または検出する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１３】
（ａ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、および
（ｃ）ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響を測定またはを検出する工程、
を含む、ＰＡＫ阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＡＫまたはＰＡＫ遺伝子に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスアッセイで測定または検出される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘテロジニアスアッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、ＤＥＬＦＩＡ（解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ）、ＳＰＡ（シンチレーション近接分析）、または、フラッシュプレート分析である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホモジニアスアッセイは、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）分析、ＦＰ（蛍光偏光）分析、ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法）、ＥＦＣ（酵素断片コンプリメンテーション）分析、または、遺伝子分析である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
方法は、アレイで行われる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法は、細胞全体を用いて行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法は、ロボットシステムで行われる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
方法は、マイクロフルイディクスを用いて行われる、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法は、ＰＡＫ阻害剤をハイスループットスクリーニングする方法である、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法を行う工程、
（ｂ）測定または検出された、関節病および／または関節痛を治療するのに適した試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）測定または検出された試験化合物を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤を用いて製剤化する工程、
を含む、関節病および／または関節痛を治療するための医薬品を製造する方法。
【公表番号】特表２００７−５３７１３４（Ｐ２００７−５３７１３４Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１９８８２（Ｐ２００６−５１９８８２）
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１７２１
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１７２１
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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