ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する腫瘍の転移を予防及び治療するためのｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用
本発明は、ｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用、及びｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する腫瘍の転移の予防及び治療のスクリーニング方法、及び前記転移の予後のための診断キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する腫瘍の転移を予防及び治療するためのｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用、前記阻害剤のスクリーニング方法、及び転移の検出のための診断キットに関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、乳房膿瘍、肉腫、メラノーマ、神経芽細胞腫の転移を予防及び治療するためのｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用、及び前記阻害剤のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、前記腫瘍の転移の診断キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＰＲＵＮＥ（ｈ−ＰＲＵＮＥ）タンパク質は、ＤＨＨスーパーファミリーに属し、これは、細菌の核ＲｅｃＪ並びに酵母及び細菌のピロホスファターゼなどのいくつかのホスホエステラーゼを含む（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）。
【０００４】
ＤＨＨスーパーファミリーは、それぞれのグループ内に、但し様々なグループにまたがらずに、非常によく保存されている−Ｃ末端モチーフに基づき２つの主要なグループに分けることができる。このスーパーファミリーのすべてのメンバーは、イオン結合に関わり、ホスホエステル化に触媒作用を及ぼすことが予測される高く保存されている荷電アミノ酸残基を含む４つの他のモチーフを有する。これらの主要な特性は、第３のモチーフ、つまりＤＨＨ（Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）であり、このスーパーファミリーはそれにちなんで名付けられている。
【０００５】
ＲｅｃＪタンパク質は、ＤＮＡ修復タンパク質であり、他のヌクレアーゼ及びきちんと特徴付けされていない細菌タンパク質と共に、第１のグループに属しているが、ＰＲＵＮＥ及びポリホスファターゼは第２のグループに属している。
【０００６】
ショウジョウバエの遺伝子ＰＲＵＮＥは、元々、野生型のハエの真っ赤な目とは対照的に、ドロソプテリンの減少による目の茶色がかった紫色を示す突然変異表現型に基づいて特徴付けられたものである（Ｔｉｍｍｏｎｓ他、１９９６年）。同型接合型ＰＲＵＮＥ突然変異体は生存可能であり、繁殖可能であるが、羽根を生じさせる成虫原基の正しい形成に干渉する少なくとも１つの単一突然変異コピーの存在下で擬似黒色腫瘍を発症することにより致命的である（ａｗｄ／Ｋ−ｐｎ、ＰＲＵＮＥのキラーともいう）。
【０００７】
ヒトは、ａｗｄ遺伝子（ｎｍ２３）の最大８個までのオーソログをコードし、そのうち少なくとも４つは、ヌクレオシド三リン酸からヌクレオシド二リン酸へのリン酸基転移に触媒作用を及ぼす活性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫＰ）についてコードする（Ｌｏｍｂａｒｄｉ他、２０００年）。
【０００８】
いくつかの腫瘍及び高増殖性細胞は、ｎｍ２３−Ｈ１ ｍＲＮＡ及びそのタンパク質を過剰発現し、ほとんどの場合、この過剰発現は、癌の初期段階に連関している。乳癌は、その生物学的異質性及び治療に対する反応性が広範であることのため、臨床管理が難しい複雑な疾患である（Ｋｅｅｎ他、２００３年）。腫瘍形成の根底にある分子レベルのメカニズムに関する知識が向上したことで、病変発症の様々な段階における様々な癌予後と相関関係を有するますます増えるバイオマーカーの同定が可能になり、その結果、最も好適な治療上の処置を選べるようになった（Ｋｅｅｎ他、Ｄｏｍｃｈｅｋ他、２００２年）。
【０００９】
原発性乳癌の場合に現在使用されている十分に確立された予後因子には、リンパ節転移、書式学的所見、癌の大きさ、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の状態、増殖指数、核又は組織学的グレードがある（Ｋｕｒｕ他、２００３年、Ｍｏｒａｂｉｔｏ他、２００３年）。腫瘍病変発症におけるその後の段階の予後のためのマーカーとして使用されるその後の変換、侵襲性、及び転移プロセスに関わる新しい分子を用意すると有益であろう。
【００１０】
乳癌及びメラノーマでは、ヒトｎｍ２３−Ｈ１の高い発現は、転移能の減少に関連する（Ｆｌｏｒｅｎｅｓ他、１９９２年）。乳癌の特異ケースについては、転移の広がりは、実質的にすべての癌死亡に関与している。
【００１１】
侵襲性腫瘍細胞になるには、その接着性を変え、原発腫瘍内の他の細胞との接触を緩め、腫瘍細胞が侵襲する組織の宿主細胞の細胞外マトリックスとの新しい接触を確立する必要がある。この文脈において、腫瘍細胞の周囲のプロテアーゼ活性の調節は、重要な役割を果たす。原発腫瘍から移行し、循環系から出て、二次器官のコロニー形成を行うために、腫瘍細胞は、運動性機能を取得する必要もある。
【００１２】
今日まで、複数の転移抑制遺伝子が分離され、特徴付けられている（Ｓｔｅｅｇ他、２００３年）。このグループ内では、ｎｍ２３は、腫瘍乳腺細胞内で過剰発現したときに細胞運動性の減少を引き起こし（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）、足場非依存性コロニー形成に影響を及ぼし、分化を引き起こす（Ｋａｎｔｏｒ他、１９９３年、Ｌｅｏｎｅ他、１９９３年、Ｈｏｗｌｅｔｔ他、１９９４年、Ｈａｒｔ−ｓｏｕｇｈ他、１９９８年、Ｌｏｍｂａｒｄｉ他、２０００年）ことが知られている。さらに、悪性乳癌細胞系クローンＭＤＡ−Ｃ１００におけるｎｍ２３−Ｈ１の過剰発現は、その転移性表現型をｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で減らすことが実証されている（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２０００年、Ｍａｏ他、２００１年、Ｔｓｅｎｇ他、２００１年）。
【００１３】
本発明者は、以前の研究で、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１との間の相互作用、及びｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ突然変異によるこの相互作用の阻害を実証した（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）。さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥの複数のコピーの増幅の結果、細胞増殖が引き起こされ、高レベルのｈ−ＰＲＵＮＥ発現は、中又は低ｎｍ２３−Ｈ１レベルに比べて、肉腫及び乳癌腫瘍の悪性度増大と相関関係があることが開示されている（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年）。
【００１４】
したがって、腫瘍及びその転移の治療及び予防に都合よく使用されるｈ−ＰＲＵＮＥの酵素活性を阻害するのに好適な化合物を提供することが必要であることは、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現により特徴付けられることは明らかである。
【００１５】
そこで、本発明の著者は、特に乳癌の転移に特に相関する、治療酵素作用阻害の影響を受けやすい、ｈ−ＰＲＵＮＥの新しい酵素活性を確認した。実際、著者は、ｈ−ＰＲＵＮＥが、基質としてのｃＡＭＰに対する親和性がｃＧＭＰよりも優先するサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有し、これは何らかのホスホジエステラーゼ阻害剤により効果的に抑制されることを発見した。
【００１６】
さらに、本発明の著者により実施された研究を通して、ｈ−ＰＲＵＮＥ酵素は、複数の組織内の転移性腫瘍のｎｍ−２３発現の同時減少を伴って過剰発現することになることが突き止められた。さらに、乳房腫瘍モデルにおけるｎｍ２３Ｈ１との物理的タンパク質間相互作用による、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ ｈ−ＰＲＵＮＥの活性増大と細胞運動性との間の直接的相関関係も見つかった。この発見は、細胞増殖及び腫瘍転移プロセスの抑制におけるｎｍ２３−Ｈ１の防御機能の修正をもたらすｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１との間の相互作用の重要性を示している。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、乳癌の臨床的発症の予後に対する潜在的独立マーカーとしてのｈ−ＰＲＵＮＥの考えられる役割は、乳癌患者グループ内でのｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質及びｎｍ２３−Ｈ１の発現の分布を研究することにより評価された。特に、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現は、様々な分析された臨床例間で均質的に分布し、例えば、腫瘍型、組織学的サイズ、エストロゲン及びプロゲステロン受容体反応性、リンパ節転移などの他の因子から独立して予後マーカーとしてタンパク質を有利に使用する機会が得られる。新しいマーカーの同定は、採用すべき目標治療の選択に関して、転移能を有する腫瘍を同定し、乳癌に悩む患者をより効果的に管理するために使用することができる。
【００１８】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害を評価する好適なスクリーニング法を通じて試験されたいくつかのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のうち、抗凝血性について既に知られている薬剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏと乳房細胞モデルの両方において、ＩＣ５０に関してｈ−ＰＲＵＮＥ活性を阻害する最高の能力を示した。また、スクリーニングにおけるビンポセチン及び３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害に対しＩＣ５０の有望な値を示しており、この選択からのデータは、上述の３つの成分の構造上類似の誘導体及び異性体に対するスクリーニングの取り扱いを示唆している。
【００１９】
最後に、多くの転移性の乳房の腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ分析から、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の高いレベルとｎｍ２３−Ｈ１発現の負の調節との間の直接的相関関係の存在が確認されており、その結果、臨床的追跡研究で報告されているように遠隔転移形成が生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的は、例えば、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、髄芽細胞腫、上皮腫、肝癌（ｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｔ細胞又はＢ細胞リンパ腫、骨髄腫、及びメラノーマなどの、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現によって特徴付けられる腫瘍転移の予防及び治療用の薬剤を製造するために、ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤を使用することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
特に、本発明は、以下の一般式（Ｉ）を有するｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤に関する。
【化１】
式中、Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なり、アミノアルコール、アミノアルキル、コレステロールからなる群から選択することができ、
Ｒ３及びＲ４は、同じ又は異なり、複素環式芳香族又は芳香環からなる群から選択することができる。好ましくは、複素環式芳香族環は、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、モルホリンからなる群から選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、ジエタノールアミンであり、Ｒ３及び／又はＲ４は、ピリミジンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のより好ましい一実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、ジエタノールアミンであり、Ｒ３及びＲ４は、ピリミジンであり、阻害剤は、ジピリダモールである。
【００２３】
本発明は、さらに、ビンポセチン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＩＣ２６１及び誘導体、構造類似物、及びその異性体からなる群から選択することができるｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用に関する。
【００２４】
さらに、本発明の目的は、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）を含むペプチドであるｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用である。特に好ましい一実施形態では、前記ペプチドは、さらに、前述のアミノ酸配列の下流に、浸透性に関わり、配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する他のペプチドを含む。したがって、浸透性があることを特徴とするペプチドは、配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０）を含む。
【００２５】
本発明の他の目的は、ペプチドが、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）を含み、特定の一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲ（配列番号１０）を含むことであり、配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲがあるため浸透性を有することを特徴とする。
【００２６】
本発明の他の目的は、ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物のスクリーニング方法であり、これは以下のステップを含む。
ａ）少なくとも１つのホスホエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害化合物又は誘導体、構造類似物、又はその異性体を選択するステップ、
ｂ）０．０５μＭから１０μＭの範囲の濃度の前記少なくとも１つの化合物を、１つのｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現細胞系に投与するステップ、
ｃ）ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析を行い、及び／又は細胞運動性対前記少なくとも１つの化合物及び化学誘引物質の濃度の分析を行い、及び前記ホスホジエステラーゼ活性を０．０１から１ｐｍｏｌ／ｍｉｎ−１／ｕｇ−１の間の値に阻害し、及び／又は前記運動を２００から１２００細胞の間の値まで阻害することができる化合物を選択するステップ。
【００２７】
前記活性の阻害剤として試験した化合物によるｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害は、前記の化合物に対するＩＣ５０の評価により確定することができる。
【００２８】
ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する細胞系は、ＭＤＡ−Ｃ１００ ４３５ ｐｒｕｎｅ ＃４（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）である。
【００２９】
ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析は、ｃ−ＡＭＰ及び／又はｃ−ＧＭＰ基質の加水分解試験により実施できる。前記基質は、０．００８μＭから１μＭの範囲の濃度で使用される。
【００３０】
本発明の他の目的は、少なくとも同定された１つの化合物、又はその誘導体、構造類似物、又は異性体を、１つ又は複数の補助剤及び／又は薬理学的に許容される賦形剤と共に、混合する追加のステップｄ）を含む、上述のような方法を含む薬剤組成物を製造する方法である。
【００３１】
さらに、本発明は、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移の予防及び治療用の薬剤を製造するための、前記腫瘍は乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、及びメラノーマである、上で定義されたような方法に従って選択されたｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物の使用に関する。
【００３２】
本発明の他の目的は、免疫学的アッセイ、ＦＩＳＨ分析、リアルタイムＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によりｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法である。特に、前記方法は、以下のステップを含むことができる。
ａ）例えば、組織切片又は生体液などの前記生物試料を、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識付けできる少なくとも１つのモノクローナル若しくはポリクローナル抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体と接触させるステップ、
ｂ）抗原抗体複合体を検出するステップ、
ｃ）抗原抗体複合体の定量分析を行うステップ。
【００３３】
抗原抗体複合体の検出及び定量分析は、免疫組織化学分析、免疫沈降分析、免疫蛍光検査分析、ＥＬＩＳＡ分析、免疫ブロット分析により実施することができる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲによりｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法に関して、特異的プライマーは、５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列である。
【００３５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法を使用して過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法に関して、標識プローブは、オリゴヌクレオチド配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含むことができる。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲの前記標識プローブは、線形又は円形プローブとすることができ（ＴａｑＭａｎ、ハイブリッド形成プローブ、分子ビーコン）、標識付けは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素により実施できる。少なくとも１つの蛍光色素（放射若しくは励起型）、好ましくは６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）による標識付けは、プローブオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施できる。
【００３７】
本発明の他の目的は、例えば、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識付けできる、少なくとも１つのモノクローナル又はポリクローナル抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体を含む、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍（例えば、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、前立腺癌、直腸結腸癌など）の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出するための診断キットである。
【００３８】
診断キットは、それとは別に、配列５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列を含むことができるｈ−ＰＲＵＮＥの特異的プライマーをいくつか含むことができる。
【００３９】
最後に、診断キットは、オリゴヌクレオチド配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含むことができるリアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成用の少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドプローブを備えることができる。
【００４０】
リアルタイムＰＣＲ用の前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、線形及び／又は円形プローブであり、標識付けは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素、好ましくは６Ｆ ＡＭ（６カルボキシフルオレセイン）を使用することができ、プローブのオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施することができる。
【００４１】
本発明の他の目的は、ＩｇＭ免疫グロブリンクラスに属し、４Ｇ３／４クローン（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）により産生されることを特徴とする、ｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質を認識し、選択的に結合することができるモノクローナルマウス抗体である。このクローンは、ＮＨ２末端でマルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ５構造）を含む融合構造内のｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質全体によるマウスへの免疫付与を通じて得られた。タンパク質は、マルトースアフィニティカラムクロマトグラフィーを通じて精製され、その後、１つのブースターが精製タンパク質１００μｇを含む５つのブースターと共に、２匹のマウスに注射された。
【００４２】
さらに、本発明は、アミノ酸配列ＮＨ２−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（配列番号４）又はその一部を含むウサギ免疫に使用されるペプチドを認識し、選択的に結合することを特徴とする、ｈ−ＰＲＵＮＥ（Ａ５９）ウサギポリクローナル抗体に関する。
【００４３】
本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列のうちの少なくとも１つを含むリアルタイムＰＣＲによるｈ−ＰＲＵＮＥ増幅用の特異的プライマーを提供することである。
【００４４】
最後に、本発明は、配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含む、リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成用のｈ−ＰＲＵＮＥ特異オリゴヌクレオチドプローブに関する。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲ用の前記オリゴヌクレオチドプローブは、線形及び／又は円形プローブであり、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素、好ましくは６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識付けすることができ、前記標識付けは、プローブのオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施することができる。
【００４６】
本発明は、好ましいいくつかの実施形態により、付属の図面の図を特に参照しつつ、例示により、但し制限することなく、説明される。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造及び機能分析
材料と方法
タンパク質配列分析
アメリカ国立バイオテクノロジーセンター（ＮＩＨ、ベテスダ）のタンパク質配列の非冗長データベースは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用して繰り返し検索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７年）。タンパク質配列の多重整列は、Ｔ＿ｃｏｆｆｅｅプログラム（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ他、１９９３年）を使用して構築され、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムの結果に基づいて補正された。
【００４８】
Ｐｈｉｌｉｐ Ｆｉｔｃｈプログラム及びＭｏｌｐｈｙパッケージＰｒｏｔＭＬプログラムを使用して系統樹が構築された。
【００４９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＤＢ−ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して、タンパク質構造のホモロジーモデリングを実施し、タンパク質バックボーンの衝突が最小になるようにテンプレートとの整列を手作業で調整した。エネルギーの最小化は、シップル様の力場を使用するＧＲＯＭＯＳプログラムを使用して実施された。
【００５０】
ＭＯＬＳＣＲＩＰＴプログラムを使用して、リボン構造タンパク質の図を作成した。
【００５１】
細胞培養
ＨＥＫ−２９３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、３７℃、ＣＯ２ ５％でウシ胎児血清１０％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補ったＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地で培養した。
【００５２】
バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）におけるタンパク質発現及び精製
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク質発現を実施した。要するに、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、及びｎｍ２３−Ｈ１（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）及びｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、Ｄ２８Ａ、Ｄ１０６Ａ、Ｄ１７９Ａ、Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ、Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ−Ｄ１２６Ａ、Ｄ２８Ａ−Δ、４ＤΔ（Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ−Δ−Ｄ１７９Ａ）をコードするｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌ消化ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｈｔａベクターにサブクローニングした。
【００５３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体ｃＤＮＡを生成するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ構造の特定部位の突然変異誘発を取扱説明書に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施した（実施例２を参照）。
【００５４】
ウイルス感染及び精製条件については、Ｇａｒｚｉａ及びｃｏＩｌ（２００３年）で説明されている。
【００５５】
その後、ヒスチジンタグ付きｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０緩衝液を使用してＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で精製した。カラム溶離は、０から０．８ＭのＮａＣｌの直線勾配で２０分にわたり、流量１ｍｌ／分で実施した。画分をさらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液に対して透析し、活性について試験した。
【００５６】
分離されたタンパク質の純度を、ＳＤＳ Ｐａｇｅ電気泳動分析により測定した。
【００５７】
ｈ−ＰＲＵＮＥホスホジエステラーゼ活性の同定及び特徴付け
ＰＤＥ活性は、Ｆｉｓｈｅｒ他、１９９８年により説明されているｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ検出アッセイにより、シンチレーションアッセイ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により測定した。
【００５８】
基質として所望の濃度のｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを含む１００μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、８．３ｍＭ ＭｇＣＩ２、１．７ｍＭ ＥＧＴＡ）を使用し、３０℃で試料を希釈、インキュベートした（非標識対３Ｈ標識の比＝３：１）。
【００５９】
培地のみを含むブランクを含み、すべての反応を３通り実施し、基質回転率２５％未満（経験により決定）となるインキュベート時間の間進行させた。
【００６０】
５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えて反応を終結させた。
【００６１】
メーカープロトコルに従って検出された放射性標識産物の量について酵素活性を計算した。陰性対照として、モチーフＩｌｌ領域（Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）に対するＡ５９ポリクローナル抗体と共にプレインキュベートした、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体を使用した。
【００６２】
特に、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体のＰＤＥ活性については、精製酵素２００ｎｇを、１０分間、３０℃でインキュベートした。
【００６３】
Ｋｍ及びＶｍａｘ値によるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットは、５〜４０分にわたり基質濃度範囲（０．０５〜１０．０μＭ）及び一定量の希釈酵素での加水分解を測定することにより決定された。初期速度を、基質濃度毎に計算し、後者に対してプロットし、それにより、速度パラメータを決定した。
【００６４】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する異なる緩衝液及びｎｍ２３活性の影響を調べ、阻害研究を実施するために、実施例２の「材料と方法」の節で報告されているように、ＰＤＥアッセイを改変した。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びヒトＰＤＥ５Ａを過剰発現する安定なＭＤＡクローンを、実施例２の「材料と方法」の節で説明されているように生成し、分析した。
【００６６】
ｉｎ ｖｉｖｏの転移プロセスの阻害を示すｎｍ２３−Ｈ１過剰発現細胞系（ＭＤＡ−Ｈ１−１７７）と共に、既に説明されているように（Ｌｅｏ他、１９９３年）、対照の乳癌細胞系ＭＤＡ−Ｃ１００を細胞運動性アッセイで使用した。
【００６７】
細胞運動性は、化学誘引物質として作用させる最終濃度としてそれぞれ０．２５％、０．５％ ＦＣＳ、２．５、及び５．０ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）使用し、６ウェルのトランスウェル技術（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）を用いて決定した（詳細については、実施例２の「材料と方法」の節を参照）。
【００６８】
統計分析
ＰＤＥ活性及び細胞運動性活性を含むすべてのアッセイは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／〜ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍに用意されているＴ検定を使用して妥当性を確認した。
【００６９】
ＦＩＳＨ及びＨＩＣ分析、腫瘍の臨床例のコレクション、ＴＮＭ選択は、実施例２の「材料と方法」の節で報告されている。
【００７０】
結果
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造及び機能分析
ＩＴＥＲＡＴＩＶＥタンパク質データベース検索（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質について実施し、これにより、統計的に有意な期待値で、ＰＲＵＮＥの真核生物オーソログ、続いて、様々な細菌からの無機ピロホスファターゼ、及びＲｅｃＪヌクレアーゼを含む様々な生物からのＤＨＨタンパク質を回収することができる（図１、パネルＣ）。
【００７１】
ＢＬＡＳＴＣＬＵＳＴプログラム及び系統発生分析を使用し、最尤法を使用するＤＨＨタンパク質のクラスタリングから、ＰＲＵＮＥタンパク質（ヒト及びショウジョウバエ）が、無機ピロホスファターゼと共に、第２のＤＨＨファミリーに属していることがわかる（図１、パネルＡ）。
【００７２】
ＤＨＨタンパク質の２つのファミリーは、ＤＨＨスーパーファミリーに典型的な４つの保存モチーフを含む共通のＮ末端ドメインを共有するが、これらは、Ｃ末端ドメインにより互いに区別される。共有されるＮ末端ドメインは、平行なベータシートを伴うアルファ／ベータ折り畳みを有し、ＤＸＤ（モチーフ−Ｉ）、Ｄ（モチーフ−ＩＩ）、ＤＨＨ（モチーフ−ＩＩＩ）、及びＤ／Ｅ（モチーフ−ＩＶ）の形態の絶対保存要素を含む（図１、パネルＡ及びＢ）。
【００７３】
これらの残基はすべて、このドメインの同じ面にあり、これらが一緒になって、少なくとも２つの二価陽イオンをキレートする触媒部位を形成する。ＰＲＵＮＥタンパク質は、形態ＤＨＲをこのファミリーの他のすべてのメンバーで観察される正準ＤＨＨ（モチーフ−ＩＩＩ）の置換として含む（図１、パネルＡ）。
【００７４】
両方のＤＨＨファミリーにおいて、Ｃ末端ドメインは、５つのストランドからなるコアシートを含み、そのうちの４つは２つのβストランドヘアピンを形成する。しかし、ＤＨＨタンパク質の第１のファミリーと第２のファミリーとの間のＣ末端ドメインの違いは、２つのスーパーファミリーの基質特異性の著しい一因となる可能性がある。さらに、ＤＨＨモジュール、哺乳類ＰＲＵＮＥのＣ末端ドメインは、非球状伸展を含み、その中に、リン酸化反応の調整を行う役割を果たしうるいくつかの保存セリンがある。
【００７５】
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造分析から、ＲｅｃＪ（Ｙａｍａ−ｇａｔａ他、２００２年）及びピロホスファターゼ（Ａｈｎ他、２００１年）との類似性がわかり、そのため、後者に対する潜在的類似活性が示唆される。
【００７６】
しかし、ａｗｄ／Ｋ−ｐｎ様ＮＤＰＫの強い相乗作用は、ＰＲＵＮＥタンパク質がヌクレオチドなどの代替基質を有する可能性があることを示唆した。
【００７７】
ＤＨＨファミリーに関する進化論的研究から、ホスホエステラーゼは、様々なホスホエステラーゼ及び加水分解酵素ドメインを含む多数のタンパク質折り畳みから誘導されることがわかっている。これらは、古典的なシグナリングＰＤＥが認識されるＨＤ折り畳み（ＰＤＥ１−１１）（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）、ＰｄｓＡ様ＰＤＥが誘導される金属βラクタマーゼ折り畳み（Ｇａｌｐｅｒｉｎ他、１９９９年、Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９９年）、及びＩｃｃ様ＰＤＥが誘導されるカルシニューリン様ホスホエステラーゼ折り畳み（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）を含む。
【００７８】
ＤＨＨ触媒ドメインは、これらの他のファミリーとは際立って異なる折り畳みを有し、ＰＤＥのまったく新しいクラス全体を潜在的に定義する可能性のある複数の類似金属キレーティング残基（アスパラギン酸及びヒスチジン）を含む。この仮説を検証するために、潜在的ＰＤＥ活性についてｈ−ＰＲＵＮＥが発現され、精製され、分析された。
【００７９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の同定及び特徴付け
ｈ−ＰＲＵＮＥがサイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）のホスホエステル結合を加水分解する能力を調べるために、ｈ−ＰＲＵＮＥのクローンを作成し、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系を使用して発現した。Ｈｉｓ−ｔａｇ付きｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ、モチーフＩＩＩ領域内に生成された突然変異（ＤＨＲＰ１２６−１２９ＡＡＡＡ）を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【００８０】
ＰＤＥアッセイを使用して、精製ｈ−ＰＲＵＮＥ触媒活性を特徴付けし、特異基質を決定した。
【００８１】
図２、パネルＡに示されているように、ｈ−ＰＲＵＮＥは、著しいＰＤＥ活性を有し、これは、ｃＧＭＰ基質よりもｃＡＭＰについて高いが、ｈ−ＰＲＵＮＥΔは、この活性が４０％減少することを示している。陽性対照としてＰＤＥ２を使用し、陰性対照は、両方とも、Ａ５９特異ポリクローナル抗体及びｈ−ＰＲＵＮＥΔと共にプレインキュベートされたｈ−ＰＲＵＮＥであった。
【００８２】
ＰＤＥ検出活性を確認するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔをヒトＨＥＫ−２９３細胞内で一時的に過剰発現し、次いで、免疫沈降し、ＰＤＥアッセイを免疫沈降タンパク質について実施した。
【００８３】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥ精製タンパク質は、昆虫由来であろうとヒト細胞由来であろうと、ＰＤＥ活性を示すことがわかる。
【００８４】
触媒部位に潜在的に関わるアミノ酸を同定するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼす単一及び複数の部位で突然変異分析を実施した。ＤＨＨ特徴モチーフ（図１、パネルＢ）のすべてのアスパラギン酸残基を単独と組合せの両方で突然変異させた（図２、パネルＢ）。突然変異体は、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系を使用して発現され、均質になるように精製された（精製収量８０％）。
【００８５】
ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性についてタンパク質を検査したところ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（Ｄ２８Ａ、Ｄ１０６Ａ、Δ、Ｄ１７９Ａ）突然変異体活性の８０％減少が観察された。つまり、Ｄ２８、Ｄ１２６、Ｈ１２７、Ｒ１２８、Ｐ１２９、及びＤ１７９アミノ酸は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性について本質的であることがわかり、したがって、それらが触媒部位の一部である可能性は最も高いことを示している。その代わりに、モチーフＩＩのＤ１０６Ａ突然変異は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼさなかった。
【００８６】
Ｋｍ値を定義するために、高い精製収量（９０％）のイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑカラム）を使用した別の精製ステップによりＨｉｓ−ｔａｇ付きｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質を均質になるように精製した。Ｋｍ及びＶｍａｘ値は、基質濃度範囲（０．０５〜１０．０μＭ）内で固定量の精製酵素によるヌクレオチド加水分解を測定し、反応の線形的部分のデータ点を考察することにより決定された。ｃＡＭＰとｃＧＭＰは両方とも、ｈ−ＰＲＵＮＥの基質であり、Ｋｍ値０．９±０．０３μＭ及び２．３±０．１１μＭをそれぞれ示す（図２、パネルＣ及びＤ）。
【００８７】
基質回転率の最大値（Ｖｍａｘ）は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対しそれぞれ１２．８±０．５ｐｍｏｌ×分−１×μｇ−１、及び１６．１±０．８ｐｍｏｌ×分−１×μｇ−１の精製酵素であることがわかった。
【００８８】
そのため、ＤＨＨスーパーファミリーのタンパク質に対するサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の証拠が指摘された。ｈ−ＰＲＵＮＥ活性に対する緩衝液の影響を調べるために、同じ塩の存在下でＴｒｉｓ ＨＣｌ及びＨＥＰＥＳ緩衝液を試験したところ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液の存在下でより高いＰＤＥ活性が観察された（図２、パネルＥ）。
【００８９】
ＤＨＨタンパク質のイオン依存性を考察する際に、ＰＤＥ ｃＡＭＰアッセイにおけるｈ−ＰＲＵＮＥのＭｇ２＋及びＭｎ２＋イオン依存性を評価した。Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液中のｈ−ＰＲＵＮＥの活性が高いことが判明したが、オキソ還元反応を避けるＨＥＰＳＥ緩衝液の存在下でＰＤＥアッセイを実施し、高い濃度の２つの異なる二価イオンを使用した。
【００９０】
イオンを含まない緩衝液でいくらかのＰＤＥ活性が測定されたが、Ｍｇ２＋はｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を刺激し（図２、パネルＥ）、対照的に、ＭｎＣｌ２の存在下では、この活性は阻害される。さらに、野生型タンパク質と同様、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体はＭｇ２＋イオンでは活性化されず（図２、パネルＦ）、したがって、ホスホジエステラーゼ活性には、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体で修正されるモチーフＩＩＩが必要であることが示される。結論として、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性がＭｇ２＋イオン濃度の陽性の影響を受けることが示された。
【００９１】
安定な乳房ＭＤＡ ｈ−ＰＲＵＮＥクローン及び細胞運動性との相関関係
ｎｍ２３−Ｈ１抗運動性及び転移抑制活性を調整するｈ−ＰＲＵＮＥ機能を調べるために、乳癌ＭＤＡ−Ｃ１００及びＨ１−１７７細胞モデルを採用した（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２０００年、Ｍａｏ他、２００１年、Ｔｓｅｎｇ他、２００１年）。
【００９２】
ＭＤＡ４３５−Ｃ１００細胞（高転移性乳癌細胞、ＡＴＣＣ）に、ＬＴＲ含有プラスミド構造（哺乳類の細胞内にエコトロピックレトロウイルスを発生させるために使用されるｐＢａｂｅ構造）内でｈ−ＰＲＵＮＥ遺伝子ｃＤＮＡのトランスフェクションを行い、トランスフェクションの後、異なるピューロマイシン耐性クローンが得られ（培養２０日目にクローンを分離する）、プラスミド抗生物質耐性が生じ、ＬＴＲプロモーターの下でそのｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡ過剰発現について選択された。
【００９３】
ＭＤＡ−Ｃ１００細胞内のｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡ（クローン＃３及び＃４、これは最後に１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ ｃＤＮＡ（クローン＃１０及び＃１１）、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ ｃＤＮＡ（クローン＃１９及び＃２０）、及びＰＤＥ５Ａ ｃＤＮＡ（クローン＃１４及び＃１６）を過剰発現するいくつかの安定なクローンが生成された。ｎｍ２３−Ｈ１を過剰発現するＭＤＡ−ＨＩ−１７７（クローン＃７及び＃８）、ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓを過剰発現するＭＤＡ（クローン＃４及び＃５）、及びｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇを過剰発現するＭＤＡ（クローン＃２及び＃３）におけるｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡを安定化させた。
【００９４】
これらのクローンのいくつかは、ＴａｑＭａｎ技術によるリアルタイムＰＣＲ分析を使用してｈ−ＰＲＵＮＥ ｍＲＮＡの発現レベルを決定するように特徴付けられた（図３、パネルＡ）。定量分析及びコピー数外挿により、ｍＲＮＡ発現のそのレベルについて４つのクローンを選択し、標的基準遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と比較した（図３、パネルＢ）。
【００９５】
さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を実施して、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３、及びＰＤＥ５Ａタンパク質の発現レベルを同定した（図３、パネルＣ）。
【００９６】
次に、トランスウェル細胞培養チャンバを使用して生成された安定なクローンの細胞運動性について分析した（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）。６個の独立クローン（ＭＤＡ−Ｃ−１００、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローン＃３及び＃４、１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン＃７及び＃８、ＭＤＡ−１ｌ−１７７）を分析した。ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンは、対照細胞系ＭＤＡ−Ｃ１００と比較したときに運動性が２倍に増大する（図３、パネルＤ）。
【００９７】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローンについて観察された値は、ｎｍ２３−Ｈ１だけを過剰発現する細胞系ＭＤＡ−ＨＩ−１７７と比較して２．２倍増大する（図３、パネルＤ）。クローンＭＤＡ−Ｈ１−１７７観察値は、既に報告されているようにＭＤＡ−Ｃ１００細胞系に比べて少なくとも４０％だけ減少し（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年）、そこで、細胞運動性の阻害についてｎｍ２３−Ｈ１の役割が確認される。
【００９８】
細胞運動性へのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の寄与を調べるために、ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託されたクローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）、及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９及び＃２０）に関する運動アッセイを実施した。これらの突然変異体が選択されたのは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼす異なる能力があるためである。
【００９９】
両方ともＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ安定なクローンと比べて、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔクローン内の細胞運動性の４０％及びほぼ完全（９０％）の減少がそれぞれ観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性が乳癌細胞系内の細胞運動性に単独で関与するかどうかを確認するために、ＭＤＡ−Ｃ１００（ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａクローン＃１４及び＃１６）のきちんと特徴付けられたＰＤＥ（ＰＤＥ５Ａ）を過剰発現するクローンを試験した。両方のＰＤＥ５Ａ過剰発現クローンにおいて細胞運動性の増大は観察されず（図３、パネルＥ）、したがってｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性のみがこの従来の細胞モデルにおいて細胞運動性を引き起こすことができることを示している。
【０１００】
さらに、報告されたのは（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）、ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ（ｈ−ＰＲＵＮＥと相互作用しない突然変異体）（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）及びｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ（ｈ−ＰＲＵＮＥを結合する能力を保持している突然変異体）タンパク質が、細胞運動性を引き起こすことができるということであった。
【０１０１】
ｈ−ＰＲＵＮＥがある場合及びない場合について突然変異体を過剰発現する細胞運動性活性におけるｈ−ＰＲＵＮＥの役割を調べ、これと細胞運動性との相関関係を求めた。ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥクローンは、ＭＤＡ−Ｃ１００対照細胞系と比較してほぼ６０％の運動の増大を示しているが、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥクローンは、ＭＤＡ−Ｃ１００細胞と比較したときに２００％の運動増大を示している（図３、パネルＦ）。
【０１０２】
結論として、ＭＤＡ−Ｃ１００内のｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現は細胞運動性を高め、ｈ−ＰＲＵＮＥは、ｎｍ３２−Ｈ１の抗運動性を戻すことができ、それにより、細胞運動性を促進する。この効果は、ｈ−ＰＲＵＮＥがｈ−ＰＲＵＮＥ相互作用障害ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ突然変異体の存在下で過剰発現されたときには観察されず、そのため、細胞運動性の増大に関してｎｍ２３−Ｈ１−ｈ−ＰＲＵＮＥ複合体の役割が推定される。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１が物理的に相互作用することを（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）考察し、ｎｍ２３ｓがｈ−ＰＲＵＮＥのＰＤＥ活性、及びｎｍ２３−ｈ−ＰＲＵＮＥ相互作用の生化学的な意義に影響を及ぼしうるかどうかを調べた。これは、ｎｍ２３−Ｈ１をｈ−ＰＲＵＮＥ精製タンパク質と共にプレインキュベートし、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することにより行った。
【０１０４】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、ｎｍ２３−Ｈ１の存在下で対照に対し最大２倍までの増大を示した。さらに、この増大した活性が物理的相互作用によるものであることを確認するために、別のｎｍ２３突然変異体を試験した。非相互作用突然変異体ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ（図４、パネルＡ）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を高めることができず、対照的に、それほどではないにせよ、相互作用突然変異体ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性をほとんど野生型ｎｍ２３−Ｈ１として高めた。これは、既に報告されているように、ｈ−ＰＲＵＮＥとの結合アフィニティが低いため可能である（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）。
【０１０５】
他の対照実験として、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の存在下でｈ−ＰＲＵＮＥΔ ＰＤＥ活性を試験したが、それは、これら２つのタンパク質が共免疫沈降アッセイ時に相互作用しないからである。ｈ−ＰＲＵＮＥΔ ＰＤＥ測定活性には増大は見られない（図４、パネルＡ）。
【０１０６】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１の直接的物理的相互作用とｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の増大との間に相関関係のあることが実証される。さらに、免疫沈降タンパク質に関する特異ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性について運動アッセイで使用されるそれぞれの安定なクローンを分析した（図４、パネルＢ）。
【０１０７】
これらの分析の結果として、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンでは、ＭＤＡ−Ｃ１００と比べて、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の増大は８倍である。その代わりに、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥＡクローンでは、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥと比較してｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の減少は０．５倍であり、これは、細胞運動性と相関関係を有する（図４、パネルＢ）。
【０１０８】
さらに、ＭＤＡ−ｈ−ＰＲＵＮＥクローンのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、安定二重ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥのと比べて、１．４倍の増大であることがわかった（図４、パネルＢ）。
【０１０９】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性と細胞運動性との間に直接的な相関関係のあることがわかる。さらに、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥクローンでは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の減少はＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥと比べて３倍であり、したがって、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性、細胞運動性、及びタンパク質間相互作用の間に直接的相関関係のあることが示される。結論として、細胞運動性に著しい影響を及ぼす、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ機能とタンパク質間相互作用の間の直接的相関関係が指摘された。
【０１１０】
ｈ−ＰＲＵＮＥのＰＤＥ阻害剤研究及び細胞運動性への影響
細胞内のｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ ＰＤＥ活性の生理学的役割を同定するために、選択的ＰＤＥ阻害剤のパネルを試験し、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質活性に影響及ぼすものがあるかどうかを確認した。
【０１１１】
ｈ−ＰＲＵＮＥがｃＡＭＰを加水分解する能力は、ジピリダモール（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、及びＰＤＥ１１に対し作用することが既に知られている）により選択的に阻害された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性のジピリダモール阻害について測定されたＩＣ５０は、０．７８±０．０５μＭであり、この値は、他の選択的ＰＤＥ阻害値（ＰＤＥ５、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０）に比べて低い（高い特異性）。ＰＤＥ６及びＰＤＥ１１では、ＩＣ５０値は、ｈ−ＰＲＵＮＥよりも低い（図５、パネルＡ）。
【０１１２】
ｈ−ＰＲＵＮＥは、さらに、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）（ＩＣ５０ ４０．２±０．８μＭ）、非選択的特異的ＰＤＥ阻害剤、及びビンポセチン（ＩＣ５０ ２２．３±１．１μＭ）、ＰＤＥ１Ｃ特異阻害剤に対し中程度に敏感である。
【０１１３】
この研究で使用されたいくつかの他の阻害剤は、他のＰＤＥに対するＩＣ５０値の場合よりも１００倍高い濃度で適用された場合でも、ｃ−ＡＭＰ ｈ−ＰＲＵＮＥ加水分解活性には影響を及ぼさなかった。阻害研究の結果は、図５、パネルＡにまとめられている。
【０１１４】
上に示されているデータは、さらに、生理学的阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するためにＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞系で検証された。
【０１１５】
これは、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現ＭＤＡクローン、及び、上述のようにｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の部分的減少（４０％）のため（図２、パネルＡ及びＢ）追加の対照としてＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔクローンを使用し、ジピリダモールが活性を阻害し、細胞運動性に関連付けることができる程度を確認するように選択された。
【０１１６】
ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ及びＰＲＵＮＥΔクローンの両方を、ジピリダモール（８μＭ、ＩＣ５０の場合よりも１０倍高い濃度）と共に２４時間の間インキュベートし、完全な酵素不活性を得て、上述のように運動アッセイを繰り返した。
【０１１７】
ジピリダモールによる処理の後、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔクローンは、それぞれ、４０％及び２０％の平均運動減少を示したが、これから、阻害剤は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対し作用し、そのため、細胞運動性の実質的減少を引き起こすことがわかる（図５、パネルＢ）。
【０１１８】
転移患者における乳癌研究
ｈ−ＰＲＵＮＥの発癌の役割をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、転移が報告された５９症例を無作為に選択した（解剖学的な疾患の程度を説明するＴＮＭ分類によるＴｘＮｘＭＩ（Ｈｅｊｎａ他、１９９９年））。
【０１１９】
診断時又は追跡調査中に転移を示した原発腫瘍組織症例を含む組織多重アレイ（ＴＭＡ）について分析を実施した（少なくとも５年分の追跡調査、診断日：１９９２〜９７）。
【０１２０】
ＦＩＳＨ分析では、ｈ−ＰＲＵＮＥ（２７９−Ｈ１９）をプローブとして含むＰＡＣを使用して、三染色体又はそれ以上のコピー数を有する５９例中２２例（３７％）の腫瘍症例を明らかにし、ｈ−ＰＲＵＮＥゲノム領域の増幅を示した。ｎｍ２３−Ｈ１をプローブとして含むＰＡＣを使用して全部で５５件の分析症例において、１つの二染色体のみが観察され、増幅は観察されなかった（図６、パネルＡ）。
【０１２１】
さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１をそれぞれ認識する２つの抗体（Ａ５９、Ｋ７３）を使用して、ＴＭＡに関する免疫組織化学分析を実施した。正常であるだけでなく、転移性癌組織のないことについてのＦＩＳＨ及び免疫組織化学分析が報告された。
【０１２２】
免疫組織病理学グレーディングにより、２２例のすべて（３７％）において、ｈ−ＰＲＵＮＥ染色体領域の細胞遺伝的増幅の後、ｎｍ２３−Ｈ１の低又は中発現レベルとは対照的に、高いｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質発現も強調されており、そのため、乳房転移形成の約１／３は、機能を抑制するｎｍ２３−Ｈ１転移の同時減少レベルを有するｈ−ＰＲＵＮＥ増幅及び過剰発現の両方によるものと考えられることを示唆している。
【０１２３】
さらに、７例（１２％）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ増幅を示さず、高いｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質レベルを有するが、ｎｍ−２３Ｈ１レベルは低い（図６、パネルＤ）。これは、遺伝子増幅とは無関係のｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の代替メカニズムの存在を示唆している。
【０１２４】
これらのデータは、乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の転移促進役割を示す。
【０１２５】
（実施例２）
乳房ＭＤＡの安定なクローンの遺伝子発現プロファイル
材料と方法
突然変異体作成
以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体を生成した。
【化２】
【０１２６】
突然変異ヌクレオチドは、太字で示され、変更されたコドンは、下線が引かれている。すべての突然変異は、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認された。
【０１２７】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥホスホジエステラーゼ活性の特徴付け
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する緩衝液の影響を調べるために、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、又はＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）を使用し、ＭｇＣｌ２の濃度を上昇させて（０、１、２、４、８、１６、及び３２ｍＭ）、ＰＤＥアッセイを改変した。
【０１２８】
イオン存在の効果を調べるために、ＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）（オキソ還元反応を避けるため）中で、ＭｇＣｌ２又はＭｎＣＩ２塩の濃度を高くしつつ（１、２、４、８、１６、３２、及び６４ｍＭ）、ＰＤＥアッセイを実施した。陰性対照として、ｈ−ＰＲＵＮＥΔを、ｈ−ＰＲＵＮＥと同じ条件で使用した。イオンが存在しない場合のｈ−ＰＲＵＮＥ活性は、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、ＥＧＴＡ １．７ｍＭ、又は５０ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、ＥＧＴＡ １．７ｍＭに対しタンパク質の長い透析の後に試験された。
【０１２９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対するｎｍ２３（ＮＤＰＫ）活性の影響は、精製ｈ−ＰＲＵＮＥを様々なｎｍ２３（７０％精製収量、−Ｈ１、−ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、又は−Ｈ１−Ｐ９６Ｓ）と共にプレインキュベートしてアッセイを実施することにより調べた。
【０１３０】
ｈ−ＰＲＵＮＥΔに対するｎｍ２３−Ｈ１の可能な効果は、精製された突然変異体タンパク質をｎｍ２３−Ｈ１と共にプレインキュベートし、ＰＤＥアッセイを実施することにより試験した。
【０１３１】
阻害剤研究に関して、８つの異なる潜在的阻害剤、つまり、シロスタマイド、ジピリダモール、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ミルリノン、ロリプラム、ビンポセチン、スリンダク、及びザプリナスト（シグマ）を試験した。
【０１３２】
低濃度のｃＡＭＰ（０．０１μＭ）を使用して、ＩＣ５０をＫｉに近似した。すべての阻害研究は、３通りに実施し、３回繰り返した。
【０１３３】
安定なクローン分析
ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、及びｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ ｃＤＮＡを、Ｎ末端のＨｉｓ−ｔａｇで修正されたＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌ消化ｐＢＡＢＥベクターにサブクローニングした。ヒトＰＤＥ５Ａ ｃＤＮＡは、同じＨｉｓ−ｔａｇ付きベクターにクローニングするために、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限末端を加えることによりＰＣＲ増幅された。
【０１３４】
ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、及びＭＤＡｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓクローンは、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ発現ベクターによりトランスフェクションが行われた。ＭＤＡ−Ｃ１００クローンは、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＤＥ５Ａ発現ベクターによりトランスフェクションが行われた。
【０１３５】
取扱説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、トランスフェクションを実施した。ウシ胎児血清１０％、ペニシリン１００単位／ｍＩ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びピューロマイシン２μｇ／ｍｌ（シグマ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でトランスフェクションを選択した。
【０１３６】
大量のトランスフェクションを行った細胞系を作成するために、１００個のピューロマイシン耐性コロニーを含むプレートをトリプシン処理し、そうして細胞系を設定した。
【０１３７】
いくつかのピューロマイシン耐性ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びｐＢＡＢＥ−ＰＤＥ５Ａクローンを、ＭＤＡクローンについて分離し、リアルタイムＰＣＲ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析の両方によりトランスフェクションを行い、特徴付けを行った。
【０１３８】
リアルタイムＰＣＲ分析では、個々の細胞クローン（ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−Ｈ１Ｓ１２０Ｇ、ＭＤＡ−Ｈ１Ｐ９６Ｓ細胞系、複数のｈ−ＰＲＵＮＥ−及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ安定なクローン）を７５ｃｍ２のフラスコ内で濃度７−９×１０６細胞で播種した。
【０１３９】
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｍＲＮＡを抽出して精製し、その後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００計測器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴａｑＭａｎ定量リアルタイムＰＣＲ検出システムにより分析した。遺伝子プライマー対を合成し（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＮＭＥ１−Ｐ／Ｎ ４３３１１８２；ＧＡＰＤＨ）、Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｓｉｇｎを使用して、ｈ−ＰＲＵＮＥとｈ−ＰＲＵＮＥΔ遺伝子の両方について６ＦＡＭプローブ配列（６−カルボキシフルオレセイン）を構築した。
【化３】
【０１４０】
複数のクローンを選択し、基準標的と比べて、定量分析及びコピー数外挿によりｍＲＮＡ発現レベルについて分析した。
【０１４１】
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析では、緩衝液中の１５μｇのタンパク質溶解物をポリアクリルアミドゲル１０％（ｗ／ｖ）又は１２．５％（ｗ／ｖ）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ、ミリポア）上にエレクトロブロットした。ｈ−ＰＲＵＮＥのｈ−ＰＲＵＮＥ特異ポリクローナル（Ａ５９、モチーフＩＩＩ領域に対し発生）、ｎｍ２３−Ｈ１のｎｍ２３−Ｈ１（クローンＮＭ３０１、Ｈ１アイソフォームに特異的、サンタクルス）、及びＰＤＥ５Ａ抗体のＨｉｓ−ｔａｇ（ＱＩＡＧＥＮ）に対するＰｅｎｔａ−Ｈｉｓで溶解物をそれぞれ免疫検出した。
【０１４２】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧでインキュベートした後、視覚化が増強された化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により実施された。１１個の細胞系、つまり、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃７及び＃８）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃２及び＃３）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃４及び＃５）、及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１１）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９）、ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａ（クローン＃１４）を選択し、タンパク質をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ上で正規化した。
【０１４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
トランスウェル技術を使用した（６ウェル−Ｃｏｍｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）。下側ウェルでは、ＢＳＡ ０．１％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（運動培地）５ｍＭ、及び希釈化学誘引物を含むＤＭＥＭ ２．５ｍｌをインキュベートし、上側ウェルでは、ＣＯ２ ５％を使用し、３７℃で、細胞を３時間インキュベートした。引き付け手順の後、細胞を固定し、メーカープロトコル（Ｃｏｍｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）に従ってＧｉｌｌ ｎ°１ヘマトキシリン液で着色し、最終的に顕微鏡を使って細胞をカウントした。
【０１４４】
ＦＩＳＨ分析
ニックトランスレーション法によりｄＵＴＰ−Ｃｙ３（赤色）で標識されたＰＡＣ ２７９−Ｈ１９（ＰＲＵＮＥ−染色体１ｑ２１．３）及び厚さ４ｍｍのホルマリン固定パラフィン包埋組織片でニックトランスレーション法によりｄＵＴＰ−ＦｌｕｏｒＸ（緑色）で標識された対照ｐＵＣ１７７（ｐＵＣ１７７はＤｒ．Ｍ．Ｒｏｃｃｈｉが提供した）。
【０１４５】
細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）により対比染色した。それぞれの症例について２つの異なる実験を実施した。ＣＯＨＵ Ｖｉｄｅｏ ａｎｄ Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えるＯｌｙｍｐｕｓコンピュータ化落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取り込んだ。損なわれていない、保存状態のよい、重なりのない核上のハイブリッド形成シグナルは、少なくとも２人の独立の研究者により評価された。
【０１４６】
ＩＨＣ分析
ＭＤＡ腫瘍は、特異Ａ５９ ｈ−ＰＲＵＮＥポリクローナル及びｎｍ２３−Ｈ１抗体でそれぞれ免疫検出された（クローンＫ７３、Ｈ１及びＨ２アイソフォームに対し特異的、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）。
【０１４７】
免疫組織化学染色の強度を使用し、腫瘍試料を、顕微鏡の下で分析された細胞の少なくとも２０％に存在する場合に陽性として分類した（ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質発現に対し強い＋＋＋、中＋＋、広く弱い染色＋又は負０（存在しない、又は集中して弱い染色））。
【０１４８】
腫瘍症例のコレクション及びＴＮＭ選択
最低５年分の追跡調査結果を有する患者を含む腫瘍症例が、ＳａｓｓａｒｉのＡＵＳＬ１によって収集された。ＴＮＭシステム分類は、Ｓｏｂｉｎによって説明されているようにこの研究に応用され（Ｈｅｊｎａ他、１９９９年）、疾患の解剖学的程度を説明するために使用され、また３つの成分、原発腫瘍の程度に対応するＴ（Ｔ０からＴ４）、所属リンパ節転移の有無及び程度に対応するＮ（Ｎ０からＮ４）、及び遠隔転移の有無を表すＭ（Ｍ０又はＭ１）の評価に基づく。５９件の腫瘍乳房症例のコレクションは、ＴｘＮｘＭ１陽性として分類された。
【０１４９】
乳房細胞クローンでの遺伝子発現
以下の手順によりプローブ作製を実施した。
【０１５０】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンからＴＲＩＺＯＬ（登録商標）法によりＲＮＡを抽出した。以下の変更と共にＡｍｅｒｓｈａｍ ＣｙＳｃｒｉｂｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用して１５から２０μｇの範囲の全ＲＮＡテンプレートに標識した。
【０１５１】
逆転写時間を３時間に延ばした。その後、３７℃で、３０分の間、Ｒｎａｓｅ−Ｈによりプローブを消化した。
【０１５２】
残留ＲＮＡを除去するため、反応混合物をＮａＯＨ ０．２５Ｍで２０分間インキュベートし、その後、ＭＯＰＳ ２．８Ｍで中和した。組み込まれているＣｙ染料の量を、Ｃｙ５とＣｙ３の両方について計算した。標識されたＣｙ３及びＣｙ５標的は、等量分結合され、スライド上にハイブリッド形成された。
【０１５３】
組み込まれているＣｙ染料の５０ｐモル未満を含むプローブは、ハイブリッド形成に使用されなかった。
【０１５４】
標準ハイブリッド形成プロトコルをこのスライドに適用した。独立の２組の実験を実施した。
【０１５５】
走査及び画像解析
それぞれ、Ｍｅｄｗａｙ Ｆａｒ ２０００−Ｉ及びＭｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社のＡｒｒａｙ Ｐｒｏソフトウェアにより、走査及び画像解析を実施した。スキャナ感度は、９００から１０００の範囲に保持され、飽和及び低強度の両方を補正した。１６ビット形式の画像を処理した。
【０１５６】
データマイニング
２つの実験条件の間の遺伝子発現の観察された相違点の統計的有意性を確定するために、それぞれの実験を３通り実施した。
【０１５７】
データ有意性及びばらつきを説明するために、いくつかの反復実験に対しＴ検定を実施した。Ｗｅｂページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｇｂ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｓｅｒｖｅｒｓ／ｃｙｂｅｒｔで入手できるＣｙｂｅｒ−Ｔツールを使用して、この検定を適用した。ｐ＝０．０５でのカットオフ値を使用した。この分析の結果として、異なるデータセットにおいてほぼ５％の疑陽性が期待される。この検定に合格したデータセットのみを使用した（Ｔ検定の後のデータ選択）。
【０１５８】
結果
ｎｍ２３−Ｈ１を単独で、及び／又はｈ−ＰＲＵＮＥと組み合わせて過剰発現する安定なクローンの遺伝子発現プロファイルを検証するために、１９，０００遺伝子セットを含む出来合のアレイを使用して遺伝子アレイ研究を実施した。このアレイは、ガラススライド上にスポットされたヒトＵｎｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡデータセットを含む（カナダ、オンタリオ州、Ａｒｒａｙ ｆａｃｉｌｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．ｃａ／）。
【０１５９】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）クローンからのＲＮＡを使用して、ハイブリッド形成を実施した。それぞれの乳癌クローンについて独立の２組の実験を実施し、Ｔ検定値（ｐ＝０．０５）を外挿した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｅｍ．ｉｔ／ｚｏｌｌｏ／ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ／ａｒｒａｙ．ｈｔｍｌ）。
【０１６０】
転移プロセスに関わる複数の遺伝子の発現レベルは、表１に示されているように、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンと比べて、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）において区別される形で調整されることがわかった。表１は、安定細胞乳房クローンについて実施されたアレイ実験をまとめたものであり、左から右への列、ＩＤ番号、Ｕｎｉｇｅｎｅ基準番号、及びヒト染色体上の位置を含む遺伝子同定、独立の２つの実験が２通りに実施された後のＭＤＡ−Ｈ１−１７７／ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン＃８のアレイデータ間の関係、標準偏差及びｐ値を含むＴ検定値、遺伝子の書誌学的参照、対応する転移のプロセスとして報告されている。
【０１６１】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【０１６２】
腫瘍形成及び転移プロセスに関与し、遺伝子発現分析において著しく変更される、複数の遺伝子を選択し、代替方法によるその発現レベルを確認した。
【０１６３】
リアルタイムＰＣＲ実験を１１個の遺伝子について実施した（遺伝子プライマー対は、ジーンバンクＩＤ配列から選択された）。これらの選択された遺伝子のうち７及び４は、それぞれ、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン（クローン＃８）において上方及び下方制御されることがわかった。発現がチップアレイとＰＣＲリアルタイムの両方により確認された、安定ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現クローンのレベルで区別されるそのような遺伝子発現を表２に報告する。
【０１６４】
上述の細胞モデルでは、細胞骨格再編成（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ型ｉｉ）、プロテアーゼ活性（プロテアソーム２６ｓサブユニット、ｎｅｄｄ４結合タンパク質）、腫瘍形成（Ｉ−プラスチン、ｒａｂ１ｂ、ｂｒａｃａ１関連タンパク質（ｂｒａｐ２））、タンパク質リン酸化反応、及び核輸送（カゼインキナーゼｉｉ １−ｃｋｉｐ１相互作用タンパク質）に関与することが知られている遺伝子の上方制御が見つかった。
【０１６５】
下方制御は、細胞外マトリックス接触又は細胞粘着（プラコフィリン、ＬＩＭ）、細胞骨格再編成（プラキン）、及び腫瘍抑制活性（ＥＸＴ１）に関与する４つの遺伝子で見つかっており、そのような証拠を表２にまとめた。この表は、安定ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現ＭＤＡクローン内の異なる遺伝子発現を報告したもので、左から右へ、ジーンバンクＩＤ同定、遺伝子名、独立の２つの実験を２通りに実施した後のクローン＃８／クローン＃１７７のアレイ発現値間の関係、アレイ発現のＰ値、リアルタイムＰＣＲにより値を設定されたクローン＃８／クローン＃１７７のアレイ発現値間の関係、リアルタイムＰＣＲのＰ値、相関関係のある細胞生物学的プロセスの列が報告されている。
【０１６６】
【表２−１】
【表２−２】
【０１６７】
要約すると、腫瘍形成に結びつくプロセスに関与する遺伝子が、発現レベルでは著しく変更されて、そのため、ｈ−ＰＲＵＮＥがこの乳癌細胞系のより高い発癌能に寄与する決定要因のあることを示していることが発見されたということである。
【０１６８】
結論
ＤＨＨスーパーファミリーに属している２つのタンパク質、つまり、ＲｅｃＪヌクレアーゼ及び無機ピロホスファターゼに基づく構造解析により、ｈ−ＰＲＵＮＥは金属イオン依存性ホスホエステラーゼ活性を有する可能性が示唆される。ホスホエステラーゼのＤＨＨファミリーの構造解析及び進化論的タンパク質畳み込み研究の結果として、哺乳類ｈ−ＰＲＵＮＥはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有することが証明された。
【０１６９】
ｈ−ＰＲＵＮＥは、ヌクレオチド上で機能することが知られている、ＮＤＰＫ活性を有するｎｍ２３−Ｈ１アイソフォームと相互作用するので、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の特徴付けと細胞シグナリングにおける役割に注目が集中した。ＤＨＨファミリーの保存モチーフＩＩＩ内の置換を含むｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体は、ＰＤＥ活性の減少を示す（図２、パネルＡ、Ｂ、Ｆ）。
【０１７０】
様々な部位の単一又は複数の突然変異分析から、モチーフＩＩＩのイスチジン（１２７）、アルギニン（１２８）、及びプロリン（１２９）、並びにそれぞれモチーフＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ内に存在するアスパラギン酸Ｄ２８、Ｄ１２６、Ｄ１７９の突然変異のみがｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に実質的な影響を及ぼし、したがって、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ触媒部位への関与の可能性が高いことを示すことがわかった。
【０１７１】
保存モチーフＩＩＩ領域は、タンパク質モデリングにより予測されるとおりＭｇ２＋イオンの結合に関与しており（図１、パネルＢ）、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイでは、ｈ−ＰＲＵＮＥも、非存在（図２、パネルＥ）、又は低金属イオン濃度（図２、パネルＦ）で機能することができることが観察された。
【０１７２】
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３ｓタンパク質レベルは、肉腫及び乳癌腫瘍において不平衡であることが実証され、ｈ−ＰＲＵＮＥはｎｍ２３−Ｈ１抗転移性機能をマイナス方向に調整することができることを示唆している。ｈ−ＰＲＵＮＥ発現の増大は、これらの腫瘍及び癌の進行の悪性度に直接相関する（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年）。複数の報告書において、ｎｍ２３−Ｈ１の抗転移活性は、ＮＤＰＫ活性と無関係である（Ｓｔｅｅｇ他、１９９３年、Ｗａｇｎｅｒ １９９７年）と主張しているため、本発明者らは、原発腫瘍部位から遠くへ移動するために癌細胞が獲得する第１の細胞機能の１つを表す、細胞運動性に対するｈ−ＰＲＵＮＥの影響を調査した。
【０１７３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性がこれらの現象に直接関与することを確認するため、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、及びｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔを、乳癌モデルにおいて過剰発現させたところ、野生型タンパク質の過剰発現は、細胞運動性を誘発するが、そのＰＤＥ機能（ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ）の減少は細胞運動性の減少に対応していることが観察された。
【０１７４】
逆に、突然変異体ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔの８０％ ＰＤＥ活性減少及びＭＤＡクローン内のその過剰発現は、細胞運動性の著しい増大を引き起こさないことが観察され、したがって、他の潜在的ｈ−ＰＲＵＮＥ活性が運動増大に関与することは除外される。
【０１７５】
他の細胞内の特徴付けされたＰＤＥは細胞移動に関連していなかったとしても、ＭＤＡの安定なクローン内のＰＤＥ活性の増大が細胞運動性に寄与する可能性があるかどうかが調査された。この目的のために、ＰＤＥ５Ａは、同じ細胞モデル内で過剰発現され、細胞運動性に対する影響について試験された。ジピリダモール（ＩＣ５０ ０．９μＭ）に対する感度について選択されたＰＤＥ５Ａは、ＭＤＡ乳房細胞運動性に影響を及ぼさず、そこで、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ機能のみが乳癌細胞の細胞運動性の増大に関与することが示される。
【０１７６】
さらに、高いｎｍ２３−Ｈ１発現背景におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現は、運動表現型の減少を示し、ｈ−ＰＲＵＮＥだけを過剰発現する細胞と比べてｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を下げることが観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、ｎｍ２３−Ｈ１との相互作用の後ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大されるが（図４、パネルＡ）、この効果はｉｎ ｖｉｖｏでは観察されなかった。これらの減少は、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンと比較してもＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ内に大量のｎｍ２３−Ｈ１が存在するということにより説明できる（図３、パネルＢ）。
【０１７７】
これは、ＰＲＵＮＥ−ｎｍ２３Ｈ１複合体形成にマイナスの影響を及ぼす可能性があり、これは異なるオリゴマー及び／又は翻訳後修飾ｎｍ２３−Ｈ１フォーム（例：セリンリン酸化反応）の存在に依存する可能性がある（Ｓｔｅｅｇ他、２００３年）。
【０１７８】
ｎｍ２３抗転移性機能に対するｈ−ＰＲＵＮＥのマイナスの調整は、タンパク質間相互作用の結果としてのＰＤＥ活性の増大によるものであるとの仮説を検証するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する２つのｎｍ２３−Ｈ１突然変異体の効果を調べた。これらのタンパク質突然変異体は、ｈ−ＰＲＵＮＥと物理的に相互作用できるｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ、及びｈ−ＰＲＵＮＥと相互作用しないｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇであり（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）、両方の突然変異体は、乳癌細胞内でトランスフェクションが行われ（ＭＤＡ−４３５）、それらはｎｍ２３−Ｈ１野生型タンパク質の内生抗運動効果を抑制することができる（Ｆｒｉｊｅ他、１９９７年、Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）。
【０１７９】
さらに、ｎｍ２３−Ｈ１−Ｓ１２０Ｇなどの高ｎｍ２３発現系内でｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する乳癌細胞は、ｎｍ２３−Ｈ１−Ｐ９６Ｓ系内の過剰発現ｈ−ＰＲＵＮＥ細胞と比較して細胞運動性が低いことが示された。
【０１８０】
したがって、これら２つのタンパク質間の物理的相互作用は、運動促進に関与しうることが実証された。さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥ−ｎｍ２３−Ｈ１−Ｓ１２０Ｇクローンは、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１−Ｐ９６Ｓの両方を過剰発現するクローン内で観察されるＰＤＥ値と比較してＰＤＥ活性がほぼ６６％低く（図４、パネルＢ）、そのため、タンパク質間相互作用、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性、及び細胞運動性効果の間に相関関係があることを決定的に示している。
【０１８１】
知られているＰＤＥ阻害剤がｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対抗して選択的に機能することができたかどうかを理解するために、８つのＰＤＥ阻害剤一組を試験したところ、ジピリダモールがｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を阻害することができ、著しいＩＣ５０値を有することが発見された。
【０１８２】
さらに、ジピリダモールを使用すると、安定なｈ−ＰＲＵＮＥ乳房クローンの運動が著しく低下し、またそれほどではないが、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ過剰発現クローンの運動も低下した（図５、パネルＢ）。ジピリダモール及び類似の薬剤などの抗凝血剤は、細胞が毛細血管壁に粘着するのを阻害することを通じて血液凝固伝導路活性に機能干渉を加えるというのが一般的見解である。ここで報告した結果に照らして、ジピリダモールを使用することは、広がっている乳癌転移に対する予防及び治療薬となりうると考えることは論理的である。
【０１８３】
さらに、細胞運動性活性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ観察データは、ＴｘＮｘＭ１患者からの有意な数の乳癌組織を使用してｉｎ ｖｉｖｏで確認された。遠隔転移を示す症例のうち５９件の腫瘍症例では、ｈ−ＰＲＵＮＥは、２２の症例（３７％）でコピー数が増幅され、過剰発現されることがわかったが、ｎｍ２３−Ｈ１は、すべての分析症例において、低いレベルで発現されていることがわかった（図６、パネルＢ、Ｃ、Ｄ）。
【０１８４】
予備データは、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を有する患者間の全生存率の統計的に有意な減少により推論されるように、乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥのマイナスの予後の役割を示している。提示されたデータは、ｈ−ＰＲＵＮＥが転移に関与する遺伝子を上方制御し、その活性は悪性度の高い腫瘍挙動の危険性をｉｎ ｖｉｖｏで高めることを示しており、したがって、乳癌患者の臨床転帰に対しマイナスの寄与をする。報告された結果は、ｈ−ＰＲＵＮＥ前転移悪性腫瘍機能を阻止するために乳癌の治療の際に使用されるｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を選択的に阻害することができる薬剤を実現する可能性として、重要な薬理学的帰結を有する。さらに、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンと比較した場合に発現が乳房ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）内で変更された腫瘍形成及び転移プロセスに関与する１１個の遺伝子を、アレイ発現により分析し、リアルタイムＰＣＲにより妥当性の検証を行った。提示される結果は、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現に相関するＭＤＡ乳癌細胞系の悪性度及び転移能の追加の証拠となる（実施例２）。
【０１８５】
全体として、これらの結果は、ｎｍ２３−Ｈ１抗転移性機能にマイナスの影響を及ぼす細胞運動性及び転移の促進に対するｈ−ＰＲＵＮＥの役割を明確にしている。癌の進行におけるｈ−ＰＲＵＮＥの役割を研究するために使用されるモデルでは、一般に、腫瘍細胞の増幅を必要とする。
【０１８６】
この増幅は、細胞質区画のｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の増大をもたらし、ｎｍ２３の転移機能の抑制剤にマイナスの影響を及ぼす。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の活性化は、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質との物理的相互作用によるものであり、複合体形成の結果、遊離ｎｍ２３−Ｈ１形態レベルの実質的減少が生じ、それにより、細胞増殖、細胞運動性、及び転移プロセスに影響が及ぶ（図７）。
【０１８７】
（実施例３）
浸潤性乳癌の診断におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の役割の研究
材料と方法
患者
この研究では、組織学的検査により乳癌と診断された患者を含めた。スイスのバーゼル大学病院の２つのアーカイブから、それぞれ地方倫理委員会とサッサリ大学の病理学協会の承認を得て症例を取り出した。第１のアーカイブは、１，５３１件の浸潤性腺管癌、３１０件の浸潤性小葉癌、６９件の粘液性癌腫、６５件の管状腺癌、４８件の髄様癌、及び８６件の他の種類の浸潤癌を含んでいた。そこで、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料を、バーゼル大学病院の病理学協会、バーゼルの臨床病理学協会、及びチューリッヒのＴｒｉｅｍｌｉ病院から入手した。第２のアーカイブは、３０７件の浸潤性腺管癌、６９件の浸潤性小葉癌、１２件の粘液性癌腫、２４件の他の種類の浸潤癌を含んでいた。
【０１８８】
診断、治療、再発、無病生存率、及び最終対照の時間の疾患段階を含む、それぞれの患者の臨床病理学的特徴はすべて、バーゼル及びサッサリの登録所から取得した。
【０１８９】
病理病期、腫瘍直径、及びリンパ節の状況は、一次病理学報告書から得られた。臨床データは、２，２９９例について１０年間の追跡調査の後に入手でき（中央値、５６カ月、範囲、２〜１２０カ月）、１５年間の追跡調査の後の臨床データは、２２２人の患者について入手できた（中央値、１３８カ月、範囲、１２１〜１７６カ月）。この研究のための標本及びデータは、バーゼル大学病院とサッサリ大学の両方の倫理委員会によって承認された。
【０１９０】
組織多重アレイ（ＴＭＡ）
ＴＭＡ構成については、既に説明されている（Ｓｉｍｏｎ他、２００１年、Ｓｉｍｏｎ他、２００２年）。要約すると、半自動ロボット高精度計測器を使用して、組織ドナーの代表的な腫瘍領域から直径０．６ｍｍの組織円筒をパンチし、それぞれ３４２から５２２の個別試料を含む６つの異なるパラフィンブロック内に配置するということである。その結果得られるＴＭＡブロックの４つのマイクロメートル切片をコーティングされたセクションシステムに移動する（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ハッケンサック）。多重アレイ化試料上の腫瘍組織の存在は、ヘマトキシリンエオシン染色により検証された。組織マイクロアレイは、それぞれの患者の乳癌の異なる領域からの少なくとも２つの切片と共に対照として正常組織を含んでいた。
【０１９１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
抗ｈ−ＰＲＵＮＥ特異モノクローナル（クローン４Ｇ３／４、１から３５１のアミノ酸の組換え融合タンパク質に対して、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）及び抗ｎｍ２３−Ｈ１（クローンＫ７３、−Ｈ１アイソフォーム特異、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）抗体を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織片を免疫染色した。取付説明書に従い、また知られているプロトコルに従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、免疫組織化学分析を実施した（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年、Ｄ’ａｎｇｅｌｏ他、２００３年）。
【０１９２】
健康な乳房細胞の代表的な対照組織病理学切片を染色することにより最適化されたＩＨＣプロトコルを確立した。正常な乳房組織では、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質は、均質的に発現されるが、ｈ−ＰＲＵＮＥの発現は、存在しないか、又は低強度であった。
【０１９３】
多重アレイ上に２通りに無作為に配置された５４個の正常試料を使用することにより染色を半定量的に評価し、免疫組織化学染色の強度及び分配を使用し、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３発現の両方について腫瘍試料を陽性（強［＋＋＋］から中［＋＋］の染色、腫瘍細胞の大半により均一に分配又は与えられる）又は陰性（非存在又は弱染色［＋］）として分類した。
【０１９４】
ＦＩＳＨ分析
知られているプロトコルに従ってパラフィン包埋ＴＭＡ切片を処理した（Ｓｉｍｏｎ他、２００２年：Ｍｕｒｅｓｕ他、２００２年）。
【０１９５】
染色体１ｑ２１．３上に局在するｈ−ＰＲＵＮＥ遺伝子領域にまたがるＰＡＣ ２７９−Ｈ１９クローン、及び染色体１７ｑ２１．３上に局在するｎｍ２３−Ｈ１遺伝子に特異的な、ＤＮＡ／ＢＡＣクローンを、ｄＵＴＰ−ＣＹ３（赤色）を使用するニックトランスレーション法で標識し、プローブとして使用した。ｐＵＣＩ７７は染色体１ｑ１２上のペリセントロメア領域に対応し、ｐＺ１７−１４は染色体１７のセントロメア領域に対応し、クローンは、ｄＣＴＰ−ＦｌｕｏｒＸ（緑色）を使用するニックトランスレーション法により標識され、対照として使用された。
【０１９６】
細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）により対比染色された。それぞれの症例について２つの異なる実験を実施した。
【０１９７】
ＤＡＰＩ、Ｃｙ３（オレンジ）又はＦｌｕｏｒＸ（Ｖｙｓｉｓ）の励起用の適切なフィルタ、及びＣＯＨＵ Ｖｉｄｅｏ ａｎｄ Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−６１落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取り込んだ。少なくとも１００個の損なわれていない、保存状態のよい、重なりのない核上のハイブリッド形成シグナルは、少なくとも２人の研究者により評価された。
【０１９８】
統計的分析
この研究には、変数及びカテゴリとして、病理学的原発腫瘍サイズ（ｐＴ）、病理学的リンパ腺状況（ｐＮ）、転移の存在（Ｍ）、エストロゲン及びプロゲステロン受容体（それぞれＥＲ及びＰＲ）の状況、診断時の年齢、組織学的腫瘍種類、及び全生存（外科手術時を開始時点として計算する）を含めた。特に、リンパ腺及び受容体の状況は、多数の症例の中では利用できなかったが、それは、これらの変数は研究対象に患者を含めるうえで必要なかったからである。
【０１９９】
生存データ解析を統計パッケージＥｇｒｅｔ（バージョン２．０．３）で実施した。生の死亡及び腫瘍特異的死亡発生率を検閲データとして使用して、Ｃｏｘ回帰モデルを実施した。
【０２００】
全生存の時間は、月で表し、独立変数（ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、ｐＴ、ｐＮ）は、３つの年齢グループ２３〜４４（Ｎ＝２５２）、４５〜６４（Ｎ＝１，１４６）、及び６５〜９８（Ｎ＝１１２３）として階層化した。
【０２０１】
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１免疫組織化学データを細分してＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ推定を実施した。
【０２０２】
Ｐｅａｒｓｏｎのχ二乗検定を使用し、病理的パラメータ（組織学的腫瘍種類、ｐＴ、ｐＮ、Ｍ、ＥＲ、ＰＲ）との関連でｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現評価を実施した。試料比率分析の正確な係数を計算し、有意なパラメータ（０．０５レベル未満）すべてを決定した。分析はすべて、統計パッケージＳＰＳＳ／７．５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を使用して実施した。
【０２０３】
結果
組織学的に証明されている乳癌診断及び利用可能な追跡調査データのある２，１０９人の患者の保管されている組織からのＴＭＡ切片について、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現レベルと共に、ｈ−ＰＲＵＮＥ染色体コピー数の評価を実施した。４１２人の乳癌患者からの追加のＴＭＡ切片（つまり、そのＴＮＭ分類が利用できた）をｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色について評価した。患者の大半は、腺管癌を組織学的変異体として有し（１，８８３人、７３％）、年齢は診断時に６０歳を超えていた（１，４２５人、５７％）。５９カ月の中央値期間（範囲２〜１７６）をカバーするそれぞれの患者の臨床的追跡調査結果のデータが利用可能であり、患者の大半は、まだ生存しており（１，７１６人、６８％）、ごく少数の患者のみがこの研究時点において追跡調査で失われた（１２人、０．５％）。２つの特異抗体（それぞれ４Ｇ３／４及びＫ７３モノクローナルＡｂクローン）を使用して免疫組織化学分析により、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の発現を評価した。図９（パネルＡ及びＢ）は、一連の多重組織アレイ内のｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の染色の代表的実施例を示している。
【０２０４】
ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の強陽性細胞質染色（ｈ−ＰＲＵＮＥ＋と呼ばれる）は、２，４６３個の試験腫瘍の大半（１，３４０人、５４％）において観察され（５８人の患者については評価しなかった）、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の陽性細胞質免疫染色は、２，０６１個の試験腫瘍のうち６１５（３０％）個において観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現について評価された２，０６１個の腫瘍組織では、陽性免疫染色の逆分布が観察された［１，１８０（５７％）の乳癌はｈ−ＰＲＵＮＥ＋であったが、６１５（３０％）個はｎｍ２３−Ｈ１＋であった］。表３には、浸潤性乳癌に存在するｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質についての免疫組織化学分析（ＩＨＣ）の結果が報告されている。ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１発現との間に統計的相関関係は観察されなかった。
【０２０５】
【表３】
【０２０６】
異なる病理組織学的パラメータに基づき、患者のサブグループ（２１０９人の乳癌患者）内のｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質発現の分布を評価した。ｈ−ＰＲＵＮＥ又はｎｍ２３−Ｈ１発現と腫瘍の種類（腺管と小葉）、ｐＴ、ｐＮ、ＥＲ、及びＰＲ反応性の間に有意な相関関係は観察されなかった（表４）。
【０２０７】
【表４−１】
【表４−２】
【０２０８】
乳癌患者の１，０１６件の腫瘍について蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析を実施した。染色体１ｑ２１．３のところでｈ−ＰＲＵＮＥゲノム領域に対応するＰＡＣクローン（２７９−Ｈ１９）及び１ｑ１２染色体のところでペリセントロメア領域に対応する対照クローンをプローブとして使用した。分析された核内の２０％超の１ｑ２１．３のところの複数のＦＩＳＨシグナルは、１７３件（１７％）の症例にあることがわかった（表５、図９Ｃ）。セントロメアに対し少なくとも２つの遺伝子コピーを有する症例及び複数のセントロメアシグナルが存在するため染色体１全体の多染色体性を有する乳癌を考察したところ、染色体１ｑ２１．３のところで非常に低いレベルのｈ−ＰＲＵＮＥ増幅が観察された（１，０１６件のうち６８症例、６．７％）。これは、遺伝子増幅メカニズムが少ない数の乳癌症例で発生することを示している。ｈ−ｐｒｕｎｅゲノム領域でのＤＮＡコピー数の増大は、三染色体性（ｐ＝０．０２７）又は四染色体性（ｐ＝０．０３３）を有する腫瘍における陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色の存在に対する有効統計的相関関係に有意に関連する（表５）。しかし、このような細胞遺伝学的変更の頻度の低いことから、関与する代替病原性経路がｈ−ＰＲＵＮＥ活性化及び乳癌のｈ−ｐｒｕｎｅ体性発現の増大を決定することが示唆される。
【０２０９】
【表５】
【０２１０】
ｈ−ｐｒｕｎｅと臨床病理学的パラメータとの相関関係
乳癌におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の臨床病理学的役割を評価するために、２，１０９件の乳癌症例の系列（病的原発腫瘍情報及び最大１５年分の臨床追跡データのすべてを含む、表４）と４１２件の乳癌症例の系列（完全なＴＮＭ分類及び最大１０年分の臨床追跡データを含む、表６）の両方を使用して、浸潤性原発乳房腫瘍について、免疫組織化学的分析を実施した。
【０２１１】
【表６】
【０２１２】
さらに、２，１０９人の患者の部分集合から取った腫瘍切片も、ｎｍ２３−Ｈ１発現について、免疫組織化学分析により調査した（表７）。
【０２１３】
【表７−１】
【表７−２】
【０２１４】
この後者の部分集合は、遠隔転移の存在についての情報を与えることがなく、リンパ腺の状況に関する情報は、リンパ節転移の存在（Ｎ＋）又は非存在（Ｎ−）に関してそのような乳癌患者について部分的に利用可能であった（陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色は、２１０／４８２［４４％］のＮ＋症例、及び１７９／４９６［３６％］のＮ−症例、Ｐ＝０．１０９で観察され、同じように、ｎｍ２３−Ｈ１＋免疫染色についての統計的相関関係は、これら２つのグループについては見られなかった）。したがって、それぞれのパラメータの予後値は、生存分析に基づいて決定された。
【０２１５】
２００２年１２月に、疾患のため７８２人（３１％）の患者が死亡したが、全体の生存期間の中央値は、５９カ月であり、生存患者の追跡は７２カ月である。Ｐｅａｒｓｏｎのχ二乗検定を使用し、いくつかの病理的パラメータ、つまり組織学的種類、腫瘍格付け（ＥｌｓｔｏｎとＥｌｌｉｓによって標準化されたとおり）、ｐＴ、ＥＲ、ＰＲ、及び（利用可な場合）ｐＮ、及びＭとの関連でｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３−Ｈ１免疫染色を評価した。ｈ−ｐｒｕｎｅ又はｎｍ２３−Ｈ１発現と腫瘍の種類（腺管と小葉）、組織学的グレード、ｐＴ、ＥＲ、及びＰＲ反応性の間に統計的に有意な相関関係は観察されなかった（表４）。代わりに、４１２人の乳癌患者の系列において陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色は進行性リンパ腺状況（Ｎ２〜Ｎ３グループ、ｐ＝０．０１７）又は遠隔転移の存在（Ｍ１グループ、ｐ＝０．０２９）との有意な相関関係を有していた（表６）。この系列の統計分析により、ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現と原発腫瘍サイズとの間の有意な関連の非存在が確認された（表６）。
【０２１６】
疾患段階及び診断時の年齢に応じて調整されたＣｏｘモデルを使用したが、ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現（ＨＲ ０．６１、９５％ Ｃｌ ０．３１〜１．１８、ｐ＝０．１４４）又はｎｍ２３−Ｈ１（ＲＲ ０．９８、９５％ Ｃｌ ０．９０〜１．０７、ｐ＝０．１５８）の予後値は観察されなかった（表８及び９、図１０）。
【０２１７】
【表８】
【０２１８】
全体として、腫瘍格付け、原発腫瘍サイズ、及び腋窩リンパ腺状況は、乳癌患者のこの系列における予後に密接に相関するパラメータである（表８及び９）。
【０２１９】
したがって、結論として、ｈ−ｐｒｕｎｅマーカーは、進行乳癌状況に関連付けられ、Ｎ１からＮ２状況に移るときのリンパ節状況の新しいマーカーと考えることができる。
【０２２０】
（実施例４）
ＮＭ２３ ＨＩ及びＨ２リン酸化反応、及びｈ−ｐｒｕｎｅ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を引き起こすｈ−ｐｒｕｎｅとの複合体の形成を阻害するＩＣ２６１の使用に関する研究
材料と方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｎｍ２３Ｈ１及びＨ２タンパク質は、カゼインキナーゼ１δによりリン酸化され、リン酸化反応は複合体の形成に介在することを示す研究（図１１）。
【０２２１】
方法−ｉｎ ｖｉｔｒｏ
リン酸化反応ｉｎ ｖｉｔｒｏ、相互作用アッセイ、及びホスホ−ｎｍ２３抗体の生成。１００ｎｇの量の精製された組換えｎｍ２３及びその突然変異体を、Ｇａｒｚｉａ他（２００３年）で説明されているように、１時間の間、３０℃で、ＣＫＩ標準反応緩衝液内でインキュベートした。その後ｎｍ２３リン酸化タンパク質を、５％ＢＳＡを補った共ＩＰ標準緩衝液内でｈ−ｐｒｕｎｅと共にインキュベートした。ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、ｈ−ｐｒｕｎｅのモチーフＩＩＩ上のペプチドに対してポリクローナル抗体Ａ５９で免疫沈降した。リン酸化されているか、又はｈ−ｐｒｕｎｅ結合されてないｎｍ２３の異なる突然変異体の存在は、同時にｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３タンパク質を検出する抗Ｈｉｓ ｔａｉｌ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で実施される免疫沈降でのその後のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により検出された。
【０２２２】
Ｋ７３ポリクローナル抗体は、免疫原として、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質からの位置Ｓ１２２でリン酸化されたＮ１１５からＥ１２７のホスホペプチドを使用して得られ、抗血清は、非選択的抗体における結果として得られるタンパク質Ａのカラム上のＩｇＧ精製、及び免疫原として使用されるホスホペプチド（ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＫＳＡＥ）上の他のアフィニティ精製の後に使用された。この第２の手順は、メーカーのプロトコルに従ってＡｆｆｉ−ｇｅｌ ２５樹脂（ｂｉｏｒａｄ）でＤＭＳＯ中に溶解された脱塩リン脂質１ｍｇの架橋結合を通じて実施された。その後、結合樹脂を、リン酸化され、既に精製されたもので免疫されたウサギの血清を使用するアフィニティ精製に使用し、直接Ａｆｆｉｇｅｌ結合ペプチドカラムに塗布された、抗体まで濃縮されたＩｇＧペプチド（Ｋ７３ポリクローナル抗体）をカラムにより吸着した。カラムは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣ １０ｍｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）をそれぞれ使用して、カラムｍｌ毎に洗浄した。０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３）で溶離を実施した。
【０２２３】
方法−ｉｎ ｖｉｖｏ
Ｉｎ ｓｉｔｕタンパク質消化及びＭＡＬＤＩ分析
トリプシン、ジチオトレイトール、及びヨードアセトアミドをＳｉｇｍａから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−ＨＰＬＣ、純度９９％は、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａからのものである。最高純度の他のすべての試薬及び溶媒は、Ｂａｋｅｒから入手した。
【０２２４】
ＳＤＳゲルから切り取り、ｍｉｌｌｉＱ水グラジエントで２回洗浄した、クマシーブルーで染色したタンパク質について分析を行った。摘出した染色物をまずＣＡＮで洗浄し、その後、０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで洗浄した。その後、溶液を除去し、洗浄を２回繰り返した。タンパク質試料を、４５分間、５６℃で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）内のインキュベートにより還元した。説明されているように、ＡＣＮ／ＡＭＢＩＣによる洗浄で還元緩衝液を除去した。暗所で、室温で、３９分間、５５ｍＭのヨードアセトアミドのインキュベートにより遊離システインをアルキル化した。重炭酸アンモニウムとＡＣＮでゲル粒子を洗浄した。１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中のトリプシン（１２．５ｎｇ／μｌ）を使って酵素消化を行った。ゲル断片を４時間の間、４℃でインキュベートした。その後、トリプシン溶液を除去し、緩衝液の新しいアリコートを加えた。試料を、１８時間の間、３７℃でインキュベートした。完全ゲル再水和に十分な最低限の反応体積を使用した。その後、室温で５０％のＡＣＮ中の１０ｍＭの重炭酸アンモニウム及び０．１％のＴＦＡを使用してゲル粒子を洗浄することによりペプチドを抽出した。
【０２２５】
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ計測器及び新しいＶｏｙａｇｅｒ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を記録した。ペプチド及びアルファ−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（ＡＣＮ中１０ｍｇ／ｍｌ／水中０．１％ ＴＦＡ、２：１、ｖ／ｖ）の混合液を金属板に塗布し、室温で乾燥させた。外部標準を使用して、質量較正を実施した。メーカーが用意したソフトウェアを使用して第１のデータを分析し、モノアイソトピック質量として報告した。
【０２２６】
図３に示されている結果は、リン酸化反応がない場合に、その部位のｎｍ２３Ｈ１及びｎｍ２３Ｈ２タンパク質はｈ−ｐｒｕｎｅとの複合体を形成しないことを示している。
【０２２７】
ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現クローンの細胞運動性研究
ＩＣ２６１による阻害に関する研究
ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ ＃３及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ ＃４細胞クローン及びＭＤＡ−４３５Ｃ−１００細胞（対照細胞）を、８μＭのジピリダモール又は５０μＭのＩＣ２６１（カゼインキナーゼＩδ及びε阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、英国ノッティンガム）でそれぞれ２４時間又は８時間かけて処理した。その後、０．５％の胎児血清ＦＣＳ濃度を化学誘引物質として使用して、細胞運動性アッセイを「ｂｏｉｄｅｎ ａｎｄ ｃｈａｍｂｅｒ」細胞に適用した。その後、顕微鏡を使って細胞の数を数え、得られたデータに統計分析を適用した（図１３Ａ）。
【０２２８】
顕微鏡を使って細胞を数えたところ、細胞運動性値は、すべて２通りに実施した５回の独立アッセイで算術平均±ＳＤである（ＭＤＡ−クローンｐｒｕｎｅ＃３及び＃４／ＭＤＡ−クローンｐｒｕｎｅ＃３及び＃４、但しＩＣ２６１ ｐ＜０．００２）。
【０２２９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
安定ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現ＭＤＡクローンはＤ’Ａｎｇｅｌｏ他、２００４年で説明されているようにして得られた。対照ＭＤＡ−Ｃ１００乳癌細胞系を、細胞運動性アッセイで使用した（Ｌｅｏｎｅ他、１９９３ａ、Ｌｅｏｎｅ他、１９９３ｂ）。細胞運動性は、０．５％ ＦＣＳ、最終濃度を化学誘引物質として使用するトランスウェル技術（６ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）を使用して決定された（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ他、２００４年を参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈ−ｐｒｕｎｅ阻害運動アッセイは以下のように実施された。ＭＤＡ−ｐｒｕｎｅ（クローン＃３及び＃４）及びＭＤＡ−Ｃ１００を、ジピリダモール（８μＭ、ＩＣ５０に関して１０倍高い濃度）で２４時間の間インキュベートし、完全な酵素不活性をもたらし、同じ細胞系をＩＣ２６１により５０μＭの濃度で８時間の間インキュベートしたが、この条件では、細胞死のシグナルなしでｎｍ２３リン酸化反応の最高の減少を観察することができ、その後、運動アッセイを上述のように繰り返した。すべての結果は、すべて２通りに実施された５回の独立の実験の平均である。統計分析は、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｉｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍで入手できる低下されたＴ検定法で実施され、Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると考えられる。
【０２３０】
ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現細胞の、ＩＣ２６１投与を受けるｃＡＭＰ−ＰＤＥの全含量に関する研究
ＭＤＡ−Ｐｒｕｎｅ＃４細胞は、そのようなものとしてあるか、又は５０μＭ ＩＣ２６１で８時間の間処理された。その後、細胞を溶解し、Ａｍｅｒｓｈａｍ「シンチレーション近接アッセイ」法を使用してそのｃＡＭＰ−ＰＤＥ全含量について試験した。ＩＣ２６１の存在下で、組換えｈ−ｐｒｕｎｅのｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性（図１３Ｂ、右）の改変は検出されなかったが、ｐｒｕｎｅ過剰発現ＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４クローンにおけるｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の全含量をきめ細かく下げることができ、ｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３複合体が細胞ＰＤＥ−ｃＡＭＰ増大（図１３Ｂ、左）に関与することを示し、またそのような複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＣ２６１により阻害できることが指摘された。
【０２３１】
Ａ．ＰＤＥ活性アッセイとｃＡＭＰ
ＰＤＥ活性は、シンチレーション近接アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定された。試料、ＭＤＡ−ｐｒｕｎｅ＃４全抽出物の２０μｇ、及び対照として使用されるＭＤＡ−Ｃ１００抽出物を、基質として所望のｃＡＭＰ濃度を含む（非標識と３Ｈ−標識比３：１）アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ［ＰＨ７．４］、８．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．７ｍＭ ＥＧＴＡ）１００μｌの中で３０℃でインキュベートした。単独の緩衝液を含むブランクを含むすべての反応を、３通り実施し、基質回転率２５％未満（経験により決定）となるインキュベート時間の間進行させた。５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡパール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えて反応を急冷した。発見された放射性同位体標識産物量に対する酵素活性を、メーカープロトコルに従って計算した。ＩＣ２６１による処理は、上述の運動アッセイの場合と同じであった。
【０２３２】
結果
得られた結果は、ＩＣ２６１を使用してカゼインキナーゼ１δを阻害することにより、ｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２リン酸化反応を阻害し、したがって、ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質とのｉｎ ｖｉｖｏの結合を阻害する可能性があることを示している。したがって、この薬剤を使用することにより、ｈ−ｐｒｕｎｅ−ｎｍ２３複合体の形成を阻害することが可能であり、これは最後にカゼインキナーゼＩによる８１２０、８１２２、８１２５領域（ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ）内のリン酸化反応に依存する。この研究では、ＩＣ２６１を使用して、ｎｍ２３Ｈ１及びＨ２のｈ−ｐｒｕｎｅへの結合を阻害し、タンパク質複合体由来の細胞運動性を阻害することができる。
【０２３３】
新しい手順では、細胞内に浸透でき、ｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されたｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２の割当量を横取りする、ｈ−ｐｒｕｎｅの結合に関して競合する新しいペプチドの使用を予測でき、その配列は、８１２０、８１２２、及び８１２５セリンのｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２範囲のアミノ酸配列から導かれる（実施例Ｈ１：ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥの後にＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の領域の浸透ペプチド配列が続く。ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、純度９５％がＰＲＩＭＭによって合成される）。そのような、又は類似のペプチドは、Ｈ１及びＨ２野生型タンパク質上でカゼインキナーゼＩリン酸化反応とｉｎ ｖｉｖｏで競合し、ｈ−ｐｒｕｎｅ複合体形成及び細胞内のｈ−ｐｒｕｎｅ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の増大及び最終的に細胞運動性の誘発に関与するリン酸化されたｎｍ２３の割当量を減らすことができる。また、（Ｈ１−：ＳＤＥＩＧＫＶＳＥＮＩＡＨＳＥの後に続く浸透ペプチド配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）と呼ばれるカゼインキナーゼＩクランブルの認識配列を有する対照ペプチドを合成した。この技術を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏでｈ−ｐｒｕｎｅとｎｍ２３との間の相互作用の阻害をより特異的に標的にすることが可能である。
【０２３４】
（実施例５）
ｈ−ｐｒｕｎｅに対するモノクローナル抗体の作成（４Ｇ３／４、１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）
尾部のＮ末端で融合され、ｐＭａｌｔｏｓｅベクターを通じて大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）内で生成される、ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、精製されたゲルであった。マウスに５週間の間免疫し（１回注射でタンパク質１００μｇ）、何らかのハイブリドーマ培養を用意するために脾臓を取り出した。免疫及び分析のためにタンパク質抗原約２ｍｇが必要であった。Ｐｒｉｍｍは、タンパク質が利用できなかった場合の免疫用に接合合成ペプチドを提供することができる。モノクローナル抗体の開発及び生産は、以下の異なるフェーズで規定される。
− ペプチド合成及びペプチド接合（必要な場合）。
− ペプチド約１０ｍｇの合成、純度＞７０％
− ペプチド３〜４ｍｇを担体タンパク質に接合（抗原として）
− ＥＬＩＳＡスクリーニング用にペプチド１〜２ｍｇを異なる担体タンパク質に接合
【０２３５】
フェーズＩ（１．５カ月）
３ ＢＡＬＢ／ｃのマウスを抗原で免疫。免疫された動物の血清の特異免疫グロブリンの定量滴定の手順。次の脾臓細胞の融合に対する免疫反応及び動物選択のＥＬＩＳＡアッセイ。
【０２３６】
フェーズＩＩ（２カ月）
脾臓摘出及び脾細胞と骨髄症細胞との融合、最も陽性のクローンのＥＬＩＳＡ凍結を介したハイブリドーマ選択。
【０２３７】
フェーズＩＩＩ（１〜１．５カ月）
限界希釈法による陽性クローン（１／２又は４）のクローニング及びサブクローニング。ハイブリドーマの凍結（２アリコート／クローン）。アリコートの解凍後の存続可能性、生産性、及び安定性アッセイ。
【０２３８】
フェーズＩＶ（１〜１．５カ月）
浮遊物０．５ｌからの細胞培養のｍＡｂ ０．５〜４ｍｇの生成及び精製。
【０２３９】
選択されたハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養浮遊物から精製されたネズミＩｇＭを生産する。免疫細胞化学に使用されるｍＡｂの量は、１：１００から３００μｇ／ｍｌに希釈されたｍＡｂ溶液に等しい。抗体は、ヒトとネズミの両方のｐｒｕｎｅに作用し認識する。内生タンパク質の検出は、ＩＣＣ、ＩＦ、及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを使用して実施される（図１４）。
【０２４０】
抗体精製は、以下のＩｇＭ精製プロトコルに従って実施された。溶解細胞の浮遊物を１ｍｌ／分の流れに曝した。ＨｉＴｒａｐ ＩｇＭを、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．８Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４（緩衝液Ａ）、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３０％イソプロパノール（緩衝液Ｃ）で平衡化した（１ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ＥＬＩＳＡアッセイをペプチド及び精製されたタンパク質全体に対し実施し、生成された抗原及びクローン選択の特異性を決定した。
【０２４１】
カラム内にハイブリドーマ浮遊物を導入し、３つの緩衝液と共に溶離プロセスを３回繰り返し、そこで、カラムを１５体積の緩衝液Ａ（１５ｍｌ）で洗浄し、カラム溶離を１２体積の緩衝液Ｂ（１２ｍｌ）で行い（１ｍｌ画分の回収）、２８０ｎｍの画分吸収度を読み取り、０．１Ｏ．Ｄ．未満の吸収度の画分を回収し、４℃で一晩、１×ＰＢＳ緩衝液に対し１２０００〜１４０００の間のカットオフの管で画分透析を行う。カラムを再生するには、７ｍｌの緩衝液Ｃを使用する。緩衝液Ｂ＋２０％エタノールでカラムを保存する。
（参考文献）
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１Ａ】ＤＨＨファミリーのホスホエステラーゼ配列の多重整列を示す図であり、４つのジェネリックモチーフ（ｇｅｎｅｒｉｃ ｍｏｔｉｆ）（Ｉ−ＩＶ）及び第２のドメインにマッピングする２つの異なるサブファミリーのモチーフ診断を別々に示しており、数字は、それぞれのタンパク質配列内の第１の整列残基の位置及び異なる要素間の距離を示す。
【図１Ｂ】ＰＰＡＳＥ及びＲｅｃＪタンパク質の結晶構造に基づくｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の「リボン」構造。矢印は、アスパラギン酸残基（Ｄ）を示す。
【図１Ｃ】ＲｅｃＪタンパク質の「リボン」構造。矢印は、アスパラギン酸残基（Ｄ）を示す。
【図２Ａ】ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ基質上のｈ−ＰＲＵＥＮ ＰＤＥ活性の同定を示す図である。
【図２Ｂ】単一及び複数の突然変異の分析結果のヒストグラムは、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の潜在的触媒部位をマッピングしている。
【図２Ｃ】Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットで、それぞれ基質としてｃＡＭＰについてＫｍ及びＶｍａｘを決定している。
【図２Ｄ】Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットで、それぞれ基質としてｃＧＭＰについてＫｍ及びＶｍａｘを決定している。
【図２Ｅ】ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性は、Ｍｇ２＋の高い濃度で２つの異なる緩衝液の存在下で測定された。
【図２Ｆ】ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性は、Ｍｇ２＋（黒色点）又はＭｎ２＋（白色点）の高い濃度の存在下で測定された。ｈ−ＰＲＵＮＥ（実線）及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ（散在する点の線形）が示されている。
【図３Ａ】安定したクローン分析及びｉｎ ｖｉｔｒｏ運動アッセイを示す図である。リアルタイムＰＣＲ定量分析によるｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の試験。関連するΔＣｔ値が示されている。
【図３Ｂ】リアルタイムによるｍＲＮＡ発現の検出。ｍ−ＲＮＡのコピー数が報告される。
【図３Ｃ】ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、及びＨｉｓ−ｔａｇ特異抗体をそれぞれ（ＰＤＥ５Ａについて）使用するＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析は、それぞれの個別細胞クローン内に発現されたタンパク質の量を示している。
【図３Ｄ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ、及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ細胞系の細胞運動性は、それぞれｈ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）単独又はｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１（クローン＃７及び＃８）を過剰発現する。
【図３Ｅ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９及び＃２０）、ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａ（クローン＃１４及び＃１６）、及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７細胞系の細胞運動性。
【図３Ｆ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃２及び＃３）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃４及び＃５）細胞系の細胞運動性、単独又はｈ−ＰＲＵＮＥとの過剰発現ｎｍ２３−Ｈ１突然変異体。
【図４】ｎｍ２３タンパク質の存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性分析、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性を示す図である（パネルＡ）．パネルＢの表には、タンパク質溶解物全体で細胞ｐｍｏｌ×ｍｉｎ−１×μｇ−１として測定されたｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の値が報告されている。
【図５】ＰＤＥの阻害活性並びにＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、及びＭＤＡ ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）細胞系の運動の分析結果を表す運動ヒストグラムの図である（パネルＡ）。パネルＢの表には、ＩＣ５０の値として表されている、８つの試験阻害剤による異なるＰＤＥ上の阻害活性が報告されており、最後の列には、いくつかの最も感度の高い化合物に対するｈ−ＰＲＵＮＥ ＩＣ５０値が示されている。
【図６】乳房の腫瘍に関連する転移のｉｎ ｖｉｖｏ分析、ｈ−ＰＲＵＮＥ（左）とｎｍ２３−Ｈ１（右）の増幅を示すＭＴＡ（多重組織アレイ）のＦＩＳＨ分析を示す図である（パネルＡ）。中及び低（０／＋）ｎｍ２３−ＨＩ発現レベル（右）と対比したｈ−ＰＲＵＮＥ高発現（＋＋＋）腫瘍（左）の２つのグループの免疫組織化学の分析（ＩＨＣ）の倍率１００×及び２００×（パネルＢ、Ｃ）。５９ ＴＮＭ１乳癌患者に実施されたＦＩＳＨ分析とＩＨＣ分析の結果表（パネルＤ）。
【図７】乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥ前転移性機能を表すモデルを示す図である。
【図８】正常な乳房組織と腫瘍乳房組織を比較するＦＩＳＨ分析及び免疫組織化学分析を示す図である。パネルＡには、正常組織及び腫瘍組織（左）と腫瘍はあるが転移していない組織（右）の両方のｈ−ＰＲＵＮＥコピー数を特徴付けることができるＭＴＡのＦＩＳＨ分析が示されており、パネルＢには、低ｈ−ＰＲＵＮＥ発現（＋）腫瘍の２つのグループについて実施される免疫組織化学分析の倍率が報告されている。
【図９】乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥの発現及び細胞遺伝分析を示す図である。パネルＡでは、ＴＭＡセクションで実施されるｈ−ＰＲＵＮＥ発現に対する免疫組織化学分析及び陽性（ａ）及び陰性（ｂ）のｈ−ＰＲＵＮＥ免疫染色の倍率４０×が示されている。パネルＢには、ｈ−ＰＲＵＮＥ／ＰＡＣ２７９−ｈ１９をプローブとして、ｐＵＣＩ７７を対照として使用する同じ試料に関するＦＩＳＨ分析が報告されている。
【図１０】ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を示す図である。乳癌のすべての患者は、ｎｍ２３−Ｈ１（Ａ）及びｈ−ＰＲＵＮＥ（Ｂ）免疫染色を受けた。ｈ−ＰＲＵＮＥ陽性乳癌は、腋窩リンパ節転移が存在する場合（Ｃ）又は存在しない場合（Ｄ）のものである。
【図１１Ａ】バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）生成ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫沈降及びカゼインキナーゼδｉｎ ｖｉｔｒｏのリン酸化された、及びリン酸化されていない、ｎｍ３２Ｈ１を示す図であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫沈降を介した複合体形成を示すためにＳ１２０−１２５領域内の複数の単一突然変異が生成された。タンパク質は、バキュロウイルスで合成された組換えタンパク質の末端ＮＨ２に存在する抗ＨＩＳ抗体を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより目に見えるようになっている。レーン１及び２は、組換えタンパク質を対照として示している。免疫沈降は、Ａ−５９抗ｈ−ｐｒｕｎｅポリクローナル抗体を使用して実施され、検出は、抗Ｈｉｓタグ（ｐｒｕｎｅ／ｎｍ３２）ポリクローナル抗体を伴うＷ．Ｂ．により実施された。
【図１１Ｂ】タンパク質配列及びタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す図であり、リン酸化陽性セリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅｓ）は太字で示されている。
【図１１Ｃ】ＳＤＳ Ｐａｇｅゲル精製及びトリプシン処理の後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分子量プロファイル分析に送られる、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｎｍ２３Ｈ２構造及び抗体を認識する抗ＨＡを使用するＣＯＳ７発現ｎｍ２３−Ｈ２を示す図であり、ペプチド及びその分子量の同定は、１つ又は２つのリン酸化反応に対応する質量増大がある、Ｖｏｙａｇｅｒ質量分析計を使用して実施された。（８０ダルトン、１６０ダルトン）。
【図１２】図１２Ａは、リン酸化ペプチドに対し数回アフィニティ精製された、ウサギで得られる、ｎｍ２３Ｈ１リン酸化領域に対応するペプチドを認識するＫ７３ポリクローナル抗体を示す図であり、レーン１及びレーン２は、バキュロウイルス生成ｎｍ２３Ｈ１及びＨ２組換えタンパク質が、カゼインキナーゼδによりｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化されたときに、ＩｇＧ濃縮特異Ｋ７３抗体を認識するリン酸化セリンにより認識されることを示している。これらのデータは、Ｋ７３特異抗体によるセリン１２０〜１２５領域内の特異リン酸化反応の存在を示している。図１２Ｃは、ＭＤＡ Ｈ１１７７が、実施例４で説明されているように、様々な時点において、ＩＣ２６１ ５０ｍＭｏｌでインキュベートされ、全抽出物３０ｍｇが、リン酸化ペプチドに対し精製されたＫ７３ポリクローナル抗体と共にｎｍ３２のリン酸化反応について分析されたことを示す図である。レーン６（０ｈで与えられた）は、レーン１で使用され、３７℃でＩＣＰ １０Ｕにより１時間処理された、抽出物３０ｍｇを示している。図１２Ｄは、ＭＤＡ Ｃ１００が、６時間かけて、ＩＣ２６１により２つの異なる濃度で処理され、ｈ−ｐｒｕｎｅは、Ａ５９ポリクローナル抗体で免疫沈降され、ｎｍ２３−Ｈ１との相互作用は、ｍｏＡｂ抗ｎｍ２３Ｈ１ ｍｏＡｂ（ＮＯＶＯＣＡＳＴＲＡ）を介して検出されたことを示す図である。レーン１及び５は、組換えｈ−ｐｒｕｎｅ ＷＢ陽性対照２０ｎｇ及びＭＤＡＨ１１７７細胞抽出物２０ｎｇをそれぞれ示している。
【図１３】図１３Ａは、ジピリダモール、ＩＣ２６１又はジピリダモール及びＩＣ２６１による処置の後の細胞運動性値（５つの独立複製アッセイについては算術平均±ＳＤ）を示す図である。図１３Ｂ（左下）は、ＩＣ２６１が存在していると、複合体が細胞内のＰＤＥ−ｃＡＭＰ増大に関わることを示すＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４細胞内の直鎖化ｃＡＭＰの内容（ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の全内容）を変えることを示す図である。実際、図１３Ｂ（右下）は、ＩＣ２６１が存在しているときにｉｎ ｖｉｔｒｏの組換えｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、その生物活性を修正しないことを示しており、比活性度値は未処理タンパク質に類似している。これらのデータから、ＩＣ２６１は、ｈ−ｐｒｕｎｅ−ｎｍ２３複合体を阻害し、後者は、ＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４で明らかなように、ホスホジエステラーゼ活性のｉｎ ｖｉｖｏ増大に関与することがわかる。
【図１４】ｐｒｕｎｅ特異モノクローナル抗体（４Ｇ３／４）を使用するＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによるｈ−ｐｒｕｎｅ検出を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する腫瘍の転移を予防及び治療するためのｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用、前記阻害剤のスクリーニング方法、及び転移の検出のための診断キットに関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、乳房膿瘍、肉腫、メラノーマ、神経芽細胞腫の転移を予防及び治療するためのｈ−ＰＲＵＮＥの酵素阻害剤の使用、及び前記阻害剤のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、前記腫瘍の転移の診断キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＰＲＵＮＥ（ｈ−ＰＲＵＮＥ）タンパク質は、ＤＨＨスーパーファミリーに属し、これは、細菌の核ＲｅｃＪ並びに酵母及び細菌のピロホスファターゼなどのいくつかのホスホエステラーゼを含む（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）。
【０００４】
ＤＨＨスーパーファミリーは、それぞれのグループ内に、但し様々なグループにまたがらずに、非常によく保存されている−Ｃ末端モチーフに基づき２つの主要なグループに分けることができる。このスーパーファミリーのすべてのメンバーは、イオン結合に関わり、ホスホエステル化に触媒作用を及ぼすことが予測される高く保存されている荷電アミノ酸残基を含む４つの他のモチーフを有する。これらの主要な特性は、第３のモチーフ、つまりＤＨＨ（Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）であり、このスーパーファミリーはそれにちなんで名付けられている。
【０００５】
ＲｅｃＪタンパク質は、ＤＮＡ修復タンパク質であり、他のヌクレアーゼ及びきちんと特徴付けされていない細菌タンパク質と共に、第１のグループに属しているが、ＰＲＵＮＥ及びポリホスファターゼは第２のグループに属している。
【０００６】
ショウジョウバエの遺伝子ＰＲＵＮＥは、元々、野生型のハエの真っ赤な目とは対照的に、ドロソプテリンの減少による目の茶色がかった紫色を示す突然変異表現型に基づいて特徴付けられたものである（Ｔｉｍｍｏｎｓ他、１９９６年）。同型接合型ＰＲＵＮＥ突然変異体は生存可能であり、繁殖可能であるが、羽根を生じさせる成虫原基の正しい形成に干渉する少なくとも１つの単一突然変異コピーの存在下で擬似黒色腫瘍を発症することにより致命的である（ａｗｄ／Ｋ−ｐｎ、ＰＲＵＮＥのキラーともいう）。
【０００７】
ヒトは、ａｗｄ遺伝子（ｎｍ２３）の最大８個までのオーソログをコードし、そのうち少なくとも４つは、ヌクレオシド三リン酸からヌクレオシド二リン酸へのリン酸基転移に触媒作用を及ぼす活性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫＰ）についてコードする（Ｌｏｍｂａｒｄｉ他、２０００年）。
【０００８】
いくつかの腫瘍及び高増殖性細胞は、ｎｍ２３−Ｈ１ ｍＲＮＡ及びそのタンパク質を過剰発現し、ほとんどの場合、この過剰発現は、癌の初期段階に連関している。乳癌は、その生物学的異質性及び治療に対する反応性が広範であることのため、臨床管理が難しい複雑な疾患である（Ｋｅｅｎ他、２００３年）。腫瘍形成の根底にある分子レベルのメカニズムに関する知識が向上したことで、病変発症の様々な段階における様々な癌予後と相関関係を有するますます増えるバイオマーカーの同定が可能になり、その結果、最も好適な治療上の処置を選べるようになった（Ｋｅｅｎ他、Ｄｏｍｃｈｅｋ他、２００２年）。
【０００９】
原発性乳癌の場合に現在使用されている十分に確立された予後因子には、リンパ節転移、書式学的所見、癌の大きさ、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の状態、増殖指数、核又は組織学的グレードがある（Ｋｕｒｕ他、２００３年、Ｍｏｒａｂｉｔｏ他、２００３年）。腫瘍病変発症におけるその後の段階の予後のためのマーカーとして使用されるその後の変換、侵襲性、及び転移プロセスに関わる新しい分子を用意すると有益であろう。
【００１０】
乳癌及びメラノーマでは、ヒトｎｍ２３−Ｈ１の高い発現は、転移能の減少に関連する（Ｆｌｏｒｅｎｅｓ他、１９９２年）。乳癌の特異ケースについては、転移の広がりは、実質的にすべての癌死亡に関与している。
【００１１】
侵襲性腫瘍細胞になるには、その接着性を変え、原発腫瘍内の他の細胞との接触を緩め、腫瘍細胞が侵襲する組織の宿主細胞の細胞外マトリックスとの新しい接触を確立する必要がある。この文脈において、腫瘍細胞の周囲のプロテアーゼ活性の調節は、重要な役割を果たす。原発腫瘍から移行し、循環系から出て、二次器官のコロニー形成を行うために、腫瘍細胞は、運動性機能を取得する必要もある。
【００１２】
今日まで、複数の転移抑制遺伝子が分離され、特徴付けられている（Ｓｔｅｅｇ他、２００３年）。このグループ内では、ｎｍ２３は、腫瘍乳腺細胞内で過剰発現したときに細胞運動性の減少を引き起こし（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）、足場非依存性コロニー形成に影響を及ぼし、分化を引き起こす（Ｋａｎｔｏｒ他、１９９３年、Ｌｅｏｎｅ他、１９９３年、Ｈｏｗｌｅｔｔ他、１９９４年、Ｈａｒｔ−ｓｏｕｇｈ他、１９９８年、Ｌｏｍｂａｒｄｉ他、２０００年）ことが知られている。さらに、悪性乳癌細胞系クローンＭＤＡ−Ｃ１００におけるｎｍ２３−Ｈ１の過剰発現は、その転移性表現型をｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で減らすことが実証されている（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２０００年、Ｍａｏ他、２００１年、Ｔｓｅｎｇ他、２００１年）。
【００１３】
本発明者は、以前の研究で、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１との間の相互作用、及びｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ突然変異によるこの相互作用の阻害を実証した（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）。さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥの複数のコピーの増幅の結果、細胞増殖が引き起こされ、高レベルのｈ−ＰＲＵＮＥ発現は、中又は低ｎｍ２３−Ｈ１レベルに比べて、肉腫及び乳癌腫瘍の悪性度増大と相関関係があることが開示されている（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年）。
【００１４】
したがって、腫瘍及びその転移の治療及び予防に都合よく使用されるｈ−ＰＲＵＮＥの酵素活性を阻害するのに好適な化合物を提供することが必要であることは、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現により特徴付けられることは明らかである。
【００１５】
そこで、本発明の著者は、特に乳癌の転移に特に相関する、治療酵素作用阻害の影響を受けやすい、ｈ−ＰＲＵＮＥの新しい酵素活性を確認した。実際、著者は、ｈ−ＰＲＵＮＥが、基質としてのｃＡＭＰに対する親和性がｃＧＭＰよりも優先するサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有し、これは何らかのホスホジエステラーゼ阻害剤により効果的に抑制されることを発見した。
【００１６】
さらに、本発明の著者により実施された研究を通して、ｈ−ＰＲＵＮＥ酵素は、複数の組織内の転移性腫瘍のｎｍ−２３発現の同時減少を伴って過剰発現することになることが突き止められた。さらに、乳房腫瘍モデルにおけるｎｍ２３Ｈ１との物理的タンパク質間相互作用による、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ ｈ−ＰＲＵＮＥの活性増大と細胞運動性との間の直接的相関関係も見つかった。この発見は、細胞増殖及び腫瘍転移プロセスの抑制におけるｎｍ２３−Ｈ１の防御機能の修正をもたらすｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１との間の相互作用の重要性を示している。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、乳癌の臨床的発症の予後に対する潜在的独立マーカーとしてのｈ−ＰＲＵＮＥの考えられる役割は、乳癌患者グループ内でのｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質及びｎｍ２３−Ｈ１の発現の分布を研究することにより評価された。特に、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現は、様々な分析された臨床例間で均質的に分布し、例えば、腫瘍型、組織学的サイズ、エストロゲン及びプロゲステロン受容体反応性、リンパ節転移などの他の因子から独立して予後マーカーとしてタンパク質を有利に使用する機会が得られる。新しいマーカーの同定は、採用すべき目標治療の選択に関して、転移能を有する腫瘍を同定し、乳癌に悩む患者をより効果的に管理するために使用することができる。
【００１８】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害を評価する好適なスクリーニング法を通じて試験されたいくつかのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のうち、抗凝血性について既に知られている薬剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏと乳房細胞モデルの両方において、ＩＣ５０に関してｈ−ＰＲＵＮＥ活性を阻害する最高の能力を示した。また、スクリーニングにおけるビンポセチン及び３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害に対しＩＣ５０の有望な値を示しており、この選択からのデータは、上述の３つの成分の構造上類似の誘導体及び異性体に対するスクリーニングの取り扱いを示唆している。
【００１９】
最後に、多くの転移性の乳房の腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ分析から、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の高いレベルとｎｍ２３−Ｈ１発現の負の調節との間の直接的相関関係の存在が確認されており、その結果、臨床的追跡研究で報告されているように遠隔転移形成が生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的は、例えば、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、髄芽細胞腫、上皮腫、肝癌（ｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｔ細胞又はＢ細胞リンパ腫、骨髄腫、及びメラノーマなどの、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現によって特徴付けられる腫瘍転移の予防及び治療用の薬剤を製造するために、ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤を使用することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
特に、本発明は、以下の一般式（Ｉ）を有するｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤に関する。
【化１】
式中、Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なり、アミノアルコール、アミノアルキル、コレステロールからなる群から選択することができ、
Ｒ３及びＲ４は、同じ又は異なり、複素環式芳香族又は芳香環からなる群から選択することができる。好ましくは、複素環式芳香族環は、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、モルホリンからなる群から選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、ジエタノールアミンであり、Ｒ３及び／又はＲ４は、ピリミジンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のより好ましい一実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、ジエタノールアミンであり、Ｒ３及びＲ４は、ピリミジンであり、阻害剤は、ジピリダモールである。
【００２３】
本発明は、さらに、ビンポセチン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＩＣ２６１及び誘導体、構造類似物、及びその異性体からなる群から選択することができるｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用に関する。
【００２４】
さらに、本発明の目的は、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）を含むペプチドであるｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用である。特に好ましい一実施形態では、前記ペプチドは、さらに、前述のアミノ酸配列の下流に、浸透性に関わり、配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する他のペプチドを含む。したがって、浸透性があることを特徴とするペプチドは、配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０）を含む。
【００２５】
本発明の他の目的は、ペプチドが、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）を含み、特定の一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲ（配列番号１０）を含むことであり、配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲがあるため浸透性を有することを特徴とする。
【００２６】
本発明の他の目的は、ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物のスクリーニング方法であり、これは以下のステップを含む。
ａ）少なくとも１つのホスホエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害化合物又は誘導体、構造類似物、又はその異性体を選択するステップ、
ｂ）０．０５μＭから１０μＭの範囲の濃度の前記少なくとも１つの化合物を、１つのｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現細胞系に投与するステップ、
ｃ）ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析を行い、及び／又は細胞運動性対前記少なくとも１つの化合物及び化学誘引物質の濃度の分析を行い、及び前記ホスホジエステラーゼ活性を０．０１から１ｐｍｏｌ／ｍｉｎ−１／ｕｇ−１の間の値に阻害し、及び／又は前記運動を２００から１２００細胞の間の値まで阻害することができる化合物を選択するステップ。
【００２７】
前記活性の阻害剤として試験した化合物によるｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害は、前記の化合物に対するＩＣ５０の評価により確定することができる。
【００２８】
ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する細胞系は、ＭＤＡ−Ｃ１００ ４３５ ｐｒｕｎｅ ＃４（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）である。
【００２９】
ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析は、ｃ−ＡＭＰ及び／又はｃ−ＧＭＰ基質の加水分解試験により実施できる。前記基質は、０．００８μＭから１μＭの範囲の濃度で使用される。
【００３０】
本発明の他の目的は、少なくとも同定された１つの化合物、又はその誘導体、構造類似物、又は異性体を、１つ又は複数の補助剤及び／又は薬理学的に許容される賦形剤と共に、混合する追加のステップｄ）を含む、上述のような方法を含む薬剤組成物を製造する方法である。
【００３１】
さらに、本発明は、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移の予防及び治療用の薬剤を製造するための、前記腫瘍は乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、及びメラノーマである、上で定義されたような方法に従って選択されたｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物の使用に関する。
【００３２】
本発明の他の目的は、免疫学的アッセイ、ＦＩＳＨ分析、リアルタイムＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によりｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法である。特に、前記方法は、以下のステップを含むことができる。
ａ）例えば、組織切片又は生体液などの前記生物試料を、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識付けできる少なくとも１つのモノクローナル若しくはポリクローナル抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体と接触させるステップ、
ｂ）抗原抗体複合体を検出するステップ、
ｃ）抗原抗体複合体の定量分析を行うステップ。
【００３３】
抗原抗体複合体の検出及び定量分析は、免疫組織化学分析、免疫沈降分析、免疫蛍光検査分析、ＥＬＩＳＡ分析、免疫ブロット分析により実施することができる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲによりｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法に関して、特異的プライマーは、５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列である。
【００３５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法を使用して過剰発現により特徴付けられる腫瘍の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法に関して、標識プローブは、オリゴヌクレオチド配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含むことができる。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲの前記標識プローブは、線形又は円形プローブとすることができ（ＴａｑＭａｎ、ハイブリッド形成プローブ、分子ビーコン）、標識付けは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素により実施できる。少なくとも１つの蛍光色素（放射若しくは励起型）、好ましくは６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）による標識付けは、プローブオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施できる。
【００３７】
本発明の他の目的は、例えば、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識付けできる、少なくとも１つのモノクローナル又はポリクローナル抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体を含む、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現により特徴付けられる腫瘍（例えば、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、前立腺癌、直腸結腸癌など）の転移を診断するため生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出するための診断キットである。
【００３８】
診断キットは、それとは別に、配列５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列を含むことができるｈ−ＰＲＵＮＥの特異的プライマーをいくつか含むことができる。
【００３９】
最後に、診断キットは、オリゴヌクレオチド配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含むことができるリアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成用の少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドプローブを備えることができる。
【００４０】
リアルタイムＰＣＲ用の前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、線形及び／又は円形プローブであり、標識付けは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素、好ましくは６Ｆ ＡＭ（６カルボキシフルオレセイン）を使用することができ、プローブのオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施することができる。
【００４１】
本発明の他の目的は、ＩｇＭ免疫グロブリンクラスに属し、４Ｇ３／４クローン（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）により産生されることを特徴とする、ｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質を認識し、選択的に結合することができるモノクローナルマウス抗体である。このクローンは、ＮＨ２末端でマルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ５構造）を含む融合構造内のｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質全体によるマウスへの免疫付与を通じて得られた。タンパク質は、マルトースアフィニティカラムクロマトグラフィーを通じて精製され、その後、１つのブースターが精製タンパク質１００μｇを含む５つのブースターと共に、２匹のマウスに注射された。
【００４２】
さらに、本発明は、アミノ酸配列ＮＨ２−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（配列番号４）又はその一部を含むウサギ免疫に使用されるペプチドを認識し、選択的に結合することを特徴とする、ｈ−ＰＲＵＮＥ（Ａ５９）ウサギポリクローナル抗体に関する。
【００４３】
本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、又はその相補配列のうちの少なくとも１つを含むリアルタイムＰＣＲによるｈ−ＰＲＵＮＥ増幅用の特異的プライマーを提供することである。
【００４４】
最後に、本発明は、配列ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）又はその相補配列又はＴをＵで置き換えた配列を含む、リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成用のｈ−ＰＲＵＮＥ特異オリゴヌクレオチドプローブに関する。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲ用の前記オリゴヌクレオチドプローブは、線形及び／又は円形プローブであり、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素、好ましくは６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識付けすることができ、前記標識付けは、プローブのオリゴヌクレオチド配列の３’及び／又は５’末端で実施することができる。
【００４６】
本発明は、好ましいいくつかの実施形態により、付属の図面の図を特に参照しつつ、例示により、但し制限することなく、説明される。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造及び機能分析
材料と方法
タンパク質配列分析
アメリカ国立バイオテクノロジーセンター（ＮＩＨ、ベテスダ）のタンパク質配列の非冗長データベースは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用して繰り返し検索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７年）。タンパク質配列の多重整列は、Ｔ＿ｃｏｆｆｅｅプログラム（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ他、１９９３年）を使用して構築され、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムの結果に基づいて補正された。
【００４８】
Ｐｈｉｌｉｐ Ｆｉｔｃｈプログラム及びＭｏｌｐｈｙパッケージＰｒｏｔＭＬプログラムを使用して系統樹が構築された。
【００４９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＤＢ−ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して、タンパク質構造のホモロジーモデリングを実施し、タンパク質バックボーンの衝突が最小になるようにテンプレートとの整列を手作業で調整した。エネルギーの最小化は、シップル様の力場を使用するＧＲＯＭＯＳプログラムを使用して実施された。
【００５０】
ＭＯＬＳＣＲＩＰＴプログラムを使用して、リボン構造タンパク質の図を作成した。
【００５１】
細胞培養
ＨＥＫ−２９３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、３７℃、ＣＯ２ ５％でウシ胎児血清１０％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補ったＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地で培養した。
【００５２】
バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）におけるタンパク質発現及び精製
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク質発現を実施した。要するに、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、及びｎｍ２３−Ｈ１（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）及びｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、Ｄ２８Ａ、Ｄ１０６Ａ、Ｄ１７９Ａ、Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ、Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ−Ｄ１２６Ａ、Ｄ２８Ａ−Δ、４ＤΔ（Ｄ２８Ａ−Ｄ１０６Ａ−Δ−Ｄ１７９Ａ）をコードするｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌ消化ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｈｔａベクターにサブクローニングした。
【００５３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体ｃＤＮＡを生成するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ構造の特定部位の突然変異誘発を取扱説明書に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施した（実施例２を参照）。
【００５４】
ウイルス感染及び精製条件については、Ｇａｒｚｉａ及びｃｏＩｌ（２００３年）で説明されている。
【００５５】
その後、ヒスチジンタグ付きｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０緩衝液を使用してＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で精製した。カラム溶離は、０から０．８ＭのＮａＣｌの直線勾配で２０分にわたり、流量１ｍｌ／分で実施した。画分をさらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液に対して透析し、活性について試験した。
【００５６】
分離されたタンパク質の純度を、ＳＤＳ Ｐａｇｅ電気泳動分析により測定した。
【００５７】
ｈ−ＰＲＵＮＥホスホジエステラーゼ活性の同定及び特徴付け
ＰＤＥ活性は、Ｆｉｓｈｅｒ他、１９９８年により説明されているｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ検出アッセイにより、シンチレーションアッセイ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により測定した。
【００５８】
基質として所望の濃度のｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを含む１００μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、８．３ｍＭ ＭｇＣＩ２、１．７ｍＭ ＥＧＴＡ）を使用し、３０℃で試料を希釈、インキュベートした（非標識対３Ｈ標識の比＝３：１）。
【００５９】
培地のみを含むブランクを含み、すべての反応を３通り実施し、基質回転率２５％未満（経験により決定）となるインキュベート時間の間進行させた。
【００６０】
５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えて反応を終結させた。
【００６１】
メーカープロトコルに従って検出された放射性標識産物の量について酵素活性を計算した。陰性対照として、モチーフＩｌｌ領域（Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）に対するＡ５９ポリクローナル抗体と共にプレインキュベートした、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体を使用した。
【００６２】
特に、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体のＰＤＥ活性については、精製酵素２００ｎｇを、１０分間、３０℃でインキュベートした。
【００６３】
Ｋｍ及びＶｍａｘ値によるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットは、５〜４０分にわたり基質濃度範囲（０．０５〜１０．０μＭ）及び一定量の希釈酵素での加水分解を測定することにより決定された。初期速度を、基質濃度毎に計算し、後者に対してプロットし、それにより、速度パラメータを決定した。
【００６４】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する異なる緩衝液及びｎｍ２３活性の影響を調べ、阻害研究を実施するために、実施例２の「材料と方法」の節で報告されているように、ＰＤＥアッセイを改変した。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びヒトＰＤＥ５Ａを過剰発現する安定なＭＤＡクローンを、実施例２の「材料と方法」の節で説明されているように生成し、分析した。
【００６６】
ｉｎ ｖｉｖｏの転移プロセスの阻害を示すｎｍ２３−Ｈ１過剰発現細胞系（ＭＤＡ−Ｈ１−１７７）と共に、既に説明されているように（Ｌｅｏ他、１９９３年）、対照の乳癌細胞系ＭＤＡ−Ｃ１００を細胞運動性アッセイで使用した。
【００６７】
細胞運動性は、化学誘引物質として作用させる最終濃度としてそれぞれ０．２５％、０．５％ ＦＣＳ、２．５、及び５．０ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）使用し、６ウェルのトランスウェル技術（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）を用いて決定した（詳細については、実施例２の「材料と方法」の節を参照）。
【００６８】
統計分析
ＰＤＥ活性及び細胞運動性活性を含むすべてのアッセイは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／〜ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍに用意されているＴ検定を使用して妥当性を確認した。
【００６９】
ＦＩＳＨ及びＨＩＣ分析、腫瘍の臨床例のコレクション、ＴＮＭ選択は、実施例２の「材料と方法」の節で報告されている。
【００７０】
結果
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造及び機能分析
ＩＴＥＲＡＴＩＶＥタンパク質データベース検索（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質について実施し、これにより、統計的に有意な期待値で、ＰＲＵＮＥの真核生物オーソログ、続いて、様々な細菌からの無機ピロホスファターゼ、及びＲｅｃＪヌクレアーゼを含む様々な生物からのＤＨＨタンパク質を回収することができる（図１、パネルＣ）。
【００７１】
ＢＬＡＳＴＣＬＵＳＴプログラム及び系統発生分析を使用し、最尤法を使用するＤＨＨタンパク質のクラスタリングから、ＰＲＵＮＥタンパク質（ヒト及びショウジョウバエ）が、無機ピロホスファターゼと共に、第２のＤＨＨファミリーに属していることがわかる（図１、パネルＡ）。
【００７２】
ＤＨＨタンパク質の２つのファミリーは、ＤＨＨスーパーファミリーに典型的な４つの保存モチーフを含む共通のＮ末端ドメインを共有するが、これらは、Ｃ末端ドメインにより互いに区別される。共有されるＮ末端ドメインは、平行なベータシートを伴うアルファ／ベータ折り畳みを有し、ＤＸＤ（モチーフ−Ｉ）、Ｄ（モチーフ−ＩＩ）、ＤＨＨ（モチーフ−ＩＩＩ）、及びＤ／Ｅ（モチーフ−ＩＶ）の形態の絶対保存要素を含む（図１、パネルＡ及びＢ）。
【００７３】
これらの残基はすべて、このドメインの同じ面にあり、これらが一緒になって、少なくとも２つの二価陽イオンをキレートする触媒部位を形成する。ＰＲＵＮＥタンパク質は、形態ＤＨＲをこのファミリーの他のすべてのメンバーで観察される正準ＤＨＨ（モチーフ−ＩＩＩ）の置換として含む（図１、パネルＡ）。
【００７４】
両方のＤＨＨファミリーにおいて、Ｃ末端ドメインは、５つのストランドからなるコアシートを含み、そのうちの４つは２つのβストランドヘアピンを形成する。しかし、ＤＨＨタンパク質の第１のファミリーと第２のファミリーとの間のＣ末端ドメインの違いは、２つのスーパーファミリーの基質特異性の著しい一因となる可能性がある。さらに、ＤＨＨモジュール、哺乳類ＰＲＵＮＥのＣ末端ドメインは、非球状伸展を含み、その中に、リン酸化反応の調整を行う役割を果たしうるいくつかの保存セリンがある。
【００７５】
ｈ−ＰＲＵＮＥの構造分析から、ＲｅｃＪ（Ｙａｍａ−ｇａｔａ他、２００２年）及びピロホスファターゼ（Ａｈｎ他、２００１年）との類似性がわかり、そのため、後者に対する潜在的類似活性が示唆される。
【００７６】
しかし、ａｗｄ／Ｋ−ｐｎ様ＮＤＰＫの強い相乗作用は、ＰＲＵＮＥタンパク質がヌクレオチドなどの代替基質を有する可能性があることを示唆した。
【００７７】
ＤＨＨファミリーに関する進化論的研究から、ホスホエステラーゼは、様々なホスホエステラーゼ及び加水分解酵素ドメインを含む多数のタンパク質折り畳みから誘導されることがわかっている。これらは、古典的なシグナリングＰＤＥが認識されるＨＤ折り畳み（ＰＤＥ１−１１）（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）、ＰｄｓＡ様ＰＤＥが誘導される金属βラクタマーゼ折り畳み（Ｇａｌｐｅｒｉｎ他、１９９９年、Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９９年）、及びＩｃｃ様ＰＤＥが誘導されるカルシニューリン様ホスホエステラーゼ折り畳み（Ａｒａｖｉｎｄ他、１９９８年）を含む。
【００７８】
ＤＨＨ触媒ドメインは、これらの他のファミリーとは際立って異なる折り畳みを有し、ＰＤＥのまったく新しいクラス全体を潜在的に定義する可能性のある複数の類似金属キレーティング残基（アスパラギン酸及びヒスチジン）を含む。この仮説を検証するために、潜在的ＰＤＥ活性についてｈ−ＰＲＵＮＥが発現され、精製され、分析された。
【００７９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の同定及び特徴付け
ｈ−ＰＲＵＮＥがサイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）のホスホエステル結合を加水分解する能力を調べるために、ｈ−ＰＲＵＮＥのクローンを作成し、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系を使用して発現した。Ｈｉｓ−ｔａｇ付きｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ、モチーフＩＩＩ領域内に生成された突然変異（ＤＨＲＰ１２６−１２９ＡＡＡＡ）を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【００８０】
ＰＤＥアッセイを使用して、精製ｈ−ＰＲＵＮＥ触媒活性を特徴付けし、特異基質を決定した。
【００８１】
図２、パネルＡに示されているように、ｈ−ＰＲＵＮＥは、著しいＰＤＥ活性を有し、これは、ｃＧＭＰ基質よりもｃＡＭＰについて高いが、ｈ−ＰＲＵＮＥΔは、この活性が４０％減少することを示している。陽性対照としてＰＤＥ２を使用し、陰性対照は、両方とも、Ａ５９特異ポリクローナル抗体及びｈ−ＰＲＵＮＥΔと共にプレインキュベートされたｈ−ＰＲＵＮＥであった。
【００８２】
ＰＤＥ検出活性を確認するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔをヒトＨＥＫ−２９３細胞内で一時的に過剰発現し、次いで、免疫沈降し、ＰＤＥアッセイを免疫沈降タンパク質について実施した。
【００８３】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥ精製タンパク質は、昆虫由来であろうとヒト細胞由来であろうと、ＰＤＥ活性を示すことがわかる。
【００８４】
触媒部位に潜在的に関わるアミノ酸を同定するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼす単一及び複数の部位で突然変異分析を実施した。ＤＨＨ特徴モチーフ（図１、パネルＢ）のすべてのアスパラギン酸残基を単独と組合せの両方で突然変異させた（図２、パネルＢ）。突然変異体は、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系を使用して発現され、均質になるように精製された（精製収量８０％）。
【００８５】
ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性についてタンパク質を検査したところ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（Ｄ２８Ａ、Ｄ１０６Ａ、Δ、Ｄ１７９Ａ）突然変異体活性の８０％減少が観察された。つまり、Ｄ２８、Ｄ１２６、Ｈ１２７、Ｒ１２８、Ｐ１２９、及びＤ１７９アミノ酸は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性について本質的であることがわかり、したがって、それらが触媒部位の一部である可能性は最も高いことを示している。その代わりに、モチーフＩＩのＤ１０６Ａ突然変異は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼさなかった。
【００８６】
Ｋｍ値を定義するために、高い精製収量（９０％）のイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑカラム）を使用した別の精製ステップによりＨｉｓ−ｔａｇ付きｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質を均質になるように精製した。Ｋｍ及びＶｍａｘ値は、基質濃度範囲（０．０５〜１０．０μＭ）内で固定量の精製酵素によるヌクレオチド加水分解を測定し、反応の線形的部分のデータ点を考察することにより決定された。ｃＡＭＰとｃＧＭＰは両方とも、ｈ−ＰＲＵＮＥの基質であり、Ｋｍ値０．９±０．０３μＭ及び２．３±０．１１μＭをそれぞれ示す（図２、パネルＣ及びＤ）。
【００８７】
基質回転率の最大値（Ｖｍａｘ）は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対しそれぞれ１２．８±０．５ｐｍｏｌ×分−１×μｇ−１、及び１６．１±０．８ｐｍｏｌ×分−１×μｇ−１の精製酵素であることがわかった。
【００８８】
そのため、ＤＨＨスーパーファミリーのタンパク質に対するサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の証拠が指摘された。ｈ−ＰＲＵＮＥ活性に対する緩衝液の影響を調べるために、同じ塩の存在下でＴｒｉｓ ＨＣｌ及びＨＥＰＥＳ緩衝液を試験したところ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液の存在下でより高いＰＤＥ活性が観察された（図２、パネルＥ）。
【００８９】
ＤＨＨタンパク質のイオン依存性を考察する際に、ＰＤＥ ｃＡＭＰアッセイにおけるｈ−ＰＲＵＮＥのＭｇ２＋及びＭｎ２＋イオン依存性を評価した。Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液中のｈ−ＰＲＵＮＥの活性が高いことが判明したが、オキソ還元反応を避けるＨＥＰＳＥ緩衝液の存在下でＰＤＥアッセイを実施し、高い濃度の２つの異なる二価イオンを使用した。
【００９０】
イオンを含まない緩衝液でいくらかのＰＤＥ活性が測定されたが、Ｍｇ２＋はｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を刺激し（図２、パネルＥ）、対照的に、ＭｎＣｌ２の存在下では、この活性は阻害される。さらに、野生型タンパク質と同様、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体はＭｇ２＋イオンでは活性化されず（図２、パネルＦ）、したがって、ホスホジエステラーゼ活性には、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体で修正されるモチーフＩＩＩが必要であることが示される。結論として、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性がＭｇ２＋イオン濃度の陽性の影響を受けることが示された。
【００９１】
安定な乳房ＭＤＡ ｈ−ＰＲＵＮＥクローン及び細胞運動性との相関関係
ｎｍ２３−Ｈ１抗運動性及び転移抑制活性を調整するｈ−ＰＲＵＮＥ機能を調べるために、乳癌ＭＤＡ−Ｃ１００及びＨ１−１７７細胞モデルを採用した（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２０００年、Ｍａｏ他、２００１年、Ｔｓｅｎｇ他、２００１年）。
【００９２】
ＭＤＡ４３５−Ｃ１００細胞（高転移性乳癌細胞、ＡＴＣＣ）に、ＬＴＲ含有プラスミド構造（哺乳類の細胞内にエコトロピックレトロウイルスを発生させるために使用されるｐＢａｂｅ構造）内でｈ−ＰＲＵＮＥ遺伝子ｃＤＮＡのトランスフェクションを行い、トランスフェクションの後、異なるピューロマイシン耐性クローンが得られ（培養２０日目にクローンを分離する）、プラスミド抗生物質耐性が生じ、ＬＴＲプロモーターの下でそのｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡ過剰発現について選択された。
【００９３】
ＭＤＡ−Ｃ１００細胞内のｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡ（クローン＃３及び＃４、これは最後に１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ ｃＤＮＡ（クローン＃１０及び＃１１）、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ ｃＤＮＡ（クローン＃１９及び＃２０）、及びＰＤＥ５Ａ ｃＤＮＡ（クローン＃１４及び＃１６）を過剰発現するいくつかの安定なクローンが生成された。ｎｍ２３−Ｈ１を過剰発現するＭＤＡ−ＨＩ−１７７（クローン＃７及び＃８）、ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓを過剰発現するＭＤＡ（クローン＃４及び＃５）、及びｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇを過剰発現するＭＤＡ（クローン＃２及び＃３）におけるｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＤＮＡを安定化させた。
【００９４】
これらのクローンのいくつかは、ＴａｑＭａｎ技術によるリアルタイムＰＣＲ分析を使用してｈ−ＰＲＵＮＥ ｍＲＮＡの発現レベルを決定するように特徴付けられた（図３、パネルＡ）。定量分析及びコピー数外挿により、ｍＲＮＡ発現のそのレベルについて４つのクローンを選択し、標的基準遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と比較した（図３、パネルＢ）。
【００９５】
さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を実施して、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３、及びＰＤＥ５Ａタンパク質の発現レベルを同定した（図３、パネルＣ）。
【００９６】
次に、トランスウェル細胞培養チャンバを使用して生成された安定なクローンの細胞運動性について分析した（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）。６個の独立クローン（ＭＤＡ−Ｃ−１００、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローン＃３及び＃４、１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン＃７及び＃８、ＭＤＡ−１ｌ−１７７）を分析した。ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンは、対照細胞系ＭＤＡ−Ｃ１００と比較したときに運動性が２倍に増大する（図３、パネルＤ）。
【００９７】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローンについて観察された値は、ｎｍ２３−Ｈ１だけを過剰発現する細胞系ＭＤＡ−ＨＩ−１７７と比較して２．２倍増大する（図３、パネルＤ）。クローンＭＤＡ−Ｈ１−１７７観察値は、既に報告されているようにＭＤＡ−Ｃ１００細胞系に比べて少なくとも４０％だけ減少し（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年）、そこで、細胞運動性の阻害についてｎｍ２３−Ｈ１の役割が確認される。
【００９８】
細胞運動性へのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の寄与を調べるために、ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託されたクローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）、及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９及び＃２０）に関する運動アッセイを実施した。これらの突然変異体が選択されたのは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に影響を及ぼす異なる能力があるためである。
【００９９】
両方ともＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ安定なクローンと比べて、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔクローン内の細胞運動性の４０％及びほぼ完全（９０％）の減少がそれぞれ観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性が乳癌細胞系内の細胞運動性に単独で関与するかどうかを確認するために、ＭＤＡ−Ｃ１００（ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａクローン＃１４及び＃１６）のきちんと特徴付けられたＰＤＥ（ＰＤＥ５Ａ）を過剰発現するクローンを試験した。両方のＰＤＥ５Ａ過剰発現クローンにおいて細胞運動性の増大は観察されず（図３、パネルＥ）、したがってｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性のみがこの従来の細胞モデルにおいて細胞運動性を引き起こすことができることを示している。
【０１００】
さらに、報告されたのは（Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年、Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ他、２００１年、Ｆｒｅｉｊｅ他、１９９７年）、ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ（ｈ−ＰＲＵＮＥと相互作用しない突然変異体）（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）及びｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ（ｈ−ＰＲＵＮＥを結合する能力を保持している突然変異体）タンパク質が、細胞運動性を引き起こすことができるということであった。
【０１０１】
ｈ−ＰＲＵＮＥがある場合及びない場合について突然変異体を過剰発現する細胞運動性活性におけるｈ−ＰＲＵＮＥの役割を調べ、これと細胞運動性との相関関係を求めた。ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥクローンは、ＭＤＡ−Ｃ１００対照細胞系と比較してほぼ６０％の運動の増大を示しているが、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥクローンは、ＭＤＡ−Ｃ１００細胞と比較したときに２００％の運動増大を示している（図３、パネルＦ）。
【０１０２】
結論として、ＭＤＡ−Ｃ１００内のｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現は細胞運動性を高め、ｈ−ＰＲＵＮＥは、ｎｍ３２−Ｈ１の抗運動性を戻すことができ、それにより、細胞運動性を促進する。この効果は、ｈ−ＰＲＵＮＥがｈ−ＰＲＵＮＥ相互作用障害ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ突然変異体の存在下で過剰発現されたときには観察されず、そのため、細胞運動性の増大に関してｎｍ２３−Ｈ１−ｈ−ＰＲＵＮＥ複合体の役割が推定される。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１が物理的に相互作用することを（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）考察し、ｎｍ２３ｓがｈ−ＰＲＵＮＥのＰＤＥ活性、及びｎｍ２３−ｈ−ＰＲＵＮＥ相互作用の生化学的な意義に影響を及ぼしうるかどうかを調べた。これは、ｎｍ２３−Ｈ１をｈ−ＰＲＵＮＥ精製タンパク質と共にプレインキュベートし、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することにより行った。
【０１０４】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、ｎｍ２３−Ｈ１の存在下で対照に対し最大２倍までの増大を示した。さらに、この増大した活性が物理的相互作用によるものであることを確認するために、別のｎｍ２３突然変異体を試験した。非相互作用突然変異体ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ（図４、パネルＡ）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を高めることができず、対照的に、それほどではないにせよ、相互作用突然変異体ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性をほとんど野生型ｎｍ２３−Ｈ１として高めた。これは、既に報告されているように、ｈ−ＰＲＵＮＥとの結合アフィニティが低いため可能である（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）。
【０１０５】
他の対照実験として、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の存在下でｈ−ＰＲＵＮＥΔ ＰＤＥ活性を試験したが、それは、これら２つのタンパク質が共免疫沈降アッセイ時に相互作用しないからである。ｈ−ＰＲＵＮＥΔ ＰＤＥ測定活性には増大は見られない（図４、パネルＡ）。
【０１０６】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１の直接的物理的相互作用とｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の増大との間に相関関係のあることが実証される。さらに、免疫沈降タンパク質に関する特異ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性について運動アッセイで使用されるそれぞれの安定なクローンを分析した（図４、パネルＢ）。
【０１０７】
これらの分析の結果として、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンでは、ＭＤＡ−Ｃ１００と比べて、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の増大は８倍である。その代わりに、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥＡクローンでは、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥと比較してｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の減少は０．５倍であり、これは、細胞運動性と相関関係を有する（図４、パネルＢ）。
【０１０８】
さらに、ＭＤＡ−ｈ−ＰＲＵＮＥクローンのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、安定二重ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥのと比べて、１．４倍の増大であることがわかった（図４、パネルＢ）。
【０１０９】
これらの結果から、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性と細胞運動性との間に直接的な相関関係のあることがわかる。さらに、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥクローンでは、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の減少はＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥと比べて３倍であり、したがって、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性、細胞運動性、及びタンパク質間相互作用の間に直接的相関関係のあることが示される。結論として、細胞運動性に著しい影響を及ぼす、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ機能とタンパク質間相互作用の間の直接的相関関係が指摘された。
【０１１０】
ｈ−ＰＲＵＮＥのＰＤＥ阻害剤研究及び細胞運動性への影響
細胞内のｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ ＰＤＥ活性の生理学的役割を同定するために、選択的ＰＤＥ阻害剤のパネルを試験し、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質活性に影響及ぼすものがあるかどうかを確認した。
【０１１１】
ｈ−ＰＲＵＮＥがｃＡＭＰを加水分解する能力は、ジピリダモール（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、及びＰＤＥ１１に対し作用することが既に知られている）により選択的に阻害された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性のジピリダモール阻害について測定されたＩＣ５０は、０．７８±０．０５μＭであり、この値は、他の選択的ＰＤＥ阻害値（ＰＤＥ５、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０）に比べて低い（高い特異性）。ＰＤＥ６及びＰＤＥ１１では、ＩＣ５０値は、ｈ−ＰＲＵＮＥよりも低い（図５、パネルＡ）。
【０１１２】
ｈ−ＰＲＵＮＥは、さらに、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）（ＩＣ５０ ４０．２±０．８μＭ）、非選択的特異的ＰＤＥ阻害剤、及びビンポセチン（ＩＣ５０ ２２．３±１．１μＭ）、ＰＤＥ１Ｃ特異阻害剤に対し中程度に敏感である。
【０１１３】
この研究で使用されたいくつかの他の阻害剤は、他のＰＤＥに対するＩＣ５０値の場合よりも１００倍高い濃度で適用された場合でも、ｃ−ＡＭＰ ｈ−ＰＲＵＮＥ加水分解活性には影響を及ぼさなかった。阻害研究の結果は、図５、パネルＡにまとめられている。
【０１１４】
上に示されているデータは、さらに、生理学的阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するためにＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞系で検証された。
【０１１５】
これは、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現ＭＤＡクローン、及び、上述のようにｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の部分的減少（４０％）のため（図２、パネルＡ及びＢ）追加の対照としてＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔクローンを使用し、ジピリダモールが活性を阻害し、細胞運動性に関連付けることができる程度を確認するように選択された。
【０１１６】
ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ及びＰＲＵＮＥΔクローンの両方を、ジピリダモール（８μＭ、ＩＣ５０の場合よりも１０倍高い濃度）と共に２４時間の間インキュベートし、完全な酵素不活性を得て、上述のように運動アッセイを繰り返した。
【０１１７】
ジピリダモールによる処理の後、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔクローンは、それぞれ、４０％及び２０％の平均運動減少を示したが、これから、阻害剤は、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対し作用し、そのため、細胞運動性の実質的減少を引き起こすことがわかる（図５、パネルＢ）。
【０１１８】
転移患者における乳癌研究
ｈ−ＰＲＵＮＥの発癌の役割をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、転移が報告された５９症例を無作為に選択した（解剖学的な疾患の程度を説明するＴＮＭ分類によるＴｘＮｘＭＩ（Ｈｅｊｎａ他、１９９９年））。
【０１１９】
診断時又は追跡調査中に転移を示した原発腫瘍組織症例を含む組織多重アレイ（ＴＭＡ）について分析を実施した（少なくとも５年分の追跡調査、診断日：１９９２〜９７）。
【０１２０】
ＦＩＳＨ分析では、ｈ−ＰＲＵＮＥ（２７９−Ｈ１９）をプローブとして含むＰＡＣを使用して、三染色体又はそれ以上のコピー数を有する５９例中２２例（３７％）の腫瘍症例を明らかにし、ｈ−ＰＲＵＮＥゲノム領域の増幅を示した。ｎｍ２３−Ｈ１をプローブとして含むＰＡＣを使用して全部で５５件の分析症例において、１つの二染色体のみが観察され、増幅は観察されなかった（図６、パネルＡ）。
【０１２１】
さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１をそれぞれ認識する２つの抗体（Ａ５９、Ｋ７３）を使用して、ＴＭＡに関する免疫組織化学分析を実施した。正常であるだけでなく、転移性癌組織のないことについてのＦＩＳＨ及び免疫組織化学分析が報告された。
【０１２２】
免疫組織病理学グレーディングにより、２２例のすべて（３７％）において、ｈ−ＰＲＵＮＥ染色体領域の細胞遺伝的増幅の後、ｎｍ２３−Ｈ１の低又は中発現レベルとは対照的に、高いｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質発現も強調されており、そのため、乳房転移形成の約１／３は、機能を抑制するｎｍ２３−Ｈ１転移の同時減少レベルを有するｈ−ＰＲＵＮＥ増幅及び過剰発現の両方によるものと考えられることを示唆している。
【０１２３】
さらに、７例（１２％）は、ｈ−ＰＲＵＮＥ増幅を示さず、高いｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質レベルを有するが、ｎｍ−２３Ｈ１レベルは低い（図６、パネルＤ）。これは、遺伝子増幅とは無関係のｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の代替メカニズムの存在を示唆している。
【０１２４】
これらのデータは、乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の転移促進役割を示す。
【０１２５】
（実施例２）
乳房ＭＤＡの安定なクローンの遺伝子発現プロファイル
材料と方法
突然変異体作成
以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ｈ−ＰＲＵＮＥ突然変異体を生成した。
【化２】
【０１２６】
突然変異ヌクレオチドは、太字で示され、変更されたコドンは、下線が引かれている。すべての突然変異は、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認された。
【０１２７】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥホスホジエステラーゼ活性の特徴付け
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する緩衝液の影響を調べるために、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、又はＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）を使用し、ＭｇＣｌ２の濃度を上昇させて（０、１、２、４、８、１６、及び３２ｍＭ）、ＰＤＥアッセイを改変した。
【０１２８】
イオン存在の効果を調べるために、ＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）（オキソ還元反応を避けるため）中で、ＭｇＣｌ２又はＭｎＣＩ２塩の濃度を高くしつつ（１、２、４、８、１６、３２、及び６４ｍＭ）、ＰＤＥアッセイを実施した。陰性対照として、ｈ−ＰＲＵＮＥΔを、ｈ−ＰＲＵＮＥと同じ条件で使用した。イオンが存在しない場合のｈ−ＰＲＵＮＥ活性は、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、ＥＧＴＡ １．７ｍＭ、又は５０ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、ＥＧＴＡ １．７ｍＭに対しタンパク質の長い透析の後に試験された。
【０１２９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対するｎｍ２３（ＮＤＰＫ）活性の影響は、精製ｈ−ＰＲＵＮＥを様々なｎｍ２３（７０％精製収量、−Ｈ１、−ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、又は−Ｈ１−Ｐ９６Ｓ）と共にプレインキュベートしてアッセイを実施することにより調べた。
【０１３０】
ｈ−ＰＲＵＮＥΔに対するｎｍ２３−Ｈ１の可能な効果は、精製された突然変異体タンパク質をｎｍ２３−Ｈ１と共にプレインキュベートし、ＰＤＥアッセイを実施することにより試験した。
【０１３１】
阻害剤研究に関して、８つの異なる潜在的阻害剤、つまり、シロスタマイド、ジピリダモール、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ミルリノン、ロリプラム、ビンポセチン、スリンダク、及びザプリナスト（シグマ）を試験した。
【０１３２】
低濃度のｃＡＭＰ（０．０１μＭ）を使用して、ＩＣ５０をＫｉに近似した。すべての阻害研究は、３通りに実施し、３回繰り返した。
【０１３３】
安定なクローン分析
ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、及びｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ ｃＤＮＡを、Ｎ末端のＨｉｓ−ｔａｇで修正されたＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌ消化ｐＢＡＢＥベクターにサブクローニングした。ヒトＰＤＥ５Ａ ｃＤＮＡは、同じＨｉｓ−ｔａｇ付きベクターにクローニングするために、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限末端を加えることによりＰＣＲ増幅された。
【０１３４】
ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、及びＭＤＡｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓクローンは、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ発現ベクターによりトランスフェクションが行われた。ＭＤＡ−Ｃ１００クローンは、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＤＥ５Ａ発現ベクターによりトランスフェクションが行われた。
【０１３５】
取扱説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、トランスフェクションを実施した。ウシ胎児血清１０％、ペニシリン１００単位／ｍＩ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びピューロマイシン２μｇ／ｍｌ（シグマ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でトランスフェクションを選択した。
【０１３６】
大量のトランスフェクションを行った細胞系を作成するために、１００個のピューロマイシン耐性コロニーを含むプレートをトリプシン処理し、そうして細胞系を設定した。
【０１３７】
いくつかのピューロマイシン耐性ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｐＢＡＢＥ−ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ、及びｐＢＡＢＥ−ＰＤＥ５Ａクローンを、ＭＤＡクローンについて分離し、リアルタイムＰＣＲ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析の両方によりトランスフェクションを行い、特徴付けを行った。
【０１３８】
リアルタイムＰＣＲ分析では、個々の細胞クローン（ＭＤＡ−Ｃ１００、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−Ｈ１Ｓ１２０Ｇ、ＭＤＡ−Ｈ１Ｐ９６Ｓ細胞系、複数のｈ−ＰＲＵＮＥ−及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ安定なクローン）を７５ｃｍ２のフラスコ内で濃度７−９×１０６細胞で播種した。
【０１３９】
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｍＲＮＡを抽出して精製し、その後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００計測器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴａｑＭａｎ定量リアルタイムＰＣＲ検出システムにより分析した。遺伝子プライマー対を合成し（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＮＭＥ１−Ｐ／Ｎ ４３３１１８２；ＧＡＰＤＨ）、Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｓｉｇｎを使用して、ｈ−ＰＲＵＮＥとｈ−ＰＲＵＮＥΔ遺伝子の両方について６ＦＡＭプローブ配列（６−カルボキシフルオレセイン）を構築した。
【化３】
【０１４０】
複数のクローンを選択し、基準標的と比べて、定量分析及びコピー数外挿によりｍＲＮＡ発現レベルについて分析した。
【０１４１】
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析では、緩衝液中の１５μｇのタンパク質溶解物をポリアクリルアミドゲル１０％（ｗ／ｖ）又は１２．５％（ｗ／ｖ）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ、ミリポア）上にエレクトロブロットした。ｈ−ＰＲＵＮＥのｈ−ＰＲＵＮＥ特異ポリクローナル（Ａ５９、モチーフＩＩＩ領域に対し発生）、ｎｍ２３−Ｈ１のｎｍ２３−Ｈ１（クローンＮＭ３０１、Ｈ１アイソフォームに特異的、サンタクルス）、及びＰＤＥ５Ａ抗体のＨｉｓ−ｔａｇ（ＱＩＡＧＥＮ）に対するＰｅｎｔａ−Ｈｉｓで溶解物をそれぞれ免疫検出した。
【０１４２】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧでインキュベートした後、視覚化が増強された化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により実施された。１１個の細胞系、つまり、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃７及び＃８）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃２及び＃３）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃４及び＃５）、及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１１）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９）、ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａ（クローン＃１４）を選択し、タンパク質をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ上で正規化した。
【０１４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
トランスウェル技術を使用した（６ウェル−Ｃｏｍｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）。下側ウェルでは、ＢＳＡ ０．１％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（運動培地）５ｍＭ、及び希釈化学誘引物を含むＤＭＥＭ ２．５ｍｌをインキュベートし、上側ウェルでは、ＣＯ２ ５％を使用し、３７℃で、細胞を３時間インキュベートした。引き付け手順の後、細胞を固定し、メーカープロトコル（Ｃｏｍｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）に従ってＧｉｌｌ ｎ°１ヘマトキシリン液で着色し、最終的に顕微鏡を使って細胞をカウントした。
【０１４４】
ＦＩＳＨ分析
ニックトランスレーション法によりｄＵＴＰ−Ｃｙ３（赤色）で標識されたＰＡＣ ２７９−Ｈ１９（ＰＲＵＮＥ−染色体１ｑ２１．３）及び厚さ４ｍｍのホルマリン固定パラフィン包埋組織片でニックトランスレーション法によりｄＵＴＰ−ＦｌｕｏｒＸ（緑色）で標識された対照ｐＵＣ１７７（ｐＵＣ１７７はＤｒ．Ｍ．Ｒｏｃｃｈｉが提供した）。
【０１４５】
細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）により対比染色した。それぞれの症例について２つの異なる実験を実施した。ＣＯＨＵ Ｖｉｄｅｏ ａｎｄ Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えるＯｌｙｍｐｕｓコンピュータ化落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取り込んだ。損なわれていない、保存状態のよい、重なりのない核上のハイブリッド形成シグナルは、少なくとも２人の独立の研究者により評価された。
【０１４６】
ＩＨＣ分析
ＭＤＡ腫瘍は、特異Ａ５９ ｈ−ＰＲＵＮＥポリクローナル及びｎｍ２３−Ｈ１抗体でそれぞれ免疫検出された（クローンＫ７３、Ｈ１及びＨ２アイソフォームに対し特異的、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）。
【０１４７】
免疫組織化学染色の強度を使用し、腫瘍試料を、顕微鏡の下で分析された細胞の少なくとも２０％に存在する場合に陽性として分類した（ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質発現に対し強い＋＋＋、中＋＋、広く弱い染色＋又は負０（存在しない、又は集中して弱い染色））。
【０１４８】
腫瘍症例のコレクション及びＴＮＭ選択
最低５年分の追跡調査結果を有する患者を含む腫瘍症例が、ＳａｓｓａｒｉのＡＵＳＬ１によって収集された。ＴＮＭシステム分類は、Ｓｏｂｉｎによって説明されているようにこの研究に応用され（Ｈｅｊｎａ他、１９９９年）、疾患の解剖学的程度を説明するために使用され、また３つの成分、原発腫瘍の程度に対応するＴ（Ｔ０からＴ４）、所属リンパ節転移の有無及び程度に対応するＮ（Ｎ０からＮ４）、及び遠隔転移の有無を表すＭ（Ｍ０又はＭ１）の評価に基づく。５９件の腫瘍乳房症例のコレクションは、ＴｘＮｘＭ１陽性として分類された。
【０１４９】
乳房細胞クローンでの遺伝子発現
以下の手順によりプローブ作製を実施した。
【０１５０】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンからＴＲＩＺＯＬ（登録商標）法によりＲＮＡを抽出した。以下の変更と共にＡｍｅｒｓｈａｍ ＣｙＳｃｒｉｂｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用して１５から２０μｇの範囲の全ＲＮＡテンプレートに標識した。
【０１５１】
逆転写時間を３時間に延ばした。その後、３７℃で、３０分の間、Ｒｎａｓｅ−Ｈによりプローブを消化した。
【０１５２】
残留ＲＮＡを除去するため、反応混合物をＮａＯＨ ０．２５Ｍで２０分間インキュベートし、その後、ＭＯＰＳ ２．８Ｍで中和した。組み込まれているＣｙ染料の量を、Ｃｙ５とＣｙ３の両方について計算した。標識されたＣｙ３及びＣｙ５標的は、等量分結合され、スライド上にハイブリッド形成された。
【０１５３】
組み込まれているＣｙ染料の５０ｐモル未満を含むプローブは、ハイブリッド形成に使用されなかった。
【０１５４】
標準ハイブリッド形成プロトコルをこのスライドに適用した。独立の２組の実験を実施した。
【０１５５】
走査及び画像解析
それぞれ、Ｍｅｄｗａｙ Ｆａｒ ２０００−Ｉ及びＭｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社のＡｒｒａｙ Ｐｒｏソフトウェアにより、走査及び画像解析を実施した。スキャナ感度は、９００から１０００の範囲に保持され、飽和及び低強度の両方を補正した。１６ビット形式の画像を処理した。
【０１５６】
データマイニング
２つの実験条件の間の遺伝子発現の観察された相違点の統計的有意性を確定するために、それぞれの実験を３通り実施した。
【０１５７】
データ有意性及びばらつきを説明するために、いくつかの反復実験に対しＴ検定を実施した。Ｗｅｂページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｇｂ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｓｅｒｖｅｒｓ／ｃｙｂｅｒｔで入手できるＣｙｂｅｒ−Ｔツールを使用して、この検定を適用した。ｐ＝０．０５でのカットオフ値を使用した。この分析の結果として、異なるデータセットにおいてほぼ５％の疑陽性が期待される。この検定に合格したデータセットのみを使用した（Ｔ検定の後のデータ選択）。
【０１５８】
結果
ｎｍ２３−Ｈ１を単独で、及び／又はｈ−ＰＲＵＮＥと組み合わせて過剰発現する安定なクローンの遺伝子発現プロファイルを検証するために、１９，０００遺伝子セットを含む出来合のアレイを使用して遺伝子アレイ研究を実施した。このアレイは、ガラススライド上にスポットされたヒトＵｎｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡデータセットを含む（カナダ、オンタリオ州、Ａｒｒａｙ ｆａｃｉｌｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．ｃａ／）。
【０１５９】
ＭＤＡ−Ｈ１−１７７及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）クローンからのＲＮＡを使用して、ハイブリッド形成を実施した。それぞれの乳癌クローンについて独立の２組の実験を実施し、Ｔ検定値（ｐ＝０．０５）を外挿した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｅｍ．ｉｔ／ｚｏｌｌｏ／ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ／ａｒｒａｙ．ｈｔｍｌ）。
【０１６０】
転移プロセスに関わる複数の遺伝子の発現レベルは、表１に示されているように、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンと比べて、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）において区別される形で調整されることがわかった。表１は、安定細胞乳房クローンについて実施されたアレイ実験をまとめたものであり、左から右への列、ＩＤ番号、Ｕｎｉｇｅｎｅ基準番号、及びヒト染色体上の位置を含む遺伝子同定、独立の２つの実験が２通りに実施された後のＭＤＡ−Ｈ１−１７７／ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン＃８のアレイデータ間の関係、標準偏差及びｐ値を含むＴ検定値、遺伝子の書誌学的参照、対応する転移のプロセスとして報告されている。
【０１６１】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【０１６２】
腫瘍形成及び転移プロセスに関与し、遺伝子発現分析において著しく変更される、複数の遺伝子を選択し、代替方法によるその発現レベルを確認した。
【０１６３】
リアルタイムＰＣＲ実験を１１個の遺伝子について実施した（遺伝子プライマー対は、ジーンバンクＩＤ配列から選択された）。これらの選択された遺伝子のうち７及び４は、それぞれ、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥクローン（クローン＃８）において上方及び下方制御されることがわかった。発現がチップアレイとＰＣＲリアルタイムの両方により確認された、安定ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現クローンのレベルで区別されるそのような遺伝子発現を表２に報告する。
【０１６４】
上述の細胞モデルでは、細胞骨格再編成（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ型ｉｉ）、プロテアーゼ活性（プロテアソーム２６ｓサブユニット、ｎｅｄｄ４結合タンパク質）、腫瘍形成（Ｉ−プラスチン、ｒａｂ１ｂ、ｂｒａｃａ１関連タンパク質（ｂｒａｐ２））、タンパク質リン酸化反応、及び核輸送（カゼインキナーゼｉｉ １−ｃｋｉｐ１相互作用タンパク質）に関与することが知られている遺伝子の上方制御が見つかった。
【０１６５】
下方制御は、細胞外マトリックス接触又は細胞粘着（プラコフィリン、ＬＩＭ）、細胞骨格再編成（プラキン）、及び腫瘍抑制活性（ＥＸＴ１）に関与する４つの遺伝子で見つかっており、そのような証拠を表２にまとめた。この表は、安定ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現ＭＤＡクローン内の異なる遺伝子発現を報告したもので、左から右へ、ジーンバンクＩＤ同定、遺伝子名、独立の２つの実験を２通りに実施した後のクローン＃８／クローン＃１７７のアレイ発現値間の関係、アレイ発現のＰ値、リアルタイムＰＣＲにより値を設定されたクローン＃８／クローン＃１７７のアレイ発現値間の関係、リアルタイムＰＣＲのＰ値、相関関係のある細胞生物学的プロセスの列が報告されている。
【０１６６】
【表２−１】
【表２−２】
【０１６７】
要約すると、腫瘍形成に結びつくプロセスに関与する遺伝子が、発現レベルでは著しく変更されて、そのため、ｈ−ＰＲＵＮＥがこの乳癌細胞系のより高い発癌能に寄与する決定要因のあることを示していることが発見されたということである。
【０１６８】
結論
ＤＨＨスーパーファミリーに属している２つのタンパク質、つまり、ＲｅｃＪヌクレアーゼ及び無機ピロホスファターゼに基づく構造解析により、ｈ−ＰＲＵＮＥは金属イオン依存性ホスホエステラーゼ活性を有する可能性が示唆される。ホスホエステラーゼのＤＨＨファミリーの構造解析及び進化論的タンパク質畳み込み研究の結果として、哺乳類ｈ−ＰＲＵＮＥはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有することが証明された。
【０１６９】
ｈ−ＰＲＵＮＥは、ヌクレオチド上で機能することが知られている、ＮＤＰＫ活性を有するｎｍ２３−Ｈ１アイソフォームと相互作用するので、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の特徴付けと細胞シグナリングにおける役割に注目が集中した。ＤＨＨファミリーの保存モチーフＩＩＩ内の置換を含むｈ−ＰＲＵＮＥΔ突然変異体は、ＰＤＥ活性の減少を示す（図２、パネルＡ、Ｂ、Ｆ）。
【０１７０】
様々な部位の単一又は複数の突然変異分析から、モチーフＩＩＩのイスチジン（１２７）、アルギニン（１２８）、及びプロリン（１２９）、並びにそれぞれモチーフＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ内に存在するアスパラギン酸Ｄ２８、Ｄ１２６、Ｄ１７９の突然変異のみがｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に実質的な影響を及ぼし、したがって、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ触媒部位への関与の可能性が高いことを示すことがわかった。
【０１７１】
保存モチーフＩＩＩ領域は、タンパク質モデリングにより予測されるとおりＭｇ２＋イオンの結合に関与しており（図１、パネルＢ）、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイでは、ｈ−ＰＲＵＮＥも、非存在（図２、パネルＥ）、又は低金属イオン濃度（図２、パネルＦ）で機能することができることが観察された。
【０１７２】
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３ｓタンパク質レベルは、肉腫及び乳癌腫瘍において不平衡であることが実証され、ｈ−ＰＲＵＮＥはｎｍ２３−Ｈ１抗転移性機能をマイナス方向に調整することができることを示唆している。ｈ−ＰＲＵＮＥ発現の増大は、これらの腫瘍及び癌の進行の悪性度に直接相関する（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年）。複数の報告書において、ｎｍ２３−Ｈ１の抗転移活性は、ＮＤＰＫ活性と無関係である（Ｓｔｅｅｇ他、１９９３年、Ｗａｇｎｅｒ １９９７年）と主張しているため、本発明者らは、原発腫瘍部位から遠くへ移動するために癌細胞が獲得する第１の細胞機能の１つを表す、細胞運動性に対するｈ−ＰＲＵＮＥの影響を調査した。
【０１７３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性がこれらの現象に直接関与することを確認するため、ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、及びｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔを、乳癌モデルにおいて過剰発現させたところ、野生型タンパク質の過剰発現は、細胞運動性を誘発するが、そのＰＤＥ機能（ｈ−ＰＲＵＮＥΔ、ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ）の減少は細胞運動性の減少に対応していることが観察された。
【０１７４】
逆に、突然変異体ｈ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔの８０％ ＰＤＥ活性減少及びＭＤＡクローン内のその過剰発現は、細胞運動性の著しい増大を引き起こさないことが観察され、したがって、他の潜在的ｈ−ＰＲＵＮＥ活性が運動増大に関与することは除外される。
【０１７５】
他の細胞内の特徴付けされたＰＤＥは細胞移動に関連していなかったとしても、ＭＤＡの安定なクローン内のＰＤＥ活性の増大が細胞運動性に寄与する可能性があるかどうかが調査された。この目的のために、ＰＤＥ５Ａは、同じ細胞モデル内で過剰発現され、細胞運動性に対する影響について試験された。ジピリダモール（ＩＣ５０ ０．９μＭ）に対する感度について選択されたＰＤＥ５Ａは、ＭＤＡ乳房細胞運動性に影響を及ぼさず、そこで、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ機能のみが乳癌細胞の細胞運動性の増大に関与することが示される。
【０１７６】
さらに、高いｎｍ２３−Ｈ１発現背景におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現は、運動表現型の減少を示し、ｈ−ＰＲＵＮＥだけを過剰発現する細胞と比べてｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を下げることが観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性は、ｎｍ２３−Ｈ１との相互作用の後ｉｎ ｖｉｔｒｏで増大されるが（図４、パネルＡ）、この効果はｉｎ ｖｉｖｏでは観察されなかった。これらの減少は、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥクローンと比較してもＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ内に大量のｎｍ２３−Ｈ１が存在するということにより説明できる（図３、パネルＢ）。
【０１７７】
これは、ＰＲＵＮＥ−ｎｍ２３Ｈ１複合体形成にマイナスの影響を及ぼす可能性があり、これは異なるオリゴマー及び／又は翻訳後修飾ｎｍ２３−Ｈ１フォーム（例：セリンリン酸化反応）の存在に依存する可能性がある（Ｓｔｅｅｇ他、２００３年）。
【０１７８】
ｎｍ２３抗転移性機能に対するｈ−ＰＲＵＮＥのマイナスの調整は、タンパク質間相互作用の結果としてのＰＤＥ活性の増大によるものであるとの仮説を検証するために、ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対する２つのｎｍ２３−Ｈ１突然変異体の効果を調べた。これらのタンパク質突然変異体は、ｈ−ＰＲＵＮＥと物理的に相互作用できるｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ、及びｈ−ＰＲＵＮＥと相互作用しないｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇであり（Ｒｅｙｍｏｎｄ他、１９９９年）、両方の突然変異体は、乳癌細胞内でトランスフェクションが行われ（ＭＤＡ−４３５）、それらはｎｍ２３−Ｈ１野生型タンパク質の内生抗運動効果を抑制することができる（Ｆｒｉｊｅ他、１９９７年、Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ他、１９９６年）。
【０１７９】
さらに、ｎｍ２３−Ｈ１−Ｓ１２０Ｇなどの高ｎｍ２３発現系内でｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する乳癌細胞は、ｎｍ２３−Ｈ１−Ｐ９６Ｓ系内の過剰発現ｈ−ＰＲＵＮＥ細胞と比較して細胞運動性が低いことが示された。
【０１８０】
したがって、これら２つのタンパク質間の物理的相互作用は、運動促進に関与しうることが実証された。さらに、ｈ−ＰＲＵＮＥ−ｎｍ２３−Ｈ１−Ｓ１２０Ｇクローンは、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１−Ｐ９６Ｓの両方を過剰発現するクローン内で観察されるＰＤＥ値と比較してＰＤＥ活性がほぼ６６％低く（図４、パネルＢ）、そのため、タンパク質間相互作用、ｈ−ＰＲＵＮＥ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性、及び細胞運動性効果の間に相関関係があることを決定的に示している。
【０１８１】
知られているＰＤＥ阻害剤がｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性に対抗して選択的に機能することができたかどうかを理解するために、８つのＰＤＥ阻害剤一組を試験したところ、ジピリダモールがｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を阻害することができ、著しいＩＣ５０値を有することが発見された。
【０１８２】
さらに、ジピリダモールを使用すると、安定なｈ−ＰＲＵＮＥ乳房クローンの運動が著しく低下し、またそれほどではないが、ｈ−ＰＲＵＮＥΔ過剰発現クローンの運動も低下した（図５、パネルＢ）。ジピリダモール及び類似の薬剤などの抗凝血剤は、細胞が毛細血管壁に粘着するのを阻害することを通じて血液凝固伝導路活性に機能干渉を加えるというのが一般的見解である。ここで報告した結果に照らして、ジピリダモールを使用することは、広がっている乳癌転移に対する予防及び治療薬となりうると考えることは論理的である。
【０１８３】
さらに、細胞運動性活性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ観察データは、ＴｘＮｘＭ１患者からの有意な数の乳癌組織を使用してｉｎ ｖｉｖｏで確認された。遠隔転移を示す症例のうち５９件の腫瘍症例では、ｈ−ＰＲＵＮＥは、２２の症例（３７％）でコピー数が増幅され、過剰発現されることがわかったが、ｎｍ２３−Ｈ１は、すべての分析症例において、低いレベルで発現されていることがわかった（図６、パネルＢ、Ｃ、Ｄ）。
【０１８４】
予備データは、ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を有する患者間の全生存率の統計的に有意な減少により推論されるように、乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥのマイナスの予後の役割を示している。提示されたデータは、ｈ−ＰＲＵＮＥが転移に関与する遺伝子を上方制御し、その活性は悪性度の高い腫瘍挙動の危険性をｉｎ ｖｉｖｏで高めることを示しており、したがって、乳癌患者の臨床転帰に対しマイナスの寄与をする。報告された結果は、ｈ−ＰＲＵＮＥ前転移悪性腫瘍機能を阻止するために乳癌の治療の際に使用されるｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性を選択的に阻害することができる薬剤を実現する可能性として、重要な薬理学的帰結を有する。さらに、ＭＤＡ−Ｈ１−１７７クローンと比較した場合に発現が乳房ＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ（クローン＃８）内で変更された腫瘍形成及び転移プロセスに関与する１１個の遺伝子を、アレイ発現により分析し、リアルタイムＰＣＲにより妥当性の検証を行った。提示される結果は、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現に相関するＭＤＡ乳癌細胞系の悪性度及び転移能の追加の証拠となる（実施例２）。
【０１８５】
全体として、これらの結果は、ｎｍ２３−Ｈ１抗転移性機能にマイナスの影響を及ぼす細胞運動性及び転移の促進に対するｈ−ＰＲＵＮＥの役割を明確にしている。癌の進行におけるｈ−ＰＲＵＮＥの役割を研究するために使用されるモデルでは、一般に、腫瘍細胞の増幅を必要とする。
【０１８６】
この増幅は、細胞質区画のｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の増大をもたらし、ｎｍ２３の転移機能の抑制剤にマイナスの影響を及ぼす。ｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の活性化は、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質との物理的相互作用によるものであり、複合体形成の結果、遊離ｎｍ２３−Ｈ１形態レベルの実質的減少が生じ、それにより、細胞増殖、細胞運動性、及び転移プロセスに影響が及ぶ（図７）。
【０１８７】
（実施例３）
浸潤性乳癌の診断におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の役割の研究
材料と方法
患者
この研究では、組織学的検査により乳癌と診断された患者を含めた。スイスのバーゼル大学病院の２つのアーカイブから、それぞれ地方倫理委員会とサッサリ大学の病理学協会の承認を得て症例を取り出した。第１のアーカイブは、１，５３１件の浸潤性腺管癌、３１０件の浸潤性小葉癌、６９件の粘液性癌腫、６５件の管状腺癌、４８件の髄様癌、及び８６件の他の種類の浸潤癌を含んでいた。そこで、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料を、バーゼル大学病院の病理学協会、バーゼルの臨床病理学協会、及びチューリッヒのＴｒｉｅｍｌｉ病院から入手した。第２のアーカイブは、３０７件の浸潤性腺管癌、６９件の浸潤性小葉癌、１２件の粘液性癌腫、２４件の他の種類の浸潤癌を含んでいた。
【０１８８】
診断、治療、再発、無病生存率、及び最終対照の時間の疾患段階を含む、それぞれの患者の臨床病理学的特徴はすべて、バーゼル及びサッサリの登録所から取得した。
【０１８９】
病理病期、腫瘍直径、及びリンパ節の状況は、一次病理学報告書から得られた。臨床データは、２，２９９例について１０年間の追跡調査の後に入手でき（中央値、５６カ月、範囲、２〜１２０カ月）、１５年間の追跡調査の後の臨床データは、２２２人の患者について入手できた（中央値、１３８カ月、範囲、１２１〜１７６カ月）。この研究のための標本及びデータは、バーゼル大学病院とサッサリ大学の両方の倫理委員会によって承認された。
【０１９０】
組織多重アレイ（ＴＭＡ）
ＴＭＡ構成については、既に説明されている（Ｓｉｍｏｎ他、２００１年、Ｓｉｍｏｎ他、２００２年）。要約すると、半自動ロボット高精度計測器を使用して、組織ドナーの代表的な腫瘍領域から直径０．６ｍｍの組織円筒をパンチし、それぞれ３４２から５２２の個別試料を含む６つの異なるパラフィンブロック内に配置するということである。その結果得られるＴＭＡブロックの４つのマイクロメートル切片をコーティングされたセクションシステムに移動する（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ハッケンサック）。多重アレイ化試料上の腫瘍組織の存在は、ヘマトキシリンエオシン染色により検証された。組織マイクロアレイは、それぞれの患者の乳癌の異なる領域からの少なくとも２つの切片と共に対照として正常組織を含んでいた。
【０１９１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
抗ｈ−ＰＲＵＮＥ特異モノクローナル（クローン４Ｇ３／４、１から３５１のアミノ酸の組換え融合タンパク質に対して、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）及び抗ｎｍ２３−Ｈ１（クローンＫ７３、−Ｈ１アイソフォーム特異、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＨ）抗体を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織片を免疫染色した。取付説明書に従い、また知られているプロトコルに従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、免疫組織化学分析を実施した（Ｆｏｒｕｓ他、２００１年、Ｄ’ａｎｇｅｌｏ他、２００３年）。
【０１９２】
健康な乳房細胞の代表的な対照組織病理学切片を染色することにより最適化されたＩＨＣプロトコルを確立した。正常な乳房組織では、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質は、均質的に発現されるが、ｈ−ＰＲＵＮＥの発現は、存在しないか、又は低強度であった。
【０１９３】
多重アレイ上に２通りに無作為に配置された５４個の正常試料を使用することにより染色を半定量的に評価し、免疫組織化学染色の強度及び分配を使用し、ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３発現の両方について腫瘍試料を陽性（強［＋＋＋］から中［＋＋］の染色、腫瘍細胞の大半により均一に分配又は与えられる）又は陰性（非存在又は弱染色［＋］）として分類した。
【０１９４】
ＦＩＳＨ分析
知られているプロトコルに従ってパラフィン包埋ＴＭＡ切片を処理した（Ｓｉｍｏｎ他、２００２年：Ｍｕｒｅｓｕ他、２００２年）。
【０１９５】
染色体１ｑ２１．３上に局在するｈ−ＰＲＵＮＥ遺伝子領域にまたがるＰＡＣ ２７９−Ｈ１９クローン、及び染色体１７ｑ２１．３上に局在するｎｍ２３−Ｈ１遺伝子に特異的な、ＤＮＡ／ＢＡＣクローンを、ｄＵＴＰ−ＣＹ３（赤色）を使用するニックトランスレーション法で標識し、プローブとして使用した。ｐＵＣＩ７７は染色体１ｑ１２上のペリセントロメア領域に対応し、ｐＺ１７−１４は染色体１７のセントロメア領域に対応し、クローンは、ｄＣＴＰ−ＦｌｕｏｒＸ（緑色）を使用するニックトランスレーション法により標識され、対照として使用された。
【０１９６】
細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）により対比染色された。それぞれの症例について２つの異なる実験を実施した。
【０１９７】
ＤＡＰＩ、Ｃｙ３（オレンジ）又はＦｌｕｏｒＸ（Ｖｙｓｉｓ）の励起用の適切なフィルタ、及びＣＯＨＵ Ｖｉｄｅｏ ａｎｄ Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−６１落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取り込んだ。少なくとも１００個の損なわれていない、保存状態のよい、重なりのない核上のハイブリッド形成シグナルは、少なくとも２人の研究者により評価された。
【０１９８】
統計的分析
この研究には、変数及びカテゴリとして、病理学的原発腫瘍サイズ（ｐＴ）、病理学的リンパ腺状況（ｐＮ）、転移の存在（Ｍ）、エストロゲン及びプロゲステロン受容体（それぞれＥＲ及びＰＲ）の状況、診断時の年齢、組織学的腫瘍種類、及び全生存（外科手術時を開始時点として計算する）を含めた。特に、リンパ腺及び受容体の状況は、多数の症例の中では利用できなかったが、それは、これらの変数は研究対象に患者を含めるうえで必要なかったからである。
【０１９９】
生存データ解析を統計パッケージＥｇｒｅｔ（バージョン２．０．３）で実施した。生の死亡及び腫瘍特異的死亡発生率を検閲データとして使用して、Ｃｏｘ回帰モデルを実施した。
【０２００】
全生存の時間は、月で表し、独立変数（ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、ｐＴ、ｐＮ）は、３つの年齢グループ２３〜４４（Ｎ＝２５２）、４５〜６４（Ｎ＝１，１４６）、及び６５〜９８（Ｎ＝１１２３）として階層化した。
【０２０１】
ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１免疫組織化学データを細分してＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ推定を実施した。
【０２０２】
Ｐｅａｒｓｏｎのχ二乗検定を使用し、病理的パラメータ（組織学的腫瘍種類、ｐＴ、ｐＮ、Ｍ、ＥＲ、ＰＲ）との関連でｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現評価を実施した。試料比率分析の正確な係数を計算し、有意なパラメータ（０．０５レベル未満）すべてを決定した。分析はすべて、統計パッケージＳＰＳＳ／７．５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を使用して実施した。
【０２０３】
結果
組織学的に証明されている乳癌診断及び利用可能な追跡調査データのある２，１０９人の患者の保管されている組織からのＴＭＡ切片について、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現レベルと共に、ｈ−ＰＲＵＮＥ染色体コピー数の評価を実施した。４１２人の乳癌患者からの追加のＴＭＡ切片（つまり、そのＴＮＭ分類が利用できた）をｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色について評価した。患者の大半は、腺管癌を組織学的変異体として有し（１，８８３人、７３％）、年齢は診断時に６０歳を超えていた（１，４２５人、５７％）。５９カ月の中央値期間（範囲２〜１７６）をカバーするそれぞれの患者の臨床的追跡調査結果のデータが利用可能であり、患者の大半は、まだ生存しており（１，７１６人、６８％）、ごく少数の患者のみがこの研究時点において追跡調査で失われた（１２人、０．５％）。２つの特異抗体（それぞれ４Ｇ３／４及びＫ７３モノクローナルＡｂクローン）を使用して免疫組織化学分析により、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の発現を評価した。図９（パネルＡ及びＢ）は、一連の多重組織アレイ内のｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の染色の代表的実施例を示している。
【０２０４】
ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の強陽性細胞質染色（ｈ−ＰＲＵＮＥ＋と呼ばれる）は、２，４６３個の試験腫瘍の大半（１，３４０人、５４％）において観察され（５８人の患者については評価しなかった）、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の陽性細胞質免疫染色は、２，０６１個の試験腫瘍のうち６１５（３０％）個において観察された。ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現について評価された２，０６１個の腫瘍組織では、陽性免疫染色の逆分布が観察された［１，１８０（５７％）の乳癌はｈ−ＰＲＵＮＥ＋であったが、６１５（３０％）個はｎｍ２３−Ｈ１＋であった］。表３には、浸潤性乳癌に存在するｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質についての免疫組織化学分析（ＩＨＣ）の結果が報告されている。ｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１発現との間に統計的相関関係は観察されなかった。
【０２０５】
【表３】
【０２０６】
異なる病理組織学的パラメータに基づき、患者のサブグループ（２１０９人の乳癌患者）内のｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１タンパク質発現の分布を評価した。ｈ−ＰＲＵＮＥ又はｎｍ２３−Ｈ１発現と腫瘍の種類（腺管と小葉）、ｐＴ、ｐＮ、ＥＲ、及びＰＲ反応性の間に有意な相関関係は観察されなかった（表４）。
【０２０７】
【表４−１】
【表４−２】
【０２０８】
乳癌患者の１，０１６件の腫瘍について蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析を実施した。染色体１ｑ２１．３のところでｈ−ＰＲＵＮＥゲノム領域に対応するＰＡＣクローン（２７９−Ｈ１９）及び１ｑ１２染色体のところでペリセントロメア領域に対応する対照クローンをプローブとして使用した。分析された核内の２０％超の１ｑ２１．３のところの複数のＦＩＳＨシグナルは、１７３件（１７％）の症例にあることがわかった（表５、図９Ｃ）。セントロメアに対し少なくとも２つの遺伝子コピーを有する症例及び複数のセントロメアシグナルが存在するため染色体１全体の多染色体性を有する乳癌を考察したところ、染色体１ｑ２１．３のところで非常に低いレベルのｈ−ＰＲＵＮＥ増幅が観察された（１，０１６件のうち６８症例、６．７％）。これは、遺伝子増幅メカニズムが少ない数の乳癌症例で発生することを示している。ｈ−ｐｒｕｎｅゲノム領域でのＤＮＡコピー数の増大は、三染色体性（ｐ＝０．０２７）又は四染色体性（ｐ＝０．０３３）を有する腫瘍における陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色の存在に対する有効統計的相関関係に有意に関連する（表５）。しかし、このような細胞遺伝学的変更の頻度の低いことから、関与する代替病原性経路がｈ−ＰＲＵＮＥ活性化及び乳癌のｈ−ｐｒｕｎｅ体性発現の増大を決定することが示唆される。
【０２０９】
【表５】
【０２１０】
ｈ−ｐｒｕｎｅと臨床病理学的パラメータとの相関関係
乳癌におけるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現の臨床病理学的役割を評価するために、２，１０９件の乳癌症例の系列（病的原発腫瘍情報及び最大１５年分の臨床追跡データのすべてを含む、表４）と４１２件の乳癌症例の系列（完全なＴＮＭ分類及び最大１０年分の臨床追跡データを含む、表６）の両方を使用して、浸潤性原発乳房腫瘍について、免疫組織化学的分析を実施した。
【０２１１】
【表６】
【０２１２】
さらに、２，１０９人の患者の部分集合から取った腫瘍切片も、ｎｍ２３−Ｈ１発現について、免疫組織化学分析により調査した（表７）。
【０２１３】
【表７−１】
【表７−２】
【０２１４】
この後者の部分集合は、遠隔転移の存在についての情報を与えることがなく、リンパ腺の状況に関する情報は、リンパ節転移の存在（Ｎ＋）又は非存在（Ｎ−）に関してそのような乳癌患者について部分的に利用可能であった（陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色は、２１０／４８２［４４％］のＮ＋症例、及び１７９／４９６［３６％］のＮ−症例、Ｐ＝０．１０９で観察され、同じように、ｎｍ２３−Ｈ１＋免疫染色についての統計的相関関係は、これら２つのグループについては見られなかった）。したがって、それぞれのパラメータの予後値は、生存分析に基づいて決定された。
【０２１５】
２００２年１２月に、疾患のため７８２人（３１％）の患者が死亡したが、全体の生存期間の中央値は、５９カ月であり、生存患者の追跡は７２カ月である。Ｐｅａｒｓｏｎのχ二乗検定を使用し、いくつかの病理的パラメータ、つまり組織学的種類、腫瘍格付け（ＥｌｓｔｏｎとＥｌｌｉｓによって標準化されたとおり）、ｐＴ、ＥＲ、ＰＲ、及び（利用可な場合）ｐＮ、及びＭとの関連でｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３−Ｈ１免疫染色を評価した。ｈ−ｐｒｕｎｅ又はｎｍ２３−Ｈ１発現と腫瘍の種類（腺管と小葉）、組織学的グレード、ｐＴ、ＥＲ、及びＰＲ反応性の間に統計的に有意な相関関係は観察されなかった（表４）。代わりに、４１２人の乳癌患者の系列において陽性ｈ−ｐｒｕｎｅ免疫染色は進行性リンパ腺状況（Ｎ２〜Ｎ３グループ、ｐ＝０．０１７）又は遠隔転移の存在（Ｍ１グループ、ｐ＝０．０２９）との有意な相関関係を有していた（表６）。この系列の統計分析により、ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現と原発腫瘍サイズとの間の有意な関連の非存在が確認された（表６）。
【０２１６】
疾患段階及び診断時の年齢に応じて調整されたＣｏｘモデルを使用したが、ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現（ＨＲ ０．６１、９５％ Ｃｌ ０．３１〜１．１８、ｐ＝０．１４４）又はｎｍ２３−Ｈ１（ＲＲ ０．９８、９５％ Ｃｌ ０．９０〜１．０７、ｐ＝０．１５８）の予後値は観察されなかった（表８及び９、図１０）。
【０２１７】
【表８】
【０２１８】
全体として、腫瘍格付け、原発腫瘍サイズ、及び腋窩リンパ腺状況は、乳癌患者のこの系列における予後に密接に相関するパラメータである（表８及び９）。
【０２１９】
したがって、結論として、ｈ−ｐｒｕｎｅマーカーは、進行乳癌状況に関連付けられ、Ｎ１からＮ２状況に移るときのリンパ節状況の新しいマーカーと考えることができる。
【０２２０】
（実施例４）
ＮＭ２３ ＨＩ及びＨ２リン酸化反応、及びｈ−ｐｒｕｎｅ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を引き起こすｈ−ｐｒｕｎｅとの複合体の形成を阻害するＩＣ２６１の使用に関する研究
材料と方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｎｍ２３Ｈ１及びＨ２タンパク質は、カゼインキナーゼ１δによりリン酸化され、リン酸化反応は複合体の形成に介在することを示す研究（図１１）。
【０２２１】
方法−ｉｎ ｖｉｔｒｏ
リン酸化反応ｉｎ ｖｉｔｒｏ、相互作用アッセイ、及びホスホ−ｎｍ２３抗体の生成。１００ｎｇの量の精製された組換えｎｍ２３及びその突然変異体を、Ｇａｒｚｉａ他（２００３年）で説明されているように、１時間の間、３０℃で、ＣＫＩ標準反応緩衝液内でインキュベートした。その後ｎｍ２３リン酸化タンパク質を、５％ＢＳＡを補った共ＩＰ標準緩衝液内でｈ−ｐｒｕｎｅと共にインキュベートした。ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、ｈ−ｐｒｕｎｅのモチーフＩＩＩ上のペプチドに対してポリクローナル抗体Ａ５９で免疫沈降した。リン酸化されているか、又はｈ−ｐｒｕｎｅ結合されてないｎｍ２３の異なる突然変異体の存在は、同時にｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３タンパク質を検出する抗Ｈｉｓ ｔａｉｌ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で実施される免疫沈降でのその後のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により検出された。
【０２２２】
Ｋ７３ポリクローナル抗体は、免疫原として、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質からの位置Ｓ１２２でリン酸化されたＮ１１５からＥ１２７のホスホペプチドを使用して得られ、抗血清は、非選択的抗体における結果として得られるタンパク質Ａのカラム上のＩｇＧ精製、及び免疫原として使用されるホスホペプチド（ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＫＳＡＥ）上の他のアフィニティ精製の後に使用された。この第２の手順は、メーカーのプロトコルに従ってＡｆｆｉ−ｇｅｌ ２５樹脂（ｂｉｏｒａｄ）でＤＭＳＯ中に溶解された脱塩リン脂質１ｍｇの架橋結合を通じて実施された。その後、結合樹脂を、リン酸化され、既に精製されたもので免疫されたウサギの血清を使用するアフィニティ精製に使用し、直接Ａｆｆｉｇｅｌ結合ペプチドカラムに塗布された、抗体まで濃縮されたＩｇＧペプチド（Ｋ７３ポリクローナル抗体）をカラムにより吸着した。カラムは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣ １０ｍｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍｌ（ｐＨ８）をそれぞれ使用して、カラムｍｌ毎に洗浄した。０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３）で溶離を実施した。
【０２２３】
方法−ｉｎ ｖｉｖｏ
Ｉｎ ｓｉｔｕタンパク質消化及びＭＡＬＤＩ分析
トリプシン、ジチオトレイトール、及びヨードアセトアミドをＳｉｇｍａから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−ＨＰＬＣ、純度９９％は、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａからのものである。最高純度の他のすべての試薬及び溶媒は、Ｂａｋｅｒから入手した。
【０２２４】
ＳＤＳゲルから切り取り、ｍｉｌｌｉＱ水グラジエントで２回洗浄した、クマシーブルーで染色したタンパク質について分析を行った。摘出した染色物をまずＣＡＮで洗浄し、その後、０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで洗浄した。その後、溶液を除去し、洗浄を２回繰り返した。タンパク質試料を、４５分間、５６℃で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）内のインキュベートにより還元した。説明されているように、ＡＣＮ／ＡＭＢＩＣによる洗浄で還元緩衝液を除去した。暗所で、室温で、３９分間、５５ｍＭのヨードアセトアミドのインキュベートにより遊離システインをアルキル化した。重炭酸アンモニウムとＡＣＮでゲル粒子を洗浄した。１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中のトリプシン（１２．５ｎｇ／μｌ）を使って酵素消化を行った。ゲル断片を４時間の間、４℃でインキュベートした。その後、トリプシン溶液を除去し、緩衝液の新しいアリコートを加えた。試料を、１８時間の間、３７℃でインキュベートした。完全ゲル再水和に十分な最低限の反応体積を使用した。その後、室温で５０％のＡＣＮ中の１０ｍＭの重炭酸アンモニウム及び０．１％のＴＦＡを使用してゲル粒子を洗浄することによりペプチドを抽出した。
【０２２５】
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ計測器及び新しいＶｏｙａｇｅｒ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を記録した。ペプチド及びアルファ−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（ＡＣＮ中１０ｍｇ／ｍｌ／水中０．１％ ＴＦＡ、２：１、ｖ／ｖ）の混合液を金属板に塗布し、室温で乾燥させた。外部標準を使用して、質量較正を実施した。メーカーが用意したソフトウェアを使用して第１のデータを分析し、モノアイソトピック質量として報告した。
【０２２６】
図３に示されている結果は、リン酸化反応がない場合に、その部位のｎｍ２３Ｈ１及びｎｍ２３Ｈ２タンパク質はｈ−ｐｒｕｎｅとの複合体を形成しないことを示している。
【０２２７】
ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現クローンの細胞運動性研究
ＩＣ２６１による阻害に関する研究
ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ ＃３及びＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ ＃４細胞クローン及びＭＤＡ−４３５Ｃ−１００細胞（対照細胞）を、８μＭのジピリダモール又は５０μＭのＩＣ２６１（カゼインキナーゼＩδ及びε阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、英国ノッティンガム）でそれぞれ２４時間又は８時間かけて処理した。その後、０．５％の胎児血清ＦＣＳ濃度を化学誘引物質として使用して、細胞運動性アッセイを「ｂｏｉｄｅｎ ａｎｄ ｃｈａｍｂｅｒ」細胞に適用した。その後、顕微鏡を使って細胞の数を数え、得られたデータに統計分析を適用した（図１３Ａ）。
【０２２８】
顕微鏡を使って細胞を数えたところ、細胞運動性値は、すべて２通りに実施した５回の独立アッセイで算術平均±ＳＤである（ＭＤＡ−クローンｐｒｕｎｅ＃３及び＃４／ＭＤＡ−クローンｐｒｕｎｅ＃３及び＃４、但しＩＣ２６１ ｐ＜０．００２）。
【０２２９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞運動性アッセイ
安定ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現ＭＤＡクローンはＤ’Ａｎｇｅｌｏ他、２００４年で説明されているようにして得られた。対照ＭＤＡ−Ｃ１００乳癌細胞系を、細胞運動性アッセイで使用した（Ｌｅｏｎｅ他、１９９３ａ、Ｌｅｏｎｅ他、１９９３ｂ）。細胞運動性は、０．５％ ＦＣＳ、最終濃度を化学誘引物質として使用するトランスウェル技術（６ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）を使用して決定された（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ他、２００４年を参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈ−ｐｒｕｎｅ阻害運動アッセイは以下のように実施された。ＭＤＡ−ｐｒｕｎｅ（クローン＃３及び＃４）及びＭＤＡ−Ｃ１００を、ジピリダモール（８μＭ、ＩＣ５０に関して１０倍高い濃度）で２４時間の間インキュベートし、完全な酵素不活性をもたらし、同じ細胞系をＩＣ２６１により５０μＭの濃度で８時間の間インキュベートしたが、この条件では、細胞死のシグナルなしでｎｍ２３リン酸化反応の最高の減少を観察することができ、その後、運動アッセイを上述のように繰り返した。すべての結果は、すべて２通りに実施された５回の独立の実験の平均である。統計分析は、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｉｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍで入手できる低下されたＴ検定法で実施され、Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると考えられる。
【０２３０】
ｈ−ｐｒｕｎｅ過剰発現細胞の、ＩＣ２６１投与を受けるｃＡＭＰ−ＰＤＥの全含量に関する研究
ＭＤＡ−Ｐｒｕｎｅ＃４細胞は、そのようなものとしてあるか、又は５０μＭ ＩＣ２６１で８時間の間処理された。その後、細胞を溶解し、Ａｍｅｒｓｈａｍ「シンチレーション近接アッセイ」法を使用してそのｃＡＭＰ−ＰＤＥ全含量について試験した。ＩＣ２６１の存在下で、組換えｈ−ｐｒｕｎｅのｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性（図１３Ｂ、右）の改変は検出されなかったが、ｐｒｕｎｅ過剰発現ＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４クローンにおけるｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の全含量をきめ細かく下げることができ、ｈ−ｐｒｕｎｅ及びｎｍ２３複合体が細胞ＰＤＥ−ｃＡＭＰ増大（図１３Ｂ、左）に関与することを示し、またそのような複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＣ２６１により阻害できることが指摘された。
【０２３１】
Ａ．ＰＤＥ活性アッセイとｃＡＭＰ
ＰＤＥ活性は、シンチレーション近接アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定された。試料、ＭＤＡ−ｐｒｕｎｅ＃４全抽出物の２０μｇ、及び対照として使用されるＭＤＡ−Ｃ１００抽出物を、基質として所望のｃＡＭＰ濃度を含む（非標識と３Ｈ−標識比３：１）アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ［ＰＨ７．４］、８．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．７ｍＭ ＥＧＴＡ）１００μｌの中で３０℃でインキュベートした。単独の緩衝液を含むブランクを含むすべての反応を、３通り実施し、基質回転率２５％未満（経験により決定）となるインキュベート時間の間進行させた。５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡパール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えて反応を急冷した。発見された放射性同位体標識産物量に対する酵素活性を、メーカープロトコルに従って計算した。ＩＣ２６１による処理は、上述の運動アッセイの場合と同じであった。
【０２３２】
結果
得られた結果は、ＩＣ２６１を使用してカゼインキナーゼ１δを阻害することにより、ｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２リン酸化反応を阻害し、したがって、ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質とのｉｎ ｖｉｖｏの結合を阻害する可能性があることを示している。したがって、この薬剤を使用することにより、ｈ−ｐｒｕｎｅ−ｎｍ２３複合体の形成を阻害することが可能であり、これは最後にカゼインキナーゼＩによる８１２０、８１２２、８１２５領域（ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥ）内のリン酸化反応に依存する。この研究では、ＩＣ２６１を使用して、ｎｍ２３Ｈ１及びＨ２のｈ−ｐｒｕｎｅへの結合を阻害し、タンパク質複合体由来の細胞運動性を阻害することができる。
【０２３３】
新しい手順では、細胞内に浸透でき、ｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されたｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２の割当量を横取りする、ｈ−ｐｒｕｎｅの結合に関して競合する新しいペプチドの使用を予測でき、その配列は、８１２０、８１２２、及び８１２５セリンのｎｍ２３−Ｈ１及びＨ２範囲のアミノ酸配列から導かれる（実施例Ｈ１：ＮＩＩＨＧＳＤＳＶＥＳＡＥＫＥの後にＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の領域の浸透ペプチド配列が続く。ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、純度９５％がＰＲＩＭＭによって合成される）。そのような、又は類似のペプチドは、Ｈ１及びＨ２野生型タンパク質上でカゼインキナーゼＩリン酸化反応とｉｎ ｖｉｖｏで競合し、ｈ−ｐｒｕｎｅ複合体形成及び細胞内のｈ−ｐｒｕｎｅ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の増大及び最終的に細胞運動性の誘発に関与するリン酸化されたｎｍ２３の割当量を減らすことができる。また、（Ｈ１−：ＳＤＥＩＧＫＶＳＥＮＩＡＨＳＥの後に続く浸透ペプチド配列ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）と呼ばれるカゼインキナーゼＩクランブルの認識配列を有する対照ペプチドを合成した。この技術を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏでｈ−ｐｒｕｎｅとｎｍ２３との間の相互作用の阻害をより特異的に標的にすることが可能である。
【０２３４】
（実施例５）
ｈ−ｐｒｕｎｅに対するモノクローナル抗体の作成（４Ｇ３／４、１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）
尾部のＮ末端で融合され、ｐＭａｌｔｏｓｅベクターを通じて大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）内で生成される、ｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、精製されたゲルであった。マウスに５週間の間免疫し（１回注射でタンパク質１００μｇ）、何らかのハイブリドーマ培養を用意するために脾臓を取り出した。免疫及び分析のためにタンパク質抗原約２ｍｇが必要であった。Ｐｒｉｍｍは、タンパク質が利用できなかった場合の免疫用に接合合成ペプチドを提供することができる。モノクローナル抗体の開発及び生産は、以下の異なるフェーズで規定される。
− ペプチド合成及びペプチド接合（必要な場合）。
− ペプチド約１０ｍｇの合成、純度＞７０％
− ペプチド３〜４ｍｇを担体タンパク質に接合（抗原として）
− ＥＬＩＳＡスクリーニング用にペプチド１〜２ｍｇを異なる担体タンパク質に接合
【０２３５】
フェーズＩ（１．５カ月）
３ ＢＡＬＢ／ｃのマウスを抗原で免疫。免疫された動物の血清の特異免疫グロブリンの定量滴定の手順。次の脾臓細胞の融合に対する免疫反応及び動物選択のＥＬＩＳＡアッセイ。
【０２３６】
フェーズＩＩ（２カ月）
脾臓摘出及び脾細胞と骨髄症細胞との融合、最も陽性のクローンのＥＬＩＳＡ凍結を介したハイブリドーマ選択。
【０２３７】
フェーズＩＩＩ（１〜１．５カ月）
限界希釈法による陽性クローン（１／２又は４）のクローニング及びサブクローニング。ハイブリドーマの凍結（２アリコート／クローン）。アリコートの解凍後の存続可能性、生産性、及び安定性アッセイ。
【０２３８】
フェーズＩＶ（１〜１．５カ月）
浮遊物０．５ｌからの細胞培養のｍＡｂ ０．５〜４ｍｇの生成及び精製。
【０２３９】
選択されたハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養浮遊物から精製されたネズミＩｇＭを生産する。免疫細胞化学に使用されるｍＡｂの量は、１：１００から３００μｇ／ｍｌに希釈されたｍＡｂ溶液に等しい。抗体は、ヒトとネズミの両方のｐｒｕｎｅに作用し認識する。内生タンパク質の検出は、ＩＣＣ、ＩＦ、及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを使用して実施される（図１４）。
【０２４０】
抗体精製は、以下のＩｇＭ精製プロトコルに従って実施された。溶解細胞の浮遊物を１ｍｌ／分の流れに曝した。ＨｉＴｒａｐ ＩｇＭを、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．８Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４（緩衝液Ａ）、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）、５体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３０％イソプロパノール（緩衝液Ｃ）で平衡化した（１ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ＥＬＩＳＡアッセイをペプチド及び精製されたタンパク質全体に対し実施し、生成された抗原及びクローン選択の特異性を決定した。
【０２４１】
カラム内にハイブリドーマ浮遊物を導入し、３つの緩衝液と共に溶離プロセスを３回繰り返し、そこで、カラムを１５体積の緩衝液Ａ（１５ｍｌ）で洗浄し、カラム溶離を１２体積の緩衝液Ｂ（１２ｍｌ）で行い（１ｍｌ画分の回収）、２８０ｎｍの画分吸収度を読み取り、０．１Ｏ．Ｄ．未満の吸収度の画分を回収し、４℃で一晩、１×ＰＢＳ緩衝液に対し１２０００〜１４０００の間のカットオフの管で画分透析を行う。カラムを再生するには、７ｍｌの緩衝液Ｃを使用する。緩衝液Ｂ＋２０％エタノールでカラムを保存する。
（参考文献）
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１Ａ】ＤＨＨファミリーのホスホエステラーゼ配列の多重整列を示す図であり、４つのジェネリックモチーフ（ｇｅｎｅｒｉｃ ｍｏｔｉｆ）（Ｉ−ＩＶ）及び第２のドメインにマッピングする２つの異なるサブファミリーのモチーフ診断を別々に示しており、数字は、それぞれのタンパク質配列内の第１の整列残基の位置及び異なる要素間の距離を示す。
【図１Ｂ】ＰＰＡＳＥ及びＲｅｃＪタンパク質の結晶構造に基づくｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の「リボン」構造。矢印は、アスパラギン酸残基（Ｄ）を示す。
【図１Ｃ】ＲｅｃＪタンパク質の「リボン」構造。矢印は、アスパラギン酸残基（Ｄ）を示す。
【図２Ａ】ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ基質上のｈ−ＰＲＵＥＮ ＰＤＥ活性の同定を示す図である。
【図２Ｂ】単一及び複数の突然変異の分析結果のヒストグラムは、ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質の潜在的触媒部位をマッピングしている。
【図２Ｃ】Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットで、それぞれ基質としてｃＡＭＰについてＫｍ及びＶｍａｘを決定している。
【図２Ｄ】Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットで、それぞれ基質としてｃＧＭＰについてＫｍ及びＶｍａｘを決定している。
【図２Ｅ】ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性は、Ｍｇ２＋の高い濃度で２つの異なる緩衝液の存在下で測定された。
【図２Ｆ】ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性は、Ｍｇ２＋（黒色点）又はＭｎ２＋（白色点）の高い濃度の存在下で測定された。ｈ−ＰＲＵＮＥ（実線）及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ（散在する点の線形）が示されている。
【図３Ａ】安定したクローン分析及びｉｎ ｖｉｔｒｏ運動アッセイを示す図である。リアルタイムＰＣＲ定量分析によるｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の試験。関連するΔＣｔ値が示されている。
【図３Ｂ】リアルタイムによるｍＲＮＡ発現の検出。ｍ−ＲＮＡのコピー数が報告される。
【図３Ｃ】ｈ−ＰＲＵＮＥ、ｎｍ２３−Ｈ１、及びＨｉｓ−ｔａｇ特異抗体をそれぞれ（ＰＤＥ５Ａについて）使用するＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析は、それぞれの個別細胞クローン内に発現されたタンパク質の量を示している。
【図３Ｄ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ Ｈ１−１７７、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ、及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７−ＰＲＵＮＥ細胞系の細胞運動性は、それぞれｈ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）単独又はｈ−ＰＲＵＮＥとｎｍ２３−Ｈ１（クローン＃７及び＃８）を過剰発現する。
【図３Ｅ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ４ＤΔ（クローン＃１９及び＃２０）、ＭＤＡ−ＰＤＥ５Ａ（クローン＃１４及び＃１６）、及びＭＤＡ−Ｈ１−１７７細胞系の細胞運動性。
【図３Ｆ】ＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｓ１２０Ｇ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃２及び＃３）、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ、ＭＤＡ−ｎｍ２３Ｈ１−Ｐ９６Ｓ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃４及び＃５）細胞系の細胞運動性、単独又はｈ−ＰＲＵＮＥとの過剰発現ｎｍ２３−Ｈ１突然変異体。
【図４】ｎｍ２３タンパク質の存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性分析、ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｈ−ＰＲＵＮＥΔ ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性を示す図である（パネルＡ）．パネルＢの表には、タンパク質溶解物全体で細胞ｐｍｏｌ×ｍｉｎ−１×μｇ−１として測定されたｈ−ＰＲＵＮＥ ＰＤＥ活性の値が報告されている。
【図５】ＰＤＥの阻害活性並びにＭＤＡ Ｃ−１００（対照）、ＭＤＡ−ＰＲＵＮＥ（クローン＃３及び＃４）、及びＭＤＡ ＰＲＵＮＥΔ（クローン＃１０及び＃１１）細胞系の運動の分析結果を表す運動ヒストグラムの図である（パネルＡ）。パネルＢの表には、ＩＣ５０の値として表されている、８つの試験阻害剤による異なるＰＤＥ上の阻害活性が報告されており、最後の列には、いくつかの最も感度の高い化合物に対するｈ−ＰＲＵＮＥ ＩＣ５０値が示されている。
【図６】乳房の腫瘍に関連する転移のｉｎ ｖｉｖｏ分析、ｈ−ＰＲＵＮＥ（左）とｎｍ２３−Ｈ１（右）の増幅を示すＭＴＡ（多重組織アレイ）のＦＩＳＨ分析を示す図である（パネルＡ）。中及び低（０／＋）ｎｍ２３−ＨＩ発現レベル（右）と対比したｈ−ＰＲＵＮＥ高発現（＋＋＋）腫瘍（左）の２つのグループの免疫組織化学の分析（ＩＨＣ）の倍率１００×及び２００×（パネルＢ、Ｃ）。５９ ＴＮＭ１乳癌患者に実施されたＦＩＳＨ分析とＩＨＣ分析の結果表（パネルＤ）。
【図７】乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥ前転移性機能を表すモデルを示す図である。
【図８】正常な乳房組織と腫瘍乳房組織を比較するＦＩＳＨ分析及び免疫組織化学分析を示す図である。パネルＡには、正常組織及び腫瘍組織（左）と腫瘍はあるが転移していない組織（右）の両方のｈ−ＰＲＵＮＥコピー数を特徴付けることができるＭＴＡのＦＩＳＨ分析が示されており、パネルＢには、低ｈ−ＰＲＵＮＥ発現（＋）腫瘍の２つのグループについて実施される免疫組織化学分析の倍率が報告されている。
【図９】乳癌のｈ−ＰＲＵＮＥの発現及び細胞遺伝分析を示す図である。パネルＡでは、ＴＭＡセクションで実施されるｈ−ＰＲＵＮＥ発現に対する免疫組織化学分析及び陽性（ａ）及び陰性（ｂ）のｈ−ＰＲＵＮＥ免疫染色の倍率４０×が示されている。パネルＢには、ｈ−ＰＲＵＮＥ／ＰＡＣ２７９−ｈ１９をプローブとして、ｐＵＣＩ７７を対照として使用する同じ試料に関するＦＩＳＨ分析が報告されている。
【図１０】ｈ−ＰＲＵＮＥ及びｎｍ２３−Ｈ１発現に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を示す図である。乳癌のすべての患者は、ｎｍ２３−Ｈ１（Ａ）及びｈ−ＰＲＵＮＥ（Ｂ）免疫染色を受けた。ｈ−ＰＲＵＮＥ陽性乳癌は、腋窩リンパ節転移が存在する場合（Ｃ）又は存在しない場合（Ｄ）のものである。
【図１１Ａ】バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）生成ｈ−ＰＲＵＮＥタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫沈降及びカゼインキナーゼδｉｎ ｖｉｔｒｏのリン酸化された、及びリン酸化されていない、ｎｍ３２Ｈ１を示す図であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫沈降を介した複合体形成を示すためにＳ１２０−１２５領域内の複数の単一突然変異が生成された。タンパク質は、バキュロウイルスで合成された組換えタンパク質の末端ＮＨ２に存在する抗ＨＩＳ抗体を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより目に見えるようになっている。レーン１及び２は、組換えタンパク質を対照として示している。免疫沈降は、Ａ−５９抗ｈ−ｐｒｕｎｅポリクローナル抗体を使用して実施され、検出は、抗Ｈｉｓタグ（ｐｒｕｎｅ／ｎｍ３２）ポリクローナル抗体を伴うＷ．Ｂ．により実施された。
【図１１Ｂ】タンパク質配列及びタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す図であり、リン酸化陽性セリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅｓ）は太字で示されている。
【図１１Ｃ】ＳＤＳ Ｐａｇｅゲル精製及びトリプシン処理の後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分子量プロファイル分析に送られる、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｎｍ２３Ｈ２構造及び抗体を認識する抗ＨＡを使用するＣＯＳ７発現ｎｍ２３−Ｈ２を示す図であり、ペプチド及びその分子量の同定は、１つ又は２つのリン酸化反応に対応する質量増大がある、Ｖｏｙａｇｅｒ質量分析計を使用して実施された。（８０ダルトン、１６０ダルトン）。
【図１２】図１２Ａは、リン酸化ペプチドに対し数回アフィニティ精製された、ウサギで得られる、ｎｍ２３Ｈ１リン酸化領域に対応するペプチドを認識するＫ７３ポリクローナル抗体を示す図であり、レーン１及びレーン２は、バキュロウイルス生成ｎｍ２３Ｈ１及びＨ２組換えタンパク質が、カゼインキナーゼδによりｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化されたときに、ＩｇＧ濃縮特異Ｋ７３抗体を認識するリン酸化セリンにより認識されることを示している。これらのデータは、Ｋ７３特異抗体によるセリン１２０〜１２５領域内の特異リン酸化反応の存在を示している。図１２Ｃは、ＭＤＡ Ｈ１１７７が、実施例４で説明されているように、様々な時点において、ＩＣ２６１ ５０ｍＭｏｌでインキュベートされ、全抽出物３０ｍｇが、リン酸化ペプチドに対し精製されたＫ７３ポリクローナル抗体と共にｎｍ３２のリン酸化反応について分析されたことを示す図である。レーン６（０ｈで与えられた）は、レーン１で使用され、３７℃でＩＣＰ １０Ｕにより１時間処理された、抽出物３０ｍｇを示している。図１２Ｄは、ＭＤＡ Ｃ１００が、６時間かけて、ＩＣ２６１により２つの異なる濃度で処理され、ｈ−ｐｒｕｎｅは、Ａ５９ポリクローナル抗体で免疫沈降され、ｎｍ２３−Ｈ１との相互作用は、ｍｏＡｂ抗ｎｍ２３Ｈ１ ｍｏＡｂ（ＮＯＶＯＣＡＳＴＲＡ）を介して検出されたことを示す図である。レーン１及び５は、組換えｈ−ｐｒｕｎｅ ＷＢ陽性対照２０ｎｇ及びＭＤＡＨ１１７７細胞抽出物２０ｎｇをそれぞれ示している。
【図１３】図１３Ａは、ジピリダモール、ＩＣ２６１又はジピリダモール及びＩＣ２６１による処置の後の細胞運動性値（５つの独立複製アッセイについては算術平均±ＳＤ）を示す図である。図１３Ｂ（左下）は、ＩＣ２６１が存在していると、複合体が細胞内のＰＤＥ−ｃＡＭＰ増大に関わることを示すＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４細胞内の直鎖化ｃＡＭＰの内容（ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の全内容）を変えることを示す図である。実際、図１３Ｂ（右下）は、ＩＣ２６１が存在しているときにｉｎ ｖｉｔｒｏの組換えｈ−ｐｒｕｎｅタンパク質は、その生物活性を修正しないことを示しており、比活性度値は未処理タンパク質に類似している。これらのデータから、ＩＣ２６１は、ｈ−ｐｒｕｎｅ−ｎｍ２３複合体を阻害し、後者は、ＭＤＡ ｐｒｕｎｅ ＃４で明らかなように、ホスホジエステラーゼ活性のｉｎ ｖｉｖｏ増大に関与することがわかる。
【図１４】ｐｒｕｎｅ特異モノクローナル抗体（４Ｇ３／４）を使用するＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによるｈ−ｐｒｕｎｅ検出を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を特徴とする腫瘍転移の予防及び治療用の薬剤を製造するためのｈ−Ｐｒｕｎｅサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用。
【請求項２】
ｈ−ｐｒｕｎｅサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なり、アミノアルコール、アミノアルキル、コレステロールからなる群から選択することができ、
Ｒ３及びＲ４は、同じ又は異なり、複素環式芳香族又は芳香環からなる群から選択することができる］を有する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記複素環式芳香族環は、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、モルホリンからなる群から選択することができる請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１及び／又はＲ２は、ジエタノールアミンである請求項２及び３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ３及び／又はＲ４は、ピリミジンである請求項２から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記阻害剤は、ジピリダモールである請求項２から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、ビンポセチン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＩＣ２６１及び誘導体、構造類似物、及びその異性体からなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、アミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）
を含むペプチドである請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲ（配列番号１０）を含むペプチドであり、浸透性のあることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を特徴とする腫瘍は、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、髄芽細胞腫、上皮腫、肝癌、Ｔ細胞又はＢ細胞リンパ腫、骨髄腫及びメラノーマ、及び肺腫瘍である請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
次のアミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）
を含むペプチド。
【請求項１２】
浸透性であることを特徴とする、アミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０）を含むペプチド。
【請求項１３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）少なくとも１つのホスホエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害化合物又は誘導体、構造類似物、又はその異性体を選択するフェーズと、
ｂ）０．０５μＭから１０μＭの範囲の濃度の前記少なくとも１つの化合物を、ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する細胞系に投与するフェーズと、
ｃ）ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析を行い、及び／又は細胞運動性対前記少なくとも１つの化合物及び化学誘引物質の濃度の分析を行い、前記ホスホジエステラーゼ活性を０．０１から１ｐｍｏｌ／ｍｉｎ−１／ｕｇ−１の間の値に阻害し、及び／又は前記運動を細胞２００から１２００個の間の値を達成するまで阻害することができる化合物を選択するフェーズと
を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記細胞系は、ＭＤＡ−Ｃ１００ ４３５ ｐｒｕｎｅ ＃４である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定量分析は、ｃ−ＡＭＰ及び／又はｃ−ＧＭＰ基質の加水分解試験により実施される請求項１３及び１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質は、０．００８μＭから１μＭの範囲の濃度で使用される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的アッセイ、ＦＩＳＨ分析、リアルタイムＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする腫瘍の転移を診断するために生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法。
【請求項１８】
ａ）前記生物試料を、少なくとも１つの抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体と接触させるステップと、
ｂ）抗原抗体複合体を検出するステップと、
ｃ）抗原抗体複合体の定量分析を行うステップと
を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物試料は、組織切片又は生体液である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識されている請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
抗原抗体複合体の前記検出及び定量分析は、免疫組織化学分析、免疫沈降分析、免疫蛍光検査分析、ＥＬＩＳＡ分析、免疫ブロット分析により実施される請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なＰＣＲリアルタイムプライマーは、配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法の標識プローブは、オリゴヌクレオチド配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
リアルタイムＰＣＲの前記標識プローブは、線形又は円形プローブである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項２４及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項２４から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項２４から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体、又はｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なプライマーの対又はｈ−ＰＲＵＮＥに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブを含む、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする腫瘍の転移の診断のための生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出するための診断キット。
【請求項３０】
ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする前記腫瘍は、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、メラノーマである請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３１】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項２９及び３０のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３２】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識されている請求項３１に記載の診断キット。
【請求項３３】
ｈ−ＰＲＵＮＥに特異的な前記プライマーの対は、配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列を含む請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３４】
リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法の前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチド配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３５】
リアルタイムＰＣＲの前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、線形又は円形プローブである請求項３４に記載の診断キット。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項３４及び３５のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３７】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項３４から３６までのいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３８】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項３７に記載の診断キット。
【請求項３９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質を認識し、選択的に結合することができ、ＩｇＭ免疫グロブリンクラスに属し、４Ｇ３／４クローン（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）により産生されることを特徴とするモノクローナルマウス抗体。
【請求項４０】
アミノ酸配列
ＮＨ２−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＩＩｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（配列番号４）
又はその一部を含む、免疫に使用されるペプチドを認識し、選択的に結合することを特徴とするｈ−ＰＲＵＮＥのウサギからのポリクローナル抗体。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチド配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列の少なくとも１つを含む、リアルタイムＰＣＲを介したｈＰＲＵＮＥ増幅のための特異的プライマー。
【請求項４２】
配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む、リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法のためのｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４３】
前記プローブは、線形又は円形プローブである請求項４２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４４】
前記プローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項４２及び４３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４５】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項４２から４４までのいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４６】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項４５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１】
ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を特徴とする腫瘍転移の予防及び治療用の薬剤を製造するためのｈ−Ｐｒｕｎｅサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤の使用。
【請求項２】
ｈ−ｐｒｕｎｅサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なり、アミノアルコール、アミノアルキル、コレステロールからなる群から選択することができ、
Ｒ３及びＲ４は、同じ又は異なり、複素環式芳香族又は芳香環からなる群から選択することができる］を有する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記複素環式芳香族環は、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、モルホリンからなる群から選択することができる請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１及び／又はＲ２は、ジエタノールアミンである請求項２及び３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ３及び／又はＲ４は、ピリミジンである請求項２から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記阻害剤は、ジピリダモールである請求項２から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、ビンポセチン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＩＣ２６１及び誘導体、構造類似物、及びその異性体からなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、アミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）
を含むペプチドである請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ｈ−ＰＲＵＮＥサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の阻害剤は、アミノ酸配列ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ ＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＯＲＲＲ（配列番号１０）を含むペプチドであり、浸透性のあることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
ｈ−ＰＲＵＮＥの過剰発現を特徴とする腫瘍は、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、髄芽細胞腫、上皮腫、肝癌、Ｔ細胞又はＢ細胞リンパ腫、骨髄腫及びメラノーマ、及び肺腫瘍である請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
次のアミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥ（配列番号９）
を含むペプチド。
【請求項１２】
浸透性であることを特徴とする、アミノ酸配列
ＮＩＩＨＧＳＯＳＶＥＳＡＥＫＥＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０）を含むペプチド。
【請求項１３】
ｈ−ＰＲＵＮＥ阻害化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）少なくとも１つのホスホエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害化合物又は誘導体、構造類似物、又はその異性体を選択するフェーズと、
ｂ）０．０５μＭから１０μＭの範囲の濃度の前記少なくとも１つの化合物を、ｈ−ＰＲＵＮＥを過剰発現する細胞系に投与するフェーズと、
ｃ）ｈ−ＰＲＵＮＥのサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の定量分析を行い、及び／又は細胞運動性対前記少なくとも１つの化合物及び化学誘引物質の濃度の分析を行い、前記ホスホジエステラーゼ活性を０．０１から１ｐｍｏｌ／ｍｉｎ−１／ｕｇ−１の間の値に阻害し、及び／又は前記運動を細胞２００から１２００個の間の値を達成するまで阻害することができる化合物を選択するフェーズと
を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記細胞系は、ＭＤＡ−Ｃ１００ ４３５ ｐｒｕｎｅ ＃４である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定量分析は、ｃ−ＡＭＰ及び／又はｃ−ＧＭＰ基質の加水分解試験により実施される請求項１３及び１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質は、０．００８μＭから１μＭの範囲の濃度で使用される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的アッセイ、ＦＩＳＨ分析、リアルタイムＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によるｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする腫瘍の転移を診断するために生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出する方法。
【請求項１８】
ａ）前記生物試料を、少なくとも１つの抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体と接触させるステップと、
ｂ）抗原抗体複合体を検出するステップと、
ｃ）抗原抗体複合体の定量分析を行うステップと
を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物試料は、組織切片又は生体液である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識されている請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
抗原抗体複合体の前記検出及び定量分析は、免疫組織化学分析、免疫沈降分析、免疫蛍光検査分析、ＥＬＩＳＡ分析、免疫ブロット分析により実施される請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なＰＣＲリアルタイムプライマーは、配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法の標識プローブは、オリゴヌクレオチド配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
リアルタイムＰＣＲの前記標識プローブは、線形又は円形プローブである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項２４及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項２４から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項２４から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体、又はｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なプライマーの対又はｈ−ＰＲＵＮＥに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブを含む、ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする腫瘍の転移の診断のための生物試料中のｈ−ＰＲＵＮＥを検出するための診断キット。
【請求項３０】
ｈ−ＰＲＵＮＥ過剰発現を特徴とする前記腫瘍は、乳癌、肉腫、神経芽細胞腫、メラノーマである請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３１】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項２９及び３０のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３２】
前記抗ｈ−ＰＲＵＮＥ抗体は、放射性同位体、蛍光分子、又は酵素で標識されている請求項３１に記載の診断キット。
【請求項３３】
ｈ−ＰＲＵＮＥに特異的な前記プライマーの対は、配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列を含む請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３４】
リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法の前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチド配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む請求項２９に記載の診断キット。
【請求項３５】
リアルタイムＰＣＲの前記標識オリゴヌクレオチドプローブは、線形又は円形プローブである請求項３４に記載の診断キット。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項３４及び３５のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３７】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項３４から３６までのいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３８】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項３７に記載の診断キット。
【請求項３９】
ｈ−ＰＲＵＮＥ組換えタンパク質を認識し、選択的に結合することができ、ＩｇＭ免疫グロブリンクラスに属し、４Ｇ３／４クローン（１０／１２／２００４にジェノアのＣＢＡに寄託）により産生されることを特徴とするモノクローナルマウス抗体。
【請求項４０】
アミノ酸配列
ＮＨ２−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＩＩｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（配列番号４）
又はその一部を含む、免疫に使用されるペプチドを認識し、選択的に結合することを特徴とするｈ−ＰＲＵＮＥのウサギからのポリクローナル抗体。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチド配列
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１）、
３’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴ−５’（配列番号２）、
又はその相補配列の少なくとも１つを含む、リアルタイムＰＣＲを介したｈＰＲＵＮＥ増幅のための特異的プライマー。
【請求項４２】
配列
ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣ（配列番号３）、
又はその相補配列又はＴがＵで置き換えられた配列を含む、リアルタイムＰＣＲ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法のためのｈ−ＰＲＵＮＥに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４３】
前記プローブは、線形又は円形プローブである請求項４２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４４】
前記プローブは、少なくとも１つの放射性同位体及び／又は蛍光色素で標識されている請求項４２及び４３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４５】
前記プローブは、５’及び／又は３’で少なくとも１つの蛍光色素で標識されている請求項４２から４４までのいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４６】
前記蛍光色素は、６−カルボキシフルオレセインである請求項４５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５１３９４０（Ｐ２００７−５１３９４０Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３７２３（Ｐ２００６−５４３７２３）
【出願日】平成１６年１２月１０日（２００４．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００４／０００６８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６０４３
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９８４９２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１０日（２００４．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００４／０００６８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６０４３
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９８４９２）
【Ｆターム（参考）】
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