オリゴヌクレオチド誘導体
【課題】オリゴヌクレオチド誘導体合成に有用である新規なヌクレオチド誘導体、及び該誘導体を用いて得られ、短い相補鎖と結合し長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチドの提供。
【解決手段】下記式で表されるホスホロアミダイト化合物、および該化合物を用いて得られるオリゴヌクレオチド誘導体。
該誘導体は、オリゴヌクレオチドアレイや医薬組成物として有用である。
【解決手段】下記式で表されるホスホロアミダイト化合物、および該化合物を用いて得られるオリゴヌクレオチド誘導体。
該誘導体は、オリゴヌクレオチドアレイや医薬組成物として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するために用いられるハイブリダイゼーションプローブに関する。特には、鎖長１５〜３０ヌクレオチド程度の成熟ｍｉＲＮＡをｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒe−ｍｉＲＮＡから区別して検出するのに用いることのできるハイブリダイゼーションプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は生物のゲノムから転写された、タンパク質をコードしない通常１９〜２３塩基程度、場合によっては１５〜３０塩基程度の鎖長のＲＮＡである。最近の研究により、ｍｉＲＮＡが細胞の発生、分化、癌化などの過程やウイルスの感染プロセスなどに重要な役割を果たしていることが示唆されている。活性な成熟ｍｉＲＮＡの生成機構は以下のとおりである。
【０００３】
まず、ゲノムより転写された１０００塩基程度のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが切断され７０−１００塩基のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが生成する。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが更に切断され、１９〜２３塩基程度の活性な成熟ｍｉＲＮＡが生成する。この成熟ｍｉＲＮＡは標的のメッセンジャーＲＮＡに結合しその翻訳を制御することで、そのメッセンジャーＲＮＡの情報をもとに合成されるタンパク質の発現量の調節を行っている。これらのｍｉＲＮＡの機能を解明し、それらの情報を疾患の診断や治療に応用するためには細胞内に存在する多数のＲＮＡの中から成熟ｍｉＲＮＡを迅速かつ網羅的に検出する技術の開発が必要である。
【０００４】
現在使用されている手法としては、生体内の全ＲＮＡをカラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動で鎖長にしたがって分離し、短鎖ＲＮＡのみを含む画分を溶出した後、ハイブリダイゼーション技術により、短鎖ＲＮＡのみを検出する方法が知られている（非特許文献１）。この方法によれば、サンプル中に長鎖核酸が含まれていないため、短鎖核酸のみを分析することができるが、カラムクロマトグラフィーや電気泳動を行うのに時間やコストがかかること、操作が煩雑なため熟練した技術社でなければ実施が困難であるなどの問題点がある。
【０００５】
また、短鎖ＲＮＡの分子工程を省略するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて短鎖ＲＮＡをプライマーとした場合のみ鎖伸長が可能な酵素反応を用いた核酸の蛍光ラベルを用いる方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法は、複数の酵素反応を用いる方法であるため、操作が煩雑になるという問題がある。
【０００６】
また、非特許文献３には、短いＲＮＡのみに結合するヘアピンプライマーを用いた成熟ｍｉＲＮＡ選択的なＲＴ−ＰＣＲ法が開示されている。しかし、ヘアピンプライマーはそのヘアピン構造の熱力学的安定性を精密にデザインする必要があり、かならずしも汎用的かつ容易に用いることができるものではない。またＲＴ−ＰＣＲでは細胞内に多数存在するｍｉＲＮＡを網羅的に検出することが困難であるためスループットの点では最適な方法ではない。
【０００７】
上記問題の根本原因は、これまでに存在する天然型および非天然型のオリゴヌクレオチドは核酸分子の配列を選択的に認識することはできるが、そのサイズを認識することができない点にある。すなわち、ある配列に相補的なオリゴヌクレオチドはそのターゲットとする配列を一部として含む長い核酸分子にも結合してしまうため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのように成熟ｍｉＲＮＡの配列をその一部に含むＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡとをハイブリダイゼーションにより区別することが困難である。これらの問題点に関する解決法がいくつか提唱されている。
【０００８】
例えば、マイクロアレイ上にヘアピン型のプローブを固定化した成熟ＲＮＡ選択的マイクロアレイが報告されている（非特許文献４）。該文献には、このヘアピンプローブにより短くプロセッシングされた成熟ｍｉＲＮＡのみを認識できると記載されているが、プローーブにヘアピン構造を形成するためには、プローブの鎖長を必要以上に長くしなければならないため、プローブの合成コストを考えた場合最適な手法ではない。また、ヘアピンプライマーが実際にどのくらい成熟ｍｉＲＮＡに選択的に結合するのかといった定量的評価も充分ではない。
また、オリゴヌクレオチドプローブの両末端に立体的に嵩高い置換基を導入して短鎖ＲＮＡのみを検出する方法も報告されている（特許文献１）が、短鎖ＲＮＡに対する結合の選択性が低く実用的な方法ではない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｓ．Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ １１，２４１−２４７，２００５年
【非特許文献２】Ｐ．Ｔ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｊ．Ｃ．Ｏｂｅｒｈｏｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｔｏｂｉａｓ，Ｚ．Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ １．ｐ１５５−１６１，２００４年
【非特許文献３】Ｃ，Ｃｈｅｎ， Ｄ．Ａ．Ｒｉｄｚｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｒｏｏｍｅｒ，Ｚ，Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｂａｒｂｉｓｉｎ，Ｎ．Ｌ．Ｘｕ，Ｖ．Ｒ．Ｍａｈｕｖａｋａｒ，Ｍ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｑ．Ｌａｏ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｕｅｇｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ ３３，ｅ１７９．
【非特許文献４】Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ａ．Ａｃｈ，Ｂ．Ｃｕｒｒｙ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ １３，ｐ１−９，２００７．
【特許文献１】特開２００７−２３８５５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、より効果的な分子デザインにより、簡素な化学修飾のみで優れた短鎖ＲＮＡ選択性を示すことのできる、生産コスト的にも優れた人工オリゴヌクレオチドプローブの開発と、それらを用いた信頼性の高いＲＮＡ検出デバイスの開発が望まれる。
本発明の目的はこれらの課題を解決するオリゴヌクレオチド誘導体とそれらを製造するための化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、オリゴヌクレオチドの末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を用いることにより、上記課題を解決し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩を提供するものである。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、j及びｍは同一であっても異なっていてもよく、1〜１０の整数を表わし、ｋは１〜５０の整数を表わし、Ｘ、Ｙ及びＺは同一であっても異なっていてもよく、水酸基、水素原子、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わす。Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わし、Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表わし、Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わし、Ｗ２は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わす（但し、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。））
【化２】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化３】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化５】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化８】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１０、Ｒ１１は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化９】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、好ましくは核酸検出用プローブとして用いられる。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイを提供する。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明は、一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物を提供する。
【化１０】
（式中、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよく、Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わし、Ｂ１は一般式（８）、（９）（１０）又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。）
【化１１】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１２】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１３】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１４】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１５】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１６】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１７】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１８】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しているので、適当な反応条件を設定することにより、短い相補鎖とのみ結合し、長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチド誘導体である。その結果、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸を反応させることにより、加えたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、かつ加えたオリゴヌクレオチドよりも鎖長の短い核酸とのみ結合させ、鎖長の短い核酸の単離、検出、機能制御に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、まず本発明のオリゴヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（１）で表わされる。
【化１９】
【００１５】
上記一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
j及びｍは、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ１〜１０の整数であり、好ましくは１〜５である。ｊ及びｍが１０を超えても、１０以下の場合に比べて効果に差異はないため、上記範囲が適当である。
【００１６】
ｋは１〜５０の整数であり、好ましくは５〜３０である。ｋは、検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ等）の鎖長によって変えることができる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しており、この置換基がアニオンに解離することにより相補鎖ＲＮＡ又は相補鎖ＤＮＡと静電反発が起こり、長い鎖長のものは結合できなくなり、末端部のアニオンとアニオンとの長さのものよりも短いＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖のみが、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができるようになる。従って、検出しようとするｍｉＲＮＡ等の長さによって、ｋの範囲を変動させることが可能である。
【００１７】
Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても、異なっていてもよく、それぞれ水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよいアルコキシ基である。アルコキシ基としては、炭素数が１〜６個のアルコキシ基が好ましく、このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、プロパン−１−イルオキシ基、ブタン−１−イルオキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。また、上記置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。
Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよいアルコキシ基である。アルコキシ基、置換基については、上記Ｘ、Ｙ及びＺについて説明したのと同様である。
【００１８】
Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表す。天然型の核酸塩基としては、例えば、チミン−１−イル、シトシン−１−イル、５−メチル−シトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、アデニン−９−イル、グアニン−９−イルなどが挙げられる。また、非天然型の核酸塩基とは、天然型の核酸塩基の環外酸素原子や環外窒素原子や環内窒素原子や環内炭素原子に置換基を有するなどの化学修飾、または環外酸素原子や環内窒素原子や環内炭素原子が他の原子に置換されるなどの化学修飾、もしくはこれらの化学修飾をともに有する核酸塩基の誘導体を表わし特に限定はされないが、好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アシル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アシルシトシン−１−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられ、特に好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アセチル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アセチルシトシン−１−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられる。また、これらの互変異性体であってもよい。
【００１９】
Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基、又は一般式（２）、一般式（４）一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる置換基を表す。天然型もしくは非天然型の核酸塩基とは、上記Ｂについて説明したのと同様である。
【化２０】
上記一般式（２）において、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【化２１】
上記一般式（３）において、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。また、置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。
【００２０】
【化２２】
上記一般式（４）において、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ２は、炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【００２１】
【化２３】
上記一般式（５）において、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【化２４】
上記一般式（６）において、Ｌ４、Ｌ５は同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【００２２】
Ｗ２は、Ｗ１と同様、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表す。天然型もしくは非天然型の核酸塩基、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）については、Ｗ１において説明したものと同様である。 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個が、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも一方の末端に、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を有している。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも一方の末端に、カルボン酸アニオン、リン酸アニオン等のアニオンに解離することが可能な置換基が存在する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、少なくとも一方の末端に、少なくとも１個の、アニオンに解離することが可能な置換基があればよく、両方の末端にあってもよい。また、アニオンに解離することが可能な置換基は１個のみでなく、複数個存在してもよい。
なお、一般式（１）におけるＢは、検出しようとする核酸に相補的な配列となるなど、適当な結合力を有する配列を選択することができる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その塩の形態であってもよい。本明細書で用いられる塩とは、本発明のヌクレオチド誘導体中に含まれる一部もしくは全てのリン酸基及びカルボキシル基のプロトンが陽イオンに置き換わった化合物を意味する。陽イオンとしては、例えば、アンモニウム、モノアルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどのアンモニウムイオン類および、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオンなどの金属イオン類が挙げられる。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しているので、適当な反応条件を設定することにより、末端部にアニオンが生成する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。
【００２５】
図１に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、適当な反応条件下では、その末端部にアニオンが生成する。ここに、長い相補鎖と短い相補鎖を混合すると、短い相補鎖（ここで、短いとは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の末端のアニオンから他方の末端のアニオンの間の距離よりも短いことを意味する。）は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合する。一方、長い相補鎖においては、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合と相補的な部分を有しているにもかかわらず、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の末端部にアニオンが存在するため、この部分で静電反発が起こり、長い相補鎖は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができない。
【００２６】
このような性質を利用することにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸とを反応させることにより、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、かつ鎖長の短い核酸のみと結合させ、鎖長の短い核酸を単離、検出、機能制御することが可能となる。例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡをＰｒｅ−ｍＲＮＡと区別して検出することが可能となる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸検出プローブとして用いることができる。
なお、適当な反応条件とは、当該技術分野において公知であり、プローブとオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズするための条件を意味する。
【００２７】
なお、上記適当な条件とは、検出しようとするオリゴヌクレオチド、また、本発明のヌクレオチドの塩基配列や塩基組成等により異なるため、一概には規定できないが、一般的な条件としては下記の通りである。
ハイブリダイゼーションは、９６穴又は３８４穴のプラスチックプレート中で実施してもよい。このようなプレートの穴に、本発明のオリゴヌクレオチドを点着させ、次いで、試料を添加してハイブリダイゼーションを行う。又は、後述する、本発明のオリゴヌクレオチドアレイを用いてもよい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃程度の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のオリゴヌクレオチドを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。ハイブリダイゼーションを実施する緩衝液としては、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、当業者に公知の方法、例えばホスホロアミダイト法を用いて製造することができる。ホスホロアミダイト法を実施する際には、後述する、本発明の化合物を用いることにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造することができる。
【００２８】
次に、本発明のオリゴヌクレオチドアレイについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を固相担体上に固定化してなる。本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、特定の塩基配列を有する、短い鎖長（通常、５０塩基以下）のオリゴヌクレオチドを検出するために用いられる。従って、固相担体に固定するオリゴヌクレオチド誘導体の塩基配列は、検出しようとする配列の相補的配列を有するものなど、適当な結合力を有する配列となる。一般に、固相担体に固定化されているオリゴヌクレオチド誘導体は、検出しようとするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションにより特異的結合により結合する。
【００２９】
なお、本明細書において、オリゴヌクレオチドアレイを製造する方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチド を合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを、当該技術分野において公知の適切なリンカーを介して固相担体表面に固定する方法とが知られている。本発明におけるオリゴヌクレオチドアレイは、このいずれの方法でも製造することができる。オン・チップ法としては、例えば光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができるが、この方法に限定されるものではない。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチド を共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９１３，１９９６）。
また、ポーラスガラス、ポリスチレンなどの固相担体にあらかじめオリゴヌクレオチドを固相合成法で合成しておき、その固相担体を接着剤などの適当な方法や物理的手法によりガラス基板上に固定化する方法も含まれる。
【００３０】
用いられる固相担体としては、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。用いられる固相担体としては、例えば、シリコン；微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス；金属；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）等が挙げられる。担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状等、どのような形状のものであってもよい。
【００３１】
上記固相担体は、ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成したものであってもよい。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ、Diamond Like Carbon）とは、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体の総称であり、その混合割合は特に限定されない。ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成する場合、その層の厚みは好ましくは１ｎｍ〜１０μｍである。
【００３２】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に共有結合させるためには、固相担体表面にアミノ基が結合しているものを用いてもよい。従って、担体としては、表面にアミノ基が結合しているか、又はアミノ基を結合することのできるものを用いることが好ましい。
【００３３】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、上述した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上述したように、短い鎖長の相補鎖とのみ結合し、このような短鎖長の相補鎖の機能を制御するために用いることができ、例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡの制御か可能となり、がん、腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、ウイルス感染症、細菌感染症、ヘルペス感染症、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、高血圧、アレルギー性疾患、パーキンソン病、、筋ジストロフィー、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症、ダウン症、アルツハイマー病、筋萎縮症、 ＡＬＳ、 頸髄損傷、 脊髄損傷、 ギランバレー症、ベーチェット病、 膠原病、リウマチなどの治療薬に用いることができる。従って、本発明は、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造することができる。本発明の医薬組成物は、それ自体又は適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等として、又は注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは外用剤等として製造することが出来る。
上記医薬組成物は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、αデンプン、デキストリン等のデンプン類；結晶セルロース；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムの等のケイ酸塩誘導体；燐酸水素カルシウム；炭酸カルシウム；硫酸カルシウム、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカ、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸）、矯味矯臭剤（甘味料、酸味料、香料等）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法により製造することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物を被験者に導入する方法については、コロイド分散系を用いてもよい。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果を奏する。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば特に制限はなく、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系が挙げられる。また、０．２〜０．４μｍのサイズの単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化することができ、オリゴヌクレオチド誘導体がこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質（相転移温度の高いリン脂質が好ましい）を、ステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソームの製造に有用な脂質の具体れとしては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物の投与量は症状や年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、注射の場合には、１回当り下限０．１mg（好適には、５mg）、上限１０００mg（好適には、５００mg）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【００３７】
次に、本発明のホスホロアミダイト化合物について説明する。本発明のホスホロアミダイト化合物は、一般式（７）で表わされる。
【化２５】
上記一般式（７）において、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、具体的には、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基等が挙げられる。Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、具体的には、２−シアノエチル基、メチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、アルキルスルホニルエチル基、アリールスルホニルエチル基等が挙げられる。Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはＲ１４及びＲ１５はイソプロピル基である。また、はＲ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよい。Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わす。置換基を有してもよいアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、２−シアノエチル基、２−メトキシエチル基等が挙げられる。ＲＮＡ２’水酸基の保護基としては、例えば、炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が結合したトリアルキルシリル基、炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が結合したトリアルキルシリルオキシメチル基、２−シアノエチル基、２−シアノエトキシメチル基等が挙げられる。好ましくは、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、２−シアノエチル基、２−シアノエトキシメチル基等である。
【００３８】
上記一般式（７）において、Ｂ１は一般式（８）、（９）、（１０）、又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。
【化２６】
上記一般式（８）において、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ３及びＬ１については、上述した一般式（２）において説明したものと同様である。Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。保護された水酸基、保護されたカルボキシル基とは、水酸基、カルボキシル基が当業者に公知の保護基で保護された基を指す。保護基の具体例を以下に例示するが、本発明に含まれる保護基はこれらに含まれるものではない。水酸基の保護基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、レブリニル基などのアシル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、２,２,２−トリクロローｔ−ブチルオキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基などのトリアルキル基などが挙げることができる。カルボキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、２−シアノエチル基などを挙げることができる。
【００３９】
【化２７】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
Ｒ２３及びＲ２４としては２−シアノエチル基、メチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、アルキルスルホニルエチル基、アリールスルホニルエチル基などがあげられる。
【００４０】
【化２８】
一般式（９）において、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ６及びＬ２については、上述した一般式（４）において説明したものと同様である。Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【００４１】
【化２９】
一般式（１０）において、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ８及びＬ３については、上述した一般式（５）において説明したものと同様である。Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【化３０】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【００４２】
本発明の、一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造する際に、３’末端および５’末端のヌクレオチドとして用いられる。一般式（７）で表わされる化合物は、本明細書、特に後述する実施例の記載等を参照することによって、当業者であれば容易に合成することができる。また、本明細書に記載されていない諸条件は当業者が適宜選択することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ホスホロアミダイト化合物の合成
ホスホロアミダイト化合物は、下記合成方法により合成した。
【化３１】
【００４４】
化合物２（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシアデノシン（化合物１、３．０ｇ，６．２５ミリモル）をピリジン６３ｍｌに溶解させた後、クロロ炭酸フェニル（１．７２ｍｌ，１３．８ミリモル）を加え、室温で２時間反応させた。次いで、抽出操作を行わずにトランス−４−アミノシクロヘキサノール（３．６ｇ，３１．３ミリモル）を加え、８５℃で３０分間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させた後、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物２、２．９５ｇ，７６％）を得た。
【化３２】
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ， ５００ ＭＨｚ） δ ０．０８−０．１１ （１２Ｈ， ｍ）， ０．７９−０．９３ （１８Ｈ， ｍ）， １．２６−１．３４ （４Ｈ， ｍ）， １．８２−１．８４ （２Ｈ， ｂｒ）， １．９４−１．９６ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．３３−２．３８ （１Ｈ， ｍ）， ２．９１−２．９６ （１Ｈ， ｍ）， ３．４６−３．４８ （１Ｈ， ｍ）， ３．５５−３．５７ （１Ｈ， ｍ）， ３．６５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ）， ３．７９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ）， ３．８５−３．８８ （１Ｈ， ｍ）， ４．５７ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）， ４．６３−４．６６ （１Ｈ， ｍ）， ６．４０ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）； ８．５２ （１Ｈ， ｓ）， ８．５７ （１Ｈ， ｓ）， ９．３５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ９．５４ （１Ｈ， ｓ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ） δ −５．５， −５．０， −４．８， １７．７， １７．９， ２５．７， ３０．４， ３３．５， ３８．５， ４８．０， ６２．４， ６７．８， ７１．８， ８３．５， ８７．１， １２０．３， １４２．１， １５０．０， １５０．３， １５０．７， １５２．６。
【００４６】
化合物３（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物２（２．２ｇ，３．５５ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ジクロロメタン（脱水）３６ｍｌに溶解させた。ここに、レブリン酸（７２９μｇ，７．０９ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．４６ｇ，７．０９ミリモル）、４−ジメチルアミノピリジン（４３ｍｇ，０．３４ミリモル）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、吸引濾過により析出物を除去して、ジクロロメタンで洗いこみを行った。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物３、１．６２ｇ，６４％） を得た。
【００４７】
【化３３】
【００４８】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ ０．０５−０．０９ （１２Ｈ， ｍ）， ０．８４−０．９０ （１８Ｈ， ｍ）， １．４６−１．５７ （４Ｈ， ｍ）， １．９９−２．０１ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１３−２．１５ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１８ （３Ｈ， ｍ）， ２．４２−２．４６ （１Ｈ， ｍ）， ２．５４−２．５６ （２Ｈ， ｍ）， ２．６１−２．６６ （１Ｈ， ｍ）， ２．７２−２．７５ （２Ｈ， ｍ）， ３．７３−３．７６ （１Ｈ， ｍ）， ３．８３−３．８６ （２Ｈ， ｍ）， ４．００−４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．６１ （１Ｈ， ｍ）， ４．７５−４．７９ （１Ｈ， ｍ）， ６．４４−６．４７ （１Ｈ， ｍ）， ８．３３ （１Ｈ， ｓ）， ８．４９ （１Ｈ， ｓ）， ９．４５−９．４６ （１Ｈ， ｍ）。
【００４９】
化合物４（Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物３（１．５ ｇ，２．０８ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水） ２１ ｍｌに溶解させた。ここにトリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．７０ ｍｌ，１０．４ミリモル）及びトリエチルアミン（１．４４ｍｌ，１０．４ミリモル）を加え、室温で１２時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を展開溶媒としてクロロホルム／メタノールを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物４、７３０ｍｇ，７２％）を得た。
【００５０】
【化３４】
【００５１】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．４５−１．５９ （４Ｈ， ｍ） ２．０１−２．０２ （２Ｈ， ｍ）， ２．１４−２．１６ （２Ｈ， ｍ）， ２．１９ （３Ｈ， ｓ）， ２．３９−２．４３ （１Ｈ， ｍ）， ２．５５−２．５７ （２Ｈ， ｍ）， ２．７４−２．７６ （２Ｈ， ｍ）， ２．９６−３．００ （２Ｈ， ｍ）， ３．８０−３．８４ （２Ｈ， ｍ）， ３．９６−３．９９ （１Ｈ， ｍ）， ４．２３ （１Ｈ， ｓ）， ４．７６−４．８０ （２Ｈ， ｍ）， ５．７４−５．７６ （１Ｈ， ｍ）， ６．４３−６．４５ （１Ｈ， ｍ）， ７．２６ （１Ｈ， ｓ）， ８．２６ （１Ｈ， ｍ）， ８．４８ （１Ｈ， ｓ）， ８．７５ （１Ｈ， ｓ）， ９．４４−９．４８ （１Ｈ， ｍ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２８．４， ２９．８， ３０．０， ３０．４， ３８．１， ４１．１， ４８．３， ６３．３， ７２．１， ７３．１， ８７．５， ８９．５， １２１．９， １４２．８， １４９．４， １５０．７， １５１．０， １５３．５， １７２．４， ２０７．０。
【００５２】
化合物５（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物４（６００ｍｇ，１．２２ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水）１２ ｍｌに溶解させた。ここに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４９７ｍｇ，１．４７ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。メタノールでクエンチした後、クロロホルムで反応溶媒を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物５、７４１ ｍｇ， ７７％） を得た。
【００５３】
【化３５】
【００５４】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．４５−１．６０ （４Ｈ， ｍ）， ２．０１−２．０３ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１４−２．１８ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．２０ （３Ｈ， ｓ）， ２．５４−２．５８ （３Ｈ， ｍ）， ２．７５ （２Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）， ２．８２−２．８７ （１Ｈ， ｍ）， ３．３６−３．４３ （２Ｈ， ｍ）， ３．７６ （６Ｈ， ｓ）， ３．８４−３．８６ （１Ｈ， ｍ）， ４．１５−４．１８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， ４．６８−４．７１ （１Ｈ， ｍ）， ４．７７−４．８１ （１Ｈ， ｍ）， ６．４７ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ）， ６．７８ （４Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ７．１９−７．３９ （９Ｈ， ｍ）， ８．０９ （１Ｈ， ｓ）， ８．１３ （１Ｈ， ｂｒ）， ８．４３ （１Ｈ， ｓ）， ９．３８ （１Ｈ， ｄ Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２８．５， ２９．８， ３０．０， ３０．４， ３８．１， ４０．３， ４８．２， ５５．３， ６３．８， ７２．２， ７２．５， ８４．６， ８６．３， ８６．７， １１３．３， １２０．９， １２７．１， １２８．０， １２８．２， １３０．１， １３５．７， １４１．１， １４４．６， １５０．０， １５０．４， １５１．１， １５３．３， １５８．７， １７２．４， ２０６．９。
【００５５】
ホスホロアミダイト化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
化合物５（３５０ｍｇ，０．４４１ミリモル）をピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々３回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）４．４ ｍｌに溶解させた。これにテトラゾール（１９ｍｇ，０．２６４ミリモル）、ジイソプロピルアミン（３７ μｌ，０．２６４ミリモル）及び２−シアノエチル−ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（１５４μｌ，０．４８６ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去した後、酢酸エチル−ジエチルエーテルの混合溶媒に溶解させ、０．２ Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で３回抽出操作を行い、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてクロロホルムを用いてリサイクルＨＰＬＣで精製し、目的物（下記式で表されるホスホロアミダイト化合物、３０３ｍｇ，７７％）を得た。
【化３６】
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．１２−１．２１ （１２Ｈ， ｍ）， １．４８−１．６０ （４Ｈ， ｍ）， ２．０２−２．０４ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１５−２．１７ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．２０ （３Ｈ， ｓ）， ２．４６−２．４８ （１Ｈ， ｍ）， ２．５６−２．６３ （３Ｈ， ｍ）， ２．７４−２．７７ （２Ｈ， ｍ）， ２．９３−２．９８ （１Ｈ， ｍ）， ３．３５−３．４３ （２Ｈ， ｍ）， ３．６０−３．７５ （４Ｈ， ｍ）， ３．７７ （６Ｈ， ｓ）， ３．８０−３．８６ （１Ｈ， ｍ）， ４．２９−４．３２ （１Ｈ， ｍ）， ４．７８−４．８１ （２Ｈ， ｍ）， ６．４３−６．４６ （１Ｈ， ｍ）， ６．７６−６．７９ （４Ｈ， ｍ）， ７．１８−７．４０ （９Ｈ， ｍ）， ８．２１−８．２４ （１Ｈ， ｍ）， ８．３４−８．３６ （１Ｈ， ｂｒ）， ８．４３ （１Ｈ， ｓ）， ９．４８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２０．２， ２０．３， ２０．４， ２０．５， ２４．５， ２４．６， ２４．７， ２８．４， ２９．７， ２９．９， ３０．３， ３８．０， ３９．３， ４３．３， ４３．４， ４８．０， ４８．２， ５５．２， ５５．３， ５８．２， ５８．３， ５８．５， ６３．３， ６３．５， ７２．１， ７３．３， ７３．４， ７４．０， ８４．８， ８６．０， ８６．５， １１３．１， １１７．５， １１７．６， １２１．０， １２６．９， １２７．９， １２８．１， １２８．２， １３０．１， １３５．７， １４１．６， １４４．６， １５０．０， １５０．４， １５１．０， １５３．３， １５８．６， １７２．３， ２０６．７；３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ １４９．７， １４９．８。
【００５７】
実施例２
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＊＊）−３’（配列番号：１）の合成
ここで下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基を表わす。ｄＡ＊、ｄＡ＊＊はそれぞれ下図で示すヌクレオチド残基を表わす。
【化３７】
【００５８】
グレンリサーチ社より購入したユニバーサルサポートＩＩ（１μｍｏｌ）を固相担体として用い、実施例１のホスホロアミダイト化合物、およびグレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルＲＮＡ ホスホロアミダイト試薬を用い、ＡＢＩ−３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機の標準的な１．０μｍｏｌスケールＲＮＡ合成プロトコールにて合成を行った。５’末端のヌクレオチド残基を結合後、オリゴヌクレオチドに対して、５０当量のヒドラジン（ピリジン−酢酸、３：２，Ｖ／Ｖ 溶液）を加え、室温で１５分間放置することにより、Ｌｅｖ基を除去した。
【００５９】
次いで、グレンリサーチ社より購入したホスファリンク試薬（５０当量）を１Ｈ−テトラゾール（５０当量）の存在下反応させ、次いで、常法によりヨウ素酸化と２Ｍ アンモニア／メタノールによる切り出しついで、濃アンモニア水で室温１８時間攪拌した。このアンモニア溶液をＣ１８カートリッジカラムに担持し、副生物を洗浄した後、２％トリフルオロ酢酸水溶液で処理した後、目的物を溶出した。得られた目的物の粗精製物を陰イオン交換ＨＰＬＣで精製して目的物を得た。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
【００６０】
実施例３
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：２）の合成
実施例２と同様の方法により目的物を合成した。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
【００６１】
実施例４
オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＊＊）−３’（配列番号：３）の合成
実施例２と同様の方法により目的物を合成した。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
なお、実施例２で得られたオリゴヌクレオチドは、両末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有しており、実施例３及び実施例で得られたオリゴヌクレオチドは、それぞれ、５’末端、３’末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有している。
【００６２】
実施例５
Ｔｍ測定による鎖長依存的ハイブリダイゼーションの解析
実施例２、実施例３又は実施例４で得られたオリゴヌクレオチドを１０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．１ Ｍ ＮａＣｌ中に、濃度が１．０ μＭになるように調整した。この溶液に、下記長鎖ＲＮＡ（配列番号：４）又は短鎖ＲＮＡ（配列番号：５）を同じく濃度１．０ μＭになるように溶解し、２６０ｎｍでの吸光度の温度依存性を５℃から９０℃まで測定した。得られたＵＶ融解曲線を微分し、その一次微分係数が極大となる温度をＴｍとした。比較として、下記天然型プローブ、および非アニオン性プローブのＴｍも測定した。結果を表１に示す。
【００６３】
長鎖ＲＮＡ（配列番号：４）：３’−ＡＵＵＡＵＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＵＵＡ−５’
短鎖ＲＮＡ（配列番号：５）：３’−ＧＵＵＣＣＡＵＧＡ−５’
天然型プローブ（配列番号：６）：５’−（ｄＣ）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＣ）−３’
非アニオン性プローブ（配列番号：７）：５’−（ｄＡ＃）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＃＃）−３’
ここで、Ａ，Ｕ、Ｇ、Ｃはリボヌクレオチド残基である。下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基である。ｄＡ＃、ｄＡ＃＃はそれぞれ下図に示すヌクレオチド残基を表わす。
【００６４】
【化３８】
【００６５】
【表１】
【００６６】
表１より、以下のことが明らかになった。
プローブの両末端、又は５’末端に、アニオンに解離することが可能な置換基を導入した実施例２、実施例３、実施例４のオリゴヌクレオチドは、長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡに強く結合した。
天然型プローブは、逆に短鎖ＲＮＡよりも長鎖ＲＮＡに強く結合した。
末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有しない、非アニオン性プローブは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡより強く結合したが、その選択性の指標であるΔＴｍ＝＋４は、アニオン性置換基を有する実施例２のΔＴｍ＝９ および実施例３のプローブのΔＴｍ＝＋７よりも小さかった。
以上の結果より、自身よりも鎖長の短いＲＮＡと選択的に結合する核酸プローブとしては本発明の実施例に示したオリゴヌクレオチドの方が、天然型プローブよりも優れていた。また、アニオンを有しないオリゴヌクレオチドと本発明の実施例に示したアニオンを有するオリゴヌクレオチドでは、本発明の実施例に示したオリゴヌクレオチドがも優れていることがわかった。
【００６７】
実施例６
５’末端にリン酸基を有する短鎖ＲＮＡに対する結合能評価
実施例５に示した実験と同様の方法により、実施例２に示すオリゴヌクレオチドが下記の長鎖ＲＮＡ、及び短鎖５’リン酸化ＲＮＡに結合する強度をＴｍ測定により調べた。 なお、短鎖ＲＮＡとしては、５’末端がリン酸化されているものを用いた。結果を表２に示す。
すなわち、短鎖ＲＮＡの５’末端は下記構造を有する。
【化３９】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表２から、実施例２で得られたオリゴヌクレオチドは、５’リン酸化された短鎖ＲＮＡに対しても、５’リン酸を有しない短鎖ＲＮＡと同様に、長鎖ＲＮＡと比較して高い親和性を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するために用いられるハイブリダイゼーションプローブに関する。特には、鎖長１５〜３０ヌクレオチド程度の成熟ｍｉＲＮＡをｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒe−ｍｉＲＮＡから区別して検出するのに用いることのできるハイブリダイゼーションプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は生物のゲノムから転写された、タンパク質をコードしない通常１９〜２３塩基程度、場合によっては１５〜３０塩基程度の鎖長のＲＮＡである。最近の研究により、ｍｉＲＮＡが細胞の発生、分化、癌化などの過程やウイルスの感染プロセスなどに重要な役割を果たしていることが示唆されている。活性な成熟ｍｉＲＮＡの生成機構は以下のとおりである。
【０００３】
まず、ゲノムより転写された１０００塩基程度のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが切断され７０−１００塩基のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが生成する。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが更に切断され、１９〜２３塩基程度の活性な成熟ｍｉＲＮＡが生成する。この成熟ｍｉＲＮＡは標的のメッセンジャーＲＮＡに結合しその翻訳を制御することで、そのメッセンジャーＲＮＡの情報をもとに合成されるタンパク質の発現量の調節を行っている。これらのｍｉＲＮＡの機能を解明し、それらの情報を疾患の診断や治療に応用するためには細胞内に存在する多数のＲＮＡの中から成熟ｍｉＲＮＡを迅速かつ網羅的に検出する技術の開発が必要である。
【０００４】
現在使用されている手法としては、生体内の全ＲＮＡをカラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動で鎖長にしたがって分離し、短鎖ＲＮＡのみを含む画分を溶出した後、ハイブリダイゼーション技術により、短鎖ＲＮＡのみを検出する方法が知られている（非特許文献１）。この方法によれば、サンプル中に長鎖核酸が含まれていないため、短鎖核酸のみを分析することができるが、カラムクロマトグラフィーや電気泳動を行うのに時間やコストがかかること、操作が煩雑なため熟練した技術社でなければ実施が困難であるなどの問題点がある。
【０００５】
また、短鎖ＲＮＡの分子工程を省略するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて短鎖ＲＮＡをプライマーとした場合のみ鎖伸長が可能な酵素反応を用いた核酸の蛍光ラベルを用いる方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法は、複数の酵素反応を用いる方法であるため、操作が煩雑になるという問題がある。
【０００６】
また、非特許文献３には、短いＲＮＡのみに結合するヘアピンプライマーを用いた成熟ｍｉＲＮＡ選択的なＲＴ−ＰＣＲ法が開示されている。しかし、ヘアピンプライマーはそのヘアピン構造の熱力学的安定性を精密にデザインする必要があり、かならずしも汎用的かつ容易に用いることができるものではない。またＲＴ−ＰＣＲでは細胞内に多数存在するｍｉＲＮＡを網羅的に検出することが困難であるためスループットの点では最適な方法ではない。
【０００７】
上記問題の根本原因は、これまでに存在する天然型および非天然型のオリゴヌクレオチドは核酸分子の配列を選択的に認識することはできるが、そのサイズを認識することができない点にある。すなわち、ある配列に相補的なオリゴヌクレオチドはそのターゲットとする配列を一部として含む長い核酸分子にも結合してしまうため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのように成熟ｍｉＲＮＡの配列をその一部に含むＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡとをハイブリダイゼーションにより区別することが困難である。これらの問題点に関する解決法がいくつか提唱されている。
【０００８】
例えば、マイクロアレイ上にヘアピン型のプローブを固定化した成熟ＲＮＡ選択的マイクロアレイが報告されている（非特許文献４）。該文献には、このヘアピンプローブにより短くプロセッシングされた成熟ｍｉＲＮＡのみを認識できると記載されているが、プローーブにヘアピン構造を形成するためには、プローブの鎖長を必要以上に長くしなければならないため、プローブの合成コストを考えた場合最適な手法ではない。また、ヘアピンプライマーが実際にどのくらい成熟ｍｉＲＮＡに選択的に結合するのかといった定量的評価も充分ではない。
また、オリゴヌクレオチドプローブの両末端に立体的に嵩高い置換基を導入して短鎖ＲＮＡのみを検出する方法も報告されている（特許文献１）が、短鎖ＲＮＡに対する結合の選択性が低く実用的な方法ではない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｓ．Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ １１，２４１−２４７，２００５年
【非特許文献２】Ｐ．Ｔ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｊ．Ｃ．Ｏｂｅｒｈｏｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｔｏｂｉａｓ，Ｚ．Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ １．ｐ１５５−１６１，２００４年
【非特許文献３】Ｃ，Ｃｈｅｎ， Ｄ．Ａ．Ｒｉｄｚｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｒｏｏｍｅｒ，Ｚ，Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｂａｒｂｉｓｉｎ，Ｎ．Ｌ．Ｘｕ，Ｖ．Ｒ．Ｍａｈｕｖａｋａｒ，Ｍ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｑ．Ｌａｏ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｕｅｇｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ ３３，ｅ１７９．
【非特許文献４】Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ａ．Ａｃｈ，Ｂ．Ｃｕｒｒｙ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ １３，ｐ１−９，２００７．
【特許文献１】特開２００７−２３８５５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、より効果的な分子デザインにより、簡素な化学修飾のみで優れた短鎖ＲＮＡ選択性を示すことのできる、生産コスト的にも優れた人工オリゴヌクレオチドプローブの開発と、それらを用いた信頼性の高いＲＮＡ検出デバイスの開発が望まれる。
本発明の目的はこれらの課題を解決するオリゴヌクレオチド誘導体とそれらを製造するための化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、オリゴヌクレオチドの末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を用いることにより、上記課題を解決し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩を提供するものである。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、j及びｍは同一であっても異なっていてもよく、1〜１０の整数を表わし、ｋは１〜５０の整数を表わし、Ｘ、Ｙ及びＺは同一であっても異なっていてもよく、水酸基、水素原子、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わす。Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わし、Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表わし、Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わし、Ｗ２は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わす（但し、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。））
【化２】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化３】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化５】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
（中Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化８】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１０、Ｒ１１は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化９】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、好ましくは核酸検出用プローブとして用いられる。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイを提供する。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明は、一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物を提供する。
【化１０】
（式中、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよく、Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わし、Ｂ１は一般式（８）、（９）（１０）又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。）
【化１１】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１２】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１３】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１４】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１５】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１６】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１７】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１８】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しているので、適当な反応条件を設定することにより、短い相補鎖とのみ結合し、長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチド誘導体である。その結果、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸を反応させることにより、加えたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、かつ加えたオリゴヌクレオチドよりも鎖長の短い核酸とのみ結合させ、鎖長の短い核酸の単離、検出、機能制御に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、まず本発明のオリゴヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（１）で表わされる。
【化１９】
【００１５】
上記一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
j及びｍは、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ１〜１０の整数であり、好ましくは１〜５である。ｊ及びｍが１０を超えても、１０以下の場合に比べて効果に差異はないため、上記範囲が適当である。
【００１６】
ｋは１〜５０の整数であり、好ましくは５〜３０である。ｋは、検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ等）の鎖長によって変えることができる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しており、この置換基がアニオンに解離することにより相補鎖ＲＮＡ又は相補鎖ＤＮＡと静電反発が起こり、長い鎖長のものは結合できなくなり、末端部のアニオンとアニオンとの長さのものよりも短いＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖のみが、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができるようになる。従って、検出しようとするｍｉＲＮＡ等の長さによって、ｋの範囲を変動させることが可能である。
【００１７】
Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても、異なっていてもよく、それぞれ水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよいアルコキシ基である。アルコキシ基としては、炭素数が１〜６個のアルコキシ基が好ましく、このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、プロパン−１−イルオキシ基、ブタン−１−イルオキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。また、上記置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。
Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよいアルコキシ基である。アルコキシ基、置換基については、上記Ｘ、Ｙ及びＺについて説明したのと同様である。
【００１８】
Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表す。天然型の核酸塩基としては、例えば、チミン−１−イル、シトシン−１−イル、５−メチル−シトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、アデニン−９−イル、グアニン−９−イルなどが挙げられる。また、非天然型の核酸塩基とは、天然型の核酸塩基の環外酸素原子や環外窒素原子や環内窒素原子や環内炭素原子に置換基を有するなどの化学修飾、または環外酸素原子や環内窒素原子や環内炭素原子が他の原子に置換されるなどの化学修飾、もしくはこれらの化学修飾をともに有する核酸塩基の誘導体を表わし特に限定はされないが、好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アシル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アシルシトシン−１−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられ、特に好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アセチル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アセチルシトシン−１−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられる。また、これらの互変異性体であってもよい。
【００１９】
Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基、又は一般式（２）、一般式（４）一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる置換基を表す。天然型もしくは非天然型の核酸塩基とは、上記Ｂについて説明したのと同様である。
【化２０】
上記一般式（２）において、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【化２１】
上記一般式（３）において、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。また、置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。
【００２０】
【化２２】
上記一般式（４）において、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ２は、炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【００２１】
【化２３】
上記一般式（５）において、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【化２４】
上記一般式（６）において、Ｌ４、Ｌ５は同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。
【００２２】
Ｗ２は、Ｗ１と同様、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表す。天然型もしくは非天然型の核酸塩基、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）については、Ｗ１において説明したものと同様である。 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個が、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも一方の末端に、一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）、又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を有している。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも一方の末端に、カルボン酸アニオン、リン酸アニオン等のアニオンに解離することが可能な置換基が存在する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、少なくとも一方の末端に、少なくとも１個の、アニオンに解離することが可能な置換基があればよく、両方の末端にあってもよい。また、アニオンに解離することが可能な置換基は１個のみでなく、複数個存在してもよい。
なお、一般式（１）におけるＢは、検出しようとする核酸に相補的な配列となるなど、適当な結合力を有する配列を選択することができる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その塩の形態であってもよい。本明細書で用いられる塩とは、本発明のヌクレオチド誘導体中に含まれる一部もしくは全てのリン酸基及びカルボキシル基のプロトンが陽イオンに置き換わった化合物を意味する。陽イオンとしては、例えば、アンモニウム、モノアルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどのアンモニウムイオン類および、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオンなどの金属イオン類が挙げられる。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を有しているので、適当な反応条件を設定することにより、末端部にアニオンが生成する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。
【００２５】
図１に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、適当な反応条件下では、その末端部にアニオンが生成する。ここに、長い相補鎖と短い相補鎖を混合すると、短い相補鎖（ここで、短いとは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の末端のアニオンから他方の末端のアニオンの間の距離よりも短いことを意味する。）は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合する。一方、長い相補鎖においては、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合と相補的な部分を有しているにもかかわらず、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の末端部にアニオンが存在するため、この部分で静電反発が起こり、長い相補鎖は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができない。
【００２６】
このような性質を利用することにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸とを反応させることにより、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、かつ鎖長の短い核酸のみと結合させ、鎖長の短い核酸を単離、検出、機能制御することが可能となる。例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡをＰｒｅ−ｍＲＮＡと区別して検出することが可能となる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸検出プローブとして用いることができる。
なお、適当な反応条件とは、当該技術分野において公知であり、プローブとオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズするための条件を意味する。
【００２７】
なお、上記適当な条件とは、検出しようとするオリゴヌクレオチド、また、本発明のヌクレオチドの塩基配列や塩基組成等により異なるため、一概には規定できないが、一般的な条件としては下記の通りである。
ハイブリダイゼーションは、９６穴又は３８４穴のプラスチックプレート中で実施してもよい。このようなプレートの穴に、本発明のオリゴヌクレオチドを点着させ、次いで、試料を添加してハイブリダイゼーションを行う。又は、後述する、本発明のオリゴヌクレオチドアレイを用いてもよい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃程度の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のオリゴヌクレオチドを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。ハイブリダイゼーションを実施する緩衝液としては、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、当業者に公知の方法、例えばホスホロアミダイト法を用いて製造することができる。ホスホロアミダイト法を実施する際には、後述する、本発明の化合物を用いることにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造することができる。
【００２８】
次に、本発明のオリゴヌクレオチドアレイについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を固相担体上に固定化してなる。本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、特定の塩基配列を有する、短い鎖長（通常、５０塩基以下）のオリゴヌクレオチドを検出するために用いられる。従って、固相担体に固定するオリゴヌクレオチド誘導体の塩基配列は、検出しようとする配列の相補的配列を有するものなど、適当な結合力を有する配列となる。一般に、固相担体に固定化されているオリゴヌクレオチド誘導体は、検出しようとするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションにより特異的結合により結合する。
【００２９】
なお、本明細書において、オリゴヌクレオチドアレイを製造する方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチド を合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを、当該技術分野において公知の適切なリンカーを介して固相担体表面に固定する方法とが知られている。本発明におけるオリゴヌクレオチドアレイは、このいずれの方法でも製造することができる。オン・チップ法としては、例えば光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができるが、この方法に限定されるものではない。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチド を共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９１３，１９９６）。
また、ポーラスガラス、ポリスチレンなどの固相担体にあらかじめオリゴヌクレオチドを固相合成法で合成しておき、その固相担体を接着剤などの適当な方法や物理的手法によりガラス基板上に固定化する方法も含まれる。
【００３０】
用いられる固相担体としては、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。用いられる固相担体としては、例えば、シリコン；微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス；金属；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）等が挙げられる。担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状等、どのような形状のものであってもよい。
【００３１】
上記固相担体は、ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成したものであってもよい。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ、Diamond Like Carbon）とは、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体の総称であり、その混合割合は特に限定されない。ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成する場合、その層の厚みは好ましくは１ｎｍ〜１０μｍである。
【００３２】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に共有結合させるためには、固相担体表面にアミノ基が結合しているものを用いてもよい。従って、担体としては、表面にアミノ基が結合しているか、又はアミノ基を結合することのできるものを用いることが好ましい。
【００３３】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、上述した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上述したように、短い鎖長の相補鎖とのみ結合し、このような短鎖長の相補鎖の機能を制御するために用いることができ、例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡの制御か可能となり、がん、腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、ウイルス感染症、細菌感染症、ヘルペス感染症、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、高血圧、アレルギー性疾患、パーキンソン病、、筋ジストロフィー、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症、ダウン症、アルツハイマー病、筋萎縮症、 ＡＬＳ、 頸髄損傷、 脊髄損傷、 ギランバレー症、ベーチェット病、 膠原病、リウマチなどの治療薬に用いることができる。従って、本発明は、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造することができる。本発明の医薬組成物は、それ自体又は適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等として、又は注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは外用剤等として製造することが出来る。
上記医薬組成物は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、αデンプン、デキストリン等のデンプン類；結晶セルロース；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムの等のケイ酸塩誘導体；燐酸水素カルシウム；炭酸カルシウム；硫酸カルシウム、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカ、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸）、矯味矯臭剤（甘味料、酸味料、香料等）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法により製造することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物を被験者に導入する方法については、コロイド分散系を用いてもよい。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果を奏する。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば特に制限はなく、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系が挙げられる。また、０．２〜０．４μｍのサイズの単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化することができ、オリゴヌクレオチド誘導体がこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質（相転移温度の高いリン脂質が好ましい）を、ステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソームの製造に有用な脂質の具体れとしては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物の投与量は症状や年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、注射の場合には、１回当り下限０．１mg（好適には、５mg）、上限１０００mg（好適には、５００mg）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【００３７】
次に、本発明のホスホロアミダイト化合物について説明する。本発明のホスホロアミダイト化合物は、一般式（７）で表わされる。
【化２５】
上記一般式（７）において、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、具体的には、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基等が挙げられる。Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、具体的には、２−シアノエチル基、メチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、アルキルスルホニルエチル基、アリールスルホニルエチル基等が挙げられる。Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはＲ１４及びＲ１５はイソプロピル基である。また、はＲ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよい。Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わす。置換基を有してもよいアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、２−シアノエチル基、２−メトキシエチル基等が挙げられる。ＲＮＡ２’水酸基の保護基としては、例えば、炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が結合したトリアルキルシリル基、炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が結合したトリアルキルシリルオキシメチル基、２−シアノエチル基、２−シアノエトキシメチル基等が挙げられる。好ましくは、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリルオキシメチル基、２−シアノエチル基、２−シアノエトキシメチル基等である。
【００３８】
上記一般式（７）において、Ｂ１は一般式（８）、（９）、（１０）、又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。
【化２６】
上記一般式（８）において、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ３及びＬ１については、上述した一般式（２）において説明したものと同様である。Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。保護された水酸基、保護されたカルボキシル基とは、水酸基、カルボキシル基が当業者に公知の保護基で保護された基を指す。保護基の具体例を以下に例示するが、本発明に含まれる保護基はこれらに含まれるものではない。水酸基の保護基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、レブリニル基などのアシル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、２,２,２−トリクロローｔ−ブチルオキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基などのトリアルキル基などが挙げることができる。カルボキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、２−シアノエチル基などを挙げることができる。
【００３９】
【化２７】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
Ｒ２３及びＲ２４としては２−シアノエチル基、メチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、アルキルスルホニルエチル基、アリールスルホニルエチル基などがあげられる。
【００４０】
【化２８】
一般式（９）において、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ６及びＬ２については、上述した一般式（４）において説明したものと同様である。Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【００４１】
【化２９】
一般式（１０）において、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。Ｒ８及びＬ３については、上述した一般式（５）において説明したものと同様である。Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【化３０】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わし、上記上記一般式（８）において説明したのと同様である。
【００４２】
本発明の、一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造する際に、３’末端および５’末端のヌクレオチドとして用いられる。一般式（７）で表わされる化合物は、本明細書、特に後述する実施例の記載等を参照することによって、当業者であれば容易に合成することができる。また、本明細書に記載されていない諸条件は当業者が適宜選択することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ホスホロアミダイト化合物の合成
ホスホロアミダイト化合物は、下記合成方法により合成した。
【化３１】
【００４４】
化合物２（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシアデノシン（化合物１、３．０ｇ，６．２５ミリモル）をピリジン６３ｍｌに溶解させた後、クロロ炭酸フェニル（１．７２ｍｌ，１３．８ミリモル）を加え、室温で２時間反応させた。次いで、抽出操作を行わずにトランス−４−アミノシクロヘキサノール（３．６ｇ，３１．３ミリモル）を加え、８５℃で３０分間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させた後、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物２、２．９５ｇ，７６％）を得た。
【化３２】
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ， ５００ ＭＨｚ） δ ０．０８−０．１１ （１２Ｈ， ｍ）， ０．７９−０．９３ （１８Ｈ， ｍ）， １．２６−１．３４ （４Ｈ， ｍ）， １．８２−１．８４ （２Ｈ， ｂｒ）， １．９４−１．９６ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．３３−２．３８ （１Ｈ， ｍ）， ２．９１−２．９６ （１Ｈ， ｍ）， ３．４６−３．４８ （１Ｈ， ｍ）， ３．５５−３．５７ （１Ｈ， ｍ）， ３．６５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ）， ３．７９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ）， ３．８５−３．８８ （１Ｈ， ｍ）， ４．５７ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）， ４．６３−４．６６ （１Ｈ， ｍ）， ６．４０ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）； ８．５２ （１Ｈ， ｓ）， ８．５７ （１Ｈ， ｓ）， ９．３５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ９．５４ （１Ｈ， ｓ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ） δ −５．５， −５．０， −４．８， １７．７， １７．９， ２５．７， ３０．４， ３３．５， ３８．５， ４８．０， ６２．４， ６７．８， ７１．８， ８３．５， ８７．１， １２０．３， １４２．１， １５０．０， １５０．３， １５０．７， １５２．６。
【００４６】
化合物３（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物２（２．２ｇ，３．５５ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ジクロロメタン（脱水）３６ｍｌに溶解させた。ここに、レブリン酸（７２９μｇ，７．０９ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．４６ｇ，７．０９ミリモル）、４−ジメチルアミノピリジン（４３ｍｇ，０．３４ミリモル）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、吸引濾過により析出物を除去して、ジクロロメタンで洗いこみを行った。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物３、１．６２ｇ，６４％） を得た。
【００４７】
【化３３】
【００４８】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ ０．０５−０．０９ （１２Ｈ， ｍ）， ０．８４−０．９０ （１８Ｈ， ｍ）， １．４６−１．５７ （４Ｈ， ｍ）， １．９９−２．０１ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１３−２．１５ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１８ （３Ｈ， ｍ）， ２．４２−２．４６ （１Ｈ， ｍ）， ２．５４−２．５６ （２Ｈ， ｍ）， ２．６１−２．６６ （１Ｈ， ｍ）， ２．７２−２．７５ （２Ｈ， ｍ）， ３．７３−３．７６ （１Ｈ， ｍ）， ３．８３−３．８６ （２Ｈ， ｍ）， ４．００−４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．６１ （１Ｈ， ｍ）， ４．７５−４．７９ （１Ｈ， ｍ）， ６．４４−６．４７ （１Ｈ， ｍ）， ８．３３ （１Ｈ， ｓ）， ８．４９ （１Ｈ， ｓ）， ９．４５−９．４６ （１Ｈ， ｍ）。
【００４９】
化合物４（Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物３（１．５ ｇ，２．０８ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水） ２１ ｍｌに溶解させた。ここにトリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．７０ ｍｌ，１０．４ミリモル）及びトリエチルアミン（１．４４ｍｌ，１０．４ミリモル）を加え、室温で１２時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を展開溶媒としてクロロホルム／メタノールを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物４、７３０ｍｇ，７２％）を得た。
【００５０】
【化３４】
【００５１】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．４５−１．５９ （４Ｈ， ｍ） ２．０１−２．０２ （２Ｈ， ｍ）， ２．１４−２．１６ （２Ｈ， ｍ）， ２．１９ （３Ｈ， ｓ）， ２．３９−２．４３ （１Ｈ， ｍ）， ２．５５−２．５７ （２Ｈ， ｍ）， ２．７４−２．７６ （２Ｈ， ｍ）， ２．９６−３．００ （２Ｈ， ｍ）， ３．８０−３．８４ （２Ｈ， ｍ）， ３．９６−３．９９ （１Ｈ， ｍ）， ４．２３ （１Ｈ， ｓ）， ４．７６−４．８０ （２Ｈ， ｍ）， ５．７４−５．７６ （１Ｈ， ｍ）， ６．４３−６．４５ （１Ｈ， ｍ）， ７．２６ （１Ｈ， ｓ）， ８．２６ （１Ｈ， ｍ）， ８．４８ （１Ｈ， ｓ）， ８．７５ （１Ｈ， ｓ）， ９．４４−９．４８ （１Ｈ， ｍ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２８．４， ２９．８， ３０．０， ３０．４， ３８．１， ４１．１， ４８．３， ６３．３， ７２．１， ７３．１， ８７．５， ８９．５， １２１．９， １４２．８， １４９．４， １５０．７， １５１．０， １５３．５， １７２．４， ２０７．０。
【００５２】
化合物５（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物４（６００ｍｇ，１．２２ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水）１２ ｍｌに溶解させた。ここに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４９７ｍｇ，１．４７ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。メタノールでクエンチした後、クロロホルムで反応溶媒を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物（以下の化学式を有する化合物５、７４１ ｍｇ， ７７％） を得た。
【００５３】
【化３５】
【００５４】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．４５−１．６０ （４Ｈ， ｍ）， ２．０１−２．０３ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１４−２．１８ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．２０ （３Ｈ， ｓ）， ２．５４−２．５８ （３Ｈ， ｍ）， ２．７５ （２Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）， ２．８２−２．８７ （１Ｈ， ｍ）， ３．３６−３．４３ （２Ｈ， ｍ）， ３．７６ （６Ｈ， ｓ）， ３．８４−３．８６ （１Ｈ， ｍ）， ４．１５−４．１８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， ４．６８−４．７１ （１Ｈ， ｍ）， ４．７７−４．８１ （１Ｈ， ｍ）， ６．４７ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ）， ６．７８ （４Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ７．１９−７．３９ （９Ｈ， ｍ）， ８．０９ （１Ｈ， ｓ）， ８．１３ （１Ｈ， ｂｒ）， ８．４３ （１Ｈ， ｓ）， ９．３８ （１Ｈ， ｄ Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２８．５， ２９．８， ３０．０， ３０．４， ３８．１， ４０．３， ４８．２， ５５．３， ６３．８， ７２．２， ７２．５， ８４．６， ８６．３， ８６．７， １１３．３， １２０．９， １２７．１， １２８．０， １２８．２， １３０．１， １３５．７， １４１．１， １４４．６， １５０．０， １５０．４， １５１．１， １５３．３， １５８．７， １７２．４， ２０６．９。
【００５５】
ホスホロアミダイト化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）− Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
化合物５（３５０ｍｇ，０．４４１ミリモル）をピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々３回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）４．４ ｍｌに溶解させた。これにテトラゾール（１９ｍｇ，０．２６４ミリモル）、ジイソプロピルアミン（３７ μｌ，０．２６４ミリモル）及び２−シアノエチル−ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（１５４μｌ，０．４８６ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去した後、酢酸エチル−ジエチルエーテルの混合溶媒に溶解させ、０．２ Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で３回抽出操作を行い、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてクロロホルムを用いてリサイクルＨＰＬＣで精製し、目的物（下記式で表されるホスホロアミダイト化合物、３０３ｍｇ，７７％）を得た。
【化３６】
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ５００ ＭＨｚ） δ １．１２−１．２１ （１２Ｈ， ｍ）， １．４８−１．６０ （４Ｈ， ｍ）， ２．０２−２．０４ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．１５−２．１７ （２Ｈ， ｂｒ）， ２．２０ （３Ｈ， ｓ）， ２．４６−２．４８ （１Ｈ， ｍ）， ２．５６−２．６３ （３Ｈ， ｍ）， ２．７４−２．７７ （２Ｈ， ｍ）， ２．９３−２．９８ （１Ｈ， ｍ）， ３．３５−３．４３ （２Ｈ， ｍ）， ３．６０−３．７５ （４Ｈ， ｍ）， ３．７７ （６Ｈ， ｓ）， ３．８０−３．８６ （１Ｈ， ｍ）， ４．２９−４．３２ （１Ｈ， ｍ）， ４．７８−４．８１ （２Ｈ， ｍ）， ６．４３−６．４６ （１Ｈ， ｍ）， ６．７６−６．７９ （４Ｈ， ｍ）， ７．１８−７．４０ （９Ｈ， ｍ）， ８．２１−８．２４ （１Ｈ， ｍ）， ８．３４−８．３６ （１Ｈ， ｂｒ）， ８．４３ （１Ｈ， ｓ）， ９．４８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ ２０．２， ２０．３， ２０．４， ２０．５， ２４．５， ２４．６， ２４．７， ２８．４， ２９．７， ２９．９， ３０．３， ３８．０， ３９．３， ４３．３， ４３．４， ４８．０， ４８．２， ５５．２， ５５．３， ５８．２， ５８．３， ５８．５， ６３．３， ６３．５， ７２．１， ７３．３， ７３．４， ７４．０， ８４．８， ８６．０， ８６．５， １１３．１， １１７．５， １１７．６， １２１．０， １２６．９， １２７．９， １２８．１， １２８．２， １３０．１， １３５．７， １４１．６， １４４．６， １５０．０， １５０．４， １５１．０， １５３．３， １５８．６， １７２．３， ２０６．７；３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ １４９．７， １４９．８。
【００５７】
実施例２
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＊＊）−３’（配列番号：１）の合成
ここで下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基を表わす。ｄＡ＊、ｄＡ＊＊はそれぞれ下図で示すヌクレオチド残基を表わす。
【化３７】
【００５８】
グレンリサーチ社より購入したユニバーサルサポートＩＩ（１μｍｏｌ）を固相担体として用い、実施例１のホスホロアミダイト化合物、およびグレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルＲＮＡ ホスホロアミダイト試薬を用い、ＡＢＩ−３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機の標準的な１．０μｍｏｌスケールＲＮＡ合成プロトコールにて合成を行った。５’末端のヌクレオチド残基を結合後、オリゴヌクレオチドに対して、５０当量のヒドラジン（ピリジン−酢酸、３：２，Ｖ／Ｖ 溶液）を加え、室温で１５分間放置することにより、Ｌｅｖ基を除去した。
【００５９】
次いで、グレンリサーチ社より購入したホスファリンク試薬（５０当量）を１Ｈ−テトラゾール（５０当量）の存在下反応させ、次いで、常法によりヨウ素酸化と２Ｍ アンモニア／メタノールによる切り出しついで、濃アンモニア水で室温１８時間攪拌した。このアンモニア溶液をＣ１８カートリッジカラムに担持し、副生物を洗浄した後、２％トリフルオロ酢酸水溶液で処理した後、目的物を溶出した。得られた目的物の粗精製物を陰イオン交換ＨＰＬＣで精製して目的物を得た。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
【００６０】
実施例３
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：２）の合成
実施例２と同様の方法により目的物を合成した。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
【００６１】
実施例４
オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＊＊）−３’（配列番号：３）の合成
実施例２と同様の方法により目的物を合成した。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析により確認した。
なお、実施例２で得られたオリゴヌクレオチドは、両末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有しており、実施例３及び実施例で得られたオリゴヌクレオチドは、それぞれ、５’末端、３’末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有している。
【００６２】
実施例５
Ｔｍ測定による鎖長依存的ハイブリダイゼーションの解析
実施例２、実施例３又は実施例４で得られたオリゴヌクレオチドを１０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．１ Ｍ ＮａＣｌ中に、濃度が１．０ μＭになるように調整した。この溶液に、下記長鎖ＲＮＡ（配列番号：４）又は短鎖ＲＮＡ（配列番号：５）を同じく濃度１．０ μＭになるように溶解し、２６０ｎｍでの吸光度の温度依存性を５℃から９０℃まで測定した。得られたＵＶ融解曲線を微分し、その一次微分係数が極大となる温度をＴｍとした。比較として、下記天然型プローブ、および非アニオン性プローブのＴｍも測定した。結果を表１に示す。
【００６３】
長鎖ＲＮＡ（配列番号：４）：３’−ＡＵＵＡＵＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＵＵＡ−５’
短鎖ＲＮＡ（配列番号：５）：３’−ＧＵＵＣＣＡＵＧＡ−５’
天然型プローブ（配列番号：６）：５’−（ｄＣ）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＣ）−３’
非アニオン性プローブ（配列番号：７）：５’−（ｄＡ＃）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＃＃）−３’
ここで、Ａ，Ｕ、Ｇ、Ｃはリボヌクレオチド残基である。下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基である。ｄＡ＃、ｄＡ＃＃はそれぞれ下図に示すヌクレオチド残基を表わす。
【００６４】
【化３８】
【００６５】
【表１】
【００６６】
表１より、以下のことが明らかになった。
プローブの両末端、又は５’末端に、アニオンに解離することが可能な置換基を導入した実施例２、実施例３、実施例４のオリゴヌクレオチドは、長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡに強く結合した。
天然型プローブは、逆に短鎖ＲＮＡよりも長鎖ＲＮＡに強く結合した。
末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有しない、非アニオン性プローブは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡより強く結合したが、その選択性の指標であるΔＴｍ＝＋４は、アニオン性置換基を有する実施例２のΔＴｍ＝９ および実施例３のプローブのΔＴｍ＝＋７よりも小さかった。
以上の結果より、自身よりも鎖長の短いＲＮＡと選択的に結合する核酸プローブとしては本発明の実施例に示したオリゴヌクレオチドの方が、天然型プローブよりも優れていた。また、アニオンを有しないオリゴヌクレオチドと本発明の実施例に示したアニオンを有するオリゴヌクレオチドでは、本発明の実施例に示したオリゴヌクレオチドがも優れていることがわかった。
【００６７】
実施例６
５’末端にリン酸基を有する短鎖ＲＮＡに対する結合能評価
実施例５に示した実験と同様の方法により、実施例２に示すオリゴヌクレオチドが下記の長鎖ＲＮＡ、及び短鎖５’リン酸化ＲＮＡに結合する強度をＴｍ測定により調べた。 なお、短鎖ＲＮＡとしては、５’末端がリン酸化されているものを用いた。結果を表２に示す。
すなわち、短鎖ＲＮＡの５’末端は下記構造を有する。
【化３９】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表２から、実施例２で得られたオリゴヌクレオチドは、５’リン酸化された短鎖ＲＮＡに対しても、５’リン酸を有しない短鎖ＲＮＡと同様に、長鎖ＲＮＡと比較して高い親和性を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、j及びｍは同一であっても異なっていてもよく、1〜１０の整数を表わし、ｋは１〜５０の整数を表わし、Ｘ、Ｙ及びＺは同一であっても異なっていてもよく、水酸基、水素原子、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わす。Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わし、Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表わし、Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わし、Ｗ２は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わす（但し、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化３】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
（式中、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化５】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化８】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１０、Ｒ１１は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化９】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【請求項２】
核酸検出用プローブとして用いられる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物。
【請求項５】
一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物。
【化１０】
（式中、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよく、Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わし、Ｂ１は一般式（８）、（９）（１０）又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。）
【化１１】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１２】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１３】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１４】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１５】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１６】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１７】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１８】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【請求項１】
一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、j及びｍは同一であっても異なっていてもよく、1〜１０の整数を表わし、ｋは１〜５０の整数を表わし、Ｘ、Ｙ及びＺは同一であっても異なっていてもよく、水酸基、水素原子、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わす。Ｖは水素原子、水酸基、又は置換基を有してもよいアルコキシ基を表わし、Ｂは、互いに異なっていてもよい、天然もしくは非天然型の核酸塩基を表わし、Ｗ１は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わし、Ｗ２は、互いに異なっていてもよい、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基を表わす（但し、Ｗ１及びＷ２のうち少なくとも１個は一般式（２）、一般式（４）、一般式（５）又は一般式（６）のいずれかで表わされる基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化３】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
（式中、Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化５】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ９はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化８】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１０、Ｒ１１は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化９】
（式中、Ｑ及びＴは、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わし、Ｒ５は水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【請求項２】
核酸検出用プローブとして用いられる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物。
【請求項５】
一般式（７）で表わされるホスホロアミダイト化合物。
【化１０】
（式中、Ｒ１２は、５’水酸基の保護基を表わし、Ｒ１３はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５は、同一であっても異なっていてもよく、炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｒ１４及びＲ１５が互いに結合して窒素原子とともに、環員数３〜１３個の環を形成してもよく、Ｒ１６は水素原子、置換基を有してもよいアルコキシ基、ＲＮＡ２’水酸基の保護基で保護された水酸基を表わし、Ｂ１は一般式（８）、（９）（１０）又は（１１）のいずれかで表わされる基を表わす。）
【化１１】
（式中、Ｒ３は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１７は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１２】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１３】
（式中Ｒ６は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１８は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１４】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１５】
（式中、Ｒ８は水素又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ１９は、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１６】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【化１７】
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ２０、Ｒ２１は互いに同一であっても異なっていてもよく、一般式（１２）で表わされる置換基、保護された水酸基、保護されたカルボキシル基、末端に保護されたカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に一般式（１２）で表わされる置換基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、末端に保護された水酸基を有する炭素数1〜６個のアルキル基を表わす。）
【化１８】
（式中、Ｒ２３及びＲ２４は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、リン酸基の保護基を表わす。）
【図１】
【公開番号】特開２００９−１９０９８３（Ｐ２００９−１９０９８３Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０３７２（Ｐ２００８−３０３７２）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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