プロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤
【課題】十分なプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を発揮し、高い整肌効果を有するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を提供する。
【解決手段】ミロバランの果実の抽出物を有効成分とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。ケブラニン類（ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群より選択される１種又は２種以上）又はその塩を有効成分とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【解決手段】ミロバランの果実の抽出物を有効成分とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。ケブラニン類（ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群より選択される１種又は２種以上）又はその塩を有効成分とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤に関し、詳しくは、皮膚の保湿に大きく関与する天然保湿因子の基となるフィラグリンの産生を促進し、皮膚中に十分な天然保湿因子を保持し、肌荒れ及び乾燥肌を防止するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮と真皮からなり、表面に存在する表皮によって水分の蒸散や異物の浸入を防止している。しかしながら、加齢等の内的因子および冬場等の極度の低湿度環境等の外的因子により、皮膚の乾燥を招き、そのことが肌荒れ、シワの原因となっていた。
【０００３】
皮膚の乾燥の原因としては、種々の要因があるが、その１つとして表皮中に存在する天然保湿因子（以下、「ＮＭＦ」とも称す）の減少がある。ＮＭＦとは、アミノ酸類、ピロリドンカルボン酸（及びその塩）、尿素、ミネラル塩類及び有機酸（及びその塩）等であり（非特許文献１）、これらの減少により皮膚中の水分を維持できず、皮膚が乾燥する。
【０００４】
そこで、ＮＭＦの低下による乾燥を防ぐための従来の技術として、ＮＭＦを構成している遊離アミノ酸やアミノ酸代謝物、また油剤を塗布することが知られている。
【０００５】
また、近年、皮膚の乾燥の要因として、プロフィラグリン及びフィラグリンが注目されている。プロフィラグリンは、巨大なリン酸化された蛋白質で、内部に複数のフィラグリン配列を含み、顆粒細胞で合成されて、ケラトヒアリン顆粒内に蓄積するが、角質細胞に変化する時点で脱リン酸化、蛋白分解を受けてフィラグリン分子に変化するフィラグリン生合成の前駆体である（非特許文献２）。一方、フィラグリンは、表皮の顆粒細胞で産生される塩基性蛋白質の一種で、分子量は約４０ｋＤａであり（非特許文献１）、ケラチン繊維を凝集させる働きがあり、コンパクトな角質細胞を形成し、さらに、角質層の上層では分解されてアミノ酸とその誘導体となりＮＭＦとしての機能も示す。また、遺伝性の角化異常疾患である尋常性魚鱗癬では、フィラグリンの発現が顕著に低下しており、その結果、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中アミノ酸の低下、角層水分量の低下やスケーリングなどの異常を示すことが知られている（非特許文献２）。
【０００６】
さらに、非特許文献３にはミロバラン（Terminalia chebula）の葉のアルコール抽出物が創傷治癒に対して、効果があることが報告されており、ラットを用いたin vivoの試験において、上皮化を有意に促進し、肉芽組織中のたんぱく質、ＤＮＡ、コラーゲン成分の有意な増加が観察されたことが示されている。なお、ミロバランの葉からはケブラグ酸、ケブリン酸、コリラギン、没食子酸が単離されたとの報告もなされている（非特許文献４参照）。
【０００７】
さらにまた、特許文献１には、ミロバランの果実のアルコール抽出物がコラーゲン合成促進効果を有することが開示されている。
【特許文献１】特開２００６−２６５１２０号公報
【非特許文献１】化粧品辞典,p614、716(2003)
【非特許文献２】皮膚科学,p34(2006)
【非特許文献３】Phytother.Res,16,p227(2002)
【非特許文献４】Bull.CentralLeather Res.Inst.,8,p230(1961)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
遊離アミノ酸、アミノ酸代謝物、または油剤を塗布する方法は、皮膚の表面を覆うことなどにより角層中の水分の蒸発を防ぐことができるが、その効果の持続性は期待できないものであった。
【０００９】
また、プロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生が促進できれば、ＮＭＦ成分の減少を恒常的に解消でき、皮膚の乾燥を防ぐことができるが、未だ十分なプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果を有するものが得られていないのが現状である。
【００１０】
さらに、ミロバランの果実のアルコール抽出物がコラーゲン合成促進効果を有することは知られているものの、作用・機能が異なるプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果については全く知られておらず、その効果については不明であった。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、十分なプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を発揮し、高い整肌効果を有するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ミロバラン（Terminalia chebula）の果実（訶子）の抽出物が表皮中に存在しＮＭＦの基となるプロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生機能を有する細胞を直接活性化させることにより肌本来の機能を高め、ミロバラン（Terminaliachebula）の果実（訶子）の抽出物中に多く含有される成分にプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用が認められ、それらの活性成分は共通の構造を有することを見出した。即ち、プロフィラグリン及び／又はフィラグリン量を増加させることによりＮＭＦが増加し、角層中に十分なＮＭＦを確保することができ、肌の乾燥を内側から解決し、潤いのある肌を保つことができる素材を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ミロバランの果実の抽出物（以下、「ミロバラン果実抽出物」と称す）を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１５】
さらに、前記ケブラニン類が、ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群から選択される１種又は２種以上であることが、好ましい。
【００１６】
さらにまた、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は皮膚外用剤として好適に使用することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤により、プロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生を効果的に促進することができる。また、高い整肌効果を有するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を提供することができた。さらに、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリング等の尋常性魚鱗癬に伴う症状の改善が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適実施形態につき具体的に説明する。
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ミロバラン果実抽出物を有効成分とするものであるが、ミロバラン果実抽出物は常法により得ることができ、例えば、ミロバランの果実を抽出溶媒と共に浸漬または加熱還流した後、濾過し、得られた抽出液をそのまま、又はこれを濃縮して得ることができる。また、濃縮または乾燥させた抽出物を、再度溶媒に溶解させて用いることもできる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水や、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、アセトン、メタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒が挙げられ、それらから選ばれる何れか１種、または任意に組み合わせた２種以上を使用することができる。抽出の条件は特に限定されないが、例えば、ミロバランの果実１重量部に対し、溶媒２〜１００重量部、その際の抽出時の温度及び時間は、０〜１００℃の温度で１０分〜１週間とすることができる。
【００１９】
本発明の他のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０、好ましくは７〜１５のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とするものである。ケブラニン類またはその塩としては、上記一般式（１）の骨格を有するものであれば、特に限定されないが、Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、水素原子、３つの水酸基を有するベンゾイル基、または３つの水酸基を有するベンゾイル基同士が結合して、環状基を形成しているもの等を挙げることができる。
【００２０】
かかるケブラニン類またはその塩は、植物からの抽出、単離、または既知の方法による合成により得ることができる。特に、上記の方法によりミロバランの果実からミロバラン果実抽出物を得た後、単離することにより、好適に得ることができる。単離方法は特に制限されるものではないが、液−液分配、各種クロマトグラフィー、再結晶化などの手法により好適に単離することができる。このようにして得られたミロバラン果実抽出物およびミロバラン果実抽出物中の上記一般式（１）の骨格を有するケブラニン類またはその塩は、優れたプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を有する。本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品等の各種分野において利用することができる。
【００２１】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、好ましくは、ケブラニン類が、ケブラグ酸（chebulagic acid）、ケブリン酸（chebulinic acid）及びケブラニン（chebulanin）からなる群から選択される１種又は２種以上であり、さらに好ましくは、高いプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を示し、かつ含有量の多いケブリン酸およびケブラニンである。それぞれの成分は上記の方法により得ることができる。このようにして得られたミロバラン果実抽出物およびミロバラン果実抽出物のそれぞれの含有成分は、優れたプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を有する。
【００２２】
上記本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を皮膚外用剤として使用する場合、ミロバラン果実抽出物、上記一般式（１）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩、ならびにミロバラン果実抽出物の含有成分であるケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニン（以下、「ミロバラン果実抽出物等」と称す）の配合量は、有効成分の種類、剤型等によっても異なるが、通常、好ましくは総量として外用剤全量中に乾燥重量として０．０００１〜５％、より好ましくは０．００１〜０．１％である。この範囲を下回るとプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果が十分に発揮され難く、この範囲を超えて配合すると効果の上昇が期待できず、経済性に欠ける他、べたつき、生薬特有のにおい、使用感の低下、生薬による染着の問題などが起こるので好ましくない。
【００２３】
本発明において、皮膚外用剤には、上記ミロバラン果実抽出物等に加えて、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧料や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の成分、例えば、保湿剤、油性成分、界面活性剤、ビタミン類、蛋白分解酵素、増粘剤、防腐剤、粉体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、乳化剤、アルコール類、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２４】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、ソルビット、マンニット等の糖アルコール、ヒアルロン酸塩、コンドロイチン硫酸塩、キトサン等の水溶性高分子、尿素、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸塩等が挙げられる。
【００２５】
油性成分としては、例えば、大豆油、ヌカ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ脂、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸グリセリド等の合成グリセリド、ジグリセリド等の油脂類、ホホバ油、カルナウバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、プリスタン等の炭化水素類、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等の高級脂肪酸類、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール、ホホバアルコール等の高級アルコール類、オクタン酸セチル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール等のエステル類、精油類およびシリコーン油類が挙げられる。
【００２６】
界面活性剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、ショ糖脂肪酸エステル、高級脂肪酸アルカノールアミド等の非イオン性界面活性剤、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、分岐鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルケニル硫酸塩、エチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル型界面活性剤、タウリン型界面活性剤、アマイドエーテルサルフェート型界面活性剤等の陰イオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型、アミノカルボン酸、スルホベタイン型等の両性界面活性剤および４級アンモニウム塩等の陽イオン性界面活性剤が挙げられるが、安全性の面から非イオン性界面活性剤が特に好ましい。
【００２７】
ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ビタミンＵ、カルニチン、フェルラ酸、γ−オリザノール、リポ酸、オロット酸及びその誘導体等が挙げられる。蛋白分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パパイン、ブロメライン、フィシン及び細菌、酵母、カビ由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００２８】
増粘剤としては、例えば、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カラギーナン、ゼラチン、キサンタンガム、ポリアクリル酸塩等の水溶性高分子化合物、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩が挙げられる。防腐剤としては、例えば、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。粉体としては、例えば、タルク、セリサイト、マイカ、カオリン、シリカ、ベントナイト、バーミキュライト、亜鉛華、雲母、雲母チタン、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、ベンガラ、酸化鉄、群青等が挙げられる。その他の成分としては、香料、色素、殺菌剤等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明の皮膚外用剤は、化粧料、入浴剤、洗浄料、洗顔料等に用いることができ、剤型は任意であり、例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、分散液、ゲル状、粉体、エアゾール、パックなどにすることができる。
【００３０】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、尋常性魚鱗癬改善剤として使用することが好ましい。この場合には、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリングを抑制でき、遺伝性の角化異常疾患である尋常性魚鱗癬の改善が可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に従い、詳細に説明する。
実験例１
ミロバラン果実抽出物の調製例
ミロバランの果実（乾燥品）２０ｇに３０％エタノール２００ｍＬを加えて２時間加熱し、放冷した。放冷後、濾過を行い、濾液を減圧乾固した。その結果、７．６１ｇのミロバラン果実抽出末を得ることができた。また、別に、６０％アセトンにて室温抽出して得たミロバラン果実抽出物５０．２８ｇから不溶物を濾去した後、SephadexLH-20（ファルマシア製）、MCI gelCHP20P（三菱化学（株）製）やセルロース、ODSゲルを用いた各種カラムクロマトグラフィーに付すことにより分離精製した結果、下記の表１に示す収量にてケブラグ酸、ケブリン酸、ケブラニン、プニカラギン（punicalagin）、没食子酸（gallic acid）およびコリラギン（corilagin）が得られた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実験例２
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用確認試験
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（NHEK）を８０ｃｍ２のフラスコで、正常ヒト表皮角化細胞培地（KGM）にて３７℃、５％CO2下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬになるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して５％CO2下、３７℃で４日間培養した。培養後、０．２５％DMSOに溶解した試験試料を含む又は含まない（コントロール）KGM２ｍＬに交換し、３７℃、５％CO2下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
【００３４】
（ウエスタンブロッティング）
１０μｇ／laneに調整したサンプルをSDS-PAGEにより展開し、PVDF膜に転写した。５％スキムミルクを含むPBS（-）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（HarborBioProducts社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Whole Ab）（AmershamBiosciences社製）、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を０．１％Tween20、０．３％スキムミルクを含むPBS（-）で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Westernblotting detection reagents and analysis system（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをKODAK 1DImage Analysis Software EDAS290 Version3.5にて定量的に測定した。
【００３５】
実施例１〜３及び比較例１〜３
試験試料としては、実施例として、ミロバラン果実抽出末（実施例１）、ミロバラン果実抽出物の主要な含有物質であるケブラグ酸（実施例２）及びケブラニン（実施例３）、比較例として、プニカラギン（比較例１）、没食子酸（比較例２）及びコリラギン（比較例３）を用い、各試料を２５μｇ／ｍＬの濃度に調整し、使用した。
【００３６】
実施例４、５及び比較例４〜６
試験試料としては、実施例として、ミロバラン果実抽出末（実施例４）及びケブリン酸（実施例５）、比較例として、プニカラギン（比較例４）、没食子酸（比較例５）及びコリラギン（比較例６）を用い、各試料を６．２５μｇ／ｍＬの濃度に調整し、使用した。
【００３７】
結果は、試験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのバンド強度（Netintensity）を用いて、試験試料のプロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用を評価した。
【００３８】
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用の計算方法は以下の計算式に従い、濃度２５μｇ／ｍＬの結果を表２に、濃度６．２５μｇ／ｍＬの結果を表３に示す。
計算式
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
（式中、Ａは被験試料添加時のバンド強度であり、Ｂは被験試料無添加時（コントロール）のバンド強度である）
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
上記表２および表３より、実施例すべてにおいて有意にプロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用を示し、特に、ミロバランの果実抽出末（実施例１、４）、ケブラニン（実施例３）およびケブリン酸（実施例５）で、その効果が顕著であった。
【００４２】
実験例３
皮膚外用剤（クリーム製剤）の調製例
実験例１で得られたミロバラン果実抽出末を、５０％ブタノール水溶液に溶解し、２％ミロバラン抽出液を得た。これを使用し、下記表４の処方（重量％）に従い、下記の製造例に準拠し、ミロバラン果実抽出液０．５％配合ハンドクリーム製剤（以下、「ミロバラン配合クリーム」という）を調製した。
【００４３】
まず、流動パラフィン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、ジメチルポリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ブチルパラベン、モノステアリン酸デカグリセリル、酢酸トコフェロールを混合し、加熱した。次に、メチルパラベン、１,３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、濃グリセリン、エデト酸２ナトリウム、トリエタノールアミン、精製水を混合し加熱し、先の混合物に加え乳化させた。冷却後、フェノキシエタノール、グリチルリチン酸ジカリウム、香料、２％ミロバラン果実抽出液を添加することによりハンドクリームを調製した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
下記表５の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、添加相を添加することによりｐＨ６．１のミロバラン果実抽出物配合ボディクリーム（１）を調製した。
【００４６】
【表５】
【００４７】
下記表６の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、添加相を添加することによりｐＨ７．５のミロバラン果実抽出物配合ボディクリーム（２）を調製した。
【００４８】
【表６】
【００４９】
下記表７の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、微細に粉砕した粉体相および添加相を添加することによりＳＰＦ２０のミロバラン果実抽出物配合日焼け止めクリームを調製した。
【００５０】
【表７】
【００５１】
実験例４
入浴剤の調製例
下記表８の処方（重量％）に従い、すべての原料を均一に混合することによりミロバラン果実抽出物配合粉体入浴剤を調製した。
【００５２】
【表８】
【００５３】
下記表９の処方（重量％）に従い、Ａ相およびＢ相を７０℃に加熱し完全溶解させ、Ａ相をＢ相に添加後、３０℃まで冷却することによりミロバラン果実抽出物配合液状入浴剤を調製した。
【００５４】
【表９】
【００５５】
実験例５
化粧水の調製例
下記表１０の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し原液を調整し、その原液を缶に入れ、ＬＰＧ、ブタン等のガスを充填することによりミロバラン果実抽出物配合化粧水（エアゾール製品）を調製した。
【００５６】
【表１０】
【００５７】
下記表１１の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し、可溶化させることによりｐＨ５．５のミロバラン果実抽出物配合弱酸性化粧水（透明タイプ）を調製した。
【００５８】
【表１１】
【００５９】
下記表１２の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し、乳化させることによりｐＨ７．５のミロバラン果実抽出物配合化粧水（白濁タイプ）を調製した。
【００６０】
【表１２】
【００６１】
下記表１３の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加して可溶化させた後、粉体相を添加することによりｐＨ６．２の３層型のミロバラン果実抽出物配合化粧水（分離型タイプ）を調製した。
【００６２】
【表１３】
【００６３】
実験例６
トニックの調製例
下記表１４の処方（重量％）に従い、まず、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、パントテニルアルコール、グリチルレチン酸、エタノール（９９．５％）、ミリスチン酸オクチルドデシル、２−エチルヘンキサン酸オクチル、香料、メントールを均一に混合した。次に、センブリ抽出液、ニンジン抽出液、1，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、エデト酸４ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ.Ｏ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ.Ｏ）、２％ミロバラン果実抽出液、精製水を均一に混合した。最後に両者を混合し、濾過して充填することによりミロバラン果実抽出物配合液状型トニックを調製した。
【００６４】
【表１４】
【００６５】
下記表１５の処方（重量％）に従い、まず、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、パントテニルアルコール、エタノール（９９．５％）、香料、メントールを均一に混合した。次に、センブリ抽出液、ニンジン抽出液、ジプロピレングリコール、３−メチル−１，３−ブタンジオール、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、エデト酸４ナトリウム、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノラウリン酸デカグリセリル、２％ミロバラン果実抽出液、精製水を均一に混合した。次に両者を混合し、濾過して原液とし、最後に、原液と噴射剤を充填処方に合わせて、缶に充填することによりミロバラン果実抽出物配合エアゾール型トニックを調製した。
【００６６】
【表１５】
【００６７】
実験例７
皮膚外用剤としての適用例
実験例３にて得られたミロバラン果実抽出液０．５％配合クリーム製剤および比較例として基剤のみをそれぞれ、３０歳女性の左右の手背（手の甲）に１日３回、大豆大程度を塗布し、塗布前と１ヶ月間後の肌のツヤ、ハリ、柔軟性、カサカサ感、くすみ感、キメおよびシワを下記の評価基準に従い評価した。
【００６８】
（評価基準）
ツヤ、ハリ、柔軟性：「ない（１）、あまりない（２）、どちらともいえない（３）、ややある（４）、ある（５）」
カサカサ感：「カサカサする（１）、ややカサカサする（２）、どちらともいえない（３）、ややしっとりする（４）、しっとりする（５）」
くすみ感：「ある（１）、ややある（２）、どちらともいえない（３）、あまりない（４）、ない（５）」
キメ：「あらい（１）、ややあらい（２）、どちらともいえない（３）、やや細かい（４）、細かい（５）」
シワ：「目立つ（１）、やや目立つ（２）、どちらともいえない（３）、あまり目立たない（４）、目立たない（５）」
【００６９】
評価結果より、塗布前および基剤のみの塗布と比較して明らかに、ミロバラン果実抽出物は、ツヤ、ハリ、柔軟性、カサカサ感、くすみ感、キメおよびシワのいずれの項目においても良好な効果を示し、基剤のみと比較して、ミロバラン果実抽出物を含有する皮膚外用剤を使用した場合には、キメが細かく整う整肌効果を有していた。また、保湿力およびハリが向上し、くすみがなくなった。さらに、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリング等の尋常性魚鱗癬に伴う症状の改善への可能性を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤に関し、詳しくは、皮膚の保湿に大きく関与する天然保湿因子の基となるフィラグリンの産生を促進し、皮膚中に十分な天然保湿因子を保持し、肌荒れ及び乾燥肌を防止するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮と真皮からなり、表面に存在する表皮によって水分の蒸散や異物の浸入を防止している。しかしながら、加齢等の内的因子および冬場等の極度の低湿度環境等の外的因子により、皮膚の乾燥を招き、そのことが肌荒れ、シワの原因となっていた。
【０００３】
皮膚の乾燥の原因としては、種々の要因があるが、その１つとして表皮中に存在する天然保湿因子（以下、「ＮＭＦ」とも称す）の減少がある。ＮＭＦとは、アミノ酸類、ピロリドンカルボン酸（及びその塩）、尿素、ミネラル塩類及び有機酸（及びその塩）等であり（非特許文献１）、これらの減少により皮膚中の水分を維持できず、皮膚が乾燥する。
【０００４】
そこで、ＮＭＦの低下による乾燥を防ぐための従来の技術として、ＮＭＦを構成している遊離アミノ酸やアミノ酸代謝物、また油剤を塗布することが知られている。
【０００５】
また、近年、皮膚の乾燥の要因として、プロフィラグリン及びフィラグリンが注目されている。プロフィラグリンは、巨大なリン酸化された蛋白質で、内部に複数のフィラグリン配列を含み、顆粒細胞で合成されて、ケラトヒアリン顆粒内に蓄積するが、角質細胞に変化する時点で脱リン酸化、蛋白分解を受けてフィラグリン分子に変化するフィラグリン生合成の前駆体である（非特許文献２）。一方、フィラグリンは、表皮の顆粒細胞で産生される塩基性蛋白質の一種で、分子量は約４０ｋＤａであり（非特許文献１）、ケラチン繊維を凝集させる働きがあり、コンパクトな角質細胞を形成し、さらに、角質層の上層では分解されてアミノ酸とその誘導体となりＮＭＦとしての機能も示す。また、遺伝性の角化異常疾患である尋常性魚鱗癬では、フィラグリンの発現が顕著に低下しており、その結果、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中アミノ酸の低下、角層水分量の低下やスケーリングなどの異常を示すことが知られている（非特許文献２）。
【０００６】
さらに、非特許文献３にはミロバラン（Terminalia chebula）の葉のアルコール抽出物が創傷治癒に対して、効果があることが報告されており、ラットを用いたin vivoの試験において、上皮化を有意に促進し、肉芽組織中のたんぱく質、ＤＮＡ、コラーゲン成分の有意な増加が観察されたことが示されている。なお、ミロバランの葉からはケブラグ酸、ケブリン酸、コリラギン、没食子酸が単離されたとの報告もなされている（非特許文献４参照）。
【０００７】
さらにまた、特許文献１には、ミロバランの果実のアルコール抽出物がコラーゲン合成促進効果を有することが開示されている。
【特許文献１】特開２００６−２６５１２０号公報
【非特許文献１】化粧品辞典,p614、716(2003)
【非特許文献２】皮膚科学,p34(2006)
【非特許文献３】Phytother.Res,16,p227(2002)
【非特許文献４】Bull.CentralLeather Res.Inst.,8,p230(1961)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
遊離アミノ酸、アミノ酸代謝物、または油剤を塗布する方法は、皮膚の表面を覆うことなどにより角層中の水分の蒸発を防ぐことができるが、その効果の持続性は期待できないものであった。
【０００９】
また、プロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生が促進できれば、ＮＭＦ成分の減少を恒常的に解消でき、皮膚の乾燥を防ぐことができるが、未だ十分なプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果を有するものが得られていないのが現状である。
【００１０】
さらに、ミロバランの果実のアルコール抽出物がコラーゲン合成促進効果を有することは知られているものの、作用・機能が異なるプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果については全く知られておらず、その効果については不明であった。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、十分なプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を発揮し、高い整肌効果を有するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ミロバラン（Terminalia chebula）の果実（訶子）の抽出物が表皮中に存在しＮＭＦの基となるプロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生機能を有する細胞を直接活性化させることにより肌本来の機能を高め、ミロバラン（Terminaliachebula）の果実（訶子）の抽出物中に多く含有される成分にプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用が認められ、それらの活性成分は共通の構造を有することを見出した。即ち、プロフィラグリン及び／又はフィラグリン量を増加させることによりＮＭＦが増加し、角層中に十分なＮＭＦを確保することができ、肌の乾燥を内側から解決し、潤いのある肌を保つことができる素材を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ミロバランの果実の抽出物（以下、「ミロバラン果実抽出物」と称す）を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１５】
さらに、前記ケブラニン類が、ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群から選択される１種又は２種以上であることが、好ましい。
【００１６】
さらにまた、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は皮膚外用剤として好適に使用することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤により、プロフィラグリン及び／又はフィラグリンの産生を効果的に促進することができる。また、高い整肌効果を有するプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を提供することができた。さらに、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリング等の尋常性魚鱗癬に伴う症状の改善が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適実施形態につき具体的に説明する。
本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、ミロバラン果実抽出物を有効成分とするものであるが、ミロバラン果実抽出物は常法により得ることができ、例えば、ミロバランの果実を抽出溶媒と共に浸漬または加熱還流した後、濾過し、得られた抽出液をそのまま、又はこれを濃縮して得ることができる。また、濃縮または乾燥させた抽出物を、再度溶媒に溶解させて用いることもできる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水や、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、アセトン、メタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒が挙げられ、それらから選ばれる何れか１種、または任意に組み合わせた２種以上を使用することができる。抽出の条件は特に限定されないが、例えば、ミロバランの果実１重量部に対し、溶媒２〜１００重量部、その際の抽出時の温度及び時間は、０〜１００℃の温度で１０分〜１週間とすることができる。
【００１９】
本発明の他のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０、好ましくは７〜１５のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とするものである。ケブラニン類またはその塩としては、上記一般式（１）の骨格を有するものであれば、特に限定されないが、Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、水素原子、３つの水酸基を有するベンゾイル基、または３つの水酸基を有するベンゾイル基同士が結合して、環状基を形成しているもの等を挙げることができる。
【００２０】
かかるケブラニン類またはその塩は、植物からの抽出、単離、または既知の方法による合成により得ることができる。特に、上記の方法によりミロバランの果実からミロバラン果実抽出物を得た後、単離することにより、好適に得ることができる。単離方法は特に制限されるものではないが、液−液分配、各種クロマトグラフィー、再結晶化などの手法により好適に単離することができる。このようにして得られたミロバラン果実抽出物およびミロバラン果実抽出物中の上記一般式（１）の骨格を有するケブラニン類またはその塩は、優れたプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を有する。本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品等の各種分野において利用することができる。
【００２１】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、好ましくは、ケブラニン類が、ケブラグ酸（chebulagic acid）、ケブリン酸（chebulinic acid）及びケブラニン（chebulanin）からなる群から選択される１種又は２種以上であり、さらに好ましくは、高いプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を示し、かつ含有量の多いケブリン酸およびケブラニンである。それぞれの成分は上記の方法により得ることができる。このようにして得られたミロバラン果実抽出物およびミロバラン果実抽出物のそれぞれの含有成分は、優れたプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進作用を有する。
【００２２】
上記本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤を皮膚外用剤として使用する場合、ミロバラン果実抽出物、上記一般式（１）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩、ならびにミロバラン果実抽出物の含有成分であるケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニン（以下、「ミロバラン果実抽出物等」と称す）の配合量は、有効成分の種類、剤型等によっても異なるが、通常、好ましくは総量として外用剤全量中に乾燥重量として０．０００１〜５％、より好ましくは０．００１〜０．１％である。この範囲を下回るとプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進効果が十分に発揮され難く、この範囲を超えて配合すると効果の上昇が期待できず、経済性に欠ける他、べたつき、生薬特有のにおい、使用感の低下、生薬による染着の問題などが起こるので好ましくない。
【００２３】
本発明において、皮膚外用剤には、上記ミロバラン果実抽出物等に加えて、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧料や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の成分、例えば、保湿剤、油性成分、界面活性剤、ビタミン類、蛋白分解酵素、増粘剤、防腐剤、粉体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、乳化剤、アルコール類、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２４】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、ソルビット、マンニット等の糖アルコール、ヒアルロン酸塩、コンドロイチン硫酸塩、キトサン等の水溶性高分子、尿素、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸塩等が挙げられる。
【００２５】
油性成分としては、例えば、大豆油、ヌカ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ脂、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸グリセリド等の合成グリセリド、ジグリセリド等の油脂類、ホホバ油、カルナウバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、プリスタン等の炭化水素類、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等の高級脂肪酸類、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール、ホホバアルコール等の高級アルコール類、オクタン酸セチル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール等のエステル類、精油類およびシリコーン油類が挙げられる。
【００２６】
界面活性剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、ショ糖脂肪酸エステル、高級脂肪酸アルカノールアミド等の非イオン性界面活性剤、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、分岐鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルケニル硫酸塩、エチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル型界面活性剤、タウリン型界面活性剤、アマイドエーテルサルフェート型界面活性剤等の陰イオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型、アミノカルボン酸、スルホベタイン型等の両性界面活性剤および４級アンモニウム塩等の陽イオン性界面活性剤が挙げられるが、安全性の面から非イオン性界面活性剤が特に好ましい。
【００２７】
ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ビタミンＵ、カルニチン、フェルラ酸、γ−オリザノール、リポ酸、オロット酸及びその誘導体等が挙げられる。蛋白分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パパイン、ブロメライン、フィシン及び細菌、酵母、カビ由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００２８】
増粘剤としては、例えば、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カラギーナン、ゼラチン、キサンタンガム、ポリアクリル酸塩等の水溶性高分子化合物、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩が挙げられる。防腐剤としては、例えば、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。粉体としては、例えば、タルク、セリサイト、マイカ、カオリン、シリカ、ベントナイト、バーミキュライト、亜鉛華、雲母、雲母チタン、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、ベンガラ、酸化鉄、群青等が挙げられる。その他の成分としては、香料、色素、殺菌剤等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明の皮膚外用剤は、化粧料、入浴剤、洗浄料、洗顔料等に用いることができ、剤型は任意であり、例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、分散液、ゲル状、粉体、エアゾール、パックなどにすることができる。
【００３０】
また、本発明のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤は、尋常性魚鱗癬改善剤として使用することが好ましい。この場合には、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリングを抑制でき、遺伝性の角化異常疾患である尋常性魚鱗癬の改善が可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に従い、詳細に説明する。
実験例１
ミロバラン果実抽出物の調製例
ミロバランの果実（乾燥品）２０ｇに３０％エタノール２００ｍＬを加えて２時間加熱し、放冷した。放冷後、濾過を行い、濾液を減圧乾固した。その結果、７．６１ｇのミロバラン果実抽出末を得ることができた。また、別に、６０％アセトンにて室温抽出して得たミロバラン果実抽出物５０．２８ｇから不溶物を濾去した後、SephadexLH-20（ファルマシア製）、MCI gelCHP20P（三菱化学（株）製）やセルロース、ODSゲルを用いた各種カラムクロマトグラフィーに付すことにより分離精製した結果、下記の表１に示す収量にてケブラグ酸、ケブリン酸、ケブラニン、プニカラギン（punicalagin）、没食子酸（gallic acid）およびコリラギン（corilagin）が得られた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実験例２
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用確認試験
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（NHEK）を８０ｃｍ２のフラスコで、正常ヒト表皮角化細胞培地（KGM）にて３７℃、５％CO2下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬになるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して５％CO2下、３７℃で４日間培養した。培養後、０．２５％DMSOに溶解した試験試料を含む又は含まない（コントロール）KGM２ｍＬに交換し、３７℃、５％CO2下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
【００３４】
（ウエスタンブロッティング）
１０μｇ／laneに調整したサンプルをSDS-PAGEにより展開し、PVDF膜に転写した。５％スキムミルクを含むPBS（-）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（HarborBioProducts社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Whole Ab）（AmershamBiosciences社製）、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を０．１％Tween20、０．３％スキムミルクを含むPBS（-）で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Westernblotting detection reagents and analysis system（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをKODAK 1DImage Analysis Software EDAS290 Version3.5にて定量的に測定した。
【００３５】
実施例１〜３及び比較例１〜３
試験試料としては、実施例として、ミロバラン果実抽出末（実施例１）、ミロバラン果実抽出物の主要な含有物質であるケブラグ酸（実施例２）及びケブラニン（実施例３）、比較例として、プニカラギン（比較例１）、没食子酸（比較例２）及びコリラギン（比較例３）を用い、各試料を２５μｇ／ｍＬの濃度に調整し、使用した。
【００３６】
実施例４、５及び比較例４〜６
試験試料としては、実施例として、ミロバラン果実抽出末（実施例４）及びケブリン酸（実施例５）、比較例として、プニカラギン（比較例４）、没食子酸（比較例５）及びコリラギン（比較例６）を用い、各試料を６．２５μｇ／ｍＬの濃度に調整し、使用した。
【００３７】
結果は、試験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのバンド強度（Netintensity）を用いて、試験試料のプロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用を評価した。
【００３８】
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用の計算方法は以下の計算式に従い、濃度２５μｇ／ｍＬの結果を表２に、濃度６．２５μｇ／ｍＬの結果を表３に示す。
計算式
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
（式中、Ａは被験試料添加時のバンド強度であり、Ｂは被験試料無添加時（コントロール）のバンド強度である）
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
上記表２および表３より、実施例すべてにおいて有意にプロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用を示し、特に、ミロバランの果実抽出末（実施例１、４）、ケブラニン（実施例３）およびケブリン酸（実施例５）で、その効果が顕著であった。
【００４２】
実験例３
皮膚外用剤（クリーム製剤）の調製例
実験例１で得られたミロバラン果実抽出末を、５０％ブタノール水溶液に溶解し、２％ミロバラン抽出液を得た。これを使用し、下記表４の処方（重量％）に従い、下記の製造例に準拠し、ミロバラン果実抽出液０．５％配合ハンドクリーム製剤（以下、「ミロバラン配合クリーム」という）を調製した。
【００４３】
まず、流動パラフィン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、ジメチルポリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ブチルパラベン、モノステアリン酸デカグリセリル、酢酸トコフェロールを混合し、加熱した。次に、メチルパラベン、１,３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、濃グリセリン、エデト酸２ナトリウム、トリエタノールアミン、精製水を混合し加熱し、先の混合物に加え乳化させた。冷却後、フェノキシエタノール、グリチルリチン酸ジカリウム、香料、２％ミロバラン果実抽出液を添加することによりハンドクリームを調製した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
下記表５の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、添加相を添加することによりｐＨ６．１のミロバラン果実抽出物配合ボディクリーム（１）を調製した。
【００４６】
【表５】
【００４７】
下記表６の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、添加相を添加することによりｐＨ７．５のミロバラン果実抽出物配合ボディクリーム（２）を調製した。
【００４８】
【表６】
【００４９】
下記表７の処方（重量％）に従い、油相と水相をそれぞれ７０℃に加熱し、完全溶解させた。水相に油相を添加して乳化させた後、冷却後、微細に粉砕した粉体相および添加相を添加することによりＳＰＦ２０のミロバラン果実抽出物配合日焼け止めクリームを調製した。
【００５０】
【表７】
【００５１】
実験例４
入浴剤の調製例
下記表８の処方（重量％）に従い、すべての原料を均一に混合することによりミロバラン果実抽出物配合粉体入浴剤を調製した。
【００５２】
【表８】
【００５３】
下記表９の処方（重量％）に従い、Ａ相およびＢ相を７０℃に加熱し完全溶解させ、Ａ相をＢ相に添加後、３０℃まで冷却することによりミロバラン果実抽出物配合液状入浴剤を調製した。
【００５４】
【表９】
【００５５】
実験例５
化粧水の調製例
下記表１０の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し原液を調整し、その原液を缶に入れ、ＬＰＧ、ブタン等のガスを充填することによりミロバラン果実抽出物配合化粧水（エアゾール製品）を調製した。
【００５６】
【表１０】
【００５７】
下記表１１の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し、可溶化させることによりｐＨ５．５のミロバラン果実抽出物配合弱酸性化粧水（透明タイプ）を調製した。
【００５８】
【表１１】
【００５９】
下記表１２の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加し、乳化させることによりｐＨ７．５のミロバラン果実抽出物配合化粧水（白濁タイプ）を調製した。
【００６０】
【表１２】
【００６１】
下記表１３の処方（重量％）に従い、水相にアルコール相を添加して可溶化させた後、粉体相を添加することによりｐＨ６．２の３層型のミロバラン果実抽出物配合化粧水（分離型タイプ）を調製した。
【００６２】
【表１３】
【００６３】
実験例６
トニックの調製例
下記表１４の処方（重量％）に従い、まず、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、パントテニルアルコール、グリチルレチン酸、エタノール（９９．５％）、ミリスチン酸オクチルドデシル、２−エチルヘンキサン酸オクチル、香料、メントールを均一に混合した。次に、センブリ抽出液、ニンジン抽出液、1，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、エデト酸４ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ.Ｏ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ.Ｏ）、２％ミロバラン果実抽出液、精製水を均一に混合した。最後に両者を混合し、濾過して充填することによりミロバラン果実抽出物配合液状型トニックを調製した。
【００６４】
【表１４】
【００６５】
下記表１５の処方（重量％）に従い、まず、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、パントテニルアルコール、エタノール（９９．５％）、香料、メントールを均一に混合した。次に、センブリ抽出液、ニンジン抽出液、ジプロピレングリコール、３−メチル−１，３−ブタンジオール、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、エデト酸４ナトリウム、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノラウリン酸デカグリセリル、２％ミロバラン果実抽出液、精製水を均一に混合した。次に両者を混合し、濾過して原液とし、最後に、原液と噴射剤を充填処方に合わせて、缶に充填することによりミロバラン果実抽出物配合エアゾール型トニックを調製した。
【００６６】
【表１５】
【００６７】
実験例７
皮膚外用剤としての適用例
実験例３にて得られたミロバラン果実抽出液０．５％配合クリーム製剤および比較例として基剤のみをそれぞれ、３０歳女性の左右の手背（手の甲）に１日３回、大豆大程度を塗布し、塗布前と１ヶ月間後の肌のツヤ、ハリ、柔軟性、カサカサ感、くすみ感、キメおよびシワを下記の評価基準に従い評価した。
【００６８】
（評価基準）
ツヤ、ハリ、柔軟性：「ない（１）、あまりない（２）、どちらともいえない（３）、ややある（４）、ある（５）」
カサカサ感：「カサカサする（１）、ややカサカサする（２）、どちらともいえない（３）、ややしっとりする（４）、しっとりする（５）」
くすみ感：「ある（１）、ややある（２）、どちらともいえない（３）、あまりない（４）、ない（５）」
キメ：「あらい（１）、ややあらい（２）、どちらともいえない（３）、やや細かい（４）、細かい（５）」
シワ：「目立つ（１）、やや目立つ（２）、どちらともいえない（３）、あまり目立たない（４）、目立たない（５）」
【００６９】
評価結果より、塗布前および基剤のみの塗布と比較して明らかに、ミロバラン果実抽出物は、ツヤ、ハリ、柔軟性、カサカサ感、くすみ感、キメおよびシワのいずれの項目においても良好な効果を示し、基剤のみと比較して、ミロバラン果実抽出物を含有する皮膚外用剤を使用した場合には、キメが細かく整う整肌効果を有していた。また、保湿力およびハリが向上し、くすみがなくなった。さらに、ケラトヒアリン顆粒の減少、角層中のアミノ酸の低下及びスケーリング等の尋常性魚鱗癬に伴う症状の改善への可能性を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミロバランの果実の抽出物を有効成分とすることを特徴とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項２】
下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とすることを特徴とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項３】
前記ケブラニン類が、ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群から選択される１種又は２種以上である請求項２記載のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
皮膚外用剤である請求項１〜３のうちいずれか一項記載のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項１】
ミロバランの果実の抽出物を有効成分とすることを特徴とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項２】
下記一般式（１）、
（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子又は置換基を有してもよく分岐を有していてもよい炭素原子数３〜２０のアシル基を表し、Ｒ１とＲ２が連結して環状基を形成してもよい）で表される骨格を有するケブラニン類またはその塩を有効成分とすることを特徴とするプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項３】
前記ケブラニン類が、ケブラグ酸、ケブリン酸及びケブラニンからなる群から選択される１種又は２種以上である請求項２記載のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
皮膚外用剤である請求項１〜３のうちいずれか一項記載のプロフィラグリン及び／又はフィラグリン産生促進剤。
【公開番号】特開２００９−２５６２６９（Ｐ２００９−２５６２６９Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０９３４８（Ｐ２００８−１０９３４８）
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【出願人】（３０８０４０６３８）ツムラライフサイエンス株式会社 (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１８日（２００８．４．１８）
【出願人】（３０８０４０６３８）ツムラライフサイエンス株式会社 (12)
【Ｆターム（参考）】
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