メラニン生成抑制剤
【課題】新規なメラニン生成抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物及び化粧品を提供すること。
【解決手段】N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤、N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物、化粧品。
【解決手段】N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤、N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン生成抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物及び化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、美白化粧料組成物としては、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチン、エラグ酸などのメラニン生成抑制剤を配合したものが知られている。しかし、十分なメラニン生成抑制効果を有するものは少ないのが現状である。
（特許文献１〜特許文献４）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２２９６０
【特許文献２】特開２００７−１０６６７５
【特許文献３】特開２００７−１３１６０２
【特許文献４】特開２００７−１３７８４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新規なメラニン生成抑制剤を提供することである。
本発明の他の目的は、新規なチロシナーゼ阻害剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記メラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記メラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品、特に美白化粧品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下のメラニン生成抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物及び化粧品を提供するものである。
１．N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
２．N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
３．上記１記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤組成物。
４．上記１記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧品。
５．上記２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物。
６．上記２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の有効成分であるN-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン合成の初期段階である“チロシナーゼ”の発現の抑制効果を有する。このため、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤であるコウジ酸に比較して遙かに強いメラニン生成阻害作用を示す。すなわち、N-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼの発現を顕著に阻害し、さらにＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者は、下記式（I）で表されるN-トランス-フェルロイルチラミンが、メラノーマ細胞に対してメラニン生成を抑制し、従来公知のチロシナーゼ阻害剤と比較して、新しい作用機序で働くメラニン生成抑制作用を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
【化１】
【０００８】
本発明者は、N-トランス-フェルロイルチラミンが従来メラニン生成抑制剤として知られているコウジ酸と比較して、遙かに高いメラニン生成抑制作用を有することを見出した。
このN-トランス-フェルロイルチラミンは、前記式（Ｉ）に示す構造を有する化合物である。
メラニン産生は、チロシン→ＤＯＰＡ→ＤＯＰＡキノン→ロイコＤＯＰＡクローム→ＤＯＰＡクローム→メラニンの過程を経るが、N-トランス-フェルロイルチラミンは、メラノーマ細胞のメラニン合成の初期段階である酸化反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”自身の産生を抑制することを見出した。
【０００９】
従って、本発明に係る前記式（Ｉ）のN-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン生成抑制剤としてまたチロシナーゼ阻害剤として有用である。
本発明のメラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤は、N-トランス-フェルロイルチラミン単独で、又は皮膚外用剤用基剤その他の成分と配合して皮膚外用剤組成物（例えば治療薬、化粧料）として使用することができる。
【００１０】
皮膚外用剤組成物として使用する場合のN-トランス-フェルロイルチラミンの配合量は、好ましくは組成物全質量当り０．０５ｐｐｍ（質量）〜１０質量％、更に好ましくは０．２ｐｐｍ（質量）〜０．５質量％、最も好ましくは０．５〜５０ｐｐｍ（質量）である。
本発明に係る皮膚外用剤を構成するのに適した皮膚外用剤基剤としては、例えば従来から皮膚外用剤に使用する溶剤、水、油（例えばグリセリン、ワセリン、オリーブ油、ハッカ油、ステアリルアルコール、シクロデキストリンなどを用いることができる。皮膚外用剤は、溶液状、分散液状、乳化液状、軟膏（剤）状、貼付（剤）状などの形態とすることができる。
【００１１】
本発明に係る皮膚外用剤組成物には、上記皮膚外用剤基剤に加えて、従来から各種皮膚外用剤に一般的に配合されている添加剤や基剤を本発明の目的を損わない範囲及び量で使用することができる。具体的には、保湿剤（例えばキシリトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、プロデュウ（ＤＬ−ピロリドンカルボン酸＋Ｌ−プロリン＋乳酸ナトリウム＋ソルビトール＋コラーゲンの水溶液）、異性化糖／ペンタバイテン）、紫外線吸収剤（例えばオキシベンゾン、グアイアズレン、サルチル酸フェニル、シノキサート、パラアミノ安息香酸エステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ベンゾントリアゾール）、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ）、抗酸化剤（例えばコーキュー１０（ＣｏＱ１０）、カロチノイド、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ローズマリー、セージ、オレガノ、セサミノール、カテコール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン）、油脂（例えばコーン油、オリーブ油）、界面活性剤（例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、酢酸ポリオキシンエチレンラノリンアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチル硫酸ナトリウム、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンラノリン、ポリオキシエチレンラノリルアルコール、ラウリン硫酸塩）、粉体（例えばシクロデキストリン）、着色剤（例えばジハイドロキシアセトン（ＤＨＡ））などがあげられる。
【００１２】
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
製造例１
N-トランス-フェルロイルチラミンの抽出及び精製
Efdi M., Itoh T., Akao Y., Nozawa Y., Koketsu M., Ishihara H., Bioorg. Med. Chem., 15, 36673671 (2007)に記載の方法により、Enicosanthum membranifolium Sinclairの枝のメタノール抽出物 (369 g) を水に注ぎ、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、及びｎ−ブタノールで順に分画し、N-トランス-フェルロイルチラミンを得た。
【００１３】
製造例２
Enicosanthum cupulare (King) Airy-Shawの風乾樹皮 (5 Kg) を細かく粉砕し、室温でメタノールに浸漬した。混合物を濾過し、真空濃縮してメタノール抽出物 (185 g)を得た。これをｎ−ヘキサン、酢酸エチル、及びｎ−ブタノールで順に分画した。酢酸エチル抽出物 (20 g) をシリカゲル 60 (Kanto Chemical Co., Ltd., 40-50 μm) カラム (φ 60 mm x 500 mm, 300 g)で分画し、クロロホルム−アセトン及びメタノールで順に溶出し、画分Ａ〜Ｊを得た。画分Ｄ (1.18 g)をＨＰＬＣ(Wakosil-II 5C18 HG Prep, φ 20 mm x 250 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo)で分離し、N-トランス-フェルロイルチラミン(40.9 mg)を得た。
【００１４】
得られたN-トランス-フェルロイルチラミンの物性を以下に示す。
Mp: 92-93℃.
UV (EtOH) νmax 207, 321 nm.
IR (KBr) vmax: 3410, 1651 cm-.
1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ2.75(2H,t,J = 7.2 Hz, H-β), 3.46(2H, t, J = 7.2 Hz, H-α), 3.86 (3H, s, OCH3), 6.40 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 6.72 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3', H-5'), 6.78 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-8), 7.00 (1H, dd, J = 2.3, 8.6 Hz, H-9), 7.04 (2H, d, J = 8.6Hz, H-2', H-6'), 7.09 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-5), 7.43 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3).
13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ35.8 (C-β), 42.5 (C-α), 56.3 (OCH3), 111.5 (C-5), 116.3 (C-3', C-5'), 116.5 (C-8), 118.6 (C-2), 123.3 (C-9), 128.0 (C-4), 130.7 (C-2', C-6'), 131.3 (C-1'), 142.1 (C-3), 149.4 (C-6), 150.2 (C-7), 156.9 (C-4'), 169.2 (C-1).
EIMS m/z: [313]+.
【００１５】
試験例１
この試験例は、従来からチロシナーゼ阻害剤として知られているコウジ酸と比較したN-トランス-フェルロイルチラミンの阻害活性作用の試験例である。
培養条件、メラニン含量の測定方法、チロシナーゼ活性の測定方法、蛋白質アッセイ、ウエスタンブロット分析の方法は以下のとおりである。
【００１６】
細胞培養
マウスB16メラノーマ細胞はリケン細胞バンク（つくば、日本）から購入した。これを10%(v/v) ウシ胎児血清、ペニシリン100ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン100μｇ／ｍｌを加えたダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM)で、CO2(5%)インキュベータ中３７℃で培養した。
【００１７】
メラニン含量の測定
B16細胞をPBSで洗浄し、2 N NaOH に溶解し60℃で１時間保持した。合成メラニンの標準品を用いて、470ｎｍの吸光度を測定し、メラニン含量を測定した。細胞の生存はトリパンブルー排除試験により決定した。
【００１８】
チロシナーゼ活性の測定
B16細胞をプロテアーゼ阻害剤含有RIPAバッファ(10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1% NP-40, 0.1% ナトリウムデオキシコレート, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)中、４℃で30分インキュベートして溶解した。これを15,000 x ｇで30分遠心分離し、上清をチロシナーゼ源とした。反応混合物は50 mM リン酸バッファ, pH 6.8, 0.05% L-dopa 及び上清を含んでいた。３７℃で２０分インキュベーションした後、ドパクロムの形成を４７０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。
【００１９】
蛋白質アッセイ
蛋白質濃度は、BSA含有DC蛋白質アッセイ試薬(Bio-Rad)を標準として行った。
ウエスタンブロット分析
細胞を、プロテアーゼ阻害剤含有RIPAバッファ中で４℃３０分インキュベートして溶解し、15,000 x ｇで３０分間遠心分離した。上清（溶解蛋白質）を7.5%ポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEにかけた。蛋白質をPVDF膜に電気泳動的に転写した。５％スキムミルクパウダ含有Trisバッファ生理食塩水中でブロックした。ブロットを第１抗体とインキュベートし、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ結合第２抗体とインキュベートした。蛋白質はECL検出装置で可視化した。
【００２０】
マウスB16メラノーマ細胞をN-トランス-フェルロイルチラミン（以下「ＦＡ」ともいう）存在下３日間培養した。ＦＡ処理した細胞中のメラニン含量は対照細胞と比較して減少していた。
B16メラノーマ細胞に10 μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン処理したものと未処理のものの顕微鏡写真を図１に示す。N-トランス-フェルロイルチラミンで処理したメラノーマ細胞は、未処理のものと比べ明らかにメラニンの生成を抑制していることがわかる。
【００２１】
試験例２
０〜２０μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン存在下３日間処理した際のメラニンの生成量、及びメラニン存在下の生存細胞数、並びにN-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）又はコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験結果を図２に示す。
Ａ：各種濃度のN-トランス-フェルロイルチラミン処理した際のメラニンの生成量
Ｂ：各種濃度のN-トランス-フェルロイルチラミン存在下の生存細胞数（対照に対する％）
Ｃ：N-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）とコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験（FA: N-トランス-フェルロイルチラミン、KA: コウジ酸）
【００２２】
図２のＡから明らかなようにN-トランス-フェルロイルチラミンで処理した際、濃度依存的にメラニンの生成量が抑制された。その際、メラノーマ細胞の数をほとんど減らすことなく作用し安全性が確認された（図２のＢ）。
また、図２のＣから、N-トランス-フェルロイルチラミンはコウジ酸に比較して遥かに強い阻害作用を示すことがわかる。
【００２３】
試験例３
L-dopa（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を基質として使用し、ドーパクロムの形成を測定することによりマウスチロシナーゼに対するＦＡの阻害活性を調べた。結果を図３に示す。ＦＡがマウスチロシナーゼ活性を阻害することがわかる。
【００２４】
試験例４
０〜１０μＭのＦＡを含む培地でマウスB16メラノーマ細胞を3日間培養し、チロシナーゼに対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析により、チロシナーゼ蛋白質の発現レベルを調べた。結果を図４に示す。ＦＡ処理によりチロシナーゼ蛋白質の発現が阻害されることがわかる。
【００２５】
以下に本発明の皮膚外用剤の実施例を示す。
実施例１ クリーム
（処方）
ステアリン酸 ４．０質量％
ステアリルアルコール ４．０
イソプロピルミリステート １５．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ３．０
プロピレングリコール １０．０
ＦＡ ０．０１
防腐剤 適量
香料 適量
イオン交換水 残余
【００２６】
実施例２ 乳液
（処方）
ステアリン酸 ２．０質量％
セチルアルコール ２．５
ワセリン ５．０
流動パラフィン １０．０
ポリエチレングリコール １２００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
カルボキシビニルポリマー ０．０５
ＦＡ ０．０１
亜硫酸水素ナトリウム ０．０１
エチルパラベン ０．３
香料 適量
イオン交換水 残余
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】B16メラノーマ細胞に10 μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン処理したものと未処理のものの顕微鏡写真を示す図面である。
【図２】N-トランス-フェルロイルチラミン存在下３日間処理した際のメラニンの生成量（Ａ）、及びメラニン存在下の生存細胞数（Ｂ）、並びにN-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）又はコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験結果（Ｃ）を示す図面である。
【図３】マウスチロシナーゼに対するＦＡの阻害活性を示す図面である。
【図４】ＦＡ処理によりチロシナーゼ蛋白質の発現が阻害されることを示す図面である。がわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン生成抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物及び化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、美白化粧料組成物としては、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチン、エラグ酸などのメラニン生成抑制剤を配合したものが知られている。しかし、十分なメラニン生成抑制効果を有するものは少ないのが現状である。
（特許文献１〜特許文献４）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２２９６０
【特許文献２】特開２００７−１０６６７５
【特許文献３】特開２００７−１３１６０２
【特許文献４】特開２００７−１３７８４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新規なメラニン生成抑制剤を提供することである。
本発明の他の目的は、新規なチロシナーゼ阻害剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記メラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記メラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品、特に美白化粧品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下のメラニン生成抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、これを含有する皮膚外用剤組成物及び化粧品を提供するものである。
１．N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
２．N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
３．上記１記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤組成物。
４．上記１記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧品。
５．上記２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物。
６．上記２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の有効成分であるN-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン合成の初期段階である“チロシナーゼ”の発現の抑制効果を有する。このため、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤であるコウジ酸に比較して遙かに強いメラニン生成阻害作用を示す。すなわち、N-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼの発現を顕著に阻害し、さらにＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者は、下記式（I）で表されるN-トランス-フェルロイルチラミンが、メラノーマ細胞に対してメラニン生成を抑制し、従来公知のチロシナーゼ阻害剤と比較して、新しい作用機序で働くメラニン生成抑制作用を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
【化１】
【０００８】
本発明者は、N-トランス-フェルロイルチラミンが従来メラニン生成抑制剤として知られているコウジ酸と比較して、遙かに高いメラニン生成抑制作用を有することを見出した。
このN-トランス-フェルロイルチラミンは、前記式（Ｉ）に示す構造を有する化合物である。
メラニン産生は、チロシン→ＤＯＰＡ→ＤＯＰＡキノン→ロイコＤＯＰＡクローム→ＤＯＰＡクローム→メラニンの過程を経るが、N-トランス-フェルロイルチラミンは、メラノーマ細胞のメラニン合成の初期段階である酸化反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”自身の産生を抑制することを見出した。
【０００９】
従って、本発明に係る前記式（Ｉ）のN-トランス-フェルロイルチラミンは、メラニン生成抑制剤としてまたチロシナーゼ阻害剤として有用である。
本発明のメラニン生成抑制剤又はチロシナーゼ阻害剤は、N-トランス-フェルロイルチラミン単独で、又は皮膚外用剤用基剤その他の成分と配合して皮膚外用剤組成物（例えば治療薬、化粧料）として使用することができる。
【００１０】
皮膚外用剤組成物として使用する場合のN-トランス-フェルロイルチラミンの配合量は、好ましくは組成物全質量当り０．０５ｐｐｍ（質量）〜１０質量％、更に好ましくは０．２ｐｐｍ（質量）〜０．５質量％、最も好ましくは０．５〜５０ｐｐｍ（質量）である。
本発明に係る皮膚外用剤を構成するのに適した皮膚外用剤基剤としては、例えば従来から皮膚外用剤に使用する溶剤、水、油（例えばグリセリン、ワセリン、オリーブ油、ハッカ油、ステアリルアルコール、シクロデキストリンなどを用いることができる。皮膚外用剤は、溶液状、分散液状、乳化液状、軟膏（剤）状、貼付（剤）状などの形態とすることができる。
【００１１】
本発明に係る皮膚外用剤組成物には、上記皮膚外用剤基剤に加えて、従来から各種皮膚外用剤に一般的に配合されている添加剤や基剤を本発明の目的を損わない範囲及び量で使用することができる。具体的には、保湿剤（例えばキシリトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、プロデュウ（ＤＬ−ピロリドンカルボン酸＋Ｌ−プロリン＋乳酸ナトリウム＋ソルビトール＋コラーゲンの水溶液）、異性化糖／ペンタバイテン）、紫外線吸収剤（例えばオキシベンゾン、グアイアズレン、サルチル酸フェニル、シノキサート、パラアミノ安息香酸エステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ベンゾントリアゾール）、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ）、抗酸化剤（例えばコーキュー１０（ＣｏＱ１０）、カロチノイド、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ローズマリー、セージ、オレガノ、セサミノール、カテコール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン）、油脂（例えばコーン油、オリーブ油）、界面活性剤（例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、酢酸ポリオキシンエチレンラノリンアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチル硫酸ナトリウム、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンラノリン、ポリオキシエチレンラノリルアルコール、ラウリン硫酸塩）、粉体（例えばシクロデキストリン）、着色剤（例えばジハイドロキシアセトン（ＤＨＡ））などがあげられる。
【００１２】
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
製造例１
N-トランス-フェルロイルチラミンの抽出及び精製
Efdi M., Itoh T., Akao Y., Nozawa Y., Koketsu M., Ishihara H., Bioorg. Med. Chem., 15, 36673671 (2007)に記載の方法により、Enicosanthum membranifolium Sinclairの枝のメタノール抽出物 (369 g) を水に注ぎ、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、及びｎ−ブタノールで順に分画し、N-トランス-フェルロイルチラミンを得た。
【００１３】
製造例２
Enicosanthum cupulare (King) Airy-Shawの風乾樹皮 (5 Kg) を細かく粉砕し、室温でメタノールに浸漬した。混合物を濾過し、真空濃縮してメタノール抽出物 (185 g)を得た。これをｎ−ヘキサン、酢酸エチル、及びｎ−ブタノールで順に分画した。酢酸エチル抽出物 (20 g) をシリカゲル 60 (Kanto Chemical Co., Ltd., 40-50 μm) カラム (φ 60 mm x 500 mm, 300 g)で分画し、クロロホルム−アセトン及びメタノールで順に溶出し、画分Ａ〜Ｊを得た。画分Ｄ (1.18 g)をＨＰＬＣ(Wakosil-II 5C18 HG Prep, φ 20 mm x 250 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo)で分離し、N-トランス-フェルロイルチラミン(40.9 mg)を得た。
【００１４】
得られたN-トランス-フェルロイルチラミンの物性を以下に示す。
Mp: 92-93℃.
UV (EtOH) νmax 207, 321 nm.
IR (KBr) vmax: 3410, 1651 cm-.
1H NMR (500 MHz, CD3OD):δ2.75(2H,t,J = 7.2 Hz, H-β), 3.46(2H, t, J = 7.2 Hz, H-α), 3.86 (3H, s, OCH3), 6.40 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 6.72 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3', H-5'), 6.78 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-8), 7.00 (1H, dd, J = 2.3, 8.6 Hz, H-9), 7.04 (2H, d, J = 8.6Hz, H-2', H-6'), 7.09 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-5), 7.43 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3).
13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ35.8 (C-β), 42.5 (C-α), 56.3 (OCH3), 111.5 (C-5), 116.3 (C-3', C-5'), 116.5 (C-8), 118.6 (C-2), 123.3 (C-9), 128.0 (C-4), 130.7 (C-2', C-6'), 131.3 (C-1'), 142.1 (C-3), 149.4 (C-6), 150.2 (C-7), 156.9 (C-4'), 169.2 (C-1).
EIMS m/z: [313]+.
【００１５】
試験例１
この試験例は、従来からチロシナーゼ阻害剤として知られているコウジ酸と比較したN-トランス-フェルロイルチラミンの阻害活性作用の試験例である。
培養条件、メラニン含量の測定方法、チロシナーゼ活性の測定方法、蛋白質アッセイ、ウエスタンブロット分析の方法は以下のとおりである。
【００１６】
細胞培養
マウスB16メラノーマ細胞はリケン細胞バンク（つくば、日本）から購入した。これを10%(v/v) ウシ胎児血清、ペニシリン100ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン100μｇ／ｍｌを加えたダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM)で、CO2(5%)インキュベータ中３７℃で培養した。
【００１７】
メラニン含量の測定
B16細胞をPBSで洗浄し、2 N NaOH に溶解し60℃で１時間保持した。合成メラニンの標準品を用いて、470ｎｍの吸光度を測定し、メラニン含量を測定した。細胞の生存はトリパンブルー排除試験により決定した。
【００１８】
チロシナーゼ活性の測定
B16細胞をプロテアーゼ阻害剤含有RIPAバッファ(10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1% NP-40, 0.1% ナトリウムデオキシコレート, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)中、４℃で30分インキュベートして溶解した。これを15,000 x ｇで30分遠心分離し、上清をチロシナーゼ源とした。反応混合物は50 mM リン酸バッファ, pH 6.8, 0.05% L-dopa 及び上清を含んでいた。３７℃で２０分インキュベーションした後、ドパクロムの形成を４７０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。
【００１９】
蛋白質アッセイ
蛋白質濃度は、BSA含有DC蛋白質アッセイ試薬(Bio-Rad)を標準として行った。
ウエスタンブロット分析
細胞を、プロテアーゼ阻害剤含有RIPAバッファ中で４℃３０分インキュベートして溶解し、15,000 x ｇで３０分間遠心分離した。上清（溶解蛋白質）を7.5%ポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEにかけた。蛋白質をPVDF膜に電気泳動的に転写した。５％スキムミルクパウダ含有Trisバッファ生理食塩水中でブロックした。ブロットを第１抗体とインキュベートし、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ結合第２抗体とインキュベートした。蛋白質はECL検出装置で可視化した。
【００２０】
マウスB16メラノーマ細胞をN-トランス-フェルロイルチラミン（以下「ＦＡ」ともいう）存在下３日間培養した。ＦＡ処理した細胞中のメラニン含量は対照細胞と比較して減少していた。
B16メラノーマ細胞に10 μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン処理したものと未処理のものの顕微鏡写真を図１に示す。N-トランス-フェルロイルチラミンで処理したメラノーマ細胞は、未処理のものと比べ明らかにメラニンの生成を抑制していることがわかる。
【００２１】
試験例２
０〜２０μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン存在下３日間処理した際のメラニンの生成量、及びメラニン存在下の生存細胞数、並びにN-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）又はコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験結果を図２に示す。
Ａ：各種濃度のN-トランス-フェルロイルチラミン処理した際のメラニンの生成量
Ｂ：各種濃度のN-トランス-フェルロイルチラミン存在下の生存細胞数（対照に対する％）
Ｃ：N-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）とコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験（FA: N-トランス-フェルロイルチラミン、KA: コウジ酸）
【００２２】
図２のＡから明らかなようにN-トランス-フェルロイルチラミンで処理した際、濃度依存的にメラニンの生成量が抑制された。その際、メラノーマ細胞の数をほとんど減らすことなく作用し安全性が確認された（図２のＢ）。
また、図２のＣから、N-トランス-フェルロイルチラミンはコウジ酸に比較して遥かに強い阻害作用を示すことがわかる。
【００２３】
試験例３
L-dopa（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を基質として使用し、ドーパクロムの形成を測定することによりマウスチロシナーゼに対するＦＡの阻害活性を調べた。結果を図３に示す。ＦＡがマウスチロシナーゼ活性を阻害することがわかる。
【００２４】
試験例４
０〜１０μＭのＦＡを含む培地でマウスB16メラノーマ細胞を3日間培養し、チロシナーゼに対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析により、チロシナーゼ蛋白質の発現レベルを調べた。結果を図４に示す。ＦＡ処理によりチロシナーゼ蛋白質の発現が阻害されることがわかる。
【００２５】
以下に本発明の皮膚外用剤の実施例を示す。
実施例１ クリーム
（処方）
ステアリン酸 ４．０質量％
ステアリルアルコール ４．０
イソプロピルミリステート １５．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ３．０
プロピレングリコール １０．０
ＦＡ ０．０１
防腐剤 適量
香料 適量
イオン交換水 残余
【００２６】
実施例２ 乳液
（処方）
ステアリン酸 ２．０質量％
セチルアルコール ２．５
ワセリン ５．０
流動パラフィン １０．０
ポリエチレングリコール １２００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
カルボキシビニルポリマー ０．０５
ＦＡ ０．０１
亜硫酸水素ナトリウム ０．０１
エチルパラベン ０．３
香料 適量
イオン交換水 残余
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】B16メラノーマ細胞に10 μＭのN-トランス-フェルロイルチラミン処理したものと未処理のものの顕微鏡写真を示す図面である。
【図２】N-トランス-フェルロイルチラミン存在下３日間処理した際のメラニンの生成量（Ａ）、及びメラニン存在下の生存細胞数（Ｂ）、並びにN-トランス-フェルロイルチラミン（10μＭ）又はコウジ酸（10μＭ）の存在下３日間培養したときの比較実験結果（Ｃ）を示す図面である。
【図３】マウスチロシナーゼに対するＦＡの阻害活性を示す図面である。
【図４】ＦＡ処理によりチロシナーゼ蛋白質の発現が阻害されることを示す図面である。がわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
請求項１記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧品。
【請求項５】
請求項２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
請求項２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品。
【請求項１】
N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
N-トランス-フェルロイルチラミンを有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
請求項１記載のメラニン生成抑制剤を含有する化粧品。
【請求項５】
請求項２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
請求項２記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する化粧品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−４０６８８（Ｐ２００９−４０６８８Ａ）
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０４１６４（Ｐ２００７−２０４１６４）
【出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【出願人】（５９４１５５５５１）
【出願人】（５９８０４１４３０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【出願人】（５９４１５５５５１）
【出願人】（５９８０４１４３０）
【Ｆターム（参考）】
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