低分子抗酸化剤及び高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含む組成物
【課題】高分子化した２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）の機能をが高められると同時に、ＴＥＭＰＯ以外の低分子抗酸化剤のうち、特に、水難溶解性であるが故に、利用分野が限定され、また、効果が制限される抗酸化剤の機能が高められた組成物の提供。
【解決手段】低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている組成物。この組成物は活性酸素もしくはラジカル種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するために有用である。
【解決手段】低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている組成物。この組成物は活性酸素もしくはラジカル種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素やフリーラジカル消去能及び抗酸化能を有する組成物に関する。より具体的には、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物及び抗酸化剤を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素やラジカル種（ＲＯＳ）による酸化的ストレスが、血管を障害し、老化や癌化を促進するだけでなく、様々な疾病の原因となることが明らかになりつつある。実際に、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病（非特許文献１）等の脳疾患のみならず、様々な虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（非特許文献２）または癌もしくは加齢等の広範な疾患に関与していることが明らかになるかまたは明らかになりつつある。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下は、活性酸素やフリーラジカル種による細胞障害によりもたらされることが知られている。そこで、ＲＯＳを効率よく消去するため、天然物もしくは合成物質等様々な抗酸化剤が検討されている。その中で、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）などのようなさまざまな低分子抗酸化物質の開発がおこなわれているものの、腎臓からの急速な排泄などの問題点を有していた。このような背景を考慮し、本発明者らは最近、ＲＯＳに対する反応性を制御する材料設計に際し、生体適合性高分子にＴＥＭＰＯ様ニトロキシラジカルを結合し、その自己組織化を利用したナノ粒子を形成すると、これまでに提案されてきた低分子化合物に比較して極めて長時間生体内で安定に存在することを見出した（非特許文献３））。例えば、低分子のＴＥＭＰＯは血中投与後最短測定時間の２分後での検出は不可能であるのに対し、本発明者らの提供したナノ粒子封入ＴＥＭＰＯ等は半減期が数時間以上と圧倒的な安定性を示した（非特許文献４）。このラジカルナノ粒子（ＲＮＰ）を脳虚血再灌流によるダメージに適用したところ、大きな酸化ストレス障害抑制効果が見られ、効果的なＲＯＳ抑制効果を示した。本発明者らは以上の成果をまとめて特許出願も行った（特許文献１）。
【０００３】
他方、ＴＥＭＰＯ等以外の多種多様な低分子抗酸化剤も医療をはじめとする種々の分野で実用されているが、抗酸化能が一定の目的上十分でないか、中には、水難溶解性であるために利用分野が限定され、また、効果が制限されるものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ ２００９／１３３６４７
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｒｉａｚａｎｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｙｃｈｉａｔｒｙ （２００２）， ７（８）， ８９１
【非特許文献２】Ｒ．Ｓｃｈｅｒｚ−Ｓｈｏｕｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２００７），１７（９），４２２
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：１０（３）５９６（２００９）
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕ． Ｃｈｅｍ．，２０ １７９２（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＴＥＭＰＯ等では、それらを特定の高分子化合物を用いて高分子化することにより所期の目的を達成することに成功した。しかし、このような高分子化したＴＥＭＰＯであっても、さらにその機能を高めることができれば当該技術分野により一層貢献できるであろう。また、ＴＥＭＰＯ以外の低分子抗酸化剤のうち、特に、水難溶解性であるが故に、利用分野が限定され、また、効果が制限される抗酸化剤の機能を高めることに対するニーズは低分子ＴＥＭＰＯに対するのと同様に存在するであろう。
【０００７】
本発明では、今ここに、低分子抗酸化剤を短に高分子化するのでなく、上記の高分子化ＴＥＭＰＯ等と組み合わせて使用することにより、低分子化抗酸化剤の利用分野を拡張できるとともに、高分子化ＴＥＭＰＯ等の抗酸化活性を有意に向上できることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明によれば、低分子抗酸化剤と高分子化ＴＥＭＰＯをはじめとする高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物、およびこのような組成物の活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の予防もしくは治療分野での使用が提供される。
【０００９】
該組成物によると、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の抗酸化能をさらに向上させることができることのみならず、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合には、その抗酸化能を保持したまま、それらを水可溶性にすることができる。
【００１０】
したがって、本願明細書は下記の態様の発明を提供することにより上記課題を解決することができる。
【００１１】
態様１：低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。
【００１２】
態様２：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化１】
【００１４】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−
Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、上記組成物。
【００１５】
態様３：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる、上記組成物。
【００１６】
態様４：高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセルに内包されている、上記態様１〜３のいずれかの組成物。
【００１７】
態様５：上記態様１〜４のいずれかを有効成分として含んでなる、活性酸素もしくはラジカル種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
以下、本発明で使用できる低分子抗酸化剤及び高分子化環状ニトキシドラジカル化合物についてより具体的に記述する。
【００１９】
低分子抗酸化剤にいう、低分子とは、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物にいう高分子と対比しうる概念を表すものとして用いている。したがって、重合体は排除される。この様な低分子抗酸化剤としては、抗酸化作用を示し、本発明の目的に沿うものであれば限定されるものでないが、ムコスタ（レバミピド）及びその類延体（Ｍａｓａｔｅｒｕ Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１１（２００６）２７−３４、参照）、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、ピペリン、等の水難溶解性の抗酸化剤、ならびに
ビタミンＣ（アスコルビン酸）、グルタチオン、フラボノイド、尿酸、等の水溶性抗酸化剤、ならびに
スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、セルロプラスミン、メタロチオネイン、チオレドキシン、等のタンパク質性抗酸化剤、ならびに
白金コロイド、フラーレン、等の粒子状抗酸化剤
を挙げることができる。
【００２０】
一方、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物としては、上記特許文献１に記載された環状ニトロキシドラジカル化合物を安定化するために高分子化したものであって、本発明の目的に沿うものであれば限定されることなく種々の高分子化合物により高分子化されたものも挙げることができる（特許文献１の全内容は、ここに引用することにより本明細書に取り込まれる）。このような安定化の典型的な方法について採録すれば、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基と該共重合体の反応性基を介して共有結合せしめる工程を含んでなる方法である。該方法において、具体的には、該官能基がアミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基であり、そして前記ブロック共重合体は該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合された形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成できるものである。
【００２１】
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物としては、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、上記高分子化ニトロキシドラジカル化合物を挙げることができる。
【００２２】
より具体的には、特許文献１に記載の一般式（ＩＩ）
【００２３】
【化２】
【００２４】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子価結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−及び−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物であることができる。さらに、一般式（ＩＩ）において、Ｌ１が原子価結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【００２５】
【化３】
【００２６】
式中、Ｒ’はメチル基である、
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、これらの化合物から形成できる高分子ミセルの安定化にｐＨ応答性を付与する点でも特に好ましいものとして提供される。
【００２７】
上記の各基または部分の定義において、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシのアルキル部分は、直鎖または分岐のアルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ドデカニル等を挙がることができる。また、Ａが、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−で置換されたアルコキシ基を表し、かつ、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す場合には、このような置換基は酸性条件下で容易に開裂してホルミル基に転化できるので、タンパク質もしくはペプチド（例えば、抗体その他のリガンド）等をそのアミノ基を介して容易に共有結合できる。かような置換基は、存在する場合には、アルコキシ基の未結合末端に存在するのが好ましい。これらの置換基は、例えば、上記特許文献２及び３に記載のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントの生成方法を参照して導入できる。
【００２８】
また、上記ブロック共重合体における、連結基Ｌ１は、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとポリ（スチレン）をどのように結合させるかにより代わり得るので限定され
るものでない。例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントをアニオンリビング重合で生成し、次いで、ハロメチルスチレンのリビング重合を継続する場合には、Ｌ１は原子価結合となる。ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントのω−末端に硫黄原子を持つポリ（エチレングリコール）誘導体を用意した場合は、該誘導体の存在下にハロメチルスチレンのラジカル重合を行うことで連結基が、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−となり得る。
【００２９】
本発明に従う組成物は、上記低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物を、必要により、希釈剤または他の製薬学的に常用されている賦形剤の存在下で混合することにより調製できる。低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の混合比率は、限定されるものでないが、重量基準で、１：９９〜９９：１、好ましくは、３：９７〜６０：４０である。
【００３０】
上記のような高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、緩衝化水溶液または水混和性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、アセトニトリル等を含有していてもよい水性媒体中で自己組織化することによってコア領域にニトロキシドラジカル部分が担持されるかもしくは存在し、シェル領域にポリ（エチレングリコール）鎖が存在するとみなせる数十ないし数百ナノメーター（ｎｍ）範囲内の粒子径を有する高分子ミセルを形成する。このような高分子ミセル形成の際に、または形成後に、低分子抗酸化剤、特に、水難溶解性抗酸化剤を水性媒体中で共存させておけば、該抗酸化剤を高分子ミセル中に内包させることができる。本発明の組成物の好ましいものとしては、低分子抗酸化剤を該高分子ミセルに内包したものを挙げることができる。このような形態をした本発明の組成物は、環状ニトロキシドラジカル化合物と低分子抗酸化剤が一体となって働き易く、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合はそれを水性媒体中で可溶化した状態にすることができる。
【００３１】
こうして形成する高分子ミセルは、ミセル形成水性液中で、例えば遠心または透析により分離、精製でき、また、凍結乾燥品としても提供できる。このような高分子ミセル内の低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の含有比率は、抗酸化剤対高分子化環状ニトキシドラジカル化合物に担持される環状ニトキシドラジカル化合物のモル比で、１：１〜１：１００００、好ましくは、１：４〜１：１００、より好ましくは１：５であることができる。
【００３２】
こうして水難溶解性抗酸化剤の少なくとも一部が内包された高分子ミセルまたは組成物は、水性媒体中で可溶化でき、従来、水難溶解性のため利用分野が限定されていた抗酸化剤の用途を大きく拡張できる。また、該高分子ミセルに内包された抗酸化剤は、仮に、それら自体が生体に対して強力な毒性を有している場合であってもその毒性を有意に軽減できる。一方、抗酸化剤が水溶性抗酸化剤であっても、高分子化ニトロキシドラジカル化合物と抗酸化剤を共存させるかまたは組み合わせることにより調製した組成物は、該高分子ミセルと同様に、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができる。質的に増強とは、例えば、ニトロキシドラジカルによる抗酸化作用等とそれと組み合わされる抗酸化剤による抗酸化作用、抗炎症作用、胃粘膜保護作用等のそれぞれの異なる作用が、相互に悪影響を受けることなく両作用を発揮し、例えば、酸化過程より複雑な機序による場合には、かような酸化過程全体を効果的に抑制できる等の作用を意味する。
【００３３】
該高分子ミセルまたは組成物は、限定されるものでないが、全体として低毒性であり、また、水可溶性である等の性質を有することから、経口投与用及び非経口投与用の医薬製剤中の有効成分として都合よく利用できる。また、該高分子ミセルまたは組成物は、後述する実施例で明らかにされるとおりに全く異なる抗酸化等について試験するモデル実験で
高い効果を奏し、また、上述したとおり、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができるので、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する広範な疾患もしくは障害の予防もしくは治療用の有効成分として利用できる。
【００３４】
活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病等の脳疾患、心筋梗塞などの虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（例えば、潰瘍性大腸炎）、癌もしくは加齢（紫外線照射による皮膚の老化、シワの形成）、動脈硬化、糖尿病、肺気腫や炎症性皮膚疾患等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害を挙げることができる。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下等に起因する、ＮＳＡＩＤｓによる消化管障害や腎機能不全も挙げることができる。
【００３５】
このよう該高分子ミセルまたは組成物は、多岐にわたる疾患もしくは障害の治療または予防に効果を発揮する有効成分として利用できるので、使用対象に応じて適切な剤形（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で、それぞれの治療有効量を製薬学的に許容されるキャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに含む製剤として提供できる。このような剤形としては、経口的、直腸的、局所的、経皮的、体内埋植的または非経口的注射による投与に適する単位剤形を挙げることができる。これらの製剤は、有効成分としての該高分子ミセルまたは組成物を、キャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに、それ自体既知の調剤方法により調製できる。例えば、経口剤形を調製するには、経口剤を調製すのに常用されている製剤媒質、例えば、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤及び液剤等の経口液状製剤の場合には、水、グリコール、油脂、アルコール等、あるいは散剤、丸薬、カプセル剤及び錠剤の場合には、固形キャリヤー、例えば、澱粉、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を使用できる。非経口剤形、特に、注射用液剤もしくは懸濁剤を調製するには、キャリヤーもしくは希釈剤は、主として滅菌水または生理食塩水であることができ、必要により、懸濁化剤を含めることができ、また生理食塩水とともにもしくは独立して、グルコース等の糖溶液を用いることができる。経皮投与剤形にあっては、キャリヤーは、経皮投与に適するキャリヤー及び、必要に応じ、皮膚浸透促進剤もしくは湿潤剤を含めることができる。また、局所的投与剤形は、クリーム剤、ゼリー剤、ローション剤、軟膏剤であることができる。
【００３６】
このような剤形は、該有効成分の投与を必要とする患者に対し、それぞれの剤形に適する投与経路で対象とする疾患もしくは障害の治療有効量を投与することにより、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の治療または予防をすることができる。有効量は、対象とする疾患もしくは障害、それらの重篤度、年齢、体重等により最適量が変動するので限定できないが、専門家が臨床試験等の試験の結果に基づいて判断できるであろう。
【００３７】
該有効成分は、他の有効成分、すなわち、対象とする疾患もしくは障害の治療もしくは予防に既に使用されているか、または使用することが提案されている医薬と、同時に、または前後して投与できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１におけるＲＮＰと低分子抗酸化剤ムコスタを水性媒体中で撹拌することにより変化するムコスタの溶解度のグラフ表示である。
【図２】実施例２におけるムコスタ内包ＲＮＰの粒子内径分布グラフ表示である。
【図３】実施例３における、ムコスタ内包ＲＮＰをＰＤ１０カラムに流したときの流出パターンのグラフ表示である。
【図４】実施例４における、ムコスタ内包ＲＮＰのインドメタシンの細胞毒性に対する影響のグラフ表示である。
【図５】実施例５の５−１）における、ＲＮＰまたはビタミンＥ内包ＲＮＰの粒径分布のグラフ表示である。■はＲＮＰ＋ビタミンＥ１０の系、●はＲＮＰ＋ビタミンＥ５の系、▲はＲＮＰ＋ビタミンＥ１の系、▼はＲＮＰ＋ビタミンＥ０．１の系、◆はＲＮＰのみの系の結果を表す。
【図６】実施例５の５−２）における、ＲＮＰとビタミンE内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果を示すグラフ表示である。●はＲＮＰ＋ビタミンＥ０の系、■はＲＮＰ＋ビタミンＥ０．１の系、▲はＲＮＰ＋ビタミンＥ１の系、▼はＲＮＰ＋ビタミンＥ５の系、◆はＲＮＰ＋ビタミンＥ１０の系の結果を表す。
【図７】実施例６の６−１）におけるヒト神経芽細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に対するＡβアミロイド（１−４２）の障害活性のグラフ表示である。
【図８】実施例６の６−２）における、ＲＮＰによるＡβ１−４２障害神経芽細胞への作用のグラフ表示である。
【図９】実施例６の６−４）における、Ａβ１−４２障害神経芽細胞に対するピペリン単独の効果のグラフ表示である。網模様の棒はＡβ1-42のみを添加したときの細胞生存率を表す。
【図１０】実施例６の６−４）における、Ａβ１−４２障害神経芽細胞に対するＲＮＰ＋ピペリン（ＰＩ）の効果のグラフ表示である。それぞれ、黒塗り棒はＰＩのみに関し、斜線の棒はＰＩ＋Ａβ＋ＲＮＰ−Ｎ（１ｍＭ）に関するデータである。
【図１１】ＮＢＴ法を用いて測定したスーパーオキシド産生量のグラフ表示である。
【図１２】デオキシリボース分解法を用いて測定したヒドロキシラジカル産生量のグラフ表示である。
【図１３】Ａβアミロイドを添加した後のアポトーシス量のグラフ表示である。
【図１４】脂質過酸化量のグラフ表示である。
【図１５】カルボニル化蛋白のグラフ表示である。
【図１６】ＤＮＡの断片化量のグラフ表示である。
【図１７】グルタチオンペルオキシダーゼ活性のグラフ表示である。
【図１８】カタラーゼ活性のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明をより具体的に説明するために、特定の高分子化ニトロキシドラジカル化合物として特許文献１の製造例１〜３（下記に採録する）に従って製造したメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ＲＮＰという）と低分子抗酸化剤としてムコスタを用いて本発明に従う組成物を調製した例について説明する。
【００４０】
製造例１：α―末端にアセタール基を有するポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の合成
アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
【００４１】
【化４】
【００４２】
α―末端にアセタール基、ω―末端にチオール基を有しているヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：４，６００；０．０２ｍｍｏｌ，９２ｍｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１ｍＬのアゾビスイソブチロニトリル／ベンゼン（０．０１ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液とクロロメチルスチレン（１ｍｍｏｌ，０．１３８ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をヘキサン中に流し込んだところ、白い沈殿が生じた。ポリクロロメチルスチレンホモポリマーを除去するために、得られた沈殿物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１３４ｍｇであり、収率は５５．１％であった。得られたアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定の結果から、二峰性の分布が確認された。生成物の情報を得るために、ＳＥＣを用いてこの２つの分布を分別し、それぞれのフラクションの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００４３】
その結果、二つのフラクションのＰＥＧとＰＣＭＳの成分比率がほぼ同じであることが明らかとなった。また、得られたブロック共重合体中のＰＣＭＳセグメントの分子量を算出するために、ＳＥＣより決定したアセタール−ＰＥＧ−ＳＨの分子量に基づき１Ｈ ＮＭＲスペクトルを解析ところ、ＰＣＭＳセグメントの分子量は、それぞれ３，３００、６，６００であることが明らかとなった）。これらの結果により、二峰性の分布は、一方がジブロック共重合体の生成物であり、他方がトリブロック共重合体の生成物であることが明らかとなった。これは、テロメリゼーション中のジブロック共重合体同士の再結合により、トリブロック共重合体が生成したということが示唆される。また、ピークフィッティングにより、ジブロック共重合体とトリブロック共重合体の成分比は、２３％と７７％であることが確認された。
【００４４】
製造例２：イミノ結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；４０ｍｇ，５．２μｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（８８ｍｇ，５２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、７６．３％であった。
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた。またサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分取し、各フラクションにおけるＥＳＲシグナルを測定した。その結果、再沈殿の回数が増すごとに２０
分〜２７分に見られる未反応アミノ−ＴＥＭＰＯのＥＳＲシグナルが消失したことから、未反応のアミノ−ＴＥＭＰＯが精製によって完全除去されていることが確認された。
【００４６】
製造例３：エーテル結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；２００ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）を加え、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。次に、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（２６０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）とＮａＨ（７０．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、目的のメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを得た。収率は、７０．０％であった。
【００４７】
製造例４：メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯのナノ粒子の調製方法
非特許文献３に記載された透析方法により製造例３で得られたメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ニトロキシラジカル含有ポリマーともいう）からラジカルナノ粒子（ｒａｄｉｃａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；以下、ＲＮＰと略記する）を調製した。概述すると、４００ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを１００ｍＬのＤＭＦに溶解した。こうして得られたポリマー溶液を膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｓｉｚｅ：
３，５００， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， ＵＳＡ）中に移し、次いで、２Ｌの水に対して２４時間透析した（水は２時間、５時間、８時間及び２０時間後に交換した。）。こうして得られたＲＮＰ含有液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実施し、ＲＮＰの直径を決定した。ＲＮＰ溶液の濃度を調節するために、得られたＲＮＰ溶液を遠心エバポレーターによりほぼ６０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、濃縮したＲＮＰのＤＬＳ測定を行い、濃縮後のＲＮＰのサイズを確認した。
【実施例１】
【００４８】
ＲＮＰを用いたムコスタの溶解性向上
スクリュー管に１．２ｍｇから８．４ｍｇまで０．６ｍｇ間隔でムコスタを量りとり、ＰＢＳ３ｍｌを加え、マグネティクスターラーを用いて２４時間撹拌した。同様の量をスクリュー管に量りとったものにＰＢＳ中の製造例４に従い製造されたＲＮＰの溶液６ｍｇ／ｍｌを３ｍｌ加え、２４時間撹拌した。撹拌後、０．２μｍのフィルターを通し、溶解していないムコスタを除去した後、二倍に希釈して、ムコスタ由来のＵＶ吸収を確認した。結果を図１に示す。図１から理解できるように、ＲＮＰを用いることでムコスタの溶解度がおよそ２倍程度に上昇したことが確認された。さらにムコスタ濃度２．０ｍｇ／ｍｌ時の粒径を下記に示す。
【実施例２】
【００４９】
ムコスタ内包後の粒子径分布と内包確認
動的光散乱法で測定したところ、図２示されるとおり、単分散な粒径分布が得られたことが確認できた。粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
【実施例３】
【００５０】
ＰＤ１０カラムに流しフラクションごとにムコスタ由来である、３５０ｎｍのＵＶ吸収を確認したところミセルと同じフラクションにピークを確認することができた（図３参照）。このことより、ムコスタがＲＮＰ粒子に内包されていることが示唆される。
【実施例４】
【００５１】
ＲＮＰとムコスタ内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤は、ミトコンドリアに障害を与え、ミトコンドリア外へ活性酸素を漏出し、細胞及び／または組織障害を惹起することが知られている。そこで、ここでは、ＲＯＳ産生による細胞障害モデルとして用い、ＲＮＰもしくは、ムコスタ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。
【００５２】
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を５×１０３個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同様に、ムコスタ内包ＲＮＰもＴＥＭＰＯ終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。直後、さらにインドメタシンを終濃度が５００μＭとなるよう細胞に添加し、２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図４に示す。図４からＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ムコスタを内包することで、ＲＮＰを単独で用いる（空のＲＮＰともいう）より、毒性を抑制することが確認された。
【実施例５】
【００５３】
抗酸化剤ビタミンEの内包と内包薬物の効果
５−１） ビタミンＥの内包
ニトロキシルラジカル含有ポリマー３６ｍｇとビタミンＥ（１０、５、１、０．１ｍｇ）をＤＭＦに対して透析を行った。結果を、図５に示す。図５から、ニトロキシルラジカル含有ポリマーとビタミンＥを一緒に透析処理することにより単分散な粒径分布のビタミンＥ内包ＲＮＰが得られ、粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
【００５４】
５−２） ＲＮＰとビタミンE内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
実施例４に記載のＲＯＳ産生による細胞障害モデル実験に準じて、ムコスタの代わりにビタミンＥを用い、ＲＮＰもしくは、ビタミンＥ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。結果を図６に示す。図６から、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ビタミンＥを内包することで、ＲＮＰを単独で用いるより、ビタミンＥの濃度依存的に上記毒性を抑制することが確認された。
【実施例６】
【００５５】
アルツハイマー治療薬 ピペリンの内包と内包薬物の効果
【００５６】
【化５】
【００５７】
６−１） Ａβアミロイド（１−４２）によるヒト神経芽細胞種株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）
アルツハイマー型障害の構築
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種株は、国立大学法人筑波大学の礒田博子（本願発明の発明者の一人）研究室より入手した。該細胞を、ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ； Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）の混合物と１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）、１％非必須ＭＥＭアミノ酸及び１％ペニシリン（５０００μｇ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍＬ）溶液を補足したハムのＦ−１２栄養混合物（Ｈａｍ’ｓＦ−１２ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）１：１（Ｖ／Ｖ）を用い、種々の目的に応じ、フラスコ中または６ｗｅｌｌ、２４ｗｅｌｌ、４８ｗｅｌｌもしくは９６ｗｅｌｌ上で、９５％加湿空気及び５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。なお、上記細胞は研究の目的で用いることを条件に、上記研究室に第三者の請求があれば自由に分譲される。細胞毒性アッセイには、イーグルの最少必須培地の血清不含改変培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いた。この実験では、細胞の付着のために、ヒト血漿から精製されたフィフロネクチン（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）５０μｇ／ｍＬで一昼夜プレートを前処理した。細胞集合を得る目的で、Ａβ１−４２を培地に溶解し、使用前に７２時間３７℃でインキュベートした。培養の２４−４８時間後、細胞（ほぼ８０％コンフルエントに達した）を培地で３度洗浄し、その後、異なる濃度のＡβ１−４２の存在下で血清を含まないダルベッコのＭＥＭ培地で４８時間インキュベートした。結果を図７に示す。ＴＥＭＰＯＬの保護効果を試験するために設計した実験では、４８時間Ａβ１−４２に曝す前に細胞を異なる濃度のＴＥＭＰＯＬとともに一昼夜処理した。図７より、本実験系ではＡβ１−４２の添加量を増すごとに神経芽細胞障害がみられた。
【００５８】
６−２） ＲＮＰによるアルツハイマーモデルの低減効果
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を１×１０４個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、５ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同時に、Ａβ１-４２（１０％（ｖ／ｖ），１０μＬ）となるように培地に添加した。２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図８に示す。図８より、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にＡβ１-４２の毒性を抑制することが確認された。また、図８に示されるようにＲＮＰの０．０１ｍＭから１ｍＭまでの濃度で細胞生存率が向上している。３ｍＭ以上では毒性が出て効果があまり変わらない。
【００５９】
６−３） ＲＮＰ＋ピペリンのＡβ１−４２障害細胞に対する効果
６−２)と同様にＲＮＰ単独の代わりにＲＮＰにピペリンを加えて評価を行った。結果を図９及び図１０に示す。
【００６０】
図９では０．１−１０μＭまで抗酸化効果がみられるが、２０μＭ以上では毒性がみられる。一方、図１０では、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、特にＲＮＰ１ｍＭではピペリン１００μＭでも全く毒性が見られず、Ａｂ１−４２障害をほぼ完全に消去していることが理解できる。
【００６１】
６−４）
図１１には、ＮＢＴ法を用いて測定したスーパーオキシド産生量を示した。ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。また図１２には、ヒドロキシラジカル産生量を示す。ヒドロキシラジカル産生量は、デオキシリボース分解法により測定を行った。図１２からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。
【００６２】
６−５）
通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞はアポトーシスを惹起し、図１３に示すように、ＤＮＡの断片化（Enrichment factor）を引き起こす。Camptothecinは、アポトーシスを誘発する化合物として知られており、図１３からもわかるとおり、ＤＮＡの断片化が生じている。一方、ＲＮＰ単独やＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、ＤＮＡの断片化がほとんど生じていないことが分かり、このことからアポトーシスを抑制していることが理解できる。
【００６３】
６−６）
図１４には、チオバルビツール酸法を用いて測定した脂質過酸化の定量結果を示した。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１４に示すように、脂質過酸化(ＭＤＡ＋ＨＡＥ)の量が増加する。一方、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に脂質過酸化の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも脂質過酸化の量を抑制することが理解できる。また図１５には、タンパク質が酸化された指標となるカルボニル化蛋白（プロテインカルボニル）の定量結果を示す。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１５に示すように、カルボニル化蛋白の量が増加する。カルボニル化蛋白の量は、ELISA法により測定を行った。図１５からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にカルボニル化蛋白の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりもカルボニル化蛋白の量を抑制することが理解できる。また同様に、図１６には、核酸が酸化された指標となる８−ＯＨｄＧの定量結果を示す。Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１６に示すように、８−ＯＨｄＧの量が増加する。図１６からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に８−ＯＨｄＧの量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも８−ＯＨｄＧの量を抑制することが理解できる。
【００６４】
６−７）
図１７に、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を示す。また図１８には、細胞内のカタラーゼ（ＣＡＴ）の活性を示す。グルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼは、Ａβアミロイドを神経芽細胞に添加しても活性が増加することはない。またＲＮＰ単独でもＧＰｘ活性及びＣＡＴ活性ともにないのに対し、ピペリンを加えると高い活性が生じる。これらの結果は、ＲＮＰがスーパーオキシド及びヒドロキシラジカルの還元に極めて有効なのに対し、ピペリンは過酸化水素の還元を効果的に行う。このため、ＲＮＰ＋ピペリンはアルツハイマー疾患に対して高い活性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により提供される高分子ミセルまたは組成物は、水溶液に対して難溶解性の薬剤の溶解性を向上させることができるだけでなく、ＲＮＰと組み合わせることにより極めて高い抗酸化能を有する薬剤として機能するため、活性酸素もしくはラジカル種（ＲＯＳ）が媒介（または関与）疾患または障害の治療または予防に有効である。したがって、限定されるものでないが、医薬、化粧品または食品の製造業で利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素やフリーラジカル消去能及び抗酸化能を有する組成物に関する。より具体的には、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物及び抗酸化剤を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素やラジカル種（ＲＯＳ）による酸化的ストレスが、血管を障害し、老化や癌化を促進するだけでなく、様々な疾病の原因となることが明らかになりつつある。実際に、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病（非特許文献１）等の脳疾患のみならず、様々な虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（非特許文献２）または癌もしくは加齢等の広範な疾患に関与していることが明らかになるかまたは明らかになりつつある。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下は、活性酸素やフリーラジカル種による細胞障害によりもたらされることが知られている。そこで、ＲＯＳを効率よく消去するため、天然物もしくは合成物質等様々な抗酸化剤が検討されている。その中で、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）などのようなさまざまな低分子抗酸化物質の開発がおこなわれているものの、腎臓からの急速な排泄などの問題点を有していた。このような背景を考慮し、本発明者らは最近、ＲＯＳに対する反応性を制御する材料設計に際し、生体適合性高分子にＴＥＭＰＯ様ニトロキシラジカルを結合し、その自己組織化を利用したナノ粒子を形成すると、これまでに提案されてきた低分子化合物に比較して極めて長時間生体内で安定に存在することを見出した（非特許文献３））。例えば、低分子のＴＥＭＰＯは血中投与後最短測定時間の２分後での検出は不可能であるのに対し、本発明者らの提供したナノ粒子封入ＴＥＭＰＯ等は半減期が数時間以上と圧倒的な安定性を示した（非特許文献４）。このラジカルナノ粒子（ＲＮＰ）を脳虚血再灌流によるダメージに適用したところ、大きな酸化ストレス障害抑制効果が見られ、効果的なＲＯＳ抑制効果を示した。本発明者らは以上の成果をまとめて特許出願も行った（特許文献１）。
【０００３】
他方、ＴＥＭＰＯ等以外の多種多様な低分子抗酸化剤も医療をはじめとする種々の分野で実用されているが、抗酸化能が一定の目的上十分でないか、中には、水難溶解性であるために利用分野が限定され、また、効果が制限されるものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ ２００９／１３３６４７
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｒｉａｚａｎｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｙｃｈｉａｔｒｙ （２００２）， ７（８）， ８９１
【非特許文献２】Ｒ．Ｓｃｈｅｒｚ−Ｓｈｏｕｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２００７），１７（９），４２２
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：１０（３）５９６（２００９）
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕ． Ｃｈｅｍ．，２０ １７９２（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＴＥＭＰＯ等では、それらを特定の高分子化合物を用いて高分子化することにより所期の目的を達成することに成功した。しかし、このような高分子化したＴＥＭＰＯであっても、さらにその機能を高めることができれば当該技術分野により一層貢献できるであろう。また、ＴＥＭＰＯ以外の低分子抗酸化剤のうち、特に、水難溶解性であるが故に、利用分野が限定され、また、効果が制限される抗酸化剤の機能を高めることに対するニーズは低分子ＴＥＭＰＯに対するのと同様に存在するであろう。
【０００７】
本発明では、今ここに、低分子抗酸化剤を短に高分子化するのでなく、上記の高分子化ＴＥＭＰＯ等と組み合わせて使用することにより、低分子化抗酸化剤の利用分野を拡張できるとともに、高分子化ＴＥＭＰＯ等の抗酸化活性を有意に向上できることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明によれば、低分子抗酸化剤と高分子化ＴＥＭＰＯをはじめとする高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物、およびこのような組成物の活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の予防もしくは治療分野での使用が提供される。
【０００９】
該組成物によると、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の抗酸化能をさらに向上させることができることのみならず、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合には、その抗酸化能を保持したまま、それらを水可溶性にすることができる。
【００１０】
したがって、本願明細書は下記の態様の発明を提供することにより上記課題を解決することができる。
【００１１】
態様１：低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。
【００１２】
態様２：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化１】
【００１４】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−
Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、上記組成物。
【００１５】
態様３：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる、上記組成物。
【００１６】
態様４：高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセルに内包されている、上記態様１〜３のいずれかの組成物。
【００１７】
態様５：上記態様１〜４のいずれかを有効成分として含んでなる、活性酸素もしくはラジカル種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
以下、本発明で使用できる低分子抗酸化剤及び高分子化環状ニトキシドラジカル化合物についてより具体的に記述する。
【００１９】
低分子抗酸化剤にいう、低分子とは、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物にいう高分子と対比しうる概念を表すものとして用いている。したがって、重合体は排除される。この様な低分子抗酸化剤としては、抗酸化作用を示し、本発明の目的に沿うものであれば限定されるものでないが、ムコスタ（レバミピド）及びその類延体（Ｍａｓａｔｅｒｕ Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１１（２００６）２７−３４、参照）、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、ピペリン、等の水難溶解性の抗酸化剤、ならびに
ビタミンＣ（アスコルビン酸）、グルタチオン、フラボノイド、尿酸、等の水溶性抗酸化剤、ならびに
スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、セルロプラスミン、メタロチオネイン、チオレドキシン、等のタンパク質性抗酸化剤、ならびに
白金コロイド、フラーレン、等の粒子状抗酸化剤
を挙げることができる。
【００２０】
一方、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物としては、上記特許文献１に記載された環状ニトロキシドラジカル化合物を安定化するために高分子化したものであって、本発明の目的に沿うものであれば限定されることなく種々の高分子化合物により高分子化されたものも挙げることができる（特許文献１の全内容は、ここに引用することにより本明細書に取り込まれる）。このような安定化の典型的な方法について採録すれば、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基と該共重合体の反応性基を介して共有結合せしめる工程を含んでなる方法である。該方法において、具体的には、該官能基がアミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基であり、そして前記ブロック共重合体は該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合された形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成できるものである。
【００２１】
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物としては、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、上記高分子化ニトロキシドラジカル化合物を挙げることができる。
【００２２】
より具体的には、特許文献１に記載の一般式（ＩＩ）
【００２３】
【化２】
【００２４】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子価結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−及び−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物であることができる。さらに、一般式（ＩＩ）において、Ｌ１が原子価結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【００２５】
【化３】
【００２６】
式中、Ｒ’はメチル基である、
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、これらの化合物から形成できる高分子ミセルの安定化にｐＨ応答性を付与する点でも特に好ましいものとして提供される。
【００２７】
上記の各基または部分の定義において、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシのアルキル部分は、直鎖または分岐のアルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ドデカニル等を挙がることができる。また、Ａが、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−で置換されたアルコキシ基を表し、かつ、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す場合には、このような置換基は酸性条件下で容易に開裂してホルミル基に転化できるので、タンパク質もしくはペプチド（例えば、抗体その他のリガンド）等をそのアミノ基を介して容易に共有結合できる。かような置換基は、存在する場合には、アルコキシ基の未結合末端に存在するのが好ましい。これらの置換基は、例えば、上記特許文献２及び３に記載のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントの生成方法を参照して導入できる。
【００２８】
また、上記ブロック共重合体における、連結基Ｌ１は、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとポリ（スチレン）をどのように結合させるかにより代わり得るので限定され
るものでない。例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントをアニオンリビング重合で生成し、次いで、ハロメチルスチレンのリビング重合を継続する場合には、Ｌ１は原子価結合となる。ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントのω−末端に硫黄原子を持つポリ（エチレングリコール）誘導体を用意した場合は、該誘導体の存在下にハロメチルスチレンのラジカル重合を行うことで連結基が、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−となり得る。
【００２９】
本発明に従う組成物は、上記低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物を、必要により、希釈剤または他の製薬学的に常用されている賦形剤の存在下で混合することにより調製できる。低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の混合比率は、限定されるものでないが、重量基準で、１：９９〜９９：１、好ましくは、３：９７〜６０：４０である。
【００３０】
上記のような高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、緩衝化水溶液または水混和性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、アセトニトリル等を含有していてもよい水性媒体中で自己組織化することによってコア領域にニトロキシドラジカル部分が担持されるかもしくは存在し、シェル領域にポリ（エチレングリコール）鎖が存在するとみなせる数十ないし数百ナノメーター（ｎｍ）範囲内の粒子径を有する高分子ミセルを形成する。このような高分子ミセル形成の際に、または形成後に、低分子抗酸化剤、特に、水難溶解性抗酸化剤を水性媒体中で共存させておけば、該抗酸化剤を高分子ミセル中に内包させることができる。本発明の組成物の好ましいものとしては、低分子抗酸化剤を該高分子ミセルに内包したものを挙げることができる。このような形態をした本発明の組成物は、環状ニトロキシドラジカル化合物と低分子抗酸化剤が一体となって働き易く、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合はそれを水性媒体中で可溶化した状態にすることができる。
【００３１】
こうして形成する高分子ミセルは、ミセル形成水性液中で、例えば遠心または透析により分離、精製でき、また、凍結乾燥品としても提供できる。このような高分子ミセル内の低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の含有比率は、抗酸化剤対高分子化環状ニトキシドラジカル化合物に担持される環状ニトキシドラジカル化合物のモル比で、１：１〜１：１００００、好ましくは、１：４〜１：１００、より好ましくは１：５であることができる。
【００３２】
こうして水難溶解性抗酸化剤の少なくとも一部が内包された高分子ミセルまたは組成物は、水性媒体中で可溶化でき、従来、水難溶解性のため利用分野が限定されていた抗酸化剤の用途を大きく拡張できる。また、該高分子ミセルに内包された抗酸化剤は、仮に、それら自体が生体に対して強力な毒性を有している場合であってもその毒性を有意に軽減できる。一方、抗酸化剤が水溶性抗酸化剤であっても、高分子化ニトロキシドラジカル化合物と抗酸化剤を共存させるかまたは組み合わせることにより調製した組成物は、該高分子ミセルと同様に、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができる。質的に増強とは、例えば、ニトロキシドラジカルによる抗酸化作用等とそれと組み合わされる抗酸化剤による抗酸化作用、抗炎症作用、胃粘膜保護作用等のそれぞれの異なる作用が、相互に悪影響を受けることなく両作用を発揮し、例えば、酸化過程より複雑な機序による場合には、かような酸化過程全体を効果的に抑制できる等の作用を意味する。
【００３３】
該高分子ミセルまたは組成物は、限定されるものでないが、全体として低毒性であり、また、水可溶性である等の性質を有することから、経口投与用及び非経口投与用の医薬製剤中の有効成分として都合よく利用できる。また、該高分子ミセルまたは組成物は、後述する実施例で明らかにされるとおりに全く異なる抗酸化等について試験するモデル実験で
高い効果を奏し、また、上述したとおり、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができるので、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する広範な疾患もしくは障害の予防もしくは治療用の有効成分として利用できる。
【００３４】
活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病等の脳疾患、心筋梗塞などの虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（例えば、潰瘍性大腸炎）、癌もしくは加齢（紫外線照射による皮膚の老化、シワの形成）、動脈硬化、糖尿病、肺気腫や炎症性皮膚疾患等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害を挙げることができる。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下等に起因する、ＮＳＡＩＤｓによる消化管障害や腎機能不全も挙げることができる。
【００３５】
このよう該高分子ミセルまたは組成物は、多岐にわたる疾患もしくは障害の治療または予防に効果を発揮する有効成分として利用できるので、使用対象に応じて適切な剤形（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で、それぞれの治療有効量を製薬学的に許容されるキャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに含む製剤として提供できる。このような剤形としては、経口的、直腸的、局所的、経皮的、体内埋植的または非経口的注射による投与に適する単位剤形を挙げることができる。これらの製剤は、有効成分としての該高分子ミセルまたは組成物を、キャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに、それ自体既知の調剤方法により調製できる。例えば、経口剤形を調製するには、経口剤を調製すのに常用されている製剤媒質、例えば、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤及び液剤等の経口液状製剤の場合には、水、グリコール、油脂、アルコール等、あるいは散剤、丸薬、カプセル剤及び錠剤の場合には、固形キャリヤー、例えば、澱粉、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を使用できる。非経口剤形、特に、注射用液剤もしくは懸濁剤を調製するには、キャリヤーもしくは希釈剤は、主として滅菌水または生理食塩水であることができ、必要により、懸濁化剤を含めることができ、また生理食塩水とともにもしくは独立して、グルコース等の糖溶液を用いることができる。経皮投与剤形にあっては、キャリヤーは、経皮投与に適するキャリヤー及び、必要に応じ、皮膚浸透促進剤もしくは湿潤剤を含めることができる。また、局所的投与剤形は、クリーム剤、ゼリー剤、ローション剤、軟膏剤であることができる。
【００３６】
このような剤形は、該有効成分の投与を必要とする患者に対し、それぞれの剤形に適する投与経路で対象とする疾患もしくは障害の治療有効量を投与することにより、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の治療または予防をすることができる。有効量は、対象とする疾患もしくは障害、それらの重篤度、年齢、体重等により最適量が変動するので限定できないが、専門家が臨床試験等の試験の結果に基づいて判断できるであろう。
【００３７】
該有効成分は、他の有効成分、すなわち、対象とする疾患もしくは障害の治療もしくは予防に既に使用されているか、または使用することが提案されている医薬と、同時に、または前後して投与できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１におけるＲＮＰと低分子抗酸化剤ムコスタを水性媒体中で撹拌することにより変化するムコスタの溶解度のグラフ表示である。
【図２】実施例２におけるムコスタ内包ＲＮＰの粒子内径分布グラフ表示である。
【図３】実施例３における、ムコスタ内包ＲＮＰをＰＤ１０カラムに流したときの流出パターンのグラフ表示である。
【図４】実施例４における、ムコスタ内包ＲＮＰのインドメタシンの細胞毒性に対する影響のグラフ表示である。
【図５】実施例５の５−１）における、ＲＮＰまたはビタミンＥ内包ＲＮＰの粒径分布のグラフ表示である。■はＲＮＰ＋ビタミンＥ１０の系、●はＲＮＰ＋ビタミンＥ５の系、▲はＲＮＰ＋ビタミンＥ１の系、▼はＲＮＰ＋ビタミンＥ０．１の系、◆はＲＮＰのみの系の結果を表す。
【図６】実施例５の５−２）における、ＲＮＰとビタミンE内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果を示すグラフ表示である。●はＲＮＰ＋ビタミンＥ０の系、■はＲＮＰ＋ビタミンＥ０．１の系、▲はＲＮＰ＋ビタミンＥ１の系、▼はＲＮＰ＋ビタミンＥ５の系、◆はＲＮＰ＋ビタミンＥ１０の系の結果を表す。
【図７】実施例６の６−１）におけるヒト神経芽細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に対するＡβアミロイド（１−４２）の障害活性のグラフ表示である。
【図８】実施例６の６−２）における、ＲＮＰによるＡβ１−４２障害神経芽細胞への作用のグラフ表示である。
【図９】実施例６の６−４）における、Ａβ１−４２障害神経芽細胞に対するピペリン単独の効果のグラフ表示である。網模様の棒はＡβ1-42のみを添加したときの細胞生存率を表す。
【図１０】実施例６の６−４）における、Ａβ１−４２障害神経芽細胞に対するＲＮＰ＋ピペリン（ＰＩ）の効果のグラフ表示である。それぞれ、黒塗り棒はＰＩのみに関し、斜線の棒はＰＩ＋Ａβ＋ＲＮＰ−Ｎ（１ｍＭ）に関するデータである。
【図１１】ＮＢＴ法を用いて測定したスーパーオキシド産生量のグラフ表示である。
【図１２】デオキシリボース分解法を用いて測定したヒドロキシラジカル産生量のグラフ表示である。
【図１３】Ａβアミロイドを添加した後のアポトーシス量のグラフ表示である。
【図１４】脂質過酸化量のグラフ表示である。
【図１５】カルボニル化蛋白のグラフ表示である。
【図１６】ＤＮＡの断片化量のグラフ表示である。
【図１７】グルタチオンペルオキシダーゼ活性のグラフ表示である。
【図１８】カタラーゼ活性のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明をより具体的に説明するために、特定の高分子化ニトロキシドラジカル化合物として特許文献１の製造例１〜３（下記に採録する）に従って製造したメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ＲＮＰという）と低分子抗酸化剤としてムコスタを用いて本発明に従う組成物を調製した例について説明する。
【００４０】
製造例１：α―末端にアセタール基を有するポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の合成
アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
【００４１】
【化４】
【００４２】
α―末端にアセタール基、ω―末端にチオール基を有しているヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：４，６００；０．０２ｍｍｏｌ，９２ｍｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１ｍＬのアゾビスイソブチロニトリル／ベンゼン（０．０１ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液とクロロメチルスチレン（１ｍｍｏｌ，０．１３８ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をヘキサン中に流し込んだところ、白い沈殿が生じた。ポリクロロメチルスチレンホモポリマーを除去するために、得られた沈殿物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１３４ｍｇであり、収率は５５．１％であった。得られたアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定の結果から、二峰性の分布が確認された。生成物の情報を得るために、ＳＥＣを用いてこの２つの分布を分別し、それぞれのフラクションの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００４３】
その結果、二つのフラクションのＰＥＧとＰＣＭＳの成分比率がほぼ同じであることが明らかとなった。また、得られたブロック共重合体中のＰＣＭＳセグメントの分子量を算出するために、ＳＥＣより決定したアセタール−ＰＥＧ−ＳＨの分子量に基づき１Ｈ ＮＭＲスペクトルを解析ところ、ＰＣＭＳセグメントの分子量は、それぞれ３，３００、６，６００であることが明らかとなった）。これらの結果により、二峰性の分布は、一方がジブロック共重合体の生成物であり、他方がトリブロック共重合体の生成物であることが明らかとなった。これは、テロメリゼーション中のジブロック共重合体同士の再結合により、トリブロック共重合体が生成したということが示唆される。また、ピークフィッティングにより、ジブロック共重合体とトリブロック共重合体の成分比は、２３％と７７％であることが確認された。
【００４４】
製造例２：イミノ結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；４０ｍｇ，５．２μｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（８８ｍｇ，５２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、７６．３％であった。
【００４５】
１Ｈ ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた。またサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分取し、各フラクションにおけるＥＳＲシグナルを測定した。その結果、再沈殿の回数が増すごとに２０
分〜２７分に見られる未反応アミノ−ＴＥＭＰＯのＥＳＲシグナルが消失したことから、未反応のアミノ−ＴＥＭＰＯが精製によって完全除去されていることが確認された。
【００４６】
製造例３：エーテル結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；２００ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）を加え、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。次に、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（２６０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）とＮａＨ（７０．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、目的のメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを得た。収率は、７０．０％であった。
【００４７】
製造例４：メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯのナノ粒子の調製方法
非特許文献３に記載された透析方法により製造例３で得られたメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ニトロキシラジカル含有ポリマーともいう）からラジカルナノ粒子（ｒａｄｉｃａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；以下、ＲＮＰと略記する）を調製した。概述すると、４００ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを１００ｍＬのＤＭＦに溶解した。こうして得られたポリマー溶液を膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｓｉｚｅ：
３，５００， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， ＵＳＡ）中に移し、次いで、２Ｌの水に対して２４時間透析した（水は２時間、５時間、８時間及び２０時間後に交換した。）。こうして得られたＲＮＰ含有液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実施し、ＲＮＰの直径を決定した。ＲＮＰ溶液の濃度を調節するために、得られたＲＮＰ溶液を遠心エバポレーターによりほぼ６０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、濃縮したＲＮＰのＤＬＳ測定を行い、濃縮後のＲＮＰのサイズを確認した。
【実施例１】
【００４８】
ＲＮＰを用いたムコスタの溶解性向上
スクリュー管に１．２ｍｇから８．４ｍｇまで０．６ｍｇ間隔でムコスタを量りとり、ＰＢＳ３ｍｌを加え、マグネティクスターラーを用いて２４時間撹拌した。同様の量をスクリュー管に量りとったものにＰＢＳ中の製造例４に従い製造されたＲＮＰの溶液６ｍｇ／ｍｌを３ｍｌ加え、２４時間撹拌した。撹拌後、０．２μｍのフィルターを通し、溶解していないムコスタを除去した後、二倍に希釈して、ムコスタ由来のＵＶ吸収を確認した。結果を図１に示す。図１から理解できるように、ＲＮＰを用いることでムコスタの溶解度がおよそ２倍程度に上昇したことが確認された。さらにムコスタ濃度２．０ｍｇ／ｍｌ時の粒径を下記に示す。
【実施例２】
【００４９】
ムコスタ内包後の粒子径分布と内包確認
動的光散乱法で測定したところ、図２示されるとおり、単分散な粒径分布が得られたことが確認できた。粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
【実施例３】
【００５０】
ＰＤ１０カラムに流しフラクションごとにムコスタ由来である、３５０ｎｍのＵＶ吸収を確認したところミセルと同じフラクションにピークを確認することができた（図３参照）。このことより、ムコスタがＲＮＰ粒子に内包されていることが示唆される。
【実施例４】
【００５１】
ＲＮＰとムコスタ内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤は、ミトコンドリアに障害を与え、ミトコンドリア外へ活性酸素を漏出し、細胞及び／または組織障害を惹起することが知られている。そこで、ここでは、ＲＯＳ産生による細胞障害モデルとして用い、ＲＮＰもしくは、ムコスタ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。
【００５２】
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を５×１０３個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同様に、ムコスタ内包ＲＮＰもＴＥＭＰＯ終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。直後、さらにインドメタシンを終濃度が５００μＭとなるよう細胞に添加し、２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図４に示す。図４からＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ムコスタを内包することで、ＲＮＰを単独で用いる（空のＲＮＰともいう）より、毒性を抑制することが確認された。
【実施例５】
【００５３】
抗酸化剤ビタミンEの内包と内包薬物の効果
５−１） ビタミンＥの内包
ニトロキシルラジカル含有ポリマー３６ｍｇとビタミンＥ（１０、５、１、０．１ｍｇ）をＤＭＦに対して透析を行った。結果を、図５に示す。図５から、ニトロキシルラジカル含有ポリマーとビタミンＥを一緒に透析処理することにより単分散な粒径分布のビタミンＥ内包ＲＮＰが得られ、粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
【００５４】
５−２） ＲＮＰとビタミンE内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
実施例４に記載のＲＯＳ産生による細胞障害モデル実験に準じて、ムコスタの代わりにビタミンＥを用い、ＲＮＰもしくは、ビタミンＥ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。結果を図６に示す。図６から、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ビタミンＥを内包することで、ＲＮＰを単独で用いるより、ビタミンＥの濃度依存的に上記毒性を抑制することが確認された。
【実施例６】
【００５５】
アルツハイマー治療薬 ピペリンの内包と内包薬物の効果
【００５６】
【化５】
【００５７】
６−１） Ａβアミロイド（１−４２）によるヒト神経芽細胞種株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）
アルツハイマー型障害の構築
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種株は、国立大学法人筑波大学の礒田博子（本願発明の発明者の一人）研究室より入手した。該細胞を、ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ； Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）の混合物と１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）、１％非必須ＭＥＭアミノ酸及び１％ペニシリン（５０００μｇ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍＬ）溶液を補足したハムのＦ−１２栄養混合物（Ｈａｍ’ｓＦ−１２ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）１：１（Ｖ／Ｖ）を用い、種々の目的に応じ、フラスコ中または６ｗｅｌｌ、２４ｗｅｌｌ、４８ｗｅｌｌもしくは９６ｗｅｌｌ上で、９５％加湿空気及び５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。なお、上記細胞は研究の目的で用いることを条件に、上記研究室に第三者の請求があれば自由に分譲される。細胞毒性アッセイには、イーグルの最少必須培地の血清不含改変培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いた。この実験では、細胞の付着のために、ヒト血漿から精製されたフィフロネクチン（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）５０μｇ／ｍＬで一昼夜プレートを前処理した。細胞集合を得る目的で、Ａβ１−４２を培地に溶解し、使用前に７２時間３７℃でインキュベートした。培養の２４−４８時間後、細胞（ほぼ８０％コンフルエントに達した）を培地で３度洗浄し、その後、異なる濃度のＡβ１−４２の存在下で血清を含まないダルベッコのＭＥＭ培地で４８時間インキュベートした。結果を図７に示す。ＴＥＭＰＯＬの保護効果を試験するために設計した実験では、４８時間Ａβ１−４２に曝す前に細胞を異なる濃度のＴＥＭＰＯＬとともに一昼夜処理した。図７より、本実験系ではＡβ１−４２の添加量を増すごとに神経芽細胞障害がみられた。
【００５８】
６−２） ＲＮＰによるアルツハイマーモデルの低減効果
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を１×１０４個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、５ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同時に、Ａβ１-４２（１０％（ｖ／ｖ），１０μＬ）となるように培地に添加した。２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図８に示す。図８より、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にＡβ１-４２の毒性を抑制することが確認された。また、図８に示されるようにＲＮＰの０．０１ｍＭから１ｍＭまでの濃度で細胞生存率が向上している。３ｍＭ以上では毒性が出て効果があまり変わらない。
【００５９】
６−３） ＲＮＰ＋ピペリンのＡβ１−４２障害細胞に対する効果
６−２)と同様にＲＮＰ単独の代わりにＲＮＰにピペリンを加えて評価を行った。結果を図９及び図１０に示す。
【００６０】
図９では０．１−１０μＭまで抗酸化効果がみられるが、２０μＭ以上では毒性がみられる。一方、図１０では、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、特にＲＮＰ１ｍＭではピペリン１００μＭでも全く毒性が見られず、Ａｂ１−４２障害をほぼ完全に消去していることが理解できる。
【００６１】
６−４）
図１１には、ＮＢＴ法を用いて測定したスーパーオキシド産生量を示した。ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。また図１２には、ヒドロキシラジカル産生量を示す。ヒドロキシラジカル産生量は、デオキシリボース分解法により測定を行った。図１２からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。
【００６２】
６−５）
通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞はアポトーシスを惹起し、図１３に示すように、ＤＮＡの断片化（Enrichment factor）を引き起こす。Camptothecinは、アポトーシスを誘発する化合物として知られており、図１３からもわかるとおり、ＤＮＡの断片化が生じている。一方、ＲＮＰ単独やＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、ＤＮＡの断片化がほとんど生じていないことが分かり、このことからアポトーシスを抑制していることが理解できる。
【００６３】
６−６）
図１４には、チオバルビツール酸法を用いて測定した脂質過酸化の定量結果を示した。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１４に示すように、脂質過酸化(ＭＤＡ＋ＨＡＥ)の量が増加する。一方、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に脂質過酸化の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも脂質過酸化の量を抑制することが理解できる。また図１５には、タンパク質が酸化された指標となるカルボニル化蛋白（プロテインカルボニル）の定量結果を示す。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１５に示すように、カルボニル化蛋白の量が増加する。カルボニル化蛋白の量は、ELISA法により測定を行った。図１５からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にカルボニル化蛋白の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりもカルボニル化蛋白の量を抑制することが理解できる。また同様に、図１６には、核酸が酸化された指標となる８−ＯＨｄＧの定量結果を示す。Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１６に示すように、８−ＯＨｄＧの量が増加する。図１６からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に８−ＯＨｄＧの量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも８−ＯＨｄＧの量を抑制することが理解できる。
【００６４】
６−７）
図１７に、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を示す。また図１８には、細胞内のカタラーゼ（ＣＡＴ）の活性を示す。グルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼは、Ａβアミロイドを神経芽細胞に添加しても活性が増加することはない。またＲＮＰ単独でもＧＰｘ活性及びＣＡＴ活性ともにないのに対し、ピペリンを加えると高い活性が生じる。これらの結果は、ＲＮＰがスーパーオキシド及びヒドロキシラジカルの還元に極めて有効なのに対し、ピペリンは過酸化水素の還元を効果的に行う。このため、ＲＮＰ＋ピペリンはアルツハイマー疾患に対して高い活性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により提供される高分子ミセルまたは組成物は、水溶液に対して難溶解性の薬剤の溶解性を向上させることができるだけでなく、ＲＮＰと組み合わせることにより極めて高い抗酸化能を有する薬剤として機能するため、活性酸素もしくはラジカル種（ＲＯＳ）が媒介（または関与）疾患または障害の治療または予防に有効である。したがって、限定されるものでないが、医薬、化粧品または食品の製造業で利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。
【請求項２】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化１】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる請求項２記載の組成物。
【請求項４】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
有効成分としての低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物、並びに製薬学的に許容されるキャリヤーもしくは希釈剤を含んでなる活性酸素もしくはラジカル
種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。
【請求項６】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化２】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項４記載の製薬学的製剤。
【請求項７】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる請求項５記載の製薬学的製剤。
【請求項８】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の製薬学的製剤。
【請求項９】
疾患または障害が、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病、脳梗塞等の脳疾患、心筋梗塞などの虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（例えば、潰瘍性大腸炎）、癌もしくは加齢（紫外線照射による皮膚の老化、シワの形成）、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下等に起因する消化管障害や腎機能不全、ま
た炎症、高血圧、高脂血症、肥満動脈硬化等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害からなる群から選ばれる請求項５〜８のいずれか一項に記載の製薬学的製剤。
【請求項１】
低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。
【請求項２】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化１】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる請求項２記載の組成物。
【請求項４】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
有効成分としての低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物、並びに製薬学的に許容されるキャリヤーもしくは希釈剤を含んでなる活性酸素もしくはラジカル
種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。
【請求項６】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化２】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項４記載の製薬学的製剤。
【請求項７】
低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる請求項５記載の製薬学的製剤。
【請求項８】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセル内に内包されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の製薬学的製剤。
【請求項９】
疾患または障害が、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病、脳梗塞等の脳疾患、心筋梗塞などの虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（例えば、潰瘍性大腸炎）、癌もしくは加齢（紫外線照射による皮膚の老化、シワの形成）、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下等に起因する消化管障害や腎機能不全、ま
た炎症、高血圧、高脂血症、肥満動脈硬化等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害からなる群から選ばれる請求項５〜８のいずれか一項に記載の製薬学的製剤。
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１８４４２９（Ｐ２０１１−１８４４２９Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３３２９６（Ｐ２０１０−１３３２９６）
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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