新規なサッカロスリックス株およびそれに由来する抗生物質、すなわち、ムタクチマイシンおよびアルドガマイシン
本発明は、２００４年２月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３１６０として寄託された新規なサッカロスリックス・アクチノミセテ(Saccharothrix actinomycete)ＳＡ１０３株またはその突然変異株；該株の選択のための方法および培地；ならびに該ＳＡ１０３株培養物からの培養液、活性濃縮物および活性化合物の製造方法に関する。本発明はまた、該製造方法によって得ることができる活性化合物、すなわち、新規なムタチマイシン(mutatimycin)およびアルドガマイシン、該活性化合物を含んでなる医薬組成物、ならびに医薬および植物薬におけるその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２００４年２月６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３１６０として寄託された新規な放線菌株サッカロスリックス(Saccharothrix)ＳＡ１０３またはその突然変異株、該株を選択するための方法および培地、該ＳＡ１０３株の培養物から培養培地、活性濃縮物および活性化合物を製造する方法に関する。本発明はまた、この製造方法によって得ることができる活性化合物、特に新規なムタクチマイシンおよびアルドガマイシン、これらの活性化合物を含んでなる医薬組成物、ならびに医学および植物薬の分野におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
抗微生物剤は、ヒトの健康、獣医学、植物病理学、食品工業、皮や木材の処置など多くの分野で広く用いられている。これらの薬剤の大部分のものは微生物によって生産されたものであり、なかでも放線菌が最も重要である。
【０００３】
新規な抗微生物剤、特に抗菌抗生物質が常に探し求められている。
実際、細菌はその本領により指数関数的に増殖し、これにより遺伝子の突然変異によって抗生物質耐性となる機会を高めることが知られている。
【０００４】
動物の領域、特にヒト、または植物で、また、食品工業や皮革工業でも、抗生物質の使用が不適切であれば、細菌の突然変異能が高まり、抗生物質耐性となる。
この問題の解決策の１つは、分別を持って抗生物質を投与することであるのは明白であるが、この解決策は予防策でしかない。
【０００５】
よって、当技術分野の現状では、新規な抗生物質を開発する必要がある。この目的で、研究者らは極限環境微生物に着目してきた。
【０００６】
本発明者らはこれによりアルジェリアのサハラ以南の土壌に存在する新規な放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３を単離し、これを２００４年２月１６日にＣＮＣＭ(Collection National de Cultures de Microorgansimes)に番号Ｉ−３１６０として寄託した。
【０００７】
本発明者らはまた、この株がアントラサイクリン種の活性化合物（そのいくつか、詳しくはムタクチマイシン（ＰＲ、Ｆ、Ｇ）はこれまでに確認されたことのないものであった）、また、アントラサイクリン種の活性化合物、詳しくはアルドガマイシン（Ｇ、ＨおよびＰ１０ｂ）を産生することも発見した。これらの活性化合物は、特にグラム陽性菌に対する抗菌活性と、抗ウイルス活性、抗増殖活性および抗癌活性を有する。
【０００８】
よって、本発明者らは、２００４年２月１６日にＣＮＣＭにＩ−３１６０として登録されたサッカロスリックスＳＡ１０３株からこれらの化合物を得る方法を開発し、その方法は実施が簡単であるという利点を持っている。従って、サッカロスリックス株から得られたこれらの抗生物質化合物はヒトおよび動物の双方で実質的な医薬として注目され、また、植物衛生としても注目され、工業規模での生産が可能である。
【０００９】
これがまさに本発明の目的である。
よって、本発明の主要な課題は、２００４年２月１６日にＣＮＣＭにＩ−３１６０として登録された放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３またはその突然変異株である。
【００１０】
本願において「突然変異株」、「変異体株」または「変異体」は、下記の活性化合物の少なくとも１つを産生する能力を保存することによりサッカロスリックスＳＡ１０３株からの選択的突然変異により得ることができるサッカロスリックス株を等しく意味する。この突然変異技術は当業者に公知のものであり、サッカロスリックスＳＡ１０３株を放射線などの物理的突然変異誘発剤、または例えばアクリフラビンなどの化学突然変異誘発剤の存在下に置いた後、適当な培地において、抗生物域（例えば最小阻害濃度法、すなわちＭＩＣなどの微生物阻害法）を用いることで残存する目的の突然変異株を選択することからなる。
【００１１】
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株は、本願の「実施例」の部分に記載されている。
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株またはその突然変異株の１つは、放線菌の増殖に一般に用いられる種々の栄養物質を含有する培地で培養する。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、スクロース、デンプン、マルトース、または動物油もしくは植物油が使用できる。窒素源としては、例えば、ダイズ粉末、肉抽出物、酵母抽出物、ペプトン、トウモロコシ浸漬水、コットンケークまたは魚油などの有機窒素が使用できる。例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムまたはリン酸アンモニウムなどの無機窒素も使用できる。必要であれば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、またはＭｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋もしくはＮｉ＋＋などの二価金属塩、およびアミノ酸またはビタミンを添加することもできる。
【００１２】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株を選択する方法であり、その方法は、下記の工程：
ａ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を含む可能性のある生体サンプルを適当な選択培地と接触させる工程；
ｂ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離する工程
を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３を単離するのに適当な選択培地である。
本願では、好適な選択培地は、少なくとも本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３は発達可能であるが、サッカロスリックスＳＡ１０３株とは異なる少なくとも１つの株の増殖または真菌などの別の微生物の増殖を妨げる手段による任意の培地を意味し、好ましくは本発明の選択培地は、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株とは異なる総ての株の増殖またはその突然変異株の増殖を妨げる働きをする。
【００１４】
このような選択培地は、上記で定義したような種々の栄養物質と、例えば、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株および／または少なくとも１つのその突然変異株のみが耐性となる抗菌薬、および／または急速な増殖が本発明の株の増殖を邪魔する、さらには妨げる真菌を排除する抗真菌薬などの少なくとも１種類の薬剤を含んでなる。
【００１５】
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株を単離するのに適当な選択培地の例としては、好ましくは約０．００５％の割合のリゾチーム、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のサイクロセリンもまた含んでなる腐植−ビタミンＢゲロースに相当するＭＩＳ培地が挙げられる。なお、この培地のｐＨは約８．５〜約９の間である。
【００１６】
本発明の放線菌株ＳＡ１０３を単離するのに適当な選択培地の別の好ましい例としては、好ましくは約０．００５％の割合のリゾチーム、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のサイクロセリン、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のペニシリン、好ましくは約５ｍｇ／ｌの割合のリファンピシンもまた含んでなるＨＶ−ビタミンＢ培地がある。なお、この培地の約８．５〜約９の間である。
【００１７】
本発明の適当な選択培地の選択性は、前記の培地に、特に、好ましくは約０．００１％の割合のアジ化ナトリウム、好ましくは約０．０１％の割合の亜テルル酸カリウム、および／または好ましくは約０．００１％の割合のクリスタルバイオレットなど、本発明のＳＡ１０３株が耐性となる他の選択物質を添加することによって強化することができる。
【００１８】
本発明の適当な選択培地に添加可能な抗真菌薬の例としては、アクチジオンおよび／またはナイスタチンが挙げられる。
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の突然変異株を選択する場合、当業者に周知のように、選択培地は、単一のアミノ酸が添加された培養培地からなってもよい。
【００１９】
本発明者らが単離に成功した本発明のＳＡ１０３株は極めて希少な株である。実際、分析した１２０を超えるサンプルで、例えば上述の抗生物質などの選択物質を用いて、または用いずにただ１個のコロニーが同定された。
【００２０】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株の培養物から培養培地を調製する方法であり、その方法は下記の工程：
ａ）前記の株を栄養培地で発酵させて培養培地を得る工程；
ｂ）場合によっては、工程ａ）で得られた培養培地を分離する工程
を含むことを特徴とする。
【００２１】
他の抗生物質の生産の場合と同様に、液体培地での好気性発酵が好ましく、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株からの活性化合物の生産は、この株の増殖に有利ないずれの温度で行ってもよく、すなわち、周囲温度〜４３℃の範囲である。２５℃〜３２℃の間の温度を用いるのが好ましい。いっそう好ましくは、温度は３０℃である。この培養を数日、例えば、２日〜１０日間続けることができる。通常、ｐＨはややアルカリ性であるが、厳密なｐＨは使用する培養培地によって異なる。この株を、ゲロース上で増殖（特に傾斜培養）させた後に採取し、場合によっては低温で保存し、培養培地を得るために、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の増殖に関して上記したものと同様の栄養物質からなる通常の液体培地に攪拌しながら接種する。
【００２２】
発酵はエルレンマイヤーフラスコで、また、種々の容積の工業用または実験用ファーメンターで行うことができる。発酵を容器で行う場合、傾斜培養物または平板培養物のサンプル、または生物の凍結乾燥培養物を栄養培地に接種することにより栄養培地中で接種株を作製することが望ましい。このようにして接種株が得られた後、これを活性化合物の大規模生産用の発酵槽の培地に無菌的に移す。適当な微生物増殖が得られる限り、接種株を生産する培地は発酵槽で用いるものと同じであっても異なっていてもよい。
【００２３】
本発明の栄養培地は一般に、上記のような本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の培養培地と同じ種類の栄養物質（炭素源、窒素源など）を含む。また、液体パラフィン、大豆油、グリースまたはシリコーンなどの消泡剤を含んでもよい。
培養培地を分離する任意の工程ｂ）は、当業者に周知のいずれかの方法により、単独で、または例えば、遠心分離、濾過または低温殺菌などの他の分離方法と組み合わせて行うことができる。
よって好ましくは、本発明の培養培地を製造する方法は、任意の工程ｂ）で行う分離は遠心分離および／または濾過および／または低温殺菌であることを特徴とする。
【００２４】
本発明のさらなる課題は、本発明の方法によって得ることができる培養培地である。
本発明の製造方法によって得られる培養培地を用い、活性化合物を抽出する。この目的で、例えば、限定されるものではないが、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、ジクロロメタン、ｎ−プロパノールまたは２−プロパノールなどの有機溶媒が用いられる。
【００２５】
この抽出工程の後、場合によっては、その活性濃縮物中の多くの極性不純物を除去し、これにより次のＨＰＬＣによる活性濃縮物の最終精製を容易にするためにこの有機相を脱水してもよい。この目的で、無水硫酸ナトリウムもしくは硫酸マグネシウム、および／または有機相の真空乾燥を行うことができる。ゲル（架橋デキストランゲル）上での濾過、セルロースカラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂または薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）の使用も考えられる。
【００２６】
このような方法は当業者に周知のものであり、当業者ならば、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の培養培地から活性濃縮物を回収するために最も好適な方法で種々の技術を単独で、または組み合わせていかに用いればよいかを知っている。
【００２７】
よって、本発明のさらなる課題は、本発明の培養培地から活性濃縮物を製造する方法であり、その方法は下記の工程：
ａ）培養培地を有機溶媒で有機抽出する工程；
ｂ）場合によっては、得られた有機相を脱水し、かつ／または真空乾燥する工程；
ｃ）場合によっては、活性濃縮物を懸濁液とし、好ましくは得られた懸濁液を濾過し、有機抽出および脱水の工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程
を含むことを特徴とする。
【００２８】
本発明の方法によって得ることができる活性濃縮物は、本発明のさらなる課題である。
これにより得られる活性濃縮物は、次に、可視光線／紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、質量分析、また、クロマトグラフィー分析（シリカゲルまたはデキストランゲルクロマトグラフィーカラム、イオン交換樹脂、液相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなど）などの機器分析によって同定する。これは得られた活性濃縮物中に存在し得る種々の活性化合物（「活性画分」とも呼ばれる）を特性決定し、生産する助けとなる。
【００２９】
よって、本発明のさらなる課題は、好ましくは薄層クロマトグラフィーおよび／または低圧液体クロマトグラフィーの後に逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により、本発明の活性濃縮物から活性化合物を製造する方法である。
【００３０】
従って、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって得られる溶出液に相当し、実質的に純粋である。
活性濃縮物から活性化合物を分離するためには、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製は避けて通れない。薄層クロマトグラフィーおよび／またはセファデックスＬＨ２０型などの定圧液体は、多くの不純物を除去した活性濃縮物を得、それにより次に続くＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製を容易にする役割を果たす。
【００３１】
好ましくは、本発明の活性化合物を製造する方法は、活性化合物が、ムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＧもしくはムタクチマイシンＦなどのムタクチマイシン、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、またはこれらの活性化合物の医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物であることを特徴とする。
【００３２】
ムタクチマイシンＰ１１は下式：
【化１】
を有する。
【００３３】
これは、「Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」ベースにＲＮ１３８６８９−８１−３として登録されている既知のムタクチマイシンＣと一致することが確認されている。
ムタクチマイシンＰＲは下式：
【化２】
を有する。
ムタクチマイシンＦは下式：
【化３】
を有する。
ムタクチマイシンＧは下式：
【化４】
を有する。
アルドガマイシンＧ（またはＰ１０ａ）は下式：
【化５】
を有する。
下記の立体化学式：
【化６】
を有するアルドガマイシンは既知のものであり、「Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」ベースにＲＮ１０７７４５−５６−２として登録されている。
【００３４】
アルドガマイシンＨ（またはＰ８）は下式：
【化７】
を有する。
アルドガマイシンＰ１０ｂ（またはスワルパマイシンＢ）は下式：
【化８】
を有する。
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化９】
を有するムタクチマイシンＰＲであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３５】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１０】
を有するムタクチマイシンＦであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３６】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１１】
を有するムタクチマイシンＧであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３７】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１２】
を有するアルドガマイシンＧであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である（ただし、下記の立体化学式：
【化１３】
を有するアルドガマイシンＧは除く）。
【００３８】
本発明のさらなる課題は、アルドガマイシンＧが下記の立体化学式：
【化１４】
を有することを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３９】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１５】
を有するアルドガマイシンＨであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４０】
好ましくは、アルドガマイシンＨは下記の立体化学式：
【化１６】
を有するか、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４１】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１７】
を有するアルドガマイシンＰ１０ｂであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４２】
好ましくは、アルドガマイシンＰ１０ｂは下記の立体化学式：
【化１８】
を有するか、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４３】
本発明のムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧ、アルドガマイシンＧ、アルドガマイシンまたはアルドガマイシンＰ１０ｂは、例えば、化学法または酵素法などの当業者に公知のいずれかの方法によって得ることができる。好ましくは、上記のように本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３からの発酵を含む製造方法が使用される。
【００４４】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦもしくはムタクチマイシンＧ、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨまたはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシンから選択される少なくとも２つの活性化合物の活性混合物である。
【００４５】
場合によっては、本発明の活性混合物は、ムタクチマイシンＰ１１，ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦもしくはムタクチマイシンＧ、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、および当業者に公知の抗菌活性、抗ウイルス活性、抗増殖活性または抗癌活性を有する他の活性化合物から選択される少なくとも２つの活性化合物を含み得る。
【００４６】
本発明の活性化合物は単独で、または、例えば、グラム陽性菌の増殖を妨げるまたは数を減らすために他の微生物薬と組み合わせて使用することができる。よって、これらの化合物は、医学的見地から、特に抗菌目的、抗ウイルス目的または抗癌目的で有用である。
【００４７】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの、治療上有効な量の本発明の活性化合物と医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物である。
【００４８】
これらの医薬組成物は、投与様式に対して医薬上適当ないずれの形態でも製造することができる。このような組成物の例は、錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤および顆粒剤などの経口投与用の固形組成物、溶液、懸濁液、シロップなどの経口投与用の液体組成物、ならびに無菌溶液、懸濁液またはエマルションなどの非経口投与用の製剤を含む。
【００４９】
本発明の活性化合物は、医薬上許容される限り、当業者に周知の、このような塩を形成するための試薬と付加塩を形成する。
【００５０】
本発明の活性化合物の好ましい使用量は、用いる特定の活性化合物、処方する特定の組成物、適用様式および特定の部位、宿主および処置する疾病によって異なる。一般に、本発明の活性化合物は、腹腔内、静脈内、皮下または局所的方法によって注射されるか、または経口投与される。当業者は、例えば、年齢、体重、性別、食生活、投与時間、排泄速度、患者の症状、医薬品の組合せ、反応感受性、および疾病の重篤度など、医薬品の作用を改質する種々の因子を考慮する。投与は継続的に行うこともできるし、最大許容量で周期的に行うこともできる。
【００５１】
抗菌薬として用いるためには、これらの活性化合物は一般に有効成分の濃度が処置する特定の生物の最小阻害濃度よりも高くなるように投与されるということを注記しておかねばならない。
【００５２】
よって、本発明の課題は、医薬品として用いるための、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨまたはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物である。
【００５３】
本発明のさらなる課題は、連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５４】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物によって、連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５５】
さらなる課題は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスの予防および／または処置を目的とする抗ウイルス医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５６】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物を用いて、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスを処置および／または予防する方法である。
【００５７】
本発明のさらなる課題は、肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者の予防および／または処置を目的とする抗癌医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５８】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物を用いて、肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者を処置および／または予防する方法である。
【００５９】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物を含んでなる医薬品を用いて、植物の病害を予防および処置する方法である。
【００６０】
ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物はまた、食品工業、皮革工業または木材工業における処置のためにも使用できる。
【００６１】
それらはまた、衛生目的、例えば、手洗いの目的、また、種々の実験器具、歯科用器具および医療器具またはその他の汚染材料を消毒する目的でも有用である。
【００６２】
以下の図の説明および実施例は本発明の説明を意図したものであって、その範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１： 材料および方法
１．１．微生物
本発明の放線菌生産株サッカロスリックスＳＡ１０３は、アルジェリア（サハラ）の乾燥地方の土壌から、土壌サンプルを無菌蒸留水に懸濁させ、アクチジオン５０ウイルスｇ／ｍｌを含有する腐食−ビタミンＢゲロース上に付着させることによって単離した。ＳＡ１０３株の純粋培養物を凍結乾燥により保存した。これをまた、実験室で用いるため、ＩＳＰ Ｎｏ．２傾斜培地(Shirling and Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340, 1996)上、６℃で維持した。
【００６４】
１．２．分類
ＳＡ１０３株の分類学的特徴を、Shirling and Gottlieb (1996) and in Waksman (“The Actinomycetes”, Vol. II, The Williams, & Wilkins Co.. Baltimore, 1961)に記載の種々の培地上で培養することにより判定した。形態学的特徴は、３０℃で１４日間増殖させた後に判定した。色の名称およびグレードの名称は、ＩＳＣＣ−ＮＢＳシステム(“Inter Society Colour Council” for the “National Bureau of Standards”)を用いて判定した。菌糸と胞子の形態の詳細な観察は、走査電子顕微鏡（日立、モデルＳ−４５０）により行った。生理学的特性はGood fellow (J. Gen. Microbiol. 69:33-90, 1971)およびWaksman (1961)の方法を用いて調べた。
【００６５】
細胞壁のジアミノピメリン酸の異性体の種類および糖の全細胞組成は、Becker et al. (Appl. Microbiol. 12:421-423, 1964)およびLechevalier and Lechevalier (“In the Actinomycetales” Ed. H. Prauser, pp.311-316, Fisher Verlag, Jena, 1970)の方法により判定した。リン脂質およびミコール酸は、Minnikin et al. (Int. J Syst. Bacteriol. 27:104-107, 1977; J. Chromatography 188:221-233, 1980)の手法により分析した。
【００６６】
１．３．発酵
成熟傾斜培養物から採取したＳＡ１０３株のサンプルを、０．４％グルコース、１％麦芽抽出物および０．４％酵母抽出物を含有する無菌培養培地（滅菌前にｐＨ７．２の調整）５０ｍｌの入ったエルレンマイヤーフラスコに接種し、３０℃にて回転攪拌機（２５０ｒｐｍ）上で２日間培養した。抗生物質を生産するため、培養培地３ｍｌを、上記培地が１００ｍｌずつ入った５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件を用いて１０日間培養した。総抗菌活性の生成を栄養ゲロース上で、枯草菌(Bacillus subtilis) ＡＴＣＣ６６３３に対するゲロース拡散試験によって行った。３０℃で２４時間インキュベーションした後に増殖阻害を調べた。抗微生物活性は、阻止域の直径を測定することによって調べた。菌糸の乾重は、ホモジナイズした培養培地１ｍｌを入れ、１０５℃で２４時間乾燥させたエッペンドルフ管にて測定した(Pfefferle et al. J. Biotech. 80:135-142, 2000)。
【００６７】
１．４．抗生物質の精製
ＳＡ１０３株による抗菌抗生物質の生産は、液体培地ＭＳ＋デンプン（１％）＋酵母抽出物（０．３％）、ｐＨ７．２で行った（５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ当たり培地１００ｍｌ、２５０ｒｐｍで攪拌、３０℃でインキュベーション）。動態から、ＳＡ１０３株は指数増殖期（１日目）の開始時から抗生物質を生産し始め、この生産が定常期の開始時まで続き、その後、安定化した後、減数期の際に低下する（図１参照）。
【００６８】
全部で８リットルの培養物を準備した。この濾液をｎ−ブタノールで抽出した。目的の抗菌抗生物質を含有するブタノール抽出液を保持した。
【００６９】
この赤色のブタノール抽出液をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。この抽出液のアリコートを、まず、移動相として再蒸留水中メタノール（８０％）を用いて、セファデックスＬＨ２０カラムに送り込んだ。しかし、抗生物質の分離（裸眼による視認とアンチバイオグラフィーによる可視化）は決定的なものではなかった。よって、この工程は除外し、ブタノール抽出液を、Ｃ１８カラムと均一濃度条件（水中６３％メタノール）、流速１．５ｍｌ／分、２２０ｎｍでの検出を用いて逆相ＨＰＬＣによりそのまま精製した。プロフィール上で得られた総てのピークに相当する画分をそれぞれ回収し、濃縮し、枯草菌に対して試験した。次の７画分（７ピーク）で活性があることが分かった：明赤色の４画分（Ｐ１１、ＰＲ、ＦおよびＧ）および無色の３画分（Ｐ８、Ｐ１０ａおよびＰ１０ｂ）。これらの抗生物質を、これまでと同じ条件で３〜４回再注入した後、ＨＰＬＣにより精製した。
【００７０】
実施例２： 結果および考察−生産株の分類学的特性決定
２．１．株の形態
ＳＡ１０３株は、線形または柔軟な胞子鎖に分断された十分発達した桃色の好気性菌糸を形成した。これらの胞子は棒状で、大きさは１．９〜２．９×０．６〜０．７ミクロンで、平滑な表面を持っている（図１）。内生胞子、強膜顆粒、束状体および鞭毛胞子は観察されなかった。基底菌糸は褐色がかった赤色から深紅で、断片はほとんど見られなかった。この株は特徴的な暗赤色の色素を豊富に生産し、これが抗菌抗生物質に相当することが明らかになった。
【００７１】
２．２．構造的特徴
表１は種々の培養支持体上でのＳＡ１０３株の培養の特徴を示す。株の増殖は酵母抽出物ならびに麦芽抽出物ゲロース、ベネットゲロースおよび栄養ゲロース上では盛んであるが、オートミールゲロースおよび無機塩−デンプンゲロース上ではそれほどでもない。菌糸の色は好気性菌糸では黄色がかった桃色から薄い赤色がかった褐色までの範囲であり、基底菌糸では褐色がかった橙色から濃暗赤色までの範囲であった。この株は、用いた菌糸の総てで暗赤色または褐色がかった橙色の水溶性色素を生産したが、メラノイド色素は見られなかった。
【００７２】
最も違いの少ない種はサッカロスリックス・シリンゲ(Saccharothrix syringae)であり、白桃食がかった好気性菌糸、基底菌糸および紫−赤−褐色の水溶性色素を持っていた。
【００７３】
２．３．化学的分類
化学的分類研究から、メソ−ジアミノピメリン酸が存在し、グリシンが存在しないことが示された（III型の細胞壁）。細胞全体の糖モチーフはラムノースおよびガラクトースからなっており（Ｅ型の細胞糖）(Kroppendstedt, “The genus Nocardiopsis. In the Procaryotes”Ed., A. Balows et al., pp.1139-1159, Springer Verlag, Berlin, 1192)、特徴的なリン脂質はホスファチジル−エタノールアミンであった（Ｐ１１型のリン脂質）。ミコール酸は検出されなかった。
【００７４】
２．４．株の生理学
生理学的試験の結果を表２に示す。
この株は、ほとんどの糖類を含む数種類の有機化合物（カゼイン、ゼラチン、ツィーン８０、デンプン、チロシンなど）を使用できる。これに対して、マンニトールを除き、オースのアルコール誘導体（イノシトール、アドニトール、ダルシトール、エリトリトールおよびソルビトール）は分解されない。この株は２０℃および４８℃（最適な３０℃）、ｐＨ５および９（最適な７〜８の間）で増殖可能である。また、リゾチームとクリスタルバイオレットには耐性があるが、ペニシリンとリファンピシンを除き、試験した抗生物質（１１）には感受性である。
【００７５】
ＳＡ１０３株はＳａ．シリンゲと、ラクトースは分解できるがヒポキサンチンと酪酸ナトリウムは分解できないこと、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オキシテトラサイクリンおよびバンコマイシンに感受性であること、ペニシリン、リファンピシンおよびクリスタルバイオレットに耐性があること、ならびにｐＨ５で増殖することによって識別される。
【００７６】
よって、ＳＡ１０３株は、サッカロスリックスの新規な種、あるいはおそらくはＳａ．シリンゲの新規な亜種であり得る。
【００７７】
２．５．分類
上記の形態的特性および化学的特性を基づけば、ＳＡ１０３株はサッカロスリックス属に属すものと結論付けられた(Labeda, et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 :426-431, 1984)。最も近縁な種サッカロスリックス・シリンゲＮＲＲＬ Ｂ−１６ ４６８Ｔに比べ、このＳＡ１０３株は、ラクトースは分解できるがヒポキサンチンと酪酸ナトリウムは分解できないこと、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オキシテトラサイクリンおよびバンコマイシンに感受性であること、ペニシリン、リファンピシン、クリスタルバイオレットおよびナトリウムアゾチドに耐性があること、ならびにｐＨ５．０で増殖することで異なる。よって、この株をサッカロスリックス種ＳＡ１０３と呼称した。
【００７８】
２．６．発酵
サッカロスリックス種ＳＡ１０３による抗菌活性の生産の経時的変動を図１に示す。枯草菌に対する生物活性の生成は１日目に始まり、４日目にピークに達した後、安定する。バイオマスは最初の３日で増大し、安定となった後、８日目に低下した。ｐＨ動態は、１日目に急激に上昇した後、中性となり、発酵の終了時に上昇することが示された。一般に、微生物による二次代謝産物の生産は定常期に始まるが、本ケースでは、生物活性の生成は増殖と強い相関があり、経時的変動の全過程で見られた。同様の経時的生産動態が、サッカロスリックス種ＳＡ２３３によるジチオロピロロン抗生物質の生産についても (Lamari et al., J. Antibiotics 55:696-701, 2002)、ストレプトミセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)によるクラブラン酸の生産についても見られた(Lebrihi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 26:130-135, 1987)。
【００７９】
２．７．抗生物質の構造の決定
抗生物質の単離および精製の種々の工程を図２にまとめている。
【００８０】
２．７．１．アントラサイクリン系抗生物質
抗生物質Ｐ１１、ＰＲ、ＦおよびＧは中性ｐＨでは明赤色、酸性ｐＨでは黄色、塩基性ｐＨでは青紫色である。Ｐ１１が主要な抗生物質であり、ＰＲは副次的な抗生物質である。これらの抗生物質を以下の直腸鏡検査：ＵＶ可視光、赤外、質量分析、ならびにプロトンおよび炭素１３のＮＭＲ（相関研究を伴う）の対象とした。また、溶解度、ＣＣＭによるＲｆの測定および元素分析（Ｐ１１に関しては後者のみ）などの補助試験も行った。
【００８１】
Ｐ１１分子のムタクチマイシンＣとしての同定
このＰ１１分子の分子量は５３０であり、化学式はＣ２７Ｈ３０Ｏ１１である。ＵＶ−可視光（ＭｅＯＨ）で得られた最大値は、２１９、２３４、２５０、２８７、４７８、４９６および５３１ｍｍである。このスペクトルはアントラサイクリン系の抗生物質のものと同様であり、また、色はｐＨが異なれば変化する。赤外スペクトルは芳香基、ヒドロキシル基、メチル基およびメトキシル基の存在を示唆する。さらに、プロトンおよび炭素１３のＮＭＲによる詳細研究（化学シフト、スピン−スピン結合定数、シグナル強度および１Ｈ−１Ｈ ｃｏｓｙ ４５、１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＣＱおよび１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＢＣ相関）を行った後、最終的な構造を解明した。このようにしてＰ１１分子は、放線菌種の突然変異株によって分泌されることが知られているムタクチマイシンＣとして同定された。ムタクチマイシンＣは、オース（６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−マンノピラノシド）と（炭素Ｃ７を介して）結合したアントラサイクリン核（２つのベンゼン環の間にキノン環を含む４つの隣接する環）からなる。Ｐ１１は水、メタノール、ｎ−ブタノール、エタノール、１−プロパノールおよびアセトンにおける溶解度が高く、ｎ−ヘキサンおよびトルエンに不溶である。
【００８２】
新規なムタクチマイシンの化学構造の決定
ムタクチマイシンＰＲ
この副次的なＰＲ分子の分子量は６６２であり、式Ｃ３２Ｈ３８Ｏ１５に相当する。ＵＶ−可視光で得られた最大値および赤外バンドＰ１１の場合と同一であり、マスフラグメントはこの２つの抗生物質間でかなりの類似性があり、化学構造が極めて似ていることを示唆している。ＰＲは水、メタノールおよびエタノールにおける溶解度が高く、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはＰＲの構造の解明に役立ち、その構造はＰ１１（ムタクチマイシンＣ）に近いことが分かり、唯一の違いは１つ目のベンゼン環の炭素と（−ＯＣＨ３の位置で）結合した第二のオースが存在することである。この第二のオースは６−デオキシ−マンノピラノシド（メチルが存在しないことで最初のものとは異なる）である。この構造により、ＰＲ分子はアントラサイクリン系に、そしてムタクチマイシン群に属す。しかし、これは既知のどのムタクチマイシンとも異なり、従って、この群の新規な抗生物質に当たり、ムタクチマイシンＰＲと呼ぶ。
【００８３】
ムタクチマイシンＦ
抗生物質Ｆの分子量は５１６（従って、Ｐ１１よりも１４小さい）、分子式Ｃ２６Ｈ２８Ｏ１１に相当する。そのＵＶ−可視光および赤外スペクトルならびにマスフラグメントはＰ１１およびＰＲのものと極めて類似している。従って、このことはこの３つの分子の間で強い類似性があることを示唆している。この化合物Ｆは水、ｎ−ブタノール、１−プロパノールおよびエタノールに可溶で、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはこの分子の構造の解明に役立ち、その構造はＰ１１（ムタクチマイシンＣ）に極めて類似していることが分かり、唯一の違いはマンノピラノシル残基の炭素Ｃ３上に、−ＯＣＨ３基の代わりにＯＨが存在することである。この抗生物質Ｆは既知のどのムタクチマイシンとも異なり、新規な分子に当たり、ムタクチマイシンＦと呼ぶ。
【００８４】
ムタクチマイシンＧ
この分子の分子量は５０２であり、式Ｃ２５Ｈ２６Ｏ１１に相当する。ＵＶ−可視光および赤外スペクトル、ならびにマスフラグメントにおいて、Ｇ、Ｆ、ＰＲおよびＰ１１間の強い類似性が見られた。生成物Ｇは水、ｎ−ブタノール、１−プロパノール、メタノールおよびエタノールに可溶で、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはこの分子の構造の解明に役立ち、その構造はＰＲと極めて類似していることが分かり、唯一の違いはアントラサイクリン核の４番目の環の炭素Ｃ７に結合した第二のオースが存在しないことである。従って、この抗生物質Ｇはムタクチマイシン群の新規な分子に当たり、よって、ムタクチマイシンＧと呼ぶ。
【００８５】
２．７．２．マクロライド系抗生物質
抗生物質Ｐ８、Ｐ１０ａおよびＰ１０ｂは無色である。Ｐ８はサッカロスリックス種ＳＡ１０３によって生産される、Ｐ１１（ムタクチマイシンＣ）に次ぐ主要分子である。この３種類の抗生物質はメタノール、ｎ−ブタノール、エタノール、１および２−プロパノール(propnol)、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムおよびジクロロメタンにおいては溶解度が高いが、水およびｎ−ヘキサンには不溶である。これらの抗生物質も上記のムタクチマイシンと同じ分光光度分析の対象としたところ、それらの化学構造の決定に至るのに役立った。
【００８６】
Ｐ１０ａのアルドガマイシンＧとしての同定
抗生物質Ｐ１０ａの分子量は７４０であり、分子式Ｃ３７Ｈ５６Ｏ１５に相当する。ＵＶ−可視光スペクトルはアルドガマイシンのものと極めて類似しており、２１６ｎｍにピークを、そして２４５ｎｍと２７８ｎｍにショルダーを示した。赤外スペクトルは、メチル基、メトキシル基、ヒドロキシル基およびカーボネート官能基の存在を示すいくつかの吸収バンドを示す。Ｐ１０ａはｎ−ブタノール、１および２−プロパノール、メタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンおよびエタノールに可溶で、ｎ−ヘキサン、トルエンおよび水には不溶である。このようにＰ１０ａ分子は、ストレプトミセス・アビジニー(Streptomyces avidinii)によって分泌されることが知られているアルドガマイシンＧとして同定された。アルドガマイシンＧは中性のマクロライドであり、そのラクトン環は、２つのメチル化糖、Ｃ１４位にミシノエ、およびＣ５位にアルドガロースが結合されている１６個の原子を含む。
【００８７】
新規なマクロライドの化学構造の決定
アルドガマイシンＨ
抗生物質Ｐ８の分子量は７１４であり、分子式Ｃ３６Ｈ５８Ｏ１４に相当する。その物理化学的特性はＰ１０ａ（アルドガマイシンＧ）のものと極めて類似している。しかし、Ｐ１０ｂのＵＶ−可視光スペクトルは２４５ｎｍと２７８ｎｍでより低い吸光強度を示し、その赤外スペクトルは、アルドガマイシンＧの場合のカーボネート基に特徴的な１８００ｃｍ−１における吸収バンドをもはや含んでいない。生成物Ｐ８は、その分光分析データを総て解析した後、アルドガマイシンＥと類似しているが、アルドガロース糖上のカーボネート官能基が存在しない（この場合は加水分解されている）ことで異なる、Ｈと呼ばれる新規なアルドガマイシンであると同定された。
【００８８】
スワルパマイシンＢ
Ｐ１０ｂ分子はＨＰＬＣによりＰ１０ｂ生成物から分離することができなかったので、複合体の形で生成物Ｐ１０ｂと同時に分析した。その分子量は６９８であり、化学式はＣ３６Ｈ５８Ｏ１３である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲ分析は最終的な構造を解明するのに役立った。そして、Ｐ１０ａはＰ８およびスワルパマイシンに極めて類似した化学構造を有する。
【００８９】
抗生物質の微生物学的活性
ムタクチマイシンＰ１１、ＰＲ、ＦおよびＧ、ならびにマクロライドＰ８、Ｐ１０（ａおよびｂ）の微生物学的活性は主としてグラム陽性菌に対するものである。最も感受性の高い細菌はミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)と肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)（感受性のある唯一のグラム陰性菌である）である。
【００９０】
最小阻害濃度(minimum inhibiting concentration)（ＭＩＣ）は、Ｍ．ルテウスおよび肺炎桿菌では５μｇ／ｍｌであり、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) ＣＩＰ ５３１５６では１０μｇ／ｍｌ、枯草菌では４０μｇ／ｍｌ、リステリア菌(Listeria monocytogenes)では５０μｇ／ｍｌであり、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)では７５μｌ／ｍｌである。新規な分子ＰＲ、ＦおよびＧは同じ微生物（リステリア菌以外）に
対して活性がある。
【００９１】
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５、グラム陰性菌の大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)病原型シリンゲおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefasciens)、ならびに酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)および糸状菌ムコール・ロマニアヌス(Mucor romannianus）に対して作用を持つ分子はなかった。
【００９２】
マクロライド（アルドガマイシンＧおよびＨ）およびスワルパマイシンＢの活性はムタクチマイシンの活性よりも大きい。実際、ＭＩＣは肺炎桿菌では０．１μｇ／ｍｌに過ぎず、枯草菌、ミクロコッカス・ルテウスおよび黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６では１μｇ／ｍｌであり（これらは最も感受性が高い）、リステリア菌およびスメグマ菌ではそれぞれ３０および５０μｇ／ｍｌである。グラム陰性菌（肺炎桿菌を除く）および真菌は耐性である。
【００９３】
供試生物 ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
（スワルパマイシン）
枯草菌ＡＴＣＣ ６６３３ １
ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ９３１４ １
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５ ＞１００
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６ １
リステリア菌ＣＩＰ ８２１１０ ３０
スメグマ菌ＡＴＣＣ ６０７ ５０
肺炎桿菌ＣＩＰ ８２．９１ ０．１
大腸菌ＡＴＣＣ １０５３６ ＞１００
シュードモナス・シリンゲＮｏ２４１０ ＞１００
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＮｏ２４１０ ＞１００
ムコール・ロマニアヌスＮＲＲＬ １８２９ ＞１００
サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ ４２２６ ＞１００
【００９４】
供試生物 ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
（アルドガマイシンＨ）
枯草菌ＡＴＣＣ ６６３３ １０
ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ９３１４ １
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５ ＞１００
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６ ５
リステリア菌ＣＩＰ ８２１１０ ＞１００
スメグマ菌ＡＴＣＣ ６０７ ２０
肺炎桿菌ＣＩＰ ８２．９１ ０．５
大腸菌ＡＴＣＣ １０５３６ ＞１００
シュードモナス・シリンゲＮｏ２４１０ ＞１００
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＮｏ２４１０ ＞１００
ムコール・ロマニアヌスＮＲＲＬ １８２９ ＞１００
サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ ４２２６ ＞１００
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
【表１２】
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】サッカロスリックス種ＳＡ１０３株の発酵特性
【図２】サッカロスリックス種ＳＡ１０３株の活性産物の単離および精製
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２００４年２月６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３１６０として寄託された新規な放線菌株サッカロスリックス(Saccharothrix)ＳＡ１０３またはその突然変異株、該株を選択するための方法および培地、該ＳＡ１０３株の培養物から培養培地、活性濃縮物および活性化合物を製造する方法に関する。本発明はまた、この製造方法によって得ることができる活性化合物、特に新規なムタクチマイシンおよびアルドガマイシン、これらの活性化合物を含んでなる医薬組成物、ならびに医学および植物薬の分野におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
抗微生物剤は、ヒトの健康、獣医学、植物病理学、食品工業、皮や木材の処置など多くの分野で広く用いられている。これらの薬剤の大部分のものは微生物によって生産されたものであり、なかでも放線菌が最も重要である。
【０００３】
新規な抗微生物剤、特に抗菌抗生物質が常に探し求められている。
実際、細菌はその本領により指数関数的に増殖し、これにより遺伝子の突然変異によって抗生物質耐性となる機会を高めることが知られている。
【０００４】
動物の領域、特にヒト、または植物で、また、食品工業や皮革工業でも、抗生物質の使用が不適切であれば、細菌の突然変異能が高まり、抗生物質耐性となる。
この問題の解決策の１つは、分別を持って抗生物質を投与することであるのは明白であるが、この解決策は予防策でしかない。
【０００５】
よって、当技術分野の現状では、新規な抗生物質を開発する必要がある。この目的で、研究者らは極限環境微生物に着目してきた。
【０００６】
本発明者らはこれによりアルジェリアのサハラ以南の土壌に存在する新規な放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３を単離し、これを２００４年２月１６日にＣＮＣＭ(Collection National de Cultures de Microorgansimes)に番号Ｉ−３１６０として寄託した。
【０００７】
本発明者らはまた、この株がアントラサイクリン種の活性化合物（そのいくつか、詳しくはムタクチマイシン（ＰＲ、Ｆ、Ｇ）はこれまでに確認されたことのないものであった）、また、アントラサイクリン種の活性化合物、詳しくはアルドガマイシン（Ｇ、ＨおよびＰ１０ｂ）を産生することも発見した。これらの活性化合物は、特にグラム陽性菌に対する抗菌活性と、抗ウイルス活性、抗増殖活性および抗癌活性を有する。
【０００８】
よって、本発明者らは、２００４年２月１６日にＣＮＣＭにＩ−３１６０として登録されたサッカロスリックスＳＡ１０３株からこれらの化合物を得る方法を開発し、その方法は実施が簡単であるという利点を持っている。従って、サッカロスリックス株から得られたこれらの抗生物質化合物はヒトおよび動物の双方で実質的な医薬として注目され、また、植物衛生としても注目され、工業規模での生産が可能である。
【０００９】
これがまさに本発明の目的である。
よって、本発明の主要な課題は、２００４年２月１６日にＣＮＣＭにＩ−３１６０として登録された放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３またはその突然変異株である。
【００１０】
本願において「突然変異株」、「変異体株」または「変異体」は、下記の活性化合物の少なくとも１つを産生する能力を保存することによりサッカロスリックスＳＡ１０３株からの選択的突然変異により得ることができるサッカロスリックス株を等しく意味する。この突然変異技術は当業者に公知のものであり、サッカロスリックスＳＡ１０３株を放射線などの物理的突然変異誘発剤、または例えばアクリフラビンなどの化学突然変異誘発剤の存在下に置いた後、適当な培地において、抗生物域（例えば最小阻害濃度法、すなわちＭＩＣなどの微生物阻害法）を用いることで残存する目的の突然変異株を選択することからなる。
【００１１】
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株は、本願の「実施例」の部分に記載されている。
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株またはその突然変異株の１つは、放線菌の増殖に一般に用いられる種々の栄養物質を含有する培地で培養する。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、スクロース、デンプン、マルトース、または動物油もしくは植物油が使用できる。窒素源としては、例えば、ダイズ粉末、肉抽出物、酵母抽出物、ペプトン、トウモロコシ浸漬水、コットンケークまたは魚油などの有機窒素が使用できる。例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムまたはリン酸アンモニウムなどの無機窒素も使用できる。必要であれば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、またはＭｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋もしくはＮｉ＋＋などの二価金属塩、およびアミノ酸またはビタミンを添加することもできる。
【００１２】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株を選択する方法であり、その方法は、下記の工程：
ａ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を含む可能性のある生体サンプルを適当な選択培地と接触させる工程；
ｂ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離する工程
を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３を単離するのに適当な選択培地である。
本願では、好適な選択培地は、少なくとも本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３は発達可能であるが、サッカロスリックスＳＡ１０３株とは異なる少なくとも１つの株の増殖または真菌などの別の微生物の増殖を妨げる手段による任意の培地を意味し、好ましくは本発明の選択培地は、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株とは異なる総ての株の増殖またはその突然変異株の増殖を妨げる働きをする。
【００１４】
このような選択培地は、上記で定義したような種々の栄養物質と、例えば、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株および／または少なくとも１つのその突然変異株のみが耐性となる抗菌薬、および／または急速な増殖が本発明の株の増殖を邪魔する、さらには妨げる真菌を排除する抗真菌薬などの少なくとも１種類の薬剤を含んでなる。
【００１５】
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株を単離するのに適当な選択培地の例としては、好ましくは約０．００５％の割合のリゾチーム、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のサイクロセリンもまた含んでなる腐植−ビタミンＢゲロースに相当するＭＩＳ培地が挙げられる。なお、この培地のｐＨは約８．５〜約９の間である。
【００１６】
本発明の放線菌株ＳＡ１０３を単離するのに適当な選択培地の別の好ましい例としては、好ましくは約０．００５％の割合のリゾチーム、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のサイクロセリン、好ましくは約１０ｍｇ／ｌの割合のペニシリン、好ましくは約５ｍｇ／ｌの割合のリファンピシンもまた含んでなるＨＶ−ビタミンＢ培地がある。なお、この培地の約８．５〜約９の間である。
【００１７】
本発明の適当な選択培地の選択性は、前記の培地に、特に、好ましくは約０．００１％の割合のアジ化ナトリウム、好ましくは約０．０１％の割合の亜テルル酸カリウム、および／または好ましくは約０．００１％の割合のクリスタルバイオレットなど、本発明のＳＡ１０３株が耐性となる他の選択物質を添加することによって強化することができる。
【００１８】
本発明の適当な選択培地に添加可能な抗真菌薬の例としては、アクチジオンおよび／またはナイスタチンが挙げられる。
本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の突然変異株を選択する場合、当業者に周知のように、選択培地は、単一のアミノ酸が添加された培養培地からなってもよい。
【００１９】
本発明者らが単離に成功した本発明のＳＡ１０３株は極めて希少な株である。実際、分析した１２０を超えるサンプルで、例えば上述の抗生物質などの選択物質を用いて、または用いずにただ１個のコロニーが同定された。
【００２０】
本発明のさらなる課題は、本発明の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株の培養物から培養培地を調製する方法であり、その方法は下記の工程：
ａ）前記の株を栄養培地で発酵させて培養培地を得る工程；
ｂ）場合によっては、工程ａ）で得られた培養培地を分離する工程
を含むことを特徴とする。
【００２１】
他の抗生物質の生産の場合と同様に、液体培地での好気性発酵が好ましく、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株からの活性化合物の生産は、この株の増殖に有利ないずれの温度で行ってもよく、すなわち、周囲温度〜４３℃の範囲である。２５℃〜３２℃の間の温度を用いるのが好ましい。いっそう好ましくは、温度は３０℃である。この培養を数日、例えば、２日〜１０日間続けることができる。通常、ｐＨはややアルカリ性であるが、厳密なｐＨは使用する培養培地によって異なる。この株を、ゲロース上で増殖（特に傾斜培養）させた後に採取し、場合によっては低温で保存し、培養培地を得るために、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の増殖に関して上記したものと同様の栄養物質からなる通常の液体培地に攪拌しながら接種する。
【００２２】
発酵はエルレンマイヤーフラスコで、また、種々の容積の工業用または実験用ファーメンターで行うことができる。発酵を容器で行う場合、傾斜培養物または平板培養物のサンプル、または生物の凍結乾燥培養物を栄養培地に接種することにより栄養培地中で接種株を作製することが望ましい。このようにして接種株が得られた後、これを活性化合物の大規模生産用の発酵槽の培地に無菌的に移す。適当な微生物増殖が得られる限り、接種株を生産する培地は発酵槽で用いるものと同じであっても異なっていてもよい。
【００２３】
本発明の栄養培地は一般に、上記のような本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の培養培地と同じ種類の栄養物質（炭素源、窒素源など）を含む。また、液体パラフィン、大豆油、グリースまたはシリコーンなどの消泡剤を含んでもよい。
培養培地を分離する任意の工程ｂ）は、当業者に周知のいずれかの方法により、単独で、または例えば、遠心分離、濾過または低温殺菌などの他の分離方法と組み合わせて行うことができる。
よって好ましくは、本発明の培養培地を製造する方法は、任意の工程ｂ）で行う分離は遠心分離および／または濾過および／または低温殺菌であることを特徴とする。
【００２４】
本発明のさらなる課題は、本発明の方法によって得ることができる培養培地である。
本発明の製造方法によって得られる培養培地を用い、活性化合物を抽出する。この目的で、例えば、限定されるものではないが、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、ジクロロメタン、ｎ−プロパノールまたは２−プロパノールなどの有機溶媒が用いられる。
【００２５】
この抽出工程の後、場合によっては、その活性濃縮物中の多くの極性不純物を除去し、これにより次のＨＰＬＣによる活性濃縮物の最終精製を容易にするためにこの有機相を脱水してもよい。この目的で、無水硫酸ナトリウムもしくは硫酸マグネシウム、および／または有機相の真空乾燥を行うことができる。ゲル（架橋デキストランゲル）上での濾過、セルロースカラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂または薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）の使用も考えられる。
【００２６】
このような方法は当業者に周知のものであり、当業者ならば、本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３株の培養培地から活性濃縮物を回収するために最も好適な方法で種々の技術を単独で、または組み合わせていかに用いればよいかを知っている。
【００２７】
よって、本発明のさらなる課題は、本発明の培養培地から活性濃縮物を製造する方法であり、その方法は下記の工程：
ａ）培養培地を有機溶媒で有機抽出する工程；
ｂ）場合によっては、得られた有機相を脱水し、かつ／または真空乾燥する工程；
ｃ）場合によっては、活性濃縮物を懸濁液とし、好ましくは得られた懸濁液を濾過し、有機抽出および脱水の工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程
を含むことを特徴とする。
【００２８】
本発明の方法によって得ることができる活性濃縮物は、本発明のさらなる課題である。
これにより得られる活性濃縮物は、次に、可視光線／紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、質量分析、また、クロマトグラフィー分析（シリカゲルまたはデキストランゲルクロマトグラフィーカラム、イオン交換樹脂、液相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなど）などの機器分析によって同定する。これは得られた活性濃縮物中に存在し得る種々の活性化合物（「活性画分」とも呼ばれる）を特性決定し、生産する助けとなる。
【００２９】
よって、本発明のさらなる課題は、好ましくは薄層クロマトグラフィーおよび／または低圧液体クロマトグラフィーの後に逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により、本発明の活性濃縮物から活性化合物を製造する方法である。
【００３０】
従って、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって得られる溶出液に相当し、実質的に純粋である。
活性濃縮物から活性化合物を分離するためには、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製は避けて通れない。薄層クロマトグラフィーおよび／またはセファデックスＬＨ２０型などの定圧液体は、多くの不純物を除去した活性濃縮物を得、それにより次に続くＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製を容易にする役割を果たす。
【００３１】
好ましくは、本発明の活性化合物を製造する方法は、活性化合物が、ムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＧもしくはムタクチマイシンＦなどのムタクチマイシン、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、またはこれらの活性化合物の医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物であることを特徴とする。
【００３２】
ムタクチマイシンＰ１１は下式：
【化１】
を有する。
【００３３】
これは、「Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」ベースにＲＮ１３８６８９−８１−３として登録されている既知のムタクチマイシンＣと一致することが確認されている。
ムタクチマイシンＰＲは下式：
【化２】
を有する。
ムタクチマイシンＦは下式：
【化３】
を有する。
ムタクチマイシンＧは下式：
【化４】
を有する。
アルドガマイシンＧ（またはＰ１０ａ）は下式：
【化５】
を有する。
下記の立体化学式：
【化６】
を有するアルドガマイシンは既知のものであり、「Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」ベースにＲＮ１０７７４５−５６−２として登録されている。
【００３４】
アルドガマイシンＨ（またはＰ８）は下式：
【化７】
を有する。
アルドガマイシンＰ１０ｂ（またはスワルパマイシンＢ）は下式：
【化８】
を有する。
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化９】
を有するムタクチマイシンＰＲであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３５】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１０】
を有するムタクチマイシンＦであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３６】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１１】
を有するムタクチマイシンＧであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３７】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１２】
を有するアルドガマイシンＧであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である（ただし、下記の立体化学式：
【化１３】
を有するアルドガマイシンＧは除く）。
【００３８】
本発明のさらなる課題は、アルドガマイシンＧが下記の立体化学式：
【化１４】
を有することを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００３９】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１５】
を有するアルドガマイシンＨであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４０】
好ましくは、アルドガマイシンＨは下記の立体化学式：
【化１６】
を有するか、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４１】
本発明のさらなる課題は、活性化合物が下式：
【化１７】
を有するアルドガマイシンＰ１０ｂであることを特徴とする、本発明の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４２】
好ましくは、アルドガマイシンＰ１０ｂは下記の立体化学式：
【化１８】
を有するか、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である。
【００４３】
本発明のムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧ、アルドガマイシンＧ、アルドガマイシンまたはアルドガマイシンＰ１０ｂは、例えば、化学法または酵素法などの当業者に公知のいずれかの方法によって得ることができる。好ましくは、上記のように本発明のサッカロスリックスＳＡ１０３からの発酵を含む製造方法が使用される。
【００４４】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦもしくはムタクチマイシンＧ、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨまたはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシンから選択される少なくとも２つの活性化合物の活性混合物である。
【００４５】
場合によっては、本発明の活性混合物は、ムタクチマイシンＰ１１，ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦもしくはムタクチマイシンＧ、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、および当業者に公知の抗菌活性、抗ウイルス活性、抗増殖活性または抗癌活性を有する他の活性化合物から選択される少なくとも２つの活性化合物を含み得る。
【００４６】
本発明の活性化合物は単独で、または、例えば、グラム陽性菌の増殖を妨げるまたは数を減らすために他の微生物薬と組み合わせて使用することができる。よって、これらの化合物は、医学的見地から、特に抗菌目的、抗ウイルス目的または抗癌目的で有用である。
【００４７】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの、治療上有効な量の本発明の活性化合物と医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物である。
【００４８】
これらの医薬組成物は、投与様式に対して医薬上適当ないずれの形態でも製造することができる。このような組成物の例は、錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤および顆粒剤などの経口投与用の固形組成物、溶液、懸濁液、シロップなどの経口投与用の液体組成物、ならびに無菌溶液、懸濁液またはエマルションなどの非経口投与用の製剤を含む。
【００４９】
本発明の活性化合物は、医薬上許容される限り、当業者に周知の、このような塩を形成するための試薬と付加塩を形成する。
【００５０】
本発明の活性化合物の好ましい使用量は、用いる特定の活性化合物、処方する特定の組成物、適用様式および特定の部位、宿主および処置する疾病によって異なる。一般に、本発明の活性化合物は、腹腔内、静脈内、皮下または局所的方法によって注射されるか、または経口投与される。当業者は、例えば、年齢、体重、性別、食生活、投与時間、排泄速度、患者の症状、医薬品の組合せ、反応感受性、および疾病の重篤度など、医薬品の作用を改質する種々の因子を考慮する。投与は継続的に行うこともできるし、最大許容量で周期的に行うこともできる。
【００５１】
抗菌薬として用いるためには、これらの活性化合物は一般に有効成分の濃度が処置する特定の生物の最小阻害濃度よりも高くなるように投与されるということを注記しておかねばならない。
【００５２】
よって、本発明の課題は、医薬品として用いるための、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨまたはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物である。
【００５３】
本発明のさらなる課題は、連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５４】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物によって、連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５５】
さらなる課題は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスの予防および／または処置を目的とする抗ウイルス医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５６】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物を用いて、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスを処置および／または予防する方法である。
【００５７】
本発明のさらなる課題は、肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者の予防および／または処置を目的とする抗癌医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物の使用である。
【００５８】
本発明のさらなる課題は、本発明の医薬組成物を用いて、肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者を処置および／または予防する方法である。
【００５９】
本発明のさらなる課題は、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物を含んでなる医薬品を用いて、植物の病害を予防および処置する方法である。
【００６０】
ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＦ、ムタクチマイシンＧまたはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどの本発明の活性化合物はまた、食品工業、皮革工業または木材工業における処置のためにも使用できる。
【００６１】
それらはまた、衛生目的、例えば、手洗いの目的、また、種々の実験器具、歯科用器具および医療器具またはその他の汚染材料を消毒する目的でも有用である。
【００６２】
以下の図の説明および実施例は本発明の説明を意図したものであって、その範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１： 材料および方法
１．１．微生物
本発明の放線菌生産株サッカロスリックスＳＡ１０３は、アルジェリア（サハラ）の乾燥地方の土壌から、土壌サンプルを無菌蒸留水に懸濁させ、アクチジオン５０ウイルスｇ／ｍｌを含有する腐食−ビタミンＢゲロース上に付着させることによって単離した。ＳＡ１０３株の純粋培養物を凍結乾燥により保存した。これをまた、実験室で用いるため、ＩＳＰ Ｎｏ．２傾斜培地(Shirling and Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340, 1996)上、６℃で維持した。
【００６４】
１．２．分類
ＳＡ１０３株の分類学的特徴を、Shirling and Gottlieb (1996) and in Waksman (“The Actinomycetes”, Vol. II, The Williams, & Wilkins Co.. Baltimore, 1961)に記載の種々の培地上で培養することにより判定した。形態学的特徴は、３０℃で１４日間増殖させた後に判定した。色の名称およびグレードの名称は、ＩＳＣＣ−ＮＢＳシステム(“Inter Society Colour Council” for the “National Bureau of Standards”)を用いて判定した。菌糸と胞子の形態の詳細な観察は、走査電子顕微鏡（日立、モデルＳ−４５０）により行った。生理学的特性はGood fellow (J. Gen. Microbiol. 69:33-90, 1971)およびWaksman (1961)の方法を用いて調べた。
【００６５】
細胞壁のジアミノピメリン酸の異性体の種類および糖の全細胞組成は、Becker et al. (Appl. Microbiol. 12:421-423, 1964)およびLechevalier and Lechevalier (“In the Actinomycetales” Ed. H. Prauser, pp.311-316, Fisher Verlag, Jena, 1970)の方法により判定した。リン脂質およびミコール酸は、Minnikin et al. (Int. J Syst. Bacteriol. 27:104-107, 1977; J. Chromatography 188:221-233, 1980)の手法により分析した。
【００６６】
１．３．発酵
成熟傾斜培養物から採取したＳＡ１０３株のサンプルを、０．４％グルコース、１％麦芽抽出物および０．４％酵母抽出物を含有する無菌培養培地（滅菌前にｐＨ７．２の調整）５０ｍｌの入ったエルレンマイヤーフラスコに接種し、３０℃にて回転攪拌機（２５０ｒｐｍ）上で２日間培養した。抗生物質を生産するため、培養培地３ｍｌを、上記培地が１００ｍｌずつ入った５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件を用いて１０日間培養した。総抗菌活性の生成を栄養ゲロース上で、枯草菌(Bacillus subtilis) ＡＴＣＣ６６３３に対するゲロース拡散試験によって行った。３０℃で２４時間インキュベーションした後に増殖阻害を調べた。抗微生物活性は、阻止域の直径を測定することによって調べた。菌糸の乾重は、ホモジナイズした培養培地１ｍｌを入れ、１０５℃で２４時間乾燥させたエッペンドルフ管にて測定した(Pfefferle et al. J. Biotech. 80:135-142, 2000)。
【００６７】
１．４．抗生物質の精製
ＳＡ１０３株による抗菌抗生物質の生産は、液体培地ＭＳ＋デンプン（１％）＋酵母抽出物（０．３％）、ｐＨ７．２で行った（５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ当たり培地１００ｍｌ、２５０ｒｐｍで攪拌、３０℃でインキュベーション）。動態から、ＳＡ１０３株は指数増殖期（１日目）の開始時から抗生物質を生産し始め、この生産が定常期の開始時まで続き、その後、安定化した後、減数期の際に低下する（図１参照）。
【００６８】
全部で８リットルの培養物を準備した。この濾液をｎ−ブタノールで抽出した。目的の抗菌抗生物質を含有するブタノール抽出液を保持した。
【００６９】
この赤色のブタノール抽出液をＲｏｔａｖａｐｏｒで濃縮した。この抽出液のアリコートを、まず、移動相として再蒸留水中メタノール（８０％）を用いて、セファデックスＬＨ２０カラムに送り込んだ。しかし、抗生物質の分離（裸眼による視認とアンチバイオグラフィーによる可視化）は決定的なものではなかった。よって、この工程は除外し、ブタノール抽出液を、Ｃ１８カラムと均一濃度条件（水中６３％メタノール）、流速１．５ｍｌ／分、２２０ｎｍでの検出を用いて逆相ＨＰＬＣによりそのまま精製した。プロフィール上で得られた総てのピークに相当する画分をそれぞれ回収し、濃縮し、枯草菌に対して試験した。次の７画分（７ピーク）で活性があることが分かった：明赤色の４画分（Ｐ１１、ＰＲ、ＦおよびＧ）および無色の３画分（Ｐ８、Ｐ１０ａおよびＰ１０ｂ）。これらの抗生物質を、これまでと同じ条件で３〜４回再注入した後、ＨＰＬＣにより精製した。
【００７０】
実施例２： 結果および考察−生産株の分類学的特性決定
２．１．株の形態
ＳＡ１０３株は、線形または柔軟な胞子鎖に分断された十分発達した桃色の好気性菌糸を形成した。これらの胞子は棒状で、大きさは１．９〜２．９×０．６〜０．７ミクロンで、平滑な表面を持っている（図１）。内生胞子、強膜顆粒、束状体および鞭毛胞子は観察されなかった。基底菌糸は褐色がかった赤色から深紅で、断片はほとんど見られなかった。この株は特徴的な暗赤色の色素を豊富に生産し、これが抗菌抗生物質に相当することが明らかになった。
【００７１】
２．２．構造的特徴
表１は種々の培養支持体上でのＳＡ１０３株の培養の特徴を示す。株の増殖は酵母抽出物ならびに麦芽抽出物ゲロース、ベネットゲロースおよび栄養ゲロース上では盛んであるが、オートミールゲロースおよび無機塩−デンプンゲロース上ではそれほどでもない。菌糸の色は好気性菌糸では黄色がかった桃色から薄い赤色がかった褐色までの範囲であり、基底菌糸では褐色がかった橙色から濃暗赤色までの範囲であった。この株は、用いた菌糸の総てで暗赤色または褐色がかった橙色の水溶性色素を生産したが、メラノイド色素は見られなかった。
【００７２】
最も違いの少ない種はサッカロスリックス・シリンゲ(Saccharothrix syringae)であり、白桃食がかった好気性菌糸、基底菌糸および紫−赤−褐色の水溶性色素を持っていた。
【００７３】
２．３．化学的分類
化学的分類研究から、メソ−ジアミノピメリン酸が存在し、グリシンが存在しないことが示された（III型の細胞壁）。細胞全体の糖モチーフはラムノースおよびガラクトースからなっており（Ｅ型の細胞糖）(Kroppendstedt, “The genus Nocardiopsis. In the Procaryotes”Ed., A. Balows et al., pp.1139-1159, Springer Verlag, Berlin, 1192)、特徴的なリン脂質はホスファチジル−エタノールアミンであった（Ｐ１１型のリン脂質）。ミコール酸は検出されなかった。
【００７４】
２．４．株の生理学
生理学的試験の結果を表２に示す。
この株は、ほとんどの糖類を含む数種類の有機化合物（カゼイン、ゼラチン、ツィーン８０、デンプン、チロシンなど）を使用できる。これに対して、マンニトールを除き、オースのアルコール誘導体（イノシトール、アドニトール、ダルシトール、エリトリトールおよびソルビトール）は分解されない。この株は２０℃および４８℃（最適な３０℃）、ｐＨ５および９（最適な７〜８の間）で増殖可能である。また、リゾチームとクリスタルバイオレットには耐性があるが、ペニシリンとリファンピシンを除き、試験した抗生物質（１１）には感受性である。
【００７５】
ＳＡ１０３株はＳａ．シリンゲと、ラクトースは分解できるがヒポキサンチンと酪酸ナトリウムは分解できないこと、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オキシテトラサイクリンおよびバンコマイシンに感受性であること、ペニシリン、リファンピシンおよびクリスタルバイオレットに耐性があること、ならびにｐＨ５で増殖することによって識別される。
【００７６】
よって、ＳＡ１０３株は、サッカロスリックスの新規な種、あるいはおそらくはＳａ．シリンゲの新規な亜種であり得る。
【００７７】
２．５．分類
上記の形態的特性および化学的特性を基づけば、ＳＡ１０３株はサッカロスリックス属に属すものと結論付けられた(Labeda, et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 :426-431, 1984)。最も近縁な種サッカロスリックス・シリンゲＮＲＲＬ Ｂ−１６ ４６８Ｔに比べ、このＳＡ１０３株は、ラクトースは分解できるがヒポキサンチンと酪酸ナトリウムは分解できないこと、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オキシテトラサイクリンおよびバンコマイシンに感受性であること、ペニシリン、リファンピシン、クリスタルバイオレットおよびナトリウムアゾチドに耐性があること、ならびにｐＨ５．０で増殖することで異なる。よって、この株をサッカロスリックス種ＳＡ１０３と呼称した。
【００７８】
２．６．発酵
サッカロスリックス種ＳＡ１０３による抗菌活性の生産の経時的変動を図１に示す。枯草菌に対する生物活性の生成は１日目に始まり、４日目にピークに達した後、安定する。バイオマスは最初の３日で増大し、安定となった後、８日目に低下した。ｐＨ動態は、１日目に急激に上昇した後、中性となり、発酵の終了時に上昇することが示された。一般に、微生物による二次代謝産物の生産は定常期に始まるが、本ケースでは、生物活性の生成は増殖と強い相関があり、経時的変動の全過程で見られた。同様の経時的生産動態が、サッカロスリックス種ＳＡ２３３によるジチオロピロロン抗生物質の生産についても (Lamari et al., J. Antibiotics 55:696-701, 2002)、ストレプトミセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)によるクラブラン酸の生産についても見られた(Lebrihi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 26:130-135, 1987)。
【００７９】
２．７．抗生物質の構造の決定
抗生物質の単離および精製の種々の工程を図２にまとめている。
【００８０】
２．７．１．アントラサイクリン系抗生物質
抗生物質Ｐ１１、ＰＲ、ＦおよびＧは中性ｐＨでは明赤色、酸性ｐＨでは黄色、塩基性ｐＨでは青紫色である。Ｐ１１が主要な抗生物質であり、ＰＲは副次的な抗生物質である。これらの抗生物質を以下の直腸鏡検査：ＵＶ可視光、赤外、質量分析、ならびにプロトンおよび炭素１３のＮＭＲ（相関研究を伴う）の対象とした。また、溶解度、ＣＣＭによるＲｆの測定および元素分析（Ｐ１１に関しては後者のみ）などの補助試験も行った。
【００８１】
Ｐ１１分子のムタクチマイシンＣとしての同定
このＰ１１分子の分子量は５３０であり、化学式はＣ２７Ｈ３０Ｏ１１である。ＵＶ−可視光（ＭｅＯＨ）で得られた最大値は、２１９、２３４、２５０、２８７、４７８、４９６および５３１ｍｍである。このスペクトルはアントラサイクリン系の抗生物質のものと同様であり、また、色はｐＨが異なれば変化する。赤外スペクトルは芳香基、ヒドロキシル基、メチル基およびメトキシル基の存在を示唆する。さらに、プロトンおよび炭素１３のＮＭＲによる詳細研究（化学シフト、スピン−スピン結合定数、シグナル強度および１Ｈ−１Ｈ ｃｏｓｙ ４５、１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＣＱおよび１Ｈ−１３Ｃ ＨＭＢＣ相関）を行った後、最終的な構造を解明した。このようにしてＰ１１分子は、放線菌種の突然変異株によって分泌されることが知られているムタクチマイシンＣとして同定された。ムタクチマイシンＣは、オース（６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−マンノピラノシド）と（炭素Ｃ７を介して）結合したアントラサイクリン核（２つのベンゼン環の間にキノン環を含む４つの隣接する環）からなる。Ｐ１１は水、メタノール、ｎ−ブタノール、エタノール、１−プロパノールおよびアセトンにおける溶解度が高く、ｎ−ヘキサンおよびトルエンに不溶である。
【００８２】
新規なムタクチマイシンの化学構造の決定
ムタクチマイシンＰＲ
この副次的なＰＲ分子の分子量は６６２であり、式Ｃ３２Ｈ３８Ｏ１５に相当する。ＵＶ−可視光で得られた最大値および赤外バンドＰ１１の場合と同一であり、マスフラグメントはこの２つの抗生物質間でかなりの類似性があり、化学構造が極めて似ていることを示唆している。ＰＲは水、メタノールおよびエタノールにおける溶解度が高く、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはＰＲの構造の解明に役立ち、その構造はＰ１１（ムタクチマイシンＣ）に近いことが分かり、唯一の違いは１つ目のベンゼン環の炭素と（−ＯＣＨ３の位置で）結合した第二のオースが存在することである。この第二のオースは６−デオキシ−マンノピラノシド（メチルが存在しないことで最初のものとは異なる）である。この構造により、ＰＲ分子はアントラサイクリン系に、そしてムタクチマイシン群に属す。しかし、これは既知のどのムタクチマイシンとも異なり、従って、この群の新規な抗生物質に当たり、ムタクチマイシンＰＲと呼ぶ。
【００８３】
ムタクチマイシンＦ
抗生物質Ｆの分子量は５１６（従って、Ｐ１１よりも１４小さい）、分子式Ｃ２６Ｈ２８Ｏ１１に相当する。そのＵＶ−可視光および赤外スペクトルならびにマスフラグメントはＰ１１およびＰＲのものと極めて類似している。従って、このことはこの３つの分子の間で強い類似性があることを示唆している。この化合物Ｆは水、ｎ−ブタノール、１−プロパノールおよびエタノールに可溶で、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはこの分子の構造の解明に役立ち、その構造はＰ１１（ムタクチマイシンＣ）に極めて類似していることが分かり、唯一の違いはマンノピラノシル残基の炭素Ｃ３上に、−ＯＣＨ３基の代わりにＯＨが存在することである。この抗生物質Ｆは既知のどのムタクチマイシンとも異なり、新規な分子に当たり、ムタクチマイシンＦと呼ぶ。
【００８４】
ムタクチマイシンＧ
この分子の分子量は５０２であり、式Ｃ２５Ｈ２６Ｏ１１に相当する。ＵＶ−可視光および赤外スペクトル、ならびにマスフラグメントにおいて、Ｇ、Ｆ、ＰＲおよびＰ１１間の強い類似性が見られた。生成物Ｇは水、ｎ−ブタノール、１−プロパノール、メタノールおよびエタノールに可溶で、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンおよびトルエンには不溶である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲはこの分子の構造の解明に役立ち、その構造はＰＲと極めて類似していることが分かり、唯一の違いはアントラサイクリン核の４番目の環の炭素Ｃ７に結合した第二のオースが存在しないことである。従って、この抗生物質Ｇはムタクチマイシン群の新規な分子に当たり、よって、ムタクチマイシンＧと呼ぶ。
【００８５】
２．７．２．マクロライド系抗生物質
抗生物質Ｐ８、Ｐ１０ａおよびＰ１０ｂは無色である。Ｐ８はサッカロスリックス種ＳＡ１０３によって生産される、Ｐ１１（ムタクチマイシンＣ）に次ぐ主要分子である。この３種類の抗生物質はメタノール、ｎ−ブタノール、エタノール、１および２−プロパノール(propnol)、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムおよびジクロロメタンにおいては溶解度が高いが、水およびｎ−ヘキサンには不溶である。これらの抗生物質も上記のムタクチマイシンと同じ分光光度分析の対象としたところ、それらの化学構造の決定に至るのに役立った。
【００８６】
Ｐ１０ａのアルドガマイシンＧとしての同定
抗生物質Ｐ１０ａの分子量は７４０であり、分子式Ｃ３７Ｈ５６Ｏ１５に相当する。ＵＶ−可視光スペクトルはアルドガマイシンのものと極めて類似しており、２１６ｎｍにピークを、そして２４５ｎｍと２７８ｎｍにショルダーを示した。赤外スペクトルは、メチル基、メトキシル基、ヒドロキシル基およびカーボネート官能基の存在を示すいくつかの吸収バンドを示す。Ｐ１０ａはｎ−ブタノール、１および２−プロパノール、メタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンおよびエタノールに可溶で、ｎ−ヘキサン、トルエンおよび水には不溶である。このようにＰ１０ａ分子は、ストレプトミセス・アビジニー(Streptomyces avidinii)によって分泌されることが知られているアルドガマイシンＧとして同定された。アルドガマイシンＧは中性のマクロライドであり、そのラクトン環は、２つのメチル化糖、Ｃ１４位にミシノエ、およびＣ５位にアルドガロースが結合されている１６個の原子を含む。
【００８７】
新規なマクロライドの化学構造の決定
アルドガマイシンＨ
抗生物質Ｐ８の分子量は７１４であり、分子式Ｃ３６Ｈ５８Ｏ１４に相当する。その物理化学的特性はＰ１０ａ（アルドガマイシンＧ）のものと極めて類似している。しかし、Ｐ１０ｂのＵＶ−可視光スペクトルは２４５ｎｍと２７８ｎｍでより低い吸光強度を示し、その赤外スペクトルは、アルドガマイシンＧの場合のカーボネート基に特徴的な１８００ｃｍ−１における吸収バンドをもはや含んでいない。生成物Ｐ８は、その分光分析データを総て解析した後、アルドガマイシンＥと類似しているが、アルドガロース糖上のカーボネート官能基が存在しない（この場合は加水分解されている）ことで異なる、Ｈと呼ばれる新規なアルドガマイシンであると同定された。
【００８８】
スワルパマイシンＢ
Ｐ１０ｂ分子はＨＰＬＣによりＰ１０ｂ生成物から分離することができなかったので、複合体の形で生成物Ｐ１０ｂと同時に分析した。その分子量は６９８であり、化学式はＣ３６Ｈ５８Ｏ１３である。プロトンおよび炭素１３のＮＭＲ分析は最終的な構造を解明するのに役立った。そして、Ｐ１０ａはＰ８およびスワルパマイシンに極めて類似した化学構造を有する。
【００８９】
抗生物質の微生物学的活性
ムタクチマイシンＰ１１、ＰＲ、ＦおよびＧ、ならびにマクロライドＰ８、Ｐ１０（ａおよびｂ）の微生物学的活性は主としてグラム陽性菌に対するものである。最も感受性の高い細菌はミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)と肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)（感受性のある唯一のグラム陰性菌である）である。
【００９０】
最小阻害濃度(minimum inhibiting concentration)（ＭＩＣ）は、Ｍ．ルテウスおよび肺炎桿菌では５μｇ／ｍｌであり、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) ＣＩＰ ５３１５６では１０μｇ／ｍｌ、枯草菌では４０μｇ／ｍｌ、リステリア菌(Listeria monocytogenes)では５０μｇ／ｍｌであり、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)では７５μｌ／ｍｌである。新規な分子ＰＲ、ＦおよびＧは同じ微生物（リステリア菌以外）に
対して活性がある。
【００９１】
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５、グラム陰性菌の大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)病原型シリンゲおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefasciens)、ならびに酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)および糸状菌ムコール・ロマニアヌス(Mucor romannianus）に対して作用を持つ分子はなかった。
【００９２】
マクロライド（アルドガマイシンＧおよびＨ）およびスワルパマイシンＢの活性はムタクチマイシンの活性よりも大きい。実際、ＭＩＣは肺炎桿菌では０．１μｇ／ｍｌに過ぎず、枯草菌、ミクロコッカス・ルテウスおよび黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６では１μｇ／ｍｌであり（これらは最も感受性が高い）、リステリア菌およびスメグマ菌ではそれぞれ３０および５０μｇ／ｍｌである。グラム陰性菌（肺炎桿菌を除く）および真菌は耐性である。
【００９３】
供試生物 ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
（スワルパマイシン）
枯草菌ＡＴＣＣ ６６３３ １
ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ９３１４ １
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５ ＞１００
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６ １
リステリア菌ＣＩＰ ８２１１０ ３０
スメグマ菌ＡＴＣＣ ６０７ ５０
肺炎桿菌ＣＩＰ ８２．９１ ０．１
大腸菌ＡＴＣＣ １０５３６ ＞１００
シュードモナス・シリンゲＮｏ２４１０ ＞１００
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＮｏ２４１０ ＞１００
ムコール・ロマニアヌスＮＲＲＬ １８２９ ＞１００
サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ ４２２６ ＞１００
【００９４】
供試生物 ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
（アルドガマイシンＨ）
枯草菌ＡＴＣＣ ６６３３ １０
ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ９３１４ １
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ７６２５ ＞１００
黄色ブドウ球菌ＣＩＰ ５３１５６ ５
リステリア菌ＣＩＰ ８２１１０ ＞１００
スメグマ菌ＡＴＣＣ ６０７ ２０
肺炎桿菌ＣＩＰ ８２．９１ ０．５
大腸菌ＡＴＣＣ １０５３６ ＞１００
シュードモナス・シリンゲＮｏ２４１０ ＞１００
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＮｏ２４１０ ＞１００
ムコール・ロマニアヌスＮＲＲＬ １８２９ ＞１００
サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ ４２２６ ＞１００
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
【表１２】
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】サッカロスリックス種ＳＡ１０３株の発酵特性
【図２】サッカロスリックス種ＳＡ１０３株の活性産物の単離および精製
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００４年２月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３１６０として寄託された放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３またはその突然変異株。
【請求項２】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡおよび／または少なくとも１つのその突然変異株を選択する方法であって、下記の工程：
ａ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を含む可能性のある生体サンプルを適当な選択培地と接触させる工程；
ｂ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離するのに適当な選択培地。
【請求項４】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株の培養物から培養培地を調製する方法であって、下記の工程：
ａ）前記の株を栄養培地で発酵させて培養培地を得る工程；
ｂ）場合によっては、工程ａ）で得られた培養培地を分離する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
任意の工程ｂ）で行われる分離が遠心分離および／または濾過および／または低温殺菌である、請求項４に記載の培養培地調製方法。
【請求項６】
請求項４および５のいずれかに記載の方法によって得ることができる培養培地。
【請求項７】
請求項６に記載の培養培地から活性濃縮物を製造する方法であって、下記の工程：
ａ）培養培地を有機溶媒で有機抽出する工程；
ｂ）場合によっては、得られた有機相を脱水し、かつ／または真空乾燥する工程；
ｃ）場合によっては、活性濃縮物を懸濁液とし、好ましくは得られた懸濁液を濾過し、有機抽出および脱水の工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７の方法によって得ることができる活性濃縮物。
【請求項９】
好ましくは薄層クロマトグラフィーおよび／または低圧液体クロマトグラフィーの後に逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により、請求項８に記載の活性濃縮物から活性化合物を製造する方法。
【請求項１０】
活性化合物がムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＧもしくはムタクチマイシンＦなどのムタクチマイシン、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、またはこれらの活性化合物の医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である、請求項９に記載の活性化合物の製造方法。
【請求項１１】
活性化合物が下式：
【化１】
を有するムタクチマイシンＰＲである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１２】
活性化合物が下式：
【化２】
を有するムタクチマイシンＦである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１３】
活性化合物が下式：
【化３】
を有するムタクチマイシンＧである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１４】
活性化合物が下式：
【化４】
を有するアルドガマイシンＧである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物（ただし、下記の立体化学式：
【化５】
を有するアルドガマイシンＧは除く）。
【請求項１５】
アルドガマイシンＧが下記の立体化学式：
【化６】
を有する請求項１４に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１６】
活性化合物が下式：
【化７】
を有するアルドガマイシンＨである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１７】
アルドガマイシンＨが下記の立体化学式：
【化８】
を有する、請求項１６に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１８】
活性化合物が下式：
【化９】
を有するアルドガマイシンＰ１０ｂである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１９】
アルドガマイシンＰ１０ｂが下記の立体化学式：
【化１０】
を有する、請求項１６に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項２０】
治療上有効な量の請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物と医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２１】
医薬品としての使用のための、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物。
【請求項２２】
連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスの予防および／または処置を意図した抗ウイルス医薬品の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者の予防および／または処置を意図した抗癌医薬品の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物を含んでなる植物薬を用いて植物の病害を予防または処置する方法。
【請求項１】
２００４年２月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３１６０として寄託された放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３またはその突然変異株。
【請求項２】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡおよび／または少なくとも１つのその突然変異株を選択する方法であって、下記の工程：
ａ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を含む可能性のある生体サンプルを適当な選択培地と接触させる工程；
ｂ）前記の株および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株を単離するのに適当な選択培地。
【請求項４】
請求項１に記載の放線菌株サッカロスリックスＳＡ１０３および／または少なくとも１つのその突然変異株の培養物から培養培地を調製する方法であって、下記の工程：
ａ）前記の株を栄養培地で発酵させて培養培地を得る工程；
ｂ）場合によっては、工程ａ）で得られた培養培地を分離する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
任意の工程ｂ）で行われる分離が遠心分離および／または濾過および／または低温殺菌である、請求項４に記載の培養培地調製方法。
【請求項６】
請求項４および５のいずれかに記載の方法によって得ることができる培養培地。
【請求項７】
請求項６に記載の培養培地から活性濃縮物を製造する方法であって、下記の工程：
ａ）培養培地を有機溶媒で有機抽出する工程；
ｂ）場合によっては、得られた有機相を脱水し、かつ／または真空乾燥する工程；
ｃ）場合によっては、活性濃縮物を懸濁液とし、好ましくは得られた懸濁液を濾過し、有機抽出および脱水の工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７の方法によって得ることができる活性濃縮物。
【請求項９】
好ましくは薄層クロマトグラフィーおよび／または低圧液体クロマトグラフィーの後に逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により、請求項８に記載の活性濃縮物から活性化合物を製造する方法。
【請求項１０】
活性化合物がムタクチマイシンＰ１１、ムタクチマイシンＰＲ、ムタクチマイシンＧもしくはムタクチマイシンＦなどのムタクチマイシン、またはアルドガマイシンＧ、アルドガマイシンＨもしくはアルドガマイシンＰ１０ｂなどのアルドガマイシン、またはこれらの活性化合物の医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物である、請求項９に記載の活性化合物の製造方法。
【請求項１１】
活性化合物が下式：
【化１】
を有するムタクチマイシンＰＲである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１２】
活性化合物が下式：
【化２】
を有するムタクチマイシンＦである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１３】
活性化合物が下式：
【化３】
を有するムタクチマイシンＧである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１４】
活性化合物が下式：
【化４】
を有するアルドガマイシンＧである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物（ただし、下記の立体化学式：
【化５】
を有するアルドガマイシンＧは除く）。
【請求項１５】
アルドガマイシンＧが下記の立体化学式：
【化６】
を有する請求項１４に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１６】
活性化合物が下式：
【化７】
を有するアルドガマイシンＨである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１７】
アルドガマイシンＨが下記の立体化学式：
【化８】
を有する、請求項１６に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１８】
活性化合物が下式：
【化９】
を有するアルドガマイシンＰ１０ｂである、請求項９および１０のいずれかに記載の製造方法によって得ることができる活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項１９】
アルドガマイシンＰ１０ｂが下記の立体化学式：
【化１０】
を有する、請求項１６に記載の活性化合物、またはその医薬上許容される付加塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および混合物。
【請求項２０】
治療上有効な量の請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物と医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２１】
医薬品としての使用のための、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物。
【請求項２２】
連鎖球菌などのグラム陽性菌が関わる感染、新生児感染、泌尿器感染、心内膜炎、肺炎、髄膜炎、耳炎、リステリア症、ジフテリア、結核またはらい病の予防および／または処置を目的とする抗生物質の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルス、ワクチンウイルス、コロナウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスに関わる感染、またはインフルエンザ、天然痘、麻疹、風疹、水痘、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎、単球増加症、黄熱、脳炎またはヘルペスの予防および／または処置を意図した抗ウイルス医薬品の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
肺、子宮、乳房もしくは卵巣の癌、結腸直腸癌、白血病などの癌に罹患している患者、または前立腺、膀胱、皮膚、脳、咽喉の腫瘍に罹患している患者の予防および／または処置を意図した抗癌医薬品の製造のための、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の活性化合物を含んでなる植物薬を用いて植物の病害を予防または処置する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５０００３５（Ｐ２００８−５０００３５Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４０１２（Ｐ２００７−５１４０１２）
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１２９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８７７７
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０３０９５３７６）アンスティテュ ナシオナル ポリテクニク ドゥ トゥールーズ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１２９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８７７７
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０３０９５３７６）アンスティテュ ナシオナル ポリテクニク ドゥ トゥールーズ (4)
【Ｆターム（参考）】
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