植物抽出物、それを含む組成物、抽出方法及びその使用
クワ植物の葉から植物抽出物を得た。これはクワ植物の葉から抽出されたものであり、この抽出物のα−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値は濃度にして９０μｇ／ｍｌ未満である。該抽出物は好ましくは５〜４０％（ｗ／ｗ）の全イミノ糖及び２０〜７０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸を含む。該抽出物は、３つの抽出工程及び精製過程から得られ、雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫のような、色素沈着による病気又は疾患の治療において、メラニン生産を低下させるために用いることができる。血中グルコースレベルを制御するためにもまた使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物抽出物、それを含む組成物、抽出方法、及び前記抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クワの葉は、アジア諸国、特に中国で、長年に渡って医薬品として使用されてきた。近年、植物化学者らが、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、ファゴミン、及びＮ−メチル−ＤＮＪなどの数多くのイミノ糖成分をクワの葉から単離している。イミノ糖の化学構造は単糖の構造と同様であり、その多くは、５〜６員環のポリヒドロキシ複素環化合物である。イミノ糖と単糖の大きな違いは、複素環のヘテロ原子にある。前者は窒素原子（Ｎ）を含むが、後者は酸素（Ｏ）を含む。
【０００３】
クワの葉由来のイミノ糖成分が、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩに対して明らかな阻害活性を呈すること、特にＤＮＪが最も強い活性をもつことが分かってきた。さらに薬理学的な実験から、ＤＮＪがメラニン細胞に作用し、ＴＹＲの成熟過程を阻害することによってメラニン生産の低下をもたらすことが明らかになった（Genji Imokawa, Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition. The Journal of Investigative dermatology, 1990, 95(1 ):39-49; Ju Young Park, hyunjung Choi, Jae Sung hwang, Junoh Kim, Ih-Seop Chang, Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells, Journal of Cosmetic Science, 2008, 59:139-150）。
【０００４】
本発明の発明者らは、酵素を用いた一連の実験を行い、そして、本発明の抽出物として記載した、クワの葉由来の全イミノ糖抽出物（１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、及びファゴミン含量として測定した）が、純粋なＤＮＪ化合物よりも、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩに対する強力な阻害活性をもつことを見い出した。この発見から、そのようなクワ抽出物をα−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害するために使用することが可能となり、この抽出物に含まれるＤＮＪはより低濃度であるため、薬の副作用（ＡＤＲ）を低減できる可能性があり、また、より安全に使用できるように最終的な製品を製造することができる。加えて、本発明に記載したクワ抽出物の製造にかかる費用は、純粋なＤＮＪ化合物を製造する費用よりもかなり低いため、病気による色素沈着過度の治療にかかる費用が大幅に減少する。
【０００５】
従って、そのような抽出物から作成した化粧品及び医薬品は、以下に構造を示すＤＮＪのような、純粋な化合物を含むものよりも、効果、安全性、及び費用の面で多くの利点を有する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
過去には、中国又はその他の国の多くの研究者達が、美白及びシミを少なくするための市場で、クワ抽出物を含む化粧品の商業化を試みた。しかしながら、それと比較すると、本抽出物は非常に異なる特徴や多数の利点を有する。
【０００８】
中国特許第ＺＬ９９１２３８９４Ｘ号には、皮膚の色素沈着治療用の植物抽出物組成物が開示されており、この組成物は、３つの主要な成分、すなわち、クワ属の植物由来抽出物、スクテラリア属の植物由来抽出物、及びサリチル酸誘導体を含んでいる。その発明のクワ抽出物はクワの根から得られたもので主にクワノンを含むが、抽出物の正確な組成については明らかになっていない。
【０００９】
米国特許出願第３４７８８４号には、同様の化粧品を目的としたクワの木の枝由来の抽出物の使用が開示されており、この抽出物中の活性成分はオキシレスベラトロール及びムルベロシドである。これら２つの発明と比較すると、本発明は以下の利点及び特徴を有する。
１．生の材料である利点。本発明で使用する生の材料、すなわちクワの葉は容易に再生でき、根及び枝よりも持続可能な資源である。また、上述した２つの発明と比較して、費用を安く抑えられる。
２．異なる作用機序。上述した２つの発明では、ＴＹＲを競合的に阻害することにより活性が達成された。本発明の作用機序は、α−グルコシダーゼの阻害を介してメラニンの生産を減少させ、成熟度の低い（かつより不活性な）ＴＹＲを生じる。
３．異なる作用成分。上述した特許では、活性成分は、フラボノイド、例えばクワノン、又はジフェニルエテノイド、例えばオキシレスベラトロール及びムルベロシドであった。一方、本発明の作用成分はイミノ糖であり、また、これらイミノ糖を豊富に含む抽出物を単離するために、異なる調製方法を用いている。
４．独特な調製方法。活性成分の抽出に最適であり、そして、例えば抽出物の物理学的特性を改善するような精製工程を確保するようにこの方法を設計しているため、抽出物は、例えば化粧品への使用により適したものとなる。
【００１０】
メラニンは、人の皮膚の色を決定する上で最も重要な因子である。メラニンは、表皮基底層のメラニン細胞におけるメラノソーム中で生合成される。通常の生理学的条件下でメラニンは、紫外線による損傷から皮膚を保護している。外部因子によってメラニンの合成や代謝が阻害されると、ホルモン障害や老化などが起こり、表皮基底層のメラニンが増加して皮膚の色が黒くなる場合がある。これはその後、病気による色素沈着、又は、雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫のような疾患を生じる可能性がある。さらに、皮膚をより白くしたいと熱望している多数の美容愛好家がいることから、皮膚を明るくする、美白、及びシミを少なくするための薬剤及び化粧品への需要がある。
【００１１】
簡単に説明すると、メラニンの生合成は以下の工程を含む。
【００１２】
【化２】
【００１３】
チロシナーゼ（ＴＹＲ）は銅イオンをもつ糖タンパク質の１種であり、メラニン生合成に重要な酵素である。ＴＹＲは、チロシンがドーパ及びドーパキノンに変換される反応を触媒する。ＴＹＲは色素沈着の減少にとって重要な標的であると考えられており、皮膚の美白及びシミを減少させる機能をもつ製品を対象とする研究分野においてしばしば用いられている。
【００１４】
ＴＹＲを標的としている現在の主な方法は、その形成及び活性を阻害して、メラニンの生産を減少させるものである。ＴＹＲ阻害剤を含む現行の製品には、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）及びその誘導体、コウジ酸及びその誘導体、並びにアルブチンが挙げられる。
【００１５】
１，４−ジヒドロキシベンゼン及びその誘導体はＴＹＲの活性を１００％阻害することができるが、それらはまたメラニン細胞を刺激し、そして細胞毒性を示す。１，４−ジヒドロキシベンゼンを長期間にわたって使用し、日光にも当たり続けると、外生の色素沈着斑が生じる場合がある。そのため、これらをスキンケア製品に使用することは禁止されている。
【００１６】
コウジ酸は非常に安定であり、かつ、銅イオンをキレートしてＴＹＲの活性を低減させることにより、色素沈着斑の低下に良い効果をもつ。しかしながら、コウジ酸の長期使用は、皮膚疾患を起こす細胞毒性を生じる場合がある。日本の研究者らは、コウジ酸が肝臓癌を引き起こす可能性があることを示した（Tamotsu Takizawa, Toshio Imai, Jun-ichi Onose, Makoto Ueda, Toru Tamura, Kunitoshi Mitsumori, Keisuke Izumi and Masao Hirose. Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine. Toxicological Sciences 2004 81 (1):43-49）。
【００１７】
アルブチンは、副作用が非常に弱い、美白及びシミ減少用美容製品だと考えられているが、光に対する感受性が非常に高く、その結果、最終的な製品には大量の日焼け防止剤を加えることが必要となる。このことは皮膚にとって負担となり、従って皮膚の老化過程が促進されることになる。
【００１８】
上述した欠点は、皮膚を白くするため及びシミを減少させるための美容製品市場に現存する製品の適用を制限するものである。
ＴＹＲは糖鎖をもつタンパク質（糖タンパク質）である。生化学分野における近年の研究から、その生産（及び成熟）過程で新しく生産されたＴＹＲを通常の生物学的機能を有する成熟ＴＹＲに変換するためには、元の糖鎖が一連の修飾を受けることが必須であることが明らかになった。α−グルコシダーゼＩ及びＩＩはこの過程の重要な酵素である。α−グルコシダーゼＩは主に、α−１，２結合を糖鎖の遠端にもつグルコース部分の「開裂」に関与し、α−グルコシダーゼＩＩは２つの工程で、α−１，３結合によって結合した残る２つのグルコース部分の開裂に関与すると考えられている（Mehta A, Zitzmann N, Rudd PM, Block TM, Dwek RA. α-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents, FEBS Letters, 1998, 430(1):17-22）。
【００１９】
α−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害すると糖タンパク質中の糖鎖の修飾が阻害されるため、成熟したＴＹＲが生産されないと考えられている。その結果、「未成熟なＴＹＲ」により、低い割合のメラニンしか生産されない（Hiroyuki Takahashi, Peter G. Parsons, Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells, The Journal of Investigative dermatology, 1992, 98(4):481-487）。
【００２０】
そのため、メラニン合成を阻害するための作用機序案を示している図４に表したように、成熟ＴＹＲの形成を最小限に抑えるためには、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害し、それによってメラニン生産とそれに続く皮膚の色素沈着を減少させることが非常に都合のよい方法である。クワ属抽出物は、α−グルコシダーゼによって触媒されるチロシナーゼの必須な修飾を阻害し、その結果、不活性型のチロシナーゼを形成する。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、クワ属植物の葉から得られる植物抽出物を提供する。該抽出物はα−グルコシダーゼＩを阻害するためのＩＣ５０値が９０μｇ／ｍｌ未満の濃度である。
この植物のα−グルコシダーゼＩを阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくは濃度にして７０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは５〜６０μｇ／ｍｌ、そしてさらに好ましくは５〜４０μｇ／ｍｌである。
【００２２】
ＩＣ５０は、実験１に示したように決定することができる。
この抽出物の活性が単離した純粋なＤＮＪの活性よりも高い原因は、抽出物中に存在するその他のイミノ糖の活性によるものであると考えられる。抽出物は好ましくは、定量ＨＰＬＣ及び／又はＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）を用いて測定した場合に、総量にして５〜４０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖を含む。測定したイミノ糖には、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、及びファゴミンが含まれる。
【００２３】
抽出物は、より好ましくは、総量にして８〜３０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖、さらに好ましくは総量にして１５〜２０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖を含む。
特徴的な化学成分の含量を正確に制御することにより、製品の質を効率的に制御することが可能になり、そして、製品の化粧用又は治療用効果を一定に保つことができる。
【００２４】
最も好ましくは、抽出物は、イミノ糖である１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、２−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−ＤＮＪ（ＧＡＬ−ＤＮＪ）及びカリステギンＢをさらに含む。
【００２５】
グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤であるＤＡＢの存在は糖代謝を制御する抽出物の使用において重要であると考えられ、この応用は本発明のさらなる側面を構成する。
抽出物はイミノ糖に加えて、好ましくは総量にして２０〜７０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を含む。
【００２６】
より好ましくは、抽出物は総量にして３０〜６０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を、さらに好ましくは総量にして４０〜５０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を含む。
抽出物に含まれるアミノ酸には、ヒトが体内で生産することのできない８種類の必須アミノ酸、並びに、インスリンの分泌を促進するアルギニン、ロイシン、リシン及びフェニルアラニンが含まれる。周知のように、アミノ酸は皮膚の水分保持及び弾性に必須である。アミノ酸が欠如すると皮膚の代謝が低下し、皮膚の老化過程が促進される（Marty J. P., NMF and cosmetology of cutaneous hydration. Annates de Dermatologie et de Venereologie, 2002, 129(1 Pt 2):131 -136）。従って、本発明の抽出物は皮膚の健康の維持を補助する機能もまた有する。
【００２７】
本発明の抽出物は、クワ科、クワ属、及び
ａ．マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）
ｂ．ロソウ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ ｖａｒ．ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓＬ．）
ｃ．クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）及び
ｄ．ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ）
から選択されるクワの葉に由来する。
【００２８】
本発明の発明者らは、一般的なクワ植物の葉の化学成分の化学分析を行い、上述したすべての種に含まれるイミノ糖含量が、その他の種の含量よりも相対的に高く、マグワの葉が最も高いイミノ糖を含むことを見い出した。
【００２９】
より好ましくは、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの１〜２０％（ｗ／ｗ）の量になるように、より好ましくは、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの２〜１０％（ｗ／ｗ）になるように、イミノ糖含量をＤＮＪを基準で標準化する。使用目的によっては、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの４〜６％（ｗ／ｗ）、又は抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの１〜３％（ｗ／ｗ）に標準化する。ＤＮＪはまた、含まれる主要な（最も収量の高い）イミノ糖である。
【００３０】
本発明の抽出物は、
・色−淡い黄色である、
・溶解度−水に溶けやすい、
・ｐＨ−１％水溶液のｐＨ値は５．５〜６．５の範囲である、及び
・ＵＶスペクトル−２１８ｎｍ及び２６３ｎｍに最大吸収を示す、
を含む数多くの点において、現行のクワ抽出物とは異なる。
【００３１】
基本となる３つの工程からなる新規の抽出及び精製方法により、この抽出物を生産することができ、この方法は本発明のさらなる側面を構成する。
本発明の第二の側面では、
ａ．葉材料の水又はアルコール抽出を実施する工程；
ｂ．強酸性陽イオン交換樹脂を用い、水で洗浄し、アンモニア溶液で溶出し、溶出液を回収して、その後それからアンモニアを除去する、カラムクロマトグラフィーによる精製工程；
ｃ．溶出液をマクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、溶液を回収する工程；及び
ｄ．抽出物を濃縮し、乾燥させる工程；
を含む、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が、９０μｇ／ｍｌ未満の濃度である、クワ植物の葉由来抽出物の生産方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、植物の葉をオーブンで乾燥させて、粗い粉末に調製し、その後、
ａ．クワ植物の葉の量に対して５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、最大５回まで抽出工程を繰り返し、
ｂ．カラム容量に対して１〜２倍量の水でカラムを洗浄し、洗い液を捨て、その後、カラム容量に対して２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎアンモニア水溶液で、１時間当たりカラム容量の１〜３倍量の溶出液となる流速で溶出し、そしてｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収し、
ｃ．溶液とカラム容量との割合が２０：１〜５：１の範囲になるようにカラムからの溶出を行い、及び
ｄ．乾燥させた抽出物が８０番のふるいを通過するように粉砕する。
【００３３】
次に、本発明の抽出物を得るための抽出過程をさらに詳細に示す。
抽出（工程１）：植物の葉をオーブンで乾燥させ、粗い粉末に調製した。生の材料の５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、好ましくは生の材料の１０〜１３倍量（ｗ／ｗ）の２０〜３０％低分子量アルコールを用いて、より好ましくは生の材料の１１倍量（ｗ／ｗ）の２５％低分子量アルコールを用いて、粉末を１〜５回抽出し、液体抽出物を得る。
【００３４】
精製１（工程２）：陽イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー：工程（１）で得られた液体抽出物をろ過した後、溶液を、強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容積の１〜２倍、好ましくは１．５倍量の水をカラムに通し、溶出液を捨てる。カラム容積の２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎアンモニア水溶液、好ましくは５倍量の０．７Ｎアンモニア水溶液を、１時間当たりカラム容積の１〜３倍量、好ましくは１．５倍量を通過させる流速で、さらにカラムに通す。ｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収する。
【００３５】
精製（工程３）：マクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー：工程（２）の溶出液からアンモニアを除去し、ｐＨを７に調整する。溶液を、マクロ多孔性吸収樹脂を充填したカラムに通す。溶液とカラム容量の割合は２０：１〜５：１、好ましくは１５：１〜１０：１、そしてより好ましくは１３：１である。カラムを通した後に回収した溶液を濃縮し、この濃縮液を乾燥させ、その後８０番のふるいを通過出来るように微粉末にして、本発明の抽出物を得る。
【００３６】
前述した抽出方法の工程（１）で使用する前記低分子量アルコールは、炭素原子が４つ以下の直鎖アルキルアルコール、好ましくはメタノール又はエタノールである。前記抽出工程では、１〜３時間、好ましくは１〜２時間、より好ましくは２時間の還流抽出を行う。
【００３７】
工程（１）で得られた液体抽出物をろ過した後には、抽出物の生理活性を改善させ、抽出物を脱色するために、より多くの不純物を除去するためのさらなる方法を適用することができる。それらの方法には、アルコール沈殿、綿状沈殿、並びに、タンパク質、タンニン、及び単糖を除去するためのその他の適切な方法が含まれる。沈殿物を遠心分離又はろ過のいずれかにより除去することができる。本明細書での好ましい精製方法は、アルコール沈殿と遠心分離である：液体抽出物を最初の容量の４分の１になるまで濃縮し、１〜３倍量の９５％エタノールを加え、３０分間撹拌し、その後８〜１２時間おいてから、１２０００回転／分で１５分間、遠心分離する。上清をさらなる精製に用いる。
【００３８】
本明細書で記載した抽出方法では、工程（２）の液体抽出物の総量は陽イオン交換樹脂カラムの２〜２０倍量、好ましくは１０〜１５倍量、より好ましくは１３倍量である。
これらの条件下では、活性成分を効率的に陽イオン交換樹脂に吸収させることができ、このことが活性化合物の含量を上昇させる助けとなる。
【００３９】
本明細書で使用する強酸性陽イオン樹脂は、以下の型から選択することができる：００１Ｘ７（＃７３２）、アンバーライトＩＲ−１２０、ダウエックス−５０、Ｌｅｗａｔｉｔ−１００、Ｚｒｏｌｉｔ２２５又はダイヤイオンＳＫ−１など。００１Ｘ７（７３２）が活性成分を濃縮させるより良い吸収特性をもち、かつ、費用が安いため、最も好ましい。
【００４０】
アンモニア水を用いて陽イオン交換カラムからの溶出を行うと、溶出液のｐＨ値は徐々に上昇する。溶出液の生物学的及び化学的解析から、ｐＨ９〜１１の画分に含まれるものが最も高い活性を示すことが明らかになったため、ｐＨ９〜１１のこれら画分のみを回収した。
【００４１】
本明細書で記載した抽出では、工程（３）での流速は、１時間当たりカラム容積の１〜４倍量、好ましくは２倍量である。この条件で、色の付いた不純物のマクロ多孔性樹脂への吸着が最大になり、しっかりと脱色することができる。
【００４２】
上述したカラムクロマトグラフィー用には、ＡＢ−８、ＨＰ２０、Ｓ−８及びＹＷＤ０３Ｆ４の４型のマクロ多孔性樹脂を選択することができる。この過程を行った後の比較及び確認から、Ｓ−８樹脂を使用した場合に最もよく脱色されることが明かになり、従ってＳ−８型樹脂が好ましいマクロ多孔性樹脂材料である。
【００４３】
上記過程によって得られたクワ葉抽出物は、紫外線でスキャンした場合に２１８．３ｎｍで最大の吸収を示し、淡い黄色であり、現在市場で入手可能なその他のクワ葉抽出物とは区別できるものである。市販されている美容製品中に用いられている大部分のクワ葉抽出物はもっと濃い色、すなわち黄色又は茶色がかった黄色のいずれかであるため最終製品に色がついてしまい、理想的な外観とは言えない。
【００４４】
本発明に記載した抽出物は容易に水に溶けるため、活性成分のより良い拡散性及び標的領域へのより良い吸収性を提供する。美容用美白製品に用いられている現行のクワ抽出物はフラボノイド（例えばクワノン）及びジフェニルエテノイド（例えばオキシレスベラトロール及びムルベロシド）を含むため、水に対する溶解度が低く、平均的な拡散性を有する。そのため、溶解度を上昇させるための低分子量アルコールを製品中に使用することが必要になり、その結果、皮膚への負担が上昇する。
【００４５】
本発明に記載した抽出物のｐＨ値は１％水溶液で５．５〜６．５である。このやや酸性のｐＨは、皮膚表面の皮脂層のｐＨ、すなわち４．５〜６．６と近似している。そのため、前記抽出物をスキンケア製品にした場合、活性成分によって引き起こされる皮膚への刺激が低減する。
【００４６】
本発明の抽出物を、皮膚の美白剤又は皮膚の色素沈着過度を減少させるために使用する医薬品又は化粧品として又は血中グルコースレベルを制御するための医薬品、栄養補助食品又は食品若しくは飲料用の成分として処方することができる。従って、それを、例えば２型糖尿病を治療するために、又は食品若しくは飲料のグリセミック指数を下げるために用いることができる。
【００４７】
本発明の第三の側面では、色素沈着による症状を治療するための化粧品又は薬物として使用する、本発明の第一の側面による植物抽出物又は本発明の第二の側面による過程から得られる製品を提供する。
【００４８】
好ましくは化粧品又は治療用製品はメラニン生産を減少させるものであり、雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫を含む色素沈着過度によって引き起こされる病気又は疾患の治療を含む。
【００４９】
本発明のクワ葉抽出物を用いた薬理学的実験から、前記抽出物はα−グルコシダーゼの活性を効果的に阻害し、等量の純粋なＤＮＪ試料よりも高い効果をもつことが明らかになった。ＤＮＪの濃度の半分の濃度の抽出物のみで、純粋なＤＮＪと同様の効果が得られる。細胞株中で試験した場合、前記抽出物は黒色腫Ａ３７５及びＢ１６細胞株中のメラニン形成に対して効果的な阻害効果を示し、市販されている美容用美白製品にしばしば用いられているアルブチン及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムなどの成分よりも高い効果を示した。本発明のクワ葉抽出物の作用機序は、アルブチン及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムの作用機序とは異なる。後者２つはＴＹＲの活性を直接的に及び競合的に阻害するが、前記クワ葉抽出物は主に、成熟した活性型のＴＹＲの形成を阻害する。前記クワ葉抽出物の利点には、高い効果及び作用の持続性が含まれる。作用機序が異なることから、本発明の前記抽出物を単独で、又は上述したＴＹＲ阻害剤と共に使用することができる。ヒトでの臨床試験により、この生体外でのデータが確認され、及び、０．２％又は０．５％クワ葉抽出物クリーム製剤を２８日間、局所的に使用すると、皮膚の色素沈着が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、皮膚の色が有意に明るくなった（Ｐ＜０．００１）。
【００５０】
本発明の第四の側面では、血中グルコースレベルを制御するために使用する、本発明の第一の側面による植物抽出物又は本発明の第二の側面による過程から得られる製品を提供する。
【００５１】
血中グルコースを制御するために使用する抽出物は、好ましくは、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤をさらに含む。
ウィスターラットモデル動物実験及びヒトでの臨床試験において本発明のクワ葉抽出物は、血中グルコースを有意に低下させる効果を示した。
【００５２】
本発明の抽出物は、活性成分が組み合わせられていることから特に良い。従って、ＤＮＪなどのイミノ糖成分は消化管でα−グルコシダーゼを阻害することにより単糖類の吸収の低下をもたらし（Asano N., Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology, 2003, 13(10): 93R -104R）、別のイミノ糖である１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（Ｄ−ＡＢ１）、が肝臓グリコーゲンホスホリラーゼに対して強力な阻害活性をもつこと、及び生体内での肝臓グリコーゲンの分解を阻害することもまた見出された。そのため、それは抗高血糖である。さらに、アルギニン、ロイシン、リシン及びフェニルアラニンのようなアミノ酸が含まれるため、インスリン分泌を促進する機能をもつ。
【００５３】
従って、本発明に記載した抽出物を、食後の血中グルコースレベルを制御するため、及び血中グルコースの均衡を調整するために使用することができる。
そのような抽出物を、血中グルコースを制御するための医薬品又は健康用製品（食品添加剤又はサプリメントなど）として処方することができる。
【００５４】
第三の側面を提供するために、抽出物を賦形剤及び任意に１つ以上のその他の活性成分を含む化粧品又は医薬品として処方することができる。
皮膚の色を明るくする薬剤として使用するためには、例えば、ビタミンＣ及びビタミン−マグネシウムホスファチジン酸のようなその誘導体、コウジ酸、アルブチン、ジアセチルボルジン、アゼライン酸、オクタデセン二酸（octadecenedioic acid）、ウンデシレノイルフェニルアラニン（ＤＥＰ−１１）、カンゾウ抽出物、アロエ抽出物、クレソン（Ｎａｓｔｕｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）抽出物、アスコフィルム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）抽出物、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）抽出物、グルタチオン、エクジソン及び／又はエラグ酸から、その他の活性成分を選択することができる。
【００５５】
好ましい化粧品又は医薬品は、本発明の抽出物と共に、ビタミンＣ誘導体及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（ＶＣ−ＰＭＧ）を含む。
併用製品では、抽出物対その他の皮膚美白剤とが好ましくは１０：１〜１：１、より好ましくは５：１の比で抽出物を含む。
【００５６】
本発明のクワ葉抽出物又はその他の成分を含む組成物を用いて皮膚疾患用の化粧品又は医薬品を製造する場合には、グリセリン、ポリエチレングリコール、セルロース誘導体などの水溶性基剤、及び脂肪、脂質、炭化水素などの脂溶性基剤などを含む、医薬品に使用可能なすべての一般的な基剤を使用することができる。下記の賦形剤も一般的に用いられ、これらには、ニパギン、クロロブタノール及びソルビン酸のような保存剤、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ＢＨＴなどの抗酸化剤、ステアリン酸、蜜ろう、パラフィン、ラウリルアルコール、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの増粘剤、トリエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤、メトキシけい皮酸オクチル、ベンゾフェノン−３など紫外線防止剤、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールなどの湿潤剤（加湿剤）、脱臭剤、香料及び着色料なども含まれる。上に挙げた賦形剤の量は、当業者には周知である。
【００５７】
前記抽出物をメラニン生産を低下させるための化粧品中に加えて使用する場合、最終産物に含まれる推奨量は０．０５〜２％、好ましくは０．１〜１％、そしてより好ましくは０．２〜０．５％（ｗｔ／ｗｔ）である。
【００５８】
第四の側面を提供するために、抽出物を、医薬品又は、食品若しくは飲料に加えて栄養補助食品として、又は有効量を添加して使用するサプリメントとして処方することができる。
【００５９】
食品又は飲料中で抽出物は、グリセミック指数を下げる機能をもつ。そのような場合には、１回当たり５０〜６００ｍｇの用量で（サイズによる）使用される。
血中グルコースレベルを制御するための経口薬を製造する場合、本発明のクワ葉抽出物を、崩壊剤（例えば乾燥でんぷん、カルボキシメチルでんぷんナトリウム、Ｌ−ＨＰＣ、架橋ＰＶＰなど）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク粉末、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール４０００など）及び粘着剤（例えばＣＭＣ）のような、経口薬に一般的な賦形剤と共に処方することができる。
【００６０】
血中グルコースレベルを制御するために前記抽出物を使用する場合、抽出物中の活性成分の濃度により、推奨量は各回当たり２５〜６００ｍｇで１日３回となり；好ましくは各回当たり１００〜３００ｍｇで１日３回であり；より好ましくは各回当たり５０〜１５０ｍｇで１日３回である。
【００６１】
標準的には、以下の形態の皮膚疾患用化粧品又は医薬品を製造することができる。これらの形態には、水、水−アルコール若しくは油を含む溶液、水若しくは油を含むゲル／コロイド、微細乳濁液、希釈剤又は粘度の高い乳濁液、遊離している若しくは密着している粉末、重合体粒子及びカプセル、とりわけ、イオン若しくは非イオン脂質媒体のような微粒子を含む水中油型分散液が含まれる。
【００６２】
本発明のクワ葉抽出物又は組成物を用いて皮膚疾患用の化粧品又は医薬品を製造する場合には、それらは、クリーム、軟膏、ローション、乳白色の液体、乳濁液、粘液、ペースト、泡、エアロゾル、などの比較的軟らかい「剤形」及び無水固体製剤（例えば棒状の）となる場合がある。
【００６３】
本発明のクワ葉抽出物を用いて血中グルコースを制御するための経口薬を製造する場合、それらを錠剤、カプセル及び粉末のような、一般的に使用される経口薬の剤形で製造することができる。
【００６４】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照することにより、以下にさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、実施例１の植物抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。上段は標準物質であるＤＮＪのＨＰＬＣのクロマトグラムを示し、下段は実施例１の植物抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例１の植物抽出物のＵＶスペクトルである。
【図３】図３は、先行技術による抽出物のＵＶスペクトルである。
【図４】図４は、色素沈着を低下させる作用機序の模式図である。
【図５】図５ａ及び図５ｂは、クワ抽出物（５ａ）及びＤＮＪ（５ｂ）によるα−グルコシダーゼレベルの阻害を示す。
【図６】図６は、チロシナーゼに対するＤＮＪ、アルブチン及びクワ抽出物の効果の比較を示す。
【図７】図７は、メラニン合成阻害に対するＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の効果の比較を示す。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、ＤＮＪ（ａ）、ＶＣ−ＰＭＧ（ｂ）及びクワ抽出物（ｃ）の細胞毒性の比較を示す。
【図９】図９は、ウィスターラットでのクワ抽出物によるグルコース低下効果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトでのクワ抽出物によるグルコース低下効果を示す。
【図１１】図１１ａ及び図１１ｂは、ヒトの皮膚のクワ抽出物による美白効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
図１のＨＰＬＣは、以下の条件で行った：
装置：ウォーターズ（米国）のＨＰＬＣ用装置一式、ｗ６００−２４２０−７１７、及びＥｍｐｏｗｅｒデータ処理システム。
カラム：Shodex Asahipakの旧ＮＨ２Ｐ−５０Ｅ（２５０×４．６５μｍ）カラムを逆相で用いた。
試薬：６．５ｎｍｏｌ酢酸アンモニウム含有アセトニトリル−水。
カラム：温度４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
検出器：Ｗ２４２０ＥＬＳＤ
ゲイン：１００；ドリフトチューブの温度５０℃；溶離液加熱レベル６０％
移動相：アセトニトリル：水（６．５ｎｍｏｌ酢酸アンモニウム含有）（８４：１６）
図２及び図３のＵＶスペクトルは以下の条件を用いて得られた。
装置：ＵＮＩＣＯ、ＵＶ−２１００分光光度計
測定波長：２００〜６００ｎｍ
試料濃度：１ｍｇ／ｍｌ
本発明の植物抽出物を、実施例１〜５を基に記述した方法により、実施例６〜９を基に説明した、様々なクワの葉から得ることができる。
【００６７】
得られた植物抽出物を化粧品若しくは医薬品として、又は食品若しくは飲料栄養補助食品として、又は実施例１０〜１６を基に説明した添加剤として処方することができる。
抽出物の様々な活性を、実施例１〜８の方法を通じてさらに説明する。
【００６８】
実施例１
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉１００ｋｇを微粉末にし、１２倍量（生材料の重量に対して）の３０％エタノールを用い、３回還流抽出する（１回当たり１時間）。抽出物を一定量まで濃縮し、００１Ｘ７のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は、液体抽出物の１４分の１とした。水でカラムを洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、その後目的の構成要素（イミノ糖）を、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間当たりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。次に溶出液をＳ−８のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、液体溶出液の１０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ５．８％、全イミノ糖２１％、及び全アミノ酸４８％を含む、淡い黄色の粉末１．４ｋｇを得た。
【００６９】
以下に示すアッセイによりイミノ糖含量を決定し、その結果を図１に示した。図１下段のプロファイルが、主要なイミノ糖のピークを示しているＨＰＬＣのクロマトグラムである（ＤＮＪ標準物質のプロファイルを上段に示した）。
【００７０】
（ａ）適切な量のＤＮＪを、対照として正確に計量し、０．１ｍｇ／ｍｌ溶液となるようにメタノールを加え、よく撹拌する。正確に溶液１ｍｌを計量し、２５ｍｌの分析用フラスコに移す。これに、１ｍｌの０．４ｍｏｌ／Ｌホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）及び２ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した５ｍｍｏｌ／ＬＦＭＯＣ−ＣＩを加える。室温で２０分間超音波処理し、すぐに２ｍｌの０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液及び０．１％酢酸を加え、よく撹拌して、対照試料溶液とする。
【００７１】
（ｂ）抽出物０．３ｇを適量の水に溶解し、予め調整しておいたポリアミドカラムに通す。塩酸溶液（ｐＨ３）で溶出する。溶出液を回収し、減圧下で約１０ｍｌになるまで濃縮する。予め調整しておいた陰イオン交換樹脂カラムに溶液を通す。カラムを水で洗浄し、溶出液を回収する。減圧下で約３０ｍｌになるまで濃縮した後、溶出液を５０ｍｌの分析用フラスコに移し、水を加える。正確に計量した溶液１ｍｌを２５ｍｌの分析用フラスコに移し、上述の（ａ）と同様に、１ｍｌの０．４ｍｏｌ／Ｌホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）及び２ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した５ｍｍｏｌ／ＬＦＭＯＣ−ＣＩを加える。室温で２０分間超音波処理し、すぐに２ｍｌの０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液及び０．１％酢酸を加え、よく撹拌して、試験溶液とする。
【００７２】
（ｃ）以下に示す条件で、溶液をＨＰＬＣにかけ、イミノ含量をそこから（Ｅｍｐｏｗｅｒにより）決定した。カラム：Ｃ１８−ＯＤＳ；移動相：アセトニトリル：０．１％酢酸（３０：７０）、で３０分間、その後移動相をアセトニトリル：０．１％酢酸（７０：３０）に換え、１０分間流す。次の試料を注入する前に、元の移動相を用いてシステムを平衡化する。クロマトグラムを検出波長２６５ｎｍで３０分間記録した。対照試料及び試験試料をそれぞれ２０μｌ、正確に計量してＨＰＬＣ装置に注入し、測定してＨＰＬＣの結果を得た。
【００７３】
標準的なアミノ酸解析装置を用いて全アミノ酸含量をアッセイした。
実施例２
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉１００ｋｇを微粉末にし、１８倍量（生材料の重量に対して）の水を用い、３回還流抽出する（１回当たり１時間）。抽出物をＤｏｗｅｘ−５０のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は、抽出物の２０分の１とした。水でカラムを洗浄し（カラム容量の２倍量）、その後０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の８倍量）で、１時間当たりカラム容量の３倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＨＰ２０のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、液体溶出液の２０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４倍の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ４．３％、全イミノ糖１９％、及び全アミノ酸４０％を含む、淡い黄色の粉末１．４ｋｇを得た。ＵＶスペクトルを図２に示す。その他のクワ抽出物とは異なり、本発明の抽出物では２つの離れたピークが見られる。不純物をより高い割合で含むその他のクワ抽出物では、その不純物が原因で２つのピークが別れず（図３を参照のこと）、そのため効果レベルが低下する可能性がある。
【００７４】
実施例３
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉２０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して５倍量の４０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、等量のエタノールを加え、一定の速度で３０分間撹拌し、その後一晩静置する。１２０００回転／分で１５分間遠心分離することにより沈殿を除去し、一定量になるまでエタノールを加える。上清を、例えば００１Ｘ７型のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量を液体の３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量と等量）１．０Ｎアンモニア水（カラム容量の２倍量）で、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＳ−８のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の１３分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ９．１％、全イミノ糖２９％、及び全アミノ酸３２％を含む、白に近い色の粉末０．１１ｋｇを得た。
【００７５】
実施例４
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１２倍量の４０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、沈降剤として硫酸アルミニウムカリウム、ｐＨ３、を加え、そして３０分間撹拌する。２時間静置した後、遠心分離により沈殿を除去し、上清のｐＨを７に調整する。上清を陽イオン樹脂、すなわち００１Ｘ７を充填したカラムに通す。カラム容量を液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の２倍量）、０．２Ｎアンモニア水（カラム容量の８倍量）で、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液を、ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の２０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ１８．６％、全イミノ糖３９％、及び全アミノ酸２１％を含む、白に近い色の粉末０．１２ｋｇを得た。
【００７６】
実施例５
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１１倍量の２５％エタノールを用い、４回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１５分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。Ｓ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ５．６％、全イミノ糖２４％、及び全アミノ酸４８％を含む、淡い黄色の粉末０．４６ｋｇを得た。
【００７７】
実施例６
乾燥させたロソウ（Morus alba var.multicaulis L.）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１１倍量の２５％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、００１Ｘ７型陽イオン交換樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通した。カラム容量は液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の２倍量）、０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＨＰ２０マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の１０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ２．１％、全イミノ糖８．３％、及び全アミノ酸６５％を含む、淡い黄色の粉末４８ｇを得た。
【００７８】
実施例７
乾燥させたクロミグワ（Morus nigra）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して８倍量の８０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、その後約６Ｌになるまで濃縮し、これに約１２Ｌのエタノールを加えた。一定の速度で３０分間撹拌し、その後一晩静置した。１２０００回転／分で１５分間遠心分離することにより沈殿を除去し、一定量になるまでエタノールを加え、そして硫酸アルミニウムのような凝集剤を適量加える。しばらく置いて完全に沈殿させた後、遠心分離によって沈殿物を除去する。上清を、００１Ｘ７型のような陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は液体の１０分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量と等量）、０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の４倍量）で、１時間あたりカラム容量の３倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を指定された量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。溶出液をＨＰ２０マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は溶出液の１５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ３．９％、全イミノ糖１５％、及び全アミノ酸５８％を含む、白に近い色の粉末４０ｇを得た。
【００７９】
実施例８
乾燥させたヤマグワ（Morus australis Poir.）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して８倍量の８０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型陽イオン樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１０分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の１３分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ１．４％、全イミノ糖５．２％、及び全アミノ酸６８％を含む、淡い黄色の粉末４２ｇを得た。
【００８０】
実施例９
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１０倍量の３０％エタノールを用い、１回還流抽出する。抽出物をろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型陽イオン樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の７倍量）で、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収する。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の１５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ４．２％、全イミノ糖２２％、及び全アミノ酸４６％を含む、淡い黄色の粉末０．５ｋｇを得た。
【００８１】
実施例１０
ステアリン酸、グリセロールモノステアレート、流動パラフィン、鯨ロウ、蜜ロウ、及びシリコン油を、８：５：３：８：１：５部の割合で混合し、７５℃に加熱する（「基剤１」の形成）。トリエタノールアミン、グリセリン、メチルパラベンを、０．７：５：０．０５部の割合で混合し、７５℃に加熱する（「基剤２」の形成）。基剤１と２を混合し、そこに３部（ｗ／ｗ）の実施例１のクワ葉抽出物を加える。よく混合し、１００ｍｌになるまで水を加える。冷却した後、適量の香料を加えて、前記クワ葉抽出物を含む美白用クリームを生産する。
【００８２】
実施例１１
グリセリン、プロピレングリコール、３０％ＮａＯＨ及びソルビン酸カリウムを、７：４：０．２：０．１部の割合（ｗ／ｗ）で混合する。１００ｍｌになるまで蒸留水を加えて水相とする。これとは別に、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、グリセロールモノステアレート及びステアリルアルコールを、１０：８：１：３部の割合で混合し、加熱して油相とする。上記の水相を９５℃に加熱し、この温度で撹拌しながら、油相を徐々に加える。約４５℃になったら、実施例４のクワ葉抽出物とＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムとの２：０．４部の割合の混合物に加え、香料を数滴加えて、２相が混ざるまで撹拌する。冷却してペーストとする。
【００８３】
実施例１２
グリセリン、プロピレングリコール、３０％ＮａＯＨ及びソルビン酸カリウムを、７：４：０．２：０．１部の割合（ｗ／ｗ）で混合する。１００ｍｌになるまで蒸留水を加えて水相とする。これとは別に、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、モノステアリン酸グリセロール及びステアリルアルコールを、１０：８：１：３部の割合で混合し、加熱して油相とする。上記の水相を９５℃に加熱し、この温度で撹拌しながら、油相を徐々に加える。約６０℃になったら、実施例１のクワ葉抽出物とＤＥＰ−１１との２：０．２部の割合の混合物に加える。香料を数滴加え、２相がよく混ざるまで撹拌する。冷却してペーストとする。
【００８４】
実施例１３
実施例５のクワ葉抽出物０．４部（ｗ／ｗ）に、０．１部のエチルパラベン、０．５部の重硫酸ナトリウム、０．１部のエデト酸２ナトリウム、及び９部のグリセリンを加え、１００ｍｌになるまで蒸留水を加えてローションとする。
【００８５】
実施例１４
実施例１のクワ葉抽出物５ｋｇ、でんぷん１．８ｋｇ、微結晶セルロース１．５ｋｇ、架橋ＰＶＰ０．４５ｋｇ、ＣＳＭ−Ｎａ０．５５ｋｇ、及び適量のステアリン酸マグネシウム及びシリコンマイクロ粉末をよく混ぜる。各錠剤の重量が約０．５ｇの錠剤２０，０００個を製造する。
【００８６】
実施例１５
実施例３のクワ葉抽出物１．０ｋｇを適量のでんぷんに混合し、各カプセルが１００ｍｇの抽出物を含むように、１０，０００個のカプセル中に充填する。
【００８７】
実施例１６
実施例３のクワ葉抽出物２．０ｋｇに、０．５ｋｇのビタミンＣ、１．０ｋｇのクエン酸、０．８ｋｇの炭酸水素ナトリウム、０．０８ｋｇのマンニトール、ＰＶＰ、ＰＥＧ６０００、香料添加剤及び結合剤を加え、起泡性の顆粒を製造する。
【００８８】
活性試験実験
実験１．α−グルコシダーゼに及ぼすクワ葉抽出物の阻害活性アッセイ
本発明のクワ葉抽出物がα−グルコシダーゼに及ぼす阻害活性を解析することを目的とした。以下に試薬及び装置を示す。
【００８９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物、
（２）ＤＮＪ標準化合物、
（３）α−グルコシダーゼ（Ｉ型、Bakers yeast、ＥＣ２３２．６０４．７）を０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解して０．４２Ｕ／ｍｌ溶液とした。
【００９０】
（４）ｐＮＰＧ。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に溶解して５ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。
（５）ｐＮＰ。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解して２００μｍｏｌ／Ｌ溶液とした。
【００９１】
（６）Multiskan Ascentマイクロプレートリーダー（Thermo Electron Co.、米国）。
方法を以下に示す。
検量線
２００μｍｏｌ／ＬのｐＮＰ溶液を０．１μｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌ、６．２５μｍｏｌ／Ｌ及び３．１２５μｍｏｌ／Ｌになるように希釈する。各希釈液から２００μｌをとりわけ、４０５ｎｍでＯＤを測定し、ＯＤ値を用いて検量線を引く。
【００９２】
試験試料のアッセイ
（１）それぞれ異なる濃度の試験試料８０μｌをマイクロプレートの個別のウェルに入れる。リン酸緩衝液８０μｌを偽薬とした。
【００９３】
（２）それぞれのウェルに、３０μｌの酵素（０．４２Ｕ／ｍｌ）を加え、３０秒静置し、その後、基質（ｐＮＰＧ）を加えて３７℃で１５分間インキュベートする。マイクロプレートリーターの電源を入れ、温度３７℃、キネティックモード、１０秒間隔に設定する。測定を１３回行う（合計２分）。
【００９４】
（３）各ウェルに基質（５ｍｍｏｌ／ＬのｐＮＰＧ）を９０μｌ加え、３０秒間撹拌し、マイクロプレートリーダーの中に置く。開始ボタンを押し、続けて３７℃でのＯＤ値を測定する。
【００９５】
（４）ｐＮＰの濃度をＸ軸に、ＯＤ値をＹ軸にとって検量線を引く。反応物の相対量を求めるために、工程（３）で得られた検量線上のＯＤ値を使用する。
（５）偽薬及びそれぞれ異なる濃度の試験試料については、時間をＸ軸に、反応物量をＹ軸に取って反応進行曲線を引く。直線の傾斜が反応時間である。
【００９６】
（６）試験試料の濃度をＸ軸にとり、Ｙ軸に反応時間をとって、試験試料の濃度曲線を引き、ＩＣ５０を求める。阻害活性（Ｕ／μｇ）＝（０．５×各ウェルの酵素活性）／（ＩＣ５０×各ウェルの試料容量）＝（０．５×０．４２×０．０３）／（ＩＣ５０×０．０８）＝０．０７８７５／ＩＣ５０。
【００９７】
結果及び考察
上述の結果から、実施例１のクワ葉抽出物がα−グルコシダーゼを阻害するＩＣ５０値は１３．６μｇ／ｍｌであり、一方、純粋なＤＮＪのＩＣ５０は７０μｇ／ｍｌであることが示された。このことは、実施例１のクワ葉抽出物の活性が純粋なＤＮＪの活性よりもかなり高いことを示すものであった。実施例１のクワ葉抽出物中のＤＮＪ含量が僅か３．５％だったことを考慮すると、前記抽出物を使用することにより、同じ若しくはそれよりも高い活性を得ることができ、それと同時に、高濃度の純粋な化合物による副作用を低減させること可能になる。クワ抽出物及びＤＮＪによるα−グルコシダーゼの生体外での阻害、並びに初期反応速度をそれぞれ示す、図５ａ及びｂを参照のこと。
【００９８】
実験２：ＴＹＲに及ぼす、クワ葉抽出物及びアルブチンの阻害活性アッセイ
黒色腫細胞株Ｂ１６でのＴＹＲ活性に試験試料が及ぼす効果及び作用機序を解析することを目的とした。以下に試薬及び装置を示す。
【００９９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）ＤＮＪ標準化合物
（３）アルブチン標準化合物
（４）Ｌ−ドーパ溶液。使用する直前に、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１００】
（５）ＷＩＰ細胞溶解緩衝液
（６）細胞培養プレート（２４ウェル及び９６ウェル）
（７）光学顕微鏡
（８）遠心機
（９）マイクロプレートリーダー
以下に方法を示した。
【０１０１】
Ｂ１６黒色腫細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心分離管に回収した。遠心分離した後、フッ化フェニル−メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含むＷＩＰ−溶解緩衝液を細胞沈殿物に加え、氷中に管を立てて３０分おき、細胞を溶解させた。その後溶液を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、細胞要素を含む上清（細胞抽出物）をアッセイに使用する目的で保持した。
【０１０２】
チロシナーゼの触媒活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の直接的な効果を決定するために、６０μｌのＤＮＪ、アルブチン又はクワ抽出物（様々な濃度の化合物を用いた）を、９６ウェルマイクロプレートに入れた、６０μｌの細胞抽出物に加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後各ウェルに８０μｌのＬ−ドーパを加えた。マイクロプレートリーダーを用い、各ウェルの吸収（４９２ｎｍ）を５分間間隔で３０分間、３７℃で記録した。
【０１０３】
チロシナーゼの触媒活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の間接的な効果を決定するために、Ｂ１６黒色腫細胞にそれぞれ異なる濃度のＤＮＪ、アルブチン、又はクワ抽出物を加えて３日間培養し、その後抽出及び評価を行った。抽出した後、４０μｌの細胞抽出物、１２０μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、及び４０μｌのＬ−ドーパ（２ｍｇ／ｍｌ）を９６ウェルマイクロプレート中に入れ、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの４９２ｎｍでの吸収を５分間間隔で３０分間、３７℃で記録した。
【０１０４】
結果及び考察
アッセイの結果を図６に見ることができる。明色のカラムは、細胞抽出物中でのチロシナーゼ活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の直接的な効果を示し、暗色のカラムはチロシナーゼ活性に及ぼす化合物の間接的な結果を示す。
【０１０５】
直接的な活性アッセイでは、アルブチンが容量依存的にチロシナーゼの活性を弱めたが、ＤＮＪ及びクワ抽出物はチロシナーゼ活性に何の効果も示さなかった。しかしながら間接的な活性アッセイでは、試験化合物の存在下で３日間細胞をインキュベートとした後には、ＤＮＪ及びクワ抽出物群においてチロシナーゼ活性の容量依存的な低下がみられたが、アルブチンはチロシナーゼ活性に影響を及ぼさなかった。
【０１０６】
これらの発見は報告されている文献と一致し、かつ、α−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＮＪ及びクワ抽出物の作用機序が異なると考えられていることを支持するものである。直接的な活性アッセイでは、アルブチンはチロシナーゼと直接相互作用し、活性部位に結合して酵素を不活性化させ、その結果、Ｌ−ドーパからｏ−ドーパキノンへの酸化が減少した。α−グルコシダーゼ阻害剤はチロシナーゼの活性に直接は作用せず、このことが、ＤＮＪ及びクワ抽出物がチロシナーゼ阻害活性に効果を示さなかった直接的な活性アッセイの結果に反映された。
【０１０７】
間接的な活性アッセイでは、ＤＮＪ及びクワ抽出物の両方がチロシナーゼに対して阻害活性をもつことが示された。α−グルコシダーゼ阻害剤は未成熟なチロシナーゼに作用し、かつ、チロシナーゼの成熟過程におけるカルネキシンの結合を阻害することにより、成熟したチロシナーゼの酵素活性に影響を及ぼす構造の変化が生じる。これらの変化は、ＤＮＪ及びクワ抽出物を加えて３日間インキュベートした後に酵素活性が低下したことからも明かとなった。アルブチンはチロシナーゼ活性部位と直接競合したが、アッセイ溶液にアルブチンが含まれていない間接的なアッセイでは、酵素活性の阻害は見られなかった。
【０１０８】
実験３．本発明のクワ葉抽出物がメラニン細胞でのメラニン含量に及ぼす効果
試験試料が黒色腫細胞株Ｂ１６のメラニン含量に与える効果を解析することを目的とした。以下に使用した試薬及び装置を示す。
【０１０９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）ＤＮＪ標準化合物
（３）ＶＣ−ＰＭＧ標準化合物
（４）ＷＩＰ溶解緩衝液
（５）光学顕微鏡
（６）細胞培養プレート（２４ウェル及び９６ウェル）
（７）遠心機
（８）マイクロプレートリーダー。
【０１１０】
以下に方法を示した。
１．対数増殖期の黒色腫Ｂ１６細胞を回収し、細胞懸濁液を適切な濃度に調整し、２４ウェルプレートに分け入れて、細胞をウェルの壁に接着させる。
【０１１１】
２．培地で希釈することにより調製した、様々な濃度の試験試料１ｍｌを各ウェルに加える（各濃度につき同じものを４つ準備した）。２日間インキュベートし、試料溶液を交換し、さらに２日間インキュベートした。
【０１１２】
３．４日目に細胞を回収し、ＰＢＳで２回、しっかりと洗浄した。ＷＩＰ溶解緩衝液を２５０μｌ加え、５分毎に４〜５回ボルテックスで撹拌しながら、氷浴中で溶解させた。
４．１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を４００μｌの１ＮのＮａＯＨに溶解し、８０℃の湯浴中に１時間おく。
【０１１３】
５．マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでのＯＤ値を測定し、相対量を算出する。
結果及び考察
アッセイの結果を図７に見ることができる。中間色のカラムは、Ｂ１６黒色腫細胞でのメラニン含量に及ぼすＤＮＪの阻害効果を示し、暗色のカラム及び白色のカラムはＢ１６黒色腫細胞でのメラニン含量に及ぼすＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の阻害効果を示す。すべての効果は、様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ又はクワ抽出物と３日間インキュベートした後に見られた効果である。
【０１１４】
対照と比較すると、様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及び実施例１で処理することにより、メラニン含量は容量依存的に有意に減少した。３種類の化合物の活性の強度は、強い方から順に、ＤＮＪ＞クワ抽出物＞ＶＣ−ＰＭＧ、という順序であった。
【０１１５】
ＤＮＪはクワ抽出物から同定された活性化合物であり、α−グルコシダーゼ阻害剤と同様にチロシナーゼの活性を弱めて、Ｂ−１６黒色腫細胞株でのメラニン生産の減少を低下させることができる。天然に生じるＤＮＪの含量はすべての植物において非常に低いため、天然のＤＮＪを商業目的で使用することは不可能である。クワ抽出物は、クワ抽出物中のＤＮＪ含量は２〜５％と低いが、ＤＮＪの活性と同様の効果を示した。このことにより、クワ抽出物中ではＤＮＪがその他の活性成分と相乗的に機能して、強い抗色素沈着効果をもたらしている可能性が示された。
【０１１６】
我々の観察から、Ｂ１６黒色腫細胞に加えたＶＣ−ＰＭＧの濃度を２００ｐｐｍより高くすると、細胞の生存能力が下がることが示された。このことにより、過剰な濃度のＶＣ−ＰＭＧによって細胞が傷つけられる恐れがある可能性が示された。天然物としてのクワ抽出物はより安全な特性をもち、かつ、ＶＣ−ＰＭＧよりも強い効果をもつ。クワ抽出物の作用機序はＶＣ−ＰＭＧの作用機序とは異なるため、クワ抽出物を単独で、又はより高い抗色素沈着効果を達成するためにＶＣ−ＰＭＧと併用して用いることができる。
【０１１７】
クワ抽出物を化粧品に加えるための美白製品として開発するために、一般的に化粧品に使用されている美白成分の用量について検討した。アルブチン：１％〜５％、コウジ酸：０．２％〜３％、ビタミン誘導体：＜３％。我々の研究から、実施例１の推奨用量は３％より低いものである。
【０１１８】
実験４．本発明のクワ葉抽出物がメラニン細胞の成長に及ぼす効果
方法
細胞の生存能力
生存能力のある細胞のミトコンドリア内酵素により、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドをＭＴＴホルマザンの結晶に変換する反応を用いたＭＴＴアッセイにより、細胞の生存率を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてＭＴＴを２ｍｇ／ｍｌになるように新しく調製した。１ｍｌ当たり２×１０４個の細胞を９６ウェルプレート中にプレーティングし、ＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ、クワ抽出物又はＤＭＥＭを培地中に加えた。実験経過の様々な時点で、ＭＴＴストック溶液２０μｌをウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２、加湿条件下、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、これら細胞のホルマザン結晶をゆっくりと撹拌することにより、１００μｌのＤＭＳＯ中に溶解した。１０分後、エライサプレートリーダーを用いて５４０ｎｍで測定することにより、ホルマザンの量を分光光度法で定量した。
【０１１９】
黒色腫細胞中のメラニン含量の決定
Ｂ１６黒色腫細胞を、１ウェル当たり４×１０４個の密度で２４ウェル培養プレート中に播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。次に細胞を様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ又はクワ抽出物で３日間処理した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心管に集めた。遠心分離した後、細胞沈殿にフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含むＷＩＰ溶解緩衝液を加え、氷上で３０分間かけて細胞を破砕した。溶液を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、沈殿に１ＮのＮａＯＨを加えて７０℃で１時間沸騰させることにより溶解した。分光光度計を用いて４０５ｎｍでメラニン含量を検定した。
【０１２０】
結果及び考察
細胞の生存能力に及ぼすＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の効果
ＭＴＴを用いて行ったＢ１６黒色腫細胞の生死判別試験のデータを、図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに示した。
【０１２１】
ＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物は、用いた濃度ではＢ１６黒色腫細胞の成長を阻害しなかった。これらのデータから、天然のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物が、２００ｐｐｍより低い濃度ではＢ１６黒色腫細胞に対して細胞毒性をもたないこと、及び、メラニン含量を下げるアッセイでは細胞の成長は影響を受けないことがはっきりと示された。
【０１２２】
実験５：ウィスターラットの血中グルコースに及ぼす本発明のクワ葉抽出物の効果
用いた試薬及び装置は以下の通りである。
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）生理食塩水
（３）ミグリトール標準化合物
（４）６４ウィスターラット
（５）ジョンソン社製One Touch Ultra血中グルコース計測器及びＣｏｄｅ９血中グルコース試験ストリップ
以下に示した方法を用いた。
【０１２３】
腹腔内注入（１５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ）又は胃内投与（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）により、動物にクワ抽出物を投与した。２型糖尿病用に認可されたα−グルコシダーゼ阻害薬であるミグリトール（グリセット（Ｇｌｙｓｅｔ）（登録商標）、２５ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として用いた。空腹時の血糖レベルを基準として記録し、でんぷん食を与えてから３０分、１時間及び２時間後の血糖レベルを測定した。動物にはでんぷん食を与える前に、クワ抽出物を投与した。
【０１２４】
結果及び考察
デンプン投与３０分、１時間、２時間後の血中グルコース（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝１０）。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
結果から、クワ抽出物が血中グルコースレベルを有意に低下させることが示された。胃内経路による投与では、活性化合物の経口生物学的利用率が良いこと、代謝によっても不活化しないことが示された。本試験では、胃内及び腹腔内両方による投与により、５０ｍｇ／ｋｇのクワ抽出物が、ミグリトール（グリセット（登録商標））と同等に、血中グルコースレベルを有意に下げることが示された。図９を参照のこと。
【０１２７】
実験６：ヒトの血中グルコースレベルの低下に及ぼすクワ抽出物の効果
方法
ヒトでの小規模試験では、一晩の絶食の後、４００ｍｇのクワ抽出物又は偽薬のいずれかを、５０ｇの粉末糖と共に患者に投与した。血糖レベルを３時間監視した。また患者の１人には、陽性対照として作用するように５０ｇのミグリトールを投与した。
【０１２８】
結果及び考察
データから、クワ抽出物が血糖レベルを劇的に減少させることが示された。クワ抽出物により、開始時の血糖の振幅が５９．９１％、２時間後の血糖レベルが５０．７８％、３時間後の血糖レベルが４７．１８％減少した。クワ抽出物は、粉末糖のグリセミック指数を８３．８から４１．２に低下させることができた。図１０を参照のこと。
【０１２９】
実験７：ヒトの皮膚の美白におけるクワ抽出物の効果
方法
本試験用に、実施例１のクワ抽出物を０．２％及び０．５％クリーム製剤に調製した。書面による同意が得られた対象女性（１８才以上）２０人の、前腕の予め所定領域に各製剤１日２回投与した。初回投与に先立ち、所定領域の皮膚色を色彩色差計ＣＲ３００で測定した。
【０１３０】
処置の２８日後、対象に試験施設を再訪してもらい、同じ所定領域の皮膚色を新たに測定して０日目とした。
以下の３つの試験指標により評価を行った。
−Ｌ＊（暗から明への変化）。これは皮膚の明度の指標である。この指標の上昇は皮膚色が明るくなったことを特徴付けるものである。
−ｂ＊（青から黄への変化）。この指標の低下は、皮膚の黄味が低下したことを特徴付けるものである。
−ＩＴＡ°（individual typological angle）。この指標は、明度（Ｌ＊）及び皮膚のメラニン指標（ｂ＊）を用いて対象の皮膚の色素沈着の度合いを示す。ＩＴＡ°の上昇は、皮膚の色素沈着の低下を特徴付けるものである。
【０１３１】
結果及び考察
Ｌ＊指標は、０．２％製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇した（平均して＋０．５４Ａ．Ｕ．）。このことは皮膚色の明度が上昇したことを表している。この効果は対象の９０％で観察された。図１１Ａを参照のこと。
【０１３２】
個別類型角（individual typological angle＝ＩＴＡ°）指標は、０．２％製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇した（平均して＋１Ａ．Ｕ．）。このことは、皮膚の色素沈着が低下したことを意味している。この効果は対象の５７％で観察された。図１１Ｂを参照のこと。
【０１３３】
０．５％製品を使用した場合には：Ｌ＊指標は製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇し、このことは皮膚の明度が上昇したことを意味している。この効果は対象の８６％で観察された。図１１Ａを参照のこと。
【０１３４】
個別類型角（ＩＴＡ°）指標は、０．５％製剤を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇し、このことは皮膚の色素沈着が低下したことを意味している。この効果は対象の６７％で観察された。図１１Ｂを参照のこと。
【０１３５】
実験８．抽出物のデータ
本発明の抽出物（試料１から３）は下記表１に表した特性値により、先行技術の抽出物とは異なる。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
上記表１の説明。
試料１〜３は実施例１〜３の製品を指す。
試料４は特許第０３１３９０２８．５号に従って調製した製品を指す。
【０１３８】
試料５は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、８０％エタノールで３回、各回１〜２時間かけて還流抽出する。１回目は生の材料の重量に対して６倍量（ｗ／ｗ）のエタノールを用い、その後２回目及び３回目の抽出は４倍量のエタノールを用いて行う。抽出物をまとめて２４時間おき、その後ろ過する。ろ液を濃縮し、水を用いて５回、７０〜８０℃で濃縮した抽出物を抽出した。各回につき、出発材料（クワの葉）の重量に対して１０倍量の水を用いた。水抽出物をまとめてｐＨを３〜４に調整し、ＮａＣｌを３〜５％の濃度になるように加える。液体を、６０ｃｍ（Ｈ）×３ｃｍ（Ｄ）カラムを用いたＤ１０１マクロ多孔性樹脂クロマトグラフィーにかけた。溶出液が透明になるまで水で溶出し、その後カラム容量に対して５倍量の３０〜５０％エタノールを用い、流速２０／ｍｌで溶出した。溶出液をまとめ、濃縮し、乾燥させて試料（５）とする。
【０１３９】
試料６は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、各回クワの葉の重量に対して１０〜１２倍量の５０〜６０％エタノールを用い、５０℃で２回抽出する。抽出物を濃縮し、Ｄ７２強酸性マクロ多孔性樹脂を充填したカラムを通し、溶液（画分１）を回収する。エタノールで溶出して画分２とし、その後２％アンモニア含有７０％エタノールで溶出して画分３を得る。画分１、２及び３をそれぞれ遠心分離し、濃縮する。乾燥させ、まとめて試料（６）とする。
【０１４０】
試料７は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、８０℃の水（１０〜１５倍量の水）で２回抽出した。抽出物をまとめてｐＨを２〜３に調整し、０℃に冷却して完全に沈殿させた。抽出物をろ過し、濃縮したろ液を陽イオン樹脂クロマトグラフィーにかけた。水で溶出し、その後等量の５０％エタノール−アンモニア水溶液の混合物で、溶出液が透明になるまで溶出する。溶出液を濃縮し、乾燥させて試料（７）とする。
【０１４１】
試料８は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、３０％エタノール（各回当たりクワの葉の５倍量）で３回抽出する。抽出物をまとめて濃縮し、エタノールを加えて沈殿させる。上清を濃縮して水を加え、Ｄ１０１マクロ多孔性樹脂カラムに通して溶液を回収する。３倍量の水で溶出し、溶液をまとめて、水での溶出液を画分１とする。続けて６０％エタノール（５倍量）で溶出し、溶出液を画分２とする。画分１のｐＨを４に調整し、陽イオン交換カラムに通す。溶出液が透明になるまでカラムを水で洗浄し、その後０．５Ｎのアンモニア溶液（８倍量）で溶出し、溶出液を回収して画分３とする。画分２及び３をそれぞれ濃縮して乾燥させ、試料（８）とする。
【０１４２】
表中で用いた溶解度を表す用語は以下のように定義する。
・「容易に溶解可能」１ｇの試料が１ｍｌ未満の水に溶ける
・「可溶性」１ｇの試料が１０〜３０ｍｌの水に溶ける
・「平均的」１ｇの試料が３０〜１００ｍｌの水に溶ける。
【０１４３】
上述した結果から、本発明の製品は、活性、重要な活性化合物の含量、色調及び水への溶解度の点で、現行の製品よりも優れていることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物抽出物、それを含む組成物、抽出方法、及び前記抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クワの葉は、アジア諸国、特に中国で、長年に渡って医薬品として使用されてきた。近年、植物化学者らが、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、ファゴミン、及びＮ−メチル−ＤＮＪなどの数多くのイミノ糖成分をクワの葉から単離している。イミノ糖の化学構造は単糖の構造と同様であり、その多くは、５〜６員環のポリヒドロキシ複素環化合物である。イミノ糖と単糖の大きな違いは、複素環のヘテロ原子にある。前者は窒素原子（Ｎ）を含むが、後者は酸素（Ｏ）を含む。
【０００３】
クワの葉由来のイミノ糖成分が、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩに対して明らかな阻害活性を呈すること、特にＤＮＪが最も強い活性をもつことが分かってきた。さらに薬理学的な実験から、ＤＮＪがメラニン細胞に作用し、ＴＹＲの成熟過程を阻害することによってメラニン生産の低下をもたらすことが明らかになった（Genji Imokawa, Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition. The Journal of Investigative dermatology, 1990, 95(1 ):39-49; Ju Young Park, hyunjung Choi, Jae Sung hwang, Junoh Kim, Ih-Seop Chang, Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells, Journal of Cosmetic Science, 2008, 59:139-150）。
【０００４】
本発明の発明者らは、酵素を用いた一連の実験を行い、そして、本発明の抽出物として記載した、クワの葉由来の全イミノ糖抽出物（１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、及びファゴミン含量として測定した）が、純粋なＤＮＪ化合物よりも、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩに対する強力な阻害活性をもつことを見い出した。この発見から、そのようなクワ抽出物をα−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害するために使用することが可能となり、この抽出物に含まれるＤＮＪはより低濃度であるため、薬の副作用（ＡＤＲ）を低減できる可能性があり、また、より安全に使用できるように最終的な製品を製造することができる。加えて、本発明に記載したクワ抽出物の製造にかかる費用は、純粋なＤＮＪ化合物を製造する費用よりもかなり低いため、病気による色素沈着過度の治療にかかる費用が大幅に減少する。
【０００５】
従って、そのような抽出物から作成した化粧品及び医薬品は、以下に構造を示すＤＮＪのような、純粋な化合物を含むものよりも、効果、安全性、及び費用の面で多くの利点を有する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
過去には、中国又はその他の国の多くの研究者達が、美白及びシミを少なくするための市場で、クワ抽出物を含む化粧品の商業化を試みた。しかしながら、それと比較すると、本抽出物は非常に異なる特徴や多数の利点を有する。
【０００８】
中国特許第ＺＬ９９１２３８９４Ｘ号には、皮膚の色素沈着治療用の植物抽出物組成物が開示されており、この組成物は、３つの主要な成分、すなわち、クワ属の植物由来抽出物、スクテラリア属の植物由来抽出物、及びサリチル酸誘導体を含んでいる。その発明のクワ抽出物はクワの根から得られたもので主にクワノンを含むが、抽出物の正確な組成については明らかになっていない。
【０００９】
米国特許出願第３４７８８４号には、同様の化粧品を目的としたクワの木の枝由来の抽出物の使用が開示されており、この抽出物中の活性成分はオキシレスベラトロール及びムルベロシドである。これら２つの発明と比較すると、本発明は以下の利点及び特徴を有する。
１．生の材料である利点。本発明で使用する生の材料、すなわちクワの葉は容易に再生でき、根及び枝よりも持続可能な資源である。また、上述した２つの発明と比較して、費用を安く抑えられる。
２．異なる作用機序。上述した２つの発明では、ＴＹＲを競合的に阻害することにより活性が達成された。本発明の作用機序は、α−グルコシダーゼの阻害を介してメラニンの生産を減少させ、成熟度の低い（かつより不活性な）ＴＹＲを生じる。
３．異なる作用成分。上述した特許では、活性成分は、フラボノイド、例えばクワノン、又はジフェニルエテノイド、例えばオキシレスベラトロール及びムルベロシドであった。一方、本発明の作用成分はイミノ糖であり、また、これらイミノ糖を豊富に含む抽出物を単離するために、異なる調製方法を用いている。
４．独特な調製方法。活性成分の抽出に最適であり、そして、例えば抽出物の物理学的特性を改善するような精製工程を確保するようにこの方法を設計しているため、抽出物は、例えば化粧品への使用により適したものとなる。
【００１０】
メラニンは、人の皮膚の色を決定する上で最も重要な因子である。メラニンは、表皮基底層のメラニン細胞におけるメラノソーム中で生合成される。通常の生理学的条件下でメラニンは、紫外線による損傷から皮膚を保護している。外部因子によってメラニンの合成や代謝が阻害されると、ホルモン障害や老化などが起こり、表皮基底層のメラニンが増加して皮膚の色が黒くなる場合がある。これはその後、病気による色素沈着、又は、雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫のような疾患を生じる可能性がある。さらに、皮膚をより白くしたいと熱望している多数の美容愛好家がいることから、皮膚を明るくする、美白、及びシミを少なくするための薬剤及び化粧品への需要がある。
【００１１】
簡単に説明すると、メラニンの生合成は以下の工程を含む。
【００１２】
【化２】
【００１３】
チロシナーゼ（ＴＹＲ）は銅イオンをもつ糖タンパク質の１種であり、メラニン生合成に重要な酵素である。ＴＹＲは、チロシンがドーパ及びドーパキノンに変換される反応を触媒する。ＴＹＲは色素沈着の減少にとって重要な標的であると考えられており、皮膚の美白及びシミを減少させる機能をもつ製品を対象とする研究分野においてしばしば用いられている。
【００１４】
ＴＹＲを標的としている現在の主な方法は、その形成及び活性を阻害して、メラニンの生産を減少させるものである。ＴＹＲ阻害剤を含む現行の製品には、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）及びその誘導体、コウジ酸及びその誘導体、並びにアルブチンが挙げられる。
【００１５】
１，４−ジヒドロキシベンゼン及びその誘導体はＴＹＲの活性を１００％阻害することができるが、それらはまたメラニン細胞を刺激し、そして細胞毒性を示す。１，４−ジヒドロキシベンゼンを長期間にわたって使用し、日光にも当たり続けると、外生の色素沈着斑が生じる場合がある。そのため、これらをスキンケア製品に使用することは禁止されている。
【００１６】
コウジ酸は非常に安定であり、かつ、銅イオンをキレートしてＴＹＲの活性を低減させることにより、色素沈着斑の低下に良い効果をもつ。しかしながら、コウジ酸の長期使用は、皮膚疾患を起こす細胞毒性を生じる場合がある。日本の研究者らは、コウジ酸が肝臓癌を引き起こす可能性があることを示した（Tamotsu Takizawa, Toshio Imai, Jun-ichi Onose, Makoto Ueda, Toru Tamura, Kunitoshi Mitsumori, Keisuke Izumi and Masao Hirose. Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine. Toxicological Sciences 2004 81 (1):43-49）。
【００１７】
アルブチンは、副作用が非常に弱い、美白及びシミ減少用美容製品だと考えられているが、光に対する感受性が非常に高く、その結果、最終的な製品には大量の日焼け防止剤を加えることが必要となる。このことは皮膚にとって負担となり、従って皮膚の老化過程が促進されることになる。
【００１８】
上述した欠点は、皮膚を白くするため及びシミを減少させるための美容製品市場に現存する製品の適用を制限するものである。
ＴＹＲは糖鎖をもつタンパク質（糖タンパク質）である。生化学分野における近年の研究から、その生産（及び成熟）過程で新しく生産されたＴＹＲを通常の生物学的機能を有する成熟ＴＹＲに変換するためには、元の糖鎖が一連の修飾を受けることが必須であることが明らかになった。α−グルコシダーゼＩ及びＩＩはこの過程の重要な酵素である。α−グルコシダーゼＩは主に、α−１，２結合を糖鎖の遠端にもつグルコース部分の「開裂」に関与し、α−グルコシダーゼＩＩは２つの工程で、α−１，３結合によって結合した残る２つのグルコース部分の開裂に関与すると考えられている（Mehta A, Zitzmann N, Rudd PM, Block TM, Dwek RA. α-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents, FEBS Letters, 1998, 430(1):17-22）。
【００１９】
α−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害すると糖タンパク質中の糖鎖の修飾が阻害されるため、成熟したＴＹＲが生産されないと考えられている。その結果、「未成熟なＴＹＲ」により、低い割合のメラニンしか生産されない（Hiroyuki Takahashi, Peter G. Parsons, Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells, The Journal of Investigative dermatology, 1992, 98(4):481-487）。
【００２０】
そのため、メラニン合成を阻害するための作用機序案を示している図４に表したように、成熟ＴＹＲの形成を最小限に抑えるためには、α−グルコシダーゼＩ及びＩＩを阻害し、それによってメラニン生産とそれに続く皮膚の色素沈着を減少させることが非常に都合のよい方法である。クワ属抽出物は、α−グルコシダーゼによって触媒されるチロシナーゼの必須な修飾を阻害し、その結果、不活性型のチロシナーゼを形成する。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、クワ属植物の葉から得られる植物抽出物を提供する。該抽出物はα−グルコシダーゼＩを阻害するためのＩＣ５０値が９０μｇ／ｍｌ未満の濃度である。
この植物のα−グルコシダーゼＩを阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくは濃度にして７０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは５〜６０μｇ／ｍｌ、そしてさらに好ましくは５〜４０μｇ／ｍｌである。
【００２２】
ＩＣ５０は、実験１に示したように決定することができる。
この抽出物の活性が単離した純粋なＤＮＪの活性よりも高い原因は、抽出物中に存在するその他のイミノ糖の活性によるものであると考えられる。抽出物は好ましくは、定量ＨＰＬＣ及び／又はＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）を用いて測定した場合に、総量にして５〜４０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖を含む。測定したイミノ糖には、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、及びファゴミンが含まれる。
【００２３】
抽出物は、より好ましくは、総量にして８〜３０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖、さらに好ましくは総量にして１５〜２０％（ｗ／ｗ）のイミノ糖を含む。
特徴的な化学成分の含量を正確に制御することにより、製品の質を効率的に制御することが可能になり、そして、製品の化粧用又は治療用効果を一定に保つことができる。
【００２４】
最も好ましくは、抽出物は、イミノ糖である１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、２−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−ＤＮＪ（ＧＡＬ−ＤＮＪ）及びカリステギンＢをさらに含む。
【００２５】
グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤であるＤＡＢの存在は糖代謝を制御する抽出物の使用において重要であると考えられ、この応用は本発明のさらなる側面を構成する。
抽出物はイミノ糖に加えて、好ましくは総量にして２０〜７０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を含む。
【００２６】
より好ましくは、抽出物は総量にして３０〜６０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を、さらに好ましくは総量にして４０〜５０％（ｗ／ｗ）のアミノ酸を含む。
抽出物に含まれるアミノ酸には、ヒトが体内で生産することのできない８種類の必須アミノ酸、並びに、インスリンの分泌を促進するアルギニン、ロイシン、リシン及びフェニルアラニンが含まれる。周知のように、アミノ酸は皮膚の水分保持及び弾性に必須である。アミノ酸が欠如すると皮膚の代謝が低下し、皮膚の老化過程が促進される（Marty J. P., NMF and cosmetology of cutaneous hydration. Annates de Dermatologie et de Venereologie, 2002, 129(1 Pt 2):131 -136）。従って、本発明の抽出物は皮膚の健康の維持を補助する機能もまた有する。
【００２７】
本発明の抽出物は、クワ科、クワ属、及び
ａ．マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）
ｂ．ロソウ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ ｖａｒ．ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓＬ．）
ｃ．クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）及び
ｄ．ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ）
から選択されるクワの葉に由来する。
【００２８】
本発明の発明者らは、一般的なクワ植物の葉の化学成分の化学分析を行い、上述したすべての種に含まれるイミノ糖含量が、その他の種の含量よりも相対的に高く、マグワの葉が最も高いイミノ糖を含むことを見い出した。
【００２９】
より好ましくは、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの１〜２０％（ｗ／ｗ）の量になるように、より好ましくは、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの２〜１０％（ｗ／ｗ）になるように、イミノ糖含量をＤＮＪを基準で標準化する。使用目的によっては、抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの４〜６％（ｗ／ｗ）、又は抽出物の総重量を基に計算した場合にＤＮＪの１〜３％（ｗ／ｗ）に標準化する。ＤＮＪはまた、含まれる主要な（最も収量の高い）イミノ糖である。
【００３０】
本発明の抽出物は、
・色−淡い黄色である、
・溶解度−水に溶けやすい、
・ｐＨ−１％水溶液のｐＨ値は５．５〜６．５の範囲である、及び
・ＵＶスペクトル−２１８ｎｍ及び２６３ｎｍに最大吸収を示す、
を含む数多くの点において、現行のクワ抽出物とは異なる。
【００３１】
基本となる３つの工程からなる新規の抽出及び精製方法により、この抽出物を生産することができ、この方法は本発明のさらなる側面を構成する。
本発明の第二の側面では、
ａ．葉材料の水又はアルコール抽出を実施する工程；
ｂ．強酸性陽イオン交換樹脂を用い、水で洗浄し、アンモニア溶液で溶出し、溶出液を回収して、その後それからアンモニアを除去する、カラムクロマトグラフィーによる精製工程；
ｃ．溶出液をマクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、溶液を回収する工程；及び
ｄ．抽出物を濃縮し、乾燥させる工程；
を含む、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が、９０μｇ／ｍｌ未満の濃度である、クワ植物の葉由来抽出物の生産方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、植物の葉をオーブンで乾燥させて、粗い粉末に調製し、その後、
ａ．クワ植物の葉の量に対して５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、最大５回まで抽出工程を繰り返し、
ｂ．カラム容量に対して１〜２倍量の水でカラムを洗浄し、洗い液を捨て、その後、カラム容量に対して２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎアンモニア水溶液で、１時間当たりカラム容量の１〜３倍量の溶出液となる流速で溶出し、そしてｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収し、
ｃ．溶液とカラム容量との割合が２０：１〜５：１の範囲になるようにカラムからの溶出を行い、及び
ｄ．乾燥させた抽出物が８０番のふるいを通過するように粉砕する。
【００３３】
次に、本発明の抽出物を得るための抽出過程をさらに詳細に示す。
抽出（工程１）：植物の葉をオーブンで乾燥させ、粗い粉末に調製した。生の材料の５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、好ましくは生の材料の１０〜１３倍量（ｗ／ｗ）の２０〜３０％低分子量アルコールを用いて、より好ましくは生の材料の１１倍量（ｗ／ｗ）の２５％低分子量アルコールを用いて、粉末を１〜５回抽出し、液体抽出物を得る。
【００３４】
精製１（工程２）：陽イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー：工程（１）で得られた液体抽出物をろ過した後、溶液を、強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容積の１〜２倍、好ましくは１．５倍量の水をカラムに通し、溶出液を捨てる。カラム容積の２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎアンモニア水溶液、好ましくは５倍量の０．７Ｎアンモニア水溶液を、１時間当たりカラム容積の１〜３倍量、好ましくは１．５倍量を通過させる流速で、さらにカラムに通す。ｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収する。
【００３５】
精製（工程３）：マクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー：工程（２）の溶出液からアンモニアを除去し、ｐＨを７に調整する。溶液を、マクロ多孔性吸収樹脂を充填したカラムに通す。溶液とカラム容量の割合は２０：１〜５：１、好ましくは１５：１〜１０：１、そしてより好ましくは１３：１である。カラムを通した後に回収した溶液を濃縮し、この濃縮液を乾燥させ、その後８０番のふるいを通過出来るように微粉末にして、本発明の抽出物を得る。
【００３６】
前述した抽出方法の工程（１）で使用する前記低分子量アルコールは、炭素原子が４つ以下の直鎖アルキルアルコール、好ましくはメタノール又はエタノールである。前記抽出工程では、１〜３時間、好ましくは１〜２時間、より好ましくは２時間の還流抽出を行う。
【００３７】
工程（１）で得られた液体抽出物をろ過した後には、抽出物の生理活性を改善させ、抽出物を脱色するために、より多くの不純物を除去するためのさらなる方法を適用することができる。それらの方法には、アルコール沈殿、綿状沈殿、並びに、タンパク質、タンニン、及び単糖を除去するためのその他の適切な方法が含まれる。沈殿物を遠心分離又はろ過のいずれかにより除去することができる。本明細書での好ましい精製方法は、アルコール沈殿と遠心分離である：液体抽出物を最初の容量の４分の１になるまで濃縮し、１〜３倍量の９５％エタノールを加え、３０分間撹拌し、その後８〜１２時間おいてから、１２０００回転／分で１５分間、遠心分離する。上清をさらなる精製に用いる。
【００３８】
本明細書で記載した抽出方法では、工程（２）の液体抽出物の総量は陽イオン交換樹脂カラムの２〜２０倍量、好ましくは１０〜１５倍量、より好ましくは１３倍量である。
これらの条件下では、活性成分を効率的に陽イオン交換樹脂に吸収させることができ、このことが活性化合物の含量を上昇させる助けとなる。
【００３９】
本明細書で使用する強酸性陽イオン樹脂は、以下の型から選択することができる：００１Ｘ７（＃７３２）、アンバーライトＩＲ−１２０、ダウエックス−５０、Ｌｅｗａｔｉｔ−１００、Ｚｒｏｌｉｔ２２５又はダイヤイオンＳＫ−１など。００１Ｘ７（７３２）が活性成分を濃縮させるより良い吸収特性をもち、かつ、費用が安いため、最も好ましい。
【００４０】
アンモニア水を用いて陽イオン交換カラムからの溶出を行うと、溶出液のｐＨ値は徐々に上昇する。溶出液の生物学的及び化学的解析から、ｐＨ９〜１１の画分に含まれるものが最も高い活性を示すことが明らかになったため、ｐＨ９〜１１のこれら画分のみを回収した。
【００４１】
本明細書で記載した抽出では、工程（３）での流速は、１時間当たりカラム容積の１〜４倍量、好ましくは２倍量である。この条件で、色の付いた不純物のマクロ多孔性樹脂への吸着が最大になり、しっかりと脱色することができる。
【００４２】
上述したカラムクロマトグラフィー用には、ＡＢ−８、ＨＰ２０、Ｓ−８及びＹＷＤ０３Ｆ４の４型のマクロ多孔性樹脂を選択することができる。この過程を行った後の比較及び確認から、Ｓ−８樹脂を使用した場合に最もよく脱色されることが明かになり、従ってＳ−８型樹脂が好ましいマクロ多孔性樹脂材料である。
【００４３】
上記過程によって得られたクワ葉抽出物は、紫外線でスキャンした場合に２１８．３ｎｍで最大の吸収を示し、淡い黄色であり、現在市場で入手可能なその他のクワ葉抽出物とは区別できるものである。市販されている美容製品中に用いられている大部分のクワ葉抽出物はもっと濃い色、すなわち黄色又は茶色がかった黄色のいずれかであるため最終製品に色がついてしまい、理想的な外観とは言えない。
【００４４】
本発明に記載した抽出物は容易に水に溶けるため、活性成分のより良い拡散性及び標的領域へのより良い吸収性を提供する。美容用美白製品に用いられている現行のクワ抽出物はフラボノイド（例えばクワノン）及びジフェニルエテノイド（例えばオキシレスベラトロール及びムルベロシド）を含むため、水に対する溶解度が低く、平均的な拡散性を有する。そのため、溶解度を上昇させるための低分子量アルコールを製品中に使用することが必要になり、その結果、皮膚への負担が上昇する。
【００４５】
本発明に記載した抽出物のｐＨ値は１％水溶液で５．５〜６．５である。このやや酸性のｐＨは、皮膚表面の皮脂層のｐＨ、すなわち４．５〜６．６と近似している。そのため、前記抽出物をスキンケア製品にした場合、活性成分によって引き起こされる皮膚への刺激が低減する。
【００４６】
本発明の抽出物を、皮膚の美白剤又は皮膚の色素沈着過度を減少させるために使用する医薬品又は化粧品として又は血中グルコースレベルを制御するための医薬品、栄養補助食品又は食品若しくは飲料用の成分として処方することができる。従って、それを、例えば２型糖尿病を治療するために、又は食品若しくは飲料のグリセミック指数を下げるために用いることができる。
【００４７】
本発明の第三の側面では、色素沈着による症状を治療するための化粧品又は薬物として使用する、本発明の第一の側面による植物抽出物又は本発明の第二の側面による過程から得られる製品を提供する。
【００４８】
好ましくは化粧品又は治療用製品はメラニン生産を減少させるものであり、雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫を含む色素沈着過度によって引き起こされる病気又は疾患の治療を含む。
【００４９】
本発明のクワ葉抽出物を用いた薬理学的実験から、前記抽出物はα−グルコシダーゼの活性を効果的に阻害し、等量の純粋なＤＮＪ試料よりも高い効果をもつことが明らかになった。ＤＮＪの濃度の半分の濃度の抽出物のみで、純粋なＤＮＪと同様の効果が得られる。細胞株中で試験した場合、前記抽出物は黒色腫Ａ３７５及びＢ１６細胞株中のメラニン形成に対して効果的な阻害効果を示し、市販されている美容用美白製品にしばしば用いられているアルブチン及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムなどの成分よりも高い効果を示した。本発明のクワ葉抽出物の作用機序は、アルブチン及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムの作用機序とは異なる。後者２つはＴＹＲの活性を直接的に及び競合的に阻害するが、前記クワ葉抽出物は主に、成熟した活性型のＴＹＲの形成を阻害する。前記クワ葉抽出物の利点には、高い効果及び作用の持続性が含まれる。作用機序が異なることから、本発明の前記抽出物を単独で、又は上述したＴＹＲ阻害剤と共に使用することができる。ヒトでの臨床試験により、この生体外でのデータが確認され、及び、０．２％又は０．５％クワ葉抽出物クリーム製剤を２８日間、局所的に使用すると、皮膚の色素沈着が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、皮膚の色が有意に明るくなった（Ｐ＜０．００１）。
【００５０】
本発明の第四の側面では、血中グルコースレベルを制御するために使用する、本発明の第一の側面による植物抽出物又は本発明の第二の側面による過程から得られる製品を提供する。
【００５１】
血中グルコースを制御するために使用する抽出物は、好ましくは、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤をさらに含む。
ウィスターラットモデル動物実験及びヒトでの臨床試験において本発明のクワ葉抽出物は、血中グルコースを有意に低下させる効果を示した。
【００５２】
本発明の抽出物は、活性成分が組み合わせられていることから特に良い。従って、ＤＮＪなどのイミノ糖成分は消化管でα−グルコシダーゼを阻害することにより単糖類の吸収の低下をもたらし（Asano N., Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology, 2003, 13(10): 93R -104R）、別のイミノ糖である１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（Ｄ−ＡＢ１）、が肝臓グリコーゲンホスホリラーゼに対して強力な阻害活性をもつこと、及び生体内での肝臓グリコーゲンの分解を阻害することもまた見出された。そのため、それは抗高血糖である。さらに、アルギニン、ロイシン、リシン及びフェニルアラニンのようなアミノ酸が含まれるため、インスリン分泌を促進する機能をもつ。
【００５３】
従って、本発明に記載した抽出物を、食後の血中グルコースレベルを制御するため、及び血中グルコースの均衡を調整するために使用することができる。
そのような抽出物を、血中グルコースを制御するための医薬品又は健康用製品（食品添加剤又はサプリメントなど）として処方することができる。
【００５４】
第三の側面を提供するために、抽出物を賦形剤及び任意に１つ以上のその他の活性成分を含む化粧品又は医薬品として処方することができる。
皮膚の色を明るくする薬剤として使用するためには、例えば、ビタミンＣ及びビタミン−マグネシウムホスファチジン酸のようなその誘導体、コウジ酸、アルブチン、ジアセチルボルジン、アゼライン酸、オクタデセン二酸（octadecenedioic acid）、ウンデシレノイルフェニルアラニン（ＤＥＰ−１１）、カンゾウ抽出物、アロエ抽出物、クレソン（Ｎａｓｔｕｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）抽出物、アスコフィルム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）抽出物、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）抽出物、グルタチオン、エクジソン及び／又はエラグ酸から、その他の活性成分を選択することができる。
【００５５】
好ましい化粧品又は医薬品は、本発明の抽出物と共に、ビタミンＣ誘導体及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（ＶＣ−ＰＭＧ）を含む。
併用製品では、抽出物対その他の皮膚美白剤とが好ましくは１０：１〜１：１、より好ましくは５：１の比で抽出物を含む。
【００５６】
本発明のクワ葉抽出物又はその他の成分を含む組成物を用いて皮膚疾患用の化粧品又は医薬品を製造する場合には、グリセリン、ポリエチレングリコール、セルロース誘導体などの水溶性基剤、及び脂肪、脂質、炭化水素などの脂溶性基剤などを含む、医薬品に使用可能なすべての一般的な基剤を使用することができる。下記の賦形剤も一般的に用いられ、これらには、ニパギン、クロロブタノール及びソルビン酸のような保存剤、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ＢＨＴなどの抗酸化剤、ステアリン酸、蜜ろう、パラフィン、ラウリルアルコール、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの増粘剤、トリエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤、メトキシけい皮酸オクチル、ベンゾフェノン−３など紫外線防止剤、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールなどの湿潤剤（加湿剤）、脱臭剤、香料及び着色料なども含まれる。上に挙げた賦形剤の量は、当業者には周知である。
【００５７】
前記抽出物をメラニン生産を低下させるための化粧品中に加えて使用する場合、最終産物に含まれる推奨量は０．０５〜２％、好ましくは０．１〜１％、そしてより好ましくは０．２〜０．５％（ｗｔ／ｗｔ）である。
【００５８】
第四の側面を提供するために、抽出物を、医薬品又は、食品若しくは飲料に加えて栄養補助食品として、又は有効量を添加して使用するサプリメントとして処方することができる。
【００５９】
食品又は飲料中で抽出物は、グリセミック指数を下げる機能をもつ。そのような場合には、１回当たり５０〜６００ｍｇの用量で（サイズによる）使用される。
血中グルコースレベルを制御するための経口薬を製造する場合、本発明のクワ葉抽出物を、崩壊剤（例えば乾燥でんぷん、カルボキシメチルでんぷんナトリウム、Ｌ−ＨＰＣ、架橋ＰＶＰなど）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク粉末、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール４０００など）及び粘着剤（例えばＣＭＣ）のような、経口薬に一般的な賦形剤と共に処方することができる。
【００６０】
血中グルコースレベルを制御するために前記抽出物を使用する場合、抽出物中の活性成分の濃度により、推奨量は各回当たり２５〜６００ｍｇで１日３回となり；好ましくは各回当たり１００〜３００ｍｇで１日３回であり；より好ましくは各回当たり５０〜１５０ｍｇで１日３回である。
【００６１】
標準的には、以下の形態の皮膚疾患用化粧品又は医薬品を製造することができる。これらの形態には、水、水−アルコール若しくは油を含む溶液、水若しくは油を含むゲル／コロイド、微細乳濁液、希釈剤又は粘度の高い乳濁液、遊離している若しくは密着している粉末、重合体粒子及びカプセル、とりわけ、イオン若しくは非イオン脂質媒体のような微粒子を含む水中油型分散液が含まれる。
【００６２】
本発明のクワ葉抽出物又は組成物を用いて皮膚疾患用の化粧品又は医薬品を製造する場合には、それらは、クリーム、軟膏、ローション、乳白色の液体、乳濁液、粘液、ペースト、泡、エアロゾル、などの比較的軟らかい「剤形」及び無水固体製剤（例えば棒状の）となる場合がある。
【００６３】
本発明のクワ葉抽出物を用いて血中グルコースを制御するための経口薬を製造する場合、それらを錠剤、カプセル及び粉末のような、一般的に使用される経口薬の剤形で製造することができる。
【００６４】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照することにより、以下にさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、実施例１の植物抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。上段は標準物質であるＤＮＪのＨＰＬＣのクロマトグラムを示し、下段は実施例１の植物抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例１の植物抽出物のＵＶスペクトルである。
【図３】図３は、先行技術による抽出物のＵＶスペクトルである。
【図４】図４は、色素沈着を低下させる作用機序の模式図である。
【図５】図５ａ及び図５ｂは、クワ抽出物（５ａ）及びＤＮＪ（５ｂ）によるα−グルコシダーゼレベルの阻害を示す。
【図６】図６は、チロシナーゼに対するＤＮＪ、アルブチン及びクワ抽出物の効果の比較を示す。
【図７】図７は、メラニン合成阻害に対するＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の効果の比較を示す。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、ＤＮＪ（ａ）、ＶＣ−ＰＭＧ（ｂ）及びクワ抽出物（ｃ）の細胞毒性の比較を示す。
【図９】図９は、ウィスターラットでのクワ抽出物によるグルコース低下効果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトでのクワ抽出物によるグルコース低下効果を示す。
【図１１】図１１ａ及び図１１ｂは、ヒトの皮膚のクワ抽出物による美白効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
図１のＨＰＬＣは、以下の条件で行った：
装置：ウォーターズ（米国）のＨＰＬＣ用装置一式、ｗ６００−２４２０−７１７、及びＥｍｐｏｗｅｒデータ処理システム。
カラム：Shodex Asahipakの旧ＮＨ２Ｐ−５０Ｅ（２５０×４．６５μｍ）カラムを逆相で用いた。
試薬：６．５ｎｍｏｌ酢酸アンモニウム含有アセトニトリル−水。
カラム：温度４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
検出器：Ｗ２４２０ＥＬＳＤ
ゲイン：１００；ドリフトチューブの温度５０℃；溶離液加熱レベル６０％
移動相：アセトニトリル：水（６．５ｎｍｏｌ酢酸アンモニウム含有）（８４：１６）
図２及び図３のＵＶスペクトルは以下の条件を用いて得られた。
装置：ＵＮＩＣＯ、ＵＶ−２１００分光光度計
測定波長：２００〜６００ｎｍ
試料濃度：１ｍｇ／ｍｌ
本発明の植物抽出物を、実施例１〜５を基に記述した方法により、実施例６〜９を基に説明した、様々なクワの葉から得ることができる。
【００６７】
得られた植物抽出物を化粧品若しくは医薬品として、又は食品若しくは飲料栄養補助食品として、又は実施例１０〜１６を基に説明した添加剤として処方することができる。
抽出物の様々な活性を、実施例１〜８の方法を通じてさらに説明する。
【００６８】
実施例１
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉１００ｋｇを微粉末にし、１２倍量（生材料の重量に対して）の３０％エタノールを用い、３回還流抽出する（１回当たり１時間）。抽出物を一定量まで濃縮し、００１Ｘ７のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は、液体抽出物の１４分の１とした。水でカラムを洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、その後目的の構成要素（イミノ糖）を、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間当たりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。次に溶出液をＳ−８のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、液体溶出液の１０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ５．８％、全イミノ糖２１％、及び全アミノ酸４８％を含む、淡い黄色の粉末１．４ｋｇを得た。
【００６９】
以下に示すアッセイによりイミノ糖含量を決定し、その結果を図１に示した。図１下段のプロファイルが、主要なイミノ糖のピークを示しているＨＰＬＣのクロマトグラムである（ＤＮＪ標準物質のプロファイルを上段に示した）。
【００７０】
（ａ）適切な量のＤＮＪを、対照として正確に計量し、０．１ｍｇ／ｍｌ溶液となるようにメタノールを加え、よく撹拌する。正確に溶液１ｍｌを計量し、２５ｍｌの分析用フラスコに移す。これに、１ｍｌの０．４ｍｏｌ／Ｌホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）及び２ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した５ｍｍｏｌ／ＬＦＭＯＣ−ＣＩを加える。室温で２０分間超音波処理し、すぐに２ｍｌの０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液及び０．１％酢酸を加え、よく撹拌して、対照試料溶液とする。
【００７１】
（ｂ）抽出物０．３ｇを適量の水に溶解し、予め調整しておいたポリアミドカラムに通す。塩酸溶液（ｐＨ３）で溶出する。溶出液を回収し、減圧下で約１０ｍｌになるまで濃縮する。予め調整しておいた陰イオン交換樹脂カラムに溶液を通す。カラムを水で洗浄し、溶出液を回収する。減圧下で約３０ｍｌになるまで濃縮した後、溶出液を５０ｍｌの分析用フラスコに移し、水を加える。正確に計量した溶液１ｍｌを２５ｍｌの分析用フラスコに移し、上述の（ａ）と同様に、１ｍｌの０．４ｍｏｌ／Ｌホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）及び２ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した５ｍｍｏｌ／ＬＦＭＯＣ−ＣＩを加える。室温で２０分間超音波処理し、すぐに２ｍｌの０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液及び０．１％酢酸を加え、よく撹拌して、試験溶液とする。
【００７２】
（ｃ）以下に示す条件で、溶液をＨＰＬＣにかけ、イミノ含量をそこから（Ｅｍｐｏｗｅｒにより）決定した。カラム：Ｃ１８−ＯＤＳ；移動相：アセトニトリル：０．１％酢酸（３０：７０）、で３０分間、その後移動相をアセトニトリル：０．１％酢酸（７０：３０）に換え、１０分間流す。次の試料を注入する前に、元の移動相を用いてシステムを平衡化する。クロマトグラムを検出波長２６５ｎｍで３０分間記録した。対照試料及び試験試料をそれぞれ２０μｌ、正確に計量してＨＰＬＣ装置に注入し、測定してＨＰＬＣの結果を得た。
【００７３】
標準的なアミノ酸解析装置を用いて全アミノ酸含量をアッセイした。
実施例２
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉１００ｋｇを微粉末にし、１８倍量（生材料の重量に対して）の水を用い、３回還流抽出する（１回当たり１時間）。抽出物をＤｏｗｅｘ−５０のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は、抽出物の２０分の１とした。水でカラムを洗浄し（カラム容量の２倍量）、その後０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の８倍量）で、１時間当たりカラム容量の３倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＨＰ２０のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、液体溶出液の２０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４倍の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ４．３％、全イミノ糖１９％、及び全アミノ酸４０％を含む、淡い黄色の粉末１．４ｋｇを得た。ＵＶスペクトルを図２に示す。その他のクワ抽出物とは異なり、本発明の抽出物では２つの離れたピークが見られる。不純物をより高い割合で含むその他のクワ抽出物では、その不純物が原因で２つのピークが別れず（図３を参照のこと）、そのため効果レベルが低下する可能性がある。
【００７４】
実施例３
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉２０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して５倍量の４０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、等量のエタノールを加え、一定の速度で３０分間撹拌し、その後一晩静置する。１２０００回転／分で１５分間遠心分離することにより沈殿を除去し、一定量になるまでエタノールを加える。上清を、例えば００１Ｘ７型のような強酸性陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量を液体の３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量と等量）１．０Ｎアンモニア水（カラム容量の２倍量）で、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＳ−８のようなマクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の１３分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ９．１％、全イミノ糖２９％、及び全アミノ酸３２％を含む、白に近い色の粉末０．１１ｋｇを得た。
【００７５】
実施例４
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１２倍量の４０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、沈降剤として硫酸アルミニウムカリウム、ｐＨ３、を加え、そして３０分間撹拌する。２時間静置した後、遠心分離により沈殿を除去し、上清のｐＨを７に調整する。上清を陽イオン樹脂、すなわち００１Ｘ７を充填したカラムに通す。カラム容量を液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の２倍量）、０．２Ｎアンモニア水（カラム容量の８倍量）で、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液を、ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の２０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ１８．６％、全イミノ糖３９％、及び全アミノ酸２１％を含む、白に近い色の粉末０．１２ｋｇを得た。
【００７６】
実施例５
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１１倍量の２５％エタノールを用い、４回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１５分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。Ｓ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ５．６％、全イミノ糖２４％、及び全アミノ酸４８％を含む、淡い黄色の粉末０．４６ｋｇを得た。
【００７７】
実施例６
乾燥させたロソウ（Morus alba var.multicaulis L.）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１１倍量の２５％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、００１Ｘ７型陽イオン交換樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通した。カラム容量は液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の２倍量）、０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整した。溶出液をＨＰ２０マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は、溶出液の１０分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ２．１％、全イミノ糖８．３％、及び全アミノ酸６５％を含む、淡い黄色の粉末４８ｇを得た。
【００７８】
実施例７
乾燥させたクロミグワ（Morus nigra）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して８倍量の８０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、その後約６Ｌになるまで濃縮し、これに約１２Ｌのエタノールを加えた。一定の速度で３０分間撹拌し、その後一晩静置した。１２０００回転／分で１５分間遠心分離することにより沈殿を除去し、一定量になるまでエタノールを加え、そして硫酸アルミニウムのような凝集剤を適量加える。しばらく置いて完全に沈殿させた後、遠心分離によって沈殿物を除去する。上清を、００１Ｘ７型のような陽イオン樹脂を充填したカラムに通す。カラム容量は液体の１０分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量と等量）、０．５Ｎアンモニア水（カラム容量の４倍量）で、１時間あたりカラム容量の３倍量の溶出液となる流速で溶出した。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を指定された量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。溶出液をＨＰ２０マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに通した。カラム容量は溶出液の１５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の４量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ３．９％、全イミノ糖１５％、及び全アミノ酸５８％を含む、白に近い色の粉末４０ｇを得た。
【００７９】
実施例８
乾燥させたヤマグワ（Morus australis Poir.）の葉５ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して８倍量の８０％エタノールを用い、３回還流抽出する。抽出物をまとめてろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型陽イオン樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１０分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の５倍量）で、１時間あたりカラム容量の１．５倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収した。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の１３分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ１．４％、全イミノ糖５．２％、及び全アミノ酸６８％を含む、淡い黄色の粉末４２ｇを得た。
【００８０】
実施例９
乾燥させたマグワ（Morus alba）の葉５０ｋｇを微粉末にし、生材料の重量に対して１０倍量の３０％エタノールを用い、１回還流抽出する。抽出物をろ過し、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）型陽イオン樹脂を充填した陽イオン樹脂カラムに通す。カラム容量は液体の１３分の１とした。カラムを水で洗浄し（カラム容量の１．５倍量）、０．７Ｎアンモニア水（カラム容量の７倍量）で、１時間あたりカラム容量の２倍量の溶出液となる流速で溶出する。ｐＨが９〜１１のアンモニア水溶出液を回収する。溶出液を一定量まで濃縮し、アンモニアを除去し、そしてｐＨを７に調整する。ＡＢ−８マクロ多孔性樹脂を充填したカラムに溶出液を通す。カラム容量は、溶出液の１５分の１とし、流速は、１時間あたりカラム容量と等量の溶出液となるようにした。回収した溶液をその後減圧下で乾燥させ、乾燥物が８０番のふるいを通過するように微粉化した。ＤＮＪ４．２％、全イミノ糖２２％、及び全アミノ酸４６％を含む、淡い黄色の粉末０．５ｋｇを得た。
【００８１】
実施例１０
ステアリン酸、グリセロールモノステアレート、流動パラフィン、鯨ロウ、蜜ロウ、及びシリコン油を、８：５：３：８：１：５部の割合で混合し、７５℃に加熱する（「基剤１」の形成）。トリエタノールアミン、グリセリン、メチルパラベンを、０．７：５：０．０５部の割合で混合し、７５℃に加熱する（「基剤２」の形成）。基剤１と２を混合し、そこに３部（ｗ／ｗ）の実施例１のクワ葉抽出物を加える。よく混合し、１００ｍｌになるまで水を加える。冷却した後、適量の香料を加えて、前記クワ葉抽出物を含む美白用クリームを生産する。
【００８２】
実施例１１
グリセリン、プロピレングリコール、３０％ＮａＯＨ及びソルビン酸カリウムを、７：４：０．２：０．１部の割合（ｗ／ｗ）で混合する。１００ｍｌになるまで蒸留水を加えて水相とする。これとは別に、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、グリセロールモノステアレート及びステアリルアルコールを、１０：８：１：３部の割合で混合し、加熱して油相とする。上記の水相を９５℃に加熱し、この温度で撹拌しながら、油相を徐々に加える。約４５℃になったら、実施例４のクワ葉抽出物とＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウムとの２：０．４部の割合の混合物に加え、香料を数滴加えて、２相が混ざるまで撹拌する。冷却してペーストとする。
【００８３】
実施例１２
グリセリン、プロピレングリコール、３０％ＮａＯＨ及びソルビン酸カリウムを、７：４：０．２：０．１部の割合（ｗ／ｗ）で混合する。１００ｍｌになるまで蒸留水を加えて水相とする。これとは別に、ステアリン酸、ステアリン酸ブチル、モノステアリン酸グリセロール及びステアリルアルコールを、１０：８：１：３部の割合で混合し、加熱して油相とする。上記の水相を９５℃に加熱し、この温度で撹拌しながら、油相を徐々に加える。約６０℃になったら、実施例１のクワ葉抽出物とＤＥＰ−１１との２：０．２部の割合の混合物に加える。香料を数滴加え、２相がよく混ざるまで撹拌する。冷却してペーストとする。
【００８４】
実施例１３
実施例５のクワ葉抽出物０．４部（ｗ／ｗ）に、０．１部のエチルパラベン、０．５部の重硫酸ナトリウム、０．１部のエデト酸２ナトリウム、及び９部のグリセリンを加え、１００ｍｌになるまで蒸留水を加えてローションとする。
【００８５】
実施例１４
実施例１のクワ葉抽出物５ｋｇ、でんぷん１．８ｋｇ、微結晶セルロース１．５ｋｇ、架橋ＰＶＰ０．４５ｋｇ、ＣＳＭ−Ｎａ０．５５ｋｇ、及び適量のステアリン酸マグネシウム及びシリコンマイクロ粉末をよく混ぜる。各錠剤の重量が約０．５ｇの錠剤２０，０００個を製造する。
【００８６】
実施例１５
実施例３のクワ葉抽出物１．０ｋｇを適量のでんぷんに混合し、各カプセルが１００ｍｇの抽出物を含むように、１０，０００個のカプセル中に充填する。
【００８７】
実施例１６
実施例３のクワ葉抽出物２．０ｋｇに、０．５ｋｇのビタミンＣ、１．０ｋｇのクエン酸、０．８ｋｇの炭酸水素ナトリウム、０．０８ｋｇのマンニトール、ＰＶＰ、ＰＥＧ６０００、香料添加剤及び結合剤を加え、起泡性の顆粒を製造する。
【００８８】
活性試験実験
実験１．α−グルコシダーゼに及ぼすクワ葉抽出物の阻害活性アッセイ
本発明のクワ葉抽出物がα−グルコシダーゼに及ぼす阻害活性を解析することを目的とした。以下に試薬及び装置を示す。
【００８９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物、
（２）ＤＮＪ標準化合物、
（３）α−グルコシダーゼ（Ｉ型、Bakers yeast、ＥＣ２３２．６０４．７）を０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解して０．４２Ｕ／ｍｌ溶液とした。
【００９０】
（４）ｐＮＰＧ。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に溶解して５ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。
（５）ｐＮＰ。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解して２００μｍｏｌ／Ｌ溶液とした。
【００９１】
（６）Multiskan Ascentマイクロプレートリーダー（Thermo Electron Co.、米国）。
方法を以下に示す。
検量線
２００μｍｏｌ／ＬのｐＮＰ溶液を０．１μｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で、それぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌ、６．２５μｍｏｌ／Ｌ及び３．１２５μｍｏｌ／Ｌになるように希釈する。各希釈液から２００μｌをとりわけ、４０５ｎｍでＯＤを測定し、ＯＤ値を用いて検量線を引く。
【００９２】
試験試料のアッセイ
（１）それぞれ異なる濃度の試験試料８０μｌをマイクロプレートの個別のウェルに入れる。リン酸緩衝液８０μｌを偽薬とした。
【００９３】
（２）それぞれのウェルに、３０μｌの酵素（０．４２Ｕ／ｍｌ）を加え、３０秒静置し、その後、基質（ｐＮＰＧ）を加えて３７℃で１５分間インキュベートする。マイクロプレートリーターの電源を入れ、温度３７℃、キネティックモード、１０秒間隔に設定する。測定を１３回行う（合計２分）。
【００９４】
（３）各ウェルに基質（５ｍｍｏｌ／ＬのｐＮＰＧ）を９０μｌ加え、３０秒間撹拌し、マイクロプレートリーダーの中に置く。開始ボタンを押し、続けて３７℃でのＯＤ値を測定する。
【００９５】
（４）ｐＮＰの濃度をＸ軸に、ＯＤ値をＹ軸にとって検量線を引く。反応物の相対量を求めるために、工程（３）で得られた検量線上のＯＤ値を使用する。
（５）偽薬及びそれぞれ異なる濃度の試験試料については、時間をＸ軸に、反応物量をＹ軸に取って反応進行曲線を引く。直線の傾斜が反応時間である。
【００９６】
（６）試験試料の濃度をＸ軸にとり、Ｙ軸に反応時間をとって、試験試料の濃度曲線を引き、ＩＣ５０を求める。阻害活性（Ｕ／μｇ）＝（０．５×各ウェルの酵素活性）／（ＩＣ５０×各ウェルの試料容量）＝（０．５×０．４２×０．０３）／（ＩＣ５０×０．０８）＝０．０７８７５／ＩＣ５０。
【００９７】
結果及び考察
上述の結果から、実施例１のクワ葉抽出物がα−グルコシダーゼを阻害するＩＣ５０値は１３．６μｇ／ｍｌであり、一方、純粋なＤＮＪのＩＣ５０は７０μｇ／ｍｌであることが示された。このことは、実施例１のクワ葉抽出物の活性が純粋なＤＮＪの活性よりもかなり高いことを示すものであった。実施例１のクワ葉抽出物中のＤＮＪ含量が僅か３．５％だったことを考慮すると、前記抽出物を使用することにより、同じ若しくはそれよりも高い活性を得ることができ、それと同時に、高濃度の純粋な化合物による副作用を低減させること可能になる。クワ抽出物及びＤＮＪによるα−グルコシダーゼの生体外での阻害、並びに初期反応速度をそれぞれ示す、図５ａ及びｂを参照のこと。
【００９８】
実験２：ＴＹＲに及ぼす、クワ葉抽出物及びアルブチンの阻害活性アッセイ
黒色腫細胞株Ｂ１６でのＴＹＲ活性に試験試料が及ぼす効果及び作用機序を解析することを目的とした。以下に試薬及び装置を示す。
【００９９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）ＤＮＪ標準化合物
（３）アルブチン標準化合物
（４）Ｌ−ドーパ溶液。使用する直前に、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１００】
（５）ＷＩＰ細胞溶解緩衝液
（６）細胞培養プレート（２４ウェル及び９６ウェル）
（７）光学顕微鏡
（８）遠心機
（９）マイクロプレートリーダー
以下に方法を示した。
【０１０１】
Ｂ１６黒色腫細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心分離管に回収した。遠心分離した後、フッ化フェニル−メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含むＷＩＰ−溶解緩衝液を細胞沈殿物に加え、氷中に管を立てて３０分おき、細胞を溶解させた。その後溶液を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、細胞要素を含む上清（細胞抽出物）をアッセイに使用する目的で保持した。
【０１０２】
チロシナーゼの触媒活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の直接的な効果を決定するために、６０μｌのＤＮＪ、アルブチン又はクワ抽出物（様々な濃度の化合物を用いた）を、９６ウェルマイクロプレートに入れた、６０μｌの細胞抽出物に加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後各ウェルに８０μｌのＬ−ドーパを加えた。マイクロプレートリーダーを用い、各ウェルの吸収（４９２ｎｍ）を５分間間隔で３０分間、３７℃で記録した。
【０１０３】
チロシナーゼの触媒活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の間接的な効果を決定するために、Ｂ１６黒色腫細胞にそれぞれ異なる濃度のＤＮＪ、アルブチン、又はクワ抽出物を加えて３日間培養し、その後抽出及び評価を行った。抽出した後、４０μｌの細胞抽出物、１２０μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、及び４０μｌのＬ−ドーパ（２ｍｇ／ｍｌ）を９６ウェルマイクロプレート中に入れ、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの４９２ｎｍでの吸収を５分間間隔で３０分間、３７℃で記録した。
【０１０４】
結果及び考察
アッセイの結果を図６に見ることができる。明色のカラムは、細胞抽出物中でのチロシナーゼ活性に及ぼす、ＤＮＪ、アルブチン、及びクワ抽出物の直接的な効果を示し、暗色のカラムはチロシナーゼ活性に及ぼす化合物の間接的な結果を示す。
【０１０５】
直接的な活性アッセイでは、アルブチンが容量依存的にチロシナーゼの活性を弱めたが、ＤＮＪ及びクワ抽出物はチロシナーゼ活性に何の効果も示さなかった。しかしながら間接的な活性アッセイでは、試験化合物の存在下で３日間細胞をインキュベートとした後には、ＤＮＪ及びクワ抽出物群においてチロシナーゼ活性の容量依存的な低下がみられたが、アルブチンはチロシナーゼ活性に影響を及ぼさなかった。
【０１０６】
これらの発見は報告されている文献と一致し、かつ、α−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＮＪ及びクワ抽出物の作用機序が異なると考えられていることを支持するものである。直接的な活性アッセイでは、アルブチンはチロシナーゼと直接相互作用し、活性部位に結合して酵素を不活性化させ、その結果、Ｌ−ドーパからｏ−ドーパキノンへの酸化が減少した。α−グルコシダーゼ阻害剤はチロシナーゼの活性に直接は作用せず、このことが、ＤＮＪ及びクワ抽出物がチロシナーゼ阻害活性に効果を示さなかった直接的な活性アッセイの結果に反映された。
【０１０７】
間接的な活性アッセイでは、ＤＮＪ及びクワ抽出物の両方がチロシナーゼに対して阻害活性をもつことが示された。α−グルコシダーゼ阻害剤は未成熟なチロシナーゼに作用し、かつ、チロシナーゼの成熟過程におけるカルネキシンの結合を阻害することにより、成熟したチロシナーゼの酵素活性に影響を及ぼす構造の変化が生じる。これらの変化は、ＤＮＪ及びクワ抽出物を加えて３日間インキュベートした後に酵素活性が低下したことからも明かとなった。アルブチンはチロシナーゼ活性部位と直接競合したが、アッセイ溶液にアルブチンが含まれていない間接的なアッセイでは、酵素活性の阻害は見られなかった。
【０１０８】
実験３．本発明のクワ葉抽出物がメラニン細胞でのメラニン含量に及ぼす効果
試験試料が黒色腫細胞株Ｂ１６のメラニン含量に与える効果を解析することを目的とした。以下に使用した試薬及び装置を示す。
【０１０９】
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）ＤＮＪ標準化合物
（３）ＶＣ−ＰＭＧ標準化合物
（４）ＷＩＰ溶解緩衝液
（５）光学顕微鏡
（６）細胞培養プレート（２４ウェル及び９６ウェル）
（７）遠心機
（８）マイクロプレートリーダー。
【０１１０】
以下に方法を示した。
１．対数増殖期の黒色腫Ｂ１６細胞を回収し、細胞懸濁液を適切な濃度に調整し、２４ウェルプレートに分け入れて、細胞をウェルの壁に接着させる。
【０１１１】
２．培地で希釈することにより調製した、様々な濃度の試験試料１ｍｌを各ウェルに加える（各濃度につき同じものを４つ準備した）。２日間インキュベートし、試料溶液を交換し、さらに２日間インキュベートした。
【０１１２】
３．４日目に細胞を回収し、ＰＢＳで２回、しっかりと洗浄した。ＷＩＰ溶解緩衝液を２５０μｌ加え、５分毎に４〜５回ボルテックスで撹拌しながら、氷浴中で溶解させた。
４．１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を４００μｌの１ＮのＮａＯＨに溶解し、８０℃の湯浴中に１時間おく。
【０１１３】
５．マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでのＯＤ値を測定し、相対量を算出する。
結果及び考察
アッセイの結果を図７に見ることができる。中間色のカラムは、Ｂ１６黒色腫細胞でのメラニン含量に及ぼすＤＮＪの阻害効果を示し、暗色のカラム及び白色のカラムはＢ１６黒色腫細胞でのメラニン含量に及ぼすＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の阻害効果を示す。すべての効果は、様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ又はクワ抽出物と３日間インキュベートした後に見られた効果である。
【０１１４】
対照と比較すると、様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及び実施例１で処理することにより、メラニン含量は容量依存的に有意に減少した。３種類の化合物の活性の強度は、強い方から順に、ＤＮＪ＞クワ抽出物＞ＶＣ−ＰＭＧ、という順序であった。
【０１１５】
ＤＮＪはクワ抽出物から同定された活性化合物であり、α−グルコシダーゼ阻害剤と同様にチロシナーゼの活性を弱めて、Ｂ−１６黒色腫細胞株でのメラニン生産の減少を低下させることができる。天然に生じるＤＮＪの含量はすべての植物において非常に低いため、天然のＤＮＪを商業目的で使用することは不可能である。クワ抽出物は、クワ抽出物中のＤＮＪ含量は２〜５％と低いが、ＤＮＪの活性と同様の効果を示した。このことにより、クワ抽出物中ではＤＮＪがその他の活性成分と相乗的に機能して、強い抗色素沈着効果をもたらしている可能性が示された。
【０１１６】
我々の観察から、Ｂ１６黒色腫細胞に加えたＶＣ−ＰＭＧの濃度を２００ｐｐｍより高くすると、細胞の生存能力が下がることが示された。このことにより、過剰な濃度のＶＣ−ＰＭＧによって細胞が傷つけられる恐れがある可能性が示された。天然物としてのクワ抽出物はより安全な特性をもち、かつ、ＶＣ−ＰＭＧよりも強い効果をもつ。クワ抽出物の作用機序はＶＣ−ＰＭＧの作用機序とは異なるため、クワ抽出物を単独で、又はより高い抗色素沈着効果を達成するためにＶＣ−ＰＭＧと併用して用いることができる。
【０１１７】
クワ抽出物を化粧品に加えるための美白製品として開発するために、一般的に化粧品に使用されている美白成分の用量について検討した。アルブチン：１％〜５％、コウジ酸：０．２％〜３％、ビタミン誘導体：＜３％。我々の研究から、実施例１の推奨用量は３％より低いものである。
【０１１８】
実験４．本発明のクワ葉抽出物がメラニン細胞の成長に及ぼす効果
方法
細胞の生存能力
生存能力のある細胞のミトコンドリア内酵素により、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドをＭＴＴホルマザンの結晶に変換する反応を用いたＭＴＴアッセイにより、細胞の生存率を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてＭＴＴを２ｍｇ／ｍｌになるように新しく調製した。１ｍｌ当たり２×１０４個の細胞を９６ウェルプレート中にプレーティングし、ＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ、クワ抽出物又はＤＭＥＭを培地中に加えた。実験経過の様々な時点で、ＭＴＴストック溶液２０μｌをウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２、加湿条件下、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、これら細胞のホルマザン結晶をゆっくりと撹拌することにより、１００μｌのＤＭＳＯ中に溶解した。１０分後、エライサプレートリーダーを用いて５４０ｎｍで測定することにより、ホルマザンの量を分光光度法で定量した。
【０１１９】
黒色腫細胞中のメラニン含量の決定
Ｂ１６黒色腫細胞を、１ウェル当たり４×１０４個の密度で２４ウェル培養プレート中に播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。次に細胞を様々な濃度のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ又はクワ抽出物で３日間処理した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心管に集めた。遠心分離した後、細胞沈殿にフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含むＷＩＰ溶解緩衝液を加え、氷上で３０分間かけて細胞を破砕した。溶液を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、沈殿に１ＮのＮａＯＨを加えて７０℃で１時間沸騰させることにより溶解した。分光光度計を用いて４０５ｎｍでメラニン含量を検定した。
【０１２０】
結果及び考察
細胞の生存能力に及ぼすＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物の効果
ＭＴＴを用いて行ったＢ１６黒色腫細胞の生死判別試験のデータを、図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに示した。
【０１２１】
ＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物は、用いた濃度ではＢ１６黒色腫細胞の成長を阻害しなかった。これらのデータから、天然のＤＮＪ、ＶＣ−ＰＭＧ及びクワ抽出物が、２００ｐｐｍより低い濃度ではＢ１６黒色腫細胞に対して細胞毒性をもたないこと、及び、メラニン含量を下げるアッセイでは細胞の成長は影響を受けないことがはっきりと示された。
【０１２２】
実験５：ウィスターラットの血中グルコースに及ぼす本発明のクワ葉抽出物の効果
用いた試薬及び装置は以下の通りである。
（１）実施例１のクワ葉抽出物
（２）生理食塩水
（３）ミグリトール標準化合物
（４）６４ウィスターラット
（５）ジョンソン社製One Touch Ultra血中グルコース計測器及びＣｏｄｅ９血中グルコース試験ストリップ
以下に示した方法を用いた。
【０１２３】
腹腔内注入（１５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ）又は胃内投与（２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）により、動物にクワ抽出物を投与した。２型糖尿病用に認可されたα−グルコシダーゼ阻害薬であるミグリトール（グリセット（Ｇｌｙｓｅｔ）（登録商標）、２５ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として用いた。空腹時の血糖レベルを基準として記録し、でんぷん食を与えてから３０分、１時間及び２時間後の血糖レベルを測定した。動物にはでんぷん食を与える前に、クワ抽出物を投与した。
【０１２４】
結果及び考察
デンプン投与３０分、１時間、２時間後の血中グルコース（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝１０）。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
結果から、クワ抽出物が血中グルコースレベルを有意に低下させることが示された。胃内経路による投与では、活性化合物の経口生物学的利用率が良いこと、代謝によっても不活化しないことが示された。本試験では、胃内及び腹腔内両方による投与により、５０ｍｇ／ｋｇのクワ抽出物が、ミグリトール（グリセット（登録商標））と同等に、血中グルコースレベルを有意に下げることが示された。図９を参照のこと。
【０１２７】
実験６：ヒトの血中グルコースレベルの低下に及ぼすクワ抽出物の効果
方法
ヒトでの小規模試験では、一晩の絶食の後、４００ｍｇのクワ抽出物又は偽薬のいずれかを、５０ｇの粉末糖と共に患者に投与した。血糖レベルを３時間監視した。また患者の１人には、陽性対照として作用するように５０ｇのミグリトールを投与した。
【０１２８】
結果及び考察
データから、クワ抽出物が血糖レベルを劇的に減少させることが示された。クワ抽出物により、開始時の血糖の振幅が５９．９１％、２時間後の血糖レベルが５０．７８％、３時間後の血糖レベルが４７．１８％減少した。クワ抽出物は、粉末糖のグリセミック指数を８３．８から４１．２に低下させることができた。図１０を参照のこと。
【０１２９】
実験７：ヒトの皮膚の美白におけるクワ抽出物の効果
方法
本試験用に、実施例１のクワ抽出物を０．２％及び０．５％クリーム製剤に調製した。書面による同意が得られた対象女性（１８才以上）２０人の、前腕の予め所定領域に各製剤１日２回投与した。初回投与に先立ち、所定領域の皮膚色を色彩色差計ＣＲ３００で測定した。
【０１３０】
処置の２８日後、対象に試験施設を再訪してもらい、同じ所定領域の皮膚色を新たに測定して０日目とした。
以下の３つの試験指標により評価を行った。
−Ｌ＊（暗から明への変化）。これは皮膚の明度の指標である。この指標の上昇は皮膚色が明るくなったことを特徴付けるものである。
−ｂ＊（青から黄への変化）。この指標の低下は、皮膚の黄味が低下したことを特徴付けるものである。
−ＩＴＡ°（individual typological angle）。この指標は、明度（Ｌ＊）及び皮膚のメラニン指標（ｂ＊）を用いて対象の皮膚の色素沈着の度合いを示す。ＩＴＡ°の上昇は、皮膚の色素沈着の低下を特徴付けるものである。
【０１３１】
結果及び考察
Ｌ＊指標は、０．２％製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇した（平均して＋０．５４Ａ．Ｕ．）。このことは皮膚色の明度が上昇したことを表している。この効果は対象の９０％で観察された。図１１Ａを参照のこと。
【０１３２】
個別類型角（individual typological angle＝ＩＴＡ°）指標は、０．２％製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇した（平均して＋１Ａ．Ｕ．）。このことは、皮膚の色素沈着が低下したことを意味している。この効果は対象の５７％で観察された。図１１Ｂを参照のこと。
【０１３３】
０．５％製品を使用した場合には：Ｌ＊指標は製品を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇し、このことは皮膚の明度が上昇したことを意味している。この効果は対象の８６％で観察された。図１１Ａを参照のこと。
【０１３４】
個別類型角（ＩＴＡ°）指標は、０．５％製剤を毎日２８日間使用した後、有意に（Ｐ＜０．００１）上昇し、このことは皮膚の色素沈着が低下したことを意味している。この効果は対象の６７％で観察された。図１１Ｂを参照のこと。
【０１３５】
実験８．抽出物のデータ
本発明の抽出物（試料１から３）は下記表１に表した特性値により、先行技術の抽出物とは異なる。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
上記表１の説明。
試料１〜３は実施例１〜３の製品を指す。
試料４は特許第０３１３９０２８．５号に従って調製した製品を指す。
【０１３８】
試料５は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、８０％エタノールで３回、各回１〜２時間かけて還流抽出する。１回目は生の材料の重量に対して６倍量（ｗ／ｗ）のエタノールを用い、その後２回目及び３回目の抽出は４倍量のエタノールを用いて行う。抽出物をまとめて２４時間おき、その後ろ過する。ろ液を濃縮し、水を用いて５回、７０〜８０℃で濃縮した抽出物を抽出した。各回につき、出発材料（クワの葉）の重量に対して１０倍量の水を用いた。水抽出物をまとめてｐＨを３〜４に調整し、ＮａＣｌを３〜５％の濃度になるように加える。液体を、６０ｃｍ（Ｈ）×３ｃｍ（Ｄ）カラムを用いたＤ１０１マクロ多孔性樹脂クロマトグラフィーにかけた。溶出液が透明になるまで水で溶出し、その後カラム容量に対して５倍量の３０〜５０％エタノールを用い、流速２０／ｍｌで溶出した。溶出液をまとめ、濃縮し、乾燥させて試料（５）とする。
【０１３９】
試料６は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、各回クワの葉の重量に対して１０〜１２倍量の５０〜６０％エタノールを用い、５０℃で２回抽出する。抽出物を濃縮し、Ｄ７２強酸性マクロ多孔性樹脂を充填したカラムを通し、溶液（画分１）を回収する。エタノールで溶出して画分２とし、その後２％アンモニア含有７０％エタノールで溶出して画分３を得る。画分１、２及び３をそれぞれ遠心分離し、濃縮する。乾燥させ、まとめて試料（６）とする。
【０１４０】
試料７は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、８０℃の水（１０〜１５倍量の水）で２回抽出した。抽出物をまとめてｐＨを２〜３に調整し、０℃に冷却して完全に沈殿させた。抽出物をろ過し、濃縮したろ液を陽イオン樹脂クロマトグラフィーにかけた。水で溶出し、その後等量の５０％エタノール−アンモニア水溶液の混合物で、溶出液が透明になるまで溶出する。溶出液を濃縮し、乾燥させて試料（７）とする。
【０１４１】
試料８は以下に記載した方法によって調製した。クワの葉を微粉末にし、３０％エタノール（各回当たりクワの葉の５倍量）で３回抽出する。抽出物をまとめて濃縮し、エタノールを加えて沈殿させる。上清を濃縮して水を加え、Ｄ１０１マクロ多孔性樹脂カラムに通して溶液を回収する。３倍量の水で溶出し、溶液をまとめて、水での溶出液を画分１とする。続けて６０％エタノール（５倍量）で溶出し、溶出液を画分２とする。画分１のｐＨを４に調整し、陽イオン交換カラムに通す。溶出液が透明になるまでカラムを水で洗浄し、その後０．５Ｎのアンモニア溶液（８倍量）で溶出し、溶出液を回収して画分３とする。画分２及び３をそれぞれ濃縮して乾燥させ、試料（８）とする。
【０１４２】
表中で用いた溶解度を表す用語は以下のように定義する。
・「容易に溶解可能」１ｇの試料が１ｍｌ未満の水に溶ける
・「可溶性」１ｇの試料が１０〜３０ｍｌの水に溶ける
・「平均的」１ｇの試料が３０〜１００ｍｌの水に溶ける。
【０１４３】
上述した結果から、本発明の製品は、活性、重要な活性化合物の含量、色調及び水への溶解度の点で、現行の製品よりも優れていることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クワ植物の葉から得られ、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして９０μｇ／ｍｌ未満である植物抽出物。
【請求項２】
α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして５〜４０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の植物抽出物。
【請求項３】
定量ＨＰＬＣ及び／又はＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）で測定した場合に全イミノ糖を５〜４０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１又は２に記載の植物抽出物。
【請求項４】
全イミノ糖を８〜３０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項５】
全イミノ糖を１５〜２０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項６】
イミノ糖が、ＤＮＪ、ファゴミン、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、１，４ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、２−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−ＤＮＪ（ＧＡＬ−ＤＮＪ）及びカリステギンＢをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項７】
２０〜７０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項８】
３０〜６０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸を含んでなる、請求項７に記載の植物抽出物。
【請求項９】
４０〜５０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の植物抽出物。
【請求項１０】
クワが
ａ．マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）
ｂ．ロソウ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ ｖａｒ．ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓ Ｌ．）
ｃ．クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）及び
ｄ．ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ）
より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１１】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に１〜２０％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１２】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に２〜１０％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１３】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に４〜６％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１４】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に１〜３％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１５】
淡い黄色又は白色に近い色であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１６】
水に容易に溶解可能であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１７】
１％水溶液とした場合にｐＨ値が５．５〜６．５になる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１８】
抽出物のＵＶスペクトルが２１８ｎｍ及び２６３ｎｍで最大吸収を示すことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１９】
クワ植物の葉から、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして９０μｇ／ｍｌ未満の抽出物を製造する方法であって、
ａ．葉材料の水又はアルコール抽出を実施する工程と；
ｂ．強酸性陽イオン交換樹脂を用い、水で洗浄し、アンモニア溶液で溶出し、溶出液を回収して、その後それからアンモニアを除去する、カラムクロマトグラフィーによる精製工程と；
ｃ．溶出液を、マクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、溶液を回収する工程と；
ｄ．該抽出物を濃縮し、乾燥させる工程と；
を含んでなる製造方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
ａ．植物の葉を乾燥させて、粗い粉末に調製し、その後、クワ植物の葉の量に対して５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、最大５回まで抽出工程を繰り返し、
ｂ．カラム容量に対して１〜２倍量の水でカラムを洗浄し、洗い液を捨て、その後、カラム容量に対して２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎのアンモニア水溶液で、１時間当たりカラム容量の１〜３倍量の溶出液となる流速で溶出し、そしてｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収し、
ｃ．溶液とカラム容量との割合が２０：１〜５：１の範囲になるようにカラムからの溶出を行い、及び
ｄ．乾燥させた抽出物が８０番のふるいを通過するように粉砕する、
方法。
【請求項２１】
色素沈着による状態を治療するための化粧品又は医薬品に用いるための、請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物。
【請求項２２】
メラニン生産を低下させるための、請求項２１に記載の植物抽出物。
【請求項２３】
雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫を含む、色素沈着過度により引き起こされる病気又は疾患を治療するための、請求項２１又は２２に記載の植物抽出物。
【請求項２４】
血中グルコースレベルを制御するため、又は食品若しくは飲料のグリセミック指数を低下させるために使用する、請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物。
【請求項２５】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物と、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチン、ジアセチルボルジン、アゼライン酸、オクタデセン二酸、ウンデシレノイルフェニルアラニン、カンゾウ抽出物、アロエ抽出物、クレソン抽出物、アスコフィルム抽出物、ホップ抽出物、グルタチオン、エクジソン及び／又はエラグ酸から選択される、１つ以上の皮膚美白剤の組み合わせを含んでなる、化粧品又は医薬品。
【請求項２６】
ビタミンＣ誘導体がＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（ＶＣ−ＰＭＧ）である、請求項２５に記載の化粧品又は医薬品。
【請求項２７】
抽出物とその他皮膚美白剤との比が１０：１〜１：１である、請求項２５又は２６に記載の化粧品又は医薬品。
【請求項２８】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物を含んでなる、医薬品、栄養補助食品又は食品若しくは飲料用添加剤又はサプリメント。
【請求項２９】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物を含んでなる食品又は飲料。
【請求項１】
クワ植物の葉から得られ、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして９０μｇ／ｍｌ未満である植物抽出物。
【請求項２】
α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして５〜４０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の植物抽出物。
【請求項３】
定量ＨＰＬＣ及び／又はＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）で測定した場合に全イミノ糖を５〜４０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１又は２に記載の植物抽出物。
【請求項４】
全イミノ糖を８〜３０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項５】
全イミノ糖を１５〜２０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項６】
イミノ糖が、ＤＮＪ、ファゴミン、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、１，４ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、２−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−ＤＮＪ（ＧＡＬ−ＤＮＪ）及びカリステギンＢをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項７】
２０〜７０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項８】
３０〜６０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸を含んでなる、請求項７に記載の植物抽出物。
【請求項９】
４０〜５０％（ｗ／ｗ）の全アミノ酸を含んでなる、請求項８に記載の植物抽出物。
【請求項１０】
クワが
ａ．マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）
ｂ．ロソウ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ ｖａｒ．ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓ Ｌ．）
ｃ．クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）及び
ｄ．ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ）
より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１１】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に１〜２０％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１２】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に２〜１０％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１３】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に４〜６％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１４】
抽出物の総重量を基準にして算出した場合に１〜３％（ｗ／ｗ）のＤＮＪを含む、請求項３に記載の植物抽出物。
【請求項１５】
淡い黄色又は白色に近い色であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１６】
水に容易に溶解可能であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１７】
１％水溶液とした場合にｐＨ値が５．５〜６．５になる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１８】
抽出物のＵＶスペクトルが２１８ｎｍ及び２６３ｎｍで最大吸収を示すことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の植物抽出物。
【請求項１９】
クワ植物の葉から、α−グルコシダーゼＩを阻害するＩＣ５０値が濃度にして９０μｇ／ｍｌ未満の抽出物を製造する方法であって、
ａ．葉材料の水又はアルコール抽出を実施する工程と；
ｂ．強酸性陽イオン交換樹脂を用い、水で洗浄し、アンモニア溶液で溶出し、溶出液を回収して、その後それからアンモニアを除去する、カラムクロマトグラフィーによる精製工程と；
ｃ．溶出液を、マクロ多孔性吸収樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、溶液を回収する工程と；
ｄ．該抽出物を濃縮し、乾燥させる工程と；
を含んでなる製造方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
ａ．植物の葉を乾燥させて、粗い粉末に調製し、その後、クワ植物の葉の量に対して５〜１８倍量（ｗ／ｗ）の０〜４０％低分子量アルコールを用いて、最大５回まで抽出工程を繰り返し、
ｂ．カラム容量に対して１〜２倍量の水でカラムを洗浄し、洗い液を捨て、その後、カラム容量に対して２〜８倍量の０．２〜１．０Ｎのアンモニア水溶液で、１時間当たりカラム容量の１〜３倍量の溶出液となる流速で溶出し、そしてｐＨ値が９．０〜１１．０の範囲の溶出液を回収し、
ｃ．溶液とカラム容量との割合が２０：１〜５：１の範囲になるようにカラムからの溶出を行い、及び
ｄ．乾燥させた抽出物が８０番のふるいを通過するように粉砕する、
方法。
【請求項２１】
色素沈着による状態を治療するための化粧品又は医薬品に用いるための、請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物。
【請求項２２】
メラニン生産を低下させるための、請求項２１に記載の植物抽出物。
【請求項２３】
雀卵斑、肝斑、妊娠線、老人斑及び黒色腫を含む、色素沈着過度により引き起こされる病気又は疾患を治療するための、請求項２１又は２２に記載の植物抽出物。
【請求項２４】
血中グルコースレベルを制御するため、又は食品若しくは飲料のグリセミック指数を低下させるために使用する、請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物。
【請求項２５】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物と、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチン、ジアセチルボルジン、アゼライン酸、オクタデセン二酸、ウンデシレノイルフェニルアラニン、カンゾウ抽出物、アロエ抽出物、クレソン抽出物、アスコフィルム抽出物、ホップ抽出物、グルタチオン、エクジソン及び／又はエラグ酸から選択される、１つ以上の皮膚美白剤の組み合わせを含んでなる、化粧品又は医薬品。
【請求項２６】
ビタミンＣ誘導体がＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（ＶＣ−ＰＭＧ）である、請求項２５に記載の化粧品又は医薬品。
【請求項２７】
抽出物とその他皮膚美白剤との比が１０：１〜１：１である、請求項２５又は２６に記載の化粧品又は医薬品。
【請求項２８】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物を含んでなる、医薬品、栄養補助食品又は食品若しくは飲料用添加剤又はサプリメント。
【請求項２９】
請求項１〜１８に記載の植物抽出物、又は、請求項１９又は２０に記載の方法による植物抽出物を含んでなる食品又は飲料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５０４６０７（Ｐ２０１３−５０４６０７Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９１１４（Ｐ２０１２−５２９１１４）
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７６９８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３２５０２
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５１２０６８６７３）ボタニック センチュリー（ベイジン）カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７６９８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３２５０２
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５１２０６８６７３）ボタニック センチュリー（ベイジン）カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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