癌および血管新生の治療のための、化学療法剤と組み合わせたベンゾキノン誘導体Ｅ３３３０
癌および血管新生の治療的処置のための新規な方法が開示される。酵素Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、その酸化還元機能を介して、癌の進行に関連する転写因子のＤＮＡ結合活性を高める。本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害するため、およびこれにより腫瘍細胞の成長、生存、遊走および転移を減少させるための薬剤の使用を記載する。加えて、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害活性は、他の治療剤の治療効果を増大させ、かつ毒性から正常細胞を保護することが示される。さらに、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害は、癌および血管新生の変性が構成要素である他の病態の治療における使用のために、血管新生を減少させることが示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６０／９８９，５６６号、および２００７年９月２６日出願の同第６０／９７５，３９６号に基づく優先権を主張する。これらの開示全体を、参照により本願明細書に援用したものとする。
【０００２】
本発明は、大きくは分子生物学、生化学、および病理学の分野に関する。より具体的には、特定の態様では、本発明は、癌の治療のための、および血管新生の阻害のためのＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１酸化還元阻害剤の使用に関する。
【０００３】
脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ（Ａｐｅ１）は酸化還元エフェクター因子（Ｒｅｆ−１）（以降、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１）としても知られ、これは二重の役割を備えた酵素である。そのＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）活性に加えて、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、転写因子を活性な還元された状態に維持する酸化還元エフェクターとしても機能する（図１を参照）。
【０００４】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、ＨＩＦ−１α、ＮＦκβ、ＡＰ−１およびｐ５３、および既知および未知の他のものなどの、腫瘍の生存および進行に関連するいくつかの転写因子のＤＮＡ結合活性を刺激することが示されている（非特許文献１）。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の発現は、乳癌、子宮頚癌、胚細胞腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、および多発性骨髄腫を含めた様々な癌において変性されていることが示されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。高いＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の発現は、放射線化学療法に対する成果の低さ、著効速度の低さ、局所的な再発のない間隔の短さ、低い生存、および高い血管新生とも関連付けられている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
血管新生は癌の成長、生存、遊走、および転移の重要な構成要素である。癌性腫瘍の部位での新しい血管の形成によって、加速された腫瘍増殖および膨張のための栄養素の供給源、ならびに腫瘍細胞が血流に侵入して身体の他の部分に広がるための経路が提供される。従って、血管新生の効果的な阻害は、癌の増殖および広がりを遅らせるまたは防ぐための有用な機序である。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１活性の増大は、血管新生と関連付けられている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の低酸素応答エレメント（ｈｙｐｏｘｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）上に形成される低酸素症誘導性の転写複合体の構成要素である（非特許文献９）。
【０００６】
癌に加えて、血管新生の変性は、とりわけ、心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症に関連する病態に寄与する。血管新生の阻害は、過剰な血管新生を伴う疾患の寛解または予防のための望ましい臨床成績である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｖａｎｓら Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２０００年、第４６１巻、８３頁
【非特許文献２】Ｐｕｇｌｉｓｉら Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ２００２年、第９巻、１１頁
【非特許文献３】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａｍ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２００１年、第２３巻、２３４頁
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第６１巻、２２２０頁
【非特許文献５】Ｐｕｇｌｉｓｉら Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第２１巻、４０４１頁
【非特許文献６】Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓら Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ２００１年、第５０巻、２７頁
【非特許文献７】Ｋａｋｏｌｙｒｉｓら Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９８年、第７７巻、１１６９頁
【非特許文献８】Ｂｏｂｏｌａら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第７巻、３５１０頁
【非特許文献９】Ｚｉｅｌら Ｆａｓｅｂ Ｊ ２００４年、第１８巻、９８６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の標的化された阻害は、癌および血管新生の治療に対する新規なアプローチである。１つの実施形態では、本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する抗癌用治療薬の使用に関する。別の実施形態では、本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する抗血管新生薬に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】腫瘍の生存において重要な転写因子の制御におけるＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元の役割。
【図２】ＶＥＧＦ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
【図３Ａ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図３Ｂ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ａ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｂ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図５】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図６】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図７】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図８】マトリゲル上に蒔かれたＣＢ−ＥＣＦＣ細胞を使用する毛細血管形成アッセイ。
【図９】限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）。
【図１０】塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてまたは用いずに処理された細胞における、網膜内皮細胞増殖を用いたＭＴＳ増殖アッセイ。
【図１１】網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ）−野生型／ｓｖ４０細胞の増殖に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図１２】ヒトの乳腺癌由来のＭＣＦ−７腫瘍細胞を使用するＭＴＳアッセイ。細胞生存／成長分析のために使用された３−（４−５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイ。
【図１３】ヒトの卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞を使用するＭＴＳアッセイ。
【図１４Ａ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｂ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｃ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｄ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１５】ＭＴＳアッセイにおける７２時間後の、化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１６】２４時間および４８時間における、膵腫瘍細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）およびゲムシタビン（０．２５μＭ）の効果。
【図１７】ＭＴＳ細胞生存アッセイ。
【図１８】ＭＴＳ細胞生存アッセイ。
【図１９】Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）（０〜５０ｍｇ／ｋｇ）が投与された雄のマウスにおける体重。
【図２０】種々の量でＲＮ３−３（Ｅ３３３０）を用いて処置され、そして処置後２日目、３日目、４日目または５日目において観察されたマウスの生存データ。
【図２１Ａ】２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。
【図２１Ｂ】２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。
【図２２】Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）についての薬物動態データ。
【図２３】細胞分化を促進することに対する、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）およびレチノイン酸の効果。
【図２４】アネキシン／ＰＩアッセイを使用する、図２３に記載されたようにして処置されたＨＬ−６０細胞のアポトーシス分析。
【図２５】ＲＮ３−３（Ｅ３３３０）および種々の用量のＲＡの効果。
【図２６】アポトーシスを受けるＨＬ−６０細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）およびＲＡの効果（アネキシン／ＰＩアッセイ）。
【図２７Ａ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｂ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｃ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｄ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する抗癌剤および抗血管新生薬の使用に関する。このような選択的な阻害には、特異的阻害、すなわち換言すれば、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１のＢＥＲ機能に対する効果はまったくないかまたは認められる程度の効果はない場合、および主たる効果がこのＢＥＲ機能と比べてその酸化還元機能に対してのものである場合が含まれる。さらなる化学療法薬／治療薬と組み合わせたこのような薬剤の使用もまた、本発明によって包含される。この他の薬剤はＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤とは異なる方法で被験体に対して作用することが望ましい。
【００１１】
血管新生の変性に関連する生理学的障害は、直接または間接的にその被験体に有害である不適切な血管新生に関連する障害を包含する。血管新生の変性は、とりわけ、癌（増殖、生存、遊走、微小環境効果、および転移を含む）、および心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症に関連する病態に寄与する。
【００１２】
用語「被験体」は、脊椎動物を含み、好ましくはヒト被験体である。用語「阻害する」およびその派生語は、その一般に受け入れられた意味を含み、それは、進行もしくは重症度を防止すること、予防すること、抑制すること、および緩慢化すること、停止すること、または逆転させることを包含する。従って、本発明の方法は、必要に応じて、医学的な治療のための投与および予防的投与の両方を含む。従って、それを必要とする被験体は、本発明の治療用途に関連する場合、医学的介入を必要とするかまたはそれを望むと特定される被験体である。有効量は、本願明細書に記載される病理学的な疾患および障害を阻害するのに必要な薬剤の量である。少なくとも１つのさらなる治療薬が被験体に投与される場合、このような薬剤の恩恵を得るために、これらの薬剤は、逐次的に、同時発生的に、または同時に投与されてもよい。
【００１３】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能は、下記の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（以降、「Ｅ３３３０」。本願明細書では「ＲＮ３−３」とも呼ばれる）によって選択的に阻害されることが見出された。
【化１】
【００１４】
Ｅ３３３００に関するさらなる情報は、Ａｂｅら、米国特許第５，２１０，２３９号（全体を、参照により本願明細書に援用したものとする）に見出すことができる。特に、調製のためのプロセス、処方物、および薬学的に許容できる塩が記載されている。
【００１５】
興味深いことに、本発明者らの研究により、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の選択的な遮断は、正常細胞においてアポトーシスをまったく引き起こさないか、またははっきりと認識できるアポトーシスをまったく引き起こさないことが示された。癌性細胞におけるアポトーシスの増加をもたらす選択的な遮断は正常細胞も損なうであろうと予想されるのも、非常にもっともである。しかしながら、本発明者らは本発明の場合はこれが当てはまらないことを見出した。
【００１６】
被験体へ施用、特にヒトでの施用が企図される場合には、意図された施用に適した形態で医薬組成物を調製することが必要となるであろう。一般に、これは、被験体にとって有害である可能性がある不純物を実質的に含まない組成物を調製することを必要とするであろう。
【００１７】
これらの薬剤は、その被験体の体重および疾患の進行の程度に基づく用量で、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、胸膜内投与または腹腔内投与することができ、そして１日に１回、２回またはさらには４回の投与で与えられてもよい。
【００１８】
薬剤を安定にして標的細胞による吸収を可能にするために、一般に、適切な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。本発明の水系組成物は、薬学的に許容できる担体または水系媒体の中に溶解または分散された有効量の当該薬剤を含む。このような組成物は無害であるとも呼ばれる。語句「薬学的にまたは薬理学的に許容できる」は、被験体に投与されたときに、有害反応、アレルギー反応、または他の副作用をもたらさない分子実体および組成物を指す。本願明細書で使用する場合、薬学的に許容できる担体には、いずれかのおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。補完的な活性成分もその組成物の中に組み込むことができる。
【００１９】
本発明で使用するための組成物は、古くから使用されている医薬調剤を含んでいてもよい。本発明に係るこれらの組成物の投与は、標的組織がいずれかの一般的な経路を介して利用可能である限り、そのいずれかの一般的な経路を介してとなろう。これには、経口経路、鼻内経路、口腔経路、直腸経路、膣内経路または局所経路が含まれる。あるいは、投与は同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射または静脈注射によってもよい。このような組成物は、通常、上記の薬学的に許容できる組成物として投与されることになろう。
【００２０】
例えば、この化合物は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体とともに処方することができ、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などへと成形することができる。このような処方物に適した賦形剤、希釈剤、および担体の例としては、以下のものが挙げられる：デンプン、糖類、マンニトール、およびケイ酸誘導体などの充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン、およびポリビニルピロリドンなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの、溶解を遅延させるための薬剤；第四級アンモニウム化合物などの再吸収促進剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールなどの表面活性剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、および固体ポリエチルグリコールなどの滑沢剤。
【００２１】
当該活性化合物は、非経口投与または腹腔内投与されてもよい。遊離塩基または薬理学的に許容できる塩としての当該活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の中、および油の中でも調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【００２２】
注射用途に適した医薬品形態には、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌された粉末が含まれる。すべての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度までは流動性を持たなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なこれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってよい。適正な流動性は、例えば、コーティング（レシチンなど）の使用によって、分散液の場合の必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルなどによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、当該組成物において吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを使用することによってもたらされうる。
【００２３】
滅菌された注射可能な溶液は、必要とされる量の当該活性化合物を必要に応じて種々の上に列挙された他の成分とともに適切な溶媒の中に組み込み、次いで濾過滅菌することによって、調製される。一般に、分散液は、基礎となる分散媒体および上に列挙された成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌された溶媒の中へと、種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合には、好ましい調製方法は、いずれかのさらなる所望の成分を加えた当該活性成分のそれまでに滅菌濾過された溶液から、それらの粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００２４】
経口投与のために、本発明の薬剤は、賦形剤とともに組み込まれて、摂取されないうがい薬および歯磨剤の形態で使用されてもよい。うがい薬は、必要とされる量の活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒の中で組み込むことによって調製されてもよい。あるいは、この活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する殺菌洗浄液に組み込まれてもよい。この活性成分は、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含めた歯磨剤の中に分散されてもよい。この活性成分は、水、結合剤、研磨剤、矯味矯臭剤、発泡剤、および湿潤剤を含んでいてもよいペースト状歯磨剤に、治療上有効量で加えられてもよい。
【００２５】
本発明で使用するための組成物は、中性または塩の形態で処方されてもよい。薬学的に許容できる塩としては、（タンパク質の遊離のアミノ基とともに形成される）酸付加塩が挙げられ、これは、例えば塩化水素酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基とともに形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００２６】
処方の後に、溶液は、投薬量処方物と適合した様式でかつ治療上有効な量で投与されるであろう。この処方物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。水溶液における非経口投与については、例えば、その溶液は必要に応じて適切に緩衝化されているべきであり、その液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはブドウ糖を用いて等張性にされているべきである。これらの特定の水溶液は、とりわけ静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適している。これに関連して、用いることができる滅菌された水系媒体は、本開示を参酌すれば当業者には分かるであろう。例えば、一投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解することができ、そして１０００ｍｌの皮下注入液に加えることができるし、または提案された注入部位で注入することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照）。治療しようとする被験体の状態に応じて、いくらかの投薬量の変更が必然的に起こるであろう。いずれにしても、投与に関与する者は、個々の被験体についての適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与については、調剤はＦＤＡおよび外国の対応する部局によって要求されるような無菌状態、一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。
【実施例】
【００２７】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の阻害は、ＶＥＧＦの放出を減少させ、毛細血管形成（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を弱め、そして大きな細胞数のコロニーの成長を阻害することが示された。このことは抗血管新生活性を表す。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００２８】
ＶＥＧＦの放出の阻害
ＶＥＧＦ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。種々の癌細胞株を２４穴プレートに蒔き、正常酸素圧（約２１％酸素）または低酸素（約２％酸素）の条件において、約２４時間、二重に処置した。細胞の上清を集め、製造業者（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州、ミネアポリス）に従って、ヒトのＶＥＧＦに特異的なキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイ供した。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、５４０ｎｍにおける補正を加えて４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、９６穴形式のプレートリーダーの中で、読み取った。低酸素は、ＶＥＧＦの放出の増加を誘導した（図２）。（図２〜７については、黒い棒＝酸素正常状態；灰色の棒＝低酸素）。
【００２９】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｈｅｙ−Ｃ２（卵嚢癌）、ＳＫＯＶ−３Ｘ（卵嚢癌）、Ｐａｎｃ１（膵臓癌）、ＰａＣａ−２（膵臓癌）、およびＩｇｒｏｖ（卵嚢癌）細胞を２４穴プレートの中に蒔き、正常酸素圧（約２１％酸素）または低酸素（約２％酸素）の条件において、異なる濃度で約２４時間、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３ｅ）で二重に処置した。細胞の上清を集め、製造業者（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州、ミネアポリス）に従って、ヒトのＶＥＧＦに特異的なキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイ供した。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、５４０ｎｍにおける補正を加えて４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、９６穴形式のプレートリーダーの中で、読み取った。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３ｅ）は、酸素正常状態および低酸素の条件下ともに、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１酸化還元機能の阻害を通して、これらの細胞からのＶＥＧＦ放出の量を減少させた（図２〜７）。
【００３０】
毛細血管形成の阻害
毛細血管形成アッセイを、マトリゲル上に蒔いたＣＢ−ＥＣＦＣ細胞を使用して実施し、Ｅ３３３０または対照培地で処置した。ＥＣＦＣは、以前に記載されたようにして培養した（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。ＥＣＦＣコロニーは、培養の５〜２２日間の間に現れた。コロニーを、４０倍の倍率の下で倒立顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ニューヨーク州、レークサクセス）を使用して目視検査によって数えた。細胞は、以前に記載されたようにして継代させた（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。
【００３１】
この管形成アッセイは、以前に記載されたようにして実施した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４（１９９９）、３５５６２−３５５７０頁）。播種の前にＣＢ−ＥＣＦＣに室温で約３０分間種々の濃度のＥ３３３０を与え、そして約１×１０４細胞／ウェルの密度でマトリゲルの層の上へと蒔いた。約８時間後、無作為に選んだ領域からの完全な管の閉じたネットワークを数え、顕微鏡の下で写真撮影した。Ｅ３３３０およびその類似体は管形成を阻害した。これは、抗血管新生および増殖阻害の指標である（図８）。
【００３２】
限界希釈アッセイ
Ｅ３３３０は、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）において大きい細胞数のコロニーの成長を阻害する。これも抗血管新生の指標である（図９）。ＥＣＦＣは以前に記載されたようにして培養した（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。ＥＣＦＣコロニーは、培養の５〜２２日間の間に現れた。コロニーおよび１コロニーあたりの細胞の数は、倒立顕微鏡を使用して目視検査により数えた。Ｅ３３３０は、この限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）において大きい細胞数のコロニーの成長を阻害した。これも抗血管新生の指標である。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）の量を増加させると、大きい細胞数を有するコロニーの数の減少、および少ない細胞数しか有しないコロニーの増加につながる（これは、細胞成長の阻害を表す）（図９）。（図９では、棒は、左から右へ、ＥｔＯＨ、および２５μＭ、３７．５μＭ、および５０μＭで投与されたＥ３３０である）。
【００３３】
内皮細胞増殖の阻害
約１０〜１００μＭのＥ３３３０は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてまたは用いずに処理した細胞において、網膜内皮細胞増殖を減少させた。若齢成熟マウスの網膜組織を剥離し、消化した。細胞を２４穴プレートに蒔き、コンフルエンスまで成長させ、次いでアッセイのために９６穴プレートへと播種した。播種から３日後、ＭＴＳ測定（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって全細胞数をアッセイした。増殖速度は、製造業者の説明書に従って算出した。異なる群からのＲＥＣの増殖を、統計的有意性について比較した。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）はＲＥＣ増殖を遮断し、これは抗血管形成効果を示す（図１０）。
【００３４】
１０〜１００μＭのＥ３３３０は、網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ）の細胞増殖を減少させた（図１１）。基礎培地では、Ｅ３３３０は、試験したすべての４つの濃度でＲＥＶＣ細胞増殖を阻害した；１０μＭ−５７％、２５μＭ−９３％（ｐ＜０．０１）。ＲＥＣ増殖は、ｂＦＧＦがこの培地の中に添加された場合には、有意に高められた。類似の阻害効果は、１０μＭ、２５μＭ、およびより高い濃度のＥ３３３０において、ｂＦＧＦ培地でも見られた。
【００３５】
インビトロ管形成アッセイ
加えて、インビトロ管形成を観察するアッセイにおいて、アバスチンのようなＥ３３３０は、内皮細胞における血管のような細管の形成を用量依存的な様式で防止するということが観察された。そのアッセイでは、アバスチンおよびＥ３３３０の併用はいずれのもの単独よりも相乗的に効果的であることも観察された。
【００３６】
ｖｌｄｌｒ−／− ノックアウトマウスアッセイにおけるＳＮＶ
Ｅ３３３０ 硝子体内処置はｖｌｄｌｒ−／− 網膜における網膜下の血管化（ＳＮＶ）の数を有意に減少させることが観察されている。ｖｌｄｌｒ−／− 変異体におけるＳＮＶ発生の阻害に対するＥ３３３０の効果を明らかにするために、非常に低密度のリポタンパク質受容体（ｖｌｄｒ）ノックアウトマウスにおいて実験を行った。各動物に溶媒対照としての１μｌの体積のＢＳＳの１回の硝子体内注射を与え、他眼に１μｌの２００μｍのＥ３３３０を与えた。Ｅ３３３０の最終濃度は、網膜においておよそ２０μＭと等価であった。ＳＮＶの定量的測定は、処置の一週間後に、レクチン−ＦＩＴＣ染色（ｓｔａｎｉｎｇ）の後の全載網膜において実施した。その結果は、１７／２０個体がＥ３３３０で処置された眼において、約３０％の減少で、ＳＮＶの数を減少させたことを示した。対照的に、アバスチン（ＶＥＧＦ抗体）処置もｂＦＧＦ抗体処置も、いずれもＳＮＶの数の阻害の徴候をまったく示さなかった。抗体注入後のＳＮＶの見かけの増加は、以前に報告されている（Ｔａｔｏｒら、２００８）外来のタンパク質によって誘発された免疫応答に起因する可能性が高かった。Ｅ３３３０は、統計的に有意な水準で（対応のあるｔ−検定においてｐ＜０．０１）、ＳＮＶの数を減少させた。網膜内血管腫状増殖（ＲＡＰ）のこのモデルは、ヒトと同様に、治療することが難しく、そして抗ＶＥＧＦ薬および抗ｂＦＧＦ薬を含めた現在の利用可能な治療に対しては良好に反応しないため、これらのデータは非常に期待を抱かせる。このＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害剤は、加齢黄斑変性症（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＡＭＤ）治療のために血管新生を調節するための新しいアプローチを提供する。
【００３７】
本発明はまた、抗癌療法としてＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する薬剤の使用を包含する。このような癌としては、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、子宮頚癌、胚細胞性腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、白血病、および多発性骨髄腫が挙げられる。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、ＨＩＦ−１α、ＮＦκβ、ＡＰ−１およびｐ５３などの、腫瘍の生存および進行に関連するいくつかの転写因子のＤＮＡ結合活性を刺激することが示されている。Ｅ３３３０によるＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の選択的な阻害は、ＤＮＡへの転写因子の結合を減少させ、癌細胞が成育する能力を弱める。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００３８】
癌細胞生存の減少
ＭＣＦ−７またはＯＶＣＡＲ−３細胞（約２〜４，０００）を９６穴プレートの各ウェルに三重に小分けし、一晩接着させた。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）をこの培養物に加えた。約２４時間後または７２時間後、約０．０５ｍｇ／ｍＬの３−（４−５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）試薬を各ウェルに加え、約３７℃で約４時間インキュベーションした後に、４９０ｎｍで吸光度測定を行った。値は、培地だけを含むウェルに対して標準化した。独立に、Ｅ３３３０は、ヒトの乳腺癌由来のＭＣＦ−７腫瘍細胞（図１２）およびヒトの卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞（図１３）を用量依存的に死滅させた。類似の効果は、多発性骨髄腫、前立腺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、および神経膠腫由来の細胞でも見ることができる。対照的に、造血胚細胞などの正常細胞を用いた本発明者らの研究における、またはヒトのＣＤ３４＋前駆細胞における有意な増殖阻害は観察されなかった。これらのデータは、それらが癌におけるＡｐｅ１／ＲＥＦ−１の酸化還元の役割の関与を示唆するという点で新規であるが、「正常」細胞生存を示唆するという点では新規ではない。
【００３９】
神経膠腫細胞遊走アッセイ
Ｅ３３３０がＳＦ７６７神経膠腫細胞の遊走能力を阻害するかどうかを明らかにするために、Ｅ３３３０を試験した。これを行うために、本発明者らは、１．５×１０６個のＳＦ７６７細胞を６０ｍｍの組織培養皿に蒔き、それらを一晩付着させ、コンフルエントな単層を形成させた。以前に記載されたようにして（Ｌｉａｎｇ ２００７）、２００μＬピペットの先を使用してひっかきまたは創傷をそのプレートにわたって作製した。次いでこれらの細胞を洗い流して浮遊細胞を除去し、培地は２５、５０、７５もしくは１００μＭのＥ３３３０または適切な溶媒対照、ＤＭＳＯを含んでいる。２４時間後にこの薬物含有培地を除去し、新しい培地を加えた。薬物を加えてから０、２４、３６および４８時間後に、３つの印をつけた場所でひっかきに沿って画像を撮影した。Ｓｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ディアグノスティック・インスツルメンツ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ミシガン州、スターリングハイツ）を使用して、そのひっかきの先端の端縁間のミクロン（１０−６ｍ）単位での距離を測定することにより、撮影された各画像について１０個の均一な場所で遊走を定量した。各データの組、各データポイントについて全部で３０、を０時間における溶媒対照の遊走に対して正規化し、標準偏差を決定するために使用した。この結果は、Ｅ３３３０はＳＦ７６７細胞が遊走する能力を阻害し、４８時間において、１００μＭのＥ３３３０で処置した細胞では溶媒対照と比べて４．０倍も大きい阻害を呈したことを示す。
【００４０】
本発明者らの結果は、微小環境、または間質に対する効果を支持する。この微小環境は癌細胞それ自体とは別個のものであるが、それは転移を含めた腫瘍の進行において一定の役割を果たす。それは、その腫瘍に対する治療剤のアクセスを制限し、薬物代謝を変え、そして薬物耐性に寄与する可能性がある。明らかに、この微小環境に影響を及ぼすことができるということは、腫瘍に対して成し遂げられる最終的な治療の結果を支援することができる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、他の治療剤と組み合わせたＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する薬剤の使用に関する。このような治療剤としては、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、メトキシアミン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸（ＲＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。選択的なＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害は、他の治療剤と相乗的に作用して抗癌有効性を高めることができる。従って、より高用量では病気を引き起こしかつ正常細胞にとって毒性である治療剤を、抗癌有効性の減少なしに、より少ない用量で投与することができる。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤の使用は、シスプラチンおよび他の化学毒性のある化合物の効果からの正常細胞にとっての保護をもたらすことができる。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００４２】
化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０
化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０は、多発性骨髄腫細胞の死滅を相乗的に高めた（図１４）。相乗的なプロットを、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを使用して作製した。Ｅ３３３０を単独でまたはメルファランと組み合わせて与えた。二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の指標として、Ｓｅｒ１３９におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を、アップステート・セル・シグナリング・ソリューションズ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（メリーランド州、ウォルサム）から入手したリン酸化特異的Ｈ２ＡＸ抗体を用いて測定した。細胞は、メルファラン単独またはＥ３３３０を加えたメルファランで処置した。薬物処置後、指数関数的に成長する細胞を採取し、冷ＰＢＳの中で洗浄し、約１００μＬの上記のＲＩＰＡアッセイ緩衝液に溶解した。タンパク質を定量し、ＳＤＳゲル添加液の中で１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（約１：１０００）または抗アクチン抗体（約１：１０００；添加対照として。ラブビジョン社（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州、フレモント）を使用して、以前に記載されたようにしてタンパク質のレベルについて調べた。ロッシュ・アプライド・バイオサイエンシーズ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（インディアナ州、インディアナポリス）から入手した化学発光キットを使用してバンドを検出した。このバンドを、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して可視化し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃソフトウェア、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．６．１を使用して定量化した。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を加えたメルファランの中では、メルファラン単独と比べてＤＳＢの増加がある。
【００４３】
化学療法薬メルファランと組み合わせてＥ３３３０（ＲＮ３−３）を加え、これが、ＭＴＳアッセイにおいて７２時間後には、多発性骨髄腫細胞の死滅を相乗的に高めることを見出した（図１５）。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を単独でまたはメルファランと組み合わせてのいずれかとして与え、そしてＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズム（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２２、２７−５５）に基づくＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアにより、％対照に対してＥＤ５０をプロットした。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を加えたメルファランは、いずれの薬剤単独よりも有効であった。
【００４４】
化学療法薬ゲムシタビンと組み合わせたＥ３３３０
Ｅ３３３０は、膵腫瘍細胞においてゲムシタビン（約０．２５μＭ）のアポトーシス誘導効果を高めた（図１６）。アポトーシスについて細胞を分析するために、細胞を蒔き、一晩付着させた。細胞をＥ３３３０単独で、またはゲムシタビンを加えたＥ３３３０で処置した。処置後約２４時間および４８時間でアポトーシスをアッセイした。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、氷冷したＰＢＳの中で洗浄し、１×結合緩衝液［約１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２］中に再懸濁した。以前に記載されたようにして（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３、２６０−２６７、２００７年１月１日）、ヨウ化プロピジウムと組み合わせたＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン）からＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ アネキシンＶを使用してアポトーシスを分析した。非常にアネキシン陽性である細胞を、アポトーシスについて陽性であると考えた。試料は、インディアナ大学癌センター（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のフローサイトメトリ施設でフローサイトメトリによって分析した。
【００４５】
化学療法薬シスプラチンと組み合わせたＥ３３３０
ＭＴＳ細胞生存アッセイによって測定したところ、約１２０μＭもの高いＥ３３３０の濃度でも、最高約７２時間まで、培養液中で成長するラットの後根神経節細胞の生存を弱めなかった（図１７）。有糸分裂後のＤＲＧ細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果はなかった。これは、非分裂細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の無毒な効果を示す。
【００４６】
ＤＲＧ細胞培養および処置は、Ｅ３３３０だけを単独で使用する以前に公開された手順（ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ 第４巻、第３号、２００５年３月２日、３６７−３７９頁）と同様にして実施した。さらに、Ｅ３３３０は、ラットの後根神経節細胞に投与されたとき、化学療法薬シスプラチンの神経毒性効果に対する保護をもたらした（図１８）。このことは、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）はいくつかの化学療法剤を高めつつも、それは、分裂していない分裂終了細胞（例えばＤＲＧ細胞）に対する保護効果を、化学療法剤の存在下でさえも有するということを実証する。
【００４７】
レチノイン酸と組み合わせたＥ３３３０
Ｅ３３３０は、細胞分化を促進することに対するレチノイン酸の効果を高めた（図２３）。示した濃度での溶媒（ＥｔＯＨ；対照）、Ｅ３３３０、レチノイン酸（ＲＡ）、またはＥ３３３０およびＲＡ、のいずれかでＨＬ−６０細胞を処置し、６日目に形態を測定した。形態の分析から、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）で処置したＨＬ−６０細胞の分化の増加が示された。６日目のＨＬ−６０細胞のアポトーシス分析から、Ｅ３３３０およびＲＡの組み合わせは、Ｅ３３３０単独で処置した細胞に比べてアポトーシスを受ける細胞の数の増加を示し、そして２５μＭの用量のＥ３３３０において、ＲＡ単独と比べて約１．５倍の増加を示すということが明らかになった（図２４）。
【００４８】
Ｅ３３３０は、１０００倍低いＲＡの用量でＲＡの効果を高めたが、より高いＲＡの用量を用いた場合と同様のレベルの分化をもたらした。ＨＬ−６０分化についてのマーカーであるＣＤ１１は、Ｅ３３３０をＲＡに加えると、より高いＲＡの用量の場合と同じレベルの分化を有するために約１０００倍（３桁）少ないＲＡしか必要とはされなくなるということを実証した（図２５）。
【００４９】
Ｅ３３３０は、分化のレベルは約１０００倍も大きく高められたとしても、より低いＲＡの用量では、アポトーシスを受けるＨＬ−６０細胞のレベル（アネキシン／ＰＩアッセイ）を有意には高めなかった（図２６）。
【００５０】
これらの結果は、ＲＡを加えたＥ３３３０は細胞分化につながるが、減少されたＲＡの用量ではこれらの細胞およびモデル系におけるアポトーシスの増加にはつながらないということを示す。
【００５１】
メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０ −多発性骨髄腫細胞
ＭＴＳによってアッセイされた場合、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０は、多発性骨髄腫細胞の死滅を高めた（図２７）。データは、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズム（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２２、２７−５５）に基づくＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを使用して算出した。Ｅ３３３０は、単独で、またはメトキシアミンと組み合わせて与えた。
【００５２】
二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の指標として、Ｓｅｒ１３９におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を、アップステート・セル・シグナリング・ソリューションズ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（メリーランド州、ウォルサム）から入手したリン酸化特異的Ｈ２ＡＸ抗体を用いて測定した。細胞は、Ｅ３３３０単独またはメトキシアミンを加えたＥ３３３０で処置した。薬物処置後、指数関数的に成長する細胞を採取し、冷ＰＢＳの中で洗浄し、約１００μＬの上記のＲＩＰＡアッセイ緩衝液に溶解した。タンパク質を定量し、ＳＤＳゲル添加液の中で１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（約１：１０００）または抗アクチン抗体（約１：１０００；添加対照として、ラブビジョン社（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州、フレモント）を使用して、以前に記載されたようにしてタンパク質のレベルについて調べた。ロッシュ・アプライド・バイオサイエンシーズ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（インディアナ州、インディアナポリス）から入手した化学発光キットを使用してバンドを検出した。このバンドを、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して可視化し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ソフトウェア、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．６．１を使用して定量化した。
【００５３】
メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０ −膵臓細胞
Ｅ３３３０は、膵腫瘍においてメトキシアミンのアポトーシス誘導効果を高めた。アポトーシスについて細胞を分析するために、細胞を蒔き、一晩付着させた。細胞をＥ３３３０単独で、またはメトキシアミンを加えたＥ３３３０で処置した。処置後約２４時間および９６時間でアポトーシスをアッセイした。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、氷冷したＰＢＳの中で洗浄し、１×結合緩衝液［約１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２］中に再懸濁した。以前に記載されたようにして（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３、２６０−２６７、２００７年１月１日）、ヨウ化プロピジウムと組み合わせたＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン）からＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ アネキシンＶを使用してアポトーシスを分析した。非常にアネキシン陽性である細胞を、アポトーシスについて陽性であると考えた。試料は、インディアナ大学癌センター（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のフローサイトメトリ施設でフローサイトメトリによって分析した。
【００５４】
予備的なインビボ実験
安全性プロファイルを調べるため、およびＥ３３３０の薬物動態特性を明らかにするために、マウスにおける予備的なインビボ実験を実施した（図１９〜２２）。
【００５５】
図１９。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）（０〜５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した雄のマウスにおける体重。５０ｍｇ／ｋｇの下でＥ３３３０（ＲＮ３−３）を用いた場合にはマウス毒性は観察されなかった。マウスをＲＮ３−３（Ｅ３３３０）で処置し、処置の２日前または化合物の３つの用量での処置後のいずれかに体重測定した。
【００５６】
図２０。種々の量でＲＮ３−３（Ｅ３３３０）を用いて処置し、そして処置後２日目、３日目、４日目または５日目において観察したマウスの生存データ。全数に対する生存するマウスの数を、生存／全数として提示する。
【００５７】
図２１。２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。マウスをＥ３３３０（ＲＮ３−３）で処置し、次いで血中濃度を臨床病理・分析コア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｒｅ、ＣＰＡＣ）において検出した。時間 対 Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）の濃度をプロットし、見積もった濃度を表に示す。各時間点において３匹のマウスを使用し、データは、各時間についてプロットされた標準偏差（図示せず）を伴う平均を表す。
【００５８】
図２２。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）についての薬物動態データ。生存、体重およびＰＫ研究からのデータを集めて、この表に示す。ＲＮ３−３（Ｅ３３３０）の半減期を、雄、雌および合わせたマウスについて、それらの体重および濃度とともに測定した。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６０／９８９，５６６号、および２００７年９月２６日出願の同第６０／９７５，３９６号に基づく優先権を主張する。これらの開示全体を、参照により本願明細書に援用したものとする。
【０００２】
本発明は、大きくは分子生物学、生化学、および病理学の分野に関する。より具体的には、特定の態様では、本発明は、癌の治療のための、および血管新生の阻害のためのＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１酸化還元阻害剤の使用に関する。
【０００３】
脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ（Ａｐｅ１）は酸化還元エフェクター因子（Ｒｅｆ−１）（以降、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１）としても知られ、これは二重の役割を備えた酵素である。そのＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）活性に加えて、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、転写因子を活性な還元された状態に維持する酸化還元エフェクターとしても機能する（図１を参照）。
【０００４】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、ＨＩＦ−１α、ＮＦκβ、ＡＰ−１およびｐ５３、および既知および未知の他のものなどの、腫瘍の生存および進行に関連するいくつかの転写因子のＤＮＡ結合活性を刺激することが示されている（非特許文献１）。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の発現は、乳癌、子宮頚癌、胚細胞腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、および多発性骨髄腫を含めた様々な癌において変性されていることが示されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。高いＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の発現は、放射線化学療法に対する成果の低さ、著効速度の低さ、局所的な再発のない間隔の短さ、低い生存、および高い血管新生とも関連付けられている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
血管新生は癌の成長、生存、遊走、および転移の重要な構成要素である。癌性腫瘍の部位での新しい血管の形成によって、加速された腫瘍増殖および膨張のための栄養素の供給源、ならびに腫瘍細胞が血流に侵入して身体の他の部分に広がるための経路が提供される。従って、血管新生の効果的な阻害は、癌の増殖および広がりを遅らせるまたは防ぐための有用な機序である。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１活性の増大は、血管新生と関連付けられている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の低酸素応答エレメント（ｈｙｐｏｘｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）上に形成される低酸素症誘導性の転写複合体の構成要素である（非特許文献９）。
【０００６】
癌に加えて、血管新生の変性は、とりわけ、心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症に関連する病態に寄与する。血管新生の阻害は、過剰な血管新生を伴う疾患の寛解または予防のための望ましい臨床成績である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｖａｎｓら Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２０００年、第４６１巻、８３頁
【非特許文献２】Ｐｕｇｌｉｓｉら Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ２００２年、第９巻、１１頁
【非特許文献３】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａｍ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２００１年、第２３巻、２３４頁
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第６１巻、２２２０頁
【非特許文献５】Ｐｕｇｌｉｓｉら Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第２１巻、４０４１頁
【非特許文献６】Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓら Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ２００１年、第５０巻、２７頁
【非特許文献７】Ｋａｋｏｌｙｒｉｓら Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９８年、第７７巻、１１６９頁
【非特許文献８】Ｂｏｂｏｌａら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１年、第７巻、３５１０頁
【非特許文献９】Ｚｉｅｌら Ｆａｓｅｂ Ｊ ２００４年、第１８巻、９８６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の標的化された阻害は、癌および血管新生の治療に対する新規なアプローチである。１つの実施形態では、本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する抗癌用治療薬の使用に関する。別の実施形態では、本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する抗血管新生薬に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】腫瘍の生存において重要な転写因子の制御におけるＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元の役割。
【図２】ＶＥＧＦ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
【図３Ａ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図３Ｂ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ａ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図４Ｂ】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図５】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図６】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図７】ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図８】マトリゲル上に蒔かれたＣＢ−ＥＣＦＣ細胞を使用する毛細血管形成アッセイ。
【図９】限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）。
【図１０】塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてまたは用いずに処理された細胞における、網膜内皮細胞増殖を用いたＭＴＳ増殖アッセイ。
【図１１】網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ）−野生型／ｓｖ４０細胞の増殖に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図１２】ヒトの乳腺癌由来のＭＣＦ−７腫瘍細胞を使用するＭＴＳアッセイ。細胞生存／成長分析のために使用された３−（４−５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイ。
【図１３】ヒトの卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞を使用するＭＴＳアッセイ。
【図１４Ａ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｂ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｃ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１４Ｄ】化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１５】ＭＴＳアッセイにおける７２時間後の、化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の、多発性骨髄腫細胞に対する効果。
【図１６】２４時間および４８時間における、膵腫瘍細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）およびゲムシタビン（０．２５μＭ）の効果。
【図１７】ＭＴＳ細胞生存アッセイ。
【図１８】ＭＴＳ細胞生存アッセイ。
【図１９】Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）（０〜５０ｍｇ／ｋｇ）が投与された雄のマウスにおける体重。
【図２０】種々の量でＲＮ３−３（Ｅ３３３０）を用いて処置され、そして処置後２日目、３日目、４日目または５日目において観察されたマウスの生存データ。
【図２１Ａ】２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。
【図２１Ｂ】２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。
【図２２】Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）についての薬物動態データ。
【図２３】細胞分化を促進することに対する、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）およびレチノイン酸の効果。
【図２４】アネキシン／ＰＩアッセイを使用する、図２３に記載されたようにして処置されたＨＬ−６０細胞のアポトーシス分析。
【図２５】ＲＮ３−３（Ｅ３３３０）および種々の用量のＲＡの効果。
【図２６】アポトーシスを受けるＨＬ−６０細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）およびＲＡの効果（アネキシン／ＰＩアッセイ）。
【図２７Ａ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｂ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｃ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【図２７Ｄ】多発性骨髄腫細胞に対する、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する抗癌剤および抗血管新生薬の使用に関する。このような選択的な阻害には、特異的阻害、すなわち換言すれば、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１のＢＥＲ機能に対する効果はまったくないかまたは認められる程度の効果はない場合、および主たる効果がこのＢＥＲ機能と比べてその酸化還元機能に対してのものである場合が含まれる。さらなる化学療法薬／治療薬と組み合わせたこのような薬剤の使用もまた、本発明によって包含される。この他の薬剤はＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤とは異なる方法で被験体に対して作用することが望ましい。
【００１１】
血管新生の変性に関連する生理学的障害は、直接または間接的にその被験体に有害である不適切な血管新生に関連する障害を包含する。血管新生の変性は、とりわけ、癌（増殖、生存、遊走、微小環境効果、および転移を含む）、および心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症に関連する病態に寄与する。
【００１２】
用語「被験体」は、脊椎動物を含み、好ましくはヒト被験体である。用語「阻害する」およびその派生語は、その一般に受け入れられた意味を含み、それは、進行もしくは重症度を防止すること、予防すること、抑制すること、および緩慢化すること、停止すること、または逆転させることを包含する。従って、本発明の方法は、必要に応じて、医学的な治療のための投与および予防的投与の両方を含む。従って、それを必要とする被験体は、本発明の治療用途に関連する場合、医学的介入を必要とするかまたはそれを望むと特定される被験体である。有効量は、本願明細書に記載される病理学的な疾患および障害を阻害するのに必要な薬剤の量である。少なくとも１つのさらなる治療薬が被験体に投与される場合、このような薬剤の恩恵を得るために、これらの薬剤は、逐次的に、同時発生的に、または同時に投与されてもよい。
【００１３】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能は、下記の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（以降、「Ｅ３３３０」。本願明細書では「ＲＮ３−３」とも呼ばれる）によって選択的に阻害されることが見出された。
【化１】
【００１４】
Ｅ３３３００に関するさらなる情報は、Ａｂｅら、米国特許第５，２１０，２３９号（全体を、参照により本願明細書に援用したものとする）に見出すことができる。特に、調製のためのプロセス、処方物、および薬学的に許容できる塩が記載されている。
【００１５】
興味深いことに、本発明者らの研究により、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の選択的な遮断は、正常細胞においてアポトーシスをまったく引き起こさないか、またははっきりと認識できるアポトーシスをまったく引き起こさないことが示された。癌性細胞におけるアポトーシスの増加をもたらす選択的な遮断は正常細胞も損なうであろうと予想されるのも、非常にもっともである。しかしながら、本発明者らは本発明の場合はこれが当てはまらないことを見出した。
【００１６】
被験体へ施用、特にヒトでの施用が企図される場合には、意図された施用に適した形態で医薬組成物を調製することが必要となるであろう。一般に、これは、被験体にとって有害である可能性がある不純物を実質的に含まない組成物を調製することを必要とするであろう。
【００１７】
これらの薬剤は、その被験体の体重および疾患の進行の程度に基づく用量で、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、胸膜内投与または腹腔内投与することができ、そして１日に１回、２回またはさらには４回の投与で与えられてもよい。
【００１８】
薬剤を安定にして標的細胞による吸収を可能にするために、一般に、適切な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。本発明の水系組成物は、薬学的に許容できる担体または水系媒体の中に溶解または分散された有効量の当該薬剤を含む。このような組成物は無害であるとも呼ばれる。語句「薬学的にまたは薬理学的に許容できる」は、被験体に投与されたときに、有害反応、アレルギー反応、または他の副作用をもたらさない分子実体および組成物を指す。本願明細書で使用する場合、薬学的に許容できる担体には、いずれかのおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。補完的な活性成分もその組成物の中に組み込むことができる。
【００１９】
本発明で使用するための組成物は、古くから使用されている医薬調剤を含んでいてもよい。本発明に係るこれらの組成物の投与は、標的組織がいずれかの一般的な経路を介して利用可能である限り、そのいずれかの一般的な経路を介してとなろう。これには、経口経路、鼻内経路、口腔経路、直腸経路、膣内経路または局所経路が含まれる。あるいは、投与は同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射または静脈注射によってもよい。このような組成物は、通常、上記の薬学的に許容できる組成物として投与されることになろう。
【００２０】
例えば、この化合物は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体とともに処方することができ、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などへと成形することができる。このような処方物に適した賦形剤、希釈剤、および担体の例としては、以下のものが挙げられる：デンプン、糖類、マンニトール、およびケイ酸誘導体などの充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン、およびポリビニルピロリドンなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの、溶解を遅延させるための薬剤；第四級アンモニウム化合物などの再吸収促進剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールなどの表面活性剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、および固体ポリエチルグリコールなどの滑沢剤。
【００２１】
当該活性化合物は、非経口投与または腹腔内投与されてもよい。遊離塩基または薬理学的に許容できる塩としての当該活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の中、および油の中でも調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【００２２】
注射用途に適した医薬品形態には、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌された粉末が含まれる。すべての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度までは流動性を持たなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なこれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってよい。適正な流動性は、例えば、コーティング（レシチンなど）の使用によって、分散液の場合の必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルなどによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、当該組成物において吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを使用することによってもたらされうる。
【００２３】
滅菌された注射可能な溶液は、必要とされる量の当該活性化合物を必要に応じて種々の上に列挙された他の成分とともに適切な溶媒の中に組み込み、次いで濾過滅菌することによって、調製される。一般に、分散液は、基礎となる分散媒体および上に列挙された成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌された溶媒の中へと、種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合には、好ましい調製方法は、いずれかのさらなる所望の成分を加えた当該活性成分のそれまでに滅菌濾過された溶液から、それらの粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００２４】
経口投与のために、本発明の薬剤は、賦形剤とともに組み込まれて、摂取されないうがい薬および歯磨剤の形態で使用されてもよい。うがい薬は、必要とされる量の活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒の中で組み込むことによって調製されてもよい。あるいは、この活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する殺菌洗浄液に組み込まれてもよい。この活性成分は、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含めた歯磨剤の中に分散されてもよい。この活性成分は、水、結合剤、研磨剤、矯味矯臭剤、発泡剤、および湿潤剤を含んでいてもよいペースト状歯磨剤に、治療上有効量で加えられてもよい。
【００２５】
本発明で使用するための組成物は、中性または塩の形態で処方されてもよい。薬学的に許容できる塩としては、（タンパク質の遊離のアミノ基とともに形成される）酸付加塩が挙げられ、これは、例えば塩化水素酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基とともに形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００２６】
処方の後に、溶液は、投薬量処方物と適合した様式でかつ治療上有効な量で投与されるであろう。この処方物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。水溶液における非経口投与については、例えば、その溶液は必要に応じて適切に緩衝化されているべきであり、その液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはブドウ糖を用いて等張性にされているべきである。これらの特定の水溶液は、とりわけ静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適している。これに関連して、用いることができる滅菌された水系媒体は、本開示を参酌すれば当業者には分かるであろう。例えば、一投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解することができ、そして１０００ｍｌの皮下注入液に加えることができるし、または提案された注入部位で注入することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照）。治療しようとする被験体の状態に応じて、いくらかの投薬量の変更が必然的に起こるであろう。いずれにしても、投与に関与する者は、個々の被験体についての適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与については、調剤はＦＤＡおよび外国の対応する部局によって要求されるような無菌状態、一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。
【実施例】
【００２７】
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の阻害は、ＶＥＧＦの放出を減少させ、毛細血管形成（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を弱め、そして大きな細胞数のコロニーの成長を阻害することが示された。このことは抗血管新生活性を表す。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００２８】
ＶＥＧＦの放出の阻害
ＶＥＧＦ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。種々の癌細胞株を２４穴プレートに蒔き、正常酸素圧（約２１％酸素）または低酸素（約２％酸素）の条件において、約２４時間、二重に処置した。細胞の上清を集め、製造業者（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州、ミネアポリス）に従って、ヒトのＶＥＧＦに特異的なキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイ供した。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、５４０ｎｍにおける補正を加えて４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、９６穴形式のプレートリーダーの中で、読み取った。低酸素は、ＶＥＧＦの放出の増加を誘導した（図２）。（図２〜７については、黒い棒＝酸素正常状態；灰色の棒＝低酸素）。
【００２９】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｈｅｙ−Ｃ２（卵嚢癌）、ＳＫＯＶ−３Ｘ（卵嚢癌）、Ｐａｎｃ１（膵臓癌）、ＰａＣａ−２（膵臓癌）、およびＩｇｒｏｖ（卵嚢癌）細胞を２４穴プレートの中に蒔き、正常酸素圧（約２１％酸素）または低酸素（約２％酸素）の条件において、異なる濃度で約２４時間、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３ｅ）で二重に処置した。細胞の上清を集め、製造業者（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州、ミネアポリス）に従って、ヒトのＶＥＧＦに特異的なキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイ供した。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、５４０ｎｍにおける補正を加えて４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、９６穴形式のプレートリーダーの中で、読み取った。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３ｅ）は、酸素正常状態および低酸素の条件下ともに、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１酸化還元機能の阻害を通して、これらの細胞からのＶＥＧＦ放出の量を減少させた（図２〜７）。
【００３０】
毛細血管形成の阻害
毛細血管形成アッセイを、マトリゲル上に蒔いたＣＢ−ＥＣＦＣ細胞を使用して実施し、Ｅ３３３０または対照培地で処置した。ＥＣＦＣは、以前に記載されたようにして培養した（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。ＥＣＦＣコロニーは、培養の５〜２２日間の間に現れた。コロニーを、４０倍の倍率の下で倒立顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ニューヨーク州、レークサクセス）を使用して目視検査によって数えた。細胞は、以前に記載されたようにして継代させた（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。
【００３１】
この管形成アッセイは、以前に記載されたようにして実施した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４（１９９９）、３５５６２−３５５７０頁）。播種の前にＣＢ−ＥＣＦＣに室温で約３０分間種々の濃度のＥ３３３０を与え、そして約１×１０４細胞／ウェルの密度でマトリゲルの層の上へと蒔いた。約８時間後、無作為に選んだ領域からの完全な管の閉じたネットワークを数え、顕微鏡の下で写真撮影した。Ｅ３３３０およびその類似体は管形成を阻害した。これは、抗血管新生および増殖阻害の指標である（図８）。
【００３２】
限界希釈アッセイ
Ｅ３３３０は、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）において大きい細胞数のコロニーの成長を阻害する。これも抗血管新生の指標である（図９）。ＥＣＦＣは以前に記載されたようにして培養した（Ｂｌｏｏｄ、２００４年１１月１日、第１０４巻、第９号、２７５２−２７６０頁）。ＥＣＦＣコロニーは、培養の５〜２２日間の間に現れた。コロニーおよび１コロニーあたりの細胞の数は、倒立顕微鏡を使用して目視検査により数えた。Ｅ３３３０は、この限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）において大きい細胞数のコロニーの成長を阻害した。これも抗血管新生の指標である。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）の量を増加させると、大きい細胞数を有するコロニーの数の減少、および少ない細胞数しか有しないコロニーの増加につながる（これは、細胞成長の阻害を表す）（図９）。（図９では、棒は、左から右へ、ＥｔＯＨ、および２５μＭ、３７．５μＭ、および５０μＭで投与されたＥ３３０である）。
【００３３】
内皮細胞増殖の阻害
約１０〜１００μＭのＥ３３３０は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いてまたは用いずに処理した細胞において、網膜内皮細胞増殖を減少させた。若齢成熟マウスの網膜組織を剥離し、消化した。細胞を２４穴プレートに蒔き、コンフルエンスまで成長させ、次いでアッセイのために９６穴プレートへと播種した。播種から３日後、ＭＴＳ測定（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって全細胞数をアッセイした。増殖速度は、製造業者の説明書に従って算出した。異なる群からのＲＥＣの増殖を、統計的有意性について比較した。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）はＲＥＣ増殖を遮断し、これは抗血管形成効果を示す（図１０）。
【００３４】
１０〜１００μＭのＥ３３３０は、網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ）の細胞増殖を減少させた（図１１）。基礎培地では、Ｅ３３３０は、試験したすべての４つの濃度でＲＥＶＣ細胞増殖を阻害した；１０μＭ−５７％、２５μＭ−９３％（ｐ＜０．０１）。ＲＥＣ増殖は、ｂＦＧＦがこの培地の中に添加された場合には、有意に高められた。類似の阻害効果は、１０μＭ、２５μＭ、およびより高い濃度のＥ３３３０において、ｂＦＧＦ培地でも見られた。
【００３５】
インビトロ管形成アッセイ
加えて、インビトロ管形成を観察するアッセイにおいて、アバスチンのようなＥ３３３０は、内皮細胞における血管のような細管の形成を用量依存的な様式で防止するということが観察された。そのアッセイでは、アバスチンおよびＥ３３３０の併用はいずれのもの単独よりも相乗的に効果的であることも観察された。
【００３６】
ｖｌｄｌｒ−／− ノックアウトマウスアッセイにおけるＳＮＶ
Ｅ３３３０ 硝子体内処置はｖｌｄｌｒ−／− 網膜における網膜下の血管化（ＳＮＶ）の数を有意に減少させることが観察されている。ｖｌｄｌｒ−／− 変異体におけるＳＮＶ発生の阻害に対するＥ３３３０の効果を明らかにするために、非常に低密度のリポタンパク質受容体（ｖｌｄｒ）ノックアウトマウスにおいて実験を行った。各動物に溶媒対照としての１μｌの体積のＢＳＳの１回の硝子体内注射を与え、他眼に１μｌの２００μｍのＥ３３３０を与えた。Ｅ３３３０の最終濃度は、網膜においておよそ２０μＭと等価であった。ＳＮＶの定量的測定は、処置の一週間後に、レクチン−ＦＩＴＣ染色（ｓｔａｎｉｎｇ）の後の全載網膜において実施した。その結果は、１７／２０個体がＥ３３３０で処置された眼において、約３０％の減少で、ＳＮＶの数を減少させたことを示した。対照的に、アバスチン（ＶＥＧＦ抗体）処置もｂＦＧＦ抗体処置も、いずれもＳＮＶの数の阻害の徴候をまったく示さなかった。抗体注入後のＳＮＶの見かけの増加は、以前に報告されている（Ｔａｔｏｒら、２００８）外来のタンパク質によって誘発された免疫応答に起因する可能性が高かった。Ｅ３３３０は、統計的に有意な水準で（対応のあるｔ−検定においてｐ＜０．０１）、ＳＮＶの数を減少させた。網膜内血管腫状増殖（ＲＡＰ）のこのモデルは、ヒトと同様に、治療することが難しく、そして抗ＶＥＧＦ薬および抗ｂＦＧＦ薬を含めた現在の利用可能な治療に対しては良好に反応しないため、これらのデータは非常に期待を抱かせる。このＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害剤は、加齢黄斑変性症（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＡＭＤ）治療のために血管新生を調節するための新しいアプローチを提供する。
【００３７】
本発明はまた、抗癌療法としてＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する薬剤の使用を包含する。このような癌としては、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、子宮頚癌、胚細胞性腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、白血病、および多発性骨髄腫が挙げられる。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１は、ＨＩＦ−１α、ＮＦκβ、ＡＰ−１およびｐ５３などの、腫瘍の生存および進行に関連するいくつかの転写因子のＤＮＡ結合活性を刺激することが示されている。Ｅ３３３０によるＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の選択的な阻害は、ＤＮＡへの転写因子の結合を減少させ、癌細胞が成育する能力を弱める。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００３８】
癌細胞生存の減少
ＭＣＦ−７またはＯＶＣＡＲ−３細胞（約２〜４，０００）を９６穴プレートの各ウェルに三重に小分けし、一晩接着させた。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）をこの培養物に加えた。約２４時間後または７２時間後、約０．０５ｍｇ／ｍＬの３−（４−５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）試薬を各ウェルに加え、約３７℃で約４時間インキュベーションした後に、４９０ｎｍで吸光度測定を行った。値は、培地だけを含むウェルに対して標準化した。独立に、Ｅ３３３０は、ヒトの乳腺癌由来のＭＣＦ−７腫瘍細胞（図１２）およびヒトの卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞（図１３）を用量依存的に死滅させた。類似の効果は、多発性骨髄腫、前立腺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、および神経膠腫由来の細胞でも見ることができる。対照的に、造血胚細胞などの正常細胞を用いた本発明者らの研究における、またはヒトのＣＤ３４＋前駆細胞における有意な増殖阻害は観察されなかった。これらのデータは、それらが癌におけるＡｐｅ１／ＲＥＦ−１の酸化還元の役割の関与を示唆するという点で新規であるが、「正常」細胞生存を示唆するという点では新規ではない。
【００３９】
神経膠腫細胞遊走アッセイ
Ｅ３３３０がＳＦ７６７神経膠腫細胞の遊走能力を阻害するかどうかを明らかにするために、Ｅ３３３０を試験した。これを行うために、本発明者らは、１．５×１０６個のＳＦ７６７細胞を６０ｍｍの組織培養皿に蒔き、それらを一晩付着させ、コンフルエントな単層を形成させた。以前に記載されたようにして（Ｌｉａｎｇ ２００７）、２００μＬピペットの先を使用してひっかきまたは創傷をそのプレートにわたって作製した。次いでこれらの細胞を洗い流して浮遊細胞を除去し、培地は２５、５０、７５もしくは１００μＭのＥ３３３０または適切な溶媒対照、ＤＭＳＯを含んでいる。２４時間後にこの薬物含有培地を除去し、新しい培地を加えた。薬物を加えてから０、２４、３６および４８時間後に、３つの印をつけた場所でひっかきに沿って画像を撮影した。Ｓｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ディアグノスティック・インスツルメンツ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ミシガン州、スターリングハイツ）を使用して、そのひっかきの先端の端縁間のミクロン（１０−６ｍ）単位での距離を測定することにより、撮影された各画像について１０個の均一な場所で遊走を定量した。各データの組、各データポイントについて全部で３０、を０時間における溶媒対照の遊走に対して正規化し、標準偏差を決定するために使用した。この結果は、Ｅ３３３０はＳＦ７６７細胞が遊走する能力を阻害し、４８時間において、１００μＭのＥ３３３０で処置した細胞では溶媒対照と比べて４．０倍も大きい阻害を呈したことを示す。
【００４０】
本発明者らの結果は、微小環境、または間質に対する効果を支持する。この微小環境は癌細胞それ自体とは別個のものであるが、それは転移を含めた腫瘍の進行において一定の役割を果たす。それは、その腫瘍に対する治療剤のアクセスを制限し、薬物代謝を変え、そして薬物耐性に寄与する可能性がある。明らかに、この微小環境に影響を及ぼすことができるということは、腫瘍に対して成し遂げられる最終的な治療の結果を支援することができる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、他の治療剤と組み合わせたＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を阻害する薬剤の使用に関する。このような治療剤としては、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、メトキシアミン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸（ＲＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。選択的なＡｐｅ１／Ｒｅｆ−１阻害は、他の治療剤と相乗的に作用して抗癌有効性を高めることができる。従って、より高用量では病気を引き起こしかつ正常細胞にとって毒性である治療剤を、抗癌有効性の減少なしに、より少ない用量で投与することができる。Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤の使用は、シスプラチンおよび他の化学毒性のある化合物の効果からの正常細胞にとっての保護をもたらすことができる。以下の実施例は、例示目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００４２】
化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０
化学療法薬メルファランと組み合わせたＥ３３３０は、多発性骨髄腫細胞の死滅を相乗的に高めた（図１４）。相乗的なプロットを、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを使用して作製した。Ｅ３３３０を単独でまたはメルファランと組み合わせて与えた。二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の指標として、Ｓｅｒ１３９におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を、アップステート・セル・シグナリング・ソリューションズ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（メリーランド州、ウォルサム）から入手したリン酸化特異的Ｈ２ＡＸ抗体を用いて測定した。細胞は、メルファラン単独またはＥ３３３０を加えたメルファランで処置した。薬物処置後、指数関数的に成長する細胞を採取し、冷ＰＢＳの中で洗浄し、約１００μＬの上記のＲＩＰＡアッセイ緩衝液に溶解した。タンパク質を定量し、ＳＤＳゲル添加液の中で１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（約１：１０００）または抗アクチン抗体（約１：１０００；添加対照として。ラブビジョン社（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州、フレモント）を使用して、以前に記載されたようにしてタンパク質のレベルについて調べた。ロッシュ・アプライド・バイオサイエンシーズ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（インディアナ州、インディアナポリス）から入手した化学発光キットを使用してバンドを検出した。このバンドを、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して可視化し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃソフトウェア、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．６．１を使用して定量化した。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を加えたメルファランの中では、メルファラン単独と比べてＤＳＢの増加がある。
【００４３】
化学療法薬メルファランと組み合わせてＥ３３３０（ＲＮ３−３）を加え、これが、ＭＴＳアッセイにおいて７２時間後には、多発性骨髄腫細胞の死滅を相乗的に高めることを見出した（図１５）。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を単独でまたはメルファランと組み合わせてのいずれかとして与え、そしてＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズム（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２２、２７−５５）に基づくＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアにより、％対照に対してＥＤ５０をプロットした。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）を加えたメルファランは、いずれの薬剤単独よりも有効であった。
【００４４】
化学療法薬ゲムシタビンと組み合わせたＥ３３３０
Ｅ３３３０は、膵腫瘍細胞においてゲムシタビン（約０．２５μＭ）のアポトーシス誘導効果を高めた（図１６）。アポトーシスについて細胞を分析するために、細胞を蒔き、一晩付着させた。細胞をＥ３３３０単独で、またはゲムシタビンを加えたＥ３３３０で処置した。処置後約２４時間および４８時間でアポトーシスをアッセイした。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、氷冷したＰＢＳの中で洗浄し、１×結合緩衝液［約１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２］中に再懸濁した。以前に記載されたようにして（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３、２６０−２６７、２００７年１月１日）、ヨウ化プロピジウムと組み合わせたＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン）からＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ アネキシンＶを使用してアポトーシスを分析した。非常にアネキシン陽性である細胞を、アポトーシスについて陽性であると考えた。試料は、インディアナ大学癌センター（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のフローサイトメトリ施設でフローサイトメトリによって分析した。
【００４５】
化学療法薬シスプラチンと組み合わせたＥ３３３０
ＭＴＳ細胞生存アッセイによって測定したところ、約１２０μＭもの高いＥ３３３０の濃度でも、最高約７２時間まで、培養液中で成長するラットの後根神経節細胞の生存を弱めなかった（図１７）。有糸分裂後のＤＲＧ細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の効果はなかった。これは、非分裂細胞に対するＥ３３３０（ＲＮ３−３）の無毒な効果を示す。
【００４６】
ＤＲＧ細胞培養および処置は、Ｅ３３３０だけを単独で使用する以前に公開された手順（ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ 第４巻、第３号、２００５年３月２日、３６７−３７９頁）と同様にして実施した。さらに、Ｅ３３３０は、ラットの後根神経節細胞に投与されたとき、化学療法薬シスプラチンの神経毒性効果に対する保護をもたらした（図１８）。このことは、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）はいくつかの化学療法剤を高めつつも、それは、分裂していない分裂終了細胞（例えばＤＲＧ細胞）に対する保護効果を、化学療法剤の存在下でさえも有するということを実証する。
【００４７】
レチノイン酸と組み合わせたＥ３３３０
Ｅ３３３０は、細胞分化を促進することに対するレチノイン酸の効果を高めた（図２３）。示した濃度での溶媒（ＥｔＯＨ；対照）、Ｅ３３３０、レチノイン酸（ＲＡ）、またはＥ３３３０およびＲＡ、のいずれかでＨＬ−６０細胞を処置し、６日目に形態を測定した。形態の分析から、Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）で処置したＨＬ−６０細胞の分化の増加が示された。６日目のＨＬ−６０細胞のアポトーシス分析から、Ｅ３３３０およびＲＡの組み合わせは、Ｅ３３３０単独で処置した細胞に比べてアポトーシスを受ける細胞の数の増加を示し、そして２５μＭの用量のＥ３３３０において、ＲＡ単独と比べて約１．５倍の増加を示すということが明らかになった（図２４）。
【００４８】
Ｅ３３３０は、１０００倍低いＲＡの用量でＲＡの効果を高めたが、より高いＲＡの用量を用いた場合と同様のレベルの分化をもたらした。ＨＬ−６０分化についてのマーカーであるＣＤ１１は、Ｅ３３３０をＲＡに加えると、より高いＲＡの用量の場合と同じレベルの分化を有するために約１０００倍（３桁）少ないＲＡしか必要とはされなくなるということを実証した（図２５）。
【００４９】
Ｅ３３３０は、分化のレベルは約１０００倍も大きく高められたとしても、より低いＲＡの用量では、アポトーシスを受けるＨＬ−６０細胞のレベル（アネキシン／ＰＩアッセイ）を有意には高めなかった（図２６）。
【００５０】
これらの結果は、ＲＡを加えたＥ３３３０は細胞分化につながるが、減少されたＲＡの用量ではこれらの細胞およびモデル系におけるアポトーシスの増加にはつながらないということを示す。
【００５１】
メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０ −多発性骨髄腫細胞
ＭＴＳによってアッセイされた場合、低分子メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０は、多発性骨髄腫細胞の死滅を高めた（図２７）。データは、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズム（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２２、２７−５５）に基づくＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを使用して算出した。Ｅ３３３０は、単独で、またはメトキシアミンと組み合わせて与えた。
【００５２】
二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の指標として、Ｓｅｒ１３９におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を、アップステート・セル・シグナリング・ソリューションズ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（メリーランド州、ウォルサム）から入手したリン酸化特異的Ｈ２ＡＸ抗体を用いて測定した。細胞は、Ｅ３３３０単独またはメトキシアミンを加えたＥ３３３０で処置した。薬物処置後、指数関数的に成長する細胞を採取し、冷ＰＢＳの中で洗浄し、約１００μＬの上記のＲＩＰＡアッセイ緩衝液に溶解した。タンパク質を定量し、ＳＤＳゲル添加液の中で１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（約１：１０００）または抗アクチン抗体（約１：１０００；添加対照として、ラブビジョン社（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カリフォルニア州、フレモント）を使用して、以前に記載されたようにしてタンパク質のレベルについて調べた。ロッシュ・アプライド・バイオサイエンシーズ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（インディアナ州、インディアナポリス）から入手した化学発光キットを使用してバンドを検出した。このバンドを、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を使用して可視化し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ソフトウェア、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４．６．１を使用して定量化した。
【００５３】
メトキシアミンと組み合わせたＥ３３３０ −膵臓細胞
Ｅ３３３０は、膵腫瘍においてメトキシアミンのアポトーシス誘導効果を高めた。アポトーシスについて細胞を分析するために、細胞を蒔き、一晩付着させた。細胞をＥ３３３０単独で、またはメトキシアミンを加えたＥ３３３０で処置した。処置後約２４時間および９６時間でアポトーシスをアッセイした。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、氷冷したＰＢＳの中で洗浄し、１×結合緩衝液［約１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２］中に再懸濁した。以前に記載されたようにして（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３、２６０−２６７、２００７年１月１日）、ヨウ化プロピジウムと組み合わせたＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン）からＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ アネキシンＶを使用してアポトーシスを分析した。非常にアネキシン陽性である細胞を、アポトーシスについて陽性であると考えた。試料は、インディアナ大学癌センター（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のフローサイトメトリ施設でフローサイトメトリによって分析した。
【００５４】
予備的なインビボ実験
安全性プロファイルを調べるため、およびＥ３３３０の薬物動態特性を明らかにするために、マウスにおける予備的なインビボ実験を実施した（図１９〜２２）。
【００５５】
図１９。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）（０〜５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した雄のマウスにおける体重。５０ｍｇ／ｋｇの下でＥ３３３０（ＲＮ３−３）を用いた場合にはマウス毒性は観察されなかった。マウスをＲＮ３−３（Ｅ３３３０）で処置し、処置の２日前または化合物の３つの用量での処置後のいずれかに体重測定した。
【００５６】
図２０。種々の量でＲＮ３−３（Ｅ３３３０）を用いて処置し、そして処置後２日目、３日目、４日目または５日目において観察したマウスの生存データ。全数に対する生存するマウスの数を、生存／全数として提示する。
【００５７】
図２１。２４時間の時間的経過の実験にわたるＥ３３３０（ＲＮ３−３）の薬物動態データ。マウスをＥ３３３０（ＲＮ３−３）で処置し、次いで血中濃度を臨床病理・分析コア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｒｅ、ＣＰＡＣ）において検出した。時間 対 Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）の濃度をプロットし、見積もった濃度を表に示す。各時間点において３匹のマウスを使用し、データは、各時間についてプロットされた標準偏差（図示せず）を伴う平均を表す。
【００５８】
図２２。Ｅ３３３０（ＲＮ３−３）についての薬物動態データ。生存、体重およびＰＫ研究からのデータを集めて、この表に示す。ＲＮ３−３（Ｅ３３３０）の半減期を、雄、雌および合わせたマウスについて、それらの体重および濃度とともに測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生の変性に関連する生理学的障害を阻害するための方法であって、それを必要とする被検体に、有効量の、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が、癌、心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記さらなる治療薬が、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、メトキシアミン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌を阻害するための方法であって、それを必要とする被検体に、有効量の、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、子宮頚癌、胚細胞性腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、白血病、および多発性骨髄腫から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる治療薬が、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる治療薬がアバスチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
血管新生の変性に関連する生理学的障害を阻害するための方法であって、それを必要とする被検体に、有効量の、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が、癌、心血管疾患、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、後水晶体線維増殖症、特発性肺線維症、急性成人呼吸促迫症候群、喘息、子宮内膜症、乾癬、ケロイド、および全身性硬化症から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記さらなる治療薬が、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、メトキシアミン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌を阻害するための方法であって、それを必要とする被検体に、有効量の、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、子宮頚癌、胚細胞性腫瘍、成人および小児の神経膠腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、非小細胞性肺癌、白血病、および多発性骨髄腫から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤がＥ３３３０、またはその薬理学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる治療薬が、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、サリドマイドおよびその誘導体、ならびにレチノイン酸から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのさらなる治療薬が前記被検体に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる治療薬がアバスチンである、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２７Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２７Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５４０５４４（Ｐ２０１０−５４０５４４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７０６４（Ｐ２０１０−５２７０６４）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７７２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２５４２
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（３０１０４６７８７）インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７７２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２５４２
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（３０１０４６７８７）インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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