インテグリン受容体の遮断に対する反応者の選別方法
本発明は、インテグリン受容体の遮断に対する反応者を同定するための方法、ならびに、上記遮断を引き起こす処置が必要な患者において当該処置に対する反応性を決定するための方法に関する。さらに、本発明は上記方法に使用されるキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断（ブロック）に対する反応者を臨床研究用に選別する方法、ならびにα２β１インテグリン受容体遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法に関する。さらに、本発明は上記方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞とコラーゲンとの間の相互作用は、細胞の移動及び分化を含む多くの生理学的機能に不可欠である。しかしながら、同じ相互作用はまた、血栓形成及び癌転移のような疾患と関係があるメカニズムを促進する可能性がある。血小板を含め、細胞は、インテグリンと呼ばれる特異的コラーゲン受容体を介してコラーゲン繊維に結合する。健常な動脈壁の内皮細胞層は、循環している血小板がコラーゲンと相互作用することを防ぐ。内皮損傷部位では、コラーゲンが露出し、損傷した内皮表面に血小板が付着して、血栓形成につながる一連の事象が開始される。血小板のコラーゲンへの付着は、コラーゲン受容体であるα２β１インテグリンによって主に媒介される。α２β１インテグリンは、血小板が血流から離れて堅固に付着することを媒介することにおいて、中心的に関与する。
【０００３】
疫学研究により、血栓の発生におけるα２β１インテグリンの役割が明らかになっており、血小板表面でのα２β１インテグリンの高い発現レベルが、血栓塞栓症の症状の独立した重要な危険因子であることが示されている（非特許文献１参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０）。加えて、高いα２β１インテグリンの発現は、心筋梗塞を含む急性冠症候群と関連付けられている。α２β１の発現レベルは、６つの異なるα２対立遺伝子によって定義され、当該発現レベルに影響を与える特定の特異的多型が同定されている。発現レベルに影響を与える特定の多型の１つは、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔである。Ｔ８０７は血小板での受容体α２β１のより高い発現と関連し、Ｃ８０７はより低い発現密度と関連している（非特許文献２参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：１９３９−１９４３）。正常集団においては、α２発現のレベルには大きな個体差がある。
【０００４】
ＳＮＰ Ｔ８０７は血栓塞栓性疾患の重要な危険因子として示唆されている。具体的に、ＳＮＰ Ｔ８０７は、若年患者（≦５０歳）の脳血管発作（脳卒中）や糖尿病性網膜症のリスクに関連する。しかしながら、多くの他の研究はそのような関連を示していないことに留意しなければならない（非特許文献１参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０）。
【０００５】
このように、α２β１インテグリンの高い発現レベルと遺伝的変異体とは、血栓性疾患を起こす潜在的危険因子と考えられるが、処置に対する反応におけるそれらの役割はほとんど明らかではなく、また、α２β１インテグリン受容体の遮断に対する血小板感受性に関するα２多型の役割についての報告は不十分である。Ｒｏｚａｌｓｋｉら（非特許文献３参照：Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．，２００５，５７：１−１３）は、ＴＴ８０７遺伝子型を有する被験体が、モノクローナル抗α２β１インテグリン抗体を用いた処置に対して、ＣＣ８０７遺伝子型を有する被験体よりも良好に反応することを示している。しかしながら、この報告はヘテロ接合型ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体の反応性について触れていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０
【非特許文献２】Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：１９３９−１９４３
【非特許文献３】Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．，２００５，５７：１−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応する被験体の同定及び選別は、一般に、成功確率を有意に向上させ、臨床的使用のための新規のα２β１インテグリン阻害剤の開発費を大幅に削減するであろう。更に、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する反応性の決定により、当該処置に反応しないことが既知である患者に対して、非倫理的に当該処置を施すことが回避される。このように、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応する患者を選別する方法が当該分野で必要とされている。そのような患者は、血栓塞栓症の症状の予防、処置、及び／又は緩和において前記インテグリン受容体の阻害剤を用いた処置によって恩恵を受けるであろうし、新規の抗血栓薬の開発を目的とする臨床研究のために選別されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、α２インテグリン遺伝子型ＴＴ８０７を有する個体、及び、α２β１インテグリンの高い全体的発現レベルを伴うα２インテグリン遺伝子型ＣＴ８０７を有する個体が、α２β１受容体の遮断に反応するという驚くべき知見に基づく。
従って、本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定する方法に関する。当該方法には以下の工程が含まれる。ａ）前記被験体から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔを決定する工程、ｂ）ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に応答する被験体として同定する工程。
【０００９】
本発明はさらに、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定する方法に関する。当該方法には以下の工程が含まれる。ａ）前記患者から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、ｂ）前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示す患者として指定する工程。
【００１０】
本発明はさらに、患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防、及び／又は緩和のための方法に関し、当該方法には、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者に対して、α２β１インテグリン阻害剤を有効量投与する工程が含まれる。
【００１１】
さらに、本発明は、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することにより、反応性があると診断された患者における血栓塞栓症の症状を予防、処置、及び／又は緩和するための薬学的組成物の製造のための、α２β１インテグリン阻害剤あるいはそれらの組み合わせの使用に関する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によると、患者は、狭心症（angina pectoris）（不安定狭心症、狭心症（stenocardia）、及び、不特定狭心症を含むがこれらに限定されない）；急性心筋梗塞；亜急性心筋梗塞（再発性心筋梗塞を含む）；心筋梗塞の血栓性及び血栓塞栓性合併症；他の虚血性心疾患（心筋梗塞につながることのない冠動脈血栓を含むがこれに限定されない）；慢性虚血性心疾患；肺塞栓症；脳梗塞（血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄、あるいは大脳静脈血栓症が原因である梗塞を含むがこれらに限定されない）；脳梗塞につながることのない血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄；一過性脳虚血発作、及び、関連する症候群；頭蓋内静脈系の血栓症；動脈塞栓症及び血栓症（動脈瘤の塞栓症及び血栓症を含むがこれらに限定されない）；血栓性静脈炎；門脈血栓症；他の静脈塞栓症及び血栓症；自家移植片、同種移植片、異種移植片、又は人工補綴物の血栓症；外傷後血栓症（ステント術又は血管形成術のような血管内手技の合併症を含むがこれらに限定されない）；ならびに吻合術の血栓症のような血栓塞栓症に罹患している。
【００１３】
本発明はさらに、ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットに関する。本発明のキットには以下が含まれる。ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬、ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液（バッファー）、ｃ）血小板上でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬、並びに、ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によると、前記α２β１インテグリン受容体の遮断は、抗体、スルホンアミド誘導体のような化合物、又は、アミノ酸配列ＲＫＫを含むペプチドのようなペプチドを含む、α２β１インテグリン阻害剤あるいはα２β１インテグリン結合試薬を用いて達成される。
以下では、本発明は添付の図面を参照して好ましい実施形態によってさらに詳細に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＴＴ８０７（白丸）遺伝子型、及び、ＣＴ８０７（白三角）遺伝子型のいずれかを有するドナーがそれぞれ、ＣＣ８０７（黒四角）遺伝子型を有するドナーよりも、それらの血小板表面で高いα２インテグリンの平均発現を有することを示す図。なお、Ｙ軸は血小板上での平均蛍光（ＭＥＦ）におけるα２インテグリンの量を示す。＊＊ｐ＜０．００５。
【図１Ｂ】遺伝子型群がスクリーニングされる方法を示す図。増幅された断片はＢｇｌ ＩＩ制限酵素で処理され、１．５％のアガロースゲル中で泳動させられる。ＴＴ８０７遺伝子型は（＋）／（＋）として、ＣＴ８０７は（＋）／（−）として、そしてＣＣ８０７は（−）／（−）として示される。
【図１Ｃ】図１Ｂの模式図。
【図２Ａ】インテグリン受容体の遮断により、α２インテグリンの高い発現レベルを有するドナー（遺伝子型ＴＴ８０７及びＣＴ８０７）においては血管閉鎖時間が長くなることを示す図。閉鎖時間はα２β１インテグリン阻害剤（ＢＴＴ−３０１６）が存在しない場合（コントロール）と存在する場合とで、ＰＦＡ−１００（血小板機能分析装置）を用いて分析した。すなわち、図２Ａは、全血管閉鎖時間に対するＢＴＴ−３０１６の効果が、ＴＴ８０７遺伝子型と、ＴＣ８０７遺伝子型及び高いα２インテグリンレベル（ＭＥＦ≧３５）とのいずれかを有する反応性のドナーを用いて示される図である。なお、図２Ａにおけるｙ軸は、ＰＦＡ−１００によって決定された全血管閉鎖時間を秒数で示している。
【図２Ｂ】インテグリン受容体の遮断により、α２インテグリンの高い発現レベルを有するドナー（遺伝子型ＴＴ８０７及びＣＴ８０７）においては血管閉鎖時間が長くなることを示す図。閉鎖時間はα２β１インテグリン阻害剤（ＢＴＴ−３０１６）が存在しない場合（コントロール）と存在する場合とで、ＰＦＡ−１００（血小板機能分析装置）を用いて分析した。すなわち、図２Ｂは、血管閉鎖時間に対するＢＴＴ−３０１６の効果が、ＣＣ８０７遺伝子型を有する非反応性のドナーを用いて示される図である。なお、図２Ｂにおいては、ｙ軸は、ＰＦＡ−１００によって決定された全血管閉鎖時間を秒数で示している。
【図３】ＥＤＴＡが、Ｃ１４標識されたインテグリン阻害剤のＣＨＯ−α２細胞への結合を阻害するが、ＣＨＯ−野生型（ｗｔ）細胞への結合を阻害しないことを示す図。このことは、標識された化合物が細胞表面上のα２インテグリンの量を特異的に検出することを示す。Ｙ軸は、細胞に対するＣ１４標識されたインテグリン阻害剤の結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法を見出すために試みられた研究に基づく。
３０人の無作為に選択した健常なボランティアについて、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔの遺伝子型を分類した。研究した被験体のうち、４３％がＣＣ８０７遺伝子型を有し、３７％がＣＴ８０７遺伝子型を有し、そして２０％がＴＴ８０７遺伝子型を有していた。
【００１７】
「ＣＴ８０７遺伝子型」との語は、本明細書中では、一方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｃを有し、かつ、他方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｔを有するヘテロ接合型の遺伝子型を指す。これに応じて、「ＣＣ８０７遺伝子型」との語は、両方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｃをそれぞれ有するホモ接合型の遺伝子型を指し、また「ＴＴ８０７遺伝子型」との語は、両方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｔをそれぞれ有するホモ接合型の遺伝子型を指す。
塩基対８０７は、例えば、Ｋｕｎｉｃｋｉら，１９９７（前記）及びＫｒｉｔｚｉｋら，１９９８（Ｂｌｏｏｄ，９２：２３８２−２３８８）によって開示され、配列番号１に示されるα２インテグリンヌクレオチド配列のヌクレオチド８０７をいう。当該α２インテグリンのｃＤＮＡ配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１７０３３の下で公的に入手することもできる。
【００１８】
α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する、遺伝子型が同定された健常なボランティアの反応性を、ＰＦＡ−１００血小板機能分析における全血管閉鎖時間に対する合成α２β１インテグリン阻害剤（例えばＷＯ２００５／０９０２９８に開示されたスルホンアミド誘導体）の効果を測定することによって評価した。
ＰＦＡ−１００分析装置は、小血管の損傷後の一次止血を刺激する高い剪断誘導性を有する装置（high shear-inducing device）である。
【００１９】
このシステムには、コラーゲン及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）でコートされた生物学的活性膜を含む試験カートリッジが含まれる。抗凝固全血試料が一定の負圧下で毛細管を通して流される。膜上の血小板アゴニスト（すなわち、ＡＤＰ及びコラーゲン）と高剪断速度（high shear rate）とによって血小板凝集が活性化され、安定な血小板プラグで開口部が閉塞される。開口部を完全に塞ぐのに必要な時間は「閉鎖時間」として表される。合成α２β１インテグリン阻害剤を、個々の健常なボランティアから得られた全血試料に添加し、ＰＦＡ−１００を用いて閉鎖時間を測定した。コントロール試料（同じ個体に由来する未処理の試料）と比較して、閉鎖時間が長くなれば、被験体をα２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性がある被験体と見なした。
【００２０】
図２Ｂに示すように、ＰＦＡ−１００分析において、ＣＣ８０７遺伝子型を有する被験体は、スルホンアミド誘導体での処置に反応しないことが分かった。したがって、当該被験体は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応しない被験体と見なされるべきである。
一方、α２β１インテグリンの高い発現レベル（平均蛍光又はＭＥＦ≧３５）とともにＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体だけでなく、ＴＴ８０７遺伝子型を有する全ての被験体は、スルホンアミド誘導体での処置に対して統計学的に有意に反応し（ｐ＜０．０５；図２Ａ）、このような被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を有する被験体と見なされるべきであることを示している。
【００２１】
上記に基づいて、本発明により、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法が提供され、当該方法には以下の工程が含まれる。上記被験体から得られた試料中で、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板上でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体として同定する工程。
【００２２】
α２インテグリン遺伝子型は、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）のような当該分野で公知である任意の適切な方法によって、任意の適切な生物学的試料中で決定することができる。本発明の１つの実施形態においては、α２インテグリン遺伝子型は全血由来の細胞ＤＮＡの全体を単離し、特異的α２インテグリンプライマーを用いたＰＣＲを行うことによって決定される。増幅されたα２断片は、その後、Ｂｇｌ ＩＩのような制限酵素で切断され、切断反応の結果がアガロースゲル上で検出される。増幅された断片に当該制限酵素の認識部位が含まれる場合は、当該断片は２つのより小さい断片に切断されるであろう。例えば、インテグリンα２ ｃＤＮＡ上の塩基対８０７にあるヌクレオチドＴはＢｇｌ ＩＩ制限酵素の認識部位を作るが、一方、同じ位置にあるヌクレオチドＣは当該制限酵素の認識部位を作らない。このように、α２インテグリン遺伝子型は、例えばＢｇｌ ＩＩ酵素での切断によって決定することができる。
【００２３】
α２β１インテグリンの発現レベルは、当該分野で公知である任意の適切な直接的あるいは間接的な方法によって決定することができる。本発明における１つの実施形態においては、血小板が全血から単離され、当該血小板は特異的蛍光α２インテグリン抗体で標識される。その後、α２抗体染色が、例えば、フローサイトメーターによって分析される。
【００２４】
本発明における別の実施形態においては、放射標識されたインテグリン阻害化合物又は蛍光標識されたインテグリン阻害化合物が、α２β１インテグリンの発現レベルを決定するために使用される。スルホンアミド誘導体（例えば、［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩；又は４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝−アミノ）フェニルフェニルケトンのナトリウム塩）のような前記インテグリン阻害化合物は、例えば、血小板表面でα２β１インテグリンに結合し、当該結合のレベルはα２β１インテグリンの発現レベルに比例する。
【００２５】
上記結合は、当業者に周知であるように、論点となっている標識の性質次第で、例えば、フローサイトメーター、シンチレーションカウンターあるいはオートラジオグラフィーによって検出することができる。本発明の更なる実施形態においては、ビオチニル化された（例えば、ストレプトアビジンが結合したビオチン）インテグリン阻害ペプチドが、α２β１インテグリンの発現レベルを評価するために使用される。前記ペプチドのα２β１インテグリンに対する結合は、α２β１インテグリンの発現レベルに比例し、例えば、化学発光によって検出することができる。インテグリン阻害ペプチドを標識するための、蛍光標識、発光標識、発色標識、測光標識、及び、放射活性標識のような他の適切な標識は、当該分野で容易に利用することができる。
【００２６】
α２β１インテグリンの発現レベルを決定するためにフローサイトメーターが使用される場合には、（蛍光抗体又は蛍光標識されたインテグリン阻害化合物によってもたらされた）蛍光の強度は、１つの血小板上のα２インテグリンの量を示す。平均蛍光（ＭＥＦ）は、１００００個の血小板がフローサイトメーターによって計数される試料による平均蛍光強度である。フローサイトメーターによって得られたヒストグラムデータの統計分析は、個々の試料についてのＭＥＦ値を提供する。異なる試料のこれらのＭＥＦ値は、フローサイトメトリーの実行が同じ機器設定で行われた場合には、互いに比較することができる。「高い発現レベル」との語は、本明細書中で使用される場合は、ＭＥＦ≧３５を意味する。
【００２７】
本発明におけるいくつかの実施形態においては、「高い発現レベル」は、コントロールの血小板と比較して、血小板に対する前記標識された化合物又はペプチドの結合の有意な（好ましくは、統計学的に有意な）増大によって決定される。当業者は、結合の差異が有意である場合を知り、そして当該差異を検出するための適切な方法を評価する。
【００２８】
本発明におけるα２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法は、例えば、新規の抗血栓薬の開発を目的とする臨床研究のための被験体を選別することにおいて有用である。α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体の同定及び選別は、一般に、成功確率を有意に向上させ、臨床的使用のための新規のα２β１インテグリン阻害剤の開発費を大幅に削減するであろう。ＴＴ８０７遺伝子型を有する被験体だけをそのような臨床試験に含める場合には、ボランティアのうちの１５〜２０％しか選択されないだろう。この態様は、何千人もの患者が必要とされる大規模な臨床試験において特に重要である。ここでは、α２β１インテグリンの高い発現レベルとともにＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体もまた、そのような臨床研究のために選択することができ、適切な個体の数はボランティアのうちの約４０％に増える。
【００２９】
本発明によれば、α２β１インテグリン受容体遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法も提供され、そして、当該処置に反応しないことが既知である患者を非倫理的に処置することが回避される。当該方法には以下の工程が含まれる。前記患者から得られた試料中で、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、並びに、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示す患者として指定する工程。
本発明におけるいくつかの実施形態においては、上記患者は血栓塞栓症の症状に罹患している。遺伝子型の決定と血小板表面でのα２β１インテグリンの発現レベルの測定は、上記のように、任意の適切な方法によって行うことができる。
【００３０】
本発明におけるα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する反応性を決定するための方法は、例えば、血栓塞栓症の症状の予防又は処置において、α２β１インテグリン阻害剤を用いた処置により恩恵を受けるであろう患者を選択するために有用である。
【００３１】
本発明によりさらに、患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防又は緩和のための方法が提供され、当該方法には、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する当該患者に対して、α２β１インテグリン受容体を有効量投与する工程が含まれる。
【００３２】
本発明はさらに、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することによって反応性があると診断された患者における血栓塞栓症の症状の予防、処置、及び／又は緩和のための薬学的組成物を製造するための、α２β１インテグリン阻害剤、あるいは、それらの組み合わせの使用に関する。
【００３３】
「血栓塞栓症の症状」との語には、本明細書中で使用される場合は、狭心症（angina pectoris）（例えば、不安定狭心症、狭心症（stenocardia）、及び、不特定狭心症）；急性心筋梗塞；亜急性心筋梗塞（再発性心筋梗塞を含む）；心筋梗塞の血栓性及び血栓塞栓性合併症；他の虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞によって生じたものではない冠動脈血栓）；慢性虚血性心疾患；肺塞栓症；脳梗塞（例えば、血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄、あるいは大脳静脈血栓症が原因である梗塞）；結果として脳梗塞にならない血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄；一過性脳虚血発作、及び、関連する症候群；頭蓋内静脈系の血栓症；動脈塞栓症及び血栓症（例えば、動脈瘤の塞栓症及び血栓症）；血栓性静脈炎；門脈血栓症；他の静脈塞栓症及び血栓症；自家移植片、同種移植片、異種移植片、又は人工補綴物の血栓症；外傷後血栓症（例えば、ステント術又は血管形成術のような血管内手技の合併症）；ならびに吻合術の血栓症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明と関連して、結果的にα２β１インテグリン受容体を遮断する適切な化合物としては、抗体、スルホンアミド誘導体及びα２β１インテグリン結合ペプチドのようなα２β１インテグリンの機能を部分的もしくは完全に阻害又はブロックする任意の化合物が挙げられる。
【００３５】
本発明の更に別の目的は、上記のように、血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定することにおいて使用される、適切に標識されたα２β１インテグリン阻害剤を提供することである。適切な標識は当業者に公知であり、これには、放射標識、蛍光標識、及び、ビオチン標識が含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
本発明によっては、ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットも提供され、上記キットには以下が含まれる。
ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬。
ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液。
ｃ）血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬。
ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【００３７】
本発明での使用に適しているＰＣＲプライマーには、α２インテグリン遺伝子の領域３４４００ｎｔ〜６４９１０ｎｔにハイブリダイズする第１のプライマーと、インテグリンα２遺伝子の領域６５４３０ｎｔ〜７２１８０ｎｔにハイブリダイズする第２のプライマーが含まれる。α２インテグリン遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＴ＿００６７１３の下で公的に入手することができる。ヌクレオチド領域３４４００〜６４９１０は、配列番号２に示されるヌクレオチド１〜３０５１１に相当し、一方、ヌクレオチド領域３４４００〜６４９１０は、配列番号３に示されるヌクレオチド１〜６７５１に相当する。通常、前記ＰＣＲプライマーの長さは１５塩基対〜２５塩基対であり、好ましくは２０塩基対である。本発明の１つの実施形態においては、前記第１のプライマーには、配列番号４に示されるヌクレオチド配列が含まれ、前記第２のプライマーには、配列番号５に示されるヌクレオチド配列が含まれる。
【００３８】
なお、α２インテグリン遺伝子の増幅に必要であり、状況に応じて本発明のキットに含められる他のＰＣＲ試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、適切なＰＣＲ緩衝液及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が挙げられる。
【００３９】
本発明の１つの実施形態においては、血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための前記α２β１インテグリン結合試薬は、α２β１抗体、好ましくは、蛍光標識されたα２β１抗体である。
【００４０】
本発明の別の実施形態においては、血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための上記α２β１インテグリン結合試薬は、例えば、ＷＯ２００５／０９０２９８、ＥＰ１２５８２５２、ＥＰ０４７２０５３、ＷＯ０３／００８３８０に記載されているスルホンアミド誘導体のような、放射標識又は蛍光標識された化合物である。適切な標識と標識方法は当業者には容易に理解される。
例えば、Ｃ１４放射標識に適している化合物としては、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチルアミン、
２Ｈ−ベンゾ［３，４−ｄ］１，３−ジオキソラン−５−イル［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩、
｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝メチル（２−メチルベンゾキサゾール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］｛４−［（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）メチルアミノ］−フェニル｝メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）フェニル］スルホニル｝−メチルアミン、
［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチル（２−メチルインドール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−６−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］カルバゾール−３−イルメチルアミン
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］（１，２−ジメチルインドール−５−イル）メチルアミン、及び
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−５−イル）アミン、が挙げられる。一方、蛍光標識には、４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトン（ＢＴＴ−３０１６）のナトリウム塩が適している。
【００４１】
本発明の更に別の実施形態においては、血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための前記α２β１インテグリン結合試薬は、ＷＯ９９／０２５５１に開示された３つのアミノ酸であるアルギニン−リジン−リジンの共線的配列（ＲＫＫ；配列番号６）を含むビオチニル化された環状ペプチドである。そのような環状ペプチドには、例えば、１コピー以上のＲＫＫ配列モチーフを含むペプチド、アミノ酸配列ＲＫＫＨ（配列番号７）を含むペプチド、アミノ酸配列ＣＲＫＫＨＣ（配列番号８）を含むペプチド、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＣ（配列番号９）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＣ（配列番号１０）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＣ（配列番号１１）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＣ（配列番号１２）、及び、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（配列番号１３）を含むペプチドが含まれる。前記ビオチニル化されたペプチドは、例えば、化学発光によって検出することができる。他の適切な標識と検出方法は当業者に容易に利用される。
【００４２】
状況に応じて、前記キットに、試料中の全ＤＮＡの単離、得られたＰＣＲ産物の精製、（Ｂｇｌ ＩＩ反応の結果を検出するための）アガロースゲル電気泳動、及び、全血からの血小板の単離に必要とされる必須の試薬の全て、又は、いくつかを含めてもよい。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
〔α２対立遺伝子の遺伝子型分類とα２β１の発現〕
３０人の健常なドナーにおけるα２対立遺伝子の分布を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ社製）を用いて、全血から全ＤＮＡを単離することによって決定した。可能性のあるＢｇｌ ＩＩ部位を含むインテグリンα２遺伝子のイントロンＧの約６００塩基対の断片を、以下のプライマーを使用してゲノムＤＮＡから増幅させた：５’プライマー（配列番号２に示された塩基対３０４８０〜３０５０３）ＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＣ（配列番号４）、及び、３’プライマー（配列番号３に示された塩基対８〜３１）ＣＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣ−ＡＧＧＴＧＧ（配列番号５）（Ｋｒｉｔｚｉｋら，１９９８）。
【００４４】
ＰＣＲ増幅は、以下のプロトコルを使用して行った：９４℃で１０分間の変性；２サイクル：９４℃で１分間の変性、６９℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張；２サイクル：９４℃で１分間の変性、６７℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張；３５サイクル：９４℃で１分間の変性、６５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張。ＰＣＲ産物をＢｇｌ ＩＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で切断し、反応産物を１．５％のアガロースゲルで分析した。
【００４５】
ドナーのα２遺伝子型を制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）に基づいて決定した。α２インテグリンｃＤＮＡ上の塩基対８０７にあるヌクレオチドＴは、Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素の認識部位を作るが、当該塩基対８０７にヌクレオチドＣがある場合には、Ｂｇｌ ＩＩでの切断は起こらないであろう。ドナーの両方の対立遺伝子にＢｇｌ ＩＩ認識部位が含まれる場合は、アガロースゲル中には２つのより小さい断片（〜３００塩基対）だけが存在するであろう（ＴＴ８０７遺伝子型）が、他方の対立遺伝子が切断されない場合には、アガロースゲル中には６００塩基対のバンドと２つのより小さいバンドが存在するであろう（ＴＣ８０７遺伝子型）。いずれの対立遺伝子にもＢｇｌ ＩＩ認識部位が含まれない場合には、アガロースゲル中には６００塩基対のバンドだけが存在するであろう（ＴＴ８０７遺伝子型）。
【００４６】
結果として、ドナーのうち、４３％がＣＣ８０７遺伝子型を持ち、３７％がＴＣ８０７遺伝子型を持ち、そして２０％がＴＴ８０７遺伝子型を持っていた。これまでに、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（Ｂｌｏｏｄ，１９９９，９３：３５８３−３５８６）は、１８４人の健常なドナーからなる１つの群においてα２インテグリンＣＴ８０７の分布を研究し、それにしたがう結果を示した。
【００４７】
全血からの血小板の単離を、ＯｐｔｉＰｒｅｐ試薬（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。密度勾配遠心分離の後、血小板を、抗α２インテグリンＦＩＴＣ結合抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、又は、コントロール抗体である抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＣＯ社製）で、室温で３０分間標識した。細胞の蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で検出した。
【００４８】
遺伝子型とα２β１発現との間の相関関係を、単離した血小板のフローサイトメトリー染色によって決定した。インテグリンα２対立遺伝子ＣＴ８０７（平均蛍光（ＭＥＦ）４０．２）を有するドナーとＴＴ８０７（ＭＥＦ ４７．２）を有するドナーとは、α２対立遺伝子ＣＣ８０７（ＭＥＦ ２３．４）を有するドナーよりも、それらの血小板表面上に多量のα２を有していた。平均的なα２β１インテグリン発現は、ホモ接合型（ＴＴ８０７）ドナー群及びヘテロ接合型（ＣＴ８０７）ドナー群のいずれにおいても高かったにもかかわらず、平均的な発現のばらつきは、ヘテロ接合型群において、より大きかった。
【００４９】
〔実施例２〕
〔血管閉鎖時間に対するインテグリン受容体の遮断の効果〕
ＰＦＡ−１００分析における全血管閉鎖時間に対する合成α２β１インテグリン阻害剤である４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトン（ＢＴＴ−３０１６）のナトリウム塩の効果を、個々の遺伝子型集団を代表するドナーについて決定した。血液を、抗凝固剤として３．２％の緩衝化したヘパリンリチウムを含むチューブの中に収集した。全血試料をインテグリン阻害化合物の存在下又は非存在下で処理した。試料を室温で１０分間インキュベートし、ＰＦＡコラーゲン／ＡＤＰカートリッジ中に分注し、閉鎖時間をＰＦＡ−１００（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）を用いて決定した。
【００５０】
ＢＴＴ−３０１６により、インテグリンα２β１の高い発現を有しているドナーにおいて、統計学的に有意に（二元ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０５）閉鎖時間を延長することが示された（フローサイトメトリー分析によって、血小板上のα２インテグリンの量はＭＥＦ≧３５と決定された）。効果は、遺伝子型（ＣＴ８０７又はＴＴ８０７）には依存しなかった。ＢＴＴ−３０１６は、低いインテグリン発現を有するドナー（遺伝子型ＣＣ８０７）においては有効ではなかった。このように、血小板のフローサイトメトリー染色を用いたα２β１インテグリンのタンパク質発現レベルの検出に、α２ ｃＤＮＡの塩基対８０７での遺伝子多型の分析を組み合わせることにより、血栓性疾患の処置においてα２β１受容体の遮断により恩恵を受けるであろう患者の選別が可能となる。
【００５１】
〔実施例３〕
〔血小板上のα２β１インテグリン発現レベルの決定におけるＣ１４標識されたインテグリン阻害剤の使用〕
Ｃ１４標識されたインテグリン阻害化合物である［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩の結合を、ＣＨＯ−ｗｔ細胞とα２インテグリンを過剰発現するＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−α２）とを用いて研究した。なお、ＣＨＯ−ｗｔ細胞は、それらの細胞表面にコラーゲン受容体インテグリンを持たない。
【００５２】
２％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に細胞を固定した。その後、当該細胞を洗浄し、反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中に懸濁した。１０μＭのＣ１４標識された阻害化合物を全ての試料に添加し、当該細胞を２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下又は非存在下で１時間、＋４℃でインキュベートした。個々の試料から２００００個の細胞をＧＦ／Ｂガラス・マイクロファイバー・フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）上にロードし、試料を１０ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。膜をシンチレーション緩衝液（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ３，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）に入れ、その活性をシンチレーションカウンターで測定した（Ｗａｌｌａｃ １４１５）。
【００５３】
Ｃ１４標識されたインテグリン阻害化合物は、ＣＨＯ−ｗｔ細胞よりもＣＨＯ−α２細胞に対してより効率よく結合した（図３）。α２インテグリンが当該化合物に結合するためにはＭｇ２＋イオンが必要であるとの事実から、ＥＤＴＡを実験に使用した。２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、標識された化合物の結合は、ＣＨＯ−α２細胞では阻害されたが、ＣＨＯ−ｗｔ細胞では阻害されなかった。これは、結合がα２インテグリンに対して特異的であることを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断（ブロック）に対する反応者を臨床研究用に選別する方法、ならびにα２β１インテグリン受容体遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法に関する。さらに、本発明は上記方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞とコラーゲンとの間の相互作用は、細胞の移動及び分化を含む多くの生理学的機能に不可欠である。しかしながら、同じ相互作用はまた、血栓形成及び癌転移のような疾患と関係があるメカニズムを促進する可能性がある。血小板を含め、細胞は、インテグリンと呼ばれる特異的コラーゲン受容体を介してコラーゲン繊維に結合する。健常な動脈壁の内皮細胞層は、循環している血小板がコラーゲンと相互作用することを防ぐ。内皮損傷部位では、コラーゲンが露出し、損傷した内皮表面に血小板が付着して、血栓形成につながる一連の事象が開始される。血小板のコラーゲンへの付着は、コラーゲン受容体であるα２β１インテグリンによって主に媒介される。α２β１インテグリンは、血小板が血流から離れて堅固に付着することを媒介することにおいて、中心的に関与する。
【０００３】
疫学研究により、血栓の発生におけるα２β１インテグリンの役割が明らかになっており、血小板表面でのα２β１インテグリンの高い発現レベルが、血栓塞栓症の症状の独立した重要な危険因子であることが示されている（非特許文献１参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０）。加えて、高いα２β１インテグリンの発現は、心筋梗塞を含む急性冠症候群と関連付けられている。α２β１の発現レベルは、６つの異なるα２対立遺伝子によって定義され、当該発現レベルに影響を与える特定の特異的多型が同定されている。発現レベルに影響を与える特定の多型の１つは、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔである。Ｔ８０７は血小板での受容体α２β１のより高い発現と関連し、Ｃ８０７はより低い発現密度と関連している（非特許文献２参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：１９３９−１９４３）。正常集団においては、α２発現のレベルには大きな個体差がある。
【０００４】
ＳＮＰ Ｔ８０７は血栓塞栓性疾患の重要な危険因子として示唆されている。具体的に、ＳＮＰ Ｔ８０７は、若年患者（≦５０歳）の脳血管発作（脳卒中）や糖尿病性網膜症のリスクに関連する。しかしながら、多くの他の研究はそのような関連を示していないことに留意しなければならない（非特許文献１参照：Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０）。
【０００５】
このように、α２β１インテグリンの高い発現レベルと遺伝的変異体とは、血栓性疾患を起こす潜在的危険因子と考えられるが、処置に対する反応におけるそれらの役割はほとんど明らかではなく、また、α２β１インテグリン受容体の遮断に対する血小板感受性に関するα２多型の役割についての報告は不十分である。Ｒｏｚａｌｓｋｉら（非特許文献３参照：Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．，２００５，５７：１−１３）は、ＴＴ８０７遺伝子型を有する被験体が、モノクローナル抗α２β１インテグリン抗体を用いた処置に対して、ＣＣ８０７遺伝子型を有する被験体よりも良好に反応することを示している。しかしながら、この報告はヘテロ接合型ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体の反応性について触れていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２２：１４−２０
【非特許文献２】Ｋｕｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：１９３９−１９４３
【非特許文献３】Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．，２００５，５７：１−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応する被験体の同定及び選別は、一般に、成功確率を有意に向上させ、臨床的使用のための新規のα２β１インテグリン阻害剤の開発費を大幅に削減するであろう。更に、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する反応性の決定により、当該処置に反応しないことが既知である患者に対して、非倫理的に当該処置を施すことが回避される。このように、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応する患者を選別する方法が当該分野で必要とされている。そのような患者は、血栓塞栓症の症状の予防、処置、及び／又は緩和において前記インテグリン受容体の阻害剤を用いた処置によって恩恵を受けるであろうし、新規の抗血栓薬の開発を目的とする臨床研究のために選別されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、α２インテグリン遺伝子型ＴＴ８０７を有する個体、及び、α２β１インテグリンの高い全体的発現レベルを伴うα２インテグリン遺伝子型ＣＴ８０７を有する個体が、α２β１受容体の遮断に反応するという驚くべき知見に基づく。
従って、本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定する方法に関する。当該方法には以下の工程が含まれる。ａ）前記被験体から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔを決定する工程、ｂ）ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に応答する被験体として同定する工程。
【０００９】
本発明はさらに、α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定する方法に関する。当該方法には以下の工程が含まれる。ａ）前記患者から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、ｂ）前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示す患者として指定する工程。
【００１０】
本発明はさらに、患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防、及び／又は緩和のための方法に関し、当該方法には、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者に対して、α２β１インテグリン阻害剤を有効量投与する工程が含まれる。
【００１１】
さらに、本発明は、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することにより、反応性があると診断された患者における血栓塞栓症の症状を予防、処置、及び／又は緩和するための薬学的組成物の製造のための、α２β１インテグリン阻害剤あるいはそれらの組み合わせの使用に関する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によると、患者は、狭心症（angina pectoris）（不安定狭心症、狭心症（stenocardia）、及び、不特定狭心症を含むがこれらに限定されない）；急性心筋梗塞；亜急性心筋梗塞（再発性心筋梗塞を含む）；心筋梗塞の血栓性及び血栓塞栓性合併症；他の虚血性心疾患（心筋梗塞につながることのない冠動脈血栓を含むがこれに限定されない）；慢性虚血性心疾患；肺塞栓症；脳梗塞（血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄、あるいは大脳静脈血栓症が原因である梗塞を含むがこれらに限定されない）；脳梗塞につながることのない血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄；一過性脳虚血発作、及び、関連する症候群；頭蓋内静脈系の血栓症；動脈塞栓症及び血栓症（動脈瘤の塞栓症及び血栓症を含むがこれらに限定されない）；血栓性静脈炎；門脈血栓症；他の静脈塞栓症及び血栓症；自家移植片、同種移植片、異種移植片、又は人工補綴物の血栓症；外傷後血栓症（ステント術又は血管形成術のような血管内手技の合併症を含むがこれらに限定されない）；ならびに吻合術の血栓症のような血栓塞栓症に罹患している。
【００１３】
本発明はさらに、ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットに関する。本発明のキットには以下が含まれる。ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬、ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液（バッファー）、ｃ）血小板上でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬、並びに、ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によると、前記α２β１インテグリン受容体の遮断は、抗体、スルホンアミド誘導体のような化合物、又は、アミノ酸配列ＲＫＫを含むペプチドのようなペプチドを含む、α２β１インテグリン阻害剤あるいはα２β１インテグリン結合試薬を用いて達成される。
以下では、本発明は添付の図面を参照して好ましい実施形態によってさらに詳細に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＴＴ８０７（白丸）遺伝子型、及び、ＣＴ８０７（白三角）遺伝子型のいずれかを有するドナーがそれぞれ、ＣＣ８０７（黒四角）遺伝子型を有するドナーよりも、それらの血小板表面で高いα２インテグリンの平均発現を有することを示す図。なお、Ｙ軸は血小板上での平均蛍光（ＭＥＦ）におけるα２インテグリンの量を示す。＊＊ｐ＜０．００５。
【図１Ｂ】遺伝子型群がスクリーニングされる方法を示す図。増幅された断片はＢｇｌ ＩＩ制限酵素で処理され、１．５％のアガロースゲル中で泳動させられる。ＴＴ８０７遺伝子型は（＋）／（＋）として、ＣＴ８０７は（＋）／（−）として、そしてＣＣ８０７は（−）／（−）として示される。
【図１Ｃ】図１Ｂの模式図。
【図２Ａ】インテグリン受容体の遮断により、α２インテグリンの高い発現レベルを有するドナー（遺伝子型ＴＴ８０７及びＣＴ８０７）においては血管閉鎖時間が長くなることを示す図。閉鎖時間はα２β１インテグリン阻害剤（ＢＴＴ−３０１６）が存在しない場合（コントロール）と存在する場合とで、ＰＦＡ−１００（血小板機能分析装置）を用いて分析した。すなわち、図２Ａは、全血管閉鎖時間に対するＢＴＴ−３０１６の効果が、ＴＴ８０７遺伝子型と、ＴＣ８０７遺伝子型及び高いα２インテグリンレベル（ＭＥＦ≧３５）とのいずれかを有する反応性のドナーを用いて示される図である。なお、図２Ａにおけるｙ軸は、ＰＦＡ−１００によって決定された全血管閉鎖時間を秒数で示している。
【図２Ｂ】インテグリン受容体の遮断により、α２インテグリンの高い発現レベルを有するドナー（遺伝子型ＴＴ８０７及びＣＴ８０７）においては血管閉鎖時間が長くなることを示す図。閉鎖時間はα２β１インテグリン阻害剤（ＢＴＴ−３０１６）が存在しない場合（コントロール）と存在する場合とで、ＰＦＡ−１００（血小板機能分析装置）を用いて分析した。すなわち、図２Ｂは、血管閉鎖時間に対するＢＴＴ−３０１６の効果が、ＣＣ８０７遺伝子型を有する非反応性のドナーを用いて示される図である。なお、図２Ｂにおいては、ｙ軸は、ＰＦＡ−１００によって決定された全血管閉鎖時間を秒数で示している。
【図３】ＥＤＴＡが、Ｃ１４標識されたインテグリン阻害剤のＣＨＯ−α２細胞への結合を阻害するが、ＣＨＯ−野生型（ｗｔ）細胞への結合を阻害しないことを示す図。このことは、標識された化合物が細胞表面上のα２インテグリンの量を特異的に検出することを示す。Ｙ軸は、細胞に対するＣ１４標識されたインテグリン阻害剤の結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法を見出すために試みられた研究に基づく。
３０人の無作為に選択した健常なボランティアについて、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔの遺伝子型を分類した。研究した被験体のうち、４３％がＣＣ８０７遺伝子型を有し、３７％がＣＴ８０７遺伝子型を有し、そして２０％がＴＴ８０７遺伝子型を有していた。
【００１７】
「ＣＴ８０７遺伝子型」との語は、本明細書中では、一方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｃを有し、かつ、他方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｔを有するヘテロ接合型の遺伝子型を指す。これに応じて、「ＣＣ８０７遺伝子型」との語は、両方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｃをそれぞれ有するホモ接合型の遺伝子型を指し、また「ＴＴ８０７遺伝子型」との語は、両方のα２インテグリン対立遺伝子のｃＤＮＡ中の塩基対８０７にＳＮＰ Ｔをそれぞれ有するホモ接合型の遺伝子型を指す。
塩基対８０７は、例えば、Ｋｕｎｉｃｋｉら，１９９７（前記）及びＫｒｉｔｚｉｋら，１９９８（Ｂｌｏｏｄ，９２：２３８２−２３８８）によって開示され、配列番号１に示されるα２インテグリンヌクレオチド配列のヌクレオチド８０７をいう。当該α２インテグリンのｃＤＮＡ配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１７０３３の下で公的に入手することもできる。
【００１８】
α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する、遺伝子型が同定された健常なボランティアの反応性を、ＰＦＡ−１００血小板機能分析における全血管閉鎖時間に対する合成α２β１インテグリン阻害剤（例えばＷＯ２００５／０９０２９８に開示されたスルホンアミド誘導体）の効果を測定することによって評価した。
ＰＦＡ−１００分析装置は、小血管の損傷後の一次止血を刺激する高い剪断誘導性を有する装置（high shear-inducing device）である。
【００１９】
このシステムには、コラーゲン及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）でコートされた生物学的活性膜を含む試験カートリッジが含まれる。抗凝固全血試料が一定の負圧下で毛細管を通して流される。膜上の血小板アゴニスト（すなわち、ＡＤＰ及びコラーゲン）と高剪断速度（high shear rate）とによって血小板凝集が活性化され、安定な血小板プラグで開口部が閉塞される。開口部を完全に塞ぐのに必要な時間は「閉鎖時間」として表される。合成α２β１インテグリン阻害剤を、個々の健常なボランティアから得られた全血試料に添加し、ＰＦＡ−１００を用いて閉鎖時間を測定した。コントロール試料（同じ個体に由来する未処理の試料）と比較して、閉鎖時間が長くなれば、被験体をα２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性がある被験体と見なした。
【００２０】
図２Ｂに示すように、ＰＦＡ−１００分析において、ＣＣ８０７遺伝子型を有する被験体は、スルホンアミド誘導体での処置に反応しないことが分かった。したがって、当該被験体は、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応しない被験体と見なされるべきである。
一方、α２β１インテグリンの高い発現レベル（平均蛍光又はＭＥＦ≧３５）とともにＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体だけでなく、ＴＴ８０７遺伝子型を有する全ての被験体は、スルホンアミド誘導体での処置に対して統計学的に有意に反応し（ｐ＜０．０５；図２Ａ）、このような被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を有する被験体と見なされるべきであることを示している。
【００２１】
上記に基づいて、本発明により、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法が提供され、当該方法には以下の工程が含まれる。上記被験体から得られた試料中で、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板上でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、及び、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体として同定する工程。
【００２２】
α２インテグリン遺伝子型は、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）のような当該分野で公知である任意の適切な方法によって、任意の適切な生物学的試料中で決定することができる。本発明の１つの実施形態においては、α２インテグリン遺伝子型は全血由来の細胞ＤＮＡの全体を単離し、特異的α２インテグリンプライマーを用いたＰＣＲを行うことによって決定される。増幅されたα２断片は、その後、Ｂｇｌ ＩＩのような制限酵素で切断され、切断反応の結果がアガロースゲル上で検出される。増幅された断片に当該制限酵素の認識部位が含まれる場合は、当該断片は２つのより小さい断片に切断されるであろう。例えば、インテグリンα２ ｃＤＮＡ上の塩基対８０７にあるヌクレオチドＴはＢｇｌ ＩＩ制限酵素の認識部位を作るが、一方、同じ位置にあるヌクレオチドＣは当該制限酵素の認識部位を作らない。このように、α２インテグリン遺伝子型は、例えばＢｇｌ ＩＩ酵素での切断によって決定することができる。
【００２３】
α２β１インテグリンの発現レベルは、当該分野で公知である任意の適切な直接的あるいは間接的な方法によって決定することができる。本発明における１つの実施形態においては、血小板が全血から単離され、当該血小板は特異的蛍光α２インテグリン抗体で標識される。その後、α２抗体染色が、例えば、フローサイトメーターによって分析される。
【００２４】
本発明における別の実施形態においては、放射標識されたインテグリン阻害化合物又は蛍光標識されたインテグリン阻害化合物が、α２β１インテグリンの発現レベルを決定するために使用される。スルホンアミド誘導体（例えば、［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩；又は４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝−アミノ）フェニルフェニルケトンのナトリウム塩）のような前記インテグリン阻害化合物は、例えば、血小板表面でα２β１インテグリンに結合し、当該結合のレベルはα２β１インテグリンの発現レベルに比例する。
【００２５】
上記結合は、当業者に周知であるように、論点となっている標識の性質次第で、例えば、フローサイトメーター、シンチレーションカウンターあるいはオートラジオグラフィーによって検出することができる。本発明の更なる実施形態においては、ビオチニル化された（例えば、ストレプトアビジンが結合したビオチン）インテグリン阻害ペプチドが、α２β１インテグリンの発現レベルを評価するために使用される。前記ペプチドのα２β１インテグリンに対する結合は、α２β１インテグリンの発現レベルに比例し、例えば、化学発光によって検出することができる。インテグリン阻害ペプチドを標識するための、蛍光標識、発光標識、発色標識、測光標識、及び、放射活性標識のような他の適切な標識は、当該分野で容易に利用することができる。
【００２６】
α２β１インテグリンの発現レベルを決定するためにフローサイトメーターが使用される場合には、（蛍光抗体又は蛍光標識されたインテグリン阻害化合物によってもたらされた）蛍光の強度は、１つの血小板上のα２インテグリンの量を示す。平均蛍光（ＭＥＦ）は、１００００個の血小板がフローサイトメーターによって計数される試料による平均蛍光強度である。フローサイトメーターによって得られたヒストグラムデータの統計分析は、個々の試料についてのＭＥＦ値を提供する。異なる試料のこれらのＭＥＦ値は、フローサイトメトリーの実行が同じ機器設定で行われた場合には、互いに比較することができる。「高い発現レベル」との語は、本明細書中で使用される場合は、ＭＥＦ≧３５を意味する。
【００２７】
本発明におけるいくつかの実施形態においては、「高い発現レベル」は、コントロールの血小板と比較して、血小板に対する前記標識された化合物又はペプチドの結合の有意な（好ましくは、統計学的に有意な）増大によって決定される。当業者は、結合の差異が有意である場合を知り、そして当該差異を検出するための適切な方法を評価する。
【００２８】
本発明におけるα２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法は、例えば、新規の抗血栓薬の開発を目的とする臨床研究のための被験体を選別することにおいて有用である。α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体の同定及び選別は、一般に、成功確率を有意に向上させ、臨床的使用のための新規のα２β１インテグリン阻害剤の開発費を大幅に削減するであろう。ＴＴ８０７遺伝子型を有する被験体だけをそのような臨床試験に含める場合には、ボランティアのうちの１５〜２０％しか選択されないだろう。この態様は、何千人もの患者が必要とされる大規模な臨床試験において特に重要である。ここでは、α２β１インテグリンの高い発現レベルとともにＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体もまた、そのような臨床研究のために選択することができ、適切な個体の数はボランティアのうちの約４０％に増える。
【００２９】
本発明によれば、α２β１インテグリン受容体遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法も提供され、そして、当該処置に反応しないことが既知である患者を非倫理的に処置することが回避される。当該方法には以下の工程が含まれる。前記患者から得られた試料中で、α２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程、前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程、並びに、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示す患者として指定する工程。
本発明におけるいくつかの実施形態においては、上記患者は血栓塞栓症の症状に罹患している。遺伝子型の決定と血小板表面でのα２β１インテグリンの発現レベルの測定は、上記のように、任意の適切な方法によって行うことができる。
【００３０】
本発明におけるα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に対する反応性を決定するための方法は、例えば、血栓塞栓症の症状の予防又は処置において、α２β１インテグリン阻害剤を用いた処置により恩恵を受けるであろう患者を選択するために有用である。
【００３１】
本発明によりさらに、患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防又は緩和のための方法が提供され、当該方法には、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する当該患者に対して、α２β１インテグリン受容体を有効量投与する工程が含まれる。
【００３２】
本発明はさらに、ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することによって反応性があると診断された患者における血栓塞栓症の症状の予防、処置、及び／又は緩和のための薬学的組成物を製造するための、α２β１インテグリン阻害剤、あるいは、それらの組み合わせの使用に関する。
【００３３】
「血栓塞栓症の症状」との語には、本明細書中で使用される場合は、狭心症（angina pectoris）（例えば、不安定狭心症、狭心症（stenocardia）、及び、不特定狭心症）；急性心筋梗塞；亜急性心筋梗塞（再発性心筋梗塞を含む）；心筋梗塞の血栓性及び血栓塞栓性合併症；他の虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞によって生じたものではない冠動脈血栓）；慢性虚血性心疾患；肺塞栓症；脳梗塞（例えば、血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄、あるいは大脳静脈血栓症が原因である梗塞）；結果として脳梗塞にならない血栓症、塞栓症、脳実質外動脈もしくは脳動脈の閉塞又は狭窄；一過性脳虚血発作、及び、関連する症候群；頭蓋内静脈系の血栓症；動脈塞栓症及び血栓症（例えば、動脈瘤の塞栓症及び血栓症）；血栓性静脈炎；門脈血栓症；他の静脈塞栓症及び血栓症；自家移植片、同種移植片、異種移植片、又は人工補綴物の血栓症；外傷後血栓症（例えば、ステント術又は血管形成術のような血管内手技の合併症）；ならびに吻合術の血栓症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明と関連して、結果的にα２β１インテグリン受容体を遮断する適切な化合物としては、抗体、スルホンアミド誘導体及びα２β１インテグリン結合ペプチドのようなα２β１インテグリンの機能を部分的もしくは完全に阻害又はブロックする任意の化合物が挙げられる。
【００３５】
本発明の更に別の目的は、上記のように、血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定することにおいて使用される、適切に標識されたα２β１インテグリン阻害剤を提供することである。適切な標識は当業者に公知であり、これには、放射標識、蛍光標識、及び、ビオチン標識が含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
本発明によっては、ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットも提供され、上記キットには以下が含まれる。
ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬。
ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液。
ｃ）血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬。
ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【００３７】
本発明での使用に適しているＰＣＲプライマーには、α２インテグリン遺伝子の領域３４４００ｎｔ〜６４９１０ｎｔにハイブリダイズする第１のプライマーと、インテグリンα２遺伝子の領域６５４３０ｎｔ〜７２１８０ｎｔにハイブリダイズする第２のプライマーが含まれる。α２インテグリン遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＴ＿００６７１３の下で公的に入手することができる。ヌクレオチド領域３４４００〜６４９１０は、配列番号２に示されるヌクレオチド１〜３０５１１に相当し、一方、ヌクレオチド領域３４４００〜６４９１０は、配列番号３に示されるヌクレオチド１〜６７５１に相当する。通常、前記ＰＣＲプライマーの長さは１５塩基対〜２５塩基対であり、好ましくは２０塩基対である。本発明の１つの実施形態においては、前記第１のプライマーには、配列番号４に示されるヌクレオチド配列が含まれ、前記第２のプライマーには、配列番号５に示されるヌクレオチド配列が含まれる。
【００３８】
なお、α２インテグリン遺伝子の増幅に必要であり、状況に応じて本発明のキットに含められる他のＰＣＲ試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、適切なＰＣＲ緩衝液及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が挙げられる。
【００３９】
本発明の１つの実施形態においては、血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための前記α２β１インテグリン結合試薬は、α２β１抗体、好ましくは、蛍光標識されたα２β１抗体である。
【００４０】
本発明の別の実施形態においては、血小板上のα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための上記α２β１インテグリン結合試薬は、例えば、ＷＯ２００５／０９０２９８、ＥＰ１２５８２５２、ＥＰ０４７２０５３、ＷＯ０３／００８３８０に記載されているスルホンアミド誘導体のような、放射標識又は蛍光標識された化合物である。適切な標識と標識方法は当業者には容易に理解される。
例えば、Ｃ１４放射標識に適している化合物としては、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチルアミン、
２Ｈ−ベンゾ［３，４−ｄ］１，３−ジオキソラン−５−イル［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩、
｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝メチル（２−メチルベンゾキサゾール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］｛４−［（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）メチルアミノ］−フェニル｝メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）フェニル］スルホニル｝−メチルアミン、
［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチル（２−メチルインドール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−６−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］カルバゾール−３−イルメチルアミン
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］（１，２−ジメチルインドール−５−イル）メチルアミン、及び
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−５−イル）アミン、が挙げられる。一方、蛍光標識には、４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトン（ＢＴＴ−３０１６）のナトリウム塩が適している。
【００４１】
本発明の更に別の実施形態においては、血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するための前記α２β１インテグリン結合試薬は、ＷＯ９９／０２５５１に開示された３つのアミノ酸であるアルギニン−リジン−リジンの共線的配列（ＲＫＫ；配列番号６）を含むビオチニル化された環状ペプチドである。そのような環状ペプチドには、例えば、１コピー以上のＲＫＫ配列モチーフを含むペプチド、アミノ酸配列ＲＫＫＨ（配列番号７）を含むペプチド、アミノ酸配列ＣＲＫＫＨＣ（配列番号８）を含むペプチド、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＣ（配列番号９）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＣ（配列番号１０）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＣ（配列番号１１）、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＣ（配列番号１２）、及び、アミノ酸配列ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（配列番号１３）を含むペプチドが含まれる。前記ビオチニル化されたペプチドは、例えば、化学発光によって検出することができる。他の適切な標識と検出方法は当業者に容易に利用される。
【００４２】
状況に応じて、前記キットに、試料中の全ＤＮＡの単離、得られたＰＣＲ産物の精製、（Ｂｇｌ ＩＩ反応の結果を検出するための）アガロースゲル電気泳動、及び、全血からの血小板の単離に必要とされる必須の試薬の全て、又は、いくつかを含めてもよい。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
〔α２対立遺伝子の遺伝子型分類とα２β１の発現〕
３０人の健常なドナーにおけるα２対立遺伝子の分布を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ社製）を用いて、全血から全ＤＮＡを単離することによって決定した。可能性のあるＢｇｌ ＩＩ部位を含むインテグリンα２遺伝子のイントロンＧの約６００塩基対の断片を、以下のプライマーを使用してゲノムＤＮＡから増幅させた：５’プライマー（配列番号２に示された塩基対３０４８０〜３０５０３）ＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＣ（配列番号４）、及び、３’プライマー（配列番号３に示された塩基対８〜３１）ＣＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣ−ＡＧＧＴＧＧ（配列番号５）（Ｋｒｉｔｚｉｋら，１９９８）。
【００４４】
ＰＣＲ増幅は、以下のプロトコルを使用して行った：９４℃で１０分間の変性；２サイクル：９４℃で１分間の変性、６９℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張；２サイクル：９４℃で１分間の変性、６７℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張；３５サイクル：９４℃で１分間の変性、６５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張。ＰＣＲ産物をＢｇｌ ＩＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で切断し、反応産物を１．５％のアガロースゲルで分析した。
【００４５】
ドナーのα２遺伝子型を制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）に基づいて決定した。α２インテグリンｃＤＮＡ上の塩基対８０７にあるヌクレオチドＴは、Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素の認識部位を作るが、当該塩基対８０７にヌクレオチドＣがある場合には、Ｂｇｌ ＩＩでの切断は起こらないであろう。ドナーの両方の対立遺伝子にＢｇｌ ＩＩ認識部位が含まれる場合は、アガロースゲル中には２つのより小さい断片（〜３００塩基対）だけが存在するであろう（ＴＴ８０７遺伝子型）が、他方の対立遺伝子が切断されない場合には、アガロースゲル中には６００塩基対のバンドと２つのより小さいバンドが存在するであろう（ＴＣ８０７遺伝子型）。いずれの対立遺伝子にもＢｇｌ ＩＩ認識部位が含まれない場合には、アガロースゲル中には６００塩基対のバンドだけが存在するであろう（ＴＴ８０７遺伝子型）。
【００４６】
結果として、ドナーのうち、４３％がＣＣ８０７遺伝子型を持ち、３７％がＴＣ８０７遺伝子型を持ち、そして２０％がＴＴ８０７遺伝子型を持っていた。これまでに、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（Ｂｌｏｏｄ，１９９９，９３：３５８３−３５８６）は、１８４人の健常なドナーからなる１つの群においてα２インテグリンＣＴ８０７の分布を研究し、それにしたがう結果を示した。
【００４７】
全血からの血小板の単離を、ＯｐｔｉＰｒｅｐ試薬（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。密度勾配遠心分離の後、血小板を、抗α２インテグリンＦＩＴＣ結合抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、又は、コントロール抗体である抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＣＯ社製）で、室温で３０分間標識した。細胞の蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で検出した。
【００４８】
遺伝子型とα２β１発現との間の相関関係を、単離した血小板のフローサイトメトリー染色によって決定した。インテグリンα２対立遺伝子ＣＴ８０７（平均蛍光（ＭＥＦ）４０．２）を有するドナーとＴＴ８０７（ＭＥＦ ４７．２）を有するドナーとは、α２対立遺伝子ＣＣ８０７（ＭＥＦ ２３．４）を有するドナーよりも、それらの血小板表面上に多量のα２を有していた。平均的なα２β１インテグリン発現は、ホモ接合型（ＴＴ８０７）ドナー群及びヘテロ接合型（ＣＴ８０７）ドナー群のいずれにおいても高かったにもかかわらず、平均的な発現のばらつきは、ヘテロ接合型群において、より大きかった。
【００４９】
〔実施例２〕
〔血管閉鎖時間に対するインテグリン受容体の遮断の効果〕
ＰＦＡ−１００分析における全血管閉鎖時間に対する合成α２β１インテグリン阻害剤である４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトン（ＢＴＴ−３０１６）のナトリウム塩の効果を、個々の遺伝子型集団を代表するドナーについて決定した。血液を、抗凝固剤として３．２％の緩衝化したヘパリンリチウムを含むチューブの中に収集した。全血試料をインテグリン阻害化合物の存在下又は非存在下で処理した。試料を室温で１０分間インキュベートし、ＰＦＡコラーゲン／ＡＤＰカートリッジ中に分注し、閉鎖時間をＰＦＡ−１００（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）を用いて決定した。
【００５０】
ＢＴＴ−３０１６により、インテグリンα２β１の高い発現を有しているドナーにおいて、統計学的に有意に（二元ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０５）閉鎖時間を延長することが示された（フローサイトメトリー分析によって、血小板上のα２インテグリンの量はＭＥＦ≧３５と決定された）。効果は、遺伝子型（ＣＴ８０７又はＴＴ８０７）には依存しなかった。ＢＴＴ−３０１６は、低いインテグリン発現を有するドナー（遺伝子型ＣＣ８０７）においては有効ではなかった。このように、血小板のフローサイトメトリー染色を用いたα２β１インテグリンのタンパク質発現レベルの検出に、α２ ｃＤＮＡの塩基対８０７での遺伝子多型の分析を組み合わせることにより、血栓性疾患の処置においてα２β１受容体の遮断により恩恵を受けるであろう患者の選別が可能となる。
【００５１】
〔実施例３〕
〔血小板上のα２β１インテグリン発現レベルの決定におけるＣ１４標識されたインテグリン阻害剤の使用〕
Ｃ１４標識されたインテグリン阻害化合物である［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩の結合を、ＣＨＯ−ｗｔ細胞とα２インテグリンを過剰発現するＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−α２）とを用いて研究した。なお、ＣＨＯ−ｗｔ細胞は、それらの細胞表面にコラーゲン受容体インテグリンを持たない。
【００５２】
２％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に細胞を固定した。その後、当該細胞を洗浄し、反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中に懸濁した。１０μＭのＣ１４標識された阻害化合物を全ての試料に添加し、当該細胞を２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下又は非存在下で１時間、＋４℃でインキュベートした。個々の試料から２００００個の細胞をＧＦ／Ｂガラス・マイクロファイバー・フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）上にロードし、試料を１０ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。膜をシンチレーション緩衝液（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ３，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）に入れ、その活性をシンチレーションカウンターで測定した（Ｗａｌｌａｃ １４１５）。
【００５３】
Ｃ１４標識されたインテグリン阻害化合物は、ＣＨＯ−ｗｔ細胞よりもＣＨＯ−α２細胞に対してより効率よく結合した（図３）。α２インテグリンが当該化合物に結合するためにはＭｇ２＋イオンが必要であるとの事実から、ＥＤＴＡを実験に使用した。２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、標識された化合物の結合は、ＣＨＯ−α２細胞では阻害されたが、ＣＨＯ−ｗｔ細胞では阻害されなかった。これは、結合がα２インテグリンに対して特異的であることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法。
ａ）前記被験体から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔを決定する工程。
ｂ）ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程。
ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体として同定する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
工程ａ）は、制限酵素断片長多型に基づくことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
工程ｂ）は、フローサイトメーター又はシンチレーションカウンターを用いた、オートラジオグラフィー、化学発光、測光、蛍光検出法又は発光検出法によって行われることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
工程ｃ）における前記高い発現レベルは、平均蛍光が３５以上であることを意味することを特徴とする方法。
【請求項５】
α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法。
ａ）前記患者から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程。
ｂ）前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程。
ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示すものとして指定する工程。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記患者は、血栓塞栓症の症状に罹患していることを特徴とする方法。
【請求項７】
患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防、及び／又は緩和のための方法であって、
ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者に対して、α２β１インテグリン阻害剤を有効量投与する工程を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、ペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することにより、反応性があると診断された患者における血栓塞栓性の症状を予防、処置、及び／又は緩和するための薬学的組成物の製造のための、α２β１インテグリン阻害剤あるいはそれらの組み合わせの使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、抗体であることを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用において、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とする使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、ペプチドであることを特徴とする使用。
【請求項１７】
ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットであって、以下を含むことを特徴とするキット。
ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬。
ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液。
ｃ）血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬。
ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットにおいて、
ａ）は、配列番号２に示されるα２インテグリン遺伝子の領域１〜３０５１１ｎｔにハイブリダイズする第１のプライマーと、配列番号３に示されるインテグリンα２遺伝子の領域１〜６７５１ｎｔにハイブリダイズする第２のプライマーとを含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記第１のプライマーには、配列番号４に示されるヌクレオチド配列が含まれ、
前記第２のプライマーには、配列番号５に示されるヌクレオチド配列が含まれることを特徴とするキット。
【請求項２０】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、抗体であることを特徴とするキット。
【請求項２１】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とするキット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とするキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットにおいて、
前記スルホンアミド誘導体は、以下の群より選択されることを特徴とするキット。
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチルアミン、
２Ｈ−ベンゾ［３，４−ｄ］１，３−ジオキソラン−５−イル［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチルアミン、［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩、
｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝メチル（２−メチルベンゾキサゾール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］｛４−［（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）メチルアミノ］−フェニル｝メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）フェニル］スルホニル｝−メチルアミン、
［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチル（２−メチルインドール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−６−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］カルバゾール−３−イルメチルアミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］（１，２−ジメチルインドール−５−イル）メチルアミン、
及び［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−５−イル）アミン、
及び４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトンのナトリウム塩。
【請求項２４】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、ペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項２５】
請求項２３に記載のキットにおいて、
前記ペプチドには、配列番号６〜１３からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれることを特徴とするキット。
【請求項１】
α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体を同定するための方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法。
ａ）前記被験体から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）Ｃ／Ｔを決定する工程。
ｂ）ＣＴ８０７遺伝子型を有する被験体から得られた血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程。
ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する被験体を、α２β１インテグリン受容体の遮断に反応する被験体として同定する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
工程ａ）は、制限酵素断片長多型に基づくことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
工程ｂ）は、フローサイトメーター又はシンチレーションカウンターを用いた、オートラジオグラフィー、化学発光、測光、蛍光検出法又は発光検出法によって行われることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
工程ｃ）における前記高い発現レベルは、平均蛍光が３５以上であることを意味することを特徴とする方法。
【請求項５】
α２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置が必要な患者において、そのような処置に対する反応性を決定するための方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法。
ａ）前記患者から得られた試料において、配列番号１に示されるα２インテグリンｃＤＮＡの塩基対８０７に位置するＳＮＰ Ｃ／Ｔを決定する工程。
ｂ）前記患者がＣＴ８０７遺伝子型を有すると決定された場合に、インビトロで血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを測定する工程。
ｃ）ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者を、α２β１インテグリン受容体の遮断に対して反応性を示すものとして指定する工程。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記患者は、血栓塞栓症の症状に罹患していることを特徴とする方法。
【請求項７】
患者の血栓塞栓症の症状の処置、予防、及び／又は緩和のための方法であって、
ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有する患者に対して、α２β１インテグリン阻害剤を有効量投与する工程を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、
前記阻害剤は、ペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＴＴ８０７遺伝子型と、α２β１インテグリンの高い発現レベルを伴うＣＴ８０７遺伝子型とのいずれかを有することにより、反応性があると診断された患者における血栓塞栓性の症状を予防、処置、及び／又は緩和するための薬学的組成物の製造のための、α２β１インテグリン阻害剤あるいはそれらの組み合わせの使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、抗体であることを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用において、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とする使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の使用において、
前記阻害剤は、ペプチドであることを特徴とする使用。
【請求項１７】
ヒト被験体においてα２β１インテグリン受容体の遮断に対する反応性を決定するためのキットであって、以下を含むことを特徴とするキット。
ａ）α２インテグリン遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー、及び、状況に応じて他のＰＣＲ試薬。
ｂ）Ｂｇｌ ＩＩ制限酵素及び適切な緩衝液。
ｃ）血小板でのα２β１インテグリンの発現レベルを検出するためのα２β１インテグリン結合試薬。
ｄ）前記ヒト被験体がα２β１インテグリン受容体の遮断を引き起こす処置に反応性があるかどうかを決定するための説明書。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットにおいて、
ａ）は、配列番号２に示されるα２インテグリン遺伝子の領域１〜３０５１１ｎｔにハイブリダイズする第１のプライマーと、配列番号３に示されるインテグリンα２遺伝子の領域１〜６７５１ｎｔにハイブリダイズする第２のプライマーとを含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記第１のプライマーには、配列番号４に示されるヌクレオチド配列が含まれ、
前記第２のプライマーには、配列番号５に示されるヌクレオチド配列が含まれることを特徴とするキット。
【請求項２０】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、抗体であることを特徴とするキット。
【請求項２１】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、α２β１インテグリン結合化合物であることを特徴とするキット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットにおいて、
前記化合物は、スルホンアミド誘導体であることを特徴とするキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットにおいて、
前記スルホンアミド誘導体は、以下の群より選択されることを特徴とするキット。
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチルアミン、
２Ｈ−ベンゾ［３，４−ｄ］１，３−ジオキソラン−５−イル［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチルアミン、［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］−スルホニル｝メチルアミンの塩酸塩、
｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝メチル（２−メチルベンゾキサゾール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］｛４−［（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）メチルアミノ］−フェニル｝メチルアミン、
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］｛［３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）フェニル］スルホニル｝−メチルアミン、
［（３−ブロモフェニル）スルホニル］メチル（２−メチルインドール−５−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−６−イル）アミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］カルバゾール−３−イルメチルアミン、
［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］（１，２−ジメチルインドール−５−イル）メチルアミン、
及び［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］メチル（１−メチルインドール−５−イル）アミン、
及び４−（｛［３−（４−フルオロフェニル）フェニル］スルホニル｝アミノ）フェニルフェニルケトンのナトリウム塩。
【請求項２４】
請求項１７に記載のキットにおいて、
前記α２β１インテグリン結合試薬は、ペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項２５】
請求項２３に記載のキットにおいて、
前記ペプチドには、配列番号６〜１３からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれることを特徴とするキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５２７２３３（Ｐ２０１０−５２７２３３Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０３５３６（Ｐ２０１０−５０３５３６）
【出願日】平成２０年４月１６日（２００８．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５７３８
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０００２１５８３）バイオティ セラピーズ コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１６日（２００８．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５７３８
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０００２１５８３）バイオティ セラピーズ コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]