クロロゲン酸酵素処理物の製造方法及びヒアルロニダーゼ阻害剤
【課題】ヒアルロニダーゼ阻害活性の高いクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品を提供すること。
【解決手段】クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造し、該クロロゲン酸酵素処理物を有効成分として含有することを特徴とする。
【解決手段】クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造し、該クロロゲン酸酵素処理物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、コラーゲン、エラスチンと並ぶ哺乳動物の結合組織に広く存在するマトリックス成分の一つである。ヒアルロン酸の機能は細胞の保持、皮膚の保水、関節の潤滑など物理的なものから、近年では血管内皮細胞、多形核白血球、マクロファージなどの細胞機能の制御など、生化学的なものも注目されている。生体内のヒアルロン酸は比較的短期間で代謝回転されており、通常の状態ではヒアルロン酸合成酵素と分解酵素の活性の平衡が保たれている。
【０００３】
しかし、一般的に、老化に伴いこの平衡が失われ、ヒアルロン酸合成に対して分解酵素（ヒアルロニダーゼ）活性が亢進することになって、組織の柔軟性や湿潤性も失われ、皮膚のしわ等の老人性変化を引き起こす。
【０００４】
また、Ｉ型アレルギーの肥満細胞からの脱顆粒とヒアルロニダーゼ活性に相関があることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
慢性関節炎リウマチの炎症部位でもヒアルロニダーゼ活性が亢進することもよく知られている。更に癌細胞が血管新生する際に、ヒアルロニダーゼ活性が亢進すると報告されている。
【０００６】
従って、ヒアルロニダーゼを阻害することは、皮膚老化、アレルギー性の炎症、リウマチ性関節炎、腫瘍の成長等の進行を抑制することにつながる。
【０００７】
従来、特許文献１には、コーヒー豆のような食品の抽出物がヒアルロニダーゼ亢進により発現する炎症に対する抗炎症作用を有する旨の記載があるが、抽出物の酵素処理は行っていない。このためコーヒー豆の抽出物について測定されたヒアルロニダーゼ阻害活性は、実用に値する高い値を示さない欠点がある。
【０００８】
なお、コーヒー豆抽出物に含まれている成分のひとつであるクロロゲン酸に関しては、特許文献２は、クロロゲン酸を含有する高血圧症予防・治療剤について記載しているが、クロロゲン酸の酵素処理は行っていない。特許文献３は、クロロゲン酸を含有するコーヒー豆抽出物がダイエット作用を有する旨記載しているが、クロロゲン酸の酵素処理は行っていない。
【０００９】
特許文献４には、カフェ酸又はカフェ−タンニン酸の酵素処理を必須成分とする抗アレルギー食品について記載しているが、カフェ酸及びカフェ−タンニン酸の酵素処理は行っていない。特許文献５には、クロロゲン酸にポリフェノールオキシダーゼを作用させ褐変させる技術が記載されているが、ヒアルロニダーゼ阻害作用については記載がない。
【００１０】
特許文献６には、コーヒー豆抽出物であるヒドロキシヒドロキノンにラッカーゼ酵素を作用させて酸化する技術が記載されているが、クロロゲン酸は酸化しないと記載している（００１１欄）。
【非特許文献１】ヒサオ カケガワ、“Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．”、１９８５、３３(１１)５０７９−５０８２
【特許文献１】特開平１１−３１８３８７号公報
【特許文献２】特開２００２−０５３４６４号公報
【特許文献３】特開２００６−３３５７５８号公報
【特許文献４】特開昭６０-１９２５５５号公報
【特許文献５】特公昭５７−３７３０１号公報
【特許文献６】特開２００６−１４９２３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、ヒアルロニダーゼ阻害活性の高い組成物について研究を重ねるうちに、クロロゲン酸に特定の酵素を作用させて得られる酵素処理物に、ヒアルロニダーゼを強く阻害する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
そこで、本発明の課題は、クロロゲン酸を酵素処理することにより得られるヒアルロニダーゼ阻害活性の高いクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（請求項１）
クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１５】
（請求項２）
クロロゲン酸類が、コーヒー由来のものであることを特徴とする請求項１記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１６】
（請求項３）
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが、コーヒー豆中に内在するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１７】
（請求項４）
請求項１〜３の何れかに記載の製造方法によって得られるクロロゲン酸酵素処理物を、有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【００１８】
（請求項５）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【００１９】
（請求項６）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲料及び食品。
【００２０】
（請求項７）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、クロロゲン酸を酵素処理することにより得られるヒアルロニダーゼ阻害活性の高いクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品を提供することができる。
【００２２】
即ち、このクロロゲン酸酵素処理物は、酵素処理を行わないクロロゲン酸に比べ、はるかにヒアルロニダーゼ阻害活性が強いので、この酵素処理物を有効成分として含有することで、皮膚老化、抗アレルギー、抗炎症効果が期待でき、皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
クロロゲン酸類には、クロロゲン酸（ｃｈｌｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、すなわちカフェ酸(ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ)とキナ酸(ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ)が結合した５−カフェオイルキナ酸ともいわれるポリフェノール化合物があり、その他、異性体としてネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、また、カフェ酸２分子がキナ酸１分子と結合したイソクロロゲン酸類があり、それらすべてを総称したものである。
【００２５】
本発明においては、クロロゲン酸酵素処理物とは、特に５-カフェオイルキナ酸に限定したものではなく、クロロゲン酸類全般の酵素処理物である。
【００２６】
本発明において、クロロゲン酸類が合成品か天然物かは限定されない。クロロゲン酸類は広く植物体中に存在するものであり、その種類を問わない。クロロゲン酸類の起源品としては、コーヒー、バナナ、リンゴ、ゴボウ等が挙げられるが、コーヒーが最もクロロゲン酸類の含量が豊富であり好ましい。
【００２７】
本発明に使用するコーヒーは、コーヒー生豆の他、生豆に果肉部分と外皮部分までを含んだコーヒー果実を用いることもでき、これらのコーヒー由来のものを用いることができるが、中でもコーヒー生豆が好ましい。
【００２８】
本発明では、これらコーヒー由来となるコーヒーの品種としては、アラビカ種、ロブスタ種などがあり、収穫する場所としては、ブラジル、コロンビア、タンザニア、インドネシア、ベトナムなどがあるが、特に品種や産地を指定するものではない。
【００２９】
コーヒー豆は、単品種で使用しても良いし、複数種をブレンドして用いてもよい。コーヒー豆は、焙煎をしない生豆のまま使用しても良いし、焙煎しても良い。焙煎する場合、通常の方法を採用することができるが、好ましくは、焙煎によるコーヒーに含まれるクロロゲン酸類の消失が少ない浅煎りが好ましい。
【００３０】
クロロゲン酸類を含有する素材としてコーヒーの生豆あるいは焙煎豆を用いて酵素処理物を得る場合、粉砕するか又はそのままの状態で加水し、酵素を加えて酵素反応を行う。あるいは、加水後に熱水抽出等を行い、抽出物の残渣を除いてから酵素を加えて、酵素反応を行うこともできる。
【００３１】
本発明では、酵素として、ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを用いる。
【００３２】
ポリフェノールオキシダーゼを用いる場合、コーヒー豆中に存在する内在のポリフェノールオキシダーゼを利用してもよいし、食品添加物等工業用酵素を用いても良く、その種類は限定されない。
【００３３】
ポリフェノールオキシダーゼの使用量は、特に制限されるものではないが、基質であるクロロゲン酸類に対し、０．１〜１０,０００ Ｕ／ｇの範囲の量を添加することが好ましく、より好ましくは１０〜１,０００ Ｕ／ｇである。
【００３４】
ポリフェノールオキシダーゼを作用させる手段としては、コーヒー豆を含む水、あるいはコーヒー豆抽出液の反応温度を好ましくは８０℃以下、より好ましくは２０〜６０℃として、好気的に酵素反応を進めればよい。
【００３５】
酵素反応中は、激しく攪拌することが酵素反応の基質の１つである酸素の供給の点で好ましく、通気しながらの攪拌が酸素供給量の増大及びそれに伴う反応速度の向上の点でさらに好ましい。反応時間は、１分〜１２時間が好ましく、より好ましくは３０分〜５時間である。
【００３６】
ペルオキシダーゼを用いる場合は、反応は過酸化物の存在下で行う必要がある。過酸化物としては、過酸化水素が好ましい。以下は過酸化水素を用いる例について説明する。
【００３７】
用いる酵素は西洋ワサビから粗酵素液を調製することもできるし、コーヒー豆に内在するペルオキシダーゼを利用しても良い。また、食品添加物等工業用酵素を用いてもよく、その種類は限定されない。
【００３８】
ペルオキシダーゼの使用量は、特に制限されるものではないが、基質であるクロロゲン酸類に対し、０．１〜１０,０００Ｕ／ｇの範囲が好ましく、より好ましくは１０〜１,０００ Ｕ／ｇの範囲である。
【００３９】
過酸化水素の使用量は、特に限定されるものではないが、クロロゲン酸類に対し、１〜１,０００ｍｇ／ｇとなるように添加することが好ましい。
【００４０】
過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼを作用させる手段としては、コーヒー豆を含む水あるいはコーヒー豆抽出液の反応温度を好ましくは８０℃以下、より好ましくは２０〜６０℃で攪拌しながら反応すればよい。反応時間は条件により異なるが、１分〜１２時間で十分である。
【００４１】
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼによるクロロゲン酸類の酵素処理が十分に進んだ時点で、８０℃以上に加熱することで酵素を失活させて反応を停止させる。
【００４２】
前記の処理により得られたクロロゲン酸酵素処理物を、濾過又は、遠心分離などの固液分離の工程により残渣を取り除くと、クロロゲン酸酵素処理物を含有する水溶液が得られる。さらに濃縮しても良いし、粉末にしてもよい。
【００４３】
クロロゲン酸酵素処理物は、クロロゲン酸類が酵素によりクロロゲン酸キノンに酸化され、さらに酸化重合することによって得られる。
【００４４】
クロロゲン酸酵素処理物は、クロロゲン酸類の、ジフェノールのオルト位やパラ位が反応した生成物、側鎖として結合している２重結合のα位やβ位が反応した生成物など多様な重合様式で、重合度（ｎ≧２）が異なる生成物の混合物であり、生成物の重合様式、重合度は特定されない。
【００４５】
得られたクロロゲン酸酵素処理物は、高いヒアルロニダーゼ阻害効果を有し、ヒアルロニダーゼ活性に起因する皮膚老化、アレルギー、炎症などを予防、防止又は低下させ、例えば食品としての価値を向上させるものである。
【００４６】
本発明のクロロゲン酸酵素処理物は、溶液又は粉末形態として製剤化することができ、あるいは添加対象とする製品の性状や工程などに合わせ、顆粒状やペースト状の最も効果が期待できる剤型に加工することができる。
【００４７】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、上記のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分として含むものである。従って、上記のクロロゲン酸酵素処理物と他の成分との混合状態であってもよい。
【００４８】
当該他の成分としては、クロロゲン酸酵素処理物の効果を損なわないものであって、かつ皮膚外用剤、飲料、食品及び医薬品の加工やその機能などに好ましい効果を有するものを使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の有効成分であるクロロゲン酸酵素処理物は、目的とする効果や使用方法からその添加量、濃度を算出すればよい。
【００５０】
本発明に係る皮膚外用剤は、本発明のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分とする化粧料（医薬部外品を含む）であり、さらには、コーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物を含有し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する化粧料である。
【００５１】
本発明に係る皮膚外用剤の剤型は任意であり、カプセル状、顆粒状、粉末状、固形状、液状、ゲル状、気泡状、液乳状、クリーム状、軟膏状、シート状などがあり、例えば、基礎化粧料をはじめ、メイクアップ化粧料、洗顔料、頭髪用化粧料、香水類、浴用剤、歯磨類等様々な製品それらの原材料又は加工中間物等として利用可能であるが、これらの例示に限定されるものではない。
【００５２】
本発明に係る皮膚外用剤の製造方法は、既知のいずれの方法によっても可能である。また、油脂類、ロウ類、各種植物抽出物、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、動物由来原料、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤など、通常の皮膚外用剤原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。さらに、一般にヒアルロニダーゼ阻害剤として既知である他の植物抽出物などを併用することで、皮膚老化防止、抗アレルギー及び抗炎症の効果を高めることもできる。
【００５３】
本発明に係る皮膚外用剤におけるクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤形などを考慮して定めることが望ましいが、一般的には製品の全量に対して０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜５０重量％程度とすればよい。
【００５４】
本発明に係る飲料及び食品は、本発明のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするものであり、さらには、コーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物を含有し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する飲料及び食品である。
【００５５】
剤型としては、液状、エキス状、ペースト状、固形状、粉末状、顆粒状などがあり、各種飲食品としては、例えば、嗜好飲料、乳飲料、アルコール飲料、穀物加工品、大豆加工品、油脂加工品、食肉加工品、水産加工品、野菜・果実加工品、乳製品、菓子類、冷菓類、調味料などが挙げられる。しかし、前記例示により本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の取り得る形態が限定されるものではない。
【００５６】
本発明に係る飲料及び食品の製造方法は、既知のいずれの方法によっても行うことができる。また、糖類、アミノ酸類、油脂類、塩類、甘味料、有機酸、乳化剤、増粘剤、栄養強化剤、色素、香料、保存料など、通常の飲料及び食品の原料として使用されているものを適宜使用することができる。また、抗アレルギー効果が既知である乳酸菌、酵母菌体などを併用することで抗アレルギー効果を高めることもでき、さらに一般にヒアルロニダーゼ阻害効果が既知である他の植物抽出液などを併用することで、抗アレルギー及び抗炎症の効果を高めることもできる。
【００５７】
本発明に係る飲料及び食品において、本発明のクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤型などを考慮して定めることが好ましいが、一般的には全量の０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜８０重量％程度とすればよい。
【００５８】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、医薬品製剤用原料を適宜配合し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する医薬品として、錠剤、丸剤、軟・硬カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤等の経口投与剤あるいは、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤などの外用剤として適用することもできる。
【００５９】
医薬品製剤用原料としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、吸着剤、潤沢剤などが挙げられる。さらにヒアルロン酸を併用することで、抗アレルギー及び抗炎症の効果をより高めることもできる。本発明に係る医薬品におけるクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤型などを考慮して定めるが、一般的には全量の０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜８０重量％程度と考えられる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明の実施の形態を具体的な実施例に基づいて説明するが、本発明は、本実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１
東京化成工業社製のクロロゲン酸を水に溶かし０．１％水溶液とした。その水溶液にアマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００Ｕ／ｇ）を０．１％添加し、５０℃で１時間振盪させ、その後、加温し、９０℃達温後、１０分間保持することで、酵素を失活させ、クロロゲン酸酵素処理物含有水溶液を得た。
【００６２】
実施例２
東京化成工業社製のクロロゲン酸を水に溶かし０．１％水溶液とした。その水溶液に和光純薬社製の酵素ペルオキシダーゼ（１００Ｕ／ｍｇ、西洋ワサビ由来）を０．０５％と、３５％過酸化水素水を０．０１％添加して、３０℃で１時間振盪させ、その後、加温し、９０℃達温後、１０分間保持することで、酵素を失活させ、クロロゲン酸酵素処理物含有水溶液を得た。
【００６３】
比較例１（酵素処理なし）
酵素を添加しない以外は実施例1と同様に実施し、クロロゲン酸含有水溶液を得た。
【００６４】
実施例３
アラビカ種のコーヒー生豆１００ｇを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、アマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００ Ｕ／g）をコーヒー生豆に対し、０．２％添加し、６０℃、３時間攪拌した後、加熱して８５℃に達温後、３０分間保持してラッカーゼを失活させた。この酵素処理液を遠心分離して、その上清を減圧濃縮し、Ｂｒｉｘ２０（糖度と固形分濃度の比）とした。さらに、これを凍結乾燥して、２３ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸重合物であるクロロゲン酸酵素処理物粉末を得た。
【００６５】
実施例４
ロブスタ種のコーヒー生豆１００ｇを焙煎し、９２ｇの焙煎コーヒー豆を得た。それを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、アマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００Ｕ／ｇ）を焙煎コーヒー豆に対し、０．１％添加し、６０℃、３時間通気しながら攪拌した後、加熱して９０℃に達温後、１０分間保持してラッカーゼを失活させた。この酵素処理液を濾過してコーヒー固形分に対して４倍量のデキストリンを加え、凍結乾燥して、１１９ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物含有粉末を得た。
【００６６】
比較例２（酵素処理なし）
実施例４と同様に、ロブスタ種のコーヒー生豆１００ｇを焙煎し、９０ｇの焙煎コーヒー豆を得た。それを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、攪拌しながら加熱して９０℃に達温後、１０分間保持した。この抽出液を濾過してコーヒー固形分に対して４倍量のデキストリンを加え、凍結乾燥して、１２１ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸含有粉末を得た。
【００６７】
実施例５
ロブスタ種のコーヒー生豆３０ｇを粗粉砕し、水３００ｇを加え、３５℃で６時間攪拌し、コーヒー生豆中に内在するポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを作用させる方法で酵素反応を行った。その後、ろ紙濾過することで、コーヒー生豆由来のクロロゲン酸酵素処理物含有抽出液を得た。これを減圧濃縮することで、Ｂｒｉｘ２４％のクロロゲン酸酵素処理物含有エキス２９ｇを得た。
【００６８】
比較例３
実施例５と同様のコーヒー生豆を粗粉砕し、８０℃の温水３００ｇを加え、さらに９０℃達温後、１０分間保持し、コーヒー生豆中のポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼの活性を失活させた後、３時間攪拌し、その後、ろ紙濾過することで、コーヒー生豆由来のクロロゲン酸含有抽出液を得た。これを減圧濃縮することで、Ｂｒｉｘ２６％のクロロゲン酸含有エキス２４ｇを得た。
【００６９】
〔ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定〕
実施例１〜５、比較例１〜３、及び、抗アレルギー剤として知られる甜茶抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を、以下の方法で分析した。
【００７０】
ヒアルロニダーゼ（ｔｙｐｅＩＶ−Ｓ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液の１００μＬ（４５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）に試料２００μＬを加えて、３７℃で２０分間放置した。
【００７１】
次に酵素活性化剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０、Ｓｉｇｍａ社製）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）２００μＬを加え、３７℃で２０分間放置した後、基質であるヒアルロン酸カリウム（ｆｒｏｍ ｒｏｏｓｔｅｒ ｃｏｍｂ、和光純薬工業社製）溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）５００μＬを入れ、３７℃で４０分間放置した。
【００７２】
次いで、０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２００μＬを加えて反応を停止させた後、０．８Ｍホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、沸騰水中で３分間加熱した。室温まで冷却後、１％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド酢酸溶液６ｍＬを加え、３７℃で２０分間放置した後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７３】
試料は実施例１〜５、比較例１〜３で得られたもの及び甜茶抽出物を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で適切な濃度に調製した。
【００７４】
上記と同様の酵素反応と吸光度測定を、試料溶液の代わりに緩衝液を用いて行った。さらにそれぞれの場合について酵素を添加せずに緩衝液を加えて同様の操作を行った。
【００７５】
以下の数式１により阻害率を算出し、ＩＣ50（５０％阻害活性）の値を求めた。表１にＩＣ50の値を示した。
（数式１）
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝（１−（Ａ−Ｂ）/（Ｃ−Ｄ））×１００
Ａ：試料溶液添加、酵素添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、酵素無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、酵素添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、酵素無添加時の吸光度
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１から、比較例１のクロロゲン酸単体では、ヒアルロニダーゼ阻害活性を示さなかったが、実施例１と２のクロロゲン酸酵素処理物は、高いヒアルロニダーゼ阻害活性を示した。
【００７８】
実施例４と比較例２の場合、デキストリンをコーヒー抽出物の４倍量添加したことから、実質的なＩＣ50の値は、それぞれ表１の値の１／５となるため、実施例４の場合もある程度高いヒアルロニダーゼ阻害活性を示したということができる。
【００７９】
実施例３〜５におけるクロロゲン酸酵素処理物の方が、甜茶抽出物よりも明らかに高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有することがわかった。
【００８０】
なお、各実施例において、クロロゲン酸類含量を高速液体クロマトグラフ法により測定した結果、実施例１と２のクロロゲン酸酵素処理物はクロロゲン酸が不検出となり、実施例３，４及び５の場合、クロロゲン酸が酵素処理する前の１／１０の含量となり、クロロゲン酸酵素処理物の同酵素阻害活性を裏付けるものであった。
【００８１】
実施例６（化粧水）
実施例３で得られたクロロゲン酸酵素処理物粉末から抽出されたクロロゲン酸酵素処理物エキス５ｇ、グリセリン１０ｇ、クエン酸０．１ｇ、及び精製水１００ｇを混合し、化粧水（ローション）を調製し、５名の被験者の皮膚に塗布した。
【００８２】
その結果、被験者のうち、２名が肌の張り、つやが改善されたと回答した。他の２名も僅かに改善されたと回答し、肌の張り、つやを改善する効果が示された。
【００８３】
実施例７（コーヒー飲料）
以下のようなコーヒー飲料を調製し、その評価を行った。
【００８４】
焙煎コーヒー豆５ｇに対し熱湯を注ぎ１００ｍＬのコーヒーを抽出し、その中に実施例４で得られたクロロゲン酸酵素処理物粉末から抽出されたクロロゲン酸酵素処理物エキスを１．０％、砂糖４．７％、脱脂粉乳０．４％、全脂粉乳０．２５％、重曹０．１２％、乳化剤０．１％を加え、７０℃で攪拌乳化し、コーヒー飲料を調製した。
【００８５】
そのコーヒー飲料をアレルギー性鼻炎を患う４名の被験者に１ヶ月間、毎日１５０ｍｌ喫飲させた。
【００８６】
その結果、被験者のうち、２名が鼻水、鼻づまり症状が改善したと回答した。他の１名も改善傾向を体感したと回答し、アレルギー性鼻炎の症状を改善する効果が示された。
【００８７】
実施例８（配合例）
以下に上述のクロロゲン酸酵素処理物の用途として配合例を示す。各々の配合例は常法により製造したもので、配合量のみを記した。単位は％（重量／重量）とする。
【００８８】
［配合例１］クリーム
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ５．０
ステアリン酸 ８．０
ステアリルアルコール ４．０
ステアリン酸ブチル ６．０
プロピレングリコール ５．０
モノステアリン酸グリセリン ２．０
水酸化カリウム ０．４
防腐剤 適 量
酸化防止剤 適 量
香料 適 量
精製水 ７０．０
【００８９】
［配合例２］ローション
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ５．０
ステアリン酸 ２．０
セチルアルコール １．５
ワセリン ４．０
グリセロールトリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．０
ソルビタンモノオレイン酸エステル ２．０
ジプロピレングリコール ５．０
ＰＥＧ１５００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
香料 適 量
防腐剤 適 量
精製水 １００とする残余
【００９０】
［配合例３］キャンディー
クロロゲン酸酵素処理物含有粉末（実施例４） ０．８
砂糖 ４２．０
水飴 ４５．０
クエン酸 ２．０
香料 ０．２
水 １０．０
【００９１】
［配合例４］アイスクリーム
クロロゲン酸酵素処理物含有粉末（実施例４） ０．６
生クリーム ３３．８
脱脂粉乳 １１．０
グラニュー糖 １４．８
加糖卵黄 ０．３
バニラエッセンス ０．１
水 ３９．４
【００９２】
［配合例５］錠剤（サプリメント）
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ６０．０
Ｌ−アスコルビン酸 １０．０
乳糖 １５．０
ステアリン酸マグネシウム １５．０
【００９３】
［配合例６］カプセル剤（サプリメント）
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ８０．０
酢酸カルシウム・一水塩 １０．０
Ｌ−乳酸マグネシウム・三水塩 １０．０
【００９４】
［配合例７］軟膏
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） １．０
酢酸ナトリウム・三水塩 １．０
ＤＬ―乳酸カルシウム ４．０
グリセリン １０．０
ワセリン ５０．０
木ロウ １０．０
ラノリン ９．０
ゴマ油 １４．５
ハッカ油 ０．５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、コラーゲン、エラスチンと並ぶ哺乳動物の結合組織に広く存在するマトリックス成分の一つである。ヒアルロン酸の機能は細胞の保持、皮膚の保水、関節の潤滑など物理的なものから、近年では血管内皮細胞、多形核白血球、マクロファージなどの細胞機能の制御など、生化学的なものも注目されている。生体内のヒアルロン酸は比較的短期間で代謝回転されており、通常の状態ではヒアルロン酸合成酵素と分解酵素の活性の平衡が保たれている。
【０００３】
しかし、一般的に、老化に伴いこの平衡が失われ、ヒアルロン酸合成に対して分解酵素（ヒアルロニダーゼ）活性が亢進することになって、組織の柔軟性や湿潤性も失われ、皮膚のしわ等の老人性変化を引き起こす。
【０００４】
また、Ｉ型アレルギーの肥満細胞からの脱顆粒とヒアルロニダーゼ活性に相関があることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
慢性関節炎リウマチの炎症部位でもヒアルロニダーゼ活性が亢進することもよく知られている。更に癌細胞が血管新生する際に、ヒアルロニダーゼ活性が亢進すると報告されている。
【０００６】
従って、ヒアルロニダーゼを阻害することは、皮膚老化、アレルギー性の炎症、リウマチ性関節炎、腫瘍の成長等の進行を抑制することにつながる。
【０００７】
従来、特許文献１には、コーヒー豆のような食品の抽出物がヒアルロニダーゼ亢進により発現する炎症に対する抗炎症作用を有する旨の記載があるが、抽出物の酵素処理は行っていない。このためコーヒー豆の抽出物について測定されたヒアルロニダーゼ阻害活性は、実用に値する高い値を示さない欠点がある。
【０００８】
なお、コーヒー豆抽出物に含まれている成分のひとつであるクロロゲン酸に関しては、特許文献２は、クロロゲン酸を含有する高血圧症予防・治療剤について記載しているが、クロロゲン酸の酵素処理は行っていない。特許文献３は、クロロゲン酸を含有するコーヒー豆抽出物がダイエット作用を有する旨記載しているが、クロロゲン酸の酵素処理は行っていない。
【０００９】
特許文献４には、カフェ酸又はカフェ−タンニン酸の酵素処理を必須成分とする抗アレルギー食品について記載しているが、カフェ酸及びカフェ−タンニン酸の酵素処理は行っていない。特許文献５には、クロロゲン酸にポリフェノールオキシダーゼを作用させ褐変させる技術が記載されているが、ヒアルロニダーゼ阻害作用については記載がない。
【００１０】
特許文献６には、コーヒー豆抽出物であるヒドロキシヒドロキノンにラッカーゼ酵素を作用させて酸化する技術が記載されているが、クロロゲン酸は酸化しないと記載している（００１１欄）。
【非特許文献１】ヒサオ カケガワ、“Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．”、１９８５、３３(１１)５０７９−５０８２
【特許文献１】特開平１１−３１８３８７号公報
【特許文献２】特開２００２−０５３４６４号公報
【特許文献３】特開２００６−３３５７５８号公報
【特許文献４】特開昭６０-１９２５５５号公報
【特許文献５】特公昭５７−３７３０１号公報
【特許文献６】特開２００６−１４９２３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、ヒアルロニダーゼ阻害活性の高い組成物について研究を重ねるうちに、クロロゲン酸に特定の酵素を作用させて得られる酵素処理物に、ヒアルロニダーゼを強く阻害する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
そこで、本発明の課題は、クロロゲン酸を酵素処理することにより得られるヒアルロニダーゼ阻害活性の高いクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（請求項１）
クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１５】
（請求項２）
クロロゲン酸類が、コーヒー由来のものであることを特徴とする請求項１記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１６】
（請求項３）
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが、コーヒー豆中に内在するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【００１７】
（請求項４）
請求項１〜３の何れかに記載の製造方法によって得られるクロロゲン酸酵素処理物を、有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【００１８】
（請求項５）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【００１９】
（請求項６）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲料及び食品。
【００２０】
（請求項７）
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、クロロゲン酸を酵素処理することにより得られるヒアルロニダーゼ阻害活性の高いクロロゲン酸酵素処理物の製造方法、クロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、及び該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品を提供することができる。
【００２２】
即ち、このクロロゲン酸酵素処理物は、酵素処理を行わないクロロゲン酸に比べ、はるかにヒアルロニダーゼ阻害活性が強いので、この酵素処理物を有効成分として含有することで、皮膚老化、抗アレルギー、抗炎症効果が期待でき、皮膚外用剤、飲料及び食品、医薬品として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
クロロゲン酸類には、クロロゲン酸（ｃｈｌｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、すなわちカフェ酸(ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ)とキナ酸(ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ)が結合した５−カフェオイルキナ酸ともいわれるポリフェノール化合物があり、その他、異性体としてネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、また、カフェ酸２分子がキナ酸１分子と結合したイソクロロゲン酸類があり、それらすべてを総称したものである。
【００２５】
本発明においては、クロロゲン酸酵素処理物とは、特に５-カフェオイルキナ酸に限定したものではなく、クロロゲン酸類全般の酵素処理物である。
【００２６】
本発明において、クロロゲン酸類が合成品か天然物かは限定されない。クロロゲン酸類は広く植物体中に存在するものであり、その種類を問わない。クロロゲン酸類の起源品としては、コーヒー、バナナ、リンゴ、ゴボウ等が挙げられるが、コーヒーが最もクロロゲン酸類の含量が豊富であり好ましい。
【００２７】
本発明に使用するコーヒーは、コーヒー生豆の他、生豆に果肉部分と外皮部分までを含んだコーヒー果実を用いることもでき、これらのコーヒー由来のものを用いることができるが、中でもコーヒー生豆が好ましい。
【００２８】
本発明では、これらコーヒー由来となるコーヒーの品種としては、アラビカ種、ロブスタ種などがあり、収穫する場所としては、ブラジル、コロンビア、タンザニア、インドネシア、ベトナムなどがあるが、特に品種や産地を指定するものではない。
【００２９】
コーヒー豆は、単品種で使用しても良いし、複数種をブレンドして用いてもよい。コーヒー豆は、焙煎をしない生豆のまま使用しても良いし、焙煎しても良い。焙煎する場合、通常の方法を採用することができるが、好ましくは、焙煎によるコーヒーに含まれるクロロゲン酸類の消失が少ない浅煎りが好ましい。
【００３０】
クロロゲン酸類を含有する素材としてコーヒーの生豆あるいは焙煎豆を用いて酵素処理物を得る場合、粉砕するか又はそのままの状態で加水し、酵素を加えて酵素反応を行う。あるいは、加水後に熱水抽出等を行い、抽出物の残渣を除いてから酵素を加えて、酵素反応を行うこともできる。
【００３１】
本発明では、酵素として、ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを用いる。
【００３２】
ポリフェノールオキシダーゼを用いる場合、コーヒー豆中に存在する内在のポリフェノールオキシダーゼを利用してもよいし、食品添加物等工業用酵素を用いても良く、その種類は限定されない。
【００３３】
ポリフェノールオキシダーゼの使用量は、特に制限されるものではないが、基質であるクロロゲン酸類に対し、０．１〜１０,０００ Ｕ／ｇの範囲の量を添加することが好ましく、より好ましくは１０〜１,０００ Ｕ／ｇである。
【００３４】
ポリフェノールオキシダーゼを作用させる手段としては、コーヒー豆を含む水、あるいはコーヒー豆抽出液の反応温度を好ましくは８０℃以下、より好ましくは２０〜６０℃として、好気的に酵素反応を進めればよい。
【００３５】
酵素反応中は、激しく攪拌することが酵素反応の基質の１つである酸素の供給の点で好ましく、通気しながらの攪拌が酸素供給量の増大及びそれに伴う反応速度の向上の点でさらに好ましい。反応時間は、１分〜１２時間が好ましく、より好ましくは３０分〜５時間である。
【００３６】
ペルオキシダーゼを用いる場合は、反応は過酸化物の存在下で行う必要がある。過酸化物としては、過酸化水素が好ましい。以下は過酸化水素を用いる例について説明する。
【００３７】
用いる酵素は西洋ワサビから粗酵素液を調製することもできるし、コーヒー豆に内在するペルオキシダーゼを利用しても良い。また、食品添加物等工業用酵素を用いてもよく、その種類は限定されない。
【００３８】
ペルオキシダーゼの使用量は、特に制限されるものではないが、基質であるクロロゲン酸類に対し、０．１〜１０,０００Ｕ／ｇの範囲が好ましく、より好ましくは１０〜１,０００ Ｕ／ｇの範囲である。
【００３９】
過酸化水素の使用量は、特に限定されるものではないが、クロロゲン酸類に対し、１〜１,０００ｍｇ／ｇとなるように添加することが好ましい。
【００４０】
過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼを作用させる手段としては、コーヒー豆を含む水あるいはコーヒー豆抽出液の反応温度を好ましくは８０℃以下、より好ましくは２０〜６０℃で攪拌しながら反応すればよい。反応時間は条件により異なるが、１分〜１２時間で十分である。
【００４１】
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼによるクロロゲン酸類の酵素処理が十分に進んだ時点で、８０℃以上に加熱することで酵素を失活させて反応を停止させる。
【００４２】
前記の処理により得られたクロロゲン酸酵素処理物を、濾過又は、遠心分離などの固液分離の工程により残渣を取り除くと、クロロゲン酸酵素処理物を含有する水溶液が得られる。さらに濃縮しても良いし、粉末にしてもよい。
【００４３】
クロロゲン酸酵素処理物は、クロロゲン酸類が酵素によりクロロゲン酸キノンに酸化され、さらに酸化重合することによって得られる。
【００４４】
クロロゲン酸酵素処理物は、クロロゲン酸類の、ジフェノールのオルト位やパラ位が反応した生成物、側鎖として結合している２重結合のα位やβ位が反応した生成物など多様な重合様式で、重合度（ｎ≧２）が異なる生成物の混合物であり、生成物の重合様式、重合度は特定されない。
【００４５】
得られたクロロゲン酸酵素処理物は、高いヒアルロニダーゼ阻害効果を有し、ヒアルロニダーゼ活性に起因する皮膚老化、アレルギー、炎症などを予防、防止又は低下させ、例えば食品としての価値を向上させるものである。
【００４６】
本発明のクロロゲン酸酵素処理物は、溶液又は粉末形態として製剤化することができ、あるいは添加対象とする製品の性状や工程などに合わせ、顆粒状やペースト状の最も効果が期待できる剤型に加工することができる。
【００４７】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、上記のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分として含むものである。従って、上記のクロロゲン酸酵素処理物と他の成分との混合状態であってもよい。
【００４８】
当該他の成分としては、クロロゲン酸酵素処理物の効果を損なわないものであって、かつ皮膚外用剤、飲料、食品及び医薬品の加工やその機能などに好ましい効果を有するものを使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の有効成分であるクロロゲン酸酵素処理物は、目的とする効果や使用方法からその添加量、濃度を算出すればよい。
【００５０】
本発明に係る皮膚外用剤は、本発明のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分とする化粧料（医薬部外品を含む）であり、さらには、コーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物を含有し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する化粧料である。
【００５１】
本発明に係る皮膚外用剤の剤型は任意であり、カプセル状、顆粒状、粉末状、固形状、液状、ゲル状、気泡状、液乳状、クリーム状、軟膏状、シート状などがあり、例えば、基礎化粧料をはじめ、メイクアップ化粧料、洗顔料、頭髪用化粧料、香水類、浴用剤、歯磨類等様々な製品それらの原材料又は加工中間物等として利用可能であるが、これらの例示に限定されるものではない。
【００５２】
本発明に係る皮膚外用剤の製造方法は、既知のいずれの方法によっても可能である。また、油脂類、ロウ類、各種植物抽出物、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、動物由来原料、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤など、通常の皮膚外用剤原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。さらに、一般にヒアルロニダーゼ阻害剤として既知である他の植物抽出物などを併用することで、皮膚老化防止、抗アレルギー及び抗炎症の効果を高めることもできる。
【００５３】
本発明に係る皮膚外用剤におけるクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤形などを考慮して定めることが望ましいが、一般的には製品の全量に対して０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜５０重量％程度とすればよい。
【００５４】
本発明に係る飲料及び食品は、本発明のクロロゲン酸酵素処理物を有効成分とするものであり、さらには、コーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物を含有し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する飲料及び食品である。
【００５５】
剤型としては、液状、エキス状、ペースト状、固形状、粉末状、顆粒状などがあり、各種飲食品としては、例えば、嗜好飲料、乳飲料、アルコール飲料、穀物加工品、大豆加工品、油脂加工品、食肉加工品、水産加工品、野菜・果実加工品、乳製品、菓子類、冷菓類、調味料などが挙げられる。しかし、前記例示により本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の取り得る形態が限定されるものではない。
【００５６】
本発明に係る飲料及び食品の製造方法は、既知のいずれの方法によっても行うことができる。また、糖類、アミノ酸類、油脂類、塩類、甘味料、有機酸、乳化剤、増粘剤、栄養強化剤、色素、香料、保存料など、通常の飲料及び食品の原料として使用されているものを適宜使用することができる。また、抗アレルギー効果が既知である乳酸菌、酵母菌体などを併用することで抗アレルギー効果を高めることもでき、さらに一般にヒアルロニダーゼ阻害効果が既知である他の植物抽出液などを併用することで、抗アレルギー及び抗炎症の効果を高めることもできる。
【００５７】
本発明に係る飲料及び食品において、本発明のクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤型などを考慮して定めることが好ましいが、一般的には全量の０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜８０重量％程度とすればよい。
【００５８】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、医薬品製剤用原料を適宜配合し、ヒアルロニダーゼ阻害効果を奏する医薬品として、錠剤、丸剤、軟・硬カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤等の経口投与剤あるいは、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤などの外用剤として適用することもできる。
【００５９】
医薬品製剤用原料としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、吸着剤、潤沢剤などが挙げられる。さらにヒアルロン酸を併用することで、抗アレルギー及び抗炎症の効果をより高めることもできる。本発明に係る医薬品におけるクロロゲン酸酵素処理物の配合量は、その剤型などを考慮して定めるが、一般的には全量の０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜８０重量％程度と考えられる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明の実施の形態を具体的な実施例に基づいて説明するが、本発明は、本実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１
東京化成工業社製のクロロゲン酸を水に溶かし０．１％水溶液とした。その水溶液にアマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００Ｕ／ｇ）を０．１％添加し、５０℃で１時間振盪させ、その後、加温し、９０℃達温後、１０分間保持することで、酵素を失活させ、クロロゲン酸酵素処理物含有水溶液を得た。
【００６２】
実施例２
東京化成工業社製のクロロゲン酸を水に溶かし０．１％水溶液とした。その水溶液に和光純薬社製の酵素ペルオキシダーゼ（１００Ｕ／ｍｇ、西洋ワサビ由来）を０．０５％と、３５％過酸化水素水を０．０１％添加して、３０℃で１時間振盪させ、その後、加温し、９０℃達温後、１０分間保持することで、酵素を失活させ、クロロゲン酸酵素処理物含有水溶液を得た。
【００６３】
比較例１（酵素処理なし）
酵素を添加しない以外は実施例1と同様に実施し、クロロゲン酸含有水溶液を得た。
【００６４】
実施例３
アラビカ種のコーヒー生豆１００ｇを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、アマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００ Ｕ／g）をコーヒー生豆に対し、０．２％添加し、６０℃、３時間攪拌した後、加熱して８５℃に達温後、３０分間保持してラッカーゼを失活させた。この酵素処理液を遠心分離して、その上清を減圧濃縮し、Ｂｒｉｘ２０（糖度と固形分濃度の比）とした。さらに、これを凍結乾燥して、２３ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸重合物であるクロロゲン酸酵素処理物粉末を得た。
【００６５】
実施例４
ロブスタ種のコーヒー生豆１００ｇを焙煎し、９２ｇの焙煎コーヒー豆を得た。それを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、アマノエンザイム社製のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、１０８,０００Ｕ／ｇ）を焙煎コーヒー豆に対し、０．１％添加し、６０℃、３時間通気しながら攪拌した後、加熱して９０℃に達温後、１０分間保持してラッカーゼを失活させた。この酵素処理液を濾過してコーヒー固形分に対して４倍量のデキストリンを加え、凍結乾燥して、１１９ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸酵素処理物含有粉末を得た。
【００６６】
比較例２（酵素処理なし）
実施例４と同様に、ロブスタ種のコーヒー生豆１００ｇを焙煎し、９０ｇの焙煎コーヒー豆を得た。それを粗粉砕し、水１,０００ｇを加え、攪拌しながら加熱して９０℃に達温後、１０分間保持した。この抽出液を濾過してコーヒー固形分に対して４倍量のデキストリンを加え、凍結乾燥して、１２１ｇのコーヒー由来のクロロゲン酸含有粉末を得た。
【００６７】
実施例５
ロブスタ種のコーヒー生豆３０ｇを粗粉砕し、水３００ｇを加え、３５℃で６時間攪拌し、コーヒー生豆中に内在するポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを作用させる方法で酵素反応を行った。その後、ろ紙濾過することで、コーヒー生豆由来のクロロゲン酸酵素処理物含有抽出液を得た。これを減圧濃縮することで、Ｂｒｉｘ２４％のクロロゲン酸酵素処理物含有エキス２９ｇを得た。
【００６８】
比較例３
実施例５と同様のコーヒー生豆を粗粉砕し、８０℃の温水３００ｇを加え、さらに９０℃達温後、１０分間保持し、コーヒー生豆中のポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼの活性を失活させた後、３時間攪拌し、その後、ろ紙濾過することで、コーヒー生豆由来のクロロゲン酸含有抽出液を得た。これを減圧濃縮することで、Ｂｒｉｘ２６％のクロロゲン酸含有エキス２４ｇを得た。
【００６９】
〔ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定〕
実施例１〜５、比較例１〜３、及び、抗アレルギー剤として知られる甜茶抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を、以下の方法で分析した。
【００７０】
ヒアルロニダーゼ（ｔｙｐｅＩＶ−Ｓ ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液の１００μＬ（４５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）に試料２００μＬを加えて、３７℃で２０分間放置した。
【００７１】
次に酵素活性化剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０、Ｓｉｇｍａ社製）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）２００μＬを加え、３７℃で２０分間放置した後、基質であるヒアルロン酸カリウム（ｆｒｏｍ ｒｏｏｓｔｅｒ ｃｏｍｂ、和光純薬工業社製）溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ；０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解）５００μＬを入れ、３７℃で４０分間放置した。
【００７２】
次いで、０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２００μＬを加えて反応を停止させた後、０．８Ｍホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、沸騰水中で３分間加熱した。室温まで冷却後、１％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド酢酸溶液６ｍＬを加え、３７℃で２０分間放置した後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７３】
試料は実施例１〜５、比較例１〜３で得られたもの及び甜茶抽出物を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で適切な濃度に調製した。
【００７４】
上記と同様の酵素反応と吸光度測定を、試料溶液の代わりに緩衝液を用いて行った。さらにそれぞれの場合について酵素を添加せずに緩衝液を加えて同様の操作を行った。
【００７５】
以下の数式１により阻害率を算出し、ＩＣ50（５０％阻害活性）の値を求めた。表１にＩＣ50の値を示した。
（数式１）
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝（１−（Ａ−Ｂ）/（Ｃ−Ｄ））×１００
Ａ：試料溶液添加、酵素添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、酵素無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、酵素添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、酵素無添加時の吸光度
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１から、比較例１のクロロゲン酸単体では、ヒアルロニダーゼ阻害活性を示さなかったが、実施例１と２のクロロゲン酸酵素処理物は、高いヒアルロニダーゼ阻害活性を示した。
【００７８】
実施例４と比較例２の場合、デキストリンをコーヒー抽出物の４倍量添加したことから、実質的なＩＣ50の値は、それぞれ表１の値の１／５となるため、実施例４の場合もある程度高いヒアルロニダーゼ阻害活性を示したということができる。
【００７９】
実施例３〜５におけるクロロゲン酸酵素処理物の方が、甜茶抽出物よりも明らかに高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有することがわかった。
【００８０】
なお、各実施例において、クロロゲン酸類含量を高速液体クロマトグラフ法により測定した結果、実施例１と２のクロロゲン酸酵素処理物はクロロゲン酸が不検出となり、実施例３，４及び５の場合、クロロゲン酸が酵素処理する前の１／１０の含量となり、クロロゲン酸酵素処理物の同酵素阻害活性を裏付けるものであった。
【００８１】
実施例６（化粧水）
実施例３で得られたクロロゲン酸酵素処理物粉末から抽出されたクロロゲン酸酵素処理物エキス５ｇ、グリセリン１０ｇ、クエン酸０．１ｇ、及び精製水１００ｇを混合し、化粧水（ローション）を調製し、５名の被験者の皮膚に塗布した。
【００８２】
その結果、被験者のうち、２名が肌の張り、つやが改善されたと回答した。他の２名も僅かに改善されたと回答し、肌の張り、つやを改善する効果が示された。
【００８３】
実施例７（コーヒー飲料）
以下のようなコーヒー飲料を調製し、その評価を行った。
【００８４】
焙煎コーヒー豆５ｇに対し熱湯を注ぎ１００ｍＬのコーヒーを抽出し、その中に実施例４で得られたクロロゲン酸酵素処理物粉末から抽出されたクロロゲン酸酵素処理物エキスを１．０％、砂糖４．７％、脱脂粉乳０．４％、全脂粉乳０．２５％、重曹０．１２％、乳化剤０．１％を加え、７０℃で攪拌乳化し、コーヒー飲料を調製した。
【００８５】
そのコーヒー飲料をアレルギー性鼻炎を患う４名の被験者に１ヶ月間、毎日１５０ｍｌ喫飲させた。
【００８６】
その結果、被験者のうち、２名が鼻水、鼻づまり症状が改善したと回答した。他の１名も改善傾向を体感したと回答し、アレルギー性鼻炎の症状を改善する効果が示された。
【００８７】
実施例８（配合例）
以下に上述のクロロゲン酸酵素処理物の用途として配合例を示す。各々の配合例は常法により製造したもので、配合量のみを記した。単位は％（重量／重量）とする。
【００８８】
［配合例１］クリーム
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ５．０
ステアリン酸 ８．０
ステアリルアルコール ４．０
ステアリン酸ブチル ６．０
プロピレングリコール ５．０
モノステアリン酸グリセリン ２．０
水酸化カリウム ０．４
防腐剤 適 量
酸化防止剤 適 量
香料 適 量
精製水 ７０．０
【００８９】
［配合例２］ローション
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ５．０
ステアリン酸 ２．０
セチルアルコール １．５
ワセリン ４．０
グリセロールトリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．０
ソルビタンモノオレイン酸エステル ２．０
ジプロピレングリコール ５．０
ＰＥＧ１５００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
香料 適 量
防腐剤 適 量
精製水 １００とする残余
【００９０】
［配合例３］キャンディー
クロロゲン酸酵素処理物含有粉末（実施例４） ０．８
砂糖 ４２．０
水飴 ４５．０
クエン酸 ２．０
香料 ０．２
水 １０．０
【００９１】
［配合例４］アイスクリーム
クロロゲン酸酵素処理物含有粉末（実施例４） ０．６
生クリーム ３３．８
脱脂粉乳 １１．０
グラニュー糖 １４．８
加糖卵黄 ０．３
バニラエッセンス ０．１
水 ３９．４
【００９２】
［配合例５］錠剤（サプリメント）
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ６０．０
Ｌ−アスコルビン酸 １０．０
乳糖 １５．０
ステアリン酸マグネシウム １５．０
【００９３】
［配合例６］カプセル剤（サプリメント）
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） ８０．０
酢酸カルシウム・一水塩 １０．０
Ｌ−乳酸マグネシウム・三水塩 １０．０
【００９４】
［配合例７］軟膏
クロロゲン酸酵素処理物（実施例３） １．０
酢酸ナトリウム・三水塩 １．０
ＤＬ―乳酸カルシウム ４．０
グリセリン １０．０
ワセリン ５０．０
木ロウ １０．０
ラノリン ９．０
ゴマ油 １４．５
ハッカ油 ０．５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項２】
クロロゲン酸類が、コーヒー由来のものであることを特徴とする請求項１記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが、コーヒー豆中に内在するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の製造方法によって得られるクロロゲン酸酵素処理物を、有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項５】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲料及び食品。
【請求項７】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１】
クロロゲン酸類を、酸素の存在下でポリフェノールオキシダーゼを作用させるか又は過酸化物の存在下でペルオキシダーゼを作用させて酸化重合することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するクロロゲン酸酵素処理物を製造するクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項２】
クロロゲン酸類が、コーヒー由来のものであることを特徴とする請求項１記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼが、コーヒー豆中に内在するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロロゲン酸酵素処理物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の製造方法によって得られるクロロゲン酸酵素処理物を、有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項５】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲料及び食品。
【請求項７】
請求項４記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【公開番号】特開２００８−２８５４２０（Ｐ２００８−２８５４２０Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２９７５３（Ｐ２００７−１２９７５３）
【出願日】平成１９年５月１５日（２００７．５．１５）
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１５日（２００７．５．１５）
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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