フェノール化合物に富む組成物及びその製造方法
粗製植物抽出物からフェノール化合物に富む組成物を製造する方法が提供されている。一つの方法には、フェノール化合物を放出できるように吸収するが極性非フェノール化合物は保持しないポリマー樹脂であって、１個以上の電子吸引性基で置換された芳香族環を含む該樹脂を用いた新規なカラム精製工程が含まれる。本発明には又、フェノール化合物に富む組成物も含まれる。本発明には、呼吸器合胞体ウィルスのようなパラミクソウィルス科、インフルエンザＡ，Ｂ，及びＣのようなオルソミクソウィルス科、パラインフルエンザ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２のようなヘルペスウィルス、及び西ナイルウィルスのようなフラビウィルス属に感染した人間を含む温血動物を治療するために、又関節炎により引起こされるような炎症、ストレス及び消化器系の病気を治療するために、フェノール化合物に富む組成物を使用する方法が含まれる。該組成物は食品媒介病原体を阻止する肉添加剤としても有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の引用〕
本願は、２０００年８月３１日に出願された米国仮出願第６０／２２９，２０５号の優先権を主張する、２００１年８月３０日に出願された米国特許出願第０９／９４３，１５８号の部分継続出願である、２００２年１１月２２日に出願された米国特許出願第１０／３０２，２６４号の部分継続出願である、２００４年１月２３日に出願された米国特許出願第１０／７６４，３２１号の優先権を主張するものであり、それらの開示をすべて全体的に本明細書に引用して援用する。
【０００２】
本発明は、植物原料からのフラボノイド化合物の抽出及び精製に関し、より具体的にはフェノール化合物に富む組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイド化合物は植物のあらゆる大気中部分に存在し、その皮、樹皮及び種子に高濃度が見出される。このような化合物は、茶、ココア、及びワインのような植物起源の多数の飲物にも見出される。フラボノイドは、ポリフェノールと呼ばれる比較的大きな族の化合物類の一員である。即ち、これらの化合物は、１個以上の芳香族環上に１個より多くのヒドロキシル基（ＯＨ）を含有する。ポリフェノール、特にフラボノイドの物理的及び化学的性質、分析、及び生物学的活性は何年にもわたって研究されてきた。
【０００４】
アントシアニンは、多数の果物、野菜、穀物、及び花の赤、紫、及び青色の原因である天然に生ずるフラボノイド化合物の特定のクラスである。例えば、ブルーベリー、ビルベリー、イチゴ、ラズベリー、ボイゼンベリー、マリオンベリー、クランベリー、エルダーベリー、等のような果物の色は、多数の異なるアントシアニンによる。３００種を超える構造的に異なるアントシアニンが事実上同定されている。アントシアニンは天然素材であるので、食物及び飲物用着色剤としての用途に大きな関心を呼んできた。
【０００５】
最近、アントシアニン顔料に対する関心は、食物酸化防止剤としての健康上の利益が考えられるので、増大してきた。例えば、ビルベリー（バチニウム・ミルチラス）のアントシアニン顔料は、視力を改善し循環障害を治療するために長い間使用されてきた。或るアントシアニン及び他のフラボノイドは抗炎症性を有することが実験的に証明されている。更に、経口投与されたアントシアニンは糖尿病及び潰瘍を治療するのに効果的であり抗ウィルス活性及び抗菌活性を有している可能性があるということが報告されている。フラボノイドのこれら望ましい性質に対する化学的根拠は、それらの抗酸化剤能力に関連していると考えられる。かくして、ベリーと他の果物及び野菜に関連する抗酸化剤特性は、それらのアントシアニン含量に帰せられてきた。
【０００６】
「オリゴマー状プロアントシアニジン」、「ＯＰＣｓ」、又は「プロシアニジン」としても知られるプロアントシアニジンは、果物、野菜、実、種子、花、及び樹皮から広く入手できる天然に生ずるフラボノイド化合物のもう一つのクラスである。プロアントシアニジンは縮合タンニンとして知られる範疇に属する。それらは、果物及び野菜に見出される最も普通のタイプのタンニンであり、その種子及び皮に大量に存在する。事実上、異なるプロアントシアニジンの混合物は普通一緒に見出され、個々の単位から多数の結合単位の複雑な分子（オリゴマー又はポリマー）まで変動する。ポリマー状プロアントシアニジンの一般的化学構造は、共通のＣ（４）−Ｃ（６）及び（又は）Ｃ（４）−Ｃ（８）結合により一緒に結合したフラボノイド３−オール単位の直鎖を含む。１３Ｃ ＮＭＲはポリマー状プロアントシアニジンの構造を同定するのに有用であったが、最近の研究はダイマー、トリマー、及びテトラマー状プロアントシアニジンの化学を解明している。フラボノイド３−オール単位のより大きなオリゴマーは大部分の植物において支配的であり、２，０００ダルトンより大きな平均分子量を有し６以上のモノマー単位を含有するものが見出されている（Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，２５：１１８（１９８７），Ｎｅｗｍａｎ等）。
【０００７】
最近のかなりの研究により、主として抗酸化剤活性が知られているプロアントシアニジンの治療的応用が探求されてきた。しかしながら、これらの化合物は、抗菌性、抗ウィルス性、抗癌性、抗炎症性、抗アレルギー性、及び血管拡張性の作用を示すことも報告されている。更に、それらは、脂質過酸化、血小板凝集、毛細血管透過性及び脆弱性を阻止し、ホスホリパーゼＡ２、シクロオキシゲナーゼ、及びリポキシゲナーゼを含む酵素系に影響することも見出されている。例えば、プロアントシアニジンのモノマー（即ち、アントシアニン）及びダイマーは、増加した毛細血管脆弱性に関連する病気の治療に用いられており、動物における抗炎症性効果を有することも示されている（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２８４：３５８（１９７７），Ｂｅｌａｄｉ，Ｉ．等）。これらの報告された発見に基づいて、オリゴマー状プロアントシアニジン（ＯＰＣｓ）は、多数の状態の治療に有用な成分となり得るのである（Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．５（２）：１４４−１５１（２０００），Ｆｉｎｅ，Ａ．Ｍ．）。
【０００８】
プロアントシアニジンはウィルスに対抗して保護することも出来るのである。試験管内の研究において、ウィッチヘーゼル（ハマメリス・バージニアナ）からのプロアントシアニジンは単純ヘルペス１ウィルス（ＨＳＶ−１）を殺した（Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄ．６月号：６２（３）：２４１−５（１９９６），Ｅｒｄｅｌｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｉｎａｔｌ，Ｊ．； Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．７月号：６２（７）：９５４−８（１９９９），ＤｅＢｒｕｙｎｅ，Ｔ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｌ．）。種々のタンニンの抗ウィルス活性について構造と活性の関係を判断するために、もう一つの研究が行われた。化学構造がより縮合されている程、抗ウィルス効果はより大きいことが判明した（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：２２４５−５０（１９８５），Ｔａｋｅｃｈｉ，Ｍ．等）。もう一つの研究において、プロアントシアニジンは抗単純ヘルペス活性を有することが示されたが、そこでは単純ヘルペス溶菌斑形成を減少させるのに必要な５０％効果量が５０％細胞障害量よりも２〜３桁の大きさ低かった（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１１：２８５−２９８（１９８９），Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．等）。
【０００９】
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１，ＣＯＸ−２）又はプロスタグランジン・エンドパーオキサイドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ−１，ＰＧＨＳ−２）酵素は、植物製品の抗炎症効果を測定するために広く使用されている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８： ２３７３−２３７８（１９８９），Ｂａｙｅｒ，Ｔ．等；及びＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２４５２−２４５７（１９９２），Ｇｏｄａ，Ｙ．等）。ＣＯＸ酵素は、非ステロイド性抗炎症薬に対する薬理上の標的部位である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：２０５３−２０５６（１９８１），Ｈｕｍｅｓ，Ｊ．Ｌ．等；及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２：４８６３−４８６５（１９７５），Ｒｏｍｅ，Ｌ．Ｈ．等）。プロスタグランジン合成に含まれるシクロオキシゲナーゼの二つのイソ酵素は、シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５：２５１，５５７５−５５７９（１９７６），Ｈｅｍｌｅｒ，Ｍ．等）。選択的ＣＯＸ−２阻害剤が主として抗炎症活性を引起こすと仮定されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：３２２８−３２３２（１９９４），Ｍａｓｆｅｒｒｅｒ，Ｊ．Ｌ．等）。フラボノイドは、抗炎症物質として、並びに、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害活性に対するそれらの構造的特色のために、今や研究されつつある。
【００１０】
アントシアニン及びプロアントシアニジンの上記特性及び利点により、果物、野菜、及び他の植物源からこれらの化合物を抽出することに向かって、多くの努力が提起されている。プロアントシアニジン及びアントシアニンに加えて、植物、果物、及び野菜は又無機塩類、クエン酸又は酒石酸のような普通の有機酸、炭水化物、フラボノイド配糖体、及びカテキンのような他の化合物をも含有する。アントシアニン及びプロアントシアニジンは他の天然に生ずる化合物から分離することがしばしば望ましい。アントシアニンは種々の操作によって植物及び果物から抽出されてきた。アントシアニンを抽出する一つの方法では、双性イオン種を形成する重硫酸塩の添加が使用されている。該抽出物はイオン交換カラムを通過させ、そこで双性イオンアントシアニン付加物が吸着され、吸着されたアントシアニンはアセトン、アルカリ、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて該樹脂から溶離される。この方法の短所には重硫酸塩の存在が含まれるが、重硫酸塩はアントシアニンの吸着を妨害し、それにより複数のカラム吸着が必要となる。アルカリを用いた溶離はアントシアニンをかなり分解させるが、一方ＤＭＦは認められた食品添加物ではないので、アントシアニンを任意の食品製品に添加する前に完全に除去しなければならない。
【００１１】
これらのフラボノイド化合物を捕えるために、明確で正確な処理及び分離技術が必要である。Ｎａｆｉｓｉ−Ｍｏｖａｇｈａｒ等は、米国特許第５，９１２，３６３号において、植物原料の水性混合物を加熱し、該水溶液を限外濾過膜に通して濾過し比較的大きな分子量のポリマー及び微粒子を除去して抽出されたプロアントシアニジンを含有する透過水を生成し、プロアントシアニジンを放出できるように保持できる吸着剤物質に該透過水を接触させることにより該液体からプロアントシアニジンを分離し、そして該保持されたプロアントシアニジンを極性溶剤で溶離することを特徴とする、植物原料からプロアントシアニジンを抽出精製する方法を記載している。しかしながら、この方法は非常に熱い抽出温度を使用しているので、プロアントシアニジンの分解が起こり得る。更に、限外濾過は最終製品からいくらかの低分子量ポリフェノール物質を除去している。
【００１２】
種々の植物原料からプロアントシアニジン及び（又は）アントシアニンを抽出単離する技術において知られている多くの方法は、有毒なそして（又は）環境的に有害な物質を使用している。従って、プロアントシアニジンを単離精製するのに使用できる現在の方法は、効率的な工業的方法まで容易には拡大されないが、それは工業的方法では種々の化学薬品や溶剤の廃棄検討が該方法の全体的実現可能性において重要な役割を演じるからである。更に、プロアントシアニジン及びアントシアニンは、それらの分解に向かう自然な傾向を最小にする方法で、単離しなければならない。
【００１３】
従って、栄養補給食品や処方薬に使用されるプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を含有する組成物を単離精製する効率的方法であって、費用効率が高く、拡大縮小が可能で、経済的に健全で、有毒な溶剤又は試薬の使用を必要とせず、そして植物原料からフェノール化合物をそれらの分解に向かう傾向を最小にする方法で単離する該効率的方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、フェノール化合物に富む組成物を抽出し、単離し、そして精製する単純化された経済的方法を提供する。より具体的には、本発明の一局面によれば、フェノール化合物に富む組成物を製造する方法において、（ａ）フェノール化合物を含有する１種以上の植物原料の粗製抽出物であって、フェノール化合物及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を用意し、（ｂ）該粗製抽出物を濾過し、（ｃ）前記フェノール化合物を放出できるように吸着するが前記極性非フェノール化合物は実質的に保持しないポリマー樹脂であって、１個以上の電子吸引性基で置換された芳香族環を含む該ポリマー樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、（ｅ）該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記フェノール化合物を含有する第一画分を収集し、（ｆ）該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記フェノール化合物を含有する第二画分を収集し、そして（ｇ）工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、前記フェノール化合物に富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得ることを特徴とする、前記製造方法が提供される。適切な置換ポリマー樹脂の例は、臭素化ポリスチレン樹脂及びプロトン化第三級アミン置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂を含むが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明の更なる局面によれば、プロアントシアニジンに富む組成物を製造する方法において、（ａ）プロアントシアニジンを含有する１種以上の植物原料を溶剤で抽出して、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の小フェノール系誘導体及び非フェノール化合物を含む粗製抽出物を提供し、（ｂ）該粗製抽出物をサイズ除外濾過以外の手段により濾過し、（ｃ）前記アントシアニンを保持し前記プロアントシアニジンを放出できるように吸着するが該極性非フェノール化合物は実質的に保持しない未置換芳香族環を含む樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して該極性非フェノール化合物を溶離し、（ｅ）該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第一画分を収集し、（ｆ）該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第二画分を収集し、そして（ｇ）工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、プロアントシアニジンに富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得ることを特徴とする、前記製造方法が提供される。適切な未置換樹脂の例は、ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体を含むが、それらに限定されない。一態様において、該第一及び（又は）第二の溶離は大体室温で行われる。
【００１６】
本発明は、フェノール化合物に富む組成物を精留して、非極性プロアントシアニジン、及び極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物から極性プロアントシアニジンを分離する方法を更に提供する。極性プロアントシアニジンは、非極性プロアントシアニジンとは異なる生物活性を有することが判明した。
【００１７】
本発明は、本発明の方法により単離された、フェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物を更に提供する。
【００１８】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＣ−１８親油性カラムで逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により分析すると、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍで吸収される化合物の溶離ピークの特性セットが観察される。例えば、一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、ＨＰＬＣ分析をここに記載した通りに行うと、実質的に図１０〜１３に図示されているように、ＨＰＬＣトレースにおいて６０〜７５分の範囲で溶離ピークの特性セットを有する特徴がある。
【００１９】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＩＲ（赤外線）分光測定により分析すると、実質的に図３３〜４０に示されているような化合物の特性吸収ピークが観察される。本発明の組成物は栄養補給食品及び処方薬として有用である。例えば、本発明の組成物は抗感染症剤（例えば、抗ウィルス剤、抗ＵＴＩ（尿路感染症）剤、及び抗菌剤）として、及び抗炎症剤として有用である。
【００２０】
本発明に関する前記の及び他の特色、有用性および利点は、本発明の好ましい態様に関する以下のより詳しい説明から、図面に説明されているように、そして特許請求の範囲に特に指摘されているように、明らかとなるであろう。
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を自然に含有する植物原料からフェノール化合物に富む組成物を製造する方法を提供する。本発明の方法は、フェノール化合物に富む精製された組成物を更に提供する。用語、「フェノール」及び「フェノール化合物」は、本明細書では交換できるように使用されており、１個以上のフェノール基を有するモノマー状、オリゴマー状、及びポリマー状化合物を含み、従ってアントシアニン、プロアントシアニジン、及びフラボノイドを含むが、それらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用されているように、用語「フェノール化合物に富む組成物」は、１種以上のフェノール化合物に富み、植物、果物、液果、及び野菜の粗製抽出物に存在する極性非フェノール化合物が実質的に激減した量である組成物のことを言う。かかる極性非フェノール化合物の例は、砂糖、セルロース、ペクチン、アミノ酸、蛋白質、核酸、及び水を含むが、それらに限定されない。
【００２３】
フェノール化合物に富む組成物は植物原料抽出物又は濃縮物から典型的に製造される。用語「抽出物」は、フェノール化合物を自然に含有する植物源から導き出された物質のことを言い、植物全体から、又は植物の種々な部分、例えば、果実、葉、茎、根、樹皮、等から製造された抽出物を含む。従って、本発明の方法は、抽出物を製造するのに使用される植物の特定の部分に限定されない。本方法は、最も典型的に、植物学的に誘導された植物原料全体又は植物原料の部分、例えば、表皮、皮、果実、実、種子、穀物、群葉、茎、樹皮以外の木質又は繊維質原料、等からの任意のフェノール化合物源を使用することが出来る。従って、本発明の方法は、抽出物を製造するのに使用される植物の特定の部分に限定されない。大部分の有色の果実、果粒、及び野菜はフェノール化合物を含有することが知られている。本発明の方法に使用することが出来る適切なフェノール化合物含有植物原料は、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジを含むが、それらに限定されず、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含むが樹皮は除く。該生の植物原料はそのまま（湿ったまま）使用しても良いし、或いは抽出前に乾燥しても良い。所望により、該生の植物原料は、抽出前に、アントシアニン及びプロアントシアニジンが低い成分を分離除去することにより、事前に分類することが出来る。
【００２４】
一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、フェノール化合物を含有する植物原料を抽出精製することにより得られる。フェノール化合物を含有する植物原料は特異で独特な特徴を有すること、即ち、各植物原料中のフェノール化合物の量及びタイプは該特定の植物原料に対して特定的であることが知られている。従って、本発明により或る特定の植物原料から単離されたフェノール化合物に富む組成物は、他の植物原料から単離された組成物とは異なるであろう。
【００２５】
図１は、フェノール化合物に富む組成物が製造できる本発明方法の一態様の工程を示すフローチャートである。本発明の方法は、いくつかの処理工程を除去することにより、又該方法に必要な試薬の量を減少させることにより、製造原価及び廃棄物処理問題を減少させて、フェノール化合物に富む組成物を得る経済的で効率的な方法を提供する。
【００２６】
抽出段階
【００２７】
この相の間に、新鮮な又は乾燥した植物原料からフェノール化合物（例えば、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノール化合物）及び極性非フェノール化合物を含む非フェノール化合物を抽出することにより、抽出物が製造される（図１、工程１０）。当業者は、バット抽出、パーコレイション、向流抽出、等のような種々の抽出方法が文献から利用できることを認識するであろう。使用される特定の抽出方法は、本発明の方法にとって本質的なものではない。抽出処理前の植物原料の粉砕程度は、抽出溶剤が効果的に接触するのに充分な微粒子表面積を提供する程度であるべきである。
【００２８】
図１に示された方法の一態様において、抽出工程（工程１０）は、新鮮な又は乾燥した植物原料を適切な量の抽出溶剤に充分な時間入れることにより達成される。抽出処理で用いられる植物原料対抽出溶剤の量は、グラム対ミリリットルの基準で約２：１〜約１：２０の間で変化する。一態様において、植物原料対抽出溶剤の比は、約１：４〜１：８の間である。植物原料と溶剤の混合物は、該植物原料に存在するアントシアニンの量に依って、所望により加熱される。即ち、もし植物原料が約０．０５％〜２％のアントシアニンを典型的に含有しているならば、該抽出は好ましくは４５℃以下で行われる。しかしながら、もし植物原料が０．０５％未満のアントシアニンを典型的に含有しているならば、該フェノール化合物の安定性に依って、室温から８５℃を越えるまでの温度で該抽出を行うことが出来る。例えば、非常に少しのアントシアニンしか含有していないクランベリーは、クランベリー抽出物に含まれるプロアントシアニジンの安定性に影響することなく、約１００℃の温度で抽出することが出来る。
【００２９】
一態様において、抽出溶剤には、水中約０〜９５％のエタノール及び約０〜３重量％、より好ましくは約０．００６〜０．０１２重量％の適切な酸を有する酸性化アルコール溶液が含まれる。他の態様において、抽出溶剤には、水中約０〜１００％のメタノール及び約０〜３重量％の適切な酸を有する酸性化アルコール溶液が含まれる。抽出工程で使用することができる適切な酸は、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、酢酸（ＨＯＡｃ）、又は塩酸（ＨＣｌ）を含むが、それらに限定されない。或いは、植物原料を非酸性化抽出溶剤で抽出してから、該抽出物に酸を添加することが出来る。抽出溶剤における酸の存在又は該抽出物は、アントシアニンの分解を最小にする助けをする。従って、一態様において、酸性条件は、図１に説明されているように、本発明方法の大部分の工程を通して維持される。
【００３０】
粗製抽出物は、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノール系誘導体のようなフェノール化合物の他に、砂糖、ペクチン、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセライド、水、及び他の化合物のような望ましくない極性非フェノール物質をも又含有する。粗製抽出物に含有される固体残渣は液体部分から分離され、該固体は上述のように再抽出されるか、又は廃棄される。
【００３１】
工程１０（図１）の一態様において、抽出処理の前又はその間に、植物原料又は抽出溶剤にペクチナーゼを添加する。或いは、抽出処理が完了してから、粗製抽出物にペクチナーゼを添加することが出来る。ペクチナーゼは、抽出物がカラム精製の間流動性を維持するように、抽出処理中又はその後の任意の点で抽出物がゲル化するのを防ぐのに役立つ。ペクチナーゼの添加量は、抽出物を製造するのに使用される植物原料の量又は抽出物に既に存在しているペクチナーゼの量に部分的に依存する。典型的に、ペクチナーゼは植物原料の約０〜０．１２重量％の量で添加される。
【００３２】
図１を続けて参照しながら、もし工程１０において粗製抽出物を製造するのにエタノール性又はメタノール性抽出溶剤が使用されたら、粗製抽出物は、濃縮の間好ましくは４５℃以下の温度を維持しながら、粗製抽出物に含有されるエタノール又はメタノールが６％より少なくなるまで濃縮される（工程２０）。濃縮された粗製抽出物を希釈するのに水が添加され、希釈された粗製抽出物は、工程３０の前に濃縮され水で再び希釈されるか、又は第二の希釈を行うことなく工程３０に直接持ち込まれる。勿論、もし粗製抽出物の製造に抽出溶液として水が使用されたら、工程２０は必要ないので、この場合図１に破線矢印により示されているように、工程１０からの粗製抽出物は工程３０に直接持ち込まれる。
【００３３】
濾過段階
【００３４】
図１に示された方法の工程３０には、工程１０又は２０からの粗製抽出物を所望により濾過して該粗製抽出物から固体を除去することが含まれる。本発明者達は、工程１０に対して説明した抽出条件を調節することにより、工程３０における濾過によって粗製抽出物から沈澱する望ましくない非フェノール化合物の量が増加するので、望ましくない物質の一部を吸着段階の前に該抽出物から除去することが出来ることを発見した。本発明方法の濾過工程３０では種々の濾過方法を使用することが出来る。工程３０で使用することが出来る一濾過方法には、珪藻土又はセルロースのような濾過助剤を測定量で粗製抽出物に添加することが含まれる。粗製抽出物と濾過助剤の混合物は、好ましくは均質になるまで振とう又は撹拌され、濾過助剤床を通して濾過される。該床は酸性水溶液、好ましくは約０．００６％の硫酸水溶液で洗浄される。
【００３５】
図１の工程３０で使用することが出来る他の濾過方法には、サイズ除外濾過以外の濾過手段を用いて粗製抽出物を濾過することが含まれる。例えば、一態様には、砂床又は好ましくはガラスウールで覆われた３０ミクロンのポリプロピレン・フィルターを通して粗製抽出物を濾過することが含まれる。なお他の濾過方法には、有利には以下に説明する工程４０の精製カラムと一列に並んで置くことができるバグフィルター（ポリエチレン又はポリプロピレンから成る袋形状の布フィルター）を使用することが含まれる。従って、上述のフィルターは、当該技術で溶液から或る大きさの分子を除去するのに使用される限外濾過膜のようなサイズ除外フィルターというよりむしろ固体除去用フィルターであると理解されるべきである。
【００３６】
吸着段階
【００３７】
図１に示された方法によりフェノール化合物を単離するために、工程３０で単離された濾過抽出物は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を放出できるように吸収するが濾過抽出物に存在していた望ましくない極性非フェノール物質はより少ししか保持しない樹脂と、接触させる。一態様において、該樹脂は１個以上の電子吸引性官能基で置換された１個以上の芳香族環を有するポリマー樹脂である。各芳香族環は１個以上の同様な又は異なる電子吸引性基で置換することができ、該電子吸引性基はハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、プロトン化アルキルアミン（第一級、第二級及び第三級アミンを含む）、スルホン酸、トリハロメチル、ＣＯＯＨ，ＮＯ２及びＣＮを含むが、それらに限定されない。或いは、該ポリマーは置換芳香族環および未置換芳香族環の混合物を含むことができる。かかる樹脂は本明細書において「置換樹脂」と言及される。好ましくは、該樹脂は承認食品等級の樹脂である。
【００３８】
本発明の目的に適した置換樹脂の一例は、三菱ケミカルアメリカ製のＳＰ−２０７ （ペンシルベニア州ベラフォンテ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）のような臭素化ポリスチレン樹脂である。ＳＰ−２０７樹脂は、逆相クロマトグラフィー用途に合わせて設計されたマクロ孔質臭素化スチレンポリマービーズ型樹脂で、約２５０〜８００ミクロンの粒径分布及び約１００〜３００Åの孔径範囲を有する。芳香族環の臭素化は、ポリスチレン樹脂の疎水性を増加させ、従来のスチレン・ジビニルベンゼン・ポリマー逆相支持体と比較して、疎水性分子に対する増加した選択性を有する樹脂を提供するように設計されている。臭素化ポリスチレン樹脂は、その堅固な結合性の故に、天然製品の精製に典型的には使用されない。
【００３９】
かくして、或る従来のポリスチレン樹脂はプロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を非常に堅固に結合するのでかかる化合物をポリスチレン樹脂から溶離するのは非常に難しいことが知られていたので、臭素化ポリスチレン樹脂はフェノール化合物を更に堅固に結合するであろうと予想された。従って、臭素化ポリスチレン樹脂がフェノール化合物の精製に適しているであろうとは予想されなかった。しかしながら、本発明者達は、驚いた事にそして予想外に、臭素化ポリスチレン樹脂は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を結合する強さが非臭素化ポリスチレン樹脂よりも低いが、望ましくない極性非フェノール化合物からのフェノール化合物の分離を依然として可能にすることを発見したのである。即ち、工程３０で単離された濾過抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上で精製することによりフェノール化合物に富む高純度組成物が得られることが発見されたのである。
【００４０】
本発明によりフェノール化合物に富む高純度組成物を提供するのに適したもう一つの置換樹脂は、Ｄｏｗｅｘ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２（ミシガン州、ミッドランドのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ販売）のようなプロトン化形状の第三級アミン置換ポリマーであるが、それは芳香族環上に第三級アミン官能基を有する食品等級のマクロ孔質スチレン・ジビニルベンゼン共重合体である。
【００４１】
いかなる理論によっても縛られたくないけれども、臭素及びプロトン化第三級アミンのような置換基は電子吸引性であるので、それらが結合している芳香族環の電子密度を減少させ、この効果はそれらの正に帯電したアントシアニンに対する保持力を減少させるのに充分であろうと考えられる。対照的に、未置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂の芳香族環はより高い電子密度を有するので、アントシアニンの正電荷により強く結合して、アントシアニンがこの樹脂により堅固に保持されるのである。かくして、Ｄｏｗｅｘ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２及び三菱ＳＰ２０７樹脂のような置換樹脂はアントシアニンを放出できるように保持することが出来るが、一方未置換ベンゼン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂はアントシアニンを保持するが放出する確率はより低いのである。
【００４２】
なお他の態様において、該樹脂は、本明細書において「未置換芳香族樹脂」又は「未置換ポリマー樹脂」と言及される未置換芳香族環を含むポリマーである。本発明の目的に適した未置換芳香族樹脂の一例は、三菱ＳＰ７０のようなポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂である。この樹脂は以下の物理的性質、即ち、２５０ｍｍの平均粒径、７００ｍ２／ｇの比表面積、及び６５Åの比孔半径を有する。ＳＰ７０樹脂は、驚いた事にプロアントシアニジンを放出できるように保持するがアントシアニンを容易には放出しない。これはアントシアニン及びプロアントシアニジンの両方に富む製品を得るのに受け入れられる樹脂であるとは普通には考えられないであろうが、著しい量のアントシアニンは含有しない植物原料、例えば、プラムからプロアントシアニジンに富む製品を単離するには適している。この態様において、抽出物を該樹脂上に供給して該樹脂から望ましい化合物を溶離する工程は、室温で行われる。ＳＰ７０を用いてプラムからプロアントシアニジンを単離する例は、実施例２１で説明する。
【００４３】
図１に示された方法の一態様において、工程３０で単離された濾過抽出物をＳＰ２０７のような置換樹脂を詰め込んだカラム上に供給する。好ましくは、該樹脂は、約２００〜７００ミクロンの粒径分布及び約５０〜３００Åの孔径範囲を有する（工程４０）。工程４０は該抽出物をカラム中に詰め込まれた樹脂と接触させるという形でここに記載されているけれども、しかし、かかる記載は単に説明の場合用に過ぎない。このように、該樹脂は本発明方法を行うためにカラム中に詰め込む必要はない。カラム上に供給される濾過抽出物の量は、粗製抽出物を製造するのに用いた植物原料に依存する。例えば、ビルベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１６〜３０グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。もう一つの例として、ブルーベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１５〜４５グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。エルダーベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１５〜４０グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。もし濃縮粗製抽出物中の固体濃度が２００グラム／リットルを超えるならば、濾過抽出物は供給する前に水で希釈することが出来る。工程４０（図１）におけるカラム装填中に溶離する画分は「画分１」として収集される。
【００４４】
濾過粗製抽出物を該樹脂上に供給した後、該吸着剤に対して殆んど又は全く親和性を有さない望ましくない極性非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸、等）は、少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶剤，例えば、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液を用いて該樹脂から溶離される（図１、工程５０）。例えば、該異質物質を溶離するために約３カラム量の０．００６％硫酸水溶液又は０．１％酢酸水溶液を使用することが出来る。該溶離液は「画分２」として収集される。
【００４５】
図１を続けて参照しながら、該カラムは次に約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶剤を含む第一溶離剤を用いて溶離する（工程６０）。工程６０では、典型的に約２〜１２カラム量の溶離溶剤が使用される。一態様において、第一溶離剤は約０．００３％の酸、例えば、硫酸、塩酸、又は酢酸を含有する。溶離工程６０の間に収集された画分は、「画分３」として収集される。「画分３」は、粗製抽出物に含有されるフェノール化合物の一部を含有し、特にアントシアニン及び（又は）プロアントシアニジンに富む。
【００４６】
ＵＶ−ＶＩＳ（紫外／可視）分光計により測定して、（抽出物に存在している場合）アントシアニンの大部分が該カラムから溶離された後で、アントシアニンを溶離するのに用いた溶剤（工程６０）よりも大きなパーセントのエタノール又はメタノールを含む極性有機溶剤を含む第二溶離剤で該カラムを溶離する（図１、工程７０）。例えば、第二溶離剤は、約７０〜９０％のエタノール／水又は約７５〜１００％のメタノール／水を含むことが出来る。溶離工程７０の間に収集される画分は「画分４」として収集される。「画分４」は、粗製抽出物に最初含有されていたフェノール化合物の更なる部分を含有し、典型的にプロアントシアニジンに富む。「画分４」は、溶離工程６０の間に単離されなかったアントシアニンを含有することも出来る。
【００４７】
温度がフェノール化合物を分解するものでないならば、工程５０、６０および７０の各々は典型的に大体室温で行われるが、それより高い又は低い温度を使用することが出来る。
【００４８】
回収方法がフェノール化合物を分解しない温度で行われるならば、「画分３」及び「画分４」中のフェノール化合物の回収は、蒸発、蒸留、凍結乾燥、等のような任意の都合の良い方法で遂行して本発明のフェノール化合物に富む組成物を提供することが出来る。
【００４９】
上述の方法は、エルダーベリー、プラム、ブルーベリー、ビルベリー、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、及び紫サツマイモを含むが、それらに限定されない、フェノール化合物を含む種々の植物原料から、栄養補給食品として用いられるフェノール化合物に充分富む組成物を製造するのに適している。一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、少なくとも１０〜８０％のフェノール化合物を含有する。他の態様において、本組成物は少なくとも１２％のフェノール化合物を含有する。なお他の態様において、本組成物は少なくとも２５％のフェノール化合物を含有する。
【００５０】
植物原料からフェノール化合物、特にプロアントシアニジンを単離するための、変化をもたらす態様において、上述のように製造された植物原料抽出物は、三菱ＳＰ７０（ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂）のような未置換芳香族樹脂上に供給される。述べたように、未置換芳香族樹脂はプロアントシアニジンを放出できるように保持するがアントシアニンを容易には放出しないので、このタイプの樹脂は、著しい量のアントシアニンを含有しない植物原料、例えば、プラムからプロアントシアニジンに富む製品を単離するのに適するのである。一態様において、該抽出物を該樹脂上に供給して該樹脂から望ましい化合物を溶離する工程は、大体室温で行われる。例えば、（上述のように製造された）粗製の又は濾過された植物抽出物、又は果物濃縮物は、未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体を詰め込んだカラム上に室温で供給される。その後で、該吸着剤に対して殆んど又は全く親和性を有さない望ましくない極性非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸、等）は、少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶剤，例えば、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液を用いて該樹脂から室温で溶離される。次にフェノール化合物を該カラムから、室温で約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶剤を含む第一溶離剤を用いて溶離して第一溶離剤画分を得、それから室温でより大きなパーセントのエタノール又はメタノールを含む第二溶離剤（例えば、７０〜９０％のエタノール／水又は７５〜１００％のメタノール／水）を用いて溶離して第二溶離剤画分を得る。更なる溶離が更なるフェノール化合物を該樹脂から溶離するかどうかを判断するために、所望なら、該第一及び第二溶離画分をフェノール化合物含量について分析することが出来る。述べた通り、未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体はアントシアニンを典型的に保持するので、プロアントシアニジンに富む組成物を単離することが目的である場合、この態様によりプロアントシアニジンからアントシアニンを分離するために、溶離条件を調整する必要はない。
【００５１】
プロアントシアニジン分離段階
【００５２】
置換樹脂から本明細書で説明されたように単離されたフェノール化合物に富む組成物、特に「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せから単離された組成物は、図１２及び１３に示されたような特性ピークを有する同様のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムを生ずることが発見された。例えば、フェノール化合物を含有する植物原料から製造され、図１に説明された方法により臭素化ポリスチレン樹脂を用いて単離され、そして「画分４」から単離されたフェノール化合物に富むあらゆる組成物のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムは、エルダーベリーから単離された「画分４」組成物に対する図１２及び１３に示されたクロマトグラムにおけるピークと同様な６０〜７５分の特性ピークを含有することが分った。「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せから単離され、本発明により製造された本発明のフェノール化合物に富む組成物は、下記に詳細に説明するように、抗感染性（例えば、抗ウィルス性）及び抗炎症性活性を有する。
【００５３】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＩＲ（赤外線）分光測定により分析すると、フェノール化合物からの特性ピークがやはり観察される。より具体的に、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、実質的に図３３〜４０に示されたＩＲ吸収ピークを有する特徴がある。
【００５４】
フェノール化合物に富む組成物（例えば、「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せ）は、実施例１１で詳細に説明されるように、又図１５に示されているように、Ｃ−１８カラムのような逆相親油性カラム上で低圧真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）を用いて、「極性」プロアントシアニジンに富む画分および「非極性」プロアントシアニジンに富む画分に更に分割することが出来ることが又発見された。例えば、エルダーベリー抽出物から単離された「画分３」組成物を水に溶解しＣ−１８カラム上に供給した。該カラムを１００％の水で洗浄して、Ｃ−１８媒体によって強くは保持されない物質を収集した。流過画分及び洗浄画分は、「画分５」として組合せたが、より極性のプロアントシアニジンを含有していた。かくして、「画分５」は「極性」プロアントシアニジンに富む画分とここで言及される（図１５）。エルダーベリーからの極性プロアントシアニジンに富む「画分５」は典型的にいくぶん紫色をしているので、この画分におけるポリマーは該オリゴマー状プロアントシアニジン鎖内に少なくとも１個以上のカチオン性アントシアニジン副単位を含有していることが示唆される。次に該ＶＬＣカラムを３０〜１００％のメタノールで溶離して、該低圧カラムに使用したＣ−１８媒体によってより強く保持されているプロアントシアニジンを収集した。複数のメタノール画分は、「画分６」として組合せたが、「画分５」で収集されたものより極性の低いプロアントシアニジンを含有していた。かくして、「画分６」は「非極性」プロアントシアニジンに富む画分とここで言及される（図１５）。非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は例えあるとしても少ししか色を有していないので、この画分におけるオリゴマー状プロアントシアニジン鎖はカチオン性アントシアニジン副単位を含有しないことが示唆される。
【００５５】
かくして、本発明は「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せに含有される非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを都合よく分離する方法を提供する。極性プロアントシアニジンに富む「画分５」及び非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は、粗製濾過水性抽出物（図１、工程３０）をＣ−１８ ＶＬＣカラム上に供給することにより直接に単離することが出来ることが又分った。単離されたプロアントシアニジンに富む画分５及び６を夫々説明するために使用する場合、用語「極性」及び「非極性」は画分５及び６におけるプロアントシアニジンの極性のことをお互いに比較して、即ち、特定の留分がＣ−１８ ＶＬＣカラム上でどのように挙動するかを言及していると理解されるべきである。本発明の極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分５）及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分６）は、実施例で論議されるように、実質的に減少した量のアントシアニンを有する。
【００５６】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分（夫々「画分５」及び「画分６」）は異なる生物活性を有することが分ったが、該非極性画分は、実施例１７で説明されるように、或る試験において該極性画分よりも大きな抗ウィルス活性を有することが分った。
【００５７】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分５及び６の各々は夫々、図１５に示されているように、又実施例１２〜１４で説明されるように、更に精製することが出来る。例えば、ＶＬＣ分離中に単離された極性プロアントシアニジンに富む「画分５」は、極性プロアントシアニジンを放出できるように保持する半分離用Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラム上に供給することが出来る。次に該カラムを、増加するパーセントのアセトニトリル、メタノール、又はエタノールを含む溶剤グラディエントで洗浄してアントシアニン及び他の極性化合物の大部分を溶離し、それから少なくとも６０％のアセトニトリル、メタノール、又はエタノールで洗浄して精製極性プロアントシアニジンを含有する「画分７」を溶離する（図１５）。更に、ＶＬＣ分離中に単離された非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は、ゲル濾過又は逆相半分離用ＨＰＬＣにより更に精製することが出来る。サイズ除外又はゲル浸透クロマトグラフィーとも呼ばれるゲル濾過は、分子をそれらのサイズにより分離する液体クロマトグラフィー技術である。このタイプの媒体は比較的小さな化合物を保持するが、一方比較的大きな非極性プロアントシアニジンに富む「画分８」（図１５）は流過溶離剤と共に溶離する。本発明の精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分７及び８は夫々、実質的に減少した量のアントシアニン及びフラボノイドを有し、又実質的に減少した量の極性非フェノール化合物を有する。更に、精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む「画分７」及び「画分８」は夫々異なる生物活性を有することが観察された。
【００５８】
用途
【００５９】
本発明の、フェノール化合物に富む組成物（「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せ）、極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分５及び７）、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分６及び８）は、様々な生物活性を有する。例えば、本発明の組成物は、実施例１５及び１６で説明されるように、抗ウィルス活性を有することが分った。本発明の組成物は、インフルエンザＡ，Ｂ，及びＣ、パラインフルエンザ・ウィルス、アデノウィルス１型、パンタトロウィルスＡ、単純ヘルペスウィルスＩ及びＩＩ、ライノウィルス、西ナイルウィルス、水痘・帯状疱疹ウィルス、及びはしかウィルスを含むがそれらに限定されないウィルスからのウィルス感染により誘発された又は併発した病気を予防及び（又は）治療するために、単独で又は他の抗ウィルス剤と組合せて使用することが出来る。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、治療的有効量の本発明組成物を投与することにより、かかるウィルスにより誘発される病気に対する予防的及び治療的応用において有利に使用することが出来る。
【００６０】
プロアントシアニジンは、それらのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害活性により抗炎症物質としても研究されている。抗炎症物質はＣＯＸ−１阻害よりもむしろＣＯＸ−２阻害に対して選択性があることが望ましいと示されている。従って、本発明の他の局面には、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を治療的有効量投与することを特徴とする、哺乳類における炎症性疾病を治療する方法が含まれる。例えば、ブルーベリー抽出物の精製中に画分３及び４として単離されたフェノール化合物に富む組成物は、高いＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１阻害選択性を有し、１０８μｇ／ｍＬのＩＣ５０（５０％抑制濃度）を有することが分った（実施例１７）。本発明の組成物は、炎症性反応を予防又は阻害するために、単独で又は他の抗炎症剤と組合せて使用することが出来る。かかる反応は、骨関節炎、アレルギー性鼻炎、循環器病、上気道疾患、創傷感染、神経炎、及び肝炎を含むが、それらに限定されない状態又は病気により引起こされ得る。
【００６１】
クランベリー及びブルーベリーから単離されたプロアントシアニジンは、細菌が膀胱壁に付着するのを阻害し、それにより尿路感染症のような疾病の可能性を減少させることが知られている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３９：１０８５−１０８６ （１９９８），Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．Ｂ．等）。プロアントシアニジンは細菌の付着を阻害することによりそれらの効果を発揮することが前提とされている。従って、本発明の他の局面には、尿生殖器感染症に伴う症状を予防し、減少させ、又は除去するのに充分な量で、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を有効量投与することを特徴とする、哺乳類における尿生殖器感染症を予防又は治療する方法が含まれる。本発明の組成物は単独で又は他の抗菌剤と組合せて使用することが出来る。
【００６２】
プロアントシアニジンは強力な抗酸化剤であることが更に知られている。例えば、プロアントシアニジンの抗酸化剤効果は循環系及び免疫系に対するそれらの多くの利点を説明すると推測される。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、食事サプリメント（例えば、食事抗酸化剤）として、又人間及び哺乳類における疾患の治療に使用することが出来るのである。例えば、本発明の組成物は、視力を改善するために、又循環器系疾患、糖尿病，及び潰瘍を治療するために使用することが出来る。
【００６３】
乾燥プラムは肉製品における病原体の成長を抑制する有効な微生物剤として役に立つことが出来ることが知られている。例えば、Ｄ．Ｆｕｎｇ（カンサス州大学）は、乾燥プラムピューレをひき肉製品における微生物阻害剤として試験した。３重量％レベルの乾燥プラムピューレを用いて、ひき肉における大腸菌やサルモネラ菌のような毒性病原菌に対する９９％の殺菌割合が報告された（次のＵＲＬ：http://www.mediarelations.ksu.eduで入手できる２００２年の新聞発表）。フェノール化合物が部分的にこの有益な効果を引起こすと考えられる。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、肉製品における病原菌の成長を妨げる肉添加剤として使用することが出来る。
【００６４】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、アラビノガラクタン、エキナシア種、ビタミン、ミネラル、多糖類、及びレンゲ属を含むが、それらに限定されない免疫活性剤と組合わせることも出来る。
【００６５】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイドを含むが、それらに限定されない抗変異原性剤と組合わせることも出来る。
【００６６】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、錠剤、カプセル、液体、又はチンキ剤として配合することが出来る。本発明により組成物を配合する際、広い範囲の付形剤を使用することが出来るが、それらの性質は勿論該組成物の意図した適用方法に依存するであろう。付形剤の例には、防腐剤、担体、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び香料添加剤、特に、カルボキシビニルポリマー、プロピレングリコール、エチルアルコール、水、セチルアルコール、飽和野菜トリグリセライド、脂肪酸エステル又はプロピレングリコール、トリエタノールアミン、グリセロール、澱粉、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、ラウリルサルフェート、燐酸二カルシウム、レシチン、等が含まれる。
【実施例１】
【００６７】
水抽出剤を用いたビルベリーの精製
１ｋｇの乾燥ビルベリー原料に対して３回の抽出を行った。最初の抽出は６Ｌの水を用い、他の２回の抽出は４Ｌの水を用いた。すべての抽出剤は濃硫酸で５ｇ／Ｌの酸濃度まで酸性化した。粗製抽出物中にアントシアニンが大体８８％回収された。正確に２．３Ｌの粗製抽出物を、ガラスウール層が上に乗せられた３０ミクロンのプロピレンフィルターに通して濾過した。該ガラスウールは一度交換し、該フィルターを脱イオン水ですすいだ。濾液の最終体積は２．４３Ｌで、濾液中にアントシアニンが９０．９％回収された。
【００６８】
カラムに臭素化ポリスチレン樹脂ＳＰ−２０７（Ｓｕｐｅｌｃｏ； Ｂｅｌｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を詰め込み、０．１％酢酸で平衡させた。該カラムに２．２４Ｌの該濾液を２９．８ｇ／Ｌの固体濃度で２．２ｍＬ／分の流速を用いて装填した。装填流出は装填されたアントシアニンの０．９％より少なく、該装填及び最初の２回のカラム洗浄におけるアントシアニンの全損失は４．０７％であった。該溶離工程でアントシアニンが８８．４％回収され、アントシアニンの物質収支は９２．５％であった。２，３百ミリリットルの溶離生成物を回転蒸発器の上で蒸発乾固させてから凍結乾燥させた。乾燥生成物の最終分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。得られた組成物は重量で４３％の全アントシアニンを含有していた。
【実施例２】
【００６９】
７０％エタノール抽出剤を用いたビルベリーの精製
２．０％のアントシアニンが分析された乾燥ビルベリー原料（６６７ｇ）を、容量で３％の硫酸を含有する７０％のエタノール／水を用いて、パーコレーションにより抽出した。粗製抽出物中の固体は、３．９重量％の全アントシアニンを含有していた。１リットルの最初の抽出容量を１００ｍＬの脱イオン水と混合し、真空で約４６０ｍＬまで蒸発させて該アルコールを除去した。該混合物に脱イオン水（３００ｍＬ）を添加し、更に１７０ｍＬの液体を蒸発させた。脱イオン水（２１０ｍＬ）を添加して最終容量を８００ｍＬとした。該水性混合物に１５０ｇのＣｅｌｉｔｅ ５１２（固体１グラム当り０．５〜０．９ｇのＣｅｌｉｔｅ）を添加した。該混合物を均質になるまで振蕩した。Ｃｅｌｉｔｅ／抽出物を真空下で３０ｇの湿ったＣｅｌｉｔｅ ５１２床上に注いだ。濾過完了後、該床を１．２０Ｌの１％硫酸水溶液で２００ｍＬずつ洗浄した。濾液量は１８５５ｍＬであった。該濾液に１４５ｍＬの脱イオン水を加えて２．０Ｌの最終容量にした。
【００７０】
該濾液の一部（６９５ｍＬ）を、１７０ｍＬの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）が装填されたカラム上に２．２ｍＬ／分（１．３ｍＬ／分／ｃｍ２）で供給した。これにより、１リットルのカラム媒体当り１７ｇのアントシアニンという装填値が得られた。該カラムを、１カラム容量の０．１％酢酸水溶液に続いて２．５カラム容量の０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノール／９０％水で洗浄した。次に該カラムを１０カラム容量の７０％エタノール／水で溶離し、該７０％エタノール画分を一緒にして６０℃、５０ｍｂａｒにおいて真空で濃縮して光る暗色乾燥非晶質固体（「画分３」）が得られた。乾燥生成物の最終分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。得られた組成物は重量で３２％の全アントシアニンを含有していた。
【００７１】
図２及び３は、本発明の方法によりビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００７２】
表１は、典型的なアントシアニンに富む組成物（「画分３」）中の各アントシアニンのパーセントを取りまとめたものである。
表１．ビルベリーの「画分３」に存在するアントシアニンの同定及び含量
【００７３】
【表１】
【実施例３】
【００７４】
ブルーベリーからのフェノール化合物に富む組成物
１０Ｌの丸底フラスコにおいて、９４０ｇの乾燥粉砕ブルーベリー（イリノイ州モメンス、Ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に４．０リットルの抽出溶剤（７０％エタノール中１．０ｗ／ｖ％硫酸）を添加した。該フラスコを４０℃に維持された恒温水槽中で２時間回転させた。該混合物をかきまぜ、真空下１５０ｇのＣｅｌｉｔｅ ５１２床に通して濾過した。ブルーベリーのバイオマスケークを５００ｍＬの抽出溶剤で洗浄した。該ケークを該Ｃｅｌｉｔｅ床から注意深く掻き取り、丸底フラスコ中に移し、上述の操作に従って再抽出した。次に第三の抽出を行った。三つの粗製抽出物を一緒にした。
【００７５】
一緒にした抽出物の一部（２．００Ｌ）を４０℃の水槽温度で真空下１７５ｍＬまで濃縮した。蒸発させた抽出物を脱イオン水で希釈して６７５ｍＬのブルーベリー粗製抽出物が得られた。該粗製抽出物を、１７０ｍＬの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）が装填され、前以て調整され（即ち、アセトンで洗浄され）平衡させられたカラム上に濾過せずに供給した。該カラムを、０．１％酢酸で、そして０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノールで洗浄した。アントシアニンは７０％エタノールで溶離された。生成物プールを６０℃、５０ｍｂａｒで真空下蒸発させた。最終生成物分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。精製されたブルーベリー組成物（「画分３」）は重量で１８％の全アントシアニンを含有し、アントシアニンの全回収は９５％であった。
【００７６】
図４及び５は、本発明の方法によりブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【実施例４】
【００７７】
ブルーベリーからのより高純度のフェノール化合物に富む組成物
この実施例では、実施例３に記載したように製造されたブルーベリーを原料とし全アントシアニンが１８重量％であるフェノール化合物に富む組成物の一部を、該組成物の純度を増加させるために、強い又は弱いアニオン交換樹脂に通過させて残留酸を除去した。
【００７８】
該フェノール化合物に富むブルーベリー組成物の約１．０ｇを、５０ｍＬの水に溶解し、強アニオン交換樹脂（ペンシルベニア州モントゴメリー、ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０ Ｍ）又は弱アニオン交換樹脂（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥＭ−６３）を含有する９ｍＬのカラムに通過させた。該カラムを３０〜３５ｍＬの水で洗浄した。該強アニオン交換樹脂カラムの場合は、該樹脂を２５ｍＬの２０％エタノールに続いて４０％エタノールで更に洗浄した。該強アニオン交換カラムから単離した組成物は２８．３重量％の全アントシアニンを含有し、該回収は８８％であった。該弱アニオン交換カラムから単離した組成物は３０．６重量％の全アントシアニンを含有し、該回収は８８％であった。
【実施例５】
【００７９】
ペクチナーゼ処理を用いたビルベリーからのフェノール化合物に富む組成物
１０２４ｇの冷凍ビルベリーに温水（５４８ｇ）を添加した。該混合物をミキサーでピューレにしてから４０℃に加熱した。次に１５０μＬのペクチナーゼ（ニューヨーク州ノリッジ、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｑｕｅｓｔ Ｓｕｐｅｒ ７ｘ）を添加して４０℃で３０分攪拌処理した。該スラリーに約４ｍＬの濃硫酸を添加して０．５％（ｗ／ｗ）の酸濃度を達成した。次に該混合物を４５℃に加熱して非常にゆっくり攪拌しながら１５分間抽出した。Ｄｉｃａｌｉｔｅ（１６４ｇ）を該抽出混合物に添加してから、それを２６ｇのＤｉｃａｌｉｔｅ床を越えて濾過した。得られたケークを４００ｍＬの０．１％温硫酸水溶液で３回洗浄した。この抽出物を２５μｍの加圧フィルターに通して濾過した。濾過抽出物のすべて（２．４Ｌ）を１７０ｍＬのＳＰ−２０７カラム上に装填した。装填後、該カラムを０．１％酢酸水溶液で洗浄してから７０％エタノール水溶液で溶離して「画分３」が提供された。「画分３」を蒸発乾固させてから凍結乾燥器上に４８時間置いた。最終生成物は、５３５ｎｍにおける吸収の標準分光光度定量により全アントシアニンを分析した。該フェノール化合物に富む組成物は、重量で４０％の全アントシアニンを含有していた。アントシアニンの全回収は大体７９％であった。
【実施例６】
【００８０】
エルダーベリー・バイオマス粉末からのフェノール化合物に富む組成物
１．８８％のアントシアニンおよび５．３１％のフェノール化合物が分析された乾燥エルダーベリー・バイオマス粉末（カリフォルニア州ロングビーチ、ＢＩ Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）約１９０ｇを１０００ｇの温水に添加した。該溶液を充分に混合して４５℃の湯浴に移した。該溶液に１９０μＬのペクチナーゼ（Ｓｕｐｅｒ ７Ｘ，Ｑｕｅｓｔ）を添加してから、該混合物を３０分間放置した。該混合物を、２．５ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４を用いて２．５のｐＨまで酸性化してから、１０分間静かに混合した。この酸性化混合物に１６４ｇのＣｅｌｉｔｅを添加してから、該酸性化混合物を２６ｇのＣｅｌｉｔｅ床を越えて濾過した。該フィルターケークを４００ｍＬの酸性化温水で３回、全体として１２００ｍＬで洗浄した。次に該濾液を２５μｍの加圧フィルターに通して濾過しエルダーベリー抽出物が得られた。
【００８１】
該エルダーベリー抽出物を、１７０ｍＬのＳＰ−２０７（三菱ケミカル）臭素化ポリスチレンカラム上に２．３ｍＬ／分（１．３ｍＬ／分／ｃｍ２）の速度で装填した。装填中該カラムから離れて収集された溶離液は、「画分１」として収集された。装填後、該カラムを３カラム容量（３ｘ１７０ｍＬ）の０．００６％硫酸水溶液で洗浄した。この洗浄からの溶離液は「画分２」として収集された。次に該カラムを８〜１０カラム容量の７０％エタノール水溶液で溶離し、それらは「画分３」として収集された。次に該カラムを３カラム容量の９０％エタノール水溶液で洗浄し、それらは「画分４」として収集された。該カラムを８カラム容量の０．００６％硫酸水溶液で再平衡化した。画分３及び４を蒸発乾固させてから乾燥するまで凍結乾燥させた。臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離の間に単離されたいくつかの画分を、実施例７及び８で記載されるように、アントシアニン及びフェノール化合物について分析した。
表２．エルダーベリー画分中のアントシアニン及びポリフェノールの分析と回収
【００８２】
【表２】
【００８３】
図６〜１３は、濾過されたエルダーベリー抽出物の、及びカラム精製の間に単離されたいくつかの画分のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。使用されたＨＰＬＣ条件は実施例９に記載される条件である。
【００８４】
図６及び７は、濾過されたエルダーベリー抽出物の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８５】
図８及び９は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上にカラム装填している間に収集された「画分１」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８６】
図１０及び１１は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂から７０％エタノールの使用によりカラム溶離している間に収集された「画分３」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８７】
図１２及び１３は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂から９０％エタノールの使用によりカラム溶離している間に収集された「画分４」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８８】
本発明のフェノール化合物に富む組成物は、実質的に図１０〜１３に示された標準的ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて６０〜７５分の範囲にピークを示す化合物を含む。
【実施例７】
【００８９】
アントシアニンの定量的測定
この方法は、外部標準を用いたＵＶ−ＶＩＳ（紫外・可視）分光光度測定法により、種々のバイオマス試料及び乾燥され精製されたフェノール化合物に富む組成物中の全アントシアニンを定量するのに用いられる。試験される各試料（例えば、濃縮されたフェノール化合物に富む組成物、乾燥されたバイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、以下に説明されるように異なる調整操作を必要とする。
【００９０】
フェノール化合物に富む組成物： 精製されたフェノール化合物に富む組成物を１００ｍＬ容量のフラスコ中に７５〜１００ｍｇ正確に秤量し、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで希釈して一杯にする。良く混合してから、この試料の０．４０〜１．６ｍＬを２％のＨＣｌ／ＭｅＯＨで希釈して１０．０ｍＬとする。
【００９１】
乾燥バイオマス： コーヒー豆ひき器中に、該豆ひき器の刃を覆うのに充分な量の乾燥バイオマスを入れる。約１分間又は微細に粉砕されるまで粉砕する。或いは、乳鉢及び乳棒を用いて該原料を微細に粉砕する。１００ｍＬ容量のフラスコ中に微細に粉砕されたバイオマスを約５０〜１００ｍｇ正確に秤量してから、約８０ｍＬの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し蓋をする。該フラスコを、５０℃の油浴又は強制空気オーブンに３０〜６０分間入れ、３０秒静かに振蕩させてから、５分間音波破砕する。該溶液を室温まで冷却させる。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを該印まで添加し混合する。該試料の一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してバイアル中に濾過する。該濾液の１．０ｍＬを２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍＬまで希釈する。該希釈係数は１０ｍＬ／１ｍＬ、即ち１０となるであろう。
【００９２】
冷凍／新鮮バイオマス： １０００ｍＬのポリプロピレンビーカー中に冷凍／新鮮バイオマスを４００．０ｇ秤量する。該ビーカー中に４００ｇの沸騰直前の水を添加する。機械的ミキサー（Ｗａｒｉｎｇ等）を用いて裏ごしする。口径の広いポリエチレンスポイトを用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取除いて、風袋が計量された１００ｍＬ容量のフラスコ中に移す。８０ｍＬの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し蓋をする。該フラスコを、５０℃の油浴又は強制空気オーブンに６０〜１２０分間入れ、３０秒静かに振蕩させてから、５分間音波破砕する。該溶液を室温まで冷却させる。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを該印まで添加し混合する。一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してバイアル中に濾過する。該希釈係数は、バイオマスと水の合計重量をバイオマスの重量で割った値となるであろう［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ＝２］。
【００９３】
乾燥損失： 上記試料中の全アントシアニン含量を得る計算は、該原料の含水量、即ち、％ＬＯＤ（乾燥損失）の測定を必要とする。％ＬＯＤを測定するため、正確に秤量されたアルミニウム・ウェーパン中に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分配し、該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。該試料を１０５℃±３℃のオーブンに２時間（２時間１５分を超えない）入れる。該試料が室温に冷えてから（乾燥器を使用しても良い）、該試料を秤量して該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。％ＬＯＤは式１を用いて０．１％に近似した正確さで決定される。
【００９４】
【数１】
［式中、％ＬＯＤ＝乾燥損失パーセント、ＷＤ＝受皿及び試料の乾燥重量（ｇ）、ＷＰ＝受皿の重量（ｇ）、そしてＷＳＰ＝受皿及び試料の初期重量（ｇ）。］
【００９５】
分析操作： ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプをオンにして光度測定モードで読めるようにセットする。該計器を、１ｃｍ光路長のガラス、石英、又は使い捨てポリスチレンのセル中に２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、５３５ｎｍでゼロ目盛に合せる。同じか又は整合させた１ｃｍのセル中で、準備した試料の吸収を５３５ｎｍで測定する。
【００９６】
計算： 全アントシアニンの濃度は式２に示されたように計算される。
【００９７】
【数２】
［式中、ＣＡＮＴＨＯＳ＝試料中全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＡＢＳＳＡＭＰ＝５３５ｎｍにおける試料の吸収、ＤＦ＝下記に説明される希釈係数、そしてＥＳ＝塩化シアニジン（サクランボ、クランベリー、エルダーベリー、及びプラムに対して、１０１．１）又は塩化デルフィニジン（ビルベリー及びブルーベリーに対して、１０２．０）の適切な外部標準の吸収率（１ｃｍのセルを用いた２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中５３５ｎｍにおける１ｍｇ／ｍＬ溶液の吸収）。乾燥バイオマスに対する希釈係数（ＤＦ）は１であり、新鮮／冷凍バイオマスに対する希釈係数はバイオマスと水の合計重量をバイオマスの重量で割った値［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ］である。精製された抽出物に対する希釈係数は、最終希釈容量を抽出物溶液の容量で割った値（例えば、１０ｍＬ／０．４０ｍＬ）である。］
【００９８】
全アントシアニンパーセントは式３に示されるように計算される。
【００９９】
【数３】
［式中、％Ａｎｔｈｏｓ＝試料中全アントシアニンのパーセント、ＣＡＮＴＨＯＳ＝全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖｏｌｕｍｅ＝試料調製の初期容量（通常１００ｍＬ）、ＷＳ＝該調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスの場合５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合５００〜１５００ｍｇ、又は精製抽出物の場合７５〜１００ｍｇ）、そしてＳＬＯＤ＝乾燥或いは新鮮バイオマス又は精製抽出物に対して（１００−％ＬＯＤ）／１００（新鮮又は冷凍バイオマスに対してこの係数はあてはまらない）］。
【実施例８】
【０１００】
全ポリフェノールの定量的測定
この方法は、外部標準として没食子酸を用いたＵＶ−ＶＩＳ（紫外・可視）分光光度測定法により、種々のバイオマス試料及び乾燥され精製されたフェノール化合物に富む組成物中の全ポリフェノールを定量的に測定するのに用いられる。
【０１０１】
該操作は２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液及び２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを必要とする。該Ｎａ２ＣＯ３溶液を調製するには、約３５０ｍＬの脱イオン水を含有する５００ｍＬ容量のフラスコ中に約１００ｇのＮａ２ＣＯ３を秤量する。１０分間音波破砕し振蕩して混合する。脱イオン水を用いて一杯になるまで希釈し、均質になるまで攪拌する。２％のＨＣｌ／ＭｅＯＨを調製するには、５００ｍＬ容量のフラスコ中に約３５０ｍＬのメタノールを移す。該フラスコ中に１０．０ｍＬのＨＣｌをピペットで入れる。メタノールを用いて一杯になるまで希釈し、均質になるまで混合する。
【０１０２】
没食子酸ストック標準を調整するには、１００ｍＬ容量のフラスコ中に１００ｍｇの没食子酸（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ）を正確に秤量する。７０ｍＬの脱イオン水を添加し、溶解するまで５分間音波破砕する。脱イオン水を用いて一杯になるまで希釈し、蓋をして均質になるまで混合する。
【０１０３】
試験する各試料（例えば、フェノール化合物に富む組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、異なる調製操作を必要とし、実施例７に説明したように調製した。
【０１０４】
乾燥損失： 上記試料中の全ポリフェノール含量を得る計算は、該原料の含水量、即ち、％ＬＯＤ（乾燥損失）の測定を必要とする。％ＬＯＤを測定するため、正確に秤量されたアルミニウム・ウェーパン中に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分配し、該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。該試料を１０５℃±３℃のオーブンに２時間（２時間１５分を超えない）入れる。該試料が室温に冷えてから（乾燥器を使用しても良い）、該試料を秤量して該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。％ＬＯＤは上記式１を用いて０．１％に近似した正確さで決定される。
【０１０５】
比色発現操作： きれいな１００ｍＬ容量のフラスコを試薬ブランクとして役立つように脇に置く。２個の１００ｍＬ容量のフラスコに「高」標準及び「低」標準とラベルを付ける。没食子酸ストック溶液を用いて、ピペットで８００ｍＬを「高」標準フラスコ中に入れ、２００ｍＬを「低」標準フラスコ中に入れる。乾燥バイオマス試料に対しては、該濾過溶液の２０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。新鮮／冷凍バイオマス試料に対しては、該濾過溶液の１０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。精製された試料に対しては、０．８０〜２．０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。上記で調製したフラスコ（試薬ブランクを含む）の各々に以下のものを添加する。
１．全容量を約６５ｍＬにするのに充分な脱イオン水を各フラスコに添加する。
２．ＦＣフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ）の５．０ｍＬを各フラスコ中にピペットで入れ、静かに攪拌する。
３．２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液の１５±２ｍＬを各フラスコ中にピペットで入れる。
４．各フラスコ中の溶液を静かにかきまぜながら混合し、脱イオン水で一杯になるまで希釈し、蓋をして逆さにする。
５．それらの溶液を少なくとも３時間しかし４時間以下発色させる。
６．濾過を必要とする試料の１０ｍＬ分割量を０．４５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターに通して適切な容器中に濾過する。
【０１０６】
分析操作： ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプをオンにして光度測定モードで読めるようにセットする。１ｃｍ光路長のガラス、石英、又は使い捨てポリスチレンのセル中で分析を行う。該計器を、試薬ブランクを用いて、７６０ｎｍでゼロ目盛に合せる。同じか又は整合させた１ｃｍのセル中で、各溶液の吸収を７６０ｎｍで測定する。
【０１０７】
計算： 全ポリフェノールの濃度を計算するには、最初に没食子酸の吸収率を測定しなければならない。この値は式４に記載されているように得られる。
【０１０８】
【数４】
［式中、ＥＲ＝吸収単位／ｇ／Ｌで表した７６０ｎｍにおける参照標準（没食子酸）の吸収率、ＡＲ＝参照標準溶液の吸収、ＣＲ＝ストック標準溶液中没食子酸の濃度、ＤＲ＝没食子酸標準に対する希釈係数（「高」標準に対する１２５又は「低」標準に対する５００）、そしてＥＬＯＤ＝パーセントとしての没食子酸固体の乾燥損失。］
【０１０９】
下記の式５に使用するため、「高」標準及び「低」標準に対する吸収率を平均化する。発色試料調製液中の全ポリフェノールの濃度は式５に示されているように計算される。
【０１１０】
【数５】
［式中、ＣＰ＝ＦＣ試料調製液中全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＡＳ＝ＦＣ試料調製液の吸収、ＤＦＣ＝試料希釈係数（ＤＦは典型的に、乾燥バイオマスに対し５、新鮮／冷凍バイオマスに対し１０、そして精製されたフェノール化合物に富む組成物に対し５０〜１２５である）、そしてＥＲ＝没食子酸標準の平均吸収率。］
【０１１１】
全ポリフェノールパーセントは式６に示されているように計算される。
【０１１２】
【数６】
［式中、％Ｐ＝試料中全ポリフェノールのパーセント、ＣＰ＝全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＶＳ＝初期試料調製液の容量（通常１００ｍＬ）、ＷＳ＝初期試料調製液に用いたバイオマス又は精製組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、そして精製抽出物に対しては７５〜１００ｍｇ）、ＤＳ＝初期試料希釈係数（ＤＳは、乾燥バイオマスに対し１、新鮮／冷凍バイオマスに対し２、又は精製抽出物に対し１である）、そしてＳＬＯＤ＝バイオマス又は精製抽出物に対して（１００−％ＬＯＤ）／１００。新鮮又は冷凍バイオマスに対してこの係数はあてはまらない。］
【実施例９】
【０１１３】
ＨＰＬＣ定性分析
この方法は、種々のバイオマス及び精製されたフェノール化合物に富む組成物中の化合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定するのに使用される。各タイプの試料は、下記に説明するように異なる調製操作を必要とする。
【０１１４】
乾燥バイオマス： 乾燥バイオマスは、まだ粉末化されてないならば、ウィリーミルを用いて１ｍｍスクリーンに通して粉砕する。適切な大きさにした円筒濾紙及びソックスレー抽出器を使用して、約１２ｇの粉末化バイオマスを円筒濾紙中に秤量し、２００ｍＬのメタノールを用いて抽出する。少なくとも２０サイクル又は抽出溶剤が澄明になるまで抽出する。該抽出液を２５０ｍＬ容量のフラスコにメタノールを用いて定量的に移し、一杯になるまで希釈して混合する。該抽出液を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１５】
冷凍／新鮮バイオマス： １０００ｍＬのポリプロピレンビーカー中に冷凍／新鮮バイオマスを４００ｇ秤量する。該ビーカー中に４００ｇの沸騰直前の水を添加する。機械的ミキサー（Ｗａｒｉｎｇ等）を用いて裏ごしする。口径の広いポリエチレンスポイトを用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取除いて、風袋が計量された１００ｍＬ容量のフラスコ中に移す。８０ｍＬのＭｅＯＨを添加し、蓋をして５０℃で３０分間加熱する。該溶液を室温まで冷却させ、メタノールで一杯になるまで調整してから、均質になるまで音波破砕する。一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１６】
精製されたフェノール化合物に富む組成物： 該フェノール化合物に富む組成物をガラスのシンチレーション・バイアル中に５０〜１００ｍｇ正確に秤量し、１０．０ｍＬの５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを添加する。５分間音波破砕する。０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１７】
ＨＰＬＣを必要とされているようにセットする。本発明の一態様において、５ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍＬの高純度タイプ１水中に混合することにより水性移動相を調製した。２０μＬの試料を周囲温度で注入した。２８０ｎｍの波長を検出に使用し、流速は１．０ｍＬ／分であり、運転時間は１０５分であった。Ｚｏｒｂａｘカラムは１５０ｘ４．６ｍｍのＩＤカラムに５μｍのＳＢＣ−１８を詰め込んだ。この態様において、移動相は以下のようにセットした：チャネルＡ：１００％アセトニトリル；チャネルＢ：Ｈ２Ｏ中０．５％ＴＦＡ；そしてチャネルＣ：１００％メタノール。表３は、本発明のこの態様に対するＨＰＬＣ階調度をまとめたものである。
【０１１８】
もし入手できるならば、試料中に存在することが知られている化合物の標準調製液を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製することが出来る。これらの標準調製液は、大体の滞留時間を測定し、それにより試料クロマトグラム中のそれらの化合物を同定するのに使用することが出来る。この方法は定性目的の為のみに使用されるので、計算は全く必要ない。
表３： 定性分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１１９】
【表３】
【実施例１０】
【０１２０】
プロアントシアニジンのパーセントを測定するための定量的ＨＰＬＣ法
このＨＰＬＣ法は、種々の画分及びフェノール化合物に富む組成物中のプロアントシアニジンの量を測定するのに使用される。各タイプの試料は異なる調製を必要とするので、実施例９で説明したように調製する。該方法は、１５０ｘ４．６ｍｍのカラムにＳｔａｂｌｅｂｏｎｄ ＳＢＣ−１８を詰め込んだ５μｍ Ｚｏｒｂａｘカラムを使用する。流速は１．５ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は１０μＬであり、そして運転時間は２４分であった。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。使用した階調度を表４に提供する。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラムにおいて幅広いピーク群として典型的に溶離された。
表４．プロアントシアニジンの％分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
プロアントシアニジンを定量するために、組織内で前以って調整したプロアントシアニジン標準を９０％より高い純度で利用する。これの試料は７０％エタノール中５．５ｍｇ／ｍＬで調製し、この実施例で説明したＨＰＬＣ法を用いて分析する。この標準に対するクロマトグラムには（図１４に見られるように）１１〜２２分の滞留時間範囲で大きな幅広いピークが含まれるが、これはプロアントシアニジンによる。１１〜２２分のピーク全体を手作業で積分する。次に、式７に示されているように、標準に対するピーク面積応答係数を、１１〜２２分の全ピーク面積を標準溶液濃度とその純度の積で割ることにより決定する。
【０１２３】
【数７】
［式中、ＲＦ＝標準に対するピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡ＝標準におけるプロアントシアニジンのピーク面積、ＣＳＴＤ＝ｍｇ／ｍＬで表した標準溶液の濃度、そしてＰＳＴＤ＝パーセントとしての標準物質純度（通常０．９０）。］
【０１２４】
試料中のプロアントシアニジンのパーセントは、上述の試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて測定することが出来る。問題の試料に対して、１１〜２２分の滞留時間範囲における全ピーク面積を測定する。しかしながら、いかなる計算をする前にも、プロアントシアニジン滞留時間範囲における非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、端から端までの全ピーク面積から引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、幅広いプロアントシアニジンのピークと共に溶離する鋭いピークとして又は該ピークの頂上における鋭いピークとして頻繁に現れ、それらのダイオードアレーによるＵＶスペクトルはプロアントシアニジンのピークの大部分としばしば異なる。非プロアントシアニジンのピーク面積を測定するには、これらのピークを手作業で積分し、それらのピーク面積を合計し、次にこの面積を１１〜２２分の全ピーク面積から引く。試料中のプロアントシアニジンのピーク正味面積が一旦測定されたら、式８に示されるように、この値を組織内標準に対するピーク面積応答係数で割って試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る。
【０１２５】
【数８】
［式中、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝試料中全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡＳＡＭＰ＝試料に対する訂正全ピーク面積、ＤＦ＝希釈係数（乾燥バイオマスに対して１、新鮮／冷凍バイオマスに対して２、そしてフェノール化合物に富む組成物に対して１）、そしてＲＦ＝式７を用いて計算されたピーク面積応答係数。］
【０１２６】
全プロアントシアニジンの％は式９に示されるように計算される。
【０１２７】
【数９】
［式中、％Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ＝試料中全プロアントシアニジンのパーセント、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖ＝試料調製液の容量（通常、乾燥バイオマスに対しては２５０ｍＬ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては１００ｍＬ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては１０ｍＬ）、そしてＷＳ＝試料調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては５０〜１００ｍｇ）。］
【実施例１１】
【０１２８】
濾過されたエルダーベリー抽出物からの極性及び非極性プロアントシアニジンの直接的分割
この実施例では、濾過されたエルダーベリー抽出物を調製し、臭素化ポリスチレン樹脂上で精製する代りに、図１５に説明した方法により、真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）カラム上に直接供給して、濾過抽出物から直接に極性プロアントシアニジン及び非極性プロアントシアニジンを分割した。
【０１２９】
メタノール中Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ４０μｍフラッシュ・クロマトグラフィー Ｃ−１８媒体のスラリー５０ｍＬを、６０ｍＬのガラス濾過器に通して濾過することにより、５０ｍＬのＣ−１８ ＶＬＣカラムを調製した。該カラムを、メタノールで、次に水で洗浄することにより、調整した。１２．０ｇの固体、７４ｍｇのアントシアニン、及び約７８０ｍｇのプロアントシアニジンを含有する濾過されたエルダーベリー抽出物の３００ｍＬ部分を、該カラム上に供給した。実施例１０で説明したＨＰＬＣ法を用いた濾過抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを図１６に示す。流過溶離液（約３００ｍＬ）及び１００ｍＬの洗浄液（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））を一緒にして極性プロアントシアニジンの「画分５」を提供した。「画分５」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に示す。次に該カラムを、０．１％ＴＦＡを含有する３０，４０，５０，６０，７０及び１００％メタノールの各１００ｍＬで溶離した。６０％メタノール溶離液中に単離された非極性プロアントシアニジンの「画分６」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に示す。これらの画分を、実施例７及び１０で説明した方法により、アントシアニン及びプロアントシアニジンに対して分析した。表５はこの実験の結果をまとめたものである。
表５： エルダーベリーの分割
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
該結果によれば、濾過抽出物中のプロアントシアニジンの７１％（５５８ｍｇ）が装填及び洗浄中に収集されたことが示されている。これらの化合物は比較的極性のプロアントシアニジンであった。非極性プロアントシアニジンは、メタノール濃度を少なくとも４０％に増加させた時に溶離された。５０〜７０％メタノール画分中に溶離されたプロアントシアニジンの純度は高かったが、それは、濾過されたエルダーベリー抽出物に含有される固体の大部分が装填溶離剤、水洗浄液、及び３０％メタノール洗浄液中に溶離された事による。
【実施例１２】
【０１３２】
ＶＬＣによるエルダーベリー・プロアントシアニジンの分割に続くゲル浸透クロマトグラフィー又は半分離用ＨＰＬＣによる精製
実施例６で説明した操作を用いて、臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離の間に７０％エタノール画分（「画分３」）を収集することにより、エルダーベリー乾燥バイオマス（ドイツ、Ｍａｒｔｉｎ Ｂａｕｅｒ）からフェノール化合物に富む組成物を調製した。このフェノール化合物に富む組成物の一部（２．００ｇ）を５０ｍＬの水に溶解し、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ４０μｍ Ｃ−１８媒体で調製した１５ｍＬのＣ−１８ ＶＬＣカラム上に供給した。流過溶離液及び２５ｍＬの水洗浄液を一緒にし凍結乾燥して、７３３ｍｇの極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）を生成した。次に該カラムを２５ｍＬの５０％メタノールで洗浄した。非極性プロアントシアニジン（「画分６」）は２５ｍＬの７０％メタノールで溶離された。この画分中のメタノールを除去し、得られた水懸濁液を凍結乾燥して、１９２ｍｇの非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を生成したが、これはＨＰＬＣ分析により１００％のプロアントシアニジンであった。この画分は例えあるとしても少ししか色を有していなかったので、この画分におけるオリゴマー状プロアントシアニジン鎖はカチオン性アントシアニン単位を含有しないことが示唆される。
【０１３３】
極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）を半分離用ＨＰＬＣにより更に精製してアントシアニン残渣及び他のより極性の不純物を除去した。これら固体の半分離用ＨＰＬＣ精製のための条件を下記に説明する。
【０１３４】
該半分離用ＨＰＬＣ法は、６μｍ，６０オングストロームのＮｏｖａ−Ｐａｋ ＨＲ Ｃ−１８媒体で充填された２．５ｘ１０ｃｍのＷａｔｅｒｓ ＰｒｅｐＰａｋカートリッジ（マサチューセッツ州ミルフォード、Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。この態様で使用した階調度は表６に提供した通りであった。流速は３０ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は典型的に５０〜１２５ｍｇの固体を含有する溶液の３〜５ｍＬであった。運転時間は３０分であった。プロアントシアニジンは１３〜２０分で溶離された幅広いピークで収集された。
表６： エルダーベリー・プロアントシアニジン精製に対するＨＰＬＣ階調度
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）の約６００ｍｇを２５ｍＬの水に溶解した。約３ｍＬ（７５ｍｇ）を８回の試験の各々に注入した。各試験において約１２〜１８分で溶離するプロアントシアニジンのピークを収集し、ため、回転蒸発器上で蒸発させてから、水溶液残渣を凍結乾燥させた。約１００ｍｇの精製極性エルダーベリー・プロアントシアニジン（「画分７」）が、ＶＬＣ分離後の極性プロアントシアニジン固体（「画分５」）６００ｍｇから得られた。半分離用ＨＰＬＣ精製後のＶＬＣ単離極性プロアントシアニジンに対する２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１９に示す。砂糖、アミノ酸、アントシアニン、有機酸、及び小さなフラボノイド化合物を含む極性前線は、図１９におけるこれらピークの不存在により証明されるように、半分離用ＨＰＬＣ精製により除去された。精製極性プロアントシアニジン（「画分７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２０に示す。
【０１３７】
非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）をゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製した。ＶＬＣ分離中に単離された非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）の一部（４８ｍｇ）を２０ｍＬの温水に溶解し、前以て水で平衡させておいた１４ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム上に装填した。装填溶離液を収集し４０ｍＬのカラム洗浄水と一緒にした。非極性プロアントシアニジンの大部分はこの点で該カラムから溶離されたが、一方それより小さなフラボノイド不純物は保持された。一緒にした装填溶離液及び洗浄溶離液を冷凍乾燥して３２ｍｇの精製非極性プロアントシアニジン「画分８」を提供した。これらの固体は強い抗ウィルス活性を有していた。図２１及び２３は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム精製前の非極性プロアントシアニジン（「画分６」）の、２８０ｎｍ及び３６８ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２２及び２４は、精製非極性プロアントシアニジン（「画分８」）の、２８０ｎｍ及び３６８ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２１における星印でマークしたピークは、それらのＵＶスペクトルに基づき非プロアントシアニジン・フラボノイド化合物である。これらの化合物は、図２２の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムに示されているように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム後に単離された精製非極性生成物（「画分８」）では減少している。ゲル精製の効果は、精製前の非極性プロアントシアニジンの３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラム（図２３）を比較することにより、より良く理解することが出来る。非プロアントシアニジン不純物は、図２３では４〜６分及び１５〜１７分に現れている。図２４に示された精製試料においては、５．８分で溶離された少量のフラボノイド化合物以外、微量のフラボノイド化合物も全く存在しない。精製非極性プロアントシアニジン「画分８」の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。図３３は画分７のＩＲスペクトルを示し、図３４は「画分８」のＩＲスペクトルを示す。
【実施例１３】
【０１３８】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるブルーベリー極性及び非極性プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、ブルーベリーから調製し、臭素化ポリスチレン樹脂からの７０％エタノール溶離中に単離したフェノール化合物に富む「画分３」であった。「画分３」の一部（６．００ｇ）を８０ｍＬの水に溶解し、前述の３０ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液を収集し１００ｍＬの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離液と一緒にした（「画分５」）。次に、該カラムを８０ｍＬの４０％メタノールで洗浄して極性化合物（「画分５」）残渣を除去してから、８０ｍＬの７０％メタノールで洗浄して非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を得た。表７はこの実験の結果をまとめたものである。
表７： ブルーベリー・プロアントシアニジンの精製
【０１３９】
【表７】
【０１４０】
極性プロアントシアニジン「画分５」（装填溶離液＋洗浄液）及び非極性プロアントシアニジン画分６（７０％メタノール溶離液）を各々、実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、夫々「画分７」及び「画分８」を提供した。半分離用精製の前及び後のブルーベリー極性プロアントシアニジン画分（即ち、「画分５」及び「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを夫々図２６及び２７に示す。半分離用精製の前及び後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン画分（即ち、「画分６」及び「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを夫々図２８及び２９に示す。図２７及び２９の約０〜８分におけるピークの不存在により証明されているように、極性及び非極性画分の半分離用精製により、望ましくないアントシアニン及び極性フラボナイド化合物がプロアントシアニジンから除去された。図３７は「画分７」のＩＲスペクトルを示し、図３８は「画分８」のＩＲスペクトルを示す。
【実施例１４】
【０１４１】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるプラム極性及び非極性プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、プラムから単離し、その６１％が極性と３９％が非極性と称された全プロアントシアニジン約１７％を含有する、「画分３」及び「画分４」の組合せであった。この組成物の一部（８．００ｇ）を、０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの水に溶解し、前述の４５ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液を収集し、該カラムを５０ｍＬの０．１％ＴＦＡで洗浄した。該装填溶離液及び洗浄画分を一緒にして極性プロアントシアニジン画分「画分５」を提供した。極性プロアントシアニジン「画分５」のＨＰＬＣを図３０に示す。該カラムを、０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの４０％メタノールに続けて０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの７０％メタノールで溶離した。すべてのメタノール画分を一緒にして非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を提供した。表８はこの実験の結果をまとめたものである。
表８： プラム・プロアントシアニジンの精製
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
極性プロアントシアニジン「画分５」（装填溶離液と洗浄溶離液の組合せ）を実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、「画分７」を提供した。アントシアニン及び他のより極性的不純物の除去により、試料のプロアントシアニジン純度は１５％から１００％に増加した。精製された極性プロアントシアニジン「画分７」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図３１に示す。非極性「画分６」（４０％及び７０％メタノール洗浄液の組合せ）は更に精製しなかった。非極性プロアントシアニジン「画分６」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図３２に示す。図３９は「画分７」のＩＲスペクトルであり、図４０は「画分６」のＩＲスペクトルである。
【実施例１５】
【０１４４】
エルダーベリーＶＬＣ画分からのプロアントシアニジン画分の精製
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ−７１ｃｄ樹脂（ペンシルベニア州フィラデルフィア、８０〜１６０μｍ粒径、ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いてＶＬＣカラムを調製した。エルダーベリーの水抽出物を調製し、この抽出物の一部を該ＶＬＣカラム上に装填した。次に、該カラムを水で洗浄してから、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、及び１００％メタノールを用いて溶離した。メタノールで溶離されたすべての画分を別個に保持した。５０％メタノールで溶離されたＶＬＣ画分を回転蒸発器上で蒸発させてメタノールを除去してから、凍結乾燥させて水を除去した。乾燥物質を、乳鉢と乳棒を用いて粉末に粉砕した。該乾燥試料を、実施例１０に説明した方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。この分析の結果を用い、ＨＰＬＣ分析法から半分離用ＨＰＬＣ法を誘導してプロアントシアニジンを単離した。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．５％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。流速は３０ｍＬ／分にセットした。使用した階調度を表９に提供する。
表９．エルダーベリー・プロアントシアニジンの精製に対するＨＰＬＣ階調度
【０１４５】
【表９】
【０１４６】
該乾燥試料の約５００ｍｇを約５０ｍｇ／ｍＬの固体濃度で水に溶解した。関連ピークの滞留時間を判断するために非常に小さな注入を行った。この最初の注入に基づいて、二つのピーク、即ち、１４〜２２分で溶離されたピークＡ、及び２６〜２８分で溶離されたピークＢを収集した。濃縮溶液の５回の注入を行い、各注入から各ピークの適切な収集液をためた。ピークＡの収集により得られた試料はプロアントシアニジンを含有すると判断され、蒸発させて有機溶剤及び一部の水を除去した。濃縮試料を、実施例１０に説明したＨＰＬＣ法を用いて分析した。該試料のクロマトグラフィー純度は９３．９％であると測定された。次に該試料を凍結乾燥させて乾燥物質を得た。一旦乾燥したら、該試料の小部分を１．９１８ｍｇ／ｍＬの濃度で７０％エタノール中に送り込み、同じＨＰＬＣ法により再分析した。この分析の結果及び先に得られたクロマトグラフィー純度を用いて、ピーク面積応答係数を決めた。このデータは、他の精製画分中のプロアントシアニジン濃度を決めるのに用いた。プロアントシアニジン「標準」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１４に示す。
【実施例１６】
【０１４７】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるクランベリー・プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、１４％の全プロアントシアニジンを含む８．００ｇの精製クランベリー抽出物（「画分３」＋「画分４」）であった。この材料を、１ｍＬのトリフルオロ酢酸を含有する１００ｍＬの水に溶解し、前述の５０ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液（１００ｍＬ）を収集し、５０ｍＬの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離液と一緒にして「画分５」を得た。次に、該カラムを１００ｍＬの４０％メタノールで洗浄して極性化合物残渣を除去してから１００ｍＬの７０％メタノールで溶離して非極性プロアントシアニジン「画分６」を得た。表１０はこの実験の結果をまとめたものである。
表１０．クランベリー・プロアントシアニジンの精製
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
極性プロアントシアニジン画分（装填溶離液 ＋ 洗浄液）を、実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、「画分７」を得た。図４１は半分離用精製前の極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムであり、図４２は精製後の極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。図４３は非極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロアントシアニジンの前に溶離されたアントシアニンのような極性非プロアントシアニジン化合物はこの方法において除去された。
【実施例１７】
【０１５０】
エルダーベリー画分の単純ヘルペス２型ウィルス分析
実施例６に説明したように単離した粗製エルダーベリー抽出物及び画分１，３並びに４の抗ウィルス活性を、ウィルス性細胞変性効果（ＣＰＥ）分析を用いて測定した。この分析は前に説明した（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｐ．Ｒｅｓ．２８：４６７−４７２（１９９３），Ｗｙｄｅ等）。すべての抗ウィルス活性は５０％効果量（ＥＤ５０）として報告される。
【０１５１】
表１１は、試験した四つの組成物に対するＣＰＥ阻害のためのＥＤ５０をまとめたものである。
表１１．エルダーベリー画分のＣＰＥ阻害のためのＥＤ５０
【０１５２】
【表１１】
【実施例１８】
【０１５３】
ウィルス分析
本発明により製造された本発明のフェノール化合物に富む組成物は、種々のＤＮＡウィルス及びＲＮＡウィルスに対して幅広い活性を示しており、人間及び動物における炎症を治療するのに有用な活性成分として適している。細胞培養において、該フェノール化合物に富む組成物は、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザＡ及びＢ型ウィルス、パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）、並びに他の呼吸系ウィルス及び単純ヘルペスウィルスの分離株や実験室株に対して強力活性を示す。フェノール化合物に富む組成物は、人間及び動物における広範囲のウィルス性感染症を治療するのに有用な活性成分として適している。
【０１５４】
各ウィルスに対する活性を測定するのに用いられる分析は、当業者に周知である。細かに切られた特定の目的組織を希望のウィルスに曝し、該ウィルスの成長割合を試験物質の存在下及び非存在下で測定した。フェノール化合物を含有する種々の植物原料から製造した精製プロアントシアニジンに富む組成物の抗ウィルス活性を測定した。
【０１５５】
細胞系： ウィルス分析は、相対的なＥＤ５０（５０％効果量）又は５０％抑制終点を測定するのに以下の細胞系を使用した： ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）及びＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）分析は、アフリカのミドリザルの腎臓を起源とするＭＡ−１０４細胞を使用し；インフルエンザＡ及びＢ分析は、犬の腎臓を起源とするＭＤＣＫ細胞を使用し；鼻炎ウィルス属分析はＨｅＬａ及びＫＢ細胞を使用し；単純ヘルペス１および２型ウィルス分析は、人間の包皮繊維芽細胞から採ったＨＨＦ細胞を使用し；西ナイルウィルス分析は、アフリカのミドリザルの腎臓から採ったＶｅｒｏ細胞を使用し；アデノウィルス１型分析は、人間の肺癌腫を起源とするＡ５４９細胞を使用し；そしてパンタトロウィルスＡ分析は、アカゲザルの腎臓を起源とするＬＬＣ−ＭＫ２細胞を使用した。
【０１５６】
該分析は、正の対照として公知の医薬品標準（リビバリン又はアシクロビール）を使用した。本実施例で用いた分析におけるリビバリンに対するＥＤ５０は以下の通りである： ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； ＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； インフルエンザＡ及びＢ分析ＥＤ５０＝２−３μｇ／ｍＬ； 鼻炎ウィルス属分析ＥＤ５０＜１μｇ／ｍＬ； 西ナイルウィルス分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； アデノウィルス１型分析ＥＤ５０＝１０μｇ／ｍＬ； 及びパンタトロウィルスＡ分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ。単純ヘルペス１および２型ウィルス分析は正の対照としてアシクロビールを使用したが、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２分析におけるＥＤ５０は１−２μｇ／ｍＬである。
【０１５７】
本発明のいくつかの組成物に対するウィルス分析で得られたデータを表１２に提供する。細胞培養において、該組成物は、インフルエンザＡ型ウィルス（株Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ３）、インフルエンザＢ型ウィルス、アデノウィルス１型、パンタトロＡ型ウィルス、及び鼻炎ウィルス属２型の分離株や実験室株に対して強力活性を示した。表１２における生物活性データを抗ウィルス判別検査におけるアシクロビール及びリバビリンと比較すると、本発明の組成物はこれらの分析において生物学的に活性であり、これらのウィルス性の病気を治療するのに使用されている確立された医薬品と競い合っても引けをとらないことが明白に示されている。
表１２： 種々の抗ウィリス分析における種々の画分のＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
【０１５８】
【表１２】
【実施例１９】
【０１５９】
フェノール化合物に富む組成物のＣＯＸ−２活性の評価
シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）は、アラキドン酸や他の必須脂肪酸を種々のプロスタグランジンに変換する触媒作用をする。プロスタグランジンは哺乳類における炎症を引起こすホルモン状物質である。ＣＯＸ−２酵素を阻害することにより、組織内の炎症を最小の副作用で減少させることが出来る。他方、ＣＯＸ−１の阻害は、胃潰瘍化や身体内における他の望ましくない副作用を引起こす。ＣＯＸ−１酵素の完全な阻害は望ましくない。ＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する化合物がより良い抗炎症剤である。植物原料から製造した本発明のフェノール化合物に富む組成物は、ＣＯＸ−２酵素を阻害することが示されており、人間及び動物における炎症を治療するのに有用な活性成分として適している。
【０１６０】
この分析においては、分析すべき物質を、希望する酵素を含有することが知られている特定のマウス又はウシの細かに切られた器官組織と混合した。この混合物にアラキドン酸を添加した。酸素の吸収割合を測定し公知のＣＯＸ阻害剤に関して観察した吸収割合と比較する。ＣＯＸ−２分析は、人間の組換え型ＣＯＸ−２ポジティブ細胞を用いたアラキドン酸からの定量的ＰＧＥ２生成に基づいている。
【０１６１】
いくつかの組成物に対する結果を表１３に示す。表１３に示した組成物に対するデータを公知の医薬品標準（アスピリン及びインドメタシン）の測定ＣＯＸ−２生物活性と比較すると、本発明の精製プロアントシアニジンに富む組成物はＣＯＸ−２分析において生物学的に活性であることが明白に示されている。アスピリンは６６０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−２に対して活性であり、２４０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−１に対して活性である。インドメタシンは１０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−２に対して活性である。従って、表１３中の組成物は、ＣＯＸ−２分析において、最も普通に使用されている炎症処理剤（即ち、アスピリン）に対して２．５〜６倍の効力増加を示し、本発明の精製プロアントシアニジンに富む組成物が哺乳類における炎症を治療するのに有用であることを示している。
表１３．プロアントシアニジンに富む組成物に対するＣＯＸ−２活性
【０１６２】
【表１３】
【実施例２０】
【０１６３】
プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂を用いたプラム濃縮物の精製
２７５ｇのプラム濃縮物（カリフォルニア州ユバ市、Ｓｕｎｓｗｅｅｔ）に１４６０ｍＬの室温水を添加した。該混合物を充分に混合してから４ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、次に該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１６４】
該濾過溶液（１．７Ｌ）を、第三級アミン置換ポリスチレン樹脂（ミシガン州ミッドランド、ダウケミカル、Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２）を含有する調整平衡化カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．５ｍＬ／分（１時間当り０．５３カラム容量）の流速で装填した。該調製材料のすべてを該カラム上に装填してから、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。該カラムを、６カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離した。各溶離溶剤は０．０３８％硫酸まで酸性化した。両方の溶離液を一試料として収集し全フェノール化合物に対して分析した。フェノール化合物の不完全な回収が示されたこの分析結果に基づいて、該カラムを更に２．５カラム容量の５０％エタノールで洗浄し、該単離溶離液を先の溶離液と一緒にした。一緒にされた該溶離液を蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。これらの画分から得られた乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて、全フェノール化合物に対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。
【０１６５】
単離された該精製プラム抽出物質は、生成物画分に対して２２．４重量％の全フェノール化合物及び５．１％のプロアントシアニジンを含んでいた。該精製プラム抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図４４に示す。該カラムに対する全回収は、全フェノール化合物に対して約９１％でありプロアントシアニジンに対して９５％であった。図４５は、比較の為に臭素化ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％エタノール溶離画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【実施例２１】
【０１６６】
未置換芳香族ポリマー樹脂を用いたプラム濃縮物の精製
５１９ｇのプラム濃縮物（カリフォルニア州ユバ市、Ｓｕｎｓｗｅｅｔ）に２７５０ｍＬの室温水を添加した。該混合物を充分に混合してから７ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、次に該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１６７】
該濾過溶液（３．２７Ｌ）を、ＳＰ−７０，未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂（日本東京、三菱ケミカル）を含有する調整平衡化カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．５ｍＬ／分（１時間当り０．５３カラム容量）の流速で装填した。装填は流出物中のポリフェノールの濃度がカラム供給物中の濃度の１８％になるまで続け、その点で装填を停止し、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。該カラムを、５カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離したが、各々は０．０３８％の硫酸を含有していた。該溶離液を別個に収集し、蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。５０％エタノール溶離液からの乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて、全フェノール化合物に対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。９０％エタノール画分からの乾燥物質は分析しなかった。
【０１６８】
該精製プラム物質は、５０％エタノール画分に対して３４重量％の全フェノール化合物及び４．９％のプロアントシアニジンを含んでいた。該カラムに対する全回収は、全ポリフェノールに対して約９５％でありプロアントシアニジンに対して１００％を超えていた。
【実施例２２】
【０１６９】
プロトン化三級アミン置換ポリスチレン樹脂を用いたクランベリー濃縮物の精製
１３０ｍＬの濃縮物（ワシントン州オセロ、ＳＶＺ ＵＳＡ）に１７００ｍＬの室温水を添加した。使用した１３０ｍＬの濃縮物は、１０６ｍＬの一つのクランベリー濃縮物（ロット♯０２−１３７７）と２４ｍＬの他のクランベリー濃縮物（ロット♯０２−１１１５５）から成っていたが、両方とも同じ源からのものであった。該混合物を充分に混合してから３ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、その後該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１７０】
該濾過溶液（１．８３Ｌ）を、第三級アミン置換ポリスチレン樹脂、Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２（ミシガン州ミッドランド、ダウケミカル）を含有する調整平衡化樹脂カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．８ｍＬ／分（１時間当り０．６３カラム容量）の流速で装填した。該調製材料のすべてを該カラム上に装填した。装填後、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。
【０１７１】
該カラムを、６カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離した。各溶離溶剤は０．０３８％硫酸まで酸性化した。両方の溶離液を一試料として収集し分析した。一緒にされた該溶離画分を蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。該乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて全フェノール化合物に対して分析し、塩化シアニジン標準に対して５３５ｎｍにおける吸収（１０１．１吸収単位／ｍｇ／ｍＬ）の標準分光光度測定によりアントシアニンに対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。該精製クランベリー抽出物質は、生成物画分に対して３０．３重量％の全フェノール化合物、１．８％のアントシアニン、及び１２．９％のプロアントシアニジンを含んでいた。
【０１７２】
図４６及び４７は、クランベリーの５０％と９０％エタノール溶離画分の組合せの、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図４６及び４７におけるＨＰＬＣクロマトグラムを、臭素化樹脂から溶離したクランベリー抽出物の２８０ｎｍ及び５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラム（夫々図４８及び４９）と比較すると、非常にわずかな相違が示される。これらの相違は、分析時の条件及び出発原料間に存在するわずかな変動にさかのぼることが出来る。
【実施例２３】
【０１７３】
本発明により更なる植物原料を抽出し精製してプロアントシアニジンに富む組成物を提供した。本発明の方法により製造した精製プロアントシアニジン組成物の限定されない例を表１４に示す。示されたプロアントシアニジンのパーセントは精製組成物中の重量パーセントである。
【０１７４】
【表１４】
【実施例２４】
【０１７５】
プロアントシアニジンのパーセントを測定するための代替定量的ＨＰＬＣ法
種々の画分及びフェノール化合物に富む組成物中のプロアントシアニジンの量を測定するのに使用されるこの代替ＨＰＬＣ法は、外部標準としてカテキンを使用する。各タイプの試料は異なる調製を必要とするので、実施例９で説明したように調製する。該方法は、１５０ｘ４．６ｍｍのカラムにＳｔａｂｌｅｂｏｎｄ ＳＢＣ−１８を詰め込んだ５μｍ Ｚｏｒｂａｘカラムを使用する。流速は１．５ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は１０μＬであり、そして運転時間は２４分であった。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。使用した階調度を表１５に提供する。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラムにおいて幅広いピーク群として典型的に溶離された。
表１５．プロアントシアニジンの％分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１７６】
【表１５】
【０１７７】
カテキン標準を調製するために、１００ｍＬ容量のフラスコ中に１００ｍｇのカテキン（ウィスコンシン州ミルウォーキー、Ａｌｄｒｉｃｈ）を正確に秤量する。７０ｍＬの５０％メタノール／水を添加し、溶解するまで５分間音波破砕する。５０％メタノール／水を用いて一杯になるまで希釈し、蓋をしてから均質になるまで混合する。調製した標準は、この実施例で説明したＨＰＬＣ法を用いて分析する。次に、式１０に示されているように、カテキン標準に対するピーク面積応答係数を、該ピーク面積を標準溶液濃度とその純度の積で割ることにより決定する。
【０１７８】
【数１０】
【０１７９】
［式中、ＲＦ＝標準に対するピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡ＝該クロマトグラムにおけるカテキンピークのピーク面積、ＣＳＴＤ＝ｍｇ／ｍＬで表した標準溶液の濃度、そしてＰＳＴＤ＝パーセントとしての標準物質純度（通常０．９８）。］
【０１８０】
試料中のプロアントシアニジンのパーセントは、上述の試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて測定することが出来る。問題の試料に対して、１１〜２２分の滞留時間範囲における全ピーク面積を測定する。しかしながら、いかなる計算をする前にも、プロアントシアニジン滞留時間範囲における非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、端から端までの全ピーク面積から引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、幅広いプロアントシアニジンのピークと共に溶離する鋭いピークとして又は該ピークの頂上における鋭いピークとして頻繁に現れ、それらのダイオードアレーによるＵＶスペクトルはプロアントシアニジンのピークの大部分としばしば異なる。非プロアントシアニジンのピーク面積を測定するには、これらのピークを手作業で積分し、それらのピーク面積を合計し、次にこの面積を１１〜２２分の全ピーク面積から引く。試料中のプロアントシアニジンのピーク正味面積が一旦測定されたら、式１１に示されるように、この値を組織内標準に対するピーク面積応答係数で割って試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る。
【０１８１】
【数１１】
【０１８２】
［式中、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝試料中全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡＳＡＭＰ＝試料に対する訂正全ピーク面積、ＤＦ＝希釈係数（乾燥バイオマスに対して１、新鮮／冷凍バイオマスに対して２、そしてフェノール化合物に富む組成物に対して１）、そしてＲＦ＝式１０を用いて計算されたピーク面積応答係数。］
【０１８３】
全プロアントシアニジンの％は式１２に示されるように計算される。
【０１８４】
【数１２】
【０１８５】
［式中、％Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ＝試料中全プロアントシアニジンのパーセント、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖ＝試料調製液の容量（通常、乾燥バイオマスに対しては２５０ｍＬ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては１００ｍＬ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては１０ｍＬ）、そしてＷＳ＝試料調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては５０〜１００ｍｇ）。］
【０１８６】
前述の記載は本発明の原理を説明しているに過ぎないと考えられる。更に、多数の修正や変更が当業者の頭には容易に浮かぶであろうから、本発明を上述の正確な構成や方法に限定することは希望しない。従って、あらゆる適当な修正や均等物は別紙特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に入ると考えることが出来る。
【０１８７】
用語「含む」は、本明細書及び別紙特許請求の範囲で使用されている場合、記載された特色、整数、成分、又は工程の存在を特定することを意図しているが、他の一つ以上の特色、整数、成分、工程、又はそれらの群の存在又は追加を除外しない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】本発明の方法によりフェノール化合物に富む組成物を製造する方法の一態様のフローチャートである。
【図２】ビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】ビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】ブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】濾過されたエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】濾過されたエルダーベリー抽出物の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】濾過されたエルダーベリー抽出物をカラム装填している間に溶離された第一画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】濾過されたエルダーベリー抽出物をカラム装填している間に溶離された第一画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に７０％エタノールで溶離された第三画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に７０％エタノールで溶離された第三画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に９０％エタノールで溶離された第四画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に９０％エタノールで溶離された第四画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４】実施例１０で説明したように調製したプロアントシアニジン標準の代替ＨＰＬＣ法を用いたＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】極性プロアントシアニジンを非極性プロアントシアニジンから分離する方法のフローチャートである。
【図１６】濾過されたエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの流過画分及び洗浄画分の組合せから単離したエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから６０％メタノール溶離液中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】半分離用ＨＰＬＣ精製後に単離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】半分離用ＨＰＬＣによる精製後のエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムであるが、そこで非プロアントシアニジンのピークは星印でマークされている。
【図２２】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２４】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２６】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２７】半分離用ＨＰＬＣ精製後のブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２８】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２９】半分離用ＨＰＬＣ精製後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３０】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３１】半分離用ＨＰＬＣ精製後のプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３２】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから４０％及び７０％メタノール溶離中に単離されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３３】精製されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３４】精製されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３５】精製されたクランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３６】精製されたクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３７】精製されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３８】精製されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３９】精製されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図４０】精製されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）のＩＲスペクトルである。
【図４１】半分離用ＨＰＬＣ精製前のクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４２】半分離用ＨＰＬＣ精製後のクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４３】クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４４】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４５】臭素化ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４６】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４７】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４８】臭素化ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４９】臭素化ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５０】精製された黒ラズベリー組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５１】精製されたイチゴ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５２】精製されたザクロ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５３】精製されたオリーブ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５４】精製されたクロフサスグリ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５５】精製されたサクランボ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５６】精製されたブドウ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５７】精製されたリンゴ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５８】精製されたバナナ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５９】精製されたサンザシの実組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６０】精製されたマンゴスチン殻組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６１】精製されたオレンジ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の引用〕
本願は、２０００年８月３１日に出願された米国仮出願第６０／２２９，２０５号の優先権を主張する、２００１年８月３０日に出願された米国特許出願第０９／９４３，１５８号の部分継続出願である、２００２年１１月２２日に出願された米国特許出願第１０／３０２，２６４号の部分継続出願である、２００４年１月２３日に出願された米国特許出願第１０／７６４，３２１号の優先権を主張するものであり、それらの開示をすべて全体的に本明細書に引用して援用する。
【０００２】
本発明は、植物原料からのフラボノイド化合物の抽出及び精製に関し、より具体的にはフェノール化合物に富む組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイド化合物は植物のあらゆる大気中部分に存在し、その皮、樹皮及び種子に高濃度が見出される。このような化合物は、茶、ココア、及びワインのような植物起源の多数の飲物にも見出される。フラボノイドは、ポリフェノールと呼ばれる比較的大きな族の化合物類の一員である。即ち、これらの化合物は、１個以上の芳香族環上に１個より多くのヒドロキシル基（ＯＨ）を含有する。ポリフェノール、特にフラボノイドの物理的及び化学的性質、分析、及び生物学的活性は何年にもわたって研究されてきた。
【０００４】
アントシアニンは、多数の果物、野菜、穀物、及び花の赤、紫、及び青色の原因である天然に生ずるフラボノイド化合物の特定のクラスである。例えば、ブルーベリー、ビルベリー、イチゴ、ラズベリー、ボイゼンベリー、マリオンベリー、クランベリー、エルダーベリー、等のような果物の色は、多数の異なるアントシアニンによる。３００種を超える構造的に異なるアントシアニンが事実上同定されている。アントシアニンは天然素材であるので、食物及び飲物用着色剤としての用途に大きな関心を呼んできた。
【０００５】
最近、アントシアニン顔料に対する関心は、食物酸化防止剤としての健康上の利益が考えられるので、増大してきた。例えば、ビルベリー（バチニウム・ミルチラス）のアントシアニン顔料は、視力を改善し循環障害を治療するために長い間使用されてきた。或るアントシアニン及び他のフラボノイドは抗炎症性を有することが実験的に証明されている。更に、経口投与されたアントシアニンは糖尿病及び潰瘍を治療するのに効果的であり抗ウィルス活性及び抗菌活性を有している可能性があるということが報告されている。フラボノイドのこれら望ましい性質に対する化学的根拠は、それらの抗酸化剤能力に関連していると考えられる。かくして、ベリーと他の果物及び野菜に関連する抗酸化剤特性は、それらのアントシアニン含量に帰せられてきた。
【０００６】
「オリゴマー状プロアントシアニジン」、「ＯＰＣｓ」、又は「プロシアニジン」としても知られるプロアントシアニジンは、果物、野菜、実、種子、花、及び樹皮から広く入手できる天然に生ずるフラボノイド化合物のもう一つのクラスである。プロアントシアニジンは縮合タンニンとして知られる範疇に属する。それらは、果物及び野菜に見出される最も普通のタイプのタンニンであり、その種子及び皮に大量に存在する。事実上、異なるプロアントシアニジンの混合物は普通一緒に見出され、個々の単位から多数の結合単位の複雑な分子（オリゴマー又はポリマー）まで変動する。ポリマー状プロアントシアニジンの一般的化学構造は、共通のＣ（４）−Ｃ（６）及び（又は）Ｃ（４）−Ｃ（８）結合により一緒に結合したフラボノイド３−オール単位の直鎖を含む。１３Ｃ ＮＭＲはポリマー状プロアントシアニジンの構造を同定するのに有用であったが、最近の研究はダイマー、トリマー、及びテトラマー状プロアントシアニジンの化学を解明している。フラボノイド３−オール単位のより大きなオリゴマーは大部分の植物において支配的であり、２，０００ダルトンより大きな平均分子量を有し６以上のモノマー単位を含有するものが見出されている（Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，２５：１１８（１９８７），Ｎｅｗｍａｎ等）。
【０００７】
最近のかなりの研究により、主として抗酸化剤活性が知られているプロアントシアニジンの治療的応用が探求されてきた。しかしながら、これらの化合物は、抗菌性、抗ウィルス性、抗癌性、抗炎症性、抗アレルギー性、及び血管拡張性の作用を示すことも報告されている。更に、それらは、脂質過酸化、血小板凝集、毛細血管透過性及び脆弱性を阻止し、ホスホリパーゼＡ２、シクロオキシゲナーゼ、及びリポキシゲナーゼを含む酵素系に影響することも見出されている。例えば、プロアントシアニジンのモノマー（即ち、アントシアニン）及びダイマーは、増加した毛細血管脆弱性に関連する病気の治療に用いられており、動物における抗炎症性効果を有することも示されている（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２８４：３５８（１９７７），Ｂｅｌａｄｉ，Ｉ．等）。これらの報告された発見に基づいて、オリゴマー状プロアントシアニジン（ＯＰＣｓ）は、多数の状態の治療に有用な成分となり得るのである（Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．５（２）：１４４−１５１（２０００），Ｆｉｎｅ，Ａ．Ｍ．）。
【０００８】
プロアントシアニジンはウィルスに対抗して保護することも出来るのである。試験管内の研究において、ウィッチヘーゼル（ハマメリス・バージニアナ）からのプロアントシアニジンは単純ヘルペス１ウィルス（ＨＳＶ−１）を殺した（Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄ．６月号：６２（３）：２４１−５（１９９６），Ｅｒｄｅｌｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｉｎａｔｌ，Ｊ．； Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．７月号：６２（７）：９５４−８（１９９９），ＤｅＢｒｕｙｎｅ，Ｔ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｌ．）。種々のタンニンの抗ウィルス活性について構造と活性の関係を判断するために、もう一つの研究が行われた。化学構造がより縮合されている程、抗ウィルス効果はより大きいことが判明した（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：２２４５−５０（１９８５），Ｔａｋｅｃｈｉ，Ｍ．等）。もう一つの研究において、プロアントシアニジンは抗単純ヘルペス活性を有することが示されたが、そこでは単純ヘルペス溶菌斑形成を減少させるのに必要な５０％効果量が５０％細胞障害量よりも２〜３桁の大きさ低かった（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１１：２８５−２９８（１９８９），Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．等）。
【０００９】
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１，ＣＯＸ−２）又はプロスタグランジン・エンドパーオキサイドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ−１，ＰＧＨＳ−２）酵素は、植物製品の抗炎症効果を測定するために広く使用されている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８： ２３７３−２３７８（１９８９），Ｂａｙｅｒ，Ｔ．等；及びＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２４５２−２４５７（１９９２），Ｇｏｄａ，Ｙ．等）。ＣＯＸ酵素は、非ステロイド性抗炎症薬に対する薬理上の標的部位である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：２０５３−２０５６（１９８１），Ｈｕｍｅｓ，Ｊ．Ｌ．等；及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２：４８６３−４８６５（１９７５），Ｒｏｍｅ，Ｌ．Ｈ．等）。プロスタグランジン合成に含まれるシクロオキシゲナーゼの二つのイソ酵素は、シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５：２５１，５５７５−５５７９（１９７６），Ｈｅｍｌｅｒ，Ｍ．等）。選択的ＣＯＸ−２阻害剤が主として抗炎症活性を引起こすと仮定されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：３２２８−３２３２（１９９４），Ｍａｓｆｅｒｒｅｒ，Ｊ．Ｌ．等）。フラボノイドは、抗炎症物質として、並びに、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害活性に対するそれらの構造的特色のために、今や研究されつつある。
【００１０】
アントシアニン及びプロアントシアニジンの上記特性及び利点により、果物、野菜、及び他の植物源からこれらの化合物を抽出することに向かって、多くの努力が提起されている。プロアントシアニジン及びアントシアニンに加えて、植物、果物、及び野菜は又無機塩類、クエン酸又は酒石酸のような普通の有機酸、炭水化物、フラボノイド配糖体、及びカテキンのような他の化合物をも含有する。アントシアニン及びプロアントシアニジンは他の天然に生ずる化合物から分離することがしばしば望ましい。アントシアニンは種々の操作によって植物及び果物から抽出されてきた。アントシアニンを抽出する一つの方法では、双性イオン種を形成する重硫酸塩の添加が使用されている。該抽出物はイオン交換カラムを通過させ、そこで双性イオンアントシアニン付加物が吸着され、吸着されたアントシアニンはアセトン、アルカリ、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて該樹脂から溶離される。この方法の短所には重硫酸塩の存在が含まれるが、重硫酸塩はアントシアニンの吸着を妨害し、それにより複数のカラム吸着が必要となる。アルカリを用いた溶離はアントシアニンをかなり分解させるが、一方ＤＭＦは認められた食品添加物ではないので、アントシアニンを任意の食品製品に添加する前に完全に除去しなければならない。
【００１１】
これらのフラボノイド化合物を捕えるために、明確で正確な処理及び分離技術が必要である。Ｎａｆｉｓｉ−Ｍｏｖａｇｈａｒ等は、米国特許第５，９１２，３６３号において、植物原料の水性混合物を加熱し、該水溶液を限外濾過膜に通して濾過し比較的大きな分子量のポリマー及び微粒子を除去して抽出されたプロアントシアニジンを含有する透過水を生成し、プロアントシアニジンを放出できるように保持できる吸着剤物質に該透過水を接触させることにより該液体からプロアントシアニジンを分離し、そして該保持されたプロアントシアニジンを極性溶剤で溶離することを特徴とする、植物原料からプロアントシアニジンを抽出精製する方法を記載している。しかしながら、この方法は非常に熱い抽出温度を使用しているので、プロアントシアニジンの分解が起こり得る。更に、限外濾過は最終製品からいくらかの低分子量ポリフェノール物質を除去している。
【００１２】
種々の植物原料からプロアントシアニジン及び（又は）アントシアニンを抽出単離する技術において知られている多くの方法は、有毒なそして（又は）環境的に有害な物質を使用している。従って、プロアントシアニジンを単離精製するのに使用できる現在の方法は、効率的な工業的方法まで容易には拡大されないが、それは工業的方法では種々の化学薬品や溶剤の廃棄検討が該方法の全体的実現可能性において重要な役割を演じるからである。更に、プロアントシアニジン及びアントシアニンは、それらの分解に向かう自然な傾向を最小にする方法で、単離しなければならない。
【００１３】
従って、栄養補給食品や処方薬に使用されるプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を含有する組成物を単離精製する効率的方法であって、費用効率が高く、拡大縮小が可能で、経済的に健全で、有毒な溶剤又は試薬の使用を必要とせず、そして植物原料からフェノール化合物をそれらの分解に向かう傾向を最小にする方法で単離する該効率的方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、フェノール化合物に富む組成物を抽出し、単離し、そして精製する単純化された経済的方法を提供する。より具体的には、本発明の一局面によれば、フェノール化合物に富む組成物を製造する方法において、（ａ）フェノール化合物を含有する１種以上の植物原料の粗製抽出物であって、フェノール化合物及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を用意し、（ｂ）該粗製抽出物を濾過し、（ｃ）前記フェノール化合物を放出できるように吸着するが前記極性非フェノール化合物は実質的に保持しないポリマー樹脂であって、１個以上の電子吸引性基で置換された芳香族環を含む該ポリマー樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、（ｅ）該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記フェノール化合物を含有する第一画分を収集し、（ｆ）該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記フェノール化合物を含有する第二画分を収集し、そして（ｇ）工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、前記フェノール化合物に富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得ることを特徴とする、前記製造方法が提供される。適切な置換ポリマー樹脂の例は、臭素化ポリスチレン樹脂及びプロトン化第三級アミン置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂を含むが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明の更なる局面によれば、プロアントシアニジンに富む組成物を製造する方法において、（ａ）プロアントシアニジンを含有する１種以上の植物原料を溶剤で抽出して、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の小フェノール系誘導体及び非フェノール化合物を含む粗製抽出物を提供し、（ｂ）該粗製抽出物をサイズ除外濾過以外の手段により濾過し、（ｃ）前記アントシアニンを保持し前記プロアントシアニジンを放出できるように吸着するが該極性非フェノール化合物は実質的に保持しない未置換芳香族環を含む樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して該極性非フェノール化合物を溶離し、（ｅ）該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第一画分を収集し、（ｆ）該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第二画分を収集し、そして（ｇ）工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、プロアントシアニジンに富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得ることを特徴とする、前記製造方法が提供される。適切な未置換樹脂の例は、ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体を含むが、それらに限定されない。一態様において、該第一及び（又は）第二の溶離は大体室温で行われる。
【００１６】
本発明は、フェノール化合物に富む組成物を精留して、非極性プロアントシアニジン、及び極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物から極性プロアントシアニジンを分離する方法を更に提供する。極性プロアントシアニジンは、非極性プロアントシアニジンとは異なる生物活性を有することが判明した。
【００１７】
本発明は、本発明の方法により単離された、フェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物を更に提供する。
【００１８】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＣ−１８親油性カラムで逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により分析すると、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍで吸収される化合物の溶離ピークの特性セットが観察される。例えば、一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、ＨＰＬＣ分析をここに記載した通りに行うと、実質的に図１０〜１３に図示されているように、ＨＰＬＣトレースにおいて６０〜７５分の範囲で溶離ピークの特性セットを有する特徴がある。
【００１９】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＩＲ（赤外線）分光測定により分析すると、実質的に図３３〜４０に示されているような化合物の特性吸収ピークが観察される。本発明の組成物は栄養補給食品及び処方薬として有用である。例えば、本発明の組成物は抗感染症剤（例えば、抗ウィルス剤、抗ＵＴＩ（尿路感染症）剤、及び抗菌剤）として、及び抗炎症剤として有用である。
【００２０】
本発明に関する前記の及び他の特色、有用性および利点は、本発明の好ましい態様に関する以下のより詳しい説明から、図面に説明されているように、そして特許請求の範囲に特に指摘されているように、明らかとなるであろう。
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を自然に含有する植物原料からフェノール化合物に富む組成物を製造する方法を提供する。本発明の方法は、フェノール化合物に富む精製された組成物を更に提供する。用語、「フェノール」及び「フェノール化合物」は、本明細書では交換できるように使用されており、１個以上のフェノール基を有するモノマー状、オリゴマー状、及びポリマー状化合物を含み、従ってアントシアニン、プロアントシアニジン、及びフラボノイドを含むが、それらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用されているように、用語「フェノール化合物に富む組成物」は、１種以上のフェノール化合物に富み、植物、果物、液果、及び野菜の粗製抽出物に存在する極性非フェノール化合物が実質的に激減した量である組成物のことを言う。かかる極性非フェノール化合物の例は、砂糖、セルロース、ペクチン、アミノ酸、蛋白質、核酸、及び水を含むが、それらに限定されない。
【００２３】
フェノール化合物に富む組成物は植物原料抽出物又は濃縮物から典型的に製造される。用語「抽出物」は、フェノール化合物を自然に含有する植物源から導き出された物質のことを言い、植物全体から、又は植物の種々な部分、例えば、果実、葉、茎、根、樹皮、等から製造された抽出物を含む。従って、本発明の方法は、抽出物を製造するのに使用される植物の特定の部分に限定されない。本方法は、最も典型的に、植物学的に誘導された植物原料全体又は植物原料の部分、例えば、表皮、皮、果実、実、種子、穀物、群葉、茎、樹皮以外の木質又は繊維質原料、等からの任意のフェノール化合物源を使用することが出来る。従って、本発明の方法は、抽出物を製造するのに使用される植物の特定の部分に限定されない。大部分の有色の果実、果粒、及び野菜はフェノール化合物を含有することが知られている。本発明の方法に使用することが出来る適切なフェノール化合物含有植物原料は、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジを含むが、それらに限定されず、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含むが樹皮は除く。該生の植物原料はそのまま（湿ったまま）使用しても良いし、或いは抽出前に乾燥しても良い。所望により、該生の植物原料は、抽出前に、アントシアニン及びプロアントシアニジンが低い成分を分離除去することにより、事前に分類することが出来る。
【００２４】
一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、フェノール化合物を含有する植物原料を抽出精製することにより得られる。フェノール化合物を含有する植物原料は特異で独特な特徴を有すること、即ち、各植物原料中のフェノール化合物の量及びタイプは該特定の植物原料に対して特定的であることが知られている。従って、本発明により或る特定の植物原料から単離されたフェノール化合物に富む組成物は、他の植物原料から単離された組成物とは異なるであろう。
【００２５】
図１は、フェノール化合物に富む組成物が製造できる本発明方法の一態様の工程を示すフローチャートである。本発明の方法は、いくつかの処理工程を除去することにより、又該方法に必要な試薬の量を減少させることにより、製造原価及び廃棄物処理問題を減少させて、フェノール化合物に富む組成物を得る経済的で効率的な方法を提供する。
【００２６】
抽出段階
【００２７】
この相の間に、新鮮な又は乾燥した植物原料からフェノール化合物（例えば、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノール化合物）及び極性非フェノール化合物を含む非フェノール化合物を抽出することにより、抽出物が製造される（図１、工程１０）。当業者は、バット抽出、パーコレイション、向流抽出、等のような種々の抽出方法が文献から利用できることを認識するであろう。使用される特定の抽出方法は、本発明の方法にとって本質的なものではない。抽出処理前の植物原料の粉砕程度は、抽出溶剤が効果的に接触するのに充分な微粒子表面積を提供する程度であるべきである。
【００２８】
図１に示された方法の一態様において、抽出工程（工程１０）は、新鮮な又は乾燥した植物原料を適切な量の抽出溶剤に充分な時間入れることにより達成される。抽出処理で用いられる植物原料対抽出溶剤の量は、グラム対ミリリットルの基準で約２：１〜約１：２０の間で変化する。一態様において、植物原料対抽出溶剤の比は、約１：４〜１：８の間である。植物原料と溶剤の混合物は、該植物原料に存在するアントシアニンの量に依って、所望により加熱される。即ち、もし植物原料が約０．０５％〜２％のアントシアニンを典型的に含有しているならば、該抽出は好ましくは４５℃以下で行われる。しかしながら、もし植物原料が０．０５％未満のアントシアニンを典型的に含有しているならば、該フェノール化合物の安定性に依って、室温から８５℃を越えるまでの温度で該抽出を行うことが出来る。例えば、非常に少しのアントシアニンしか含有していないクランベリーは、クランベリー抽出物に含まれるプロアントシアニジンの安定性に影響することなく、約１００℃の温度で抽出することが出来る。
【００２９】
一態様において、抽出溶剤には、水中約０〜９５％のエタノール及び約０〜３重量％、より好ましくは約０．００６〜０．０１２重量％の適切な酸を有する酸性化アルコール溶液が含まれる。他の態様において、抽出溶剤には、水中約０〜１００％のメタノール及び約０〜３重量％の適切な酸を有する酸性化アルコール溶液が含まれる。抽出工程で使用することができる適切な酸は、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、酢酸（ＨＯＡｃ）、又は塩酸（ＨＣｌ）を含むが、それらに限定されない。或いは、植物原料を非酸性化抽出溶剤で抽出してから、該抽出物に酸を添加することが出来る。抽出溶剤における酸の存在又は該抽出物は、アントシアニンの分解を最小にする助けをする。従って、一態様において、酸性条件は、図１に説明されているように、本発明方法の大部分の工程を通して維持される。
【００３０】
粗製抽出物は、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノール系誘導体のようなフェノール化合物の他に、砂糖、ペクチン、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセライド、水、及び他の化合物のような望ましくない極性非フェノール物質をも又含有する。粗製抽出物に含有される固体残渣は液体部分から分離され、該固体は上述のように再抽出されるか、又は廃棄される。
【００３１】
工程１０（図１）の一態様において、抽出処理の前又はその間に、植物原料又は抽出溶剤にペクチナーゼを添加する。或いは、抽出処理が完了してから、粗製抽出物にペクチナーゼを添加することが出来る。ペクチナーゼは、抽出物がカラム精製の間流動性を維持するように、抽出処理中又はその後の任意の点で抽出物がゲル化するのを防ぐのに役立つ。ペクチナーゼの添加量は、抽出物を製造するのに使用される植物原料の量又は抽出物に既に存在しているペクチナーゼの量に部分的に依存する。典型的に、ペクチナーゼは植物原料の約０〜０．１２重量％の量で添加される。
【００３２】
図１を続けて参照しながら、もし工程１０において粗製抽出物を製造するのにエタノール性又はメタノール性抽出溶剤が使用されたら、粗製抽出物は、濃縮の間好ましくは４５℃以下の温度を維持しながら、粗製抽出物に含有されるエタノール又はメタノールが６％より少なくなるまで濃縮される（工程２０）。濃縮された粗製抽出物を希釈するのに水が添加され、希釈された粗製抽出物は、工程３０の前に濃縮され水で再び希釈されるか、又は第二の希釈を行うことなく工程３０に直接持ち込まれる。勿論、もし粗製抽出物の製造に抽出溶液として水が使用されたら、工程２０は必要ないので、この場合図１に破線矢印により示されているように、工程１０からの粗製抽出物は工程３０に直接持ち込まれる。
【００３３】
濾過段階
【００３４】
図１に示された方法の工程３０には、工程１０又は２０からの粗製抽出物を所望により濾過して該粗製抽出物から固体を除去することが含まれる。本発明者達は、工程１０に対して説明した抽出条件を調節することにより、工程３０における濾過によって粗製抽出物から沈澱する望ましくない非フェノール化合物の量が増加するので、望ましくない物質の一部を吸着段階の前に該抽出物から除去することが出来ることを発見した。本発明方法の濾過工程３０では種々の濾過方法を使用することが出来る。工程３０で使用することが出来る一濾過方法には、珪藻土又はセルロースのような濾過助剤を測定量で粗製抽出物に添加することが含まれる。粗製抽出物と濾過助剤の混合物は、好ましくは均質になるまで振とう又は撹拌され、濾過助剤床を通して濾過される。該床は酸性水溶液、好ましくは約０．００６％の硫酸水溶液で洗浄される。
【００３５】
図１の工程３０で使用することが出来る他の濾過方法には、サイズ除外濾過以外の濾過手段を用いて粗製抽出物を濾過することが含まれる。例えば、一態様には、砂床又は好ましくはガラスウールで覆われた３０ミクロンのポリプロピレン・フィルターを通して粗製抽出物を濾過することが含まれる。なお他の濾過方法には、有利には以下に説明する工程４０の精製カラムと一列に並んで置くことができるバグフィルター（ポリエチレン又はポリプロピレンから成る袋形状の布フィルター）を使用することが含まれる。従って、上述のフィルターは、当該技術で溶液から或る大きさの分子を除去するのに使用される限外濾過膜のようなサイズ除外フィルターというよりむしろ固体除去用フィルターであると理解されるべきである。
【００３６】
吸着段階
【００３７】
図１に示された方法によりフェノール化合物を単離するために、工程３０で単離された濾過抽出物は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を放出できるように吸収するが濾過抽出物に存在していた望ましくない極性非フェノール物質はより少ししか保持しない樹脂と、接触させる。一態様において、該樹脂は１個以上の電子吸引性官能基で置換された１個以上の芳香族環を有するポリマー樹脂である。各芳香族環は１個以上の同様な又は異なる電子吸引性基で置換することができ、該電子吸引性基はハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、プロトン化アルキルアミン（第一級、第二級及び第三級アミンを含む）、スルホン酸、トリハロメチル、ＣＯＯＨ，ＮＯ２及びＣＮを含むが、それらに限定されない。或いは、該ポリマーは置換芳香族環および未置換芳香族環の混合物を含むことができる。かかる樹脂は本明細書において「置換樹脂」と言及される。好ましくは、該樹脂は承認食品等級の樹脂である。
【００３８】
本発明の目的に適した置換樹脂の一例は、三菱ケミカルアメリカ製のＳＰ−２０７ （ペンシルベニア州ベラフォンテ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）のような臭素化ポリスチレン樹脂である。ＳＰ−２０７樹脂は、逆相クロマトグラフィー用途に合わせて設計されたマクロ孔質臭素化スチレンポリマービーズ型樹脂で、約２５０〜８００ミクロンの粒径分布及び約１００〜３００Åの孔径範囲を有する。芳香族環の臭素化は、ポリスチレン樹脂の疎水性を増加させ、従来のスチレン・ジビニルベンゼン・ポリマー逆相支持体と比較して、疎水性分子に対する増加した選択性を有する樹脂を提供するように設計されている。臭素化ポリスチレン樹脂は、その堅固な結合性の故に、天然製品の精製に典型的には使用されない。
【００３９】
かくして、或る従来のポリスチレン樹脂はプロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を非常に堅固に結合するのでかかる化合物をポリスチレン樹脂から溶離するのは非常に難しいことが知られていたので、臭素化ポリスチレン樹脂はフェノール化合物を更に堅固に結合するであろうと予想された。従って、臭素化ポリスチレン樹脂がフェノール化合物の精製に適しているであろうとは予想されなかった。しかしながら、本発明者達は、驚いた事にそして予想外に、臭素化ポリスチレン樹脂は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を結合する強さが非臭素化ポリスチレン樹脂よりも低いが、望ましくない極性非フェノール化合物からのフェノール化合物の分離を依然として可能にすることを発見したのである。即ち、工程３０で単離された濾過抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上で精製することによりフェノール化合物に富む高純度組成物が得られることが発見されたのである。
【００４０】
本発明によりフェノール化合物に富む高純度組成物を提供するのに適したもう一つの置換樹脂は、Ｄｏｗｅｘ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２（ミシガン州、ミッドランドのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ販売）のようなプロトン化形状の第三級アミン置換ポリマーであるが、それは芳香族環上に第三級アミン官能基を有する食品等級のマクロ孔質スチレン・ジビニルベンゼン共重合体である。
【００４１】
いかなる理論によっても縛られたくないけれども、臭素及びプロトン化第三級アミンのような置換基は電子吸引性であるので、それらが結合している芳香族環の電子密度を減少させ、この効果はそれらの正に帯電したアントシアニンに対する保持力を減少させるのに充分であろうと考えられる。対照的に、未置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂の芳香族環はより高い電子密度を有するので、アントシアニンの正電荷により強く結合して、アントシアニンがこの樹脂により堅固に保持されるのである。かくして、Ｄｏｗｅｘ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２及び三菱ＳＰ２０７樹脂のような置換樹脂はアントシアニンを放出できるように保持することが出来るが、一方未置換ベンゼン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂はアントシアニンを保持するが放出する確率はより低いのである。
【００４２】
なお他の態様において、該樹脂は、本明細書において「未置換芳香族樹脂」又は「未置換ポリマー樹脂」と言及される未置換芳香族環を含むポリマーである。本発明の目的に適した未置換芳香族樹脂の一例は、三菱ＳＰ７０のようなポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂である。この樹脂は以下の物理的性質、即ち、２５０ｍｍの平均粒径、７００ｍ２／ｇの比表面積、及び６５Åの比孔半径を有する。ＳＰ７０樹脂は、驚いた事にプロアントシアニジンを放出できるように保持するがアントシアニンを容易には放出しない。これはアントシアニン及びプロアントシアニジンの両方に富む製品を得るのに受け入れられる樹脂であるとは普通には考えられないであろうが、著しい量のアントシアニンは含有しない植物原料、例えば、プラムからプロアントシアニジンに富む製品を単離するには適している。この態様において、抽出物を該樹脂上に供給して該樹脂から望ましい化合物を溶離する工程は、室温で行われる。ＳＰ７０を用いてプラムからプロアントシアニジンを単離する例は、実施例２１で説明する。
【００４３】
図１に示された方法の一態様において、工程３０で単離された濾過抽出物をＳＰ２０７のような置換樹脂を詰め込んだカラム上に供給する。好ましくは、該樹脂は、約２００〜７００ミクロンの粒径分布及び約５０〜３００Åの孔径範囲を有する（工程４０）。工程４０は該抽出物をカラム中に詰め込まれた樹脂と接触させるという形でここに記載されているけれども、しかし、かかる記載は単に説明の場合用に過ぎない。このように、該樹脂は本発明方法を行うためにカラム中に詰め込む必要はない。カラム上に供給される濾過抽出物の量は、粗製抽出物を製造するのに用いた植物原料に依存する。例えば、ビルベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１６〜３０グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。もう一つの例として、ブルーベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１５〜４５グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。エルダーベリーから粗製抽出物を製造する場合、１リットルのＳＰ２０７樹脂当り、約１５〜４０グラムのフェノール化合物を供給することが出来る。もし濃縮粗製抽出物中の固体濃度が２００グラム／リットルを超えるならば、濾過抽出物は供給する前に水で希釈することが出来る。工程４０（図１）におけるカラム装填中に溶離する画分は「画分１」として収集される。
【００４４】
濾過粗製抽出物を該樹脂上に供給した後、該吸着剤に対して殆んど又は全く親和性を有さない望ましくない極性非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸、等）は、少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶剤，例えば、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液を用いて該樹脂から溶離される（図１、工程５０）。例えば、該異質物質を溶離するために約３カラム量の０．００６％硫酸水溶液又は０．１％酢酸水溶液を使用することが出来る。該溶離液は「画分２」として収集される。
【００４５】
図１を続けて参照しながら、該カラムは次に約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶剤を含む第一溶離剤を用いて溶離する（工程６０）。工程６０では、典型的に約２〜１２カラム量の溶離溶剤が使用される。一態様において、第一溶離剤は約０．００３％の酸、例えば、硫酸、塩酸、又は酢酸を含有する。溶離工程６０の間に収集された画分は、「画分３」として収集される。「画分３」は、粗製抽出物に含有されるフェノール化合物の一部を含有し、特にアントシアニン及び（又は）プロアントシアニジンに富む。
【００４６】
ＵＶ−ＶＩＳ（紫外／可視）分光計により測定して、（抽出物に存在している場合）アントシアニンの大部分が該カラムから溶離された後で、アントシアニンを溶離するのに用いた溶剤（工程６０）よりも大きなパーセントのエタノール又はメタノールを含む極性有機溶剤を含む第二溶離剤で該カラムを溶離する（図１、工程７０）。例えば、第二溶離剤は、約７０〜９０％のエタノール／水又は約７５〜１００％のメタノール／水を含むことが出来る。溶離工程７０の間に収集される画分は「画分４」として収集される。「画分４」は、粗製抽出物に最初含有されていたフェノール化合物の更なる部分を含有し、典型的にプロアントシアニジンに富む。「画分４」は、溶離工程６０の間に単離されなかったアントシアニンを含有することも出来る。
【００４７】
温度がフェノール化合物を分解するものでないならば、工程５０、６０および７０の各々は典型的に大体室温で行われるが、それより高い又は低い温度を使用することが出来る。
【００４８】
回収方法がフェノール化合物を分解しない温度で行われるならば、「画分３」及び「画分４」中のフェノール化合物の回収は、蒸発、蒸留、凍結乾燥、等のような任意の都合の良い方法で遂行して本発明のフェノール化合物に富む組成物を提供することが出来る。
【００４９】
上述の方法は、エルダーベリー、プラム、ブルーベリー、ビルベリー、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、ラズベリー、ブドウ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、及び紫サツマイモを含むが、それらに限定されない、フェノール化合物を含む種々の植物原料から、栄養補給食品として用いられるフェノール化合物に充分富む組成物を製造するのに適している。一態様において、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、少なくとも１０〜８０％のフェノール化合物を含有する。他の態様において、本組成物は少なくとも１２％のフェノール化合物を含有する。なお他の態様において、本組成物は少なくとも２５％のフェノール化合物を含有する。
【００５０】
植物原料からフェノール化合物、特にプロアントシアニジンを単離するための、変化をもたらす態様において、上述のように製造された植物原料抽出物は、三菱ＳＰ７０（ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂）のような未置換芳香族樹脂上に供給される。述べたように、未置換芳香族樹脂はプロアントシアニジンを放出できるように保持するがアントシアニンを容易には放出しないので、このタイプの樹脂は、著しい量のアントシアニンを含有しない植物原料、例えば、プラムからプロアントシアニジンに富む製品を単離するのに適するのである。一態様において、該抽出物を該樹脂上に供給して該樹脂から望ましい化合物を溶離する工程は、大体室温で行われる。例えば、（上述のように製造された）粗製の又は濾過された植物抽出物、又は果物濃縮物は、未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体を詰め込んだカラム上に室温で供給される。その後で、該吸着剤に対して殆んど又は全く親和性を有さない望ましくない極性非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸、等）は、少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶剤，例えば、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液を用いて該樹脂から室温で溶離される。次にフェノール化合物を該カラムから、室温で約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶剤を含む第一溶離剤を用いて溶離して第一溶離剤画分を得、それから室温でより大きなパーセントのエタノール又はメタノールを含む第二溶離剤（例えば、７０〜９０％のエタノール／水又は７５〜１００％のメタノール／水）を用いて溶離して第二溶離剤画分を得る。更なる溶離が更なるフェノール化合物を該樹脂から溶離するかどうかを判断するために、所望なら、該第一及び第二溶離画分をフェノール化合物含量について分析することが出来る。述べた通り、未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体はアントシアニンを典型的に保持するので、プロアントシアニジンに富む組成物を単離することが目的である場合、この態様によりプロアントシアニジンからアントシアニンを分離するために、溶離条件を調整する必要はない。
【００５１】
プロアントシアニジン分離段階
【００５２】
置換樹脂から本明細書で説明されたように単離されたフェノール化合物に富む組成物、特に「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せから単離された組成物は、図１２及び１３に示されたような特性ピークを有する同様のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムを生ずることが発見された。例えば、フェノール化合物を含有する植物原料から製造され、図１に説明された方法により臭素化ポリスチレン樹脂を用いて単離され、そして「画分４」から単離されたフェノール化合物に富むあらゆる組成物のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムは、エルダーベリーから単離された「画分４」組成物に対する図１２及び１３に示されたクロマトグラムにおけるピークと同様な６０〜７５分の特性ピークを含有することが分った。「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せから単離され、本発明により製造された本発明のフェノール化合物に富む組成物は、下記に詳細に説明するように、抗感染性（例えば、抗ウィルス性）及び抗炎症性活性を有する。
【００５３】
本発明のフェノール化合物に富む組成物をＩＲ（赤外線）分光測定により分析すると、フェノール化合物からの特性ピークがやはり観察される。より具体的に、本発明のフェノール化合物に富む組成物は、実質的に図３３〜４０に示されたＩＲ吸収ピークを有する特徴がある。
【００５４】
フェノール化合物に富む組成物（例えば、「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せ）は、実施例１１で詳細に説明されるように、又図１５に示されているように、Ｃ−１８カラムのような逆相親油性カラム上で低圧真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）を用いて、「極性」プロアントシアニジンに富む画分および「非極性」プロアントシアニジンに富む画分に更に分割することが出来ることが又発見された。例えば、エルダーベリー抽出物から単離された「画分３」組成物を水に溶解しＣ−１８カラム上に供給した。該カラムを１００％の水で洗浄して、Ｃ−１８媒体によって強くは保持されない物質を収集した。流過画分及び洗浄画分は、「画分５」として組合せたが、より極性のプロアントシアニジンを含有していた。かくして、「画分５」は「極性」プロアントシアニジンに富む画分とここで言及される（図１５）。エルダーベリーからの極性プロアントシアニジンに富む「画分５」は典型的にいくぶん紫色をしているので、この画分におけるポリマーは該オリゴマー状プロアントシアニジン鎖内に少なくとも１個以上のカチオン性アントシアニジン副単位を含有していることが示唆される。次に該ＶＬＣカラムを３０〜１００％のメタノールで溶離して、該低圧カラムに使用したＣ−１８媒体によってより強く保持されているプロアントシアニジンを収集した。複数のメタノール画分は、「画分６」として組合せたが、「画分５」で収集されたものより極性の低いプロアントシアニジンを含有していた。かくして、「画分６」は「非極性」プロアントシアニジンに富む画分とここで言及される（図１５）。非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は例えあるとしても少ししか色を有していないので、この画分におけるオリゴマー状プロアントシアニジン鎖はカチオン性アントシアニジン副単位を含有しないことが示唆される。
【００５５】
かくして、本発明は「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せに含有される非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを都合よく分離する方法を提供する。極性プロアントシアニジンに富む「画分５」及び非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は、粗製濾過水性抽出物（図１、工程３０）をＣ−１８ ＶＬＣカラム上に供給することにより直接に単離することが出来ることが又分った。単離されたプロアントシアニジンに富む画分５及び６を夫々説明するために使用する場合、用語「極性」及び「非極性」は画分５及び６におけるプロアントシアニジンの極性のことをお互いに比較して、即ち、特定の留分がＣ−１８ ＶＬＣカラム上でどのように挙動するかを言及していると理解されるべきである。本発明の極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分５）及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分６）は、実施例で論議されるように、実質的に減少した量のアントシアニンを有する。
【００５６】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分（夫々「画分５」及び「画分６」）は異なる生物活性を有することが分ったが、該非極性画分は、実施例１７で説明されるように、或る試験において該極性画分よりも大きな抗ウィルス活性を有することが分った。
【００５７】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分５及び６の各々は夫々、図１５に示されているように、又実施例１２〜１４で説明されるように、更に精製することが出来る。例えば、ＶＬＣ分離中に単離された極性プロアントシアニジンに富む「画分５」は、極性プロアントシアニジンを放出できるように保持する半分離用Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラム上に供給することが出来る。次に該カラムを、増加するパーセントのアセトニトリル、メタノール、又はエタノールを含む溶剤グラディエントで洗浄してアントシアニン及び他の極性化合物の大部分を溶離し、それから少なくとも６０％のアセトニトリル、メタノール、又はエタノールで洗浄して精製極性プロアントシアニジンを含有する「画分７」を溶離する（図１５）。更に、ＶＬＣ分離中に単離された非極性プロアントシアニジンに富む「画分６」は、ゲル濾過又は逆相半分離用ＨＰＬＣにより更に精製することが出来る。サイズ除外又はゲル浸透クロマトグラフィーとも呼ばれるゲル濾過は、分子をそれらのサイズにより分離する液体クロマトグラフィー技術である。このタイプの媒体は比較的小さな化合物を保持するが、一方比較的大きな非極性プロアントシアニジンに富む「画分８」（図１５）は流過溶離剤と共に溶離する。本発明の精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む画分７及び８は夫々、実質的に減少した量のアントシアニン及びフラボノイドを有し、又実質的に減少した量の極性非フェノール化合物を有する。更に、精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む「画分７」及び「画分８」は夫々異なる生物活性を有することが観察された。
【００５８】
用途
【００５９】
本発明の、フェノール化合物に富む組成物（「画分３」、「画分４」、又はそれらの組合せ）、極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分５及び７）、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（画分６及び８）は、様々な生物活性を有する。例えば、本発明の組成物は、実施例１５及び１６で説明されるように、抗ウィルス活性を有することが分った。本発明の組成物は、インフルエンザＡ，Ｂ，及びＣ、パラインフルエンザ・ウィルス、アデノウィルス１型、パンタトロウィルスＡ、単純ヘルペスウィルスＩ及びＩＩ、ライノウィルス、西ナイルウィルス、水痘・帯状疱疹ウィルス、及びはしかウィルスを含むがそれらに限定されないウィルスからのウィルス感染により誘発された又は併発した病気を予防及び（又は）治療するために、単独で又は他の抗ウィルス剤と組合せて使用することが出来る。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、治療的有効量の本発明組成物を投与することにより、かかるウィルスにより誘発される病気に対する予防的及び治療的応用において有利に使用することが出来る。
【００６０】
プロアントシアニジンは、それらのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害活性により抗炎症物質としても研究されている。抗炎症物質はＣＯＸ−１阻害よりもむしろＣＯＸ−２阻害に対して選択性があることが望ましいと示されている。従って、本発明の他の局面には、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を治療的有効量投与することを特徴とする、哺乳類における炎症性疾病を治療する方法が含まれる。例えば、ブルーベリー抽出物の精製中に画分３及び４として単離されたフェノール化合物に富む組成物は、高いＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１阻害選択性を有し、１０８μｇ／ｍＬのＩＣ５０（５０％抑制濃度）を有することが分った（実施例１７）。本発明の組成物は、炎症性反応を予防又は阻害するために、単独で又は他の抗炎症剤と組合せて使用することが出来る。かかる反応は、骨関節炎、アレルギー性鼻炎、循環器病、上気道疾患、創傷感染、神経炎、及び肝炎を含むが、それらに限定されない状態又は病気により引起こされ得る。
【００６１】
クランベリー及びブルーベリーから単離されたプロアントシアニジンは、細菌が膀胱壁に付着するのを阻害し、それにより尿路感染症のような疾病の可能性を減少させることが知られている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３９：１０８５−１０８６ （１９９８），Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．Ｂ．等）。プロアントシアニジンは細菌の付着を阻害することによりそれらの効果を発揮することが前提とされている。従って、本発明の他の局面には、尿生殖器感染症に伴う症状を予防し、減少させ、又は除去するのに充分な量で、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を有効量投与することを特徴とする、哺乳類における尿生殖器感染症を予防又は治療する方法が含まれる。本発明の組成物は単独で又は他の抗菌剤と組合せて使用することが出来る。
【００６２】
プロアントシアニジンは強力な抗酸化剤であることが更に知られている。例えば、プロアントシアニジンの抗酸化剤効果は循環系及び免疫系に対するそれらの多くの利点を説明すると推測される。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、食事サプリメント（例えば、食事抗酸化剤）として、又人間及び哺乳類における疾患の治療に使用することが出来るのである。例えば、本発明の組成物は、視力を改善するために、又循環器系疾患、糖尿病，及び潰瘍を治療するために使用することが出来る。
【００６３】
乾燥プラムは肉製品における病原体の成長を抑制する有効な微生物剤として役に立つことが出来ることが知られている。例えば、Ｄ．Ｆｕｎｇ（カンサス州大学）は、乾燥プラムピューレをひき肉製品における微生物阻害剤として試験した。３重量％レベルの乾燥プラムピューレを用いて、ひき肉における大腸菌やサルモネラ菌のような毒性病原菌に対する９９％の殺菌割合が報告された（次のＵＲＬ：http://www.mediarelations.ksu.eduで入手できる２００２年の新聞発表）。フェノール化合物が部分的にこの有益な効果を引起こすと考えられる。従って、本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、肉製品における病原菌の成長を妨げる肉添加剤として使用することが出来る。
【００６４】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、アラビノガラクタン、エキナシア種、ビタミン、ミネラル、多糖類、及びレンゲ属を含むが、それらに限定されない免疫活性剤と組合わせることも出来る。
【００６５】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイドを含むが、それらに限定されない抗変異原性剤と組合わせることも出来る。
【００６６】
本発明のフェノール化合物に富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、錠剤、カプセル、液体、又はチンキ剤として配合することが出来る。本発明により組成物を配合する際、広い範囲の付形剤を使用することが出来るが、それらの性質は勿論該組成物の意図した適用方法に依存するであろう。付形剤の例には、防腐剤、担体、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び香料添加剤、特に、カルボキシビニルポリマー、プロピレングリコール、エチルアルコール、水、セチルアルコール、飽和野菜トリグリセライド、脂肪酸エステル又はプロピレングリコール、トリエタノールアミン、グリセロール、澱粉、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、ラウリルサルフェート、燐酸二カルシウム、レシチン、等が含まれる。
【実施例１】
【００６７】
水抽出剤を用いたビルベリーの精製
１ｋｇの乾燥ビルベリー原料に対して３回の抽出を行った。最初の抽出は６Ｌの水を用い、他の２回の抽出は４Ｌの水を用いた。すべての抽出剤は濃硫酸で５ｇ／Ｌの酸濃度まで酸性化した。粗製抽出物中にアントシアニンが大体８８％回収された。正確に２．３Ｌの粗製抽出物を、ガラスウール層が上に乗せられた３０ミクロンのプロピレンフィルターに通して濾過した。該ガラスウールは一度交換し、該フィルターを脱イオン水ですすいだ。濾液の最終体積は２．４３Ｌで、濾液中にアントシアニンが９０．９％回収された。
【００６８】
カラムに臭素化ポリスチレン樹脂ＳＰ−２０７（Ｓｕｐｅｌｃｏ； Ｂｅｌｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を詰め込み、０．１％酢酸で平衡させた。該カラムに２．２４Ｌの該濾液を２９．８ｇ／Ｌの固体濃度で２．２ｍＬ／分の流速を用いて装填した。装填流出は装填されたアントシアニンの０．９％より少なく、該装填及び最初の２回のカラム洗浄におけるアントシアニンの全損失は４．０７％であった。該溶離工程でアントシアニンが８８．４％回収され、アントシアニンの物質収支は９２．５％であった。２，３百ミリリットルの溶離生成物を回転蒸発器の上で蒸発乾固させてから凍結乾燥させた。乾燥生成物の最終分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。得られた組成物は重量で４３％の全アントシアニンを含有していた。
【実施例２】
【００６９】
７０％エタノール抽出剤を用いたビルベリーの精製
２．０％のアントシアニンが分析された乾燥ビルベリー原料（６６７ｇ）を、容量で３％の硫酸を含有する７０％のエタノール／水を用いて、パーコレーションにより抽出した。粗製抽出物中の固体は、３．９重量％の全アントシアニンを含有していた。１リットルの最初の抽出容量を１００ｍＬの脱イオン水と混合し、真空で約４６０ｍＬまで蒸発させて該アルコールを除去した。該混合物に脱イオン水（３００ｍＬ）を添加し、更に１７０ｍＬの液体を蒸発させた。脱イオン水（２１０ｍＬ）を添加して最終容量を８００ｍＬとした。該水性混合物に１５０ｇのＣｅｌｉｔｅ ５１２（固体１グラム当り０．５〜０．９ｇのＣｅｌｉｔｅ）を添加した。該混合物を均質になるまで振蕩した。Ｃｅｌｉｔｅ／抽出物を真空下で３０ｇの湿ったＣｅｌｉｔｅ ５１２床上に注いだ。濾過完了後、該床を１．２０Ｌの１％硫酸水溶液で２００ｍＬずつ洗浄した。濾液量は１８５５ｍＬであった。該濾液に１４５ｍＬの脱イオン水を加えて２．０Ｌの最終容量にした。
【００７０】
該濾液の一部（６９５ｍＬ）を、１７０ｍＬの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）が装填されたカラム上に２．２ｍＬ／分（１．３ｍＬ／分／ｃｍ２）で供給した。これにより、１リットルのカラム媒体当り１７ｇのアントシアニンという装填値が得られた。該カラムを、１カラム容量の０．１％酢酸水溶液に続いて２．５カラム容量の０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノール／９０％水で洗浄した。次に該カラムを１０カラム容量の７０％エタノール／水で溶離し、該７０％エタノール画分を一緒にして６０℃、５０ｍｂａｒにおいて真空で濃縮して光る暗色乾燥非晶質固体（「画分３」）が得られた。乾燥生成物の最終分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。得られた組成物は重量で３２％の全アントシアニンを含有していた。
【００７１】
図２及び３は、本発明の方法によりビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００７２】
表１は、典型的なアントシアニンに富む組成物（「画分３」）中の各アントシアニンのパーセントを取りまとめたものである。
表１．ビルベリーの「画分３」に存在するアントシアニンの同定及び含量
【００７３】
【表１】
【実施例３】
【００７４】
ブルーベリーからのフェノール化合物に富む組成物
１０Ｌの丸底フラスコにおいて、９４０ｇの乾燥粉砕ブルーベリー（イリノイ州モメンス、Ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に４．０リットルの抽出溶剤（７０％エタノール中１．０ｗ／ｖ％硫酸）を添加した。該フラスコを４０℃に維持された恒温水槽中で２時間回転させた。該混合物をかきまぜ、真空下１５０ｇのＣｅｌｉｔｅ ５１２床に通して濾過した。ブルーベリーのバイオマスケークを５００ｍＬの抽出溶剤で洗浄した。該ケークを該Ｃｅｌｉｔｅ床から注意深く掻き取り、丸底フラスコ中に移し、上述の操作に従って再抽出した。次に第三の抽出を行った。三つの粗製抽出物を一緒にした。
【００７５】
一緒にした抽出物の一部（２．００Ｌ）を４０℃の水槽温度で真空下１７５ｍＬまで濃縮した。蒸発させた抽出物を脱イオン水で希釈して６７５ｍＬのブルーベリー粗製抽出物が得られた。該粗製抽出物を、１７０ｍＬの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）が装填され、前以て調整され（即ち、アセトンで洗浄され）平衡させられたカラム上に濾過せずに供給した。該カラムを、０．１％酢酸で、そして０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノールで洗浄した。アントシアニンは７０％エタノールで溶離された。生成物プールを６０℃、５０ｍｂａｒで真空下蒸発させた。最終生成物分析は、標準分光光度定量により、塩化デルフィニジン標準物質に対して５３５ｎｍにおける吸収（１．０ｃｍにおいて１０２吸収単位／ｇ／Ｌ）であった。精製されたブルーベリー組成物（「画分３」）は重量で１８％の全アントシアニンを含有し、アントシアニンの全回収は９５％であった。
【００７６】
図４及び５は、本発明の方法によりブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の、５１０ｎｍ及び２８０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【実施例４】
【００７７】
ブルーベリーからのより高純度のフェノール化合物に富む組成物
この実施例では、実施例３に記載したように製造されたブルーベリーを原料とし全アントシアニンが１８重量％であるフェノール化合物に富む組成物の一部を、該組成物の純度を増加させるために、強い又は弱いアニオン交換樹脂に通過させて残留酸を除去した。
【００７８】
該フェノール化合物に富むブルーベリー組成物の約１．０ｇを、５０ｍＬの水に溶解し、強アニオン交換樹脂（ペンシルベニア州モントゴメリー、ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０ Ｍ）又は弱アニオン交換樹脂（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥＭ−６３）を含有する９ｍＬのカラムに通過させた。該カラムを３０〜３５ｍＬの水で洗浄した。該強アニオン交換樹脂カラムの場合は、該樹脂を２５ｍＬの２０％エタノールに続いて４０％エタノールで更に洗浄した。該強アニオン交換カラムから単離した組成物は２８．３重量％の全アントシアニンを含有し、該回収は８８％であった。該弱アニオン交換カラムから単離した組成物は３０．６重量％の全アントシアニンを含有し、該回収は８８％であった。
【実施例５】
【００７９】
ペクチナーゼ処理を用いたビルベリーからのフェノール化合物に富む組成物
１０２４ｇの冷凍ビルベリーに温水（５４８ｇ）を添加した。該混合物をミキサーでピューレにしてから４０℃に加熱した。次に１５０μＬのペクチナーゼ（ニューヨーク州ノリッジ、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｑｕｅｓｔ Ｓｕｐｅｒ ７ｘ）を添加して４０℃で３０分攪拌処理した。該スラリーに約４ｍＬの濃硫酸を添加して０．５％（ｗ／ｗ）の酸濃度を達成した。次に該混合物を４５℃に加熱して非常にゆっくり攪拌しながら１５分間抽出した。Ｄｉｃａｌｉｔｅ（１６４ｇ）を該抽出混合物に添加してから、それを２６ｇのＤｉｃａｌｉｔｅ床を越えて濾過した。得られたケークを４００ｍＬの０．１％温硫酸水溶液で３回洗浄した。この抽出物を２５μｍの加圧フィルターに通して濾過した。濾過抽出物のすべて（２．４Ｌ）を１７０ｍＬのＳＰ−２０７カラム上に装填した。装填後、該カラムを０．１％酢酸水溶液で洗浄してから７０％エタノール水溶液で溶離して「画分３」が提供された。「画分３」を蒸発乾固させてから凍結乾燥器上に４８時間置いた。最終生成物は、５３５ｎｍにおける吸収の標準分光光度定量により全アントシアニンを分析した。該フェノール化合物に富む組成物は、重量で４０％の全アントシアニンを含有していた。アントシアニンの全回収は大体７９％であった。
【実施例６】
【００８０】
エルダーベリー・バイオマス粉末からのフェノール化合物に富む組成物
１．８８％のアントシアニンおよび５．３１％のフェノール化合物が分析された乾燥エルダーベリー・バイオマス粉末（カリフォルニア州ロングビーチ、ＢＩ Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）約１９０ｇを１０００ｇの温水に添加した。該溶液を充分に混合して４５℃の湯浴に移した。該溶液に１９０μＬのペクチナーゼ（Ｓｕｐｅｒ ７Ｘ，Ｑｕｅｓｔ）を添加してから、該混合物を３０分間放置した。該混合物を、２．５ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４を用いて２．５のｐＨまで酸性化してから、１０分間静かに混合した。この酸性化混合物に１６４ｇのＣｅｌｉｔｅを添加してから、該酸性化混合物を２６ｇのＣｅｌｉｔｅ床を越えて濾過した。該フィルターケークを４００ｍＬの酸性化温水で３回、全体として１２００ｍＬで洗浄した。次に該濾液を２５μｍの加圧フィルターに通して濾過しエルダーベリー抽出物が得られた。
【００８１】
該エルダーベリー抽出物を、１７０ｍＬのＳＰ−２０７（三菱ケミカル）臭素化ポリスチレンカラム上に２．３ｍＬ／分（１．３ｍＬ／分／ｃｍ２）の速度で装填した。装填中該カラムから離れて収集された溶離液は、「画分１」として収集された。装填後、該カラムを３カラム容量（３ｘ１７０ｍＬ）の０．００６％硫酸水溶液で洗浄した。この洗浄からの溶離液は「画分２」として収集された。次に該カラムを８〜１０カラム容量の７０％エタノール水溶液で溶離し、それらは「画分３」として収集された。次に該カラムを３カラム容量の９０％エタノール水溶液で洗浄し、それらは「画分４」として収集された。該カラムを８カラム容量の０．００６％硫酸水溶液で再平衡化した。画分３及び４を蒸発乾固させてから乾燥するまで凍結乾燥させた。臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離の間に単離されたいくつかの画分を、実施例７及び８で記載されるように、アントシアニン及びフェノール化合物について分析した。
表２．エルダーベリー画分中のアントシアニン及びポリフェノールの分析と回収
【００８２】
【表２】
【００８３】
図６〜１３は、濾過されたエルダーベリー抽出物の、及びカラム精製の間に単離されたいくつかの画分のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。使用されたＨＰＬＣ条件は実施例９に記載される条件である。
【００８４】
図６及び７は、濾過されたエルダーベリー抽出物の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８５】
図８及び９は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上にカラム装填している間に収集された「画分１」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８６】
図１０及び１１は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂から７０％エタノールの使用によりカラム溶離している間に収集された「画分３」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８７】
図１２及び１３は、濾過されたエルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂から９０％エタノールの使用によりカラム溶離している間に収集された「画分４」の、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８８】
本発明のフェノール化合物に富む組成物は、実質的に図１０〜１３に示された標準的ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて６０〜７５分の範囲にピークを示す化合物を含む。
【実施例７】
【００８９】
アントシアニンの定量的測定
この方法は、外部標準を用いたＵＶ−ＶＩＳ（紫外・可視）分光光度測定法により、種々のバイオマス試料及び乾燥され精製されたフェノール化合物に富む組成物中の全アントシアニンを定量するのに用いられる。試験される各試料（例えば、濃縮されたフェノール化合物に富む組成物、乾燥されたバイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、以下に説明されるように異なる調整操作を必要とする。
【００９０】
フェノール化合物に富む組成物： 精製されたフェノール化合物に富む組成物を１００ｍＬ容量のフラスコ中に７５〜１００ｍｇ正確に秤量し、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで希釈して一杯にする。良く混合してから、この試料の０．４０〜１．６ｍＬを２％のＨＣｌ／ＭｅＯＨで希釈して１０．０ｍＬとする。
【００９１】
乾燥バイオマス： コーヒー豆ひき器中に、該豆ひき器の刃を覆うのに充分な量の乾燥バイオマスを入れる。約１分間又は微細に粉砕されるまで粉砕する。或いは、乳鉢及び乳棒を用いて該原料を微細に粉砕する。１００ｍＬ容量のフラスコ中に微細に粉砕されたバイオマスを約５０〜１００ｍｇ正確に秤量してから、約８０ｍＬの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し蓋をする。該フラスコを、５０℃の油浴又は強制空気オーブンに３０〜６０分間入れ、３０秒静かに振蕩させてから、５分間音波破砕する。該溶液を室温まで冷却させる。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを該印まで添加し混合する。該試料の一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してバイアル中に濾過する。該濾液の１．０ｍＬを２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍＬまで希釈する。該希釈係数は１０ｍＬ／１ｍＬ、即ち１０となるであろう。
【００９２】
冷凍／新鮮バイオマス： １０００ｍＬのポリプロピレンビーカー中に冷凍／新鮮バイオマスを４００．０ｇ秤量する。該ビーカー中に４００ｇの沸騰直前の水を添加する。機械的ミキサー（Ｗａｒｉｎｇ等）を用いて裏ごしする。口径の広いポリエチレンスポイトを用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取除いて、風袋が計量された１００ｍＬ容量のフラスコ中に移す。８０ｍＬの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し蓋をする。該フラスコを、５０℃の油浴又は強制空気オーブンに６０〜１２０分間入れ、３０秒静かに振蕩させてから、５分間音波破砕する。該溶液を室温まで冷却させる。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを該印まで添加し混合する。一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してバイアル中に濾過する。該希釈係数は、バイオマスと水の合計重量をバイオマスの重量で割った値となるであろう［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ＝２］。
【００９３】
乾燥損失： 上記試料中の全アントシアニン含量を得る計算は、該原料の含水量、即ち、％ＬＯＤ（乾燥損失）の測定を必要とする。％ＬＯＤを測定するため、正確に秤量されたアルミニウム・ウェーパン中に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分配し、該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。該試料を１０５℃±３℃のオーブンに２時間（２時間１５分を超えない）入れる。該試料が室温に冷えてから（乾燥器を使用しても良い）、該試料を秤量して該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。％ＬＯＤは式１を用いて０．１％に近似した正確さで決定される。
【００９４】
【数１】
［式中、％ＬＯＤ＝乾燥損失パーセント、ＷＤ＝受皿及び試料の乾燥重量（ｇ）、ＷＰ＝受皿の重量（ｇ）、そしてＷＳＰ＝受皿及び試料の初期重量（ｇ）。］
【００９５】
分析操作： ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプをオンにして光度測定モードで読めるようにセットする。該計器を、１ｃｍ光路長のガラス、石英、又は使い捨てポリスチレンのセル中に２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、５３５ｎｍでゼロ目盛に合せる。同じか又は整合させた１ｃｍのセル中で、準備した試料の吸収を５３５ｎｍで測定する。
【００９６】
計算： 全アントシアニンの濃度は式２に示されたように計算される。
【００９７】
【数２】
［式中、ＣＡＮＴＨＯＳ＝試料中全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＡＢＳＳＡＭＰ＝５３５ｎｍにおける試料の吸収、ＤＦ＝下記に説明される希釈係数、そしてＥＳ＝塩化シアニジン（サクランボ、クランベリー、エルダーベリー、及びプラムに対して、１０１．１）又は塩化デルフィニジン（ビルベリー及びブルーベリーに対して、１０２．０）の適切な外部標準の吸収率（１ｃｍのセルを用いた２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中５３５ｎｍにおける１ｍｇ／ｍＬ溶液の吸収）。乾燥バイオマスに対する希釈係数（ＤＦ）は１であり、新鮮／冷凍バイオマスに対する希釈係数はバイオマスと水の合計重量をバイオマスの重量で割った値［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ］である。精製された抽出物に対する希釈係数は、最終希釈容量を抽出物溶液の容量で割った値（例えば、１０ｍＬ／０．４０ｍＬ）である。］
【００９８】
全アントシアニンパーセントは式３に示されるように計算される。
【００９９】
【数３】
［式中、％Ａｎｔｈｏｓ＝試料中全アントシアニンのパーセント、ＣＡＮＴＨＯＳ＝全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖｏｌｕｍｅ＝試料調製の初期容量（通常１００ｍＬ）、ＷＳ＝該調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスの場合５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合５００〜１５００ｍｇ、又は精製抽出物の場合７５〜１００ｍｇ）、そしてＳＬＯＤ＝乾燥或いは新鮮バイオマス又は精製抽出物に対して（１００−％ＬＯＤ）／１００（新鮮又は冷凍バイオマスに対してこの係数はあてはまらない）］。
【実施例８】
【０１００】
全ポリフェノールの定量的測定
この方法は、外部標準として没食子酸を用いたＵＶ−ＶＩＳ（紫外・可視）分光光度測定法により、種々のバイオマス試料及び乾燥され精製されたフェノール化合物に富む組成物中の全ポリフェノールを定量的に測定するのに用いられる。
【０１０１】
該操作は２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液及び２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを必要とする。該Ｎａ２ＣＯ３溶液を調製するには、約３５０ｍＬの脱イオン水を含有する５００ｍＬ容量のフラスコ中に約１００ｇのＮａ２ＣＯ３を秤量する。１０分間音波破砕し振蕩して混合する。脱イオン水を用いて一杯になるまで希釈し、均質になるまで攪拌する。２％のＨＣｌ／ＭｅＯＨを調製するには、５００ｍＬ容量のフラスコ中に約３５０ｍＬのメタノールを移す。該フラスコ中に１０．０ｍＬのＨＣｌをピペットで入れる。メタノールを用いて一杯になるまで希釈し、均質になるまで混合する。
【０１０２】
没食子酸ストック標準を調整するには、１００ｍＬ容量のフラスコ中に１００ｍｇの没食子酸（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ）を正確に秤量する。７０ｍＬの脱イオン水を添加し、溶解するまで５分間音波破砕する。脱イオン水を用いて一杯になるまで希釈し、蓋をして均質になるまで混合する。
【０１０３】
試験する各試料（例えば、フェノール化合物に富む組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、異なる調製操作を必要とし、実施例７に説明したように調製した。
【０１０４】
乾燥損失： 上記試料中の全ポリフェノール含量を得る計算は、該原料の含水量、即ち、％ＬＯＤ（乾燥損失）の測定を必要とする。％ＬＯＤを測定するため、正確に秤量されたアルミニウム・ウェーパン中に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分配し、該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。該試料を１０５℃±３℃のオーブンに２時間（２時間１５分を超えない）入れる。該試料が室温に冷えてから（乾燥器を使用しても良い）、該試料を秤量して該重量を０．１ｍｇに近似した正確さで記録する。％ＬＯＤは上記式１を用いて０．１％に近似した正確さで決定される。
【０１０５】
比色発現操作： きれいな１００ｍＬ容量のフラスコを試薬ブランクとして役立つように脇に置く。２個の１００ｍＬ容量のフラスコに「高」標準及び「低」標準とラベルを付ける。没食子酸ストック溶液を用いて、ピペットで８００ｍＬを「高」標準フラスコ中に入れ、２００ｍＬを「低」標準フラスコ中に入れる。乾燥バイオマス試料に対しては、該濾過溶液の２０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。新鮮／冷凍バイオマス試料に対しては、該濾過溶液の１０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。精製された試料に対しては、０．８０〜２．０ｍＬを１００ｍＬ容量のフラスコ中にピペットで入れる。上記で調製したフラスコ（試薬ブランクを含む）の各々に以下のものを添加する。
１．全容量を約６５ｍＬにするのに充分な脱イオン水を各フラスコに添加する。
２．ＦＣフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ）の５．０ｍＬを各フラスコ中にピペットで入れ、静かに攪拌する。
３．２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液の１５±２ｍＬを各フラスコ中にピペットで入れる。
４．各フラスコ中の溶液を静かにかきまぜながら混合し、脱イオン水で一杯になるまで希釈し、蓋をして逆さにする。
５．それらの溶液を少なくとも３時間しかし４時間以下発色させる。
６．濾過を必要とする試料の１０ｍＬ分割量を０．４５μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターに通して適切な容器中に濾過する。
【０１０６】
分析操作： ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプをオンにして光度測定モードで読めるようにセットする。１ｃｍ光路長のガラス、石英、又は使い捨てポリスチレンのセル中で分析を行う。該計器を、試薬ブランクを用いて、７６０ｎｍでゼロ目盛に合せる。同じか又は整合させた１ｃｍのセル中で、各溶液の吸収を７６０ｎｍで測定する。
【０１０７】
計算： 全ポリフェノールの濃度を計算するには、最初に没食子酸の吸収率を測定しなければならない。この値は式４に記載されているように得られる。
【０１０８】
【数４】
［式中、ＥＲ＝吸収単位／ｇ／Ｌで表した７６０ｎｍにおける参照標準（没食子酸）の吸収率、ＡＲ＝参照標準溶液の吸収、ＣＲ＝ストック標準溶液中没食子酸の濃度、ＤＲ＝没食子酸標準に対する希釈係数（「高」標準に対する１２５又は「低」標準に対する５００）、そしてＥＬＯＤ＝パーセントとしての没食子酸固体の乾燥損失。］
【０１０９】
下記の式５に使用するため、「高」標準及び「低」標準に対する吸収率を平均化する。発色試料調製液中の全ポリフェノールの濃度は式５に示されているように計算される。
【０１１０】
【数５】
［式中、ＣＰ＝ＦＣ試料調製液中全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＡＳ＝ＦＣ試料調製液の吸収、ＤＦＣ＝試料希釈係数（ＤＦは典型的に、乾燥バイオマスに対し５、新鮮／冷凍バイオマスに対し１０、そして精製されたフェノール化合物に富む組成物に対し５０〜１２５である）、そしてＥＲ＝没食子酸標準の平均吸収率。］
【０１１１】
全ポリフェノールパーセントは式６に示されているように計算される。
【０１１２】
【数６】
［式中、％Ｐ＝試料中全ポリフェノールのパーセント、ＣＰ＝全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＶＳ＝初期試料調製液の容量（通常１００ｍＬ）、ＷＳ＝初期試料調製液に用いたバイオマス又は精製組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、そして精製抽出物に対しては７５〜１００ｍｇ）、ＤＳ＝初期試料希釈係数（ＤＳは、乾燥バイオマスに対し１、新鮮／冷凍バイオマスに対し２、又は精製抽出物に対し１である）、そしてＳＬＯＤ＝バイオマス又は精製抽出物に対して（１００−％ＬＯＤ）／１００。新鮮又は冷凍バイオマスに対してこの係数はあてはまらない。］
【実施例９】
【０１１３】
ＨＰＬＣ定性分析
この方法は、種々のバイオマス及び精製されたフェノール化合物に富む組成物中の化合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定するのに使用される。各タイプの試料は、下記に説明するように異なる調製操作を必要とする。
【０１１４】
乾燥バイオマス： 乾燥バイオマスは、まだ粉末化されてないならば、ウィリーミルを用いて１ｍｍスクリーンに通して粉砕する。適切な大きさにした円筒濾紙及びソックスレー抽出器を使用して、約１２ｇの粉末化バイオマスを円筒濾紙中に秤量し、２００ｍＬのメタノールを用いて抽出する。少なくとも２０サイクル又は抽出溶剤が澄明になるまで抽出する。該抽出液を２５０ｍＬ容量のフラスコにメタノールを用いて定量的に移し、一杯になるまで希釈して混合する。該抽出液を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１５】
冷凍／新鮮バイオマス： １０００ｍＬのポリプロピレンビーカー中に冷凍／新鮮バイオマスを４００ｇ秤量する。該ビーカー中に４００ｇの沸騰直前の水を添加する。機械的ミキサー（Ｗａｒｉｎｇ等）を用いて裏ごしする。口径の広いポリエチレンスポイトを用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取除いて、風袋が計量された１００ｍＬ容量のフラスコ中に移す。８０ｍＬのＭｅＯＨを添加し、蓋をして５０℃で３０分間加熱する。該溶液を室温まで冷却させ、メタノールで一杯になるまで調整してから、均質になるまで音波破砕する。一部を０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１６】
精製されたフェノール化合物に富む組成物： 該フェノール化合物に富む組成物をガラスのシンチレーション・バイアル中に５０〜１００ｍｇ正確に秤量し、１０．０ｍＬの５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを添加する。５分間音波破砕する。０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルターに通してＨＰＬＣバイアル中に濾過する。
【０１１７】
ＨＰＬＣを必要とされているようにセットする。本発明の一態様において、５ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍＬの高純度タイプ１水中に混合することにより水性移動相を調製した。２０μＬの試料を周囲温度で注入した。２８０ｎｍの波長を検出に使用し、流速は１．０ｍＬ／分であり、運転時間は１０５分であった。Ｚｏｒｂａｘカラムは１５０ｘ４．６ｍｍのＩＤカラムに５μｍのＳＢＣ−１８を詰め込んだ。この態様において、移動相は以下のようにセットした：チャネルＡ：１００％アセトニトリル；チャネルＢ：Ｈ２Ｏ中０．５％ＴＦＡ；そしてチャネルＣ：１００％メタノール。表３は、本発明のこの態様に対するＨＰＬＣ階調度をまとめたものである。
【０１１８】
もし入手できるならば、試料中に存在することが知られている化合物の標準調製液を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製することが出来る。これらの標準調製液は、大体の滞留時間を測定し、それにより試料クロマトグラム中のそれらの化合物を同定するのに使用することが出来る。この方法は定性目的の為のみに使用されるので、計算は全く必要ない。
表３： 定性分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１１９】
【表３】
【実施例１０】
【０１２０】
プロアントシアニジンのパーセントを測定するための定量的ＨＰＬＣ法
このＨＰＬＣ法は、種々の画分及びフェノール化合物に富む組成物中のプロアントシアニジンの量を測定するのに使用される。各タイプの試料は異なる調製を必要とするので、実施例９で説明したように調製する。該方法は、１５０ｘ４．６ｍｍのカラムにＳｔａｂｌｅｂｏｎｄ ＳＢＣ−１８を詰め込んだ５μｍ Ｚｏｒｂａｘカラムを使用する。流速は１．５ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は１０μＬであり、そして運転時間は２４分であった。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。使用した階調度を表４に提供する。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラムにおいて幅広いピーク群として典型的に溶離された。
表４．プロアントシアニジンの％分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
プロアントシアニジンを定量するために、組織内で前以って調整したプロアントシアニジン標準を９０％より高い純度で利用する。これの試料は７０％エタノール中５．５ｍｇ／ｍＬで調製し、この実施例で説明したＨＰＬＣ法を用いて分析する。この標準に対するクロマトグラムには（図１４に見られるように）１１〜２２分の滞留時間範囲で大きな幅広いピークが含まれるが、これはプロアントシアニジンによる。１１〜２２分のピーク全体を手作業で積分する。次に、式７に示されているように、標準に対するピーク面積応答係数を、１１〜２２分の全ピーク面積を標準溶液濃度とその純度の積で割ることにより決定する。
【０１２３】
【数７】
［式中、ＲＦ＝標準に対するピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡ＝標準におけるプロアントシアニジンのピーク面積、ＣＳＴＤ＝ｍｇ／ｍＬで表した標準溶液の濃度、そしてＰＳＴＤ＝パーセントとしての標準物質純度（通常０．９０）。］
【０１２４】
試料中のプロアントシアニジンのパーセントは、上述の試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて測定することが出来る。問題の試料に対して、１１〜２２分の滞留時間範囲における全ピーク面積を測定する。しかしながら、いかなる計算をする前にも、プロアントシアニジン滞留時間範囲における非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、端から端までの全ピーク面積から引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、幅広いプロアントシアニジンのピークと共に溶離する鋭いピークとして又は該ピークの頂上における鋭いピークとして頻繁に現れ、それらのダイオードアレーによるＵＶスペクトルはプロアントシアニジンのピークの大部分としばしば異なる。非プロアントシアニジンのピーク面積を測定するには、これらのピークを手作業で積分し、それらのピーク面積を合計し、次にこの面積を１１〜２２分の全ピーク面積から引く。試料中のプロアントシアニジンのピーク正味面積が一旦測定されたら、式８に示されるように、この値を組織内標準に対するピーク面積応答係数で割って試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る。
【０１２５】
【数８】
［式中、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝試料中全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡＳＡＭＰ＝試料に対する訂正全ピーク面積、ＤＦ＝希釈係数（乾燥バイオマスに対して１、新鮮／冷凍バイオマスに対して２、そしてフェノール化合物に富む組成物に対して１）、そしてＲＦ＝式７を用いて計算されたピーク面積応答係数。］
【０１２６】
全プロアントシアニジンの％は式９に示されるように計算される。
【０１２７】
【数９】
［式中、％Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ＝試料中全プロアントシアニジンのパーセント、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖ＝試料調製液の容量（通常、乾燥バイオマスに対しては２５０ｍＬ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては１００ｍＬ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては１０ｍＬ）、そしてＷＳ＝試料調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては５０〜１００ｍｇ）。］
【実施例１１】
【０１２８】
濾過されたエルダーベリー抽出物からの極性及び非極性プロアントシアニジンの直接的分割
この実施例では、濾過されたエルダーベリー抽出物を調製し、臭素化ポリスチレン樹脂上で精製する代りに、図１５に説明した方法により、真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）カラム上に直接供給して、濾過抽出物から直接に極性プロアントシアニジン及び非極性プロアントシアニジンを分割した。
【０１２９】
メタノール中Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ４０μｍフラッシュ・クロマトグラフィー Ｃ−１８媒体のスラリー５０ｍＬを、６０ｍＬのガラス濾過器に通して濾過することにより、５０ｍＬのＣ−１８ ＶＬＣカラムを調製した。該カラムを、メタノールで、次に水で洗浄することにより、調整した。１２．０ｇの固体、７４ｍｇのアントシアニン、及び約７８０ｍｇのプロアントシアニジンを含有する濾過されたエルダーベリー抽出物の３００ｍＬ部分を、該カラム上に供給した。実施例１０で説明したＨＰＬＣ法を用いた濾過抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを図１６に示す。流過溶離液（約３００ｍＬ）及び１００ｍＬの洗浄液（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））を一緒にして極性プロアントシアニジンの「画分５」を提供した。「画分５」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に示す。次に該カラムを、０．１％ＴＦＡを含有する３０，４０，５０，６０，７０及び１００％メタノールの各１００ｍＬで溶離した。６０％メタノール溶離液中に単離された非極性プロアントシアニジンの「画分６」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に示す。これらの画分を、実施例７及び１０で説明した方法により、アントシアニン及びプロアントシアニジンに対して分析した。表５はこの実験の結果をまとめたものである。
表５： エルダーベリーの分割
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
該結果によれば、濾過抽出物中のプロアントシアニジンの７１％（５５８ｍｇ）が装填及び洗浄中に収集されたことが示されている。これらの化合物は比較的極性のプロアントシアニジンであった。非極性プロアントシアニジンは、メタノール濃度を少なくとも４０％に増加させた時に溶離された。５０〜７０％メタノール画分中に溶離されたプロアントシアニジンの純度は高かったが、それは、濾過されたエルダーベリー抽出物に含有される固体の大部分が装填溶離剤、水洗浄液、及び３０％メタノール洗浄液中に溶離された事による。
【実施例１２】
【０１３２】
ＶＬＣによるエルダーベリー・プロアントシアニジンの分割に続くゲル浸透クロマトグラフィー又は半分離用ＨＰＬＣによる精製
実施例６で説明した操作を用いて、臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離の間に７０％エタノール画分（「画分３」）を収集することにより、エルダーベリー乾燥バイオマス（ドイツ、Ｍａｒｔｉｎ Ｂａｕｅｒ）からフェノール化合物に富む組成物を調製した。このフェノール化合物に富む組成物の一部（２．００ｇ）を５０ｍＬの水に溶解し、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ４０μｍ Ｃ−１８媒体で調製した１５ｍＬのＣ−１８ ＶＬＣカラム上に供給した。流過溶離液及び２５ｍＬの水洗浄液を一緒にし凍結乾燥して、７３３ｍｇの極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）を生成した。次に該カラムを２５ｍＬの５０％メタノールで洗浄した。非極性プロアントシアニジン（「画分６」）は２５ｍＬの７０％メタノールで溶離された。この画分中のメタノールを除去し、得られた水懸濁液を凍結乾燥して、１９２ｍｇの非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を生成したが、これはＨＰＬＣ分析により１００％のプロアントシアニジンであった。この画分は例えあるとしても少ししか色を有していなかったので、この画分におけるオリゴマー状プロアントシアニジン鎖はカチオン性アントシアニン単位を含有しないことが示唆される。
【０１３３】
極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）を半分離用ＨＰＬＣにより更に精製してアントシアニン残渣及び他のより極性の不純物を除去した。これら固体の半分離用ＨＰＬＣ精製のための条件を下記に説明する。
【０１３４】
該半分離用ＨＰＬＣ法は、６μｍ，６０オングストロームのＮｏｖａ−Ｐａｋ ＨＲ Ｃ−１８媒体で充填された２．５ｘ１０ｃｍのＷａｔｅｒｓ ＰｒｅｐＰａｋカートリッジ（マサチューセッツ州ミルフォード、Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。この態様で使用した階調度は表６に提供した通りであった。流速は３０ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は典型的に５０〜１２５ｍｇの固体を含有する溶液の３〜５ｍＬであった。運転時間は３０分であった。プロアントシアニジンは１３〜２０分で溶離された幅広いピークで収集された。
表６： エルダーベリー・プロアントシアニジン精製に対するＨＰＬＣ階調度
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
極性プロアントシアニジン画分（「画分５」）の約６００ｍｇを２５ｍＬの水に溶解した。約３ｍＬ（７５ｍｇ）を８回の試験の各々に注入した。各試験において約１２〜１８分で溶離するプロアントシアニジンのピークを収集し、ため、回転蒸発器上で蒸発させてから、水溶液残渣を凍結乾燥させた。約１００ｍｇの精製極性エルダーベリー・プロアントシアニジン（「画分７」）が、ＶＬＣ分離後の極性プロアントシアニジン固体（「画分５」）６００ｍｇから得られた。半分離用ＨＰＬＣ精製後のＶＬＣ単離極性プロアントシアニジンに対する２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１９に示す。砂糖、アミノ酸、アントシアニン、有機酸、及び小さなフラボノイド化合物を含む極性前線は、図１９におけるこれらピークの不存在により証明されるように、半分離用ＨＰＬＣ精製により除去された。精製極性プロアントシアニジン（「画分７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２０に示す。
【０１３７】
非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）をゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製した。ＶＬＣ分離中に単離された非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）の一部（４８ｍｇ）を２０ｍＬの温水に溶解し、前以て水で平衡させておいた１４ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム上に装填した。装填溶離液を収集し４０ｍＬのカラム洗浄水と一緒にした。非極性プロアントシアニジンの大部分はこの点で該カラムから溶離されたが、一方それより小さなフラボノイド不純物は保持された。一緒にした装填溶離液及び洗浄溶離液を冷凍乾燥して３２ｍｇの精製非極性プロアントシアニジン「画分８」を提供した。これらの固体は強い抗ウィルス活性を有していた。図２１及び２３は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム精製前の非極性プロアントシアニジン（「画分６」）の、２８０ｎｍ及び３６８ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２２及び２４は、精製非極性プロアントシアニジン（「画分８」）の、２８０ｎｍ及び３６８ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２１における星印でマークしたピークは、それらのＵＶスペクトルに基づき非プロアントシアニジン・フラボノイド化合物である。これらの化合物は、図２２の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムに示されているように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム後に単離された精製非極性生成物（「画分８」）では減少している。ゲル精製の効果は、精製前の非極性プロアントシアニジンの３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラム（図２３）を比較することにより、より良く理解することが出来る。非プロアントシアニジン不純物は、図２３では４〜６分及び１５〜１７分に現れている。図２４に示された精製試料においては、５．８分で溶離された少量のフラボノイド化合物以外、微量のフラボノイド化合物も全く存在しない。精製非極性プロアントシアニジン「画分８」の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。図３３は画分７のＩＲスペクトルを示し、図３４は「画分８」のＩＲスペクトルを示す。
【実施例１３】
【０１３８】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるブルーベリー極性及び非極性プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、ブルーベリーから調製し、臭素化ポリスチレン樹脂からの７０％エタノール溶離中に単離したフェノール化合物に富む「画分３」であった。「画分３」の一部（６．００ｇ）を８０ｍＬの水に溶解し、前述の３０ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液を収集し１００ｍＬの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離液と一緒にした（「画分５」）。次に、該カラムを８０ｍＬの４０％メタノールで洗浄して極性化合物（「画分５」）残渣を除去してから、８０ｍＬの７０％メタノールで洗浄して非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を得た。表７はこの実験の結果をまとめたものである。
表７： ブルーベリー・プロアントシアニジンの精製
【０１３９】
【表７】
【０１４０】
極性プロアントシアニジン「画分５」（装填溶離液＋洗浄液）及び非極性プロアントシアニジン画分６（７０％メタノール溶離液）を各々、実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、夫々「画分７」及び「画分８」を提供した。半分離用精製の前及び後のブルーベリー極性プロアントシアニジン画分（即ち、「画分５」及び「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを夫々図２６及び２７に示す。半分離用精製の前及び後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン画分（即ち、「画分６」及び「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを夫々図２８及び２９に示す。図２７及び２９の約０〜８分におけるピークの不存在により証明されているように、極性及び非極性画分の半分離用精製により、望ましくないアントシアニン及び極性フラボナイド化合物がプロアントシアニジンから除去された。図３７は「画分７」のＩＲスペクトルを示し、図３８は「画分８」のＩＲスペクトルを示す。
【実施例１４】
【０１４１】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるプラム極性及び非極性プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、プラムから単離し、その６１％が極性と３９％が非極性と称された全プロアントシアニジン約１７％を含有する、「画分３」及び「画分４」の組合せであった。この組成物の一部（８．００ｇ）を、０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの水に溶解し、前述の４５ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液を収集し、該カラムを５０ｍＬの０．１％ＴＦＡで洗浄した。該装填溶離液及び洗浄画分を一緒にして極性プロアントシアニジン画分「画分５」を提供した。極性プロアントシアニジン「画分５」のＨＰＬＣを図３０に示す。該カラムを、０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの４０％メタノールに続けて０．５％ＴＦＡを含有する１００ｍＬの７０％メタノールで溶離した。すべてのメタノール画分を一緒にして非極性プロアントシアニジン画分（「画分６」）を提供した。表８はこの実験の結果をまとめたものである。
表８： プラム・プロアントシアニジンの精製
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
極性プロアントシアニジン「画分５」（装填溶離液と洗浄溶離液の組合せ）を実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、「画分７」を提供した。アントシアニン及び他のより極性的不純物の除去により、試料のプロアントシアニジン純度は１５％から１００％に増加した。精製された極性プロアントシアニジン「画分７」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図３１に示す。非極性「画分６」（４０％及び７０％メタノール洗浄液の組合せ）は更に精製しなかった。非極性プロアントシアニジン「画分６」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図３２に示す。図３９は「画分７」のＩＲスペクトルであり、図４０は「画分６」のＩＲスペクトルである。
【実施例１５】
【０１４４】
エルダーベリーＶＬＣ画分からのプロアントシアニジン画分の精製
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ−７１ｃｄ樹脂（ペンシルベニア州フィラデルフィア、８０〜１６０μｍ粒径、ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いてＶＬＣカラムを調製した。エルダーベリーの水抽出物を調製し、この抽出物の一部を該ＶＬＣカラム上に装填した。次に、該カラムを水で洗浄してから、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、及び１００％メタノールを用いて溶離した。メタノールで溶離されたすべての画分を別個に保持した。５０％メタノールで溶離されたＶＬＣ画分を回転蒸発器上で蒸発させてメタノールを除去してから、凍結乾燥させて水を除去した。乾燥物質を、乳鉢と乳棒を用いて粉末に粉砕した。該乾燥試料を、実施例１０に説明した方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。この分析の結果を用い、ＨＰＬＣ分析法から半分離用ＨＰＬＣ法を誘導してプロアントシアニジンを単離した。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．５％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。流速は３０ｍＬ／分にセットした。使用した階調度を表９に提供する。
表９．エルダーベリー・プロアントシアニジンの精製に対するＨＰＬＣ階調度
【０１４５】
【表９】
【０１４６】
該乾燥試料の約５００ｍｇを約５０ｍｇ／ｍＬの固体濃度で水に溶解した。関連ピークの滞留時間を判断するために非常に小さな注入を行った。この最初の注入に基づいて、二つのピーク、即ち、１４〜２２分で溶離されたピークＡ、及び２６〜２８分で溶離されたピークＢを収集した。濃縮溶液の５回の注入を行い、各注入から各ピークの適切な収集液をためた。ピークＡの収集により得られた試料はプロアントシアニジンを含有すると判断され、蒸発させて有機溶剤及び一部の水を除去した。濃縮試料を、実施例１０に説明したＨＰＬＣ法を用いて分析した。該試料のクロマトグラフィー純度は９３．９％であると測定された。次に該試料を凍結乾燥させて乾燥物質を得た。一旦乾燥したら、該試料の小部分を１．９１８ｍｇ／ｍＬの濃度で７０％エタノール中に送り込み、同じＨＰＬＣ法により再分析した。この分析の結果及び先に得られたクロマトグラフィー純度を用いて、ピーク面積応答係数を決めた。このデータは、他の精製画分中のプロアントシアニジン濃度を決めるのに用いた。プロアントシアニジン「標準」の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図１４に示す。
【実施例１６】
【０１４７】
ＶＬＣに続く半分離用ＨＰＬＣによるクランベリー・プロアントシアニジンの精製
この実施例の出発材料は、１４％の全プロアントシアニジンを含む８．００ｇの精製クランベリー抽出物（「画分３」＋「画分４」）であった。この材料を、１ｍＬのトリフルオロ酢酸を含有する１００ｍＬの水に溶解し、前述の５０ｍＬ Ｃ−１８ ＶＬＣカラム上に装填した。装填溶離液（１００ｍＬ）を収集し、５０ｍＬの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離液と一緒にして「画分５」を得た。次に、該カラムを１００ｍＬの４０％メタノールで洗浄して極性化合物残渣を除去してから１００ｍＬの７０％メタノールで溶離して非極性プロアントシアニジン「画分６」を得た。表１０はこの実験の結果をまとめたものである。
表１０．クランベリー・プロアントシアニジンの精製
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
極性プロアントシアニジン画分（装填溶離液 ＋ 洗浄液）を、実施例１２に説明した方法により半分離用ＨＰＬＣで更に精製して、「画分７」を得た。図４１は半分離用精製前の極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムであり、図４２は精製後の極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。図４３は非極性プロアントシアニジン画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロアントシアニジンの前に溶離されたアントシアニンのような極性非プロアントシアニジン化合物はこの方法において除去された。
【実施例１７】
【０１５０】
エルダーベリー画分の単純ヘルペス２型ウィルス分析
実施例６に説明したように単離した粗製エルダーベリー抽出物及び画分１，３並びに４の抗ウィルス活性を、ウィルス性細胞変性効果（ＣＰＥ）分析を用いて測定した。この分析は前に説明した（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｐ．Ｒｅｓ．２８：４６７−４７２（１９９３），Ｗｙｄｅ等）。すべての抗ウィルス活性は５０％効果量（ＥＤ５０）として報告される。
【０１５１】
表１１は、試験した四つの組成物に対するＣＰＥ阻害のためのＥＤ５０をまとめたものである。
表１１．エルダーベリー画分のＣＰＥ阻害のためのＥＤ５０
【０１５２】
【表１１】
【実施例１８】
【０１５３】
ウィルス分析
本発明により製造された本発明のフェノール化合物に富む組成物は、種々のＤＮＡウィルス及びＲＮＡウィルスに対して幅広い活性を示しており、人間及び動物における炎症を治療するのに有用な活性成分として適している。細胞培養において、該フェノール化合物に富む組成物は、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザＡ及びＢ型ウィルス、パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）、並びに他の呼吸系ウィルス及び単純ヘルペスウィルスの分離株や実験室株に対して強力活性を示す。フェノール化合物に富む組成物は、人間及び動物における広範囲のウィルス性感染症を治療するのに有用な活性成分として適している。
【０１５４】
各ウィルスに対する活性を測定するのに用いられる分析は、当業者に周知である。細かに切られた特定の目的組織を希望のウィルスに曝し、該ウィルスの成長割合を試験物質の存在下及び非存在下で測定した。フェノール化合物を含有する種々の植物原料から製造した精製プロアントシアニジンに富む組成物の抗ウィルス活性を測定した。
【０１５５】
細胞系： ウィルス分析は、相対的なＥＤ５０（５０％効果量）又は５０％抑制終点を測定するのに以下の細胞系を使用した： ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）及びＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）分析は、アフリカのミドリザルの腎臓を起源とするＭＡ−１０４細胞を使用し；インフルエンザＡ及びＢ分析は、犬の腎臓を起源とするＭＤＣＫ細胞を使用し；鼻炎ウィルス属分析はＨｅＬａ及びＫＢ細胞を使用し；単純ヘルペス１および２型ウィルス分析は、人間の包皮繊維芽細胞から採ったＨＨＦ細胞を使用し；西ナイルウィルス分析は、アフリカのミドリザルの腎臓から採ったＶｅｒｏ細胞を使用し；アデノウィルス１型分析は、人間の肺癌腫を起源とするＡ５４９細胞を使用し；そしてパンタトロウィルスＡ分析は、アカゲザルの腎臓を起源とするＬＬＣ−ＭＫ２細胞を使用した。
【０１５６】
該分析は、正の対照として公知の医薬品標準（リビバリン又はアシクロビール）を使用した。本実施例で用いた分析におけるリビバリンに対するＥＤ５０は以下の通りである： ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； ＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； インフルエンザＡ及びＢ分析ＥＤ５０＝２−３μｇ／ｍＬ； 鼻炎ウィルス属分析ＥＤ５０＜１μｇ／ｍＬ； 西ナイルウィルス分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ； アデノウィルス１型分析ＥＤ５０＝１０μｇ／ｍＬ； 及びパンタトロウィルスＡ分析ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍＬ。単純ヘルペス１および２型ウィルス分析は正の対照としてアシクロビールを使用したが、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２分析におけるＥＤ５０は１−２μｇ／ｍＬである。
【０１５７】
本発明のいくつかの組成物に対するウィルス分析で得られたデータを表１２に提供する。細胞培養において、該組成物は、インフルエンザＡ型ウィルス（株Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ３）、インフルエンザＢ型ウィルス、アデノウィルス１型、パンタトロＡ型ウィルス、及び鼻炎ウィルス属２型の分離株や実験室株に対して強力活性を示した。表１２における生物活性データを抗ウィルス判別検査におけるアシクロビール及びリバビリンと比較すると、本発明の組成物はこれらの分析において生物学的に活性であり、これらのウィルス性の病気を治療するのに使用されている確立された医薬品と競い合っても引けをとらないことが明白に示されている。
表１２： 種々の抗ウィリス分析における種々の画分のＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
【０１５８】
【表１２】
【実施例１９】
【０１５９】
フェノール化合物に富む組成物のＣＯＸ−２活性の評価
シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）は、アラキドン酸や他の必須脂肪酸を種々のプロスタグランジンに変換する触媒作用をする。プロスタグランジンは哺乳類における炎症を引起こすホルモン状物質である。ＣＯＸ−２酵素を阻害することにより、組織内の炎症を最小の副作用で減少させることが出来る。他方、ＣＯＸ−１の阻害は、胃潰瘍化や身体内における他の望ましくない副作用を引起こす。ＣＯＸ−１酵素の完全な阻害は望ましくない。ＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する化合物がより良い抗炎症剤である。植物原料から製造した本発明のフェノール化合物に富む組成物は、ＣＯＸ−２酵素を阻害することが示されており、人間及び動物における炎症を治療するのに有用な活性成分として適している。
【０１６０】
この分析においては、分析すべき物質を、希望する酵素を含有することが知られている特定のマウス又はウシの細かに切られた器官組織と混合した。この混合物にアラキドン酸を添加した。酸素の吸収割合を測定し公知のＣＯＸ阻害剤に関して観察した吸収割合と比較する。ＣＯＸ−２分析は、人間の組換え型ＣＯＸ−２ポジティブ細胞を用いたアラキドン酸からの定量的ＰＧＥ２生成に基づいている。
【０１６１】
いくつかの組成物に対する結果を表１３に示す。表１３に示した組成物に対するデータを公知の医薬品標準（アスピリン及びインドメタシン）の測定ＣＯＸ−２生物活性と比較すると、本発明の精製プロアントシアニジンに富む組成物はＣＯＸ−２分析において生物学的に活性であることが明白に示されている。アスピリンは６６０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−２に対して活性であり、２４０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−１に対して活性である。インドメタシンは１０μｇ／ｍＬでＣＯＸ−２に対して活性である。従って、表１３中の組成物は、ＣＯＸ−２分析において、最も普通に使用されている炎症処理剤（即ち、アスピリン）に対して２．５〜６倍の効力増加を示し、本発明の精製プロアントシアニジンに富む組成物が哺乳類における炎症を治療するのに有用であることを示している。
表１３．プロアントシアニジンに富む組成物に対するＣＯＸ−２活性
【０１６２】
【表１３】
【実施例２０】
【０１６３】
プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂を用いたプラム濃縮物の精製
２７５ｇのプラム濃縮物（カリフォルニア州ユバ市、Ｓｕｎｓｗｅｅｔ）に１４６０ｍＬの室温水を添加した。該混合物を充分に混合してから４ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、次に該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１６４】
該濾過溶液（１．７Ｌ）を、第三級アミン置換ポリスチレン樹脂（ミシガン州ミッドランド、ダウケミカル、Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２）を含有する調整平衡化カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．５ｍＬ／分（１時間当り０．５３カラム容量）の流速で装填した。該調製材料のすべてを該カラム上に装填してから、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。該カラムを、６カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離した。各溶離溶剤は０．０３８％硫酸まで酸性化した。両方の溶離液を一試料として収集し全フェノール化合物に対して分析した。フェノール化合物の不完全な回収が示されたこの分析結果に基づいて、該カラムを更に２．５カラム容量の５０％エタノールで洗浄し、該単離溶離液を先の溶離液と一緒にした。一緒にされた該溶離液を蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。これらの画分から得られた乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて、全フェノール化合物に対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。
【０１６５】
単離された該精製プラム抽出物質は、生成物画分に対して２２．４重量％の全フェノール化合物及び５．１％のプロアントシアニジンを含んでいた。該精製プラム抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを図４４に示す。該カラムに対する全回収は、全フェノール化合物に対して約９１％でありプロアントシアニジンに対して９５％であった。図４５は、比較の為に臭素化ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％エタノール溶離画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【実施例２１】
【０１６６】
未置換芳香族ポリマー樹脂を用いたプラム濃縮物の精製
５１９ｇのプラム濃縮物（カリフォルニア州ユバ市、Ｓｕｎｓｗｅｅｔ）に２７５０ｍＬの室温水を添加した。該混合物を充分に混合してから７ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、次に該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１６７】
該濾過溶液（３．２７Ｌ）を、ＳＰ−７０，未置換ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体樹脂（日本東京、三菱ケミカル）を含有する調整平衡化カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．５ｍＬ／分（１時間当り０．５３カラム容量）の流速で装填した。装填は流出物中のポリフェノールの濃度がカラム供給物中の濃度の１８％になるまで続け、その点で装填を停止し、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。該カラムを、５カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離したが、各々は０．０３８％の硫酸を含有していた。該溶離液を別個に収集し、蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。５０％エタノール溶離液からの乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて、全フェノール化合物に対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。９０％エタノール画分からの乾燥物質は分析しなかった。
【０１６８】
該精製プラム物質は、５０％エタノール画分に対して３４重量％の全フェノール化合物及び４．９％のプロアントシアニジンを含んでいた。該カラムに対する全回収は、全ポリフェノールに対して約９５％でありプロアントシアニジンに対して１００％を超えていた。
【実施例２２】
【０１６９】
プロトン化三級アミン置換ポリスチレン樹脂を用いたクランベリー濃縮物の精製
１３０ｍＬの濃縮物（ワシントン州オセロ、ＳＶＺ ＵＳＡ）に１７００ｍＬの室温水を添加した。使用した１３０ｍＬの濃縮物は、１０６ｍＬの一つのクランベリー濃縮物（ロット♯０２−１３７７）と２４ｍＬの他のクランベリー濃縮物（ロット♯０２−１１１５５）から成っていたが、両方とも同じ源からのものであった。該混合物を充分に混合してから３ｍＬの濃硫酸を添加することにより酸性化し、その後該酸性化溶液をワットマン♯１紙フィルターに通して濾過した。
【０１７０】
該濾過溶液（１．８３Ｌ）を、第三級アミン置換ポリスチレン樹脂、Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２（ミシガン州ミッドランド、ダウケミカル）を含有する調整平衡化樹脂カラム（０．９６メートル、１７０ｍＬ）上に約１．８ｍＬ／分（１時間当り０．６３カラム容量）の流速で装填した。該調製材料のすべてを該カラム上に装填した。装填後、該カラムを０．０３８％硫酸含有水で洗浄した。
【０１７１】
該カラムを、６カラム容量の５０％エタノール／水で、次に５カラム容量の９０％エタノール／水で溶離した。各溶離溶剤は０．０３８％硫酸まで酸性化した。両方の溶離液を一試料として収集し分析した。一緒にされた該溶離画分を蒸発させてエタノール及びいくらかの水を除去してから、凍結乾燥器上に４８時間置いた。該乾燥物質を、ホリン・シオカルトー分光光度測定法（没食子酸標準に対して７６０ｎｍにおける吸収）を用いて全フェノール化合物に対して分析し、塩化シアニジン標準に対して５３５ｎｍにおける吸収（１０１．１吸収単位／ｍｇ／ｍＬ）の標準分光光度測定によりアントシアニンに対して分析した。この同じ乾燥画分は又、本明細書に説明されているようにＨＰＬＣ法（カテキン標準に対して２８０ｎｍにおける吸収）を用いて、プロアントシアニジンに対しても分析した。該精製クランベリー抽出物質は、生成物画分に対して３０．３重量％の全フェノール化合物、１．８％のアントシアニン、及び１２．９％のプロアントシアニジンを含んでいた。
【０１７２】
図４６及び４７は、クランベリーの５０％と９０％エタノール溶離画分の組合せの、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍ夫々におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図４６及び４７におけるＨＰＬＣクロマトグラムを、臭素化樹脂から溶離したクランベリー抽出物の２８０ｎｍ及び５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラム（夫々図４８及び４９）と比較すると、非常にわずかな相違が示される。これらの相違は、分析時の条件及び出発原料間に存在するわずかな変動にさかのぼることが出来る。
【実施例２３】
【０１７３】
本発明により更なる植物原料を抽出し精製してプロアントシアニジンに富む組成物を提供した。本発明の方法により製造した精製プロアントシアニジン組成物の限定されない例を表１４に示す。示されたプロアントシアニジンのパーセントは精製組成物中の重量パーセントである。
【０１７４】
【表１４】
【実施例２４】
【０１７５】
プロアントシアニジンのパーセントを測定するための代替定量的ＨＰＬＣ法
種々の画分及びフェノール化合物に富む組成物中のプロアントシアニジンの量を測定するのに使用されるこの代替ＨＰＬＣ法は、外部標準としてカテキンを使用する。各タイプの試料は異なる調製を必要とするので、実施例９で説明したように調製する。該方法は、１５０ｘ４．６ｍｍのカラムにＳｔａｂｌｅｂｏｎｄ ＳＢＣ−１８を詰め込んだ５μｍ Ｚｏｒｂａｘカラムを使用する。流速は１．５ｍＬ／分であり、検出器は２８０ｎｍにセットし、注入容量は１０μＬであり、そして運転時間は２４分であった。移動相は、チャネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャネルＢ＝水中０．１％トリフルオロ酢酸；チャネルＣ＝１００％メタノールであった。使用した階調度を表１５に提供する。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラムにおいて幅広いピーク群として典型的に溶離された。
表１５．プロアントシアニジンの％分析のためのＨＰＬＣ階調度
【０１７６】
【表１５】
【０１７７】
カテキン標準を調製するために、１００ｍＬ容量のフラスコ中に１００ｍｇのカテキン（ウィスコンシン州ミルウォーキー、Ａｌｄｒｉｃｈ）を正確に秤量する。７０ｍＬの５０％メタノール／水を添加し、溶解するまで５分間音波破砕する。５０％メタノール／水を用いて一杯になるまで希釈し、蓋をしてから均質になるまで混合する。調製した標準は、この実施例で説明したＨＰＬＣ法を用いて分析する。次に、式１０に示されているように、カテキン標準に対するピーク面積応答係数を、該ピーク面積を標準溶液濃度とその純度の積で割ることにより決定する。
【０１７８】
【数１０】
【０１７９】
［式中、ＲＦ＝標準に対するピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡ＝該クロマトグラムにおけるカテキンピークのピーク面積、ＣＳＴＤ＝ｍｇ／ｍＬで表した標準溶液の濃度、そしてＰＳＴＤ＝パーセントとしての標準物質純度（通常０．９８）。］
【０１８０】
試料中のプロアントシアニジンのパーセントは、上述の試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて測定することが出来る。問題の試料に対して、１１〜２２分の滞留時間範囲における全ピーク面積を測定する。しかしながら、いかなる計算をする前にも、プロアントシアニジン滞留時間範囲における非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、端から端までの全ピーク面積から引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、幅広いプロアントシアニジンのピークと共に溶離する鋭いピークとして又は該ピークの頂上における鋭いピークとして頻繁に現れ、それらのダイオードアレーによるＵＶスペクトルはプロアントシアニジンのピークの大部分としばしば異なる。非プロアントシアニジンのピーク面積を測定するには、これらのピークを手作業で積分し、それらのピーク面積を合計し、次にこの面積を１１〜２２分の全ピーク面積から引く。試料中のプロアントシアニジンのピーク正味面積が一旦測定されたら、式１１に示されるように、この値を組織内標準に対するピーク面積応答係数で割って試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る。
【０１８１】
【数１１】
【０１８２】
［式中、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝試料中全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＰＡＳＡＭＰ＝試料に対する訂正全ピーク面積、ＤＦ＝希釈係数（乾燥バイオマスに対して１、新鮮／冷凍バイオマスに対して２、そしてフェノール化合物に富む組成物に対して１）、そしてＲＦ＝式１０を用いて計算されたピーク面積応答係数。］
【０１８３】
全プロアントシアニジンの％は式１２に示されるように計算される。
【０１８４】
【数１２】
【０１８５】
［式中、％Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ＝試料中全プロアントシアニジンのパーセント、ＣＰＲＯＡＮＴＨＯＳ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ｖ＝試料調製液の容量（通常、乾燥バイオマスに対しては２５０ｍＬ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては１００ｍＬ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては１０ｍＬ）、そしてＷＳ＝試料調製に用いたバイオマス又はフェノール化合物に富む組成物の重量（通常、乾燥バイオマスに対しては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスに対しては５００〜１５００ｍｇ、又はフェノール化合物に富む組成物に対しては５０〜１００ｍｇ）。］
【０１８６】
前述の記載は本発明の原理を説明しているに過ぎないと考えられる。更に、多数の修正や変更が当業者の頭には容易に浮かぶであろうから、本発明を上述の正確な構成や方法に限定することは希望しない。従って、あらゆる適当な修正や均等物は別紙特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に入ると考えることが出来る。
【０１８７】
用語「含む」は、本明細書及び別紙特許請求の範囲で使用されている場合、記載された特色、整数、成分、又は工程の存在を特定することを意図しているが、他の一つ以上の特色、整数、成分、工程、又はそれらの群の存在又は追加を除外しない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】本発明の方法によりフェノール化合物に富む組成物を製造する方法の一態様のフローチャートである。
【図２】ビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】ビルベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】ブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ブルーベリーから製造したフェノール化合物に富む組成物（「画分３」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】濾過されたエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】濾過されたエルダーベリー抽出物の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】濾過されたエルダーベリー抽出物をカラム装填している間に溶離された第一画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】濾過されたエルダーベリー抽出物をカラム装填している間に溶離された第一画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に７０％エタノールで溶離された第三画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に７０％エタノールで溶離された第三画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に９０％エタノールで溶離された第四画分の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂上でカラム精製している間に９０％エタノールで溶離された第四画分の５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４】実施例１０で説明したように調製したプロアントシアニジン標準の代替ＨＰＬＣ法を用いたＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】極性プロアントシアニジンを非極性プロアントシアニジンから分離する方法のフローチャートである。
【図１６】濾過されたエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの流過画分及び洗浄画分の組合せから単離したエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから６０％メタノール溶離液中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】半分離用ＨＰＬＣ精製後に単離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】半分離用ＨＰＬＣによる精製後のエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムであるが、そこで非プロアントシアニジンのピークは星印でマークされている。
【図２２】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２４】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の３６８ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにおける精製後のエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２６】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２７】半分離用ＨＰＬＣ精製後のブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２８】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２９】半分離用ＨＰＬＣ精製後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３０】半分離用ＨＰＬＣ精製前であってＣ−１８媒体におけるＶＬＣクロマトグラフィー中に単離されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３１】半分離用ＨＰＬＣ精製後のプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３２】ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから４０％及び７０％メタノール溶離中に単離されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３３】精製されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３４】精製されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３５】精製されたクランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３６】精製されたクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３７】精製されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図３８】精製されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分８」）のＩＲスペクトルである。
【図３９】精製されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）のＩＲスペクトルである。
【図４０】精製されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）のＩＲスペクトルである。
【図４１】半分離用ＨＰＬＣ精製前のクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分５」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４２】半分離用ＨＰＬＣ精製後のクランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「画分７」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４３】クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「画分６」）の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４４】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４５】臭素化ポリスチレン樹脂からプラム濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４６】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４７】プロトン化第三級アミン置換ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４８】臭素化ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４９】臭素化ポリスチレン樹脂からクランベリー濃縮物の溶離中に収集された５０％及び９０％エタノール溶離画分の組合せの５１０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５０】精製された黒ラズベリー組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５１】精製されたイチゴ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５２】精製されたザクロ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５３】精製されたオリーブ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５４】精製されたクロフサスグリ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５５】精製されたサクランボ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５６】精製されたブドウ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５７】精製されたリンゴ組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５８】精製されたバナナ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５９】精製されたサンザシの実組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６０】精製されたマンゴスチン殻組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６１】精製されたオレンジ皮組成物の２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール化合物に富む組成物を製造する方法において、
ａ） フェノール化合物を含有する１種以上の植物原料の粗製抽出物であって、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を用意し、
ｂ） 前記粗製抽出物を濾過し、
ｃ） 前記フェノールを放出できるように吸着するが前記極性非フェノール化合物は保持しないポリマー樹脂であって、１個以上の電子吸引性基で置換された芳香族環を含む該樹脂に、前記の濾過された抽出物を接触させ、
ｄ） 前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、
ｅ） 該樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノール化合物を含有する第一画分を収集し、
ｆ） 該樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノール化合物を含有する第二画分を収集し、そして
ｇ） 工程ｅ）又は工程ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程ｅ）及びｆ）から前記画分を組合せて、フェノール化合物に富む組成物であって、前記極性非フェノール化合物の量が実質的に激減している該組成物を得る、
ことを特徴とする前記製造方法。
【請求項２】
前記電子吸引性基がＦ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，プロトン化アルキルアミン、スルホン酸、トリハロメチル、ＣＯＯＨ，ＮＯ２及びＣＮから成る群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記樹脂がプロトン化第三級アミン置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記粗製抽出物が、乾燥した又は新鮮な植物原料を酸性化抽出溶剤で抽出することにより製造される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記の酸性化抽出溶剤が、約０〜９５％のエタノール及び約０〜３％の酸を有する水溶液、又は、約０〜１００％のメタノール及び約０〜３％の酸を有する水溶液を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
前記酸が硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記洗浄溶離剤が少なくとも０．００３％の酸を含有する、請求項１の方法。
【請求項８】
前記酸が酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項７の方法。
【請求項９】
前記第一溶離剤が水中に約５０〜７０％のエタノール及び０．００３％の酸を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記酸が酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記第二溶離剤が水中に約７０〜９０％のエタノールを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記組成物が約１０〜８０％の前記フェノール化合物を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記組成物が少なくとも１２％の前記フェノール化合物を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記組成物が少なくとも２５％の前記フェノール化合物を含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、スグリ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）が前記粗製抽出物にペクチナーゼを添加することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記ペクチナーゼが前記植物原料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記組成物に付形剤を添加することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記付形剤が防腐剤、担体、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び香料添加剤から成る群から選択される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１の方法において、
ｈ） 工程ｅ）からの前記組成物、工程ｆ）からの前記組成物、又は工程ｇ）からの前記組成物を、逆相親油性樹脂が充填された低圧真空液体クロマトグラフィーカラム上に供給し、該供給中に溶離する画分を収集し、
ｉ） 前記樹脂を水で溶離し、
ｊ） 工程ｈ）及びｉ）からの画分を組合せて極性プロアントシアニジンに富む第一組成物を得、そして
ｋ） 前記樹脂を増加する量の極性有機溶剤で溶離して非極性プロアントシアニジンに富む第二組成物を得る、
ことを更に含む前記方法。
【請求項２１】
前記第一組成物を逆相分離用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製して実質的にアントシアニンの存在しない前記のより極性のプロアントシアニジンを得ることを更に含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記第二組成物をゲル濾過又は分離用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製して実質的にアントシアニンの存在しない前記のより極性の低いプロアントシアニジンを得ることを更に含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
フェノール化合物に富む、精製された、植物原料に基づく組成物。
【請求項２４】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、クランベリー、ブルーベリー、エルダーベリー、プラム、ラズベリー、イチゴ、ザクロ、オリーブ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、サクランボ、ブドウ、リンゴ、バナナ、サンザシ、マンゴスチン、オレンジの皮、及び西洋スグリから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
前記組成物の約５〜３０重量％のプロアントシアニジンを含む、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
請求項１の方法により製造した組成物を有効量投与することを特徴とする、感染微生物又は感染菌により引起こされる哺乳類の症状を治療する方法。
【請求項２７】
前記微生物がインフルエンザ・ウィルスＡ型、インフルエンザ・ウィルスＢ型、ライノウィルス２型、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザ・ウィルス、西ナイルウィルス、水痘・帯状疱疹ウィルス、鼻炎ウィルス属２型、アデノウィルスＩ型、及びパンタトロＡウィルスから成る群から選択されるウィルスである、請求項２６の方法。
【請求項２８】
請求項１の方法により得た組成物を有効量投与することを特徴とする、非ウィルス性微生物感染により引起こされる哺乳類の症状を治療する方法。
【請求項２９】
請求項１の方法により得た組成物を肉製品に病原体の成長を抑制するのに有効な量で添加することを特徴とする、肉製品における病原体の成長を抑制する方法。
【請求項３０】
プロアントシアニジンに富む組成物を製造する方法において、
（ａ） プロアントシアニジンを含有する１種以上の植物原料を溶剤で抽出して、フェノール化合物を含有する粗製抽出物であって、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の小フェノール系誘導体及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を提供し、
（ｂ） 該粗製抽出物をサイズ除外濾過以外の手段により濾過し、
（ｃ） 前記アントシアニンを保持し前記プロアントシアニジンを放出できるように吸着するが該極性非フェノール化合物は実質的に保持しない未置換芳香族環を含む樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、
（ｄ） 前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、
（ｅ） 該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第一画分を収集し、
（ｆ） 該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第二画分を収集し、そして
（ｇ） 工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、前記プロアントシアニジンに富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得る、
ことを特徴とする前記製造方法。
【請求項３１】
前記樹脂がポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記接触工程及び洗浄工程を大体室温で行う、請求項３３の方法。
【請求項３３】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、スグリ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項３０の方法。
【請求項１】
フェノール化合物に富む組成物を製造する方法において、
ａ） フェノール化合物を含有する１種以上の植物原料の粗製抽出物であって、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を用意し、
ｂ） 前記粗製抽出物を濾過し、
ｃ） 前記フェノールを放出できるように吸着するが前記極性非フェノール化合物は保持しないポリマー樹脂であって、１個以上の電子吸引性基で置換された芳香族環を含む該樹脂に、前記の濾過された抽出物を接触させ、
ｄ） 前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、
ｅ） 該樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノール化合物を含有する第一画分を収集し、
ｆ） 該樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノール化合物を含有する第二画分を収集し、そして
ｇ） 工程ｅ）又は工程ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程ｅ）及びｆ）から前記画分を組合せて、フェノール化合物に富む組成物であって、前記極性非フェノール化合物の量が実質的に激減している該組成物を得る、
ことを特徴とする前記製造方法。
【請求項２】
前記電子吸引性基がＦ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，プロトン化アルキルアミン、スルホン酸、トリハロメチル、ＣＯＯＨ，ＮＯ２及びＣＮから成る群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記樹脂がプロトン化第三級アミン置換スチレン・ジビニルベンゼン共重合体である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記粗製抽出物が、乾燥した又は新鮮な植物原料を酸性化抽出溶剤で抽出することにより製造される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記の酸性化抽出溶剤が、約０〜９５％のエタノール及び約０〜３％の酸を有する水溶液、又は、約０〜１００％のメタノール及び約０〜３％の酸を有する水溶液を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
前記酸が硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記洗浄溶離剤が少なくとも０．００３％の酸を含有する、請求項１の方法。
【請求項８】
前記酸が酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項７の方法。
【請求項９】
前記第一溶離剤が水中に約５０〜７０％のエタノール及び０．００３％の酸を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記酸が酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記第二溶離剤が水中に約７０〜９０％のエタノールを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記組成物が約１０〜８０％の前記フェノール化合物を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記組成物が少なくとも１２％の前記フェノール化合物を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記組成物が少なくとも２５％の前記フェノール化合物を含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、スグリ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）が前記粗製抽出物にペクチナーゼを添加することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記ペクチナーゼが前記植物原料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記組成物に付形剤を添加することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記付形剤が防腐剤、担体、緩衝剤、増粘剤、沈澱防止剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び香料添加剤から成る群から選択される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１の方法において、
ｈ） 工程ｅ）からの前記組成物、工程ｆ）からの前記組成物、又は工程ｇ）からの前記組成物を、逆相親油性樹脂が充填された低圧真空液体クロマトグラフィーカラム上に供給し、該供給中に溶離する画分を収集し、
ｉ） 前記樹脂を水で溶離し、
ｊ） 工程ｈ）及びｉ）からの画分を組合せて極性プロアントシアニジンに富む第一組成物を得、そして
ｋ） 前記樹脂を増加する量の極性有機溶剤で溶離して非極性プロアントシアニジンに富む第二組成物を得る、
ことを更に含む前記方法。
【請求項２１】
前記第一組成物を逆相分離用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製して実質的にアントシアニンの存在しない前記のより極性のプロアントシアニジンを得ることを更に含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記第二組成物をゲル濾過又は分離用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製して実質的にアントシアニンの存在しない前記のより極性の低いプロアントシアニジンを得ることを更に含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
フェノール化合物に富む、精製された、植物原料に基づく組成物。
【請求項２４】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、クランベリー、ブルーベリー、エルダーベリー、プラム、ラズベリー、イチゴ、ザクロ、オリーブ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、サクランボ、ブドウ、リンゴ、バナナ、サンザシ、マンゴスチン、オレンジの皮、及び西洋スグリから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
前記組成物の約５〜３０重量％のプロアントシアニジンを含む、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
請求項１の方法により製造した組成物を有効量投与することを特徴とする、感染微生物又は感染菌により引起こされる哺乳類の症状を治療する方法。
【請求項２７】
前記微生物がインフルエンザ・ウィルスＡ型、インフルエンザ・ウィルスＢ型、ライノウィルス２型、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザ・ウィルス、西ナイルウィルス、水痘・帯状疱疹ウィルス、鼻炎ウィルス属２型、アデノウィルスＩ型、及びパンタトロＡウィルスから成る群から選択されるウィルスである、請求項２６の方法。
【請求項２８】
請求項１の方法により得た組成物を有効量投与することを特徴とする、非ウィルス性微生物感染により引起こされる哺乳類の症状を治療する方法。
【請求項２９】
請求項１の方法により得た組成物を肉製品に病原体の成長を抑制するのに有効な量で添加することを特徴とする、肉製品における病原体の成長を抑制する方法。
【請求項３０】
プロアントシアニジンに富む組成物を製造する方法において、
（ａ） プロアントシアニジンを含有する１種以上の植物原料を溶剤で抽出して、フェノール化合物を含有する粗製抽出物であって、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の小フェノール系誘導体及び極性非フェノール化合物を含む該抽出物を提供し、
（ｂ） 該粗製抽出物をサイズ除外濾過以外の手段により濾過し、
（ｃ） 前記アントシアニンを保持し前記プロアントシアニジンを放出できるように吸着するが該極性非フェノール化合物は実質的に保持しない未置換芳香族環を含む樹脂に、該粗製抽出物を接触させ、
（ｄ） 前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄して前記極性非フェノール化合物を溶離し、
（ｅ） 該樹脂を第一溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第一画分を収集し、
（ｆ） 該樹脂を第二溶離剤で溶離し、前記プロアントシアニジンを含有する第二画分を収集し、そして
（ｇ） 工程（ｅ）又は工程（ｆ）から該画分を単離して、或いは、工程（ｅ）及び（ｆ）から前記画分を組合せて、前記プロアントシアニジンに富み前記極性非フェノール化合物が実質的に激減している組成物を得る、
ことを特徴とする前記製造方法。
【請求項３１】
前記樹脂がポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記接触工程及び洗浄工程を大体室温で行う、請求項３３の方法。
【請求項３３】
前記植物原料が、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、黒イチゴ、イチゴ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、クランベリー、サクランボ、赤ラズベリー、黒ラズベリー、ブドウ、スグリ、ハイビスカスの花、ピーマン、インゲン豆、エンドウ豆、赤キャベツ、紫トウモロコシ、紫サツマイモ、オリーブ、ザクロ、マンゴスチン、リンゴ、サンザシ、西洋スグリ、及びオレンジから成る群から選択され、該植物原料全体又はそれらの表皮，皮、果実、実、殻又は種子を含む、請求項３０の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【公表番号】特表２００７−５１８８１２（Ｐ２００７−５１８８１２Ａ）
【公表日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１３１１（Ｐ２００６−５５１３１１）
【出願日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００１９８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２７６２
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２５１１１１）フェノーリックス、エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００１９８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２７６２
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２５１１１１）フェノーリックス、エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
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