保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物
【課題】 皮膚外用剤や機能性経口組成物などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤を提供する。
【解決手段】 コモチシダ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供することにより、上記課題を解決することを見いだしたものである。
【解決手段】 コモチシダ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供することにより、上記課題を解決することを見いだしたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、皮膚の乾燥を防ぎ、皮膚にうるおいを与える保湿成分を提供するために、様々な有効成分の配合検討がなされてきた。また、加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線などによる細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の保湿効果と安全性に優れた保湿剤としてハリブキ属植物の抽出物（特許文献１参照）、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献２参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献３参照）、クロレラ抽出物（特許文献４参照）、ビワ抽出物（特許文献５参照）等が開示されている。抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献６参照）等が、生体内の脂肪蓄積を抑制する成分としては、シッポゴケ科植物の抽出物（特許文献７参照）等が、美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献８参照）等が、抗炎症作用を有する植物エキスとして、蘇葉、カカオ及び茴香の乾燥物又はその熱水抽出エキス（特許文献９参照）、カンナ科植物の溶媒抽出物（特許文献１０参照）等が、免疫賦活剤としては、ニラの種子及び／又はその抽出物（特許文献１１参照）等が、それぞれすでに知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７７０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献４】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献５】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献６】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献７】特開２００５−６０３４５号公報
【特許文献８】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献９】特開２００３−２０１２４６号公報
【特許文献１０】特開平４−２７０２２４号公報
【特許文献１１】特開２００８−３１１２２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来はその効果が知られていなかったコモチシダ属植物またはその抽出物に優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、コモチシダ属植物より選ばれる少なくとも１種の植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、コモチシダ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を配合することにより、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いるコモチシダ属植物は、シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）に属する多年草で、宮城県以南・富山県以西の本州、四国、九州に分布し、ヨーロッパやアメリカでは観賞用にされている。コモチシダ属には、アイオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ × ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ Ｈ．Ｃｈｒｉｓｔ）、アイコモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． × Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）、イズコモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ × ｉｚｕｅｎｓｉｓ Ｓａ．Ｋｕｒａｔａ）、オオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｌ．ｆ．） Ｊ．Ｓｍ．）、オオギミシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｈａｒｌａｎｄｉｉ Ｈｏｏｋ．）、コモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ．）、ハイコモチシダ（別名：ジョウレンシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｕｎｉｇｅｍｍａｔａ （Ｍａｋｉｎｏ） Ｎａｋａｉ）、ハチジョウカグマ（別名：タイワンコモチシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）、トサノオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｌ． ｆｉｌ．） Ｓｍ． ｖａｒ． ｌａｔｉｓｅｃｔａ Ｔａｇａｗａ）、およびホソバオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｋｅｍｐｉｉ Ｃｏｐｅｌ．）が知られている。
【００１０】
本発明は、コモチシダ属植物であれば特に限定されないが、本発明の効果の点から適当なものとして、ハチジョウカグマ（別名：タイワンコモチシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）が挙げられる。
【００１１】
これらコモチシダ属植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、胞子体、配偶体のいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、胞子体の全草、根、全葉、葉身、葉柄などを用いるとよい。好ましくは、葉身、葉柄などを含む全葉がよい。
【００１２】
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１３】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり、抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、好ましくは、水、エタノールがよい。これらは単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種または２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよく、好ましくは、二酸化炭素がよい。
【００１５】
コモチシダ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。あるいは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。コモチシダ属植物の前記抽出物やその処理物および分画物は、各処理および分画後に凍結乾燥し、用時溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１６】
コモチシダ属植物またはその抽出物は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物として利用することができる。
【００１７】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞のアルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【００１８】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩのコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞のＡＴＰ産生促進作用、ヒト表皮角化細胞の賦活作用、およびヒト表皮角化細胞タイプＩＶのコラーゲン産生促進作用を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１９】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れた過酸化脂質耐性、ラジカル消去作用、スーパーオキサイドアニオン消去作用を有し、優れた抗酸化効果を発揮する。
【００２０】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤は、優れたヒト前駆脂肪細胞の中性脂肪蓄積抑制作用を有し、優れた痩身効果を発揮する。
【００２１】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたヒト表皮メラニン細胞のチロシナーゼ活性阻害作用およびＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防・改善して、優れた美白効果を発揮する。
【００２２】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、優れた抗炎症効果を発揮する。
【００２３】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする免疫賦活剤は、ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用を有し、優れた免疫賦活効果を発揮する。
【００２４】
コモチシダ属植物またはその抽出物を含有する皮膚外用剤は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果などを発揮する。
【００２５】
コモチシダ属植物またはその抽出物を含有する機能性経口組成物は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果などを発揮する。
【００２６】
これらの各剤は、コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他成分の配合の有無等については、何ら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状または粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、またはその他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤または分散剤等）を任意に含むことができる。
【００２７】
ここで皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品または外用医薬品等の皮膚または毛髪に外用される全ての外用組成物を意味している。機能性経口組成物についても、医薬品、食品または飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２８】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローション等の可溶化系、カラミンローション等の分散系、またはクリームや乳液等の乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤またはパップ剤等の種々の剤型で提供することもできる。
【００２９】
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料またはメイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤またはパップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品または外用医薬品などが例示できる。
【００３０】
機能性経口組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品（サプリメント）または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤またはエキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００３１】
皮膚外用剤または機能性経口組成物には、コモチシダ属植物またはその抽出物の他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料および洗浄料等に通常配合される任意の成分、例えば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、またはアルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤あるいはコモチシダ属植物以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。
【００３２】
飲食品等の経口組成物の場合も、経口用として通常用いられる各種成分との組み合わせにおいて、特に限定されるものではない。
【００３３】
コモチシダ属植物またはその抽出物の皮膚外用剤または機能性経口組成物への配合量は、種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して固形分換算で、好ましくは０．０００１〜１０．０質量％であり、より好ましくは０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【００３４】
以下にコモチシダ属植物抽出物の調製例、保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果および免疫賦活効果を評価するための試験方法、皮膚外用剤または機能性食品としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００３５】
［抽出物１］
ハチジョウカグマの新葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。
【００３６】
［抽出物２］
ハチジョウカグマの古葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。
【００３７】
［抽出物３］
ハチジョウカグマの新葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、１２０℃で２０分間抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、抽出物３を得た。
【００３８】
［抽出物４］
ハチジョウカグマの古葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、１２０℃で２０分間抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、抽出物４を得た。
【００３９】
［抽出物５］
ハチジョウカグマの新葉を乾燥させて粉砕し、セルに充填する。２時間、２５Ｍｐａ、４０℃、５ｍＬ／分の条件で液化二酸化炭素をセルに送液し抽出物５を得た。
【００４０】
［抽出物６］
ハチジョウカグマの古葉を乾燥させて粉砕し、セルに充填する。２時間、２５Ｍｐａ、４０℃、５ｍＬ／分の条件で液化二酸化炭素をセルに送液し抽出物６を得た。
【００４１】
ここで言う、新葉とは赤みのある葉を用い、古葉とは緑色の葉を用いた。上記抽出物を用いて、各効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊および＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【実施例１】
【００４２】
＜保湿効果（ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表１に示す各濃度となるように抽出物３を添加したサンプル培養液に交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）熱水抽出物（抽出物３）は有意な保湿効果が認められた。
【実施例２】
【００４５】
＜保湿効果（ヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後１．２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地（分化誘導培地）にて表２に示す各濃度に抽出物５を添加したサンプル培養液に交換し、さらに９日間培養した。培地交換は３日に１回のペースで行った。培養上清中に分泌された尿素の定量には、尿素窒素 Ｂ−テストワコー（和光純薬）を用いた。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチン、尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールに由来する５７０ｎｍの吸光度を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を１００とした時の相対値にて表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
表２の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）超臨界抽出物（抽出物５）は有意な保湿効果が認められた。
【００４８】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、ヒアルロン酸産生促進作用およびアルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【実施例３】
【００４９】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価）＞
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレート播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるように抽出物１を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価では、試料を含む培地の他に、コントロールとして１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価結果を、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした場合の相対値として表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）を添加した培地では有意な細胞賦活効果が認められた。
【実施例４】
【００５２】
＜抗老化効果（ヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表４に示す各濃度となるように抽出物１を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）は有意なコラーゲン産生促進効果が認められた。
【実施例５】
【００５５】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭによって表５に示す各濃度になるように抽出物２を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰデタミネーションキットを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。
評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
表５の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は有意なＡＴＰ産生促進効果が認められた。
【実施例６】
【００５８】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞賦活作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表６に示す各濃度に抽出物４を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
表６の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意な細胞賦活効果が認められた。
【実施例７】
【００６１】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞タイプＩＶコラーゲン産生促進作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表７に示す各濃度に抽出物１を添加した培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩＶコラーゲンの定量には、タイプＩＶコラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）及びビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを添加し反応させた後、６５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶ型コラーゲン産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表７に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
表７の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）は有意なコラーゲン産生促進効果が認められた。
【００６４】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、およびＡＴＰ産生促進作用を有し、優れた抗老化効果を発揮する。
【実施例８】
【００６５】
＜抗酸化効果（ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１０％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表８に示す各濃度にするように抽出物４を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。任意濃度のｔ−ブチルヒドロペルオキシドを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに、１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し、３７℃にて２時間培養した。次に１％酢酸を含む５０％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取りこまれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。
評価結果をｔ−ブチルヒドロペルオキシド無添加のコントロールにおける細胞生存率を１００としたときの相対値にて表８に示す。
【００６６】
【表８】
【００６７】
表８の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意な過酸化脂質耐性効果が認められた。
【実施例９】
【００６８】
＜抗酸化効果（ＤＰＰＨラジカル消去作用）＞
抽出物６を、５０質量％エタノールを用いて表９に示した濃度に調整して試料溶液とし、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジカル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、良く混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。その後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料を添加しなかった場合のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を式（１）に導入して求めた。測定結果を表９に示す。
式（１）：ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００６９】
【表９】
【００７０】
表９の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）超臨界抽出物（抽出物６）は有意なＤＰＰＨラジカル消去効果が認められた。
【実施例１０】
【００７１】
＜抗酸化効果（スーパーオキサイドアニオン消去作用）＞
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ ヒポキサンチンを含むＨａｎｋｓ（＋）溶液７５μＬに、抽出物４を表１０に示す濃度となるようにＨａｎｋｓ（＋）溶液で希釈した試料２５μＬを添加し、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を加え、３７℃で１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（２）の値をスーパーオキサイドアニオン消去率とした。評価結果を表１０に示した。
式（２）：消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００７２】
【表１０】
【００７３】
表１０の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物１０）は有意なスーパーオキサイドアニオン消去効果が認められた。
【００７４】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、過酸化脂質耐性作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用、およびスーパーオキサイドアニオン消去作用を有し、優れた抗酸化効果を発揮する。
【実施例１１】
【００７５】
＜痩身効果（ヒト前駆脂肪細胞中性脂肪蓄積抑制作用の評価）＞
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱを１ウェル当り５．０×１０３個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有）を用いた。４８時間培養後、表１１に示す濃度となるように抽出物１を添加したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン、１μＭ デキサメタゾン、２００μＭ インドメタシン、５００μＭ イソブチルメチルキサンチン含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、０．５質量／体積％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を１００とした時の相対値にて表１１に示す。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
表１１の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）エタノール抽出物（抽出物１）は有意な中性脂肪蓄積効果が認められ、優れた痩身効果を発揮する。
【実施例１２】
【００７８】
＜美白効果（ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用）＞
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェル当たり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、クラボウ社製Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓによって表１２に示す各濃度になるように抽出物４を添加した培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に、１質量％トリトン−Ｘ含有リン酸緩衝液７５μＬに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μＬを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量を、式（３）に各測定値を導入して求めた。
式（３）：生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）｝−２．１６６／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにより各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当たりのドーパメラニン生成量を求めた。コントロールの値を１００とした時の相対値より、チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。結果を表１２に示す。
【００７９】
【表１２】
【００８０】
表１２の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意なチロシナーゼ活性阻害効果が認められた。
【実施例１３】
【００８１】
＜美白効果（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価）＞
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表１３に示す濃度になるように抽出物２を添加した培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定５及び判定１とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１３に示す。
判定及び基準
判定 基準
１ ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白）
２ ポジティブコントロールより僅かに黒化する（うすい褐色）
３ ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
４ ネガティブコントロールと比べやや黒化が抑制されている（黒褐色） ５ ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒）
【００８２】
【表１３】
【００８３】
表１３の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は有意なメラニン産生抑制効果が認められた。
【００８４】
ハチジョウカグマ抽出物は、チロシナーゼ阻害活性およびメラニン産生抑制作用を有し、優れた美白効果を発揮する。
【実施例１４】
【００８５】
＜抗炎症効果（ヒアルロニダーゼ阻害作用の評価）＞
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ユニット／ｍＬとなるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。緩衝液にて表１４に示す濃度になるように抽出物２を添加した溶液０．１ｍＬおよび酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４ＮのＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え、反応停止後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、反応溶液を９６ウェルマイクロプレートに移し、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。ヒアルロニダーゼ阻害作用は次式に定義される。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
評価結果を表１４に示す。
【００８６】
【表１４】
【００８７】
表１４から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は、有意なヒアルロニダーゼ阻害効果が認められ、優れた抗炎症効果を発揮する。
【実施例１５】
【００８８】
＜免疫賦活効果（ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用）＞
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のＦＢＳを添加したＲｐｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。２４時間後、フォルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地にて表１５に示す各濃度になるように抽出物１を添加した培養液に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表１５に示す。
【００８９】
【表１５】
【００９０】
表１５から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）を添加した培地では、有意なヒト急性単球白血病細胞株（免疫細胞）の賦活作用が認められ、優れた免疫賦活効果を発揮する。
【００９１】
続いて、上記各調製方法で得られたコモチシダ属植物抽出物を配合した皮膚外用剤および機能性経口組成物の処方例を示す。
【実施例１６】
【００９２】
乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（10）精製水 １００とする残部
（11）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（12）抽出物１ ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後４０℃にて、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【実施例１７】
【００９３】
化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 １００とする残部
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）抽出物２ １．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。さらに（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【実施例１８】
【００９４】
クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（10）精製水 １００とする残部
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（12）抽出物３ ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。（11）を添加して攪拌後、冷却し４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【実施例１９】
【００９５】
美容液
（１）精製水 １００とする残部(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（11）ベヘニルアルコール ０．７５
（12）ミツロウ １．０
（13）ホホバ油 １．０
（14）１，３−ブチレングリコール １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（16）抽出物４ ３．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後５０℃にて（15）を、４０℃にて（16）を加え、均一に混合する。
【実施例２０】
【００９６】
水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）抽出物１ ０．５
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【実施例２１】
【００９７】
クレンジング料
（１）スクワラン ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）精製水 １００とする残部
（４）抽出物６ ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【実施例２２】
【００９８】
洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２５．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 １００とする残部
（８）抽出物２ ０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却後４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【実施例２３】
【００９９】
メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 １００とする残部
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（10）黄酸化鉄 ０．４
（11）香料 ０．１
（12）抽出物３ ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【実施例２４】
【０１００】
乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 １００とする残部
（11）酸化チタン ９．０
（12）タルク ７．４
（13）ベンガラ ０．５
（14）黄酸化鉄 １．１
（15）黒酸化鉄 ０．１
（16）香料 ０．１
（17）抽出物４ ０．５
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【実施例２５】
【０１０１】
油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３４．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１，３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 １００とする残部
（11）香料 ０．１
（12）抽出物５ ３．０
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（9）を（10）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と抽出物５を加え、均一に混合する。
【実施例２６】
【０１０２】
パック
（１）精製水 １００とする残部(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）抽出物１ １．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却する。４０℃にて（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【実施例２７】
【０１０３】
入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）抽出物２ ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【実施例２８】
【０１０４】
ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１，３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（10）精製水 １００とする残部
（11）抽出物３ ２．０
（12）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【実施例２９】
【０１０５】
ヘアートニック
（１）エタノール ５０．０(質量％)
（２）精製水 １００とする残部
（３）抽出物４ ３．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【実施例３０】
【０１０６】
錠剤
（１）コーンスターチ ４４．０（質量％）
（２）結晶セルロース １００とする残部
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５．０
（４）無水ケイ酸 ０．５
（５）ステアリン酸マグネシウム ０．５
（６）抽出物５ ５．０
製法：（１）〜（６）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して、１錠２００ｍｇの錠剤を得る。
【実施例３１】
【０１０７】
散剤
（１）ケイ酸アルミン酸マグネシウム ９５．３（質量％）
（２）カルボキシメチルセルロースカルシウム １００とする残部
（３）抽出物６ ４．０
製法：（１）〜（３）の粉体を混合後、粉砕機にて粉砕し、均一に分散する。
【実施例３２】
【０１０８】
キャンデー
（１）白糖 ６０．０（質量％）
（２）水飴 １００とする残部
（３）抽出物１ ５．０
（４）香料 適量
製法：（１）と（２）を加熱混合・均一化した後冷却し、７０℃にて成分（３）と（４）を添加し、混合均一化した後成型する。
【実施例３３】
【０１０９】
ドリンク剤
（１）アミノエチルスルホン酸 １０００ｍｇ
（２）硝酸チアミン １０ｍｇ
（３）リン酸リボフラビンナトリウム ５ｍｇ
（４）塩酸ピリドキシン １０ｍｇ
（５）無水カフェイン ５０ｍｇ
（６）クエン酸 ２５０ｍｇ
（７）Ｄ−ソルビトール液 ８ｍｇ
（８）抽出物２ １０００ｍｇ
（９）香料 微量
（10）精製水 １００ｍＬとする残部
製法：（１）〜（９）を順次（10）に添加し、均一化する。
【０１１０】
実施例１６〜実施例２９に示した皮膚外用剤は、保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する組成物であった。また実施例３０〜実施例３３に示した機能性経口組成物は保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する組成物であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、皮膚の乾燥を防ぎ、皮膚にうるおいを与える保湿成分を提供するために、様々な有効成分の配合検討がなされてきた。また、加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線などによる細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の保湿効果と安全性に優れた保湿剤としてハリブキ属植物の抽出物（特許文献１参照）、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献２参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献３参照）、クロレラ抽出物（特許文献４参照）、ビワ抽出物（特許文献５参照）等が開示されている。抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献６参照）等が、生体内の脂肪蓄積を抑制する成分としては、シッポゴケ科植物の抽出物（特許文献７参照）等が、美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献８参照）等が、抗炎症作用を有する植物エキスとして、蘇葉、カカオ及び茴香の乾燥物又はその熱水抽出エキス（特許文献９参照）、カンナ科植物の溶媒抽出物（特許文献１０参照）等が、免疫賦活剤としては、ニラの種子及び／又はその抽出物（特許文献１１参照）等が、それぞれすでに知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７７０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献４】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献５】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献６】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献７】特開２００５−６０３４５号公報
【特許文献８】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献９】特開２００３−２０１２４６号公報
【特許文献１０】特開平４−２７０２２４号公報
【特許文献１１】特開２００８−３１１２２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来はその効果が知られていなかったコモチシダ属植物またはその抽出物に優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、コモチシダ属植物より選ばれる少なくとも１種の植物またはその抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、コモチシダ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を配合することにより、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いるコモチシダ属植物は、シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）に属する多年草で、宮城県以南・富山県以西の本州、四国、九州に分布し、ヨーロッパやアメリカでは観賞用にされている。コモチシダ属には、アイオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ × ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ Ｈ．Ｃｈｒｉｓｔ）、アイコモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． × Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）、イズコモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ × ｉｚｕｅｎｓｉｓ Ｓａ．Ｋｕｒａｔａ）、オオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｌ．ｆ．） Ｊ．Ｓｍ．）、オオギミシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｈａｒｌａｎｄｉｉ Ｈｏｏｋ．）、コモチシダ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ．）、ハイコモチシダ（別名：ジョウレンシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｕｎｉｇｅｍｍａｔａ （Ｍａｋｉｎｏ） Ｎａｋａｉ）、ハチジョウカグマ（別名：タイワンコモチシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）、トサノオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｌ． ｆｉｌ．） Ｓｍ． ｖａｒ． ｌａｔｉｓｅｃｔａ Ｔａｇａｗａ）、およびホソバオオカグマ（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｋｅｍｐｉｉ Ｃｏｐｅｌ．）が知られている。
【００１０】
本発明は、コモチシダ属植物であれば特に限定されないが、本発明の効果の点から適当なものとして、ハチジョウカグマ（別名：タイワンコモチシダ）（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｓｗ． ｖａｒ． ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｓｅｎｓｔ．）が挙げられる。
【００１１】
これらコモチシダ属植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、胞子体、配偶体のいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、胞子体の全草、根、全葉、葉身、葉柄などを用いるとよい。好ましくは、葉身、葉柄などを含む全葉がよい。
【００１２】
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１３】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり、抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、好ましくは、水、エタノールがよい。これらは単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種または２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよく、好ましくは、二酸化炭素がよい。
【００１５】
コモチシダ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。あるいは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。コモチシダ属植物の前記抽出物やその処理物および分画物は、各処理および分画後に凍結乾燥し、用時溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１６】
コモチシダ属植物またはその抽出物は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、機能性経口組成物として利用することができる。
【００１７】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞のアルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【００１８】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩのコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞のＡＴＰ産生促進作用、ヒト表皮角化細胞の賦活作用、およびヒト表皮角化細胞タイプＩＶのコラーゲン産生促進作用を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１９】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れた過酸化脂質耐性、ラジカル消去作用、スーパーオキサイドアニオン消去作用を有し、優れた抗酸化効果を発揮する。
【００２０】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤は、優れたヒト前駆脂肪細胞の中性脂肪蓄積抑制作用を有し、優れた痩身効果を発揮する。
【００２１】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたヒト表皮メラニン細胞のチロシナーゼ活性阻害作用およびＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防・改善して、優れた美白効果を発揮する。
【００２２】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、優れた抗炎症効果を発揮する。
【００２３】
コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分とする免疫賦活剤は、ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用を有し、優れた免疫賦活効果を発揮する。
【００２４】
コモチシダ属植物またはその抽出物を含有する皮膚外用剤は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果などを発揮する。
【００２５】
コモチシダ属植物またはその抽出物を含有する機能性経口組成物は、優れた保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果などを発揮する。
【００２６】
これらの各剤は、コモチシダ属植物またはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他成分の配合の有無等については、何ら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状または粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、またはその他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤または分散剤等）を任意に含むことができる。
【００２７】
ここで皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品または外用医薬品等の皮膚または毛髪に外用される全ての外用組成物を意味している。機能性経口組成物についても、医薬品、食品または飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２８】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローション等の可溶化系、カラミンローション等の分散系、またはクリームや乳液等の乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤またはパップ剤等の種々の剤型で提供することもできる。
【００２９】
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料またはメイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤またはパップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品または外用医薬品などが例示できる。
【００３０】
機能性経口組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品（サプリメント）または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤またはエキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００３１】
皮膚外用剤または機能性経口組成物には、コモチシダ属植物またはその抽出物の他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料および洗浄料等に通常配合される任意の成分、例えば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、またはアルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、痩身剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤あるいはコモチシダ属植物以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。
【００３２】
飲食品等の経口組成物の場合も、経口用として通常用いられる各種成分との組み合わせにおいて、特に限定されるものではない。
【００３３】
コモチシダ属植物またはその抽出物の皮膚外用剤または機能性経口組成物への配合量は、種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して固形分換算で、好ましくは０．０００１〜１０．０質量％であり、より好ましくは０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【００３４】
以下にコモチシダ属植物抽出物の調製例、保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果および免疫賦活効果を評価するための試験方法、皮膚外用剤または機能性食品としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００３５】
［抽出物１］
ハチジョウカグマの新葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。
【００３６】
［抽出物２］
ハチジョウカグマの古葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。
【００３７】
［抽出物３］
ハチジョウカグマの新葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、１２０℃で２０分間抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、抽出物３を得た。
【００３８】
［抽出物４］
ハチジョウカグマの古葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、１２０℃で２０分間抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、抽出物４を得た。
【００３９】
［抽出物５］
ハチジョウカグマの新葉を乾燥させて粉砕し、セルに充填する。２時間、２５Ｍｐａ、４０℃、５ｍＬ／分の条件で液化二酸化炭素をセルに送液し抽出物５を得た。
【００４０】
［抽出物６］
ハチジョウカグマの古葉を乾燥させて粉砕し、セルに充填する。２時間、２５Ｍｐａ、４０℃、５ｍＬ／分の条件で液化二酸化炭素をセルに送液し抽出物６を得た。
【００４１】
ここで言う、新葉とは赤みのある葉を用い、古葉とは緑色の葉を用いた。上記抽出物を用いて、各効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊および＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【実施例１】
【００４２】
＜保湿効果（ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表１に示す各濃度となるように抽出物３を添加したサンプル培養液に交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）熱水抽出物（抽出物３）は有意な保湿効果が認められた。
【実施例２】
【００４５】
＜保湿効果（ヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後１．２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地（分化誘導培地）にて表２に示す各濃度に抽出物５を添加したサンプル培養液に交換し、さらに９日間培養した。培地交換は３日に１回のペースで行った。培養上清中に分泌された尿素の定量には、尿素窒素 Ｂ−テストワコー（和光純薬）を用いた。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチン、尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールに由来する５７０ｎｍの吸光度を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を１００とした時の相対値にて表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
表２の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）超臨界抽出物（抽出物５）は有意な保湿効果が認められた。
【００４８】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、ヒアルロン酸産生促進作用およびアルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【実施例３】
【００４９】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価）＞
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレート播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるように抽出物１を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価では、試料を含む培地の他に、コントロールとして１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価結果を、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした場合の相対値として表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）を添加した培地では有意な細胞賦活効果が認められた。
【実施例４】
【００５２】
＜抗老化効果（ヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表４に示す各濃度となるように抽出物１を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）は有意なコラーゲン産生促進効果が認められた。
【実施例５】
【００５５】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用の評価）＞
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭによって表５に示す各濃度になるように抽出物２を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰデタミネーションキットを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。
評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
表５の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は有意なＡＴＰ産生促進効果が認められた。
【実施例６】
【００５８】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞賦活作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表６に示す各濃度に抽出物４を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
表６の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意な細胞賦活効果が認められた。
【実施例７】
【００６１】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞タイプＩＶコラーゲン産生促進作用の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表７に示す各濃度に抽出物１を添加した培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩＶコラーゲンの定量には、タイプＩＶコラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）及びビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを添加し反応させた後、６５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶ型コラーゲン産生量を求めた。
評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表７に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
表７の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）は有意なコラーゲン産生促進効果が認められた。
【００６４】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、およびＡＴＰ産生促進作用を有し、優れた抗老化効果を発揮する。
【実施例８】
【００６５】
＜抗酸化効果（ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性の評価）＞
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１０％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表８に示す各濃度にするように抽出物４を添加した培養液に交換し、さらに２４時間培養した。任意濃度のｔ−ブチルヒドロペルオキシドを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに、１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し、３７℃にて２時間培養した。次に１％酢酸を含む５０％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取りこまれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。
評価結果をｔ−ブチルヒドロペルオキシド無添加のコントロールにおける細胞生存率を１００としたときの相対値にて表８に示す。
【００６６】
【表８】
【００６７】
表８の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意な過酸化脂質耐性効果が認められた。
【実施例９】
【００６８】
＜抗酸化効果（ＤＰＰＨラジカル消去作用）＞
抽出物６を、５０質量％エタノールを用いて表９に示した濃度に調整して試料溶液とし、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジカル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、良く混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。その後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料を添加しなかった場合のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を式（１）に導入して求めた。測定結果を表９に示す。
式（１）：ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００６９】
【表９】
【００７０】
表９の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）超臨界抽出物（抽出物６）は有意なＤＰＰＨラジカル消去効果が認められた。
【実施例１０】
【００７１】
＜抗酸化効果（スーパーオキサイドアニオン消去作用）＞
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ ヒポキサンチンを含むＨａｎｋｓ（＋）溶液７５μＬに、抽出物４を表１０に示す濃度となるようにＨａｎｋｓ（＋）溶液で希釈した試料２５μＬを添加し、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を加え、３７℃で１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（２）の値をスーパーオキサイドアニオン消去率とした。評価結果を表１０に示した。
式（２）：消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００７２】
【表１０】
【００７３】
表１０の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物１０）は有意なスーパーオキサイドアニオン消去効果が認められた。
【００７４】
上述のとおり、ハチジョウカグマ抽出物は、過酸化脂質耐性作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用、およびスーパーオキサイドアニオン消去作用を有し、優れた抗酸化効果を発揮する。
【実施例１１】
【００７５】
＜痩身効果（ヒト前駆脂肪細胞中性脂肪蓄積抑制作用の評価）＞
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱを１ウェル当り５．０×１０３個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有）を用いた。４８時間培養後、表１１に示す濃度となるように抽出物１を添加したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン、１μＭ デキサメタゾン、２００μＭ インドメタシン、５００μＭ イソブチルメチルキサンチン含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、０．５質量／体積％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を１００とした時の相対値にて表１１に示す。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
表１１の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）エタノール抽出物（抽出物１）は有意な中性脂肪蓄積効果が認められ、優れた痩身効果を発揮する。
【実施例１２】
【００７８】
＜美白効果（ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用）＞
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェル当たり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、クラボウ社製Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓによって表１２に示す各濃度になるように抽出物４を添加した培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に、１質量％トリトン−Ｘ含有リン酸緩衝液７５μＬに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μＬを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量を、式（３）に各測定値を導入して求めた。
式（３）：生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）｝−２．１６６／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイキットにより各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当たりのドーパメラニン生成量を求めた。コントロールの値を１００とした時の相対値より、チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。結果を表１２に示す。
【００７９】
【表１２】
【００８０】
表１２の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）熱水抽出物（抽出物４）は有意なチロシナーゼ活性阻害効果が認められた。
【実施例１３】
【００８１】
＜美白効果（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価）＞
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表１３に示す濃度になるように抽出物２を添加した培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定５及び判定１とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１３に示す。
判定及び基準
判定 基準
１ ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白）
２ ポジティブコントロールより僅かに黒化する（うすい褐色）
３ ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
４ ネガティブコントロールと比べやや黒化が抑制されている（黒褐色） ５ ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒）
【００８２】
【表１３】
【００８３】
表１３の結果から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は有意なメラニン産生抑制効果が認められた。
【００８４】
ハチジョウカグマ抽出物は、チロシナーゼ阻害活性およびメラニン産生抑制作用を有し、優れた美白効果を発揮する。
【実施例１４】
【００８５】
＜抗炎症効果（ヒアルロニダーゼ阻害作用の評価）＞
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ユニット／ｍＬとなるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。緩衝液にて表１４に示す濃度になるように抽出物２を添加した溶液０．１ｍＬおよび酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４ＮのＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え、反応停止後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、反応溶液を９６ウェルマイクロプレートに移し、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。ヒアルロニダーゼ阻害作用は次式に定義される。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
評価結果を表１４に示す。
【００８６】
【表１４】
【００８７】
表１４から明らかなように、ハチジョウカグマ（古葉）５０％エタノール抽出物（抽出物２）は、有意なヒアルロニダーゼ阻害効果が認められ、優れた抗炎症効果を発揮する。
【実施例１５】
【００８８】
＜免疫賦活効果（ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用）＞
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のＦＢＳを添加したＲｐｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。２４時間後、フォルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地にて表１５に示す各濃度になるように抽出物１を添加した培養液に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表１５に示す。
【００８９】
【表１５】
【００９０】
表１５から明らかなように、ハチジョウカグマ（新葉）５０％エタノール抽出物（抽出物１）を添加した培地では、有意なヒト急性単球白血病細胞株（免疫細胞）の賦活作用が認められ、優れた免疫賦活効果を発揮する。
【００９１】
続いて、上記各調製方法で得られたコモチシダ属植物抽出物を配合した皮膚外用剤および機能性経口組成物の処方例を示す。
【実施例１６】
【００９２】
乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（10）精製水 １００とする残部
（11）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（12）抽出物１ ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後４０℃にて、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【実施例１７】
【００９３】
化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 １００とする残部
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）抽出物２ １．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。さらに（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【実施例１８】
【００９４】
クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（10）精製水 １００とする残部
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（12）抽出物３ ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。（11）を添加して攪拌後、冷却し４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【実施例１９】
【００９５】
美容液
（１）精製水 １００とする残部(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（11）ベヘニルアルコール ０．７５
（12）ミツロウ １．０
（13）ホホバ油 １．０
（14）１，３−ブチレングリコール １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（16）抽出物４ ３．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後５０℃にて（15）を、４０℃にて（16）を加え、均一に混合する。
【実施例２０】
【００９６】
水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）抽出物１ ０．５
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【実施例２１】
【００９７】
クレンジング料
（１）スクワラン ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）精製水 １００とする残部
（４）抽出物６ ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【実施例２２】
【００９８】
洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２５．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 １００とする残部
（８）抽出物２ ０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却後４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【実施例２３】
【００９９】
メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 １００とする残部
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（10）黄酸化鉄 ０．４
（11）香料 ０．１
（12）抽出物３ ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【実施例２４】
【０１００】
乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 １００とする残部
（11）酸化チタン ９．０
（12）タルク ７．４
（13）ベンガラ ０．５
（14）黄酸化鉄 １．１
（15）黒酸化鉄 ０．１
（16）香料 ０．１
（17）抽出物４ ０．５
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【実施例２５】
【０１０１】
油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３４．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１，３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 １００とする残部
（11）香料 ０．１
（12）抽出物５ ３．０
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（9）を（10）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と抽出物５を加え、均一に混合する。
【実施例２６】
【０１０２】
パック
（１）精製水 １００とする残部(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）抽出物１ １．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却する。４０℃にて（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【実施例２７】
【０１０３】
入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）抽出物２ ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【実施例２８】
【０１０４】
ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１，３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（10）精製水 １００とする残部
（11）抽出物３ ２．０
（12）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【実施例２９】
【０１０５】
ヘアートニック
（１）エタノール ５０．０(質量％)
（２）精製水 １００とする残部
（３）抽出物４ ３．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【実施例３０】
【０１０６】
錠剤
（１）コーンスターチ ４４．０（質量％）
（２）結晶セルロース １００とする残部
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム ５．０
（４）無水ケイ酸 ０．５
（５）ステアリン酸マグネシウム ０．５
（６）抽出物５ ５．０
製法：（１）〜（６）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して、１錠２００ｍｇの錠剤を得る。
【実施例３１】
【０１０７】
散剤
（１）ケイ酸アルミン酸マグネシウム ９５．３（質量％）
（２）カルボキシメチルセルロースカルシウム １００とする残部
（３）抽出物６ ４．０
製法：（１）〜（３）の粉体を混合後、粉砕機にて粉砕し、均一に分散する。
【実施例３２】
【０１０８】
キャンデー
（１）白糖 ６０．０（質量％）
（２）水飴 １００とする残部
（３）抽出物１ ５．０
（４）香料 適量
製法：（１）と（２）を加熱混合・均一化した後冷却し、７０℃にて成分（３）と（４）を添加し、混合均一化した後成型する。
【実施例３３】
【０１０９】
ドリンク剤
（１）アミノエチルスルホン酸 １０００ｍｇ
（２）硝酸チアミン １０ｍｇ
（３）リン酸リボフラビンナトリウム ５ｍｇ
（４）塩酸ピリドキシン １０ｍｇ
（５）無水カフェイン ５０ｍｇ
（６）クエン酸 ２５０ｍｇ
（７）Ｄ−ソルビトール液 ８ｍｇ
（８）抽出物２ １０００ｍｇ
（９）香料 微量
（10）精製水 １００ｍＬとする残部
製法：（１）〜（９）を順次（10）に添加し、均一化する。
【０１１０】
実施例１６〜実施例２９に示した皮膚外用剤は、保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する組成物であった。また実施例３０〜実施例３３に示した機能性経口組成物は保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、痩身効果、美白効果、抗炎症効果、免疫賦活効果を有する組成物であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤。
【請求項２】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項３】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤。
【請求項５】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項６】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項７】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項８】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項９】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする機能性経口組成物。
【請求項１】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤。
【請求項２】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項３】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤。
【請求項５】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項６】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項７】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項８】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項９】
コモチシダ属（Ｗｏｏｄｗａｒｄｉａ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有することを特徴とする機能性経口組成物。
【公開番号】特開２０１０−１３２６０６（Ｐ２０１０−１３２６０６Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１０３５９（Ｐ２００８−３１０３５９）
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]