細胞内浸透を促進する脂肪族モノアミン又はカチオン性ポリマーを含む、水和ラメラ相又はリポソーム、及び、これを含む化粧組成物又は医薬組成物、及び、この物質のスクリーニング法
【課題】有利には皮膚又は毛髪の細胞中への、物質又は有効成分の細胞内浸透を増加させることができ、かつ、細胞毒性又は上記細胞の細胞死誘導を抑制する新規の水和ラメラ相又はリポソームを提供する。
【解決手段】
本発明は、
有効成分の細胞内浸透を局所的な塗布によって刺激するためのリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、
ａ）Ｃ１０〜Ｃ１３の脂肪鎖を１つ有する１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン；
ｂ）ステアリン酸アルコニウムクロライド又はココアルコニウムクロライド；並びに
ｃ）式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質
式中、Ｒは植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
からなる群より選択される物質又はその混合物を含む
ことを特徴とするリポソーム
に関する。
上記リポソームは、物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激するための化粧品又は医薬品において非常に有用である。
【解決手段】
本発明は、
有効成分の細胞内浸透を局所的な塗布によって刺激するためのリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、
ａ）Ｃ１０〜Ｃ１３の脂肪鎖を１つ有する１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン；
ｂ）ステアリン酸アルコニウムクロライド又はココアルコニウムクロライド；並びに
ｃ）式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質
式中、Ｒは植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
からなる群より選択される物質又はその混合物を含む
ことを特徴とするリポソーム
に関する。
上記リポソームは、物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激するための化粧品又は医薬品において非常に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は本質的に、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
上記水和ラメラ相又はリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を促進する物質を含む、
水和ラメラ相又はリポソーム
に関する。
より具体的には、本発明は、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される有効成分の少なくとも１種の細胞内浸透を刺激できる（ポリエチレンイミン、又は、本明細書及び特許請求の範囲における炭素含有鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８の脂肪族モノアミン、又は、本明細書及び特許請求の範囲におけるカチオン性ポリマーからなる群より選択される）物質又はその混合物を（少なくともその構造の一部に）含み、かつ、
細胞内浸透に対して本質的に不活性であって、特に細胞内浸透の促進に対して潜在的に活性を有する物質のスクリーニング法の範囲においてこの浸透を視覚化できる蛍光化合物（例えばペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））を任意に含む、
水和ラメラ相又はリポソーム
に関する。
【０００２】
本発明はまた、
上記水和ラメラ相又はリポソームを含む化粧品組成物又は皮膚化粧組成物、又は、医薬組成物又は皮膚医薬組成物
に関する。
【０００３】
本発明はまた、
本発明の化粧品組成物又は皮膚化粧組成物を皮膚又は毛髪の患部上に塗布することを含む
化粧処置の方法
に関する。本発明はまた、
水和ラメラ相又はリポソームの化粧剤としての使用であって、
特に（上記水和ラメラ相又はリポソーム中に保持される物質又は有効成分の性質に応じて、特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚又は毛髪の着色効果を有する）化粧組成物を製造するための使用
に関する。
【０００４】
本発明はまた、
細胞内浸透の促進に対して潜在的に活性を有する物質を検出するためのスクリーニング法
に関する。
【背景技術】
【０００５】
近年、特許文献１中に、周囲の培地のｐＨとイオン強度とに対する感度が非常に高いＣＡＴＥＳＯＭＥＳ（商標）という名称のカチオン性リポソームが記載されている。この物質は、Ｎｎ，Ｎｎ−ジメチル−１，ｎ−ジアミノアルキル型であるジアミン脂肪アルキルアンモニウム脂肪族アシル塩から構成されている。この文献において、ＡＤＤＡと称される物質は、ＤＤＡと称されるジアミン、炭素数ｎが２〜８のアルキル部（５段落３７〜３９行目参照）、炭素数１０〜３０の脂肪酸に由来する脂肪族アシル化部（５段落４１〜４８行目）からつくられている。
【０００６】
上記物質ＡＤＤＡは、ＣＡＴＥＭＯＬ ２２０及び２６０等のＣＡＴＥＭＯＬの商品名でＰｈｏｅｎｉｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（サマヴィル、ニュージャージー州、アメリカ）から市販されていると言われる。
【０００７】
ＣＡＴＥＳＯＭＥＳは、炭素数１０〜２８の脂肪酸（例えばベヘン酸）と組み合わさってＡ−ＡＤＤＡ塩という塩を形成するが、この混合物は等モルずつの混合物で、ｐＨ６〜１０においてつくられ、ＡＤＤＡの４級アミン基と上記脂肪酸のカルボキシル基との間で塩が形成されたものである（５段落６６行目〜６段落４行目参照）
【０００８】
このＨａｙｗａｒｄの文献は、二分子層がトリ塩型ヘミコハク酸ステロール等の有機酸ステロール塩を含むような従来のリポソームに関する特許文献２も引用している（５段落１３〜１８行目）。
【特許文献１】アメリカ特許６，０７１，５３５Ａ（Ｈａｙｗａｒｄ）
【特許文献２】アメリカ特許４，７２１，６１２Ａ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の要約
本発明の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中への、物質又は有効成分の細胞内浸透を増加させることができ、かつ、細胞毒性又は上記細胞の細胞死誘導を抑制する新規の水和ラメラ相又はリポソームを提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１０】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中への、物質又は有効成分の細胞内浸透を促進し、かつ、比較的高い比率で水和ラメラ相又はリポソーム中に上記物質又は有効成分を封入できる新規の水和ラメラ相又はリポソームを提供するという技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１１】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中へ、物質又は有効成分を良好に細胞内浸透させ、かつ、細胞毒性又は上記細胞の細胞死（アポトーシス）誘導を抑制する水和ラメラ相又はリポソームを含む新規の化粧品組成物又は皮膚化粧組成物、又は、医薬組成物又は皮膚医薬組成物を提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１２】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中へ、物質又は有効成分の細胞内浸透の改善に対して潜在的に活性を有する物質をスクリーニングする新規の方法、また、好ましくは、細胞毒性又は上記細胞のアポトーシス誘導を評価する新規の方法を提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１３】
上記技術的な問題は全て、化粧品又は医薬品の工業規模で使用できる安全で信頼できる方法によって初めて同時に解決できる。
【００１４】
従って、第一の態様によれば、本発明は、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される有効成分の少なくとも１種の細胞内浸透を刺激できる、以下の群：
ａ）ポリエチレンイミン；
ｂ）炭素含有鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８の１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン、有利にはＣ１０〜Ｃ１８の脂肪鎖を１つ有するモノアミン、好ましくはＣ１０〜Ｃ１８の脂肪鎖を１つ有する１級又は４級モノアミン；
ｃ）カチオン性ポリマー、特にカチオン性天然ポリマー又は任意にカチオン化された天然ポリマー又はカチオン性合成ポリマー：
より選択される物質又はその混合物を含み、かつ、
上記水和ラメラ相又はリポソームは、細胞内浸透に対して本質的に不活性であってこの浸透を視覚化できる蛍光化合物（例えばペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））の少なくとも１種を任意に含む
ことを特徴とする水和ラメラ相又はリポソーム
を提供する。
【００１５】
特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、
上記任意にカチオン化された天然ポリマーが、キトサン、４級化蜂蜜ポリマー；植物タンパク質、特に小麦タンパク質又は４級化小麦タンパク質、米タンパク質又は４級化米タンパク質、大豆タンパク質又は４級化大豆タンパク質；コラーゲン又は４級化コラーゲン、ケラチン又は４級化ケラチン、カゼイン又は４級化カゼイン、セルロース又は４級化セルロース、ガール又は４級化ガールからなる群より選択される
ことを特徴とする。
上記の４級化ポリマーは一般に市販されており、４級化は一般に、元々のポリマーの化学基上に３級アミンをグラフトして得られる。
【００１６】
別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、
上記１級モノアミンが、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、オクタデシルアミンからなる群より選択されるものであるか、又は、Ｃ８〜Ｃ１８の炭化水素鎖を有するコプラアミンの混合物等の１級アミンの混合物である
ことを特徴とする。
【００１７】
ある特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームはポリエチレンイミンを含む。
【００１８】
別の特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、例えば、トリグリセリド、極性リン脂質及び極性スフィンゴ脂質からなる群より選択される極性脂質等の、リポソーム膜を改変する物質の少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む。
【００１９】
別の特定の実施形態によれば、
上記極性リン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジルイノシトールから選択される１種又はこれらの混合物である。
【００２０】
有利には、上記極性リン脂質は、セラミド、スフィンゴリン脂質、グリコスフィンゴ脂質から選択される１種又はこれらの混合物である。
【００２１】
別の変形形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、極性脂質又は極性スフィンゴ脂質の少なくとも１種を、特にトリ塩型ヘミコハク酸ステロール等の有機酸ステロール塩として含む。
【００２２】
本発明の別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、大豆、ナタネ、ヒマワリ、ルピナス、ピーナッツ、ゴマ、マロー（ｍａｒｒｏｗ）、ヌカ油、ビッグシードファルスフラックス（ｂｉｇｓｅｅｄ ｆａｌｓｅｆｌａｘ）、キンセンカ、亜麻及び麻からなる群より選択される天然物から抽出したレシチンの少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む。
【００２３】
別の変形形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、コレステロール又はヘミコハク酸コレステロール等のコレステロール誘導体を含む脂質相を膜強化剤として更に含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、界面活性物質又は界面活性剤の少なくとも１種を、上記ラメラ相又はリポソーム膜を流体化する物質として脂質相中に含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の別の特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、細胞内浸透（特に皮膚又は毛髪の細胞内浸透）に対して本質的に不活性な蛍光物質を含む。一般的に好ましく用いられる上記蛍光物質は、特に上記ラメラ相又はリポソームを含む組成物の約０．０１重量％の割合で、５−ペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセインを含む、又は、この物質から構成される。
【００２６】
本発明の有利な実施形態によれば、
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物の０．０５重量％〜２５重量％、好ましくは上記組成物の０．５重量％〜２．５重量％である。
【００２７】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
上記脂肪族モノアミンはＣ１０〜Ｃ１３の炭素含有鎖を有する。
有利には、上記脂肪族モノアミンは、Ｃ１０〜Ｃ１８、好ましくはＣ１０〜Ｃ１３の脂肪族炭素含有鎖を１つ含む４級化した１級モノアミンである。
【００２８】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
有効成分の細胞内浸透を促進する上記４級化分子は、式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された４級化植物タンパク質（好ましくは大豆タンパク質）の溶液から選択される。
式中、Ｒは加水分解されている又はされていない、ヒドロキシアルキル化、特にヒドロキシプロピル化されている又はされていない植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基、好ましくはメチル基又はエチル基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキルラジカル、好ましくは主として炭素数１２のアルキル（ラウリル）ラジカルである。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、
上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される物質又は有効成分は、ビタミンＥ、フラボノイド、カロテノイド、ビタミンＣ又はそれらの誘導体等の抗ラジカル剤；カテキン、ヒドロキノン、アルブチン、フィチン酸、エラグ酸、ビタミンＣ又はそれらの誘導体等の脱色素剤；キサンチン誘導体の少なくとも１種等のスリミング剤、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、コレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物又はそれらの誘導体等の皮膚又は毛髪の着色剤からなる群より選択される。
【００３０】
第二の態様によれば、本発明はまた、
細胞内浸透を刺激する物質を少なくとも１種含む水和ラメラ相又はリポソームを、任意的に化粧品、皮膚化粧品、医薬品又は皮膚医薬品に許容される賦形剤中に含む、化粧組成物又は皮膚化粧組成物；医薬組成物又は皮膚医薬組成物
に関する。
【００３１】
上記賦形剤は当業者に公知のものであり、背景技術の記載中に示す従来技術文献２件の中に引用されている。
【００３２】
他の賦形剤は、単なる説明であって本発明の範囲を何ら制限するものではない、以下に記載する化粧組成物、皮膚化粧組成物、医薬組成物又は皮膚医薬組成物の例に由来する。
【００３３】
第三の態様によれば、本発明はまた、
上記の、又は、本発明に不可欠な部分である実施例に関連する以下の記載に由来する水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物を皮膚又は毛髪上に局所的に塗布することを含む化粧処置の方法
に関する。
【００３４】
第四の態様によれば、本発明はまた、
上記の、又は、本発明に不可欠な部分である実施例に由来する水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物を、所望の治療処置を行うのに十分な量、皮膚又は毛髪上に局所的に塗布することを含む
ことを特徴とする治療処置の方法
を含む。
一般に、上記水和ラメラ相又はリポソームは、上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される、所望の治療処置に関連する効果を有する有効成分を少なくとも１種含む。
【００３５】
化粧処置の範囲において、本発明は、抗皺処置、抗酸化処置、スリミング処置、皮膚再生処置、皮膚又は毛髪の着色処置からなる群より選択される化粧処置の実施を提供する。
【００３６】
治療処置の範囲において、本発明は、治療する病状に応じて皮膚又は毛髪の適切な治療処置の実施を提供する。
【００３７】
本発明はまた、
特に（特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚又は毛髪の着色効果を有する）化粧組成物を製造するための、又は、医薬組成物を製造するための、水和ラメラ相又はリポソームの化粧剤としての使用
に関する。
いずれの組成物の場合においても、局所経路用であることが好ましい。
【００３８】
第五の態様によれば、本発明はまた、
水和ラメラ相又はリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する能力を潜在的に有する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）上記水和ラメラ相又はリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、好ましくは細胞内浸透に対して本質的に不活性な、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、潜在的に活性を有していて細胞内浸透を刺激できる物質から選択される試験物質、及び、基準物質を任意に配合すること；
ｄ）上記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物から上記水和ラメラ相又はリポソームを形成する任意の適切な方法によって、上記水和ラメラ相又はリポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法
にも関する。
【００３９】
別の実施形態によれば、
蛍光化合物の細胞内浸透の結果を、（特にポリエチレンイミンを含む）基準物質について得られた細胞内浸透と比較する。
【００４０】
更に別の実施形態によれば、
潜在的に活性を有する物質による細胞毒性及び／又はアポトーシス誘導を、特に繊維芽細胞の、好ましくは正常ヒト繊維芽細胞の培養細胞において測定する。
【００４１】
更に別の実施形態によれば、
細胞内浸透に関して本質的に不活性な蛍光化合物は、上記繊維芽細胞の培養細胞中に自発的に浸透しない蛍光化合物である。
【００４２】
更に別の実施形態によれば、
上記蛍光化合物は、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセインを含む、又は、この物質であり、
この物質は、細胞内浸透の評価に使用する水和ラメラ相又はリポソームを含む最終組成物に対して０．０１重量％の濃度で使用される。
【００４３】
上記方法の別の有利な実施形態によれば、
上記蛍光化合物はポリエチレンイミンの存在下で配合し、
上記蛍光化合物及びポリエチレンイミンの濃度は細胞毒性を有さない濃度である。
【００４４】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
上記細胞内浸透を潜在的に刺激できる物質は、上記に記載する、又は、本発明に不可欠な実施例を参照して以下に記載する、上記ラメラ相又はリポソーム中に配合した、アルキル鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８、好ましくはＣ１０〜Ｃ１３の１級脂肪族モノアミン、又は、カチオン性ポリマー、特に任意にカチオン化された天然ポリマー若しくはカチオン性合成ポリマーから選択される。
【００４５】
第六の態様によれば、本発明はまた、
上記に記載の、又は、本発明に不可欠な実施例に由来する水和ラメラ相又はリポソームの、化粧剤としての、又は、化粧組成物を製造するための、特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚若しくは毛髪の着色効果のための使用
に関する。
【００４６】
上述の態様のうちのいずれの範囲内においても、界面活性剤を有利に水脂混合物中に添加して、リポソームの膜を流体化できる。
【００４７】
本発明には、例えば繊維芽細胞の培養細胞中に自発的に浸透せず、かつ、それ自身又はリポソーム中に封入した後で細胞毒性をほとんど誘導せず、例えば大豆レシチンに基づくリポソーム中に高率（約８０％）で配合され、封入後も（放出及び蛍光が変化せず）安定であり、かつ、リポソームの不安定化を誘導しない蛍光性トレーサーの選択が必要である。選択したトレーサーは有利には、濃度０．０１％、すなわち最終１８５μＭの５−ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ＰＦＢ−Ｆ）である。
【００４８】
有利には、上記リポソームを調製するための分散法は、剪断、超音波、押し出し、水和／脱水和（凍結乾燥）、凍結／解凍、逆相蒸発から選択されることが好ましい。
【００４９】
リポソーム（ラメラ構造）の存在を、透過型電子顕微鏡を用いて証明する。リポソームの大きさを、透過型電子顕微鏡及びレーザー粒径分析によって測定する。
【００５０】
有利には、リポソームの調製はｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ６で行う。
【００５１】
有利には、所望の有効成分の細胞内浸透は皮膚細胞中におけるものである。
【００５２】
有利には、有効成分の皮膚細胞中への細胞内浸透は、主として繊維芽細胞、ケラチノサイト及びメラノサイトを標的とする。
【００５３】
細胞内浸透を検出する手段は、定量及び視覚化による方法から選択されることが好ましく、分光蛍光計による蛍光強度の定量、及び、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）光学顕微鏡による視覚化が好ましい。
【００５４】
有利には、効果を有する分子とは、第一に、蛍光性トレーサーの細胞内浸透に対する刺激を、（カチオン性分子を全く含まない）ネガティブコントロールより１０％を超えて多く、有利には（基準カチオン性分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）を含む）ポジティブコントロールと同程度又はこれより多く、することができる分子とする。第二に、選択した分子は、好ましくは、細胞毒性及び／若しくはアポトーシス現象を誘導してはならないか、又は，細胞毒性及び／若しくはアポトーシス現象を誘導する場合でも、基準カチオン性分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）のそれよりも小さいものでなければならない。
【００５５】
有利には、細胞内浸透を刺激するために選択される活性分子は以下からなる群：
ａ）様々な炭素含有鎖長の１〜４級アミン、有利には、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、オクタデシルアミン、ベンジルジメチル（オクタデシル）塩化アンモニウム（又は塩化ステアリルアルコニウム（ｓｔｅａｒｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、１級アミン（例えばＣ８〜Ｃ１８のコプラアミン）の混合物、ポリクオタニウム１６；
ｂ）カチオン性ポリマー、有利には、キトサン、４級化蜂蜜タンパク質、植物タンパク質、特に小麦タンパク質、米タンパク質、大豆タンパク質又はこれらの４級化誘導体；４級化セルロース又はガール：
より選択される。
【００５６】
有利には、使用するカチオン性物質の濃度は０．０５％〜２５％、好ましくは０．５〜２．５％、好ましくは１％である。
【００５７】
有利には、細胞内浸透の刺激効果は、中鎖（Ｃ１０〜Ｃ１３）の炭素含有鎖が最も高く、長鎖（Ｃ１５〜Ｃ１８）は中程度であり、短鎖（Ｃ１０未満）は小さい。
【００５８】
有利には、細胞内浸透の刺激効果は、立体障害が誘導されるため、例えば同一炭素含有鎖を２本含む２級アミン（Ｃ１０−ＮＨ−Ｃ１０）と比較して、１級アミン（例えばＣ１０−ＮＨ２）が最も高い。
【００５９】
有利には、ある特定の４級化ポリマーにより、そのポリマーそのものの性質に起因して、細胞内浸透の刺激率を良好にできる。例えば、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解（ｌａｕｒｙｌｄｉｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｅｄ）小麦タンパク質はラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質の約６分の１の効果しかない。
【００６０】
有利には、選択したカチオン性分子は、使用する基準分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）より、細胞毒性が低く、かつ／又は、アポトーシス誘導が少ない。
【００６１】
有利には、細胞毒性の定量は、細胞のアルカリフォスファターゼ活性の評価による細胞生存率確認試験、及び、インターロイキン１α測定によって行う。アポトーシスはカスパーゼ−１の定量によって行う。
【００６２】
有利には、上記画期的方法で調製したリポソームを使用すれば、上記の蛍光性トレーサーを化粧品、皮膚化粧品又は医薬品の有効成分で置き換えることにより、この有効成分の細胞内浸透の増加を誘導できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
当業者には、本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の実施例を参照した説明から明らかであろう。実施例は本発明に不可欠であり、また、実施例を含む本明細書全体の中に記載される従来技術に照らして新規の特徴は全て、その機能、概略共に本発明に不可欠である。上記より、実施例は全て、一般的な範囲を示す。また、実施例において、特に指示のない限り、割合は重量で、温度は摂氏で、圧力は大気圧で表す。
【００６４】
図面の説明
添付する図１〜４は、本発明による、あらかじめ選択したトレーサー２種、それぞれＰＢＦ−Ｆ及びＴＲＩＴＣの細胞内浸透を視覚化したものである：
−図１は、１０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦ−Ｆを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図２は、４０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦ−Ｆを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図３は、１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図４は、１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％及びＰＥＩを３％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【実施例１】
【００６５】
＜蛍光性トレーサーを封入したリポソームの調製及び精製＞
蛍光性トレーサーは、例えば放射能という点で安全なだけでなく、定量の際、及び、細胞培養モデルにおける細胞内浸透を視覚的に明らかにする際、非常に簡単に使用できるという利点がある。トレーサーを選抜するために、様々な水溶性又は脂溶性トレーサーを０．０１％含むリポソームを調製し、正常ヒト繊維芽細胞上にこれを塗布する前に精製して未封入のトレーサーを除去する。同時に、蛍光性トレーサーを用いずにリポソームコントロールを調製する。
【００６６】
ａ）リポソーム調製プロトコールの選択
リポソームを、ｐＨ５に調節したＴｒｉｚｍａ希釈バッファー（シグマ社、フランス）５５ｍＭ−２７ｍＭＮａＣｌ中に濃度２０％で溶解した大豆レシチンを用いて調製する。常温で磁気により３０分間撹拌した後、混合物を１０分間非常に激しくホモジナイズする。その後、リポソームをＤＦ培地［仔ウシ血清１０％、ペニシリン最終濃度１００ＵＩ／ｍＬ、ゲンタマイシン最終濃度１μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ最終濃度１μｇ／ｍＬを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ））／Ｈａｍ Ｆ１２ ｇｌｕｔａｍａｘ］中に希釈して、大豆レシチンの濃度を変える（０．５、１、２、３、４、５、７．５、１０％）。
【００６７】
腹部の生検（ｐｌａｓｙ）から抽出して９６ウェルプレート中で培養した正常ヒト繊維芽細胞培養細胞上に、リポソーム懸濁液２５０μＬを添加する。それぞれの濃度について、６つの異なるウェル上で試験する。ｐＨ７．４のリン酸バッファーで３回洗浄した後、細胞生存率を、パラニトロフェニルリン酸を用いて細胞内のアルカリフォスファターゼ活性を測定する試験によって評価する。培養ウェル中にリポソームを添加せずに作成したコントロールに対して、生細胞の割合を計算する（ｎ＝６）。この結果から、上限７．５％までのレシチン濃度において、細胞生存率が８５％を超えることが分かる。レシチン１０％においては、生存率が、許容される閾値７５％を下回る。細胞生存率が９０％を超えることを可能にする濃度である５％を選択する。
【００６８】
ｂ）蛍光性トレーサーを封入した５％大豆レシチンリポソームの調製
大豆レシチン０．５ｇ、製造者の推奨によりあらかじめ可溶化した蛍光性トレーサー０．０１％をディッシュ中に導入し、Ｔｒｉｚｍａバッファー１０ｍＬ中に希釈する。常温で磁気により３０分間撹拌した後、混合物を１０分間非常に激しくホモジナイズしてリポソーム溶液を得る。この溶液中においてリポソームは平均的な大きさである。平均的な大きさとは、正確なホモジナイズ条件に応じて１００〜８００ｎｍの範囲内である。
【００６９】
リポソーム中に封入されていないトレーサーの画分をリポソーム中に封入されたトレーサーの画分から分けるために、精製する。精製は、リポソーム溶液を常温において円錐管中で１０分間、１７９０ｇにて遠心分離して行う。その後プラグ（ｐｌｕｇ）を回収し、培地１０ｍＬ中に可溶化する。リポソームネガティブコントロールを、上記プロトコールによって蛍光性トレーサーを用いずにつくる。試料を遮光状態で４℃において２４時間保持する。様々な種類の蛍光性トレーサー、すなわちｐＨ感受性トレーサー、カルシウム感受性トレーサー等を用いて、リポソームを２６種作る。
【実施例２】
【００７０】
＜リポソーム中に封入でき、正常ヒト繊維芽細胞培養細胞中に自発的に浸透しない蛍光性トレーサーの選択＞
トレーサーを選抜するために、実施例１に記載のプロトコールにより、多様な水溶性又は脂溶性トレーサーを様々な濃度で含むリポソームを調製して精製する（表１）。
【００７１】
表１：トレーサーとしての蛍光性プローブの選択
【００７２】
【表１】
【００７３】
コントロール（フリーの蛍光性トレーサー）を、上記と同じ濃度で蛍光性トレーサーを希釈バッファー中に溶解してつくり、細胞毒性及び繊維芽細胞への自発的浸透を定量する。並行して、蛍光性トレーサーを全く含まないネガティブコントロールとしてのリポソームとの比較を行う。実際には、腹部の形成外科手術に由来する生検から繊維芽細胞を抽出し、ＤＦ培地中で増殖させる。ＤＦ培地とはすなわち、仔ウシ血清１０％、ペニシリン最終濃度１００ＵＩ／ｍＬ、ゲンタマイシン最終濃度１μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ最終濃度１μｇ／ｍＬを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｈａｍ Ｆ１２ ｇｌｕｔａｍａｘである。
【００７４】
まず、遠心分離により精製したリポソームをＤＦ培地中に添加後、ボルテックスを用いてホモジナイズし、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社、ＭＷ２４）中で培養した繊維芽細胞上に１ｍＬ／ウェルの割合で注入する。同様の条件でコントロールをつくる。無処理コントロールもつくる。繊維芽細胞をリポソームの存在下で３７℃において２４時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄する。そしてまず、蛍光を、分光蛍光計によりＣｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００（Ｒ）（ミリポア社）を用いて乾燥状態で測定する。次に、目的の分子についての細胞内の蛍光を、オリンパス社製倒立顕微鏡（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＩＸ７０）により、対応する励起フィルターを用いて観察する（対物１０倍、４０倍及び１００倍）。最後に、実施例１に記載するように、蛍光性トレーサーの細胞毒性を９６ウェルプレート中で２４時間インキュベートすることにより測定する。
【００７５】
得られた結果から、試験した分子２５種のうち、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセインＰＦＢ−Ｆ（Ｐ１２９２５分子プローブ）及びテトラメチルローダミンイソチオシアネートＴＲＩＴＣ（Ｔ−４９０分子プローブ）だけが、リポソーム中への封入、繊維芽細胞上への２４時間の投与、及び、リポソーム内容物の浸透の定量の結果、興味深いポジティブな結果を示すことが分かった。
【００７６】
添付する図１〜４は、あらかじめ選択したトレーサー２種、ＰＢＦ−Ｆ及びＴＲＩＴＣを濃度０．０１％でリポソーム中に封入して、繊維芽細胞とともに２４時間インキュベートした後、その細胞内浸透を視覚化した写真である。
【００７７】
表２：トレーサーのスクリーニングの結果
【００７８】
【表２】
【００７９】
ＴＲＩＴＣは、標識は強いが（表１及び添付図１〜４）、わずかではあるが細胞毒性を有し、培地中にフリーの状態で添加した場合にわずかに浸透する。従って、ＰＦＢ−Ｆの方がより良好なトレーサーであるようである。
【実施例３】
【００８０】
＜ポリエチレンイミンが存在する場合又は存在しない場合の、ＰＦＢ−Ｆ（ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）存在下における細胞内浸透に関する研究＞
大豆レシチンを５％、及び、ＰＦＢ−Ｆ又はＴＲＩＴＣを０．０１％含み、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２５ｋＤａ）を０．５％含む又は含まないリポソームを実施例１に記載するプロトコールによって調製し、実施例２に記載するように、２４ウェルプレート中で培養したヒト繊維芽細胞上に添加して２４時間インキュベートした後で、その細胞内浸透を調べる。
【００８１】
得られた結果から、ＰＥＩを添加すると、ＰＦＢ−Ｆリポソームの浸透が１３．７倍刺激され、一方、ＴＲＩＴＣリポソームの浸透が１６分の１に減少することが分かる（添付図１〜４の写真を参照）。従って、トレーサーとして最後まで保留できるのは、リポソーム中に０．０１％の濃度で封入したＰＦＢ−Ｆ（ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン）である。
【実施例４】
【００８２】
＜ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ＰＦＢ−Ｆ）を含むリポソームの安定性に関する研究＞
リポソームの安定性を、ＤＦ培地中への蛍光性トレーサーの放出を分光蛍光計を用いて調べることによって評価する。この研究は、ｐＨ、イオン強度、及び、界面活性剤の存在について行う。実際には、大豆レシチンを５％、ＰＦＢ−Ｆを０．０１％、及び、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を５０μＭ含むリポソームを調製する。リポソーム溶液のｐＨを６、７、８、９に調節する；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を５０、１００、１５０、２００ｍＭに調節し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度を０．１、０．５、１、３％に調節する。得られた結果を表３中に示す。
【００８３】
表３：放出と、界面活性剤の存在、イオン強度及びｐＨとの関係に関する研究
【００８４】
【表３】
【００８５】
結果から、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を５０μＭ含むリポソームが不安定になり始めるのは、ＮａＣｌの濃度が２００ｍＭの時、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＳＤＳの濃度が０．５％の時、ｐＨが７より高い時であることが示唆される。
【実施例５】
【００８６】
＜蛍光性トレーサーＰＦＢ−Ｂの封入率とポリエチレンイミン濃度＞
リポソームを、実施例５に記載する方法に従い、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）の濃度を０〜１００μＭの範囲で増加させて調製する。１７９０ｇで１０分間遠心分離した後、上清を分光蛍光計によって定量する。封入率を初期濃度に対して計算する。結果を表４中に示す。
【００８７】
表４：ＰＦＢ−Ｆの封入率とＰＥＩ濃度
【００８８】
【表４】
【００８９】
封入率は、ＰＥＩ濃度上昇の影響を受けないことが分かる。
【実施例６】
【００９０】
＜様々な濃度のポリエチレンイミンを含む蛍光性リポソームのスクリーニング条件の開発＞
リポソームを、実施例１に記載するプロトコールに従い、ポリエチレンイミン（６Ｎ塩酸で中和したＰＥＩ（２５ｋＤａ））の濃度を変えて、すなわち０、５、１０、５０μＭの濃度で、かつ、ＰＦＢ−Ｆの濃度は０．０１％で調製する。２４ウェルプレート中で単層培養した繊維芽細胞上にリポソームを添加して２、４、６、２４及び４８時間インキュベートし、ｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄した後、無処理の繊維芽細胞ブランクを基準として、かつ、同じ濃度のフリーのＰＦＢ−Ｆを基準として分光蛍光計によって定量する。結果を表５中に示す。
【００９１】
表５：ＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透と、時間及びＰＥＩ濃度との関係に関する研究（各条件につきｎ＝４）（任意の蛍光単位で表す）
【００９２】
【表５】
【００９３】
ＰＥＩ濃度が５０μＭで、かつ、繊維芽細胞上で２４時間以上インキュベートする場合に最も良い結果が得られる。この条件は、細胞内浸透を刺激する分子をスクリーニングするために使用することとする。上記結果は、フリーのプローブコントロール（ｐ＜０．０５）に対して、濃度が５μＭ以上の全ての試験において統計的に有意である。
【実施例７】
【００９４】
＜ポリエチレンイミンを５０μＭ含む蛍光性リポソームの、時間経過による細胞内浸透及び細胞毒性の調査＞
実験は、ＰＥＩ濃度０〜１００μＭについて実施例６に従って行う。蛍光の定量は実施例６に従って行う。細胞内浸透の刺激は、ＰＥＩを含まないリポソームに対する刺激率として表す。
【００９５】
細胞生存率は、９６ウェルプレート中（１ウェル当たりリポソーム溶液２５０μＬ）において、アルカリフォスファターゼ活性を細胞層について評価する試験（パラニトロフェニルリン酸を用いた試験、ｎ＝６）によって行う。細胞生存率確認試験の結果を、ＰＥＩを含まない蛍光性リポソームコントロールに対して、生細胞の割合として表す。ＩＬ１αの測定（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を、２４時間インキュベート後に採取した培地について行い、並行して、総タンパク質の測定（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、シグマ社）も行う。結果を表６及び表７中に示す。
【００９６】
表６：ＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透率及び細胞毒性と、時間及びＰＥＩ濃度（各条件につきｎ＝４）
【００９７】
【表６】
【００９８】
表７：ＩＬ１α（ｐｇ）／総タンパク質（ｍｇ）の測定
【００９９】
【表７】
【０１００】
結果から、この実験においてＰＥＩの存在下で、蛍光性トレーサーの浸透率を３４倍まで上昇可能であることが分かる。しかしながら、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）濃度が５０μＭの際に、無視できない細胞毒性現象が２４時間後から観察され、４８時間後には、半数を超える細胞が死んだことが観察されている。ＩＬ１αの合成については、濃度５０μＭにおける刺激が１．６倍であり、１００μＭにおいては２．６倍である。従ってこの分子は、顕著な炎症性ストレスを引き起こす。
【実施例８】
【０１０１】
＜リポソーム中に封入した蛍光性トレーサーの細胞内浸透を刺激する分子のスクリーニング＞
リポソームを、実施例５に記載するように、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、塩酸でｐＨ７に中和した試験分子１、０．１、０．０１％を用いて、必要であればＴｒｉｚｍａ希釈バッファー中で、調製する。
【０１０２】
まず分子５５種を３項目について試験し、５０μＭのＰＥＩ（２５ｋＤａ）と比較する。細胞内浸透を、実施例２に記載するように、２４ウェルプレートの中で培養した正常ヒト繊維芽細胞上で２４時間インキュベートした後、定量する。細胞生存率を、９６ウェルプレート中でリポソーム懸濁液２００μＬについて測定する。１％の濃度について得られた結果を表８中に示す。
【０１０３】
【表８−１】
【０１０４】
【表８−２】
【０１０５】
スクリーニングを行った結果、蛍光性トレーサーの細胞内浸透を１０％を超えて刺激できる分子１５種を選抜した。濃度１％において細胞生存率は多様である（３７〜９９％）。蛍光性トレーサーの視覚化により、浸透を３２％を超えて刺激する分子の浸透が確認された。これらの分子を優先的に保留する。
【実施例９】
【０１０６】
＜細胞内浸透の刺激に及ぼす分子構造の影響＞
上述の実施例の記載に従って、アルキル鎖長３〜１８の１級脂肪族モノアミンを含むリポソームの調製、及び、蛍光標識の細胞内浸透の定量を行う。結果を表９中に示す。
【０１０７】
表９：細胞内浸透の刺激と炭素含有鎖長
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
長さの異なる脂肪鎖を有する脂肪族アミンをリポソーム膜中に封入して調べることにより、炭素含有鎖の長さが、レシチンを５％含むリポソーム中に封入したＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透を刺激する活性に及ぼす影響が明らかになる。脂肪酸は鎖長の観点から大まかに、短鎖（炭素数８未満）、中鎖（炭素数１０〜１８）及び長鎖（炭素数１８超）に分類される。この分類法を適用すると、本研究の範囲内で試験した１級脂肪族アミンは、中鎖である場合に、細胞内浸透を刺激する特性をリポソームに付与するようである。
【実施例１０】
【０１１０】
＜細胞内浸透に及ぼす立体障害の影響＞
レシチン５％を含むリポソーム中に封入した蛍光性トレーサーの細胞内浸透を刺激できる分子の特徴を十分定義するために、本発明者らは、これらの分子の潜在的な刺激活性に及ぼす立体障害の影響を観察した。従って、本発明者らは、１級脂肪族モノアミンの存在下におけるリポソーム中に封入したＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透について調べ、また、２級脂肪族モノアミンについても調べた。実施例８に記載するように、１級又は２級脂肪族アミンを含むリポソームの調製、及び、蛍光マーカーの細胞内浸透の定量を行う。結果を表１０中に示す。ジアミンでは、マーカーの細胞内浸透がそれほど良好ではない。
【０１１１】
表１０：細胞内浸透の刺激と炭素含有鎖の数
【０１１２】
【表１０】
【実施例１１】
【０１１３】
＜細胞内浸透に及ぼす立体障害の影響＞
特に実施例９又は１０に記載するように進行するにつれ、炭素含有鎖の長さは、リポソーム内容物の細胞内浸透の刺激において介在する唯一の因子ではないことが分かる。実際、リポソーム中に封入される下記化１中の化学構造を比較すると、特定のＲ基によってＣ１２の炭素含有鎖が干渉されることが分かる。
【０１１４】
【化１】
【０１１５】
４級化分子Ｙ及びＡは当業者に公知の物質である。封入された４級化分子（市販の分子）の立体障害は、レシチンを含むリポソームの細胞内浸透の刺激に関与している。次の種類の分子（表１１）は、例えば、１％で使用して、細胞内浸透を上限＋３９％の範囲で刺激できる。その他、アーモンド、エンドウ豆、ジャガイモ又は藻類から抽出した分子の４級化加水分解物も使用できる。
【０１１６】
【表１１】
【実施例１２】
【０１１７】
＜（細胞内浸透を刺激する）機能性分子の最適な濃度＞
蛍光性トレーサーの細胞内浸透の刺激を、異なる濃度の機能性分子について試験し、最適な濃度を選抜する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液を溶解してリポソームを形成する。実施例２に記載するように、細胞内浸透及び細胞毒性を測定する。得られた結果を表１２中に示す。
【０１１８】
表１２：細胞内浸透を刺激する分子の濃度、刺激率、及び、細胞生存率に関する研究
【０１１９】
【表１２】
【０１２０】
これより、所望の細胞内浸透は、機能性分子の濃度、及び、許容される最大の細胞毒性によって変わる。
【実施例１３】
【０１２１】
＜ポリエチレンイミンと選択した４級化大豆との炎症作用の比較＞
インターロイキン１α合成の刺激を、５０μＭのＰＥＩで機能化したリポソーム、及び、様々な濃度の４級化大豆溶液について比較する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液又はＰＥＩ５０μＭを溶解してリポソームを形成する。ＩＬ１α濃度を、実施例７に記載するようにキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定する。並行して、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を用いた試験により、ウェル当たりの細胞数を測定する。ＩＬ１α濃度の結果を、得られたＰＮＰＰの光学密度と比較する。得られた結果を表１３中に示す。
【０１２２】
表１３：インターロイキン１αの合成に及ぼす機能性分子（ＰＥＩ及び４級化大豆）の影響
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
得られた結果から、上記で選択した４級化大豆の溶液が、細胞毒性、及び、（基準分子ＰＥＩに関しては非常に小さい）炎症性ストレスを誘導することが分かる。
【実施例１４】
【０１２５】
＜ポリエチレンイミンと選択した４級化大豆とのアポトーシス効果の比較＞
インターロイキン１αの合成の刺激を、５０μＭのＰＥＩで機能化したリポソーム、及び、様々な濃度の４級化大豆溶液について比較する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液又はＰＥＩ５０μＭを溶解してリポソームを形成する。カスパーゼ−１の濃度をキット（Ｃａｓｐａｓｅ−１ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定する。並行して、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を用いた試験により、ウェル当たりの細胞数を測定する。カスパーゼ−１の濃度の結果を、得られたＰＮＰＰの光学密度と比較する。得られた結果を表１４中に示す。
【０１２６】
表１４：カスパーゼ−１の濃度に及ぼす機能性分子の影響
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
得られた結果から、上記で選択した４級化大豆の溶液が、細胞毒性、及び、（基準分子ＰＥＩに関しては非常に小さい）アポトーシスストレスを誘導することが分かる。
【実施例１５】
【０１２９】
＜透過型電子顕微鏡を用いた実施例１４のリポソーム組成物の構造の観察＞
４級化大豆溶液２％を用い、有効成分及び蛍光性トレーサーを添加せずに調製したリポソームを、透過型電子顕微鏡を用いて観察した。リポソームのネガティブ染色を、重金属塩で多重ラメラ小胞の二分子層間を満たすことにより行う。フィリップス社ＣＭ１２０電子顕微鏡を倍率３０〜６００００で用いて観察する。この観察から、多重ラメラ構造に特徴的な同心円状の脂質層の存在が明らかである。観察されたリポソームの大きさの平均値は１５０〜２５０ｎｍである。
【実施例１６】
【０１３０】
＜実施例１１の４級化大豆溶液を用いることによる、抗ラジカル保護に及ぼす刺激＞
リポソームを、大豆レシチン５％、天然ビタミンＥ０．２％、及び、実施例１１の２％４級化大豆溶液（分子Ｙ）を用いて調製する。実際には、天然ビタミンＥ０．４ｇを、大豆レシチン１０ｇ及び９６％エタノール１０ｍＬに添加する。この溶液を、磁気により撹拌しながら、常温で遮光状態において１晩蒸発させる。エタノールを蒸発させた後、脱イオン水１００ｍＬを添加する。この混合物を完全に溶解するまで撹拌する。
【０１３１】
次に、リポソームを、レシチン−ビタミンＥ溶液５ｍＬ、４級化大豆溶液１９０μＬ（すなわち２％）及びＴｒｉｚｍａ希釈バッファー（５５ｍＭ）４．８０ｍＬを加えて調製し、ｐＨ５に調節したＮａＣｌ（２７ｍＭ）を磁気により撹拌しながら遮光状態で３０分間かけて混合する。その後、この溶液を最高速度で１０分間ホモジナイズし、変性リポソームを形成する。一方でこの同じ溶液をホモジナイズせずに調製し、フリーのビタミンＥコントロールとする。
【０１３２】
天然ビタミンＥを基盤とするリポソームを、細胞毒性を防ぐためにＰＥＩ（２５ｋＤａ）１０μＭの存在下で、かつ、機能性分子なしで調製する。正常ヒト繊維芽細胞を２４ウェルプレート中に播種し、コンフルエントになるまで培養する。カルシウム及びマグネシウムを含むｐＨ７．４のリン酸バッファー（インビトロジェン社）で３回洗浄した後、それぞれの溶液を培地中に二倍希釈して少なくとも２時間インキュベートする（すなわちビタミンＥの最終濃度０．１％）。ウェルに培地のみを注入してインキュベートしたものを以下でプローブコントロールとして用いる。カルシウム及びマグネシウムを含むｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄してリポソーム及びフリーのビタミンＥを除去した後、細胞層を、次のように調製したジヒドロローダミン１２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）溶液２００μＬ／ウェルの存在下でインキュベートする：１ｍＭのジヒドロローダミン１２３溶液１５０μＬをＨＢＳＳバッファー１５ｍＬに溶解して調製。プレートは４９０〜５３０ｎｍにおいて蛍光を読み取り、９１２ｎｍのＵＶＢを０．８Ｊ／ｃｍ２で照射して、蛍光を同じ波長で再度読み取る。結果を比率で表す。
Ａ＝照射／非照射（Ｉ／ＮＩ）。
Ｂ＝（Ｉ／ＮＩリポソーム）／（Ｉ／ＮＩプローブコントロール）
Ｃ＝リポソーム化ビタミンＥ／フリーのビタミンＥ
【０１３３】
使用した蛍光性プローブにより、細胞内反応性酸素媒体の存在を調べることができる。というのは、細胞内反応性酸素媒体は細胞膜を通って受動分散し、そこでカチオン性ローダミンに酸化され得るからである。蛍光性プローブは、例えば過酸化水素及びペルオキシ亜硝酸と能動的に反応する。得られた結果を表１５中に示す。
【０１３４】
表１５：改変リポソームによる抗ラジカル保護
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
これらの結果から、４級化大豆タンパク質によって機能化されたリポソームにより、非機能性リポソームと比較してラジカルストレスに対する保護効果が２０％を超えて大きくなるが、一方、基準分子ＰＥＩによって機能化されたリポソームについては保護効果が観察できないだけでなく、別のストレスが発生していることが示される。
【実施例１７】
【０１３７】
＜本発明の物質による脱色素作用に及ぼす刺激＞
リポソームを次のプロトコールに従って調製した：大豆レシチン５％に、２％４級化大豆溶液又はＰＥＩ１０μＭを添加する、又は、添加しない。ここに、有効成分も共に封入する：防腐剤０．０５％を含まないＰｈｙｔｏｌｉｇｈｔ（Ｒ）（コレティカ社、リヨン、フランス）（植物有効成分の混合物）、アルブチン０．０５％及びカテキン（シグマ社）１ｍＭ。この分子を、フリーの状態で、又は、レシチン５％リポソーム中に封入して、又は、ＰＥＩ１０μＭで若しくは４級化大豆２％で機能化したリポソーム中に封入して、２４ウェルプレート中でプレコンフルエントまで培養した正常ヒトメラノサイト上に添加した。リポソーム化した又はしていない有効成分を、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において６６時間、ＭＭＫ２培地（シグマ社）中でインキュベートする。カルシウム及びマグネシウムを含むリン酸バッファー（インビトロジェン社）で３回洗浄して、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含むリン酸バッファー中に抽出した後、チロシナーゼ活性を、Ｌ−ＤＯＰＡ及びＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）の存在下で測定することにより定量する。ＭＢＴＨ−ｏ−キノン化合物の形成を、速度論的に測定した４９０ｎｍにおける吸光度の値により明らかにする。チロシナーゼ活性を、酵素反応の傾斜（割合）によって表す。結果を表１６中に示す。
【０１３８】
表１６：リポソーム化又は非リポソーム化有効成分の脱色素効果（酵素反応速度で表す）
【０１３９】
【表１６】
【０１４０】
これらの結果から、共に封入した有効成分は、機能化されると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける正常ヒトメラノサイトのチロシナーゼ活性の阻害を増大できることが分かる。４級化大豆による機能化は、ＰＥＩの添加によるものと比較して、植物抽出物の複合体についてはより効果が大きく、アルブチンについては同等であり、カテキンについてはわずかに効果が小さい。全ての場合において、活性は、非機能性リポソームと比較して少なくとも２．３倍大きい。
【実施例１８】
【０１４１】
＜本発明の物質の大きさを小さくする方法＞
リポソームの大きさを、高圧ホモジナイザーを使用することによって小さくできる（作業圧力は１０００バール超、好ましくは２０００バール超、より好ましくは３０００バール超）。この装置を用い、３０００バールにおいて約５０ｎｍのリポソームが得られる。リポソームの大きさを、実施例１５に記載するように、レーザー粒径測定器（ベックマンコールター社、Ｎ４ ｐｌｕｓ（サブミクロン粒子アナライザー）及び透過型電子顕微鏡を用いて調べた。
【実施例１９】
【０１４２】
＜経皮浸透後に本発明の物質によって保持される物質の浸透の立証：蛍光性トレーサー、ビタミンＥ又は遺伝物質についての実施例＞
フリーの形態の、又は、実施例１１中で選択した２％４級化大豆溶液を含む若しくは含まない実施例１２に記載のリポソーム中に封入した形態の、蛍光性分子（０．０１％ＰＦＰ−Ｆ）の浸透を、ヒト皮膚上における経皮浸透によって定量した。分散速度を分光蛍光計によって３〜２４時間測定した。また、更に２４時間後の放出量を測定した。そして貯蔵量も測定した。１条件について、５つの試料を試験した。これから得られた表１７中に示す結果から、ベクトル化（ｖｅｃｔｏｒｉｓｅｄ）していない形態又は４級化物質なしでベクトル化した形態と比較して、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、蛍光性トレーサーの分散、放出及び貯蔵を著しく刺激できることが分かる。
【０１４３】
【表１７】
【０１４４】
フリーの形態の、又は、実施例１１中で選択した２％４級化大豆溶液を含む若しくは含まない実施例１２に記載のリポソーム中に封入した形態の、ビタミンＥ分子（０．５％）の浸透を、ヒト皮膚における経皮浸透によって定量した。分散速度を高速液体クロマトグラフィーによって５〜２４時間測定した。また、更に２４時間後の放出量を測定した。そして貯蔵量も測定した。得られた結果から、ベクトル化していない形態又は４級化物質なしでベクトル化した形態と比較して、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、ビタミンＥの分散、放出及び貯蔵を著しく刺激できることが分かる。
【０１４５】
経皮浸透について、上記と同じ実験を、２％大豆溶液の存在下における実施例１２に記載のリポソーム中に蛍光性遺伝物質（２００ｍＭ）を封入して又は封入せずに実施した。エピ蛍光光学顕微鏡による皮膚断面の観察から、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、遺伝物質を真皮深層へ分散させることができることが分かる。
【０１４６】
二重鎖エラスチン１９−２０の蛍光性プローブの配列：
センス：５’−（ＦＩＴＣ）ＡＧＣＵＧＣＵＡＡＧＧＣＵＧＧＣＧＣＵＴＴ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＵＵＡＧＣＡＧＣＵＴＴ−３’
【実施例２０】
【０１４７】
＜水中油エマルション型の化粧製剤又は医薬製剤における本発明の物質の使用＞
「製剤２０ａ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
Ｂ
ステアリン酸グリコールＳＥ １４
トリイソノナオイン（Ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ） ５
ヤシ油脂肪酸オクチル ６
Ｃ
ｐＨ５．５に調整したブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【０１４８】
「製剤２０ｂ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ポリアクリルアミド、イソパラフィン、 ２．８
ラウレス−７
Ｂ
ブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
２
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン ０．５
ブチレングリコール
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【０１４９】
「製剤２０ｃ」
Ａ
カルボマー ０．５０
プロピレングリコール ３
グリセリン ５
水 ｑｓｐ １００
Ｂ
ヤシ油脂肪酸オクチル ５
ビサボロール（Ｂｉｓａｂｏｌｏｌ） ０．３０
ジメチコン ０．３０
Ｃ
水酸化ナトリウム １．６０
Ｄ
フェノキシエタノール、 ０．５０
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｅ
香料 ０．３０
Ｆ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２１】
【０１５０】
＜油中水型の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸 ３
カプリン酸トリグリセリド ３
オクタン酸セテアリル ４
アジピン酸ジブチル ３
ブドウ種子油 １．５
ホホバ油 １．５
フェノキシエタノール、 ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
グリセリン ３
ブチレングリコール ３
硫酸マグネシウム ０．５
ＥＤＴＡ ０．０５
水 ｑｓｐ １００
Ｃ
シクロメチコン １
ジメチコン １
Ｄ
香料 ０．３
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２２】
【０１５１】
＜三層エマルション型の製剤における本発明の物質の使用＞
「第一のエマルション Ｗ１／Ｏ」
Ａ
ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸 ４
カプリン酸トリグリセリド ７．５
イソヘキサデカン １５
ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル（Ｓｔｅａｒｕｌ ｅｔｈｅｒ） ７．５
Ｂ
水 ６５．３
Ｃ
フェノキシエタノール、 ０．７
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
【０１５２】
「第二のエマルション Ｗ１／Ｏ／Ｗ２」
Ａ
第一のエマルション ６０
Ｂ
ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７ ２
フェノキシエタノール、 ０．３
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３ジオール
水 ｑｓｐ１００
Ｃ
カルボマー １５
Ｄ
トリエタノールアミン ＰＨ６．０〜６．５
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２３】
【０１５３】
＜口紅等の無水製品状の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ミネラルワックス １７．０
イソステアリン酸イソステアリル ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴン ２．６
イソステアリン酸プロピレングリコール １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ ３．０
水添パーム核油脂肪酸グリセリド、 ３．４
水添パーム油脂肪酸グリセリド
ラノリン油 ３．４
ゴマ油 １．７
乳酸セチル １．７
鉱物油、ラノリンアルコール ３．０
Ｂ
ヒマシ油 ｑｓｐ １００
二酸化チタン ３．９
ＣＩ １５８５０：１ ０．６１６
ＣＩ ４５４１０：１ ０．２５６
ＣＩ １９１４０：１ ０．０４８
ＣＩ ７７４９１ ２．０４８
Ｃ
本発明の物質 ０．０１〜５％
【実施例２４】
【０１５４】
＜水性ゲル（アイライナー、スリミング剤等）の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
水 ｑｓｐ １００
カルボマー ０．５
ブチレングリコール １５
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２５】
【０１５５】
＜本発明の物質を含む医薬製剤の調製＞
「製剤２５ａ：錠剤の調製」
Ａ
賦形剤 １錠当たりのｇ
ラクトース ０．３５９
スクロース ０．２４０
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１
【０１５６】
「製剤２５ｂ：軟膏の調製」
Ａ
賦形剤
低密度ポリエチレン ５．５
流動パラフィン ｑｓｐ１００
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１
【０１５７】
「製剤２５ｃ：注射用製剤の調製」
Ａ
賦形剤
等張食塩水 ５ｍＬ
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１ｇ
Ａ相及びＢ相は別々のアンプル中に封入し、使用前に混合する。
【実施例２６】
【０１５８】
＜本発明の物質の化粧品としての許容性の評価＞
（活性成分を封入していない）実施例１５によって得られた化合物について、ウサギにおける皮膚及び眼刺激試験、ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、並びに、モルモットにおける感作性試験によって毒性試験を行った。
【０１５９】
＜ウサギの皮膚における一次刺激の評価＞
上記製剤を、ウサギ３匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関するＯＥＣＤ推奨の方法に従って、希釈せずに０．５ｍＬずつ塗布した。上記物質を、１９８２年２月２１日のフランス共和国の公式機関紙（「ＪＯＲＦ」）で公表された、１９８２年２月１日の決議で定義された基準に従って分類した。上記試験結果から、実施例１２によって得られた化合物を含む製剤は、皮膚に対して刺激がないと結論づけることができた。
【０１６０】
＜ウサギにおける眼刺激試験＞
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関して１９８７年２月２４日にＯＥＣＤ指令書４０５番によって推奨されている方法に従い、ウサギ３匹の眼中に０．１ｍＬを１回で滴下した。この試験の結果から、これらの製剤は、眼に対して刺激がないものと考えることができる。
【０１６１】
＜ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験＞
上記製剤を、１９８７年２月２４日のＯＥＣＤ指令書４０１番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット５匹及び雌ラット５匹に、５ｇ／体重１ｋｇの量を１回で経口投与した。ＬＤ０及びＬＤ５０は、５０００ｍｇ／ｋｇを超えることが分かった。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
【０１６２】
＜モルモットにおける潜在的皮膚感作性の評価＞
上記製剤に対して、ＯＥＣＤ指令書４０６番に従ったプロトコールであるＭａｇｎｕｓｓｏｎ−Ｋｌｉｇｍａｎｎ極大試験を行った。これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
【０１６３】
＜潜在的突然変異誘発性の評価＞
プロトコールは、ＯＥＣＤ指令書４７１番に従う（指令書９２／６９／ＥＥＣ）。突然変異誘発試験を、≪ネズミチフス菌≫及び≪大腸菌≫について、エームスらの方法に従って実施した（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７５年、３１、３４７−３６４）。５つの菌株を最小培地中で本発明の物質に、（変異原前駆体及び変異原を直接識別するために）外因性代謝活性システムを使用して又は使用せずに、暴露した。インキュベートした後、変異したコロニーを数え、コントロールのうちで自発的に変異したコロニーの数と比較した。本発明の物質は、指令書９２／６９／ＥＥＣの意味において、突然変異活性を有していない。
【０１６４】
＜健康な志願者に対する潜在的感作性の評価＞
本発明の物質の潜在的アレルギー性を、志願者の群に対して評価する。プロトコールは、誘導過程及び誘引試験を含むＭａｒｚｕｌｌｉ及びＭａｉｂａｃｈの方法（Ｃｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、１９７６年、２、１−１７）に従う。この試験は、１８〜６５歳で任意の肌質の、健康な女性及び／又は男性志願者１００人の群に対して実施する。本発明の物質を２０％に希釈して含む閉塞パッチを、各志願者の肩において実施した。パッチは皮膚に直接２４時間接触させておき、２日毎に取り替えて３週間、合計９回実施した。各パッチを除去した後、刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を評価した＝誘導過程。
【０１６５】
２週間後、上記とは別に、本発明の物質を２０％に希釈して含むパッチを、各志願者の皮膚に貼り、皮膚表面に直接２４時間接触させた。刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を、パッチを除去して２４、４８及び７２時間後に評価した＝「攻撃」過程。この研究の志願者１００人中誰も、誘導過程及び「攻撃」過程のどちらにおいても刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を示さなかった。上記で保留していた実験条件下において、２０％に希釈した本発明の物質は潜在的なアレルギー性を有していない。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】１０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦＦを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図２】４０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦＦを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図３】１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図４】１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％及びＰＥＩを３％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は本質的に、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
上記水和ラメラ相又はリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を促進する物質を含む、
水和ラメラ相又はリポソーム
に関する。
より具体的には、本発明は、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される有効成分の少なくとも１種の細胞内浸透を刺激できる（ポリエチレンイミン、又は、本明細書及び特許請求の範囲における炭素含有鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８の脂肪族モノアミン、又は、本明細書及び特許請求の範囲におけるカチオン性ポリマーからなる群より選択される）物質又はその混合物を（少なくともその構造の一部に）含み、かつ、
細胞内浸透に対して本質的に不活性であって、特に細胞内浸透の促進に対して潜在的に活性を有する物質のスクリーニング法の範囲においてこの浸透を視覚化できる蛍光化合物（例えばペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））を任意に含む、
水和ラメラ相又はリポソーム
に関する。
【０００２】
本発明はまた、
上記水和ラメラ相又はリポソームを含む化粧品組成物又は皮膚化粧組成物、又は、医薬組成物又は皮膚医薬組成物
に関する。
【０００３】
本発明はまた、
本発明の化粧品組成物又は皮膚化粧組成物を皮膚又は毛髪の患部上に塗布することを含む
化粧処置の方法
に関する。本発明はまた、
水和ラメラ相又はリポソームの化粧剤としての使用であって、
特に（上記水和ラメラ相又はリポソーム中に保持される物質又は有効成分の性質に応じて、特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚又は毛髪の着色効果を有する）化粧組成物を製造するための使用
に関する。
【０００４】
本発明はまた、
細胞内浸透の促進に対して潜在的に活性を有する物質を検出するためのスクリーニング法
に関する。
【背景技術】
【０００５】
近年、特許文献１中に、周囲の培地のｐＨとイオン強度とに対する感度が非常に高いＣＡＴＥＳＯＭＥＳ（商標）という名称のカチオン性リポソームが記載されている。この物質は、Ｎｎ，Ｎｎ−ジメチル−１，ｎ−ジアミノアルキル型であるジアミン脂肪アルキルアンモニウム脂肪族アシル塩から構成されている。この文献において、ＡＤＤＡと称される物質は、ＤＤＡと称されるジアミン、炭素数ｎが２〜８のアルキル部（５段落３７〜３９行目参照）、炭素数１０〜３０の脂肪酸に由来する脂肪族アシル化部（５段落４１〜４８行目）からつくられている。
【０００６】
上記物質ＡＤＤＡは、ＣＡＴＥＭＯＬ ２２０及び２６０等のＣＡＴＥＭＯＬの商品名でＰｈｏｅｎｉｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（サマヴィル、ニュージャージー州、アメリカ）から市販されていると言われる。
【０００７】
ＣＡＴＥＳＯＭＥＳは、炭素数１０〜２８の脂肪酸（例えばベヘン酸）と組み合わさってＡ−ＡＤＤＡ塩という塩を形成するが、この混合物は等モルずつの混合物で、ｐＨ６〜１０においてつくられ、ＡＤＤＡの４級アミン基と上記脂肪酸のカルボキシル基との間で塩が形成されたものである（５段落６６行目〜６段落４行目参照）
【０００８】
このＨａｙｗａｒｄの文献は、二分子層がトリ塩型ヘミコハク酸ステロール等の有機酸ステロール塩を含むような従来のリポソームに関する特許文献２も引用している（５段落１３〜１８行目）。
【特許文献１】アメリカ特許６，０７１，５３５Ａ（Ｈａｙｗａｒｄ）
【特許文献２】アメリカ特許４，７２１，６１２Ａ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の要約
本発明の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中への、物質又は有効成分の細胞内浸透を増加させることができ、かつ、細胞毒性又は上記細胞の細胞死誘導を抑制する新規の水和ラメラ相又はリポソームを提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１０】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中への、物質又は有効成分の細胞内浸透を促進し、かつ、比較的高い比率で水和ラメラ相又はリポソーム中に上記物質又は有効成分を封入できる新規の水和ラメラ相又はリポソームを提供するという技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１１】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中へ、物質又は有効成分を良好に細胞内浸透させ、かつ、細胞毒性又は上記細胞の細胞死（アポトーシス）誘導を抑制する水和ラメラ相又はリポソームを含む新規の化粧品組成物又は皮膚化粧組成物、又は、医薬組成物又は皮膚医薬組成物を提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１２】
本発明の別の主要な目的は、有利には皮膚又は毛髪の細胞中へ、物質又は有効成分の細胞内浸透の改善に対して潜在的に活性を有する物質をスクリーニングする新規の方法、また、好ましくは、細胞毒性又は上記細胞のアポトーシス誘導を評価する新規の方法を提供するという新しい技術的な問題を予想外の方法で解決することである。
【００１３】
上記技術的な問題は全て、化粧品又は医薬品の工業規模で使用できる安全で信頼できる方法によって初めて同時に解決できる。
【００１４】
従って、第一の態様によれば、本発明は、
水和ラメラ相又はリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される有効成分の少なくとも１種の細胞内浸透を刺激できる、以下の群：
ａ）ポリエチレンイミン；
ｂ）炭素含有鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８の１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン、有利にはＣ１０〜Ｃ１８の脂肪鎖を１つ有するモノアミン、好ましくはＣ１０〜Ｃ１８の脂肪鎖を１つ有する１級又は４級モノアミン；
ｃ）カチオン性ポリマー、特にカチオン性天然ポリマー又は任意にカチオン化された天然ポリマー又はカチオン性合成ポリマー：
より選択される物質又はその混合物を含み、かつ、
上記水和ラメラ相又はリポソームは、細胞内浸透に対して本質的に不活性であってこの浸透を視覚化できる蛍光化合物（例えばペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））の少なくとも１種を任意に含む
ことを特徴とする水和ラメラ相又はリポソーム
を提供する。
【００１５】
特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、
上記任意にカチオン化された天然ポリマーが、キトサン、４級化蜂蜜ポリマー；植物タンパク質、特に小麦タンパク質又は４級化小麦タンパク質、米タンパク質又は４級化米タンパク質、大豆タンパク質又は４級化大豆タンパク質；コラーゲン又は４級化コラーゲン、ケラチン又は４級化ケラチン、カゼイン又は４級化カゼイン、セルロース又は４級化セルロース、ガール又は４級化ガールからなる群より選択される
ことを特徴とする。
上記の４級化ポリマーは一般に市販されており、４級化は一般に、元々のポリマーの化学基上に３級アミンをグラフトして得られる。
【００１６】
別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、
上記１級モノアミンが、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、オクタデシルアミンからなる群より選択されるものであるか、又は、Ｃ８〜Ｃ１８の炭化水素鎖を有するコプラアミンの混合物等の１級アミンの混合物である
ことを特徴とする。
【００１７】
ある特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームはポリエチレンイミンを含む。
【００１８】
別の特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、例えば、トリグリセリド、極性リン脂質及び極性スフィンゴ脂質からなる群より選択される極性脂質等の、リポソーム膜を改変する物質の少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む。
【００１９】
別の特定の実施形態によれば、
上記極性リン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジルイノシトールから選択される１種又はこれらの混合物である。
【００２０】
有利には、上記極性リン脂質は、セラミド、スフィンゴリン脂質、グリコスフィンゴ脂質から選択される１種又はこれらの混合物である。
【００２１】
別の変形形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、極性脂質又は極性スフィンゴ脂質の少なくとも１種を、特にトリ塩型ヘミコハク酸ステロール等の有機酸ステロール塩として含む。
【００２２】
本発明の別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、大豆、ナタネ、ヒマワリ、ルピナス、ピーナッツ、ゴマ、マロー（ｍａｒｒｏｗ）、ヌカ油、ビッグシードファルスフラックス（ｂｉｇｓｅｅｄ ｆａｌｓｅｆｌａｘ）、キンセンカ、亜麻及び麻からなる群より選択される天然物から抽出したレシチンの少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む。
【００２３】
別の変形形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、コレステロール又はヘミコハク酸コレステロール等のコレステロール誘導体を含む脂質相を膜強化剤として更に含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の別の有利な実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、界面活性物質又は界面活性剤の少なくとも１種を、上記ラメラ相又はリポソーム膜を流体化する物質として脂質相中に含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の別の特定の実施形態によれば、
上記ラメラ相又はリポソームは、細胞内浸透（特に皮膚又は毛髪の細胞内浸透）に対して本質的に不活性な蛍光物質を含む。一般的に好ましく用いられる上記蛍光物質は、特に上記ラメラ相又はリポソームを含む組成物の約０．０１重量％の割合で、５−ペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセインを含む、又は、この物質から構成される。
【００２６】
本発明の有利な実施形態によれば、
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物の０．０５重量％〜２５重量％、好ましくは上記組成物の０．５重量％〜２．５重量％である。
【００２７】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
上記脂肪族モノアミンはＣ１０〜Ｃ１３の炭素含有鎖を有する。
有利には、上記脂肪族モノアミンは、Ｃ１０〜Ｃ１８、好ましくはＣ１０〜Ｃ１３の脂肪族炭素含有鎖を１つ含む４級化した１級モノアミンである。
【００２８】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
有効成分の細胞内浸透を促進する上記４級化分子は、式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された４級化植物タンパク質（好ましくは大豆タンパク質）の溶液から選択される。
式中、Ｒは加水分解されている又はされていない、ヒドロキシアルキル化、特にヒドロキシプロピル化されている又はされていない植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基、好ましくはメチル基又はエチル基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキルラジカル、好ましくは主として炭素数１２のアルキル（ラウリル）ラジカルである。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、
上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される物質又は有効成分は、ビタミンＥ、フラボノイド、カロテノイド、ビタミンＣ又はそれらの誘導体等の抗ラジカル剤；カテキン、ヒドロキノン、アルブチン、フィチン酸、エラグ酸、ビタミンＣ又はそれらの誘導体等の脱色素剤；キサンチン誘導体の少なくとも１種等のスリミング剤、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、コレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物又はそれらの誘導体等の皮膚又は毛髪の着色剤からなる群より選択される。
【００３０】
第二の態様によれば、本発明はまた、
細胞内浸透を刺激する物質を少なくとも１種含む水和ラメラ相又はリポソームを、任意的に化粧品、皮膚化粧品、医薬品又は皮膚医薬品に許容される賦形剤中に含む、化粧組成物又は皮膚化粧組成物；医薬組成物又は皮膚医薬組成物
に関する。
【００３１】
上記賦形剤は当業者に公知のものであり、背景技術の記載中に示す従来技術文献２件の中に引用されている。
【００３２】
他の賦形剤は、単なる説明であって本発明の範囲を何ら制限するものではない、以下に記載する化粧組成物、皮膚化粧組成物、医薬組成物又は皮膚医薬組成物の例に由来する。
【００３３】
第三の態様によれば、本発明はまた、
上記の、又は、本発明に不可欠な部分である実施例に関連する以下の記載に由来する水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物を皮膚又は毛髪上に局所的に塗布することを含む化粧処置の方法
に関する。
【００３４】
第四の態様によれば、本発明はまた、
上記の、又は、本発明に不可欠な部分である実施例に由来する水和ラメラ相又はリポソームを含む組成物を、所望の治療処置を行うのに十分な量、皮膚又は毛髪上に局所的に塗布することを含む
ことを特徴とする治療処置の方法
を含む。
一般に、上記水和ラメラ相又はリポソームは、上記水和ラメラ相又はリポソーム中に存在する又は保持される、所望の治療処置に関連する効果を有する有効成分を少なくとも１種含む。
【００３５】
化粧処置の範囲において、本発明は、抗皺処置、抗酸化処置、スリミング処置、皮膚再生処置、皮膚又は毛髪の着色処置からなる群より選択される化粧処置の実施を提供する。
【００３６】
治療処置の範囲において、本発明は、治療する病状に応じて皮膚又は毛髪の適切な治療処置の実施を提供する。
【００３７】
本発明はまた、
特に（特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚又は毛髪の着色効果を有する）化粧組成物を製造するための、又は、医薬組成物を製造するための、水和ラメラ相又はリポソームの化粧剤としての使用
に関する。
いずれの組成物の場合においても、局所経路用であることが好ましい。
【００３８】
第五の態様によれば、本発明はまた、
水和ラメラ相又はリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する能力を潜在的に有する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）上記水和ラメラ相又はリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、好ましくは細胞内浸透に対して本質的に不活性な、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、潜在的に活性を有していて細胞内浸透を刺激できる物質から選択される試験物質、及び、基準物質を任意に配合すること；
ｄ）上記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物から上記水和ラメラ相又はリポソームを形成する任意の適切な方法によって、上記水和ラメラ相又はリポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法
にも関する。
【００３９】
別の実施形態によれば、
蛍光化合物の細胞内浸透の結果を、（特にポリエチレンイミンを含む）基準物質について得られた細胞内浸透と比較する。
【００４０】
更に別の実施形態によれば、
潜在的に活性を有する物質による細胞毒性及び／又はアポトーシス誘導を、特に繊維芽細胞の、好ましくは正常ヒト繊維芽細胞の培養細胞において測定する。
【００４１】
更に別の実施形態によれば、
細胞内浸透に関して本質的に不活性な蛍光化合物は、上記繊維芽細胞の培養細胞中に自発的に浸透しない蛍光化合物である。
【００４２】
更に別の実施形態によれば、
上記蛍光化合物は、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセインを含む、又は、この物質であり、
この物質は、細胞内浸透の評価に使用する水和ラメラ相又はリポソームを含む最終組成物に対して０．０１重量％の濃度で使用される。
【００４３】
上記方法の別の有利な実施形態によれば、
上記蛍光化合物はポリエチレンイミンの存在下で配合し、
上記蛍光化合物及びポリエチレンイミンの濃度は細胞毒性を有さない濃度である。
【００４４】
本発明の更に別の有利な実施形態によれば、
上記細胞内浸透を潜在的に刺激できる物質は、上記に記載する、又は、本発明に不可欠な実施例を参照して以下に記載する、上記ラメラ相又はリポソーム中に配合した、アルキル鎖長Ｃ１０〜Ｃ１８、好ましくはＣ１０〜Ｃ１３の１級脂肪族モノアミン、又は、カチオン性ポリマー、特に任意にカチオン化された天然ポリマー若しくはカチオン性合成ポリマーから選択される。
【００４５】
第六の態様によれば、本発明はまた、
上記に記載の、又は、本発明に不可欠な実施例に由来する水和ラメラ相又はリポソームの、化粧剤としての、又は、化粧組成物を製造するための、特に、抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、皮膚若しくは毛髪の着色効果のための使用
に関する。
【００４６】
上述の態様のうちのいずれの範囲内においても、界面活性剤を有利に水脂混合物中に添加して、リポソームの膜を流体化できる。
【００４７】
本発明には、例えば繊維芽細胞の培養細胞中に自発的に浸透せず、かつ、それ自身又はリポソーム中に封入した後で細胞毒性をほとんど誘導せず、例えば大豆レシチンに基づくリポソーム中に高率（約８０％）で配合され、封入後も（放出及び蛍光が変化せず）安定であり、かつ、リポソームの不安定化を誘導しない蛍光性トレーサーの選択が必要である。選択したトレーサーは有利には、濃度０．０１％、すなわち最終１８５μＭの５−ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ＰＦＢ−Ｆ）である。
【００４８】
有利には、上記リポソームを調製するための分散法は、剪断、超音波、押し出し、水和／脱水和（凍結乾燥）、凍結／解凍、逆相蒸発から選択されることが好ましい。
【００４９】
リポソーム（ラメラ構造）の存在を、透過型電子顕微鏡を用いて証明する。リポソームの大きさを、透過型電子顕微鏡及びレーザー粒径分析によって測定する。
【００５０】
有利には、リポソームの調製はｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ６で行う。
【００５１】
有利には、所望の有効成分の細胞内浸透は皮膚細胞中におけるものである。
【００５２】
有利には、有効成分の皮膚細胞中への細胞内浸透は、主として繊維芽細胞、ケラチノサイト及びメラノサイトを標的とする。
【００５３】
細胞内浸透を検出する手段は、定量及び視覚化による方法から選択されることが好ましく、分光蛍光計による蛍光強度の定量、及び、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）光学顕微鏡による視覚化が好ましい。
【００５４】
有利には、効果を有する分子とは、第一に、蛍光性トレーサーの細胞内浸透に対する刺激を、（カチオン性分子を全く含まない）ネガティブコントロールより１０％を超えて多く、有利には（基準カチオン性分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）を含む）ポジティブコントロールと同程度又はこれより多く、することができる分子とする。第二に、選択した分子は、好ましくは、細胞毒性及び／若しくはアポトーシス現象を誘導してはならないか、又は，細胞毒性及び／若しくはアポトーシス現象を誘導する場合でも、基準カチオン性分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）のそれよりも小さいものでなければならない。
【００５５】
有利には、細胞内浸透を刺激するために選択される活性分子は以下からなる群：
ａ）様々な炭素含有鎖長の１〜４級アミン、有利には、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、オクタデシルアミン、ベンジルジメチル（オクタデシル）塩化アンモニウム（又は塩化ステアリルアルコニウム（ｓｔｅａｒｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、１級アミン（例えばＣ８〜Ｃ１８のコプラアミン）の混合物、ポリクオタニウム１６；
ｂ）カチオン性ポリマー、有利には、キトサン、４級化蜂蜜タンパク質、植物タンパク質、特に小麦タンパク質、米タンパク質、大豆タンパク質又はこれらの４級化誘導体；４級化セルロース又はガール：
より選択される。
【００５６】
有利には、使用するカチオン性物質の濃度は０．０５％〜２５％、好ましくは０．５〜２．５％、好ましくは１％である。
【００５７】
有利には、細胞内浸透の刺激効果は、中鎖（Ｃ１０〜Ｃ１３）の炭素含有鎖が最も高く、長鎖（Ｃ１５〜Ｃ１８）は中程度であり、短鎖（Ｃ１０未満）は小さい。
【００５８】
有利には、細胞内浸透の刺激効果は、立体障害が誘導されるため、例えば同一炭素含有鎖を２本含む２級アミン（Ｃ１０−ＮＨ−Ｃ１０）と比較して、１級アミン（例えばＣ１０−ＮＨ２）が最も高い。
【００５９】
有利には、ある特定の４級化ポリマーにより、そのポリマーそのものの性質に起因して、細胞内浸透の刺激率を良好にできる。例えば、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解（ｌａｕｒｙｌｄｉｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｅｄ）小麦タンパク質はラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質の約６分の１の効果しかない。
【００６０】
有利には、選択したカチオン性分子は、使用する基準分子（５０μＭで使用するポリエチレンイミン）より、細胞毒性が低く、かつ／又は、アポトーシス誘導が少ない。
【００６１】
有利には、細胞毒性の定量は、細胞のアルカリフォスファターゼ活性の評価による細胞生存率確認試験、及び、インターロイキン１α測定によって行う。アポトーシスはカスパーゼ−１の定量によって行う。
【００６２】
有利には、上記画期的方法で調製したリポソームを使用すれば、上記の蛍光性トレーサーを化粧品、皮膚化粧品又は医薬品の有効成分で置き換えることにより、この有効成分の細胞内浸透の増加を誘導できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
当業者には、本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の実施例を参照した説明から明らかであろう。実施例は本発明に不可欠であり、また、実施例を含む本明細書全体の中に記載される従来技術に照らして新規の特徴は全て、その機能、概略共に本発明に不可欠である。上記より、実施例は全て、一般的な範囲を示す。また、実施例において、特に指示のない限り、割合は重量で、温度は摂氏で、圧力は大気圧で表す。
【００６４】
図面の説明
添付する図１〜４は、本発明による、あらかじめ選択したトレーサー２種、それぞれＰＢＦ−Ｆ及びＴＲＩＴＣの細胞内浸透を視覚化したものである：
−図１は、１０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦ−Ｆを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図２は、４０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦ−Ｆを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図３は、１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
−図４は、１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％及びＰＥＩを３％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【実施例１】
【００６５】
＜蛍光性トレーサーを封入したリポソームの調製及び精製＞
蛍光性トレーサーは、例えば放射能という点で安全なだけでなく、定量の際、及び、細胞培養モデルにおける細胞内浸透を視覚的に明らかにする際、非常に簡単に使用できるという利点がある。トレーサーを選抜するために、様々な水溶性又は脂溶性トレーサーを０．０１％含むリポソームを調製し、正常ヒト繊維芽細胞上にこれを塗布する前に精製して未封入のトレーサーを除去する。同時に、蛍光性トレーサーを用いずにリポソームコントロールを調製する。
【００６６】
ａ）リポソーム調製プロトコールの選択
リポソームを、ｐＨ５に調節したＴｒｉｚｍａ希釈バッファー（シグマ社、フランス）５５ｍＭ−２７ｍＭＮａＣｌ中に濃度２０％で溶解した大豆レシチンを用いて調製する。常温で磁気により３０分間撹拌した後、混合物を１０分間非常に激しくホモジナイズする。その後、リポソームをＤＦ培地［仔ウシ血清１０％、ペニシリン最終濃度１００ＵＩ／ｍＬ、ゲンタマイシン最終濃度１μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ最終濃度１μｇ／ｍＬを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ））／Ｈａｍ Ｆ１２ ｇｌｕｔａｍａｘ］中に希釈して、大豆レシチンの濃度を変える（０．５、１、２、３、４、５、７．５、１０％）。
【００６７】
腹部の生検（ｐｌａｓｙ）から抽出して９６ウェルプレート中で培養した正常ヒト繊維芽細胞培養細胞上に、リポソーム懸濁液２５０μＬを添加する。それぞれの濃度について、６つの異なるウェル上で試験する。ｐＨ７．４のリン酸バッファーで３回洗浄した後、細胞生存率を、パラニトロフェニルリン酸を用いて細胞内のアルカリフォスファターゼ活性を測定する試験によって評価する。培養ウェル中にリポソームを添加せずに作成したコントロールに対して、生細胞の割合を計算する（ｎ＝６）。この結果から、上限７．５％までのレシチン濃度において、細胞生存率が８５％を超えることが分かる。レシチン１０％においては、生存率が、許容される閾値７５％を下回る。細胞生存率が９０％を超えることを可能にする濃度である５％を選択する。
【００６８】
ｂ）蛍光性トレーサーを封入した５％大豆レシチンリポソームの調製
大豆レシチン０．５ｇ、製造者の推奨によりあらかじめ可溶化した蛍光性トレーサー０．０１％をディッシュ中に導入し、Ｔｒｉｚｍａバッファー１０ｍＬ中に希釈する。常温で磁気により３０分間撹拌した後、混合物を１０分間非常に激しくホモジナイズしてリポソーム溶液を得る。この溶液中においてリポソームは平均的な大きさである。平均的な大きさとは、正確なホモジナイズ条件に応じて１００〜８００ｎｍの範囲内である。
【００６９】
リポソーム中に封入されていないトレーサーの画分をリポソーム中に封入されたトレーサーの画分から分けるために、精製する。精製は、リポソーム溶液を常温において円錐管中で１０分間、１７９０ｇにて遠心分離して行う。その後プラグ（ｐｌｕｇ）を回収し、培地１０ｍＬ中に可溶化する。リポソームネガティブコントロールを、上記プロトコールによって蛍光性トレーサーを用いずにつくる。試料を遮光状態で４℃において２４時間保持する。様々な種類の蛍光性トレーサー、すなわちｐＨ感受性トレーサー、カルシウム感受性トレーサー等を用いて、リポソームを２６種作る。
【実施例２】
【００７０】
＜リポソーム中に封入でき、正常ヒト繊維芽細胞培養細胞中に自発的に浸透しない蛍光性トレーサーの選択＞
トレーサーを選抜するために、実施例１に記載のプロトコールにより、多様な水溶性又は脂溶性トレーサーを様々な濃度で含むリポソームを調製して精製する（表１）。
【００７１】
表１：トレーサーとしての蛍光性プローブの選択
【００７２】
【表１】
【００７３】
コントロール（フリーの蛍光性トレーサー）を、上記と同じ濃度で蛍光性トレーサーを希釈バッファー中に溶解してつくり、細胞毒性及び繊維芽細胞への自発的浸透を定量する。並行して、蛍光性トレーサーを全く含まないネガティブコントロールとしてのリポソームとの比較を行う。実際には、腹部の形成外科手術に由来する生検から繊維芽細胞を抽出し、ＤＦ培地中で増殖させる。ＤＦ培地とはすなわち、仔ウシ血清１０％、ペニシリン最終濃度１００ＵＩ／ｍＬ、ゲンタマイシン最終濃度１μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ最終濃度１μｇ／ｍＬを添加した、５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｈａｍ Ｆ１２ ｇｌｕｔａｍａｘである。
【００７４】
まず、遠心分離により精製したリポソームをＤＦ培地中に添加後、ボルテックスを用いてホモジナイズし、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社、ＭＷ２４）中で培養した繊維芽細胞上に１ｍＬ／ウェルの割合で注入する。同様の条件でコントロールをつくる。無処理コントロールもつくる。繊維芽細胞をリポソームの存在下で３７℃において２４時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄する。そしてまず、蛍光を、分光蛍光計によりＣｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００（Ｒ）（ミリポア社）を用いて乾燥状態で測定する。次に、目的の分子についての細胞内の蛍光を、オリンパス社製倒立顕微鏡（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＩＸ７０）により、対応する励起フィルターを用いて観察する（対物１０倍、４０倍及び１００倍）。最後に、実施例１に記載するように、蛍光性トレーサーの細胞毒性を９６ウェルプレート中で２４時間インキュベートすることにより測定する。
【００７５】
得られた結果から、試験した分子２５種のうち、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセインＰＦＢ−Ｆ（Ｐ１２９２５分子プローブ）及びテトラメチルローダミンイソチオシアネートＴＲＩＴＣ（Ｔ−４９０分子プローブ）だけが、リポソーム中への封入、繊維芽細胞上への２４時間の投与、及び、リポソーム内容物の浸透の定量の結果、興味深いポジティブな結果を示すことが分かった。
【００７６】
添付する図１〜４は、あらかじめ選択したトレーサー２種、ＰＢＦ−Ｆ及びＴＲＩＴＣを濃度０．０１％でリポソーム中に封入して、繊維芽細胞とともに２４時間インキュベートした後、その細胞内浸透を視覚化した写真である。
【００７７】
表２：トレーサーのスクリーニングの結果
【００７８】
【表２】
【００７９】
ＴＲＩＴＣは、標識は強いが（表１及び添付図１〜４）、わずかではあるが細胞毒性を有し、培地中にフリーの状態で添加した場合にわずかに浸透する。従って、ＰＦＢ−Ｆの方がより良好なトレーサーであるようである。
【実施例３】
【００８０】
＜ポリエチレンイミンが存在する場合又は存在しない場合の、ＰＦＢ−Ｆ（ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）存在下における細胞内浸透に関する研究＞
大豆レシチンを５％、及び、ＰＦＢ−Ｆ又はＴＲＩＴＣを０．０１％含み、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２５ｋＤａ）を０．５％含む又は含まないリポソームを実施例１に記載するプロトコールによって調製し、実施例２に記載するように、２４ウェルプレート中で培養したヒト繊維芽細胞上に添加して２４時間インキュベートした後で、その細胞内浸透を調べる。
【００８１】
得られた結果から、ＰＥＩを添加すると、ＰＦＢ−Ｆリポソームの浸透が１３．７倍刺激され、一方、ＴＲＩＴＣリポソームの浸透が１６分の１に減少することが分かる（添付図１〜４の写真を参照）。従って、トレーサーとして最後まで保留できるのは、リポソーム中に０．０１％の濃度で封入したＰＦＢ−Ｆ（ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン）である。
【実施例４】
【００８２】
＜ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ＰＦＢ−Ｆ）を含むリポソームの安定性に関する研究＞
リポソームの安定性を、ＤＦ培地中への蛍光性トレーサーの放出を分光蛍光計を用いて調べることによって評価する。この研究は、ｐＨ、イオン強度、及び、界面活性剤の存在について行う。実際には、大豆レシチンを５％、ＰＦＢ−Ｆを０．０１％、及び、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を５０μＭ含むリポソームを調製する。リポソーム溶液のｐＨを６、７、８、９に調節する；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を５０、１００、１５０、２００ｍＭに調節し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度を０．１、０．５、１、３％に調節する。得られた結果を表３中に示す。
【００８３】
表３：放出と、界面活性剤の存在、イオン強度及びｐＨとの関係に関する研究
【００８４】
【表３】
【００８５】
結果から、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を５０μＭ含むリポソームが不安定になり始めるのは、ＮａＣｌの濃度が２００ｍＭの時、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＳＤＳの濃度が０．５％の時、ｐＨが７より高い時であることが示唆される。
【実施例５】
【００８６】
＜蛍光性トレーサーＰＦＢ−Ｂの封入率とポリエチレンイミン濃度＞
リポソームを、実施例５に記載する方法に従い、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）の濃度を０〜１００μＭの範囲で増加させて調製する。１７９０ｇで１０分間遠心分離した後、上清を分光蛍光計によって定量する。封入率を初期濃度に対して計算する。結果を表４中に示す。
【００８７】
表４：ＰＦＢ−Ｆの封入率とＰＥＩ濃度
【００８８】
【表４】
【００８９】
封入率は、ＰＥＩ濃度上昇の影響を受けないことが分かる。
【実施例６】
【００９０】
＜様々な濃度のポリエチレンイミンを含む蛍光性リポソームのスクリーニング条件の開発＞
リポソームを、実施例１に記載するプロトコールに従い、ポリエチレンイミン（６Ｎ塩酸で中和したＰＥＩ（２５ｋＤａ））の濃度を変えて、すなわち０、５、１０、５０μＭの濃度で、かつ、ＰＦＢ−Ｆの濃度は０．０１％で調製する。２４ウェルプレート中で単層培養した繊維芽細胞上にリポソームを添加して２、４、６、２４及び４８時間インキュベートし、ｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄した後、無処理の繊維芽細胞ブランクを基準として、かつ、同じ濃度のフリーのＰＦＢ−Ｆを基準として分光蛍光計によって定量する。結果を表５中に示す。
【００９１】
表５：ＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透と、時間及びＰＥＩ濃度との関係に関する研究（各条件につきｎ＝４）（任意の蛍光単位で表す）
【００９２】
【表５】
【００９３】
ＰＥＩ濃度が５０μＭで、かつ、繊維芽細胞上で２４時間以上インキュベートする場合に最も良い結果が得られる。この条件は、細胞内浸透を刺激する分子をスクリーニングするために使用することとする。上記結果は、フリーのプローブコントロール（ｐ＜０．０５）に対して、濃度が５μＭ以上の全ての試験において統計的に有意である。
【実施例７】
【００９４】
＜ポリエチレンイミンを５０μＭ含む蛍光性リポソームの、時間経過による細胞内浸透及び細胞毒性の調査＞
実験は、ＰＥＩ濃度０〜１００μＭについて実施例６に従って行う。蛍光の定量は実施例６に従って行う。細胞内浸透の刺激は、ＰＥＩを含まないリポソームに対する刺激率として表す。
【００９５】
細胞生存率は、９６ウェルプレート中（１ウェル当たりリポソーム溶液２５０μＬ）において、アルカリフォスファターゼ活性を細胞層について評価する試験（パラニトロフェニルリン酸を用いた試験、ｎ＝６）によって行う。細胞生存率確認試験の結果を、ＰＥＩを含まない蛍光性リポソームコントロールに対して、生細胞の割合として表す。ＩＬ１αの測定（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を、２４時間インキュベート後に採取した培地について行い、並行して、総タンパク質の測定（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、シグマ社）も行う。結果を表６及び表７中に示す。
【００９６】
表６：ＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透率及び細胞毒性と、時間及びＰＥＩ濃度（各条件につきｎ＝４）
【００９７】
【表６】
【００９８】
表７：ＩＬ１α（ｐｇ）／総タンパク質（ｍｇ）の測定
【００９９】
【表７】
【０１００】
結果から、この実験においてＰＥＩの存在下で、蛍光性トレーサーの浸透率を３４倍まで上昇可能であることが分かる。しかしながら、ＰＥＩ（２５ｋＤａ）濃度が５０μＭの際に、無視できない細胞毒性現象が２４時間後から観察され、４８時間後には、半数を超える細胞が死んだことが観察されている。ＩＬ１αの合成については、濃度５０μＭにおける刺激が１．６倍であり、１００μＭにおいては２．６倍である。従ってこの分子は、顕著な炎症性ストレスを引き起こす。
【実施例８】
【０１０１】
＜リポソーム中に封入した蛍光性トレーサーの細胞内浸透を刺激する分子のスクリーニング＞
リポソームを、実施例５に記載するように、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、塩酸でｐＨ７に中和した試験分子１、０．１、０．０１％を用いて、必要であればＴｒｉｚｍａ希釈バッファー中で、調製する。
【０１０２】
まず分子５５種を３項目について試験し、５０μＭのＰＥＩ（２５ｋＤａ）と比較する。細胞内浸透を、実施例２に記載するように、２４ウェルプレートの中で培養した正常ヒト繊維芽細胞上で２４時間インキュベートした後、定量する。細胞生存率を、９６ウェルプレート中でリポソーム懸濁液２００μＬについて測定する。１％の濃度について得られた結果を表８中に示す。
【０１０３】
【表８−１】
【０１０４】
【表８−２】
【０１０５】
スクリーニングを行った結果、蛍光性トレーサーの細胞内浸透を１０％を超えて刺激できる分子１５種を選抜した。濃度１％において細胞生存率は多様である（３７〜９９％）。蛍光性トレーサーの視覚化により、浸透を３２％を超えて刺激する分子の浸透が確認された。これらの分子を優先的に保留する。
【実施例９】
【０１０６】
＜細胞内浸透の刺激に及ぼす分子構造の影響＞
上述の実施例の記載に従って、アルキル鎖長３〜１８の１級脂肪族モノアミンを含むリポソームの調製、及び、蛍光標識の細胞内浸透の定量を行う。結果を表９中に示す。
【０１０７】
表９：細胞内浸透の刺激と炭素含有鎖長
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
長さの異なる脂肪鎖を有する脂肪族アミンをリポソーム膜中に封入して調べることにより、炭素含有鎖の長さが、レシチンを５％含むリポソーム中に封入したＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透を刺激する活性に及ぼす影響が明らかになる。脂肪酸は鎖長の観点から大まかに、短鎖（炭素数８未満）、中鎖（炭素数１０〜１８）及び長鎖（炭素数１８超）に分類される。この分類法を適用すると、本研究の範囲内で試験した１級脂肪族アミンは、中鎖である場合に、細胞内浸透を刺激する特性をリポソームに付与するようである。
【実施例１０】
【０１１０】
＜細胞内浸透に及ぼす立体障害の影響＞
レシチン５％を含むリポソーム中に封入した蛍光性トレーサーの細胞内浸透を刺激できる分子の特徴を十分定義するために、本発明者らは、これらの分子の潜在的な刺激活性に及ぼす立体障害の影響を観察した。従って、本発明者らは、１級脂肪族モノアミンの存在下におけるリポソーム中に封入したＰＦＢ−Ｆの細胞内浸透について調べ、また、２級脂肪族モノアミンについても調べた。実施例８に記載するように、１級又は２級脂肪族アミンを含むリポソームの調製、及び、蛍光マーカーの細胞内浸透の定量を行う。結果を表１０中に示す。ジアミンでは、マーカーの細胞内浸透がそれほど良好ではない。
【０１１１】
表１０：細胞内浸透の刺激と炭素含有鎖の数
【０１１２】
【表１０】
【実施例１１】
【０１１３】
＜細胞内浸透に及ぼす立体障害の影響＞
特に実施例９又は１０に記載するように進行するにつれ、炭素含有鎖の長さは、リポソーム内容物の細胞内浸透の刺激において介在する唯一の因子ではないことが分かる。実際、リポソーム中に封入される下記化１中の化学構造を比較すると、特定のＲ基によってＣ１２の炭素含有鎖が干渉されることが分かる。
【０１１４】
【化１】
【０１１５】
４級化分子Ｙ及びＡは当業者に公知の物質である。封入された４級化分子（市販の分子）の立体障害は、レシチンを含むリポソームの細胞内浸透の刺激に関与している。次の種類の分子（表１１）は、例えば、１％で使用して、細胞内浸透を上限＋３９％の範囲で刺激できる。その他、アーモンド、エンドウ豆、ジャガイモ又は藻類から抽出した分子の４級化加水分解物も使用できる。
【０１１６】
【表１１】
【実施例１２】
【０１１７】
＜（細胞内浸透を刺激する）機能性分子の最適な濃度＞
蛍光性トレーサーの細胞内浸透の刺激を、異なる濃度の機能性分子について試験し、最適な濃度を選抜する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液を溶解してリポソームを形成する。実施例２に記載するように、細胞内浸透及び細胞毒性を測定する。得られた結果を表１２中に示す。
【０１１８】
表１２：細胞内浸透を刺激する分子の濃度、刺激率、及び、細胞生存率に関する研究
【０１１９】
【表１２】
【０１２０】
これより、所望の細胞内浸透は、機能性分子の濃度、及び、許容される最大の細胞毒性によって変わる。
【実施例１３】
【０１２１】
＜ポリエチレンイミンと選択した４級化大豆との炎症作用の比較＞
インターロイキン１α合成の刺激を、５０μＭのＰＥＩで機能化したリポソーム、及び、様々な濃度の４級化大豆溶液について比較する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液又はＰＥＩ５０μＭを溶解してリポソームを形成する。ＩＬ１α濃度を、実施例７に記載するようにキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定する。並行して、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を用いた試験により、ウェル当たりの細胞数を測定する。ＩＬ１α濃度の結果を、得られたＰＮＰＰの光学密度と比較する。得られた結果を表１３中に示す。
【０１２２】
表１３：インターロイキン１αの合成に及ぼす機能性分子（ＰＥＩ及び４級化大豆）の影響
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
得られた結果から、上記で選択した４級化大豆の溶液が、細胞毒性、及び、（基準分子ＰＥＩに関しては非常に小さい）炎症性ストレスを誘導することが分かる。
【実施例１４】
【０１２５】
＜ポリエチレンイミンと選択した４級化大豆とのアポトーシス効果の比較＞
インターロイキン１αの合成の刺激を、５０μＭのＰＥＩで機能化したリポソーム、及び、様々な濃度の４級化大豆溶液について比較する。実際には、Ｔｒｉｚｍａ希釈バッファー中に、大豆レシチン５％、ＰＦＢ−Ｆ０．０１％、及び、０．５〜２．５％４級化大豆溶液又はＰＥＩ５０μＭを溶解してリポソームを形成する。カスパーゼ−１の濃度をキット（Ｃａｓｐａｓｅ−１ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定する。並行して、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を用いた試験により、ウェル当たりの細胞数を測定する。カスパーゼ−１の濃度の結果を、得られたＰＮＰＰの光学密度と比較する。得られた結果を表１４中に示す。
【０１２６】
表１４：カスパーゼ−１の濃度に及ぼす機能性分子の影響
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
得られた結果から、上記で選択した４級化大豆の溶液が、細胞毒性、及び、（基準分子ＰＥＩに関しては非常に小さい）アポトーシスストレスを誘導することが分かる。
【実施例１５】
【０１２９】
＜透過型電子顕微鏡を用いた実施例１４のリポソーム組成物の構造の観察＞
４級化大豆溶液２％を用い、有効成分及び蛍光性トレーサーを添加せずに調製したリポソームを、透過型電子顕微鏡を用いて観察した。リポソームのネガティブ染色を、重金属塩で多重ラメラ小胞の二分子層間を満たすことにより行う。フィリップス社ＣＭ１２０電子顕微鏡を倍率３０〜６００００で用いて観察する。この観察から、多重ラメラ構造に特徴的な同心円状の脂質層の存在が明らかである。観察されたリポソームの大きさの平均値は１５０〜２５０ｎｍである。
【実施例１６】
【０１３０】
＜実施例１１の４級化大豆溶液を用いることによる、抗ラジカル保護に及ぼす刺激＞
リポソームを、大豆レシチン５％、天然ビタミンＥ０．２％、及び、実施例１１の２％４級化大豆溶液（分子Ｙ）を用いて調製する。実際には、天然ビタミンＥ０．４ｇを、大豆レシチン１０ｇ及び９６％エタノール１０ｍＬに添加する。この溶液を、磁気により撹拌しながら、常温で遮光状態において１晩蒸発させる。エタノールを蒸発させた後、脱イオン水１００ｍＬを添加する。この混合物を完全に溶解するまで撹拌する。
【０１３１】
次に、リポソームを、レシチン−ビタミンＥ溶液５ｍＬ、４級化大豆溶液１９０μＬ（すなわち２％）及びＴｒｉｚｍａ希釈バッファー（５５ｍＭ）４．８０ｍＬを加えて調製し、ｐＨ５に調節したＮａＣｌ（２７ｍＭ）を磁気により撹拌しながら遮光状態で３０分間かけて混合する。その後、この溶液を最高速度で１０分間ホモジナイズし、変性リポソームを形成する。一方でこの同じ溶液をホモジナイズせずに調製し、フリーのビタミンＥコントロールとする。
【０１３２】
天然ビタミンＥを基盤とするリポソームを、細胞毒性を防ぐためにＰＥＩ（２５ｋＤａ）１０μＭの存在下で、かつ、機能性分子なしで調製する。正常ヒト繊維芽細胞を２４ウェルプレート中に播種し、コンフルエントになるまで培養する。カルシウム及びマグネシウムを含むｐＨ７．４のリン酸バッファー（インビトロジェン社）で３回洗浄した後、それぞれの溶液を培地中に二倍希釈して少なくとも２時間インキュベートする（すなわちビタミンＥの最終濃度０．１％）。ウェルに培地のみを注入してインキュベートしたものを以下でプローブコントロールとして用いる。カルシウム及びマグネシウムを含むｐＨ７．４のリン酸バッファー中で３回洗浄してリポソーム及びフリーのビタミンＥを除去した後、細胞層を、次のように調製したジヒドロローダミン１２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）溶液２００μＬ／ウェルの存在下でインキュベートする：１ｍＭのジヒドロローダミン１２３溶液１５０μＬをＨＢＳＳバッファー１５ｍＬに溶解して調製。プレートは４９０〜５３０ｎｍにおいて蛍光を読み取り、９１２ｎｍのＵＶＢを０．８Ｊ／ｃｍ２で照射して、蛍光を同じ波長で再度読み取る。結果を比率で表す。
Ａ＝照射／非照射（Ｉ／ＮＩ）。
Ｂ＝（Ｉ／ＮＩリポソーム）／（Ｉ／ＮＩプローブコントロール）
Ｃ＝リポソーム化ビタミンＥ／フリーのビタミンＥ
【０１３３】
使用した蛍光性プローブにより、細胞内反応性酸素媒体の存在を調べることができる。というのは、細胞内反応性酸素媒体は細胞膜を通って受動分散し、そこでカチオン性ローダミンに酸化され得るからである。蛍光性プローブは、例えば過酸化水素及びペルオキシ亜硝酸と能動的に反応する。得られた結果を表１５中に示す。
【０１３４】
表１５：改変リポソームによる抗ラジカル保護
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
これらの結果から、４級化大豆タンパク質によって機能化されたリポソームにより、非機能性リポソームと比較してラジカルストレスに対する保護効果が２０％を超えて大きくなるが、一方、基準分子ＰＥＩによって機能化されたリポソームについては保護効果が観察できないだけでなく、別のストレスが発生していることが示される。
【実施例１７】
【０１３７】
＜本発明の物質による脱色素作用に及ぼす刺激＞
リポソームを次のプロトコールに従って調製した：大豆レシチン５％に、２％４級化大豆溶液又はＰＥＩ１０μＭを添加する、又は、添加しない。ここに、有効成分も共に封入する：防腐剤０．０５％を含まないＰｈｙｔｏｌｉｇｈｔ（Ｒ）（コレティカ社、リヨン、フランス）（植物有効成分の混合物）、アルブチン０．０５％及びカテキン（シグマ社）１ｍＭ。この分子を、フリーの状態で、又は、レシチン５％リポソーム中に封入して、又は、ＰＥＩ１０μＭで若しくは４級化大豆２％で機能化したリポソーム中に封入して、２４ウェルプレート中でプレコンフルエントまで培養した正常ヒトメラノサイト上に添加した。リポソーム化した又はしていない有効成分を、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において６６時間、ＭＭＫ２培地（シグマ社）中でインキュベートする。カルシウム及びマグネシウムを含むリン酸バッファー（インビトロジェン社）で３回洗浄して、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％含むリン酸バッファー中に抽出した後、チロシナーゼ活性を、Ｌ−ＤＯＰＡ及びＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）の存在下で測定することにより定量する。ＭＢＴＨ−ｏ−キノン化合物の形成を、速度論的に測定した４９０ｎｍにおける吸光度の値により明らかにする。チロシナーゼ活性を、酵素反応の傾斜（割合）によって表す。結果を表１６中に示す。
【０１３８】
表１６：リポソーム化又は非リポソーム化有効成分の脱色素効果（酵素反応速度で表す）
【０１３９】
【表１６】
【０１４０】
これらの結果から、共に封入した有効成分は、機能化されると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける正常ヒトメラノサイトのチロシナーゼ活性の阻害を増大できることが分かる。４級化大豆による機能化は、ＰＥＩの添加によるものと比較して、植物抽出物の複合体についてはより効果が大きく、アルブチンについては同等であり、カテキンについてはわずかに効果が小さい。全ての場合において、活性は、非機能性リポソームと比較して少なくとも２．３倍大きい。
【実施例１８】
【０１４１】
＜本発明の物質の大きさを小さくする方法＞
リポソームの大きさを、高圧ホモジナイザーを使用することによって小さくできる（作業圧力は１０００バール超、好ましくは２０００バール超、より好ましくは３０００バール超）。この装置を用い、３０００バールにおいて約５０ｎｍのリポソームが得られる。リポソームの大きさを、実施例１５に記載するように、レーザー粒径測定器（ベックマンコールター社、Ｎ４ ｐｌｕｓ（サブミクロン粒子アナライザー）及び透過型電子顕微鏡を用いて調べた。
【実施例１９】
【０１４２】
＜経皮浸透後に本発明の物質によって保持される物質の浸透の立証：蛍光性トレーサー、ビタミンＥ又は遺伝物質についての実施例＞
フリーの形態の、又は、実施例１１中で選択した２％４級化大豆溶液を含む若しくは含まない実施例１２に記載のリポソーム中に封入した形態の、蛍光性分子（０．０１％ＰＦＰ−Ｆ）の浸透を、ヒト皮膚上における経皮浸透によって定量した。分散速度を分光蛍光計によって３〜２４時間測定した。また、更に２４時間後の放出量を測定した。そして貯蔵量も測定した。１条件について、５つの試料を試験した。これから得られた表１７中に示す結果から、ベクトル化（ｖｅｃｔｏｒｉｓｅｄ）していない形態又は４級化物質なしでベクトル化した形態と比較して、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、蛍光性トレーサーの分散、放出及び貯蔵を著しく刺激できることが分かる。
【０１４３】
【表１７】
【０１４４】
フリーの形態の、又は、実施例１１中で選択した２％４級化大豆溶液を含む若しくは含まない実施例１２に記載のリポソーム中に封入した形態の、ビタミンＥ分子（０．５％）の浸透を、ヒト皮膚における経皮浸透によって定量した。分散速度を高速液体クロマトグラフィーによって５〜２４時間測定した。また、更に２４時間後の放出量を測定した。そして貯蔵量も測定した。得られた結果から、ベクトル化していない形態又は４級化物質なしでベクトル化した形態と比較して、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、ビタミンＥの分散、放出及び貯蔵を著しく刺激できることが分かる。
【０１４５】
経皮浸透について、上記と同じ実験を、２％大豆溶液の存在下における実施例１２に記載のリポソーム中に蛍光性遺伝物質（２００ｍＭ）を封入して又は封入せずに実施した。エピ蛍光光学顕微鏡による皮膚断面の観察から、４級化大豆の存在下で調製したリポソームを使用すると、遺伝物質を真皮深層へ分散させることができることが分かる。
【０１４６】
二重鎖エラスチン１９−２０の蛍光性プローブの配列：
センス：５’−（ＦＩＴＣ）ＡＧＣＵＧＣＵＡＡＧＧＣＵＧＧＣＧＣＵＴＴ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＵＵＡＧＣＡＧＣＵＴＴ−３’
【実施例２０】
【０１４７】
＜水中油エマルション型の化粧製剤又は医薬製剤における本発明の物質の使用＞
「製剤２０ａ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
Ｂ
ステアリン酸グリコールＳＥ １４
トリイソノナオイン（Ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ） ５
ヤシ油脂肪酸オクチル ６
Ｃ
ｐＨ５．５に調整したブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【０１４８】
「製剤２０ｂ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ポリアクリルアミド、イソパラフィン、 ２．８
ラウレス−７
Ｂ
ブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
２
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン ０．５
ブチレングリコール
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【０１４９】
「製剤２０ｃ」
Ａ
カルボマー ０．５０
プロピレングリコール ３
グリセリン ５
水 ｑｓｐ １００
Ｂ
ヤシ油脂肪酸オクチル ５
ビサボロール（Ｂｉｓａｂｏｌｏｌ） ０．３０
ジメチコン ０．３０
Ｃ
水酸化ナトリウム １．６０
Ｄ
フェノキシエタノール、 ０．５０
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｅ
香料 ０．３０
Ｆ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２１】
【０１５０】
＜油中水型の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸 ３
カプリン酸トリグリセリド ３
オクタン酸セテアリル ４
アジピン酸ジブチル ３
ブドウ種子油 １．５
ホホバ油 １．５
フェノキシエタノール、 ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
グリセリン ３
ブチレングリコール ３
硫酸マグネシウム ０．５
ＥＤＴＡ ０．０５
水 ｑｓｐ １００
Ｃ
シクロメチコン １
ジメチコン １
Ｄ
香料 ０．３
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２２】
【０１５１】
＜三層エマルション型の製剤における本発明の物質の使用＞
「第一のエマルション Ｗ１／Ｏ」
Ａ
ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸 ４
カプリン酸トリグリセリド ７．５
イソヘキサデカン １５
ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル（Ｓｔｅａｒｕｌ ｅｔｈｅｒ） ７．５
Ｂ
水 ６５．３
Ｃ
フェノキシエタノール、 ０．７
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
【０１５２】
「第二のエマルション Ｗ１／Ｏ／Ｗ２」
Ａ
第一のエマルション ６０
Ｂ
ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７ ２
フェノキシエタノール、 ０．３
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３ジオール
水 ｑｓｐ１００
Ｃ
カルボマー １５
Ｄ
トリエタノールアミン ＰＨ６．０〜６．５
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２３】
【０１５３】
＜口紅等の無水製品状の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ミネラルワックス １７．０
イソステアリン酸イソステアリル ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴン ２．６
イソステアリン酸プロピレングリコール １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ ３．０
水添パーム核油脂肪酸グリセリド、 ３．４
水添パーム油脂肪酸グリセリド
ラノリン油 ３．４
ゴマ油 １．７
乳酸セチル １．７
鉱物油、ラノリンアルコール ３．０
Ｂ
ヒマシ油 ｑｓｐ １００
二酸化チタン ３．９
ＣＩ １５８５０：１ ０．６１６
ＣＩ ４５４１０：１ ０．２５６
ＣＩ １９１４０：１ ０．０４８
ＣＩ ７７４９１ ２．０４８
Ｃ
本発明の物質 ０．０１〜５％
【実施例２４】
【０１５４】
＜水性ゲル（アイライナー、スリミング剤等）の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
水 ｑｓｐ １００
カルボマー ０．５
ブチレングリコール １５
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
【実施例２５】
【０１５５】
＜本発明の物質を含む医薬製剤の調製＞
「製剤２５ａ：錠剤の調製」
Ａ
賦形剤 １錠当たりのｇ
ラクトース ０．３５９
スクロース ０．２４０
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１
【０１５６】
「製剤２５ｂ：軟膏の調製」
Ａ
賦形剤
低密度ポリエチレン ５．５
流動パラフィン ｑｓｐ１００
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１
【０１５７】
「製剤２５ｃ：注射用製剤の調製」
Ａ
賦形剤
等張食塩水 ５ｍＬ
Ｂ
本発明の物質 ０．００１〜０．１ｇ
Ａ相及びＢ相は別々のアンプル中に封入し、使用前に混合する。
【実施例２６】
【０１５８】
＜本発明の物質の化粧品としての許容性の評価＞
（活性成分を封入していない）実施例１５によって得られた化合物について、ウサギにおける皮膚及び眼刺激試験、ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、並びに、モルモットにおける感作性試験によって毒性試験を行った。
【０１５９】
＜ウサギの皮膚における一次刺激の評価＞
上記製剤を、ウサギ３匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関するＯＥＣＤ推奨の方法に従って、希釈せずに０．５ｍＬずつ塗布した。上記物質を、１９８２年２月２１日のフランス共和国の公式機関紙（「ＪＯＲＦ」）で公表された、１９８２年２月１日の決議で定義された基準に従って分類した。上記試験結果から、実施例１２によって得られた化合物を含む製剤は、皮膚に対して刺激がないと結論づけることができた。
【０１６０】
＜ウサギにおける眼刺激試験＞
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関して１９８７年２月２４日にＯＥＣＤ指令書４０５番によって推奨されている方法に従い、ウサギ３匹の眼中に０．１ｍＬを１回で滴下した。この試験の結果から、これらの製剤は、眼に対して刺激がないものと考えることができる。
【０１６１】
＜ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験＞
上記製剤を、１９８７年２月２４日のＯＥＣＤ指令書４０１番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット５匹及び雌ラット５匹に、５ｇ／体重１ｋｇの量を１回で経口投与した。ＬＤ０及びＬＤ５０は、５０００ｍｇ／ｋｇを超えることが分かった。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
【０１６２】
＜モルモットにおける潜在的皮膚感作性の評価＞
上記製剤に対して、ＯＥＣＤ指令書４０６番に従ったプロトコールであるＭａｇｎｕｓｓｏｎ−Ｋｌｉｇｍａｎｎ極大試験を行った。これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
【０１６３】
＜潜在的突然変異誘発性の評価＞
プロトコールは、ＯＥＣＤ指令書４７１番に従う（指令書９２／６９／ＥＥＣ）。突然変異誘発試験を、≪ネズミチフス菌≫及び≪大腸菌≫について、エームスらの方法に従って実施した（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７５年、３１、３４７−３６４）。５つの菌株を最小培地中で本発明の物質に、（変異原前駆体及び変異原を直接識別するために）外因性代謝活性システムを使用して又は使用せずに、暴露した。インキュベートした後、変異したコロニーを数え、コントロールのうちで自発的に変異したコロニーの数と比較した。本発明の物質は、指令書９２／６９／ＥＥＣの意味において、突然変異活性を有していない。
【０１６４】
＜健康な志願者に対する潜在的感作性の評価＞
本発明の物質の潜在的アレルギー性を、志願者の群に対して評価する。プロトコールは、誘導過程及び誘引試験を含むＭａｒｚｕｌｌｉ及びＭａｉｂａｃｈの方法（Ｃｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、１９７６年、２、１−１７）に従う。この試験は、１８〜６５歳で任意の肌質の、健康な女性及び／又は男性志願者１００人の群に対して実施する。本発明の物質を２０％に希釈して含む閉塞パッチを、各志願者の肩において実施した。パッチは皮膚に直接２４時間接触させておき、２日毎に取り替えて３週間、合計９回実施した。各パッチを除去した後、刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を評価した＝誘導過程。
【０１６５】
２週間後、上記とは別に、本発明の物質を２０％に希釈して含むパッチを、各志願者の皮膚に貼り、皮膚表面に直接２４時間接触させた。刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を、パッチを除去して２４、４８及び７２時間後に評価した＝「攻撃」過程。この研究の志願者１００人中誰も、誘導過程及び「攻撃」過程のどちらにおいても刺激及び皮膚感作の臨床的徴候を示さなかった。上記で保留していた実験条件下において、２０％に希釈した本発明の物質は潜在的なアレルギー性を有していない。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】１０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦＦを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図２】４０倍の対物レンズを用いて見た、ＰＢＦＦを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図３】１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【図４】１００倍の対物レンズを用いて見た、ＴＲＩＴＣを０．０１％及びＰＥＩを３％有するリポソームとともに２４時間インキュベートした繊維芽細胞を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分の細胞内浸透を局所的な塗布によって刺激するためのリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、
ａ）Ｃ１０〜Ｃ１３の脂肪鎖を１つ有する１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン；
ｂ）ステアリン酸アルコニウムクロライド又はココアルコニウムクロライド；並びに
ｃ）式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質
式中、Ｒは植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
からなる群より選択される物質又はその混合物を含む
ことを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、又は、皮膚又は毛髪の着色効果のための請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲは、小麦タンパク質、米タンパク質、及び大豆タンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記１級モノアミンが、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、及び、トリデシルアミンからなる群より選択されるものであるか、又は、Ｃ１０〜Ｃ１３の炭化水素鎖を有するコプラアミンの混合物である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
リポソームは、リポソーム膜を改変する物質の少なくとも１種を脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記リポソーム膜を改変する物質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、及び、ホスファチジルイノシトールから選択される１種又はこれらの混合物である
ことを特徴とする請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記リポソーム膜を改変する物質は、セラミド、スフィンゴリン脂質、及び、グリコスフィンゴ脂質から選択される１種又はこれらの混合物である
ことを特徴とする請求項５に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソームは、大豆、ナタネ、ヒマワリ、ルピナス、ピーナッツ、ゴマ、マロー（ｍａｒｒｏｗ）、ヌカ油、ビッグシードファルスフラックス（ｂｉｇｓｅｅｄ ｆａｌｓｅｆｌａｘ）、キンセンカ、亜麻及び麻からなる群より選択される天然物から抽出したレシチンの少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記リポソームは、コレステロール又はヘミコハク酸コレステロールを膜強化剤として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記リポソームは、界面活性物質又は界面活性剤の少なくとも１種を、前記リポソーム膜を流体化する物質として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記リポソームは、前記リポソームを含む組成物の０．０１重量％の割合で５−ペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセインを含む蛍光物質を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１２】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、リポソームを含む組成物の０．０５重量％〜２５重量％である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、リポソームを含む組成物の０．５重量％〜２．５重量％である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、加水分解、ヒドロキシアルキル化、または加水分解されかつヒドロキシアルキル化若しくはヒドロキシプロピル化されている
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は炭素数１０〜１３のアルキル基である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１６】
Ｒ３は炭素数１２の基（ラウリル）である
ことを特徴とする請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質、又は、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記リポソーム中に存在する又は保持される物質又は有効成分は、抗ラジカル剤、ビタミンＥ、フラボノイド、カロテノイド、ビタミンＣ、脱色素剤、カテキン、ヒドロキノン、アルブチン、フィチン酸、エラグ酸、スリミング剤、キサンチン、皮膚又は毛髪の着色剤、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、及びコレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記リポソームは蛍光化合物の少なくとも１種を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記蛍光化合物は、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）である
ことを特徴とする請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２１】
ａ）リポソーム中に存在する又は保持される少なくとも１種の有効成分；
ｂ）極性リン脂質、及び；
ｃ）少なくともその構造の一部に、前記有効成分の細胞内浸透を刺激する物質又はその混合物であって、前記物質又はその混合物が式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質であるもの
式中、Ｒは米タンパク質又は大豆タンパク質から選択される植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
を含むことを特徴とするリポソーム。
【請求項２２】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、加水分解、ヒドロキシアルキル化、または加水分解されかつヒドロキシアルキル化若しくはヒドロキシプロピル化されている
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２３】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は、炭素数１０〜１３のアルキル基である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２４】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は、炭素数１２のアルキル基、ラウリル基である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２５】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質、又は、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２６】
請求項１又は２１記載のリポソームを、化粧品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする化粧組成物又は皮膚化粧組成物。
【請求項２７】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、最終組成物の０．０５重量％〜２５重量％である
ことを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、最終組成物の０．５重量％〜２．５重量％である
ことを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、又は、皮膚又は毛髪の着色効果を有する、局所的に塗布する化粧組成物又は皮膚化粧組成物であって、
請求項１又は２１記載のリポソームを含む
ことを特徴とする化粧組成物又は皮膚化粧組成物。
【請求項３０】
請求項１又は２１記載のリポソームを、医薬品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする、局所的に塗布する医薬組成物又は皮膚医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１記載のリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）請求項１記載のリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、細胞内浸透を刺激する活性についてスクリーニングされる試験物質、及び、基準物質を配合すること；
ｄ）前記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物からリポソームを形成する方法によって、前記リポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法。
【請求項３２】
請求項２１記載のリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）請求項２１記載のリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、細胞内浸透を刺激する活性についてスクリーニングされる試験物質、及び、基準物質を配合すること；
ｄ）前記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物からリポソームを形成する方法によって、前記リポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法。
【請求項３３】
蛍光化合物の細胞内浸透の結果を、ポリエチレンイミンを含む基準物質について得られた細胞内浸透と比較する
ことを特徴とする請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項１】
有効成分の細胞内浸透を局所的な塗布によって刺激するためのリポソームであって、
少なくともその構造の一部に、
ａ）Ｃ１０〜Ｃ１３の脂肪鎖を１つ有する１級、２級、３級又は４級脂肪族モノアミン；
ｂ）ステアリン酸アルコニウムクロライド又はココアルコニウムクロライド；並びに
ｃ）式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質
式中、Ｒは植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
からなる群より選択される物質又はその混合物を含む
ことを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、又は、皮膚又は毛髪の着色効果のための請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲは、小麦タンパク質、米タンパク質、及び大豆タンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記１級モノアミンが、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミン、及び、トリデシルアミンからなる群より選択されるものであるか、又は、Ｃ１０〜Ｃ１３の炭化水素鎖を有するコプラアミンの混合物である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
リポソームは、リポソーム膜を改変する物質の少なくとも１種を脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記リポソーム膜を改変する物質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、及び、ホスファチジルイノシトールから選択される１種又はこれらの混合物である
ことを特徴とする請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記リポソーム膜を改変する物質は、セラミド、スフィンゴリン脂質、及び、グリコスフィンゴ脂質から選択される１種又はこれらの混合物である
ことを特徴とする請求項５に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソームは、大豆、ナタネ、ヒマワリ、ルピナス、ピーナッツ、ゴマ、マロー（ｍａｒｒｏｗ）、ヌカ油、ビッグシードファルスフラックス（ｂｉｇｓｅｅｄ ｆａｌｓｅｆｌａｘ）、キンセンカ、亜麻及び麻からなる群より選択される天然物から抽出したレシチンの少なくとも１種を単独で又は混合物として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記リポソームは、コレステロール又はヘミコハク酸コレステロールを膜強化剤として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記リポソームは、界面活性物質又は界面活性剤の少なくとも１種を、前記リポソーム膜を流体化する物質として脂質相中に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記リポソームは、前記リポソームを含む組成物の０．０１重量％の割合で５−ペンタフルオロベンゾイルアミンフルオレセインを含む蛍光物質を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１２】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、リポソームを含む組成物の０．０５重量％〜２５重量％である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、リポソームを含む組成物の０．５重量％〜２．５重量％である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、加水分解、ヒドロキシアルキル化、または加水分解されかつヒドロキシアルキル化若しくはヒドロキシプロピル化されている
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は炭素数１０〜１３のアルキル基である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１６】
Ｒ３は炭素数１２の基（ラウリル）である
ことを特徴とする請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質、又は、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質である
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記リポソーム中に存在する又は保持される物質又は有効成分は、抗ラジカル剤、ビタミンＥ、フラボノイド、カロテノイド、ビタミンＣ、脱色素剤、カテキン、ヒドロキノン、アルブチン、フィチン酸、エラグ酸、スリミング剤、キサンチン、皮膚又は毛髪の着色剤、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、及びコレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記リポソームは蛍光化合物の少なくとも１種を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記蛍光化合物は、ペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）である
ことを特徴とする請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２１】
ａ）リポソーム中に存在する又は保持される少なくとも１種の有効成分；
ｂ）極性リン脂質、及び；
ｃ）少なくともその構造の一部に、前記有効成分の細胞内浸透を刺激する物質又はその混合物であって、前記物質又はその混合物が式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質であるもの
式中、Ｒは米タンパク質又は大豆タンパク質から選択される植物タンパク質分子を記号化したものである；Ｒ１及びＲ２は独立してＣ１〜Ｃ６の炭化水素基であり、Ｒ３は炭素数１０〜１８のアルキル基である
を含むことを特徴とするリポソーム。
【請求項２２】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、加水分解、ヒドロキシアルキル化、または加水分解されかつヒドロキシアルキル化若しくはヒドロキシプロピル化されている
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２３】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は、炭素数１０〜１３のアルキル基である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２４】
前記式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質のＲ３は、炭素数１２のアルキル基、ラウリル基である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２５】
式Ｒ−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）型に４級化された植物タンパク質が、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質、又は、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解大豆タンパク質である
ことを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２６】
請求項１又は２１記載のリポソームを、化粧品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする化粧組成物又は皮膚化粧組成物。
【請求項２７】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、最終組成物の０．０５重量％〜２５重量％である
ことを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
細胞内浸透を刺激する物質の濃度は、最終組成物の０．５重量％〜２．５重量％である
ことを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
抗皺効果、抗酸化効果、スリミング効果、皮膚再生効果、又は、皮膚又は毛髪の着色効果を有する、局所的に塗布する化粧組成物又は皮膚化粧組成物であって、
請求項１又は２１記載のリポソームを含む
ことを特徴とする化粧組成物又は皮膚化粧組成物。
【請求項３０】
請求項１又は２１記載のリポソームを、医薬品に許容される賦形剤との混合物として含む
ことを特徴とする、局所的に塗布する医薬組成物又は皮膚医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１記載のリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）請求項１記載のリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、細胞内浸透を刺激する活性についてスクリーニングされる試験物質、及び、基準物質を配合すること；
ｄ）前記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物からリポソームを形成する方法によって、前記リポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法。
【請求項３２】
請求項２１記載のリポソームに保持される物質又は有効成分の細胞内浸透を刺激する物質の少なくとも１種のスクリーニング法であって、
ａ）請求項２１記載のリポソームを形成できる水脂混合物を調製すること；
ｂ）この水脂混合物中への分散工程の前に、蛍光化合物を配合すること；
ｃ）この水脂混合物中への分散工程の前又はその間に、細胞内浸透を刺激する活性についてスクリーニングされる試験物質、及び、基準物質を配合すること；
ｄ）前記段階ｂ）又は段階ｃ）のいずれかにおいて得られる水脂混合物からリポソームを形成する方法によって、前記リポソームを調製すること；
ｅ）細胞内の蛍光を測定することによって、少なくとも蛍光化合物の細胞内浸透を検出すること；
を含む
ことを特徴とするスクリーニング法。
【請求項３３】
蛍光化合物の細胞内浸透の結果を、ポリエチレンイミンを含む基準物質について得られた細胞内浸透と比較する
ことを特徴とする請求項３１または３２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１０８０５６（Ｐ２００９−１０８０５６Ａ）
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６７８６６（Ｐ２００８−２６７８６６）
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【分割の表示】特願２００４−３７０５５２（Ｐ２００４−３７０５５２）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（５００２２６９４８）ビーエーエスエフ ビューティ ケア ソリューションズ フランス エスエーエス (21)
【住所又は居所原語表記】３２ ｒｕｅ Ｓａｉｎｔ Ｊｅａｎ−ｄｅ−Ｄｉｅｕ ６９００７ ＬＹＯＮ， ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【分割の表示】特願２００４−３７０５５２（Ｐ２００４−３７０５５２）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（５００２２６９４８）ビーエーエスエフ ビューティ ケア ソリューションズ フランス エスエーエス (21)
【住所又は居所原語表記】３２ ｒｕｅ Ｓａｉｎｔ Ｊｅａｎ−ｄｅ−Ｄｉｅｕ ６９００７ ＬＹＯＮ， ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
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