近赤外スペクトル領域で非侵襲的にイメージングするのに有用な化合物及び方法を開示する。式中のＱが（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるポリメチン架橋の一部である、式Ｉで表されるシアニン化合物を提供する。式Ｉで表される化合物のバイオコンジュゲート、該化合物を用いた生体分子の標識化方法、及びイメージング方法も包含する。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００９年４月１７日出願の米国仮特許出願第６１／１７０，５７９号、及び２００９年６月５日出願の米国仮特許出願第６１／１８４，７５０号の優先権を主張する。あらゆる目的で参考までにこれらの出願の開示内容を本明細書に引用する。
【０００２】
《発明の背景》
シアニン染料は、種々の用途、例えば、ＤＮＡ塩基配列決定に対するリガンド又は生体分子を標識化するのに広く用いられてきた。（例えば、シアニン染料によるＤＮＡのストランドを同定する典型的な方法についての米国特許第５，５７１，３８８号明細書参照。）科学者が生物学的用途にシアニン染料を好んで用いるのは、他にも理由がある中で、これらの染料の多くが近赤外（ＮＩＲ）のスペクトル領域（６００〜１０００ｎｍ）の蛍光を発するからである。このことにより、シアニン染料は生体分子の自己発光由来の干渉を受けにくくなる。
【０００３】
シアニン染料の他の利点として、例えば、以下を挙げることができる：１）シアニン染料は強く光を吸収しそして蛍光を発する；２）多くのシアニン染料は蛍光顕微鏡下で急速に白化しない；３）有効なカップリング試薬であるシアニン染料誘導体を作ることができる；４）多くの構造及び合成手順を利用することができ、そしてこの種類の染料は多目的に使用することができ；及び５）シアニン染料は比較的小さい（典型的な分子量は約１，０００ダルトンである）ので、標識化された生体分子がその結合部位に到達し又はその機能を果たす能力を低下させることがあるような明らかな立体障害を惹起しない。
【０００４】
それらの利点にもかかわらず、公知のシアニン染料の多くはいくつかの欠点を有している。公知のシアニン染料の中には、バイオアッセイにおいて通常見られる一定の試薬の存在下に安定でないものがある。かかる試薬として、水酸化アンモニウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、第一級アミン、第二級アミン、及び過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を挙げることができる。更に、公知のシアニン染料の中には、生物学的用途、例えば、ＤＮＡ塩基配列決定、ウエスタンブロッティング、インセル（in-cell）ウエスタン免疫蛍光測定法、インビトロ又はインビボ光学的イメージング、顕微鏡検査法、及び遺伝子型決定に必要な熱安定性及び光安定性を欠いているものがあり、一方で、他の染料は対称性ではなく、このことはそれらの染料を高い純度及び収率で合成することをより困難にしている。（対称性の染料の利点については、米国特許第６，７４７，１５９号明細書参照。）
【０００５】
これらの理由のため、安定でかつ対称性のシアニン染料が、生体分子の標識化並びに疾病、例えば、癌の診断及び予後のインビボ・イメージングに用いるのに必要とされる。かかる組成物及び方法は、種々の治療に対する応答の分析に役立つであろう。本発明は、これらの要求及び他の要求を満たす。
【０００６】
《発明の簡潔な概要》
本発明は、化合物、バイオコンジュゲート、標識化の方法、及び非侵襲的に標的分子を測定又は検出する方法を提供し、このようにして上記した当該技術分野の問題を解決する。
【０００７】
このようにして、本発明は、或る実施態様において、式Ｉ：
【化１】

で表される化合物を提供する。
【０００８】
上記式Ｉ中、Ｑは、
【化２】

からなる群から選択されるポリメチン架橋の一部であり；
Ｑは、ポリメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分であり；
【０００９】
Ｒ^１はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されているアルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
【００１０】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アミドアルキル基、アルキルチオアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、若しくはスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している環炭素原子と一緒になって、スピロシクロアルキル環若しくは環外アルケンを形成し、前記スピロシクロアルキル環はＲ^１４０個〜６個によって更に置換されており、前記環外アルケンはＲ^１４０個〜２個によって更に置換されており；
【００１１】
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^４及びＲ^５、並びにＲ^５及びＲ^６からなる群から選択される構成員の対は、前記構成員の対が結合している原子の対と一緒になってアリール環を形成し、前記アリール環はそれぞれＲ^１４０個〜２個によって更に置換されており；
【００１２】
Ｒ^７は水素原子及びアルキル基からなる群から選択される構成員であるか；又は、代わりに、両方のＲ^７は、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、環を形成し、前記環はシクロアルキル環及びヘテロシクリル環からなる群から選択され；そして前記環はＲ^１４０個〜３個又は環外アルケンによって更に置換されており、前記アルケンはＲ^１４０個〜２個によって更に置換されており；
【００１３】
Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、スルホナト基、及び−Ｌ−Ｙ−Ｚからなる群から独立して選択される構成員であり；Ｒ^８及びＲ^９からなる群から選択される正確に１つの構成員は−Ｌ−Ｙ−Ｚであり；
【００１４】
Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員であり；
【００１５】
Ｒ^１３はそれぞれ、ヒドロキシル基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、及びチオアセチル基からなる群から独立して選択される構成員であり；
【００１６】
Ｒ^１４はそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びアルコキシアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であり；前記Ｒ^１４アルキル基又はアルケニル基はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されており；
【００１７】
Ｌは、単結合、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン基、及びＣ_１〜Ｃ_１０アルケニレン基からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；前記アルキレン基又はアルケニレン基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
【００１８】
Ｙは、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＲ^１５−、−ＮＲ^１５Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１５−、−ＮＺ−、−ＮＺＣ（Ｏ）−、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＺ−からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；
【００１９】
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^１６からなる群からの構成員１つによって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
【００２０】
Ｒ^１５は、アルキル基及びアルコキシカルボニルアルキル基からなる群から選択される構成員であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
【００２１】
Ｒ^１６はそれぞれ独立して、活性化アシル基、アジド基、アルキニル基、ホルミル基、グリシジル基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ヒドラジジル基（hydrazidyl）、イソチオシアナト基、ヨードアセトアミジル基、マレイミジル基、メルカプト基、ホスホルアミジチル基（phosphoramidityl）、及びビニルスルホニル基からなる群から選択される構成員であり；前記化合物はバランスの取れた（balanced）電荷を有する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、式ＩＩ：
【化３】

で表されるバイオコンジュゲートを提供する。
【００２３】
上記式ＩＩ中、Ｑ^Ｌは、
【化４】

からなる群から選択されるポリメチン架橋の一部であり；
Ｑ^Ｌは、ポリメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分であり；
【００２４】
Ｒ^１、Ｒ^２ａ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｌ、及びＹは、式Ｉで表される化合物について前記定義した通りであり、
【００２５】
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^Ｌからなる群からの１つの構成員によって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり；そして前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
【００２６】
Ｒ^Ｌはそれぞれ、結合基及びそれによって結合された生体分子を含み、前記化合物はＲ^Ｌ少なくとも１個を含み、そして前記化合物はバランスの取れた電荷を有する。
【００２７】
更に別の実施態様において、本発明は、式Ｉを有する化合物とリガンド又は生体分子とを接触させて式ＩＩで表される対応するバイオコンジュゲート化合物を生成することを含む、式Ｉで表される化合物を用いてリガンド又は生体分子を標識化する方法又はプロセスを提供する。
【００２８】
更にまた別の実施態様において、種々の生物医学的用途において組織及び器官のインビトロ又はインビボの光学的イメージング剤として、式Ｉ又は式ＩＩで表される化合物を用いることができる。或る観点において、本発明は、式Ｉ又は式ＩＩで表される化合物を投与することを含むイメージング方法を提供する。
【００２９】
本発明の更なる観点、目的、及び利点は、以下の詳細な記載及び図面を考慮することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ａ〜Ｄは、本発明の染料８のヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体コンジュゲート（パネルＡ〜Ｂ）と商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０染料（「ＬＩ−ＣＯＲ ６８０」）のＧＡＭ抗体コンジュゲート（パネルＣ〜Ｄ）との間のウエスタンブロット全蛍光の比較を示す。
【００３１】
【図２】Ａ〜Ｄは、本発明の染料８のストレプトアビジンコンジュゲート（パネルＡ〜Ｃ）と商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０ストレプトアビジンコンジュゲート（「ＬＩ−ＣＯＲストレプトアビジン６８０」）（パネルＤ）との間のウエスタンブロット全蛍光の比較を示す。
【００３２】
【図３】Ａ〜Ｂは、パネルＡにメタノール中の化合物８の吸光度及び発光スペクトル（６８０ｎｍ）を；及びパネルＢにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の吸光度及び発光スペクトル（６７６ｎｍ）を示す。
【００３３】
【図４】ＧＡＭ抗体にコンジュゲートした化合物８の１：１ＰＢＳ：メタノール中の吸光度スペクトルを示す。
【００３４】
【図５】ラクトアルブミンにコンジュゲートした化合物８の１：１ＰＢＳ：メタノール中の吸光度スペクトルを示す。
【００３５】
【図６】化合物８を用いて種々のＤ／Ｐで標識化した一連のヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体試料の蛍光スペクトルを示す。
【００３６】
【図７】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０を用いて種々のＤ／Ｐで標識化した一連のヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体試料の蛍光スペクトルを示す。
【００３７】
【図８】化合物８とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０とのＧＡＲ抗体コンジュゲートのＤ／Ｐに応じた相対蛍光を示す。
【００３８】
【図９】Ａ〜Ｂは、５０フェムトモル（fmole）（パネルＡ）；及び２５フェムトモル（パネルＢ）でのＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、化合物８、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０の間の光安定性の比較を示す。
【００３９】
【図１０】Ａ〜Ｂは、化合物８とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０との間の細胞染色及び相対蛍光の比較を示す（パネルＡ）。パネルＢは、蛍光強度を比較する。
【００４０】
【図１１】Ａ〜Ｃは、化合物８で標識化されたＧＡＲ抗体を用いたＨＥＲ２タンパク質の免疫蛍光染色を示す。パネルＡ（「７００チャネル」）：ウサギ抗ＨＥＲ２ｍＡｂ、それに続いてＧＡＲ二次抗体と細胞をインキュベートした。パネルＢ：サイトックスグリーン（Sytox green）を用いて核を染色した。パネルＣに合成画像を示す。サイトックスグリーン検出に対する顕微鏡設定は、スペクトル幅２０ｎｍで中心を４８８ｎｍとする励起フィルターを有していた。ダイクロックを４９５ｎｍに設定し、そして発光フィルターはスペクトル幅５０ｎｍで中心を５２５ｎｍとした。「７００チャネル」についての検出設定は、スペクトル幅６０ｎｍで中心を６２０ｎｍとする励起フィルターを有していた。ダイクロックを６６０ｎｍに設定し、そして発光フィルターはスペクトル幅７５ｎｍで中心を７００ｎｍとした。
【００４１】
【図１２】Ａ〜Ｃは、化合物８（パネルＡ）；ＩＲＤｙｅ６８０（パネルＢ）；及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（パネルＣ）とのβ−アクチンＧＡＭ抗体コンジュゲートのウエスタンブロット全蛍光の比較を示す。
【００４２】
【図１３】細胞溶解物（cell lysate）の増加濃度におけるβ−アクチンＧＡＭ抗体コンジュゲートの蛍光強度の直線性を示す。
【００４３】
【図１４】化合物８、ＩＲＤｙｅ６８０、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０とのｐ３８ＧＡＲ抗体コンジュゲートのウエスタンブロット全蛍光の比較を示す。
【００４４】
【図１５】Ａ〜Ｃは、ＩＲＤｙｅ６８０（パネルＡ）；化合物８（パネルＢ）；及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（パネルＣ）とのＡｋｔＧＡＭ抗体コンジュゲートの２色ウエスタンブロット全蛍光の比較を示す。それぞれの場合において、アクチンに対するウサギｍＡｂ（最下列（bottom series））は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ・ＧＡＲ抗体コンジュゲートを用いて検出した。
【００４５】
【図１６】Ａ〜Ｂは、化合物８、ＩＲＤｙｅ６８０、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０とのＡｋｔＧＡＲ抗体コンジュゲートのウエスタンブロット全蛍光比較を示す（パネルＡ）。一次抗体を用いない対照試験をパネルＢに示す。
【００４６】
《発明の詳細な説明》
《Ｉ．定義》
本明細書中で用いる「活性化アシル基」は、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ基を含む。「脱離基」又は「ＬＧ」は、求核性アシル置換（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧのカルボニルへの求核性付加（nucleophilic addition）、それに続く脱離基の除去（elimination））による置換を受けやすい基である。代表的な脱離基として、ハロゲン原子、シアノ基、アジド基、カルボン酸誘導体、例えば、ｔ−ブチルカルボキシ基、及びカーボネート誘導体、例えば、ｉ−ＢｕＯＣ（Ｏ）Ｏ−基を挙げることができる。活性化アシル基は、カルボジイミドによって活性化され無水物または混合無水物−ＯＣ（Ｏ）Ｒ^ａ又は−ＯＣ（ＮＲ^ａ）ＮＨＲ^ｂ（式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂはＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６ペルフルオロアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ基、シクロヘキシル基、３−ジメチルアミノプロピル基、若しくはＮ−モルホリノエチル基からなる群から独立して選択される構成員である）を形成するカルボン酸又は本明細書中で定義した通りの活性化エステル基であることがある。好ましい活性化アシル基として活性化エステル基を挙げることができる。
【００４７】
本明細書中で用いる「活性化エステル基」は、エチルエステル基より求核性付加による置換及び除去を受けやすいカルボキシル基の誘導体（例えば、ＮＨＳエステル、スルホ−ＮＨＳエステル、ＰＡＭエステル又はハロフェニルエステル）を含む。活性化エステルの代表的なカルボニル置換基として、スクシンイミジルオキシ基（−ＯＣ_４Ｈ_４ＮＯ_２）、スルホスクシンイミジルオキシ基（−ＯＣ_４Ｈ_３ＮＯ_２ＳＯ_３Ｈ）、−１−オキシベンゾトリアゾリル基（−ＯＣ_６Ｈ_４Ｎ_３）；４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル基；又は電子吸引性置換基、例えば、ニトロ基、フルオロ基、クロロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、又はそれらの組み合わせ（例えば、ペンタフルオロフェニルオキシ基）によって場合により１回以上置換されていることがあるアリールオキシ基を挙げることができる。好ましい活性化エステルとして、スクシンイミジルオキシエステル及びスルホスクシンイミジルオキシエステルを挙げることができる。
【００４８】
本明細書中で用いる「アシル基」は、本明細書中で定義した通りのアルカノイル基、アロイル基、ヘテロシクロイル基、又はヘテロアロイル基を含む。代表的なアシル基として、アセチル基、ベンゾイル基、ニコチノイル基等を挙げることができる。
【００４９】
本明細書中で用いる「アルカノイル基」は、式中のアルキル基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なアルカノイル基として、アセチル基、エタノイル基等を挙げることができる。
【００５０】
本明細書中で用いる「アルケニル基」は、炭素−炭素二重結合又は三重結合少なくとも１個を含む、炭素原子２個〜約１５個の直鎖又は分枝鎖の脂肪族炭化水素基を含む。好ましいアルケニル基は炭素原子２個〜約１２個を有している。より好ましいアルケニル基は炭素原子２個〜約６個を含んでいる。或る観点において、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第二の観点において、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい（例えば、アルキニル基）。本明細書中で用いる「低級アルケニル基」は、炭素原子２個〜約６個のアルケニル基を含む。代表的なアルケニル基として、ビニル基、アリル基、ｎ−ブテニル基、２−ブテニル基、３−メチルブテニル基、ｎ−ペンテニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、デセニル基、プロピニル基、２−ブチニル基、３−メチルブチニル基、ｎ−ペンチニル基、ヘプチニル基等を挙げることができる。
【００５１】
本明細書中で用いる「アルケニレン基」は、炭素−炭素二重結合又は三重結合少なくとも１個を含む直鎖又は分枝鎖の二価炭化水素基を含む。好ましいアルケニレン基は鎖中に炭素原子２個〜約１２個を含み、そしてより好ましくはアルケニレン基は鎖中に炭素原子２個〜６個を含む。或る観点において、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の観点において、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい。代表的なアルケニレン基として、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−、−ＣＨ_２ＣＨ=ＣＨＣＨ_２−、エチニレン基、プロピニレン基、ｎ−ブチニレン基等を挙げることができる。
【００５２】
本明細書中で用いる「アルコキシ基」は、式中のアルキル基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｏ−基を含む。代表的なアルコキシ基として、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ヘプトキシ基等を挙げることができる。
【００５３】
本明細書中で用いる「アルコキシアルキル基」は、式中のアルキル基及びアルキレン基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｏ−アルキレン−基を含む。代表的なアルコキシアルキル基として、メトキシエチル基、エトキシメチル基、ｎ−ブトキシメチル基及びシクロペンチルメチルオキシエチル基を挙げることができる。
【００５４】
本明細書中で用いる「アルコキシカルボニル基」は、エステル基；すなわち、式中のアルキル基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基を含む。代表的なアルコキシカルボニル基として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
【００５５】
本明細書中で用いる「アルコキシカルボニルアルキル基」は、式中のアルキル基及びアルキレン基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｏ−ＣＯ−アルキレン−基を含む。代表的なアルコキシカルボニルアルキル基として、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルエチル基等を挙げることができる。
【００５６】
本明細書中で用いる「アルキル基」は、鎖中に炭素原子約１個〜約２０個を有する、直鎖又は分枝鎖であることができる、脂肪族炭化水素基を含む。好ましいアルキル基は鎖中に炭素原子１個〜約１２個を有する。より好ましいアルキル基は鎖中に炭素原子１個〜６個を有する。本明細書中で用いる「分枝鎖」は、１個以上の低級アルキル基、例えば、メチル基、エチル基又はプロピル基が直鎖状アルキル鎖に結合している分枝鎖を含む。本明細書中で用いる「低級アルキル」は、鎖中に炭素原子１個〜約６個、好ましくは、炭素原子５個又は６個を含み、直鎖又は分枝鎖であることができる。代表的なアルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、及び３−ペンチル基を挙げることができる。
【００５７】
本明細書中で用いる「アルキレン基」は、炭素原子１個〜約６個の直鎖又は分枝鎖の二価の炭化水素鎖を含む。好ましいアルキレン基は、炭素原子１個〜約４個を有する低級アルキレン基である。代表的なアルキレン基として、メチレン基、エチレン基等を挙げることができる。
【００５８】
本明細書中で用いる「アルキルチオ基」は、式中のアルキル基が本明細書中で定義した通りである、アルキル−Ｓ−基を含む。好ましいアルキルチオ基は、アルキル基が低級アルキル基であるアルキルチオ基である。代表的なアルキルチオ基として、メチルチオ基、エチルチオ基、イソプロピルチオ基、ヘプチルチオ基等を挙げることができる。
【００５９】
本明細書中で用いる「アルキルチオアルキル基」は、式中のアルキルチオ基及びアルキレン基が本明細書中で定義されている、アルキルチオ−アルキレン−基を含む。代表的なアルキルチオアルキル基として、メチルチオメチル基、エチルチオプロピル基、イソプロピルチオエチル基等を挙げることができる。
【００６０】
本明細書中で用いる「アミド基」は、式中のＹ_１及びＹ_２が独立して水素原子、アルキル基、若しくはアルケニル基であるか；又はＹ_１及びＹ_２が、Ｙ_１及びＹ_２が結合している窒素原子と一緒になって、４員〜７員のアザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル基）を形成する、式Ｙ_１Ｙ_２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−で表される基を含む。代表的なアミド基として、第一級アミド（Ｈ_２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）基、メチルアミド基、ジメチルアミド基、ジエチルアミド基等を挙げることができる。好ましくは、「アミド基」は、式中のＲ及びＲ’が水素原子及びアルキル基からなる群から独立して選択される構成員である、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基である。より好ましくは、Ｒ及びＲ’の少なくとも１つが水素原子である。
【００６１】
本明細書中で用いる「アミドアルキル基」は、式中のアミド基及びアルキレン基が本明細書中で定義されている、アミド−アルキレン−基を含む。代表的なアミドアルキル基として、アミドメチル基、アミドエチル基、ジメチルアミドメチル基等を挙げることができる。
【００６２】
本明細書中で用いる「アミノ基」は、式中のＹ_１及びＹ_２が独立して水素原子、アシル基、若しくはアルキル基であるか；又はＹ_１及びＹ_２が、Ｙ_１及びＹ_２が結合している窒素原子と一緒になって、４員〜７員のアザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル基）を形成する、式Ｙ_１Ｙ_２Ｎ−で表される基を含む。場合により、Ｙ_１及びＹ_２が独立して水素原子又はアルキル基である場合には、追加の置換基が窒素原子に付加されて第四級アンモニウムイオンを作ることができる。代表的なアミノ基として、第一級アミノ基（Ｈ_２Ｎ−）、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等を挙げることができる。好ましくは、「アミノ基」は、式中のＲ及びＲ’がＨ原子及びアルキル基からなる群から独立して選択される構成員である、−ＮＲＲ’基である。好ましくは、Ｒ及びＲ’の少なくとも１つがＨ原子である。
【００６３】
本明細書中で用いる「アミノアルキル基」は、式中のアミノ基及びアルキレン基が本明細書中で定義されている、アミノ−アルキレン−基を含む。代表的なアミノアルキル基として、アミノメチル基、アミノエチル基、ジメチルアミノメチル基等を挙げることができる。
【００６４】
本明細書中で用いる「アロイル基」は、式中のアリール基が本明細書中で定義されている、アリール−ＣＯ−基を含む。代表的なアロイル基としてベンゾイル基、ナフト−１−オイル基及びナフト−２−オイル基を挙げることができる。
【００６５】
本明細書中で用いる「アリール基」は、炭素原子６個〜約１４個、好ましくは炭素原子６個〜約１０個の単環式又は多環式芳香環系を含む。代表的なアリール基として、フェニル基及びナフチル基を挙げることができる。
【００６６】
本明細書中で用いる「芳香環」は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、及び窒素原子からなる群から選択されるヘテロ原子０個〜４個を含んでいることができる、５〜１２員の単環式又は縮合多環式芳香族部分を含む。典型的な芳香環として、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンザチアゾリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンズインドール、キノリン等を挙げることができる。芳香環基は、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、シアノ基、スルホナト基、アミノスルホニル基、アリール基、スルホニル基、アミノカルボニル基、カルボキシ基、アシルアミノ基、アルキルスルホニル基、アミノ基及び置換された若しくは置換されていない置換基によって１個以上の位置で置換されていることができる。
【００６７】
本明細書中で用いる「バランスの取れた電荷」は、化合物及びそれに関連した対イオンに対する正味電荷（net charge）が標準的な生理学的条件下でゼロであることを含む。バランスの取れた電荷を達成するために、本明細書中の化合物のインドリニウム環の+１電荷のバランスをとるスルホナト基の最初の付加（first additional）後に、カチオン性の対イオン（例えば、Ｉ族金属の陽イオン、例えば、ナトリウム）を添加して付加したスルホナト基由来の陰電荷のバランスを取る必要がある。同様に、アニオン性の対イオンを添加して、任意の付加的な（additional）カチオン基（例えば、生理学的条件下で大部分のアミノ基）のバランスをとる必要がある。
【００６８】
本明細書中で用いる「生体分子」は、生物学的系に用いるための天然又は合成分子を含む。好ましい生体分子として、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、炭水化物誘導体、オリゴ糖、多糖、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ヌクレオチドトリホスフェート、アシクロターミネータートリホスフェート（acyclo terminator triphosphates）、ＰＮＡ等を挙げることができる。より好ましい生体分子として、タンパク質、ペプチド、抗体、アビジン、ストレプトアビジン等を挙げることができる。更により好ましい生体分子として、抗体、アビジン、及びストレプトアビジンを挙げることができる。
【００６９】
本明細書中で用いる「カルボキシ基」及び「カルボキシル基」は、ＨＯＣ（Ｏ）−基（すなわち、カルボン酸）又はその塩を含む。
【００７０】
本明細書中で用いる「カルボキシアルキル基」は、式中のアルキレン基が本明細書中で定義されている、ＨＯＣ（Ｏ）−アルキレン−基を含む。代表的なカルボキシアルキル基として、カルボキシメチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ_２−）基及びカルボキシエチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２−）基を挙げることができる。
【００７１】
本明細書中で用いる「シクロアルキル基」は、炭素原子約３個〜約１０個、好ましくは、炭素原子約５個〜約１０個の単環式又は複環式非芳香環系を含む。より好ましいシクロアルキル環は、環原子５個又は６個を含む。シクロアルキル基は、場合により、ｓｐ^２混成炭素原子少なくとも1個を含んでいることがある（例えば、環内又は環外オレフィンを含む環）。代表的な単環式シクロアルキル基として、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプチル基等を挙げることができる。代表的な複環式シクロアルキル基として、１−デカリン基、ノルボルニル基、アダマンチル基等を挙げることができる。
【００７２】
本明細書中で用いる「シクロアルキレン基」は、炭素原子約４個〜約８個を有する二価シクロアルキル基を含む。好ましいシクロアルキレニル基として、１，２−、１，３−、又は１，４−シス若しくはトランス−シクロヘキシレン基を挙げることができる。
【００７３】
本明細書中で用いる「シアニン染料」は、不飽和架橋（unsaturated bridge）によって結合された２つの置換又は非置換の窒素原子含有複素環式環を有する化合物を含む。
【００７４】
本明細書中で交換可能に用いる「環外アルケン」又は「環外オレフィン」は、環の一部であるアルケン炭素原子１個及び同じ環の部分ではないが第二の環内に含まれていることができる他のアルケン炭素原子を有するアルケンを含む。第二のアルケン炭素原子は、置換されていなくても又は置換されていてもよい。第二のアルケン炭素原子が二置換されている場合には、それらの置換基は同じであるか（例えば、１，１−ジメチル置換）又は異なっている（例えば、１−メチル−１−（２−エトキシエチル）置換）ことができる。環外アルケンを有する化合物の例として、メチレンシクロヘキサン；（Ｅ）−１−エチリデン−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン；ペンタン−３−イリデンシクロヘプタン；２−シクロブチリデンプロパン−１−オール；及び（３−メトキシシクロペント−２−エニリデン）シクロヘキサンを挙げることができる。
【００７５】
本明細書中で用いる「ハロ」又は「ハロゲン原子」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを含む。
【００７６】
本明細書中で用いる「ヘプタメチン」は、ポリメチン炭素原子７個を含有するポリメチンを含む。好ましい実施態様では、ヘプタメチンは４位で置換されている。
【００７７】
本明細書中で用いる「ヘテロ原子」は、炭素原子又は水素原子以外の原子を含む。典型的なヘテロ原子はＯ、Ｓ、及びＮを含む。ヘテロ原子の窒素原子又は硫黄原子は、場合により、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド（スルホキシド）、又はＳ，Ｓ−ジオキシド（スルホン）に酸化されていることがある。好ましい観点において、ヘテロ原子はアルキレン炭素原子に対する少なくとも２つの結合を有している（例えば、−Ｃ_１〜Ｃ_９アルキレン−Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_９アルキレン−）。或る実施態様において、ヘテロ原子はアシル基、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、又はヘテロアリール基によって更に置換されている（例えば、−Ｎ（Ｍｅ）−；−Ｎ（Ａｃ）−）。
【００７８】
本明細書中で用いる「ヘテロアロイル基」は、式中のヘテロアリール基が本明細書中で定義した通りであるヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なヘテロアロイル基として、チオフェノイル基、ニコチノイル基、ピロロ−２−イルカルボニル基、ピリジノイル基等を挙げることができる。
【００７９】
本明細書中で用いる「ヘテロシクロイル基」は、式中のヘテロシクリル基が本明細書中で定義した通りである、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なヘテロシクロイル基として、Ｎ−メチルプロリノイル基、テトラヒドロフラノイル基等を挙げることができる。
【００８０】
本明細書中で用いる「ヘテロシクリル基」は、環系中の原子１個以上が炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素又は硫黄である、環原子約３個〜約１０個の、好ましくは、環原子約５個〜約１０個の飽和の単環式又は多環式非芳香環系を含む。好ましいヘテロシクリル基は、環原子約５個〜約６個を含む。ヘテロシクリル基は、場合により、ｓｐ^２混成原子少なくとも１個を含んでいることがある（例えば、カルボニル基、環内オレフィン又は環外オレフィンを含む環）。ヘテロシクリルの前の接頭語「アザ」、「オキサ」又は「チア」は、少なくとも窒素原子、酸素原子又は硫黄原子がそれぞれ環原子として存在することを意味する。ヘテロシクリル基の窒素原子又は硫黄原子は、場合により、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド又はＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化されていることがある。代表的な単環式ヘテロシクリル環として、ピペリジル基、ピロリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、チアゾリジニル基、１，３−ジオキソラニル基、１，４−ジオキサニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフェニル基、テトラヒドロチオピラニル基等を挙げることができる。本明細書中で用いる「ヘテロシクリレン基」は、二価のヘテロシクリル基を含む。代表的なシクロアルキレニル基として、１，２−、１，３−、又は１，４−ピペルジニレン（piperdinylene）基並びに２，３−又は２，４−シス又はトランス−ピペリジニレン基を挙げることができる。
【００８１】
本明細書中で用いる「ヘテロアリール基」は、環系中の原子少なくとも１個が炭素以外の元素、すなわち、窒素、酸素又は硫黄である、環原子約５個〜約１４個の、好ましくは、環原子約５個〜約１０個の単環式又は多環式芳香環系を含む。好ましいヘテロアリール基は、環原子約５個〜約６個を含む。ヘテロアリールの前の接頭語「アザ」、「オキサ」又は「チア」は、少なくとも窒素原子、酸素原子又は硫黄原子がそれぞれ環原子として存在することを意味する。ヘテロアリール基の窒素原子は、場合により、対応するＮ−オキシドに酸化されていることがある。代表的なヘテロアリール基として、ピラジニル基、フラニル基、チエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピラゾリル基、フラザニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、１，２，４−チアジアゾリル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、キノキサリニル基、フタラジニル基、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン基、イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル基、ベンゾフラザニル基、インドリル基、アザインドリル基、ベンズイミダゾリル基、ベンゾチエニル基、キノリニル基、イミダゾリル基、チエノピリジル基、キナゾリニル基、チエノピリミジル基、ピロロピリジル基、イミダゾピリジル基、イソキノリニル基、ベンゾアザインドリル基、１，２，４−トリアジニル基、ベンゾチアゾリル基等を挙げることができる。
【００８２】
本明細書中で用いる「ヒドロキシアルキル基」は、ヒドロキシ基１個又は２個以上で置換されている本明細書中で定義した通りであるアルキル基を含む。好ましいヒドロキシアルキル基は低級アルキル基を含む。代表的なヒドロキシアルキル基として、ヒドロキシメチル基及び２−ヒドロキシエチル基を挙げることができる。
【００８３】
本明細書中で用いる「結合基」は、式Ｉで表される化合物を生体分子と結合する原子を含む。表１は結合基の好ましい結合のリスト（すなわち、Ｃ欄）を含んでおり；結合基は得られた結合を含みそして場合により追加の原子を含んでいることができる。R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. (1992)も参照されたい。或る実施態様において、Ｒ^１６は生体分子との結合反応前の結合基前駆物質を表し、そしてＲ^Ｌは式Ｉで表される化合物と生体分子との間で得られた結合を表す（すなわち、Ｒ^Ｌは結合基及び該結合基によって結合した生体分子を含む）。好ましい反応性官能基として、ホスホルアミジット基、活性化エステル基（例えば、ＮＨＳエステル基）、チオシアネート基、イソチオシアネート基、マレイミド基及びヨードアセトアミド基を挙げることができる。
【００８４】
本明細書中で用いる「メチン炭素原子」又は「ポリメチン炭素原子」は、ポリメチン架橋によって２つの複素環式環を直接結合する炭素原子を含む。好ましい実施態様によれば、ポリメチン架橋の少なくとも１つのポリメチン炭素原子は、別の基、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、又はアリール基（例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ａｒ）＝ＣＨ−ＣＨ＝又は＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（Ａｒ）−（ＣＨ＝ＣＨ）_２−）によって更に置換されている。
【００８５】
本明細書中で用いる「オキソ基」は、式＞Ｃ＝Ｏで表される基（すなわち、カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−）を含む。
【００８６】
本明細書中で用いる「ペンタメチン基」は、ポリメチン炭素原子５個を含むポリメチン基を含む。好ましい実施態様において、ペンタメチン基は３位で置換されている。
【００８７】
本明細書中で用いる「ポリエン基」は、本明細書中で定義した通りの結合している「アルケニレン」基少なくとも２個を含む直鎖又は分枝鎖の二価炭化水素鎖を含む。ポリエン基は、場合により、本明細書中で定義した通りの「アルキレン基置換基」１個以上で置換されていることがある。ポリエンの部分は環中に含めることができる（すなわち、式中のＲ及び末端結合（terminal bond）がより大きい環に結合している、＝Ｃ（Ｒ）−；又は式中のＲ^１及びＲ^２がより大きい環に結合している、−Ｃ（Ｒ^１）＝Ｃ（Ｒ^２）−）。代表的なポリエンとして、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ａｒ）＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｒ）＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（Ａｒ）−（ＣＨ＝ＣＨ）_２−等を挙げることができる。
【００８８】
本明細書中で用いる「ポリメチン基」又は「ポリメチン架橋」は、式Ｉで表される化合物の２つの窒素原子含有複素環式環に直接結合した不飽和架橋を形成する一連の結合したｓｐ^２混成炭素原子を含む。好ましい実施態様によれば、ポリメチン基は複素環式環に直接結合した炭素原子５個又は７個を含む（すなわち、ペンタメチン又はヘプタメチン）。
【００８９】
本明細書中で用いる「ホスホルアミジチル基」は、アルコキシ基２個及びアミノ基に結合した三価のリン原子を含む。
【００９０】
本明細書中で用いる「スピロシクロアルキル基」は、炭素原子上のジェミナル置換基が置き換えられて１，１−置換された環を形成するシクロアルキル基を含む。
【００９１】
本明細書中で用いる「スルホナト基」は、好ましくはカチオン、例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋等によってバランスされた−ＳＯ_３⁻基を含む。
【００９２】
本明細書中で用いる「スルホナトアルキル基」は、式中のスルホナト基及びアルキレン基が本明細書中で定義した通りであるスルホナト−アルキレン−基を含む。より好ましい実施態様は、炭素原子２個〜６個を有するアルキレン基を含み、そして最も好ましい実施態様は炭素原子２個、３個又は４個を有するアルキレン基を含む。代表的なスルホナトアルキル基として、スルホナトメチル基、３−スルホナトプロピル基、４−スルホナトブチル基、５−スルホナトペンチル基、６−スルホナトヘキシル基等を挙げることができる。
【００９３】
《ＩＩ．シアニン染料化合物》
或る実施態様において、本発明は式Ｉ：
【化５】

で表される化合物を提供する。
【００９４】
上記式Ｉ中、Ｑは、式：
【化６】

でそれぞれ表される、メチン炭素原子１個のセグメント及びメチン炭素原子３個のセグメントからなる群から選択される構成員であり、式中のセグメントはメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分である。
【００９５】
好ましい観点において、Ｑは、式：
【化７】

で表されるペンタメチンであるポリメチン架橋の一部である。
【００９６】
第二の好ましい観点において、Ｑは、式：
【化８】

で表されるヘプタメチンであるポリメチン架橋の一部である。
【００９７】
代わりの好ましい観点において、ポリメチン架橋は、式：
【化９】

で表される置換ヘプタメチンである。
【００９８】
より好ましくは、置換ヘプタメチンは、式：
【化１０】

で表されるシクロアルキル環を含む。
【００９９】
Ｒ^１は、Ｒ^１３０個〜１個によって更に置換されているアルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがある。好ましい観点において、Ｒ^１はＣ_２〜Ｃ_１２アルキル基である。より好ましい観点において、Ｒ^１はＣ_２〜Ｃ_８アルキル基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１はＣ_２〜Ｃ_６アルキル基である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^１はエチル基、プロピル基、ブチル基又はペンチル基であり、Ｒ^１はＲ^１３１個によって更に置換されている。
【０１００】
好ましい観点において、Ｒ^１は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そしてｒは１〜２０の整数である。より好ましい観点において、ｒは２、３又は４である。
【０１０１】
代わりの好ましい観点において、Ｒ^１は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシ基及びスルホナト基からなる群から選択されるＲ^１３１個で更に置換されているアルキル基である。より好ましい観点において、Ｒ^１のＲ^１３置換基はカルボキシ基又はスルホナト基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１の置換基Ｒ^１３はスルホナト基である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^１は、スルホナトエチル基、スルホナトプロピル基、スルホナトブチル基、又はスルホナトペンチル基である。
【０１０２】
別の代わりの好ましい観点において、Ｒ^１は、Ｒ^１３１個で更に置換されている非分枝アルキル基である。より好ましい観点において、Ｒ^１は、シアニン染料複素環窒素原子へのその結合点と反対のアルキル基の末端でＲ^１３によって置換されている非分枝アルキル基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１は、２−スルホナトエチル基、３−スルホナトプロピル基、４−スルホナトブチル基、又は５−スルホナトペンチル基である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^１は、３−スルホナトプロピル基又は４−スルホナトブチル基である。
【０１０３】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アミドアルキル基、アルキルチオアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、若しくはスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している原子と一緒になって又はスピロシクロアルキル環となり、前記スピロシクロアルキル環はＲ^１４０個〜６個によって更に置換されている。
【０１０４】
好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは同じである。より好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはアルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、又はスルホナトアルキル基である。更により好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはアルキル基、カルボキシアルキル基、又はスルホナトアルキル基である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはメチル基である。
【０１０５】
代わりの好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは異なる。より好ましい観点において、Ｒ^２ａはアルキル基であり、そしてＲ^２ｂはアルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、又はスルホナトアルキル基からなる群から選択される。更により好ましい観点において、Ｒ^２ａはアルキル基であり、そしてＲ^２ｂはアルキル基、カルボキシアルキル基、又はスルホナトアルキル基からなる群から選択される。
【０１０６】
別の代わりの好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している環炭素原子と一緒になって、スピロシクロアルキル環を形成し、前記スピロシクロアルキル環はＲ^１４０個〜６個によって更に置換されている。より好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、シクロペンチル環又はシクロヘキシル環を形成する。代わりのより好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^１４０個〜６個によって更に置換されているシクロペンチル環又はシクロヘキシル環を形成する。更により好ましい観点において、Ｒ^１４はアルキル基である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^１４はメチル基である（例えば、３，３−又は４，４−ジメチル置換）。
【０１０７】
なお別の代わりの好ましい観点において、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している環炭素原子と一緒になって、環外アルケンを形成し、前記環外アルケンはＲ^１４０個〜２個によって更に置換されている。より好ましい観点において、環外アルケンは対称的に置換されている（例えば、非置換；ジアルキル；ジシアノ）。代わりに、環外アルケンはＲ^１４基２個によって置換されている。更により好ましくは、環外アルケンのＲ^１４置換基はシアノ基である。
【０１０８】
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、アミノ基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^４及びＲ^５、並びにＲ^５及びＲ^６からなる群から選択される構成員の対は、前記構成員の対が結合している原子の対と一緒になってアリール環を形成し、前記アリール環はそれぞれＲ^１４０個〜２個によって更に置換されている。
【０１０９】
第１の観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、アミノ基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員である。好ましい観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、カルボキシ基、カルボキシアルキル基、スルファナト（sulfanato）基、及びスルファナトアルキル（sulfanatoalkyl）基からなる群から独立して選択される構成員である。より好ましい実施態様において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子及びスルファナト基からなる群から独立して選択される構成員である。
【０１１０】
別の観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の少なくとも１つの構成員は、水素原子である。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に１つの構成員は水素原子である。好ましい観点において、対Ｒ^３及びＲ^４；Ｒ^３及びＲ^５；Ｒ^３及びＲ^６；Ｒ^４及びＲ^５；Ｒ^４及びＲ^６；Ｒ^５及びＲ^６から選択される置換基の対の少なくとも１つは水素原子である。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に２つの構成員は水素原子である。より好ましい観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に３つの構成員は水素原子である。更により好ましい観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^６は水素原子である。
【０１１１】
別の代わりの観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の少なくとも１つの構成員は、スルホナト基又はスルホナトアルキル基である。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群から選択される正確に１つの置換基は、スルホナト基又はスルホナトアルキル基である。好ましい観点において、Ｒ^５はスルホナト基である。更に別の観点において、対Ｒ^３及びＲ^４；Ｒ^３及びＲ^５；Ｒ^３及びＲ^６；Ｒ^４及びＲ^５；Ｒ^４及びＲ^６；Ｒ^５及びＲ^６から選択される置換基の対の構成員はそれぞれ、スルホナト基又はスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に２つの構成員はそれぞれ独立して、スルホナト基又はスルホナトアルキル基から選択される。更にまた別の観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に３つの構成員はそれぞれ独立して、スルホナト基又はスルホナトアルキル基から選択される。
【０１１２】
別の代わりの観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の少なくとも１つの構成員は、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である（例えば、スルホナト−ＳＯ_３⁻、カルボキシ−ＣＯ_２⁻）。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に１つの構成員は、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である。好ましい観点において、Ｒ^５は、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である。更に別の観点において、対Ｒ^３及びＲ^４；Ｒ^３及びＲ^５；Ｒ^３及びＲ^６；Ｒ^４及びＲ^５；Ｒ^４及びＲ^６；Ｒ^５及びＲ^６から選択される置換基の対の構成員はそれぞれ、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である。代わりに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に２つの構成員は、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である。更にまた別の観点において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６からなる群の正確に３つの構成員は、生理学的ｐＨにおいてアニオン性である。
【０１１３】
第２の観点において、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^４及びＲ^５、並びにＲ^５及びＲ^６からなる群から選択される構成員の対は、該構成員の対が結合する原子の対と一緒になってアリール環を形成し、前記アリール環はそれぞれＲ^１４０個〜２個によって更に置換されている。好ましい観点において、Ｒ^５及びＲ^６は、該構成員の対が結合する原子の対と一緒になって、Ｒ^１４０個〜２個によって更に置換されているフェニル環を形成する。より好ましい観点において、フェニル環はＲ^１４１個〜２個によって更に置換されている。更により好ましい観点において、フェニル環はＲ^１４２個によって更に置換されている。
【０１１４】
好ましい観点において、Ｒ^ｎ及びＲ^ｎ＋１から形成されるアリール環（例えば、Ｒ^５及びＲ^６から形成されるアリール環）のＲ^１４置換基は、カルボキシ基、カルボキシアルキル基、スルホナト基、又はスルホナトアルキル基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１４置換基は、スルホナト基又はスルホナトアルキル基である。なお更により好ましい観点において、ベンゾインドリニウムＲ^１４置換基は、スルホナト基である。代わりの好ましい観点において、ベンゾインドリニウムＲ^１４置換基は、シアノ基である。
【０１１５】
より好ましい観点において、Ｒ^ｎ及びＲ^ｎ＋１から形成されるアリール環はＲ^１４１個〜２個によって更に置換されており、そしてアリール環のＲ^１４置換基はインドリニウム環との環接合に隣接する炭素原子に結合している。代わりに、アリール環はＲ^１４１個〜２個によって更に置換されており、そしてアリール環のＲ^１４置換基はインドリニウム環との環接合に隣接しない炭素原子に結合している。代わりに、アリール環は隣接する置換基１個及び隣接しない置換基１個によって更に置換されている（例えば、式Ｉａで表される化合物）。
【０１１６】
代わりに、好ましい観点において、化合物は式Ｉａ：
【化１１】

を有している。
【０１１７】
更により好ましい観点において、式Ｉａで表されるベンゾインドリニウムＲ^１４置換基は、カルボキシ基、カルボキシアルキル基、スルホナト基、又はスルホナトアルキル基である。更により好ましい観点において、ベンゾインドリニウムＲ^１４置換基は、スルホナト基又はスルホナトアルキル基である。なお更により好ましい観点において、ベンゾインドリニウムＲ^１４置換基は、スルホナト基である。
【０１１８】
Ｒ^７は水素原子及びアルキル基からなる群から選択される構成員であるか；又は、代わりに、両方のＲ^７は、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、環を形成し、前記環はシクロアルキル環及びヘテロシクリル環からなる群から選択され、そして前記環はＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている。
【０１１９】
或る観点において、両方のＲ^７は、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、５員環及び６員環からなる群から選択される環を形成し、前記環はＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている。より好ましい観点において、環は６員環である（例えば、両方のＲ^７が一緒になってプロピリデン結合基を形成する）。更により好ましい観点において、環はシクロヘキシルである。
【０１２０】
Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、スルホナト基、及び−Ｌ−Ｙ−Ｚからなる群から独立して選択される構成員であり；Ｒ^８及びＲ^９からなる群から選択される正確に１つの構成員は−Ｌ−Ｙ−Ｚである。
【０１２１】
或る観点において、Ｒ^８は−Ｌ−Ｙ−Ｚである。代わりに、Ｒ^９は−Ｌ−Ｙ−Ｚである。
【０１２２】
第２の観点において、Ｒ^８は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子である。より好ましい観点において、Ｒ^８は水素原子である。別のより好ましい観点において、Ｒ^８はフルオロ基である。
【０１２３】
代わりに、Ｒ^９は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子である。より好ましい観点において、Ｒ^９は５−カルボキシペンチル基である。代わりに、Ｒ^９は４−カルボキシブチル基である。
【０１２４】
Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である。
【０１２５】
第１の観点において、Ｒ^１０は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子である。より好ましい観点において、Ｒ^１０は水素原子である。代わりに、Ｒ^１０はフルオロ基である。
【０１２６】
第２の観点において、Ｒ^１１は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子である。より好ましい観点において、Ｒ^１１は水素原子である。代わりに、Ｒ^１１はフルオロ基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１０及びＲ^１１は水素原子である。
【０１２７】
第３の観点において、Ｒ^１２は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子である。より好ましい観点において、Ｒ^１２は水素原子である。代わりに、Ｒ^１２はフルオロ基である。更により好ましい観点において、Ｒ^１０及びＲ^１２は水素原子である。代わりに、Ｒ^１１及びＲ^１２は水素原子である。なお更により好ましい観点において、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は水素原子である。
【０１２８】
第４の観点において、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２で置換されたフェニル環は、水素原子以外の、独立して選択された置換基によって１，２，３−置換されており、そして１−置換基はポリメチン架橋である（例えば、Ｒ^８は−Ｌ−Ｙ−ＺでありかつＲ^９はアルキル基である；Ｒ^８はハロ−でありかつＲ^９は−Ｌ−Ｙ−Ｚである）。代わりに、環は１，２，４−置換されている。代わりに、環は１，２，５−置換されている。代わりに、環は１，２，６−置換されている。代わりに、環は１，３，４−置換されている。代わりに、環は１，３，５−置換されている。代わりに、環は１，３，６−置換されている。
【０１２９】
第５の観点において、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２で置換されたフェニル環は、水素原子以外の、独立して選択された置換基によって１，２，３，４−置換されており、そして１−置換基はポリメチン架橋である。代わりに、環は１，２，３，５−置換されている。代わりに、環は１，２，３，６−置換されている。代わりに、環は１，２，４，５−置換されている。代わりに、環は１，２，４，６−置換されている。代わりに、環は１，２，５，６−置換されている。代わりに、環は１，３，４，５−置換されている。代わりに、環は１，３，４，６−置換されている。代わりに、環は１，３，５，６−置換されている。
【０１３０】
第６の観点において、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２で置換されたフェニル環は、独立して選択された水素原子以外の置換基によって１，２，３，４，５−置換されており、そして１−置換基はポリメチン架橋である。代わりに、環は１，３，４，５，６−置換されている。代わりに、環は１，２，４，５，６−置換されている。代わりに、環は１，２，３，５，６−置換されている。代わりに、環は１，２，３，４，６−置換されている。代わりに、環はそれぞれの環位置で独立して置換されている。
【０１３１】
第７の観点において、Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２はそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である。
【０１３２】
第８の観点において、フェニル環とその置換基Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２との組み合わせは、炭素原子少なくとも１０個を有する。
【０１３３】
Ｒ^１３はそれぞれ、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アミド基、スルホナト基、及びチオアセチル基からなる群から独立して選択される構成員である。好ましい実施態様では、Ｒ^１３は、カルボキシル基、アミド基、又はアルコキシカルボニル基である。より好ましい実施態様では、Ｒ^１３はカルボキシル基である。代わりに、Ｒ^１３はスルホナト基である。代わりに、Ｒ^１３はシアノ基である。
【０１３４】
Ｒ^１４はそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びアルコキシアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であり；前記Ｒ^１４アルキル基又はアルケニル基はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されている。好ましい観点において、Ｒ^１４は、アルキル基、アルケニル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、又はアルコキシカルボニルアルキル基である。代わりに、Ｒ^１４はスルホナト基である。更に好ましい観点において、Ｒ^１４は、アルキル基、又はＲ^１３１個によって置換されたアルキル基である。代わりに、Ｒ^１４は、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はスルホナトアルキル基である。
【０１３５】
Ｌは、単結合、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン基、及びＣ_１〜Ｃ_１０アルケニレン基からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；前記アルキレン基又はアルケニレン基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがある。好ましい観点において、Ｌは存在しない。代わりに、Ｌは、エーテル結合によって中断されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキレン基である（例えば、ポリエチレングリコールオリゴマー）。
【０１３６】
Ｙは、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＲ^１５−、−ＮＲ^１５Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１５−、−ＮＺ−、−ＮＺＣ（Ｏ）−、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＺ−からなる群から選択される、場合により存在する構成員である。好ましい観点において、Ｙは単結合である。代わりに、Ｙは−Ｏ−である。代わりに、Ｙは、場合によりアミド窒素原子においてＲ^１５によって置換されていることがあるアミド基である。
【０１３７】
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^１６からなる群からの構成員１つによって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがある。より好ましい観点において、Ｚは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基である。代わりに、Ｚは、エーテル結合によって中断されている（例えば、ポリエチレングリコールオリゴマー）。更により好ましい観点において、Ｚは、カルボキシアルキル基又はスルホナトアルキル基である。なお更により好ましい観点において、Ｚは、５−カルボキシペンチル基又は４−カルボキシブチル基である。
【０１３８】
別の代わりの好ましい観点において、−Ｌ−Ｙ−は（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚはカルボキシル基又は活性化アシル基であり；そしてｔは１〜１０の整数である。
【０１３９】
更に別の代わりの好ましい観点において、Ｚは任意であり、そしてＲ^１３又はＲ^１６は−Ｌ−Ｙ−に直接結合しているか又はＬ及びＹが存在しない場合はフェニル環自体に直接結合している。
【０１４０】
なお更に別の代わりの好ましい観点において、−Ｌ−Ｙ−Ｚは、炭素原子少なくとも４個を有している。代わりに、Ｚは炭素原子少なくとも４個を有している。
【０１４１】
Ｒ^１５は、アルキル基及びアルコキシカルボニルアルキル基からなる群から選択される構成員であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがある。好ましい観点において、Ｒ^１５はアルキル基である。より好ましい観点において、Ｒ^１５は低級アルキル基である。代わりに、Ｒ^１５は、エーテル結合によって中断されている（例えば、ポリエチレングリコールオリゴマー）。
【０１４２】
Ｒ^１６はそれぞれ独立して、活性化アシル基、ホルミル基、グリシジル基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ヒドラジジル基、イソチオシアナト基、ヨードアセトアミジル基、マレイミジル基、メルカプト基、ホスホルアミジチル基、及びビニルスルホニル基からなる群から選択される構成員である。好ましい観点において、Ｒ^１６は、活性化アシル基、マレイミジル基、ホスホルアミジチル基、又はグリシジル基である。より好ましい実施態様では、Ｒ^１６は、活性化アシル基である。代わりに、Ｒ^１６は、活性化エステル基である。更により好ましい実施態様によると、Ｒ^１６は、スクシンイミジルオキシ−エステル基又はスルホスクシンイミジルオキシ−エステル基である。
【０１４３】
前記化合物はバランスがとれた電荷を有する。好ましい観点において、アルカリ金属対イオン（例えば、ナトリウム又はカリウム）によって前記化合物の正味アニオン電荷のバランスをとる。より好ましい観点において、少なくとも１つの対イオンはナトリウムである。代わりに、全ての対イオンがナトリウムである。
【０１４４】
好ましい観点において、Ｑは、式：
【化１２】

であり；そしてＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ、水素原子及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である。前記Ｑは、例えば、式Ｉａの一部である。
【０１４５】
より好ましい観点において、前記化合物は式：
【化１３】

を有する。
【０１４６】
第２のより好ましい観点において、前記化合物は式：
【化１４】

を有する。
【０１４７】
代わりに、或る観点において、活性化アシル基がカルボキシ基の代わりに存在する。更により好ましい観点において、活性化アシル基は活性化エステル基である。更になおより好ましい観点において、活性化エステル基はスクシンイミジルオキシ−エステル基である。
【０１４８】
第１の観点において、式Ｉで表される化合物は、約５５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する。好ましくは、前記化合物は、約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する。より好ましくは、前記化合物は、約６００ｎｍ〜約７２５ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する。代わりに、前記化合物は、約７２５ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する。
【０１４９】
本発明の１つの好ましい観点は、両方の複素環式環に同じ置換基を有する化合物である（例えば、Ｒ^１は、場合により電荷バランスを取るために異なる対イオンを有していることがある、同じスルホナトアルキル基である）。このことは、化合物の合成及び精製の間に利点を与える。
【０１５０】
本願は、種々のジアステレオマー、エナンチオマー、及び当業者に明らかなオレフィン立体異性体を含み、本明細書中に記載した化合物の可能な立体異性体の全てを広く包含する。本願は更に、当該技術分野で周知であるシアニン染料化合物の立体異性体のあらゆる精製方法並びにこれらの方法によって得られるあらゆる精製化合物に関する。
【０１５１】
《ＩＩＩ．式Ｉで表される化合物》
１つの観点において、ポリメチン架橋としての置換基を既に含んでいるジアルデヒド又はジアルデヒド等価物（例えば、シッフ塩基）との反応によって、式Ｉで表される好ましいシアニン化合物を製造する。ジアルデヒドの典型的な製法は、係属中の米国特許出願第１２／０６５，３９１号（米国公開特許第２００８／０２６７８８３Ａ１号）に含まれている。シッフ塩基の典型的な製法は、米国特許第６，７４７，１５９号明細書に含まれている（Ａｒ＝Ｐｈ；ピリジン／Ａｃ_２Ｏ，Δ）。ポリメチン架橋の合成後に場合により置換基を改変することができる（例えば、脱保護、生体分子との反応のための活性化、又は結合基を形成する反応）。
【化１５】

【０１５２】
別の観点において、ポリメチン架橋に置換基を導入する有機金属カップリングによって、式Ｉで表される好ましいシアニン化合物を製造する。より好ましくは、パラジウムカップリングによって置換基を取り込む。その取り込み後に、場合により置換基を改変することができる（例えば、脱保護、生体分子との反応のための活性化、又は結合基を形成する反応）。
【０１５３】
鈴木カップリングとしても知られる鈴木・宮浦反応はその発見以来、広く有機合成に用いられてきた：Miyaura, N.; Yamada, K.; Suzuki, A. Tetrahedron Lett. 1979, 36, 3437-3440。最近には、鈴木カップリングを用いて、水溶性シアニン染料のヘプタメチン架橋の中央位置に、置換されたアリール置換基が取り込まれた：Lee, H.; Mason, J. C.; Achilefu, S. J. Org. Chem. 2006, 71, 7862-7865。
【０１５４】
しかしながら、塩基を用いた加熱の標準的な鈴木カップリング条件下では多くのシアニン染料が分解するため、シアニン染料の合成にそれを用いる例はほとんど知られていない。
【０１５５】
本発明のとりわけ好ましい観点において、その一部を本明細書の実施例中で詳記するが、鈴木カップリング反応によって式Ｉで表される化合物の置換基を取り込む。或る実施態様において、鈴木カップリングのためのポリメチン基体は、３−ハロペンタメチン又は４−ハロヘプタメチンである。好ましい実施態様では、ハロ−置換基は、クロリド又はブロミドである。より好ましい実施態様では、ハロ−置換基は、ブロミドである。
【０１５６】
シアニン染料の他の製造方法及びその合成前駆体は、Hamer, F. M., Cyanine Dyes and Related Compounds, Weissberger, Mass., ed. Wiley Interscience, N.Y. 1964；及びMojzych, M., Henary, M. “Synthesis of Cyanine Dyes,” Top. Heterocycl. Chem., vol. 14, Springer Berlin, Heildelberg, 2008, pp. 1-9に包括されている。更に、米国特許第４，３３７，０６３号明細書；４，４０４，２８９号明細書；及び４，４０５，７１１号明細書は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基を有する種々のシアニン染料の合成を記載している。米国特許第４，９８１，９７７号明細書は、カルボン酸基を有するシアニン染料の合成を記載している。米国特許第５，２６８，４８６号明細書は、アリールスルホネートシアニン染料の製造方法を記載している。米国特許第６，０２７，７０９号明細書は、ホスホルアミジット基を有するシアニン染料の製造方法を開示している。米国特許第６，０４８，９８２号明細書は、イソチオシアネート、イソシアネート、ホスホルアミジット、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−又はジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−又はジ−ハロゲン置換ジアジン、アジリジン、スルホニルハリド、酸ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、グリオキサール及びアルデヒドからなる群から選択される反応性基を有するシアニン染料の製造方法を開示している。
【０１５７】
１つの共通の合成経路は、その一部を本明細書の実施例中で詳記する、当該技術分野で周知の方法による置換又は非置換のインドールスルホン酸第四級塩の製造を伴う。特に好ましいインドール第四級塩として、中でも、本明細書に例示するインドールスルホン酸第四級塩及びベンゾインドールスルホン酸第四級塩を挙げることができる。
【０１５８】
次いで、その一部を本明細書の実施例に詳記するが、当該技術分野で周知の技術及び反応条件によって、合成した塩の対をジアルデヒド又はジアルデヒド等価物（例えば、シッフ塩基）と反応させてポリメチン架橋を形成する。典型的なシッフ塩基として、Ｎ−［（３−アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリンモノヒドロクロリド及びＮ−（２−ブロモ−３−（フェニルアミノ）アリリデン）ベンゼンアミニウムブロミドを挙げることができる。シッフ塩基は、商業的供給者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）から購入することができ、又は当該技術分野で周知の方法（例えば、実施例５の方法）によって製造することができる。
【０１５９】
《ＩＶ．生体分子の標識化方法》
上記に定義した式Ｉで表されるシアニン化合物は、生体分子に結合させることができる。種々のタイプの生体分子への染料の結合方法は、当該技術分野において周知である。例えば、オリゴヌクレオチド標識化法の総説については、R. Haugland in Excited States of Biopolymers, Steiner ed., Plenum Press (1983)、Fluorogenic Probe Design and Synthesis：A Technical Guide, PE Applied Biosystems (1996)、及びG. T. Herman, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)を参照されたい。
【０１６０】
「クリック」ケミストリーは、本発明に係る染料を生体分子に結合するための１つの可能な方法を提供する。クリックケミストリーは、シンプルで強力な（robust）反応、例えば、分子間結合を形成する、銅触媒によるアジドとアルキンとの付加環化を用いる。クリックケミストリーの総説については、Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. 2001, 40, 2004を参照されたい。
【０１６１】
１つの観点において、式Ｉで表されるシアニン化合物は、それがいったん可溶性のリガンド又は生体分子に結合されれば、そのリガンド又は生体分子はその可溶性を維持することから、水溶液中で充分な可溶性を有する。或る場合には、バイオコンジュゲートは有機媒体（例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ）中でも良好な溶解性を有しており、このことは望ましい材料の標識化に対する合成アプローチにかなりの多様性を与える。
【０１６２】
別の観点において、本発明は、式Ｉで表される化合物を用いたリガンド又は生体分子の標識化方法を提供し、この方法は：式Ｉ又はＩａを有する化合物とリガンド又は生体分子とを接触させて対応する式ＩＩ又はＩＩａで表されるバイオコンジュゲート化合物を生成することを含む。
【０１６３】
或る好ましい実施態様において、Ｒ^１６基又はＲ^１３基は、生体分子上のチオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基と反応して、染料と生体分子との間に結合基を形成する。より好ましい実施態様において、水性緩衝液と有機溶媒、例えば、ＤＭＦとのｐＨ８〜９の混合物中で、この反応を実施する。代わりに、蒸留水又は緩衝水溶液中で、この反応を実施する。チオール基又は酸性基に対して、とりわけ、基体が反応性アミノ基も含んでいる場合には、反応溶媒として７又はそれより低いｐＨが好ましい。
【０１６４】
リガンド又は生体分子へ式Ｉで表される化合物を結合するのに有用な反応性官能基の選択例を表１に示し、ここで結合は染料とリガンド又は生体分子との反応から生ずる。表１のＡ欄は、式Ｉで表される化合物又は生体分子上に存在することができる反応性官能基のリストである。Ｂ欄は、生体分子又は式Ｉで表される化合物上に存在することができ、そしてＡ欄に示された官能基と反応してＣ欄の結合を形成する、相補的な反応性基（好ましくは、カルボキシル、ヒドロキシル、チオール、又はアミノ官能基）のリストである。当業者は、本発明に用いるのに適当な他の結合があることを承知しているであろう。
【表１】

【０１６５】
カルボン酸を有する式Ｉで表される化合物をアミン含有リガンド又は生体分子と結合する場合、最初に活性化剤によってカルボン酸をより反応性の形態、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は混成無水物に変換することができる。得られた活性化アシルを用いてアミン含有リガンド又は生体分子を処理してアミド結合を形成する。より好ましい実施態様によれば、場合により存在する共溶媒としてＤＭＳＯ又はＤＭＦを用いてｐＨ８〜９の水性緩衝液中でこの反応を実施する。代わりに、蒸留水中又は緩衝水溶液中でこの反応を実施する。
【０１６６】
同様に、イソシアネート含有又はイソチオシアネート含有の式Ｉで表される化合物の結合は、カルボキシ染料についての手順と同様であるが、活性化工程を要しない。活性化アシル化合物を直接に用いてアミン含有リガンド又は生体分子を処理してウレア結合又はチオウレア結合を形成する。より好ましい実施態様において、場合により存在する共溶媒としてＤＭＳＯ又はＤＭＦを用いてｐＨ９〜１０の水性緩衝液中でこの反応を実施する。代わりに、蒸留水中又は緩衝水溶液中でこの反応を実施する。
【０１６７】
式Ｉで表される化合物又は生体分子が反応性ヒドロキシル基を有している場合、ホスホルアミジット化学によってそれをリガンド又は生体分子に結合して、最終的に染料と生体分子との間にホスフェート結合を形成することができる。かかる標識化方法の例として、多くの好ましい結合基、結合方法、及び容易に標識化することができる生体分子を開示する、米国特許第６，０２７，７０９号明細書を参照されたい。或る実施態様において、米国特許第６，０２７，７０９号明細書に開示されているように、固相合成が好ましい。
【０１６８】
好ましい実施態様によれば、生体分子はＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホルアミジット化学を用いると、合成過程の間にＤＮＡ又はＲＮＡを標識化することができる。固相支持体に結合させる間に、保護ヌクレオチドを標識化する。ホスホルアミジット及びテトラゾール活性化剤と遊離５’−ＯＨ基を反応させて亜リン酸結合を形成し、この亜リン酸結合はその後ホスフェートに酸化される。次いで、アンモニアによって又は別の標準的な方法によって、標識したＤＮＡ又はＲＮＡを固相から切り離す。
【０１６９】
一般に、ＤＮＡ合成装置においてＤＮＡ分子を標識化するシアニン染料のホスホルアミジットを調製することが好ましい。標準的なホスホルアミジット化学によって、支持体に結合した保護オリゴヌクレオチドの５’末端に染料を結合するのも好ましい。ＤＮＡ配列決定に用いるのに好ましいラベルターミネーターのリストについては、米国特許第５，３３２，６６６号明細書を参照されたい。
【０１７０】
別の好ましい実施態様によれば、生体分子は抗体である。場合により有機共溶媒を含むことがある緩衝液中で、塩基性pＨ条件下に室温で抗体標識化を実施することが好ましい。例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−５０カラムの装置を用いたゲル透過クロマトグラフィーにより又は透析により標識化抗体を精製して、コンジュゲートされない式Ｉで表される化合物のいずれをも除去することも好ましい。当業者は、他の精製方法及び手段があることを承知しているであろう。
【０１７１】
更に別の好ましい実施態様によれば、生体分子は、Ｒ^１６にマレイミジル置換基との反応によって結合基を形成するチオール基を含む。より好ましい実施態様において、生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、チオール化ヌクレオチド、又はチオール化デオキシヌクレオチドである。
【０１７２】
更に他の観点において、結合基又は生体分子は、ポリマーを含む。好ましい実施態様によれば、前記ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ポリウレタンのコポリマー、及びＰＥＧ−ポリプロピレンのコポリマーからなる群から選択される構成員である。更に他の観点において、結合基は、多糖、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリマー、コポリマー及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される構成員である。
【０１７３】
或る観点では、本発明により生体分子をキットを用いて標識化することができる。或る場合に、キットは、本願明細書に開示した染料（すなわち、式Ｉ又は式Ｉａで表される化合物）及び緩衝液を含む。好ましくは、キットは、場合により酸又は塩基を加えてｐＨ調整されていることがある結合緩衝液（例えば、スクシンイミドエステルとの反応にはｐＨ８．５が好ましくそしてマレイミドとの反応にはｐＨ７が好ましい）、例えば、１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ５）を含む。好ましくは、緩衝液は制限された低い蛍光バックグランドを有する。
【０１７４】
場合により、キットは精製サブキットを含んでいることができる。好ましい染料により生体分子を標識化した後、任意の副反応生成物及び通常の加水分解から得られる任意の遊離加水分解生成物から標識化した生体分子を分離することができる。アミノ酸１３個以下を含む生体分子の場合、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は不純物を除去することができる。或る場合に、場合により商業的に入手可能なＴＬＣキットによって実施されることがある、分取ＴＬＣを用いて染料標識化ペプチド又はタンパク質を精製することができる。
【０１７５】
より大きい生体分子、例えば、より大きいペプチド又はタンパク質の場合には、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−１５、Ｇ−２５、又はＧ−５０樹脂が望ましくない派生物を除去することができる。所定の場合には、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から商業的に入手可能なタンパク質キットのゲル濾過を用いて、遊離染料から染料標識化ペプチド及びタンパク質を分離することができる。脱塩後に残る標識化生体分子は、しばしば、更に精製することなく充分に用いることができる。或る場合に、ＨＰＬＣ又は他のクロマトグラフィー法によって異種生成物の活性を分析して評価することが必要となることがある。
【０１７６】
《Ｖ．バイオコンジュゲート化合物》
本発明の別の実施態様によれば、式ＩＩ：
【化１６】

で表されるバイオコンジュゲートを提供する。
【０１７７】
上記式中、Ｑ^Ｌは、それぞれ式：
【化１７】

［式中、セグメントはポリメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分である］で表される、ポリメチン炭素原子１個のセグメント及びポリメチン炭素原子３個のセグメントからなる群から選択される構成員である。
【０１７８】
Ｒ^１、Ｒ^２ａ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｌ、及びＹは、式Ｉで表される化合物について前記定義した通りであり、本明細書中で特定される好ましい実施態様を全て含む。
【０１７９】
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^Ｌからなる群からの構成員１つによって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基である。より好ましい観点において、ＺはＣ_１〜Ｃ_６アルキル基である。代わりに、Ｚはエーテル結合（例えば、ポリエチレングリコールオリゴマー）によって中断されている。なお更により好ましい観点において、少なくとも１つのＺは、−プロピレン−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^Ｌ又は−ブチレン−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^Ｌである。代わりに、正確に１つのＺが−プロピレン−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^Ｌ又は−ブチレン−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^Ｌである。
【０１８０】
代わりの観点において、Ｚは任意であり、そしてＲ^Ｌは−Ｌ−Ｙ−に直接結合しているか又はＬ及びＹが存在しない場合にはフェニル環自体に直接結合してさえいる。
【０１８１】
Ｒ^Ｌはそれぞれ、１）生体分子にシアニン染料化合物を結合する結合基；及び２）シアニン染料化合物を結合させる生体分子（すなわち、結合基及びそれによって結合される生体分子）を含み、化合物はＲ^Ｌ少なくとも１つを含む。好ましい結合基を表１（Ｃ欄）に示す。とりわけ好ましい観点において、結合基はアミド基又はエステル基である。更にとりわけ好ましい観点において、結合基はアミド基である。
【０１８２】
前記化合物はバランスの取れた電荷を有する。好ましい観点において、化合物の正味アニオン電荷はアルカリ金属対イオン（例えば、ナトリウム又はカリウム）によってバランスが取られる。より好ましい観点において、少なくとも１つの対イオンはナトリウムである。代わりに、全ての対イオンがナトリウムである。
【０１８３】
バイオコンジュゲートの別の好ましい実施態様において、バイオコンジュゲートの実施態様に、式Ｉで表される本発明の化合物の任意の好ましい実施態様又は観点を含んでいることができる。好ましいバイオコンジュゲートの実施態様に対応する式Ｉで表される好ましい化合物の典型的な例を、本明細書の特許請求の範囲に記載する。
【０１８４】
バイオコンジュゲートのより好ましい観点は、下記構造：
【化１８】

［式中、Ｒ^Ｌは、結合基及びそれによって結合される生体分子を含む］を有する。
【０１８５】
バイオコンジュゲートの第２のより好ましい観点は、下記構造：
【化１９】

［式中、Ｒ^Ｌは、結合基及びそれによって結合される生体分子を含む］を有する。
【０１８６】
或る観点において、本発明の好ましい生体分子として、アシクロターミネータートリホスフェート、抗体、抗原、アビジン、炭水化物、デオキシ核酸、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート、酵素補因子、酵素基質、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ハプテン、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチドホスフェート、ヌクレオチドポリホスフェート、オリゴ糖、ペプチド、ＰＮＡ、多糖、タンパク質、及びストレプトアビジン等を挙げることができる。
【０１８７】
更に他の場合に、適当なヌクレオチドとして、ヌクレオシドポリホスフェートを挙げることができ、その例として限定的でなく、デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート、リボヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、炭素環式ヌクレオシドポリホスフェート及び非環式ヌクレオシドポリホスフェート及びそれらの類似体を挙げることができる。ヌクレオチドはホスフェート鎖中にホスフェート基３個、４個、５個、６個以上を含有し、該ホスフェート基（例えば、α、β、γ、ε、又は末端ホスフェート基）、糖、塩基、又はそれらの組み合わせは、式Ｉで表される化合物を用いて標識化される。ポリホスフェートヌクレオチドとして、限定的ではなく、テトラホスフェート、ペンタホスフェート、ヘキサホスフェート、ヘプタホスフェート等を挙げることができる。塩基として、例えば、プリン（アデニン及びグアニン）、ピリミジン（チミン、ウラシル及びシトシン）及びそれらの誘導体を挙げることができる。
【０１８８】
或る場合に、ホスホロチオエート結合（例えば、参考までに本明細書中に引用する、米国特許第６，３２３，１８６号明細書参照）、ヘテロ原子、又は表１の結合Ｃを生ずる官能基Ａ若しくはＢによって、ホスフェート基（例えば、α、β、γ、ε−ホスフェート基、又は末端ホスフェート基）に式Ｉで表される染料を結合させる。γ−ホスホエステル結合ヌクレオシドトリホスフェートを用いてポリメラーゼによって特定のヌクレオチドを重合する方法及び組成物を提供する、発明の名称「γ−ホスホエステルヌクレオシドトリホスフェート（γ-phosphoester nucleoside triphosphates）」の米国特許第６，３９９，３３５号（参考までに本明細書中に引用する）も参照されたい。ヌクレオチドに式Ｉで表される化合物を結合する他の方法は当業者に知られている。ＤＮＡポリメラーゼと共にこれらのヌクレオチドを用いれば、ＲＮＡ又はＤＮＡ中へのヌクレオチド塩基の取り込み後に遊離される標識化ピロホスフェート又はポリホスフェートの同定によりＤＮＡ又はＲＮＡ配列中の特定のヌクレオチドの同定に至ることができる（例えば、それぞれを参考までに本明細書中に引用する、米国特許第６，２３２，０７５号明細書、米国特許公開第２００４／０２４１７１６号明細書及び米国特許第７，４５２，６９８号明細書を参照されたい）。
【０１８９】
より好ましい観点として、抗体、アビジン、及びストレプトアビジンを挙げることができる。なお更に好ましい観点として、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体、ヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体、及びストレプトアビジンを挙げることができる。
【０１９０】
所定の他の観点において、本発明の好ましい生体分子として、ソマトスタチン、エンドスタチン、炭水化物、オリゴ糖、アプタマー、リポソーム、ＰＥＧ、アンギオポエチン、アンギオスタチン、アンギオテンシンＩＩ、α_２−抗プラスミン、アネキシンＶ、β−シクロデキストリンテトラデカスルフェート、エンドグリン、エンドシアリン、エンドスタチン、上皮成長因子、フィブリン、フィブリノペプチドβ、線維芽細胞成長因子、ＦＧＦ−３、塩基性フィブロネクチン、フマギリン、ヘパリン、肝細胞増殖因子、ヒアルロナン、非インシュリン様（aninsulin-like）成長因子、インターフェロン−α，β阻害剤、ＩＬ阻害剤、ラミニン、白血病抑制因子、リノミド、メタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗体、抗体断片、非環式ＲＧＤペプチド、環式ＲＧＤペプチド、胎盤増殖因子、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、血小板活性化因子アンタゴニスト、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、プレイオトロピン、プロリフェリン、プロリフェリン関連タンパク質、セレクチン、ＳＰＡＲＣ、ヘビ毒、サブスタンスＰ、スラミン、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤、サリドマイド、トロンビン、トロンビンレセプター活性化テトラデカペプチド、形質転換成長因子−α，β、形質転換成長因子レセプター、腫瘍増殖因子−α、腫瘍壊死因子、ビトロネクチン等を挙げることができる。
【０１９１】
更に他の観点において、好ましい生体分子として炭水化物及び炭水化物誘導体を挙げることができる。典型的な例として、グルコサミン、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、及びそれらの誘導体を挙げることができる。なお、より好ましい生体分子として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース、及びラセミ体２−デオキシグルコースを挙げることができる。
【０１９２】
なお更に他の観点において、生体分子は、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ｃ−Ｒｙｋ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ２４、インテグリン、ＦＧＦＲ、ＫＦＧＲ、ＶＥＧＦＲ、ＴＲＡＩＬデコイレセプター、レチノイドレセプター、成長レセプター、ＰＰＡＲ、ビタミンレセプター、グルココルジコステロイド（glucocordicosteroid）レセプター、レチノイド−Ｘレセプター、ＲＨＡＭＭ、高親和性フォレートレセプター、Ｍｅｔレセプター、エストロゲンレセプター及びＫｉ６７からなる群から選択されるレセプターに対する親和性を有するリガンドであることができる。
【０１９３】
代わりに、生体分子は、ソマトスタチン、エンドスタチン、炭水化物、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、アプタマー、リポソーム及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【０１９４】
なお別の観点では、生体分子は、小分子薬剤又は薬剤様分子、例えば、テトラサイクリン系抗生物質、テトラサイクリン誘導体、及びカルセインである。
【０１９５】
《ＶＩ．イメージング方法》
別の実施態様によれば、種々の生物医学的用途において組織及び器官のインビトロ又はインビボの光学的イメージング剤として式Ｉで表される化合物を用いることができる。或る実施態様によれば、本発明は、式Ｉで表される化合物を投与することを含む、イメージング方法を提供する。
【０１９６】
本発明の或る好ましい観点において、本明細書に記載の式Ｉ又は式Ｉａで表される本発明化合物のあらゆる実施態様又は観点を前記イメージング方法において用いることができる。本願明細書及び特許請求の範囲に、前記方法に用いるのに好ましい化合物の典型例を記載する。
【０１９７】
別の実施態様において、本発明は、式ＩＩで表される化合物を投与することを含むイメージング方法を提供する。好ましい観点において、Ｒ^Ｌは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース、及びラセミ体２−デオキシグルコースから選択される生体分子を含む。
【０１９８】
本発明の或る好ましい観点において、本明細書に記載の式ＩＩで表される本発明化合物のあらゆる実施態様又は観点を前記イメージング方法において用いることができる。本願の明細書及び特許請求の範囲に、前記方法に用いるのに好ましい化合物の典型例を記載する。
【０１９９】
或る好ましい観点において、限定的でなく、器官の断層撮影、器官機能のモニタリング、冠動脈造影、蛍光内視鏡検査、腫瘍のイメージング、レーザー誘導手術、光音響法、音響蛍光法等を含む、種々の生物医学的用途における組織及び器官のインビボ・イメージング剤として、本発明の化合物を用いる。１つの観点において、本発明の化合物は、染料の血液クリアランス特性をモニタリングすることによる腫瘍及び他の異常の存在の検出に有用である。本発明の別の観点において、本発明化合物は、腹腔鏡検査法に基づく腫瘍の微小転移検出のためのレーザー補助誘導手術に有用である。なお別の観点において、本発明化合物は、アテローム硬化性プラーク及び血餅の診断に有用である。
【０２００】
更なる観点において、（１）眼科学における眼疾患のイメージングに、例えば、直接的顕微鏡イメージングによる脈絡網膜疾患、例えば、血管障害、網膜障害、血管新生、及び腫瘍の可視化を高めるために；（２）直接的顕微鏡イメージングによる皮膚疾患、例えば、皮膚腫瘍のイメージングに；（３）内視鏡検査による胃腸疾患、口腔疾患、気管支疾患、頚部疾患、及び泌尿器疾患及び腫瘍のイメージングに；（４）可撓性内視鏡カテーテルによるアテローム硬化性プラーク及び他の血管異常のイメージングに；（５）２Ｄ又は３Ｄ画像再構成による乳房腫瘍のイメージングに；並びに（６）２Ｄ又は３Ｄ画像再構成による脳腫瘍、灌流（perfusion）、及び発作（stroke）のイメージングに、本発明の化合物を用いる。
【０２０１】
バイオコンジュゲートである本発明の化合物は、被験者の腫瘍、組織、及び器官をイメージングするのにとりわけ有用である。例えば、式Ｉで表される化合物を用いて抗腫瘍抗体を標識化し、次いで腫瘍の検出及びイメージングのために被験者にそのバイオコンジュゲート抗体を投与することによって、癌細胞又は癌組織の存在を確認することができる。染料化合物と他の抗体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、細胞表面レセプターのリガンド、小分子等も、被験者の腫瘍、組織、及び器官をインビボでイメージングするのに有用な剤である。
【０２０２】
本発明の化合物は、イメージング手順の前に、イメージングすべき器官又は組織に全身的に又は局所的に投与することができる。或る観点において、静脈内的に本発明化合物を投与する。別の観点において、非経口的に本発明化合物を投与する。なお別の観点において、経腸的に本発明化合物を投与する。本発明化合物の投与に用いる組成物は、一般に、意図される投与のタイプに適した通常の薬剤学的な担体及び賦形剤と共に有効量の本発明化合物又はコンジュゲートを含んでいる。例えば、非経口的製剤は、有利には、式Ｉで表される化合物又は式ＩＩで表されるバイオコンジュゲートの滅菌性の水溶液又は水性懸濁液を含んでいる。経腸的投与のための組成物は、一般に、場合により緩衝剤、界面活性剤、チキソトロープ剤、香味剤等を含んでいることができる水溶液又は水性懸濁液中に有効量の本発明化合物又はバイオコンジュゲートを含んでいる。
【０２０３】
腫瘍、組織、又は器官の望ましい光学的イメージを達成するのに有効な量で本発明組成物を投与する。かかる量は、用いられる特定の化合物又はバイオコンジュゲート、イメージング手順に付される腫瘍、組織、又は器官、用いられるイメージング装置等に依存して、広範に変化することがある。
【０２０４】
本発明の方法は、治療的有効量の化合物；ターゲッティング剤、例えば、バイオコンジュゲート；又はそれらの混合物を被験者に投与することを備えている。１つの観点において、ターゲッティング剤は選択的に標的組織に結合する。次いで、光感作剤によって吸収される波長又は波長帯域に対応する波長又は波長帯域の光を与える。別の観点において、本発明の化合物は、１種以上のタイプの標的細胞又は組織に結合することができる剤として働き、適切な波長帯域の光に曝露された場合に、その光を吸収して、標的細胞又は組織をイルミネートし、損傷し又は破壊する物質を生じさせる。好ましくは、本発明化合物は、投与される被験者に無毒であり、又は被験者に投与することができる無毒の組成物に配合することができる。更に、光に曝露された後、生成するあらゆる光分解された形態の化合物も好ましくは無毒である。
【０２０５】
更に別の観点において、限定的でない例として、摂取、注入、経皮的（transcutaneous）投与、経皮（transdermal）投与等を含む、任意の公知手段によって本発明の化合物を投与する。好ましくは、経皮的に被験者に本発明化合物を投与する。
【０２０６】
本発明の更なる観点において、治療のための標的、腫瘍組織、又は器官は、血管内皮組織、腫瘍の異常血管壁、充実性腫瘍、頭部の腫瘍、頚部の腫瘍、消化管の腫瘍、肝臓の腫瘍、胸部の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、睾丸の腫瘍、肺の腫瘍、非充実性腫瘍、造血組織及びリンパ組織の１つの悪性細胞、脈管系の病変、病的骨髄、神経組織又は病的神経組織、及び疾患が自己免疫疾患及び炎症性疾患の１つである病的細胞からなる群から選択される。なお更なる観点において、標的組織は、アテローム性動脈硬化病変、動静脈奇形、動脈瘤、及び静脈病変からなる群から選択されるタイプの脈管系の病変である。
【０２０７】
更に別の観点において、エネルギーの形態として、限定的でなく、光（すなわち、放射）、熱、音波、超音波、化学、光、マイクロ波、イオン化（例えば、Ｘ線及びガンマ線）、機械、及び電気を挙げることができる。本明細書中で用いる「放射」という用語は全ての波長及び波長帯域を含む。好ましくは、光感作剤を励起する波長又は波長帯域と一致するか又は少なくとも部分的に一致する放射波長又は波長帯域を選択する。本発明の化合物は、典型的には、それらを励起して標的細胞、組織、器官、又は腫瘍を照射し、損傷し又は破壊する物質を生成する吸収波長帯域１つ又は２つ以上を有する。好ましくは、放射波長又は波長帯域は、光感作剤の励起波長又は波長帯域と一致し、そして血液タンパク質を含む被験者の非標的細胞及び残部（rest）による低吸収を示す。より好ましくは、放射波長又は波長帯域は、約６００ｎｍ〜約１０００ｎｍのＮＩＲ範囲又はその関連範囲（例えば、本願の特許請求の範囲に記載の範囲）内にある。
【０２０８】
或る観点において、試料を同定又は定量化できるように本発明の化合物を用いて試料を直接に染色又は標識化する。例えば、生物学的又は非生物学的流体中の検出可能なトレーサー成分として、生物学的標的アナライトのアッセイの一部として；又は、染色された試料を照射して選択的に腫瘍細胞及び組織を破壊する、腫瘍の光力学的治療のような目的で；又は、通常、光感作による一重項酸素の生成を介して、動脈プラーク又は動脈細胞を光学的に切除する（photoablate）ために、本発明化合物を添加することができる。
【０２０９】
一般的に、試料は、液体供給源から直接に、又は固体材料（有機又は無機）からの洗液として又は培養のために細胞が導入されていた増殖培地として、又は評価のために細胞が置かれていた緩衝溶液として得られる。試料が細胞を含む場合、細胞は場合により、微生物を含む単細胞、又は多細胞生物、胚、組織、生検材料、フィラメント、バイオフィルム等を含む、２次元又は３次元の層において他の細胞と一緒になった多細胞であることがある。
【０２１０】
本明細書中で用いる検出可能な光学的応答は、観察又は機器のいずれかにより検出することができる光学的信号における変化又は光学的信号の発生を含む。一般的に、検出可能な応答は、蛍光における変化、例えば、強度の変化、蛍光の励起若しくは発光波長分布、蛍光寿命、蛍光偏光、又はそれらの組み合わせである。標準的な応答又は予期される応答と比較した、染色の程度及び／又は位置は、試料が所与の特徴を有しているか否か及びその程度が如何ほどかを示す。本発明の一部の化合物は、蛍光発光をほとんど示さないことがあるが、それにもかかわらず、発色団の染料として有用である。かかる発色団は、蛍光（又はフォースター（Foerster））共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）用途において、又は試料若しくは試料の一部に所望の色を与えるエネルギー供与体として有用である。
【０２１１】
ＦＲＥＴは、供与体分子（例えば、染料）が光を吸収して励起状態となる方法である。発光するよりむしろ、最初の分子がその励起状態を他の特性を持ったアクセプター分子（例えば、異なる波長で蛍光を発する染料又は消光物質）に移し、そしてアクセプターは蛍光を発するか又は励起を消光する（quench）。移動の効率は２つの分子の近接性に依存するので、それは分子複合体形成又は生体分子構造に関する情報を示すことができる。それは、特定の複合体が細胞又は生物（organism）内のどこに位置しているかを示すことができる（例えば、ＦＲＥＴ光学顕微鏡）。ＦＲＥＴ法においてアクセプター（クエンチャー）として同様の染料を用いる方法については、X. Peng, H. Chen, D. R. Draney, W. Volcheck, A. Schultz-Geschwender, and D. M. Olive, “A nonfluorescent, broad-range quencher dye for Foerster resonance energy transfer assays,” Anal. Biochem 2009, 388(2): 220-228を参照されたい。
【０２１２】
或る場合に、適当なＦＲＥＴアクセプターは、参考まで本明細書に引用する第ＷＯ２００７／００５２２２号に開示されている。この化合物は、本質的に、式ＩＩＩ：
【化２０】

で表される非蛍光染料を含んでおり、上記式ＩＩＩの置換基は次のように定義される：Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、水素原子及び場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基からなる群から選択される。代わりに、Ｒ^１及びＲ^２はそれらが結合する以下の基：
【化２１】

と一緒になって５員環又は７員環を形成し、該環はハロゲン原子、シアノ基、スルホネート基、（Ｃ_１〜Ｃ_８）ハロアルキル基、ヒドロキシ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシ基及び場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル基からなる群から選択される置換基１〜４個によって場合により置換されていることがある。
【０２１３】
式ＩＩＩにおいて、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立して、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基であり、そして場合によりそれらが結合している原子と一緒になって５員又は７員の炭素環式環を形成していることがあり；又は代わりに、置換基Ｒ^３及びＲ^４は以下の基：
【化２２】

と交換されており（replace）、式中のＢは（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基であるか；又はＢ及びＲ^９Ａはそれらが結合している炭素原子と一緒になって、場合によりヘテロ原子１個又は２個を有していることがあり及び場合により二重結合３個までを有していることがある５員環又は６員環を形成する。
【０２１４】
置換基Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立して場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基であるか；又は場合によりそれらが結合している原子と一緒になって環を形成することができる。
【０２１５】
置換基Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立して、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、場合により置換されていることがあるアリール（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、場合により置換されていることがあるヘテロアリール（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−（ＣＨ_２）_ｃＲ^１３及び−（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５からなる群から選択される。添字ｃ及びｄはそれぞれ独立して１〜５０の整数である。Ｒ^１３は、生体分子上のカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオ基と直接に反応しない官能基である。Ｒ^１５は、メルカプト基、アミノ基、ハロアルキル基、ホスホルアミジチル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアナト基、ヨードアセトアミジル基、マレイミジル基及び活性化カルボン酸からなる群から選択される結合基である。
【０２１６】
置換基Ｒ^{９ａ〜９ｄ}及びＲ^{１０ａ〜１０ｄ}はそれぞれ独立して、水素原子、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−ＳＯ_３Ｃａｔ^＋、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１Ｒ^１２、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−ＮＲ^１２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−ＮＲ^１２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１１、−（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^１２（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｒ^１５及び−ＮＲ^２０Ｒ^２１からなる群から選択され、式中、Ｃａｔ^＋はカチオンである。置換基Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して、水素原子及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基からなる群から選択され；Ｒ^２０及びＲ^２１はそれぞれ独立して、水素原子、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル基、ＣａｔＯ_３Ｓ（Ｃ_１〜Ｃ_５０）アルキレン基からなる群から選択される。
【０２１７】
代わりに、隣接する原子上に位置するＲ^{１０ａ〜１０ｄ}の任意の２つの置換基は、それらが結合している原子と一緒になって、場合によりヘテロ原子１個又は２個を有していることがあり及び場合により二重結合を３つまで有していることがある５員環又は６員環を形成し；該環は、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−ＳＯ_３⁻Ｃａｔ、ハロゲン原子、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１Ｒ^１２、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−ＮＲ^１２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−ＮＲ^１２Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１１、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^１２（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｒ^１５及び−ＮＲ^２０Ｒ^２１からなる群から選択される置換基１個〜３個によって更に置換されていることができる。
【０２１８】
式ＩＩＩにおいて、変数ａは０〜３の整数でありそして変数ｂは０〜２の整数である。Ａは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル基、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）ジアルキルアミノ基、場合により置換されていることがあるアルキルチオ基、−（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｒ^１５、場合により置換されていることがある（Ｃ_１〜Ｃ_６）ヘテロアルキル基、フェノキシ基及び場合により置換されていることがある式：
【化２３】

［Ｒ^３６ａ〜Ｒ^３６ｅ基はそれぞれ独立して、水素原子、−ＳＯ_３Ｃａｔ^＋、−（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−ＮＲ^１２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^１２（ＣＨ_２）_ｄＲ^１５、−Ｒ^１５、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、カルボキシル基及びＮＲ^２０Ｒ^２１基からなる群から選択される］を有するアリールオキシ基からなる群から選択される。
【０２１９】
式ＩＩＩで表される化合物は結合基少なくとも１個を有する。或る観点において、本発明の化合物は結合基１個以上、例えば、結合基１個、２個、３個以上を有する。式ＩＩＩで表される化合物の種々の位置に、結合基Ｒ^１５少なくとも１個を結合させることができる。
【０２２０】
生物学的用途に対して、本発明の化合物は、一般的に、当該技術分野において一般的に知られている方法によって調製される水溶液、ほぼ水溶性の（mostly aqueous）溶液又は水混和性溶液中で用いられる。本発明化合物の正確な濃度は、実験条件及び望ましい結果に依存するが、０．００００１ｍＭ〜０．１ｍＭまでの範囲、例えば、約０．００１ｍＭ〜約０．０１ｍＭが考えられる。最適濃度は、最小のバックグランド蛍光を有する満足な結果が達成されるまでの系統的変化により決定される。
【０２２１】
或る観点において、本発明の方法は、式Ｉで表される化合物、式ＩＩで表されるバイオコンジュゲート、又はそれらの任意の観点若しくは実施態様を含む用量を用いた動物又は試料の処理を含んでいることができる。本発明化合物の正確な濃度は、対象及び望ましい結果に依存している。或る実施態様において、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、又は０．０７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、又は０．０７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。或る他の実施態様において、少なくとも約０．１、０．２５、０．５、又は０．７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約０．１、０．２５、０．５、又は０．７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。更に他の実施態様において、少なくとも約０．１、０．２５、０．５、又は０．７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約０．１、０．２５、０．５、又は０．７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。なお更に他の実施態様において、少なくとも約１、２．５、５、又は７．５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約１、２．５、５、又は７．５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。追加の他の実施態様において、少なくとも約１０、２５、５０、又は７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約１０、２５、５０、又は７５ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。追加の更に他の実施態様において、少なくとも約１００、２５０、５００、又は７５０ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。代わりに、多くとも約１００、２５０、５００、又は７５０ｍｇ／ｋｇの用量を用いる。他の有効投与量は当業者によって容易に決定することができる。
【０２２２】
本発明化合物は、最も有利には、生物学的成分を有する試料を染色するのに用いられる。試料は、成分（例えば、そのままの細胞、固定化細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、オルガネラ、及びそれらの組み合わせ）の異種混合物、又は単一成分又は成分（例えば、天然若しくは合成アミノ酸、核酸又は炭水化物ポリマー、又は脂質膜複合体）の同種群を含んでいることができる。これらの混合物は、一般的に、使用濃度範囲内で生細胞及び他の生物学的成分に対し無毒である。
【０２２３】
本発明化合物と着目した試料成分との間の接触を促進するいずれかの方法により、本発明化合物を試料と合わせる。一般的には、単純に試料に本発明化合物又は該化合物を含む溶液を添加する。本発明の所定の化合物、とりわけ、スルホン酸部分１個又は２個以上により置換されている化合物は、生物学的細胞の膜に対して不透過性である傾向があり、そしていったん内部に入れば一般的に生細胞を充分に染色する。原形質膜を透過性にする処理、例えば、エレクトロポレーション、衝撃処理又は高濃度細胞外ＡＴＰを用いて、選択された化合物を細胞内に導入することができる。代わりに、例えば、圧力微量注入、スクレープローディング（scrape loading）、パッチクランプ法、又は食作用により、細胞内へ物理的に、選択された染料化合物を挿入することができる。
【０２２４】
染色後又は染色の間の任意の時に、検出することができる光学的応答を与えるべく選択された光の波長を用いて試料を照明し、そして光学的応答を検出するための手段を用いて試料を観察する。本発明の化合物を照明するのに有用である装置として、限定的でなく、ハンドヘルド紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザー及びレーザーダイオードを挙げることができる。これらの照明源は、場合により、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準蛍光光度計若しくはミニ蛍光光度計、又はクロマトグラフ用検出器に組み込まれていることがある。本発明の好ましい観点は、波長６３３〜６３６ｎｍ、６４７ｎｍ、６４９ｎｍ、６５１ｎｍ、６４７〜６５１ｎｍ、６６０ｎｍ、６７４ｎｍ、６７５ｎｍ、６７８ｎｍ、６８０ｎｍ、６７４〜６８０ｎｍ、６８５ｎｍ、６７４〜６８５ｎｍ、６８０〜６８５ｎｍで又はその近傍で、及び７００ｎｍを超える波長、例えば、７８０ｎｍ、８１０ｎｍ及び８５０ｎｍで又はその近傍で励起することができる化合物であり、それはこれらの領域が典型的な化合物のアウトプット又は比較的安価の励起源のアウトプットとよく一致するからである。
【０２２５】
光学的応答は、場合により、目視検査によって、又は以下の装置：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、エピ蛍光（epifluorescence）顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかを用いることによって、又は信号を増幅する手段（例えば、光電子増倍管）によって検出されることがある。フローサイトメーターによって試料を検査する場合、試料の検査は場合により、その蛍光応答により試料の部分をソートすることを含むことがある。
【０２２６】
《ＶＩＩ．実施例》
以下に、実施例を用いて本発明を記載するが、これらは説明の目的のためにだけ設けるものである。従って、これらは、特許請求の範囲によって規定された本発明の範囲を限定するように構成されたものではない。
《実施例１》
６−ヒドラジノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸塩の調製
【化２４】

６−ヒドラジノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸塩（１）
【０２２７】
６−アミノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム塩（２５ｇ、７２ミリモル）を水１５０ｍＬ中に溶解しそして濃塩酸５０ｍＬに添加した。このスラリーを氷／塩浴中で約０℃まで冷却し、そして冷水２５ｍＬ中の亜硝酸ナトリウム（５．４６ｇ、７９．２ミリモル）を１０分間にわたり滴状に添加した。塩化第一スズ（２０．４２ｇ、１０８ミリモル）を濃塩酸１５ｍＬ中に溶解し、０℃まで冷却しそして２０分間にわたり反応混合物に添加した。得られた溶液を３時間にわたり攪拌しながら室温まで加温した。この溶液をロータリーエバポレーションによって容積を減らし、そしてイソプロパノールの添加によって生成物を沈殿させた。化合物１を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、そして真空乾燥させた。
《実施例２》
２，３，３−トリメチルベンズインドール６，８−ジスルホン酸塩の製造
【化２５】

２，３，３−トリメチルベンズインドール６，８−ジスルホン酸塩（２）
【０２２８】
６−ヒドラジノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸塩（１）（１０ｇ、２５ミリモル）、イソプロピルメチルケトン（１２ｇ、１４０ミリモル）及び酢酸カリウム（６ｇ、６１ミリモル）を氷酢酸７５ｍＬ中で合わせて、そして、１４５℃で２２時間加熱した。この溶液を冷却し、ロータリーエバポレーションによって酢酸を除去した。この残渣をメタノール中に溶解しそして濾過した。次いで、イソプロパノールを用いてメタノール濾液から化合物２を沈殿させ、濾過し、イソプロパノール及びエーテルを用いて洗浄し、そして真空乾燥させた。
《実施例３》
１，１，２−トリメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化２６】

１，１，２−トリメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（３）
【０２２９】
乾燥１，２−ジクロロベンゼン５０ｍＬ中で２，３，３−トリメチルベンズインドール６，８−ジスルホン酸塩（２）（２．２ｇ、５ミリモル）を攪拌した。１，３−プロパンスルトン（２．８ｇ、２３ミリモル）を添加し、そしてこの溶液を封管中で１４５℃に１５時間加熱した。この溶液を冷却し、そして溶媒をデカントして除いた。この固形生成物３をイソプロパノール５０ｍＬ部分３回、次いでエーテル５０ｍＬを用いてフィルター上で洗浄しそして真空乾燥させ、暗紫色の固形物（２．５ｇ、９０％）を得た。
《実施例４》
１，１，２−トリメチル−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化２７】

１，１，２−トリメチル−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（４）
【０２３０】
出発材料として１，４−ブタンスルトンを用いる以外は、化合物３（実施例３）と同様にして化合物４を製造した。
《実施例５》
（Ｅ）−Ｎ−（（Ｚ）−２−ブロモ−３−（フェニルアミノ）アリリデン）ベンゼンアミニウムブロミドの製造
【化２８】

（Ｅ）−Ｎ−（（Ｚ）−２−ブロモ−３−（フェニルアミノ）アリリデン）ベンゼンアミニウムブロミド（５）
【０２３１】
文献（Simonis, H. Ber. Deut. Chem. Ges. 1901, 34, 509；米国特許第６，７４７，１５９号明細書）に開示の方法を用いる。１００ｍＬビーカー中のエタノール１５ｍＬ中にアニリン３．５４ｇを溶解する。別途、１００ｍＬ三角フラスコ中のエタノール１５ｍＬ中にムコ臭素酸５ｇを溶解する。冷却しながら、この溶液をアニリン／メタノール溶液に滴状に添加する。この反応混合物は、ＣＯ_２の発生を伴い、すぐに黄色に、次いでオレンジ色に変わる。添加の終了時点で、この混合物をその容積が半分に減るまでウォーターバス中で加熱する。得られた溶液を氷塩混合物を用いて冷却し、黄色の結晶性沈殿を形成する。この固形物をガラス濾過器上に集めて純粋な生成物５を得；追加の生成物５は母液の濃縮及び再結晶により回収することができる。
《実施例６》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化２９】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（６）
【０２３２】
還流冷却器を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに１，１，２−トリメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（３）（５６５ｍｇ、１ミリモル）、（Ｅ）−Ｎ−（（Ｚ）−２−ブロモ−３−（フェニルアミノ）アリリデン）ベンゼンアミニウムブロミド（５）（１５０ｍｇ、０．５ミリモル）、及びピリジン（１ｍＬ）を充填した。このフラスコに無水酢酸（１０ｍＬ）を添加し、そしてこの混合物を１１５℃で２時間加熱し、室温まで冷却し、そしてエチルエーテル２５ｍＬで希釈した。得られる暗青色の染料沈殿を濾過により集め、次いで水２０ｍＬ中に溶解しそして分取用逆相ＨＰＬＣによって精製して青色粉末として化合物６を得た（２８５ｍｇ、５０％；ＵＶ／可視吸収最大６７４ｎｍ）。
《実施例７》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化３０】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（７）
【０２３３】
出発材料として化合物４を用いた以外は、化合物６（実施例６）と同様にして化合物７を製造した。
《実施例８》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化３１】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（８）
【０２３４】
化合物６（８０ｍｇ）、３−（４−カルボキシブチル）フェニルボロン酸（４０ｍｇ）、及び炭酸セシウム（２０ｍｇ）を、窒素下室温において１：１水：エタノール（１０ｍＬ）中で攪拌する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ）をこの反応混合物に添加する。この混合物を４時間還流し、そして溶媒及び揮発性化合物を真空蒸発させる。１：４アセトニトリル：水混合物を用いた溶出による逆相Ｃ１８−官能化シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって、この粗製生成物を精製する。精製生成物８はＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝６８０ｎｍ、ε＝２２９，０００；λ_ＰＢＳ＝６７６ｎｍ、ε＝２３９，０００を有している。
《実施例９》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化３２】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（９）
【０２３５】
乾燥ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）中の化合物８（２００ｍｇ）の溶液に、トリエチルアミン（１５０μＬ）及びＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（８２ｍｇ）を添加した。この混合物を室温で２時間攪拌し、そして溶媒を除去してスクシンイミジルエステルを得た。
《実施例１０》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（２−カルボキシエチル）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化３３】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（２−カルボキシエチル）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（１０）
【０２３６】
出発材料として３−（３−ボロノフェニル）プロピオン酸を用いる以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物１０を製造した。
《実施例１１》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（３−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−３−オキソプロピル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（１１）の製造
【化３４】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（３−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−３−オキソプロピル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（１１）
【０２３７】
出発材料として化合物１０を用いた以外は、化合物９（実施例９）と同様にして化合物１１を製造した。
《実施例１２》
２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化３５】

２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１２）
【０２３８】
ジクロロベンゼン１００ｍＬ中の商業的に入手可能な５−スルホ−２，３，３−トリメチルインドリニウム分子内塩１４ｇ及びプロパンスルトン１４ｇの混合物を１１０℃で２時間加熱した。冷却後、溶媒をデカントし次いでアセトニトリル１００ｍＬ中にこの固形物を溶解しそして酢酸エチル３００ｍＬを添加する。得られる粘着性固形物を再び酢酸エチル３００ｍＬ中に攪拌して生成物１２を２０ｇ得た。
《実施例１３》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化３６】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１３）
【０２３９】
出発材料として化合物１２を用いた以外は、化合物６（実施例６）と同様にして化合物１３を製造した。ＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝６５０ｎｍ。
《実施例１４》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化３７】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１４）
【０２４０】
出発材料として化合物１３を用いた以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物１４を製造した。ＵＶ／可視吸収最大：λ_Ｈ２Ｏ＝６４９ｎｍ、ε＝１９０，０００；λ_ＭｅＯＨ＝６５０ｎｍ、ε＝１８０，０００；（Ｍ＋１）^＋としてのＭＳ計算値（実測値）９３５．２１（９３５．３）。
《実施例１５》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（３−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化３８】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（３−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１５）
【０２４１】
出発材料として化合物１４を用いる以外は、化合物９（実施例９）と同様にして化合物１５を製造した。
《実施例１６》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（カルボキシメトキシ）−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化３９】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（カルボキシメトキシ）−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（１６）
【０２４２】
出発材料として２−（３−ボロノ−フルオロフェノキシ）酢酸を用いる以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物１６を製造した。精製化合物１６はＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝６７７ｎｍ、ε＝２０５，０００；λ_ＰＢＳ＝６７４ｎｍ、ε＝１９５，０００を有している。
《実施例１７》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（２，６−ジフルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４０】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（２，６−ジフルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１７）
【０２４３】
上記に示したクロロ染料前駆体１００ｍｇ、２，６−ジフルオロ−４−メトキシフェニルボロン酸７０ｍｇ、及びＰｄ（ＰＰｈ_３）_４１０ｍｇを合わせることにより化合物１７を製造した。この混合物を窒素ガス下でＨ_２Ｏを用いて５時間還流した。Ｃ１８−官能化シリカ及び１５：８５アセトニトリル／Ｈ_２Ｏグラジエントを用いた逆相ＨＰＬＣによって、未処理溶液（green solution）を分離した。精製化合物はＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝７８３ｎｍ、λ_ＰＢＳ＝７７７ｎｍ、及び８０５ｎｍでの発光（emission）を有している。
《実施例１８》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−ブトキシ−２，６−ジフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４１】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−ブトキシ−２，６−ジフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１８）
【０２４４】
化合物１７（実施例１７）と同様にして、ＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝７８６ｎｍ、λ_ＰＢＳ＝７７９ｎｍ、及び８０５ｎｍでの発光を有する、化合物１８を製造した。
《実施例１９》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−ブトキシ−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４２】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−ブトキシ−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（１９）
【０２４５】
化合物１７（実施例１７）と同様にして、ＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝７８９ｎｍ、λ_ＰＢＳ＝７８２ｎｍ、及び８０６ｎｍでの発光を有する、化合物１９を製造した。ε_ＭｅＯＨ＝３００，０００；ε_ＰＢＳ＝２４０，０００。
《実施例２０》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−ブトキシ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４３】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−ブトキシ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２０）
【０２４６】
化合物１７（実施例１７）と同様にして、ＵＶ／可視吸収最大λ_ＭｅＯＨ＝７９０ｎｍ、λ_ＰＢＳ＝７８６ｎｍ、及び８０５ｎｍでの発光を有する、化合物２０を製造した。
《実施例２１》
化合物１０を用いたストレプトアビジンのバイオコンジュゲートの製造
【０２４７】
ＤＭＦ中で化合物１１を１ｍｇ／ｍＬに再構成した。典型的には、ｐＨ８．５のＰＢＳ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬでストレプトアビジンを再構成した。このストレプトアビジン試料に染料を（種々のモル比で）添加しそして暗中において室温で２時間のインキュベートに付した。このコンジュゲートをＰＢＳ緩衝液に対して広範囲に透析してコンジュゲートしていない遊離の染料を除去した。コンジュゲート中のタンパク質のモル当たりの染料のモル比を下記のように計算した。
【数１】

上式中、
・ε_染料＝２３９，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１
・ε_{ストレプトアビジン}＝１７５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１
・０．０９は２８０ｎｍにおける６８０染料吸収に対する補正係数である。
《実施例２２》
ＧＡＭ抗体の化合物８とのバイオコンジュゲートの製造
【０２４８】
ＤＭＦ中で化合物９を１ｍｇ／ｍＬに再構成した。典型的には、ｐＨ８．５のＰＢＳ緩衝液中にヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１ｍｇ／ｍＬで再構成した。このＧＡＭ抗体試料に染料を（種々のモル比で）添加しそして暗中において室温で２時間のインキュベートに付した。このコンジュゲートをＰＢＳ緩衝液に対して広範囲に透析してコンジュゲートしていない遊離の染料を除去した。タンパク質に対する染料の比を上記のように計算した。
《実施例２３》
化合物１０のストレプトアビジンバイオコンジュゲートと商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０及びＡｌｅｘａ ６８０ダイのストレプトアビジンバイオコンジュゲートとの全蛍光のドットブロットイムノアッセイ比較
【０２４９】
種々の量のビオチニル化抗ウサギＩｇＧで予めニトロセルロース膜をコートした。この膜をＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファで３０分間ブロックし、引き続いて種々のＤ／Ｐ比の化合物１０とストレプトアビジンとのバイオコンジュゲートを用いて３０分間インキュベートした。１Ｘ ＰＢＳ及び１Ｘ ＰＢＳ−Ｔを用いて膜を強く洗浄した。ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）赤外線イメージャー上でこの膜を走査した。
【０２５０】
これらの試験における化合物１０のストレプトアビジンバイオコンジュゲートは、この波長範囲において最良の市販ストレプトアビジンコンジュゲートと同等に機能する。３．０ｐｇと６．１ｐｇとの間のＬＯＤ差は、希釈列において単一スポットであり、実験変動に対応できる。化合物１０コンジュゲートのバンドの蛍光強度は市販コンジュゲートのものと同等であるか又はそれより良好である。膜に対するコンジュゲートの非特異的結合による蛍光バックグランドも、試験したコンジュゲート全てについて低い。
【表２】

《実施例２４》
化合物８のＧＡＭ抗体バイオコンジュゲートと商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０ダイのＧＡＭ抗体バイオコンジュゲートとのバックグランド蛍光のＩＣＷ比較
【０２５１】
化合物８とのＧＡＭコンジュゲートを、細胞ベースの免疫組織化学的分析（「Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ」又はＩＣＷ）によって評価し、そしてＬＩ−ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ（商標）６８０ＧＡＭバイオコンジュゲート、ＬＩ−ＣＯＲ Ｐａｒｔ Ｎｏ．９２６−３２２２０と比較した。９６ウェルプレート中にＡ４３１細胞、ＡＴＣＣ Ｐａｒｔ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５５５をシードしそして３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、３７％ホルムアルデヒドで細胞を固定化し、そしてＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を用いて細胞を透過処理した。透過処理後に、Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファを用いて細胞をブロックした。
【０２５２】
ＬＩ−ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ（商標）６８０−ＧＡＭ抗体及び化合物８−ＧＡＭ抗体バイオコンジュゲートの両方を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中で希釈し、そして最終濃度２μｇ／ｍＬ、各試料当たり１２ウェルでプレートに添加した。室温で１時間にわたり穏やかに振盪しながら試料をインキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で３回洗浄し、そしてマイクロプレート２プレセット（Microplate 2 preset）を用い、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）赤外線イメージャー上で走査した。各試料について平均積分強度を計算しそしてＬＩ−ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ（商標）６８０−ＧＡＭ抗体と化合物８−ＧＡＭ抗体とを比較した。結果を下記表３及び４に示す。
【０２５３】
ＮＩＲにおける生物学的材料の低い蛍光バックグランドは、マイクロプレート中の生きた又は固定化された細胞での実験を可能とする。重要な例は、「Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ」（ＩＣＷ）技法の、固定化された細胞中の細胞タンパク質の免疫組織化学的検出である。かかる系においては、検出のために用いられる染料標識化抗体が、最初の細胞環境の極めて低い蛍光バックグランドを維持することが重大である。従って、検出抗体に結合する染料分子は、他の細胞タンパク質、膜等に対して極めて低い非特異的結合を有していなければならず、さもなければ標識化抗体はそれらの特徴物に付着し実験をだめにする。ＩＲＤｙｅ（商標）６８０又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６８０で標識化した抗体は細胞に対し極めて低い非特異的結合を維持する。表３のデータは、化合物８で標識化したＧＡＭ抗体がこの試験において２つの標準よりやや高いバックグランドを与えるが、それでもなお極めて低い非特異的バックグランドを有していることを示す。この染料を用いてＩＣＷ及び他の細胞ベース（インビボ）用途に適した標識化抗体を生成することができる。
【表３】

《実施例２５》
化合物８のＧＡＭ抗体バイオコンジュゲートと商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０のＧＡＭ抗体バイオコンジュゲートとの全蛍光のウエスタンブロット比較
【０２５４】
ジャーカット（Jurkat）溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥによって流し（５μｇ〜７８ｎｇ）そしてニトロセルロースに移した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）−２０（ＯＢＢＴ）を用いてブロットをブロックした。ＯＢＢＴ中に希釈したモノクローナル抗チューブリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ７８１６）又はモノクローナル抗アクチン（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ ＭＳ−１２９５−Ｐ１）を用いてブロットをプローブした。次いで、最終濃度０．１μｇ／ｍＬにＯＢＢＴ中に希釈した以下の二次抗体の１つを用いてブロットを検出した：ＧＡＭ−化合物８ Ｄ／Ｐ＝１．６又はＬＩ−ＣＯＲ ＧＡＭ６８０（図１Ｃ〜Ｄ参照）。
【０２５５】
表４及び図１Ａ〜Ｂのデータは、ウエスタンブロッティング用途に対し本発明の染料の１つ（化合物８）により与えられる優れた性質を示している。ＩＲＤｙｅ（商標）６８０で標識化した抗体は大変に充分に機能しそして現在の技術水準を表す「対照」としての役目を果たす。化合物８で標識化した抗体は、対照と比べて有意に高い、２倍より大きい蛍光強度を有する。蛍光染料標識化した生体分子の大部分は、例えば、ウエスタンブロットに用いられる膜に、非特異的に付着する傾向を示す。図1及び表４の蛍光バックグランドデータが示すように、ＩＲＤｙｅ（商標）６８０及び化合物８（図１Ａ〜Ｂ）を用いて、膜への極めて少ない非特異的結合を有する標識化抗体を形成することができる。
【表４】

《実施例２６》
化合物８へのストレプトアビジンコンジュゲートと商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ（商標）６８０ダイのストレプトアビジンへのコンジュゲートとの全蛍光のウエスタンブロット比較
【０２５６】
ジャーカット溶解物をゲル上に流した（５μｇ〜７８ｎｇ）。Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中に１：１０００希釈されたｍｓ抗アクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｏ．ＭＳ−１２９５Ｐ）、それに続いてＯｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッカー＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中に１：２０，０００希釈されたビオチン−ＳＰ ＧＡＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｎｏ． １１５−０６５−１６６）を用いてブロットをプローブした。次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）ブロッキングバッファ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中の種々の６８０ストレプトアビジンバイオコンジュゲートを用いてブロットを検出した（図２Ｄ参照）。
【０２５７】
本発明の染料の１つ（化合物８）のストレプトアビジンコンジュゲートも有利なことにこの例における市販のストレプトアビジンコンジュゲートと同等である。図２Ａ〜Ｃ中、化合物８コンジュゲートを用いて検出された各ブロットにおいて、最も希釈されたアクチンバンドをはっきり観察することができる。各ブロットにおける全アクチンバンドの全蛍光強度を、膜の代表的なバックグランド領域と共に、表５に要約する。化合物８コンジュゲートの蛍光強度は、対照より２〜３倍高く、一方、蛍光バックグランドはほんのわずかに高いに過ぎない。
【表５】

《実施例２７》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（５−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化４４】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（５−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（２１）
【０２５８】
化合物９（０．１８ミリモル）を乾燥ＤＭＳＯ２０ｍＬ中に溶解しそして乾燥窒素下に室温で攪拌する。次いで、この攪拌溶液に２−マレイミジオ（2-maleimidio）エチルアミン（９３．２ｍｇ、０．３７ミリモル）を添加し、引き続いてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（９５ｍｇ、０．５５ミリモル）を添加する。攪拌を４５分間継続する。この反応にＤＭＦ（２０ｍＬ）を添加し、そして完全混合が達成されるまで攪拌を続ける。次いで、攪拌ジエチルエーテル４００ｍＬ中に徐々にこの溶液を注いで生成物を沈殿させる。このエーテル懸濁液を更に５分間攪拌した後、１時間放置する。エーテルをデカントし、追加のＤＭＦ２０ｍＬを添加して固形物を再溶解する。次いで、第２の攪拌エーテル４００ｍＬ部分中にこのＤＭＦ溶液を沈殿させる。濾過により、この粗製生成物２１を集める。場合により、例えば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、又は再結晶によって、更に精製を行うことができる。
《実施例２８》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−３−オキソプロピル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化４５】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（３−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−３−オキソプロピル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（２２）
【０２５９】
出発材料として化合物１１を用いた以外は、化合物２１（実施例２７）と同様にして化合物２２を製造する。
《実施例２９》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（３−（５−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４６】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（３−（５−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２３）
【０２６０】
出発材料として化合物１５を用いる以外は、化合物２１（実施例２７）と同様にして化合物２３を製造する。
《実施例３０》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−カルボキシフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４７】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−カルボキシフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２４）の製造
【０２６１】
出発材料としてシクロペンチルクロロ染料前駆体及び３−ボロノ安息香酸を用いた以外は、化合物１７と同様にして化合物２４を製造した。ここで用いるボロン酸中間体は多用途（versatile）であり種々の設計変更に応じて注文合成（custom synthesis）により改変することができる。種々のタイプの置換基及び置換基長さを用いてフェニル環を置換することができる。１つの注文合成製造業者は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＣｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓ社である。
《実施例３１》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロピル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４８】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロピル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２５）
【０２６２】
出発材料として４−（３−ボロノフェニル）ブタン酸を用いる以外は、化合物２４と同様にして化合物２５を製造する。
《実施例３１Ｂ》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシブチル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化４９】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシブチル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２６）
【０２６３】
出発材料として５−（３−ボロノフェニル）ペンタン酸を用いた以外は、化合物２４と同様にして化合物２６を製造した。ＵＶ：λ_ＰＢＳ＝７５６ｎｍ、ε＝２６０，０００；λ_ＭｅＯＨ＝７６６ｎｍ、ε＝３３０，０００．発光（Emission）：λ_ＭｅＯＨ＝７７６ｎｍ。
《実施例３２》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ，７Ｅ）−４−（３−カルボキシフェニル）−７−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）ヘプタ−１，３，５−トリエニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化５０】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ，７Ｅ）−４−（３−カルボキシフェニル）−７−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）ヘプタ−１，３，５−トリエニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２７）
【０２６４】
出発材料としてクロロ染料前駆体及びｍ−カルボキシフェニルボロン酸を用いる以外は、化合物２４と同様にして化合物２７を製造する。代わりに、別のハロゲン原子、例えば、ヨード又はクロロによりブロモ置換基を交換することができるが、ブロモが好ましい。
《実施例３３》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロピル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化５１】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロピル）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロペント−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２８）
【０２６５】
出発材料として４−（３−ボロノフェニル）ブタン酸を用いる以外は、化合物２４と同様にして化合物２８を製造する。代わりに、別のハロゲン原子、例えば、ヨード又はクロロによりブロモ置換基を交換することができるが、ブロモが好ましい。
《実施例３４》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）−２−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）シクロへキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化５２】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）−２−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）シクロへキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（２９）
【０２６６】
上記に示したように、３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニルボロン酸を用いる以外は、化合物１７と同じ方法により化合物２９を製造する。
《実施例３５》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）−２−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）シクロへキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸テトラブチルアンモニウムの製造
【化５３】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）−２−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）シクロへキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸テトラブチルアンモニウム（３０）
【０２６７】
化合物２９のナトリウムイオンのイオン交換により化合物３０を製造する。テトラアルキルアンモニウム等のような塩へのイオン交換は、ＤＮＡ合成に適した有機溶媒（例えば、アセトニトリル）中の染料の溶解性を改善する。これは、ヒドロキシ染料の精製方法の一部としての、又は個別のイオン交換工程としてのクロマトグラフィーを用いて実施することができる。市販のカチオン性イオン交換樹脂は広く入手することができる。
《実施例３６》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（４−（（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノオキシ）ブトキシ）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸テトラブチルアンモニウムの製造
【化５４】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（４−（（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノオキシ）ブトキシ）フェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸テトラブチルアンモニウム（３１）
【０２６８】
米国特許第６，０２７，７０９号に記載の一般的方法を用いる。乾燥塩化メチレン１０ｍＬ中に化合物３０（０．１４０ミリモル）を溶解し、アルゴン下に氷／塩浴中約０℃で３０分間攪拌する。この染料溶液に、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−シアノエチルホスフィン（２．１３ｍＬ、塩化メチレン中０．１５Ｍ）の溶液を添加する。次いで、この冷却溶液にアセトニトリル中テトラゾール（０．１２８ｍＬ、０．５Ｍ）を添加する。２０分後に冷却を取り去り、室温で更に１．５時間反応を続ける。５％炭酸水素ナトリウム水溶液を用いてこの反応混合物を急冷し、水で２回洗浄し、そして硫酸ナトリウムを用いて乾燥させる。溶媒を真空除去する。この粗製生成物を塩化メチレン１．５ｍＬ中に取り、そしてヘキサン中に沈殿させることにより生成物３１を得る。
《実施例３７》
ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートの製造
【化５５】

ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲート（３２）
【０２６９】
米国特許第６，０２７，７０９号明細書に記載の一般的方法を用いる。蛍光染料３２のホスホルアミジットを用いて、ＤＮＡ合成機により製造されたＤＮＡ分子を標識化することができる。標準的なホスホルアミジット化学を介して、保護され支持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５’末端に染料を結合する。２００ナノモルスケールでの典型的な収量は、精製前で５０〜１００ナノモルの範囲であることが予想される。
【０２７０】
標準的な試薬及び製造業者によって教示された方法に従ってＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ ＤＮＡ合成機により、ＤＮＡオリゴヌクレオチドＭ１３ｆｗｄ（−２９）、Ｍ１３ｒｅｖ、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６のそれぞれを合成する。次いで、同じ装置を用い、上記の製造された染料ホスホルアミジットのアセトニトリル中０．１Ｍ溶液を用いた処理によって各オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光標識を結合する。染料ホスホルアミジットの結合には、テトラゾール中の染料を合成カラムへ送達した後に３分間の遅延をはさみ、結合反応のために追加の時間を与える。酸化、開裂、脱保護及びＨＰＬＣによる精製後に、５’−蛍光標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチドが生成される。
【０２７１】
標識化オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製には、５μ粒子、孔径３００Ａを有するＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ社）、１．７ｍＬ／分を用いることができる。溶媒Ａは水性０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中４％アセトニトリルであり、そして溶媒Ｂは水性０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中８０％アセトニトリルである。グラジエントプロフィールは、３５分間にわたる１０〜４５％Ｂ、１５分間にわたる４５〜１００％Ｂ，１０分間での１００〜１０％Ｂである。当業者であれば、種々の染料の精製に対し必要に応じてこれらの条件を変更し又は交換することができる。
【０２７２】
標識化オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲート３２は、例えば、ＤＮＡ塩基配列決定のサンガー法におけるプライマーとして、遺伝子型決定のテールドプライマーとして、又はハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。
《実施例３８》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（２−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化５６】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（２−（４−カルボキシブチル）フェニル）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（３３）
【０２７３】
出発材料として２−５−（２−ボロノフェニル）ペンタン酸を用いる以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物３３を製造する。
《実施例３９》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（２−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化５７】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（３−スルホナトプロピル）インドリン−２−イリデン）−３−（２−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンチル）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−３，３−ジメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（３４）
【０２７４】
出発材料として化合物３３を用いる以外は、化合物９（実施例９）と同様にして化合物《実施例４０》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化５８】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（３５）
【０２７５】
出発材料として４−（３−ボロノ−５−フルオロフェノキシ）ブタン酸を用いる以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物３５を製造する。
《実施例４０Ｂ》
２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−（３−カルボキシメトキシ−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウムの製造
【化５９】

２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−カルボキシメトキシ−５−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジメチル−６，８−ジスルホナト−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６，８−ジスルホン酸ナトリウム（３６）
【０２７６】
出発材料として２−（３−ボロノ−５−フルオロフェノキシ）酢酸を用いた以外は、化合物８（実施例８）と同様にして化合物３６を製造した。
《実施例４１》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−２，６−ジフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化６０】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−２，６−ジフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（３７）
【０２７７】
出発材料として４−（３−ボロノ−２，４−ジフルオロフェノキシ）ブタン酸を用いる以外は、化合物１７と同様にして化合物３７を製造する。
《実施例４２》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化６１】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（３−カルボキシプロポキシ）−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム（３８）
【０２７８】
出発材料として４−（３−ボロノ−２，４，６−トリフルオロフェノキシ）ブタン酸を用いた以外は、化合物１７（実施例１７）と同様にして化合物３８を製造した。
《実施例４２Ｂ》
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（４−カルボキシブチル）−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウムの製造
【化６２】

２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（４−カルボキシブチル）−２，４，６−トリフルオロフェニル）−３−（（Ｅ）−２−（３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキス−１−エニル）ビニル）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸ナトリウム （３９）
【０２７９】
出発材料として５−（３−ボロノ−２，４，６−トリフルオロフェノキシ）ペンタン酸を用いる以外は、化合物１７（実施例１７）と同様にして化合物３９を製造する。
《実施例４３》
３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸ナトリウムの製造
【化６３】

３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸ナトリウム（４０）
【０２８０】
出発材料として３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−ブロモ−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸ナトリウム及び３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニルボロン酸を用いる以外は、化合物１６及び２９と同様にして化合物４０を製造する。
《実施例４４》
３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸テトラブチルアンモニウムの製造
【化６４】

３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）−３−（３−（４−ヒドロキシブトキシ）フェニル）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸テトラブチルアンモニウム（４１）
【０２８１】
化合物３０と同様にして化合物４１を製造する。
《実施例４５》
３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−（（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノオキシ）ブトキシ）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸テトラブチルアンモニウムの製造
【化６５】

３−（２−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｅ）−３−（３−（４−（（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノオキシ）ブトキシ）フェニル）−５−（１，１−ジメチル−３−（３−スルホナトプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−３−イル）プロパン−１−スルホン酸テトラブチルアンモニウム（４２）
【０２８２】
化合物３１と同様にして化合物４２を製造する。
《実施例４６》
ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートＩＩの製造
【化６６】

ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートＩＩ（４３）
【０２８３】
化合物３２と同様にして化合物４３を製造する。
《実施例４７》
ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートＩＩＩの製造
【化６７】

ホスホルアミド結合基を用いたオリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートＩＩＩ（４４）
【０２８４】
化合物１２、１３、及び２９〜３２と同様にして化合物４４及びその前駆体を製造する。
《実施例４８》
染料の明るさ：化合物８
【０２８５】
化合物８のベースライン蛍光を測定した。
【０２８６】
ＬＩ−ＣＯＲで製造した染料標識化したヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）コンジュゲートを用いて生理学的緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬの固定化抗体濃度で蛍光測定を行った（図３Ａ〜Ｂ及び図４）。染料標識化したラクトアルブミンコンジュゲートも試験した（図５）。
【０２８７】
化合物８の吸収最大は水溶液中で６７６ｎｍ及びメタノール中で６９３ｎｍである。化合物８は、７００ｎｍチャネルにおいてＡｅｒｉｕｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｅｒ及びＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ上で用いるのに最適化された高い水溶性の染料である。
《実施例４９》
染料の明るさの比較：化合物８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ＬＴ
【０２８８】
化合物８と商業的に入手可能な染料Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０との比較を行った。
【０２８９】
ＬＩ−ＣＯＲで製造した染料標識化したヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）コンジュゲートを用いて生理学的緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬの固定化抗体濃度で蛍光測定を行った。各染料の最適励起波長でＰＴＩ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて蛍光を測定した（図６及び図７）。各コンジュゲートの蛍光強度は最初に標識化した増加程度につれて、最大値に達するまで増加した。その後の追加の染料はコンジュゲートの蛍光を増加させなかった。
【０２９０】
各コンジュゲートの蛍光強度は最初に標識化した増加程度につれて、最大値に達するまで増加した。その後、追加の染料はコンジュゲートの蛍光を増加させなかった。各染料について標識化程度対蛍光のプロット（図８）は、概して、同じＤ／Ｐ値において化合物８とのＧＡＲコンジュゲートはＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒとのＧＡＲコンジュゲートより強く蛍光を発したことを示している。更に、コンジュゲートに添加された追加の化合物８蛍光体は、試験した全範囲にわたり蛍光を増加させ続けた（Ｄ／Ｐ６．４まで）。対照的に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０コンジュゲートは急速に横ばいとなり、約３を超える増加Ｄ／Ｐに対して有益性はなかった。このようにＤ／Ｐが増加するにつれてコンジュゲートの蛍光が横ばいとなるのは周知の現象であり、染料の自己消光によるものと考えられる。化合物８コンジュゲートは少なくともＤ／Ｐ６．４まで蛍光強度を増加させ続けるので、化合物８コンジュゲートはこの自己消光に対してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０より耐性である。全体として、化合物８コンジュゲートは、対応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０コンジュゲートより有意に明るい。
《実施例５０》
光安定性の比較：化合物８、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０２９１】
化合物８の光安定性を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０及びＩＲＤｙｅ７００ＤＸの光安定性と比較した。ＩＲＤｙｅ７００ＤＸは、公知の最も光安定性の７００ｎｍ蛍光染料の１つである。ニトロセルロース膜上に等モル量の染料標識化したコンジュゲート（すなわち、適当な染料を用いて標識化されたヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）二次抗体）をスポットすることにより試験試料を調製した。次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ上でこの膜を繰り返し走査したので、レーザー源への染料の長時間曝露によってある程度の光分解が引き起こされた。各染料の信号強度を、その染料の最初の走査における信号に対して正規化させた（図９Ａ〜Ｂ）。
【０２９２】
７００ＤＸ試料の相対的蛍光は１００回の走査後で本質的に変化しなかった。化合物８試料の蛍光は追加の走査と共にわずかに減少したが、この減少はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０試料の減少より有意に少なかった。このことは、化合物８が光分解に対して良好な耐性を有していることを示す。
《実施例５１》
ＧＡＲ細胞染色の比較：化合物８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０２９３】
蛍光測定のために化合物８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０で標識化したＧＡＲ二次抗体を（他のＧＡＲ機能性試験について前記したように）細胞染色に用いた（図１０Ａ〜Ｂ）。
【０２９４】
培養したＳＫ−ＢＲ−３（Ａ）又はＳＫ−ＯＶ０３（Ｂ）を３．７％ホルムアルデヒドで固定化し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。細胞をウサギ坑ＨＥＲ２ｍＡｂ（ＣＳＴ）とインキュベートし、引き続いて化合物８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０で標識化したヤギ及びウサギ二次抗体とインキュベートした。このプレートをＯｄｙｓｓｅｙイメージャー上で走査した。原画像を左側に示し、そして定量化した信号強度を右側に示す（図１０Ａ〜Ｂ）。
【０２９５】
化合物８コンジュゲートの明るさ及び光安定性は、顕微鏡及びＩｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎｓ（商標）に対してそれらを選択することを申し分ないものとする。更に、比較に適したＤ／Ｐ比における全蛍光強度又は「明るさ」は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０の場合より化合物８の場合の方が大きかった。信号強度は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０コンジュゲートと比較して化合物８標識化二次抗体で染色した細胞では２〜３倍高かった。後のＩｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎのデータは、染料標識化コンジュゲートについての蛍光測定データと似ていた。
《実施例５２》
蛍光免疫染色の比較：化合物８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０２９６】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞膜上で染料標識化抗体を用いてＨＥＲ２タンパク質を染色した。化合物８で標識化したＧＡＲ二次抗体を蛍光測定に用いた。
【０２９７】
カバーガラス上で細胞を培養した。実施例５０に従った固定化及び透過処理の後、細胞をウサギ抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ（ＣＳＴ）と、それに続いて化合物８で標識化したＧＡＲ二次抗体（Ｄ／Ｐ＝３．３）とをインキュベートした。サイトックスグリーン（Sytox green）を用いて核を染色した。オリンパス顕微鏡上に画像を得、そして付随のソフトウェアを用いてデコンボルブ（deconvolve）した（図１１Ａ〜Ｃ）。
《実施例５３》
β−アクチンウエスタンブロットの比較：化合物８、ＩＲＤｙｅ６８０、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０２９８】
ウエスタンブロットによって、商業的に入手可能なＩＲＤｙｅ６８０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体コンジュゲートと化合物８コンジュゲートとを比較した。全ての抗体コンジュゲートは実験のために０．１μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２９９】
ウエスタンブロットを行ってＣ３２溶解物中のアクチンを検出した。Ｃ３２全細胞溶解物（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）１０μｇから出発した２倍希釈液を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元性ゲル（reducing gel）上にロードしそしてニトロセルロース膜（Ｏｄｙｓｓｅｙ社）に移した。β−アクチンに対するマウス一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中０．２％Ｔｗｅｅｎ２０の緩衝液中の１：１０００希釈で用いた。同様にして、種々のヤギ抗マウス二次抗体を希釈した。全ての抗体を周囲温度で１時間インキュベーションした。ウエスタンブロットの結果を図１２Ａ〜Ｃに示す。ウエスタンブロットは全て２連で実施した。
【０３００】
ＩＲＤｙｅ６８０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０二次抗体の両方との比較により、化合物８抗体の信号強度、バックグランド及び実行希釈の評価を行った。細胞溶解物の濃度を約５０００ｎｇ／レーンまで増加させたとき、信号強度は直線的であった（図１３）。化合物８の直線的動作範囲はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０の場合より広かった。全体として、化合物８ＧＡＭを用いて検出された信号は、ＩＲＤｙｅ６８０ＧＡＭより３倍及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ＧＡＭより１．５倍大きかった。化合物８ＧＡＭを用いて処理された膜におけるバックグランドは、他の７００チャネル蛍光体を用いた処理のものと同等であった。ウエスタンブロットの目視検査は、３つのＧＡＭコンジュゲート抗体間で同様の検出限界であることを示した。また、０．０４μｇ／ｍＬに希釈した化合物８ＧＡＭは、同じ希釈率でのＩＲＤｙｅ６８０ＧＡＭと比較した信号からみて優れた性能を維持している。
《実施例５４》
ｐ３８ウエスタンブロットの比較：化合物８、ＩＲＤｙｅ６８０、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０３０１】
ウエスタンブロットを行って、ジャーカット溶解物中の低発現タンパク質ｐ３８を検出した。市販され入手可能なＩＲＤｙｅ６８０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体コンジュゲートと化合物８コンジュゲートとを比較した。実施例５３に記載のように、染料標識化抗体を希釈した。
【０３０２】
ジャーカット細胞溶解物１０μｇから出発した２倍希釈液を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元性ゲル上にロードしそしてニトロセルロース膜（Ｏｄｙｓｓｅｙ社）に移した。ｐ３８に対するウサギ一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中０．２％Ｔｗｅｅｎ２０の緩衝液中１：１０００希釈で用いた。同様にして、種々のヤギ抗ウサギ二次抗体を希釈した。全ての抗体を周囲温度で１時間インキュベーションした。ウエスタンブロットの結果を図１４Ａ〜Ｃに示す。ウエスタンブロットは全て２連で実施した。
【０３０３】
化合物８ＧＡＲコンジュゲートは、信号強度においてＩＲＤｙｅ６８０より２倍〜４倍改善された性能を有していた。この標的に関して、目視の検出限界も同じだけ改善された（それぞれ、コンジュゲート濃度０．１μｇ／ｍＬ及び０．０４μ／ｍＬ）。ＩＲＤｙｅ６８０ＧＡＲの信号は、同じ濃度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ＧＡＲより１．７倍までの明るさがあり、そして検出限界はｐ３８標的に対して１回の２倍希釈以内であった。全てのウエスタンブロットにおいて追加のバンドが見られ、このことは一次抗体が追加のタンパク質を検出していることを示す。
《実施例５５》
Ａｋｔ２色ウエスタンブロット：化合物８、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０
【０３０４】
低豊富タンパク質Ａｋｔを検出するための平衡化（balanced）２色ウエスタンブロットを、化合物８ＧＡＭ及びＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ＧＡＲ抗体を用いて実施した。実施例５３に記載のように、染料標識化した抗体を希釈した。
【０３０５】
ＮＩＨ３Ｔ３溶解物（１０μｇから出発して２倍希釈）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離しそしてニトロセルロースに移した。膜をＬＩ−ＣＯＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いてブロックした。一次抗体は、Ａｋｔ（マウスｍＡｂ）及びアクチン（ウサギｍＡｂ）に対するものであり、１：１０００希釈した。アクチンを検出するための二次抗体はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ＧＡＲ（１：１０，０００）であった。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ上で（Ａ）ＩＲＤｙｅ６８０ ＧＡＭ（０．１μｇ／ｍＬ）；（Ｂ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ ＧＡＭ（０．１μｇ／ｍＬ）；（Ｃ）化合物８ＧＡＭ（０．１μｇ／ｍＬ）を用いてＡｋｔを検出した。
【０３０６】
再度、化合物８コンジュゲートはＩＲＤｙｅ６８０と比べてより明るかった（図１５Ａ及び図１５Ｃ）。化合物８ＧＡＭは、同等の目視上の検出限界を有してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ ＧＡＭより低いバックグランドを示した（図１５Ｂ〜Ｃ）。
《実施例５６》
化合物８を用いたＡｋｔウエスタンブロット
【０３０７】
Ａ４３１溶解物中のＡｋｔを検出するために化合物８ＧＡＭを用いて追加のウエスタンブロット実験（図１６Ａ〜Ｂ）を行った。実施例５３に記載のように、染料標識化した抗体を希釈した。
【０３０８】
Ａ４３１溶解物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離し、Ｏｄｙｓｓｅｙニトロセルロースに移しそしてＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中でブロックした。実験Ａとして、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に希釈（１：１０００）したＡｋｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて膜を１時間インキュベートし、洗浄した後、化合物８ＧＡＭ（０．１μｇ／ｍＬ）と１時間インキュベートした。０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中でそれを希釈した。実験の図１６Ｂとして、Ａに記載のようにして二次抗体中でのみ膜をインキュベートした。説明書の通りに（as directed）、全ての膜を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒにより画像化した。
【０３０９】
図１６Ａは、広範囲のタンパク質濃度にわたるコンジュゲートの直線性を示している（５０μｇ〜２０ｎｇ；Ｒ^２は０．９９８２であり溶解物３０μｇ〜２０ｎｇ）。
【０３１０】
化合物８二次抗体は、種々の溶解物（ジャーカット、ＨｅＬａ、Ｃ３２，Ａ４３１及びＮＩＨ３Ｔ３）中のタンパク質への低い非特異的結合を有することが示された。一次抗体を用いないでウエスタンブロットを実施した場合の、この低い結合の例を図１６Ｂに示す。タンパク質５０μｇの存在下でさえ、化合物８ＧＡＭ抗体から信号はほとんど検出されない。
【０３１１】
上記の記述は説明することを意図するものであり限定することを意図するものでないことを理解されたい。上記の記述を読めば当業者には多くの実施態様が明白であろう。従って、本発明の範囲は、上記の記述に捉われずに決定されるべきであり、その代わりに特許請求の範囲の記載と等価の全範囲に従って、特許請求の範囲に関して決定されるべきである。特許出願、特許、及びＰＣＴ公報を含む、本願に記載した論文及び文献の開示内容は、あらゆる目的で参考までに本願明細書に引用する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】

［式中、Ｑは：
【化２】

からなる群から選択されるポリメチン架橋の一部であり；
Ｑは、ポリメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分であり；
Ｒ^１はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されているアルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アミドアルキル基、アルキルチオアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、若しくはスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している環炭素原子と一緒になって、スピロシクロアルキル環若しくは環外アルケンを形成し、前記スピロシクロアルキル環はＲ^１４０個〜６個によって更に置換されており、前記環外アルケンはＲ^１４０個〜２個によって置換されており；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^４及びＲ^５、並びにＲ^５及びＲ^６からなる群から選択される構成員の対は、前記構成員の対が結合している原子の対と一緒になってアリール環を形成し、前記アリール環はそれぞれＲ^１４０個〜２個によって更に置換されており；
Ｒ^７は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択される構成員であるか；又は、代わりに、両方のＲ^７は、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、環を形成し、前記環はシクロアルキル環及びヘテロシクリル環からなる群から選択され、そして前記環はＲ^１４０個〜３個によって更に置換されており；
Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、スルホナト基、及び−Ｌ−Ｙ−Ｚからなる群から独立して選択される構成員であり；Ｒ^８及びＲ^９からなる群から選択される正確に１つの構成員は−Ｌ−Ｙ−Ｚであり；
Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員であり；
Ｒ^１３はそれぞれ、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アミド基、スルホナト基、及びチオアセチル基からなる群から独立して選択される構成員であり；
Ｒ^１４はそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びアルコキシアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であり；前記Ｒ^１４アルキル基又はアルケニル基はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されており；
Ｌは、単結合、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン基、及びＣ_１〜Ｃ_１０アルケニレン基からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；前記アルキレン基又はアルケニレン基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｙは、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＲ^１５−、−ＮＲ^１５Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１５−、−ＮＺ−、−ＮＺＣ（Ｏ）−、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＺ−からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^１６からなる群からの構成員１つによって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｒ^１５は、アルキル基及びアルコキシカルボニルアルキル基からなる群から選択される構成員であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｒ^１６はそれぞれ独立して、活性化アシル基、ホルミル基、グリシジル基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ヒドラジジル基、イソチオシアナト基、ヨードアセトアミジル基、マレイミジル基、メルカプト基、ホスホルアミジチル基、及びビニルスルホニル基からなる群から選択される構成員である］
で表される化合物であって、バランスの取れた電荷を有する前記化合物。
【請求項２】
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６がそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｑが
【化３】

である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、メチル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そしてｒが１〜２０の整数である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ｒが、２、３、又は４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そして、ｔが１〜１０の整数である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
式：
【化４】

を有する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｑが、式：
【化５】

であり；そして、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６がそれぞれ、水素原子及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
式：
【化６】

を有する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｑが、式：
【化７】

である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、メチル基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
ｒが２、３、又は４である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
両方のＲ^７が、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、５員環及び６員環からなる群から選択される環を形成し、前記環がＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そしてｔが１〜１０の整数である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
式Ｉａ：
【化８】

を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｑが、式：
【化９】

である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、メチル基である、請求項２１又は２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項２１又は２２に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
ｒが２、３、又は４である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そして、ｔが１〜１０の整数である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
式：
【化１０】

を有する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
式：
【化１１】

を有する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｑが、式：
【化１２】

であり；そして、Ｒ^１４がそれぞれ水素原子及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
式：
【化１３】

を有する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
式：
【化１４】

を有する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｑが、式：
【化１５】

である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、メチル基である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
ｒが２、３、又は４である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３９】
両方のＲ^７が、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、５員環及び６員環からなる群から選択される環を形成し、前記環がＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４０】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そして、ｔが１〜１０の整数である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４２】
約５５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４３】
約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４４】
約６００ｎｍ〜約７２５ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４５】
約７２５ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４６】
式ＩＩ：
【化１６】

［式中、Ｑ^Ｌは、
【化１７】

からなる群から選択されるポリメチン架橋の一部であり；
Ｑ^Ｌは、ポリメチン炭素原子５個又は７個のポリメチン架橋の中央部分であり；
Ｒ^１は、Ｒ^１３０個又は１個によって更に置換されているアルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂはそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アミドアルキル基、アルキルチオアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、若しくはスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが結合している環炭素原子と一緒になって、スピロシクロアルキル環若しくは環外アルケンを形成し、前記スピロシクロアルキル環はＲ^１４０個〜６個によって更に置換されており、前記環外アルケンはＲ^１４０個〜２個によって置換されており；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アミノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であるか；又は、代わりに、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^４及びＲ^５、並びにＲ^５及びＲ^６からなる群から選択される構成員の対は、前記構成員の対が結合している原子の対と一緒になってアリール環を形成し、前記アリール環はそれぞれＲ^１４０個〜２個によって更に置換されており；
Ｒ^７は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択される構成員であるか；又は、代わりに、両方のＲ^７は、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、環を形成し、前記環はシクロアルキル環及びヘテロシクリル環からなる群から選択され、そして前記環はＲ^１４０個〜３個によって更に置換されており；
Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、スルホナト基、及び−Ｌ−Ｙ−Ｚからなる群から独立して選択される構成員であり；Ｒ^８及びＲ^９からなる群から選択される正確に１つの構成員は−Ｌ−Ｙ−Ｚであり；
Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員であり；
Ｒ^１３はそれぞれ、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アミド基、スルホナト基、及びチオアセチル基からなる群から独立して選択される構成員であり；
Ｒ^１４はそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びアルコキシアルキル基からなる群から独立して選択される構成員であり；前記Ｒ^１４アルキル基又はアルケニル基はＲ^１３０個〜１個によって更に置換されており；
Ｌは、単結合、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン基、及びＣ_１〜Ｃ_１０アルケニレン基からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；前記アルキレン基又はアルケニレン基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｙは、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＲ^１５−、−ＮＲ^１５Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１５−、−ＮＺ−、−ＮＺＣ（Ｏ）−、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＺ−からなる群から選択される、場合により存在する構成員であり；
Ｚはそれぞれ、Ｒ^１３及びＲ^Ｌからなる群からの構成員１つによって更に置換されている独立して選択されたＣ_１〜Ｃ_１０アルキル基であり；前記アルキル基は場合によりヘテロ原子少なくとも１個によって中断されていることがあり；
Ｒ^１５は、アルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルチオアルキル基、及びアルコキシカルボニルアルキル基からなる群から選択される構成員であり；
Ｒ^Ｌはそれぞれ、結合基及びそれによって結合された生体分子を含み、ここで、化合物はＲ^Ｌ少なくとも１個を含むものとする］
で表されるバイオコンジュゲート化合物であって、バランスの取れた電荷を有する前記化合物。
【請求項４７】
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６がそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基、スルホナト基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、及びスルホナトアルキル基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｑ^Ｌが、式：
【化１８】

である、請求項４６又は４７に記載の化合物。
【請求項４９】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、両方ともメチル基である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５２】
ｒが２、３、又は４である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５３】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そして、ｔが１〜１０の整数である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５５】
Ｑ^Ｌが、式：
【化１９】

であり；そして
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６がそれぞれ、水素原子及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｑ^Ｌが下記式：
【化２０】

である、請求項４６又は４７に記載の化合物。
【請求項５７】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが両方ともメチル基である、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５８】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５９】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６０】
ｒが２、３、又は４である、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６１】
両方のＲ^７が、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、５員環及び６員環からなる群から選択される環を形成し、前記環がＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６２】
−Ｌ−Ｙ−が（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚがカルボキシル基又は活性化アシル基であり；そしてｔが１〜１０の整数である、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６３】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６４】
式Ｉａ：
【化２１】

を有する、請求項４６に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｑ^Ｌが、式：
【化２２】

である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、両方ともメチル基である、請求項６４又は６５に記載の化合物。
【請求項６７】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項６４又は６５に記載の化合物。
【請求項６８】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６９】
ｒが２、３、又は４である、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７０】
−Ｌ−Ｙ−が、（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚが、カルボキシル基又は活性化アシル基であり；そして、ｔが１〜１０の整数である、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７１】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７２】
Ｑ^Ｌが、式：
【化２３】

であり；そして、Ｒ^１４がそれぞれ水素原子及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７３】
Ｑ^Ｌが、式：
【化２４】

である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項７４】
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂが、両方ともメチル基である、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７５】
Ｒ^９が、−Ｌ−Ｙ−Ｚである、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７６】
Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３Ｈ又は（ＣＨ_２）_ｒＳＯ_３⁻であり；そして、ｒが１〜２０の整数である、請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７７】
ｒが２、３、又は４である、請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７８】
両方のＲ^７が、両方のＲ^７が結合しているポリエンの介在セグメントと一緒になって、５員環及び６員環からなる群から選択される環を形成し、前記環がＲ^１４０個〜３個によって更に置換されている、請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７９】
−Ｌ−Ｙ−が（ＣＨ_２）_ｔであり；Ｚがカルボキシル基又は活性化アシル基であり；そしてｔが１〜１０の整数である、請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８０】
Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、及びスルホナト基からなる群から独立して選択される構成員である、請求項６４〜７９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８１】
約５５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項４６〜８０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８２】
約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項４６〜８１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８３】
約６００ｎｍ〜約７２５ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項４６〜８２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８４】
約７２５ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲内の波長で蛍光を発する、請求項４６〜８２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８５】
前記生体分子が、グルコサミン、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項４６〜８０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８６】
前記生体分子が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース、及びラセミ体２−デオキシグルコースからなる群から選択される、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
前記生体分子が、ソマトスタチン、エンドスタチン、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチドポリホスフェート、オリゴ糖、アプタマー、リポソーム、ＰＥＧ、アンギオポエチン、アンギオスタチン、アンギオテンシンＩＩ、α_２−抗プラスミン、アネキシンＶ、β−シクロデキストリンテトラデカスルフェート、エンドグリン、エンドシアリン、エンドスタチン、上皮成長因子、フィブリン、フィブリノペプチドβ、線維芽細胞成長因子、ＦＧＦ−３、塩基性フィブロネクチン、フマギリン、ヘパリン、肝細胞増殖因子、ヒアルロナン、非インシュリン様成長因子、インターフェロン−α，β阻害剤、ＩＬ阻害剤、ラミニン、白血病抑制因子、リノミド、メタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗体、抗体断片、非環式ＲＧＤペプチド、環式ＲＧＤペプチド、胎盤増殖因子、胎盤プロフェリン関連タンパク質、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、血小板活性化因子アンタゴニスト、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、プレイオトロピン、プロリフェリン、プロリフェリン関連タンパク質、セレクチン、ＳＰＡＲＣ、ヘビ毒、サブスタンスＰ、スラミン、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤、サリドマイド、トロンビン、トロンビンレセプター活性化テトラデカペプチド、形質転換成長因子−α，β、形質転換成長因子レセプター、腫瘍増殖因子−α、腫瘍壊死因子、ビトロネクチン、及びカルセインからなる群から選択される、請求項４６〜８６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８８】
生体分子を標識化する方法であって、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の化合物を生体分子と反応させることを含む前記方法。
【請求項８９】
前記生体分子が、アシクロターミネータートリホスフェート、抗体、抗原、アビジン、炭水化物、デオキシ核酸、酵素補因子、酵素基質、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ハプテン、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチドポリホスフェート、オリゴ糖、ペプチド、ＰＮＡ、多糖、タンパク質、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項８８に記載の生体分子を標識化する方法。
【請求項９０】
生体分子を標識化する方法であって：
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の化合物を生体分子と反応させることを含み；
前記生体分子が、ソマトスタチン、エンドスタチン、炭水化物、オリゴ糖、アプタマー、リポソーム、ＰＥＧ、アンギオポエチン、アンギオスタチン、アンギオテンシンＩＩ、α_２−抗プラスミン、アネキシンＶ、β−シクロデキストリンテトラデカスルフェート、エンドグリン、エンドシアリン、エンドスタチン、上皮成長因子、フィブリン、フィブリノペプチドβ、線維芽細胞成長因子、ＦＧＦ−３、塩基性フィブロネクチン、フマギリン、ヘパリン、肝細胞増殖因子、ヒアルロナン、非インシュリン様成長因子、インターフェロン−α，β阻害剤、ＩＬ阻害剤、ラミニン、白血病抑制因子、リノミド、メタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗体、抗体断片、非環式ＲＧＤペプチド、環式ＲＧＤペプチド、胎盤増殖因子、胎盤プロフェリン関連タンパク質、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、血小板活性化因子アンタゴニスト、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、プレイオトロピン、プロリフェリン、プロリフェリン関連タンパク質、セレクチン、ＳＰＡＲＣ、ヘビ毒、サブスタンスＰ、スラミン、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤、サリドマイド、トロンビン、トロンビンレセプター活性化テトラデカペプチド、形質転換成長因子−α，β、形質転換成長因子レセプター、腫瘍増殖因子−α、腫瘍壊死因子、ビトロネクチン、及びカルセインからなる群から選択される、前記方法。
【請求項９１】
前記生体分子が、グルコサミン、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記生体分子が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース、及びラセミ体２−デオキシグルコースからなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
請求項１〜８７のいずれか一項に記載の化合物を、組織又は生物に投与することを含むイメージング方法。

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１３】

【図１】

【図２】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【公表番号】特表２０１２−５２４１５３（Ｐ２０１２−５２４１５３Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５９７３（Ｐ２０１２−５０５９７３）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１４３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１１６３
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１１２４８２８３）ライコア　インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＬＩ−ＣＯＲ，　Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】