イカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物
本発明は、イカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物に関し、より具体的には、イカリイン加水分解物であるイカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIを含有する化粧料に関し、上記イカリイン加水分解物は、（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階と、（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階とを含む方法によって製造されることができる。本発明による化粧料用組成物は、抗酸化、抗老化、美白またはしわ改善用に適用されることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イカリイン（icariin）加水分解物を含有する化粧料用組成物に関し、より具体的には、イカリイン加水分解物であるイカリチン（icaritin）、イカリシドＩ（icariside I）及びイカリシドII（icariside II）を含有する化粧料に関し、上記イカリイン加水分解物は、（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階と、（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階とを含む方法によって製造することができる。
【背景技術】
【０００２】
エピメディウム（Epimedium）属植物類は、メギ科に属し、中国薬典には、Ｅ．ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｕｍ、Ｅ．ｓａｇｉｔｔａｔｕｍ及びＥ．ｋｏｒｅａｎｕｍの３種が記録されている。エピメディウム属植物の成分は、フラボノイド（flavonoid）、アルカロイド（alkaloid）及びリグナン（lignan）などが主成分として報告されている。特に、三枝九葉草（Epimedium koreanum Nakai）の地上部を乾かした生薬は、淫羊かくであって、漢方及び民間で強精、全身不随や健忘症の治療剤及び神経性強壮剤の目的に使われている。
【０００３】
体内酵素系、還元代謝、化学薬品、公害物質及び光化学反応などの各種物理的、化学的及び環境的要因などによって生成される活性酸素は、細胞構成成分である脂質、タンパク質、糖及びＤＮＡなどに対して非選択的、非可逆的な破壊作用をすることで、細胞老化または癌を含めた各種疾病を起こすものと知られている。また、これらの活性酸素による脂質過酸化の結果として生成される脂質過酸化物を含めたさまざまな体内過酸化物も細胞に対する酸化的破壊を起こして各種機能障害を引き起こすことで、さまざまな疾病の原因になる。
【０００４】
したがって、このような自由ラジカルを消去することができる化合物（free radical scavengers）または過酸化物生成抑制物質のような抗酸化剤がこれらの酸化物に起因する老化及び各種疾患の抑制または治療剤として期待される。
【０００５】
天然抗酸化剤を開発するために多くの天然物由来の原料が研究されて来たが、大部分の天然物由来の原料は、単純抽出物の形態で使われて来ており、その抽出物の示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされず、経験と口伝によって化粧料などに使われていることが現況である。
【０００６】
一方、皮膚の老化は、その要因によって大きく２つに分けることができる。それらのうち１つである自然的な老化（Intrinsic aging）は、皮膚の構造と生理的な機能が年を取りながら継続的な減退を起こすものであり、他の１つである外的老化（Extrinsic aging）は、太陽光線など累積された外部ストレスによって発生するものである。特に太陽光の紫外線（ultraviolet rays；ＵＶ）は、よく知られた老化原因の１つであって、長期間紫外線に露出された皮膚は、角質層が厚くなり、皮膚の主要構成要素であるコラーゲンとエラスチンが変成され、皮膚の弾力性を失って行くようになる。このようなコラーゲンとエラスチンは、さまざまな要因によって調節され、コラゲナーゼ（collagenase）とエラスターゼ（elastase）のような基質メタロプロテアーゼ（matrix metallo protease）の発現によって生成されたコラーゲンとエラスチンが分解され、結果として、皮膚内のコラーゲン含量が減少する現象が現われるようになる。
【０００７】
このような弾力減少の原因になるコラーゲン及びエラスチンの減少を抑制しようとする目的でさまざまな物質が開発されて使用されているが、それらのうちレチノールとレチノイン酸などのレチノイドなどが弾力改善効果を示し（Dermatologytherapy, 1998, 16, 357〜364）、レグミノサ種子（Leguminosae Seeds）から得られたタンパク質分画も弾力増大効果を示すのに応用されている（米国特許第５，３２２，８３９号）。
【０００８】
しかし、これらのレチノイドは、少量だけを皮膚に適用しても、刺激が現われるという短所を有し、大部分の天然物由来の原料は、単純抽出物の形態で使用されてきており、その抽出物の示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされていないので、その抽出物の活性を持続的に維持、制御しにくいことが現況である。
【０００９】
一方、人間の皮膚色を決定するには、さまざまな要因が関与するが、それらのうちメラニン色素を作るメラノサイト（melanocyte）の活動性、血管の分布、皮膚の厚さ及びカロチノイドやビリルビンなどの人体内外の色素含有有無などの要因が重要である。
【００１０】
これらのうち、特に最も重要な要因は、人体内のメラノサイトでチロシナーゼなどのいろいろな酵素が作用して生成されるメラニンという黒色色素である。このメラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレスなどと関連した生理的要因及び紫外線の照射などのような環境的要因などが影響を及ぼす。
【００１１】
身体皮膚のメラニン細胞で生成されるメラニン色素は、黒い色素とタンパク質の複合体形態を有するフェノール系高分子物質であって、太陽から照射される紫外線を遮断し、真皮以下の皮膚器官を保護すると共に、皮膚生体内に生じた自由ラジカルなどを抑制するなど皮膚内タンパク質と遺伝子を保護する有用な役目を担当する。
【００１２】
このように皮膚内・外部のストレス的刺激によって生じたメラニンは、ストレスが消えても、皮膚角質化を通じて外部に排出される前までは消えない安定した物質である。しかし、メラニンが必要以上に多く生ずる場合、染みやそばかす、斑点などのような過色素沈着症を誘発し、美容上、良くない結果をもたらすようになる。
【００１３】
また、レジャー人口の増加に伴って、外部で活動することを楽しむ人々が多くなり、紫外線によるメラニン色素沈着を抑制しようとする要求が増えるようになった。
【００１４】
このような要求に応じて、従来、アスコルビン酸、コージ酸、アルブチン、ハイドロキノン、グルタチオンまたはこれらの誘導体、またはチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して使用してきたが、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性問題、化粧料に配合時に現われる剤型安定性の問題などによってその使用が制限されている。
【特許文献１】米国特許第５，３２２，８３９号
【非特許文献１】Dermatologytherapy, 1998, 16, 357〜364
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これより、本発明者らは、上記問題点を解決し、さらに優れた抗酸化剤、抗老化剤、美白剤原料を探し出すための研究の一環として、様々な天然物を検索した結果、エピメディウム属植物抽出物のフラボノイド成分であるイカリインが優れた効能を示すことを知見し、ひいては、イカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解して生成されたイカリイン加水分解物が抗酸化、抗老化及び美白剤として効果がさらに優れていることを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の目的は、イカリイン加水分解物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、エピメディウム属植物由来のイカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用した分解反応を通じて上記化粧料組成物に有効成分として含有されるイカリイン加水分解物を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明は、下記化学式１で表されるイカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物を提供する：
【化１】
上記で、Ｒ１は、ＯＨまたはラムノピラノースであり、Ｒ２は、ＯＨまたはグルコピラノースである。但し、Ｒ１とＲ２は、同時にラムノピラノースとグルコピラノースではない。
【００１９】
本発明において、上記組成物は、抗酸化用、抗老化用、美白用またはしわ改善用化粧料組成物であることができる。
【００２０】
本発明による化粧料組成物に含有されるイカリイン加水分解物は、（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階と、（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階とを含む方法によって製造することができる。
【００２１】
上記（ａ）段階の植物抽出物は、エピメディウム属から由来されたものであり、上記有機溶媒は、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１つ以上の有機溶媒、またはこれら有機溶媒と水との混合溶媒を使用することができ、好ましくは、８０％エタノールを使用することができる。
【００２２】
また、上記（ｂ）段階で使用する酸は、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選択された１つ以上の酸、またはこれら酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。この時、使用することができる酸の濃度は、０．１〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は、１０〜５０％であり、反応温度は、５０〜１００℃であり、反応時間は、０．５〜８時間である。
【００２３】
上記（ｂ）段階で使用する塩基は、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１つ以上の塩基、またはこれら塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。この時、使用することができる塩基の濃度は、０．１〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は、１０〜５０％であり、反応温度は、５０〜１００℃であり、反応時間は、０．５〜２４時間である。
【００２４】
上記（ｂ）段階で使用する酵素または上記酵素を生産する微生物は、糖結合を分解する酵素または上記糖結合を分解する酵素を生産する微生物を使用することができ、上記酵素は、イカリインから糖部分を除去し、イカリイン加水分解物を分離する。
【００２５】
上記酵素として、グルコシダーゼ（glucosidase）、アラビノシダーゼ（arabinosidase）、ラムノシダーゼ（rhamnosidase）、キシロシダーゼ（Xylosidase）、セルラーゼ（cellulase）、ヘスペリジナーゼ（hesperidinase）、ナリギナーゼ（naringinase）、グルクロニダーゼ（glucuronidase）、ペクチナーゼ（pectinase）、ガラクトシダーゼ（galactosidase）及びアミログルコシダーゼ（amyloglucosidase）よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。
【００２６】
また、上記酵素を生産する微生物は、アスペルギルス（aspergillus）属、バチルス（bacillus）属、ペニシリウム（penicillium）属、リゾプス（rhizopus）属、リゾムコール（rhizomucor）属、タラロマイセス（talaromyces）属、ビフィドバクテリウム（bifidobacterium）属、モルティエレラ（mortierella）属、クリプトコッカス（cryptococcus）属及びミクロバクテリウム（microbacterium）属よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。
【００２７】
本発明によるイカリイン及びイカリイン加水分解物であるイカリチン、イカリシドＩ及びIIは、下記の構造式を有する：
【化２】
【００２８】
以下、本発明においてイカリイン加水分解物を製造する過程をさらに詳しく説明する。
【００２９】
上記（ａ）段階で、植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する方法は、次の通りである。すなわち、植物に約１乃至６倍、好ましくは、約３倍の水またはエタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１つ以上の有機溶媒、またはこれら有機溶媒と水との混合溶媒を入れ、常温で１乃至５回撹拌しながら抽出して脱脂させた後、脱脂された植物に約１乃至８倍、好ましくは約４倍の水または有機溶媒を入れ、１乃至５回還流抽出した後、１０乃至２０℃で１乃至３日間沈積させる。
【００３０】
上記沈積物を濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテルなどを利用して色素を除去した後、水層をブタノールなどを使用して１乃至５回抽出した後、収得した有機溶媒層を減圧濃縮してブタノールなどの抽出物を得て、これを少量のメタノールなどに溶解した後、大量のエチルアセテートなどを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、イカリインを収得することができる。
【００３１】
上記（ｂ）段階で、上記収得されたイカリインを酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解し、イカリイン加水分解物を製造する。
【００３２】
この際、酸を利用する場合、植物抽出物に０．１〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の酸、または酸及びアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％エタノール混合溶媒）を加えた後、５０乃至１００℃、好ましくは、８０℃水浴で１乃至４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解し、反応液を収得することができる。
【００３３】
塩基を利用する場合、植物抽出物を溶解した後、０．１〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の塩基、または塩基及びアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％ブタノール混合溶媒）を加えて、５０乃至１００℃、好ましくは、１００℃水浴で１乃至４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解し、反応液を収得することができる。
【００３４】
酵素を利用する場合、植物抽出物を５乃至２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を添加して約３７℃水浴で約４０乃至５５時間、好ましくは、約４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば、熱水（８０〜１００℃）中で５乃至１５分間加熱して加水分解反応を終了させ、反応液を収得することができる。
【００３５】
上記酵素を生産する微生物を利用する場合、植物抽出物を５乃至１０倍、好ましくは約１０倍のイオン水に溶解させた後、約１２１℃で３０分間滅菌して約３０℃に冷却した後、あらかじめ培養された微生物を液体量に対して５〜１０％に接種し、３０℃で２乃至５日、好ましくは５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば、加水分解反応を終了させ、培養液を５，０００乃至１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸溜水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を収得することができる。
【００３６】
上記のように、酸、塩基、酵素、または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解した後、収得した反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１乃至５回撹拌させた後、沈澱された塩を濾過を通じて除去し、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリイン加水分解物を収得することができる。
【００３７】
本発明によって製造されたイカリイン加水分解物は、ＤＰＰＨ及びＲＯＳ生成を抑制させることによって、抗酸化効能に優れており、また、コラーゲン生合成を促進させ、コラゲナーゼ発現を抑制させることによって、抗老化効能に優れており、更には、メラニン生成を抑制させ、紫外線によって生成された色素沈着を改善させることによって、美白効能に優れている。
【００３８】
したがって、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する抗酸化用化粧料組成物を提供することができる。
【００３９】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する抗老化用化粧料組成物を提供することができる。
【００４０】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物を提供する。
【００４１】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する皮膚しわ改善用外用剤組成物を提供することができる。
【００４２】
上記化粧料用組成物は、化粧料組成物または薬学組成物に剤型化されることができ、組成物内で上記イカリイン加水分解物の含量は、組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量％の量で含有させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであって、これらの実施例によって本発明の権利範囲が限定されるのではない。
【００４４】
［実施例１］イカリインの製造及び同定
＜イカリインの製造＞
三枝九葉草の乾燥した葉２ｋｇにヘキサン６Ｌを入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶葉１ｋｇに８０％メタノール４Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。次に、濾過布濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。得られたすべての１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得て、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加し、生成された沈殿物を乾燥することによって、イカリインを含有する三枝九葉草抽出物８０ｇを収得した。
【００４５】
＜イカリインの同定＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリイン２．３ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ， Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００４６】
＜イカリインの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性（Positive）ＦＡＢ−ＭＳ：６７７［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，Ｒｈａｍ−６），１．６１ ＆ １．６９（６Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｍｅ−１１），ｃａ ３．１−３．３（ｍ），３．３３（１Ｈ，ｂｒ ｄ−ｌｉｋｅ，ｃａ ５），ｃａ ３．４−３．６（ｍ），ｃａ ３．７−３．７６（１Ｈ，ｍ），３．８６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−４'），４．０１（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ２''），５．００（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ１'''），５．１９（１Ｈ，ｂｒ ｔ，７，Ｈ１０），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ１''），６．６４（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１２（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），７．８９（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'），１２．５３（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−５）．
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１５３．０，１３５．７，１７８．３，１６０．５，９８．２，１６１．４，１０８．４，１５７．３，１０５．６，１２２．２，１３０．５，１１４．１，１６０．５，１１４．１，１３０．５，２１．１，１２２．３，１３１．１，２５．４，１７．５，１０２．０，７０．４，７０．６，６９．７，７０．１，１７．９，１００．６，７３．４，７６．７，７１．２，７６．７，６０．７，５５．５
酸加水分解物：イカリチン、グルコース、ラムノ−ス
【００４７】
［実施例２］イカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造及び同定
＜酸加水分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ ＨＣｌ−５０％メタノール溶液（ｖ／ｖ）を加え、８０℃水浴で８時間加熱還流させて、イカリインに結合された糖を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈澱した塩を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した後、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．９ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．５ｇをそれぞれ収得した。
【００４８】
＜塩基加水分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを乾燥ピリジン（５００ｍＬ）に溶解し、これにナトリウムメトキシド（sodium methoxide）（powder、１０ｇ）を加え、水浴で８時間加熱還流させて、イカリインに結合された糖を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈澱した塩を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．６ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．８ｇをそれぞれ収得した。
【００４９】
＜酵素分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを１００ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解させ、これに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；Ｓｉｇｍａ社製造）を添加し、３７℃水浴上で４８時間撹拌させながら、薄層クロマトグラフィーで周期的に確認し、イカリインが完全に消失したところで、熱水（８０〜１００℃）中で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈殿物を濾過を通じてとり除いた後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得した粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン１．１ｇ、イカリシドＩ １．２ｇ及びイカリシドII ０．９ｇをそれぞれ収得した。
【００５０】
＜微生物を利用したイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養されたアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）ＫＣＣＭ １１８８５を液体量に対して５〜１０％に接種して３０℃で５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーでイカリインの消去率を確認し、完全に消失したところで、反応を終了させた。培養液を５，０００乃至１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸溜水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を得た。上記沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈殿物を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、上記収得した粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．８ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．８ｇをそれぞれ収得した。
【００５１】
＜イカリシドＩの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリシドＩ １．８ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５２】
＜イカリシドＩの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：５３１［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７０，１．８３（ｅａ．３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−４''，５''），２．９０（２Ｈ，Ｈ１''），３．８７（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．８３−５．４０（ｍ，ｓｕｇａｒ ｐｒｏｔｏｎｓ），６．６４（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１６（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），８．２３（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'）
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１４６．９，１３６．２，１７６．５，１６０．１，９７．５，１６０．６，１０８．１１５２．７，１０４．５，１２３．４，１２９．３，１１４．１，１５８．５，１１４．１，１２９．３，２１．５，１２２．３，１３１．１，２５．４，１７．９，１００．５，７３．４，７６．７，６９．７，７７．２，６０．７，５５．４
酸加水分解物：イカリチン、グルコース
【００５３】
＜イカリシドIIの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリシドII １．５ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５４】
＜イカリシドIIの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：５１５［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７９（３Ｈ，ｄ，６，Ｍｅ−５''），１．６３ ＆ １．６８（６Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｍｅ−１１），３．０３（１Ｈ，ｑｄ，６，９．５，Ｈ５''），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，９，９．５，Ｈ４''），ｃａ３．４（２Ｈ−９，ｏｖｅｒｌａｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ Ｈ２Ｏ），３．４７（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ３''），３．８５（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−４'），３．９８（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ２''），５．１５（１Ｈ，ｂｒ ｔ，７，Ｈ１０），５．２６（１Ｈ，ｄ，１．５，Ｈ１''），６．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１２（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），７．８６（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'），１２．５２（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−５）
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１５６．２，１３３．８，１７７．１，１０３．６，１５８．１，９７．８，１６０．９，１０５．４，１５３．８，２１．０，１２１．７，１３０．３，１７．６，２５．２，１２１．８，１２９．７，１１３．５，１６０．５，５５．２，１０１．４，６９．７，７０．０，７０．２，７０．８，１７．３
酸加水分解物：イカリチン、ラムノ−ス
【００５５】
＜イカリチンの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリチン２．４ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５６】
＜イカリチンの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：３６９［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ：３．８２（３Ｈ，ｓ， ＯＭｅ），１．６２（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−５''），１．７５（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−４''），５．１４（１Ｈ，ｔ，６，Ｈ２''），３．２４（２Ｈ，ｄ，６，Ｈ１''），７．０８（２Ｈ，ｄ，８．７，Ｈ３'，５'），８．１０（２Ｈ，ｄ，８．７，Ｈ２'，６'），６．２７（１Ｈ，ｓ，Ｈ６）
【００５７】
［試験例１］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの抗酸化効果試験（ＤＰＰＨ ｔｅｓｔ）
有機ラジカルであるＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）の還元によって（抗酸化剤は酸化される）発生する吸光度の変化を通じて抗酸化能を評価する方法を使用した。下記例によってＤＰＰＨの酸化が抑制され、吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定し、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度を有効抗酸化濃度として評価した。
【００５８】
１００μＭ（ｉｎ エタノール）ＤＰＰＨ溶液１９０μＬと上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンと対照試料をそれぞれ１０μＬ入れて反応液を作り、３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。対照試料としては、広く使用している合成抗酸化剤トロロックス（Trolox）を使用した。
各物質のＤＰＰＨ分析結果を下記表１に示した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１から明らかなように、本発明によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良い活性を示し、トロロックスよりも抗酸化効能に優れていることが分かった。
【００６１】
［試験例２］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの蛍光物質を利用した活性酸素種（reactive oxygen species；ＲＯＳ）生成抑制能試験
試験に使用した細胞株は、人間角質形成細胞ＨａＣａＴ細胞株（Human keratinocytes HaCaT cell line）であって、蛍光測定用９６孔ブラックプレートに各孔当たり２．０×１０4個に分株し、ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Dulbeccos Modification of Eagles Medium、ＦＢＳ１０％）培地を使用して３７℃、５％ＣＯ2条件で１日間培養した後、試験試料を処理した。下記表２に示されている試料処理に使用された培地としてペニシリン／ストレプトマイシンが添加された無血清ＤＭＥＭ（ＦＢＳ free）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件で１日間培養した。
【００６２】
試験試料を入れて２４時間培養した後、ＨＣＳＳ（ＨＥＰＥＳ−bufferedcontrol salt solution）で洗浄して残っている培地を除去し、ＨＣＳＳに２０μＭで用意したＤＣＦＨ−ＤＡ（2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc）を１００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ2条件で２０分間培養し、ＨＣＳＳで洗浄した。その後、試料濃度別に処理されたＨＣＳＳを１００μＬ加えた後、初期にＲＯＳに酸化されたＤＣＦ（dichlorofluorescein）の蛍光度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）で蛍光強度を測定した。その後、ＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ2）を照射し、処理直後及び処理３時間後の蛍光度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）で蛍光強度を測定した。
比較試料としてはトロロックスを使用した。
各試験物質のＲＯＳ生成抑制能実験結果は、下記表２に示した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良い活性を示し、トロロックスよりもＲＯＳ生成抑制能がさらに優れていることが分かる。
【００６５】
［試験例３］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのコラーゲン生合成促進効果の測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのコラーゲン生合成促進効果をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。
【００６６】
まず、人間繊維芽細胞（fibroblast）（PromoCell, Germany）を２４孔（well）に１孔当たり１０5個ずつ播種し（seeding）し、９０％程度成長するまで培養した。これを２４時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養した後、無血清培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧをそれぞれ１０-4モル濃度で処理し、２４時間ＣＯ2培養器で培養した。これらの上澄液を採取し、プロコーラゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキット（proc/;ollagen type（Ｉ））を利用してプロコーラゲン（procollagen）の増減可否を調べた。その結果を表３に示す。ここで、合成能は、無処理群を１００にして対比したものである。
【００６７】
【表３】
【００６８】
その結果、上記表３から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良いコラーゲン生合成増加効果を示し、陽性対照群に比べてさらに良い効能を示すことを確認することができた。
【００６９】
［試験例４］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのコラゲナーゼ発現抑制効能測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンから得た物質のコラゲナーゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のように測定した。
【００７０】
まず、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている９６孔平板培養器（96-well microtiter plate）に人間の纎維雅細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０％程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、試験物質として無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００７１】
その後、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムパマシャ社）を利用してコラゲナーゼ生成程度を測定した。
【００７２】
まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６−孔平板（96-well plate）に配位された細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後、発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００７３】
黄色を呈する９６−孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記数式１によってコラゲナーゼの発現程度を計算した。この時、上記試験物質を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。
［数式１］
コラゲナーゼ発現程度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：上記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００７４】
一方、上記人間の繊維芽細胞で上記試験物質のコラゲナーゼ発現抑制効能を測定した結果をコラゲナーゼ発現程度で下記表４に示す。これは、無処理群のコラゲナーゼ発現程度を１００にして対比したものである。
【００７５】
【表４】
【００７６】
その結果、上記表４から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりコラゲナーゼ発現を効果的に抑制することを確認することができた。
【００７７】
［試験例５］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのエラスターゼ発現抑制効能測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのエラスターゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のように測定した。
【００７８】
まず、試験は、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている９６孔平板培養器に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０％程度成長するまで培養した。その後、無血清培地で２４時間培養し、試験物質として無血清培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００７９】
その後、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なエラスターゼ測定器具（米国アマシャムパマシャ社）を利用してエラスターゼ生成程度を測定した。
【００８０】
まず、１次エラスターゼ抗体が均一に塗布された９６−孔平板に配位された細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後、発色団が結合された２次エラスチン抗体を９６−孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００８１】
黄色を呈する９６−孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記数式２によってエラスターゼの発現程度を計算した。この時、上記試験物質を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。
［数式２］
エラスターゼ発現程度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：上記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００８２】
一方、上記人間の繊維芽細胞で上記試験物質のエラスターゼ発現抑制効能を測定した結果を下記表５に示す。これは、無処理群の発現程度を１００にして対比したものである。
【００８３】
【表５】
【００８４】
その結果、上記表５から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりエラスターゼ発現を効果的に抑制することを確認することができた。
【００８５】
［試験例６］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのメラニン生成抑制効果測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのメラニン生成抑制効果を調べるためにねずみの色素細胞を利用して測定した。
【００８６】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のねずみの色素細胞（Ｍｅｌ−Ａｂ cell）（Dooley, T. P. et al, Skin pharmacol, 7, pp188-200）を、ＤＭＥＭに１０％牛胎盤血清、１００ｎＭ２−Ｏ−テトラデカノイル ホルボール（tetradecanoylphorbol）−１３−アセテート、及び１ｎＭコレラ毒素（cholera toxin）を添加した培地で３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。培養されたＭｅｌ−Ａｂ細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで取り外し、２４−ウェルプレートにて１０5細胞／ウェルの濃度で細胞を培養した。２日目から３日連続して１０ｐｐｍの各試験物質でハイドロキノン、上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンを加えて培養した。この時、上記ハイドロキノンは、陽性対照群として使用した。次に、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、４００ｎｍで吸光度を測定した後、下記数式３によってメラニン生成抑制率を計算し、その結果を表６に示した（Ｄｏｏｌｅｙの方法）。
［数式３］
メラニン生成抑制率（％）＝１００−｛（各試験物質の吸光度／対照群の吸光度）ｘ１００｝
【００８７】
【表６】
【００８８】
上記表６から明らかなように、本発明によって収得した上記実施例２で同定したイカリチン、イカリシドＩ及びIIが、実施例１で同定したイカリインより良いメラニン生成抑制率を示すものと確認され、特にイカリチン、イカリシドＩ及びIIは、ハイドロキノンと類似の程度のメラニン生成抑制率を示すことを確認した。
【００８９】
［試験例７］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの人体皮膚に対する美白効果試験
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンの人体皮膚に対する美白効果を調べるために、下記のような実験を行った。
まず、元気な１２名の男性を対象にして被検者の上膊部位に直径１．５ｃｍの孔が開いた不透明テープを貼り付けた後、各被検者の最小紅斑量（Minimal Erythema Dose）の１．５〜２倍位の紫外線（ＵＶＢ）を照射し、皮膚の黒化を誘導した。
【００９０】
上記紫外線の照射後、上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンの各々１％（溶媒は１，３−ブチレングリコール：エタノール＝７：３）、ハイドロキノン１％、溶媒（vehicle）（陰性対照群）１％だけを塗布し、１ヶ所は何も塗布せず、１０週間状態変化を観察した。１週単位で皮膚の色を色差計ＣＲ２００２（日本国、ミノルタ社）で測定した。
【００９１】
その後、上記各試験物質の塗布開始時点と塗布完了時点での皮膚色の差異（ΔＬ＊）を下記数式４によって計算し、これを下記表７に示した。一方、美白効果は、試料塗布部位と対照群部位のΔＬ＊の比較として判定するが、ΔＬ＊値が２程度の場合は、沈着された色素の美白化が明らかな場合であり、１．５程度以上なら美白効果があると判定することができる。
［数式４］
ΔＬ＊＝塗布完了時点でのＬ＊値−塗布開始時点でのＬ＊値
【００９２】
【表７】
【００９３】
上記表７から明らかなように、本発明によって収得した実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンは、ハイドロキノンと類似の程度の皮膚色の明るさ程度を示すことを確認した。これは、上記物質が紫外線によって生成された色素沈着を改善し、皮膚色を明るくするからである。
【００９４】
以下、上記組成物の剤型化を製剤例を通じて説明するが、これは、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００９５】
［製剤例１］せっけん製造
【００９６】
【表８】
【００９７】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比によってせっけんを製造した。
【００９８】
［製剤例２］ローション製造
【００９９】
【表９】
【０１００】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）によってローションを製造した。
【０１０１】
［製剤例３］クリーム製造
【０１０２】
【表１０】
【０１０３】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）でクリームを製造した。
【０１０４】
［製剤例４］パック製造
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）でパックを製造した。
【０１０７】
［製剤例５］美容液製造
【０１０８】
【表１２】
【０１０９】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）で美容液を製造した。
【０１１０】
［製剤例６］散剤の製造
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
上記の成分を混合し、気密布に充填し、散剤を製造した。
【０１１３】
［製剤例７］錠剤の製造
【０１１４】
【表１４】
【０１１５】
上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠し、錠剤を製造した。
【０１１６】
［製剤例８］カプセル剤の製造
【０１１７】
【表１５】
【０１１８】
通常のカプセル剤の製造方法によって上記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【０１１９】
［製剤例９］注射剤の製造
【０１２０】
【表１６】
【０１２１】
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍＬ）上記の成分含量で製造した。
【０１２２】
［製剤例１０］液剤の製造
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、上記の成分を混合した後、精製水を加えて全体１００ｍＬに調節した後、茶色の瓶に充填し滅菌させて、液剤を製造した。
【０１２５】
[発明の効果]
以上説明したように、本発明では、エピメディウム属植物抽出物のフラボノイド成分であるイカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解して生成されたイカリイン加水分解物を含有する化粧料組成物がＤＰＰＨ及びＲＯＳ生成抑制効能を有する抗酸化効果とともに、コラーゲン生合成促進効果、エラスターゼ及びコラゲナーゼの発現抑制効果による抗老化効果、メラニン生成を抑制し、紫外線（ultraviolet rays；ＵＶ）によって生成された色素沈着を改善する効果による美白効果を示すことができることを確認した。したがって、本発明によるイカリイン加水分解物は、抗酸化、抗老化、美白、しわ改善用化粧料組成物または薬学組成物として非常に有用に使用されることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イカリイン（icariin）加水分解物を含有する化粧料用組成物に関し、より具体的には、イカリイン加水分解物であるイカリチン（icaritin）、イカリシドＩ（icariside I）及びイカリシドII（icariside II）を含有する化粧料に関し、上記イカリイン加水分解物は、（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階と、（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階とを含む方法によって製造することができる。
【背景技術】
【０００２】
エピメディウム（Epimedium）属植物類は、メギ科に属し、中国薬典には、Ｅ．ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｕｍ、Ｅ．ｓａｇｉｔｔａｔｕｍ及びＥ．ｋｏｒｅａｎｕｍの３種が記録されている。エピメディウム属植物の成分は、フラボノイド（flavonoid）、アルカロイド（alkaloid）及びリグナン（lignan）などが主成分として報告されている。特に、三枝九葉草（Epimedium koreanum Nakai）の地上部を乾かした生薬は、淫羊かくであって、漢方及び民間で強精、全身不随や健忘症の治療剤及び神経性強壮剤の目的に使われている。
【０００３】
体内酵素系、還元代謝、化学薬品、公害物質及び光化学反応などの各種物理的、化学的及び環境的要因などによって生成される活性酸素は、細胞構成成分である脂質、タンパク質、糖及びＤＮＡなどに対して非選択的、非可逆的な破壊作用をすることで、細胞老化または癌を含めた各種疾病を起こすものと知られている。また、これらの活性酸素による脂質過酸化の結果として生成される脂質過酸化物を含めたさまざまな体内過酸化物も細胞に対する酸化的破壊を起こして各種機能障害を引き起こすことで、さまざまな疾病の原因になる。
【０００４】
したがって、このような自由ラジカルを消去することができる化合物（free radical scavengers）または過酸化物生成抑制物質のような抗酸化剤がこれらの酸化物に起因する老化及び各種疾患の抑制または治療剤として期待される。
【０００５】
天然抗酸化剤を開発するために多くの天然物由来の原料が研究されて来たが、大部分の天然物由来の原料は、単純抽出物の形態で使われて来ており、その抽出物の示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされず、経験と口伝によって化粧料などに使われていることが現況である。
【０００６】
一方、皮膚の老化は、その要因によって大きく２つに分けることができる。それらのうち１つである自然的な老化（Intrinsic aging）は、皮膚の構造と生理的な機能が年を取りながら継続的な減退を起こすものであり、他の１つである外的老化（Extrinsic aging）は、太陽光線など累積された外部ストレスによって発生するものである。特に太陽光の紫外線（ultraviolet rays；ＵＶ）は、よく知られた老化原因の１つであって、長期間紫外線に露出された皮膚は、角質層が厚くなり、皮膚の主要構成要素であるコラーゲンとエラスチンが変成され、皮膚の弾力性を失って行くようになる。このようなコラーゲンとエラスチンは、さまざまな要因によって調節され、コラゲナーゼ（collagenase）とエラスターゼ（elastase）のような基質メタロプロテアーゼ（matrix metallo protease）の発現によって生成されたコラーゲンとエラスチンが分解され、結果として、皮膚内のコラーゲン含量が減少する現象が現われるようになる。
【０００７】
このような弾力減少の原因になるコラーゲン及びエラスチンの減少を抑制しようとする目的でさまざまな物質が開発されて使用されているが、それらのうちレチノールとレチノイン酸などのレチノイドなどが弾力改善効果を示し（Dermatologytherapy, 1998, 16, 357〜364）、レグミノサ種子（Leguminosae Seeds）から得られたタンパク質分画も弾力増大効果を示すのに応用されている（米国特許第５，３２２，８３９号）。
【０００８】
しかし、これらのレチノイドは、少量だけを皮膚に適用しても、刺激が現われるという短所を有し、大部分の天然物由来の原料は、単純抽出物の形態で使用されてきており、その抽出物の示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされていないので、その抽出物の活性を持続的に維持、制御しにくいことが現況である。
【０００９】
一方、人間の皮膚色を決定するには、さまざまな要因が関与するが、それらのうちメラニン色素を作るメラノサイト（melanocyte）の活動性、血管の分布、皮膚の厚さ及びカロチノイドやビリルビンなどの人体内外の色素含有有無などの要因が重要である。
【００１０】
これらのうち、特に最も重要な要因は、人体内のメラノサイトでチロシナーゼなどのいろいろな酵素が作用して生成されるメラニンという黒色色素である。このメラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレスなどと関連した生理的要因及び紫外線の照射などのような環境的要因などが影響を及ぼす。
【００１１】
身体皮膚のメラニン細胞で生成されるメラニン色素は、黒い色素とタンパク質の複合体形態を有するフェノール系高分子物質であって、太陽から照射される紫外線を遮断し、真皮以下の皮膚器官を保護すると共に、皮膚生体内に生じた自由ラジカルなどを抑制するなど皮膚内タンパク質と遺伝子を保護する有用な役目を担当する。
【００１２】
このように皮膚内・外部のストレス的刺激によって生じたメラニンは、ストレスが消えても、皮膚角質化を通じて外部に排出される前までは消えない安定した物質である。しかし、メラニンが必要以上に多く生ずる場合、染みやそばかす、斑点などのような過色素沈着症を誘発し、美容上、良くない結果をもたらすようになる。
【００１３】
また、レジャー人口の増加に伴って、外部で活動することを楽しむ人々が多くなり、紫外線によるメラニン色素沈着を抑制しようとする要求が増えるようになった。
【００１４】
このような要求に応じて、従来、アスコルビン酸、コージ酸、アルブチン、ハイドロキノン、グルタチオンまたはこれらの誘導体、またはチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して使用してきたが、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性問題、化粧料に配合時に現われる剤型安定性の問題などによってその使用が制限されている。
【特許文献１】米国特許第５，３２２，８３９号
【非特許文献１】Dermatologytherapy, 1998, 16, 357〜364
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これより、本発明者らは、上記問題点を解決し、さらに優れた抗酸化剤、抗老化剤、美白剤原料を探し出すための研究の一環として、様々な天然物を検索した結果、エピメディウム属植物抽出物のフラボノイド成分であるイカリインが優れた効能を示すことを知見し、ひいては、イカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解して生成されたイカリイン加水分解物が抗酸化、抗老化及び美白剤として効果がさらに優れていることを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の目的は、イカリイン加水分解物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、エピメディウム属植物由来のイカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用した分解反応を通じて上記化粧料組成物に有効成分として含有されるイカリイン加水分解物を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明は、下記化学式１で表されるイカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物を提供する：
【化１】
上記で、Ｒ１は、ＯＨまたはラムノピラノースであり、Ｒ２は、ＯＨまたはグルコピラノースである。但し、Ｒ１とＲ２は、同時にラムノピラノースとグルコピラノースではない。
【００１９】
本発明において、上記組成物は、抗酸化用、抗老化用、美白用またはしわ改善用化粧料組成物であることができる。
【００２０】
本発明による化粧料組成物に含有されるイカリイン加水分解物は、（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階と、（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階とを含む方法によって製造することができる。
【００２１】
上記（ａ）段階の植物抽出物は、エピメディウム属から由来されたものであり、上記有機溶媒は、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１つ以上の有機溶媒、またはこれら有機溶媒と水との混合溶媒を使用することができ、好ましくは、８０％エタノールを使用することができる。
【００２２】
また、上記（ｂ）段階で使用する酸は、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選択された１つ以上の酸、またはこれら酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。この時、使用することができる酸の濃度は、０．１〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は、１０〜５０％であり、反応温度は、５０〜１００℃であり、反応時間は、０．５〜８時間である。
【００２３】
上記（ｂ）段階で使用する塩基は、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１つ以上の塩基、またはこれら塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。この時、使用することができる塩基の濃度は、０．１〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は、１０〜５０％であり、反応温度は、５０〜１００℃であり、反応時間は、０．５〜２４時間である。
【００２４】
上記（ｂ）段階で使用する酵素または上記酵素を生産する微生物は、糖結合を分解する酵素または上記糖結合を分解する酵素を生産する微生物を使用することができ、上記酵素は、イカリインから糖部分を除去し、イカリイン加水分解物を分離する。
【００２５】
上記酵素として、グルコシダーゼ（glucosidase）、アラビノシダーゼ（arabinosidase）、ラムノシダーゼ（rhamnosidase）、キシロシダーゼ（Xylosidase）、セルラーゼ（cellulase）、ヘスペリジナーゼ（hesperidinase）、ナリギナーゼ（naringinase）、グルクロニダーゼ（glucuronidase）、ペクチナーゼ（pectinase）、ガラクトシダーゼ（galactosidase）及びアミログルコシダーゼ（amyloglucosidase）よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。
【００２６】
また、上記酵素を生産する微生物は、アスペルギルス（aspergillus）属、バチルス（bacillus）属、ペニシリウム（penicillium）属、リゾプス（rhizopus）属、リゾムコール（rhizomucor）属、タラロマイセス（talaromyces）属、ビフィドバクテリウム（bifidobacterium）属、モルティエレラ（mortierella）属、クリプトコッカス（cryptococcus）属及びミクロバクテリウム（microbacterium）属よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。
【００２７】
本発明によるイカリイン及びイカリイン加水分解物であるイカリチン、イカリシドＩ及びIIは、下記の構造式を有する：
【化２】
【００２８】
以下、本発明においてイカリイン加水分解物を製造する過程をさらに詳しく説明する。
【００２９】
上記（ａ）段階で、植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する方法は、次の通りである。すなわち、植物に約１乃至６倍、好ましくは、約３倍の水またはエタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１つ以上の有機溶媒、またはこれら有機溶媒と水との混合溶媒を入れ、常温で１乃至５回撹拌しながら抽出して脱脂させた後、脱脂された植物に約１乃至８倍、好ましくは約４倍の水または有機溶媒を入れ、１乃至５回還流抽出した後、１０乃至２０℃で１乃至３日間沈積させる。
【００３０】
上記沈積物を濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテルなどを利用して色素を除去した後、水層をブタノールなどを使用して１乃至５回抽出した後、収得した有機溶媒層を減圧濃縮してブタノールなどの抽出物を得て、これを少量のメタノールなどに溶解した後、大量のエチルアセテートなどを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、イカリインを収得することができる。
【００３１】
上記（ｂ）段階で、上記収得されたイカリインを酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解し、イカリイン加水分解物を製造する。
【００３２】
この際、酸を利用する場合、植物抽出物に０．１〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の酸、または酸及びアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％エタノール混合溶媒）を加えた後、５０乃至１００℃、好ましくは、８０℃水浴で１乃至４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解し、反応液を収得することができる。
【００３３】
塩基を利用する場合、植物抽出物を溶解した後、０．１〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の塩基、または塩基及びアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％ブタノール混合溶媒）を加えて、５０乃至１００℃、好ましくは、１００℃水浴で１乃至４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解し、反応液を収得することができる。
【００３４】
酵素を利用する場合、植物抽出物を５乃至２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を添加して約３７℃水浴で約４０乃至５５時間、好ましくは、約４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば、熱水（８０〜１００℃）中で５乃至１５分間加熱して加水分解反応を終了させ、反応液を収得することができる。
【００３５】
上記酵素を生産する微生物を利用する場合、植物抽出物を５乃至１０倍、好ましくは約１０倍のイオン水に溶解させた後、約１２１℃で３０分間滅菌して約３０℃に冷却した後、あらかじめ培養された微生物を液体量に対して５〜１０％に接種し、３０℃で２乃至５日、好ましくは５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば、加水分解反応を終了させ、培養液を５，０００乃至１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸溜水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を収得することができる。
【００３６】
上記のように、酸、塩基、酵素、または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解した後、収得した反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１乃至５回撹拌させた後、沈澱された塩を濾過を通じて除去し、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリイン加水分解物を収得することができる。
【００３７】
本発明によって製造されたイカリイン加水分解物は、ＤＰＰＨ及びＲＯＳ生成を抑制させることによって、抗酸化効能に優れており、また、コラーゲン生合成を促進させ、コラゲナーゼ発現を抑制させることによって、抗老化効能に優れており、更には、メラニン生成を抑制させ、紫外線によって生成された色素沈着を改善させることによって、美白効能に優れている。
【００３８】
したがって、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する抗酸化用化粧料組成物を提供することができる。
【００３９】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する抗老化用化粧料組成物を提供することができる。
【００４０】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物を提供する。
【００４１】
また、本発明では、上記イカリイン加水分解物を有効成分として含有する皮膚しわ改善用外用剤組成物を提供することができる。
【００４２】
上記化粧料用組成物は、化粧料組成物または薬学組成物に剤型化されることができ、組成物内で上記イカリイン加水分解物の含量は、組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量％の量で含有させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであって、これらの実施例によって本発明の権利範囲が限定されるのではない。
【００４４】
［実施例１］イカリインの製造及び同定
＜イカリインの製造＞
三枝九葉草の乾燥した葉２ｋｇにヘキサン６Ｌを入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶葉１ｋｇに８０％メタノール４Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。次に、濾過布濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。得られたすべての１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得て、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加し、生成された沈殿物を乾燥することによって、イカリインを含有する三枝九葉草抽出物８０ｇを収得した。
【００４５】
＜イカリインの同定＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリイン２．３ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ， Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００４６】
＜イカリインの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性（Positive）ＦＡＢ−ＭＳ：６７７［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，Ｒｈａｍ−６），１．６１ ＆ １．６９（６Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｍｅ−１１），ｃａ ３．１−３．３（ｍ），３．３３（１Ｈ，ｂｒ ｄ−ｌｉｋｅ，ｃａ ５），ｃａ ３．４−３．６（ｍ），ｃａ ３．７−３．７６（１Ｈ，ｍ），３．８６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−４'），４．０１（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ２''），５．００（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ１'''），５．１９（１Ｈ，ｂｒ ｔ，７，Ｈ１０），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ１''），６．６４（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１２（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），７．８９（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'），１２．５３（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−５）．
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１５３．０，１３５．７，１７８．３，１６０．５，９８．２，１６１．４，１０８．４，１５７．３，１０５．６，１２２．２，１３０．５，１１４．１，１６０．５，１１４．１，１３０．５，２１．１，１２２．３，１３１．１，２５．４，１７．５，１０２．０，７０．４，７０．６，６９．７，７０．１，１７．９，１００．６，７３．４，７６．７，７１．２，７６．７，６０．７，５５．５
酸加水分解物：イカリチン、グルコース、ラムノ−ス
【００４７】
［実施例２］イカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造及び同定
＜酸加水分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ ＨＣｌ−５０％メタノール溶液（ｖ／ｖ）を加え、８０℃水浴で８時間加熱還流させて、イカリインに結合された糖を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈澱した塩を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した後、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．９ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．５ｇをそれぞれ収得した。
【００４８】
＜塩基加水分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを乾燥ピリジン（５００ｍＬ）に溶解し、これにナトリウムメトキシド（sodium methoxide）（powder、１０ｇ）を加え、水浴で８時間加熱還流させて、イカリインに結合された糖を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈澱した塩を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．６ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．８ｇをそれぞれ収得した。
【００４９】
＜酵素分解方法によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを１００ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解させ、これに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；Ｓｉｇｍａ社製造）を添加し、３７℃水浴上で４８時間撹拌させながら、薄層クロマトグラフィーで周期的に確認し、イカリインが完全に消失したところで、熱水（８０〜１００℃）中で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈殿物を濾過を通じてとり除いた後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。収得した粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン１．１ｇ、イカリシドＩ １．２ｇ及びイカリシドII ０．９ｇをそれぞれ収得した。
【００５０】
＜微生物を利用したイカリチン、イカリシドＩ及びIIの製造＞
上記実施例１で収得した抽出物２０ｇを１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養されたアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）ＫＣＣＭ １１８８５を液体量に対して５〜１０％に接種して３０℃で５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーでイカリインの消去率を確認し、完全に消失したところで、反応を終了させた。培養液を５，０００乃至１０，０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸溜水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を得た。上記沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌させた後（３回）、沈殿物を濾過を通じて除去した。濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、上記収得した粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、イカリチン０．８ｇ、イカリシドＩ ０．７ｇ及びイカリシドII ０．８ｇをそれぞれ収得した。
【００５１】
＜イカリシドＩの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリシドＩ １．８ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５２】
＜イカリシドＩの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：５３１［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７０，１．８３（ｅａ．３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−４''，５''），２．９０（２Ｈ，Ｈ１''），３．８７（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．８３−５．４０（ｍ，ｓｕｇａｒ ｐｒｏｔｏｎｓ），６．６４（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１６（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），８．２３（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'）
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１４６．９，１３６．２，１７６．５，１６０．１，９７．５，１６０．６，１０８．１１５２．７，１０４．５，１２３．４，１２９．３，１１４．１，１５８．５，１１４．１，１２９．３，２１．５，１２２．３，１３１．１，２５．４，１７．９，１００．５，７３．４，７６．７，６９．７，７７．２，６０．７，５５．４
酸加水分解物：イカリチン、グルコース
【００５３】
＜イカリシドIIの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリシドII １．５ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５４】
＜イカリシドIIの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：５１５［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７９（３Ｈ，ｄ，６，Ｍｅ−５''），１．６３ ＆ １．６８（６Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｍｅ−１１），３．０３（１Ｈ，ｑｄ，６，９．５，Ｈ５''），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，９，９．５，Ｈ４''），ｃａ３．４（２Ｈ−９，ｏｖｅｒｌａｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ Ｈ２Ｏ），３．４７（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ３''），３．８５（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−４'），３．９８（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ２''），５．１５（１Ｈ，ｂｒ ｔ，７，Ｈ１０），５．２６（１Ｈ，ｄ，１．５，Ｈ１''），６．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），７．１２（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ３'，５'），７．８６（２Ｈ，ｄ，９，Ｈ２'，６'），１２．５２（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−５）
13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１５６．２，１３３．８，１７７．１，１０３．６，１５８．１，９７．８，１６０．９，１０５．４，１５３．８，２１．０，１２１．７，１３０．３，１７．６，２５．２，１２１．８，１２９．７，１１３．５，１６０．５，５５．２，１０１．４，６９．７，７０．０，７０．２，７０．８，１７．３
酸加水分解物：イカリチン、ラムノ−ス
【００５５】
＜イカリチンの同定＞
上記酵素分解法で収得した抽出物２０ｇをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ充填）で精製した。この時、展開溶媒としては、クロロホルムとメタノールを使用し、クロロホルムとメタノールの比を１０：１から２：１まで濃度勾配を高めて分画を収得し、これらの分画からイカリチン２．４ｇを収得した。上記収得した生成物を同定した結果（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２０００ ３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ社）、下記のような特性を示した。
【００５６】
＜イカリチンの物理化学的性状＞
性状：淡い微黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：３６９［Ｍ＋Ｈ］
1Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ：３．８２（３Ｈ，ｓ， ＯＭｅ），１．６２（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−５''），１．７５（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−４''），５．１４（１Ｈ，ｔ，６，Ｈ２''），３．２４（２Ｈ，ｄ，６，Ｈ１''），７．０８（２Ｈ，ｄ，８．７，Ｈ３'，５'），８．１０（２Ｈ，ｄ，８．７，Ｈ２'，６'），６．２７（１Ｈ，ｓ，Ｈ６）
【００５７】
［試験例１］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの抗酸化効果試験（ＤＰＰＨ ｔｅｓｔ）
有機ラジカルであるＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）の還元によって（抗酸化剤は酸化される）発生する吸光度の変化を通じて抗酸化能を評価する方法を使用した。下記例によってＤＰＰＨの酸化が抑制され、吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定し、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度を有効抗酸化濃度として評価した。
【００５８】
１００μＭ（ｉｎ エタノール）ＤＰＰＨ溶液１９０μＬと上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンと対照試料をそれぞれ１０μＬ入れて反応液を作り、３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。対照試料としては、広く使用している合成抗酸化剤トロロックス（Trolox）を使用した。
各物質のＤＰＰＨ分析結果を下記表１に示した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１から明らかなように、本発明によるイカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良い活性を示し、トロロックスよりも抗酸化効能に優れていることが分かった。
【００６１】
［試験例２］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの蛍光物質を利用した活性酸素種（reactive oxygen species；ＲＯＳ）生成抑制能試験
試験に使用した細胞株は、人間角質形成細胞ＨａＣａＴ細胞株（Human keratinocytes HaCaT cell line）であって、蛍光測定用９６孔ブラックプレートに各孔当たり２．０×１０4個に分株し、ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Dulbeccos Modification of Eagles Medium、ＦＢＳ１０％）培地を使用して３７℃、５％ＣＯ2条件で１日間培養した後、試験試料を処理した。下記表２に示されている試料処理に使用された培地としてペニシリン／ストレプトマイシンが添加された無血清ＤＭＥＭ（ＦＢＳ free）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件で１日間培養した。
【００６２】
試験試料を入れて２４時間培養した後、ＨＣＳＳ（ＨＥＰＥＳ−bufferedcontrol salt solution）で洗浄して残っている培地を除去し、ＨＣＳＳに２０μＭで用意したＤＣＦＨ−ＤＡ（2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc）を１００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ2条件で２０分間培養し、ＨＣＳＳで洗浄した。その後、試料濃度別に処理されたＨＣＳＳを１００μＬ加えた後、初期にＲＯＳに酸化されたＤＣＦ（dichlorofluorescein）の蛍光度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）で蛍光強度を測定した。その後、ＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ2）を照射し、処理直後及び処理３時間後の蛍光度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）で蛍光強度を測定した。
比較試料としてはトロロックスを使用した。
各試験物質のＲＯＳ生成抑制能実験結果は、下記表２に示した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良い活性を示し、トロロックスよりもＲＯＳ生成抑制能がさらに優れていることが分かる。
【００６５】
［試験例３］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのコラーゲン生合成促進効果の測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのコラーゲン生合成促進効果をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。
【００６６】
まず、人間繊維芽細胞（fibroblast）（PromoCell, Germany）を２４孔（well）に１孔当たり１０5個ずつ播種し（seeding）し、９０％程度成長するまで培養した。これを２４時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養した後、無血清培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧをそれぞれ１０-4モル濃度で処理し、２４時間ＣＯ2培養器で培養した。これらの上澄液を採取し、プロコーラゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキット（proc/;ollagen type（Ｉ））を利用してプロコーラゲン（procollagen）の増減可否を調べた。その結果を表３に示す。ここで、合成能は、無処理群を１００にして対比したものである。
【００６７】
【表３】
【００６８】
その結果、上記表３から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりさらに良いコラーゲン生合成増加効果を示し、陽性対照群に比べてさらに良い効能を示すことを確認することができた。
【００６９】
［試験例４］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのコラゲナーゼ発現抑制効能測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンから得た物質のコラゲナーゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のように測定した。
【００７０】
まず、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている９６孔平板培養器（96-well microtiter plate）に人間の纎維雅細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０％程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、試験物質として無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００７１】
その後、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムパマシャ社）を利用してコラゲナーゼ生成程度を測定した。
【００７２】
まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６−孔平板（96-well plate）に配位された細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後、発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００７３】
黄色を呈する９６−孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記数式１によってコラゲナーゼの発現程度を計算した。この時、上記試験物質を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。
［数式１］
コラゲナーゼ発現程度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：上記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００７４】
一方、上記人間の繊維芽細胞で上記試験物質のコラゲナーゼ発現抑制効能を測定した結果をコラゲナーゼ発現程度で下記表４に示す。これは、無処理群のコラゲナーゼ発現程度を１００にして対比したものである。
【００７５】
【表４】
【００７６】
その結果、上記表４から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりコラゲナーゼ発現を効果的に抑制することを確認することができた。
【００７７】
［試験例５］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのエラスターゼ発現抑制効能測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのエラスターゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のように測定した。
【００７８】
まず、試験は、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている９６孔平板培養器に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０％程度成長するまで培養した。その後、無血清培地で２４時間培養し、試験物質として無血清培地に溶解された上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチン、並びにトコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００７９】
その後、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なエラスターゼ測定器具（米国アマシャムパマシャ社）を利用してエラスターゼ生成程度を測定した。
【００８０】
まず、１次エラスターゼ抗体が均一に塗布された９６−孔平板に配位された細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後、発色団が結合された２次エラスチン抗体を９６−孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００８１】
黄色を呈する９６−孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記数式２によってエラスターゼの発現程度を計算した。この時、上記試験物質を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。
［数式２］
エラスターゼ発現程度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：上記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００８２】
一方、上記人間の繊維芽細胞で上記試験物質のエラスターゼ発現抑制効能を測定した結果を下記表５に示す。これは、無処理群の発現程度を１００にして対比したものである。
【００８３】
【表５】
【００８４】
その結果、上記表５から明らかなように、イカリチン、イカリシドＩ及びIIがイカリインよりエラスターゼ発現を効果的に抑制することを確認することができた。
【００８５】
［試験例６］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIのメラニン生成抑制効果測定
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンのメラニン生成抑制効果を調べるためにねずみの色素細胞を利用して測定した。
【００８６】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のねずみの色素細胞（Ｍｅｌ−Ａｂ cell）（Dooley, T. P. et al, Skin pharmacol, 7, pp188-200）を、ＤＭＥＭに１０％牛胎盤血清、１００ｎＭ２−Ｏ−テトラデカノイル ホルボール（tetradecanoylphorbol）−１３−アセテート、及び１ｎＭコレラ毒素（cholera toxin）を添加した培地で３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。培養されたＭｅｌ−Ａｂ細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで取り外し、２４−ウェルプレートにて１０5細胞／ウェルの濃度で細胞を培養した。２日目から３日連続して１０ｐｐｍの各試験物質でハイドロキノン、上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンを加えて培養した。この時、上記ハイドロキノンは、陽性対照群として使用した。次に、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、４００ｎｍで吸光度を測定した後、下記数式３によってメラニン生成抑制率を計算し、その結果を表６に示した（Ｄｏｏｌｅｙの方法）。
［数式３］
メラニン生成抑制率（％）＝１００−｛（各試験物質の吸光度／対照群の吸光度）ｘ１００｝
【００８７】
【表６】
【００８８】
上記表６から明らかなように、本発明によって収得した上記実施例２で同定したイカリチン、イカリシドＩ及びIIが、実施例１で同定したイカリインより良いメラニン生成抑制率を示すものと確認され、特にイカリチン、イカリシドＩ及びIIは、ハイドロキノンと類似の程度のメラニン生成抑制率を示すことを確認した。
【００８９】
［試験例７］イカリイン、イカリチン、イカリシドＩ及びイカリシドIIの人体皮膚に対する美白効果試験
上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンの人体皮膚に対する美白効果を調べるために、下記のような実験を行った。
まず、元気な１２名の男性を対象にして被検者の上膊部位に直径１．５ｃｍの孔が開いた不透明テープを貼り付けた後、各被検者の最小紅斑量（Minimal Erythema Dose）の１．５〜２倍位の紫外線（ＵＶＢ）を照射し、皮膚の黒化を誘導した。
【００９０】
上記紫外線の照射後、上記実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンの各々１％（溶媒は１，３−ブチレングリコール：エタノール＝７：３）、ハイドロキノン１％、溶媒（vehicle）（陰性対照群）１％だけを塗布し、１ヶ所は何も塗布せず、１０週間状態変化を観察した。１週単位で皮膚の色を色差計ＣＲ２００２（日本国、ミノルタ社）で測定した。
【００９１】
その後、上記各試験物質の塗布開始時点と塗布完了時点での皮膚色の差異（ΔＬ＊）を下記数式４によって計算し、これを下記表７に示した。一方、美白効果は、試料塗布部位と対照群部位のΔＬ＊の比較として判定するが、ΔＬ＊値が２程度の場合は、沈着された色素の美白化が明らかな場合であり、１．５程度以上なら美白効果があると判定することができる。
［数式４］
ΔＬ＊＝塗布完了時点でのＬ＊値−塗布開始時点でのＬ＊値
【００９２】
【表７】
【００９３】
上記表７から明らかなように、本発明によって収得した実施例１〜２で同定したイカリイン、イカリシドＩ、イカリシドII及びイカリチンは、ハイドロキノンと類似の程度の皮膚色の明るさ程度を示すことを確認した。これは、上記物質が紫外線によって生成された色素沈着を改善し、皮膚色を明るくするからである。
【００９４】
以下、上記組成物の剤型化を製剤例を通じて説明するが、これは、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００９５】
［製剤例１］せっけん製造
【００９６】
【表８】
【００９７】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比によってせっけんを製造した。
【００９８】
［製剤例２］ローション製造
【００９９】
【表９】
【０１００】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）によってローションを製造した。
【０１０１】
［製剤例３］クリーム製造
【０１０２】
【表１０】
【０１０３】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）でクリームを製造した。
【０１０４】
［製剤例４］パック製造
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）でパックを製造した。
【０１０７】
［製剤例５］美容液製造
【０１０８】
【表１２】
【０１０９】
上記成分に精製水を満たして全量を１００にし、上記の配合比（％）で美容液を製造した。
【０１１０】
［製剤例６］散剤の製造
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
上記の成分を混合し、気密布に充填し、散剤を製造した。
【０１１３】
［製剤例７］錠剤の製造
【０１１４】
【表１４】
【０１１５】
上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠し、錠剤を製造した。
【０１１６】
［製剤例８］カプセル剤の製造
【０１１７】
【表１５】
【０１１８】
通常のカプセル剤の製造方法によって上記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【０１１９】
［製剤例９］注射剤の製造
【０１２０】
【表１６】
【０１２１】
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍＬ）上記の成分含量で製造した。
【０１２２】
［製剤例１０］液剤の製造
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、上記の成分を混合した後、精製水を加えて全体１００ｍＬに調節した後、茶色の瓶に充填し滅菌させて、液剤を製造した。
【０１２５】
[発明の効果]
以上説明したように、本発明では、エピメディウム属植物抽出物のフラボノイド成分であるイカリインから酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解して生成されたイカリイン加水分解物を含有する化粧料組成物がＤＰＰＨ及びＲＯＳ生成抑制効能を有する抗酸化効果とともに、コラーゲン生合成促進効果、エラスターゼ及びコラゲナーゼの発現抑制効果による抗老化効果、メラニン生成を抑制し、紫外線（ultraviolet rays；ＵＶ）によって生成された色素沈着を改善する効果による美白効果を示すことができることを確認した。したがって、本発明によるイカリイン加水分解物は、抗酸化、抗老化、美白、しわ改善用化粧料組成物または薬学組成物として非常に有用に使用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されるイカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物：
【化１】
上記で、Ｒ１は、ＯＨまたはラムノピラノースであり、Ｒ２は、ＯＨまたはグルコピラノースであるが、Ｒ１とＲ２は同時にラムノピラノースとグルコピラノースではない。
【請求項２】
上記組成物は、抗酸化用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記組成物は、抗老化用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記組成物は、美白用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記組成物は、しわ改善用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記イカリイン加水分解物は、次の段階を含む方法によって製造されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物：
（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階；及び
（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階。
【請求項７】
上記（ａ）段階の植物抽出物は、エピメディウム属から由来されたものであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記（ｂ）段階の酸は、塩酸、硫酸及び窒酸よりなる群から選択された１つ以上の酸、またはこれら酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記（ｂ）段階の塩基は、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１つ以上の塩基、またはこれら塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
上記（ｂ）段階の酵素は、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘスペリジナーゼ、ナリギナーゼ、グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上のものであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
上記（ｂ）段階の微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、リゾムコール属、タラロマイセス属、ビフィドバクテリウム属、モルティエレラ属、クリプトコッカス属及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１】
下記化学式１で表されるイカリイン加水分解物を含有する化粧料用組成物：
【化１】
上記で、Ｒ１は、ＯＨまたはラムノピラノースであり、Ｒ２は、ＯＨまたはグルコピラノースであるが、Ｒ１とＲ２は同時にラムノピラノースとグルコピラノースではない。
【請求項２】
上記組成物は、抗酸化用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記組成物は、抗老化用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記組成物は、美白用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記組成物は、しわ改善用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記イカリイン加水分解物は、次の段階を含む方法によって製造されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物：
（ａ）植物から水または有機溶媒を利用してイカリインを含有する植物抽出物を収得する段階；及び
（ｂ）上記収得された植物抽出物を酸、塩基、酵素または上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解する段階。
【請求項７】
上記（ａ）段階の植物抽出物は、エピメディウム属から由来されたものであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記（ｂ）段階の酸は、塩酸、硫酸及び窒酸よりなる群から選択された１つ以上の酸、またはこれら酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記（ｂ）段階の塩基は、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１つ以上の塩基、またはこれら塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１つ以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
上記（ｂ）段階の酵素は、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘスペリジナーゼ、ナリギナーゼ、グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上のものであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
上記（ｂ）段階の微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、リゾムコール属、タラロマイセス属、ビフィドバクテリウム属、モルティエレラ属、クリプトコッカス属及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【公表番号】特表２００９−５１７４６１（Ｐ２００９−５１７４６１Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３１７４（Ｐ２００８−５４３１７４）
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００４４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４０８５
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００４４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４０８５
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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