バイオフィルムの処理において使用するためのＤ−アミノ酸
Ｄ−アミノ酸を使って、バイオフィルムを治療(処理)または低減する方法、バイオフィルム関連障害を治療する方法、および、バイオフィルム形成を防止する方法が、記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、同時係属中の２０１０年１月８日出願米国仮出願第６１／２９３、４１４号、および２０１０年４月３０日出願米国特許仮出願第６１／３２９、９３０号の優先権を主張する。
【０００２】
この出願は、本出願と同日付出願の「バイオフィルム処理のための方法とコーティング組成物」の名称の同時係属中国際特許出願と関連している。
これらの出願の内容は、参照によって組み込まれる。
【０００３】
米国政府の権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所認可ＣＡ２４４８７、ＧＭ０５８２１３、ＧＭ０８２１３７、ＧＭ０８６２５８、およびＧＭ１８５６８に基づいて米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
バイオフィルムは、表面で定着および増殖し、細胞外ポリマー基質により覆われている細胞の共同体である。これらは、増殖が遅く、多くは増殖の定常期にある。これらは、全部ではないにしても、多くは病原体により形成されうる。ＣＤＣによれば、米国の全感染症中の６５％が、共通の病原体により形成され得るバイオフィルムが原因である。また、バイオフィルムは、飲料水送水系等の工業環境中にも認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】(なし)
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明の態様は、細菌によるバイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害する方法を特徴とする。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と表面を接触させ、それによりバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害することを含む。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。特定の実施形態では、細菌は、桿菌、ブドウ球菌、大腸菌、またはシュードモナス細菌である。
【０００７】
他の態様では、本発明は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む工業、治療または、医薬組成物等の組成物を特徴とする。特定の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、組成物は、２つ以上のＤ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、およびＤ−トリプトファンを含み、またさらなる実施形態では、後者の組成物が、基本的にデタージェントおよび／またはＬアミノ酸を含まない。他の実施形態では、組成物は、本明細書記載の、例えば、水処理または配管系等の工業バイオフィルムの治療に使用される。
【０００８】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にＬ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にデタージェントを含まない。例えば、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。
【００１０】
別の本開示態様は、治療を必要としている患者のバイオフィルム関連障害の治療方法に関し、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物を患者に投与し、それによりバイオフィルム関連障害を治療することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、または、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的な組み合わせである。一部の実施形態では、組成物は、皮膚および粘膜表面およびそれらの組み合わせからなる群より選択される患者の表面に投与される。他の実施形態では、表面は、口腔表面、皮膚表面、尿路表面、腟管表面、または肺表面である。
【００１１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１２】
一部の実施形態では、組成物は、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、鼻、または局所的投与、およびこれらの組み合わせにより患者に投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、患者はヒトである。
【００１４】
一部の実施形態では、バイオフィルムの形成が阻害される。他の実施形態では、以前に形成されたバイオフィルムが破壊される。
【００１５】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度で、例えば、０．１ｎＭ〜１００μＭの濃度で投与される。
【００１６】
さらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、および尿路感染ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の実施形態では、バイオフィルム関連障害は、医療機器関連感染症である。さらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、歯周病、例えば、歯肉炎、歯周炎または口臭である。またさらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、細菌が原因である。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。さらに他の実施形態では、細菌は、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ（Ｅｎｔｅｍｂａｃｔｅｒ）、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である。
本開示の別の態様は、生物学的関連表面上でのバイオフィルム形成細菌によるバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害する方法に関し、この方法は、生物学的表面と有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物とを接触させ、それによりバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１８】
一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である。
【００１９】
一部の実施形態では、表面は、医療機器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、または口腔内装置を含む。他の実施形態では、医療機器は、鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
前述の方法の一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２１】
前述の方法のいずれかの内の一部の実施形態では、方法は、殺生物剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、殺生物剤は、抗生物質である。
【００２２】
さらに他の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。
【００２３】
さらに別の本発明の態様は、バイオフィルム形成を治療、低減、または阻害するのに有効な量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の混合物を含む組成物に関し、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−チロシンである。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらなる他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。さらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態では、前述の組成物のいずれかが、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含んでもよい。他の実施形態では、前述の組成物のいずれかが、薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。前述の組成物のいずれかのさらに他の実施形態では、有効量は、バイオフィルム関連障害を治療または防ぐのに有効な量である。一部の実施形態では、有効量は、表面上のバイオフィルムを治療(処理)または防ぐのに有効な量を含む。
【００２７】
さらに別の前述の組成物のいずれかの実施形態では、バイオフィルム関連障害は、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、または尿路感染症である。一部の実施形態では、バイオフィルム関連障害は、医療機器関連感染症である。
【００２８】
一部の前述の組成物のいずれかの実施形態では、組成物は、表面への適用に適した薬剤をさらに含む。他の前述の組成物のいずれかの実施形態では、組成物は、洗浄液、包帯、創傷ジェル、または人工組織として処方される。さらなる実施形態では、組成物は、錠剤、丸薬、トローチ、カプセル、エアロゾルスプレー、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、クリーム、またはフォームとして処方される。一部の実施形態では、組成物は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜的、腟および直腸投与用に処方される。
【００２９】
本開示の別の態様は、バイオフィルム耐性医療機器に関し、この機器は、体液に接触しやすい表面、および前記表面上にコートしたまたはその中に含浸されたＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、バイオフィルム形成を治療、低減または阻害するのに有効な量であり、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−チロシンであり、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄチロシンを含む。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤプロリンおよびＤフェニルアラニンをさらに含む。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、徐放製剤として処方される。一部の実施形態では、表面は、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。さらなる実施形態では、表面は、基本的に、デタージェントを含まない。
【００３２】
一部の実施形態では、機器は、１つまたは複数の鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータおよび内視鏡から選択される。
【００３３】
本開示のさらなる態様は、飲用液に関し、０．０００００１％〜０．１％の範囲の濃度のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３４】
本開示の別の態様は、バイオフィルム形成に耐性を示す組成物に関し、薬学的にまたは化粧用に適切な基剤、および基剤中に分散した有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それによりバイオフィルム形成の治療、低減または阻害を行い、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３５】
一部の実施形態では、基剤は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００３６】
一部の実施形態では、基剤は、液体、ゲル、ペースト、または粉末から選択される。さらなる実施形態では、組成物は、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、石けん、ローション、クリーム、デオドラント剤、スキンケア製品、化粧品用パーソナルケア製品、インティメイト・ハイジーン製品、フットケア製品、光防護剤、日焼け剤、防虫剤、制汗剤、シェービング剤、脱毛剤、香料、デンタルケア、デンタルケア・口腔ケア製剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３７】
以下の図は、説明の目的のみで提示されるもであり、制限を加える意図はない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、枯草菌株ＮＣＩＢ３６１０の細胞を示す。この細胞は、１２ウエルプレートを使って液体バイオフィルム誘導培地中、２２ ℃で３日間（Ａ）または８日間（Ｂ）成長させた。図１Ｃ及び１Ｄは、６〜８日間培養液（Ｃ）または３日間培養液（Ｄ）の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに適用後、乾燥・再懸濁したメタノール溶出液（１：１００ｖ／ｖ）を添加した培地中で３日間成長させた細胞を示す。ウエルに添加された最終濃度の濃縮因子は、元の馴化培地の容量ベースで１：４希釈であった。図１Ｅは、その因子がメタノールを使ったステップワイズ溶出によりＣ−１８カラムでさらに精製されたことを除いて、図１Ｃと同じである。３μｌの４０％メタノール溶出液を添加した結果を示す。図１Ｆは、新しい培地への添加の前に、４０％メタノール溶出液をプロテイナーゼＫビーズと共に２時間インキュベートし、続いて、遠心分離によりビーズを除去したことを除いて、図１Ｃと同じである。
【図２】図２Ａは、３日間のインキュベーション後に、バイオフィルム誘導培地中で新しく播種した培養液にＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）を添加した場合のペリクル形成に対する効果を示す。図２Ｂは、ペリクル形成の完全な阻害に必要なＤ−アミノ酸の最小バイオフィルム阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＢＩＣ）を示す。図２Ｃは、アミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン（３μＭ）の添加またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物添加に続いて、さらに８時間インキュベーションした３日間培養液を示す。図２Ｄは、野性型またはｙｌｍＥおよびｒａｃＸに対し二重変異体株（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地から得た濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、３７℃のグルコース（０．５％）およびＮａＣｌ（３％）を含むＴＳＢ培地中で、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、ウエルへのアミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）添加またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件を付加した。未結合細胞を洗い流した後、ポリスチレンに結合した細胞をクリスタルバイオレットで染色して可視化した。
【図３】図３Ａは、細胞壁への放射性のＤ−チロシンの組み込みを示す。細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結果を、細胞（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）への全体組み込みのパーセントとして示す。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体含有細胞（ＤＲ−３０（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））からの全蛍光を示す。Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在の場合について、バイオフィルム誘導培地中で定常期になるまで振盪を加えながら細胞を成長させた。図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞会合を示す。表示されているように、Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在（未治療）の場合について、野性型細胞およびｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有ｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞をバイオフィルム誘導培地中で定常期（ＯＤ＝１．５）になるまで振盪を加えながら細胞を成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ線維の細胞会合を示す。Ｄ−チロシンのない場合（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加の場合（画像３〜６）について、２４時間培養液に対し、１２時間追加してインキュベートした。実施例に記載のように、ＴａｓＡ繊維を抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、透過型電子顕微鏡により可視化した。菌体外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像化が著しく改善されたので、細胞はｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）に対し変異体であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し；中空矢印は、個別の繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドル、画像３、４と６は、個別の繊維および細胞から離脱したバンドルを示し、画像３〜５は、ほとんどまたは全く繊維状物質のない細胞を示す。
【図４】図４Ａは、Ｄ−チロシン含有または非含有の固体（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、表示した配列変化中でｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異が生じたコドンにより特定される残基である。
【図５】図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充した後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたＭＳｇｇ培地含有ウエルを示す。
【図６】図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートした固体ＭＳｇｇ培地を含むプレートを示す。
【図７】図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートしたＮＣＩＢ３６１０（野性型）およびｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）の二重欠失変異体を示す。
【図８】図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える効果を示す。細胞をＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。
【図９】図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺを保持）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺを保持）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。
【図１０】図１０は、緑膿菌バイオフィルム形成のＤ−アミノ酸による阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中３０℃で４８時間成長させた。アミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン添加またはＤ−アミノ酸混合物の条件をウエルに付加した。ポリスチレンに結合した細胞を、未結合細胞を洗い流した後、クリスタルバイオレットで染色して可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗い流し、完全に乾燥した。
【図１１】図１１は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１２】図１２は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＭ６３培地中で４８時間成長させた緑膿菌のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１３】図１３は、個別Ｄ−アミノ酸または混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１４】図１４は、Ｌ−アミノ酸と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１５】図１５は、浮遊細菌を除去後Ｄ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１６】図１６は、浮遊細菌を除去後Ｌ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１７】図１７は、浮遊細菌を除去後ＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルム内の細胞の定量化である。細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。
【図１８】図１８は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図１９】図１９は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図２０】図２０は、Ｍ６３固体培地上の緑膿菌中のバイオフィルム形成に与えるＤ−ａａの効果を示す。コロニーは、室温で４日間成長させた。
【図２１】図２１は、バイオフィルム誘導条件下における、緑膿菌の６ウエルプレートのボタン中の単一付着細胞のＳｙｔｏｘ染色を示す。
【図２２】図２２は、ＬＢ培地中でＤ−アミノ酸（１００μＭ）またはＬ−アミノ酸（１００μＭ）混合物と共に４８時間成長させたプロテウス・ミラビリスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図２３】図２３は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸（１ｍＭ）を含む、ショ糖（０．５％）培地を添加したＢＨＩ培地で７２時間成長させたストレプトコッカス・ミュータンスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
特に他の定義がなければ、本明細書で使われる全ての技術科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で挙げた全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のみの目的であり、制限する意図はない。
【００４０】
他の本発明の特徴および優位点は、以下の詳細記述、および請求項から明らかとなろう。当業者には明らかなように、本明細書記載の特定の特徴および実施形態は、他の特徴または実施形態のいずれかと組み合わせ可能である。
【００４１】
定義
用語の「障害」、「疾患」、および「状態」は、本明細書では、患者状態に対し、同義に使用される。障害は、患者の身体の正常な機能に影響する妨害または撹乱である。疾患は、種々の原因、例えば、特定可能な一群の症状を特徴とする感染、遺伝的欠陥、または環境的ストレスから生じた器官、身体部位、またはシステムの病理学的状態である。障害または疾患は、バイオフィルムが樹立されている細菌の疾患関連増殖を特徴とするバイオフィルム関連障害を指してもよい。
【００４２】
用語の「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書では、本明細書記載の組成物（例えば、予防もしくは治療組成物）の投与、もしくは治療薬の組み合わせ（例えば、予防もしくは治療組成物の組み合わせ）の投与の結果としての、バイオフィルムもしくはバイオフィルム関連障害の発生または発症の阻害またはバイオフィルムもしくは患者の表面または内部のバイオフィルム関連障害の１つまたは複数の徴候もしくは症状の再発、発症、もしくは発生の防止を指す。
【００４３】
本明細書で使われる「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、障害もしくはその症状を改善する、または障害もしくはその症状の進行を防ぐもしくは遅らせるのに有効な量、方式（例えば、投与スケジュール）、および／またはモード（例えば、投与経路）で、本明細書記載の組成物を投与することを指す。これは、例えば、バイオフィルムもしくはバイオフィルム関連障害関連パラメータまたはその徴候もしくは症状が、例えば、統計的に有意な程度にまたは当業者に検出可能な程度に、改善することにより証明できる。有効量、方式、またはモードは、表面、適用先、および／または患者に依存して変化し、表面、適用先、および／または患者に合わせることが可能である。バイオフィルムまたはバイオフィルム関連障害またはその徴候もしくは症状の進行を防ぐまたは遅らせることにより、治療により、罹患した表面または罹患したもしくは診断された患者の内部のバイオフィルムまたはバイオフィルム関連障害またはその徴候もしくは症状から生ずる悪化を防ぐまたは遅らせることができる。
【００４４】
本発明は、少なくとも一部は、成熟バイオフィルム由来の馴化培地中に存在するＤ−アミノ酸がバイオフィルム形成を防ぎ、既存のバイオフィルム分解の引き金となるという発見に基づいている。標準的アミノ酸は、相互に鏡像関係にあるＬ−またはＤ−アミノ酸と呼ばれる２つの光学的異性体のどちらかの形で存在しうる。Ｌ−アミノ酸は、タンパク質中に見出される大部分のアミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸は細菌のペプチドグリカン細胞壁の成分である。
【００４５】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、生存および非生存表面上のバイオフィルムに浸透でき、細菌の表面への付着およびバイオフィルムのさらなる発達を阻害でき、このようなバイオフィルムを剥離させることができおよび／または生物学的基質中のバイオフィルム形成微生物のさらなる増殖を阻害することができ、またはこのような微生物を消滅させることができる。Ｄ−アミノ酸は、当技術分野で既知であり、既知の技術を使って調製可能である。代表的方法には、例えば、米国特許公開第２００９０２０３０９１号に記載のものが含まれる。Ｄ−アミノ酸は、また、市販品として入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から）。
【００４６】
本明細書記載の方法には、いずれのＤ−アミノ酸も使用可能であり、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、またはＤ−チロシンが、非制限的に含まれる。Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは他のＤ−アミノ酸と組み合わせて使用可能である。代表的方法では、２、３、４、５、６、または７以上のＤ−アミノ酸が組み合わせて使用される。好ましくは、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、またはＤ−トリプトファンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。他の好ましい実施形態では、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。
【００４７】
Ｄ−アミノ酸は、０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で投与可能である。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの濃度で投与可能である。
【００４８】
バイオフィルム形成の阻害または治療に特に有効であると解った代表的Ｄ−アミノ酸組成物には、Ｄ−チロシンが含まれる。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、単独で使用され、例えば、１ｍＭ未満、または１００μＭ未満、または１０μＭ未満の濃度として、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用できる。
【００４９】
他の実施形態では、Ｄ−チロシンが１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンと組み合わせて使用される。Ｄ−チロシンの１つまたは複数のＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンとの組み合わせは、相乗的となり得、１０μＭ以下、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの全体Ｄ−アミノ酸濃度、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度でバイオフィルム形成を阻害または治療するのに有効である可能性がある。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルである。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルではない。
【００５１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満のＬ−アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、Ｌ−アミノ酸のパーセンテージは、対応するＤ−アミノ酸に対する割合である。例えば、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸のラセミ混合物は、５０％Ｌ−アミノ酸を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。例えば、組成物は、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２５重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０２５重量％未満、約０．０１重量％未満、約０．００５重量％未満、約０．００２５重量％未満、約０．００１重量％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。他の実施形態では、組成物は、全体組成物に対して、約３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．２５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２５重量％未満、０．０１重量％未満、０．００５重量％未満、０．００２５重量％未満、０．００１重量％未満のデタージェントを含む。デタージェント、例えば、界面活性剤含有製剤に置いて、界面活性剤が活性試薬、例えば、Ｄ−アミノ酸と相互作用し、往々にして、試薬の有効性に大きな影響を与える可能性がある。一部の実施形態では、特定の界面活性剤型の存在が有効性を変えるかどうかを判定するための選別として、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤および双性イオン界面活性剤に対して試薬の有効性を選別する必要が生じうる。デタージェントの低減または除去が組成物の有効性を増加させおよび／または製剤の合併症を低減し得る。
【００５３】
他の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントおよびＬ−アミノ酸の両方を含まない。
【００５４】
バイオフィルム
ほとんどの細菌は、バイオフィルムとして知られる複合体の基質含有多細胞の共同体を形成できる（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：４９（２０００）；Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。バイオフィルム関連細菌は、外界からの刺激、例えば、抗生物質から保護されている（Ｂｒｙｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１００：１（２００８））。しかし、バイオフィルムが熟成するにつれ、栄養素が限定的となり老廃物が蓄積して、バイオフィルム関連細菌は、浮遊実体に戻る方が都合がよくなる（Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。従って、バイオフィルムは、有限の寿命を有し、最終的な分解を特徴とする。
【００５５】
他の単細胞の生物に加えて、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、バイオフィルムを産生できる。細菌性バイオフィルムは、コロニーを形成している細胞により産生される細胞外の多糖基質内に包まれた細胞表面付着共同体である。バイオフィルム成長は、一連のプログラムされたステップにより発生し、このステップは、最初の表面への付着、３次元マイクロコロニー形成、およびその後の成熟バイオフィルムの成長を含む。バイオフィルム内の細胞の場所が深くなればなるほど（例えば、細胞がバイオフィルムが付着している固体表面に近いほど、大部分のバイオフィルム基質により遮蔽され、保護される）、細胞はさらに代謝不活性になる。この生理学的変化と勾配の結果、効率的システムが樹立され、それにより微生物が多様な機能的体質を有する細菌性共同体集団が作られる。また、バイオフィルムは、種々の、多様な非細胞性成分で作られ、これらに限定されないが、炭水化物（単体および複合体）、脂質、タンパク質（ポリペプチドを含む）、および糖類およびタンパク質の脂質複合体類（リポ多糖類およびリポタンパク質）を含んでもよい。バイオフィルムは、２つ以上の細菌種（多菌性バイオフィルム）の集積共同体、または１つの特異的バクテリアを優先的に含んでもよい。
【００５６】
バイオフィルムは、適した成長条件が発生し、微生物に対し生存を保証する選択優位性を提供できるまで、一定時間の間休眠状態での細菌の存在を可能とする。しかし、この選択は、バイオフィルムがヒト細菌感染の約６５％に関与すると認められている点で、ヒトの健康に重大な脅威を提起する可能性がある（Ｓｍｉｔｈ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５７：１５３９−１５５０（２００５）；Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：９５−１０８（２００４））。
【００５７】
本明細書記載のように、バイオフィルムは、多種多様の生物学的、医学的、商業的、工業的、およびプロセシング作用に影響を与える可能性もある。
【００５８】
バイオフィルム形成細菌
本明細書記載の方法は、バイオフィルムの形成および／または脅威を防ぐ、または遅らせるために使用できる。代表的方法では、バイオフィルムは、バイオフィルム成形細菌により形成される。細菌は、グラム陰性菌種またはグラム陽性細菌性種であってもよい。このような細菌の非制限的例には、以下の属のメンバーが含まれる：アクチノバチルス属のメンバー（例えば、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス）、アシネトバクター属のメンバー（例えば、アシネトバクター・バウマンニ）、エロモナス属のメンバー、ボルデテラ属のメンバー（例えば、百日咳菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、またはパラ百日咳菌）、ブレビバシラス属のメンバー、ブルセラ属のメンバー、バクテロイデス属のメンバー（例えば、バクテロイデス・フラジリス）、バークホルデリア属のメンバー（例えば、セパシア菌または類鼻疽菌）、ボレリア属のメンバー（例えば、ライム病ボレリア）、桿菌属のメンバー（例えば、炭疽菌または枯草菌）、カンピロバクター属のメンバー（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、キャプノサイトファーガ属のメンバー、カルジオバクテリウム属のメンバー（例えば、カーディオバクテリウム・ホミニス）、シトロバクター属のメンバー、クロストリジウム属のメンバー（例えば、破傷風菌またはクロストリジウム・ディフィシル）、クラミジア属のメンバー（例えば、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジア、またはオウム病クラミジア）、エイケネラ属のメンバー（例えば、エイケネラ・コローデンス）、エンテロバクター属のメンバー、エシェリキア属のメンバー（例えば、大腸菌）、フランシセラ属のメンバー（例えば、野兎病菌）、フソバクテリウム属のメンバー、フラボバクテリウム属のメンバー、ヘモフィルス属のメンバー（例えば、軟性下疳菌またはインフルエンザ菌）、ヘリコバクター属のメンバー（例えば、ピロリ菌）、キンゲラ属のメンバー（例えば、キンゲラ・キンゲ）、クレブシエラ属のメンバー（例えば、肺炎桿菌）、レジオネラ属のメンバー（例えば、在郷軍人病菌）、リステリア属のメンバー（例えば、リステリア菌）、レプトスピラ属のメンバー、モラクセラ属のメンバー（例えば、カタル球菌）、モルガネラ属のメンバー、マイコプラズマ属のメンバー（例えば、マイコプラズマ・ホミニスまたは肺炎マイコプラズマ）、マイコバクテリウム属のメンバー（例えば、マイコバクテリウム結核またはらい菌）、ナイセリア属のメンバー（例えば、淋菌または髄膜炎菌）、パスツレラ属のメンバー（例えば、パスツレラ・マルトシダ）、プロテウス属のメンバー（例えば、プロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ミラビリス）、プレボテラ属のメンバー、プレジオモナス属のメンバー（例えば、プレジオモナス・シゲロイデス）、シュードモナス属のメンバー（例えば、緑膿菌）、プロビデンシア属のメンバー、リケッチア属のメンバー（例えば、リケッチア・リケッチイまたは発疹熱リケッチア）、ステノトロフォモナス属のメンバー（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌）、連鎖球菌属のメンバー（例えば、緑色連鎖球菌、化膿性連鎖球菌（グループＡ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢ）、ストレプトコッカス・ボビス、または肺炎球菌）、ストレプトマイセス属のメンバー（例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス）、サルモネラ属のメンバー（例えば、腸炎菌、チフス菌、またはネズミチフス菌）、セラチア属のメンバー（例えば、霊菌）、赤痢菌属のメンバー、スピリルム属のメンバー（例えば、鼡咬症スピリルム）、トレポネーマ属のメンバー（例えば、梅毒トレポネーマ）、ベイヨネラ属のメンバー、ビブリオ属のメンバー（例えば、コレラ菌、腸炎ビブリオ、またはビブリオ・バルニフィカス）、エルシニア属のメンバー（例えば、エンテロコリチカ菌、ペスト菌、または仮性結核菌）、およびザントモナス属のメンバー（例えば、ザントモナス・マルトフィリア）。
【００５９】
枯草菌は、特異的に半固体表面上に複合共同体を構築し、静置培養液の空気／液体界面に厚いペリクルを形成する（Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：６３８（２００７）；Ｖｌａｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２：９４５（２００８）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１））。枯草菌バイオフィルムは、菌体外多糖およびタンパク質ＴａｓＡから成るアミロイド線維で構成される細胞外の基質により一緒に保持された長鎖細胞から成る（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６）；Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））。菌体外多糖は、ｅｐｓＡ−Ｏオペロンによりコードされた酵素により産生され（「ｅｐｓオペロン」）、ＴａｓＡタンパク質は、ｙｑｘＭ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロン（「ｙｑｘＭオペロン」）のプロモーター遠位遺伝子によりコードされる（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６））。
【００６０】
バイオフィルム産生細菌、例えば、本明細書記載の種は、本明細書記載のように、インビトロで、または表面上で、生存患者中に見出すことができる。
【００６１】
適用／製剤
Ｄ−アミノ酸が患者に投与される場合には、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、医薬組成物に組み込むことができる。Ｄ−アミノ酸は、薬学的に許容可能な塩、エステルまたはＤ−アミノ酸の誘導体として医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、このような組成物には、Ｄ−アミノ酸および薬学的に許容可能なキャリアが含まれる。本明細書で使われる用語の「薬学的に許容可能なキャリア」は、本明細書記載のＤ−アミノ酸と一緒に患者に投与可能な、その薬理学的活性を破壊しないキャリアを意味する。薬学的に許容可能なキャリアには、例えば、医薬品投与と共生できる溶剤、結合剤、分散媒体、コーティング、防腐剤、着色剤、等張性および吸収遅延剤、等が含まれる。補助的活性化合物も組成物中に組込み可能である。
【００６２】
用語の「薬学的に許容可能な塩」には、これらに限定されないが、水溶性および水不溶性の塩、例えば、アセタート、アムソナート（４、４−ジアミノスチルベン−２、２−ジスルホナート）、ベンゼンスルホナート、ベンゾアート、ビカルボナート、ビスルファート、ビタルトラート、ボラート、ブロミド、ブチラート、カルシウムエデタート、カンシラート、カルボナート、クロリド、シトラート、クラブラリアート、ジヒドロクロリド、エデタート、エジシラート、エストラート、エシラート、フマラート、グルセプタート、グルコナート、グルタマート、グリコリルアルサニラート、ヘキサフルオロホスファート、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロキシナフトアート、ヨージド、イソチオナート、ラクタート、ラクトビオナート、ラウラート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、メチルブロミド、メチルニトラート、メチルスルファート、ムカート、ナプシラート、ニトラート、Ｎメチルグルカミンアンモニウム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトアート、オレアート、オキサラート、パルミタート、パモアート（１、１−メテン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトアート、エインボナート）、パントテナート、ホスファート／ジホスファート、ピクラート、ポリガラクツロナート、プロピオナート、ｐ−トルエンスルホナート、サリチラート、ステアラート、スブアセタート、スクシナート、スルファート、スルホサリクラート、スラマート、タンナート、タルトラート、テオクラート、トシラート、トリトヨージド、およびバレラート塩が含まれる。
【００６３】
また、Ｄ−アミノ酸は、エステルまたは誘導体の形であってもよい。適切なエステルの例には、ホルマート、アセタート、プロピオナート、ブチラート、イソブチラート、ペンタノアート、クロトナート、およびベンゾアートが含まれる。一部の薬学的に許容可能な誘導体には、水溶性を高める化学基が含まれる。
【００６４】
使用可能な薬学的に許容可能なキャリアの非制限的例には、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ＰＶＡ、部分水解ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート−ｃｏ−ビニルアルコール）、架橋ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、架橋部分水解ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、架橋ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリ−Ｄ、Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ＰＧＡ、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（無水物）、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールの共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、ポリエチレングリコール；およびこれらの組み合わせおよび混合物が含まれる。
【００６５】
他のキャリアには、例えば、水性ゼラチン、水性タンパク質、高分子キャリア、架橋剤、またはこれらの組み合わせが含まれる。他の例では、キャリアは、基質である。さらに別の例では、キャリアには、水、薬学的に許容可能な緩衝液塩、薬学的に許容可能な緩衝液、薬学的に許容可能な抗酸化剤、アスコルビン酸、１つまたは複数の薬学的に許容可能な低分子量ポリペプチド、約２〜約１０アミノ酸残基含有ペプチド、１つまたは複数の薬学的に許容可能なタンパク質、１つまたは複数の薬学的に許容可能なアミノ酸、ヒト必須アミノ酸、１つまたは複数の薬学的に許容可能な炭水化物、１つまたは複数の薬学的に許容可能な炭水化物由来物質、非還元糖、グルコース、ショ糖、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、マルトデキストリン、デキストリン、シクロデキストリン、薬学的に許容可能なキレート化剤、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、２価金属イオン用キレート化剤、三価の金属イオン用キレート化剤、グルタチオン、薬学的に許容可能な非特異的血清アルブミン、および／またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
Ｄ−アミノ酸含有医薬組成物は、当業者には既知であるように、目的投与経路に適合するように処方可能である。投与経路の非制限的例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜的、腟および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、下記成分を含んでもよい：無菌希釈剤、例えば、注射剤用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；抗菌薬、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはナトリウムビスルフィット；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、アセタート、シトラートまたはホスファートおよび浸透圧調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムにより調整可能である。非経口の製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射器または複数用量のバイアルに封入可能である。
【００６７】
注射用途に適した医薬組成物には、無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌水溶液（水溶性の場合は）または分散液および無菌の粉末が含まれる。静脈内投与用の適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全てのケースで、組成物は、無菌で、容易に注射可能である程度に流動性が必要である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌および真菌、の汚染作用に対し保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）を含む溶媒または分散媒、ならびに適切なこれらの混合物でありうる。例えば、レシチン等によるコーティングにより、分散の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適した流動度を維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって行うことができる。組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより行うことができる（例えば、レミントン薬科学（第２１版）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．（２００６）参照）。
【００６８】
無菌の注射可能溶液は、必要に応じ、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと一緒に、適切な溶媒中の必要量のＤ−アミノ酸を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製可能である。通常、分散液は、ベースになる分散媒および上記列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌溶媒中に活性化合物を組み込むことにより調製できる。無菌注射可能溶液調製用の無菌粉末の場合は、調製方法には、非制限的例として、事前に除菌されたその溶液由来のいずれかの追加の所望成分を加えた有効成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥が含まれる。
【００６９】
経口組成物には、通常、不活性の希釈剤または食用キャリアが含まれる。経口治療投与の目的のため、Ｄ−アミノ酸は、賦形剤と共に組み入れられ、錠剤、丸薬、トローチ、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形で使用できる。経口組成物は、また、うがい薬として使用するため液体キャリアを使って調製可能である。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含有できる。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ、等は、次の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含んでもよい：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、ショ糖またはサッカリン；または香味料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ調味料。
【００７０】
吸入による投与に対しては、Ｄ−アミノ酸は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で送達できる。
【００７１】
また、全身性投与は、経粘膜的または経皮的方法により行うことができる。経粘膜または経皮投与に対しては、透過すべきバリアに対し適切な浸透剤が製剤中に含められる。このような浸透剤は、通常、当技術分野で既知であり、これらに限定されないが、例えば、経粘膜的投与に対しては、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用により行うことができる。経皮投与に対しては、活性化合物は、通常、当技術分野で知られているように、例えば、軟膏、塗り薬、ゲル、またはクリーム剤に処方される。
【００７２】
急性または慢性創傷の治療に対しては、Ｄ−アミノ酸は、包帯、洗浄液、ゲル、または人工組織として処方できる。
【００７３】
バイオフィルムは、口腔表面（例えば、歯、舌、のどの奥、等）上に形成可能である。これらのバイオフィルムは、このような環境中に存在する天然の微生物叢の日々の細菌活性に関連しうるが、また、口腔関連疾患、例えば、歯周病（例えば、歯肉炎または歯周炎）、口臭、または虫歯にも関係しうる。例えば、一般的歯周病である歯周炎は、歯根表面上にバイオフィルムとして存在する少群のグラム陰性細菌、特に、ジンジバリス菌、バクテロイデス・フォーサイスおよびアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンスが原因であると考えられており、後者の細菌は、若年性歯周炎の症例で主に見つかっている。歯周病に関与すると考えられる他の細菌には、トレポネーマ・デンティコラ、トレポネマ・ソクランスキー、フソバクテリウム・ヌクレアタム、およびプレボテラ・インターメディア、シドフィルス菌、カゼイ菌、アクチノミセス・ビスコーサス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、ストレプトコッカス・サングイス、緑色レンサ球菌、ならびにミュータンス菌が含まれる。このような口腔表面へのＤ−アミノ酸の適用により、細菌性バイオフィルム形成を阻害または防ぐことができる。通常、このような口腔表面への適用は、通常の使用方法では、全身性の投与の目的のように意図的に飲み込むことをしないで、全ての歯の表面および／または口腔組織に実質的に接触するのに充分な時間の間、口腔中に保持される製品経由でなされる。口腔表面で使用するＤ−アミノ酸は、ガム、ペースト（例えば、歯磨き粉）として処方でき、これは、その後、患者のこのような表面のバイオフィルムに直接適用できる。ペースト製剤は、研磨材をさらに含んでもよい。Ｄ−アミノ酸をゲル製剤または液体製剤中に存在させることも可能である。例えば、Ｄ−アミノ酸は、患者の口腔表面のバイオフィルムと直接接触できるうがい薬として処方できる。さらに、Ｄ−アミノ酸は、口腔状態の治療または予防のために、ポリマーフィルムまたは小平板として（例えば、徐放製剤として）処方可能である。一実施形態では、本発明のＤ−アミノ酸は、歯周炎用の補助抗菌療法として使用可能であり、チップの形で歯または歯の間に直接適用できる。本発明の口腔ケア組成物は、治療リンス、特に、口腔リンス；歯磨剤、例えば、練り歯磨き、歯磨ジェル、および歯磨き粉；摩耗防止ゲル；マウススプレー；ムース；フォーム；チューインガム、ロゼンジおよびブレスミント；飲料水添加物；歯科溶液および洗浄液；ならびに備品、例えば、糸ようじおよびテープ、を含む種々の形態であってよい。歯科備品は、歯科糸ようじまたはテープ、チップ、ストリップ、フィルムおよびポリマー繊維を含む含浸した繊維であってもよい。
【００７４】
例えば、経口組成物は、組成物の全体重量ベースで、約０．０１重量％〜約１５重量％、例えば、０．０１重量％〜１５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および経口的に受容可能なアジュバントを含みうる。１つの経口組成物の非制限的例は、１０重量％ソルビトール、１０重量％グリセリン、１５重量％エタノール、１５重量％プロピレングリコール、０．５重量％ナトリウムラウリル硫酸塩、０．２５重量％ナトリウムメチルコシルタウラート、０．２５重量％ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロック共重合体、０．１０重量％ペパーミント香料、０．１〜０．５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および４８．６重量％の水を含む。
【００７５】
経口組成物は、例えば、ゲル、ペースト、クリームまたは水性の製剤（うがい薬）の形態であってもよい。また、経口組成物は、虫歯の形成に逆らう効力を有するフッ化物イオン、例えば、無機のフッ化物塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウムもしくはカルシウムフッ化物、または有機フッ化物塩、例えば、アミンフッ化物（ＯＬＡＦＬＵＯＲの商標で知られる）を放出する化合物を含むことができる。経口組成物は、当技術分野で「経口的に受容可能なキャリア」として知られる化合物をさらに含むことができる。これらは、本明細書で使用されるように、従来の口腔ケア組成物中の添加物を意味し、これらに限定されないが、下記のものを含む：フッ化物イオンソース、抗結石または抗歯石試薬、緩衝液、研磨剤、例えば、シリカ、漂白剤、例えば、過酸化物ソース、アルカリ金属重炭酸塩、肥厚物質、湿潤剤、水、界面活性剤、二酸化チタニウム、香料系、甘味料、キシリトール、着色料、およびこれらの混合物。このような物質は、当技術分野ではよく知られており、調製される組成物に対する所望の身体的、美容および性能特性に基づいて当業者により容易に選択される。これらのキャリアは、典型的には、経口組成物中の重量で約５０％〜約９９％、好ましくは約７０％〜約９８％、さらに好ましくは約９０％〜約９５％、のレベルで含んでもよい。使用されるキャリアの選択は、基本的に、組成物が口腔中に導入される方法により決定される。好ましい実施形態では、経口組成物は、歯磨剤、例えば、練り歯磨き、歯磨ジェルおよび歯磨き粉の形態である。このような練り歯磨きおよび歯磨ジェルの成分には、通常、１つまたは複数の歯科研磨材（約６％〜約５０％）、界面活性剤（約０．５％〜約１０％）、糊料（約０．１％〜約５％）、湿潤剤（約１０％〜約５５％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、着色料（約０．０１％〜約０．５％）および水（約２％〜約４５％）が含まれる。このような練り歯磨きまたは歯磨ジェルは、また、１つまたは複数の虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％〜約０．３％）および抗結石剤（約０．１％〜約１３％）を含んでもよい。歯磨き粉は、実質的に全て非液体成分である。他の好ましい口腔ケア組成物は、うがい薬またはリンス、マウススプレー、歯科溶液および洗浄液を含む液体製品である。このようなうがい薬およびマウススプレーの成分には、典型的には、１つまたは複数の水（約４５％〜約９５％）、エタノール（約０％〜約２５％）、湿潤剤（約０％〜約５０％）、界面活性剤（約０．０１％〜約７％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、および着色料（約０．００１％〜約０．５％）が含まれる。このようなうがい薬およびマウススプレーは、また、１つまたは複数の虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％〜約０．３％）および抗結石剤（約０．１％〜約３％）を含んでもよい。歯科溶液の成分には、通常、１つまたは複数の水（約９０％〜約９９％）、防腐剤（約０．０１％〜約０．５％）、糊料（０％〜約５％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、および界面活性剤（０％〜約５％）が含まれる。
【００７６】
また、Ｄ−アミノ酸含有医薬組成物は、坐剤（例えば、従来の坐剤基剤、例えば、ココアバターおよび他のグリセリド）または直腸への送達用の停留かん腸剤の形に調製可能である。
【００７７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。一部の例では、デタージェントは、組成物の毒性の一因となりうる。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％未満、またはそれ未満のデタージェント、例えば、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、約０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、約０．００２５％未満、０．００１％未満のデタージェントを含む。
【００７８】
一部の医薬組成物は、身体からの急速除去に対しＤ−アミノ酸を保護するキャリア、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化したデリバリーシステムを含む徐放製剤、を加えて調製できる（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：２２９７−２３０８、２００７に記載のように）。生分解性、生体適合性高分子、例えば、エチレン酢酸ビニール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用可能である。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。また、材料は、市場から入手可能である（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．から）。リポソーム懸濁液（細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を有する特定の細胞を標的とするリポソームを含む）も、また、薬学的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは、例えば、米国特許第４、５２２、８１１号に記載のように、当業者に既知の方法に従って調製できる。
【００７９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、ユニット投与剤形で経口または非経口の組成物を処方することは好都合でありうる。本明細書で使われるユニット投与剤形は、治療される患者に対する単位投与量として適した物理的に離散性のユニットを指す；各ユニットは、必要な医薬品キャリアと協調して所望の治療効果を得るように計算された活性化合物の所定量を含む。
【００８０】
このような化合物の毒性および治療の有効性は、細胞培養または実験動物を使った標準的医薬手順、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）測定手順、により決定できる。毒性と治療効果間の用量比率は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。毒性副作用を示す化合物は、使用可能であるが、正常細胞に対し起こりうる損傷を最小にし、それにより、副作用を減らすために、このような化合物を罹患した組織の部位に標的化するデリバリーシステムを設計するように配慮しなければならない。
【００８１】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトでの使用に対する投与量の範囲を決めるために使用できる。このような化合物の投与量は、通常、毒性がほとんどまたは完全にないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変わりうる。本明細書記載の方法で使用されるいずれの化合物に対しても、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定可能である。細胞培養で測定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量を動物モデルで決定可能である。このような情報は、ヒトの有用な用量をさらに正確に決定するのに使用可能である。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーを使って測定できる。このような組成物を調製し、試験するための情報は、当技術分野で既知である（例えば、レミントン薬科学（第２１版）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．（２００６）参照）。
【００８２】
一部の例では、約０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５０μＭ Ｄ−アミノ酸、例えば、約０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約２５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１０μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または約０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭＤ−アミノ酸が投与される、例えば、０．０００５μＭＤ−アミノ酸〜５０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜２５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜１０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜１μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸が投与される。好ましくは、Ｄ−アミノ酸がナノモル濃度で、例えば、約５ｎＭ、約１０ｎＭで、約１５ｎＭで、約２０ｎＭで、約２５ｎＭで、約３０ｎＭ、約５０ｎＭで、またはそれ超で投与され、または好ましくは、５ｎＭで、１０ｎＭで、１５ｎＭで、２０ｎＭで、２５ｎＭで、３０ｎＭで、または５０ｎＭで投与される。
【００８３】
他の例では、Ｄ−アミノ酸の治療有効量または投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約５ｍｇ／ｋｇ体重、または好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．２５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。
【００８４】
医師は、特定の因子が、患者を効果的に治療するのに必要な投与量に影響する可能性があることを理解している。これらに限定されないが、この因子には、疾患または障害の重症度、前治療、総体的な健康および／または患者の年齢、および他の現在の疾患が含まれる。さらに、Ｄ−アミノ酸の治療有効量での患者の治療は、単回治療または一連の治療を含んでもよい。一例では、患者は、約０．０６ｍｇ〜約１２０ｍｇの範囲で、約１〜１０週の間、あるいは２〜８週の間、約３〜７週の間、または約４、５、もしくは６週の間、毎週１回、または好ましくは０．０６ｍｇ〜１２０ｍｇの範囲で、１〜１０の週の間、あるいは２〜８週の間、３〜７週の間、または４、５、もしくは６週の間、毎週１回Ｄ−アミノ酸で治療される。また、治療に使用されるＤ−アミノ酸の効果的投与量は、特定の治療コースの間で、増加または減少可能であることも理解されよう。
【００８５】
医薬組成物は、投与インストラクションと一緒に、容器、パック、またはディスペンサー中に入れることができる。当業者なら、本明細書記載の医薬組成物は単回用量バイアルとして処方できることを理解するであろう。
【００８６】
本明細書記載の治療有効量のＤ−アミノ酸含有医薬組成物での患者の治療は、単回治療、継続的治療、または複数の用量に分けた一連の治療であってもよい。治療には、単回投与、継続投与、または１つまたは複数の年次にわたる定期的投与を含むことができる。一部の症例で、常習的な長期投与が必要な場合がある。通常、各製剤は、本明細書記載のバイオフィルム関連障害または状態の有害作用または症状の阻害または低減または除去に充分な量を投与される。
【００８７】
Ｄ−アミノ酸は、パーソナルケア製品、例えば、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、液体および固体石けん（合成界面活性剤および飽和および／または不飽和脂肪酸の塩ベースの）、ローションおよびクリーム剤、デオドラント剤、その他の水性のまたはアルコール溶液、例えば、皮膚用クレンジング溶液、モイストクリーニングクロス、オイルまたは粉末に入れる抗バイオフィルム活性物質として適する。挫瘡中で発生する支配的微生物であるアクネ菌は、バイオフィルム中に居住可能である。従って、Ｄ−アミノ酸は、挫瘡管理に使うパーソナルケア組成物として特に適切である。従って、本発明は、また、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸および化粧用として許容できるキャリアまたはアジュバントを含むパーソナルケア製品に関する。
【００８８】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、各種のパーソナルケアに使われる製品に抗バイオフィルム特性を付与するのに適する。パーソナルケア製品は、製品全体重量ベースで約０．０１％〜約１５重量％、例えば、約０．１重量％〜約１０重量％、または０．０１重量％〜１５重量％、例えば、０．１重量％〜１０重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および化粧品として許容できるアジュバントを含んでもよい。パーソナルケア製品の形態に応じて、このような製品は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸に加えて、さらなる成分、例えば、金属イオン封鎖剤、着色剤、香油、肥厚または凝固剤（稠度調節剤）、皮膚軟化薬、ＵＶ吸収剤、皮膚保護剤、抗酸化剤、機械的性質を改善する添加物、例えば、ジカルボン酸および／またはＣ１４〜Ｃ２２脂肪酸のアルミニウム、亜鉛、カルシウムまたはマグネシウム塩、および、任意選択の防腐剤を含んでもよい。
【００８９】
一実施形態では、Ｄ−アミノ酸含有抗挫瘡組成物は、少なくとも１つの抗菌剤を更に含むことができる。好ましくは、抗菌剤は抗生物質である。抗生物質は、トブラマイシン、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、リファンピン、トリクロサン、オキスフロキサシン、マクロライド、ペニシリン、セファロスポリン、アモキシシリン／ｃｌａｖｕｌａｎｔｅ、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、アモキシシリン／スルバクタム、メトロニダゾール、フルオロキノロン、キノロン、ケトライド、またはアミノグリコシドからなる群より選択できる。本発明は、挫瘡を管理する方法を提供し、挫瘡に苦しんでいる患者に有効量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸含有抗挫瘡組成物を投与することを含み、抗挫瘡組成物中のＤ−アミノ酸は、バイオフィルムの防止、低減、阻害または除去に充分な量が含まれる。
【００９０】
パーソナルケア製品は、油中水型または水中油型乳剤、アルコールまたはアルコール含有製品、イオン性または非イオン性両親媒性脂質の小胞性分散液、ゲル、固体スティックまたはエアロゾル製品の形であってもよい。油中水型または水中油型乳剤として、化粧用として許容可能なアジュバントは、好ましくは、約５％〜約５０％のオイル相、約５％〜約２０％の乳化剤および約３０％〜９０％の水、または５％〜５０％のオイル相、５％〜２０％の乳化剤および３０％〜９０％の水を含む。オイル相は、化粧品に適した任意のオイル、例えば、１つまたは複数の炭化水素オイル、ろう、天然オイル、シリコーンオイル、脂肪酸エステルまたは脂肪酸アルコールを含んでもよい。好ましいモノまたはポリオールは、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセリンおよびソルビトールである。
【００９１】
本明細書記載の化粧品処方は、種々の分野で使用できる。このような製品には、例えば、非制限的に、下記が含まれる：
−スキンケア製品、例えば、錠剤型または液体石けんの形の皮膚洗浄およびクレンジング剤、合成デタージェントまたは洗浄ペースト、
−入浴剤、例えば、液体（泡沫浴、乳剤、シャワー剤）または固体浴剤、例えば、入浴用固形香料およびバスソルト；
−スキンケア製品、例えば、皮膚乳剤、マルチエマルジョンまたはスキンオイル；
−化粧用パーソナルケア製品、例えば、デイクリームまたは粉末クリーム、フェースパウダー（ルーズまたは圧密）、ほお紅またはクリーム化粧品、アイケア製品、例えば、アイシャドウ製品、マスカラ、アイライナー、アイクリームまたはアイフィックスクリーム；リップケア製品、例えば、口紅、リップグロス、リップペンシル、ネイルケア製品、例えば、マニキュア、ネイルリムーバー、ネイルハードナーまたはキューティクルリムーバーの形のフェイシャル化粧品；
−インティメイト・ハイジーン製品、例えば、インティメイトウオッシングローションまたはインティメイトスプレー；
−フットケア製品、例えば、フットバス、フットパウダー、フットクリームまたはフットケアバルサム、特殊デオドラント剤および制汗剤または角質除去剤；
−光防御剤、例えば、サンミルク、ローション、クリームまたはオイル、サンブロックまたはトロピカル日焼け防止剤、日焼け前製剤または日焼け後製剤；
−日焼け剤、例えば、セルフタンニングクリーム；
−脱色剤、例えば、皮膚漂白剤または皮膚美白剤；
−防虫剤、例えば、防虫オイル、ローション、スプレーまたはスティック；
−デオドラント剤、例えば、デオドラントスプレー、ポンプ式スプレー、デオドラントゲル、スティックまたはロールオン；
−制汗剤、例えば、制汗剤スティック、クリームまたはロールオン；
−ブレミッシュドスキンのクレンジングおよびケア用製品、例えば、合成デタージェント（固体または液体）、ピーリングもしくはこすり落とし剤またはピーリングマスク剤；
−化学的脱毛剤（脱毛術）、例えば、脱毛パウダー、液体脱毛剤、クリームまたはペーストタイプ脱毛剤、ゲル型またはエアロゾルフォーム型脱毛剤；
−シェービング剤、例えば、シェービングソープ、発泡シェービングクリーム、非発泡シェービングクリーム、フォームおよびゲル、ドライシェービング用プレシェイブ用品、アフターシェイブズまたはアフターシェイブローション；
−香料剤、例えば、フレグランス（オーデコロン、オードトワレ、オードパフューム、パルファン・ド・トワレ、パフューム）、香油またはパフュームクリーム；
−デンタルケア、入れ歯ケアおよび口腔ケア製品、例えば、練り歯磨き、ゲル練り歯磨き、歯磨き粉、うがい薬濃縮剤、抗プラークうがい薬、入れ歯洗浄剤または入れ歯固定剤；
−化粧用ヘアトリートメント製品、例えば、シャンプーおよびコンディショナーの形の洗髪剤、ヘアケア製品、例えば、プレトリートメント製品、ヘアトニック、スタイリングクリーム、スタイリングジェル、ポマード、ヘアリンス、トリートメントパック、ヘアーインテンシブトリートメント、髪型固定剤、例えば、パーマ用毛髪ウエーブ剤（ホットパーマ、マイルドパーマ、コールドパーマ）、縮毛矯正剤、液体セッティング剤、ヘアフォーム、ヘアスプレー、漂白剤、例えば、過酸化水素溶液、ライトニングシャンプー、漂白クリーム、漂白パウダー、漂白ペーストまたはオイル、自己酸化染料、または天然ヘア着色剤、例えば、シコウカまたはカモミール含有、一時的、半永久的または永久的ヘア着色剤。
【００９２】
下記は、調製可能な種々の、１つまたは複数のＤ−アミノ酸含有製剤の非制限的例を示す。１つまたは複数のＤ−アミノ酸を種々の濃度で容易に組み込むことが可能な多種多様な類似の製品が当技術分野で既知である。
【００９３】
代表的石けんは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、０．３〜１重量％の二酸化チタン、１〜１０重量％のステアリン酸、例えば、獣脂脂肪酸またはココナッツ脂肪酸、またはグリセリンのナトリウム塩の石けん基剤添加物１００重量％。
【００９４】
代表的シャンプーは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、１２．０重量％のラウレス−２硫酸ナトリウム、４．０重量％コカミドプロピルベタイン、３．０重量％のＮａＣｌおよび水の添加物１００重量％。
【００９５】
代表的デオドラントは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、６０重量％のエタノール、０．３重量％の香油、および水添加物１００重量％。
【００９６】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸医薬組成物を投与して、生物学的関連表面または基質上のバイオフィルム形成を防ぐまたは低減させる。非限定的例として、これらの表面には、気道、肺、口腔、消化管および腟管、耳の内部または目の表面および尿路の上皮または粘膜表面が含まれる。例えば、バイオフィルムは、肺（例えば、肺炎、嚢胞性繊維症、またはＣＯＰＤ患者の肺）の表面、例えば、肺の上皮細胞の表面に悪影響を与える。
【００９７】
特定の実施形態では、表面は、生物学的関連表面であり、体液、例えば、患者の液体成分、例えば、血液、血清、痰、涙腺分泌物、精液、尿、腟分泌物等に接触しがちな表面、および組織試料、等である。生物学的関連表面は、医療機器、装置、またはインプラントの構成要素であってもよい。非制限的例には、クランプ、鉗子、ハサミ、皮膚単鉤、管（例えば、気管内または消化器系チューブ）、ニードル、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、留置カテーテルを含むカテーテル（例えば、泌尿器カテーテル、血管カテーテル、腹膜透析カテーテル、中心静脈カテーテル）、カテーテル部品（例えば、ニードル、ルアーロックコネクター、無針コネクタ）、矯正装置、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、シャント、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡が含まれる。本発明は、長期移植に適合した医療機器の表面上のバイオフィルム蓄積のリスクを実質的に減らす目的に特に適しており、医療機器が約３０日〜約１２ヶ月以上の比較的長期間のあいだ、また、このようなバイオフィルムの痂皮形成および閉塞に起因する装置の早期故障の可能性に対し、移植したまま保持することが意図されている。しかし、このような痂皮形成は、例えば、３０日以下のより短期間後の医療機器で発生する可能性があり、しかも、長期移植装置でも同様であると考えられている。例えば、特定の実施形態では、長期間利用される医療機器は、２４時間以上の長期間、例えば、１週間、移植されている可能性がある。
【００９８】
特定の例では、患者は、医療機器、カテーテル、ステント、人工器官、等の移植／挿入、または創傷被覆材の適用の前、その間、またはその後に、Ｄ−アミノ酸の投与を受けることができる。一部の例では、創傷被覆材には、抗菌剤、例えば、銀が含まれる。移植前またはその後の治療は、移植の直前もしくは直後または移植の数時間前もしくは後に行ってもよく、また、熟練した医師が適切と見なす回数で、１回でも複数回行ってもよい。
【００９９】
Ｄ−アミノ酸は、任意の既知の手段により、例えば、治療的量のＤ−アミノ酸を、表面に被覆する、コーティングする、接触させる、近づける、充填する、または負荷することにより、表面に適用できる。具体的な例では、Ｄ−アミノ酸は、表面にポリマー／Ｄ−アミノ酸フィルムをスプレーすることにより、表面をポリマー／Ｄ−アミノ酸溶液に浸漬することにより、または他の共有結合または非共有結合手法により直接表面に貼り付けられる。他の例では、表面は、Ｄ−アミノ酸を吸収する物質（例えば、ヒドロゲル）で被覆される。
【０１００】
組成物は、コーティングまたはフィルムであってもよい。フィルムまたはコーティングの一部として適用する場合は、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸は、結合剤をも含む組成物の一部としてもよい。結合剤は、本抗バイオフィルムと適合する任意のポリマーまたはオリゴマーであってよい。結合剤は、抗バイオフィルム組成物調製の前のポリマーまたはオリゴマーの形であってもよく、または、基質への適用後を含む調製の間または後の重合により形成されてもよい。特定の適用、例えば、特定のコーティング適用では、適用後の抗バイオフィルム組成物オリゴマーまたはポリマーを架橋させることが望ましいであろう。本明細書で使われる用語の「結合剤」には、材料、例えば、医薬品およびパーソナルケア産業で商業的に使用されているグリコール、オイル、ろうおよび界面活性剤が含まれる。一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ（Ｇ．Ｒ．Ａ．Ｓ．））材料が好ましい。
【０１０１】
組成物が、例えば、カレンダー仕上げまたは共押し出しを含む接着剤の使用または溶融塗布により表面に適用される熱可塑性フィルムの場合は、結合剤は、フィルム調製に使用される熱可塑性ポリマー基質である。組成物がコーティングの場合には、組成物は、液体溶液または懸濁液、ペースト、ゲル、オイルとして適用でき、またはコーティング組成物は、固体、例えば、粉末コーティングでもよく、これは、その後、熱、ＵＶ光他の方法により硬化される。
【０１０２】
本発明の組成物は、コーティングまたはフィルムでもよいので、結合剤は、コーティング調製またはフィルム調製に使用される任意のポリマーを含むことができる。例えば、結合剤は、熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーである。熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーには、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、不飽和ポリアミド、ポリイミド、シリコン含有およびカルバマートポリマー、フッ素化ポリマー、置換アクリルエステル由来、例えば、エポキシアクリラート、ウレタンアクリラートまたはポリエステルアクリラート由来架橋性アクリル樹脂が含まれる。また、ポリマーは、前出材料の混合物でも、共重合体でもよい。
【０１０３】
生体適合性コーティングポリマー、例えば、ポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］（ＰＨＡＥ）ポリエステル（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５２、６５−７０（２００４））もまた、本発明の結合剤として使用可能である。アルキド樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、シリコーン含有ポリマー、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、フッ素化ポリマーおよびビニルアセタートポリマー、ビニルアルコールおよびビニルアミンは、本発明に有用な通常のコーティング結合剤の非制限的例である。他の既知のコーティング結合剤は、本開示の一部である。
【０１０４】
コーティングは、例えば、メラミン樹脂、尿素樹脂、イソシアナート、イソシアヌラート、ポリイソシアナート、エポキシ樹脂、無水物、ポリ酸およびアミンで架橋可能であり、アクセラレータを加えても加えなくてもよい。本明細書記載の組成物は、生物蓄積に好適な条件に暴露される表面に適用される、例えば、コーティングであってもよい。前記コーティング中の本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在が、表面への生物の付着を防ぐ。
【０１０５】
コーティングは溶媒ベースでも水性でもよい。水性コーティングは、通常、より環境に優しいと考えられる。一部の例では、コーティングは、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および結合剤または水ベースコーティングもしくはペンキの水性分散液であってもよい。例えば、コーティングは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸およびアクリル、メタクリル酸またはアクリルアミドポリマーもしくはコポリマーまたはポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］ポリエステルの水性分散液を含んでもよい。
【０１０６】
一部の例では、コーティング組成物は、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、へら引き、または刷毛、ローラーまたは他の塗布器を含む任意の従来の手段により表面に塗装できる。乾燥または硬化時間を考慮して適用してもよい。
【０１０７】
コーティングまたはフィルムの厚さは、用途に応じて変わり得るが、当業者ならわずかな試験の後に容易に決定できる。
【０１０８】
一部の例では、本明細書記載の組成物は、保護用のラミネートフィルムの形であってもよい。このようなフィルムは、熱硬化、熱可塑、エラストマー、または架橋ポリマーを含んでもよい。これらに限定されないが、このようなポリマーの例には、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和のポリエステル、不飽和のポリアミド、ポリイミド、フッ素化ポリマー、シリコン含有およびカルバマートポリマーが含まれる。ポリマーは、また、前述の材料の混合物および共重合体であってもよい。
【０１０９】
本明細書記載の組成物がプリフォームフィルムである場合は、例えば、接着剤の使用、または表面上への共押し出しにより表面に適用可能である。また、本発明のエステルを採用するのが好都合でもあり得るシーラントまたはコーキングの使用が必要と思われる締め具を介して機械的に貼り付けることもできる。プラスチックフィルムは、また、カレンダー仕上げ、溶融塗布およびシュリンクラップを含む熱を使った適用が可能である。
【０１１０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸の広範囲の適用を考えると、Ｄ−アミノ酸含有組成物は、他の添加物、例えば、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、ヒンダードアミン、ホスフィットまたはホスホニット、ベンゾフラン−２−オン、チオ相乗剤、ポリアミド安定剤、金属ステアラート、核形成剤、充填剤、強化剤、潤滑剤、乳化剤、染料、顔料、分散剤、他の光学的光沢剤、難燃剤、帯電防止剤、発泡剤、等、例えば、下記に列挙した材料、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【０１１１】
プラスチックから調製される医療機器は、成形中に、例えば、成形プロセスの間にＤ−アミノ酸を組み入れることができる。本方法により利益を得るプラスチックベース医療機器には、これらに限定されないが、医薬の分野で使われるプラスチック製品、例えば、包帯材料、注射器、カテーテル、等、いわゆる「医療機器」、手袋およびマットレスが含まれる。このようなプラスチックスの代表例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＣ、ＰＯＭ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルおよびメタクリル酸、ポリブタジエン、熱可塑性ポリオレフィン、アイオノマー、不飽和ポリエステルならびにＡＢＳ、ＳＡＮおよびＰＣ／ＡＢＳを含むポリマー樹脂の混合物である。
【０１１２】
Ｄ−アミノ酸、特に低濃度のものは、摂取の可能性のある用途、例えば、バイオフィルム発生の可能性のある再利用可能水ボトルまたは飲用容器であっても安全に使用可能である。このような水輸送機器の表面は、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を含む製剤で洗浄可能であり、または低レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、導管を通過する水の中に導入可能である。例えば、約０．０００１重量％未満または約１重量％までの、典型的には、約０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をこのような水中に導入できる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．１％、例えば、約０．０００００１％〜約０．０１％、または約０．０００００１％〜約０．００１％、または０．０００００１％〜０．１％、０．０００００１％〜０．０１％、または０．０００００１％〜０．００１％の濃度が、このような用途に使用可能である。
【０１１３】
コーティングまたはフィルムで使用される場合は、少量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が、短期の使用、例えば、単回使用、季節的または廃棄用品、特にスプリント、カテーテル、管、歯科設備等、ヒトとの接触の可能性のある用途に提示可能である。一般的に、重量ベースで、約０．００１％未満から約５％まで、例えば、約３％までもしくは約２％まで、または好ましくは０．００１％未満から５％まで、３％までもしくは２％までの１つまたは複数のアミノ酸をこのようなコーティングまたはフィルムに使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．５％、または約０．０００１％〜約０．０１％、または好ましくは、０．０００１％〜１％、０．０００１％〜０．５％、もしくは０．０００１％〜０．０１％の濃度の１つまたは複数のＤ−アミノ酸がコーティング用途で使用可能である。
【０１１４】
成形プラスチック製品への組込みに対しては、約０．００００１％〜約１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能で、例えば、重量ベースで、約０．０００１％〜約３％、例えば、約０．００１％から約１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、または好ましくは、０．００００１％〜１０％、０．０００１％〜３％、０．００１％から１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。すでに成形済みの製品または線維の表面中にＤ−アミノ酸が含浸された状況では、表面に存在するＤ−アミノ酸の実際の量は、基質材料、含浸組成物の配合、および含浸ステップの間に使われた時間と温度に依存すると思われる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．１％、もしくは約０．０００１％〜約０．０１％の濃度がプラスチックスに使用可能であり、または好ましくは、０．０００１％〜１％、０．０００１％〜０．１％、もしくは、０．０００１％〜０．０１％の１つまたは複数のアミノ酸が使用可能である。
【０１１５】
Ｄ−アミノ酸を使った治療によるバイオフィルムの阻害または減少は、当技術分野で充分に確立された技術を使って測定できる。これらの技術は、吸着生物の発色を測定し、顕微鏡法を使ってインビボで微生物を観察することにより細菌の付着を評価すること、または毒性試薬に応答したバイオフィルム中の細胞死をモニターすることを可能にする。治療後、バイオフィルムは、バイオフィルムに覆われている表面積、厚さ、および一貫性（例えば、バイオフィルムの健全性）を減らすことができる。バイオフィルムアッセイの非制限的例には、マイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイ、蛍光ベースバイオフィルムアッセイ、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６９３-３７０１（２００５）による静的バイオフィルムアッセイ、空気液体界面アッセイ、コロニーバイオフィルムアッセイ、およびＫａｄｏｕｒｉ Ｄｒｉｐ−Ｆｅｄバイオフィルムアッセイ（Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、（２００５）微生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１．Ｂ．１．１−１．Ｂ．１．１７）が含まれる。このようなアッセイは、バイオフィルム形成の破壊または阻害に対するＤ−アミノ酸の活性の測定に使用できる（Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７（６）：６６３−７２；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００６）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ５（１）：３２−６）。
【０１１６】
他の例では、治療は、細菌の増殖を測定することによりアッセイ可能であり、および／または生物試料中のバイオフィルム形成細菌の密度を測定することにより定量可能である。生物試料の非制限的例には、血液、血清、痰、涙腺分泌物、精液、尿、腟分泌物、および組織試料が含まれる。細菌の増殖の減少は、また、胸部Ｘ線または肺の機能試験（ＰＦＴ）（例えば、肺活量測定または強制呼気量（ＦＥＶ１））により測定可能である。
【０１１７】
他の状況では、バイオフィルム産生細菌の存在または増殖は、例えば、上述の生物試料中のバイオフィルム産生細菌の抗原の存在を検出することにより測定可能である。例えば、肺炎球菌成分に対する抗体は、例えば、生物試料中の連鎖球菌抗原の存在をアッセイすることにより、バイオフィルム関連状態または障害に苦しんでいる患者のコロニー形成／感染をアッセイするために使用できる。このような抗体は、当技術分野で充分に確立された方法に従って産生することができ、または、市販品として入手することができる（例えば、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；またはＧｅｎｅＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、から）。
【０１１８】
Ｄ−アミノ酸によるバイオフィルム関連障害の治療のための適切な治療薬は、当技術分野で充分に確立された技術を使って決定できる。例えば、哺乳動物を使った動物モデルを使用して、Ｄ−アミノ酸を使った治療の有効性を評価可能である。非制限的例には、ポリマービーズ、例えば、Ｄ−アミノ酸を加えたポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）ビーズをラットに移植し、バイオフィルムを防ぐ能力を評価することが含まれる。ラット中のポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）ビーズおよびウサギ中のカテーテルは、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成のための動物モデルとして使用されている。Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｚｏ ｅｔ ａｌ．、抗微生物剤および化学療法（ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ）、Ｊｕｌｙ ２００７、ｐ．２５９４-２５９６、およびＢｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、Ｊｕｌｙ ２００４、ｐ．４６６５-４６８４を参照。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
併用療法
ごく一般的には、バイオフィルムは、生存または非生存微生物、特に、細菌の集合体であり、細胞外高分子物質（ＥＰＳ基質）、例えば、多糖類の形のそれらの代謝物と一緒に、生存および非生存表面に付着している、と理解されている。通常、浮遊細胞に対して顕著な増殖阻害または致死作用を示す抗バイオフィルム物質の活性は、例えば、生物学的基質中への活性物質の不十分な浸透のために、バイオフィルム中に組み込まれた微生物に関しては大きく低減する可能性がある。
【０１２０】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは第２の試薬、例えば、殺生物剤、抗生物質、または抗菌剤と組み合わせて投与し、バイオフィルムを治療する、またはバイオフィルムの形成を防ぐことができる。抗生物質は、Ｄ−アミノ酸と順次に、または同時に投与してもよい。例えば、いずれかの本明細書記載の組成物は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸および１つまたは複数の第２の試薬を含むように処方できる。
【０１２１】
抗生物質は、細菌の増殖を阻害する、または細菌を死滅させ得る当業者に既知の任意の化合物でよい。有用な抗生物質の非制限的例には、リンコサミド（クリンダマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）；アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）；ベータ−ラクタム（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム）；糖ペプチド抗生物質（例えば、バンコマイシン）；ポリペプチド抗生物質（例えば、バシトラシン）；マクロライド（エリスロマイシン）、アンフォテリシン；スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェナイド、ｐ‐アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗シュードモナス（例えば、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン）またはそれらのいずれかの塩もしくは変異体が含まれる。このような抗生物質は、市販品として、例えば、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ、Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、およびＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）から入手可能である。使用される抗生物質は、細菌感染のタイプに依存する。
【０１２２】
追加の既知の殺生物剤には、ビグアナイド、クロルヘキシジン、トリクロサン、二酸化塩素、等が含まれる。
【０１２３】
抗菌剤の有用な例には、これらに限定されないが、次のものが含まれる：ピリチオン、特に、亜鉛錯体（ＺＰＴ）；Ｏｃｔｏｐｉｒｏｘ（登録商標）；ジメチルジメチロールヒダントイン（Ｇｌｙｄａｎｔ（登録商標））；メチルクロロイソチアゾリノン／メチルイソチアゾリノン（Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（登録商標））；ナトリウムスルフィット；ナトリウムビスルフィット；イミダゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｌｌ １１５（登録商標））、ジアゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｉｌｌ ＩＩ（登録商標））；ベンジルアルコール；２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ（登録商標））；ホルマリン（ホルムアルデヒド）；ヨードプロペニルブチルカルバマート（Ｐｏｌｙｐｈａｓｅ Ｐ１００（登録商標））；クロルアセトアミド；メタンアミン；メチルジブロモニトリルグルタロニトリル（１、２−ジブロモ−２、４−ジシアノブタンまたはＴｅｋｔａｍｅｒ（登録商標））；グルタルアルデヒド；５−ブロモ−５−ニトロ−１、３−ジオキサン（Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標））；フェネチルアルコール；ｏ−フェニルフェノール／ナトリウムｏ−フェニルフェノール；ナトリウムヒドロキシメチルグリシナート（Ｓｕｔｔｏｃｉｄｅ Ａ（登録商標））；ポリメトキシ二環式オキサゾリジン（ＮｕｏｓｅｐｔＣ（登録商標））；ジメトキサン；チメロサール；ジクロロベンジルアルコール；カプタン；クロルフェネシン；ジクロロフェン；クロロブタノール；グリセリルラウラート；ハロゲン化ジフェニルエーテル；２、４、４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシ−ジフェニルエーテル（トリクロサン（登録商標）またはＴＣＳ）；２、２’−ジヒドロキシ−５、５’−ジブロモ−ジフェニルエーテル；フェノール性化合物；フェノール；２−メチルフェノール；３−メチルフェノール；４−メチルフェノール；４−エチルフェノール；２、４−ジメチルフェノール；２、５−ジメチルフェノール；３、４−ジメチルフェノール；２、６−ジメチルフェノール；４−ｎ−プロピルフェノール；４−ｎ−ブチルフェノール；４−ｎ−アミルフェノール；４−ｔｅｒｔ−アミルフェノール；４−ｎ−ヘキシルフェノール；４−ｎ−ヘプチルフェノール；モノおよびポリアルキルおよび芳香族ハロフェノール；ｐ−クロロフェノール；メチルｐ−クロロフェノール；エチルｐ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｐ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｐ−クロロフェノール；ｎ−アミルｐ−クロロフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−クロロフェノール；シクロヘキシルｐ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｐ−クロロフェノール；ｎ−オクチルｐ−クロロフェノール；ｏ−クロロフェノール；メチルｏ−クロロフェノール；エチルｏ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｏ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｏ−クロロフェノール；ｎ−アミルｏ−クロロフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｏ−クロロフェノール；ｏ−ベンジルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ；ｍ−ジメチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；３−メチルｐ−クロロフェノール；３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−ｎ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−エチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−ブチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−イソ−プロピル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ジエチルメチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−２−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−ｓｅｃ−アミル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；２−ジエチルメチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−オクチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール：ｐ−ブロモフェノール；メチルｐ−ブロモフェノール；エチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−プロピルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ブチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｐ−ブロモフェノール；シクロヘキシルｐ−ブロモフェノール；ｏ−ブロモフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−ブロモフェノール；ｎ−プロピル−ｍ、ｍ−ジメチルｏ−ブロモフェノール；２−フェニルフェノール；４−クロロ−２−メチルフェノール；４−クロロ−３−メチルフェノール；４−クロロ−３、５−ジメチルフェノール；２、４−ジクロロ−３、５−ジメチルフェノール；３、４、５、６−テラブロモ−２−メチルフェノール；５−メチル−２−ペンチルフェノール；４−イソプロピル−３−メチルフェノール；パラ−クロロ−メタ−キシレノール（ＰＣＭＸ）；クロロチモール；フェノキシエタノール；フェノキシイソプロパノール；５−クロロ−２−ヒドロキシジフェニルメタン；レゾルシノールおよびその誘導体；レゾルシノール；メチルレゾルシノール；エチルレゾルシノール；ｎ−プロピルレゾルシノール；ｎ−ブチルレゾルシノール；ｎ−アミルレゾルシノール；ｎ−ヘキシルレゾルシノール；ｎ−ヘプチルレゾルシノール；ｎ−オクチルレゾルシノール；ｎ−ノニルレゾルシノール；フェニルレゾルシノール；ベンジルレゾルシノール；フェニルエチルレゾルシノール；フェニルプロピルレゾルシノール；ｐ−クロロベンジルレゾルシノール；５−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；５−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；ビスフェノール酸化合物；２、２’−メチレンビス−（４−クロロフェノール）；２、２’−メチレンビス−（３、４、６−トリクロロフェノール）；２、２’−メチレンビス（４−クロロ−６−ブロモフェノール）；ビス（２−ヒドロキシ−３、５−ジクロロフェニル）スルフィド；ビス（２−ヒドロキシ−５−クロロベンジル）スルフィド；安息香酸エステル（パラベン）；メチルパラベン；プロピルパラベン；ブチルパラベン；エチルパラベン；イソプロピルパラベン；イソブチルパラベン；ベンジルパラベン；ナトリウムメチルパラベン；ナトリウムプロピルパラベン；ハロゲン化カルバニリド；３、４、４’−トリクロロカルバニリド（トリクロカーバン（登録商標）またはＴＣＣ）；３−トリフルオロメチル−４、４’−ジクロロカルバニリド；３、３’、４−トリクロロカルバニリド；クロルヘキシジンおよびそのジグルコナート；ジアセタートおよびジヒドロクロリド；ウンデセン酸；チアベンダゾール、ヘキセチジン；ポリ（ヘキサメチルエネビグアニド）塩酸塩（Ｃｏｓｍｏｃｉｌ（登録商標））；銀化合物、例えば、有機銀塩またはＪＭ Ａｃｔｉｃａｒｅ（登録商標）および微粒子化した銀粒子等のそれらの製剤を含む無機銀塩、銀塩化物。
【０１２４】
バイオフィルム関連障害
Ｄ−アミノ酸を使った方法および治療は、生物体の増殖を阻害することもなく、またはことさら阻害することなく、バイオフィルムの形成の阻害または防止することを含み、また、一旦形成されたバイオフィルムの破壊を含む。
【０１２５】
Ｄ−アミノ酸は、患者のバイオフィルム形成を減らす有効量のＤ−アミノ酸を患者に投与することにより、患者のバイオフィルム関連障害を治療するために使用できる。細菌増殖の減少は、患者のバイオフィルム産生の減少または阻害を表す。
【０１２６】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム成形細菌の表面への付着を減少させることにより、または細菌の死滅を増やすことにより、バイオフィルム形成を阻害または低減することができる。この治療手法は、バイオフィルム関連障害もしくは状態、または微生物のバイオフィルム形成に関連した医療機器関連感染症の治療のために使用可能である。
【０１２７】
バイオフィルム関連障害の非制限的例には、中耳炎、前立腺炎、膀胱炎、気管支拡張症、細菌性心内膜炎、骨髄炎、虫歯、歯周病、感染性腎結石、挫瘡、レジオネラ症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および嚢胞性繊維症が含まれる。一具体的例では、嚢胞性繊維症患者は、肺と消化管中にバイオフィルムの蓄積が認められる。ＣＯＰＤ、例えば、肺気腫および慢性気管支炎に罹患している患者は、気道の特徴的炎症を示し、この気道を通り、その後、肺から出ていく気流が慢性的に妨害される。
【０１２８】
バイオフィルム関連障害は、また、移植／挿入機器由来の感染である医療機器関連感染症、例えば、胆汁ステント由来の感染、整形外科インプラント感染、およびカテーテル関連感染（腎臓、血管、腹膜）を包含してもよい。また、感染は、皮膚および／または軟組織の健全性が損なわれている部位から始まる可能性がある。非制限的例には、皮膚炎、末梢血管疾患由来潰瘍、火傷、および外傷が含まれる。例えば、グラム陽性菌、例えば、肺炎球菌は、このような組織の日和見感染の原因になりうる。肺炎球菌の火傷部位に感染する能力は、例えば、皮膚の破損、火傷関連免疫不全、および抗生物質選択により強化される。
【０１２９】
一部の例では、患者は治療される。患者は、霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳動物であってもよい（これらに限定されない）。患者は、非ヒト動物、例えば、トリ（例えば、ウズラ、ニワトリ、もしくはシチメンチョウ）、家畜（例えば、雌ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、もしくはヒツジ）、ペット（例えば、ネコ、イヌ、もしくはモルモット、ラット、もしくはマウス）、または実験動物（例えば、障害用動物モデル）であってもよい。非制限的な代表的患者は、ヒト乳児、思春期前小児、青年、成人、または中年／高齢成人であってもよい。
【０１３０】
一部の例では、治療を必要としている患者は、１つまたは複数の本明細書記載の感染または障害に罹患している患者でありうる。一部の例では、患者は、生物学的関連表面でバイオフィルムを発生する危険に曝されている、または既にこのようなバイオフィルムを発生させている。このような危険に曝されている患者は、Ｄ−アミノ酸による治療の候補であり、これにより、バイオフィルム産生関連障害／状態の発生または発症を阻害する、またはバイオフィルム関連障害または状態の１つまたは複数の症状の再発、発症、もしくは進行を防ぐことができる。このような患者は、当業者には臨床的に明らか、または検出可能であるが、まだ完全には形成されていない未成熟バイオフィルムを宿している可能性がある。留置装置、例えば、医療機器の移植が予定されている患者もまた、バイオフィルム発生の危険のある患者である。また、バイオフィルム発生の危険は、バイオフィルム関連疾患（例えば、嚢胞性繊維症に関連するチャネルトランスポーター変異の存在）の発生の傾向に起因する可能性がある。このようなバイオフィルム関連障害の患者は、初期段階、例えば、細菌感染および／またはバイオフィルム形成がまだ検出されない段階にある可能性がある。
【０１３１】
特定の例では、本明細書記載の方法は、嚢胞性繊維症患者の気道中のバイオフィルム形成を防ぐために使用可能である。このような患者は、気道の細菌感染のない間に、または細菌感染の検出時に治療できる。
【０１３２】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これは、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではない。室温は、２０〜２５℃の範囲の温度を示す。
【実施例】
【０１３３】
材料と方法
株と培地。 Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃またはＭＳｇｇ培地（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１６２１（２００１））中、２３℃で枯草菌ＮＣＩＢ ３６１０およびその誘導体を成長させた。固形培地には、１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒを添加した。必要な場合は、枯草菌の増殖用に抗生物質を次の濃度で添加した：テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、およびエリスロマイシン５μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌ。
【０１３４】
本実験で使った株：
全枯草菌株は、強固なバイオフィルムを形成する野生株のＮＣＩＢ３６１０の誘導体である（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）） ；
株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ ｃａｔ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ ｓｐｅｃ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＩＫＧ５５（ΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃ ΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲ） ；
株ＤＲ−３０（ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｃａｔ）；
株ＩＫＧ４０（ｙｑｘＭ２）；
株ＩＫＧ４４（ｙｑｘＭ６）；
株ＩＫＧ５０（ｙｑｘＭ２ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
株ＩＫＧ５１（ｙｑｘＭ６ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
ブドウ球菌ＳＣ０１（Ｋｏｌｔｅｒ ｌａｂコレクション由来）。
【０１３５】
株構築。標準的手法を使って株を構築した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ、２００１）。ロングフランキングＰＣＲ変異誘発を使ってΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃおよびΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲを生成した（Ｗａｃｈ、Ｙｅａｓｔ １２：２５９（１９９６））。ＤＮＡを、コンピテント細胞のＤＮＡ媒介形質転換により、株ＰＹ７９誘導体中に導入した（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：３１８（１９７８））。ＳＰＰ１ファージ媒介形質導入を使って、抗生物質耐性結合変異をＰＹ７９誘導体からＮＣＩＢ ３６１０中に導入した（Ｙａｓｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１３４３（１９７４））。
【０１３６】
試薬。 アミノ酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。１４Ｃ−Ｄ−チロシンおよび１４Ｃ−Ｌ−プロリンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１３７】
コロニーおよびペリクル形成。固形培地上へのコロニー形成形成のために、細胞を最初にＬＢ培地中で指数増殖期迄増殖し、３μｌの培養液を１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ含有固形ＭＳｇｇ培地上に配置した。プレートを２３℃でインキュベートした。液体培地中のペリクル形成のために、細胞を指数増殖期迄成長させ、１２ウエルプレート（ＶＷＲ）中で、６μｌの培養液を６ｍｌの培地と混合した。プレートを２３℃でインキュベートした。コロニーとペリクルの画像をＳＰＯＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で撮影した。
【０１３８】
馴化培地の調製。ＬＢ培地中で細胞を指数増殖期まで成長させた。０．１ｍｌの培養液を１００ｍｌのＭＳｇｇ培地に添加し、５００ｍｌビーカー中、２３℃で振盪を加えずに成長させた。次に、遠心分離を使って８、０００ｒｐｍ、１５分間ペリクルおよび馴化培地を集めた。馴化培地（上清液）を取りだし、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾液を２４℃で貯蔵した。さらなる精製のために、Ｃ−１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカートリッジを使って、５％毎のステップの０％〜１００％メタノールによる段階的溶出により、バイオフィルム阻害活性を分別した。
【０１３９】
馴化培地中のＤ−アミノ酸の特定および定量化。（Ａ）アミノ酸の定量化。Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐの標準溶液を種々の濃度（０．００１〜０．２ｍＭ）で調製した。これらの溶液を０％〜６０％から１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）のステップ勾配溶媒系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ ４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）の（０−１２−２０分）の条件でＬＣ／ＭＳで分析し、イオンカウント積分により各アミノ酸濃度の検量線を得た。馴化培地試料を、全４つのキラルアミノ酸の全体濃度測定と同じ方法でＬＣ／ＭＳを使って分析した。（Ｂ）Ｄ−アミノ酸の特定。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥し、１００μＬの１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解した。１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ＦＤＡＡ（Ｎ−（２、４−ジニトロ−５−フルオロ−フェニル）−Ｌ−アラニンアミド）溶液をアセトン中で調製し、５０μＬのアセトン溶液を１Ｎ ＮａＨＣＯ３中の試料に添加した。反応混合物を８０℃で５分間インキュベートし、５０μＬの２Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。誘導体を、１０％〜１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）の勾配溶媒系を使って３０分間にわたりＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣ／６１３０シリーズＭＳ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）を使って分析した。Ｌ−ＦＤＡＡ−アミノ酸の保持時間をＬ−ＦＤＡＡ真性標準アミノ酸と比較した。
【０１４０】
クリスタルバイオレット染色。細胞を６ウエルプレートで成長させたこと以外は、以前記載したのと同様にクリスタルバイオレット染色を行った（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９５（１９９８））。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄し、完全に乾燥した。
【０１４１】
蛍光顕微鏡観察。蛍光顕微鏡分析用として、１ｍｌの培養液を採取した。細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５０μｌのＰＢＳ緩衝液中に懸濁した。カバースライドをポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。試料をＯｌｙｍｐｕｓワークステーションＢＸ６１顕微鏡を使って調査した。自動化ソフトウェアプログラムＳｉｍｐｌｅＰＣＩを使って画像を取り込み、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って解析した。
【０１４２】
透過型電子顕微鏡観察および免疫標識。試料を蒸留水で希釈し、炭素またはホルムバール／炭素被覆グリッド上に吸着させた。真空エバポレーター中でグロー放電で使用する前にグリッド表面を親水性にした。試料がフィルム表面上に吸着されるとすぐに、過剰試料を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で拭き取り、グリッドを５μｌの染色溶液（１〜２％水性ウラニルアセタート）上に数分間浮かべた後、拭き取った。試料を乾燥し、Ｔｅｃｎａｉ（登録商標）Ｇ2ＳｐｉｒｉｔＢｉｏＴＷＩＮ顕微鏡を使い、加速電圧８０ＫＶで調査した。ＡＭＴ ２ｋ ＣＣＤカメラで画像を撮影した。
【０１４３】
ＴａｓＡの免疫局在性のために、ニッケルグリッド上の希釈試料を０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ中の１％脱脂粉ミルクから成るブロッキング緩衝液上に３０分間浮かべ、ブロッキング緩衝液で１：１５０に希釈した抗ＴａｓＡ一次抗体と共に２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ウサギ２０ｎｍ金二次抗体（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に１時間暴露し洗浄した。全てのグリッドをウラニルアセタートおよび鉛シトラートで染色した後、上述のように観察した。
【０１４４】
β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイ。細胞をＭＳｇｇ培地中、３７℃でウォーターバスを使って浸透を加えながら培養した。１ｍｌの培養液を各時点で採取した。β−ガラクトシダーゼ活性を以前に記載の方法と同様に測定した（Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２５４（２００８））。
【０１４５】
アミノ酸の細胞壁への組込み。増殖の指数増殖期の中間点で５０ｍｌの培養液中の細胞を遠心分離により採取し、０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、５ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、１０μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリンで治療し、３７℃で２時間、さらにインキュベートした。全細胞および細胞壁画分の放射能をモニターし、間隔を置いて試料を取り出した。全細胞中への取り込みの測定用として、０．１ｍｌの試料を採取した。細胞壁への取り込みの測定用として、０．５ｍｌの試料を採取した。細胞を遠心分離により採取し、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム含有ＳＭ緩衝液［０．５Ｍショ糖、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭカリウムホスファート、ｐＨ（６．８）］中に再懸濁した。次に、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、得られたプロトプラストを５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により取り出し、細胞壁物質を上清液中に残した。細胞壁画分はタンパク質を含まないことが、抗シグマＡ抗体を使った免疫ブロット法分析により確認された。最後に、１０ｍｌの５％トリクロロ酢酸を全細胞試料および細胞壁物質に添加し、氷上で少なくとも３０分間維持した。ＴＣＡ不溶性物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｍ孔径、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に採取し、５％ＴＣＡで洗浄した。フィルターを風乾し、シンチレーションバイアル中に置き、シンチレーションカウンターを使って、ＴＣＡ不溶性物のカウント／分を測定した。
【０１４６】
実施例１．枯草菌により形成されたバイオフィルム中のＤ−アミノ酸の選別
枯草菌は、バイオフィルムを誘導培地中での３日間のインキュベーション後の静置培養空気／液体界面に分厚いペリクルを形成する（図１Ａ）。しかし、追加の３から５日のインキュベーションにより、ペリクルは、その構造的健全性を失う（図１−Ｂ）。成熟バイオフィルムが、バイオフィルム分解の引き金を引く因子を産生するのかどうかを調べるために、馴化培地の濃縮および部分精製抽出物の新しい培地に添加した場合のペリクル形成に与える効果をアッセイした。この目的のために、８日間培養液由来の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに負荷した。次に、そのカラムからの濃縮した溶出液を、新しく播種した培養液に添加した。等容量の馴化培地由来の物質の２５％に相等する濃縮溶出液の量が、ペリクル形成を防ぐのに充分であった（図１Ｃ）。対照としての、３日間培養液由来の馴化培地を使って調製した追加の濃縮溶出液は、ペリクル形成に対しほとんどまたは全く効果を示さないことが観察された（図１Ｄ）。さらなる因子の精製は、メタノールの濃度増加と共にカートリッジを段階的に溶出することにより達成された。４０％メタノールでの溶出により、ペリクル形成の阻害に対し高度に活性な画分が得られた（図１Ｅ）。しかも、この物質は、細胞成長にはほとんどまたは全く影響を与えなかった。バイオフィルム阻害活性は、１００℃で２時間の加熱およびプロテイナーゼＫ処理に耐性を示した（図１Ｆ）。
【０１４７】
Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンが、液体および固形培地の両方で、枯草菌によるバイオフィルム形成を阻害するものとして選別された（図２Ａ、５、６）。図２Ａは、バイオフィルムを誘導する培地中の新しく播種した培養液中へのＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）の添加の、３日間のインキュベーション後のペリクル形成に対する効果を示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方が、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。同様に、図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充したＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたウエルを示す。Ｄ−アミノ酸のみが、バイオフィルム形成の阻害に対し活性であった。
【０１４８】
図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充した固形ＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートしたプレートを示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方がバイオフィルム形成を阻害した。
【０１４９】
Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンは、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。対照的に対応するＬ−異性体および他のアミノ酸のＤ−異性体、例えば、Ｄ−アラニンおよびＤ−フェニルアラニンは、枯草菌に対するバイオフィルム阻害アッセイで有効ではなかった。
【０１５０】
次に、バイオフィルム形成を防ぐのに必要な最小濃度（ＭＩＣ：最小阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を測定した。図２Ｂに示すように、それぞれのＤ−アミノ酸は、活性が変わり、Ｄ−チロシンが最も有効であった。Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−ロイシンは、約１ｍＭのＭＩＣであり、一方、Ｄ−チロシンは、約１００ｎＭのＭＩＣである。著しいのは、全ての４つのＤ−アミノ酸の混合物（等モル量の）は、特に強力で、１０ｎＭ未満のＭＢＩＣであった。従って、Ｄ−アミノ酸は、相乗的に作用する。Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成を阻害するのみでなく、既存バイオフィルムを破壊した。図２Ｃは、３日間培養液を示し、これに対し、どのアミノ酸も添加されない（未治療）、またはＤ−チロシン（３μＭ）が添加された、またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物が添加されたものに対し、続いて、さらに８時間インキュベーションを行った。Ｄ−チロシンまたは４つのＤ−アミノ酸の混合物の追加により、８時間の間に、ペリクルの顕著な崩壊が起こった。
【０１５１】
Ｄ−アミノ酸は、これらのアミノ酸のα−炭素立体中心をＬ−型からＤ−型へ変換する酵素であるアミノ酸ラセマーゼにより生成される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０３（２００３））。バイオフィルム阻害因子はＤ−アミノ酸であるという考えと一致する遺伝的証拠は、ｙｌｍＥおよびｒａｃＸ、遺伝子の変異体を使って得られ、その予測された産物は、既知のラセマーゼに類似の配列を示した。ｙｌｍＥまたはｒａｃＸ単独に対する株変異体は、ペリクル分解の中程度の遅延を示した（データは示さず）。図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートした、ＮＣＩＢ３６１０（ＷＴ）ならびにｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）に対し２重に欠失した株変異体示す。想定上のラセマーゼである二重変異体細胞により形成されたペリクルの分解が有意に遅延し、ラセマーゼ活性が特異的に低減した株もまた、低減した抗バイオフィルム阻害を示すことを示唆している。また、二重変異体由来馴化培地は、野性型由来の馴化培地とは対照的に、バイオフィルム形成阻害に関し無力であった。図２Ｄは、野性型または二重変異体が有意なバイオフィルム成長を示すｙｌｍＥおよびｒａｃＸの二重株変異体（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地の濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。
【０１５２】
次いで、Ｄ−アミノ酸がバイオフィルム成熟の間に産生されるのかどうか、また、成熟バイオフィルムの分解を説明するのに充分な存在量で産生されるのかどうかを測定した。従って、ＬＣ／ＭＳを行い、続いて、ペリクル形成の初期および後期に採取した馴化培地に対し、Ｎα−（２、４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（Ｌ−ＦＤＡＡ）による誘導体化を使ってＤ−アミノ酸を特定した。Ｄ−チロシン（６μＭ）、Ｄ−ロイシン（２３μＭ）、およびＤ−メチオニン（５μＭ）は、６日目までにバイオフィルム形成を阻害するのに必要な、またはそれ超の濃度で存在したが、３日目には、１０ｎＭ未満の濃度で、例えば、バイオフィルム形成を阻害するのに十分ではないレベルで存在したという結果であった。
【０１５３】
馴化培地と同様に、Ｄ−アミノ酸は、細胞成長を阻害せず、基質オペロンｅｐｓおよびｙｑｘＭの発現も阻害しなかった（図８〜９）。図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える影響を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。Ｄ−アミノ酸治療培養液中の細胞成長は、実質的に未治療試料と同じであった。図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ保有）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ保有）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。この場合も、Ｄ−アミノ酸治療試料にたいするｙｑｘＭおよびｅｐｓ発現は、実質的に未治療試料と同じであった。
【０１５４】
Ｄ−アミノ酸は、細胞壁のペプチドグリカン成分のペプチド架橋中に組み込まれることを以前報告した。確認のため、細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。図３Ａは、放射性Ｄ−チロシンの細胞壁への組込みを示す。１４Ｃ−Ｄ−チロシンを使って、Ｄ−チロシン（１４Ｃ−Ｌ−プロリンではそうではないが）は、細胞壁に組み込まれたことが示された。結果を細胞中への合計組込み（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）のパーセントで表す。
【０１５５】
細胞壁中に組み込まれたＤ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維を細胞への固定から離脱させることが可能かどうかを調べるために、ＴａｓＡと蛍光のレポーターｍＣｈｅｒｒｙの機能性融合体の局在化を調べた。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体を含む細胞由来の合計蛍光を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（６μＭ）の存在または非存在下のバイオフィルム誘導培地中で振盪を加えながら定常期まで成長させた。図３Ｂに示すように、Ｄ−チロシンによる治療は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの合計蓄積に対しほとんどまたは全く効果がなかった。細胞を遠心分離で洗浄し、再懸濁した後、蛍光顕微鏡で調べたが、未治療細胞（凝集していることが多い）は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙで強力に装飾されていることが認められた。対照的に、Ｄ−チロシン治療細胞（ほとんど非凝集）は、低レベルの蛍光を示すに過ぎなかった。Ｄ−ロイシンおよび４つのＤ−アミノ酸等モル混合物でも、同様の結果が得られた。非修飾ＴａｓＡタンパク質の局在化もまた、金標識抗ＴａｓＡ抗体を使って透過電子顕微鏡で解析された。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ繊維の細胞会合を示す。２４時間培養液を、Ｄ−チロシン無し（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加あり（画像３〜６）の場合で、追加の１２時間のインキュベートを行った。ＴａｓＡ繊維を、抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、実施例に記載のように透過電子顕微鏡により可視化した。外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像処理が著しく改善されたので、細胞は、菌体ｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）の変異であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し、中空矢印はそれぞれの繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは、１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドルを示し、画像３、４および６は、細胞から離脱した個別繊維およびバンドルを示し、画像３〜５は、繊維物質がほとんど無いか全く無い細胞を示す。ＴａｓＡ繊維は、未治療ペリクルの細胞に固定されているように見えた（図３Ｄ、画像１と２）。対照的に、Ｄ−チロシンで１２時間治療した細胞は、ＴａｓＡ繊維ではほとんど装飾されていない細胞の混合物および細胞に固定されていない遊離ＴａｓＡ繊維または繊維凝集体で構成されていた（図３Ｄ、画像３〜６）。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−チロシンがバイオフィルムを治療する１つの機序は、細胞による繊維の脱落の導入である可能性がある。
【０１５６】
Ｄ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を破壊することにより作用することの遺伝的証拠をＤ−チロシン耐性変異体の単離から入手した。図４Ａは、Ｄ−チロシン非含有または含有固形（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。Ｄ−チロシン（図４Ａ）またはＤ−ロイシン（データを示さず）含有固形培地上で成長の間に形成された平坦コロニー上に、しわの寄った乳頭状突起が自然に現れた。重要なことは、全ての４つの活性Ｄ−アミノ酸を含むプレート上には、このような乳頭状突起は出現しなかったことである。精製される場合、これらの自然の変異体は、Ｄ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在下、しわの寄ったコロニーやペリクルを生じた。いくつかのこのような変異体が単離されたが、大抵は、ｙｑｘＭオペロンまたはその近くに変異を含んでいた。２つの変異が詳細に調査され、７５９塩基対長ｙｑｘＭ遺伝子の３’末端近傍のフレームシフト変異であることがわかった。ｙｑｘＭ２は、ｙｑｘＭ読み取り枠中の塩基対７２８の位置のＧ：Ｃの挿入であり、ｙｑｘＭ６は、塩基対５６８の位置のＡ：Ｔの欠失であった（図４Ｂ）。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異により図に示された配列変化を生じ、コドンから特定された残基である。
【０１５７】
図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞会合を示す。ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有の野性型細胞およびｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞を、バイオフィルム誘導培地中で、図中で示したようにＤ−チロシン（６μＭ）の存在またはＤ−チロシン非存在（未治療）下で振盪を加えながら定常期（ＯＤ＝１．５）まで成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。蛍光顕微鏡結果は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６の存在が、凝集およびＤ−チロシン治療細胞に対するＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙによる細胞装飾を復活させたことを示す（図３Ｃ）。以前に行った仕事では、ＴａｓＡと細胞の結合のためにＹｑｘＭが必要であることが示された（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６））。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−アミノ酸のバイオフィルム阻害効果が、ＹｑｘＭ変異体によって打ち負かされ得るというこの発見は、Ｄ−アミノ酸の細胞壁への組込みの効果が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を傷害することであるという考えを補強するものである。ＹｑｘＭのＣ末端近傍ドメインは、細胞壁中のＤ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在に呼応してＴａｓＡ放出の引き金になる可能性がある。
【０１５８】
実施例２．黄色ブドウ球菌および緑膿菌によるバイオフィルム形成におけるアミノ酸の選別
他の細菌に関し、バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果について調査した。病原菌ブドウ球菌は、プラスチック表面上にバイオフィルムを形成する（Ｏｔｔｏ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２２：２０７（２００８））。これは、非結合細胞を洗い流し、結合細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって検出できる。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グルコース（０．５％）とＮａＣｌ（３％）含有ＴＳＢ培地中で３７℃、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、アミノ酸添加無し（未治療）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。図２Ｅは、５０μＭ濃度のＤ−チロシンおよび５０ｎＭ濃度のＤ−アミノ酸混合物（Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニン；各５０ｎＭ）が病原菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し極めて効果的であることを示す。
【０１５９】
さらに、図１０は、１０μＭのＤ−チロシンが緑膿菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し効果的であったことを示し、また、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンの１μＭの等モル混合物が有効であったことを示す。図１０は、Ｄ−アミノ酸による緑膿菌バイオフィルム形成の阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中で、３０℃、４８時間成長させた。さらに、アミノ酸添加無し（未治療）、Ｄ−チロシンまたはＤ−アミノ酸等モル混合物添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄後、完全に乾燥した。
【０１６０】
実施例３．ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルム阻害に対し活性なＤ−アミノ酸混合物
２つの異なる混合物は、ブドウ球菌バイオフィルムの形成の阻害に対し極めて活性である。１つは、Ｄ−チロシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシンおよびＤ−トリプトファンの等モル混合物である。枯草菌、ブドウ球菌（図１１）、および緑膿菌（図１２）の全試験細菌株で、Ｄ−ｔｒｐ、Ｄ−ｍｅｔ、Ｄ−ｔｙｒおよびＤ−ｌｅｕのＤ−ａａ混合物は、個別のアミノ酸よりも極めて低い濃度で活性であった。表１の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。表２の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを下表１と２に示す：
【表１】
【表２】
【０１６１】
Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリンの等モル混合物は、上記混合物よりもさらに効果的である。また、その混合物は、個々のアミノ酸それぞれよりも混合物として活性が大きい（図１３と１４）。表３と４の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを表３と４に示す：
【表３】
【表４】
【０１６２】
実施例４．黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の代替定量方法
浮遊細胞をＧｉｌｓｏｎピペットで完全に除去し、次いで、ペーパータオル越しに液体を排出した。次に、バイオフィルムプレートの画像を黒を背景に注意深く撮影した（図１５と１６）。表５と６の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。データを表５と６に示す：
【表５】
【表６】
【０１６３】
バイオフィルム細胞をＰＢＳ中に再懸濁することにより上記表５と６のプレートから除去し、これらのＯＤ６００を分光光度計を使って測定した（図１７）。表７の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを吸収された細菌のＯＤ６００を測定することにより可視化した。データを表７示す：
【表７】
【０１６４】
実施例５．エポキシ表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果
異なる表面からのＤ−アミノ酸の徐放方法開発の可能性を試験する目的で、エポキシ表面をＤ−アミノ酸混合物中で２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。表８と９の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。図１８と１９に示すように、Ｄ−ａａ混合物（上述のような）は、浸漬状態の基質上のブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減させた。データを表８と９に示す：
【表８】
【表９】
【０１６５】
さらに、Ｎｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１表面をＤ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニンと共に２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。Ｄ−ａａ混合物（Ｌ−混合物ではそうではないが）は、ブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減した。
【０１６６】
この実施例では、ポリマー基質は、ＵＶＯ−１１４（Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＵＶ−硬化型ポリマーを使って、ポリジメチルシロキサン（ＳＹＬＧＡＲＤ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で成形した。
【０１６７】
実施例６．緑膿菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果を観察する別の方法
枯草菌と同様に、緑膿菌は、複合体構造を特定の培地に形成する。これらの複合体構造には、細胞外基質の適切な形成と構築が必要である。Ｄ−チロシン（５００μＭ）またはＤ−トリプトファン（５００μＭ）の追加により、特定培地の緑膿菌バイオフィルム形成が阻害され（図２０）、一方、Ｌ−チロシン（５００μＭ）およびＬ−トリプトファンの追加では、そうならなかった。同様の結果が枯草菌でも得られた。これらの実験では、生物体／株はＰ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。
【０１６８】
Ｄ−アミノ酸のある場合と無い場合について、Ｓｙｔｏ−９染色を使って６ウエルプレート上でバイオフィルム形成を観察する別の方法は、以下の通りである：緑膿菌バイオフィルムをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％グルタルアルデヒドで少なくとも１時固定した。次に、固定バイオフィルムを、ＰＢＳで再度１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）中に１５分間浸漬した。溶液を冷ＰＢＳＴ中の０．１ｎＭ ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と入れ替え、暗所で少なくとも１５分間緩やかに揺らした。バイオフィルムの蛍光像をＸｅランプおよびＫ３ライカフィルターキューブを使ってライカＤＭＲＸ複式顕微鏡で取り込んだ。図２１に示すように、Ｄ−チロシンの存在下で、バイオフィルムプレートの底に付着した細胞の数が激減した。単一細胞付着量をｉｍａｇｅＪを使って定量化した。Ｄ−ａａに浸漬したエポキシ表面に付着した細胞の量の減少は、Ｌ−ａａ対照に比較して相当多かった。
【表１０】
【０１６９】
実施例７．グラム陰性病原菌に与えるＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陰性病原菌プロテウス・ミラビリスに対して試験した。図２２に示すように、Ｄ−ａａ混合物はプロテウス・ミラビリスに対して活性であった。表１１のバイオフィルムは、クリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１１に示す：
【表１１】
【０１７０】
実施例８：グラム陽性の病原菌に対するＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陽性の病原菌ストレプトコッカス・ミュータンスに対して試験した。図２３に示すように、Ｄ−ａａ混合物は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し活性であった。表１２のバイオフィルムをクリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１２に示す：
【表１２】
【０１７１】
医療機器に使用可能なコーティング関連の実施例
実施例９：Ｄ−チロシン含有コーティング
樹脂固形分の重量ベースで、０．５％のＤ−チロシンを市販ポリエステルポリオールおよび市販イソシアヌラートベースの２成分ポリエステルウレタンコーティング中に組み込む。コーティング系は、全体樹脂固形分ベースで０．０１５％のジブチルスズジラウラートにより触媒される。
【０１７２】
コーティング製剤をへら引きにより透明ガラススライド約４”ｘ６”上に塗布して約２ミル（０．００２”）のフィルム厚さにする。
【０１７３】
これらのフィルムを１２０°Ｆ（４９℃）のオーブン中で硬化する。
【０１７４】
実施例１０：Ｄ−アミノ酸混合物含有ポリマー
液体シリコーンゴムシートを米国特許第５、９７３、０３０号に記載のようにして調製する。製剤中に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物をさらに０．０１〜１重量パーセント添加する。
【０１７５】
実施例１１：Ｄ−アミノ酸混合物含有水ベースコーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む水ベース透明アクリル産業コーティング製剤を２ミル厚さでガラススライドにコートする。
【０１７６】
実施例１２：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベースコーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む溶媒べースポリウレタンコーティングを調製する。このコーティングを２ミル厚さでガラススライドに塗布する。
【０１７７】
実施例１３：Ｄ−アミノ酸混合物含有ＵＶ硬化型水ベースコーティング
透明ＵＶ硬化型水性産業コーティングを高速スターラーで各成分（下表参照）の混合により配合した。
【表１３】
【０１７８】
調合製剤に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を添加し、高せん断速度（２０００ｒｐｍ）下、室温で３０分間攪拌する。比較の目的のため、Ｄ−アミノ酸不含の対照製剤を同じ方法で調製する。
【０１７９】
コーティングを５０μｍスリットコーターで白塗装アルミニウムパネルに塗布し、６０℃で１０分間乾燥した後、２つの中圧水銀ランプ（２ｘ８０Ｗ／ｃｍ）を用いて５ｍ／ｍｉｎで硬化する。
【０１８０】
実施例１４：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベースコーティング
２液型溶媒使用ポリウレタンコーティングを下記の手順で調製する：
【０１８１】
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を、ミルベース配合として結合剤および溶媒に添加し、高せん断速度で１０分間、５μｍ未満の粒径になるまで攪拌する。
【０１８２】
ミルベース配合
【表１４】
【０１８３】
コーティング製剤は、成分Ａの材料を混合し、最終段階で塗布の前に成分Ｂを添加して調製する（下表参照）。全体製剤中のＤ−アミノ酸混合物の含量は、０．１重量％である。
【表１５】
【０１８４】
それぞれのコーティング製剤を白塗装アルミニウムパネル上にスプレーし（乾燥被覆厚さ：４０μｍ）、８０℃で３０分乾燥する。
【０１８５】
美容／パーソナルケア配合関連実施例
実施例１５：油中水型（Ｗ／Ｏ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｗ／Ｏ乳剤を調製する。
Ｗ／Ｏ乳剤：
部分Ａ
流動パラフィン ７．５部
イソヘキサデカン ６．０
ＰＥＧ−７水素化ヒマシ油 ４．１
イソプロピルパルミタート ２．０
Cera microcristallina ０．５
ラノリンアルコール ０．６
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
硫酸マグネシウム １．０
グリシン ３．２０
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１８６】
実施例１６：水中油型（Ｏ／Ｗ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｏ／Ｗ乳剤を調製する。
Ｏ／Ｗ乳剤：
部分Ａ
ステアレス−２ ２．２部
ステアレス−２１ １．０
ＰＥＧ−１５ ステアリルエーテル ６．０
ジカプリリルエーテル ６．０
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
ナトリウムポリアクリラート ０．２
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１８７】
実施例１７：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成のインビボ阻害
Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５１：２５９４（２００７）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１８８】
実施例１８：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の別のインビボ阻害
Ｂｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８６：４６６５（２００４）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１８９】
実施例１９：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ＴｙｐおよびＤ−Ｍｅｔの安定水性混合物の調製
アミノ酸Ｄ−ＭｅｔおよびＤ−Ｌｅｕを、室温で５ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に別々に溶解する。通常、各アミノ酸に対し、１０ｍＬの溶液が調製される。Ｄ−トリプトファンは、脱イオン水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の少しの加熱が必要である。Ｄ−チロシンは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０５Ｍ ＨＣｌに溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の加熱が必要である。加熱超音波処理浴を使って、アミノ酸の溶解を促進することができる。全ての溶液は組み合わされ、室温で細菌濾過を行って約４０ｍＬの保存液が得られる。
【０１９０】
実施例２０：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｒｏ、およびＤ−Ｐｈｅの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９１】
実施例２１：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｐ、およびＤ−Ｇｌｕの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９２】
実施例２２：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、およびＤ−Ｌｙｓの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９３】
実施例２３：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ａｓｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９４】
実施例２４：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、およびＤ−Ｇｌｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９５】
等価物
本発明をその詳細説明と関連付けて説明してきたが、前述の記載は説明の目的のためのものであって本発明の範囲を制限する意図はなく、これは添付の請求項の範囲によって定められることは理解されるべきである。他の態様、優位性、および変更は以下の請求項の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、同時係属中の２０１０年１月８日出願米国仮出願第６１／２９３、４１４号、および２０１０年４月３０日出願米国特許仮出願第６１／３２９、９３０号の優先権を主張する。
【０００２】
この出願は、本出願と同日付出願の「バイオフィルム処理のための方法とコーティング組成物」の名称の同時係属中国際特許出願と関連している。
これらの出願の内容は、参照によって組み込まれる。
【０００３】
米国政府の権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所認可ＣＡ２４４８７、ＧＭ０５８２１３、ＧＭ０８２１３７、ＧＭ０８６２５８、およびＧＭ１８５６８に基づいて米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
バイオフィルムは、表面で定着および増殖し、細胞外ポリマー基質により覆われている細胞の共同体である。これらは、増殖が遅く、多くは増殖の定常期にある。これらは、全部ではないにしても、多くは病原体により形成されうる。ＣＤＣによれば、米国の全感染症中の６５％が、共通の病原体により形成され得るバイオフィルムが原因である。また、バイオフィルムは、飲料水送水系等の工業環境中にも認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】(なし)
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明の態様は、細菌によるバイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害する方法を特徴とする。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と表面を接触させ、それによりバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害することを含む。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。特定の実施形態では、細菌は、桿菌、ブドウ球菌、大腸菌、またはシュードモナス細菌である。
【０００７】
他の態様では、本発明は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む工業、治療または、医薬組成物等の組成物を特徴とする。特定の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、組成物は、２つ以上のＤ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、およびＤ−トリプトファンを含み、またさらなる実施形態では、後者の組成物が、基本的にデタージェントおよび／またはＬアミノ酸を含まない。他の実施形態では、組成物は、本明細書記載の、例えば、水処理または配管系等の工業バイオフィルムの治療に使用される。
【０００８】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にＬ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にデタージェントを含まない。例えば、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。
【００１０】
別の本開示態様は、治療を必要としている患者のバイオフィルム関連障害の治療方法に関し、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物を患者に投与し、それによりバイオフィルム関連障害を治療することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、または、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的な組み合わせである。一部の実施形態では、組成物は、皮膚および粘膜表面およびそれらの組み合わせからなる群より選択される患者の表面に投与される。他の実施形態では、表面は、口腔表面、皮膚表面、尿路表面、腟管表面、または肺表面である。
【００１１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１２】
一部の実施形態では、組成物は、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、鼻、または局所的投与、およびこれらの組み合わせにより患者に投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、患者はヒトである。
【００１４】
一部の実施形態では、バイオフィルムの形成が阻害される。他の実施形態では、以前に形成されたバイオフィルムが破壊される。
【００１５】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度で、例えば、０．１ｎＭ〜１００μＭの濃度で投与される。
【００１６】
さらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、および尿路感染ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の実施形態では、バイオフィルム関連障害は、医療機器関連感染症である。さらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、歯周病、例えば、歯肉炎、歯周炎または口臭である。またさらなる実施形態では、バイオフィルム関連障害は、細菌が原因である。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。さらに他の実施形態では、細菌は、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ（Ｅｎｔｅｍｂａｃｔｅｒ）、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である。
本開示の別の態様は、生物学的関連表面上でのバイオフィルム形成細菌によるバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害する方法に関し、この方法は、生物学的表面と有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物とを接触させ、それによりバイオフィルム形成を治療、低減、または阻害することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１８】
一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である。
【００１９】
一部の実施形態では、表面は、医療機器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、または口腔内装置を含む。他の実施形態では、医療機器は、鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
前述の方法の一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、Ｄ−チロシンに加えて、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２１】
前述の方法のいずれかの内の一部の実施形態では、方法は、殺生物剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、殺生物剤は、抗生物質である。
【００２２】
さらに他の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。
【００２３】
さらに別の本発明の態様は、バイオフィルム形成を治療、低減、または阻害するのに有効な量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の混合物を含む組成物に関し、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−チロシンである。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらなる他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。さらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態では、前述の組成物のいずれかが、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含んでもよい。他の実施形態では、前述の組成物のいずれかが、薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。前述の組成物のいずれかのさらに他の実施形態では、有効量は、バイオフィルム関連障害を治療または防ぐのに有効な量である。一部の実施形態では、有効量は、表面上のバイオフィルムを治療(処理)または防ぐのに有効な量を含む。
【００２７】
さらに別の前述の組成物のいずれかの実施形態では、バイオフィルム関連障害は、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、または尿路感染症である。一部の実施形態では、バイオフィルム関連障害は、医療機器関連感染症である。
【００２８】
一部の前述の組成物のいずれかの実施形態では、組成物は、表面への適用に適した薬剤をさらに含む。他の前述の組成物のいずれかの実施形態では、組成物は、洗浄液、包帯、創傷ジェル、または人工組織として処方される。さらなる実施形態では、組成物は、錠剤、丸薬、トローチ、カプセル、エアロゾルスプレー、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、クリーム、またはフォームとして処方される。一部の実施形態では、組成物は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜的、腟および直腸投与用に処方される。
【００２９】
本開示の別の態様は、バイオフィルム耐性医療機器に関し、この機器は、体液に接触しやすい表面、および前記表面上にコートしたまたはその中に含浸されたＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、バイオフィルム形成を治療、低減または阻害するのに有効な量であり、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−チロシンであり、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄチロシンを含む。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤプロリンおよびＤフェニルアラニンをさらに含む。他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、徐放製剤として処方される。一部の実施形態では、表面は、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。さらなる実施形態では、表面は、基本的に、デタージェントを含まない。
【００３２】
一部の実施形態では、機器は、１つまたは複数の鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータおよび内視鏡から選択される。
【００３３】
本開示のさらなる態様は、飲用液に関し、０．０００００１％〜０．１％の範囲の濃度のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３４】
本開示の別の態様は、バイオフィルム形成に耐性を示す組成物に関し、薬学的にまたは化粧用に適切な基剤、および基剤中に分散した有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それによりバイオフィルム形成の治療、低減または阻害を行い、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００３５】
一部の実施形態では、基剤は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００３６】
一部の実施形態では、基剤は、液体、ゲル、ペースト、または粉末から選択される。さらなる実施形態では、組成物は、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、石けん、ローション、クリーム、デオドラント剤、スキンケア製品、化粧品用パーソナルケア製品、インティメイト・ハイジーン製品、フットケア製品、光防護剤、日焼け剤、防虫剤、制汗剤、シェービング剤、脱毛剤、香料、デンタルケア、デンタルケア・口腔ケア製剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３７】
以下の図は、説明の目的のみで提示されるもであり、制限を加える意図はない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、枯草菌株ＮＣＩＢ３６１０の細胞を示す。この細胞は、１２ウエルプレートを使って液体バイオフィルム誘導培地中、２２ ℃で３日間（Ａ）または８日間（Ｂ）成長させた。図１Ｃ及び１Ｄは、６〜８日間培養液（Ｃ）または３日間培養液（Ｄ）の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに適用後、乾燥・再懸濁したメタノール溶出液（１：１００ｖ／ｖ）を添加した培地中で３日間成長させた細胞を示す。ウエルに添加された最終濃度の濃縮因子は、元の馴化培地の容量ベースで１：４希釈であった。図１Ｅは、その因子がメタノールを使ったステップワイズ溶出によりＣ−１８カラムでさらに精製されたことを除いて、図１Ｃと同じである。３μｌの４０％メタノール溶出液を添加した結果を示す。図１Ｆは、新しい培地への添加の前に、４０％メタノール溶出液をプロテイナーゼＫビーズと共に２時間インキュベートし、続いて、遠心分離によりビーズを除去したことを除いて、図１Ｃと同じである。
【図２】図２Ａは、３日間のインキュベーション後に、バイオフィルム誘導培地中で新しく播種した培養液にＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）を添加した場合のペリクル形成に対する効果を示す。図２Ｂは、ペリクル形成の完全な阻害に必要なＤ−アミノ酸の最小バイオフィルム阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＢＩＣ）を示す。図２Ｃは、アミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン（３μＭ）の添加またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物添加に続いて、さらに８時間インキュベーションした３日間培養液を示す。図２Ｄは、野性型またはｙｌｍＥおよびｒａｃＸに対し二重変異体株（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地から得た濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、３７℃のグルコース（０．５％）およびＮａＣｌ（３％）を含むＴＳＢ培地中で、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、ウエルへのアミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）添加またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件を付加した。未結合細胞を洗い流した後、ポリスチレンに結合した細胞をクリスタルバイオレットで染色して可視化した。
【図３】図３Ａは、細胞壁への放射性のＤ−チロシンの組み込みを示す。細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結果を、細胞（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）への全体組み込みのパーセントとして示す。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体含有細胞（ＤＲ−３０（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））からの全蛍光を示す。Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在の場合について、バイオフィルム誘導培地中で定常期になるまで振盪を加えながら細胞を成長させた。図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞会合を示す。表示されているように、Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在（未治療）の場合について、野性型細胞およびｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有ｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞をバイオフィルム誘導培地中で定常期（ＯＤ＝１．５）になるまで振盪を加えながら細胞を成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ線維の細胞会合を示す。Ｄ−チロシンのない場合（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加の場合（画像３〜６）について、２４時間培養液に対し、１２時間追加してインキュベートした。実施例に記載のように、ＴａｓＡ繊維を抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、透過型電子顕微鏡により可視化した。菌体外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像化が著しく改善されたので、細胞はｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）に対し変異体であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し；中空矢印は、個別の繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドル、画像３、４と６は、個別の繊維および細胞から離脱したバンドルを示し、画像３〜５は、ほとんどまたは全く繊維状物質のない細胞を示す。
【図４】図４Ａは、Ｄ−チロシン含有または非含有の固体（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、表示した配列変化中でｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異が生じたコドンにより特定される残基である。
【図５】図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充した後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたＭＳｇｇ培地含有ウエルを示す。
【図６】図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートした固体ＭＳｇｇ培地を含むプレートを示す。
【図７】図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートしたＮＣＩＢ３６１０（野性型）およびｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）の二重欠失変異体を示す。
【図８】図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える効果を示す。細胞をＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。
【図９】図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺを保持）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺを保持）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。
【図１０】図１０は、緑膿菌バイオフィルム形成のＤ−アミノ酸による阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中３０℃で４８時間成長させた。アミノ酸無添加（未治療）、Ｄ−チロシン添加またはＤ−アミノ酸混合物の条件をウエルに付加した。ポリスチレンに結合した細胞を、未結合細胞を洗い流した後、クリスタルバイオレットで染色して可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗い流し、完全に乾燥した。
【図１１】図１１は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１２】図１２は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＭ６３培地中で４８時間成長させた緑膿菌のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１３】図１３は、個別Ｄ−アミノ酸または混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１４】図１４は、Ｌ−アミノ酸と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１５】図１５は、浮遊細菌を除去後Ｄ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１６】図１６は、浮遊細菌を除去後Ｌ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１７】図１７は、浮遊細菌を除去後ＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルム内の細胞の定量化である。細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。
【図１８】図１８は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図１９】図１９は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図２０】図２０は、Ｍ６３固体培地上の緑膿菌中のバイオフィルム形成に与えるＤ−ａａの効果を示す。コロニーは、室温で４日間成長させた。
【図２１】図２１は、バイオフィルム誘導条件下における、緑膿菌の６ウエルプレートのボタン中の単一付着細胞のＳｙｔｏｘ染色を示す。
【図２２】図２２は、ＬＢ培地中でＤ−アミノ酸（１００μＭ）またはＬ−アミノ酸（１００μＭ）混合物と共に４８時間成長させたプロテウス・ミラビリスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図２３】図２３は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸（１ｍＭ）を含む、ショ糖（０．５％）培地を添加したＢＨＩ培地で７２時間成長させたストレプトコッカス・ミュータンスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
特に他の定義がなければ、本明細書で使われる全ての技術科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で挙げた全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のみの目的であり、制限する意図はない。
【００４０】
他の本発明の特徴および優位点は、以下の詳細記述、および請求項から明らかとなろう。当業者には明らかなように、本明細書記載の特定の特徴および実施形態は、他の特徴または実施形態のいずれかと組み合わせ可能である。
【００４１】
定義
用語の「障害」、「疾患」、および「状態」は、本明細書では、患者状態に対し、同義に使用される。障害は、患者の身体の正常な機能に影響する妨害または撹乱である。疾患は、種々の原因、例えば、特定可能な一群の症状を特徴とする感染、遺伝的欠陥、または環境的ストレスから生じた器官、身体部位、またはシステムの病理学的状態である。障害または疾患は、バイオフィルムが樹立されている細菌の疾患関連増殖を特徴とするバイオフィルム関連障害を指してもよい。
【００４２】
用語の「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書では、本明細書記載の組成物（例えば、予防もしくは治療組成物）の投与、もしくは治療薬の組み合わせ（例えば、予防もしくは治療組成物の組み合わせ）の投与の結果としての、バイオフィルムもしくはバイオフィルム関連障害の発生または発症の阻害またはバイオフィルムもしくは患者の表面または内部のバイオフィルム関連障害の１つまたは複数の徴候もしくは症状の再発、発症、もしくは発生の防止を指す。
【００４３】
本明細書で使われる「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、障害もしくはその症状を改善する、または障害もしくはその症状の進行を防ぐもしくは遅らせるのに有効な量、方式（例えば、投与スケジュール）、および／またはモード（例えば、投与経路）で、本明細書記載の組成物を投与することを指す。これは、例えば、バイオフィルムもしくはバイオフィルム関連障害関連パラメータまたはその徴候もしくは症状が、例えば、統計的に有意な程度にまたは当業者に検出可能な程度に、改善することにより証明できる。有効量、方式、またはモードは、表面、適用先、および／または患者に依存して変化し、表面、適用先、および／または患者に合わせることが可能である。バイオフィルムまたはバイオフィルム関連障害またはその徴候もしくは症状の進行を防ぐまたは遅らせることにより、治療により、罹患した表面または罹患したもしくは診断された患者の内部のバイオフィルムまたはバイオフィルム関連障害またはその徴候もしくは症状から生ずる悪化を防ぐまたは遅らせることができる。
【００４４】
本発明は、少なくとも一部は、成熟バイオフィルム由来の馴化培地中に存在するＤ−アミノ酸がバイオフィルム形成を防ぎ、既存のバイオフィルム分解の引き金となるという発見に基づいている。標準的アミノ酸は、相互に鏡像関係にあるＬ−またはＤ−アミノ酸と呼ばれる２つの光学的異性体のどちらかの形で存在しうる。Ｌ−アミノ酸は、タンパク質中に見出される大部分のアミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸は細菌のペプチドグリカン細胞壁の成分である。
【００４５】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、生存および非生存表面上のバイオフィルムに浸透でき、細菌の表面への付着およびバイオフィルムのさらなる発達を阻害でき、このようなバイオフィルムを剥離させることができおよび／または生物学的基質中のバイオフィルム形成微生物のさらなる増殖を阻害することができ、またはこのような微生物を消滅させることができる。Ｄ−アミノ酸は、当技術分野で既知であり、既知の技術を使って調製可能である。代表的方法には、例えば、米国特許公開第２００９０２０３０９１号に記載のものが含まれる。Ｄ−アミノ酸は、また、市販品として入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から）。
【００４６】
本明細書記載の方法には、いずれのＤ−アミノ酸も使用可能であり、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、またはＤ−チロシンが、非制限的に含まれる。Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは他のＤ−アミノ酸と組み合わせて使用可能である。代表的方法では、２、３、４、５、６、または７以上のＤ−アミノ酸が組み合わせて使用される。好ましくは、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、またはＤ−トリプトファンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。他の好ましい実施形態では、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。
【００４７】
Ｄ−アミノ酸は、０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で投与可能である。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの濃度で投与可能である。
【００４８】
バイオフィルム形成の阻害または治療に特に有効であると解った代表的Ｄ−アミノ酸組成物には、Ｄ−チロシンが含まれる。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、単独で使用され、例えば、１ｍＭ未満、または１００μＭ未満、または１０μＭ未満の濃度として、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用できる。
【００４９】
他の実施形態では、Ｄ−チロシンが１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンと組み合わせて使用される。Ｄ−チロシンの１つまたは複数のＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンとの組み合わせは、相乗的となり得、１０μＭ以下、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの全体Ｄ−アミノ酸濃度、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度でバイオフィルム形成を阻害または治療するのに有効である可能性がある。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルである。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルではない。
【００５１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満のＬ−アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、Ｌ−アミノ酸のパーセンテージは、対応するＤ−アミノ酸に対する割合である。例えば、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸のラセミ混合物は、５０％Ｌ−アミノ酸を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。例えば、組成物は、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２５重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０２５重量％未満、約０．０１重量％未満、約０．００５重量％未満、約０．００２５重量％未満、約０．００１重量％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。他の実施形態では、組成物は、全体組成物に対して、約３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．２５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２５重量％未満、０．０１重量％未満、０．００５重量％未満、０．００２５重量％未満、０．００１重量％未満のデタージェントを含む。デタージェント、例えば、界面活性剤含有製剤に置いて、界面活性剤が活性試薬、例えば、Ｄ−アミノ酸と相互作用し、往々にして、試薬の有効性に大きな影響を与える可能性がある。一部の実施形態では、特定の界面活性剤型の存在が有効性を変えるかどうかを判定するための選別として、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤および双性イオン界面活性剤に対して試薬の有効性を選別する必要が生じうる。デタージェントの低減または除去が組成物の有効性を増加させおよび／または製剤の合併症を低減し得る。
【００５３】
他の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントおよびＬ−アミノ酸の両方を含まない。
【００５４】
バイオフィルム
ほとんどの細菌は、バイオフィルムとして知られる複合体の基質含有多細胞の共同体を形成できる（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：４９（２０００）；Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。バイオフィルム関連細菌は、外界からの刺激、例えば、抗生物質から保護されている（Ｂｒｙｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１００：１（２００８））。しかし、バイオフィルムが熟成するにつれ、栄養素が限定的となり老廃物が蓄積して、バイオフィルム関連細菌は、浮遊実体に戻る方が都合がよくなる（Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。従って、バイオフィルムは、有限の寿命を有し、最終的な分解を特徴とする。
【００５５】
他の単細胞の生物に加えて、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、バイオフィルムを産生できる。細菌性バイオフィルムは、コロニーを形成している細胞により産生される細胞外の多糖基質内に包まれた細胞表面付着共同体である。バイオフィルム成長は、一連のプログラムされたステップにより発生し、このステップは、最初の表面への付着、３次元マイクロコロニー形成、およびその後の成熟バイオフィルムの成長を含む。バイオフィルム内の細胞の場所が深くなればなるほど（例えば、細胞がバイオフィルムが付着している固体表面に近いほど、大部分のバイオフィルム基質により遮蔽され、保護される）、細胞はさらに代謝不活性になる。この生理学的変化と勾配の結果、効率的システムが樹立され、それにより微生物が多様な機能的体質を有する細菌性共同体集団が作られる。また、バイオフィルムは、種々の、多様な非細胞性成分で作られ、これらに限定されないが、炭水化物（単体および複合体）、脂質、タンパク質（ポリペプチドを含む）、および糖類およびタンパク質の脂質複合体類（リポ多糖類およびリポタンパク質）を含んでもよい。バイオフィルムは、２つ以上の細菌種（多菌性バイオフィルム）の集積共同体、または１つの特異的バクテリアを優先的に含んでもよい。
【００５６】
バイオフィルムは、適した成長条件が発生し、微生物に対し生存を保証する選択優位性を提供できるまで、一定時間の間休眠状態での細菌の存在を可能とする。しかし、この選択は、バイオフィルムがヒト細菌感染の約６５％に関与すると認められている点で、ヒトの健康に重大な脅威を提起する可能性がある（Ｓｍｉｔｈ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５７：１５３９−１５５０（２００５）；Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：９５−１０８（２００４））。
【００５７】
本明細書記載のように、バイオフィルムは、多種多様の生物学的、医学的、商業的、工業的、およびプロセシング作用に影響を与える可能性もある。
【００５８】
バイオフィルム形成細菌
本明細書記載の方法は、バイオフィルムの形成および／または脅威を防ぐ、または遅らせるために使用できる。代表的方法では、バイオフィルムは、バイオフィルム成形細菌により形成される。細菌は、グラム陰性菌種またはグラム陽性細菌性種であってもよい。このような細菌の非制限的例には、以下の属のメンバーが含まれる：アクチノバチルス属のメンバー（例えば、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス）、アシネトバクター属のメンバー（例えば、アシネトバクター・バウマンニ）、エロモナス属のメンバー、ボルデテラ属のメンバー（例えば、百日咳菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、またはパラ百日咳菌）、ブレビバシラス属のメンバー、ブルセラ属のメンバー、バクテロイデス属のメンバー（例えば、バクテロイデス・フラジリス）、バークホルデリア属のメンバー（例えば、セパシア菌または類鼻疽菌）、ボレリア属のメンバー（例えば、ライム病ボレリア）、桿菌属のメンバー（例えば、炭疽菌または枯草菌）、カンピロバクター属のメンバー（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、キャプノサイトファーガ属のメンバー、カルジオバクテリウム属のメンバー（例えば、カーディオバクテリウム・ホミニス）、シトロバクター属のメンバー、クロストリジウム属のメンバー（例えば、破傷風菌またはクロストリジウム・ディフィシル）、クラミジア属のメンバー（例えば、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジア、またはオウム病クラミジア）、エイケネラ属のメンバー（例えば、エイケネラ・コローデンス）、エンテロバクター属のメンバー、エシェリキア属のメンバー（例えば、大腸菌）、フランシセラ属のメンバー（例えば、野兎病菌）、フソバクテリウム属のメンバー、フラボバクテリウム属のメンバー、ヘモフィルス属のメンバー（例えば、軟性下疳菌またはインフルエンザ菌）、ヘリコバクター属のメンバー（例えば、ピロリ菌）、キンゲラ属のメンバー（例えば、キンゲラ・キンゲ）、クレブシエラ属のメンバー（例えば、肺炎桿菌）、レジオネラ属のメンバー（例えば、在郷軍人病菌）、リステリア属のメンバー（例えば、リステリア菌）、レプトスピラ属のメンバー、モラクセラ属のメンバー（例えば、カタル球菌）、モルガネラ属のメンバー、マイコプラズマ属のメンバー（例えば、マイコプラズマ・ホミニスまたは肺炎マイコプラズマ）、マイコバクテリウム属のメンバー（例えば、マイコバクテリウム結核またはらい菌）、ナイセリア属のメンバー（例えば、淋菌または髄膜炎菌）、パスツレラ属のメンバー（例えば、パスツレラ・マルトシダ）、プロテウス属のメンバー（例えば、プロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ミラビリス）、プレボテラ属のメンバー、プレジオモナス属のメンバー（例えば、プレジオモナス・シゲロイデス）、シュードモナス属のメンバー（例えば、緑膿菌）、プロビデンシア属のメンバー、リケッチア属のメンバー（例えば、リケッチア・リケッチイまたは発疹熱リケッチア）、ステノトロフォモナス属のメンバー（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌）、連鎖球菌属のメンバー（例えば、緑色連鎖球菌、化膿性連鎖球菌（グループＡ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢ）、ストレプトコッカス・ボビス、または肺炎球菌）、ストレプトマイセス属のメンバー（例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス）、サルモネラ属のメンバー（例えば、腸炎菌、チフス菌、またはネズミチフス菌）、セラチア属のメンバー（例えば、霊菌）、赤痢菌属のメンバー、スピリルム属のメンバー（例えば、鼡咬症スピリルム）、トレポネーマ属のメンバー（例えば、梅毒トレポネーマ）、ベイヨネラ属のメンバー、ビブリオ属のメンバー（例えば、コレラ菌、腸炎ビブリオ、またはビブリオ・バルニフィカス）、エルシニア属のメンバー（例えば、エンテロコリチカ菌、ペスト菌、または仮性結核菌）、およびザントモナス属のメンバー（例えば、ザントモナス・マルトフィリア）。
【００５９】
枯草菌は、特異的に半固体表面上に複合共同体を構築し、静置培養液の空気／液体界面に厚いペリクルを形成する（Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：６３８（２００７）；Ｖｌａｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２：９４５（２００８）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１））。枯草菌バイオフィルムは、菌体外多糖およびタンパク質ＴａｓＡから成るアミロイド線維で構成される細胞外の基質により一緒に保持された長鎖細胞から成る（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６）；Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））。菌体外多糖は、ｅｐｓＡ−Ｏオペロンによりコードされた酵素により産生され（「ｅｐｓオペロン」）、ＴａｓＡタンパク質は、ｙｑｘＭ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロン（「ｙｑｘＭオペロン」）のプロモーター遠位遺伝子によりコードされる（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６））。
【００６０】
バイオフィルム産生細菌、例えば、本明細書記載の種は、本明細書記載のように、インビトロで、または表面上で、生存患者中に見出すことができる。
【００６１】
適用／製剤
Ｄ−アミノ酸が患者に投与される場合には、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、医薬組成物に組み込むことができる。Ｄ−アミノ酸は、薬学的に許容可能な塩、エステルまたはＤ−アミノ酸の誘導体として医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、このような組成物には、Ｄ−アミノ酸および薬学的に許容可能なキャリアが含まれる。本明細書で使われる用語の「薬学的に許容可能なキャリア」は、本明細書記載のＤ−アミノ酸と一緒に患者に投与可能な、その薬理学的活性を破壊しないキャリアを意味する。薬学的に許容可能なキャリアには、例えば、医薬品投与と共生できる溶剤、結合剤、分散媒体、コーティング、防腐剤、着色剤、等張性および吸収遅延剤、等が含まれる。補助的活性化合物も組成物中に組込み可能である。
【００６２】
用語の「薬学的に許容可能な塩」には、これらに限定されないが、水溶性および水不溶性の塩、例えば、アセタート、アムソナート（４、４−ジアミノスチルベン−２、２−ジスルホナート）、ベンゼンスルホナート、ベンゾアート、ビカルボナート、ビスルファート、ビタルトラート、ボラート、ブロミド、ブチラート、カルシウムエデタート、カンシラート、カルボナート、クロリド、シトラート、クラブラリアート、ジヒドロクロリド、エデタート、エジシラート、エストラート、エシラート、フマラート、グルセプタート、グルコナート、グルタマート、グリコリルアルサニラート、ヘキサフルオロホスファート、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロキシナフトアート、ヨージド、イソチオナート、ラクタート、ラクトビオナート、ラウラート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、メチルブロミド、メチルニトラート、メチルスルファート、ムカート、ナプシラート、ニトラート、Ｎメチルグルカミンアンモニウム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトアート、オレアート、オキサラート、パルミタート、パモアート（１、１−メテン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトアート、エインボナート）、パントテナート、ホスファート／ジホスファート、ピクラート、ポリガラクツロナート、プロピオナート、ｐ−トルエンスルホナート、サリチラート、ステアラート、スブアセタート、スクシナート、スルファート、スルホサリクラート、スラマート、タンナート、タルトラート、テオクラート、トシラート、トリトヨージド、およびバレラート塩が含まれる。
【００６３】
また、Ｄ−アミノ酸は、エステルまたは誘導体の形であってもよい。適切なエステルの例には、ホルマート、アセタート、プロピオナート、ブチラート、イソブチラート、ペンタノアート、クロトナート、およびベンゾアートが含まれる。一部の薬学的に許容可能な誘導体には、水溶性を高める化学基が含まれる。
【００６４】
使用可能な薬学的に許容可能なキャリアの非制限的例には、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ＰＶＡ、部分水解ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート−ｃｏ−ビニルアルコール）、架橋ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、架橋部分水解ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、架橋ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリ−Ｄ、Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ＰＧＡ、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（無水物）、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールの共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、ポリエチレングリコール；およびこれらの組み合わせおよび混合物が含まれる。
【００６５】
他のキャリアには、例えば、水性ゼラチン、水性タンパク質、高分子キャリア、架橋剤、またはこれらの組み合わせが含まれる。他の例では、キャリアは、基質である。さらに別の例では、キャリアには、水、薬学的に許容可能な緩衝液塩、薬学的に許容可能な緩衝液、薬学的に許容可能な抗酸化剤、アスコルビン酸、１つまたは複数の薬学的に許容可能な低分子量ポリペプチド、約２〜約１０アミノ酸残基含有ペプチド、１つまたは複数の薬学的に許容可能なタンパク質、１つまたは複数の薬学的に許容可能なアミノ酸、ヒト必須アミノ酸、１つまたは複数の薬学的に許容可能な炭水化物、１つまたは複数の薬学的に許容可能な炭水化物由来物質、非還元糖、グルコース、ショ糖、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、マルトデキストリン、デキストリン、シクロデキストリン、薬学的に許容可能なキレート化剤、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、２価金属イオン用キレート化剤、三価の金属イオン用キレート化剤、グルタチオン、薬学的に許容可能な非特異的血清アルブミン、および／またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
Ｄ−アミノ酸含有医薬組成物は、当業者には既知であるように、目的投与経路に適合するように処方可能である。投与経路の非制限的例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜的、腟および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、下記成分を含んでもよい：無菌希釈剤、例えば、注射剤用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；抗菌薬、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはナトリウムビスルフィット；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、アセタート、シトラートまたはホスファートおよび浸透圧調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムにより調整可能である。非経口の製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射器または複数用量のバイアルに封入可能である。
【００６７】
注射用途に適した医薬組成物には、無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌水溶液（水溶性の場合は）または分散液および無菌の粉末が含まれる。静脈内投与用の適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全てのケースで、組成物は、無菌で、容易に注射可能である程度に流動性が必要である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌および真菌、の汚染作用に対し保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）を含む溶媒または分散媒、ならびに適切なこれらの混合物でありうる。例えば、レシチン等によるコーティングにより、分散の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適した流動度を維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって行うことができる。組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより行うことができる（例えば、レミントン薬科学（第２１版）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．（２００６）参照）。
【００６８】
無菌の注射可能溶液は、必要に応じ、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと一緒に、適切な溶媒中の必要量のＤ−アミノ酸を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製可能である。通常、分散液は、ベースになる分散媒および上記列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌溶媒中に活性化合物を組み込むことにより調製できる。無菌注射可能溶液調製用の無菌粉末の場合は、調製方法には、非制限的例として、事前に除菌されたその溶液由来のいずれかの追加の所望成分を加えた有効成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥が含まれる。
【００６９】
経口組成物には、通常、不活性の希釈剤または食用キャリアが含まれる。経口治療投与の目的のため、Ｄ−アミノ酸は、賦形剤と共に組み入れられ、錠剤、丸薬、トローチ、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形で使用できる。経口組成物は、また、うがい薬として使用するため液体キャリアを使って調製可能である。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含有できる。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ、等は、次の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含んでもよい：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、ショ糖またはサッカリン；または香味料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ調味料。
【００７０】
吸入による投与に対しては、Ｄ−アミノ酸は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で送達できる。
【００７１】
また、全身性投与は、経粘膜的または経皮的方法により行うことができる。経粘膜または経皮投与に対しては、透過すべきバリアに対し適切な浸透剤が製剤中に含められる。このような浸透剤は、通常、当技術分野で既知であり、これらに限定されないが、例えば、経粘膜的投与に対しては、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用により行うことができる。経皮投与に対しては、活性化合物は、通常、当技術分野で知られているように、例えば、軟膏、塗り薬、ゲル、またはクリーム剤に処方される。
【００７２】
急性または慢性創傷の治療に対しては、Ｄ−アミノ酸は、包帯、洗浄液、ゲル、または人工組織として処方できる。
【００７３】
バイオフィルムは、口腔表面（例えば、歯、舌、のどの奥、等）上に形成可能である。これらのバイオフィルムは、このような環境中に存在する天然の微生物叢の日々の細菌活性に関連しうるが、また、口腔関連疾患、例えば、歯周病（例えば、歯肉炎または歯周炎）、口臭、または虫歯にも関係しうる。例えば、一般的歯周病である歯周炎は、歯根表面上にバイオフィルムとして存在する少群のグラム陰性細菌、特に、ジンジバリス菌、バクテロイデス・フォーサイスおよびアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンスが原因であると考えられており、後者の細菌は、若年性歯周炎の症例で主に見つかっている。歯周病に関与すると考えられる他の細菌には、トレポネーマ・デンティコラ、トレポネマ・ソクランスキー、フソバクテリウム・ヌクレアタム、およびプレボテラ・インターメディア、シドフィルス菌、カゼイ菌、アクチノミセス・ビスコーサス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、ストレプトコッカス・サングイス、緑色レンサ球菌、ならびにミュータンス菌が含まれる。このような口腔表面へのＤ−アミノ酸の適用により、細菌性バイオフィルム形成を阻害または防ぐことができる。通常、このような口腔表面への適用は、通常の使用方法では、全身性の投与の目的のように意図的に飲み込むことをしないで、全ての歯の表面および／または口腔組織に実質的に接触するのに充分な時間の間、口腔中に保持される製品経由でなされる。口腔表面で使用するＤ−アミノ酸は、ガム、ペースト（例えば、歯磨き粉）として処方でき、これは、その後、患者のこのような表面のバイオフィルムに直接適用できる。ペースト製剤は、研磨材をさらに含んでもよい。Ｄ−アミノ酸をゲル製剤または液体製剤中に存在させることも可能である。例えば、Ｄ−アミノ酸は、患者の口腔表面のバイオフィルムと直接接触できるうがい薬として処方できる。さらに、Ｄ−アミノ酸は、口腔状態の治療または予防のために、ポリマーフィルムまたは小平板として（例えば、徐放製剤として）処方可能である。一実施形態では、本発明のＤ−アミノ酸は、歯周炎用の補助抗菌療法として使用可能であり、チップの形で歯または歯の間に直接適用できる。本発明の口腔ケア組成物は、治療リンス、特に、口腔リンス；歯磨剤、例えば、練り歯磨き、歯磨ジェル、および歯磨き粉；摩耗防止ゲル；マウススプレー；ムース；フォーム；チューインガム、ロゼンジおよびブレスミント；飲料水添加物；歯科溶液および洗浄液；ならびに備品、例えば、糸ようじおよびテープ、を含む種々の形態であってよい。歯科備品は、歯科糸ようじまたはテープ、チップ、ストリップ、フィルムおよびポリマー繊維を含む含浸した繊維であってもよい。
【００７４】
例えば、経口組成物は、組成物の全体重量ベースで、約０．０１重量％〜約１５重量％、例えば、０．０１重量％〜１５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および経口的に受容可能なアジュバントを含みうる。１つの経口組成物の非制限的例は、１０重量％ソルビトール、１０重量％グリセリン、１５重量％エタノール、１５重量％プロピレングリコール、０．５重量％ナトリウムラウリル硫酸塩、０．２５重量％ナトリウムメチルコシルタウラート、０．２５重量％ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロック共重合体、０．１０重量％ペパーミント香料、０．１〜０．５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および４８．６重量％の水を含む。
【００７５】
経口組成物は、例えば、ゲル、ペースト、クリームまたは水性の製剤（うがい薬）の形態であってもよい。また、経口組成物は、虫歯の形成に逆らう効力を有するフッ化物イオン、例えば、無機のフッ化物塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウムもしくはカルシウムフッ化物、または有機フッ化物塩、例えば、アミンフッ化物（ＯＬＡＦＬＵＯＲの商標で知られる）を放出する化合物を含むことができる。経口組成物は、当技術分野で「経口的に受容可能なキャリア」として知られる化合物をさらに含むことができる。これらは、本明細書で使用されるように、従来の口腔ケア組成物中の添加物を意味し、これらに限定されないが、下記のものを含む：フッ化物イオンソース、抗結石または抗歯石試薬、緩衝液、研磨剤、例えば、シリカ、漂白剤、例えば、過酸化物ソース、アルカリ金属重炭酸塩、肥厚物質、湿潤剤、水、界面活性剤、二酸化チタニウム、香料系、甘味料、キシリトール、着色料、およびこれらの混合物。このような物質は、当技術分野ではよく知られており、調製される組成物に対する所望の身体的、美容および性能特性に基づいて当業者により容易に選択される。これらのキャリアは、典型的には、経口組成物中の重量で約５０％〜約９９％、好ましくは約７０％〜約９８％、さらに好ましくは約９０％〜約９５％、のレベルで含んでもよい。使用されるキャリアの選択は、基本的に、組成物が口腔中に導入される方法により決定される。好ましい実施形態では、経口組成物は、歯磨剤、例えば、練り歯磨き、歯磨ジェルおよび歯磨き粉の形態である。このような練り歯磨きおよび歯磨ジェルの成分には、通常、１つまたは複数の歯科研磨材（約６％〜約５０％）、界面活性剤（約０．５％〜約１０％）、糊料（約０．１％〜約５％）、湿潤剤（約１０％〜約５５％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、着色料（約０．０１％〜約０．５％）および水（約２％〜約４５％）が含まれる。このような練り歯磨きまたは歯磨ジェルは、また、１つまたは複数の虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％〜約０．３％）および抗結石剤（約０．１％〜約１３％）を含んでもよい。歯磨き粉は、実質的に全て非液体成分である。他の好ましい口腔ケア組成物は、うがい薬またはリンス、マウススプレー、歯科溶液および洗浄液を含む液体製品である。このようなうがい薬およびマウススプレーの成分には、典型的には、１つまたは複数の水（約４５％〜約９５％）、エタノール（約０％〜約２５％）、湿潤剤（約０％〜約５０％）、界面活性剤（約０．０１％〜約７％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、および着色料（約０．００１％〜約０．５％）が含まれる。このようなうがい薬およびマウススプレーは、また、１つまたは複数の虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％〜約０．３％）および抗結石剤（約０．１％〜約３％）を含んでもよい。歯科溶液の成分には、通常、１つまたは複数の水（約９０％〜約９９％）、防腐剤（約０．０１％〜約０．５％）、糊料（０％〜約５％）、香味料（約０．０４％〜約２％）、甘味料（約０．１％〜約３％）、および界面活性剤（０％〜約５％）が含まれる。
【００７６】
また、Ｄ−アミノ酸含有医薬組成物は、坐剤（例えば、従来の坐剤基剤、例えば、ココアバターおよび他のグリセリド）または直腸への送達用の停留かん腸剤の形に調製可能である。
【００７７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、デタージェントを含まない。一部の例では、デタージェントは、組成物の毒性の一因となりうる。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％未満、またはそれ未満のデタージェント、例えば、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、約０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、約０．００２５％未満、０．００１％未満のデタージェントを含む。
【００７８】
一部の医薬組成物は、身体からの急速除去に対しＤ−アミノ酸を保護するキャリア、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化したデリバリーシステムを含む徐放製剤、を加えて調製できる（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：２２９７−２３０８、２００７に記載のように）。生分解性、生体適合性高分子、例えば、エチレン酢酸ビニール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用可能である。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。また、材料は、市場から入手可能である（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．から）。リポソーム懸濁液（細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を有する特定の細胞を標的とするリポソームを含む）も、また、薬学的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは、例えば、米国特許第４、５２２、８１１号に記載のように、当業者に既知の方法に従って調製できる。
【００７９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、ユニット投与剤形で経口または非経口の組成物を処方することは好都合でありうる。本明細書で使われるユニット投与剤形は、治療される患者に対する単位投与量として適した物理的に離散性のユニットを指す；各ユニットは、必要な医薬品キャリアと協調して所望の治療効果を得るように計算された活性化合物の所定量を含む。
【００８０】
このような化合物の毒性および治療の有効性は、細胞培養または実験動物を使った標準的医薬手順、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）測定手順、により決定できる。毒性と治療効果間の用量比率は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。毒性副作用を示す化合物は、使用可能であるが、正常細胞に対し起こりうる損傷を最小にし、それにより、副作用を減らすために、このような化合物を罹患した組織の部位に標的化するデリバリーシステムを設計するように配慮しなければならない。
【００８１】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトでの使用に対する投与量の範囲を決めるために使用できる。このような化合物の投与量は、通常、毒性がほとんどまたは完全にないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変わりうる。本明細書記載の方法で使用されるいずれの化合物に対しても、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定可能である。細胞培養で測定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量を動物モデルで決定可能である。このような情報は、ヒトの有用な用量をさらに正確に決定するのに使用可能である。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーを使って測定できる。このような組成物を調製し、試験するための情報は、当技術分野で既知である（例えば、レミントン薬科学（第２１版）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．（２００６）参照）。
【００８２】
一部の例では、約０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５０μＭ Ｄ−アミノ酸、例えば、約０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約２５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１０μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または約０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭＤ−アミノ酸が投与される、例えば、０．０００５μＭＤ−アミノ酸〜５０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜２５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜１０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜１μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸が投与される。好ましくは、Ｄ−アミノ酸がナノモル濃度で、例えば、約５ｎＭ、約１０ｎＭで、約１５ｎＭで、約２０ｎＭで、約２５ｎＭで、約３０ｎＭ、約５０ｎＭで、またはそれ超で投与され、または好ましくは、５ｎＭで、１０ｎＭで、１５ｎＭで、２０ｎＭで、２５ｎＭで、３０ｎＭで、または５０ｎＭで投与される。
【００８３】
他の例では、Ｄ−アミノ酸の治療有効量または投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約５ｍｇ／ｋｇ体重、または好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．２５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。
【００８４】
医師は、特定の因子が、患者を効果的に治療するのに必要な投与量に影響する可能性があることを理解している。これらに限定されないが、この因子には、疾患または障害の重症度、前治療、総体的な健康および／または患者の年齢、および他の現在の疾患が含まれる。さらに、Ｄ−アミノ酸の治療有効量での患者の治療は、単回治療または一連の治療を含んでもよい。一例では、患者は、約０．０６ｍｇ〜約１２０ｍｇの範囲で、約１〜１０週の間、あるいは２〜８週の間、約３〜７週の間、または約４、５、もしくは６週の間、毎週１回、または好ましくは０．０６ｍｇ〜１２０ｍｇの範囲で、１〜１０の週の間、あるいは２〜８週の間、３〜７週の間、または４、５、もしくは６週の間、毎週１回Ｄ−アミノ酸で治療される。また、治療に使用されるＤ−アミノ酸の効果的投与量は、特定の治療コースの間で、増加または減少可能であることも理解されよう。
【００８５】
医薬組成物は、投与インストラクションと一緒に、容器、パック、またはディスペンサー中に入れることができる。当業者なら、本明細書記載の医薬組成物は単回用量バイアルとして処方できることを理解するであろう。
【００８６】
本明細書記載の治療有効量のＤ−アミノ酸含有医薬組成物での患者の治療は、単回治療、継続的治療、または複数の用量に分けた一連の治療であってもよい。治療には、単回投与、継続投与、または１つまたは複数の年次にわたる定期的投与を含むことができる。一部の症例で、常習的な長期投与が必要な場合がある。通常、各製剤は、本明細書記載のバイオフィルム関連障害または状態の有害作用または症状の阻害または低減または除去に充分な量を投与される。
【００８７】
Ｄ−アミノ酸は、パーソナルケア製品、例えば、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、液体および固体石けん（合成界面活性剤および飽和および／または不飽和脂肪酸の塩ベースの）、ローションおよびクリーム剤、デオドラント剤、その他の水性のまたはアルコール溶液、例えば、皮膚用クレンジング溶液、モイストクリーニングクロス、オイルまたは粉末に入れる抗バイオフィルム活性物質として適する。挫瘡中で発生する支配的微生物であるアクネ菌は、バイオフィルム中に居住可能である。従って、Ｄ−アミノ酸は、挫瘡管理に使うパーソナルケア組成物として特に適切である。従って、本発明は、また、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸および化粧用として許容できるキャリアまたはアジュバントを含むパーソナルケア製品に関する。
【００８８】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、各種のパーソナルケアに使われる製品に抗バイオフィルム特性を付与するのに適する。パーソナルケア製品は、製品全体重量ベースで約０．０１％〜約１５重量％、例えば、約０．１重量％〜約１０重量％、または０．０１重量％〜１５重量％、例えば、０．１重量％〜１０重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および化粧品として許容できるアジュバントを含んでもよい。パーソナルケア製品の形態に応じて、このような製品は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸に加えて、さらなる成分、例えば、金属イオン封鎖剤、着色剤、香油、肥厚または凝固剤（稠度調節剤）、皮膚軟化薬、ＵＶ吸収剤、皮膚保護剤、抗酸化剤、機械的性質を改善する添加物、例えば、ジカルボン酸および／またはＣ１４〜Ｃ２２脂肪酸のアルミニウム、亜鉛、カルシウムまたはマグネシウム塩、および、任意選択の防腐剤を含んでもよい。
【００８９】
一実施形態では、Ｄ−アミノ酸含有抗挫瘡組成物は、少なくとも１つの抗菌剤を更に含むことができる。好ましくは、抗菌剤は抗生物質である。抗生物質は、トブラマイシン、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、リファンピン、トリクロサン、オキスフロキサシン、マクロライド、ペニシリン、セファロスポリン、アモキシシリン／ｃｌａｖｕｌａｎｔｅ、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、アモキシシリン／スルバクタム、メトロニダゾール、フルオロキノロン、キノロン、ケトライド、またはアミノグリコシドからなる群より選択できる。本発明は、挫瘡を管理する方法を提供し、挫瘡に苦しんでいる患者に有効量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸含有抗挫瘡組成物を投与することを含み、抗挫瘡組成物中のＤ−アミノ酸は、バイオフィルムの防止、低減、阻害または除去に充分な量が含まれる。
【００９０】
パーソナルケア製品は、油中水型または水中油型乳剤、アルコールまたはアルコール含有製品、イオン性または非イオン性両親媒性脂質の小胞性分散液、ゲル、固体スティックまたはエアロゾル製品の形であってもよい。油中水型または水中油型乳剤として、化粧用として許容可能なアジュバントは、好ましくは、約５％〜約５０％のオイル相、約５％〜約２０％の乳化剤および約３０％〜９０％の水、または５％〜５０％のオイル相、５％〜２０％の乳化剤および３０％〜９０％の水を含む。オイル相は、化粧品に適した任意のオイル、例えば、１つまたは複数の炭化水素オイル、ろう、天然オイル、シリコーンオイル、脂肪酸エステルまたは脂肪酸アルコールを含んでもよい。好ましいモノまたはポリオールは、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセリンおよびソルビトールである。
【００９１】
本明細書記載の化粧品処方は、種々の分野で使用できる。このような製品には、例えば、非制限的に、下記が含まれる：
−スキンケア製品、例えば、錠剤型または液体石けんの形の皮膚洗浄およびクレンジング剤、合成デタージェントまたは洗浄ペースト、
−入浴剤、例えば、液体（泡沫浴、乳剤、シャワー剤）または固体浴剤、例えば、入浴用固形香料およびバスソルト；
−スキンケア製品、例えば、皮膚乳剤、マルチエマルジョンまたはスキンオイル；
−化粧用パーソナルケア製品、例えば、デイクリームまたは粉末クリーム、フェースパウダー（ルーズまたは圧密）、ほお紅またはクリーム化粧品、アイケア製品、例えば、アイシャドウ製品、マスカラ、アイライナー、アイクリームまたはアイフィックスクリーム；リップケア製品、例えば、口紅、リップグロス、リップペンシル、ネイルケア製品、例えば、マニキュア、ネイルリムーバー、ネイルハードナーまたはキューティクルリムーバーの形のフェイシャル化粧品；
−インティメイト・ハイジーン製品、例えば、インティメイトウオッシングローションまたはインティメイトスプレー；
−フットケア製品、例えば、フットバス、フットパウダー、フットクリームまたはフットケアバルサム、特殊デオドラント剤および制汗剤または角質除去剤；
−光防御剤、例えば、サンミルク、ローション、クリームまたはオイル、サンブロックまたはトロピカル日焼け防止剤、日焼け前製剤または日焼け後製剤；
−日焼け剤、例えば、セルフタンニングクリーム；
−脱色剤、例えば、皮膚漂白剤または皮膚美白剤；
−防虫剤、例えば、防虫オイル、ローション、スプレーまたはスティック；
−デオドラント剤、例えば、デオドラントスプレー、ポンプ式スプレー、デオドラントゲル、スティックまたはロールオン；
−制汗剤、例えば、制汗剤スティック、クリームまたはロールオン；
−ブレミッシュドスキンのクレンジングおよびケア用製品、例えば、合成デタージェント（固体または液体）、ピーリングもしくはこすり落とし剤またはピーリングマスク剤；
−化学的脱毛剤（脱毛術）、例えば、脱毛パウダー、液体脱毛剤、クリームまたはペーストタイプ脱毛剤、ゲル型またはエアロゾルフォーム型脱毛剤；
−シェービング剤、例えば、シェービングソープ、発泡シェービングクリーム、非発泡シェービングクリーム、フォームおよびゲル、ドライシェービング用プレシェイブ用品、アフターシェイブズまたはアフターシェイブローション；
−香料剤、例えば、フレグランス（オーデコロン、オードトワレ、オードパフューム、パルファン・ド・トワレ、パフューム）、香油またはパフュームクリーム；
−デンタルケア、入れ歯ケアおよび口腔ケア製品、例えば、練り歯磨き、ゲル練り歯磨き、歯磨き粉、うがい薬濃縮剤、抗プラークうがい薬、入れ歯洗浄剤または入れ歯固定剤；
−化粧用ヘアトリートメント製品、例えば、シャンプーおよびコンディショナーの形の洗髪剤、ヘアケア製品、例えば、プレトリートメント製品、ヘアトニック、スタイリングクリーム、スタイリングジェル、ポマード、ヘアリンス、トリートメントパック、ヘアーインテンシブトリートメント、髪型固定剤、例えば、パーマ用毛髪ウエーブ剤（ホットパーマ、マイルドパーマ、コールドパーマ）、縮毛矯正剤、液体セッティング剤、ヘアフォーム、ヘアスプレー、漂白剤、例えば、過酸化水素溶液、ライトニングシャンプー、漂白クリーム、漂白パウダー、漂白ペーストまたはオイル、自己酸化染料、または天然ヘア着色剤、例えば、シコウカまたはカモミール含有、一時的、半永久的または永久的ヘア着色剤。
【００９２】
下記は、調製可能な種々の、１つまたは複数のＤ−アミノ酸含有製剤の非制限的例を示す。１つまたは複数のＤ−アミノ酸を種々の濃度で容易に組み込むことが可能な多種多様な類似の製品が当技術分野で既知である。
【００９３】
代表的石けんは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、０．３〜１重量％の二酸化チタン、１〜１０重量％のステアリン酸、例えば、獣脂脂肪酸またはココナッツ脂肪酸、またはグリセリンのナトリウム塩の石けん基剤添加物１００重量％。
【００９４】
代表的シャンプーは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、１２．０重量％のラウレス−２硫酸ナトリウム、４．０重量％コカミドプロピルベタイン、３．０重量％のＮａＣｌおよび水の添加物１００重量％。
【００９５】
代表的デオドラントは、例えば、下記の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、６０重量％のエタノール、０．３重量％の香油、および水添加物１００重量％。
【００９６】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸医薬組成物を投与して、生物学的関連表面または基質上のバイオフィルム形成を防ぐまたは低減させる。非限定的例として、これらの表面には、気道、肺、口腔、消化管および腟管、耳の内部または目の表面および尿路の上皮または粘膜表面が含まれる。例えば、バイオフィルムは、肺（例えば、肺炎、嚢胞性繊維症、またはＣＯＰＤ患者の肺）の表面、例えば、肺の上皮細胞の表面に悪影響を与える。
【００９７】
特定の実施形態では、表面は、生物学的関連表面であり、体液、例えば、患者の液体成分、例えば、血液、血清、痰、涙腺分泌物、精液、尿、腟分泌物等に接触しがちな表面、および組織試料、等である。生物学的関連表面は、医療機器、装置、またはインプラントの構成要素であってもよい。非制限的例には、クランプ、鉗子、ハサミ、皮膚単鉤、管（例えば、気管内または消化器系チューブ）、ニードル、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、留置カテーテルを含むカテーテル（例えば、泌尿器カテーテル、血管カテーテル、腹膜透析カテーテル、中心静脈カテーテル）、カテーテル部品（例えば、ニードル、ルアーロックコネクター、無針コネクタ）、矯正装置、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、シャント、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡が含まれる。本発明は、長期移植に適合した医療機器の表面上のバイオフィルム蓄積のリスクを実質的に減らす目的に特に適しており、医療機器が約３０日〜約１２ヶ月以上の比較的長期間のあいだ、また、このようなバイオフィルムの痂皮形成および閉塞に起因する装置の早期故障の可能性に対し、移植したまま保持することが意図されている。しかし、このような痂皮形成は、例えば、３０日以下のより短期間後の医療機器で発生する可能性があり、しかも、長期移植装置でも同様であると考えられている。例えば、特定の実施形態では、長期間利用される医療機器は、２４時間以上の長期間、例えば、１週間、移植されている可能性がある。
【００９８】
特定の例では、患者は、医療機器、カテーテル、ステント、人工器官、等の移植／挿入、または創傷被覆材の適用の前、その間、またはその後に、Ｄ−アミノ酸の投与を受けることができる。一部の例では、創傷被覆材には、抗菌剤、例えば、銀が含まれる。移植前またはその後の治療は、移植の直前もしくは直後または移植の数時間前もしくは後に行ってもよく、また、熟練した医師が適切と見なす回数で、１回でも複数回行ってもよい。
【００９９】
Ｄ−アミノ酸は、任意の既知の手段により、例えば、治療的量のＤ−アミノ酸を、表面に被覆する、コーティングする、接触させる、近づける、充填する、または負荷することにより、表面に適用できる。具体的な例では、Ｄ−アミノ酸は、表面にポリマー／Ｄ−アミノ酸フィルムをスプレーすることにより、表面をポリマー／Ｄ−アミノ酸溶液に浸漬することにより、または他の共有結合または非共有結合手法により直接表面に貼り付けられる。他の例では、表面は、Ｄ−アミノ酸を吸収する物質（例えば、ヒドロゲル）で被覆される。
【０１００】
組成物は、コーティングまたはフィルムであってもよい。フィルムまたはコーティングの一部として適用する場合は、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸は、結合剤をも含む組成物の一部としてもよい。結合剤は、本抗バイオフィルムと適合する任意のポリマーまたはオリゴマーであってよい。結合剤は、抗バイオフィルム組成物調製の前のポリマーまたはオリゴマーの形であってもよく、または、基質への適用後を含む調製の間または後の重合により形成されてもよい。特定の適用、例えば、特定のコーティング適用では、適用後の抗バイオフィルム組成物オリゴマーまたはポリマーを架橋させることが望ましいであろう。本明細書で使われる用語の「結合剤」には、材料、例えば、医薬品およびパーソナルケア産業で商業的に使用されているグリコール、オイル、ろうおよび界面活性剤が含まれる。一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ（Ｇ．Ｒ．Ａ．Ｓ．））材料が好ましい。
【０１０１】
組成物が、例えば、カレンダー仕上げまたは共押し出しを含む接着剤の使用または溶融塗布により表面に適用される熱可塑性フィルムの場合は、結合剤は、フィルム調製に使用される熱可塑性ポリマー基質である。組成物がコーティングの場合には、組成物は、液体溶液または懸濁液、ペースト、ゲル、オイルとして適用でき、またはコーティング組成物は、固体、例えば、粉末コーティングでもよく、これは、その後、熱、ＵＶ光他の方法により硬化される。
【０１０２】
本発明の組成物は、コーティングまたはフィルムでもよいので、結合剤は、コーティング調製またはフィルム調製に使用される任意のポリマーを含むことができる。例えば、結合剤は、熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーである。熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーには、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、不飽和ポリアミド、ポリイミド、シリコン含有およびカルバマートポリマー、フッ素化ポリマー、置換アクリルエステル由来、例えば、エポキシアクリラート、ウレタンアクリラートまたはポリエステルアクリラート由来架橋性アクリル樹脂が含まれる。また、ポリマーは、前出材料の混合物でも、共重合体でもよい。
【０１０３】
生体適合性コーティングポリマー、例えば、ポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］（ＰＨＡＥ）ポリエステル（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５２、６５−７０（２００４））もまた、本発明の結合剤として使用可能である。アルキド樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、シリコーン含有ポリマー、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、フッ素化ポリマーおよびビニルアセタートポリマー、ビニルアルコールおよびビニルアミンは、本発明に有用な通常のコーティング結合剤の非制限的例である。他の既知のコーティング結合剤は、本開示の一部である。
【０１０４】
コーティングは、例えば、メラミン樹脂、尿素樹脂、イソシアナート、イソシアヌラート、ポリイソシアナート、エポキシ樹脂、無水物、ポリ酸およびアミンで架橋可能であり、アクセラレータを加えても加えなくてもよい。本明細書記載の組成物は、生物蓄積に好適な条件に暴露される表面に適用される、例えば、コーティングであってもよい。前記コーティング中の本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在が、表面への生物の付着を防ぐ。
【０１０５】
コーティングは溶媒ベースでも水性でもよい。水性コーティングは、通常、より環境に優しいと考えられる。一部の例では、コーティングは、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および結合剤または水ベースコーティングもしくはペンキの水性分散液であってもよい。例えば、コーティングは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸およびアクリル、メタクリル酸またはアクリルアミドポリマーもしくはコポリマーまたはポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］ポリエステルの水性分散液を含んでもよい。
【０１０６】
一部の例では、コーティング組成物は、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、へら引き、または刷毛、ローラーまたは他の塗布器を含む任意の従来の手段により表面に塗装できる。乾燥または硬化時間を考慮して適用してもよい。
【０１０７】
コーティングまたはフィルムの厚さは、用途に応じて変わり得るが、当業者ならわずかな試験の後に容易に決定できる。
【０１０８】
一部の例では、本明細書記載の組成物は、保護用のラミネートフィルムの形であってもよい。このようなフィルムは、熱硬化、熱可塑、エラストマー、または架橋ポリマーを含んでもよい。これらに限定されないが、このようなポリマーの例には、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和のポリエステル、不飽和のポリアミド、ポリイミド、フッ素化ポリマー、シリコン含有およびカルバマートポリマーが含まれる。ポリマーは、また、前述の材料の混合物および共重合体であってもよい。
【０１０９】
本明細書記載の組成物がプリフォームフィルムである場合は、例えば、接着剤の使用、または表面上への共押し出しにより表面に適用可能である。また、本発明のエステルを採用するのが好都合でもあり得るシーラントまたはコーキングの使用が必要と思われる締め具を介して機械的に貼り付けることもできる。プラスチックフィルムは、また、カレンダー仕上げ、溶融塗布およびシュリンクラップを含む熱を使った適用が可能である。
【０１１０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸の広範囲の適用を考えると、Ｄ−アミノ酸含有組成物は、他の添加物、例えば、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、ヒンダードアミン、ホスフィットまたはホスホニット、ベンゾフラン−２−オン、チオ相乗剤、ポリアミド安定剤、金属ステアラート、核形成剤、充填剤、強化剤、潤滑剤、乳化剤、染料、顔料、分散剤、他の光学的光沢剤、難燃剤、帯電防止剤、発泡剤、等、例えば、下記に列挙した材料、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【０１１１】
プラスチックから調製される医療機器は、成形中に、例えば、成形プロセスの間にＤ−アミノ酸を組み入れることができる。本方法により利益を得るプラスチックベース医療機器には、これらに限定されないが、医薬の分野で使われるプラスチック製品、例えば、包帯材料、注射器、カテーテル、等、いわゆる「医療機器」、手袋およびマットレスが含まれる。このようなプラスチックスの代表例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＣ、ＰＯＭ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルおよびメタクリル酸、ポリブタジエン、熱可塑性ポリオレフィン、アイオノマー、不飽和ポリエステルならびにＡＢＳ、ＳＡＮおよびＰＣ／ＡＢＳを含むポリマー樹脂の混合物である。
【０１１２】
Ｄ−アミノ酸、特に低濃度のものは、摂取の可能性のある用途、例えば、バイオフィルム発生の可能性のある再利用可能水ボトルまたは飲用容器であっても安全に使用可能である。このような水輸送機器の表面は、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を含む製剤で洗浄可能であり、または低レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、導管を通過する水の中に導入可能である。例えば、約０．０００１重量％未満または約１重量％までの、典型的には、約０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をこのような水中に導入できる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．１％、例えば、約０．０００００１％〜約０．０１％、または約０．０００００１％〜約０．００１％、または０．０００００１％〜０．１％、０．０００００１％〜０．０１％、または０．０００００１％〜０．００１％の濃度が、このような用途に使用可能である。
【０１１３】
コーティングまたはフィルムで使用される場合は、少量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が、短期の使用、例えば、単回使用、季節的または廃棄用品、特にスプリント、カテーテル、管、歯科設備等、ヒトとの接触の可能性のある用途に提示可能である。一般的に、重量ベースで、約０．００１％未満から約５％まで、例えば、約３％までもしくは約２％まで、または好ましくは０．００１％未満から５％まで、３％までもしくは２％までの１つまたは複数のアミノ酸をこのようなコーティングまたはフィルムに使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．５％、または約０．０００１％〜約０．０１％、または好ましくは、０．０００１％〜１％、０．０００１％〜０．５％、もしくは０．０００１％〜０．０１％の濃度の１つまたは複数のＤ−アミノ酸がコーティング用途で使用可能である。
【０１１４】
成形プラスチック製品への組込みに対しては、約０．００００１％〜約１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能で、例えば、重量ベースで、約０．０００１％〜約３％、例えば、約０．００１％から約１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、または好ましくは、０．００００１％〜１０％、０．０００１％〜３％、０．００１％から１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。すでに成形済みの製品または線維の表面中にＤ−アミノ酸が含浸された状況では、表面に存在するＤ−アミノ酸の実際の量は、基質材料、含浸組成物の配合、および含浸ステップの間に使われた時間と温度に依存すると思われる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．１％、もしくは約０．０００１％〜約０．０１％の濃度がプラスチックスに使用可能であり、または好ましくは、０．０００１％〜１％、０．０００１％〜０．１％、もしくは、０．０００１％〜０．０１％の１つまたは複数のアミノ酸が使用可能である。
【０１１５】
Ｄ−アミノ酸を使った治療によるバイオフィルムの阻害または減少は、当技術分野で充分に確立された技術を使って測定できる。これらの技術は、吸着生物の発色を測定し、顕微鏡法を使ってインビボで微生物を観察することにより細菌の付着を評価すること、または毒性試薬に応答したバイオフィルム中の細胞死をモニターすることを可能にする。治療後、バイオフィルムは、バイオフィルムに覆われている表面積、厚さ、および一貫性（例えば、バイオフィルムの健全性）を減らすことができる。バイオフィルムアッセイの非制限的例には、マイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイ、蛍光ベースバイオフィルムアッセイ、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６９３-３７０１（２００５）による静的バイオフィルムアッセイ、空気液体界面アッセイ、コロニーバイオフィルムアッセイ、およびＫａｄｏｕｒｉ Ｄｒｉｐ−Ｆｅｄバイオフィルムアッセイ（Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、（２００５）微生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１．Ｂ．１．１−１．Ｂ．１．１７）が含まれる。このようなアッセイは、バイオフィルム形成の破壊または阻害に対するＤ−アミノ酸の活性の測定に使用できる（Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７（６）：６６３−７２；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００６）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ５（１）：３２−６）。
【０１１６】
他の例では、治療は、細菌の増殖を測定することによりアッセイ可能であり、および／または生物試料中のバイオフィルム形成細菌の密度を測定することにより定量可能である。生物試料の非制限的例には、血液、血清、痰、涙腺分泌物、精液、尿、腟分泌物、および組織試料が含まれる。細菌の増殖の減少は、また、胸部Ｘ線または肺の機能試験（ＰＦＴ）（例えば、肺活量測定または強制呼気量（ＦＥＶ１））により測定可能である。
【０１１７】
他の状況では、バイオフィルム産生細菌の存在または増殖は、例えば、上述の生物試料中のバイオフィルム産生細菌の抗原の存在を検出することにより測定可能である。例えば、肺炎球菌成分に対する抗体は、例えば、生物試料中の連鎖球菌抗原の存在をアッセイすることにより、バイオフィルム関連状態または障害に苦しんでいる患者のコロニー形成／感染をアッセイするために使用できる。このような抗体は、当技術分野で充分に確立された方法に従って産生することができ、または、市販品として入手することができる（例えば、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；またはＧｅｎｅＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、から）。
【０１１８】
Ｄ−アミノ酸によるバイオフィルム関連障害の治療のための適切な治療薬は、当技術分野で充分に確立された技術を使って決定できる。例えば、哺乳動物を使った動物モデルを使用して、Ｄ−アミノ酸を使った治療の有効性を評価可能である。非制限的例には、ポリマービーズ、例えば、Ｄ−アミノ酸を加えたポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）ビーズをラットに移植し、バイオフィルムを防ぐ能力を評価することが含まれる。ラット中のポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）ビーズおよびウサギ中のカテーテルは、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成のための動物モデルとして使用されている。Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｚｏ ｅｔ ａｌ．、抗微生物剤および化学療法（ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ）、Ｊｕｌｙ ２００７、ｐ．２５９４-２５９６、およびＢｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、Ｊｕｌｙ ２００４、ｐ．４６６５-４６８４を参照。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
併用療法
ごく一般的には、バイオフィルムは、生存または非生存微生物、特に、細菌の集合体であり、細胞外高分子物質（ＥＰＳ基質）、例えば、多糖類の形のそれらの代謝物と一緒に、生存および非生存表面に付着している、と理解されている。通常、浮遊細胞に対して顕著な増殖阻害または致死作用を示す抗バイオフィルム物質の活性は、例えば、生物学的基質中への活性物質の不十分な浸透のために、バイオフィルム中に組み込まれた微生物に関しては大きく低減する可能性がある。
【０１２０】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは第２の試薬、例えば、殺生物剤、抗生物質、または抗菌剤と組み合わせて投与し、バイオフィルムを治療する、またはバイオフィルムの形成を防ぐことができる。抗生物質は、Ｄ−アミノ酸と順次に、または同時に投与してもよい。例えば、いずれかの本明細書記載の組成物は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸および１つまたは複数の第２の試薬を含むように処方できる。
【０１２１】
抗生物質は、細菌の増殖を阻害する、または細菌を死滅させ得る当業者に既知の任意の化合物でよい。有用な抗生物質の非制限的例には、リンコサミド（クリンダマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）；アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）；ベータ−ラクタム（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム）；糖ペプチド抗生物質（例えば、バンコマイシン）；ポリペプチド抗生物質（例えば、バシトラシン）；マクロライド（エリスロマイシン）、アンフォテリシン；スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェナイド、ｐ‐アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗シュードモナス（例えば、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン）またはそれらのいずれかの塩もしくは変異体が含まれる。このような抗生物質は、市販品として、例えば、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ、Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、およびＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）から入手可能である。使用される抗生物質は、細菌感染のタイプに依存する。
【０１２２】
追加の既知の殺生物剤には、ビグアナイド、クロルヘキシジン、トリクロサン、二酸化塩素、等が含まれる。
【０１２３】
抗菌剤の有用な例には、これらに限定されないが、次のものが含まれる：ピリチオン、特に、亜鉛錯体（ＺＰＴ）；Ｏｃｔｏｐｉｒｏｘ（登録商標）；ジメチルジメチロールヒダントイン（Ｇｌｙｄａｎｔ（登録商標））；メチルクロロイソチアゾリノン／メチルイソチアゾリノン（Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（登録商標））；ナトリウムスルフィット；ナトリウムビスルフィット；イミダゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｌｌ １１５（登録商標））、ジアゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｉｌｌ ＩＩ（登録商標））；ベンジルアルコール；２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ（登録商標））；ホルマリン（ホルムアルデヒド）；ヨードプロペニルブチルカルバマート（Ｐｏｌｙｐｈａｓｅ Ｐ１００（登録商標））；クロルアセトアミド；メタンアミン；メチルジブロモニトリルグルタロニトリル（１、２−ジブロモ−２、４−ジシアノブタンまたはＴｅｋｔａｍｅｒ（登録商標））；グルタルアルデヒド；５−ブロモ−５−ニトロ−１、３−ジオキサン（Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標））；フェネチルアルコール；ｏ−フェニルフェノール／ナトリウムｏ−フェニルフェノール；ナトリウムヒドロキシメチルグリシナート（Ｓｕｔｔｏｃｉｄｅ Ａ（登録商標））；ポリメトキシ二環式オキサゾリジン（ＮｕｏｓｅｐｔＣ（登録商標））；ジメトキサン；チメロサール；ジクロロベンジルアルコール；カプタン；クロルフェネシン；ジクロロフェン；クロロブタノール；グリセリルラウラート；ハロゲン化ジフェニルエーテル；２、４、４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシ−ジフェニルエーテル（トリクロサン（登録商標）またはＴＣＳ）；２、２’−ジヒドロキシ−５、５’−ジブロモ−ジフェニルエーテル；フェノール性化合物；フェノール；２−メチルフェノール；３−メチルフェノール；４−メチルフェノール；４−エチルフェノール；２、４−ジメチルフェノール；２、５−ジメチルフェノール；３、４−ジメチルフェノール；２、６−ジメチルフェノール；４−ｎ−プロピルフェノール；４−ｎ−ブチルフェノール；４−ｎ−アミルフェノール；４−ｔｅｒｔ−アミルフェノール；４−ｎ−ヘキシルフェノール；４−ｎ−ヘプチルフェノール；モノおよびポリアルキルおよび芳香族ハロフェノール；ｐ−クロロフェノール；メチルｐ−クロロフェノール；エチルｐ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｐ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｐ−クロロフェノール；ｎ−アミルｐ−クロロフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−クロロフェノール；シクロヘキシルｐ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｐ−クロロフェノール；ｎ−オクチルｐ−クロロフェノール；ｏ−クロロフェノール；メチルｏ−クロロフェノール；エチルｏ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｏ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｏ−クロロフェノール；ｎ−アミルｏ−クロロフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｏ−クロロフェノール；ｏ−ベンジルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ；ｍ−ジメチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；３−メチルｐ−クロロフェノール；３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−ｎ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−エチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−ブチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−イソ−プロピル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ジエチルメチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−２−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−ｓｅｃ−アミル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；２−ジエチルメチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−オクチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール：ｐ−ブロモフェノール；メチルｐ−ブロモフェノール；エチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−プロピルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ブチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｐ−ブロモフェノール；シクロヘキシルｐ−ブロモフェノール；ｏ−ブロモフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−ブロモフェノール；ｎ−プロピル−ｍ、ｍ−ジメチルｏ−ブロモフェノール；２−フェニルフェノール；４−クロロ−２−メチルフェノール；４−クロロ−３−メチルフェノール；４−クロロ−３、５−ジメチルフェノール；２、４−ジクロロ−３、５−ジメチルフェノール；３、４、５、６−テラブロモ−２−メチルフェノール；５−メチル−２−ペンチルフェノール；４−イソプロピル−３−メチルフェノール；パラ−クロロ−メタ−キシレノール（ＰＣＭＸ）；クロロチモール；フェノキシエタノール；フェノキシイソプロパノール；５−クロロ−２−ヒドロキシジフェニルメタン；レゾルシノールおよびその誘導体；レゾルシノール；メチルレゾルシノール；エチルレゾルシノール；ｎ−プロピルレゾルシノール；ｎ−ブチルレゾルシノール；ｎ−アミルレゾルシノール；ｎ−ヘキシルレゾルシノール；ｎ−ヘプチルレゾルシノール；ｎ−オクチルレゾルシノール；ｎ−ノニルレゾルシノール；フェニルレゾルシノール；ベンジルレゾルシノール；フェニルエチルレゾルシノール；フェニルプロピルレゾルシノール；ｐ−クロロベンジルレゾルシノール；５−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；５−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；ビスフェノール酸化合物；２、２’−メチレンビス−（４−クロロフェノール）；２、２’−メチレンビス−（３、４、６−トリクロロフェノール）；２、２’−メチレンビス（４−クロロ−６−ブロモフェノール）；ビス（２−ヒドロキシ−３、５−ジクロロフェニル）スルフィド；ビス（２−ヒドロキシ−５−クロロベンジル）スルフィド；安息香酸エステル（パラベン）；メチルパラベン；プロピルパラベン；ブチルパラベン；エチルパラベン；イソプロピルパラベン；イソブチルパラベン；ベンジルパラベン；ナトリウムメチルパラベン；ナトリウムプロピルパラベン；ハロゲン化カルバニリド；３、４、４’−トリクロロカルバニリド（トリクロカーバン（登録商標）またはＴＣＣ）；３−トリフルオロメチル−４、４’−ジクロロカルバニリド；３、３’、４−トリクロロカルバニリド；クロルヘキシジンおよびそのジグルコナート；ジアセタートおよびジヒドロクロリド；ウンデセン酸；チアベンダゾール、ヘキセチジン；ポリ（ヘキサメチルエネビグアニド）塩酸塩（Ｃｏｓｍｏｃｉｌ（登録商標））；銀化合物、例えば、有機銀塩またはＪＭ Ａｃｔｉｃａｒｅ（登録商標）および微粒子化した銀粒子等のそれらの製剤を含む無機銀塩、銀塩化物。
【０１２４】
バイオフィルム関連障害
Ｄ−アミノ酸を使った方法および治療は、生物体の増殖を阻害することもなく、またはことさら阻害することなく、バイオフィルムの形成の阻害または防止することを含み、また、一旦形成されたバイオフィルムの破壊を含む。
【０１２５】
Ｄ−アミノ酸は、患者のバイオフィルム形成を減らす有効量のＤ−アミノ酸を患者に投与することにより、患者のバイオフィルム関連障害を治療するために使用できる。細菌増殖の減少は、患者のバイオフィルム産生の減少または阻害を表す。
【０１２６】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム成形細菌の表面への付着を減少させることにより、または細菌の死滅を増やすことにより、バイオフィルム形成を阻害または低減することができる。この治療手法は、バイオフィルム関連障害もしくは状態、または微生物のバイオフィルム形成に関連した医療機器関連感染症の治療のために使用可能である。
【０１２７】
バイオフィルム関連障害の非制限的例には、中耳炎、前立腺炎、膀胱炎、気管支拡張症、細菌性心内膜炎、骨髄炎、虫歯、歯周病、感染性腎結石、挫瘡、レジオネラ症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および嚢胞性繊維症が含まれる。一具体的例では、嚢胞性繊維症患者は、肺と消化管中にバイオフィルムの蓄積が認められる。ＣＯＰＤ、例えば、肺気腫および慢性気管支炎に罹患している患者は、気道の特徴的炎症を示し、この気道を通り、その後、肺から出ていく気流が慢性的に妨害される。
【０１２８】
バイオフィルム関連障害は、また、移植／挿入機器由来の感染である医療機器関連感染症、例えば、胆汁ステント由来の感染、整形外科インプラント感染、およびカテーテル関連感染（腎臓、血管、腹膜）を包含してもよい。また、感染は、皮膚および／または軟組織の健全性が損なわれている部位から始まる可能性がある。非制限的例には、皮膚炎、末梢血管疾患由来潰瘍、火傷、および外傷が含まれる。例えば、グラム陽性菌、例えば、肺炎球菌は、このような組織の日和見感染の原因になりうる。肺炎球菌の火傷部位に感染する能力は、例えば、皮膚の破損、火傷関連免疫不全、および抗生物質選択により強化される。
【０１２９】
一部の例では、患者は治療される。患者は、霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳動物であってもよい（これらに限定されない）。患者は、非ヒト動物、例えば、トリ（例えば、ウズラ、ニワトリ、もしくはシチメンチョウ）、家畜（例えば、雌ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、もしくはヒツジ）、ペット（例えば、ネコ、イヌ、もしくはモルモット、ラット、もしくはマウス）、または実験動物（例えば、障害用動物モデル）であってもよい。非制限的な代表的患者は、ヒト乳児、思春期前小児、青年、成人、または中年／高齢成人であってもよい。
【０１３０】
一部の例では、治療を必要としている患者は、１つまたは複数の本明細書記載の感染または障害に罹患している患者でありうる。一部の例では、患者は、生物学的関連表面でバイオフィルムを発生する危険に曝されている、または既にこのようなバイオフィルムを発生させている。このような危険に曝されている患者は、Ｄ−アミノ酸による治療の候補であり、これにより、バイオフィルム産生関連障害／状態の発生または発症を阻害する、またはバイオフィルム関連障害または状態の１つまたは複数の症状の再発、発症、もしくは進行を防ぐことができる。このような患者は、当業者には臨床的に明らか、または検出可能であるが、まだ完全には形成されていない未成熟バイオフィルムを宿している可能性がある。留置装置、例えば、医療機器の移植が予定されている患者もまた、バイオフィルム発生の危険のある患者である。また、バイオフィルム発生の危険は、バイオフィルム関連疾患（例えば、嚢胞性繊維症に関連するチャネルトランスポーター変異の存在）の発生の傾向に起因する可能性がある。このようなバイオフィルム関連障害の患者は、初期段階、例えば、細菌感染および／またはバイオフィルム形成がまだ検出されない段階にある可能性がある。
【０１３１】
特定の例では、本明細書記載の方法は、嚢胞性繊維症患者の気道中のバイオフィルム形成を防ぐために使用可能である。このような患者は、気道の細菌感染のない間に、または細菌感染の検出時に治療できる。
【０１３２】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これは、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではない。室温は、２０〜２５℃の範囲の温度を示す。
【実施例】
【０１３３】
材料と方法
株と培地。 Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃またはＭＳｇｇ培地（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１６２１（２００１））中、２３℃で枯草菌ＮＣＩＢ ３６１０およびその誘導体を成長させた。固形培地には、１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒを添加した。必要な場合は、枯草菌の増殖用に抗生物質を次の濃度で添加した：テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、およびエリスロマイシン５μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌ。
【０１３４】
本実験で使った株：
全枯草菌株は、強固なバイオフィルムを形成する野生株のＮＣＩＢ３６１０の誘導体である（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）） ；
株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ ｃａｔ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ ｓｐｅｃ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＩＫＧ５５（ΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃ ΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲ） ；
株ＤＲ−３０（ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｃａｔ）；
株ＩＫＧ４０（ｙｑｘＭ２）；
株ＩＫＧ４４（ｙｑｘＭ６）；
株ＩＫＧ５０（ｙｑｘＭ２ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
株ＩＫＧ５１（ｙｑｘＭ６ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
ブドウ球菌ＳＣ０１（Ｋｏｌｔｅｒ ｌａｂコレクション由来）。
【０１３５】
株構築。標準的手法を使って株を構築した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ、２００１）。ロングフランキングＰＣＲ変異誘発を使ってΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃおよびΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲを生成した（Ｗａｃｈ、Ｙｅａｓｔ １２：２５９（１９９６））。ＤＮＡを、コンピテント細胞のＤＮＡ媒介形質転換により、株ＰＹ７９誘導体中に導入した（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：３１８（１９７８））。ＳＰＰ１ファージ媒介形質導入を使って、抗生物質耐性結合変異をＰＹ７９誘導体からＮＣＩＢ ３６１０中に導入した（Ｙａｓｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１３４３（１９７４））。
【０１３６】
試薬。 アミノ酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。１４Ｃ−Ｄ−チロシンおよび１４Ｃ−Ｌ−プロリンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１３７】
コロニーおよびペリクル形成。固形培地上へのコロニー形成形成のために、細胞を最初にＬＢ培地中で指数増殖期迄増殖し、３μｌの培養液を１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ含有固形ＭＳｇｇ培地上に配置した。プレートを２３℃でインキュベートした。液体培地中のペリクル形成のために、細胞を指数増殖期迄成長させ、１２ウエルプレート（ＶＷＲ）中で、６μｌの培養液を６ｍｌの培地と混合した。プレートを２３℃でインキュベートした。コロニーとペリクルの画像をＳＰＯＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で撮影した。
【０１３８】
馴化培地の調製。ＬＢ培地中で細胞を指数増殖期まで成長させた。０．１ｍｌの培養液を１００ｍｌのＭＳｇｇ培地に添加し、５００ｍｌビーカー中、２３℃で振盪を加えずに成長させた。次に、遠心分離を使って８、０００ｒｐｍ、１５分間ペリクルおよび馴化培地を集めた。馴化培地（上清液）を取りだし、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾液を２４℃で貯蔵した。さらなる精製のために、Ｃ−１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカートリッジを使って、５％毎のステップの０％〜１００％メタノールによる段階的溶出により、バイオフィルム阻害活性を分別した。
【０１３９】
馴化培地中のＤ−アミノ酸の特定および定量化。（Ａ）アミノ酸の定量化。Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐの標準溶液を種々の濃度（０．００１〜０．２ｍＭ）で調製した。これらの溶液を０％〜６０％から１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）のステップ勾配溶媒系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ ４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）の（０−１２−２０分）の条件でＬＣ／ＭＳで分析し、イオンカウント積分により各アミノ酸濃度の検量線を得た。馴化培地試料を、全４つのキラルアミノ酸の全体濃度測定と同じ方法でＬＣ／ＭＳを使って分析した。（Ｂ）Ｄ−アミノ酸の特定。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥し、１００μＬの１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解した。１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ＦＤＡＡ（Ｎ−（２、４−ジニトロ−５−フルオロ−フェニル）−Ｌ−アラニンアミド）溶液をアセトン中で調製し、５０μＬのアセトン溶液を１Ｎ ＮａＨＣＯ３中の試料に添加した。反応混合物を８０℃で５分間インキュベートし、５０μＬの２Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。誘導体を、１０％〜１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）の勾配溶媒系を使って３０分間にわたりＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣ／６１３０シリーズＭＳ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）を使って分析した。Ｌ−ＦＤＡＡ−アミノ酸の保持時間をＬ−ＦＤＡＡ真性標準アミノ酸と比較した。
【０１４０】
クリスタルバイオレット染色。細胞を６ウエルプレートで成長させたこと以外は、以前記載したのと同様にクリスタルバイオレット染色を行った（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９５（１９９８））。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄し、完全に乾燥した。
【０１４１】
蛍光顕微鏡観察。蛍光顕微鏡分析用として、１ｍｌの培養液を採取した。細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５０μｌのＰＢＳ緩衝液中に懸濁した。カバースライドをポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。試料をＯｌｙｍｐｕｓワークステーションＢＸ６１顕微鏡を使って調査した。自動化ソフトウェアプログラムＳｉｍｐｌｅＰＣＩを使って画像を取り込み、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って解析した。
【０１４２】
透過型電子顕微鏡観察および免疫標識。試料を蒸留水で希釈し、炭素またはホルムバール／炭素被覆グリッド上に吸着させた。真空エバポレーター中でグロー放電で使用する前にグリッド表面を親水性にした。試料がフィルム表面上に吸着されるとすぐに、過剰試料を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で拭き取り、グリッドを５μｌの染色溶液（１〜２％水性ウラニルアセタート）上に数分間浮かべた後、拭き取った。試料を乾燥し、Ｔｅｃｎａｉ（登録商標）Ｇ2ＳｐｉｒｉｔＢｉｏＴＷＩＮ顕微鏡を使い、加速電圧８０ＫＶで調査した。ＡＭＴ ２ｋ ＣＣＤカメラで画像を撮影した。
【０１４３】
ＴａｓＡの免疫局在性のために、ニッケルグリッド上の希釈試料を０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ中の１％脱脂粉ミルクから成るブロッキング緩衝液上に３０分間浮かべ、ブロッキング緩衝液で１：１５０に希釈した抗ＴａｓＡ一次抗体と共に２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ウサギ２０ｎｍ金二次抗体（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に１時間暴露し洗浄した。全てのグリッドをウラニルアセタートおよび鉛シトラートで染色した後、上述のように観察した。
【０１４４】
β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイ。細胞をＭＳｇｇ培地中、３７℃でウォーターバスを使って浸透を加えながら培養した。１ｍｌの培養液を各時点で採取した。β−ガラクトシダーゼ活性を以前に記載の方法と同様に測定した（Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２５４（２００８））。
【０１４５】
アミノ酸の細胞壁への組込み。増殖の指数増殖期の中間点で５０ｍｌの培養液中の細胞を遠心分離により採取し、０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、５ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、１０μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリンで治療し、３７℃で２時間、さらにインキュベートした。全細胞および細胞壁画分の放射能をモニターし、間隔を置いて試料を取り出した。全細胞中への取り込みの測定用として、０．１ｍｌの試料を採取した。細胞壁への取り込みの測定用として、０．５ｍｌの試料を採取した。細胞を遠心分離により採取し、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム含有ＳＭ緩衝液［０．５Ｍショ糖、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭカリウムホスファート、ｐＨ（６．８）］中に再懸濁した。次に、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、得られたプロトプラストを５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により取り出し、細胞壁物質を上清液中に残した。細胞壁画分はタンパク質を含まないことが、抗シグマＡ抗体を使った免疫ブロット法分析により確認された。最後に、１０ｍｌの５％トリクロロ酢酸を全細胞試料および細胞壁物質に添加し、氷上で少なくとも３０分間維持した。ＴＣＡ不溶性物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｍ孔径、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に採取し、５％ＴＣＡで洗浄した。フィルターを風乾し、シンチレーションバイアル中に置き、シンチレーションカウンターを使って、ＴＣＡ不溶性物のカウント／分を測定した。
【０１４６】
実施例１．枯草菌により形成されたバイオフィルム中のＤ−アミノ酸の選別
枯草菌は、バイオフィルムを誘導培地中での３日間のインキュベーション後の静置培養空気／液体界面に分厚いペリクルを形成する（図１Ａ）。しかし、追加の３から５日のインキュベーションにより、ペリクルは、その構造的健全性を失う（図１−Ｂ）。成熟バイオフィルムが、バイオフィルム分解の引き金を引く因子を産生するのかどうかを調べるために、馴化培地の濃縮および部分精製抽出物の新しい培地に添加した場合のペリクル形成に与える効果をアッセイした。この目的のために、８日間培養液由来の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに負荷した。次に、そのカラムからの濃縮した溶出液を、新しく播種した培養液に添加した。等容量の馴化培地由来の物質の２５％に相等する濃縮溶出液の量が、ペリクル形成を防ぐのに充分であった（図１Ｃ）。対照としての、３日間培養液由来の馴化培地を使って調製した追加の濃縮溶出液は、ペリクル形成に対しほとんどまたは全く効果を示さないことが観察された（図１Ｄ）。さらなる因子の精製は、メタノールの濃度増加と共にカートリッジを段階的に溶出することにより達成された。４０％メタノールでの溶出により、ペリクル形成の阻害に対し高度に活性な画分が得られた（図１Ｅ）。しかも、この物質は、細胞成長にはほとんどまたは全く影響を与えなかった。バイオフィルム阻害活性は、１００℃で２時間の加熱およびプロテイナーゼＫ処理に耐性を示した（図１Ｆ）。
【０１４７】
Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンが、液体および固形培地の両方で、枯草菌によるバイオフィルム形成を阻害するものとして選別された（図２Ａ、５、６）。図２Ａは、バイオフィルムを誘導する培地中の新しく播種した培養液中へのＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）の添加の、３日間のインキュベーション後のペリクル形成に対する効果を示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方が、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。同様に、図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充したＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたウエルを示す。Ｄ−アミノ酸のみが、バイオフィルム形成の阻害に対し活性であった。
【０１４８】
図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充した固形ＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートしたプレートを示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方がバイオフィルム形成を阻害した。
【０１４９】
Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンは、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。対照的に対応するＬ−異性体および他のアミノ酸のＤ−異性体、例えば、Ｄ−アラニンおよびＤ−フェニルアラニンは、枯草菌に対するバイオフィルム阻害アッセイで有効ではなかった。
【０１５０】
次に、バイオフィルム形成を防ぐのに必要な最小濃度（ＭＩＣ：最小阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を測定した。図２Ｂに示すように、それぞれのＤ−アミノ酸は、活性が変わり、Ｄ−チロシンが最も有効であった。Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−ロイシンは、約１ｍＭのＭＩＣであり、一方、Ｄ−チロシンは、約１００ｎＭのＭＩＣである。著しいのは、全ての４つのＤ−アミノ酸の混合物（等モル量の）は、特に強力で、１０ｎＭ未満のＭＢＩＣであった。従って、Ｄ−アミノ酸は、相乗的に作用する。Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成を阻害するのみでなく、既存バイオフィルムを破壊した。図２Ｃは、３日間培養液を示し、これに対し、どのアミノ酸も添加されない（未治療）、またはＤ−チロシン（３μＭ）が添加された、またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物が添加されたものに対し、続いて、さらに８時間インキュベーションを行った。Ｄ−チロシンまたは４つのＤ−アミノ酸の混合物の追加により、８時間の間に、ペリクルの顕著な崩壊が起こった。
【０１５１】
Ｄ−アミノ酸は、これらのアミノ酸のα−炭素立体中心をＬ−型からＤ−型へ変換する酵素であるアミノ酸ラセマーゼにより生成される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０３（２００３））。バイオフィルム阻害因子はＤ−アミノ酸であるという考えと一致する遺伝的証拠は、ｙｌｍＥおよびｒａｃＸ、遺伝子の変異体を使って得られ、その予測された産物は、既知のラセマーゼに類似の配列を示した。ｙｌｍＥまたはｒａｃＸ単独に対する株変異体は、ペリクル分解の中程度の遅延を示した（データは示さず）。図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートした、ＮＣＩＢ３６１０（ＷＴ）ならびにｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）に対し２重に欠失した株変異体示す。想定上のラセマーゼである二重変異体細胞により形成されたペリクルの分解が有意に遅延し、ラセマーゼ活性が特異的に低減した株もまた、低減した抗バイオフィルム阻害を示すことを示唆している。また、二重変異体由来馴化培地は、野性型由来の馴化培地とは対照的に、バイオフィルム形成阻害に関し無力であった。図２Ｄは、野性型または二重変異体が有意なバイオフィルム成長を示すｙｌｍＥおよびｒａｃＸの二重株変異体（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地の濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。
【０１５２】
次いで、Ｄ−アミノ酸がバイオフィルム成熟の間に産生されるのかどうか、また、成熟バイオフィルムの分解を説明するのに充分な存在量で産生されるのかどうかを測定した。従って、ＬＣ／ＭＳを行い、続いて、ペリクル形成の初期および後期に採取した馴化培地に対し、Ｎα−（２、４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（Ｌ−ＦＤＡＡ）による誘導体化を使ってＤ−アミノ酸を特定した。Ｄ−チロシン（６μＭ）、Ｄ−ロイシン（２３μＭ）、およびＤ−メチオニン（５μＭ）は、６日目までにバイオフィルム形成を阻害するのに必要な、またはそれ超の濃度で存在したが、３日目には、１０ｎＭ未満の濃度で、例えば、バイオフィルム形成を阻害するのに十分ではないレベルで存在したという結果であった。
【０１５３】
馴化培地と同様に、Ｄ−アミノ酸は、細胞成長を阻害せず、基質オペロンｅｐｓおよびｙｑｘＭの発現も阻害しなかった（図８〜９）。図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える影響を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。Ｄ−アミノ酸治療培養液中の細胞成長は、実質的に未治療試料と同じであった。図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ保有）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ保有）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。この場合も、Ｄ−アミノ酸治療試料にたいするｙｑｘＭおよびｅｐｓ発現は、実質的に未治療試料と同じであった。
【０１５４】
Ｄ−アミノ酸は、細胞壁のペプチドグリカン成分のペプチド架橋中に組み込まれることを以前報告した。確認のため、細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。図３Ａは、放射性Ｄ−チロシンの細胞壁への組込みを示す。１４Ｃ−Ｄ−チロシンを使って、Ｄ−チロシン（１４Ｃ−Ｌ−プロリンではそうではないが）は、細胞壁に組み込まれたことが示された。結果を細胞中への合計組込み（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）のパーセントで表す。
【０１５５】
細胞壁中に組み込まれたＤ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維を細胞への固定から離脱させることが可能かどうかを調べるために、ＴａｓＡと蛍光のレポーターｍＣｈｅｒｒｙの機能性融合体の局在化を調べた。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体を含む細胞由来の合計蛍光を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（６μＭ）の存在または非存在下のバイオフィルム誘導培地中で振盪を加えながら定常期まで成長させた。図３Ｂに示すように、Ｄ−チロシンによる治療は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの合計蓄積に対しほとんどまたは全く効果がなかった。細胞を遠心分離で洗浄し、再懸濁した後、蛍光顕微鏡で調べたが、未治療細胞（凝集していることが多い）は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙで強力に装飾されていることが認められた。対照的に、Ｄ−チロシン治療細胞（ほとんど非凝集）は、低レベルの蛍光を示すに過ぎなかった。Ｄ−ロイシンおよび４つのＤ−アミノ酸等モル混合物でも、同様の結果が得られた。非修飾ＴａｓＡタンパク質の局在化もまた、金標識抗ＴａｓＡ抗体を使って透過電子顕微鏡で解析された。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ繊維の細胞会合を示す。２４時間培養液を、Ｄ−チロシン無し（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加あり（画像３〜６）の場合で、追加の１２時間のインキュベートを行った。ＴａｓＡ繊維を、抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、実施例に記載のように透過電子顕微鏡により可視化した。外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像処理が著しく改善されたので、細胞は、菌体ｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）の変異であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し、中空矢印はそれぞれの繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは、１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドルを示し、画像３、４および６は、細胞から離脱した個別繊維およびバンドルを示し、画像３〜５は、繊維物質がほとんど無いか全く無い細胞を示す。ＴａｓＡ繊維は、未治療ペリクルの細胞に固定されているように見えた（図３Ｄ、画像１と２）。対照的に、Ｄ−チロシンで１２時間治療した細胞は、ＴａｓＡ繊維ではほとんど装飾されていない細胞の混合物および細胞に固定されていない遊離ＴａｓＡ繊維または繊維凝集体で構成されていた（図３Ｄ、画像３〜６）。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−チロシンがバイオフィルムを治療する１つの機序は、細胞による繊維の脱落の導入である可能性がある。
【０１５６】
Ｄ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を破壊することにより作用することの遺伝的証拠をＤ−チロシン耐性変異体の単離から入手した。図４Ａは、Ｄ−チロシン非含有または含有固形（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。Ｄ−チロシン（図４Ａ）またはＤ−ロイシン（データを示さず）含有固形培地上で成長の間に形成された平坦コロニー上に、しわの寄った乳頭状突起が自然に現れた。重要なことは、全ての４つの活性Ｄ−アミノ酸を含むプレート上には、このような乳頭状突起は出現しなかったことである。精製される場合、これらの自然の変異体は、Ｄ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在下、しわの寄ったコロニーやペリクルを生じた。いくつかのこのような変異体が単離されたが、大抵は、ｙｑｘＭオペロンまたはその近くに変異を含んでいた。２つの変異が詳細に調査され、７５９塩基対長ｙｑｘＭ遺伝子の３’末端近傍のフレームシフト変異であることがわかった。ｙｑｘＭ２は、ｙｑｘＭ読み取り枠中の塩基対７２８の位置のＧ：Ｃの挿入であり、ｙｑｘＭ６は、塩基対５６８の位置のＡ：Ｔの欠失であった（図４Ｂ）。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異により図に示された配列変化を生じ、コドンから特定された残基である。
【０１５７】
図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞会合を示す。ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有の野性型細胞およびｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞を、バイオフィルム誘導培地中で、図中で示したようにＤ−チロシン（６μＭ）の存在またはＤ−チロシン非存在（未治療）下で振盪を加えながら定常期（ＯＤ＝１．５）まで成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。蛍光顕微鏡結果は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６の存在が、凝集およびＤ−チロシン治療細胞に対するＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙによる細胞装飾を復活させたことを示す（図３Ｃ）。以前に行った仕事では、ＴａｓＡと細胞の結合のためにＹｑｘＭが必要であることが示された（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６））。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−アミノ酸のバイオフィルム阻害効果が、ＹｑｘＭ変異体によって打ち負かされ得るというこの発見は、Ｄ−アミノ酸の細胞壁への組込みの効果が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を傷害することであるという考えを補強するものである。ＹｑｘＭのＣ末端近傍ドメインは、細胞壁中のＤ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在に呼応してＴａｓＡ放出の引き金になる可能性がある。
【０１５８】
実施例２．黄色ブドウ球菌および緑膿菌によるバイオフィルム形成におけるアミノ酸の選別
他の細菌に関し、バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果について調査した。病原菌ブドウ球菌は、プラスチック表面上にバイオフィルムを形成する（Ｏｔｔｏ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２２：２０７（２００８））。これは、非結合細胞を洗い流し、結合細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって検出できる。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グルコース（０．５％）とＮａＣｌ（３％）含有ＴＳＢ培地中で３７℃、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、アミノ酸添加無し（未治療）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。図２Ｅは、５０μＭ濃度のＤ−チロシンおよび５０ｎＭ濃度のＤ−アミノ酸混合物（Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニン；各５０ｎＭ）が病原菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し極めて効果的であることを示す。
【０１５９】
さらに、図１０は、１０μＭのＤ−チロシンが緑膿菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し効果的であったことを示し、また、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンの１μＭの等モル混合物が有効であったことを示す。図１０は、Ｄ−アミノ酸による緑膿菌バイオフィルム形成の阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中で、３０℃、４８時間成長させた。さらに、アミノ酸添加無し（未治療）、Ｄ−チロシンまたはＤ−アミノ酸等モル混合物添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄後、完全に乾燥した。
【０１６０】
実施例３．ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルム阻害に対し活性なＤ−アミノ酸混合物
２つの異なる混合物は、ブドウ球菌バイオフィルムの形成の阻害に対し極めて活性である。１つは、Ｄ−チロシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシンおよびＤ−トリプトファンの等モル混合物である。枯草菌、ブドウ球菌（図１１）、および緑膿菌（図１２）の全試験細菌株で、Ｄ−ｔｒｐ、Ｄ−ｍｅｔ、Ｄ−ｔｙｒおよびＤ−ｌｅｕのＤ−ａａ混合物は、個別のアミノ酸よりも極めて低い濃度で活性であった。表１の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。表２の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを下表１と２に示す：
【表１】
【表２】
【０１６１】
Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリンの等モル混合物は、上記混合物よりもさらに効果的である。また、その混合物は、個々のアミノ酸それぞれよりも混合物として活性が大きい（図１３と１４）。表３と４の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを表３と４に示す：
【表３】
【表４】
【０１６２】
実施例４．黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の代替定量方法
浮遊細胞をＧｉｌｓｏｎピペットで完全に除去し、次いで、ペーパータオル越しに液体を排出した。次に、バイオフィルムプレートの画像を黒を背景に注意深く撮影した（図１５と１６）。表５と６の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。データを表５と６に示す：
【表５】
【表６】
【０１６３】
バイオフィルム細胞をＰＢＳ中に再懸濁することにより上記表５と６のプレートから除去し、これらのＯＤ６００を分光光度計を使って測定した（図１７）。表７の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを吸収された細菌のＯＤ６００を測定することにより可視化した。データを表７示す：
【表７】
【０１６４】
実施例５．エポキシ表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果
異なる表面からのＤ−アミノ酸の徐放方法開発の可能性を試験する目的で、エポキシ表面をＤ−アミノ酸混合物中で２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。表８と９の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。図１８と１９に示すように、Ｄ−ａａ混合物（上述のような）は、浸漬状態の基質上のブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減させた。データを表８と９に示す：
【表８】
【表９】
【０１６５】
さらに、Ｎｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１表面をＤ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニンと共に２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。Ｄ−ａａ混合物（Ｌ−混合物ではそうではないが）は、ブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減した。
【０１６６】
この実施例では、ポリマー基質は、ＵＶＯ−１１４（Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＵＶ−硬化型ポリマーを使って、ポリジメチルシロキサン（ＳＹＬＧＡＲＤ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で成形した。
【０１６７】
実施例６．緑膿菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果を観察する別の方法
枯草菌と同様に、緑膿菌は、複合体構造を特定の培地に形成する。これらの複合体構造には、細胞外基質の適切な形成と構築が必要である。Ｄ−チロシン（５００μＭ）またはＤ−トリプトファン（５００μＭ）の追加により、特定培地の緑膿菌バイオフィルム形成が阻害され（図２０）、一方、Ｌ−チロシン（５００μＭ）およびＬ−トリプトファンの追加では、そうならなかった。同様の結果が枯草菌でも得られた。これらの実験では、生物体／株はＰ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。
【０１６８】
Ｄ−アミノ酸のある場合と無い場合について、Ｓｙｔｏ−９染色を使って６ウエルプレート上でバイオフィルム形成を観察する別の方法は、以下の通りである：緑膿菌バイオフィルムをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％グルタルアルデヒドで少なくとも１時固定した。次に、固定バイオフィルムを、ＰＢＳで再度１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）中に１５分間浸漬した。溶液を冷ＰＢＳＴ中の０．１ｎＭ ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と入れ替え、暗所で少なくとも１５分間緩やかに揺らした。バイオフィルムの蛍光像をＸｅランプおよびＫ３ライカフィルターキューブを使ってライカＤＭＲＸ複式顕微鏡で取り込んだ。図２１に示すように、Ｄ−チロシンの存在下で、バイオフィルムプレートの底に付着した細胞の数が激減した。単一細胞付着量をｉｍａｇｅＪを使って定量化した。Ｄ−ａａに浸漬したエポキシ表面に付着した細胞の量の減少は、Ｌ−ａａ対照に比較して相当多かった。
【表１０】
【０１６９】
実施例７．グラム陰性病原菌に与えるＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陰性病原菌プロテウス・ミラビリスに対して試験した。図２２に示すように、Ｄ−ａａ混合物はプロテウス・ミラビリスに対して活性であった。表１１のバイオフィルムは、クリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１１に示す：
【表１１】
【０１７０】
実施例８：グラム陽性の病原菌に対するＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陽性の病原菌ストレプトコッカス・ミュータンスに対して試験した。図２３に示すように、Ｄ−ａａ混合物は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し活性であった。表１２のバイオフィルムをクリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１２に示す：
【表１２】
【０１７１】
医療機器に使用可能なコーティング関連の実施例
実施例９：Ｄ−チロシン含有コーティング
樹脂固形分の重量ベースで、０．５％のＤ−チロシンを市販ポリエステルポリオールおよび市販イソシアヌラートベースの２成分ポリエステルウレタンコーティング中に組み込む。コーティング系は、全体樹脂固形分ベースで０．０１５％のジブチルスズジラウラートにより触媒される。
【０１７２】
コーティング製剤をへら引きにより透明ガラススライド約４”ｘ６”上に塗布して約２ミル（０．００２”）のフィルム厚さにする。
【０１７３】
これらのフィルムを１２０°Ｆ（４９℃）のオーブン中で硬化する。
【０１７４】
実施例１０：Ｄ−アミノ酸混合物含有ポリマー
液体シリコーンゴムシートを米国特許第５、９７３、０３０号に記載のようにして調製する。製剤中に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物をさらに０．０１〜１重量パーセント添加する。
【０１７５】
実施例１１：Ｄ−アミノ酸混合物含有水ベースコーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む水ベース透明アクリル産業コーティング製剤を２ミル厚さでガラススライドにコートする。
【０１７６】
実施例１２：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベースコーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む溶媒べースポリウレタンコーティングを調製する。このコーティングを２ミル厚さでガラススライドに塗布する。
【０１７７】
実施例１３：Ｄ−アミノ酸混合物含有ＵＶ硬化型水ベースコーティング
透明ＵＶ硬化型水性産業コーティングを高速スターラーで各成分（下表参照）の混合により配合した。
【表１３】
【０１７８】
調合製剤に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を添加し、高せん断速度（２０００ｒｐｍ）下、室温で３０分間攪拌する。比較の目的のため、Ｄ−アミノ酸不含の対照製剤を同じ方法で調製する。
【０１７９】
コーティングを５０μｍスリットコーターで白塗装アルミニウムパネルに塗布し、６０℃で１０分間乾燥した後、２つの中圧水銀ランプ（２ｘ８０Ｗ／ｃｍ）を用いて５ｍ／ｍｉｎで硬化する。
【０１８０】
実施例１４：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベースコーティング
２液型溶媒使用ポリウレタンコーティングを下記の手順で調製する：
【０１８１】
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を、ミルベース配合として結合剤および溶媒に添加し、高せん断速度で１０分間、５μｍ未満の粒径になるまで攪拌する。
【０１８２】
ミルベース配合
【表１４】
【０１８３】
コーティング製剤は、成分Ａの材料を混合し、最終段階で塗布の前に成分Ｂを添加して調製する（下表参照）。全体製剤中のＤ−アミノ酸混合物の含量は、０．１重量％である。
【表１５】
【０１８４】
それぞれのコーティング製剤を白塗装アルミニウムパネル上にスプレーし（乾燥被覆厚さ：４０μｍ）、８０℃で３０分乾燥する。
【０１８５】
美容／パーソナルケア配合関連実施例
実施例１５：油中水型（Ｗ／Ｏ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｗ／Ｏ乳剤を調製する。
Ｗ／Ｏ乳剤：
部分Ａ
流動パラフィン ７．５部
イソヘキサデカン ６．０
ＰＥＧ−７水素化ヒマシ油 ４．１
イソプロピルパルミタート ２．０
Cera microcristallina ０．５
ラノリンアルコール ０．６
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
硫酸マグネシウム １．０
グリシン ３．２０
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１８６】
実施例１６：水中油型（Ｏ／Ｗ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｏ／Ｗ乳剤を調製する。
Ｏ／Ｗ乳剤：
部分Ａ
ステアレス−２ ２．２部
ステアレス−２１ １．０
ＰＥＧ−１５ ステアリルエーテル ６．０
ジカプリリルエーテル ６．０
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
ナトリウムポリアクリラート ０．２
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１８７】
実施例１７：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成のインビボ阻害
Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５１：２５９４（２００７）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１８８】
実施例１８：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の別のインビボ阻害
Ｂｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８６：４６６５（２００４）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１８９】
実施例１９：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ＴｙｐおよびＤ−Ｍｅｔの安定水性混合物の調製
アミノ酸Ｄ−ＭｅｔおよびＤ−Ｌｅｕを、室温で５ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に別々に溶解する。通常、各アミノ酸に対し、１０ｍＬの溶液が調製される。Ｄ−トリプトファンは、脱イオン水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の少しの加熱が必要である。Ｄ−チロシンは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０５Ｍ ＨＣｌに溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の加熱が必要である。加熱超音波処理浴を使って、アミノ酸の溶解を促進することができる。全ての溶液は組み合わされ、室温で細菌濾過を行って約４０ｍＬの保存液が得られる。
【０１９０】
実施例２０：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｒｏ、およびＤ−Ｐｈｅの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９１】
実施例２１：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｐ、およびＤ−Ｇｌｕの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９２】
実施例２２：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、およびＤ−Ｌｙｓの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９３】
実施例２３：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ａｓｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９４】
実施例２４：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、およびＤ−Ｇｌｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１９５】
等価物
本発明をその詳細説明と関連付けて説明してきたが、前述の記載は説明の目的のためのものであって本発明の範囲を制限する意図はなく、これは添付の請求項の範囲によって定められることは理解されるべきである。他の態様、優位性、および変更は以下の請求項の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療の必要な患者のバイオフィルム関連障害を治療する方法であって、
有効量のＤ−アミノ酸、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはその誘導体を含む組成物を患者に投与し、それによってバイオフィルム関連障害を治療することを含み、前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２】
治療の必要な患者のバイオフィルム関連障害を治療する方法であって、
有効量の２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせ、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそれらの誘導体を含む組成物を患者に投与し、それによってバイオフィルム関連障害を治療することを含む方法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、皮膚および粘膜表面ならびにこれらの組み合わせから成る群より選択される患者の表面に投与される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
表面が、口腔表面、皮膚表面、尿路表面、腟管表面、または肺表面である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、鼻、または局所投与、およびこれらの組み合わせを介して患者に投与される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者がヒトである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
バイオフィルムの形成が阻害される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前に形成されたバイオフィルムが破壊される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸が、０．１ｎＭ〜１００μＭの濃度で投与される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオフィルム関連障害が、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、および尿路感染ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオフィルム関連障害が、医療機器関連感染症である請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
バイオフィルム関連障害が、細菌により引き起こされる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的関連表面上の細菌によるバイオフィルム形成の治療(処理)、低減、または阻害方法であって、
有効量のＤ−アミノ酸、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそれらの誘導体を含む組成物を生物学的表面に接触させ、それによってバイオフィルム形成の治療(処理)、低減または阻害することを含み、前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１５】
生物学的関連表面上の細菌によるバイオフィルム形成の治療(処理)、低減、または阻害方法であって、
２つ以上のＤ−アミノ酸の有効量の組み合わせ、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはその誘導体を含む組成物と生物学的表面を接触させ、バイオフィルムの形成を低減または阻害することを含む方法。
【請求項１６】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンから成る群から選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表面が、医療機器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、または口腔内装置を含む請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
医療機器が、鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細菌が、グラム陰性またはグラム陽性細菌である請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細菌が、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、Ｄ−チロシンを含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−アスパラギンからなる群より選択される１つまたは複数のＤ−アミノ酸をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
殺生物剤を投与することをさらに含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
殺生物剤が、抗生物質である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、基本的にデタージェントを含まない請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量のＤ−アミノ酸を含む組成物であって、
前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される組成物。
【請求項３１】
バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量の２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物。
【請求項３２】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｄ−アミノ酸がＤ−チロシンである請求項３０、３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
組成物が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
有効量が、バイオフィルム関連障害を治療または防ぐのに有効な量である請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
バイオフィルム関連障害が、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、または尿路感染である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
バイオフィルム関連障害が、医療機器関連感染症である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
有効量が、表面上のバイオフィルムを治療または防ぐのに有効な量を含む請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が、表面への適用に適合した試薬をさらに含む請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
組成物が、洗浄液、包帯、創傷ゲル、または人工組織として処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
組成物が、錠剤、丸薬、トローチ、カプセル剤、エアロゾルスプレー、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、クリーム、またはフォームとして処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
組成物が、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、腟および直腸投与用として処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
バイオフィルム耐性医療機器であって、
体液に接触しがちな表面；および前記表面上にコートまたは前記表面中に含浸されたＤ−アミノ酸を含み、
Ｄ−アミノ酸が、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量であり、前記コーティングが、基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるバイオフィルム耐性医療機器。
【請求項５０】
体液に接触しがちな表面、および前記表面上にコートまたは前記表面中に含浸されたＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、バイオフィルム形成を治療、低減、または阻害するのに有効な量であるバイオフィルム耐性医療機器。
【請求項５１】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項５０に記載の機器。
【請求項５２】
コーティングがＤ−チロシンを含む請求項４９、５０または５１のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５３】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５４】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５５】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−アスパラギンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５６】
Ｄ−アミノ酸が、徐放製剤として処方される請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５７】
表面が、基本的にデタージェントを含まない請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５８】
機器が、１つまたは複数の鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータおよび内視鏡から選択される請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５９】
Ｄ−アミノ酸を０．０００００１％〜０．５％の範囲の濃度で含む飲用液体であって、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される飲用液体。
【請求項６０】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせを０．０００００１％〜０．５％の範囲の濃度で含む飲用液体であって、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである飲用液体。
【請求項６１】
バイオフィルム形成に耐性のある組成物であって、
薬学的にまたは化粧品として適切な基剤；および
その基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルムの形成を治療(処理)、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され、
基剤が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まない、組成物。
【請求項６２】
バイオフィルム形成に耐性のある組成物であって、
薬学的にまたは化粧品として適切な基剤；および
その基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルムの形成を治療(処理)、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである、組成物。
【請求項６３】
基剤が、液体、ゲル、ペースト、または粉末から選択される請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
組成物が、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製剤、石けん、ローション、クリーム、デオドラント剤、スキンケア製剤、化粧品用パーソナルケア製剤、インティメイト・ハイジーン製剤、フットケア製剤、光防護製剤、日焼け剤、防虫剤、制汗剤、シェービング剤、脱毛剤、香料製剤、デンタルケア、入れ歯ケア・口腔ケア製剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
経口組成物であって、
経口的に受容可能なキャリア；および
有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減または阻害し、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され、
組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まない、経口組成物。
【請求項６６】
経口組成物であって、
経口的に受容可能なキャリア；および
有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである経口組成物。
【請求項６７】
経口組成物が、練り歯磨き、歯磨ジェル、または歯磨き粉の形態である請求項６５または６６に記載の経口組成物。
【請求項６８】
経口組成物が、うがい薬、マウスリンス、マウススプレー、歯科溶液、または洗浄液の形態である請求項６５または６６に記載の経口組成物。
【請求項１】
治療の必要な患者のバイオフィルム関連障害を治療する方法であって、
有効量のＤ−アミノ酸、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはその誘導体を含む組成物を患者に投与し、それによってバイオフィルム関連障害を治療することを含み、前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２】
治療の必要な患者のバイオフィルム関連障害を治療する方法であって、
有効量の２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせ、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそれらの誘導体を含む組成物を患者に投与し、それによってバイオフィルム関連障害を治療することを含む方法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、皮膚および粘膜表面ならびにこれらの組み合わせから成る群より選択される患者の表面に投与される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
表面が、口腔表面、皮膚表面、尿路表面、腟管表面、または肺表面である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、鼻、または局所投与、およびこれらの組み合わせを介して患者に投与される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者がヒトである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
バイオフィルムの形成が阻害される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前に形成されたバイオフィルムが破壊される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸が、０．１ｎＭ〜１００μＭの濃度で投与される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオフィルム関連障害が、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、および尿路感染ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオフィルム関連障害が、医療機器関連感染症である請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
バイオフィルム関連障害が、細菌により引き起こされる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的関連表面上の細菌によるバイオフィルム形成の治療(処理)、低減、または阻害方法であって、
有効量のＤ−アミノ酸、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそれらの誘導体を含む組成物を生物学的表面に接触させ、それによってバイオフィルム形成の治療(処理)、低減または阻害することを含み、前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１５】
生物学的関連表面上の細菌によるバイオフィルム形成の治療(処理)、低減、または阻害方法であって、
２つ以上のＤ−アミノ酸の有効量の組み合わせ、または薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはその誘導体を含む組成物と生物学的表面を接触させ、バイオフィルムの形成を低減または阻害することを含む方法。
【請求項１６】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンから成る群から選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表面が、医療機器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、または口腔内装置を含む請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
医療機器が、鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータ、および内視鏡ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細菌が、グラム陰性またはグラム陽性細菌である請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細菌が、アクチノバチルス、アシネトバクター、エロモナス、ボルデテラ、ブレビバシラス、ブルセラ、バクテロイデス、バークホルデリア、ボレリア、桿菌、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、カルジオバクテリウム、シトロバクター、クロストリジウム、クラミジア、エイケネラ、エンテロバクター、エシェリキア、エンテンバクタ、フランシセラ、フソバクテリウム、フラボバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、キンゲラ、クレブシエラ、レジオネラ、リステリア、レプトスピラ、モラクセラ、モルガネラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、プレボテラ、プレジオモナス、シュードモナス、プロビデンシア、リケッチア、ステノトロフォモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、スピリルム、トレポネーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア、またはザントモナスの各属由来である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、Ｄ−チロシンを含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−アスパラギンからなる群より選択される１つまたは複数のＤ−アミノ酸をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
殺生物剤を投与することをさらに含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
殺生物剤が、抗生物質である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、基本的にデタージェントを含まない請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量のＤ−アミノ酸を含む組成物であって、
前記組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される組成物。
【請求項３１】
バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量の２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物。
【請求項３２】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｄ−アミノ酸がＤ−チロシンである請求項３０、３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
組成物が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
有効量が、バイオフィルム関連障害を治療または防ぐのに有効な量である請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
バイオフィルム関連障害が、肺炎、嚢胞性繊維症、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、または尿路感染である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
バイオフィルム関連障害が、医療機器関連感染症である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
有効量が、表面上のバイオフィルムを治療または防ぐのに有効な量を含む請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が、表面への適用に適合した試薬をさらに含む請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
組成物が、洗浄液、包帯、創傷ゲル、または人工組織として処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
組成物が、錠剤、丸薬、トローチ、カプセル剤、エアロゾルスプレー、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、クリーム、またはフォームとして処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
組成物が、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、腟および直腸投与用として処方されている請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
バイオフィルム耐性医療機器であって、
体液に接触しがちな表面；および前記表面上にコートまたは前記表面中に含浸されたＤ−アミノ酸を含み、
Ｄ−アミノ酸が、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減、または阻害するのに有効な量であり、前記コーティングが、基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まず、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されるバイオフィルム耐性医療機器。
【請求項５０】
体液に接触しがちな表面、および前記表面上にコートまたは前記表面中に含浸されたＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、バイオフィルム形成を治療、低減、または阻害するのに有効な量であるバイオフィルム耐性医療機器。
【請求項５１】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項５０に記載の機器。
【請求項５２】
コーティングがＤ−チロシンを含む請求項４９、５０または５１のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５３】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５４】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５５】
コーティングが、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−アスパラギンをさらに含む請求項５２に記載の機器。
【請求項５６】
Ｄ−アミノ酸が、徐放製剤として処方される請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５７】
表面が、基本的にデタージェントを含まない請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５８】
機器が、１つまたは複数の鉗子、ピンセット、ハサミ、皮膚単鉤、管、針、開創器、歯石除去器、ドリル、のみ、やすり、鋸、カテーテル、整形外科器具、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、ステント、分路、ペースメーカー、手術用ピン、人工呼吸器、ベンチレータおよび内視鏡から選択される請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の機器。
【請求項５９】
Ｄ−アミノ酸を０．０００００１％〜０．５％の範囲の濃度で含む飲用液体であって、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される飲用液体。
【請求項６０】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせを０．０００００１％〜０．５％の範囲の濃度で含む飲用液体であって、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである飲用液体。
【請求項６１】
バイオフィルム形成に耐性のある組成物であって、
薬学的にまたは化粧品として適切な基剤；および
その基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルムの形成を治療(処理)、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され、
基剤が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まない、組成物。
【請求項６２】
バイオフィルム形成に耐性のある組成物であって、
薬学的にまたは化粧品として適切な基剤；および
その基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルムの形成を治療(処理)、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである、組成物。
【請求項６３】
基剤が、液体、ゲル、ペースト、または粉末から選択される請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
組成物が、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製剤、石けん、ローション、クリーム、デオドラント剤、スキンケア製剤、化粧品用パーソナルケア製剤、インティメイト・ハイジーン製剤、フットケア製剤、光防護製剤、日焼け剤、防虫剤、制汗剤、シェービング剤、脱毛剤、香料製剤、デンタルケア、入れ歯ケア・口腔ケア製剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
経口組成物であって、
経口的に受容可能なキャリア；および
有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減または阻害し、
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、およびＤ−チロシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され、
組成物が基本的に対応するＬ−アミノ酸を含まない、経口組成物。
【請求項６６】
経口組成物であって、
経口的に受容可能なキャリア；および
有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を治療(処理)、低減または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである経口組成物。
【請求項６７】
経口組成物が、練り歯磨き、歯磨ジェル、または歯磨き粉の形態である請求項６５または６６に記載の経口組成物。
【請求項６８】
経口組成物が、うがい薬、マウスリンス、マウススプレー、歯科溶液、または洗浄液の形態である請求項６５または６６に記載の経口組成物。
【公表番号】特表２０１３−５１６４９２（Ｐ２０１３−５１６４９２Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８２１３（Ｐ２０１２−５４８２１３）
【出願日】平成２３年１月１０日（２０１１．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０７０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５３２６
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１０日（２０１１．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０７０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５３２６
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]