後発酵茶及びその製造方法
【課題】抗酸化活性が高く、渋味や刺激性が弱く、皮膚外用剤、浴用剤、食品への適用が可能な植物由来の新たな素材を提供する
【解決手段】Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
【解決手段】Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶を発酵させて得られる、抗酸化作用を有する後発酵茶、その抽出物及びそれらを含有する皮膚外用剤組成物、浴用剤組成物、食品組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で愛飲されている緑茶、烏龍茶、紅茶といった茶は、栄養摂取だけではなく、嗜好品としても飲用される。また、ストレス解消や気分転換等を目的としても飲用される。これは茶が、味だけでなく香りをも楽しめる飲料であることを意味する。例えば、紅茶は、発酵工程中に茶葉に含まれる香り成分が増加するため、その香りを堪能する飲料として位置付けられている。
【０００３】
茶は、製法の違いから次の４種類に大別される。緑茶に代表される不発酵茶、烏龍茶に代表される半発酵茶、紅茶に代表される完全発酵茶及び黒茶に代表される後発酵茶である。
不発酵茶は生茶葉を蒸熱又は炒熱処理して殺青した後、揉捻、乾燥したものであり、生茶葉自身の持つ酵素群は失われている。それゆえ、カテキン由来の独特の苦味を持つ。
一方、半発酵茶及び完全発酵茶は、殺青を行わず、揉捻して生茶葉自身の持つ酵素群の作用で発酵を行わせた後、加熱により酵素群を失活させて乾燥させたものであり、その発酵の程度により半発酵茶と完全発酵茶に分けられる。一般的に、緑茶と比較し、苦味が少なく、独特の風味を持つものが多い。
また、後発酵茶は、通常、不発酵茶を原料に自然環境の微生物を生育させ、製造されたものである。生育する微生物としては乳酸菌、真菌、酵母等が知られている（非特許文献１）が、発酵工程上、該微生物をコントロールすることは難しい。それゆえ、生育する微生物の種類、発酵期間等により、風味が異なる。
【０００４】
また、茶に水を加えて微生物発酵処理する方法に関しては、これまで、例えば特許文献１及び２において、真菌類を用いた技術が開示されている。
【０００５】
特許文献１には、麹菌によるスラリー発酵を行い、ガレート基を有するカテキン類を低減させ、没食子酸含有量を高めた後発酵茶飲料が記載されている。そして、この後発酵茶は粉砕した原料茶葉を水に懸濁させた状態で行うスラリー発酵で、かつこのスラリー発酵が、麹菌の酵素は活性を有するが麹菌は生育・増殖しない温度帯で行うことにより製造されている。
【０００６】
特許文献２には、β−１，３／１，６−グルカン、キチン、γ−アミノ酪酸等の機能や香気成分産生を目的に、茶葉を２５〜８０重量％の水分を含むように調整し、真菌類を接種し、生育させ、発酵機能茶を得ることが記載されている。
【０００７】
緑茶は、一般的に、カテキン類が豊富で、抗酸化活性が高く、抗がん効果、動脈硬化抑制効果、血圧上昇抑制効果、抗糖尿病効果、肥満予防効果、抗アレルギー効果、抗菌・抗ウイルス効果等が知られている（非特許文献２）。しかし、緑茶の味はカテキン特有の渋みを持ち、食品として使用する場合に有効量を摂取することは非常に困難が伴う。また、化粧品素材として使用する場合も皮膚への刺激性がある。それゆえ、より抗酸化活性が高く、刺激性の少ない素材が求められていた。
【０００８】
また、太陽光線に含まれる紫外線は、ヒトの皮膚組織、例えば表皮層、真皮層にまで到達し、これら組織を構成する基底細胞（角化細胞）やメラニン細胞、線維芽細胞に刺激を与えたり、細胞を破壊する事により、皮膚に紅斑を生じさせ、色素沈着や時に炎症、皮膚がんをも発生させる事がある（非特許文献３）。それゆえ、紫外線暴露の影響を抑制するために、紫外線吸収あるいは紫外線散乱作用を有するサンスクリーン剤や、紫外線暴露より発生するフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤、紫外線暴露による皮膚組織のダメージを防止あるいは修復する皮膚損傷防止剤／修復剤等の開発が行われてきた。しかしながら、サンスクリーン剤は、皮膚刺激や光毒性の問題、あるいは効果が強いゆえに、人によっては接触性皮膚炎を誘発する場合もある。これらサンスクリーン剤は合成によって得られる高分子化合物や金属化合物であり、それゆえ、より安全性の高い、天然物から得られる紫外線防御剤が求められている。
【０００９】
天然物由来の紫外線防御剤としてはケルセチン配糖体（特許文献３）、アカハギンナンソウ抽出物（特許文献４）、マンゴスチン（特許文献５）、キク科植物抽出物（特許文献６）やモクレン科オガタマノキ属植物からの抽出物（特許文献７）が知られている。特許文献３は培養細胞に紫外線を照射することにより紫外線防御作用を証明したものであり、その他の特許文献４〜７は紫外線Ａ波、紫外線Ｂ波の吸収波長領域を持つことから紫外線防御作用を示している。
【００１０】
後発酵茶に関しては、皮膚外用剤として用いることは知られておらず、ましてや紫外線防御作用についても全く知られていない。
【特許文献１】特開２００５−２７８５１９号公報
【特許文献２】特開２００６−１４６８４号公報
【特許文献３】特許第２９０９５２２号公報
【特許文献４】特許第２７００６０１号公報
【特許文献５】特開平９−８７１５５号公報
【特許文献６】特２００２−１２８６３０号公報
【特許文献７】特開２００５−６８０７５号公報
【非特許文献１】日本家政学会誌，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１２，ｐ１０９５〜１１０１（１９９４）
【非特許文献２】村松敬一郎、小國伊太郎、伊勢村護、杉山公男、山本（前田）万理編「茶の機能」学会出版センター（２００２）Ｐ．６６〜３０４
【非特許文献３】宮地良樹、長沼雅子編著「化粧品・外用薬研究者のための皮膚科学」文光堂（２００５）Ｐ．４５〜４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の如く、緑茶は、カテキン類が豊富で、抗酸化活性が高く、種々の効果を有するが、カテキン特有の渋みや皮膚への刺激性があるゆえ、より抗酸化活性が高く、刺激性の少ない素材が求められていた。また、従来の紫外線吸収剤に用いられる素材の中には人によっては接触性皮膚炎の誘発や光毒性作用が見られるため、紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止でき、より安全性の高い、天然由来の素材が求められていた。一方、現在市場にある碁石茶、阿波番茶、プーアル茶等の後発酵茶は、渋味がなく、刺激性もないが、自然環境中で、微生物を生育させ、製造しているので、製品の品質を安定させることが難しく、また抗酸化活性は低いものである。
従って、本発明の目的は、抗酸化活性が高く、渋味や刺激性が弱く、種々の化粧料、浴用剤や食品等への適用が可能な植物由来の新たな素材を提供することにある。また、当該植物由来の新たな素材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは、抗酸化活性の弱い後発酵茶に着目し種々検討した結果、抗酸化活性の指標の一つであるＳＯＤ活性を指標にして、後発酵茶の製造条件を検討した。まず、微生物として糸状菌、乳酸菌、酵母等を用いて茶を発酵させ、ＳＯＤ活性を指標にスクリーニングしたところ、糸状菌による発酵が最もＳＯＤ活性を高めることを見出した。
次いで、該糸状菌を用いて、培養・発酵条件についても鋭意検討を重ねた結果、ある特定の適度な水分を茶に含浸させ、該糸状菌を接種し、生育させることで、ＳＯＤ活性が著しく高い後発酵茶が得られること、さらに当該発酵茶は渋味が弱く、かつ刺激性が低いため化粧料、浴用剤や食品等の素材として有用であることを見出した。また、当該後発酵茶又はその抽出物は紫外線暴露による皮膚障害を有意に防止する抗紫外線ストレス活性を有するため、紫外線防御剤として有用であることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を提供するものである。
（１）Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
（２）Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種し、生育せしめることを特徴とする、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶の製造方法。
（３）（１）記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出した後発酵茶抽出物。
（４）（１）記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出することを特徴とする後発酵茶抽出物の製造方法。
（５）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
（６）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする浴用剤組成物。
（７）（１）記載の後発酵茶又は（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする食品組成物。
（８）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
（９）（１）記載の後発酵茶又は（３）の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする紫外線防御剤。
（１０）紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止するものである（９）記載の紫外線防御剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の後発酵茶及びその抽出物は、優れた抗酸化活性を有し、渋味が弱く、かつ刺激性が少ない。また、当該後発酵茶及びその抽出物は、安全性が高く、紫外線暴露によって誘導される皮膚障害を予防・軽減する効果を有する。従って、当該後発酵茶及びその抽出物は、化粧料等の皮膚外用剤、浴用剤、食品等において抗酸化剤や紫外線防御剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の後発酵茶の原料としての茶は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種であれば、特に品種等には限定されない。また、収穫直後の生茶葉、青殺後の茶葉、粗揉後の茶葉、揉捻後の茶葉、中揉後の茶葉、精揉後の茶葉、荒茶等の緑茶であっても、茶茎、茶花及びこれらの粉末品等の加工品等であっても、さらに半発酵茶、完全発酵茶も使用可能であり、原料となる茶は後発酵茶の用途により、適宜選択可能である。このうち、不発酵茶を用いることが、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から好ましい。
【００１６】
これらの茶の発酵に用いられる微生物は、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から糸状菌であるのが好ましい。糸状菌としては、醸造食品や発酵食品等の食品に使用可能な糸状菌の中から選抜することが可能である。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等を使用することができ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられ、さらには該糸状菌から誘導される変異株であっても使用することができる。これらを単独で若しくはそれらを組合せて使用してもよい。これらの菌株は、ＩＦＯ、ＩＡＭ、ＡＴＣＣ、ＮＲＲＣ等の菌株分譲機関、日本醸造協会や市販の種菌株販売会社等から入手可能である。
【００１７】
本発明においては、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上、好ましくは１５０重量部以上、より好ましくは２００重量部以上、最適には３００〜４００重量部の水を加える。ここでの水分量の調整は原料となる茶に、水を加え、馴染ませ、糸状菌が生育できる条件にすることを意味する。例えば、荒茶を使用した場合、該荒茶はすでに約３〜５重量％の水分を既に含んでおり、加える水分量は、茶が含んでいる水分を考慮して調整する必要がある。また、生茶葉のように水分を７０〜８０重量％含んでいるものについては、加水しなくても良い。上記の水分含量は、培養・発酵に用いる糸状菌が繁殖又は発酵可能な量であり、かつ本発明の高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得るために重要である。該糸状菌を優先的に繁殖させることで、雑菌汚染をより防止することができる。該水分調整後に、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うことが挙げられる。該殺菌後は、冷却し、該茶を殺菌済み培養・発酵槽に移し、下記の植菌工程を行う。なお、該殺菌工程は、茶の水分量が変化しないように密閉系で行うのが好ましい。
【００１８】
水分含量を調整した茶に、糸状菌を接種し、一般に２０〜４０℃で３〜３０日間、好ましくは２５〜３７℃で３〜７日間培養・発酵する。ここで培養・発酵方法は、通常用いられる方法であれば、液体培養・発酵法、固体培養・発酵法等いずれの方法でも良い。次いで、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うこと、又は、８０〜１２０℃で加熱乾燥し該糸状菌を殺菌するとともに、水分含量を１０重量％以下、好ましくは５重量％以下にする。これにより、本発明のＳＯＤ活性の高い後発酵茶が製造される。
【００１９】
本発明の後発酵茶は、そのままの形態でも利用可能であるが、加熱、乾熱、マイクロ波等で殺菌を行い、さらに粉砕後、粉末、ペーストの形で、あるいは溶媒を用いて抽出し、後発酵茶抽出物として利用できる。さらに、当該後発酵茶抽出物を、スプレードライヤー、ドラムドライヤー、フリーズドライヤー、エアードライヤー等を用いて乾燥し、粉末化を行うことで、後発酵茶抽出物末とすることができる。また、必要に応じて造粒機等を用いて顆粒品とすることができる。
【００２０】
上記抽出の際に用いる溶媒としては、水又は炭素数１〜６のアルコール類若しくはグリコール類を単独で若しくはこれら溶媒の２つ以上の組合せが使用でき、例えば水、エタノール、含水エタノール、１，３―ブチレングリコール、含水１，３−ブチレングリコール等が挙げられる。好ましくは含水エタノール若しくは含水１，３−ブチレングリコール、より好ましくは水とエタノールの５〜９５：９５〜５の混合物（ｖ／ｖ）、水と１，３−ブチレングリコールの５〜９５：９５〜５の混合物（ｖ／ｖ）が使用できる。
抽出条件としては、約２０〜７０℃で０．１〜５時間抽出し、ろ過を行い、得られたろ液を８０〜９５℃で３０分間の条件で加熱処理を行い冷却することが好ましい。
上記抽出物は、適宜、不活性な不純物を除去するため、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の分離・精製方法によって、更に精製してもよい。具体的には、抽出物末を上記抽出溶媒を用いて再度抽出することが挙げられる。
【００２１】
上記の製造方法により得られた後発酵茶又はその抽出物は、抗酸化活性の一つの指標であるＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り２，０００ｕｎｉｔｓ以上、好ましくは８，０００ｕｎｉｔｓ以上、より好ましくは９，０００ｕｎｉｔｓ以上、さらに好ましくは９，０００〜５００，０００ｕｎｉｔｓ有する。例えば、原料としての茶に緑茶を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを用いて本発明の製造方法にて製造した後発酵茶は、ＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り９，０００ｕｎｉｔｓ以上を有している。
【００２２】
本発明の後発酵茶又はその抽出物は、後記実施例に示すように優れたＳＯＤ活性を有することから、皮膚外用剤組成物、浴用剤組成物、食品組成物等における抗酸化剤として有用である。また、本発明の後発酵茶又はその抽出物は抗酸化活性及び抗紫外線ストレス活性を有するとともに、皮膚刺激が少なく、渋味も弱いことから、皮膚外用剤又は浴用剤に応用した場合、肌の老化防止効果、抗炎症効果、抗アレルギー効果、紫外線防御効果、紫外線暴露に起因する皮膚障害の防止効果等の機能が、食品に応用した場合、内臓脂肪低減効果、血糖値上昇抑制効果、糖尿病抑制効果、血圧上昇抑制効果等の機能、紫外線暴露に起因する皮膚障害の防止効果が、さらに、消臭剤としての機能が期待できる。
ここで、抗紫外線ストレス活性とは、紫外線照射により生じる細胞傷害に対する抑制活性をいう。また、紫外線暴露に起因する障害としては、紫外線暴露により生じる種々の皮膚疾患、例えば、光線過敏症等が挙げられる。
【００２３】
本発明でいう皮膚外用剤とは、皮膚に適用しうる剤形のものであって、クリーム、化粧水、乳液、パック料、美容液、ファンデーション、パウダー、リップクリーム等の化粧料、抗炎症剤、抗真菌剤、鎮痛剤、抗掻痒剤、ステロイド剤等を含む医薬品・医薬部外品、シャンプー、リンス等の洗浄剤等を指す。
【００２４】
皮膚外用剤組成物の形態としては特に限定されず、例えば、薬用又は／及び化粧品用の化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料；洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、シャンプー剤、リンス剤、トリートメント剤、パーマネント剤、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料等が挙げられる。その他、消臭・防臭剤や衛生用品、衛生綿類、ウエットテッシュ等に応用できる。
これらの皮膚外用剤の調製にあたっては、水、界面活性剤、キレート剤、油剤、乳化剤、保湿剤、増粘剤、多価アルコール、アルコール類、美白剤、防腐剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、香料等を適宜配合することができる。
【００２５】
浴用剤組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、液状、ゲル状、錠剤状等が挙げられる。また、食品組成物の形態としては、アンプル状、カプセル状、丸剤状、錠剤状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状、気泡状等の他、各種食品中に配合することもできる。これらの組成物の調製にあたっては、賦形剤、結合剤、滑沢剤等を適宜配合することができる。
【００２６】
また、皮膚外用剤、浴用剤及び食品への本発明後発酵茶又はその抽出物の配合量は、固形分（乾燥重量）換算で０．０００１〜２０重量％、０．０１〜１０重量％が好ましく、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２８】
［試験例１］
緑茶（荒茶）５００ｇを１００重量部としてそれぞれ０重量部、５０重量部、７０重量部、８０重量部、１００重量部、２００重量部、３００重量部、３５０重量部、４００重量部、５００重量部、７００重量部の水を加え、混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養した後、乾燥させ、後発酵茶を得た。該後発酵茶に５，０００ｍＬの５０％（体積／体積）エタノールを添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶抽出物を得た。該後発酵茶抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）を用いてＳＯＤ活性を測定し、後発酵茶固形分当たりに換算した。結果を表１に示す。
【００２９】
ＳＯＤ活性の測定は以下の通り行った。まず、試料となる後発酵茶抽出物を蒸留水で希釈し、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、０．０３７５ｍｇ／ｍＬ、０．００７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．００３７５ｍｇ／ｍＬになるようにサンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を９６ｗｅｌｌ プレートの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ分注した。次に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに同封されているＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調製したＷＳＴ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬずつ加えよく混合した。さらに、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに付属のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調整したＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬずつマルチチャンネルピペットにて加え、プレートリーダー中で３７℃、２０分間インキュベートし、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。尚、各々にはＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの代わりに付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いたブランクを設けた。さらに、サンプル溶液の代わりに蒸留水を用いたコントロール及びそのブランクを設けた。測定した吸光度から、「スーパーオキシド」と「ＷＳＴ−１」から「ＷＳＴ−１ ｆｏｒｍａｚａｎ」が生成される反応の阻害率を求め、さらにサンプルのＩＣ50値（単位：ｇ／ｍＬ）を算出した。
また、サンプル溶液の代わりにＳＯＤ標準品を用い、ＳＯＤ濃度と阻害率の関数にて検量線を作成した。作成した検量線から、ＳＯＤのＩＣ50値（単位：ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を算出した。
上記の「サンプルのＩＣ50値」及び「ＳＯＤのＩＣ50値」からサンプルのＳＯＤ活性を算出した。計算式は以下の通りである。
（サンプルのＳＯＤ活性 単位：ｕｎｉｔｓ／ｇ）＝（ＳＯＤのＩＣ50値）÷（サンプルのＩＣ50値）
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１より、水添加量２００〜５００重量部の範囲で高いＳＯＤ活性を、３００〜４００重量部でより高いＳＯＤ活性を示すことがわかる。
【００３２】
また、得られた後発酵茶抽出物を皮膚に塗布したところほとんど刺激性がなかった。また、味も渋味が低く良好であった。
【００３３】
また、同様の方法で、従来から飲用されている後発酵茶のＳＯＤ活性を測定した結果を
表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２より、本発明の後発酵茶が、従来の後発酵茶に比べて高いＳＯＤ活性を有することがわかる。
【００３６】
［実施例１］
緑茶（荒茶）５００ｇに、１，７５０ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４８６ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、５，０００ｍＬの水を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１０８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、２０，０６２ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり８０，２３８ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３７】
［実施例２］
緑茶（荒茶）５００ｇに、２，５００ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵した。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４９２ｇを得た。次いで、５，０００ｍＬの５０％エタノール（以下５０％ＥｔＯＨという）を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い、冷却して後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物を得た。得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末を得た（１１０ｇ）。得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、１９，８８４ｕｎｉｔｓ（後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１ｇ当たり９０，３８４ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３８】
［実施例３］
収穫した直後の生茶葉（水分含量：７８重量％）５００ｇを水にて洗浄後、よく水をきり、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶９３ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、１，０００ｍＬの水を添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い、冷却して後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、９，１００ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり３７，０００ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３９】
［実施例４］ 実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１００ｇに５０％１，３−ブチレングリコール（以下５０％ＢＧという）を５，０００ｇ添加し、５０℃で３０分間抽出を行った。次いでろ過を行いろ液を得た。得られたろ液について精密ろ過を行い、５０％ＢＧにて後発酵茶抽出物固形分１％になるように希釈し、後発酵茶５０％ＢＧ抽出物を得た。得られた後発酵茶５０％ＢＧ抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、抽出物１ｇ当たり８９０ｕｎｉｔｓ（固形分１ｇ当たり８９，０００ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物は、皮膚刺激性がなく、良好であった。
【００４０】
［比較例１］
緑茶（荒茶）５００ｇに、６，７５０ｍＬの水を添加し撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却し、緑茶抽出物を得た。得られた緑茶抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、緑茶抽出物末を得た。得られた緑茶抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、緑茶固形分１ｇ当たり、４，７６０ｕｎｉｔｓ（緑茶抽出物末１ｇ当たり１９，８００ｕｎｉｔｓ）であった。ただし、この抽出物は渋味、苦味が強く、皮膚刺激性も強いものであった。
【００４１】
［試験例２］抗紫外線ストレス試験
紫外線は皮膚を構成する細胞の中の一種である線維芽細胞にストレスを与える要因の一つである。そのストレスにより線維芽細胞にＤＮＡ損傷を起こし、８−ＯＨｄＧの生成量を増加させる。紫外線Ａ波（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）は皮膚の表皮を通過し線維芽細胞の存在する真皮まで到達するので、紫外線Ａ波をヒト正常線維芽細胞へ照射することにより細胞にストレスを与えることができる。
それゆえ、ヒト正常線維芽細胞を用いて、実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末の抗紫外線ストレス活性を、デオキシリボ核酸（以下ＤＮＡという）損傷マーカーである８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下８−ＯＨｄＧという）を測定することにより検討した。
【００４２】
ヒト正常線維芽細胞の培養条件は、以下の通りとした。
ヒト正常線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（シグマ社製）（以下ＦＢＳという）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク社製）（以下ＤＭＥＭという）を培地として使用し、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で、週２回の培地交換を行い、培養した。
【００４３】
サンプル溶液の調製は、以下の通り行った。
実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１００ｍｇを秤量し、１０ｍＬの増殖培地に完全に溶解させた。その後、０．２μｍ滅菌フィルターを用いて滅菌ろ過し、１％溶液とした。この１％溶液を増殖培地で希釈し、０．０００１％、及び０．００００５％のサンプル溶液を調製した。
【００４４】
抗紫外線ストレス試験は、以下の通り行った。
ヒト正常線維芽細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１０ｍＬを１０ｃｍ ｄｉｓｈに播種した（３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）。翌日、０．０００１％及び０．００００５％のサンプルを添加した１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ１０ｍＬと交換した。１時間培養後、紫外線Ａ波を７０分間照射した（紫外線Ａ波強度：１０Ｊ／ｃｍ2）。直ちに、培養上清を除去し、トリプシン処理により細胞をｄｉｓｈより剥し、ピペットにて細胞懸濁液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
回収した細胞から、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔ（和光純薬工業社製）を用いてＤＮＡを次のように抽出した。
まず、１．５ｍＬエッペンドルフチューブを遠心分離後、上清捨て、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳという）を加え混合し、遠心（３，０００ｇ、５分）後、上清を除去した。得られた細胞ペレットに、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え、Ｖｏｒｔｅｘにて撹拌後、遠心（１０，０００ｇ、２０秒）し、上清を除去した。上記操作を２回繰り返した後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を２００μＬとＰｒｏｔｅａｓｅ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１０μＬを加えて混合し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、Ｓｏｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を３００μＬ加えて混合し、更にイソプロピルアルコール（和光純薬工業社製）０．５ｍＬを加えて、白い綿状のＤＮＡが完全に見えてくるまで静置した。遠心（１０，０００ｇ、１０分）後、上清を除去し、得られたＤＮＡに洗浄液（Ａ）（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え混合し、遠心（１０，０００ｇ、５分）した後、上清を除去し、更に洗浄液（Ｂ）（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え混合し、遠心（１０，０００ｇ、５分）した後、上清を除去し、沈殿物（ＤＮＡ）を軽く減圧乾燥した後、５０μＬの滅菌超純水に溶解した（ＤＮＡ水溶液）。
次に、５０μＬのＤＮＡ水溶液に、２００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を５．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬに超純粋にて濃度を調製したｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（和光純薬工業社製）水溶液を５．５μＬ（２ｕｎｉｔｓ）加え、３７℃で１時間インキュベートした。更に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．４）を５．５μＬ、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラ社製）を１μＬ（２ｕｎｉｔｓ）添加し、３７℃にて更に１時間インキュベートしＤＮＡを加水分解した。ＤＮＡ加水分解液の２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し、ＤＮＡ水溶液の濃度、純度をチェックした。
最後に、ＤＮＡ加水分解液中に含まれる８−ＯＨｄＧを、高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋ（日本老化制御研究所製）を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。
５０μＬのＤＮＡ加水分解水溶液（約２０〜３０μｇ）を、８−ＯＨｄＧを固相化しているマイクロプレート用モジュール（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）のウェルに分注した。続いて各ウェルに、８−ＯＨｄＧと特異的に反応するモノクローナル抗体である第一抗体溶液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を５０μＬずつ添加し、プレートを左右に振動させ、よく混合した。４℃で一晩反応させた後、ウェルから反応液を捨て、洗浄液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）で洗浄した。次に、各ウェルにモノクローナル抗体と結合する酵素標識抗体である第二抗体溶液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を１００μＬずつ分注し、よく混合した。常温で１時間反応後、ウェルから反応液を捨て、洗浄液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）で洗浄した。各ウェルに反応停止液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を１００μＬ加え、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。
【００４５】
抗紫外線ストレス試験の結果は図１に示す。
サンプル溶液で培養後、紫外線Ａ波照射処理した細胞のＤＮＡにおける８−ＯＨｄＧ生成量を、サンプル溶液無添加で紫外線Ａ波照射処理した陰性コントロールのそれと比較したところ、サンプル溶液は紫外線Ａ波照射に対する抗紫外線ストレス活性を有していることが示唆された。特に、０．０００１％においては、サンプル無添加で紫外線Ａ波無照射のブランクと近い値となり、最も抗紫外線ストレス活性を示した。
以上より、後発酵茶抽出物は、紫外線Ａ波に対する抗紫外線ストレス活性があると判断した。
【００４６】
以下に上述の実施例品を用いた配合例を示すが、各々の配合例は各製品の製造における常法により製造したもので、配合量のみを記した。また、単位は％（重量／重量）で記す。
【００４７】
［配合例１］皮膚外用剤組成物（ローション）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
エタノール １５．０
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
防腐剤 ０．１
精製水 ７９．８
【００４８】
［配合例２］皮膚外用剤組成物（乳液）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ステアリン酸 ０．２
セタノール １．５
ワセリン ３．０
流動パラフイン ７．０
ＰＯＥ（１０）モノオレイン酸エステル １．５
酢酸トコフェロール ０．２
グリセリン ５．０
トリエタノールアミン ０．１
防腐剤 ０．１
精製水 ７６．４
【００４９】
［配合例３］皮膚外用剤組成物（透明化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
１，３−ブチレングリコール ６．０
グリセリン ４．０
オレイルアルコール ０．１
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル ０．５
ＰＯＥ（１５）ラウリルアルコールエーテル ０．５
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
褐色防止剤 適量
緩衝剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５０】
［配合例４］皮膚外用剤組成物（柔軟化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ０．５
ソルビット ４．０
ジプロピレングリコール ６．０
ＰＥＧ １５００ ５．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５
メチルセルロース ０．２
クインスシード ０．１
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
キレート剤 適量
褐色防止剤 適量
緩衝剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５１】
［配合例５］皮膚外用剤組成物（半透明マイクロエマルション化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
１，３−ブチレングリコール ６．０
グリセリン ５．０
ＰＥＧ ４０００ ３．０
オリーブ油 ０．５
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアリン酸エステル １．５
ＰＯＥ（５）オレイルアルコールエーテル ０．３
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
緩衝剤 適量
褐色防止剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５２】
［配合例６］皮膚外用剤組成物（収斂化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ジプロピレングリコール １．０
ソルビット １．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル １．０
スルホ石炭酸亜鉛 ０．２
クエン酸 ０．１
エタノール １５．０
香料 適量
防腐剤 適量
緩衝剤 適量
色剤 適量
褐色防止剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５３】
［配合例７］皮膚外用剤組成物（エモリエントローション）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ステアリン酸 ２．０
セチルアルコール １．５
ワセリン ４．０
スクワラン ５．０
グリセロールトリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．０
ソルビタンモノオレイン酸エステル ２．０
ジプロピレングリコール ５．０
ＰＥＧ １５００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 １００とする残余
【００５４】
［配合例８］皮膚外用剤組成物（シャンプー）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム ５．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン
３．０
ヤシ油脂肪酸サルコシンナトリウム ２．０
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン ２．０
２−アルキルーＮ―カルボキシメチルーＮ―ヒドロキシエチルイ
ミダゾリニウムベタイン ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．０
ジステアリン酸エチレングリコール ３．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド １．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 １．０
メチルポリシロキサン ０．５
ジイソステアリン酸ポリグリセリル ２．０
混合植物抽出液（１０） ０．５
加水分解ケラチン末 ０．３
アスコルビン酸ナトリウム ０．１
ピロクトンオラミン ０．５
メチルパラベン ０．３
塩化ジメチルジアリルアンモニウム・アクリルアミド共重合体
０．１
塩化Ｏ−（２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
センサマーＣＩ−５０ ３．０
精製水 １００とする残余
【００５５】
［配合例９］浴用剤組成物（粉末タイプ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
硫酸ナトリウム ４９．５
炭酸水素ナトリウム ４９．５
【００５６】
［配合例１０］浴用剤組成物（錠剤タイプ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
硫酸ナトリウム ４４．６
炭酸水素ナトリウム １４．７
コハク酸 ２１．７
滑沢剤 適量
色剤 適量
香料 適量
【００５７】
［配合例１１］食品組成物（あめ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） ０．２
砂糖 ５０．０
水飴 ３３．０
クエン酸 ２．０
香料 ０．２
水 １４．６
【００５８】
［配合例１２］食品組成物（茶飲料（１））
後発酵茶水抽出物末（実施例１） ０．３
緑茶抽出物 ０．７
ビタミンＣ ０．１
水 ９８．９
【００５９】
［配合例１３］食品組成物（茶飲料（２））
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
ビタミンＣ ０．１
水 ９８．９
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物（実施例２）における紫外線Ａ波照射後の細胞から抽出したＤＮＡ中の８−ＯＨｄＧ量を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶を発酵させて得られる、抗酸化作用を有する後発酵茶、その抽出物及びそれらを含有する皮膚外用剤組成物、浴用剤組成物、食品組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で愛飲されている緑茶、烏龍茶、紅茶といった茶は、栄養摂取だけではなく、嗜好品としても飲用される。また、ストレス解消や気分転換等を目的としても飲用される。これは茶が、味だけでなく香りをも楽しめる飲料であることを意味する。例えば、紅茶は、発酵工程中に茶葉に含まれる香り成分が増加するため、その香りを堪能する飲料として位置付けられている。
【０００３】
茶は、製法の違いから次の４種類に大別される。緑茶に代表される不発酵茶、烏龍茶に代表される半発酵茶、紅茶に代表される完全発酵茶及び黒茶に代表される後発酵茶である。
不発酵茶は生茶葉を蒸熱又は炒熱処理して殺青した後、揉捻、乾燥したものであり、生茶葉自身の持つ酵素群は失われている。それゆえ、カテキン由来の独特の苦味を持つ。
一方、半発酵茶及び完全発酵茶は、殺青を行わず、揉捻して生茶葉自身の持つ酵素群の作用で発酵を行わせた後、加熱により酵素群を失活させて乾燥させたものであり、その発酵の程度により半発酵茶と完全発酵茶に分けられる。一般的に、緑茶と比較し、苦味が少なく、独特の風味を持つものが多い。
また、後発酵茶は、通常、不発酵茶を原料に自然環境の微生物を生育させ、製造されたものである。生育する微生物としては乳酸菌、真菌、酵母等が知られている（非特許文献１）が、発酵工程上、該微生物をコントロールすることは難しい。それゆえ、生育する微生物の種類、発酵期間等により、風味が異なる。
【０００４】
また、茶に水を加えて微生物発酵処理する方法に関しては、これまで、例えば特許文献１及び２において、真菌類を用いた技術が開示されている。
【０００５】
特許文献１には、麹菌によるスラリー発酵を行い、ガレート基を有するカテキン類を低減させ、没食子酸含有量を高めた後発酵茶飲料が記載されている。そして、この後発酵茶は粉砕した原料茶葉を水に懸濁させた状態で行うスラリー発酵で、かつこのスラリー発酵が、麹菌の酵素は活性を有するが麹菌は生育・増殖しない温度帯で行うことにより製造されている。
【０００６】
特許文献２には、β−１，３／１，６−グルカン、キチン、γ−アミノ酪酸等の機能や香気成分産生を目的に、茶葉を２５〜８０重量％の水分を含むように調整し、真菌類を接種し、生育させ、発酵機能茶を得ることが記載されている。
【０００７】
緑茶は、一般的に、カテキン類が豊富で、抗酸化活性が高く、抗がん効果、動脈硬化抑制効果、血圧上昇抑制効果、抗糖尿病効果、肥満予防効果、抗アレルギー効果、抗菌・抗ウイルス効果等が知られている（非特許文献２）。しかし、緑茶の味はカテキン特有の渋みを持ち、食品として使用する場合に有効量を摂取することは非常に困難が伴う。また、化粧品素材として使用する場合も皮膚への刺激性がある。それゆえ、より抗酸化活性が高く、刺激性の少ない素材が求められていた。
【０００８】
また、太陽光線に含まれる紫外線は、ヒトの皮膚組織、例えば表皮層、真皮層にまで到達し、これら組織を構成する基底細胞（角化細胞）やメラニン細胞、線維芽細胞に刺激を与えたり、細胞を破壊する事により、皮膚に紅斑を生じさせ、色素沈着や時に炎症、皮膚がんをも発生させる事がある（非特許文献３）。それゆえ、紫外線暴露の影響を抑制するために、紫外線吸収あるいは紫外線散乱作用を有するサンスクリーン剤や、紫外線暴露より発生するフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤、紫外線暴露による皮膚組織のダメージを防止あるいは修復する皮膚損傷防止剤／修復剤等の開発が行われてきた。しかしながら、サンスクリーン剤は、皮膚刺激や光毒性の問題、あるいは効果が強いゆえに、人によっては接触性皮膚炎を誘発する場合もある。これらサンスクリーン剤は合成によって得られる高分子化合物や金属化合物であり、それゆえ、より安全性の高い、天然物から得られる紫外線防御剤が求められている。
【０００９】
天然物由来の紫外線防御剤としてはケルセチン配糖体（特許文献３）、アカハギンナンソウ抽出物（特許文献４）、マンゴスチン（特許文献５）、キク科植物抽出物（特許文献６）やモクレン科オガタマノキ属植物からの抽出物（特許文献７）が知られている。特許文献３は培養細胞に紫外線を照射することにより紫外線防御作用を証明したものであり、その他の特許文献４〜７は紫外線Ａ波、紫外線Ｂ波の吸収波長領域を持つことから紫外線防御作用を示している。
【００１０】
後発酵茶に関しては、皮膚外用剤として用いることは知られておらず、ましてや紫外線防御作用についても全く知られていない。
【特許文献１】特開２００５−２７８５１９号公報
【特許文献２】特開２００６−１４６８４号公報
【特許文献３】特許第２９０９５２２号公報
【特許文献４】特許第２７００６０１号公報
【特許文献５】特開平９−８７１５５号公報
【特許文献６】特２００２−１２８６３０号公報
【特許文献７】特開２００５−６８０７５号公報
【非特許文献１】日本家政学会誌，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１２，ｐ１０９５〜１１０１（１９９４）
【非特許文献２】村松敬一郎、小國伊太郎、伊勢村護、杉山公男、山本（前田）万理編「茶の機能」学会出版センター（２００２）Ｐ．６６〜３０４
【非特許文献３】宮地良樹、長沼雅子編著「化粧品・外用薬研究者のための皮膚科学」文光堂（２００５）Ｐ．４５〜４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の如く、緑茶は、カテキン類が豊富で、抗酸化活性が高く、種々の効果を有するが、カテキン特有の渋みや皮膚への刺激性があるゆえ、より抗酸化活性が高く、刺激性の少ない素材が求められていた。また、従来の紫外線吸収剤に用いられる素材の中には人によっては接触性皮膚炎の誘発や光毒性作用が見られるため、紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止でき、より安全性の高い、天然由来の素材が求められていた。一方、現在市場にある碁石茶、阿波番茶、プーアル茶等の後発酵茶は、渋味がなく、刺激性もないが、自然環境中で、微生物を生育させ、製造しているので、製品の品質を安定させることが難しく、また抗酸化活性は低いものである。
従って、本発明の目的は、抗酸化活性が高く、渋味や刺激性が弱く、種々の化粧料、浴用剤や食品等への適用が可能な植物由来の新たな素材を提供することにある。また、当該植物由来の新たな素材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは、抗酸化活性の弱い後発酵茶に着目し種々検討した結果、抗酸化活性の指標の一つであるＳＯＤ活性を指標にして、後発酵茶の製造条件を検討した。まず、微生物として糸状菌、乳酸菌、酵母等を用いて茶を発酵させ、ＳＯＤ活性を指標にスクリーニングしたところ、糸状菌による発酵が最もＳＯＤ活性を高めることを見出した。
次いで、該糸状菌を用いて、培養・発酵条件についても鋭意検討を重ねた結果、ある特定の適度な水分を茶に含浸させ、該糸状菌を接種し、生育させることで、ＳＯＤ活性が著しく高い後発酵茶が得られること、さらに当該発酵茶は渋味が弱く、かつ刺激性が低いため化粧料、浴用剤や食品等の素材として有用であることを見出した。また、当該後発酵茶又はその抽出物は紫外線暴露による皮膚障害を有意に防止する抗紫外線ストレス活性を有するため、紫外線防御剤として有用であることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を提供するものである。
（１）Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
（２）Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種し、生育せしめることを特徴とする、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶の製造方法。
（３）（１）記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出した後発酵茶抽出物。
（４）（１）記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出することを特徴とする後発酵茶抽出物の製造方法。
（５）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
（６）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする浴用剤組成物。
（７）（１）記載の後発酵茶又は（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする食品組成物。
（８）（３）記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
（９）（１）記載の後発酵茶又は（３）の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする紫外線防御剤。
（１０）紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止するものである（９）記載の紫外線防御剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の後発酵茶及びその抽出物は、優れた抗酸化活性を有し、渋味が弱く、かつ刺激性が少ない。また、当該後発酵茶及びその抽出物は、安全性が高く、紫外線暴露によって誘導される皮膚障害を予防・軽減する効果を有する。従って、当該後発酵茶及びその抽出物は、化粧料等の皮膚外用剤、浴用剤、食品等において抗酸化剤や紫外線防御剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の後発酵茶の原料としての茶は、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種であれば、特に品種等には限定されない。また、収穫直後の生茶葉、青殺後の茶葉、粗揉後の茶葉、揉捻後の茶葉、中揉後の茶葉、精揉後の茶葉、荒茶等の緑茶であっても、茶茎、茶花及びこれらの粉末品等の加工品等であっても、さらに半発酵茶、完全発酵茶も使用可能であり、原料となる茶は後発酵茶の用途により、適宜選択可能である。このうち、不発酵茶を用いることが、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から好ましい。
【００１６】
これらの茶の発酵に用いられる微生物は、高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得る点から糸状菌であるのが好ましい。糸状菌としては、醸造食品や発酵食品等の食品に使用可能な糸状菌の中から選抜することが可能である。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等を使用することができ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられ、さらには該糸状菌から誘導される変異株であっても使用することができる。これらを単独で若しくはそれらを組合せて使用してもよい。これらの菌株は、ＩＦＯ、ＩＡＭ、ＡＴＣＣ、ＮＲＲＣ等の菌株分譲機関、日本醸造協会や市販の種菌株販売会社等から入手可能である。
【００１７】
本発明においては、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上、好ましくは１５０重量部以上、より好ましくは２００重量部以上、最適には３００〜４００重量部の水を加える。ここでの水分量の調整は原料となる茶に、水を加え、馴染ませ、糸状菌が生育できる条件にすることを意味する。例えば、荒茶を使用した場合、該荒茶はすでに約３〜５重量％の水分を既に含んでおり、加える水分量は、茶が含んでいる水分を考慮して調整する必要がある。また、生茶葉のように水分を７０〜８０重量％含んでいるものについては、加水しなくても良い。上記の水分含量は、培養・発酵に用いる糸状菌が繁殖又は発酵可能な量であり、かつ本発明の高いＳＯＤ活性を有する後発酵茶を得るために重要である。該糸状菌を優先的に繁殖させることで、雑菌汚染をより防止することができる。該水分調整後に、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うことが挙げられる。該殺菌後は、冷却し、該茶を殺菌済み培養・発酵槽に移し、下記の植菌工程を行う。なお、該殺菌工程は、茶の水分量が変化しないように密閉系で行うのが好ましい。
【００１８】
水分含量を調整した茶に、糸状菌を接種し、一般に２０〜４０℃で３〜３０日間、好ましくは２５〜３７℃で３〜７日間培養・発酵する。ここで培養・発酵方法は、通常用いられる方法であれば、液体培養・発酵法、固体培養・発酵法等いずれの方法でも良い。次いで、殺菌工程を加えることが好ましい。該殺菌条件は、例えば、８０〜１００℃で３０〜６０分間、あるいは１００〜１２１℃で１５〜３０分間等の条件で加熱殺菌を行うこと、又は、８０〜１２０℃で加熱乾燥し該糸状菌を殺菌するとともに、水分含量を１０重量％以下、好ましくは５重量％以下にする。これにより、本発明のＳＯＤ活性の高い後発酵茶が製造される。
【００１９】
本発明の後発酵茶は、そのままの形態でも利用可能であるが、加熱、乾熱、マイクロ波等で殺菌を行い、さらに粉砕後、粉末、ペーストの形で、あるいは溶媒を用いて抽出し、後発酵茶抽出物として利用できる。さらに、当該後発酵茶抽出物を、スプレードライヤー、ドラムドライヤー、フリーズドライヤー、エアードライヤー等を用いて乾燥し、粉末化を行うことで、後発酵茶抽出物末とすることができる。また、必要に応じて造粒機等を用いて顆粒品とすることができる。
【００２０】
上記抽出の際に用いる溶媒としては、水又は炭素数１〜６のアルコール類若しくはグリコール類を単独で若しくはこれら溶媒の２つ以上の組合せが使用でき、例えば水、エタノール、含水エタノール、１，３―ブチレングリコール、含水１，３−ブチレングリコール等が挙げられる。好ましくは含水エタノール若しくは含水１，３−ブチレングリコール、より好ましくは水とエタノールの５〜９５：９５〜５の混合物（ｖ／ｖ）、水と１，３−ブチレングリコールの５〜９５：９５〜５の混合物（ｖ／ｖ）が使用できる。
抽出条件としては、約２０〜７０℃で０．１〜５時間抽出し、ろ過を行い、得られたろ液を８０〜９５℃で３０分間の条件で加熱処理を行い冷却することが好ましい。
上記抽出物は、適宜、不活性な不純物を除去するため、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の分離・精製方法によって、更に精製してもよい。具体的には、抽出物末を上記抽出溶媒を用いて再度抽出することが挙げられる。
【００２１】
上記の製造方法により得られた後発酵茶又はその抽出物は、抗酸化活性の一つの指標であるＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り２，０００ｕｎｉｔｓ以上、好ましくは８，０００ｕｎｉｔｓ以上、より好ましくは９，０００ｕｎｉｔｓ以上、さらに好ましくは９，０００〜５００，０００ｕｎｉｔｓ有する。例えば、原料としての茶に緑茶を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを用いて本発明の製造方法にて製造した後発酵茶は、ＳＯＤ活性を、後発酵茶固形分１ｇ当り９，０００ｕｎｉｔｓ以上を有している。
【００２２】
本発明の後発酵茶又はその抽出物は、後記実施例に示すように優れたＳＯＤ活性を有することから、皮膚外用剤組成物、浴用剤組成物、食品組成物等における抗酸化剤として有用である。また、本発明の後発酵茶又はその抽出物は抗酸化活性及び抗紫外線ストレス活性を有するとともに、皮膚刺激が少なく、渋味も弱いことから、皮膚外用剤又は浴用剤に応用した場合、肌の老化防止効果、抗炎症効果、抗アレルギー効果、紫外線防御効果、紫外線暴露に起因する皮膚障害の防止効果等の機能が、食品に応用した場合、内臓脂肪低減効果、血糖値上昇抑制効果、糖尿病抑制効果、血圧上昇抑制効果等の機能、紫外線暴露に起因する皮膚障害の防止効果が、さらに、消臭剤としての機能が期待できる。
ここで、抗紫外線ストレス活性とは、紫外線照射により生じる細胞傷害に対する抑制活性をいう。また、紫外線暴露に起因する障害としては、紫外線暴露により生じる種々の皮膚疾患、例えば、光線過敏症等が挙げられる。
【００２３】
本発明でいう皮膚外用剤とは、皮膚に適用しうる剤形のものであって、クリーム、化粧水、乳液、パック料、美容液、ファンデーション、パウダー、リップクリーム等の化粧料、抗炎症剤、抗真菌剤、鎮痛剤、抗掻痒剤、ステロイド剤等を含む医薬品・医薬部外品、シャンプー、リンス等の洗浄剤等を指す。
【００２４】
皮膚外用剤組成物の形態としては特に限定されず、例えば、薬用又は／及び化粧品用の化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料；洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、シャンプー剤、リンス剤、トリートメント剤、パーマネント剤、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料等が挙げられる。その他、消臭・防臭剤や衛生用品、衛生綿類、ウエットテッシュ等に応用できる。
これらの皮膚外用剤の調製にあたっては、水、界面活性剤、キレート剤、油剤、乳化剤、保湿剤、増粘剤、多価アルコール、アルコール類、美白剤、防腐剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、香料等を適宜配合することができる。
【００２５】
浴用剤組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、液状、ゲル状、錠剤状等が挙げられる。また、食品組成物の形態としては、アンプル状、カプセル状、丸剤状、錠剤状、粉末状、顆粒状、固形状、液状、ゲル状、気泡状等の他、各種食品中に配合することもできる。これらの組成物の調製にあたっては、賦形剤、結合剤、滑沢剤等を適宜配合することができる。
【００２６】
また、皮膚外用剤、浴用剤及び食品への本発明後発酵茶又はその抽出物の配合量は、固形分（乾燥重量）換算で０．０００１〜２０重量％、０．０１〜１０重量％が好ましく、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２８】
［試験例１］
緑茶（荒茶）５００ｇを１００重量部としてそれぞれ０重量部、５０重量部、７０重量部、８０重量部、１００重量部、２００重量部、３００重量部、３５０重量部、４００重量部、５００重量部、７００重量部の水を加え、混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養した後、乾燥させ、後発酵茶を得た。該後発酵茶に５，０００ｍＬの５０％（体積／体積）エタノールを添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶抽出物を得た。該後発酵茶抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）を用いてＳＯＤ活性を測定し、後発酵茶固形分当たりに換算した。結果を表１に示す。
【００２９】
ＳＯＤ活性の測定は以下の通り行った。まず、試料となる後発酵茶抽出物を蒸留水で希釈し、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、０．０３７５ｍｇ／ｍＬ、０．００７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．００３７５ｍｇ／ｍＬになるようにサンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を９６ｗｅｌｌ プレートの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ分注した。次に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに同封されているＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調製したＷＳＴ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬずつ加えよく混合した。さらに、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴに付属のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに従い調整したＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬずつマルチチャンネルピペットにて加え、プレートリーダー中で３７℃、２０分間インキュベートし、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。尚、各々にはＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの代わりに付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いたブランクを設けた。さらに、サンプル溶液の代わりに蒸留水を用いたコントロール及びそのブランクを設けた。測定した吸光度から、「スーパーオキシド」と「ＷＳＴ−１」から「ＷＳＴ−１ ｆｏｒｍａｚａｎ」が生成される反応の阻害率を求め、さらにサンプルのＩＣ50値（単位：ｇ／ｍＬ）を算出した。
また、サンプル溶液の代わりにＳＯＤ標準品を用い、ＳＯＤ濃度と阻害率の関数にて検量線を作成した。作成した検量線から、ＳＯＤのＩＣ50値（単位：ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を算出した。
上記の「サンプルのＩＣ50値」及び「ＳＯＤのＩＣ50値」からサンプルのＳＯＤ活性を算出した。計算式は以下の通りである。
（サンプルのＳＯＤ活性 単位：ｕｎｉｔｓ／ｇ）＝（ＳＯＤのＩＣ50値）÷（サンプルのＩＣ50値）
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１より、水添加量２００〜５００重量部の範囲で高いＳＯＤ活性を、３００〜４００重量部でより高いＳＯＤ活性を示すことがわかる。
【００３２】
また、得られた後発酵茶抽出物を皮膚に塗布したところほとんど刺激性がなかった。また、味も渋味が低く良好であった。
【００３３】
また、同様の方法で、従来から飲用されている後発酵茶のＳＯＤ活性を測定した結果を
表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２より、本発明の後発酵茶が、従来の後発酵茶に比べて高いＳＯＤ活性を有することがわかる。
【００３６】
［実施例１］
緑茶（荒茶）５００ｇに、１，７５０ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４８６ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、５，０００ｍＬの水を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却して、後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１０８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、２０，０６２ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり８０，２３８ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３７】
［実施例２］
緑茶（荒茶）５００ｇに、２，５００ｍＬの水を加え混合後、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該緑茶を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み５ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵した。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶４９２ｇを得た。次いで、５，０００ｍＬの５０％エタノール（以下５０％ＥｔＯＨという）を添加し、５０℃で１時間、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い、冷却して後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物を得た。得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末を得た（１１０ｇ）。得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、１９，８８４ｕｎｉｔｓ（後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１ｇ当たり９０，３８４ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３８】
［実施例３］
収穫した直後の生茶葉（水分含量：７８重量％）５００ｇを水にて洗浄後、よく水をきり、密閉系で、８０℃で６０分間加熱殺菌を行った。３０℃まで冷却後、該茶葉を、予め殺菌済みの培養・発酵槽に移し、厚み４ｃｍになるように堆積し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８を植菌した。植菌後、３０℃で７日間培養・発酵させた。培養・発酵完了後、送風乾燥機にて乾燥させ、本発明の後発酵茶９３ｇを得た。次いで、該後発酵茶に、１，０００ｍＬの水を添加し、撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い、冷却して後発酵茶水抽出物を得た。得られた後発酵茶水抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、後発酵茶水抽出物末を得た（１８ｇ）。得られた後発酵茶水抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、後発酵茶固形分１ｇ当たり、９，１００ｕｎｉｔｓ（後発酵茶水抽出物末１ｇ当たり３７，０００ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物末は、渋味もなく、苦味もなく、皮膚刺激性もなく、良好であった。
【００３９】
［実施例４］ 実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１００ｇに５０％１，３−ブチレングリコール（以下５０％ＢＧという）を５，０００ｇ添加し、５０℃で３０分間抽出を行った。次いでろ過を行いろ液を得た。得られたろ液について精密ろ過を行い、５０％ＢＧにて後発酵茶抽出物固形分１％になるように希釈し、後発酵茶５０％ＢＧ抽出物を得た。得られた後発酵茶５０％ＢＧ抽出物に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、抽出物１ｇ当たり８９０ｕｎｉｔｓ（固形分１ｇ当たり８９，０００ｕｎｉｔｓ）であった。得られた抽出物は、皮膚刺激性がなく、良好であった。
【００４０】
［比較例１］
緑茶（荒茶）５００ｇに、６，７５０ｍＬの水を添加し撹拌抽出を行った。ろ過により固液分離を行い、得られたろ液を固形分３０％（重量／体積）まで濃縮し、８０℃で３０分間加熱処理を行い冷却し、緑茶抽出物を得た。得られた緑茶抽出物をフリーズドライヤーにて乾燥することで、緑茶抽出物末を得た。得られた緑茶抽出物末に関して、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いＳＯＤ活性を測定した結果、緑茶固形分１ｇ当たり、４，７６０ｕｎｉｔｓ（緑茶抽出物末１ｇ当たり１９，８００ｕｎｉｔｓ）であった。ただし、この抽出物は渋味、苦味が強く、皮膚刺激性も強いものであった。
【００４１】
［試験例２］抗紫外線ストレス試験
紫外線は皮膚を構成する細胞の中の一種である線維芽細胞にストレスを与える要因の一つである。そのストレスにより線維芽細胞にＤＮＡ損傷を起こし、８−ＯＨｄＧの生成量を増加させる。紫外線Ａ波（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）は皮膚の表皮を通過し線維芽細胞の存在する真皮まで到達するので、紫外線Ａ波をヒト正常線維芽細胞へ照射することにより細胞にストレスを与えることができる。
それゆえ、ヒト正常線維芽細胞を用いて、実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末の抗紫外線ストレス活性を、デオキシリボ核酸（以下ＤＮＡという）損傷マーカーである８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下８−ＯＨｄＧという）を測定することにより検討した。
【００４２】
ヒト正常線維芽細胞の培養条件は、以下の通りとした。
ヒト正常線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（シグマ社製）（以下ＦＢＳという）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク社製）（以下ＤＭＥＭという）を培地として使用し、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で、週２回の培地交換を行い、培養した。
【００４３】
サンプル溶液の調製は、以下の通り行った。
実施例２で得られた後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物末１００ｍｇを秤量し、１０ｍＬの増殖培地に完全に溶解させた。その後、０．２μｍ滅菌フィルターを用いて滅菌ろ過し、１％溶液とした。この１％溶液を増殖培地で希釈し、０．０００１％、及び０．００００５％のサンプル溶液を調製した。
【００４４】
抗紫外線ストレス試験は、以下の通り行った。
ヒト正常線維芽細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１０ｍＬを１０ｃｍ ｄｉｓｈに播種した（３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）。翌日、０．０００１％及び０．００００５％のサンプルを添加した１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ１０ｍＬと交換した。１時間培養後、紫外線Ａ波を７０分間照射した（紫外線Ａ波強度：１０Ｊ／ｃｍ2）。直ちに、培養上清を除去し、トリプシン処理により細胞をｄｉｓｈより剥し、ピペットにて細胞懸濁液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
回収した細胞から、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔ（和光純薬工業社製）を用いてＤＮＡを次のように抽出した。
まず、１．５ｍＬエッペンドルフチューブを遠心分離後、上清捨て、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳという）を加え混合し、遠心（３，０００ｇ、５分）後、上清を除去した。得られた細胞ペレットに、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え、Ｖｏｒｔｅｘにて撹拌後、遠心（１０，０００ｇ、２０秒）し、上清を除去した。上記操作を２回繰り返した後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を２００μＬとＰｒｏｔｅａｓｅ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１０μＬを加えて混合し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、Ｓｏｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を３００μＬ加えて混合し、更にイソプロピルアルコール（和光純薬工業社製）０．５ｍＬを加えて、白い綿状のＤＮＡが完全に見えてくるまで静置した。遠心（１０，０００ｇ、１０分）後、上清を除去し、得られたＤＮＡに洗浄液（Ａ）（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え混合し、遠心（１０，０００ｇ、５分）した後、上清を除去し、更に洗浄液（Ｂ）（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＷＢ Ｋｉｔに付属）を１ｍＬ加え混合し、遠心（１０，０００ｇ、５分）した後、上清を除去し、沈殿物（ＤＮＡ）を軽く減圧乾燥した後、５０μＬの滅菌超純水に溶解した（ＤＮＡ水溶液）。
次に、５０μＬのＤＮＡ水溶液に、２００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を５．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬに超純粋にて濃度を調製したｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（和光純薬工業社製）水溶液を５．５μＬ（２ｕｎｉｔｓ）加え、３７℃で１時間インキュベートした。更に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．４）を５．５μＬ、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラ社製）を１μＬ（２ｕｎｉｔｓ）添加し、３７℃にて更に１時間インキュベートしＤＮＡを加水分解した。ＤＮＡ加水分解液の２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し、ＤＮＡ水溶液の濃度、純度をチェックした。
最後に、ＤＮＡ加水分解液中に含まれる８−ＯＨｄＧを、高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋ（日本老化制御研究所製）を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。
５０μＬのＤＮＡ加水分解水溶液（約２０〜３０μｇ）を、８−ＯＨｄＧを固相化しているマイクロプレート用モジュール（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）のウェルに分注した。続いて各ウェルに、８−ＯＨｄＧと特異的に反応するモノクローナル抗体である第一抗体溶液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を５０μＬずつ添加し、プレートを左右に振動させ、よく混合した。４℃で一晩反応させた後、ウェルから反応液を捨て、洗浄液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）で洗浄した。次に、各ウェルにモノクローナル抗体と結合する酵素標識抗体である第二抗体溶液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を１００μＬずつ分注し、よく混合した。常温で１時間反応後、ウェルから反応液を捨て、洗浄液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）で洗浄した。各ウェルに反応停止液（高感度８−ＯＨｄＧ ｃｈｅｃｋに付属）を１００μＬ加え、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。
【００４５】
抗紫外線ストレス試験の結果は図１に示す。
サンプル溶液で培養後、紫外線Ａ波照射処理した細胞のＤＮＡにおける８−ＯＨｄＧ生成量を、サンプル溶液無添加で紫外線Ａ波照射処理した陰性コントロールのそれと比較したところ、サンプル溶液は紫外線Ａ波照射に対する抗紫外線ストレス活性を有していることが示唆された。特に、０．０００１％においては、サンプル無添加で紫外線Ａ波無照射のブランクと近い値となり、最も抗紫外線ストレス活性を示した。
以上より、後発酵茶抽出物は、紫外線Ａ波に対する抗紫外線ストレス活性があると判断した。
【００４６】
以下に上述の実施例品を用いた配合例を示すが、各々の配合例は各製品の製造における常法により製造したもので、配合量のみを記した。また、単位は％（重量／重量）で記す。
【００４７】
［配合例１］皮膚外用剤組成物（ローション）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
エタノール １５．０
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
防腐剤 ０．１
精製水 ７９．８
【００４８】
［配合例２］皮膚外用剤組成物（乳液）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ステアリン酸 ０．２
セタノール １．５
ワセリン ３．０
流動パラフイン ７．０
ＰＯＥ（１０）モノオレイン酸エステル １．５
酢酸トコフェロール ０．２
グリセリン ５．０
トリエタノールアミン ０．１
防腐剤 ０．１
精製水 ７６．４
【００４９】
［配合例３］皮膚外用剤組成物（透明化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
１，３−ブチレングリコール ６．０
グリセリン ４．０
オレイルアルコール ０．１
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル ０．５
ＰＯＥ（１５）ラウリルアルコールエーテル ０．５
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
褐色防止剤 適量
緩衝剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５０】
［配合例４］皮膚外用剤組成物（柔軟化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ０．５
ソルビット ４．０
ジプロピレングリコール ６．０
ＰＥＧ １５００ ５．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５
メチルセルロース ０．２
クインスシード ０．１
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
キレート剤 適量
褐色防止剤 適量
緩衝剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５１】
［配合例５］皮膚外用剤組成物（半透明マイクロエマルション化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
１，３−ブチレングリコール ６．０
グリセリン ５．０
ＰＥＧ ４０００ ３．０
オリーブ油 ０．５
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアリン酸エステル １．５
ＰＯＥ（５）オレイルアルコールエーテル ０．３
エタノール １０．０
香料 適量
色剤 適量
防腐剤 適量
緩衝剤 適量
褐色防止剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５２】
［配合例６］皮膚外用剤組成物（収斂化粧水）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ジプロピレングリコール １．０
ソルビット １．０
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル １．０
スルホ石炭酸亜鉛 ０．２
クエン酸 ０．１
エタノール １５．０
香料 適量
防腐剤 適量
緩衝剤 適量
色剤 適量
褐色防止剤 適量
精製水 １００とする残余
【００５３】
［配合例７］皮膚外用剤組成物（エモリエントローション）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ステアリン酸 ２．０
セチルアルコール １．５
ワセリン ４．０
スクワラン ５．０
グリセロールトリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．０
ソルビタンモノオレイン酸エステル ２．０
ジプロピレングリコール ５．０
ＰＥＧ １５００ ３．０
トリエタノールアミン １．０
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 １００とする残余
【００５４】
［配合例８］皮膚外用剤組成物（シャンプー）
後発酵茶５０％ＢＧ抽出物（実施例４） ５．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム ５．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン
３．０
ヤシ油脂肪酸サルコシンナトリウム ２．０
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン ２．０
２−アルキルーＮ―カルボキシメチルーＮ―ヒドロキシエチルイ
ミダゾリニウムベタイン ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．０
ジステアリン酸エチレングリコール ３．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド １．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 １．０
メチルポリシロキサン ０．５
ジイソステアリン酸ポリグリセリル ２．０
混合植物抽出液（１０） ０．５
加水分解ケラチン末 ０．３
アスコルビン酸ナトリウム ０．１
ピロクトンオラミン ０．５
メチルパラベン ０．３
塩化ジメチルジアリルアンモニウム・アクリルアミド共重合体
０．１
塩化Ｏ−（２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
センサマーＣＩ−５０ ３．０
精製水 １００とする残余
【００５５】
［配合例９］浴用剤組成物（粉末タイプ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
硫酸ナトリウム ４９．５
炭酸水素ナトリウム ４９．５
【００５６】
［配合例１０］浴用剤組成物（錠剤タイプ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
硫酸ナトリウム ４４．６
炭酸水素ナトリウム １４．７
コハク酸 ２１．７
滑沢剤 適量
色剤 適量
香料 適量
【００５７】
［配合例１１］食品組成物（あめ）
後発酵茶水抽出物末（実施例１） ０．２
砂糖 ５０．０
水飴 ３３．０
クエン酸 ２．０
香料 ０．２
水 １４．６
【００５８】
［配合例１２］食品組成物（茶飲料（１））
後発酵茶水抽出物末（実施例１） ０．３
緑茶抽出物 ０．７
ビタミンＣ ０．１
水 ９８．９
【００５９】
［配合例１３］食品組成物（茶飲料（２））
後発酵茶水抽出物末（実施例１） １．０
ビタミンＣ ０．１
水 ９８．９
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】後発酵茶５０％ＥｔＯＨ抽出物（実施例２）における紫外線Ａ波照射後の細胞から抽出したＤＮＡ中の８−ＯＨｄＧ量を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
【請求項２】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種し、生育せしめることを特徴とする、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｔｕａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出した後発酵茶抽出物。
【請求項４】
請求項１記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出することを特徴とする後発酵茶抽出物の製造方法。
【請求項５】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする浴用剤組成物。
【請求項７】
請求項１記載の後発酵茶又は請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする食品組成物。
【請求項８】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項９】
請求項１記載の後発酵茶又は請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする紫外線防御剤。
【請求項１０】
紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止するものである請求項９記載の紫外線防御剤。
【請求項１】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種して生育せしめることにより得られる、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶。
【請求項２】
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ種由来の茶に、茶乾燥重量１００重量部に対して１１０重量部以上の水を加え、糸状菌を接種し、生育せしめることを特徴とする、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｔｕａｓｅ）活性を固形分換算で２，０００ｕｎｉｔｓ／ｇ以上を有する後発酵茶の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出した後発酵茶抽出物。
【請求項４】
請求項１記載の後発酵茶から、水、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール及び含水１，３−ブチレングリコールからなる群より選択される１種又は２種以上の抽出溶媒を用いて抽出することを特徴とする後発酵茶抽出物の製造方法。
【請求項５】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする浴用剤組成物。
【請求項７】
請求項１記載の後発酵茶又は請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする食品組成物。
【請求項８】
請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項９】
請求項１記載の後発酵茶又は請求項３記載の後発酵茶抽出物を含有することを特徴とする紫外線防御剤。
【請求項１０】
紫外線暴露に起因する皮膚障害を防止するものである請求項９記載の紫外線防御剤。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２１２１３６（Ｐ２００８−２１２１３６Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５７４９４（Ｐ２００７−１５７４９４）
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（０００２１００６７）池田食研株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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