抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体
インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し、そして該受容体を阻害し、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよび血清が腫瘍細胞の増殖および生存に与える影響に拮抗し、そしてアゴニスト活性を実質的に欠いている、抗体、ヒト化抗体、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、抗体断片、誘導体化抗体、および該抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲート。抗体およびその断片を、場合によって他の療法剤と組み合わせて、ＩＧＦ−Ｉ受容体発現レベルが上昇した腫瘍、例えば乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌腫、滑膜肉腫、前立腺癌および膵臓癌の治療に用いることも可能であるし、そして誘導体化抗体を、ＩＧＦ−Ｉ受容体発現レベルが上昇した腫瘍の診断および画像化に用いることも可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０１］本出願は、本明細書にその全体が援用される、親出願第１０／１７０，３９０号、２００２年６月１４日出願の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
［０２］本発明は、ヒト・インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）に結合する抗体に関する。より詳細には、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞機能を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。さらにより詳細には、本発明は、腫瘍細胞の増殖および生存に対するＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよび血清の効果に拮抗し、そしてアゴニスト活性を実質的に欠いている、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。本発明はまた、前記抗体の断片、前記抗体のヒト化バージョンおよび表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）バージョン、前記抗体のコンジュゲート、抗体誘導体、並びに診断適用、研究適用および療法適用におけるこれらの使用にも関する。本発明はさらに、上述の抗体およびその断片から作成される、改善された抗体またはその断片に関する。別の側面において、本発明は、抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドに、そして該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［０３］インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）は、膜貫通ヘテロ四量体タンパク質であり、２つの細胞外アルファ鎖および２つの膜貫通ベータ鎖を有し、これらの鎖がジスルフィド連結されてβ−α−α−β立体配置を形成している。ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに、リガンドであるインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）が結合すると、細胞内チロシンキナーゼ・ドメインが活性化され、受容体の自己リン酸化および基質リン酸化が生じる。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、インスリン受容体に相同であり、ベータ鎖チロシンキナーゼ・ドメインにおいて、８４％の高い配列類似性を有し、そしてアルファ鎖細胞外システインリッチ・ドメインにおいて、４８％の低い配列類似性を有する（Ｕｌｒｉｃｈ， Ａ．ら， １９８６， ＥＭＢＯ， ５， ２５０３−２５１２；Ｆｕｊｉｔａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｙ．ら， １９８６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １６７２７−１６７３１；ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．ら， １９９５， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １６， １４３−１６３）。ＩＧＦ−Ｉ受容体およびそのリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、胚形成の間の増殖および発生、成体における代謝、細胞増殖および細胞分化を含む、多くの生理学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす（ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， ２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４１， １２８７−１２８８；ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３６， ６３３−６４０）。
【０００４】
［０４］ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、血液中では、主にＩＧＦ結合性タンパク質との複合体中に存在して、どちらも内分泌ホルモンとして機能し、そして局所的に産生されるパラ分泌および自己分泌増殖因子として機能する（Ｈｕｍｂｅｌ， Ｒ．Ｅ．， １９９０， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９０， ４４５−４６２；Ｃｏｈｉｃｋ， Ｗ．Ｓ．およびＣｌｅｍｍｏｎｓ， Ｄ．Ｒ．， １９９３， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５， １３１−１５３）。
【０００５】
［０５］ＩＧＦ−Ｉ受容体は、腫瘍細胞の増殖、トランスフォーメーションおよび生存の促進に関連付けられてきている（Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３３２， Ｆ１０５−Ｆ１２６；Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ， Ｖ．Ａ．ら， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １５２， ３３９−３４４；Ｋａｌｅｋｏ， Ｍ．， Ｒｕｔｔｅｒ， Ｗ．Ｊ．，およびＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， ４６４−４７３）。したがって、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、滑膜肉腫および膵臓癌を含む、いくつかの種類の腫瘍は、通常より高いレベルのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現することが知られる（Ｋｈａｎｄｗａｌａ， Ｈ．Ｍ．ら， ２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２１， ２１５−２４４；Ｗｅｒｎｅｒ， Ｈ．およびＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９６， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６８， １８３−２２３；Ｈａｐｐｅｒｆｉｅｌｄ， Ｌ．Ｃ．ら， １９９７， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １８３， ４１２−４１７；Ｆｒｉｅｒ， Ｓ．ら， １９９９， Ｇｕｔ， ４４， ７０４−７０８；ｖａｎ Ｄａｍ， Ｐ．Ａ．ら， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， ４７， ９１４−９１９；Ｘｉｅ， Ｙ．ら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９， ３５８８−３５９１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｕ．ら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２００７−２０１１）。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、肺癌、乳癌、結腸癌、骨肉腫および子宮頸癌などのいくつかのヒト腫瘍細胞株の強力なマイトジェンであることが示されてきている（Ａｎｋｒａｐｐ， Ｄ．Ｐ．およびＢｅｖａｎ， Ｄ．Ｒ．， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３， ３３９９−３４０４；Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３；Ｈｅｒｍａｎｔｏ， Ｕ．ら， ２０００， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， １１， ６５５−６６４；Ｇｕｏ， Ｙ．Ｓ．ら， １９９５， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｓｕｒｇ．， １８１， １４５−１５４；Ｋａｐｐｅｌ， Ｃ．Ｃ．ら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４， ２８０３−２８０７；Ｓｔｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ａ．ら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６， １７６１−１７６５）。これらの腫瘍および腫瘍細胞株のいくつかはまた、高レベルのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩも発現し、これらが自己分泌方式またはパラ分泌方式で増殖を刺激することも可能である（Ｑｕｉｎｎ， Ｋ．Ａ．ら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， １１４７７−１１４８３）。
【０００６】
［０６］疫学的研究によって、ＩＧＦ−Ｉ血漿レベルの上昇（およびＩＧＦ結合性タンパク質−３の低レベル）と、前立腺癌、結腸癌、肺癌および乳癌のリスクの増加に相関関係があることが示されてきている（Ｃｈａｎ， Ｊ．Ｍ．ら， １９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９， ５６３−５６６；Ｗｏｌｋ， Ａ．ら， １９９８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９０， ９１１−９１５；Ｍａ， Ｊ．ら， １９９９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９１， ６２０−６２５；Ｙｕ， Ｈ．ら， １９９９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９１， １５１−１５６；Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ， Ｓ．Ｅ．ら， １９９８， Ｌａｎｃｅｔ， ３５１， １３９３−１３９６）。癌予防のため、血漿中のＩＧＦ−Ｉレベルを低下させるか、またはＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害するための戦略が示唆されてきている（Ｗｕ， Ｙ．ら， ２００２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６２， １０３０−１０３５；Ｇｒｉｍｂｅｒｇ， ＡおよびＣｏｈｅｎ Ｐ．， ２０００， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １８３， １−９）。
【０００７】
［０７］ＩＧＦ−Ｉ受容体は、増殖因子枯渇、足場非依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）または細胞傷害性薬剤処置によって引き起こされるアポトーシスから腫瘍細胞を保護する（Ｎａｖａｒｒｏ， Ｍ．およびＢａｓｅｒｇａ， Ｒ．， ２００１， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４２， １０７３−１０８１；Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３３２， Ｆ１０５−Ｆ１２６）。ＩＧＦ−Ｉ受容体の分裂促進活性、トランスフォーミング活性および抗アポトーシス活性に決定的なドメインは、突然変異分析によって同定されてきている。
【０００８】
［０８］例えば、ＩＧＦ−Ｉ受容体のチロシン１２５１残基は、抗アポトーシス活性およびトランスフォーメーション活性に決定的であるが、分裂促進活性には決定的でないと同定されてきている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ．ら， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ４２７−４３５；Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。リガンドが活性化するＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内シグナル伝達経路は、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２）のチロシン残基のリン酸化を伴い、これによって、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）が膜に補充される。ＰＩ−３−キナーゼの、膜に結合したリン脂質産物が、セリン／スレオニンキナーゼであるＡｋｔを活性化し、Ａｋｔの基質には、アポトーシス促進性タンパク質ＢＡＤが含まれ、ＢＡＤは、リン酸化されると不活性状態になる（Ｄａｔｔａ， Ｓ．Ｒ．， Ｂｒｕｎｅｔ， Ａ．およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ２９０５−２９２７；Ｋｕｌｉｋ， Ｇ．， Ｋｌｉｐｐｅｌ， Ａ．およびＷｅｂｅｒ， Ｍ．Ｊ．， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， １５９５−１６０６）。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体の分裂促進性シグナル伝達は、ＰＩ−３−キナーゼを必要とし、そしてマイトジェンが活性化するプロテインキナーゼには非依存性である一方、分化したラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞における生存性シグナル伝達は、ＰＩ−３−キナーゼ経路、およびマイトジェンが活性化するプロテインキナーゼ経路の両方を必要とする（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１；Ｐａｒｒｉｚａｓ， Ｍ．， Ｓａｌｔｉｅｌ， Ａ．Ｒ．およびＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， １５４−１６１）。
【０００９】
［０９］アンチセンス戦略によってＩＧＦ−Ｉ受容体レベルを下方制御すると、黒色腫、肺癌腫、卵巣癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫および横紋筋肉腫などのいくつかの腫瘍細胞株の腫瘍形成性が、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、減少することが示されてきている（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆ， Ｍ．ら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４， ４８４８−４８５０；Ｌｅｅ， Ｃ．−Ｔ．ら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６， ３０３８−３０４１；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．ら， １９９８， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７７， ５６７−５７１；Ｔｒｏｊａｎ， Ｊ．ら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５９， ９４−９７；Ｌｉｕ， Ｘ．ら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８， ５４３２−５４３８；Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｄ．Ｎ．ら， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４， １２３５−１２４２）。同様に、ＩＧＦ−Ｉ受容体の優性ネガティブ突然変異体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現しているトランスフォーメーションされたＲａｔ−１細胞のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成性およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を減少させることが報告されてきている（Ｐｒａｇｅｒ， Ｄ．ら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ２１８１−２１８５）。
【００１０】
［１０］ＩＧＦ−Ｉ受容体ｍＲＮＡに対するアンチセンスを発現する腫瘍細胞を、生体拡散（ｂｉｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）チャンバー中、動物に注射すると、大規模なアポトーシスが起こる。ＩＧＦ−Ｉ受容体の阻害によるアポトーシスに対して、腫瘍細胞は、正常細胞より感受性であるという仮説に基づいて、この観察から、ＩＧＦ−Ｉ受容体は魅力的な療法ターゲットとなる。（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆ， Ｍ．ら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２４６３−２４６９；Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５，２４９−２５２）。
【００１１】
［１１］腫瘍細胞においてＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害する別の戦略は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに結合し、そしてその活性化を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を使用している。ＩＧＦ−Ｉ受容体に対するマウス・モノクローナル抗体を作成する、いくつかの試みが報告されてきており、このうち、２つの阻害性抗体、ＩＲ３および１Ｈ７が入手可能であり、そしていくつかのＩＧＦ−Ｉ受容体研究において、これらの使用が報告されてきている。
【００１２】
［１２］ＩＲ３抗体は、マウスを免疫するために、インスリン受容体の部分的に精製された胎盤調製物を用いて作成されてきており、これによって、インスリン受容体結合に関して選択的な抗体ＩＲ１と、そしてＩＧＦ−Ｉ受容体（ソマトメジン−Ｃ受容体）の優先的な免疫沈降を示すが、またインスリン受容体の弱い免疫沈降も示す、２つの抗体、ＩＲ２およびＩＲ３が得られた（Ｋｕｌｌ， Ｆ．Ｃ．ら， １９８３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８， ６５６１−６５６６）。
【００１３】
［１３］１Ｈ７抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の精製された胎盤調製物でマウスを免疫することによって作成されてきており、これによって、阻害性抗体１Ｈ７に加えて、３つの刺激性抗体が得られた（Ｌｉ， Ｓ．−Ｌ．ら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９６， ９２−９８；Ｘｉｏｎｇ， Ｌ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５３５６−５３６０）。
【００１４】
［１４］別の報告において、高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するトランスフェクションされた３Ｔ３細胞でマウスを免疫することによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的なマウス・モノクローナル抗体集団が得られており、これらの抗体は、結合競合研究によって、そしてトランスフェクションされた３Ｔ３細胞に対するＩＧＦ−Ｉ結合の阻害または刺激によって、７つのグループに分類された（Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。
【００１５】
［１５］上述のように、ＩＲ３抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＧＦ−Ｉ受容体研究で最も一般的に用いられる阻害性抗体であるが、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するトランスフェクションされた３Ｔ３細胞およびＣＨＯ細胞において、アゴニスト性活性を示すという欠点がある（Ｋａｔｏ， Ｈ．ら， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ２６５５−２６６１；Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｇ．およびＲｏｔｈ， Ｒ．Ａ．， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７１， １２４４−１２５１）。同様に、Ｓｏｏｓらに作成された抗体集団の中で、最も阻害性の抗体、２４−５７および２４−６０もまた、トランスフェクションされた３Ｔ３細胞において、アゴニスト性活性を示した（Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。ＩＲ３抗体は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞において、そして可溶化後に、発現された受容体へのＩＧＦ−Ｉの結合を阻害する（がＩＧＦ−ＩＩの結合は阻害しない）ことが報告されているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞において、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩがＤＮＡ合成を刺激する能力の両方を阻害することが示されている（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｇ．およびＲｏｔｈ， Ｒ．Ａ．， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７１， １２４４−１２５１）。キメラ・インスリン−ＩＧＦ−Ｉ受容体構築物によって、ＩＲ３抗体の結合性エピトープがＩＧＦ−Ｉ受容体の２２３〜２７４の領域であると推測されている（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｔ．Ａ．およびＲｕｔｔｅｒ， Ｗ．Ｊ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， １８６６３−１８６６７；Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。
【００１６】
［１６］ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株は、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの増殖反応を示すモデル細胞株として用いられる（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１）。ＭＣＦ−７細胞において、ＩＲ３抗体は、血清不含条件において、外因性に添加されたＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの刺激性効果を、およそ８０％、不完全に遮断する。また、ＩＲ３抗体は、１０％血清中、ＭＣＦ−７細胞の増殖を有意には阻害しない（２５％未満）（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．ら， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖が、ＩＲ３抗体によって弱くしか阻害されないのは、ヌードマウスにおいて、ＩＲ３抗体で処理しても、ＭＣＦ−７異種移植片の増殖が、有意には阻害されないというｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果と関連がある可能性もある（Ａｒｔｅａｇａ， Ｃ．Ｌ．ら， １９８９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４， １４１８−１４２３）。
【００１７】
［１７］ＩＲ３および他の報告される抗体が、弱いアゴニスト性活性を持ち、そして（血清不含条件において外因性に添加されたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩによる刺激でなく）血清が刺激する、より生理学的な条件において、ＭＣＦ−７細胞などの腫瘍細胞の増殖を有意に阻害することが不能であるため、血清が刺激する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害するが、それ自体では有意なアゴニスト性活性を示さない、新規抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
［１８］したがって、本発明の目的は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し、そして該受容体と拮抗することによって、該受容体の細胞活性を阻害し、そしてまた、該受容体に対するアゴニスト活性を実質的に欠いている、抗体、抗体断片および抗体誘導体を提供することである。
【００１９】
［１９］したがって、第一の態様において、軽鎖および重鎖両方の可変領域のアミノ酸配列、軽鎖および重鎖の可変領域の遺伝子のｃＤＮＡ配列、そのＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、その表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段に関して、本明細書において完全に性質決定されている、ネズミ抗体ＥＭ１６４を提供する。
【００２０】
［２０］第二の態様において、抗体ＥＭ１６４の表面再構成（resurfaced）バージョンまたはヒト化バージョンであって、抗体の表面曝露残基またはその断片が、既知のヒト抗体表面により緊密に似るように、軽鎖および重鎖の両方で置換されている、前記バージョンを提供する。こうしたヒト化抗体は、ネズミＥＭ１６４に比較して、療法剤または診断剤として、増加した有用性を有しうる。抗体ＥＭ１６４のヒト化バージョンはまた、軽鎖および重鎖両方の可変領域のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖および重鎖の可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、これらの表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段の開示に関して、本明細書に完全に性質決定される。
【００２１】
［２１］第三の態様において、例えば血清、インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩなどの増殖刺激剤の存在下で、約８０％より多く、癌細胞の増殖を阻害することが可能な抗体を提供する。
【００２２】
［２２］第四の態様において、それぞれ配列番号１〜３：
【００２３】
【化１】
【００２４】
に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む重鎖；
および配列番号４〜６：
【００２５】
【化２】
【００２６】
に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を有する、抗体または抗体断片を提供する。
［２３］第五の態様において、配列番号７：
【００２７】
【化３】
【００２８】
に示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗体を提供する。
［２４］同様に、配列番号８：
【００２９】
【化４】
【００３０】
に示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体を提供する。
［２５］第六の態様において、配列番号９〜１２：
【００３１】
【化５】
【００３２】
の１つに対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構成軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
［２６］同様に、配列番号１３：
【００３３】
【化６】
【００３４】
に対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構成重鎖可変領域を有する抗体を提供する。
［２７］第七の態様において、改善された特性を有する、本発明の抗体または抗体断片を提供する。例えば、本発明の抗体または断片の親和性成熟によって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対して改善された親和性を有する抗体または抗体断片が調製される。
【００３５】
［２８］本発明はさらに、前記抗体のコンジュゲートであって、本発明の抗体または抗体のエピトープ結合性断片に、直接、あるいは切断可能リンカーまたは切断不能リンカーを介して、細胞傷害性剤が共有結合している、前記コンジュゲートを提供する。好ましい態様において、細胞傷害性剤は、タキソール、メイタンシノイド、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。
【００３６】
［２９］本発明はさらに、研究適用または診断適用における使用のため、さらに標識された抗体またはその断片を提供する。好ましい態様において、標識は放射標識、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、発色団、画像化剤または金属イオンである。
【００３７】
［３０］診断法であって、癌を有すると推測される被験者に、前記標識抗体または断片を投与して、そして被験者体内の標識分布を測定するかまたは監視する、前記方法もまた、提供する。
【００３８】
［３１］第八の態様において、本発明は、本発明の抗体、抗体断片または抗体コンジュゲートを、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて投与することによって、癌を有する被験者を治療する方法を提供する。癌は、例えば乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、またはＩＧＦ−Ｉ受容体レベルが上昇していることがこれから決定されるであろう他の癌の１以上であることも可能である。
【００３９】
［３２］第九の態様において、本発明は、本発明の抗体、抗体断片または抗体コンジュゲートを、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて投与することによって、癌を有する被験者を治療する方法を提供する。特に、好ましい細胞傷害性剤および療法剤には、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンが含まれる。より好ましくは、療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００４０】
［３３］癌は、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫、またはＩＧＦ−Ｉ受容体レベルが上昇していることがこれから決定されるであろう他の癌の１以上であることも可能である。
【００４１】
［３４］第十の態様において、本発明は、本明細書記載の１以上の要素、およびこれらの要素を使用するための使用説明書を含むキットを提供する。好ましい態様において、本発明のキットには、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤が含まれる。この好ましい態様のための使用説明書には、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌細胞の増殖を阻害するための使用説明書、並びに／あるいは本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌を有する患者を治療する方法のための使用説明書が含まれる。
【００４２】
発明の詳細な説明
［６２］本発明の発明者らは、細胞表面上のヒト・インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に特異的に結合する新規抗体を発見しそして改善した。該抗体および断片は、受容体自体を活性化する能力を伴わずに、受容体の細胞機能を阻害するユニークな能力を有する。したがって、ＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合し、そして阻害することが以前から知られていた抗体はまた、ＩＧＦ−ＩＲリガンドの非存在下であっても、受容体を活性化するのに対して、本発明の抗体または断片は、ＩＧＦ−ＩＲに拮抗するが、アゴニスト活性を実質的に欠いている。さらに、本発明の抗体および抗体断片は、血清の存在下で、８０％を超えて、ＭＣＦ−７細胞などのヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、これは以前から知られていた抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて得られる阻害より高い度合いである。
【００４３】
［６３］本発明は、ネズミ抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、本明細書のＥＭ１６４から出発し、該抗体は、軽鎖および重鎖両方のアミノ酸配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段に関して、完全に性質決定されている。
【００４４】
［６４］図１５に、ＥＭ１６４の配列と並列させて、生殖系列配列を示す。比較によって、軽鎖のＣＤＲ１中および重鎖のＣＤＲ２中の各１つを含めて、ＥＭ１６４中のありうる体細胞突然変異が同定される。
【００４５】
［６５］抗体ＥＭ１６４軽鎖および重鎖、並びにヒト化バージョンの、一次アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を本明細書に開示する。しかし、本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体および断片に限定されない。その代わり、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し、そして該受容体の生物学的活性に拮抗するが、アゴニスト活性を実質的に欠いている、すべての抗体および断片が、本発明の範囲内に属する。したがって、抗体および抗体断片は、抗体ＥＭ１６４またはヒト化誘導体と、骨格のアミノ酸配列、ＣＤＲ、軽鎖および重鎖が異なってもよく、そしてそれでも本発明の範囲内に属することもありうる。
【００４６】
［６６］モデリングによって、抗体ＥＭ１６４のＣＤＲが同定され、そしてその分子構造が予測されてきている。この場合もやはり、ＣＤＲはエピトープ認識に重要であるが、本発明の抗体および断片に必須ではない。したがって、例えば本発明の抗体の親和性成熟によって産生された、改善された特性を有する抗体および断片を提供する。
【００４７】
［６７］多様な抗体および抗体断片、並びに抗体模倣体は、特定のＣＤＲセットに隣接する可変領域配列および定常領域配列内の突然変異、欠失および／または挿入によって、容易に産生可能である。したがって、例えば、既定のＣＤＲセットに関して、異なる重鎖で置換することによって、異なるクラスのＡｂを作成することも可能であり、したがって、例えば、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１〜２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプおよびアイソタイプを産生することも可能である。同様に、完全に合成されたフレームワーク内に、既定のＣＤＲセットを包埋することによって、本発明の範囲内の人工的抗体を産生することも可能である。用語「可変」は、本明細書において、抗体間で配列が異なり、そして抗原に対する特定の抗体各々の結合および特異性に際して用いられる、可変ドメインの特定の部分を指すのに用いられる。しかし、可変性は、通常、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するのではない。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのフレームワーク領域を含み、主として、３つのＣＤＲに連結されたベータ・シート立体配置を採用し、ＣＤＲは、ベータ・シート構造を連結し、そしてある場合にはベータ・シート構造の一部を形成する、ループを形作る。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって非常に近接して一緒に保持され、そして他方の鎖由来のＣＤＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｅ．Ａ． Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， １９９１， ＮＩＨ）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合には、直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を示す。
【００４８】
［６８］表面再構成およびＣＤＲ移植などのいくつかの技術を用いて、ヒト化抗体、または他の哺乳動物による非拒絶のために適応させた抗体を、産生することも可能である。表面再構成技術においては、分子モデリング、統計解析および突然変異誘発を組み合わせて、ターゲット宿主の既知の抗体の表面に似るように、可変領域の非ＣＤＲ表面を調節する。抗体表面を再構成する戦略および方法、並びに異なる宿主内で抗体の免疫原性を減少させる他の方法は、本明細書にその全体が援用される、米国特許５，６３９，６４１に開示される。ＣＤＲ移植技術においては、ネズミ重鎖および軽鎖のＣＤＲを、完全にヒトであるフレームワーク配列内に移植する。
【００４９】
［６９］本発明にはまた、本明細書中に記載される抗体の機能上の同等物も含まれる。機能上の同等物は、抗体のものに匹敵する結合特性を有し、そして例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体、並びにそれらの断片を含む。こうした機能上の同等物を産生する方法が、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／２１３１９、欧州特許出願第２３９，４００号；ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；および欧州特許出願ＥＰ ３３２，４２４に開示され、これら出願は、それぞれ全体が本明細書に援用される。
【００５０】
［７０］機能上の同等物には、本発明の抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチドが含まれる。「実質的に同じ」は、アミノ酸配列に適用された場合、本明細書において、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４−２４４８（１９８８）にしたがって、ＦＡＳＴＡ検索法によって決定されるように、別のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を持つ配列と定義される。
【００５１】
［７１］キメラ抗体は、好ましくは、ヒトの抗体定常領域から実質的にまたは独占的に得られた定常領域、およびヒト以外の哺乳動物の可変領域配列から実質的にまたは独占的に得られた可変領域を有する。抗体のヒト化型は、例えばマウス抗体の、相補性決定領域をヒトのフレームワークドメイン内に置換することによって作成され、例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト化抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的にまたは独占的に由来する、定常領域、および相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変領域、並びにヒト以外の哺乳動物に実質的にまたは独占的に由来するＣＤＲを有する。
【００５２】
［７２］機能上の同等物には、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる、一本鎖抗体断片もまた含まれる。これらの断片は、１以上の相互連結リンカーを伴いまたは伴わずに、抗体可変軽鎖配列（ＶＬ）の少なくとも１つの断片に係留された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）、抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含有する。こうしたリンカーは、ひとたび（ＶＬ）ドメインおよび（ＶＨ）ドメインが連結されたならば、一本鎖抗体断片が由来する全抗体のターゲット分子結合特異性が維持されるように、これらのドメインが適切に三次元フォールディングされることを確実にするよう選択された、短い柔軟なペプチドであることも可能である。一般的に、（ＶＬ）配列または（ＶＨ）配列のカルボキシル末端は、こうしたペプチド・リンカーによって、相補（ＶＬ）配列および（ＶＨ）配列のアミノ末端に、共有結合されていることも可能である。分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリーまたは類似の技術によって、一本鎖抗体断片を生成することも可能である。真核細胞、または細菌を含む原核細胞いずれかにおいて、これらのタンパク質を産生することも可能である。
【００５３】
［７３］一本鎖抗体断片は、本明細書記載の全抗体の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含有するが、これらの抗体の定常ドメインのある程度またはすべてを欠く。これらの定常ドメインは、抗原結合に必要ではないが、全抗体構造の主要部分を構成する。一本鎖抗体断片は、したがって、定常ドメインの一部またはすべてを含有する抗体の使用に関連する不具合のある程度を克服することも可能である。例えば、一本鎖抗体断片は、生物学的分子および重鎖定常領域間の望ましくない相互作用、または他の望ましくない生物学的活性を持たない傾向がある。さらに、一本鎖抗体断片は、全抗体よりかなり小さく、そしてしたがって、全抗体より毛細血管透過性が高いことから、より効率的に局在し、そしてターゲット抗原結合部位に結合することが可能になる。また、抗体断片は、原核細胞において、比較的大規模に産生可能であり、したがって産生が容易である。さらに、一本鎖抗体断片は比較的サイズが小さいことから、全抗体よりも、レシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低くなる。
【００５４】
［７４］機能上の同等物には、さらに、全抗体のものと同じかまたは匹敵する結合特性を有する抗体の断片が含まれる。こうした断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片の一方または両方を含有することも可能である。好ましくは、抗体断片は、全抗体の６つの相補性決定領域すべてを含有するが、３つ、４つまたは５つのＣＤＲなど、こうした領域すべてより少ない領域を含有する断片もまた、機能性である。さらに、機能上の同等物は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそのサブクラスのいずれか１つのメンバーであることも可能であるし、また機能上の同等物をこれらのクラスおよびサブクラスと組み合わせることも可能である。
【００５５】
［７５］本明細書記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４およびそのヒト化変異体のアミノ酸配列および核酸配列の知識を用いて、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体にやはり結合し、そしてＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞機能を阻害する、他の抗体を作成することも可能である。いくつかの研究によって、最初の抗体配列の知識に基づいて、抗体配列中の多様な位置で、１以上のアミノ酸変化を導入した際の、結合および発現レベルなどの特性に対する影響が調査されてきている（Ｙａｎｇ， Ｗ．Ｐ．ら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５４， ３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ， Ｃ．ら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， ８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９）。
【００５６】
［７６］これらの研究において、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラープローン（error-prone）ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のミューテーター株などの方法を用い、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖の遺伝子配列を変化させることによって、最初の抗体の変異体が生成された（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９；Ａｄｅｙ， Ｎ．Ｂ．ら， １９９６， 第１６章， ｐｐ．２７７−２９１， “Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”中， Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ．ら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。最初の抗体の配列を変化させるこれらの方法によって、親和性が改善された第二の抗体が生じている（Ｇｒａｍ， Ｈ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ， Ｅ．Ｔ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， １０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２， １６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．ら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６， ７７−８８；Ｓｈｏｒｔ， Ｍ．Ｋ．ら， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， １６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．ら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ２７６２２−２７６２８）。
【００５７】
［７７］抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の指定戦略（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ）によって、本発明記載の抗体配列を用いて、機能が改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を作成することも可能である。
【００５８】
［７８］本発明のコンジュゲートは、細胞傷害性剤に連結された、本明細書に開示する抗体、断片、およびその類似体を含む。好ましい細胞傷害性剤は、メイタンシノイド、タキサンおよびＣＣ−１０６５類似体である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によってコンジュゲートを調製することも可能である。細胞傷害性剤を抗体に連結するため、連結基を用いる。適切な連結基が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、または抗体および細胞傷害性剤の間にチオエーテル結合を形成することによって、コンジュゲートを構築することも可能である。
【００５９】
［７９］好ましい細胞傷害性剤の中に、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体がある。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。適切なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号および第５，８４６，５４５号に開示される。
【００６０】
［８０］タキサンもまた、好ましい細胞傷害性剤である。本発明での使用に適したタキサンが、米国特許第６，３７２，７３８号および第６，３４０，７０１号に開示される。
［８１］ＣＣ−１０６５およびその類似体もまた、本発明での使用に好ましい細胞傷害性薬剤である。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号；第６，３４０，７０１号；第５，８４６，５４５号および第５，５８５，４９９号に開示される。
【００６１】
［８２］こうした細胞傷害性コンジュゲートの調製のための魅力的な候補はＣＣ−１０６５であり、これはストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された、強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンなどの一般的に用いられる抗癌薬剤より、ｉｎ ｖｉｔｒｏで約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ． Ｂｈｕｙａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４２， ３５３２−３５３７（１９８２））。
【００６２】
［８３］メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、およびカリケアマイシンなどの細胞傷害性薬剤もまた、本発明のコンジュゲートの調製に適しており、そして薬剤分子を、血清アルブミンなどの中間キャリアー分子を通じて、抗体分子に連結することもまた可能である。
【００６３】
［８４］診断適用のため、本発明の抗体は、典型的には、検出可能部分で標識されるであろう。検出可能部分は、直接または間接的いずれかで検出可能シグナルを生じることが可能ないかなるものであることも可能である。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１３１Ｉなどの放射性同位体；フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光化合物または化学発光化合物；あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼなどの酵素であることも可能である。
【００６４】
［８５］検出可能部分に抗体をコンジュゲート化するため、当該技術分野に知られるいかなる方法を使用することも可能であり、こうした方法には、Ｈｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３０：４０７（１９８２）が含まれる。
【００６５】
［８６］競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなどの、いかなる既知のアッセイ法で、本発明の抗体を使用することも可能である（Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７））。
【００６６】
［８７］本発明の抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化にも有用であり、この場合、放射線不透過（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）剤または放射性同位体などの検出可能部分で標識した抗体を被験者に、好ましくは血流中に投与し、そして宿主中の標識抗体の存在および位置をアッセイする。この画像化技術は、悪性腫瘍の病期決定および治療に有用である。核磁気共鳴、放射線学、または当該技術分野に知られる他の検出手段のいずれによるものであれ、宿主において検出可能である、いかなる部分で抗体を標識することも可能である。
【００６７】
［８８］本発明の抗体はまた、アフィニティー精製剤としても有用である。このプロセスでは、当該技術分野に周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙などの適切な支持体上に抗体を固定する。
【００６８】
［８９］本発明の抗体はまた、細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害することに基づいて、生物学的研究における試薬としても有用である。
［９０］療法適用のため、薬学的に許容しうる投薬型で、本発明の抗体またはコンジュゲートを被験者に投与する。これらは、ボーラスとして、またはある期間に渡る連続注入によって静脈内に、筋肉内経路、皮下経路、関節内経路、滑膜内経路、クモ膜下腔内経路、経口経路、局所経路、または吸入経路によって、投与可能である。また、腫瘍内経路、腫瘍周辺経路、病巣内経路、または病巣周辺経路によって抗体を投与して、局所、並びに全身性の療法効果を発揮することも可能である。適切な薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤、および賦形剤が周知であり、そして臨床状況を保証するものとして、当業者によって決定可能である。適切なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤の例には：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれる。本発明の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することも可能である。
【００６９】
［９１］他の療法処置において、１以上のさらなる療法剤と、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートを同時投与するか、または連続投与することも可能である。適切な療法剤には、限定されるわけではないが、細胞傷害性剤または細胞分裂停止剤が含まれる。タキソールは、細胞傷害性剤でもあり、好ましい療法剤である。
【００７０】
［９２］癌療法剤は、宿主への損傷を最小限にしつつ、癌細胞を殺すかまたはその増殖を制限することを模索する剤である。したがって、こうした剤は、癌細胞特性における、健康な宿主細胞とのいかなる相違（例えば代謝、血管形成または細胞表面抗原提示）を利用することも可能である。腫瘍形態形成における相違が、介入の潜在的な箇所である：例えば、第二の療法剤は、固形腫瘍内部の血管形成を遅延させ、それによってその増殖速度を遅らせる際に有用な、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体であることも可能である。他の療法剤には、限定されるわけではないが、グラニセトロンＨＣｌなどの補助剤（ａｄｊｕｎｃｔｓ）、酢酸ロイプロリドなどのアンドロゲン阻害剤、ドキソルビシンなどの抗生物質、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、インターフェロン・アルファ−２ａなどの代謝拮抗剤、タキソールなどの細胞傷害性剤、ｒａｓファルネシル・トランスフェラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤、アルデスロイキンなどの免疫調節剤、およびメルファランＨＣｌなどのナイトロジェンマスタード誘導体等が含まれる。
【００７１】
［９３］抗癌効力を改善するために、ＥＭ１６４と組み合わせることも可能な療法剤には、腫瘍学治療に用いられる多様な剤が含まれ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、エポチロン、並びに細胞傷害性薬剤および細胞表面受容体に対する抗体のコンジュゲートがある。好ましい療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００７２】
［９４］１以上のさらなる療法剤を、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートの前に、これらと同時に、またはこれらの後に投与することも可能である。当業者は、各療法剤に関して、投与の特定の順番に利点がありうることを理解するであろう。同様に、当業者は、各療法剤に関して、剤、および本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートを投与する間の時間の長さが、多様であろうことを理解するであろう。
【００７３】
［９５］当業者は、各療法剤の投薬量が、剤の独自性に応じることを理解するであろうが、好ましい投薬量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲であることも可能である。白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン）などの好ましい剤に関しては、好ましい投薬量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約４００ｍｇ／平方メートルであり、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）に関しては、好ましい投薬量は、約２０ｍｇ／平方メートル〜約１５０ｍｇ／平方メートルであり、ゲムシタビンに関しては、好ましい投薬量は、約１００ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルであり、そしてカンプトテシンに関しては、好ましい投薬量は、約５０ｍｇ／平方メートル〜約３５０ｍｇ／平方メートルである。これらおよび他の療法剤の投薬量は、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートが、療法剤と同時にまたは連続して投与されるかどうかに応じる可能性もある。
【００７４】
［９６］本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および１以上のさらなる療法剤の投与は、同時投与されるかまたは連続投与されるかいずれであっても、療法適用に関して、上述するように行うことも可能である。同時投与に適した薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤、および賦形剤は、同時投与される特定の療法剤の独自性に応じることが、当業者に理解されるであろう。
【００７５】
［９７］凍結乾燥型でなく、水性投薬型で存在する場合、抗体は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で配合されるであろうが、これらの範囲外の広い変動が許容される。疾患治療のため、抗体またはコンジュゲートの適切な投薬量は、上に定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または療法目的で投与されるかどうか、以前の療法の経過、患者の病歴および抗体に対する応答、並びに主治医の自由裁量に応じるであろう。抗体を一度にまたは一連の治療に渡って、患者に適切に投与する。
【００７６】
［９８］疾患の種類および重症度に応じて、例えば１以上の別個の投与によるか、または連続注入によるかいずれであっても、好ましくは約１ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの抗体が、患者に投与する、最初の候補投薬量であり、より好ましくは、１もしくはそれより多くの分散投与（separate administration）または連続注入のいずれかによる約１０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの抗体である。数日以上に渡る反復投与では、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、治療を反復する。しかし、他の投薬措置が有用である可能性もあり、そしてこれらも排除されない。
【００７７】
［９９］本発明にはまた、本明細書記載の要素の１以上、およびこれらの要素を使用するための使用説明書を含むキットも含まれる。好ましい態様において、本発明のキットには、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤が含まれる。この好ましい態様の使用説明書には、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて癌細胞の増殖を阻害するための使用説明書、並びに／あるいは本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌を有する患者を治療する方法のための使用説明書が含まれる。
【００７８】
［１００］好ましくは、キットに用いられる抗体は、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有するか、または抗体はエピトープ結合性断片であり、抗体および断片はどちらも、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する。キット中で用いられる抗体および抗体断片はまた、ＥＭ１６４抗体の表面再構成バージョン、ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョン、あるいは少なくとも１つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を有する、ＥＭ１６４抗体の改変されたバージョンであることも可能である。これらの３つのバージョンの抗体および抗体断片は、ＥＭ１６４抗体と同じ結合特異性を保持する。
【００７９】
［１０１］好ましくは、キットに用いられる療法剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される。より好ましくは、療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００８０】
［１０２］本発明のキットの要素は、キットに適した形であり、例えば溶液または凍結乾燥粉末である。キットの要素の濃度または量は、キットの各要素の同一性および意図される使用に応じて多様であることが、当業者には理解されるであろう。
【００８１】
［１０３］キットの使用説明書に言及される癌およびそれに由来する細胞には、乳癌、結腸癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫が含まれる。
【実施例】
【００８２】
実施例
［１０４］本発明は、ここで、以下の実施例に言及することによって記載されるが、実施例は例示でしかなく、そして本発明を限定することは意図されない。
【００８３】
（実施例１）
ネズミＥＭ１６４抗体
［１０５］この第一の実施例において、本発明のネズミ抗体の完全一次アミノ酸構造およびｃＤＮＡ配列、並びにその結合特性および組換え型でのその発現手段を開示する。したがって、免疫学的技術分野の一般の当業者が、過度な実験を伴わずに前記抗体を調製可能であるように、本発明の抗体およびその調製法の完全な開示を提供する。
【００８４】
Ａ． 抗ＩＧＦ−Ｉ受容体モノクローナル抗体ハイブリドーマの生成
［１０６］多数のＩＧＦ−Ｉ受容体（細胞あたり〜１０７）を発現するため、Ｙ１２５１Ｆ突然変異を持つヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する細胞株を免疫に用いた。ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞質ドメインにおけるＹ１２５１Ｆ突然変異によって、トランスフォーメーションおよび抗アポトーシス・シグナル伝達の欠失が生じたが、ＩＧＦ−Ｉ結合、およびＩＧＦ−Ｉが刺激する分裂促進シグナル伝達には影響はなかった（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ．ら， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ４２７−４３５；Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。本実施例の抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに結合し、これはＹ１２５１Ｆ突然変異体および野生型受容体の両方で同一であったため、この突然変異は、その他の点では、抗体生成に影響を及ぼさなかった。
【００８５】
［１０７］Ｙ１２５１Ｆ突然変異体ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子と一緒にピューロマイシン抵抗性遺伝子をトランスフェクションすることによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体欠損マウスの３Ｔ３様細胞から、Ｙ１２５１Ｆ突然変異を含むヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する細胞株を生成し、そしてピューロマイシン（２．５マイクログラム／ｍｌ）を用いて、そして高ＩＧＦ−Ｉ受容体発現に関するＦＡＣＳ分取によって、選択した（Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。大部分の細胞には毒性である、２５マイクログラム／ｍｌなどの高濃度のピューロマイシンを用いて、高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体発現を有する細胞株をさらに選択した。生存コロニーを摘み取り、そして高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体発現を示すものを選択した。
【００８６】
［１０８］Ｙ１２５１Ｆ突然変異体ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞（５ｘ１０５細胞、０．２ｍｌのＰＢＳに懸濁）で、第０日に、６ヶ月齢のＣＡＦ１／Ｊメスマウスを腹腔内経路で免疫した。０．２ｍｌの細胞懸濁物を用いて動物に以下のように追加免疫した：第２日、１ｘ１０６細胞；第５日、２ｘ１０６細胞；第７日、第９日、第１２日、および第２３日、１ｘ１０７細胞。第２６日にマウスを屠殺し、そして脾臓を取り除いた。
【００８７】
［１０９］２枚のすりガラス・スライド間で脾臓をすりつぶして、単細胞懸濁物を得て、これを、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する血清不含ＲＰＭＩ培地（ＳＦＭ）で洗浄した。脾臓細胞ペレットを１０ｍｌの水中の０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム溶液に、氷上で１０分間再懸濁して、赤血球細胞を溶解し、そして次いで、血清不含培地（ＳＦＭ）で洗浄した。脾臓細胞（１．２ｘ１０８）を、非分泌性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル；カタログ番号ＣＲＬ１５８０）由来の骨髄腫細胞（４ｘ１０７）と一緒に、試験管中でプールし、そして血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＦＭ）で洗浄した。上清を取り除いて、そして細胞ペレットを残った培地に再懸濁した。試験管を３７℃の水の入ったビーカーに入れ、そして穏やかに振盪しながら、１．５ｍｌのポリエチレングリコール溶液（７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、５０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）、平均分子量１５００）を滴下速度０．５ｍｌ／分で、ゆっくりと添加した。１分間待った後、１０ｍｌのＳＦＭを以下のように添加した：最初の１分間に渡って１ｍｌ、次の１分間に渡って２ｍｌ、そして次の１分間に渡って７ｍｌ。次いで、さらに１０ｍｌを１分間に渡ってゆっくりと添加した。遠心分離によって細胞をペレットにし、ＳＦＭで洗浄し、そして５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ハイブリドーマ・クローニング上清（ＨＣＳ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０増殖培地に再懸濁した。ウェルあたり２００μｌ中、２ｘ１０５脾臓細胞で、細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに植え付けた。５〜７日後、ウェルあたり１００μｌを取り除き、そしてヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）および５％ＦＢＳを補った増殖培地で置き換えた。免疫およびハイブリドーマ産生に用いた一般的な条件は、Ｊ． ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ． Ｖｕｎａｋｉｓ（監修， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １２１， “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＰａｒｔＩ”；１９８６；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，フロリダ）、並びにＥ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９８８；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載される。当業者に周知であるように、免疫およびハイブリドーマ産生の他の技術もまた使用可能である。
【００８８】
［１１０］以下に記載するように、ＥＬＩＳＡによって精製ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合に関して、そして、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニングによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞に対する特異的結合に関して、およびヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対する結合の欠如に関して、ハイブリドーマ・クローン由来の培養上清をスクリーニングした。ヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対するよりも、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞に、より高い結合親和性を示すクローンを増殖させ、そしてサブクローニングした。上記結合アッセイによって、サブクローンの培養上清をさらにスクリーニングした。この方法によって、サブクローン３Ｆ１−Ｃ８−Ｄ７（ＥＭ１６４）を選択し、そして以下に記載するように、重鎖および軽鎖遺伝子をクローニングし、そして配列決定した。
【００８９】
［１１１］以下の方法によって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合に関して、ハイブリドーマ・クローンからの上清のスクリーニングに使用するため、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を単離した。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、またはＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンなどのビオチン化試薬を用いて、組換えＩＧＦ−Ｉを修飾することによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを調製した。ビオチン化ＩＧＦ−Ｉをストレプトアビジン−アガロースビーズ上に吸収させ、そしてヒト野生型またはＹ１２５１Ｆ突然変異体ＩＧＦＲを過剰発現する細胞由来の溶解物とインキュベーションした。ビーズを洗浄し、そして２〜４Ｍ尿素およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはオクチル−β−グルコシドなどの界面活性剤を含有する緩衝液を用いて溶出した。溶出したＩＧＦ−Ｉ受容体をＰＢＳに対して透析し、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度に関して分析すると、それぞれ約１３５ｋＤａおよび９５ｋＤａの分子量のＩＧＦ−Ｉ受容体のアルファ鎖およびベータ鎖のバンドが示された。
【００９０】
［１１２］精製ＩＧＦ−Ｉ受容体に対するハイブリドーマ上清の結合に関してチェックするため、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４ＨＢ ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を精製ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体試料（アフィニティー精製試料の尿素／オクチル−β−グルコシド溶出からの透析によって調製したもの）でコーティングし、ｐＨ９．５の５０ｍＭ ＣＨＥＳ緩衝液で希釈した（１００μｌ；４℃、一晩）。２００μｌのブロッキング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ−Ｔ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）でウェルをブロッキングし、そしてハイブリドーマ・クローン由来の上清（１００μｌ；ブロッキング緩衝液で希釈）と約１時間〜１２時間インキュベーションし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．８μｇ／ｍｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した（０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．２中、０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ、０．０３％Ｈ２Ｏ２）。典型的には、３Ｆ１ハイブリドーマ・サブクローン由来の上清は、発色３分以内に、約１．２吸光単位のシグナルを生じ、これはいくつかの他のハイブリドーマ・クローンからの上清に関して得られた０．０の値とは対照的であった。このＥＬＩＳＡの一般的な条件は、Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９９９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載されるような抗体結合および検出のための標準的ＥＬＩＳＡ条件と同様であり、この条件もまた、使用可能である。
【００９１】
［１１３］ヒトＹ１２５１Ｆ−ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞株に対して、そしてヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞株に対して、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、そしてヒト・インスリン受容体に特異的に結合しないハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。どちらの細胞株もＩＧＦ−Ｉ受容体欠損マウスの３Ｔ３様細胞から生成した。迅速なトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって、組織培養フラスコから、ＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞およびインスリン受容体過剰発現細胞を別個に採取し、１０％ＦＢＳを含有する増殖培地に懸濁し、遠心分離によってペレットにし、そしてＰＢＳで洗浄した。植物性血球凝集素（phytohemagglutinin）（２０μｇ／ｍｌ ＰＨＡの１００μｌ）でコーティングしたＩｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレートのウェルに、洗浄した細胞（約１〜３ｘ１０６細胞／ｍｌの１００μｌ）を添加し、遠心分離し、そしてＰＨＡでコーティングしたウェルに１０分間接着させた。細胞を含むプレートを軽く叩いてＰＢＳを取り除き、そして次いで３７℃で一晩乾燥させた。ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液で、ウェルを３７℃で１時間ブロッキングし、そして次いで、ＰＢＳで穏やかに洗浄した。次いで、ＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞を含有するウェル、およびインスリン受容体過剰発現細胞を含有するウェルに、ハイブリドーマ・クローンからの上清のアリコット（１００μｌ；ブロッキング緩衝液で希釈）を添加し、そして周囲温度で１時間インキュベーションした。ＰＢＳでウェルを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．８μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベーションし、その後、洗浄し、そして次いでＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて結合を検出した。典型的には、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して、３Ｆ１ハイブリドーマ・サブクローンからの上清は、発色１２分以内に、０．８８吸光単位のシグナルを生じ、これはヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して得られた０．２２吸光単位の値とは対照的であった。
【００９２】
［１１４］製造者の指定にしたがって、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ３５０フラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州）中でハイブリドーマを増殖させて、精製ＥＭ１６４抗体を提供した。抗体標準を用いた、ＥＬＩＳＡによる、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色による定量化に基づいて、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコから採取した上清中、約０．５〜１ｍｇ／ｍｌの収量の抗体を得た。３Ｍ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．９で装填および洗浄し、その後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭ酢酸溶液で溶出する、標準的精製条件下で、プロテインＡ−アガロースビーズ・カラム上のアフィニティー・クロマトグラフィーによって、抗体を精製した。抗体を含有する溶出分画を、冷２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４溶液で中和し、そしてＰＢＳ中、４℃で透析した。２８０ｎｍの吸光度を測定することによって抗体濃度を決定した（消光係数＝１．４ｍｇ−１ｍｌｃｍ−１）。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって、精製抗体試料を分析すると、それぞれ約５５ｋＤａおよび２５ｋＤａの抗体重鎖および軽鎖のバンドのみが示された。精製抗体のアイソタイプは、カッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１であった。
【００９３】
Ｂ． ＥＭ１６４抗体の結合特性
［１１５］ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞を用い、そしてヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞を用いた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、精製ＥＭ１６４抗体の特異的結合を立証した（図１）。丸底９６ウェルプレート中、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞を用い、そしてインスリン受容体を過剰発現する細胞を用いて（２ｘ１０５細胞／ｍｌ）、１００μｌ冷ＦＡＣＳ緩衝液（ダルベッコのＭＥＭ培地中の１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中でＥＭ１６４抗体（５０〜１００ｎＭ）を１時間インキュベーションした。遠心分離によって細胞をペレットにし、そしてそっと叩くことによって冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＦＩＴＣコンジュゲート（１００μｌ；ＦＡＣＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌ）と氷上で１時間インキュベーションした。細胞をペレットにし、洗浄し、そしてＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド溶液１２０μｌに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ読取装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、プレートを分析した。
【００９４】
［１１６］ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞をＥＭ１６４抗体とインキュベーションすると、強い蛍光シフトが得られたが、これはインスリン受容体を過剰発現する細胞をＥＭ１６４抗体とインキュベーションした際の有意でないシフトとは対照的であり（図１）、これによって、ＥＭ１６４抗体が、ＩＧＦ−Ｉ受容体への結合において、選択的であり、そしてインスリン受容体に結合しないことが立証された。対照抗体、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体１Ｈ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗インスリン受容体アルファ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、それぞれ、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞およびインスリン受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して、蛍光シフトを生じた（図１）。ＥＭ１６４抗体、およびＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を用いたＦＡＣＳアッセイによってもまた、強い蛍光シフトが観察され（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１）、これによってＥＭ１６４抗体が、ヒト腫瘍細胞表面上のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に結合することが示された。
【００９５】
［１１７］直接コーティングされたＩＧＦ−Ｉ受容体（上述のように、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用いてアフィニティー精製したもの）または間接的に捕捉されるビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体いずれかを用いて、いくつかの濃度で抗体の結合をＥＬＩＳＡ滴定することによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体とＥＭ１６４抗体の結合に関する解離定数（Ｋｄ）を決定した。ＰＥＯ−マレイミド−ビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、界面活性剤で可溶化した、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞由来の溶解物をビオチン化することによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を調製し、ＮＨＳ−アガロースビーズ上に固定した抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体を用いて、これをアフィニティー精製し、そしてＮＰ−４０界面活性剤を含有する緩衝液中の２〜４Ｍ尿素で溶出し、そしてＰＢＳ中で透析した。
【００９６】
［１１８］Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレートを炭酸緩衝液（１５０ｍＭ炭酸ナトリウム、３５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）中の１μｇ／ｍｌストレプトアビジン１００μｌで、４℃で一晩コーティングすることによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体とＥＭ１６４抗体の結合に関するＫｄを決定した。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルを、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）でブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体（１０〜１００ｎｇ）と周囲温度で４時間インキュベーションした。次いで、間接的に捕捉されたビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中、いくつかの濃度（５．１ｘ１０−１３Ｍ〜２００ｎＭ）のＥＭ１６４抗体と周囲温度で２時間インキュベーションし、そして次いで４℃で一晩インキュベーションした。次に、ウェルをＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧＨ＋Ｌ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した。一部位結合に関して、非線形回帰によって、Ｋｄ値を概算した。
【００９７】
［１１９］Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９９９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載されるように、抗体のパパイン消化によって調製された、ＥＭ１６４抗体のＦａｂ断片を用いて、同様の結合滴定を行った。
【００９８】
［１２０］ビオチン化ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体へのＥＭ１６４抗体の結合に関する結合滴定曲線は、０．１ｎＭのＫｄ値を生じた（図２）。ＥＭ１６４抗体のＦａｂ断片もまた、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に非常に緊密に結合し、Ｋｄ値は０．３ｎＭであり、これによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体へのＥＭ１６４抗体の単量体結合もまた、非常に強いことが示された。
【００９９】
［１２１］ＥＭ１６４抗体によるＩＧＦ−Ｉ受容体の結合に関する解離定数がこのように極端に低い値であるのは、固定ＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した抗体を１〜２日間、長く洗浄した後に、強い結合シグナルが観察されることによって確証されるように、部分的に、ｋｏｆｆ速度が非常に遅いためであった。
【０１００】
［１２２］プロテインＧ−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）上に固定されたＥＭ１６４抗体と、界面活性剤で可溶化されたヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の溶解物をインキュベーションすることによって立証されるように、ＥＭ１６４抗体をＩＧＦ−Ｉ受容体の免疫沈降に用いることも可能である。ウサギ・ポリクローナル抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖（Ｃ末端）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用い、次いで洗浄し、そして増進化学発光（ＥＣＬ）検出を行って、ＥＭ１６４抗体免疫沈降物のウェスタンブロットを検出した。ＭＣＦ−７細胞からのＥＭ１６４免疫沈降物のウェスタンブロットは、約９５ｋＤａのＩＧＦ−Ｉ受容体のベータ鎖および約２２０ｋＤａのプロ−ＩＧＦ−Ｉ受容体に対応するバンドを示した。他の細胞種に関して、同様の免疫沈降を行って、ＥＭ１６４抗体結合の種特異性をチェックしたところ、ｃｏｓ−７細胞（アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ））由来のＩＧＦ−Ｉ受容体にはやはり結合したが、３Ｔ３細胞（マウス）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター）またはヤギ線維芽細胞（ヤギ）のＩＧＦ−Ｉ受容体には結合しなかった。ＥＭ１６４抗体は、ＭＣＦ−７細胞由来の溶解物のウェスタンブロットにおいて、ＳＤＳ変性ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を検出せず、これによってＥＭ１６４抗体が、天然の非変性ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のコンホメーション・エピトープに結合することが示された。
【０１０１】
［１２３］Ｌ１ドメインおよびＬ２ドメインに隣接するシステインリッチ・ドメイン（残基１〜４６８）を含み、これに１６量体Ｃ末端ピース（残基７０４〜７１９）が融合し、そしてＣ末端エピトープタグで終わる、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）アルファ鎖構築物を用いて、ＥＭ１６４抗体の結合ドメインをさらに性質決定した。残基４６９〜７０３を欠く、このより小さいＩＧＦ−Ｉ受容体は、天然全長ＩＧＦ−Ｉ受容体に比較して、より緊密ではないが、ＩＧＦ−Ｉに結合すると報告されている（Ｍｏｌｉｎａ， Ｌ．ら， ２０００， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４６７， ２２６−２３０；Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｃ．ら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ３７２５１−３７３５６）。したがって、残基１〜４６８を含み、これに残基７０４〜７１９のＣ末端ピースが融合して、そしてＣ末端ｍｙｃエピトープタグが隣接する、一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖構築物を調製した。この構築物を発現する安定細胞株、そしてまたヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞中で該構築物を一過性に発現する細胞株を構築した。この一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖構築物に対して、ＥＭ１６４抗体が強く結合することが観察された。試験した２つの抗体のうち、ＩＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）もまた、この一部切除アルファ鎖に結合したが、１Ｈ７抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は結合せず、これによって、ＥＭ１６４抗体のエピトープが、１Ｈ７抗体のエピトープとは明らかに別個であることが示された。
【０１０２】
Ｃ． ＭＣＦ−７細胞に対するＩＧＦ−１結合の、ＥＭ１６４抗体による阻害
［１２４］ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に対するＩＧＦ−Ｉの結合は、ＥＭ１６４抗体によって阻害された（図３）。ＭＣＦ−７細胞を、血清不含培地中、５μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体を伴いまたは伴わずに２時間インキュベーションし、その後、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＧＦ−Ｉと３７℃で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞を血清不含培地で２回洗浄して、未結合ビオチン−ＩＧＦ−Ｉを取り除き、そして次いで、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に溶解した。マウス・モノクローナル抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体でＩｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢ ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、そしてこれを、溶解物からＩＧＦ−Ｉ受容体および結合したビオチン−ＩＧＦ−Ｉを捕捉するのに用いた。ＩＧＦ−Ｉ受容体のベータ鎖の細胞質Ｃ末端ドメインに、コーティングされた抗体が結合しても、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインへのビオチン−ＩＧＦ−Ｉの結合には干渉しなかった。ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートとインキュベーションし、再び洗浄し、そして次いでＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて検出した。５μｇ／ｍｌ ＥＭ１６４抗体による、ＭＣＦ−７細胞へのＩＧＦ−Ｉ結合の阻害は、本質的に定量的であり、そしてビオチン−ＩＧＦ−Ｉを欠く対照を用いて得たＥＬＩＳＡバックグラウンドのものとほぼ同等であった。
【０１０３】
［１２５］ＥＭ１６４抗体による、ＭＣＦ−７細胞へのＩＧＦ−Ｉ結合の阻害に関する上述のアッセイに加えて、以下のアッセイによって、ＥＭ１６４抗体が、結合したＩＧＦ−ＩをＭＣＦ−７細胞から置換する（ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）のに非常に有効であることが立証され、これは生理学的条件下で、アンタゴニスト性抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が、結合した内因性生理学的リガンド（ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩなど）を置換するのが望ましいことに適っている。このＩＧＦ−Ｉ置換アッセイにおいて、１２ウェルプレート中で増殖させたＭＣＦ−７細胞を血清枯渇させ、そして次いで血清不含培地中、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ（２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）と３７℃（または４℃）で１〜２時間インキュベーションした。次いで、結合したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを伴う細胞を、ＥＭ１６４抗体または対照抗体（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で、３７℃（または４℃）で３０分間〜４時間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１％ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液中、４℃で溶解した。上述のようにＥＬＩＳＡを行って、溶解物からＩＧＦ−Ｉ受容体を捕捉し、そして次いで、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用いて、受容体に結合したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを検出した。このＥＬＩＳＡによって、ＥＭ１６４抗体が、先に結合していたビオチン化ＩＧＦ−Ｉを細胞から、３７℃ではほぼ完全に（３０分以内に９０％、そして４時間以内に〜１００％）、そして４℃２時間では約５０％、置換可能であることが立証された。別の実験において、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞をビオチン−ＩＧＦ−Ｉとインキュベーションし、次いで洗浄し、そしてＥＭ１６４抗体と４℃で２時間インキュベーションすると、結合したビオチン−ＩＧＦ−Ｉが８０％減少した。したがって、ＥＭ１６４抗体は、先に結合していたＩＧＦ−Ｉを癌細胞から置換するのに非常に有効であり、このことは、結合した内因性生理学的リガンドを置換することによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に拮抗するために、療法的に重要であろう。
【０１０４】
［１２６］ＥＭ１６４抗体とＭＣＦ−７細胞を４℃で２時間（または３７℃で３０分間）インキュベーションすると、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｓｃ−７１３）を用いたウェスタンブロット分析に基づいて、ＩＧＦ−Ｉ受容体の有意な下方制御が生じなかったが、ＥＭ１６４抗体とより長い時間、３７℃で２時間インキュベーションすると、ＩＧＦ−Ｉ受容体の２５％の下方制御が生じた。したがって、この短時間の実験において、４℃および３７℃両方で、ＥＭ１６４抗体によって、ＩＧＦ−Ｉ結合が阻害され、そして結合したＩＧＦ−Ｉが置換されたのは、ＥＭ１６４抗体の結合による受容体の下方制御では説明不能である。ＥＭ１６４抗体によって、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への結合が強力に阻害され、そして先に結合していたＩＧＦ−Ｉが置換される機構は、結合部位の共有を通じてか、または立体的閉鎖（ｓｔｅｒｉｃ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を通じてか、またはアロステリック効果を通じてかのいずれかで、結合に関して競合することである可能性がある。
【０１０５】
Ｄ． ＥＭ１６４抗体による、ＩＧＦ−Ｉ受容体が仲介する細胞シグナル伝達の阻害
［１２７］乳癌ＭＣＦ−７細胞および骨肉腫ＳａＯＳ−２細胞をＥＭ１６４抗体で処理すると、ＩＧＦ−Ｉ受容体自己リン酸化の阻害によって、そしてインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）、ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２などの下流エフェクターのリン酸化の阻害によって示されるように、細胞内ＩＧＦ−Ｉ受容体シグナル伝達がほぼ完全に阻害された（図４〜６）。
【０１０６】
［１２８］図４において、ＭＣＦ−７細胞を、標準的な培地中、１２ウェルプレート中で３日間増殖させ、そして次いで、血清不含培地中、２０μｇ／ｍｌ ＥＭ１６４抗体（または抗Ｂ４対照抗体）で３時間処理し、次いで５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで、３７℃で２０分間刺激した。次いで、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有する氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭロイペプチン、５μＭペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、および５μｇ／ｍｌアプロチニン）中で細胞を溶解した。抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖Ｃ末端モノクローナル抗体ＴＣ１２３でＥＬＩＳＡプレートをあらかじめコーティングし、そして溶解物試料と周囲温度で５時間インキュベーションして、ＩＧＦ−Ｉ受容体を捕捉した。次いで、捕捉したＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そしてビオチン化抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０；０．２５μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、そしてストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（０．８μｇ／ｍｌ）と３０分間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質で検出した。対照抗Ｂ４抗体を用いると、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化の阻害は示されなかった。対照的に、ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化が完全に阻害された（図４）。
【０１０７】
［１２９］インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）のリン酸化の阻害を立証するため、固定抗ＩＲＳ−１抗体を用いて溶解物からＩＲＳ−１を捕捉するＥＬＩＳＡを用い、次いで、リン酸化ＩＲＳ−１に結合する、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）の会合したｐ８５サブユニットを測定した（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｊ．Ｇ．ら， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ９９９４−１０００３）。図５において、ＭＣＦ−７細胞を、血清不含培地中の５μｇ／ｍｌ抗体（ＥＭ１６４またはＩＲ３）で２時間処理し、次いで５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで、３７℃で１０分間刺激した。コーティングしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベーションすることによって、抗ＩＲＳ−１抗体（ウサギ・ポリクローナル；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を間接的に捕捉し、これを次いで、４℃で一晩インキュベーションすることによって、細胞溶解物試料からＩＲＳ−１を捕捉するのに用いた。次いで、ウェルをマウス・モノクローナル抗ｐ８５−ＰＩ−３キナーゼ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４時間インキュベーションし、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲートで３０分間処理した。次いでウェルを洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて検出した（図５）。図５に示すように、ＥＭ１６４抗体は、ＩＲ３抗体よりも、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＲＳ−１リン酸化を阻害するのにより有効であり、そしてＩＧＦ−Ｉの非存在下で、ＥＭ１６４抗体を細胞とインキュベーションした際に、ＥＭ１６４抗体は、ＩＲＳ−１リン酸化に対していかなるアゴニスト活性も示さなかった。
【０１０８】
［１３０］ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２などの他の下流エフェクターの活性化もまた、溶解物のウェスタンブロットおよびリン酸化特異的抗体（ウサギ・ポリクローナル抗ホスホＳｅｒ４７３ Ａｋｔポリクローナル抗体および抗ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて示されるように、ＳａＯＳ−２細胞（図６）において、およびＭＣＦ−７細胞において、用量依存方式で、ＥＭ１６４抗体に阻害された。汎ＥＲＫ抗体によって、すべてのレーンに等量のタンパク質が装填されたことが立証された（図６）。ＥＭ１６４抗体でＳａＯＳ−２細胞を処理すると、ＥＧＦが刺激するＥｒｋ１／２のリン酸化は阻害されず、したがって、ＥＭ１６４抗体によるＩＧＦ受容体シグナル伝達経路の阻害が特異的であることが立証された。
【０１０９】
Ｅ． ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよび血清が刺激するヒト腫瘍細胞の増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害
［１３１］ＩＧＦ−Ｉに対する増殖反応および生存反応に関して、血清不含条件下で、いくつかのヒト腫瘍細胞株を試験した。これらの細胞株を、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、または血清の存在下、ＥＭ１６４抗体で処理し、そして２〜４日後、ＭＴＴアッセイを用いて、増殖反応および生存反応を測定した。血清を含む標準的な培地中、９６ウェルプレート中で、およそ１５００細胞をプレーティングし、翌日、培地を血清不含培地と交換した（トランスフェリンおよびＢＳＡを補った血清不含ＲＰＭＩ培地、またはＤｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１に特定されるようなフェノールレッド不含培地）。血清不含培地中で１日増殖させた後、約７５μｌの１０μｇ／ｍｌ抗体と細胞を３０分間〜３時間インキュベーションし、その後、２５μｌのＩＧＦ−Ｉ（またはＩＧＦ−ＩＩまたは血清）溶液を添加して、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ、または２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−ＩＩ、または０．０４〜１０％血清の最終濃度にした。いくつかの実験では、ＥＭ１６４抗体を添加する前に、細胞をまず、ＩＧＦ−Ｉで１５分間刺激するか、またはＩＧＦ−ＩおよびＥＭ１６４抗体の両方を一緒に添加した。次いで、細胞をさらに２〜３日間増殖させた。次いで、ＭＴＴ（３−（４，５）−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；２５μｌのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ溶液）を添加し、そして細胞を２〜３時間、インキュベーターに戻した。次いで培地を取り除き、そして１００μｌ ＤＭＳＯと交換し、混合し、そしてプレートの吸光度を５４５ｎｍで測定した。いくつかのヒト腫瘍細胞株は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩまたは血清を添加すると、増殖反応および生存反応を示し、これはＥＭ１６４抗体によって有意に阻害され、この阻害には、抗体をＩＧＦ−Ｉの前に添加するか、またはＩＧＦ−Ｉを抗体の前に添加するか、またはＩＧＦ−Ｉおよび抗体を一緒に添加するかどうかは関わりなかった（表１）。
【０１１０】
表１． ＩＧＦ−Ｉが刺激する腫瘍細胞の増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
ａ５〜１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体を含有する血清不含培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉに反応した細胞の３〜４日間の増殖／生存のＭＴＴアッセイ。
ｂ対照（血清を含むが抗体を含まないもの）との比較に基づいた、ＭＴＴアッセイまたはコロニー形成アッセイによる、５〜１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体の存在下の１．２５〜１０％血清中の細胞増殖の阻害；細胞による自己分泌／パラ分泌ＩＧＦ刺激を計上するため、対照（血清を含まないが抗体を含むもの、および血清を含むが抗体を含まないもの）に基づいて、ＭＣＦ−７細胞、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に関して、阻害の度合いを定量的に測定した。ＮＤは、データがないか、または染色が困難であるため、データが劣っていることを示す。
［１３２］ＥＭ１６４抗体は、ＩＧＦ−Ｉまたは血清が刺激する、乳癌ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を強く阻害した（図７および図８）。別の実験において、ＥＭ１６４抗体は、ＩＧＦ−ＩＩが刺激する、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を強く阻害した。ＩＲ３抗体などの商業的に入手可能な抗体を用いた先の報告では、血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を、こうした抗体が弱くしか阻害しないことが示されており、これは、ＩＲ３および１Ｈ７抗体に関して、図７で確認したとおりである（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．ら， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３）。対照的に、ＥＭ１６４抗体は、血清またはＩＧＦが刺激するＭＣＦ−７細胞の強力な阻害剤であった。図８に示すように、ＥＭ１６４抗体は、広い範囲の血清濃度（０．０４〜１０％血清）に渡って、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を阻害するのに同等に有効である。
【０１１３】
［１３３］細胞を計数することによって、ＥＭ１６４抗体によるＭＣＦ−７細胞の増殖阻害を測定した。したがって、１２ウェルプレートにおいて、１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体の存在下または非存在下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に、約７５００の細胞をプレーティングした。増殖５日後、未処理対照試料の細胞数は２０．５ｘ１０４細胞であり、対照的に、ＥＭ１６４抗体で処理した試料では、わずか１．７ｘ１０４細胞であった。ＥＭ１６４抗体で処理すると、５日間で、ＭＣＦ−７細胞の増殖は、約１２倍まで阻害された。ＥＭ１６４抗体によるこの阻害は、ＭＣＦ−７細胞の６日間のアッセイにおいて、ＩＲ３抗体を用いて報告された２．５倍の阻害より有意に高かった（Ｒｏｈｌｉｋ， Ｑ．Ｔ．ら， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４９， ２７６−２８１）。
【０１１４】
［１３４］ＩＧＦ−Ｉおよび血清が刺激する、非小細胞肺癌株ＮＣＩ−Ｈ８３８の増殖および生存もまた、対照抗Ｂ４抗体に比較して、ＥＭ１６４抗体によって、強く阻害された（図９）。血清不含培地において、ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方に関して、未処理試料より小さいシグナルが生じ、これはおそらく、ＥＭ１６４抗体が、これらの細胞の自己分泌およびパラ分泌ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ刺激も阻害したためであろう（図７および図９）。ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＨＴ２９結腸癌細胞のコロニーサイズもまた、非常に減少した。
【０１１５】
［１３５］ＥＭ１６４抗体は、したがって、ＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ−Ｈ８３８細胞などの腫瘍細胞の、血清が刺激する増殖を８０％を超えて阻害するのに有効である点で、すべての既知の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の中でもユニークである。
【０１１６】
［１３６］ＥＭ１６４抗体は、細胞周期のＧ０／Ｇ１期で細胞増殖停止を引き起こし、そしてＩＧＦ−Ｉの分裂促進効果を無効にした。細胞周期解析のため、ＭＣＦ−７細胞を、ＥＭ１６４（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、ＩＧＦ−Ｉ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１日間処理し、そして次いでヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって分析した。図２５に示すように、ＥＭ１６４の非存在下、ＩＧＦ−Ｉ刺激に反応した細胞のサイクリング（細胞の４１％がＳ期にあり、そして５０％がＧ０／Ｇ１期にあった）は、ＥＭ１６４処理細胞で抑制された（細胞の９％のみがＳ期にあり、そして７７％がＧ０／Ｇ１期にあった）。
【０１１７】
［１３７］細胞増殖の阻害に加えて、ＥＭ１６４抗体処理によって、細胞のアポトーシスが生じた。アポトーシス測定のため、ＥＭ１６４の存在下または非存在下、ＩＧＦ−Ｉまたは血清と１日間インキュベーションしたＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞において、カスパーゼによるサイトケラチンＣＫ１８タンパク質の切断を測定した（図２６）。ＥＭ１６４の非存在下、ＩＧＦ−Ｉまたは血清を添加すると、ＩＧＦ−Ｉがない対照に比較して、カスパーゼ切断されたＣＫ１８のシグナルはより低く、ＩＧＦ−Ｉおよび血清が、カスパーゼの活性化を妨げることが示された。ＥＭ１６４の非存在下よりＥＭ１６４の存在下で得られる切断ＣＫ１８のレベルがより大きいことから示されるように、ＥＭ１６４で処理すると、ＩＧＦ−Ｉおよび血清の抗アポトーシス効果が抑制された。
【０１１８】
Ｆ．他の細胞傷害性剤および細胞分裂停止剤と併用した、ＥＭ１６４抗体による、ヒト腫瘍細胞増殖および生存の相乗的阻害
［１３８］タキソールとＥＭ１６４抗体を併用投与すると、タキソール単独よりも、非小細胞肺癌Ｃａｌｕ６細胞の増殖および生存に、有意により阻害性になった。同様に、カンプトテシンとＥＭ１６４抗体を併用すると、結腸癌ＨＴ２９細胞の増殖および生存に対して、カンプトテシン単独よりも、有意により阻害性になった。ＥＭ１６４抗体単独では、有機化学毒性薬剤と同程度に細胞に毒性であるとは期待されないことから、ＥＭ１６４抗体の主に細胞分裂停止効果および化学毒性薬剤の細胞傷害性効果の間の相乗作用は、臨床設定における併用癌療法において、非常に有効でありうる。
【０１１９】
［１３９］ＥＭ１６４抗体と抗ＥＧＦ受容体抗体（ＫＳ７７）の併用効果は、ＨＴ−３細胞、ＲＤ細胞、ＭＣＦ−７細胞、およびＡ４３１細胞などのいくつかの腫瘍細胞株の増殖および生存に対して、ＥＭ１６４抗体またはＫＳ７７抗体単独のいずれより、有意により阻害性であった。したがって、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびＥＧＦ受容体などの２つの増殖因子受容体の中和抗体を併用した相乗効果もまた、臨床的癌治療に有用でありうる。
【０１２０】
［１４０］表１に示すような多様なヒト癌細胞株の増殖および生存を阻害する際の単一剤としてのＥＭ１６４抗体の効力に基づいて、ＥＭ１６４抗体と他の抗癌療法剤を併用して、さらなる効力研究を行った。多様な癌細胞株に対するこれらの研究において、ＥＭ１６４抗体および他の抗癌療法剤の併用治療によって、ＥＭ１６４または他の療法剤単独のいずれよりもさらに高い、抗癌効力が生じた。したがって、ＥＭ１６４と他の療法剤のこれらの併用は、癌細胞の増殖および生存を阻害する際に非常に有効である。抗癌効力を改善するため、ＥＭ１６４と併用可能である療法剤には、腫瘍学治療に用いられる多様な剤が含まれ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、エポチロン、並びに細胞傷害性薬剤および細胞表面受容体に対する抗体のコンジュゲートがある。
【０１２１】
［１４１］これらの併用療法のため、アルキル化剤、白金剤、ホルモン療法、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗微小管剤、分化剤、抗血管新生療法または抗血管形成療法、放射線療法、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のアゴニストおよびアンタゴニスト、細胞表面受容体に対する阻害性抗体または小分子阻害剤、並びに他の化学療法剤（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）などの、多様な作用機構の抗癌剤１以上と、ＥＭ１６４を併用する。１つの例において、ＬＨＲＨアンタゴニストであるアンチド（０．１〜１０マイクロモル濃度（micromolar））およびＥＭ１６４抗体（０．１〜１０ナノモル濃度（nanomolar））を併用すると、ＥＭ１６４またはアンチド単独のいずれよりも、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖が有意に阻害された。白金剤との併用療法の例において、ＥＭ１６４抗体（１０マイクログラム／ｍｌ）およびシスプラチン（０．１〜６０マイクログラム／ｍｌ）の併用治療によって、ＥＭ１６４抗体またはシスプラチン単独のいずれかによる阻害に比較して、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖および生存が、より多く阻害された。
【０１２２】
［１４２］ＥＭ１６４抗体と他の療法剤とのこれらの併用は、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、いくつかの種類の癌に対して有効である。ＥＭ１６４抗体および療法剤を、同時にまたは連続して、癌療法のために投与することも可能である。
【０１２３】
［１４３］ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する腫瘍に、細胞傷害性薬剤をターゲティング搬送する際、ＥＭ１６４抗体と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートもまた有用である。ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する腫瘍の治療および画像化に、ＥＭ１６４抗体と放射標識または他の標識のコンジュゲートを用いることも可能である。
【０１２４】
Ｇ．免疫不全マウスにおけるヒト癌異種移植片中、単一剤としてのまたは抗癌剤と併用した、ＥＭ１６４処置の効果
［１４４］１ｘ１０７ Ｃａｌｕ−６細胞を皮下注射することによって、免疫不全マウスにおいて、ヒト非小細胞肺癌Ｃａｌｕ−６異種移植片を確立した。図１０に示すように、処置群あたり５匹のマウスを用いて、確立された１００ｍｍ３ Ｃａｌｕ−６異種移植片を含有するこれらのマウスを、ＥＭ１６４抗体単独（０．８ｍｇ／マウスを１週２回で６回、静脈内注射）で、またはタキソール単独（２日ごとに、タキソールを５回、腹腔内注射；１５ｍｇ／ｋｇ）で、またはタキソールおよびＥＭ１６４抗体処置併用で、またはＰＢＳ単独（２００μｌ／マウスを１週２回で６回、静脈内注射）で処置した。ＰＢＳ対照に比較して、ＥＭ１６４抗体処置によって、腫瘍増殖は、有意に遅延された。マウスの体重測定に基づくと、ＥＭ１６４抗体の毒性はまったく観察されなかった。タキソール単独処置は、第１４日までは有効であったが、その後、腫瘍は再び増殖し始めた。しかし、タキソールおよびＥＭ１６４抗体の併用処置群では、タキソール単独処置群に比較して、腫瘍増殖は有意に遅延された。
【０１２５】
［１４５］ＰＢＳ中の１０７ ＢｘＰＣ−３細胞を皮下注射することによって、５週齢メスＳＣＩＤ／ＩＣＲマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）において、ヒト膵臓癌異種移植片を確立した（第０日）。次いで、５つの処置群各々で、５匹のマウスを用いて、確立された８０ｍｍ３の腫瘍を所持するマウスを、ＥＭ１６４単独（第１２日、第１６日、第１９日、第２３日、第２６日、第２９日、第３６日、第４３日、第５０日、第５４日、第５８日、第６１日および第６４日に、側面尾静脈に０．８ｍｇ／マウスを１３回、静脈内注射）で、ゲムシタビン単独（第１２日および第１９日に、１５０ｍｇ／ｋｇ／マウスを２回、腹腔内注射）で、上記スケジュールにしたがってゲムシタビンおよびＥＭ１６４併用で、ＰＢＳ単独で、そして対照抗体単独（ＥＭ１６４と同じスケジュールにしたがって）で処置した。図２７に示すように、ＥＭ１６４単独処置、またはゲムシタビンとの併用処置によって、ＥＭ１６４処置群では、５匹の動物のうち４匹で、そして併用処置群では５匹の動物すべてで、腫瘍異種移植片の完全な退行がまず生じた。測定可能な腫瘍再増殖は、ＥＭ１６４群では第４３日、そして併用処置群では第６８日になってようやく、１より多い動物で見られ、第７４日に対照処置群と比較すると、有意に小さい平均腫瘍体積を生じた（それぞれＰ＝０．０２９および０．００２；両側Ｔ検定；図２７）。別の研究において、ＥＭ１６４抗体処置（単独または抗ＥＧＦ受容体抗体との併用；腹腔内注射）は、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片の増殖を阻害した。
【０１２６】
［１４６］ネズミＥＭ１６４およびヒト化ＥＭ１６４抗体は、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片増殖の同等の阻害を示しており、したがって、ヒト化ＥＭ１６４の効力が、ｉｎ ｖｉｖｏで、ネズミＥＭ１６４の効力と同等であることが立証された。ＥＭ１６４抗体の異なる投与様式を比較すると、ＥＭ１６４抗体の腹腔内投与および静脈内投与はどちらも、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片増殖の同等の阻害を示した。別の異種移植片研究において、マウスにおいて確立されたＡ−６７３ヒト横紋筋肉腫／ユーイング肉腫異種移植片をＥＭ１６４抗体で処置すると、増殖が有意に遅延された。
【０１２７】
Ｈ． ＥＭ１６４抗体の軽鎖および重鎖のクローニングおよび配列決定
［１４７］ＥＭ１６４ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを精製した。４〜５μｇの総ＲＮＡ、およびオリゴｄＴプライマーまたはランダム六量体プライマーのいずれかを用いて、逆転写酵素反応を行った。
【０１２８】
［１４８］Ｃｏら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８， １１４９−１１５４（１９９２））に記載されるＲＡＣＥ法を用いて、そしてＷａｎｇら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３３， １６７−１７７（２０００））に記載されるような縮重プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＲＡＣＥ ＰＣＲ法は、第一鎖ｃＤＮＡの３’端にポリＧテールを付加する中間工程を必要とする。ＲＴ反応物をＱｉａｎｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムで精製し、そして５０μｌの１ｘＮＥＢ緩衝液４中に溶出した。溶出液に対して、１ｘＮＥＢ緩衝液４中、０．２５ｍＭ ＣｏＣｌ２、１ｍＭ ｄＧＴＰ、および５単位の末端転移酵素（ＮＥＢ）で、ｄＧテール付加反応を行った。混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、そして次いで、反応物の１／５（１０μｌ）を、ＰＣＲ反応に直接添加して、テンプレートＤＮＡとして利用した。
【０１２９】
［１４９］ＲＡＣＥおよび縮重ＰＣＲ反応は、プライマーおよびテンプレートが異なることを除いて、同一であった。ＲＡＣＥ ＰＣＲテンプレートには末端転移酵素反応を直接用い、一方、縮重ＰＣＲ反応には、ＲＴ反応混合物を直接用いた。
【０１３０】
［１５０］ＲＡＣＥ反応および縮重ＰＣＲ反応両方において、同じ３’軽鎖プライマー：
【０１３１】
【化７】
【０１３２】
および３’重鎖プライマー：
【０１３３】
【化８】
【０１３４】
を用いた。
［１５１］ＲＡＣＥ ＰＣＲにおいて、１つのポリＣ ５’プライマー：
【０１３５】
【化９】
【０１３６】
を重鎖および軽鎖両方に用い、一方、縮重５’端ＰＣＲプライマーは、軽鎖に関しては：
【０１３７】
【化１０】
【０１３８】
であり、そして重鎖に関しては：
【０１３９】
【化１１】
【０１４０】
の等量混合物であった。
【０１４１】
［１５２］上記プライマー配列において、混合塩基は以下のように定義される：Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ。
【０１４２】
［１５３］以下のプログラムを用いて、ＰＣＲ反応を行った：１）９４℃３分間、２）９４℃１５秒間、３）４５℃１分間、４）７２℃２分間、５）工程２に戻って２９周期、６）７２℃１０分間の最終伸長工程で終了。
【０１４３】
［１５４］ＰＣＲプライマーによって生成した制限酵素を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＰＣＲ産物をクローニングした。
［１５５］慣用的手段によって、いくつかの個々の軽鎖クローンおよび重鎖クローンを配列決定して、ポリメラーゼが生成しうる配列エラーを同定し、そして回避した（図１２および図１３）。Ｃｈｏｔｈｉａ規範的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）分類定義を用いて、３つの軽鎖および重鎖ＣＤＲを同定した（図１２〜図１４）。
【０１４４】
［１５６］ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔデータベースを検索すると、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体軽鎖可変領域が、おそらく、マウスＩｇＶｋ Ｃｒ１生殖系列遺伝子に由来し、一方、重鎖可変領域が、おそらく、ＩｇＶｈ Ｊ５５８．ｃ生殖系列遺伝子に由来することが示された（図１５）。
【０１４５】
［１５７］ネズミＥＭ１６４抗体のタンパク質配列決定を行って、図１２および図１３に示す配列を確認した。精製したＥＭ１６４抗体の重鎖および軽鎖のタンパク質バンドを、ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件）からＰＶＤＦ膜にトランスファーし、ＰＶＤＦ膜から切り出し、そしてタンパク質配列決定によって分析した。軽鎖のＮ末端配列は、エドマン配列決定によって：ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳ（配列番号２０）であることが決定され、これは、ＥＭ１６４ハイブリドーマから得たクローニング軽鎖遺伝子のＮ末端配列にマッチした。
【０１４６】
［１５８］重鎖のＮ末端は、遮断されていてエドマン・タンパク質配列決定が不能であることが見出された。ポストソース分解（ＰＳＤ）を介して、マス１１２９．５（Ｍ＋Ｈ＋、モノアイソトピック）の重鎖のトリプシン消化ペプチド断片を断片化し、そしてその配列は、ＧＲＰＤＹＹＧＳＳＫ（配列番号２１）であることが決定された。ポストソース分解（ＰＳＤ）を介して、マス２６６４．２（Ｍ＋Ｈ＋、モノアイソトピック）の重鎖の別のトリプシン消化ペプチド断片もまた断片化し、そしてその配列は：ＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＦＡＲ（配列番号２２）であることが同定された。これらの配列はどちらも、ＥＭ１６４ハイブリドーマから得られるクローニング重鎖遺伝子のＣＤＲ３およびフレームワーク３（ＦＲ３）のものに完全にマッチする。
【０１４７】
Ｉ． ＥＭ１６４抗体の組換え発現
［１５９］軽鎖および重鎖の対配列を単一の哺乳動物発現ベクターにクローニングした（図１６）。ヒト可変配列のＰＣＲプライマーは制限部位を生成し、この制限部位によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングベクター中にありつつ、ヒト・シグナル配列が付着することが可能になり、そして軽鎖または重鎖に関して、それぞれ、ＥｃｏＲＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＡｐａＩ部位を用いて、哺乳動物発現プラスミドに可変配列をクローニングした（図１６）。軽鎖可変配列を、ヒトＩｇＫ定常領域上にインフレームでクローニングし、そして重鎖可変配列を、ヒトＩｇガンマ１定常領域配列中にクローニングした。最終発現プラスミドにおいて、ヒトＣＭＶプロモーターは、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡ配列両方の発現を駆動した。当該技術分野に周知の方法にしたがって、組換えマウスＥＭ１６４抗体の発現および精製を進めた。
【０１４８】
（実施例２）
ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョン
［１６０］療法剤または診断剤として適切なヒト化バージョンを提供するため、ＥＭ１６４抗体の表面再構成を、一般的に、米国特許５，６３９，６４１に開示される原理および方法にしたがって、そして以下のように、進めた。
【０１４９】
Ａ．表面予測
［１６１］解明された構造を持つ抗体セットの可変領域残基の溶媒アクセス可能性を用いて、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体（ＥＭ１６４）可変領域の表面残基を予測した。１２７のユニークな抗体構造ファイル・セットのアミノ酸溶媒アクセス可能性（表２）をＭＣソフトウェア・パッケージで計算した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら， １９９４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３５， ９５９−９７３）。１２７の構造のこのセットから、配列並列によって、１０の最も類似の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を決定した。各可変領域残基に関して、平均溶媒アクセス可能性を計算し、そして３０％を超える平均アクセス可能性の位を表面残基と見なした。２つの同一な隣接残基を持つ構造に関してのみ、個々の残基のアクセス可能性を計算することによって、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を持つ位をさらに調べた。
【０１５０】
表２−抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体（ＥＭ１６４）の表面を予測するのに用いた、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベース由来の１２７の抗体構造
【０１５１】
【表２】
【０１５２】
Ｂ．分子モデリング：
［１６２］オックスフォード分子ソフトウェア・パッケージＡｂＭを用いて、ネズミＥＭ１６４の分子モデルを生成した。最も類似のアミノ酸配列を持つ抗体の構造ファイル、軽鎖の２ｊｅｌ、そして重鎖の１ｎｑｂを用いて、抗体フレームワークを構築した。非冗長解明構造を含有するＣ−α構造データベースを検索することによって、非規範的ＣＤＲを構築した。ＣＤＲから５Å以内に位置する残基を決定した。
【０１５３】
Ｃ．ヒトＡｂ選択
［１６３］ネズミＥＭ１６４の表面位を、Ｋａｂａｔデータベース中のヒト抗体配列の対応する位と比較した（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．およびＷｕ， Ｔ．Ｔ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９：２０５−２０６）。抗体データベース管理ソフトウェアＳＲ（Ｓｅａｒｌｅ １９９８）を用いて、天然重鎖および軽鎖ヒト抗体対から抗体表面残基を抽出し、そして並列させた。ＣＤＲから５Å以内に来る位を特に考慮して、最も同一の表面残基を持つヒト抗体表面を選択して、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体表面残基を置換した。
【０１５４】
Ｄ． ＰＣＲ突然変異誘発
［１６４］ネズミＥＭ１６４ ｃＤＮＡクローン（上記）に対してＰＣＲ突然変異誘発を行って、表面再構成ヒトＥＭ１６４（本明細書においてｈｕＥＭ１６４）を構築した。ｈｕＥＭ１６４のすべての試験されるバージョンに必要な８アミノ酸変化を作成するため、プライマーセットを設計し、そしてこれとは別に２つの５Å残基変化を作成するため、さらなるプライマーを設計した（表３）。以下のプログラムを用いて、ＰＣＲ反応を行った：１）９４℃１分間、２）９４℃１５秒間、３）５５℃１分間、４）７２℃１分間、５）工程２に戻って２９周期、６）７２℃４分間の最終伸長工程で終了。対応する制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、そして上述のように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクターにクローニングした。クローンを配列決定して、望ましいアミノ酸変化を確認した。
【０１５５】
表３−４つのヒト化ＥＭ１６４抗体を構築するのに用いたＰＣＲプライマー
【０１５６】
【表３】
【０１５７】
Ｅ．可変領域表面残基
［１６５］Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３５， ９５９−９７３， １９９４）およびＲｏｇｕｓｋａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ９， ８９５−９０４， １９９６）に記載される抗体表面再構成技術は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を予測することから始まる。表面残基は、総表面領域の少なくとも３０％が水分子にアクセス可能であるアミノ酸と定義される。
【０１５８】
［１６６］１２７の抗体構造ファイル・セット中、１０の最も相同な抗体を同定した（図１７および図１８）。これらの並列配列に関して、各Ｋａｂａｔ位の溶媒アクセス可能性を平均し、そして各残基の相対的アクセス可能性の分布を図１９に示した。軽鎖および重鎖の両方が、少なくとも３０％の平均相対アクセス可能性を持つ２６の残基を有する（図１９）：したがって、これらの残基は、ＥＭ１６４の予測される表面残基であった。いくつかの残基は、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を有し、そして残基の両側に隣接する２つの残基が同一である抗体のみを平均することによって、これらをさらに調べた（表４および表５）。このさらなる解析後も、上に同定する表面残基の元来のセットは変化しないままであった。
【０１５９】
表４−ＥＭ１６４抗体の軽鎖および重鎖の可変配列の表面残基および平均アクセス可能性
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
表５
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
検討中の残基の両側に隣接する２つの残基が同一である抗体サブセットを平均することによって、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を有する残基を、さらに解析した。これらのボーダーライン表面位およびその新しい平均アクセス可能性を提供する。ＮＡは、１０の最も類似の抗体において、同一の隣接残基がない残基を指す。
【０１６４】
Ｆ．どの残基がＣＤＲから５Å以内に収まるかを決定する分子モデリング
［１６７］ＡｂＭソフトウェア・パッケージで生成した上述の分子モデルを分析して、どのＥＭ１６４表面残基が、ＣＤＲから５Å以内にあるかを決定した。ネズミＥＭ１６４抗体の表面を再構成するため、ＣＤＲ外の表面残基はすべて、ヒト対応物に変化させなければならないが、ＣＤＲから５Å以内の残基はまた抗原特異性にも寄与しうるため、特に気をつけて扱われる。したがって、これらの後者の残基を同定し、そしてヒト化プロセス全体に渡って、注意深く検討しなければならない。表面再構成に用いたＣＤＲ定義は、重鎖ＣＤＲ２に関してＡｂＭ定義、そして残りの５つのＣＤＲに関してＫａｂａｔ定義を組み合わせている（図１４）。表６は、ＥＭ１６４モデルの軽鎖または重鎖の配列いずれかにおいて、ＣＤＲ残基いずれかから５Å以内にあった残基を示す。
【０１６５】
表６ ＣＤＲから５Å以内にあるＥＭ１６４抗体フレームワーク表面残基
ＣＤＲから５Å以内のＥＭ１６４表面残基
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
Ｇ．最も相同なヒト表面の同定
［１６８］抗体データベースに対して、特定される残基位のみの検索の手はずを整えるＳＲソフトウェアを用いて、Ｋａｂａｔ抗体配列データベース内で、ＥＭ１６４を表面再構成する候補ヒト抗体表面を同定した。天然対形成を保持するため、軽鎖および重鎖両方の表面残基を一緒に比較した。Ｋａｂａｔデータベースの最も相同なヒト表面を配列同一性の順位で並列させた。トップの５つの表面を表７に提供する。次いで、これらの表面を比較して、このうちどれがＣＤＲから５Å以内に最小の変化しか必要としないかを同定した。白血病Ｂ細胞抗体、ＣＬＬ１．６９は、最少数の表面残基変化（総数１０）しか必要とせず、そしてこれらの残基のうち２つのみがＣＤＲから５Å以内に存在した。
【０１６８】
［１６９］ＥＭ１６４の全長可変領域配列もまた、Ｋａｂａｔヒト抗体データベースに対して並列させ、そして再び、ＣＬＬ１．６９が最も類似のヒト可変領域配列と同定された。総合すると、これらの配列比較によって、ヒト白血病Ｂ細胞抗体ＣＬＬ１．６９は、ＥＭ１６４のヒト表面として好ましい選択と同定された。
【０１６９】
表７−Ｋａｂａｔデータベースから抽出されたトップの５つのヒト配列
【０１７０】
【表７】
【０１７１】
ＳＲ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ １９９３）によって並列を生成した。ＣＤＲから５Å以内にあるＥＭ１６４表面残基を下線で示す。
【０１７２】
Ｈ．ヒト化ＥＭ１６４遺伝子の構築
［１７０］上述のようなＰＣＲ突然変異誘発技術を用いて、ＥＭ１６４の１０の表面残基変化（表７）を作成した。ＣＬＬ１．６９の表面残基のうち８つは、ＣＤＲから５Å以内にはないため、ヒト化ＥＭ１６４のすべてのバージョンで、これらの残基をネズミからヒトに変化させた（表８および表９）。ＣＤＲから５Å以内の２つの軽鎖表面残基（Ｋａｂａｔの３位および４５位）をヒトに変化させるかまたはネズミのままにした。総合すると、これらのオプションによって、構築したＥＭ１６４の４つのヒト化バージョンが生成される（図２２および図２３）。
【０１７３】
［１７１］４つのヒト化バージョンのうち、バージョン１．０は、１０のヒト表面残基をすべて有する。ＣＤＲ近傍の変化に関して、最も保存的なバージョンは、バージョン１．１であり、このバージョンは、ＣＤＲから５Å以内にあるネズミ表面残基の両方を保持した。４つのヒト化ＥＭ１６４抗体遺伝子を、一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションに使用するため、抗体発現プラスミドにクローニングした（図１６）。
【０１７４】
表８−ヒト化ＥＭ１６４抗体のバージョン１．０〜１．３の残基変化
【０１７５】
【表８】
【０１７６】
Ｉ．全長ＩＧＦ−Ｉ受容体への、そして一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖への結合に関する、ネズミＥＭ１６４抗体とヒト化ＥＭ１６４抗体バージョンの親和性の比較
［１７２］上述のように、ビオチン化全長ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体またはｍｙｃ−エピトープタグ化一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖を用いた結合競合アッセイを通じて、ヒト化ＥＭ１６４抗体バージョン１．０〜１．３の親和性を、ネズミＥＭ１６４抗体のものと比較した。ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞において、適切な発現ベクターの一過性トランスフェクションによって、ヒト化ＥＭ１６４抗体試料を得て、そして精製したヒト化抗体標準を用いたＥＬＩＳＡによって抗体濃度を決定した。ＥＬＩＳＡ結合競合測定のため、ヒト化抗体試料および多様な濃度のネズミＥＭ１６４抗体の混合物を、間接的に捕捉されたビオチン化全長ＩＧＦ−Ｉ受容体またはｍｙｃ−エピトープタグ化一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖とインキュベーションした。平衡化後、ヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用いて、結合したヒト化抗体を検出した。理論的には傾き＝（Ｋｄ ヒト化Ａｂ／Ｋｄ ネズミＡｂ）を持つ直線を生じる、（［結合したネズミＡｂ］／［結合したヒト化Ａｂ］）対（［ネズミＡｂ］／［ヒト化Ａｂ］）のプロットを用いて、ヒト化抗体およびネズミ抗体の相対的親和性を決定した。
【０１７７】
［１７３］典型的な競合アッセイを図１１に示す。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢ ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり１００μｌの炭酸緩衝液中、５μｇ／ｍｌストレプトアビジンで、周囲温度で７時間コーティングした。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルを、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体（ウェルあたり５ｎｇ）と、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、間接的に捕捉したビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そして１００μｌのブロッキング緩衝液中、ヒト化ＥＭ１６４抗体（１５．５ｎｇ）およびネズミ抗体（０ｎｇ、または１６．３５ｎｇ、または３２．７ｎｇ、または６５．４ｎｇ、または１６３．５ｎｇ）の混合物と、周囲温度で２時間インキュベーションし、そして次いで、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、ウェルをＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、１μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した。
【０１７８】
［１７４］（［結合したネズミＡｂ］／［結合したヒト化Ａｂ］）対（［ネズミＡｂ］／［ヒト化Ａｂ］）のプロットは、０．５２の傾き（＝Ｋｄ ヒト化Ａｂ／Ｋｄ ネズミＡｂ）を持つ直線（ｒ２＝０．９９６）を生じた。したがって、ヒト化抗体バージョン１．０は、ネズミＥＭ１６４抗体より緊密にＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した。全長ＩＧＦ−Ｉ受容体への、または一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖への結合に関して、ネズミＥＭ１６４抗体とヒト化ＥＭ１６４抗体のバージョン１．０、１．１、１．２および１．３の競合に関して、約０．５〜０．８の範囲の勾配の類似の値が得られたことから、ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョンがすべて類似の親和性を有し、これはすべて、親ネズミＥＭ１６４抗体のものより優れていたことが示された。重鎖中に９２Ｆ→Ｃ突然変異を持つＥＭ１６４抗体のキメラバージョンは、ネズミＥＭ１６４抗体との類似の結合競合において、約３の傾きを示したことから、ＥＭ１６４の９２Ｆ→Ｃ突然変異体が、ＩＧＦ−Ｉ受容体への結合に関して、ネズミＥＭ１６４抗体より３倍低い親和性を有することが示された。ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ネズミＥＭ１６４抗体と同様の阻害を示した（図２４）。血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体による阻害は、ネズミＥＭ１６４抗体による阻害と同様であった。
【０１７９】
表９
【０１８０】
【表９】
【０１８１】
ＥＭ１６４Ａｂの異なるバージョンの軽鎖および重鎖の可変領域ポリペプチドに関して、Ｋａｂａｔ番号付け系を用いる。アミノ酸残基は、ポリペプチド鎖における位にしたがって、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）にグループ分けされる。
【０１８２】
Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， １９９１， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２から採用。
【０１８３】
Ｊ．本明細書記載のネズミ抗体配列およびヒト化抗体配列から出発して、改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を提供するプロセス
［１７５］抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４およびそのヒト化変異体のアミノ酸配列および核酸配列を用いて、改善された特性を有し、そしてやはり本発明の範囲内である、他の抗体を作成した。こうした改善された特性には、ＩＧＦ−Ｉ受容体への親和性増加が含まれる。いくつかの研究によって、最初の抗体配列の知識に基づいて、抗体配列の多様な位で、１以上のアミノ酸変化を導入した際の、結合および発現レベルなどの特性に対する影響が調査されてきている（Ｙａｎｇ， Ｗ．Ｐ．ら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５４， ３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ， Ｃ．ら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， ８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９）。
【０１８４】
［１７６］これらの研究において、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌のミューテーター株などの方法を用い、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖の遺伝子配列を変化させることによって、最初の抗体の変異体が生成された（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９；Ａｄｅｙ， Ｎ．Ｂ．ら， １９９６， 第１６章， ｐｐ．２７７−２９１， “Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”中， Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ．ら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。最初の抗体の配列を変化させるこれらの方法により、標準的なスクリーニング技術の使用を通じて、親和性が改善された第二の抗体が生じている（Ｇｒａｍ， Ｈ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ， Ｅ．Ｔ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， １０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２， １６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．ら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６， ７７−８８；Ｓｈｏｒｔ， Ｍ．Ｋ．ら， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， １６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．ら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ２７６２２−２７６２８）。
【０１８５】
［１７７］抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の指定戦略によって、本発明記載の抗体配列を用いて、機能が改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を作成することも可能であり、例えば療法剤の付着に用いる、共有修飾のための好都合な付着点にある未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基またはチオール基など、適切な基を有する抗体がある。
【０１８６】
Ｋ．ネズミ抗体、キメラ抗体および他の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のための代替発現系
［１７８］ヒト化抗体（上記）を発現するのに用いたものと類似の哺乳動物プラスミドから、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もまた、発現させた。発現プラスミドは、軽鎖カッパ配列および重鎖ガンマ−１配列を含むネズミ定常領域を有することが知られる（ＭｃＬｅａｎら， ２０００， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３７， ８３７−８４５）。単純な制限消化およびクローニングによって、抗体可変領域いずれか、例えばネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を受け入れるように、これらのプラスミドを設計した。通常は、発現プラスミド中のものと適合する制限部位を生成するため、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のさらなるＰＣＲが必要であった。
【０１８７】
［１７９］全長ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を発現する別のアプローチは、キメラ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体発現プラスミドのヒト定常領域を置換することであった。可変領域のカセット、並びに軽鎖および重鎖両方の定常領域のカセットを用いて、キメラ発現プラスミド（図１６）を構築した。制限消化によって、抗体可変配列をこの発現プラスミドにクローニングしたのとちょうど同じように、別の制限消化を用いて、定常領域配列いずれかにおいてクローニングした。例えば、抗ＩＧＦ−Ｉ抗体可変領域のクローニングのため、本明細書に記載するＲＮＡなど、ネズミ・ハイブリドーマＲＮＡから、カッパ軽鎖ｃＤＮＡおよびガンマ−１重鎖ｃＤＮＡをクローニングした。同様に、Ｋａｂａｔデータベースにおいて入手可能な配列から、適切なプライマーを設計した（表１０を参照されたい）。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、定常領域配列をクローニングし、そしてこれらの断片をキメラ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体発現プラスミドにクローニングするのに必要な制限部位を生成した。次いで、このプラスミドを用いて、ＣＨＯ細胞株などの標準的哺乳動物発現系において、全長ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を発現した。
【０１８８】
表１０−それぞれ、ネズミ・ガンマ−１定常領域およびネズミ・カッパ定常領域をクローニングするため設計したプライマー
【０１８９】
【表１０】
【０１９０】
Ｋａｂａｔデータベースにおいて入手可能な配列からプライマーを設計した（Ｊｏｈｎｓｏｎ， ＧおよびＷｕ， Ｔ．Ｔ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９：２０５−２０６）。
【０１９１】
寄託の記述
［１８０］ネズミＥＭ１６４抗体を作成するハイブリドーマを、ブダペスト条約の条項のもとに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＰＯ Ｂｏｘ １５４９， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１０８に、２００２年６月１４日に寄託し、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７を割り当てられた。
【０１９２】
［１８１］特定の特許および印刷刊行物が本開示において言及されており、これらの解説は、本明細書にそれぞれ完全に援用される。
［１８２］本発明は、詳細に、そして特定の態様に関連して記載されてきているが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変化および修飾が実行可能であることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】［３５］図１は、ヒトＹ１２５１Ｆ ＩＧＦ−Ｉ受容体またはヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対する精製ＥＭ１６４抗体の特異的結合の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す。
【図２】［３６］図２は、ビオチン化ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対するＥＭ１６４抗体の結合に関する結合滴定曲線を示す。
【図３】［３７］図３は、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に対するビオチン化ＩＧＦ−Ｉの結合の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図４】［３８］図４は、ＭＣＦ−７細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図５】［３９］図５は、ＭＣＦ−７細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＲＳ−１リン酸化の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図６】［４０］図６は、ＳａＯＳ−２細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するシグナル伝達の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図７】［４１］図７は、ＭＴＴアッセイによって評価されるような、異なる増殖条件下でのＭＣＦ−７細胞の増殖および生存に対するＥＭ１６４抗体の効果を示す。
【図８】［４２］図８は、多様な濃度の血清存在下、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存に対するＥＭ１６４抗体の効果を示す。
【図９】［４３］図９は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するおよび血清が刺激するＮＣＩ−Ｈ８３８細胞増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図１０】［４４］図１０は、マウスにおけるＣａｌｕ−６肺癌異種移植片の増殖に対する、ＥＭ１６４抗体、タキソール、またはＥＭ１６４抗体およびタキソールの組み合わせでの処置の効果を示す。
【図１１】［４５］図１１は、ヒト化ＥＭ１６４抗体（ｖ．１．０）およびネズミＥＭ１６４抗体の結合の間の競合を示す。
【図１２】［４６］図１２は、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の軽鎖のリーダー領域および可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。矢印はフレームワーク１の始まりをマークする。Ｋａｂａｔにしたがう３つのＣＤＲ配列を下線で示す。
【図１３】［４７］図１３は、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の重鎖のリーダー領域および可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。矢印はフレームワーク１の始まりをマークする。Ｋａｂａｔにしたがう３つのＣＤＲ配列を下線で示す。
【図１４】［４８］図１４は、Ｃｈｏｔｈｉａ規範的クラス定義によって決定されるような、抗体ＥＭ１６４の軽鎖および重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＣＤＲのＡｂＭモデリング・ソフトウェア定義もまた示す。軽鎖：ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＣＤＲ２は配列番号５であり、そしてＣＤＲ３は配列番号６である。重鎖：ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＣＤＲ２は配列番号２であり、そしてＣＤＲ３は配列番号３である。ＡｂＭ重鎖：ＣＤＲ１は配列番号５３であり、ＣＤＲ２は配列番号５４であり、そしてＣＤＲ３は配列番号５５である。
【図１５】［４９］図１５は、Ｃｒ１（配列番号５６）およびＪ５８８．ｃ（配列番号５７）遺伝子の生殖系列配列と並列させた、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す。ダッシュ記号（−）は配列同一性を示す。
【図１６】［５０］図１６は、組換えＥＭ１６４キメラ抗体および組換えヒト化ＥＭ１６４抗体を構築し、そして発現するのに用いたプラスミドを示す。Ａ）軽鎖クローニングプラスミド、Ｂ）重鎖クローニングプラスミド、Ｃ）哺乳動物抗体発現プラスミド。
【図１７】［５１］図１７は、ＥＭ１６４の表面残基を予測するのに用いた構造ファイル・セットにおいて、１２７の抗体からスクリーニングした１０の最も相同な軽鎖アミノ酸配列を示す。ｅｍｌ６４ ＬＣ（配列番号５８）、２ｊｅｌ（配列番号５９）、２ｐｃｐ（配列番号６０）、１ｎｑｂ（配列番号６１）、１ｋｅｌ（配列番号６２）、１ｈｙｘ（配列番号６３）、１ｉｇｆ（配列番号６４）、１ｔｅｔ（配列番号６５）、１ｃｌｚ（配列番号６６）、１ｂｌｎ（配列番号６７）、１ｃｌｙ（配列番号６８）、コンセンサス（配列番号６９）。
【図１８】［５２］図１８は、ＥＭ１６４の表面残基を予測するのに用いた構造ファイル・セットにおいて、１２７の抗体からスクリーニングした１０の最も相同な重鎖アミノ酸配列を示す。ｅｍ１６４ ＨＣ（配列番号７０）、１ｎｑｂ（配列番号７１）、１ｎｇｐ（配列番号７２）、１ｆｂｉ（配列番号７３）、１ａｆｖ（配列番号７４）、１ｙｕｈ（配列番号７５）、１ｐｌｇ（配列番号７６）、１ｄ５ｂ（配列番号７７）、１ａｅ６（配列番号７８）、１ａｘｓ（配列番号７９）、３ｈｆｌ（配列番号８０）、コンセンサス（配列番号８１）。
【図１９】［５３］図１９は、１０の最も相同な構造からの、（Ａ）軽鎖および（Ｂ）重鎖の可変領域残基各々の平均アクセス可能性を示す。数字は、Ｋａｂａｔ抗体配列位番号を示す。
【図２０】［５４］図２０は、ネズミＥＭ１６４（ｍｕＥＭ１６４）およびヒト化ＥＭ１６４（ｈｕＥＭ１６４）抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列を示す。ｍｕＥＭ１６４（配列番号８２）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．０（配列番号８３）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．１（配列番号８４）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．２（配列番号８５）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．３（配列番号８６）。
【図２１】［５５］図２１は、ネズミ（ｍｕＥＭ１６４、配列番号８７）およびヒト化ＥＭ１６４抗体（ｈｕＥＭ１６４、配列番号８８）の重鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
【図２２】［５６］図２２は、軽鎖（ＤＮＡ、配列番号８９、アミノ酸、配列番号９０）および重鎖（ＤＮＡ、配列番号９１、アミノ酸、配列番号９２）両方のｈｕＥＭ１６４ ｖ１．０の可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２３−１】［５７］図２３は、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．１（ＤＮＡ、配列番号９３；アミノ酸、配列番号９４）、ｖ１．２（ＤＮＡ、配列番号９５；アミノ酸、配列番号９６）およびｖ１．３（ＤＮＡ、配列番号９７；アミノ酸、配列番号９８）の軽鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２３−２】［５７］図２３は、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．１（ＤＮＡ、配列番号９３；アミノ酸、配列番号９４）、ｖ１．２（ＤＮＡ、配列番号９５；アミノ酸、配列番号９６）およびｖ１．３（ＤＮＡ、配列番号９７；アミノ酸、配列番号９８）の軽鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２４】［５８］図２４は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体およびネズミＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図２５】［５９］図２５は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞のサイクリングを、ＥＭ１６４が抑制することを示す。
【図２６】［６０］図２６は、ＩＧＦ−１および血清の抗アポトーシス効果を、ＥＭ１６４が抑制することを示す。ＣＫ１８タンパク質の切断レベルが増加していることによって立証されるように、ＥＭ１６４で処理すると、アポトーシス細胞死が生じる。
【図２７】［６１］図２７は、免疫不全マウスにおけるヒトＢｘＰＣ−３膵臓癌異種移植片の増殖に対する、ＥＭ１６４抗体、ゲムシタビン、またはＥＭ１６４抗体およびゲムシタビンの組み合わせでの処理の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
［０１］本出願は、本明細書にその全体が援用される、親出願第１０／１７０，３９０号、２００２年６月１４日出願の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
［０２］本発明は、ヒト・インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）に結合する抗体に関する。より詳細には、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞機能を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。さらにより詳細には、本発明は、腫瘍細胞の増殖および生存に対するＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよび血清の効果に拮抗し、そしてアゴニスト活性を実質的に欠いている、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。本発明はまた、前記抗体の断片、前記抗体のヒト化バージョンおよび表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）バージョン、前記抗体のコンジュゲート、抗体誘導体、並びに診断適用、研究適用および療法適用におけるこれらの使用にも関する。本発明はさらに、上述の抗体およびその断片から作成される、改善された抗体またはその断片に関する。別の側面において、本発明は、抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドに、そして該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［０３］インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）は、膜貫通ヘテロ四量体タンパク質であり、２つの細胞外アルファ鎖および２つの膜貫通ベータ鎖を有し、これらの鎖がジスルフィド連結されてβ−α−α−β立体配置を形成している。ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに、リガンドであるインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）が結合すると、細胞内チロシンキナーゼ・ドメインが活性化され、受容体の自己リン酸化および基質リン酸化が生じる。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、インスリン受容体に相同であり、ベータ鎖チロシンキナーゼ・ドメインにおいて、８４％の高い配列類似性を有し、そしてアルファ鎖細胞外システインリッチ・ドメインにおいて、４８％の低い配列類似性を有する（Ｕｌｒｉｃｈ， Ａ．ら， １９８６， ＥＭＢＯ， ５， ２５０３−２５１２；Ｆｕｊｉｔａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｙ．ら， １９８６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １６７２７−１６７３１；ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．ら， １９９５， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １６， １４３−１６３）。ＩＧＦ−Ｉ受容体およびそのリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、胚形成の間の増殖および発生、成体における代謝、細胞増殖および細胞分化を含む、多くの生理学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす（ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， ２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４１， １２８７−１２８８；ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３６， ６３３−６４０）。
【０００４】
［０４］ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、血液中では、主にＩＧＦ結合性タンパク質との複合体中に存在して、どちらも内分泌ホルモンとして機能し、そして局所的に産生されるパラ分泌および自己分泌増殖因子として機能する（Ｈｕｍｂｅｌ， Ｒ．Ｅ．， １９９０， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９０， ４４５−４６２；Ｃｏｈｉｃｋ， Ｗ．Ｓ．およびＣｌｅｍｍｏｎｓ， Ｄ．Ｒ．， １９９３， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５， １３１−１５３）。
【０００５】
［０５］ＩＧＦ−Ｉ受容体は、腫瘍細胞の増殖、トランスフォーメーションおよび生存の促進に関連付けられてきている（Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３３２， Ｆ１０５−Ｆ１２６；Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ， Ｖ．Ａ．ら， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １５２， ３３９−３４４；Ｋａｌｅｋｏ， Ｍ．， Ｒｕｔｔｅｒ， Ｗ．Ｊ．，およびＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， ４６４−４７３）。したがって、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、滑膜肉腫および膵臓癌を含む、いくつかの種類の腫瘍は、通常より高いレベルのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現することが知られる（Ｋｈａｎｄｗａｌａ， Ｈ．Ｍ．ら， ２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２１， ２１５−２４４；Ｗｅｒｎｅｒ， Ｈ．およびＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９６， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６８， １８３−２２３；Ｈａｐｐｅｒｆｉｅｌｄ， Ｌ．Ｃ．ら， １９９７， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １８３， ４１２−４１７；Ｆｒｉｅｒ， Ｓ．ら， １９９９， Ｇｕｔ， ４４， ７０４−７０８；ｖａｎ Ｄａｍ， Ｐ．Ａ．ら， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， ４７， ９１４−９１９；Ｘｉｅ， Ｙ．ら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９， ３５８８−３５９１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｕ．ら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２００７−２０１１）。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、肺癌、乳癌、結腸癌、骨肉腫および子宮頸癌などのいくつかのヒト腫瘍細胞株の強力なマイトジェンであることが示されてきている（Ａｎｋｒａｐｐ， Ｄ．Ｐ．およびＢｅｖａｎ， Ｄ．Ｒ．， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３， ３３９９−３４０４；Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３；Ｈｅｒｍａｎｔｏ， Ｕ．ら， ２０００， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， １１， ６５５−６６４；Ｇｕｏ， Ｙ．Ｓ．ら， １９９５， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｓｕｒｇ．， １８１， １４５−１５４；Ｋａｐｐｅｌ， Ｃ．Ｃ．ら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４， ２８０３−２８０７；Ｓｔｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ａ．ら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６， １７６１−１７６５）。これらの腫瘍および腫瘍細胞株のいくつかはまた、高レベルのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩも発現し、これらが自己分泌方式またはパラ分泌方式で増殖を刺激することも可能である（Ｑｕｉｎｎ， Ｋ．Ａ．ら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， １１４７７−１１４８３）。
【０００６】
［０６］疫学的研究によって、ＩＧＦ−Ｉ血漿レベルの上昇（およびＩＧＦ結合性タンパク質−３の低レベル）と、前立腺癌、結腸癌、肺癌および乳癌のリスクの増加に相関関係があることが示されてきている（Ｃｈａｎ， Ｊ．Ｍ．ら， １９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９， ５６３−５６６；Ｗｏｌｋ， Ａ．ら， １９９８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９０， ９１１−９１５；Ｍａ， Ｊ．ら， １９９９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９１， ６２０−６２５；Ｙｕ， Ｈ．ら， １９９９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ９１， １５１−１５６；Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ， Ｓ．Ｅ．ら， １９９８， Ｌａｎｃｅｔ， ３５１， １３９３−１３９６）。癌予防のため、血漿中のＩＧＦ−Ｉレベルを低下させるか、またはＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害するための戦略が示唆されてきている（Ｗｕ， Ｙ．ら， ２００２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６２， １０３０−１０３５；Ｇｒｉｍｂｅｒｇ， ＡおよびＣｏｈｅｎ Ｐ．， ２０００， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １８３， １−９）。
【０００７】
［０７］ＩＧＦ−Ｉ受容体は、増殖因子枯渇、足場非依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）または細胞傷害性薬剤処置によって引き起こされるアポトーシスから腫瘍細胞を保護する（Ｎａｖａｒｒｏ， Ｍ．およびＢａｓｅｒｇａ， Ｒ．， ２００１， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４２， １０７３−１０８１；Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３３２， Ｆ１０５−Ｆ１２６）。ＩＧＦ−Ｉ受容体の分裂促進活性、トランスフォーミング活性および抗アポトーシス活性に決定的なドメインは、突然変異分析によって同定されてきている。
【０００８】
［０８］例えば、ＩＧＦ−Ｉ受容体のチロシン１２５１残基は、抗アポトーシス活性およびトランスフォーメーション活性に決定的であるが、分裂促進活性には決定的でないと同定されてきている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ．ら， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ４２７−４３５；Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。リガンドが活性化するＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内シグナル伝達経路は、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２）のチロシン残基のリン酸化を伴い、これによって、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）が膜に補充される。ＰＩ−３−キナーゼの、膜に結合したリン脂質産物が、セリン／スレオニンキナーゼであるＡｋｔを活性化し、Ａｋｔの基質には、アポトーシス促進性タンパク質ＢＡＤが含まれ、ＢＡＤは、リン酸化されると不活性状態になる（Ｄａｔｔａ， Ｓ．Ｒ．， Ｂｒｕｎｅｔ， Ａ．およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｅ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ２９０５−２９２７；Ｋｕｌｉｋ， Ｇ．， Ｋｌｉｐｐｅｌ， Ａ．およびＷｅｂｅｒ， Ｍ．Ｊ．， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， １５９５−１６０６）。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体の分裂促進性シグナル伝達は、ＰＩ−３−キナーゼを必要とし、そしてマイトジェンが活性化するプロテインキナーゼには非依存性である一方、分化したラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞における生存性シグナル伝達は、ＰＩ−３−キナーゼ経路、およびマイトジェンが活性化するプロテインキナーゼ経路の両方を必要とする（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１；Ｐａｒｒｉｚａｓ， Ｍ．， Ｓａｌｔｉｅｌ， Ａ．Ｒ．およびＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， １５４−１６１）。
【０００９】
［０９］アンチセンス戦略によってＩＧＦ−Ｉ受容体レベルを下方制御すると、黒色腫、肺癌腫、卵巣癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫および横紋筋肉腫などのいくつかの腫瘍細胞株の腫瘍形成性が、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、減少することが示されてきている（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆ， Ｍ．ら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４， ４８４８−４８５０；Ｌｅｅ， Ｃ．−Ｔ．ら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６， ３０３８−３０４１；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．ら， １９９８， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７７， ５６７−５７１；Ｔｒｏｊａｎ， Ｊ．ら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５９， ９４−９７；Ｌｉｕ， Ｘ．ら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８， ５４３２−５４３８；Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｄ．Ｎ．ら， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４， １２３５−１２４２）。同様に、ＩＧＦ−Ｉ受容体の優性ネガティブ突然変異体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現しているトランスフォーメーションされたＲａｔ−１細胞のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成性およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を減少させることが報告されてきている（Ｐｒａｇｅｒ， Ｄ．ら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ２１８１−２１８５）。
【００１０】
［１０］ＩＧＦ−Ｉ受容体ｍＲＮＡに対するアンチセンスを発現する腫瘍細胞を、生体拡散（ｂｉｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）チャンバー中、動物に注射すると、大規模なアポトーシスが起こる。ＩＧＦ−Ｉ受容体の阻害によるアポトーシスに対して、腫瘍細胞は、正常細胞より感受性であるという仮説に基づいて、この観察から、ＩＧＦ−Ｉ受容体は魅力的な療法ターゲットとなる。（Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆ， Ｍ．ら， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２４６３−２４６９；Ｂａｓｅｒｇａ， Ｒ．， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５，２４９−２５２）。
【００１１】
［１１］腫瘍細胞においてＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害する別の戦略は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに結合し、そしてその活性化を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を使用している。ＩＧＦ−Ｉ受容体に対するマウス・モノクローナル抗体を作成する、いくつかの試みが報告されてきており、このうち、２つの阻害性抗体、ＩＲ３および１Ｈ７が入手可能であり、そしていくつかのＩＧＦ−Ｉ受容体研究において、これらの使用が報告されてきている。
【００１２】
［１２］ＩＲ３抗体は、マウスを免疫するために、インスリン受容体の部分的に精製された胎盤調製物を用いて作成されてきており、これによって、インスリン受容体結合に関して選択的な抗体ＩＲ１と、そしてＩＧＦ−Ｉ受容体（ソマトメジン−Ｃ受容体）の優先的な免疫沈降を示すが、またインスリン受容体の弱い免疫沈降も示す、２つの抗体、ＩＲ２およびＩＲ３が得られた（Ｋｕｌｌ， Ｆ．Ｃ．ら， １９８３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８， ６５６１−６５６６）。
【００１３】
［１３］１Ｈ７抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の精製された胎盤調製物でマウスを免疫することによって作成されてきており、これによって、阻害性抗体１Ｈ７に加えて、３つの刺激性抗体が得られた（Ｌｉ， Ｓ．−Ｌ．ら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９６， ９２−９８；Ｘｉｏｎｇ， Ｌ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５３５６−５３６０）。
【００１４】
［１４］別の報告において、高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するトランスフェクションされた３Ｔ３細胞でマウスを免疫することによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的なマウス・モノクローナル抗体集団が得られており、これらの抗体は、結合競合研究によって、そしてトランスフェクションされた３Ｔ３細胞に対するＩＧＦ−Ｉ結合の阻害または刺激によって、７つのグループに分類された（Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。
【００１５】
［１５］上述のように、ＩＲ３抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＧＦ−Ｉ受容体研究で最も一般的に用いられる阻害性抗体であるが、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するトランスフェクションされた３Ｔ３細胞およびＣＨＯ細胞において、アゴニスト性活性を示すという欠点がある（Ｋａｔｏ， Ｈ．ら， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ２６５５−２６６１；Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｇ．およびＲｏｔｈ， Ｒ．Ａ．， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７１， １２４４−１２５１）。同様に、Ｓｏｏｓらに作成された抗体集団の中で、最も阻害性の抗体、２４−５７および２４−６０もまた、トランスフェクションされた３Ｔ３細胞において、アゴニスト性活性を示した（Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。ＩＲ３抗体は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞において、そして可溶化後に、発現された受容体へのＩＧＦ−Ｉの結合を阻害する（がＩＧＦ−ＩＩの結合は阻害しない）ことが報告されているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞において、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩがＤＮＡ合成を刺激する能力の両方を阻害することが示されている（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｇ．およびＲｏｔｈ， Ｒ．Ａ．， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７１， １２４４−１２５１）。キメラ・インスリン−ＩＧＦ−Ｉ受容体構築物によって、ＩＲ３抗体の結合性エピトープがＩＧＦ−Ｉ受容体の２２３〜２７４の領域であると推測されている（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｔ．Ａ．およびＲｕｔｔｅｒ， Ｗ．Ｊ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， １８６６３−１８６６７；Ｓｏｏｓ， Ｍ．Ａ．ら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７， １２９５５−１２９６３）。
【００１６】
［１６］ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株は、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの増殖反応を示すモデル細胞株として用いられる（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１）。ＭＣＦ−７細胞において、ＩＲ３抗体は、血清不含条件において、外因性に添加されたＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの刺激性効果を、およそ８０％、不完全に遮断する。また、ＩＲ３抗体は、１０％血清中、ＭＣＦ−７細胞の増殖を有意には阻害しない（２５％未満）（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．ら， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖が、ＩＲ３抗体によって弱くしか阻害されないのは、ヌードマウスにおいて、ＩＲ３抗体で処理しても、ＭＣＦ−７異種移植片の増殖が、有意には阻害されないというｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果と関連がある可能性もある（Ａｒｔｅａｇａ， Ｃ．Ｌ．ら， １９８９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４， １４１８−１４２３）。
【００１７】
［１７］ＩＲ３および他の報告される抗体が、弱いアゴニスト性活性を持ち、そして（血清不含条件において外因性に添加されたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩによる刺激でなく）血清が刺激する、より生理学的な条件において、ＭＣＦ−７細胞などの腫瘍細胞の増殖を有意に阻害することが不能であるため、血清が刺激する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害するが、それ自体では有意なアゴニスト性活性を示さない、新規抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
［１８］したがって、本発明の目的は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し、そして該受容体と拮抗することによって、該受容体の細胞活性を阻害し、そしてまた、該受容体に対するアゴニスト活性を実質的に欠いている、抗体、抗体断片および抗体誘導体を提供することである。
【００１９】
［１９］したがって、第一の態様において、軽鎖および重鎖両方の可変領域のアミノ酸配列、軽鎖および重鎖の可変領域の遺伝子のｃＤＮＡ配列、そのＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、その表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段に関して、本明細書において完全に性質決定されている、ネズミ抗体ＥＭ１６４を提供する。
【００２０】
［２０］第二の態様において、抗体ＥＭ１６４の表面再構成（resurfaced）バージョンまたはヒト化バージョンであって、抗体の表面曝露残基またはその断片が、既知のヒト抗体表面により緊密に似るように、軽鎖および重鎖の両方で置換されている、前記バージョンを提供する。こうしたヒト化抗体は、ネズミＥＭ１６４に比較して、療法剤または診断剤として、増加した有用性を有しうる。抗体ＥＭ１６４のヒト化バージョンはまた、軽鎖および重鎖両方の可変領域のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖および重鎖の可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、これらの表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段の開示に関して、本明細書に完全に性質決定される。
【００２１】
［２１］第三の態様において、例えば血清、インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩなどの増殖刺激剤の存在下で、約８０％より多く、癌細胞の増殖を阻害することが可能な抗体を提供する。
【００２２】
［２２］第四の態様において、それぞれ配列番号１〜３：
【００２３】
【化１】
【００２４】
に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む重鎖；
および配列番号４〜６：
【００２５】
【化２】
【００２６】
に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を有する、抗体または抗体断片を提供する。
［２３］第五の態様において、配列番号７：
【００２７】
【化３】
【００２８】
に示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗体を提供する。
［２４］同様に、配列番号８：
【００２９】
【化４】
【００３０】
に示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体を提供する。
［２５］第六の態様において、配列番号９〜１２：
【００３１】
【化５】
【００３２】
の１つに対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構成軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
［２６］同様に、配列番号１３：
【００３３】
【化６】
【００３４】
に対応するアミノ酸配列を有する、ヒト化または表面再構成重鎖可変領域を有する抗体を提供する。
［２７］第七の態様において、改善された特性を有する、本発明の抗体または抗体断片を提供する。例えば、本発明の抗体または断片の親和性成熟によって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対して改善された親和性を有する抗体または抗体断片が調製される。
【００３５】
［２８］本発明はさらに、前記抗体のコンジュゲートであって、本発明の抗体または抗体のエピトープ結合性断片に、直接、あるいは切断可能リンカーまたは切断不能リンカーを介して、細胞傷害性剤が共有結合している、前記コンジュゲートを提供する。好ましい態様において、細胞傷害性剤は、タキソール、メイタンシノイド、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。
【００３６】
［２９］本発明はさらに、研究適用または診断適用における使用のため、さらに標識された抗体またはその断片を提供する。好ましい態様において、標識は放射標識、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、発色団、画像化剤または金属イオンである。
【００３７】
［３０］診断法であって、癌を有すると推測される被験者に、前記標識抗体または断片を投与して、そして被験者体内の標識分布を測定するかまたは監視する、前記方法もまた、提供する。
【００３８】
［３１］第八の態様において、本発明は、本発明の抗体、抗体断片または抗体コンジュゲートを、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて投与することによって、癌を有する被験者を治療する方法を提供する。癌は、例えば乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、またはＩＧＦ−Ｉ受容体レベルが上昇していることがこれから決定されるであろう他の癌の１以上であることも可能である。
【００３９】
［３２］第九の態様において、本発明は、本発明の抗体、抗体断片または抗体コンジュゲートを、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて投与することによって、癌を有する被験者を治療する方法を提供する。特に、好ましい細胞傷害性剤および療法剤には、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンが含まれる。より好ましくは、療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００４０】
［３３］癌は、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫、またはＩＧＦ−Ｉ受容体レベルが上昇していることがこれから決定されるであろう他の癌の１以上であることも可能である。
【００４１】
［３４］第十の態様において、本発明は、本明細書記載の１以上の要素、およびこれらの要素を使用するための使用説明書を含むキットを提供する。好ましい態様において、本発明のキットには、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤が含まれる。この好ましい態様のための使用説明書には、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌細胞の増殖を阻害するための使用説明書、並びに／あるいは本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌を有する患者を治療する方法のための使用説明書が含まれる。
【００４２】
発明の詳細な説明
［６２］本発明の発明者らは、細胞表面上のヒト・インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に特異的に結合する新規抗体を発見しそして改善した。該抗体および断片は、受容体自体を活性化する能力を伴わずに、受容体の細胞機能を阻害するユニークな能力を有する。したがって、ＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合し、そして阻害することが以前から知られていた抗体はまた、ＩＧＦ−ＩＲリガンドの非存在下であっても、受容体を活性化するのに対して、本発明の抗体または断片は、ＩＧＦ−ＩＲに拮抗するが、アゴニスト活性を実質的に欠いている。さらに、本発明の抗体および抗体断片は、血清の存在下で、８０％を超えて、ＭＣＦ−７細胞などのヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、これは以前から知られていた抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いて得られる阻害より高い度合いである。
【００４３】
［６３］本発明は、ネズミ抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、本明細書のＥＭ１６４から出発し、該抗体は、軽鎖および重鎖両方のアミノ酸配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定、並びに組換え型でのその発現手段に関して、完全に性質決定されている。
【００４４】
［６４］図１５に、ＥＭ１６４の配列と並列させて、生殖系列配列を示す。比較によって、軽鎖のＣＤＲ１中および重鎖のＣＤＲ２中の各１つを含めて、ＥＭ１６４中のありうる体細胞突然変異が同定される。
【００４５】
［６５］抗体ＥＭ１６４軽鎖および重鎖、並びにヒト化バージョンの、一次アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を本明細書に開示する。しかし、本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体および断片に限定されない。その代わり、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し、そして該受容体の生物学的活性に拮抗するが、アゴニスト活性を実質的に欠いている、すべての抗体および断片が、本発明の範囲内に属する。したがって、抗体および抗体断片は、抗体ＥＭ１６４またはヒト化誘導体と、骨格のアミノ酸配列、ＣＤＲ、軽鎖および重鎖が異なってもよく、そしてそれでも本発明の範囲内に属することもありうる。
【００４６】
［６６］モデリングによって、抗体ＥＭ１６４のＣＤＲが同定され、そしてその分子構造が予測されてきている。この場合もやはり、ＣＤＲはエピトープ認識に重要であるが、本発明の抗体および断片に必須ではない。したがって、例えば本発明の抗体の親和性成熟によって産生された、改善された特性を有する抗体および断片を提供する。
【００４７】
［６７］多様な抗体および抗体断片、並びに抗体模倣体は、特定のＣＤＲセットに隣接する可変領域配列および定常領域配列内の突然変異、欠失および／または挿入によって、容易に産生可能である。したがって、例えば、既定のＣＤＲセットに関して、異なる重鎖で置換することによって、異なるクラスのＡｂを作成することも可能であり、したがって、例えば、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１〜２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプおよびアイソタイプを産生することも可能である。同様に、完全に合成されたフレームワーク内に、既定のＣＤＲセットを包埋することによって、本発明の範囲内の人工的抗体を産生することも可能である。用語「可変」は、本明細書において、抗体間で配列が異なり、そして抗原に対する特定の抗体各々の結合および特異性に際して用いられる、可変ドメインの特定の部分を指すのに用いられる。しかし、可変性は、通常、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するのではない。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのフレームワーク領域を含み、主として、３つのＣＤＲに連結されたベータ・シート立体配置を採用し、ＣＤＲは、ベータ・シート構造を連結し、そしてある場合にはベータ・シート構造の一部を形成する、ループを形作る。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって非常に近接して一緒に保持され、そして他方の鎖由来のＣＤＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｅ．Ａ． Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， １９９１， ＮＩＨ）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合には、直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を示す。
【００４８】
［６８］表面再構成およびＣＤＲ移植などのいくつかの技術を用いて、ヒト化抗体、または他の哺乳動物による非拒絶のために適応させた抗体を、産生することも可能である。表面再構成技術においては、分子モデリング、統計解析および突然変異誘発を組み合わせて、ターゲット宿主の既知の抗体の表面に似るように、可変領域の非ＣＤＲ表面を調節する。抗体表面を再構成する戦略および方法、並びに異なる宿主内で抗体の免疫原性を減少させる他の方法は、本明細書にその全体が援用される、米国特許５，６３９，６４１に開示される。ＣＤＲ移植技術においては、ネズミ重鎖および軽鎖のＣＤＲを、完全にヒトであるフレームワーク配列内に移植する。
【００４９】
［６９］本発明にはまた、本明細書中に記載される抗体の機能上の同等物も含まれる。機能上の同等物は、抗体のものに匹敵する結合特性を有し、そして例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体、並びにそれらの断片を含む。こうした機能上の同等物を産生する方法が、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／２１３１９、欧州特許出願第２３９，４００号；ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；および欧州特許出願ＥＰ ３３２，４２４に開示され、これら出願は、それぞれ全体が本明細書に援用される。
【００５０】
［７０］機能上の同等物には、本発明の抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチドが含まれる。「実質的に同じ」は、アミノ酸配列に適用された場合、本明細書において、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４−２４４８（１９８８）にしたがって、ＦＡＳＴＡ検索法によって決定されるように、別のアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を持つ配列と定義される。
【００５１】
［７１］キメラ抗体は、好ましくは、ヒトの抗体定常領域から実質的にまたは独占的に得られた定常領域、およびヒト以外の哺乳動物の可変領域配列から実質的にまたは独占的に得られた可変領域を有する。抗体のヒト化型は、例えばマウス抗体の、相補性決定領域をヒトのフレームワークドメイン内に置換することによって作成され、例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト化抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的にまたは独占的に由来する、定常領域、および相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変領域、並びにヒト以外の哺乳動物に実質的にまたは独占的に由来するＣＤＲを有する。
【００５２】
［７２］機能上の同等物には、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる、一本鎖抗体断片もまた含まれる。これらの断片は、１以上の相互連結リンカーを伴いまたは伴わずに、抗体可変軽鎖配列（ＶＬ）の少なくとも１つの断片に係留された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）、抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含有する。こうしたリンカーは、ひとたび（ＶＬ）ドメインおよび（ＶＨ）ドメインが連結されたならば、一本鎖抗体断片が由来する全抗体のターゲット分子結合特異性が維持されるように、これらのドメインが適切に三次元フォールディングされることを確実にするよう選択された、短い柔軟なペプチドであることも可能である。一般的に、（ＶＬ）配列または（ＶＨ）配列のカルボキシル末端は、こうしたペプチド・リンカーによって、相補（ＶＬ）配列および（ＶＨ）配列のアミノ末端に、共有結合されていることも可能である。分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリーまたは類似の技術によって、一本鎖抗体断片を生成することも可能である。真核細胞、または細菌を含む原核細胞いずれかにおいて、これらのタンパク質を産生することも可能である。
【００５３】
［７３］一本鎖抗体断片は、本明細書記載の全抗体の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含有するが、これらの抗体の定常ドメインのある程度またはすべてを欠く。これらの定常ドメインは、抗原結合に必要ではないが、全抗体構造の主要部分を構成する。一本鎖抗体断片は、したがって、定常ドメインの一部またはすべてを含有する抗体の使用に関連する不具合のある程度を克服することも可能である。例えば、一本鎖抗体断片は、生物学的分子および重鎖定常領域間の望ましくない相互作用、または他の望ましくない生物学的活性を持たない傾向がある。さらに、一本鎖抗体断片は、全抗体よりかなり小さく、そしてしたがって、全抗体より毛細血管透過性が高いことから、より効率的に局在し、そしてターゲット抗原結合部位に結合することが可能になる。また、抗体断片は、原核細胞において、比較的大規模に産生可能であり、したがって産生が容易である。さらに、一本鎖抗体断片は比較的サイズが小さいことから、全抗体よりも、レシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低くなる。
【００５４】
［７４］機能上の同等物には、さらに、全抗体のものと同じかまたは匹敵する結合特性を有する抗体の断片が含まれる。こうした断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片の一方または両方を含有することも可能である。好ましくは、抗体断片は、全抗体の６つの相補性決定領域すべてを含有するが、３つ、４つまたは５つのＣＤＲなど、こうした領域すべてより少ない領域を含有する断片もまた、機能性である。さらに、機能上の同等物は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそのサブクラスのいずれか１つのメンバーであることも可能であるし、また機能上の同等物をこれらのクラスおよびサブクラスと組み合わせることも可能である。
【００５５】
［７５］本明細書記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４およびそのヒト化変異体のアミノ酸配列および核酸配列の知識を用いて、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体にやはり結合し、そしてＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞機能を阻害する、他の抗体を作成することも可能である。いくつかの研究によって、最初の抗体配列の知識に基づいて、抗体配列中の多様な位置で、１以上のアミノ酸変化を導入した際の、結合および発現レベルなどの特性に対する影響が調査されてきている（Ｙａｎｇ， Ｗ．Ｐ．ら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５４， ３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ， Ｃ．ら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， ８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９）。
【００５６】
［７６］これらの研究において、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラープローン（error-prone）ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のミューテーター株などの方法を用い、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖の遺伝子配列を変化させることによって、最初の抗体の変異体が生成された（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９；Ａｄｅｙ， Ｎ．Ｂ．ら， １９９６， 第１６章， ｐｐ．２７７−２９１， “Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”中， Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ．ら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。最初の抗体の配列を変化させるこれらの方法によって、親和性が改善された第二の抗体が生じている（Ｇｒａｍ， Ｈ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ， Ｅ．Ｔ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， １０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２， １６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．ら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６， ７７−８８；Ｓｈｏｒｔ， Ｍ．Ｋ．ら， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， １６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．ら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ２７６２２−２７６２８）。
【００５７】
［７７］抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の指定戦略（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ）によって、本発明記載の抗体配列を用いて、機能が改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を作成することも可能である。
【００５８】
［７８］本発明のコンジュゲートは、細胞傷害性剤に連結された、本明細書に開示する抗体、断片、およびその類似体を含む。好ましい細胞傷害性剤は、メイタンシノイド、タキサンおよびＣＣ−１０６５類似体である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によってコンジュゲートを調製することも可能である。細胞傷害性剤を抗体に連結するため、連結基を用いる。適切な連結基が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、または抗体および細胞傷害性剤の間にチオエーテル結合を形成することによって、コンジュゲートを構築することも可能である。
【００５９】
［７９］好ましい細胞傷害性剤の中に、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体がある。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。適切なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号および第５，８４６，５４５号に開示される。
【００６０】
［８０］タキサンもまた、好ましい細胞傷害性剤である。本発明での使用に適したタキサンが、米国特許第６，３７２，７３８号および第６，３４０，７０１号に開示される。
［８１］ＣＣ−１０６５およびその類似体もまた、本発明での使用に好ましい細胞傷害性薬剤である。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号；第６，３４０，７０１号；第５，８４６，５４５号および第５，５８５，４９９号に開示される。
【００６１】
［８２］こうした細胞傷害性コンジュゲートの調製のための魅力的な候補はＣＣ−１０６５であり、これはストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された、強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンなどの一般的に用いられる抗癌薬剤より、ｉｎ ｖｉｔｒｏで約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ． Ｂｈｕｙａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４２， ３５３２−３５３７（１９８２））。
【００６２】
［８３］メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、およびカリケアマイシンなどの細胞傷害性薬剤もまた、本発明のコンジュゲートの調製に適しており、そして薬剤分子を、血清アルブミンなどの中間キャリアー分子を通じて、抗体分子に連結することもまた可能である。
【００６３】
［８４］診断適用のため、本発明の抗体は、典型的には、検出可能部分で標識されるであろう。検出可能部分は、直接または間接的いずれかで検出可能シグナルを生じることが可能ないかなるものであることも可能である。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１３１Ｉなどの放射性同位体；フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光化合物または化学発光化合物；あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼなどの酵素であることも可能である。
【００６４】
［８５］検出可能部分に抗体をコンジュゲート化するため、当該技術分野に知られるいかなる方法を使用することも可能であり、こうした方法には、Ｈｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３０：４０７（１９８２）が含まれる。
【００６５】
［８６］競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなどの、いかなる既知のアッセイ法で、本発明の抗体を使用することも可能である（Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７））。
【００６６】
［８７］本発明の抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化にも有用であり、この場合、放射線不透過（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）剤または放射性同位体などの検出可能部分で標識した抗体を被験者に、好ましくは血流中に投与し、そして宿主中の標識抗体の存在および位置をアッセイする。この画像化技術は、悪性腫瘍の病期決定および治療に有用である。核磁気共鳴、放射線学、または当該技術分野に知られる他の検出手段のいずれによるものであれ、宿主において検出可能である、いかなる部分で抗体を標識することも可能である。
【００６７】
［８８］本発明の抗体はまた、アフィニティー精製剤としても有用である。このプロセスでは、当該技術分野に周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙などの適切な支持体上に抗体を固定する。
【００６８】
［８９］本発明の抗体はまた、細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体の機能を阻害することに基づいて、生物学的研究における試薬としても有用である。
［９０］療法適用のため、薬学的に許容しうる投薬型で、本発明の抗体またはコンジュゲートを被験者に投与する。これらは、ボーラスとして、またはある期間に渡る連続注入によって静脈内に、筋肉内経路、皮下経路、関節内経路、滑膜内経路、クモ膜下腔内経路、経口経路、局所経路、または吸入経路によって、投与可能である。また、腫瘍内経路、腫瘍周辺経路、病巣内経路、または病巣周辺経路によって抗体を投与して、局所、並びに全身性の療法効果を発揮することも可能である。適切な薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤、および賦形剤が周知であり、そして臨床状況を保証するものとして、当業者によって決定可能である。適切なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤の例には：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれる。本発明の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することも可能である。
【００６９】
［９１］他の療法処置において、１以上のさらなる療法剤と、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートを同時投与するか、または連続投与することも可能である。適切な療法剤には、限定されるわけではないが、細胞傷害性剤または細胞分裂停止剤が含まれる。タキソールは、細胞傷害性剤でもあり、好ましい療法剤である。
【００７０】
［９２］癌療法剤は、宿主への損傷を最小限にしつつ、癌細胞を殺すかまたはその増殖を制限することを模索する剤である。したがって、こうした剤は、癌細胞特性における、健康な宿主細胞とのいかなる相違（例えば代謝、血管形成または細胞表面抗原提示）を利用することも可能である。腫瘍形態形成における相違が、介入の潜在的な箇所である：例えば、第二の療法剤は、固形腫瘍内部の血管形成を遅延させ、それによってその増殖速度を遅らせる際に有用な、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体であることも可能である。他の療法剤には、限定されるわけではないが、グラニセトロンＨＣｌなどの補助剤（ａｄｊｕｎｃｔｓ）、酢酸ロイプロリドなどのアンドロゲン阻害剤、ドキソルビシンなどの抗生物質、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、インターフェロン・アルファ−２ａなどの代謝拮抗剤、タキソールなどの細胞傷害性剤、ｒａｓファルネシル・トランスフェラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤、アルデスロイキンなどの免疫調節剤、およびメルファランＨＣｌなどのナイトロジェンマスタード誘導体等が含まれる。
【００７１】
［９３］抗癌効力を改善するために、ＥＭ１６４と組み合わせることも可能な療法剤には、腫瘍学治療に用いられる多様な剤が含まれ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、エポチロン、並びに細胞傷害性薬剤および細胞表面受容体に対する抗体のコンジュゲートがある。好ましい療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００７２】
［９４］１以上のさらなる療法剤を、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートの前に、これらと同時に、またはこれらの後に投与することも可能である。当業者は、各療法剤に関して、投与の特定の順番に利点がありうることを理解するであろう。同様に、当業者は、各療法剤に関して、剤、および本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートを投与する間の時間の長さが、多様であろうことを理解するであろう。
【００７３】
［９５］当業者は、各療法剤の投薬量が、剤の独自性に応じることを理解するであろうが、好ましい投薬量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲であることも可能である。白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン）などの好ましい剤に関しては、好ましい投薬量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約４００ｍｇ／平方メートルであり、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）に関しては、好ましい投薬量は、約２０ｍｇ／平方メートル〜約１５０ｍｇ／平方メートルであり、ゲムシタビンに関しては、好ましい投薬量は、約１００ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルであり、そしてカンプトテシンに関しては、好ましい投薬量は、約５０ｍｇ／平方メートル〜約３５０ｍｇ／平方メートルである。これらおよび他の療法剤の投薬量は、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートが、療法剤と同時にまたは連続して投与されるかどうかに応じる可能性もある。
【００７４】
［９６］本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および１以上のさらなる療法剤の投与は、同時投与されるかまたは連続投与されるかいずれであっても、療法適用に関して、上述するように行うことも可能である。同時投与に適した薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤、および賦形剤は、同時投与される特定の療法剤の独自性に応じることが、当業者に理解されるであろう。
【００７５】
［９７］凍結乾燥型でなく、水性投薬型で存在する場合、抗体は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で配合されるであろうが、これらの範囲外の広い変動が許容される。疾患治療のため、抗体またはコンジュゲートの適切な投薬量は、上に定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または療法目的で投与されるかどうか、以前の療法の経過、患者の病歴および抗体に対する応答、並びに主治医の自由裁量に応じるであろう。抗体を一度にまたは一連の治療に渡って、患者に適切に投与する。
【００７６】
［９８］疾患の種類および重症度に応じて、例えば１以上の別個の投与によるか、または連続注入によるかいずれであっても、好ましくは約１ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの抗体が、患者に投与する、最初の候補投薬量であり、より好ましくは、１もしくはそれより多くの分散投与（separate administration）または連続注入のいずれかによる約１０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの抗体である。数日以上に渡る反復投与では、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、治療を反復する。しかし、他の投薬措置が有用である可能性もあり、そしてこれらも排除されない。
【００７７】
［９９］本発明にはまた、本明細書記載の要素の１以上、およびこれらの要素を使用するための使用説明書を含むキットも含まれる。好ましい態様において、本発明のキットには、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤が含まれる。この好ましい態様の使用説明書には、本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて癌細胞の増殖を阻害するための使用説明書、並びに／あるいは本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲート、および療法剤を用いて、癌を有する患者を治療する方法のための使用説明書が含まれる。
【００７８】
［１００］好ましくは、キットに用いられる抗体は、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有するか、または抗体はエピトープ結合性断片であり、抗体および断片はどちらも、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する。キット中で用いられる抗体および抗体断片はまた、ＥＭ１６４抗体の表面再構成バージョン、ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョン、あるいは少なくとも１つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を有する、ＥＭ１６４抗体の改変されたバージョンであることも可能である。これらの３つのバージョンの抗体および抗体断片は、ＥＭ１６４抗体と同じ結合特異性を保持する。
【００７９】
［１０１］好ましくは、キットに用いられる療法剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される。より好ましくは、療法剤は、白金剤（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００８０】
［１０２］本発明のキットの要素は、キットに適した形であり、例えば溶液または凍結乾燥粉末である。キットの要素の濃度または量は、キットの各要素の同一性および意図される使用に応じて多様であることが、当業者には理解されるであろう。
【００８１】
［１０３］キットの使用説明書に言及される癌およびそれに由来する細胞には、乳癌、結腸癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫が含まれる。
【実施例】
【００８２】
実施例
［１０４］本発明は、ここで、以下の実施例に言及することによって記載されるが、実施例は例示でしかなく、そして本発明を限定することは意図されない。
【００８３】
（実施例１）
ネズミＥＭ１６４抗体
［１０５］この第一の実施例において、本発明のネズミ抗体の完全一次アミノ酸構造およびｃＤＮＡ配列、並びにその結合特性および組換え型でのその発現手段を開示する。したがって、免疫学的技術分野の一般の当業者が、過度な実験を伴わずに前記抗体を調製可能であるように、本発明の抗体およびその調製法の完全な開示を提供する。
【００８４】
Ａ． 抗ＩＧＦ−Ｉ受容体モノクローナル抗体ハイブリドーマの生成
［１０６］多数のＩＧＦ−Ｉ受容体（細胞あたり〜１０７）を発現するため、Ｙ１２５１Ｆ突然変異を持つヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する細胞株を免疫に用いた。ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞質ドメインにおけるＹ１２５１Ｆ突然変異によって、トランスフォーメーションおよび抗アポトーシス・シグナル伝達の欠失が生じたが、ＩＧＦ−Ｉ結合、およびＩＧＦ−Ｉが刺激する分裂促進シグナル伝達には影響はなかった（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ．ら， １９９７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ４２７−４３５；Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。本実施例の抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインに結合し、これはＹ１２５１Ｆ突然変異体および野生型受容体の両方で同一であったため、この突然変異は、その他の点では、抗体生成に影響を及ぼさなかった。
【００８５】
［１０７］Ｙ１２５１Ｆ突然変異体ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子と一緒にピューロマイシン抵抗性遺伝子をトランスフェクションすることによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体欠損マウスの３Ｔ３様細胞から、Ｙ１２５１Ｆ突然変異を含むヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する細胞株を生成し、そしてピューロマイシン（２．５マイクログラム／ｍｌ）を用いて、そして高ＩＧＦ−Ｉ受容体発現に関するＦＡＣＳ分取によって、選択した（Ｍｉｕｒａ， Ｍ．ら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２２６３９−２２６４４）。大部分の細胞には毒性である、２５マイクログラム／ｍｌなどの高濃度のピューロマイシンを用いて、高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体発現を有する細胞株をさらに選択した。生存コロニーを摘み取り、そして高レベルのＩＧＦ−Ｉ受容体発現を示すものを選択した。
【００８６】
［１０８］Ｙ１２５１Ｆ突然変異体ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞（５ｘ１０５細胞、０．２ｍｌのＰＢＳに懸濁）で、第０日に、６ヶ月齢のＣＡＦ１／Ｊメスマウスを腹腔内経路で免疫した。０．２ｍｌの細胞懸濁物を用いて動物に以下のように追加免疫した：第２日、１ｘ１０６細胞；第５日、２ｘ１０６細胞；第７日、第９日、第１２日、および第２３日、１ｘ１０７細胞。第２６日にマウスを屠殺し、そして脾臓を取り除いた。
【００８７】
［１０９］２枚のすりガラス・スライド間で脾臓をすりつぶして、単細胞懸濁物を得て、これを、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する血清不含ＲＰＭＩ培地（ＳＦＭ）で洗浄した。脾臓細胞ペレットを１０ｍｌの水中の０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム溶液に、氷上で１０分間再懸濁して、赤血球細胞を溶解し、そして次いで、血清不含培地（ＳＦＭ）で洗浄した。脾臓細胞（１．２ｘ１０８）を、非分泌性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル；カタログ番号ＣＲＬ１５８０）由来の骨髄腫細胞（４ｘ１０７）と一緒に、試験管中でプールし、そして血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＦＭ）で洗浄した。上清を取り除いて、そして細胞ペレットを残った培地に再懸濁した。試験管を３７℃の水の入ったビーカーに入れ、そして穏やかに振盪しながら、１．５ｍｌのポリエチレングリコール溶液（７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中、５０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）、平均分子量１５００）を滴下速度０．５ｍｌ／分で、ゆっくりと添加した。１分間待った後、１０ｍｌのＳＦＭを以下のように添加した：最初の１分間に渡って１ｍｌ、次の１分間に渡って２ｍｌ、そして次の１分間に渡って７ｍｌ。次いで、さらに１０ｍｌを１分間に渡ってゆっくりと添加した。遠心分離によって細胞をペレットにし、ＳＦＭで洗浄し、そして５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ハイブリドーマ・クローニング上清（ＨＣＳ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０増殖培地に再懸濁した。ウェルあたり２００μｌ中、２ｘ１０５脾臓細胞で、細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに植え付けた。５〜７日後、ウェルあたり１００μｌを取り除き、そしてヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）および５％ＦＢＳを補った増殖培地で置き換えた。免疫およびハイブリドーマ産生に用いた一般的な条件は、Ｊ． ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ． Ｖｕｎａｋｉｓ（監修， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １２１， “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＰａｒｔＩ”；１９８６；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，フロリダ）、並びにＥ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９８８；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載される。当業者に周知であるように、免疫およびハイブリドーマ産生の他の技術もまた使用可能である。
【００８８】
［１１０］以下に記載するように、ＥＬＩＳＡによって精製ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合に関して、そして、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニングによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞に対する特異的結合に関して、およびヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対する結合の欠如に関して、ハイブリドーマ・クローン由来の培養上清をスクリーニングした。ヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対するよりも、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞に、より高い結合親和性を示すクローンを増殖させ、そしてサブクローニングした。上記結合アッセイによって、サブクローンの培養上清をさらにスクリーニングした。この方法によって、サブクローン３Ｆ１−Ｃ８−Ｄ７（ＥＭ１６４）を選択し、そして以下に記載するように、重鎖および軽鎖遺伝子をクローニングし、そして配列決定した。
【００８９】
［１１１］以下の方法によって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合に関して、ハイブリドーマ・クローンからの上清のスクリーニングに使用するため、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を単離した。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、またはＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンなどのビオチン化試薬を用いて、組換えＩＧＦ−Ｉを修飾することによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを調製した。ビオチン化ＩＧＦ−Ｉをストレプトアビジン−アガロースビーズ上に吸収させ、そしてヒト野生型またはＹ１２５１Ｆ突然変異体ＩＧＦＲを過剰発現する細胞由来の溶解物とインキュベーションした。ビーズを洗浄し、そして２〜４Ｍ尿素およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはオクチル−β−グルコシドなどの界面活性剤を含有する緩衝液を用いて溶出した。溶出したＩＧＦ−Ｉ受容体をＰＢＳに対して透析し、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度に関して分析すると、それぞれ約１３５ｋＤａおよび９５ｋＤａの分子量のＩＧＦ−Ｉ受容体のアルファ鎖およびベータ鎖のバンドが示された。
【００９０】
［１１２］精製ＩＧＦ−Ｉ受容体に対するハイブリドーマ上清の結合に関してチェックするため、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４ＨＢ ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を精製ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体試料（アフィニティー精製試料の尿素／オクチル−β−グルコシド溶出からの透析によって調製したもの）でコーティングし、ｐＨ９．５の５０ｍＭ ＣＨＥＳ緩衝液で希釈した（１００μｌ；４℃、一晩）。２００μｌのブロッキング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ−Ｔ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）でウェルをブロッキングし、そしてハイブリドーマ・クローン由来の上清（１００μｌ；ブロッキング緩衝液で希釈）と約１時間〜１２時間インキュベーションし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．８μｇ／ｍｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した（０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．２中、０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ、０．０３％Ｈ２Ｏ２）。典型的には、３Ｆ１ハイブリドーマ・サブクローン由来の上清は、発色３分以内に、約１．２吸光単位のシグナルを生じ、これはいくつかの他のハイブリドーマ・クローンからの上清に関して得られた０．０の値とは対照的であった。このＥＬＩＳＡの一般的な条件は、Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９９９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載されるような抗体結合および検出のための標準的ＥＬＩＳＡ条件と同様であり、この条件もまた、使用可能である。
【００９１】
［１１３］ヒトＹ１２５１Ｆ−ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞株に対して、そしてヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞株に対して、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、そしてヒト・インスリン受容体に特異的に結合しないハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。どちらの細胞株もＩＧＦ−Ｉ受容体欠損マウスの３Ｔ３様細胞から生成した。迅速なトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって、組織培養フラスコから、ＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞およびインスリン受容体過剰発現細胞を別個に採取し、１０％ＦＢＳを含有する増殖培地に懸濁し、遠心分離によってペレットにし、そしてＰＢＳで洗浄した。植物性血球凝集素（phytohemagglutinin）（２０μｇ／ｍｌ ＰＨＡの１００μｌ）でコーティングしたＩｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレートのウェルに、洗浄した細胞（約１〜３ｘ１０６細胞／ｍｌの１００μｌ）を添加し、遠心分離し、そしてＰＨＡでコーティングしたウェルに１０分間接着させた。細胞を含むプレートを軽く叩いてＰＢＳを取り除き、そして次いで３７℃で一晩乾燥させた。ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液で、ウェルを３７℃で１時間ブロッキングし、そして次いで、ＰＢＳで穏やかに洗浄した。次いで、ＩＧＦ−Ｉ受容体過剰発現細胞を含有するウェル、およびインスリン受容体過剰発現細胞を含有するウェルに、ハイブリドーマ・クローンからの上清のアリコット（１００μｌ；ブロッキング緩衝液で希釈）を添加し、そして周囲温度で１時間インキュベーションした。ＰＢＳでウェルを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．８μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベーションし、その後、洗浄し、そして次いでＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて結合を検出した。典型的には、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して、３Ｆ１ハイブリドーマ・サブクローンからの上清は、発色１２分以内に、０．８８吸光単位のシグナルを生じ、これはヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して得られた０．２２吸光単位の値とは対照的であった。
【００９２】
［１１４］製造者の指定にしたがって、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ３５０フラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州）中でハイブリドーマを増殖させて、精製ＥＭ１６４抗体を提供した。抗体標準を用いた、ＥＬＩＳＡによる、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色による定量化に基づいて、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコから採取した上清中、約０．５〜１ｍｇ／ｍｌの収量の抗体を得た。３Ｍ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．９で装填および洗浄し、その後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭ酢酸溶液で溶出する、標準的精製条件下で、プロテインＡ−アガロースビーズ・カラム上のアフィニティー・クロマトグラフィーによって、抗体を精製した。抗体を含有する溶出分画を、冷２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４溶液で中和し、そしてＰＢＳ中、４℃で透析した。２８０ｎｍの吸光度を測定することによって抗体濃度を決定した（消光係数＝１．４ｍｇ−１ｍｌｃｍ−１）。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって、精製抗体試料を分析すると、それぞれ約５５ｋＤａおよび２５ｋＤａの抗体重鎖および軽鎖のバンドのみが示された。精製抗体のアイソタイプは、カッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１であった。
【００９３】
Ｂ． ＥＭ１６４抗体の結合特性
［１１５］ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞を用い、そしてヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞を用いた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、精製ＥＭ１６４抗体の特異的結合を立証した（図１）。丸底９６ウェルプレート中、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞を用い、そしてインスリン受容体を過剰発現する細胞を用いて（２ｘ１０５細胞／ｍｌ）、１００μｌ冷ＦＡＣＳ緩衝液（ダルベッコのＭＥＭ培地中の１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中でＥＭ１６４抗体（５０〜１００ｎＭ）を１時間インキュベーションした。遠心分離によって細胞をペレットにし、そしてそっと叩くことによって冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＦＩＴＣコンジュゲート（１００μｌ；ＦＡＣＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌ）と氷上で１時間インキュベーションした。細胞をペレットにし、洗浄し、そしてＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド溶液１２０μｌに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ読取装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、プレートを分析した。
【００９４】
［１１６］ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞をＥＭ１６４抗体とインキュベーションすると、強い蛍光シフトが得られたが、これはインスリン受容体を過剰発現する細胞をＥＭ１６４抗体とインキュベーションした際の有意でないシフトとは対照的であり（図１）、これによって、ＥＭ１６４抗体が、ＩＧＦ−Ｉ受容体への結合において、選択的であり、そしてインスリン受容体に結合しないことが立証された。対照抗体、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体１Ｈ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗インスリン受容体アルファ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、それぞれ、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞およびインスリン受容体を過剰発現する細胞とのインキュベーションに際して、蛍光シフトを生じた（図１）。ＥＭ１６４抗体、およびＩＧＦ−Ｉ受容体を発現するヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を用いたＦＡＣＳアッセイによってもまた、強い蛍光シフトが観察され（Ｄｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１）、これによってＥＭ１６４抗体が、ヒト腫瘍細胞表面上のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に結合することが示された。
【００９５】
［１１７］直接コーティングされたＩＧＦ−Ｉ受容体（上述のように、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用いてアフィニティー精製したもの）または間接的に捕捉されるビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体いずれかを用いて、いくつかの濃度で抗体の結合をＥＬＩＳＡ滴定することによって、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体とＥＭ１６４抗体の結合に関する解離定数（Ｋｄ）を決定した。ＰＥＯ−マレイミド−ビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、界面活性剤で可溶化した、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞由来の溶解物をビオチン化することによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を調製し、ＮＨＳ−アガロースビーズ上に固定した抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体を用いて、これをアフィニティー精製し、そしてＮＰ−４０界面活性剤を含有する緩衝液中の２〜４Ｍ尿素で溶出し、そしてＰＢＳ中で透析した。
【００９６】
［１１８］Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢプレートを炭酸緩衝液（１５０ｍＭ炭酸ナトリウム、３５０ｍＭ重炭酸ナトリウム）中の１μｇ／ｍｌストレプトアビジン１００μｌで、４℃で一晩コーティングすることによって、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体とＥＭ１６４抗体の結合に関するＫｄを決定した。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルを、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）でブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体（１０〜１００ｎｇ）と周囲温度で４時間インキュベーションした。次いで、間接的に捕捉されたビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中、いくつかの濃度（５．１ｘ１０−１３Ｍ〜２００ｎＭ）のＥＭ１６４抗体と周囲温度で２時間インキュベーションし、そして次いで４℃で一晩インキュベーションした。次に、ウェルをＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧＨ＋Ｌ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、０．５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した。一部位結合に関して、非線形回帰によって、Ｋｄ値を概算した。
【００９７】
［１１９］Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ（“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９９９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク）に記載されるように、抗体のパパイン消化によって調製された、ＥＭ１６４抗体のＦａｂ断片を用いて、同様の結合滴定を行った。
【００９８】
［１２０］ビオチン化ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体へのＥＭ１６４抗体の結合に関する結合滴定曲線は、０．１ｎＭのＫｄ値を生じた（図２）。ＥＭ１６４抗体のＦａｂ断片もまた、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に非常に緊密に結合し、Ｋｄ値は０．３ｎＭであり、これによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体へのＥＭ１６４抗体の単量体結合もまた、非常に強いことが示された。
【００９９】
［１２１］ＥＭ１６４抗体によるＩＧＦ−Ｉ受容体の結合に関する解離定数がこのように極端に低い値であるのは、固定ＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した抗体を１〜２日間、長く洗浄した後に、強い結合シグナルが観察されることによって確証されるように、部分的に、ｋｏｆｆ速度が非常に遅いためであった。
【０１００】
［１２２］プロテインＧ−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）上に固定されたＥＭ１６４抗体と、界面活性剤で可溶化されたヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の溶解物をインキュベーションすることによって立証されるように、ＥＭ１６４抗体をＩＧＦ−Ｉ受容体の免疫沈降に用いることも可能である。ウサギ・ポリクローナル抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖（Ｃ末端）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用い、次いで洗浄し、そして増進化学発光（ＥＣＬ）検出を行って、ＥＭ１６４抗体免疫沈降物のウェスタンブロットを検出した。ＭＣＦ−７細胞からのＥＭ１６４免疫沈降物のウェスタンブロットは、約９５ｋＤａのＩＧＦ−Ｉ受容体のベータ鎖および約２２０ｋＤａのプロ−ＩＧＦ−Ｉ受容体に対応するバンドを示した。他の細胞種に関して、同様の免疫沈降を行って、ＥＭ１６４抗体結合の種特異性をチェックしたところ、ｃｏｓ−７細胞（アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ））由来のＩＧＦ−Ｉ受容体にはやはり結合したが、３Ｔ３細胞（マウス）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター）またはヤギ線維芽細胞（ヤギ）のＩＧＦ−Ｉ受容体には結合しなかった。ＥＭ１６４抗体は、ＭＣＦ−７細胞由来の溶解物のウェスタンブロットにおいて、ＳＤＳ変性ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を検出せず、これによってＥＭ１６４抗体が、天然の非変性ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のコンホメーション・エピトープに結合することが示された。
【０１０１】
［１２３］Ｌ１ドメインおよびＬ２ドメインに隣接するシステインリッチ・ドメイン（残基１〜４６８）を含み、これに１６量体Ｃ末端ピース（残基７０４〜７１９）が融合し、そしてＣ末端エピトープタグで終わる、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）アルファ鎖構築物を用いて、ＥＭ１６４抗体の結合ドメインをさらに性質決定した。残基４６９〜７０３を欠く、このより小さいＩＧＦ−Ｉ受容体は、天然全長ＩＧＦ−Ｉ受容体に比較して、より緊密ではないが、ＩＧＦ−Ｉに結合すると報告されている（Ｍｏｌｉｎａ， Ｌ．ら， ２０００， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４６７， ２２６−２３０；Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｃ．ら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ３７２５１−３７３５６）。したがって、残基１〜４６８を含み、これに残基７０４〜７１９のＣ末端ピースが融合して、そしてＣ末端ｍｙｃエピトープタグが隣接する、一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖構築物を調製した。この構築物を発現する安定細胞株、そしてまたヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞中で該構築物を一過性に発現する細胞株を構築した。この一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖構築物に対して、ＥＭ１６４抗体が強く結合することが観察された。試験した２つの抗体のうち、ＩＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）もまた、この一部切除アルファ鎖に結合したが、１Ｈ７抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は結合せず、これによって、ＥＭ１６４抗体のエピトープが、１Ｈ７抗体のエピトープとは明らかに別個であることが示された。
【０１０２】
Ｃ． ＭＣＦ−７細胞に対するＩＧＦ−１結合の、ＥＭ１６４抗体による阻害
［１２４］ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に対するＩＧＦ−Ｉの結合は、ＥＭ１６４抗体によって阻害された（図３）。ＭＣＦ−７細胞を、血清不含培地中、５μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体を伴いまたは伴わずに２時間インキュベーションし、その後、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＧＦ−Ｉと３７℃で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞を血清不含培地で２回洗浄して、未結合ビオチン−ＩＧＦ−Ｉを取り除き、そして次いで、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に溶解した。マウス・モノクローナル抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体でＩｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢ ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、そしてこれを、溶解物からＩＧＦ−Ｉ受容体および結合したビオチン−ＩＧＦ−Ｉを捕捉するのに用いた。ＩＧＦ−Ｉ受容体のベータ鎖の細胞質Ｃ末端ドメインに、コーティングされた抗体が結合しても、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインへのビオチン−ＩＧＦ−Ｉの結合には干渉しなかった。ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートとインキュベーションし、再び洗浄し、そして次いでＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて検出した。５μｇ／ｍｌ ＥＭ１６４抗体による、ＭＣＦ−７細胞へのＩＧＦ−Ｉ結合の阻害は、本質的に定量的であり、そしてビオチン−ＩＧＦ−Ｉを欠く対照を用いて得たＥＬＩＳＡバックグラウンドのものとほぼ同等であった。
【０１０３】
［１２５］ＥＭ１６４抗体による、ＭＣＦ−７細胞へのＩＧＦ−Ｉ結合の阻害に関する上述のアッセイに加えて、以下のアッセイによって、ＥＭ１６４抗体が、結合したＩＧＦ−ＩをＭＣＦ−７細胞から置換する（ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）のに非常に有効であることが立証され、これは生理学的条件下で、アンタゴニスト性抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が、結合した内因性生理学的リガンド（ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩなど）を置換するのが望ましいことに適っている。このＩＧＦ−Ｉ置換アッセイにおいて、１２ウェルプレート中で増殖させたＭＣＦ−７細胞を血清枯渇させ、そして次いで血清不含培地中、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ（２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）と３７℃（または４℃）で１〜２時間インキュベーションした。次いで、結合したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを伴う細胞を、ＥＭ１６４抗体または対照抗体（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で、３７℃（または４℃）で３０分間〜４時間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１％ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液中、４℃で溶解した。上述のようにＥＬＩＳＡを行って、溶解物からＩＧＦ−Ｉ受容体を捕捉し、そして次いで、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用いて、受容体に結合したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを検出した。このＥＬＩＳＡによって、ＥＭ１６４抗体が、先に結合していたビオチン化ＩＧＦ−Ｉを細胞から、３７℃ではほぼ完全に（３０分以内に９０％、そして４時間以内に〜１００％）、そして４℃２時間では約５０％、置換可能であることが立証された。別の実験において、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞をビオチン−ＩＧＦ−Ｉとインキュベーションし、次いで洗浄し、そしてＥＭ１６４抗体と４℃で２時間インキュベーションすると、結合したビオチン−ＩＧＦ−Ｉが８０％減少した。したがって、ＥＭ１６４抗体は、先に結合していたＩＧＦ−Ｉを癌細胞から置換するのに非常に有効であり、このことは、結合した内因性生理学的リガンドを置換することによって、ＩＧＦ−Ｉ受容体に拮抗するために、療法的に重要であろう。
【０１０４】
［１２６］ＥＭ１６４抗体とＭＣＦ−７細胞を４℃で２時間（または３７℃で３０分間）インキュベーションすると、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｓｃ−７１３）を用いたウェスタンブロット分析に基づいて、ＩＧＦ−Ｉ受容体の有意な下方制御が生じなかったが、ＥＭ１６４抗体とより長い時間、３７℃で２時間インキュベーションすると、ＩＧＦ−Ｉ受容体の２５％の下方制御が生じた。したがって、この短時間の実験において、４℃および３７℃両方で、ＥＭ１６４抗体によって、ＩＧＦ−Ｉ結合が阻害され、そして結合したＩＧＦ−Ｉが置換されたのは、ＥＭ１６４抗体の結合による受容体の下方制御では説明不能である。ＥＭ１６４抗体によって、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への結合が強力に阻害され、そして先に結合していたＩＧＦ−Ｉが置換される機構は、結合部位の共有を通じてか、または立体的閉鎖（ｓｔｅｒｉｃ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を通じてか、またはアロステリック効果を通じてかのいずれかで、結合に関して競合することである可能性がある。
【０１０５】
Ｄ． ＥＭ１６４抗体による、ＩＧＦ−Ｉ受容体が仲介する細胞シグナル伝達の阻害
［１２７］乳癌ＭＣＦ−７細胞および骨肉腫ＳａＯＳ−２細胞をＥＭ１６４抗体で処理すると、ＩＧＦ−Ｉ受容体自己リン酸化の阻害によって、そしてインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）、ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２などの下流エフェクターのリン酸化の阻害によって示されるように、細胞内ＩＧＦ−Ｉ受容体シグナル伝達がほぼ完全に阻害された（図４〜６）。
【０１０６】
［１２８］図４において、ＭＣＦ−７細胞を、標準的な培地中、１２ウェルプレート中で３日間増殖させ、そして次いで、血清不含培地中、２０μｇ／ｍｌ ＥＭ１６４抗体（または抗Ｂ４対照抗体）で３時間処理し、次いで５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで、３７℃で２０分間刺激した。次いで、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有する氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭロイペプチン、５μＭペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、および５μｇ／ｍｌアプロチニン）中で細胞を溶解した。抗ＩＧＦ−Ｉ受容体ベータ鎖Ｃ末端モノクローナル抗体ＴＣ１２３でＥＬＩＳＡプレートをあらかじめコーティングし、そして溶解物試料と周囲温度で５時間インキュベーションして、ＩＧＦ−Ｉ受容体を捕捉した。次いで、捕捉したＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そしてビオチン化抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０；０．２５μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、そしてストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（０．８μｇ／ｍｌ）と３０分間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質で検出した。対照抗Ｂ４抗体を用いると、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化の阻害は示されなかった。対照的に、ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化が完全に阻害された（図４）。
【０１０７】
［１２９］インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）のリン酸化の阻害を立証するため、固定抗ＩＲＳ−１抗体を用いて溶解物からＩＲＳ−１を捕捉するＥＬＩＳＡを用い、次いで、リン酸化ＩＲＳ−１に結合する、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）の会合したｐ８５サブユニットを測定した（Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｊ．Ｇ．ら， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ９９９４−１０００３）。図５において、ＭＣＦ−７細胞を、血清不含培地中の５μｇ／ｍｌ抗体（ＥＭ１６４またはＩＲ３）で２時間処理し、次いで５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで、３７℃で１０分間刺激した。コーティングしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベーションすることによって、抗ＩＲＳ−１抗体（ウサギ・ポリクローナル；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を間接的に捕捉し、これを次いで、４℃で一晩インキュベーションすることによって、細胞溶解物試料からＩＲＳ−１を捕捉するのに用いた。次いで、ウェルをマウス・モノクローナル抗ｐ８５−ＰＩ−３キナーゼ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４時間インキュベーションし、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲートで３０分間処理した。次いでウェルを洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて検出した（図５）。図５に示すように、ＥＭ１６４抗体は、ＩＲ３抗体よりも、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＲＳ−１リン酸化を阻害するのにより有効であり、そしてＩＧＦ−Ｉの非存在下で、ＥＭ１６４抗体を細胞とインキュベーションした際に、ＥＭ１６４抗体は、ＩＲＳ−１リン酸化に対していかなるアゴニスト活性も示さなかった。
【０１０８】
［１３０］ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２などの他の下流エフェクターの活性化もまた、溶解物のウェスタンブロットおよびリン酸化特異的抗体（ウサギ・ポリクローナル抗ホスホＳｅｒ４７３ Ａｋｔポリクローナル抗体および抗ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて示されるように、ＳａＯＳ−２細胞（図６）において、およびＭＣＦ−７細胞において、用量依存方式で、ＥＭ１６４抗体に阻害された。汎ＥＲＫ抗体によって、すべてのレーンに等量のタンパク質が装填されたことが立証された（図６）。ＥＭ１６４抗体でＳａＯＳ−２細胞を処理すると、ＥＧＦが刺激するＥｒｋ１／２のリン酸化は阻害されず、したがって、ＥＭ１６４抗体によるＩＧＦ受容体シグナル伝達経路の阻害が特異的であることが立証された。
【０１０９】
Ｅ． ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよび血清が刺激するヒト腫瘍細胞の増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害
［１３１］ＩＧＦ−Ｉに対する増殖反応および生存反応に関して、血清不含条件下で、いくつかのヒト腫瘍細胞株を試験した。これらの細胞株を、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、または血清の存在下、ＥＭ１６４抗体で処理し、そして２〜４日後、ＭＴＴアッセイを用いて、増殖反応および生存反応を測定した。血清を含む標準的な培地中、９６ウェルプレート中で、およそ１５００細胞をプレーティングし、翌日、培地を血清不含培地と交換した（トランスフェリンおよびＢＳＡを補った血清不含ＲＰＭＩ培地、またはＤｕｆｏｕｒｎｙ， Ｂ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３１１６３−３１１７１に特定されるようなフェノールレッド不含培地）。血清不含培地中で１日増殖させた後、約７５μｌの１０μｇ／ｍｌ抗体と細胞を３０分間〜３時間インキュベーションし、その後、２５μｌのＩＧＦ−Ｉ（またはＩＧＦ−ＩＩまたは血清）溶液を添加して、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ、または２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−ＩＩ、または０．０４〜１０％血清の最終濃度にした。いくつかの実験では、ＥＭ１６４抗体を添加する前に、細胞をまず、ＩＧＦ−Ｉで１５分間刺激するか、またはＩＧＦ−ＩおよびＥＭ１６４抗体の両方を一緒に添加した。次いで、細胞をさらに２〜３日間増殖させた。次いで、ＭＴＴ（３−（４，５）−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；２５μｌのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ溶液）を添加し、そして細胞を２〜３時間、インキュベーターに戻した。次いで培地を取り除き、そして１００μｌ ＤＭＳＯと交換し、混合し、そしてプレートの吸光度を５４５ｎｍで測定した。いくつかのヒト腫瘍細胞株は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩまたは血清を添加すると、増殖反応および生存反応を示し、これはＥＭ１６４抗体によって有意に阻害され、この阻害には、抗体をＩＧＦ−Ｉの前に添加するか、またはＩＧＦ−Ｉを抗体の前に添加するか、またはＩＧＦ−Ｉおよび抗体を一緒に添加するかどうかは関わりなかった（表１）。
【０１１０】
表１． ＩＧＦ−Ｉが刺激する腫瘍細胞の増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
ａ５〜１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体を含有する血清不含培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉに反応した細胞の３〜４日間の増殖／生存のＭＴＴアッセイ。
ｂ対照（血清を含むが抗体を含まないもの）との比較に基づいた、ＭＴＴアッセイまたはコロニー形成アッセイによる、５〜１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体の存在下の１．２５〜１０％血清中の細胞増殖の阻害；細胞による自己分泌／パラ分泌ＩＧＦ刺激を計上するため、対照（血清を含まないが抗体を含むもの、および血清を含むが抗体を含まないもの）に基づいて、ＭＣＦ−７細胞、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に関して、阻害の度合いを定量的に測定した。ＮＤは、データがないか、または染色が困難であるため、データが劣っていることを示す。
［１３２］ＥＭ１６４抗体は、ＩＧＦ−Ｉまたは血清が刺激する、乳癌ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を強く阻害した（図７および図８）。別の実験において、ＥＭ１６４抗体は、ＩＧＦ−ＩＩが刺激する、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を強く阻害した。ＩＲ３抗体などの商業的に入手可能な抗体を用いた先の報告では、血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を、こうした抗体が弱くしか阻害しないことが示されており、これは、ＩＲ３および１Ｈ７抗体に関して、図７で確認したとおりである（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｋ．Ｊ．ら， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０， ４８−５３）。対照的に、ＥＭ１６４抗体は、血清またはＩＧＦが刺激するＭＣＦ−７細胞の強力な阻害剤であった。図８に示すように、ＥＭ１６４抗体は、広い範囲の血清濃度（０．０４〜１０％血清）に渡って、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存を阻害するのに同等に有効である。
【０１１３】
［１３３］細胞を計数することによって、ＥＭ１６４抗体によるＭＣＦ−７細胞の増殖阻害を測定した。したがって、１２ウェルプレートにおいて、１０μｇ／ｍｌのＥＭ１６４抗体の存在下または非存在下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に、約７５００の細胞をプレーティングした。増殖５日後、未処理対照試料の細胞数は２０．５ｘ１０４細胞であり、対照的に、ＥＭ１６４抗体で処理した試料では、わずか１．７ｘ１０４細胞であった。ＥＭ１６４抗体で処理すると、５日間で、ＭＣＦ−７細胞の増殖は、約１２倍まで阻害された。ＥＭ１６４抗体によるこの阻害は、ＭＣＦ−７細胞の６日間のアッセイにおいて、ＩＲ３抗体を用いて報告された２．５倍の阻害より有意に高かった（Ｒｏｈｌｉｋ， Ｑ．Ｔ．ら， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４９， ２７６−２８１）。
【０１１４】
［１３４］ＩＧＦ−Ｉおよび血清が刺激する、非小細胞肺癌株ＮＣＩ−Ｈ８３８の増殖および生存もまた、対照抗Ｂ４抗体に比較して、ＥＭ１６４抗体によって、強く阻害された（図９）。血清不含培地において、ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方に関して、未処理試料より小さいシグナルが生じ、これはおそらく、ＥＭ１６４抗体が、これらの細胞の自己分泌およびパラ分泌ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ刺激も阻害したためであろう（図７および図９）。ＥＭ１６４抗体で処理すると、ＨＴ２９結腸癌細胞のコロニーサイズもまた、非常に減少した。
【０１１５】
［１３５］ＥＭ１６４抗体は、したがって、ＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ−Ｈ８３８細胞などの腫瘍細胞の、血清が刺激する増殖を８０％を超えて阻害するのに有効である点で、すべての既知の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の中でもユニークである。
【０１１６】
［１３６］ＥＭ１６４抗体は、細胞周期のＧ０／Ｇ１期で細胞増殖停止を引き起こし、そしてＩＧＦ−Ｉの分裂促進効果を無効にした。細胞周期解析のため、ＭＣＦ−７細胞を、ＥＭ１６４（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、ＩＧＦ−Ｉ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１日間処理し、そして次いでヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって分析した。図２５に示すように、ＥＭ１６４の非存在下、ＩＧＦ−Ｉ刺激に反応した細胞のサイクリング（細胞の４１％がＳ期にあり、そして５０％がＧ０／Ｇ１期にあった）は、ＥＭ１６４処理細胞で抑制された（細胞の９％のみがＳ期にあり、そして７７％がＧ０／Ｇ１期にあった）。
【０１１７】
［１３７］細胞増殖の阻害に加えて、ＥＭ１６４抗体処理によって、細胞のアポトーシスが生じた。アポトーシス測定のため、ＥＭ１６４の存在下または非存在下、ＩＧＦ−Ｉまたは血清と１日間インキュベーションしたＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞において、カスパーゼによるサイトケラチンＣＫ１８タンパク質の切断を測定した（図２６）。ＥＭ１６４の非存在下、ＩＧＦ−Ｉまたは血清を添加すると、ＩＧＦ−Ｉがない対照に比較して、カスパーゼ切断されたＣＫ１８のシグナルはより低く、ＩＧＦ−Ｉおよび血清が、カスパーゼの活性化を妨げることが示された。ＥＭ１６４の非存在下よりＥＭ１６４の存在下で得られる切断ＣＫ１８のレベルがより大きいことから示されるように、ＥＭ１６４で処理すると、ＩＧＦ−Ｉおよび血清の抗アポトーシス効果が抑制された。
【０１１８】
Ｆ．他の細胞傷害性剤および細胞分裂停止剤と併用した、ＥＭ１６４抗体による、ヒト腫瘍細胞増殖および生存の相乗的阻害
［１３８］タキソールとＥＭ１６４抗体を併用投与すると、タキソール単独よりも、非小細胞肺癌Ｃａｌｕ６細胞の増殖および生存に、有意により阻害性になった。同様に、カンプトテシンとＥＭ１６４抗体を併用すると、結腸癌ＨＴ２９細胞の増殖および生存に対して、カンプトテシン単独よりも、有意により阻害性になった。ＥＭ１６４抗体単独では、有機化学毒性薬剤と同程度に細胞に毒性であるとは期待されないことから、ＥＭ１６４抗体の主に細胞分裂停止効果および化学毒性薬剤の細胞傷害性効果の間の相乗作用は、臨床設定における併用癌療法において、非常に有効でありうる。
【０１１９】
［１３９］ＥＭ１６４抗体と抗ＥＧＦ受容体抗体（ＫＳ７７）の併用効果は、ＨＴ−３細胞、ＲＤ細胞、ＭＣＦ−７細胞、およびＡ４３１細胞などのいくつかの腫瘍細胞株の増殖および生存に対して、ＥＭ１６４抗体またはＫＳ７７抗体単独のいずれより、有意により阻害性であった。したがって、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびＥＧＦ受容体などの２つの増殖因子受容体の中和抗体を併用した相乗効果もまた、臨床的癌治療に有用でありうる。
【０１２０】
［１４０］表１に示すような多様なヒト癌細胞株の増殖および生存を阻害する際の単一剤としてのＥＭ１６４抗体の効力に基づいて、ＥＭ１６４抗体と他の抗癌療法剤を併用して、さらなる効力研究を行った。多様な癌細胞株に対するこれらの研究において、ＥＭ１６４抗体および他の抗癌療法剤の併用治療によって、ＥＭ１６４または他の療法剤単独のいずれよりもさらに高い、抗癌効力が生じた。したがって、ＥＭ１６４と他の療法剤のこれらの併用は、癌細胞の増殖および生存を阻害する際に非常に有効である。抗癌効力を改善するため、ＥＭ１６４と併用可能である療法剤には、腫瘍学治療に用いられる多様な剤が含まれ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、エポチロン、並びに細胞傷害性薬剤および細胞表面受容体に対する抗体のコンジュゲートがある。
【０１２１】
［１４１］これらの併用療法のため、アルキル化剤、白金剤、ホルモン療法、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗微小管剤、分化剤、抗血管新生療法または抗血管形成療法、放射線療法、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のアゴニストおよびアンタゴニスト、細胞表面受容体に対する阻害性抗体または小分子阻害剤、並びに他の化学療法剤（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ．Ｔ．， Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｓ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ．， 第６版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， フィラデルフィア， ２００１）などの、多様な作用機構の抗癌剤１以上と、ＥＭ１６４を併用する。１つの例において、ＬＨＲＨアンタゴニストであるアンチド（０．１〜１０マイクロモル濃度（micromolar））およびＥＭ１６４抗体（０．１〜１０ナノモル濃度（nanomolar））を併用すると、ＥＭ１６４またはアンチド単独のいずれよりも、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖が有意に阻害された。白金剤との併用療法の例において、ＥＭ１６４抗体（１０マイクログラム／ｍｌ）およびシスプラチン（０．１〜６０マイクログラム／ｍｌ）の併用治療によって、ＥＭ１６４抗体またはシスプラチン単独のいずれかによる阻害に比較して、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖および生存が、より多く阻害された。
【０１２２】
［１４２］ＥＭ１６４抗体と他の療法剤とのこれらの併用は、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、いくつかの種類の癌に対して有効である。ＥＭ１６４抗体および療法剤を、同時にまたは連続して、癌療法のために投与することも可能である。
【０１２３】
［１４３］ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する腫瘍に、細胞傷害性薬剤をターゲティング搬送する際、ＥＭ１６４抗体と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートもまた有用である。ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する腫瘍の治療および画像化に、ＥＭ１６４抗体と放射標識または他の標識のコンジュゲートを用いることも可能である。
【０１２４】
Ｇ．免疫不全マウスにおけるヒト癌異種移植片中、単一剤としてのまたは抗癌剤と併用した、ＥＭ１６４処置の効果
［１４４］１ｘ１０７ Ｃａｌｕ−６細胞を皮下注射することによって、免疫不全マウスにおいて、ヒト非小細胞肺癌Ｃａｌｕ−６異種移植片を確立した。図１０に示すように、処置群あたり５匹のマウスを用いて、確立された１００ｍｍ３ Ｃａｌｕ−６異種移植片を含有するこれらのマウスを、ＥＭ１６４抗体単独（０．８ｍｇ／マウスを１週２回で６回、静脈内注射）で、またはタキソール単独（２日ごとに、タキソールを５回、腹腔内注射；１５ｍｇ／ｋｇ）で、またはタキソールおよびＥＭ１６４抗体処置併用で、またはＰＢＳ単独（２００μｌ／マウスを１週２回で６回、静脈内注射）で処置した。ＰＢＳ対照に比較して、ＥＭ１６４抗体処置によって、腫瘍増殖は、有意に遅延された。マウスの体重測定に基づくと、ＥＭ１６４抗体の毒性はまったく観察されなかった。タキソール単独処置は、第１４日までは有効であったが、その後、腫瘍は再び増殖し始めた。しかし、タキソールおよびＥＭ１６４抗体の併用処置群では、タキソール単独処置群に比較して、腫瘍増殖は有意に遅延された。
【０１２５】
［１４５］ＰＢＳ中の１０７ ＢｘＰＣ−３細胞を皮下注射することによって、５週齢メスＳＣＩＤ／ＩＣＲマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）において、ヒト膵臓癌異種移植片を確立した（第０日）。次いで、５つの処置群各々で、５匹のマウスを用いて、確立された８０ｍｍ３の腫瘍を所持するマウスを、ＥＭ１６４単独（第１２日、第１６日、第１９日、第２３日、第２６日、第２９日、第３６日、第４３日、第５０日、第５４日、第５８日、第６１日および第６４日に、側面尾静脈に０．８ｍｇ／マウスを１３回、静脈内注射）で、ゲムシタビン単独（第１２日および第１９日に、１５０ｍｇ／ｋｇ／マウスを２回、腹腔内注射）で、上記スケジュールにしたがってゲムシタビンおよびＥＭ１６４併用で、ＰＢＳ単独で、そして対照抗体単独（ＥＭ１６４と同じスケジュールにしたがって）で処置した。図２７に示すように、ＥＭ１６４単独処置、またはゲムシタビンとの併用処置によって、ＥＭ１６４処置群では、５匹の動物のうち４匹で、そして併用処置群では５匹の動物すべてで、腫瘍異種移植片の完全な退行がまず生じた。測定可能な腫瘍再増殖は、ＥＭ１６４群では第４３日、そして併用処置群では第６８日になってようやく、１より多い動物で見られ、第７４日に対照処置群と比較すると、有意に小さい平均腫瘍体積を生じた（それぞれＰ＝０．０２９および０．００２；両側Ｔ検定；図２７）。別の研究において、ＥＭ１６４抗体処置（単独または抗ＥＧＦ受容体抗体との併用；腹腔内注射）は、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片の増殖を阻害した。
【０１２６】
［１４６］ネズミＥＭ１６４およびヒト化ＥＭ１６４抗体は、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片増殖の同等の阻害を示しており、したがって、ヒト化ＥＭ１６４の効力が、ｉｎ ｖｉｖｏで、ネズミＥＭ１６４の効力と同等であることが立証された。ＥＭ１６４抗体の異なる投与様式を比較すると、ＥＭ１６４抗体の腹腔内投与および静脈内投与はどちらも、マウスにおいて確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片増殖の同等の阻害を示した。別の異種移植片研究において、マウスにおいて確立されたＡ−６７３ヒト横紋筋肉腫／ユーイング肉腫異種移植片をＥＭ１６４抗体で処置すると、増殖が有意に遅延された。
【０１２７】
Ｈ． ＥＭ１６４抗体の軽鎖および重鎖のクローニングおよび配列決定
［１４７］ＥＭ１６４ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを精製した。４〜５μｇの総ＲＮＡ、およびオリゴｄＴプライマーまたはランダム六量体プライマーのいずれかを用いて、逆転写酵素反応を行った。
【０１２８】
［１４８］Ｃｏら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８， １１４９−１１５４（１９９２））に記載されるＲＡＣＥ法を用いて、そしてＷａｎｇら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３３， １６７−１７７（２０００））に記載されるような縮重プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＲＡＣＥ ＰＣＲ法は、第一鎖ｃＤＮＡの３’端にポリＧテールを付加する中間工程を必要とする。ＲＴ反応物をＱｉａｎｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムで精製し、そして５０μｌの１ｘＮＥＢ緩衝液４中に溶出した。溶出液に対して、１ｘＮＥＢ緩衝液４中、０．２５ｍＭ ＣｏＣｌ２、１ｍＭ ｄＧＴＰ、および５単位の末端転移酵素（ＮＥＢ）で、ｄＧテール付加反応を行った。混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、そして次いで、反応物の１／５（１０μｌ）を、ＰＣＲ反応に直接添加して、テンプレートＤＮＡとして利用した。
【０１２９】
［１４９］ＲＡＣＥおよび縮重ＰＣＲ反応は、プライマーおよびテンプレートが異なることを除いて、同一であった。ＲＡＣＥ ＰＣＲテンプレートには末端転移酵素反応を直接用い、一方、縮重ＰＣＲ反応には、ＲＴ反応混合物を直接用いた。
【０１３０】
［１５０］ＲＡＣＥ反応および縮重ＰＣＲ反応両方において、同じ３’軽鎖プライマー：
【０１３１】
【化７】
【０１３２】
および３’重鎖プライマー：
【０１３３】
【化８】
【０１３４】
を用いた。
［１５１］ＲＡＣＥ ＰＣＲにおいて、１つのポリＣ ５’プライマー：
【０１３５】
【化９】
【０１３６】
を重鎖および軽鎖両方に用い、一方、縮重５’端ＰＣＲプライマーは、軽鎖に関しては：
【０１３７】
【化１０】
【０１３８】
であり、そして重鎖に関しては：
【０１３９】
【化１１】
【０１４０】
の等量混合物であった。
【０１４１】
［１５２］上記プライマー配列において、混合塩基は以下のように定義される：Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ。
【０１４２】
［１５３］以下のプログラムを用いて、ＰＣＲ反応を行った：１）９４℃３分間、２）９４℃１５秒間、３）４５℃１分間、４）７２℃２分間、５）工程２に戻って２９周期、６）７２℃１０分間の最終伸長工程で終了。
【０１４３】
［１５４］ＰＣＲプライマーによって生成した制限酵素を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＰＣＲ産物をクローニングした。
［１５５］慣用的手段によって、いくつかの個々の軽鎖クローンおよび重鎖クローンを配列決定して、ポリメラーゼが生成しうる配列エラーを同定し、そして回避した（図１２および図１３）。Ｃｈｏｔｈｉａ規範的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）分類定義を用いて、３つの軽鎖および重鎖ＣＤＲを同定した（図１２〜図１４）。
【０１４４】
［１５６］ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔデータベースを検索すると、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体軽鎖可変領域が、おそらく、マウスＩｇＶｋ Ｃｒ１生殖系列遺伝子に由来し、一方、重鎖可変領域が、おそらく、ＩｇＶｈ Ｊ５５８．ｃ生殖系列遺伝子に由来することが示された（図１５）。
【０１４５】
［１５７］ネズミＥＭ１６４抗体のタンパク質配列決定を行って、図１２および図１３に示す配列を確認した。精製したＥＭ１６４抗体の重鎖および軽鎖のタンパク質バンドを、ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件）からＰＶＤＦ膜にトランスファーし、ＰＶＤＦ膜から切り出し、そしてタンパク質配列決定によって分析した。軽鎖のＮ末端配列は、エドマン配列決定によって：ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳ（配列番号２０）であることが決定され、これは、ＥＭ１６４ハイブリドーマから得たクローニング軽鎖遺伝子のＮ末端配列にマッチした。
【０１４６】
［１５８］重鎖のＮ末端は、遮断されていてエドマン・タンパク質配列決定が不能であることが見出された。ポストソース分解（ＰＳＤ）を介して、マス１１２９．５（Ｍ＋Ｈ＋、モノアイソトピック）の重鎖のトリプシン消化ペプチド断片を断片化し、そしてその配列は、ＧＲＰＤＹＹＧＳＳＫ（配列番号２１）であることが決定された。ポストソース分解（ＰＳＤ）を介して、マス２６６４．２（Ｍ＋Ｈ＋、モノアイソトピック）の重鎖の別のトリプシン消化ペプチド断片もまた断片化し、そしてその配列は：ＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＦＡＲ（配列番号２２）であることが同定された。これらの配列はどちらも、ＥＭ１６４ハイブリドーマから得られるクローニング重鎖遺伝子のＣＤＲ３およびフレームワーク３（ＦＲ３）のものに完全にマッチする。
【０１４７】
Ｉ． ＥＭ１６４抗体の組換え発現
［１５９］軽鎖および重鎖の対配列を単一の哺乳動物発現ベクターにクローニングした（図１６）。ヒト可変配列のＰＣＲプライマーは制限部位を生成し、この制限部位によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングベクター中にありつつ、ヒト・シグナル配列が付着することが可能になり、そして軽鎖または重鎖に関して、それぞれ、ＥｃｏＲＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＡｐａＩ部位を用いて、哺乳動物発現プラスミドに可変配列をクローニングした（図１６）。軽鎖可変配列を、ヒトＩｇＫ定常領域上にインフレームでクローニングし、そして重鎖可変配列を、ヒトＩｇガンマ１定常領域配列中にクローニングした。最終発現プラスミドにおいて、ヒトＣＭＶプロモーターは、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡ配列両方の発現を駆動した。当該技術分野に周知の方法にしたがって、組換えマウスＥＭ１６４抗体の発現および精製を進めた。
【０１４８】
（実施例２）
ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョン
［１６０］療法剤または診断剤として適切なヒト化バージョンを提供するため、ＥＭ１６４抗体の表面再構成を、一般的に、米国特許５，６３９，６４１に開示される原理および方法にしたがって、そして以下のように、進めた。
【０１４９】
Ａ．表面予測
［１６１］解明された構造を持つ抗体セットの可変領域残基の溶媒アクセス可能性を用いて、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体（ＥＭ１６４）可変領域の表面残基を予測した。１２７のユニークな抗体構造ファイル・セットのアミノ酸溶媒アクセス可能性（表２）をＭＣソフトウェア・パッケージで計算した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら， １９９４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３５， ９５９−９７３）。１２７の構造のこのセットから、配列並列によって、１０の最も類似の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を決定した。各可変領域残基に関して、平均溶媒アクセス可能性を計算し、そして３０％を超える平均アクセス可能性の位を表面残基と見なした。２つの同一な隣接残基を持つ構造に関してのみ、個々の残基のアクセス可能性を計算することによって、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を持つ位をさらに調べた。
【０１５０】
表２−抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体（ＥＭ１６４）の表面を予測するのに用いた、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベース由来の１２７の抗体構造
【０１５１】
【表２】
【０１５２】
Ｂ．分子モデリング：
［１６２］オックスフォード分子ソフトウェア・パッケージＡｂＭを用いて、ネズミＥＭ１６４の分子モデルを生成した。最も類似のアミノ酸配列を持つ抗体の構造ファイル、軽鎖の２ｊｅｌ、そして重鎖の１ｎｑｂを用いて、抗体フレームワークを構築した。非冗長解明構造を含有するＣ−α構造データベースを検索することによって、非規範的ＣＤＲを構築した。ＣＤＲから５Å以内に位置する残基を決定した。
【０１５３】
Ｃ．ヒトＡｂ選択
［１６３］ネズミＥＭ１６４の表面位を、Ｋａｂａｔデータベース中のヒト抗体配列の対応する位と比較した（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．およびＷｕ， Ｔ．Ｔ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９：２０５−２０６）。抗体データベース管理ソフトウェアＳＲ（Ｓｅａｒｌｅ １９９８）を用いて、天然重鎖および軽鎖ヒト抗体対から抗体表面残基を抽出し、そして並列させた。ＣＤＲから５Å以内に来る位を特に考慮して、最も同一の表面残基を持つヒト抗体表面を選択して、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体表面残基を置換した。
【０１５４】
Ｄ． ＰＣＲ突然変異誘発
［１６４］ネズミＥＭ１６４ ｃＤＮＡクローン（上記）に対してＰＣＲ突然変異誘発を行って、表面再構成ヒトＥＭ１６４（本明細書においてｈｕＥＭ１６４）を構築した。ｈｕＥＭ１６４のすべての試験されるバージョンに必要な８アミノ酸変化を作成するため、プライマーセットを設計し、そしてこれとは別に２つの５Å残基変化を作成するため、さらなるプライマーを設計した（表３）。以下のプログラムを用いて、ＰＣＲ反応を行った：１）９４℃１分間、２）９４℃１５秒間、３）５５℃１分間、４）７２℃１分間、５）工程２に戻って２９周期、６）７２℃４分間の最終伸長工程で終了。対応する制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、そして上述のように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクターにクローニングした。クローンを配列決定して、望ましいアミノ酸変化を確認した。
【０１５５】
表３−４つのヒト化ＥＭ１６４抗体を構築するのに用いたＰＣＲプライマー
【０１５６】
【表３】
【０１５７】
Ｅ．可変領域表面残基
［１６５］Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３５， ９５９−９７３， １９９４）およびＲｏｇｕｓｋａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ９， ８９５−９０４， １９９６）に記載される抗体表面再構成技術は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を予測することから始まる。表面残基は、総表面領域の少なくとも３０％が水分子にアクセス可能であるアミノ酸と定義される。
【０１５８】
［１６６］１２７の抗体構造ファイル・セット中、１０の最も相同な抗体を同定した（図１７および図１８）。これらの並列配列に関して、各Ｋａｂａｔ位の溶媒アクセス可能性を平均し、そして各残基の相対的アクセス可能性の分布を図１９に示した。軽鎖および重鎖の両方が、少なくとも３０％の平均相対アクセス可能性を持つ２６の残基を有する（図１９）：したがって、これらの残基は、ＥＭ１６４の予測される表面残基であった。いくつかの残基は、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を有し、そして残基の両側に隣接する２つの残基が同一である抗体のみを平均することによって、これらをさらに調べた（表４および表５）。このさらなる解析後も、上に同定する表面残基の元来のセットは変化しないままであった。
【０１５９】
表４−ＥＭ１６４抗体の軽鎖および重鎖の可変配列の表面残基および平均アクセス可能性
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
表５
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
検討中の残基の両側に隣接する２つの残基が同一である抗体サブセットを平均することによって、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を有する残基を、さらに解析した。これらのボーダーライン表面位およびその新しい平均アクセス可能性を提供する。ＮＡは、１０の最も類似の抗体において、同一の隣接残基がない残基を指す。
【０１６４】
Ｆ．どの残基がＣＤＲから５Å以内に収まるかを決定する分子モデリング
［１６７］ＡｂＭソフトウェア・パッケージで生成した上述の分子モデルを分析して、どのＥＭ１６４表面残基が、ＣＤＲから５Å以内にあるかを決定した。ネズミＥＭ１６４抗体の表面を再構成するため、ＣＤＲ外の表面残基はすべて、ヒト対応物に変化させなければならないが、ＣＤＲから５Å以内の残基はまた抗原特異性にも寄与しうるため、特に気をつけて扱われる。したがって、これらの後者の残基を同定し、そしてヒト化プロセス全体に渡って、注意深く検討しなければならない。表面再構成に用いたＣＤＲ定義は、重鎖ＣＤＲ２に関してＡｂＭ定義、そして残りの５つのＣＤＲに関してＫａｂａｔ定義を組み合わせている（図１４）。表６は、ＥＭ１６４モデルの軽鎖または重鎖の配列いずれかにおいて、ＣＤＲ残基いずれかから５Å以内にあった残基を示す。
【０１６５】
表６ ＣＤＲから５Å以内にあるＥＭ１６４抗体フレームワーク表面残基
ＣＤＲから５Å以内のＥＭ１６４表面残基
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
Ｇ．最も相同なヒト表面の同定
［１６８］抗体データベースに対して、特定される残基位のみの検索の手はずを整えるＳＲソフトウェアを用いて、Ｋａｂａｔ抗体配列データベース内で、ＥＭ１６４を表面再構成する候補ヒト抗体表面を同定した。天然対形成を保持するため、軽鎖および重鎖両方の表面残基を一緒に比較した。Ｋａｂａｔデータベースの最も相同なヒト表面を配列同一性の順位で並列させた。トップの５つの表面を表７に提供する。次いで、これらの表面を比較して、このうちどれがＣＤＲから５Å以内に最小の変化しか必要としないかを同定した。白血病Ｂ細胞抗体、ＣＬＬ１．６９は、最少数の表面残基変化（総数１０）しか必要とせず、そしてこれらの残基のうち２つのみがＣＤＲから５Å以内に存在した。
【０１６８】
［１６９］ＥＭ１６４の全長可変領域配列もまた、Ｋａｂａｔヒト抗体データベースに対して並列させ、そして再び、ＣＬＬ１．６９が最も類似のヒト可変領域配列と同定された。総合すると、これらの配列比較によって、ヒト白血病Ｂ細胞抗体ＣＬＬ１．６９は、ＥＭ１６４のヒト表面として好ましい選択と同定された。
【０１６９】
表７−Ｋａｂａｔデータベースから抽出されたトップの５つのヒト配列
【０１７０】
【表７】
【０１７１】
ＳＲ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ １９９３）によって並列を生成した。ＣＤＲから５Å以内にあるＥＭ１６４表面残基を下線で示す。
【０１７２】
Ｈ．ヒト化ＥＭ１６４遺伝子の構築
［１７０］上述のようなＰＣＲ突然変異誘発技術を用いて、ＥＭ１６４の１０の表面残基変化（表７）を作成した。ＣＬＬ１．６９の表面残基のうち８つは、ＣＤＲから５Å以内にはないため、ヒト化ＥＭ１６４のすべてのバージョンで、これらの残基をネズミからヒトに変化させた（表８および表９）。ＣＤＲから５Å以内の２つの軽鎖表面残基（Ｋａｂａｔの３位および４５位）をヒトに変化させるかまたはネズミのままにした。総合すると、これらのオプションによって、構築したＥＭ１６４の４つのヒト化バージョンが生成される（図２２および図２３）。
【０１７３】
［１７１］４つのヒト化バージョンのうち、バージョン１．０は、１０のヒト表面残基をすべて有する。ＣＤＲ近傍の変化に関して、最も保存的なバージョンは、バージョン１．１であり、このバージョンは、ＣＤＲから５Å以内にあるネズミ表面残基の両方を保持した。４つのヒト化ＥＭ１６４抗体遺伝子を、一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションに使用するため、抗体発現プラスミドにクローニングした（図１６）。
【０１７４】
表８−ヒト化ＥＭ１６４抗体のバージョン１．０〜１．３の残基変化
【０１７５】
【表８】
【０１７６】
Ｉ．全長ＩＧＦ−Ｉ受容体への、そして一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖への結合に関する、ネズミＥＭ１６４抗体とヒト化ＥＭ１６４抗体バージョンの親和性の比較
［１７２］上述のように、ビオチン化全長ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体またはｍｙｃ−エピトープタグ化一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖を用いた結合競合アッセイを通じて、ヒト化ＥＭ１６４抗体バージョン１．０〜１．３の親和性を、ネズミＥＭ１６４抗体のものと比較した。ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞において、適切な発現ベクターの一過性トランスフェクションによって、ヒト化ＥＭ１６４抗体試料を得て、そして精製したヒト化抗体標準を用いたＥＬＩＳＡによって抗体濃度を決定した。ＥＬＩＳＡ結合競合測定のため、ヒト化抗体試料および多様な濃度のネズミＥＭ１６４抗体の混合物を、間接的に捕捉されたビオチン化全長ＩＧＦ−Ｉ受容体またはｍｙｃ−エピトープタグ化一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖とインキュベーションした。平衡化後、ヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートを用いて、結合したヒト化抗体を検出した。理論的には傾き＝（Ｋｄ ヒト化Ａｂ／Ｋｄ ネズミＡｂ）を持つ直線を生じる、（［結合したネズミＡｂ］／［結合したヒト化Ａｂ］）対（［ネズミＡｂ］／［ヒト化Ａｂ］）のプロットを用いて、ヒト化抗体およびネズミ抗体の相対的親和性を決定した。
【０１７７】
［１７３］典型的な競合アッセイを図１１に示す。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢ ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり１００μｌの炭酸緩衝液中、５μｇ／ｍｌストレプトアビジンで、周囲温度で７時間コーティングした。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルを、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体（ウェルあたり５ｎｇ）と、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、間接的に捕捉したビオチン化ＩＧＦ−Ｉ受容体を含有するウェルを洗浄し、そして１００μｌのブロッキング緩衝液中、ヒト化ＥＭ１６４抗体（１５．５ｎｇ）およびネズミ抗体（０ｎｇ、または１６．３５ｎｇ、または３２．７ｎｇ、または６５．４ｎｇ、または１６３．５ｎｇ）の混合物と、周囲温度で２時間インキュベーションし、そして次いで、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、ウェルをＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１００μｌ；ブロッキング緩衝液中、１μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベーションし、その後、洗浄し、そしてＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５ｎｍで検出した。
【０１７８】
［１７４］（［結合したネズミＡｂ］／［結合したヒト化Ａｂ］）対（［ネズミＡｂ］／［ヒト化Ａｂ］）のプロットは、０．５２の傾き（＝Ｋｄ ヒト化Ａｂ／Ｋｄ ネズミＡｂ）を持つ直線（ｒ２＝０．９９６）を生じた。したがって、ヒト化抗体バージョン１．０は、ネズミＥＭ１６４抗体より緊密にＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した。全長ＩＧＦ−Ｉ受容体への、または一部切除ＩＧＦ−Ｉ受容体アルファ鎖への結合に関して、ネズミＥＭ１６４抗体とヒト化ＥＭ１６４抗体のバージョン１．０、１．１、１．２および１．３の競合に関して、約０．５〜０．８の範囲の勾配の類似の値が得られたことから、ＥＭ１６４抗体のヒト化バージョンがすべて類似の親和性を有し、これはすべて、親ネズミＥＭ１６４抗体のものより優れていたことが示された。重鎖中に９２Ｆ→Ｃ突然変異を持つＥＭ１６４抗体のキメラバージョンは、ネズミＥＭ１６４抗体との類似の結合競合において、約３の傾きを示したことから、ＥＭ１６４の９２Ｆ→Ｃ突然変異体が、ＩＧＦ−Ｉ受容体への結合に関して、ネズミＥＭ１６４抗体より３倍低い親和性を有することが示された。ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ネズミＥＭ１６４抗体と同様の阻害を示した（図２４）。血清が刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体による阻害は、ネズミＥＭ１６４抗体による阻害と同様であった。
【０１７９】
表９
【０１８０】
【表９】
【０１８１】
ＥＭ１６４Ａｂの異なるバージョンの軽鎖および重鎖の可変領域ポリペプチドに関して、Ｋａｂａｔ番号付け系を用いる。アミノ酸残基は、ポリペプチド鎖における位にしたがって、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）にグループ分けされる。
【０１８２】
Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， １９９１， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２から採用。
【０１８３】
Ｊ．本明細書記載のネズミ抗体配列およびヒト化抗体配列から出発して、改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を提供するプロセス
［１７５］抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４およびそのヒト化変異体のアミノ酸配列および核酸配列を用いて、改善された特性を有し、そしてやはり本発明の範囲内である、他の抗体を作成した。こうした改善された特性には、ＩＧＦ−Ｉ受容体への親和性増加が含まれる。いくつかの研究によって、最初の抗体配列の知識に基づいて、抗体配列の多様な位で、１以上のアミノ酸変化を導入した際の、結合および発現レベルなどの特性に対する影響が調査されてきている（Ｙａｎｇ， Ｗ．Ｐ．ら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５４， ３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ， Ｃ．ら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， ８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９）。
【０１８４】
［１７６］これらの研究において、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌のミューテーター株などの方法を用い、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖の遺伝子配列を変化させることによって、最初の抗体の変異体が生成された（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ．Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９；Ａｄｅｙ， Ｎ．Ｂ．ら， １９９６， 第１６章， ｐｐ．２７７−２９１， “Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”中， Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ．ら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。最初の抗体の配列を変化させるこれらの方法により、標準的なスクリーニング技術の使用を通じて、親和性が改善された第二の抗体が生じている（Ｇｒａｍ， Ｈ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ， Ｅ．Ｔ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， １０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２， １６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．ら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６， ７７−８８；Ｓｈｏｒｔ， Ｍ．Ｋ．ら， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， １６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．ら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ２７６２２−２７６２８）。
【０１８５】
［１７７］抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の指定戦略によって、本発明記載の抗体配列を用いて、機能が改善された抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を作成することも可能であり、例えば療法剤の付着に用いる、共有修飾のための好都合な付着点にある未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基またはチオール基など、適切な基を有する抗体がある。
【０１８６】
Ｋ．ネズミ抗体、キメラ抗体および他の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のための代替発現系
［１７８］ヒト化抗体（上記）を発現するのに用いたものと類似の哺乳動物プラスミドから、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もまた、発現させた。発現プラスミドは、軽鎖カッパ配列および重鎖ガンマ−１配列を含むネズミ定常領域を有することが知られる（ＭｃＬｅａｎら， ２０００， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３７， ８３７−８４５）。単純な制限消化およびクローニングによって、抗体可変領域いずれか、例えばネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を受け入れるように、これらのプラスミドを設計した。通常は、発現プラスミド中のものと適合する制限部位を生成するため、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のさらなるＰＣＲが必要であった。
【０１８７】
［１７９］全長ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を発現する別のアプローチは、キメラ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体発現プラスミドのヒト定常領域を置換することであった。可変領域のカセット、並びに軽鎖および重鎖両方の定常領域のカセットを用いて、キメラ発現プラスミド（図１６）を構築した。制限消化によって、抗体可変配列をこの発現プラスミドにクローニングしたのとちょうど同じように、別の制限消化を用いて、定常領域配列いずれかにおいてクローニングした。例えば、抗ＩＧＦ−Ｉ抗体可変領域のクローニングのため、本明細書に記載するＲＮＡなど、ネズミ・ハイブリドーマＲＮＡから、カッパ軽鎖ｃＤＮＡおよびガンマ−１重鎖ｃＤＮＡをクローニングした。同様に、Ｋａｂａｔデータベースにおいて入手可能な配列から、適切なプライマーを設計した（表１０を参照されたい）。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、定常領域配列をクローニングし、そしてこれらの断片をキメラ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体発現プラスミドにクローニングするのに必要な制限部位を生成した。次いで、このプラスミドを用いて、ＣＨＯ細胞株などの標準的哺乳動物発現系において、全長ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を発現した。
【０１８８】
表１０−それぞれ、ネズミ・ガンマ−１定常領域およびネズミ・カッパ定常領域をクローニングするため設計したプライマー
【０１８９】
【表１０】
【０１９０】
Ｋａｂａｔデータベースにおいて入手可能な配列からプライマーを設計した（Ｊｏｈｎｓｏｎ， ＧおよびＷｕ， Ｔ．Ｔ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９：２０５−２０６）。
【０１９１】
寄託の記述
［１８０］ネズミＥＭ１６４抗体を作成するハイブリドーマを、ブダペスト条約の条項のもとに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＰＯ Ｂｏｘ １５４９， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１０８に、２００２年６月１４日に寄託し、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７を割り当てられた。
【０１９２】
［１８１］特定の特許および印刷刊行物が本開示において言及されており、これらの解説は、本明細書にそれぞれ完全に援用される。
［１８２］本発明は、詳細に、そして特定の態様に関連して記載されてきているが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変化および修飾が実行可能であることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】［３５］図１は、ヒトＹ１２５１Ｆ ＩＧＦ−Ｉ受容体またはヒト・インスリン受容体を過剰発現する細胞に対する精製ＥＭ１６４抗体の特異的結合の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す。
【図２】［３６］図２は、ビオチン化ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対するＥＭ１６４抗体の結合に関する結合滴定曲線を示す。
【図３】［３７］図３は、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に対するビオチン化ＩＧＦ−Ｉの結合の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図４】［３８］図４は、ＭＣＦ−７細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＧＦ−Ｉ受容体の自己リン酸化の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図５】［３９］図５は、ＭＣＦ−７細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するＩＲＳ−１リン酸化の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図６】［４０］図６は、ＳａＯＳ−２細胞においてＩＧＦ−Ｉが刺激するシグナル伝達の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図７】［４１］図７は、ＭＴＴアッセイによって評価されるような、異なる増殖条件下でのＭＣＦ−７細胞の増殖および生存に対するＥＭ１６４抗体の効果を示す。
【図８】［４２］図８は、多様な濃度の血清存在下、ＭＣＦ−７細胞の増殖および生存に対するＥＭ１６４抗体の効果を示す。
【図９】［４３］図９は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するおよび血清が刺激するＮＣＩ−Ｈ８３８細胞増殖および生存の、ＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図１０】［４４］図１０は、マウスにおけるＣａｌｕ−６肺癌異種移植片の増殖に対する、ＥＭ１６４抗体、タキソール、またはＥＭ１６４抗体およびタキソールの組み合わせでの処置の効果を示す。
【図１１】［４５］図１１は、ヒト化ＥＭ１６４抗体（ｖ．１．０）およびネズミＥＭ１６４抗体の結合の間の競合を示す。
【図１２】［４６］図１２は、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の軽鎖のリーダー領域および可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。矢印はフレームワーク１の始まりをマークする。Ｋａｂａｔにしたがう３つのＣＤＲ配列を下線で示す。
【図１３】［４７］図１３は、ネズミ抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の重鎖のリーダー領域および可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。矢印はフレームワーク１の始まりをマークする。Ｋａｂａｔにしたがう３つのＣＤＲ配列を下線で示す。
【図１４】［４８］図１４は、Ｃｈｏｔｈｉａ規範的クラス定義によって決定されるような、抗体ＥＭ１６４の軽鎖および重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＣＤＲのＡｂＭモデリング・ソフトウェア定義もまた示す。軽鎖：ＣＤＲ１は配列番号４であり、ＣＤＲ２は配列番号５であり、そしてＣＤＲ３は配列番号６である。重鎖：ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＣＤＲ２は配列番号２であり、そしてＣＤＲ３は配列番号３である。ＡｂＭ重鎖：ＣＤＲ１は配列番号５３であり、ＣＤＲ２は配列番号５４であり、そしてＣＤＲ３は配列番号５５である。
【図１５】［４９］図１５は、Ｃｒ１（配列番号５６）およびＪ５８８．ｃ（配列番号５７）遺伝子の生殖系列配列と並列させた、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体ＥＭ１６４の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す。ダッシュ記号（−）は配列同一性を示す。
【図１６】［５０］図１６は、組換えＥＭ１６４キメラ抗体および組換えヒト化ＥＭ１６４抗体を構築し、そして発現するのに用いたプラスミドを示す。Ａ）軽鎖クローニングプラスミド、Ｂ）重鎖クローニングプラスミド、Ｃ）哺乳動物抗体発現プラスミド。
【図１７】［５１］図１７は、ＥＭ１６４の表面残基を予測するのに用いた構造ファイル・セットにおいて、１２７の抗体からスクリーニングした１０の最も相同な軽鎖アミノ酸配列を示す。ｅｍｌ６４ ＬＣ（配列番号５８）、２ｊｅｌ（配列番号５９）、２ｐｃｐ（配列番号６０）、１ｎｑｂ（配列番号６１）、１ｋｅｌ（配列番号６２）、１ｈｙｘ（配列番号６３）、１ｉｇｆ（配列番号６４）、１ｔｅｔ（配列番号６５）、１ｃｌｚ（配列番号６６）、１ｂｌｎ（配列番号６７）、１ｃｌｙ（配列番号６８）、コンセンサス（配列番号６９）。
【図１８】［５２］図１８は、ＥＭ１６４の表面残基を予測するのに用いた構造ファイル・セットにおいて、１２７の抗体からスクリーニングした１０の最も相同な重鎖アミノ酸配列を示す。ｅｍ１６４ ＨＣ（配列番号７０）、１ｎｑｂ（配列番号７１）、１ｎｇｐ（配列番号７２）、１ｆｂｉ（配列番号７３）、１ａｆｖ（配列番号７４）、１ｙｕｈ（配列番号７５）、１ｐｌｇ（配列番号７６）、１ｄ５ｂ（配列番号７７）、１ａｅ６（配列番号７８）、１ａｘｓ（配列番号７９）、３ｈｆｌ（配列番号８０）、コンセンサス（配列番号８１）。
【図１９】［５３］図１９は、１０の最も相同な構造からの、（Ａ）軽鎖および（Ｂ）重鎖の可変領域残基各々の平均アクセス可能性を示す。数字は、Ｋａｂａｔ抗体配列位番号を示す。
【図２０】［５４］図２０は、ネズミＥＭ１６４（ｍｕＥＭ１６４）およびヒト化ＥＭ１６４（ｈｕＥＭ１６４）抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列を示す。ｍｕＥＭ１６４（配列番号８２）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．０（配列番号８３）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．１（配列番号８４）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．２（配列番号８５）、ｈｕＥＭ１６４ Ｖ１．３（配列番号８６）。
【図２１】［５５］図２１は、ネズミ（ｍｕＥＭ１６４、配列番号８７）およびヒト化ＥＭ１６４抗体（ｈｕＥＭ１６４、配列番号８８）の重鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
【図２２】［５６］図２２は、軽鎖（ＤＮＡ、配列番号８９、アミノ酸、配列番号９０）および重鎖（ＤＮＡ、配列番号９１、アミノ酸、配列番号９２）両方のｈｕＥＭ１６４ ｖ１．０の可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２３−１】［５７］図２３は、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．１（ＤＮＡ、配列番号９３；アミノ酸、配列番号９４）、ｖ１．２（ＤＮＡ、配列番号９５；アミノ酸、配列番号９６）およびｖ１．３（ＤＮＡ、配列番号９７；アミノ酸、配列番号９８）の軽鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２３−２】［５７］図２３は、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．１（ＤＮＡ、配列番号９３；アミノ酸、配列番号９４）、ｖ１．２（ＤＮＡ、配列番号９５；アミノ酸、配列番号９６）およびｖ１．３（ＤＮＡ、配列番号９７；アミノ酸、配列番号９８）の軽鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２４】［５８］図２４は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞の増殖および生存の、ヒト化ＥＭ１６４ ｖ１．０抗体およびネズミＥＭ１６４抗体による阻害を示す。
【図２５】［５９］図２５は、ＩＧＦ−Ｉが刺激するＭＣＦ−７細胞のサイクリングを、ＥＭ１６４が抑制することを示す。
【図２６】［６０］図２６は、ＩＧＦ−１および血清の抗アポトーシス効果を、ＥＭ１６４が抑制することを示す。ＣＫ１８タンパク質の切断レベルが増加していることによって立証されるように、ＥＭ１６４で処理すると、アポトーシス細胞死が生じる。
【図２７】［６１］図２７は、免疫不全マウスにおけるヒトＢｘＰＣ−３膵臓癌異種移植片の増殖に対する、ＥＭ１６４抗体、ゲムシタビン、またはＥＭ１６４抗体およびゲムシタビンの組み合わせでの処理の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはそのエピトープ結合性断片であり、そして前記抗体または前記断片がインスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し：
（ｉ）マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｉ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有する表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｉｉ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体、あるいはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｖ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有する抗体の機能上の同等物、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｖ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と比較して少なくとも１つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を有し、そしてネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有するネズミ抗体ＥＭ１６４の変異体、またはそのエピトープ結合性断片、および
（ｖｉ）マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４、またはそのエピトープ結合性断片
からなる群より選択される、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項２】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
第一の療法剤が、約１ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で患者に投与され、そして第二の療法剤が、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
第一の療法剤が、約１０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で患者に投与され、そして第二の療法剤が、約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物および薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項７】
（ａ）第一の療法剤であって：
【化１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの相補性決定領域を含む抗体または抗体断片である、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項８】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、抗体または抗体断片であり、前記重鎖可変領域が、それぞれ配列番号１〜３：
【化２】
に示されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含み；そして前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号４〜６：
【化３】
に示されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含む、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項９】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはその断片であり、前記抗体が、配列番号７：
【化４】
に示されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が配列番号７に示される前記アミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９の組成物。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域が配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項９の組成物。
【請求項１２】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはその断片であり、前記抗体が、配列番号８：
【化５】
に示されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に示される前記アミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２の組成物。
【請求項１５】
（ａ）第一の療法剤であって：
【化６】
からなる群より選択される配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその断片である、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１６】
（ａ）第一の療法剤であって、配列番号１３：
【化７】
に示される配列を有する重鎖可変領域を含む、抗体またはその断片である、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１７】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項７〜１６のいずれか１つの組成物。
【請求項１８】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項７〜１６のいずれか１つの組成物。
【請求項１９】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞と請求項１の組成物を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
癌を有する患者を治療する方法であって、請求項１の組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
癌を有する患者を治療する方法であって、請求項６の薬剤組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記癌が、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫からなる群より選択される癌である、請求項１９〜２１のいずれか１つの治療法。
【請求項２３】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、
（ｂ）第二の療法剤、および
（ｃ）使用説明書
を含む、キット。
【請求項２４】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を：
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者に有効量の：
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記細胞を、前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤と同時に接触させる、請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記細胞を、前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤と、連続して、そしていずれかの順序で接触させる、請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤を同時に投与する、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤を、連続して、そしていずれかの順序で投与する、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項２４または２５の方法。
【請求項３１】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項２４または２５の方法。
【請求項１】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはそのエピトープ結合性断片であり、そして前記抗体または前記断片がインスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合し：
（ｉ）マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｉ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有する表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｉｉ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体、あるいはそのエピトープ結合性断片、
（ｉｖ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有する抗体の機能上の同等物、またはそのエピトープ結合性断片、
（ｖ）ネズミ抗体ＥＭ１６４と比較して少なくとも１つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を有し、そしてネズミ抗体ＥＭ１６４と同じ結合特異性を有するネズミ抗体ＥＭ１６４の変異体、またはそのエピトープ結合性断片、および
（ｖｉ）マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４、またはそのエピトープ結合性断片
からなる群より選択される、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項２】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
第一の療法剤が、約１ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で患者に投与され、そして第二の療法剤が、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
第一の療法剤が、約１０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で患者に投与され、そして第二の療法剤が、約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの投薬量で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物および薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項７】
（ａ）第一の療法剤であって：
【化１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの相補性決定領域を含む抗体または抗体断片である、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項８】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、抗体または抗体断片であり、前記重鎖可変領域が、それぞれ配列番号１〜３：
【化２】
に示されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含み；そして前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号４〜６：
【化３】
に示されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含む、前記の第一の療法剤、並びに
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項９】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはその断片であり、前記抗体が、配列番号７：
【化４】
に示されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が配列番号７に示される前記アミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９の組成物。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域が配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項９の組成物。
【請求項１２】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が抗体またはその断片であり、前記抗体が、配列番号８：
【化５】
に示されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に示される前記アミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２の組成物。
【請求項１５】
（ａ）第一の療法剤であって：
【化６】
からなる群より選択される配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗体またはその断片である、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１６】
（ａ）第一の療法剤であって、配列番号１３：
【化７】
に示される配列を有する重鎖可変領域を含む、抗体またはその断片である、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を含む、組成物。
【請求項１７】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項７〜１６のいずれか１つの組成物。
【請求項１８】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項７〜１６のいずれか１つの組成物。
【請求項１９】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞と請求項１の組成物を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
癌を有する患者を治療する方法であって、請求項１の組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
癌を有する患者を治療する方法であって、請求項６の薬剤組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記癌が、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および横紋筋肉腫からなる群より選択される癌である、請求項１９〜２１のいずれか１つの治療法。
【請求項２３】
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、
（ｂ）第二の療法剤、および
（ｃ）使用説明書
を含む、キット。
【請求項２４】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を：
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者に有効量の：
（ａ）第一の療法剤であって、前記の第一の療法剤が、マウス・ハイブリドーマＥＭ１６４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４５７）に産生されるネズミ抗体ＥＭ１６４と同じアミノ酸配列を有する抗体、またはそのエピトープ結合性断片であり、前記抗体または前記断片が、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合する、前記の第一の療法剤、および
（ｂ）第二の療法剤
を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記細胞を、前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤と同時に接触させる、請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記細胞を、前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤と、連続して、そしていずれかの順序で接触させる、請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤を同時に投与する、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記の第一の療法剤および前記の第二の療法剤を、連続して、そしていずれかの順序で投与する、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記の第二の療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ（ハーセプチン）、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エクセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ（アバスチン）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ（リツキサン）、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ（ゼバリン）、トシツモマブ（ベキサール）、インターフェロン・アルファ−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ（ベルケード）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロニチブ（タルセバ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ、Ａｂｘ−ＥＧＦ）、およびエポチロンからなる群より選択される、請求項２４または２５の方法。
【請求項３１】
前記の第二の療法剤が、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびカンプトテシンからなる群より選択される、請求項２４または２５の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公表番号】特表２００８−５０２５８９（Ｐ２００８−５０２５８９Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３８３２（Ｐ２００６−５４３８３２）
【出願日】平成１６年１２月７日（２００４．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６１５４１
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０４０３９１５５）イミュノジェン・インコーポレーテッド (36)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月７日（２００４．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８２３０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６１５４１
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０４０３９１５５）イミュノジェン・インコーポレーテッド (36)
【Ｆターム（参考）】
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