美白用皮膚外用剤
【課題】 日焼けや生理不順等複数の原因に由来して発生する色黒、肌質の異常、しみ等の改善に優れた美白用皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【解決手段】
（１）下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
（２）前記（Ｂ）のメラニン合成抑制剤として、特にサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物から選ばれる１種以上を用い、（Ｃ）の活性酸素消去剤として、特にワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上を用いる美白用皮膚外用剤。
【解決手段】
（１）下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
（２）前記（Ｂ）のメラニン合成抑制剤として、特にサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物から選ばれる１種以上を用い、（Ｃ）の活性酸素消去剤として、特にワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上を用いる美白用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン合成阻害剤、活性酸素消去剤、エストロゲン様作用剤及びヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する美白用皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、メラニン合成抑制剤、活性酸素消去剤、エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物及びヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシンを配合した、皮膚美白効果が著しく改良され、日焼け後の肌質改善に優れ、高いしみ改善効果を持つ美白用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚におけるメラニン色素の役割は、紫外線による皮膚障害を緩和することにあるが、局所的な色素沈着、いわゆるシミ等は過剰にメラニン合成が亢進しており、美容上大きな問題であり、これらを制御できる美白剤は極めてニーズが高い。皮膚におけるメラニン生成及び代謝機構から、美白薬剤の作用機序として、メラノサイト内のメラニン生成抑制、既成メラニンの還元、表皮内メラニン排出促進、メラノサイトに対する選択的毒性が考えられる。その中で、美白化粧品にはメラノサイトに対する緩和性から、アルブチン、ビタミンＣ及びその誘導体、エラグ酸、ルシノール、カモミラＥＴなどが配合されている。メラニン生成抑制剤の評価方としては、in vitroの評価としては、チロシナーゼ活性阻害作用、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン合成阻害が検討されてきた（非特許文献１、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）。
【０００３】
また、活性酸素による色素沈着に対する係りも研究されてきており、活性酸素の中で最も安定であるＨ２Ｏ２がメラノーマ細胞のチロシナーゼのレベルを上昇させる。この作用はＨ２Ｏ２に特異なものである。また、メラニン生成の律速段階であるチロシナーゼによるチロシンのＤＯＰＡへのhydroxylation及びドーパキノンへの酸化過程において活性酸素が関与するなどの報告がある（非特許文献２）。このようなことから、これまで活性酸素から皮膚を守る化粧料が開発されており、特に天然物から活性酸素消去剤の開発が行なわれてきた（非特許文献２、特許文献８、特許文献９参照）。
【０００４】
一方、ストレス社会である現代では、２０歳代、３０歳代女性にストレスによる生理不順が増加しており、これに伴う皮膚障害の一つとして生理不順由来のしみが問題となっている。これらは、一般的な日焼けによるしみや日焼けによる肌質の異常と複合的な症状を呈しており、対応化粧品の開発が望まれている。
【０００５】
しかしながら、これまで開発されている多くは、個々の有用性、皮膚外用剤への配合検討が主であり、複合原因による症状に対する有効性、安全性、コスト性等の面において問題があり、未だ充分に満足のいくものではなかった。以下に従来の公知文献を挙げる。
【０００６】
【非特許文献１】武田ら監修、化粧品の有用性、薬事日報社、１４４−１６１、２００１
【非特許文献２】正木仁,FRAGRANCE JOURNAL，Vol.３２,No.４，２００４，２６−３２
【特許文献１】特開平８−４８６２１
【特許文献２】特開平８−２８３１４３
【特許文献３】特開平９−３１５９２８
【特許文献４】特開２０００−１０９４７６
【特許文献５】特開２００１−２５５８
【特許文献６】特開２００２−１１４６２６
【特許文献７】特開２００３−１０４８３５
【特許文献８】特開２００４−１６８７３２
【特許文献９】特開２００４−２３８３１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、日焼けや生理不順等複数の原因に由来して発生する色黒、肌質の異常、しみ等の改善に優れた美白用皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以上のような現状に鑑み、真に優れた美白効果を有する皮膚外用剤を得るべく鋭意研究を重ねた結果、（Ａ）高いチロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、（Ｂ）メラニン合成抑制作用のあるサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物、（Ｃ）活性酸素消去作用のあるワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物、（Ｄ）エストロゲン様作用のあるカッコン抽出物及び（Ｅ）抗炎症作用のあるアセチルチロシンを併用した皮膚外用剤に、優れた美白効果及び日焼け後の肌質改善効果、しみ改善効果を高める相乗効果を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本願発明は下記の請求項により構成されている。
請求項１： 下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
請求項２： メラニン合成抑制剤が、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物、から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
請求項３： 活性酸素消去剤が、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明に係る美白用皮膚外用剤は以上のように構成したから、（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、（Ｂ）メラニン合成抑制剤（例：サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物等から選ばれる１種以上の植物抽出物）、（Ｃ）活性酸素消去剤（例：ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物等から選ばれる１種以上の植物抽出物）、（Ｄ）エストロゲン様作用のあるカッコン抽出物、及び（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン等の各成分の相乗作用により、優れた美白効果及び日焼け後の肌質改善効果、しみ改善効果を有する安全性の高い美白用皮膚外用剤が得られるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の必須構成成分の一つであるソウハクヒとは、クワ科（Moraceae）クワ（Morus）マグワ（Morus alba L.）の根皮で、このマグワは東アジアで広く栽培されている。ソウハクヒ抽出物にチロシナーゼ活性阻害作用のあることは、広く知られている。本発明で用いるソウハクヒ抽出物は、通常チロシナーゼ活性阻害作用を高めたものを使用するのが好ましい。
【００１２】
本発明において用いるメラニン生成抑制剤は、既知のメラニン合成抑制剤で良いが、スクリーニングにより確認した結果、特に、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物が好ましい。これらを１種又は２種以上の組み合わせで使用することもできる。
【００１３】
本発明において用いるサンザシとは、バラ（Rosaceae）サンザシ属（Crataegus）サンザシ（Crataegus cuneata Sieb.et Zucc.）の果実である。
【００１４】
本発明において用いるセイヨウボダイジュとは、シナノキ科（Tiliaceae）シナノキ属（Tilia）のTilia cordata Mill.、Tilia platyphyllos Scop.、Tilia europaea Linneの花又は／及び葉である。
【００１５】
本発明において用いるクロレラとは、緑藻網クロロコックム目クロレラ属（Chlorella）クロレラ（Chlorella vulgaris）で、単細胞藻である。
【００１６】
本発明において用いる活性酸素消去剤は、一般に広く使用されている活性酸素消去作用が期待されるものの中で、効果及び安全性の高い、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物が主たるものである。
【００１７】
本発明において用いるワレモコウとは、バラ科（Rosaceae）ワレモコウ属（Sanguisorba）ワレモコウ（Sanguisorba officinalis）の根茎である。
【００１８】
本発明において用いるボタンピとは、ボタン科（Paeoniaceae）ボタン属（Paeonia）、ボタン（Paeonia suffruticosa）の根皮である。
【００１９】
本発明において用いるオリーブとは、モクセイ科（Oleaceae）、オリーブ属（Olea）、オリーブ（Olea europaea）の葉である。
【００２０】
本発明において用いる茶類としては、緑茶（煎茶、焙じ茶、玉露、かぶせ茶、てん茶等）、ウーロン茶，紅茶等の不発酵茶、半発酵茶、発酵茶を挙げることができる。
【００２１】
本発明で使用するエストローゲン様作用剤は、一般に女性ホルモン様作用を有するとして広く使用されているもので良く、ダイズ抽出物、カッコン抽出物、プエラリア・ミリィフィカ抽出物、レッドクローバー抽出物等があるが、イソフラボノイド含有量の高いカッコン抽出物を用いる。
【００２２】
本発明において用いるカッコンとは、マメ科（Leguminosae）クズ属（Pueraria）、クズ（Pueraria lobata）の根である。カッコン抽出物は、プエラリン、ダイゼインなどのイソフラボノイドを含有し、エストローゲン様作用を有することは、広く知られている。通常カラム処理して、イソフラボン濃度を高めた抽出物を使用する。
【００２３】
本発明において用いるアセチルチロシンは、化粧品に一般に皮膚コンディショニング剤として使用されているものであるが、ヒアルロニダーゼ阻害作用のあることは、これまで知られていない。
【００２４】
本発明において用いる抽出物の調製方法について、以下に例をあげて詳述する（以下の方法に限られるものではない。）。
【００２５】
（製造例１）ソウハクヒ抽出物の製法
日局ソウハクヒ３００ｇに３０vol％エタノール溶液３０００ｇを加え、５０℃にて８時間抽出した後、ろ過し、ろ液を減圧下約５００ｇまで濃縮する。濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。３０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を減圧乾固した後、５０％１，３−ブチレングリコール３００ｇを加え溶解した後、ろ過して、ソウハクヒ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、３．１２％であった。
【００２６】
（製造例２）サンザシ抽出物の製法
サンザシ１００ｇに３０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を２００ｇまで濃縮した後、濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。１０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を濃縮乾固する。乾固物に５０％１，３−ブチレングリコール５００ｇを加え溶解した後、ろ過して、サンザシ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．５４％であった。
【００２７】
（製造例３）セイヨウボダイジュ抽出物
セイヨウボイジュ１００ｇに５０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を２００ｇまで濃縮した後、濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。１０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を濃縮乾固する。乾固物に５０％１，３−ブチレングリコール５００ｇを加え溶解した後、ろ過して、セイヨウボダイジュ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．７４％であった。
【００２８】
（製造例４）クロレラ抽出物
クロレラ１００ｇに精製水３０００ｇを加え、７０℃にて５時間抽出し、冷後、ろ過する。ろ液を減圧下、１０００ｇまで濃縮する。濃縮液に活性炭を加え、５０℃にて、脱色脱臭する。ろ過後、ろ液に３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇを加え、更にろ過し、クロレラ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、２．８％であった。
【００２９】
（製造例５）ワレモコウ抽出物の製法
ワレモコウ１００ｇに５０vol％エタノール溶液１０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してワレモコウ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．７４％であった。
【００３０】
（製造例６）ボタンピ抽出物の製法
ボタンピ１００ｇに５０％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してボタンピ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．１３％であった。
【００３１】
（製造例７）オリーブ葉抽出物の製法
オリーブ葉１００ｇに５０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、５０℃にて８時間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してオリーブ葉抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．５２％であった。
【００３２】
（製造例８）茶抽出物の製造法
緑茶１００ｇに５０vol％エタノール２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出後、これをろ過する。ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後ろ過して茶葉抽出物を得る。製品の蒸発残留物は、１．９５％であった。
【００３３】
（製造例９）カッコン抽出物の製造
カッコン１００ｇに無水エタノール２０００ｍＬを加え、室温で５日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下濃縮乾固し、５０％１，３−ブチレングリコール溶液２００ｇを加え溶解した後、ろ過してカッコン抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１.５３％であった。
【００３４】
つぎに、上記製法にて製造した抽出物及びアセチルチロシンの個々の効果について、参考例として例示する。
【００３５】
（参考例１）ソウハクヒ抽出物のチロシナーゼ活性阻害作用
試験試料は、製造例１で５０％１，３−ブチレングリコール溶液に溶解前の乾固物を用い、精製水にて希釈し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度とした。１０％ＦＢＳ（牛胎児血清；日冷より購入）及びテオフィリン（０．０９ｍｇ／ｍＬ）含有ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、マウス由来Ｂ１６メラノーマ培養細胞を９６穴プレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した後、試験試料の各濃度を添加し、３７℃、５％ＣＯ２にてさらに３日間培養した。チロシナーゼ活性の測定前にウエル中の培地は除去し、ＰＢＳ１００μＬで２回洗浄した。各ウエル中に４５μＬｋ１％トラインＸ（ローム・アンド・ハウス社）を含むＰＢＳを加え、１分間プレートを振動させ、細胞膜を破壊し、マイクロプレートリーダーで、波長４７５ｎｍの吸光度を測定し、これを０分時の吸光度とした。その後、すばやく５μＬの１０ｍＭのＬ-ＤＯＰＡ溶液を加えて、３７℃にて６０分間インキュベートした。１分間プレートを振動させた後、同様に吸光度を測定し、６０分時の吸光度とした。試験試料を添加していない（コントロール）場合の０分時と６０分時の吸光度差に対する試験試料の吸光度差の割合をチロシナーゼ活性阻害率とした。チロシナーゼ活性阻害率は、７８．６％であった。
なお、前記製造例１のカラム処理を行わないソウハクヒ抽出物とカラム処理したソウハクヒ抽出物では、約１０倍の阻害活性の差が現われた。
【００３６】
（参考例２）メラニン生成抑制効果試験
製造例２〜４の各抽出物をＰＢＳ（−）にて希釈して固形分換算で、０．０５ｍｇ／ｍＬとしたものを試験試料とした。マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて、３５ｍＭのシャーレに５×１０４cellずつ播種し、５％ＣＯ２にて３７℃２４時間培養した。２４時間後、シャーレの培地を除去し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍＬと試験試料２０μＬ加え、さらに３７℃にて３日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、１．５ｍＬチュウブに入れ、２５℃、１２０００回転、１０分間遠心操作し、細胞ペレットを作成した。コントロールには、２０μＬのＰＢＳ（−）を用いた。評価は、下記の評価基準にて行なった。
【００３７】
＜評価基準＞
細胞ペレットの色調
０−コントロールと同様な黒色
１−コントロールに比べわずかに薄い黒色
２−コントロールに比べて明瞭に薄い黒色
３−灰色に近い黒色
４−灰色
５−白色
細胞ペレットの量
１−コントロールに比べ明瞭に少ない。
２−コントロールに比べわずかに少ない。
３−コントロールと同量
試験結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示したように、抽出物にはメラニン生成抑制効果が見られ、細胞毒性も少なかった。
【００４０】
（参考例３）
活性酸素消去能の測定は、製造例５〜８の抽出物を用いて、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去能を測定した。ＳＯＤ様活性は、ＮＢＴ法（ＸＯＤ系と組み合わせたBeauchampsらの方法 Anal.Bioche.,４４、２７９〜２８７、１９７１）に従った。ＤＰＰＨラジカル（ジフェニルピクリルヒドラジルラジカル）消去能の測定は、ＤＰＰＨラジカル（Sigma社）をエタノールに溶解し０．１ｍＭ溶液とし、０．１ｍＭＤＰＰＨラジカル溶液３ｍＬを試験管にとり、各濃度に精製水にて希釈した試験溶液０．５ｍＬを加え、室温で１０分間放置後、波長５１７ｎｍで吸光度を測定する方法で行った。試験結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
（参考例４）
エストロゲン様作用の測定は、製造例９のカッコン抽出物についてエストロゲン様作用活性をエストロゲン依存性細胞の増殖に対する影響を調べる方法（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ，５９５−６０２，１９９２）で測定した。ヒト乳がん細胞由来のＭＣＦ−７細胞を５％ＦＢＳ（チャコール・デキストラン処理）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＥａｇｌｅｓ ＭＥＭ（フェノールレッド除去）を用いて、５×１０４ ｃｅｌｌ/ｍＬの密度で浮遊させた細胞懸濁液０.１ｍＬを９６穴マイクロカルチャープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後各濃度の試料をカルチャープレートに添加し、６日間培養を行なった。培養後ＭＴＴ還元法にて細胞濃度の測定を行い、エストロゲン様作用とした。本発明で使用するカッコン抽出物を０．５％添加した結果は、増殖率１４２．３％であった。
【００４３】
（参考例５）ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の測定
ヒアルロニダーゼは、結合組織に分布するヒアルロン酸の加水分解酵素であり、炎症時において活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞及び血管の透過性を高める役割を演じると考えられている。また起炎酵素として知られており、抗炎症剤や抗アレルギー剤により阻害されることも知られている。従って、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用は、抗アレルギー活性の一つとされている。
【００４４】
（試験方法）
アセチルチロシンを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５に調製）にて各濃度に希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Sigma社製，TypeIV-Ｓ，最終酵素活性を４００NFunit/ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてcompound４８/８０（Sigma社製）の酢酸緩衝液溶液（０.１mg/ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度０．４mg/ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４.９５gに水５０ｍＬを加え、１N水酸化ナトリウム溶液にてpH９.１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０gに１０Ｎ塩酸溶液１２.５ｍＬ、酢酸８７.５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各資料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、阻害活性率を求め、各濃度より５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を求めた。ＩＣ５０は、３．６２ｍｇ／ｍＬであった。
【００４５】
本発明の必須成分であるソウハクヒ抽出物、メラニン生成抑制剤、活性酸素消去剤、カッコン抽出物及びアセチルチロシンの配合量は、特に規定するものではない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、乾燥固形物に換算して好ましくは、０．０００１％〜１０．０％、特に０．００１％〜１．０％が効果の面から好ましい。
【００４６】
本発明の皮膚外用剤は、上記必須成分以外に通常の皮膚外用剤で使用される任意の成分を含有することができる。例えば、油分、湿潤剤、紫外線防止剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤の他、皮脂分泌調整剤、消炎剤、収斂剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤等、さらに生理活性作用を有する動植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を必要に応じて適宜配合し、剤型に応じて常法により製造することができる。
【００４７】
本発明の皮膚外用剤の剤型は、任意であり、化粧水などの可溶化系、乳液、クリームなどの乳化系、または、軟膏、分散液、粉末系などの従来皮膚外用剤に用いられる何れの剤型でもかまわない。また、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）美白効果試験
夏期の太陽光に４時間（１日２時間２日間）晒された２０〜２５歳の健常な女性２０名を被験者とし、左右上腕内側部皮膚を対象として太陽光に晒された日の５日後より、各皮膚外用剤を朝夕１回ずつ２週間塗布した。皮膚外用剤の処方は下記に示す。
【００５０】
（実施例２、３）美白効果用皮膚外用剤
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１６）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら冷却し、クリームを調製した。薬剤で示した抽出物は、製造例で製造したものを使用し、コントロールには、５０％１，３−ブチレングリコール溶液を使用した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（１０）防腐剤 適量
（１１）キサンタンガム ０．１％
（１２）グリセリン １．０％
（１３）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（１４）防腐剤 適量
（１５）薬剤（表３記載） ５．０％
（１６）精製水 残余
【００５１】
【表３】
【００５２】
使用後の淡色化効果を下記の判定基準に基づいて判定した。結果を表４に記す。
【００５３】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな淡色化効果が認められた。
やや有効：コントロールに比較して淡色化効果が認められた。
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった。
【００５４】
また、日焼け後の肌質の改善効果を下記の判定基準に基づいて判定した。結果を表４に記す。
【００５５】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな肌質の改善効果が認められた。
やや有効：コントロールに比較して明らかな肌質の改善効果が認められた。
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４から明らかなように、淡色化効果に関しては、比較例、実施例共に効果の差はなく、有効な結果を示した。チロシナーゼ活性阻害作用効果のあるソウハクヒ抽出物とメラニン合成抑制剤であるサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物の組み合わせにて、有効な淡色化効果があることが確認された。一方、日焼け後の肌質の改善効果では、活性酸素消去剤を加えた組み合わせ、さらにエストロゲン様作用のあるカッコン抽出物を加えた組み合わせ、さらに本発明のアセチルチロシンを組み合わせたクリームに明らかな差異があることが示された。本発明の皮膚外用剤に日焼けの淡色効果及び肌質の改善効果があることが確認された。
【００５８】
（実施例４）しみの改善効果試験
２５歳〜３９歳のしみに悩む女性６０名を被験者とし、各１０名ずつ実施例１，２及び比較例１〜４のクリームを朝夕２回、洗顔後に顔面皮膚に連日塗布し、３ケ月間使用後及び６ケ月間使用した後、しみに対する改善効果について調べた。使用期間中に皮膚の異常を訴えた者はいなかった。効果は、顔面のしみの状態を視覚評価した。結果を表５に示す。
【００５９】
（判定基準）
有効 ：しみが目立たなくなった。
やや有効：しみが以前より目立たなくなった。
効果なし：変化なし。
【００６０】
【表５】
【００６１】
表５より明らかなように、本発明の組み合わせの皮膚外用剤にしみ改善の相乗効果をみいだすことができた。
【００６２】
さらに、本発明による美白用皮膚外用剤の実施例を示す。いずれの実施例も美白効果を有し、安全性の高い皮膚外用剤であった。
【００６３】
（実施例５）化粧水
下記成分（９）〜（１２）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（８）及び（１３）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調製した。
（成分） （重量％）
（１）クインスシードエキス ５．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ２．０％
（４）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．０％
（５）サンザシ抽出物（製造例２） １．０％
（６）ボタンピ抽出物（製造例６） １．０％
（７）カッコン抽出物（製造例９） １．０％
（８）アセチルチロシン ０．０１％
（９）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（１０）エチルアルコール ５．０％
（１１）防腐剤 適量
（１２）香料 適量
（１３）精製水 残余
【００６４】
（実施例６）乳液
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１５）及び（１７）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、乳液を調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合リシノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（１０）防腐剤 適量
（１１）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．０％
（１２）セイヨウボダイジュ抽出物（製造例３） １．０％
（１３）オリーブ葉抽出物（製造例７） １．０％
（１４）カッコン抽出物（製造例９） １．０％
（１５）アセチルチロシン ０．０５％
（１６）香料 適量
（１７）精製水 残余
【００６５】
（実施例７）石けん
石けん製造の定法により下記成分を混合し製した。
（成分） （重量％）
（１）石けん素地 ５３．２％
（２）スクロール １９．４％
（３）ホホバ油 ０．２５％
（４）ソウハクヒ.抽出物（製造例１） １．５％
（５）クロレラ抽出物（製造例４） ０．５％
（６）ボタンピ抽出物（製造例６） ０．５％
（７）カッコン抽出物（製造例９） ０．５％
（８）アセチルチロシン ０．１％
（９）濃グリセリン ６．５％
（１０）ヒドロキシエタンジホスホン酸 ０．１５％
（１１）常水 残余
【００６６】
（実施例８）クレンジングジェル
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（１１）及び（１３）を７０℃に加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１２）を加えてクレンジングジェルを製した。
（成分） （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５８．８％
（３）防腐剤 適量
（４）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．５％
（５）セイヨウボダイジュ抽出物（製造例３） ０．５％
（６）ワレモコウ抽出物（製造例５） ０．５％
（７）カッコン抽出物（製造例９） ０．５％
（８）アセチルチロシン ０．１％
（９）濃グリセリン ５．９％
（１０）アスコルビン酸 ０．５％
（１１）ソルビトール ５．０％
（１２）香料 適量
（１３）精製水 残余
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン合成阻害剤、活性酸素消去剤、エストロゲン様作用剤及びヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する美白用皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、メラニン合成抑制剤、活性酸素消去剤、エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物及びヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシンを配合した、皮膚美白効果が著しく改良され、日焼け後の肌質改善に優れ、高いしみ改善効果を持つ美白用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚におけるメラニン色素の役割は、紫外線による皮膚障害を緩和することにあるが、局所的な色素沈着、いわゆるシミ等は過剰にメラニン合成が亢進しており、美容上大きな問題であり、これらを制御できる美白剤は極めてニーズが高い。皮膚におけるメラニン生成及び代謝機構から、美白薬剤の作用機序として、メラノサイト内のメラニン生成抑制、既成メラニンの還元、表皮内メラニン排出促進、メラノサイトに対する選択的毒性が考えられる。その中で、美白化粧品にはメラノサイトに対する緩和性から、アルブチン、ビタミンＣ及びその誘導体、エラグ酸、ルシノール、カモミラＥＴなどが配合されている。メラニン生成抑制剤の評価方としては、in vitroの評価としては、チロシナーゼ活性阻害作用、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン合成阻害が検討されてきた（非特許文献１、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）。
【０００３】
また、活性酸素による色素沈着に対する係りも研究されてきており、活性酸素の中で最も安定であるＨ２Ｏ２がメラノーマ細胞のチロシナーゼのレベルを上昇させる。この作用はＨ２Ｏ２に特異なものである。また、メラニン生成の律速段階であるチロシナーゼによるチロシンのＤＯＰＡへのhydroxylation及びドーパキノンへの酸化過程において活性酸素が関与するなどの報告がある（非特許文献２）。このようなことから、これまで活性酸素から皮膚を守る化粧料が開発されており、特に天然物から活性酸素消去剤の開発が行なわれてきた（非特許文献２、特許文献８、特許文献９参照）。
【０００４】
一方、ストレス社会である現代では、２０歳代、３０歳代女性にストレスによる生理不順が増加しており、これに伴う皮膚障害の一つとして生理不順由来のしみが問題となっている。これらは、一般的な日焼けによるしみや日焼けによる肌質の異常と複合的な症状を呈しており、対応化粧品の開発が望まれている。
【０００５】
しかしながら、これまで開発されている多くは、個々の有用性、皮膚外用剤への配合検討が主であり、複合原因による症状に対する有効性、安全性、コスト性等の面において問題があり、未だ充分に満足のいくものではなかった。以下に従来の公知文献を挙げる。
【０００６】
【非特許文献１】武田ら監修、化粧品の有用性、薬事日報社、１４４−１６１、２００１
【非特許文献２】正木仁,FRAGRANCE JOURNAL，Vol.３２,No.４，２００４，２６−３２
【特許文献１】特開平８−４８６２１
【特許文献２】特開平８−２８３１４３
【特許文献３】特開平９−３１５９２８
【特許文献４】特開２０００−１０９４７６
【特許文献５】特開２００１−２５５８
【特許文献６】特開２００２−１１４６２６
【特許文献７】特開２００３−１０４８３５
【特許文献８】特開２００４−１６８７３２
【特許文献９】特開２００４−２３８３１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、日焼けや生理不順等複数の原因に由来して発生する色黒、肌質の異常、しみ等の改善に優れた美白用皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以上のような現状に鑑み、真に優れた美白効果を有する皮膚外用剤を得るべく鋭意研究を重ねた結果、（Ａ）高いチロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、（Ｂ）メラニン合成抑制作用のあるサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物、（Ｃ）活性酸素消去作用のあるワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物、（Ｄ）エストロゲン様作用のあるカッコン抽出物及び（Ｅ）抗炎症作用のあるアセチルチロシンを併用した皮膚外用剤に、優れた美白効果及び日焼け後の肌質改善効果、しみ改善効果を高める相乗効果を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本願発明は下記の請求項により構成されている。
請求項１： 下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
請求項２： メラニン合成抑制剤が、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物、から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
請求項３： 活性酸素消去剤が、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明に係る美白用皮膚外用剤は以上のように構成したから、（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物、（Ｂ）メラニン合成抑制剤（例：サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物等から選ばれる１種以上の植物抽出物）、（Ｃ）活性酸素消去剤（例：ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物等から選ばれる１種以上の植物抽出物）、（Ｄ）エストロゲン様作用のあるカッコン抽出物、及び（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン等の各成分の相乗作用により、優れた美白効果及び日焼け後の肌質改善効果、しみ改善効果を有する安全性の高い美白用皮膚外用剤が得られるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の必須構成成分の一つであるソウハクヒとは、クワ科（Moraceae）クワ（Morus）マグワ（Morus alba L.）の根皮で、このマグワは東アジアで広く栽培されている。ソウハクヒ抽出物にチロシナーゼ活性阻害作用のあることは、広く知られている。本発明で用いるソウハクヒ抽出物は、通常チロシナーゼ活性阻害作用を高めたものを使用するのが好ましい。
【００１２】
本発明において用いるメラニン生成抑制剤は、既知のメラニン合成抑制剤で良いが、スクリーニングにより確認した結果、特に、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物が好ましい。これらを１種又は２種以上の組み合わせで使用することもできる。
【００１３】
本発明において用いるサンザシとは、バラ（Rosaceae）サンザシ属（Crataegus）サンザシ（Crataegus cuneata Sieb.et Zucc.）の果実である。
【００１４】
本発明において用いるセイヨウボダイジュとは、シナノキ科（Tiliaceae）シナノキ属（Tilia）のTilia cordata Mill.、Tilia platyphyllos Scop.、Tilia europaea Linneの花又は／及び葉である。
【００１５】
本発明において用いるクロレラとは、緑藻網クロロコックム目クロレラ属（Chlorella）クロレラ（Chlorella vulgaris）で、単細胞藻である。
【００１６】
本発明において用いる活性酸素消去剤は、一般に広く使用されている活性酸素消去作用が期待されるものの中で、効果及び安全性の高い、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物が主たるものである。
【００１７】
本発明において用いるワレモコウとは、バラ科（Rosaceae）ワレモコウ属（Sanguisorba）ワレモコウ（Sanguisorba officinalis）の根茎である。
【００１８】
本発明において用いるボタンピとは、ボタン科（Paeoniaceae）ボタン属（Paeonia）、ボタン（Paeonia suffruticosa）の根皮である。
【００１９】
本発明において用いるオリーブとは、モクセイ科（Oleaceae）、オリーブ属（Olea）、オリーブ（Olea europaea）の葉である。
【００２０】
本発明において用いる茶類としては、緑茶（煎茶、焙じ茶、玉露、かぶせ茶、てん茶等）、ウーロン茶，紅茶等の不発酵茶、半発酵茶、発酵茶を挙げることができる。
【００２１】
本発明で使用するエストローゲン様作用剤は、一般に女性ホルモン様作用を有するとして広く使用されているもので良く、ダイズ抽出物、カッコン抽出物、プエラリア・ミリィフィカ抽出物、レッドクローバー抽出物等があるが、イソフラボノイド含有量の高いカッコン抽出物を用いる。
【００２２】
本発明において用いるカッコンとは、マメ科（Leguminosae）クズ属（Pueraria）、クズ（Pueraria lobata）の根である。カッコン抽出物は、プエラリン、ダイゼインなどのイソフラボノイドを含有し、エストローゲン様作用を有することは、広く知られている。通常カラム処理して、イソフラボン濃度を高めた抽出物を使用する。
【００２３】
本発明において用いるアセチルチロシンは、化粧品に一般に皮膚コンディショニング剤として使用されているものであるが、ヒアルロニダーゼ阻害作用のあることは、これまで知られていない。
【００２４】
本発明において用いる抽出物の調製方法について、以下に例をあげて詳述する（以下の方法に限られるものではない。）。
【００２５】
（製造例１）ソウハクヒ抽出物の製法
日局ソウハクヒ３００ｇに３０vol％エタノール溶液３０００ｇを加え、５０℃にて８時間抽出した後、ろ過し、ろ液を減圧下約５００ｇまで濃縮する。濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。３０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を減圧乾固した後、５０％１，３−ブチレングリコール３００ｇを加え溶解した後、ろ過して、ソウハクヒ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、３．１２％であった。
【００２６】
（製造例２）サンザシ抽出物の製法
サンザシ１００ｇに３０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を２００ｇまで濃縮した後、濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。１０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を濃縮乾固する。乾固物に５０％１，３−ブチレングリコール５００ｇを加え溶解した後、ろ過して、サンザシ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．５４％であった。
【００２７】
（製造例３）セイヨウボダイジュ抽出物
セイヨウボイジュ１００ｇに５０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を２００ｇまで濃縮した後、濃縮液を合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムに通液する。１０vol％エタノール溶液にて洗浄後、５０vol％エタノール溶液にて溶出し、溶出液を濃縮乾固する。乾固物に５０％１，３−ブチレングリコール５００ｇを加え溶解した後、ろ過して、セイヨウボダイジュ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．７４％であった。
【００２８】
（製造例４）クロレラ抽出物
クロレラ１００ｇに精製水３０００ｇを加え、７０℃にて５時間抽出し、冷後、ろ過する。ろ液を減圧下、１０００ｇまで濃縮する。濃縮液に活性炭を加え、５０℃にて、脱色脱臭する。ろ過後、ろ液に３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇを加え、更にろ過し、クロレラ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、２．８％であった。
【００２９】
（製造例５）ワレモコウ抽出物の製法
ワレモコウ１００ｇに５０vol％エタノール溶液１０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してワレモコウ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．７４％であった。
【００３０】
（製造例６）ボタンピ抽出物の製法
ボタンピ１００ｇに５０％エタノール溶液２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してボタンピ抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．１３％であった。
【００３１】
（製造例７）オリーブ葉抽出物の製法
オリーブ葉１００ｇに５０vol％エタノール溶液２０００ｇを加え、５０℃にて８時間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後、ろ過してオリーブ葉抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１．５２％であった。
【００３２】
（製造例８）茶抽出物の製造法
緑茶１００ｇに５０vol％エタノール２０００ｇを加え、室温にて３日間抽出後、これをろ過する。ろ液を減圧下、濃縮乾固する。乾固物を３０％１，３−ブチレングリコール１０００ｇに溶解した後ろ過して茶葉抽出物を得る。製品の蒸発残留物は、１．９５％であった。
【００３３】
（製造例９）カッコン抽出物の製造
カッコン１００ｇに無水エタノール２０００ｍＬを加え、室温で５日間抽出する。これをろ過し、ろ液を減圧下濃縮乾固し、５０％１，３−ブチレングリコール溶液２００ｇを加え溶解した後、ろ過してカッコン抽出物を製する。製品の蒸発残留物は、１.５３％であった。
【００３４】
つぎに、上記製法にて製造した抽出物及びアセチルチロシンの個々の効果について、参考例として例示する。
【００３５】
（参考例１）ソウハクヒ抽出物のチロシナーゼ活性阻害作用
試験試料は、製造例１で５０％１，３−ブチレングリコール溶液に溶解前の乾固物を用い、精製水にて希釈し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度とした。１０％ＦＢＳ（牛胎児血清；日冷より購入）及びテオフィリン（０．０９ｍｇ／ｍＬ）含有ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、マウス由来Ｂ１６メラノーマ培養細胞を９６穴プレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した後、試験試料の各濃度を添加し、３７℃、５％ＣＯ２にてさらに３日間培養した。チロシナーゼ活性の測定前にウエル中の培地は除去し、ＰＢＳ１００μＬで２回洗浄した。各ウエル中に４５μＬｋ１％トラインＸ（ローム・アンド・ハウス社）を含むＰＢＳを加え、１分間プレートを振動させ、細胞膜を破壊し、マイクロプレートリーダーで、波長４７５ｎｍの吸光度を測定し、これを０分時の吸光度とした。その後、すばやく５μＬの１０ｍＭのＬ-ＤＯＰＡ溶液を加えて、３７℃にて６０分間インキュベートした。１分間プレートを振動させた後、同様に吸光度を測定し、６０分時の吸光度とした。試験試料を添加していない（コントロール）場合の０分時と６０分時の吸光度差に対する試験試料の吸光度差の割合をチロシナーゼ活性阻害率とした。チロシナーゼ活性阻害率は、７８．６％であった。
なお、前記製造例１のカラム処理を行わないソウハクヒ抽出物とカラム処理したソウハクヒ抽出物では、約１０倍の阻害活性の差が現われた。
【００３６】
（参考例２）メラニン生成抑制効果試験
製造例２〜４の各抽出物をＰＢＳ（−）にて希釈して固形分換算で、０．０５ｍｇ／ｍＬとしたものを試験試料とした。マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて、３５ｍＭのシャーレに５×１０４cellずつ播種し、５％ＣＯ２にて３７℃２４時間培養した。２４時間後、シャーレの培地を除去し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍＬと試験試料２０μＬ加え、さらに３７℃にて３日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、１．５ｍＬチュウブに入れ、２５℃、１２０００回転、１０分間遠心操作し、細胞ペレットを作成した。コントロールには、２０μＬのＰＢＳ（−）を用いた。評価は、下記の評価基準にて行なった。
【００３７】
＜評価基準＞
細胞ペレットの色調
０−コントロールと同様な黒色
１−コントロールに比べわずかに薄い黒色
２−コントロールに比べて明瞭に薄い黒色
３−灰色に近い黒色
４−灰色
５−白色
細胞ペレットの量
１−コントロールに比べ明瞭に少ない。
２−コントロールに比べわずかに少ない。
３−コントロールと同量
試験結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１に示したように、抽出物にはメラニン生成抑制効果が見られ、細胞毒性も少なかった。
【００４０】
（参考例３）
活性酸素消去能の測定は、製造例５〜８の抽出物を用いて、ＳＯＤ様活性及びＤＰＰＨラジカル消去能を測定した。ＳＯＤ様活性は、ＮＢＴ法（ＸＯＤ系と組み合わせたBeauchampsらの方法 Anal.Bioche.,４４、２７９〜２８７、１９７１）に従った。ＤＰＰＨラジカル（ジフェニルピクリルヒドラジルラジカル）消去能の測定は、ＤＰＰＨラジカル（Sigma社）をエタノールに溶解し０．１ｍＭ溶液とし、０．１ｍＭＤＰＰＨラジカル溶液３ｍＬを試験管にとり、各濃度に精製水にて希釈した試験溶液０．５ｍＬを加え、室温で１０分間放置後、波長５１７ｎｍで吸光度を測定する方法で行った。試験結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
（参考例４）
エストロゲン様作用の測定は、製造例９のカッコン抽出物についてエストロゲン様作用活性をエストロゲン依存性細胞の増殖に対する影響を調べる方法（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ，５９５−６０２，１９９２）で測定した。ヒト乳がん細胞由来のＭＣＦ−７細胞を５％ＦＢＳ（チャコール・デキストラン処理）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＥａｇｌｅｓ ＭＥＭ（フェノールレッド除去）を用いて、５×１０４ ｃｅｌｌ/ｍＬの密度で浮遊させた細胞懸濁液０.１ｍＬを９６穴マイクロカルチャープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後各濃度の試料をカルチャープレートに添加し、６日間培養を行なった。培養後ＭＴＴ還元法にて細胞濃度の測定を行い、エストロゲン様作用とした。本発明で使用するカッコン抽出物を０．５％添加した結果は、増殖率１４２．３％であった。
【００４３】
（参考例５）ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の測定
ヒアルロニダーゼは、結合組織に分布するヒアルロン酸の加水分解酵素であり、炎症時において活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞及び血管の透過性を高める役割を演じると考えられている。また起炎酵素として知られており、抗炎症剤や抗アレルギー剤により阻害されることも知られている。従って、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用は、抗アレルギー活性の一つとされている。
【００４４】
（試験方法）
アセチルチロシンを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５に調製）にて各濃度に希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Sigma社製，TypeIV-Ｓ，最終酵素活性を４００NFunit/ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてcompound４８/８０（Sigma社製）の酢酸緩衝液溶液（０.１mg/ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度０．４mg/ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４.９５gに水５０ｍＬを加え、１N水酸化ナトリウム溶液にてpH９.１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０gに１０Ｎ塩酸溶液１２.５ｍＬ、酢酸８７.５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各資料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、阻害活性率を求め、各濃度より５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を求めた。ＩＣ５０は、３．６２ｍｇ／ｍＬであった。
【００４５】
本発明の必須成分であるソウハクヒ抽出物、メラニン生成抑制剤、活性酸素消去剤、カッコン抽出物及びアセチルチロシンの配合量は、特に規定するものではない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、乾燥固形物に換算して好ましくは、０．０００１％〜１０．０％、特に０．００１％〜１．０％が効果の面から好ましい。
【００４６】
本発明の皮膚外用剤は、上記必須成分以外に通常の皮膚外用剤で使用される任意の成分を含有することができる。例えば、油分、湿潤剤、紫外線防止剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤の他、皮脂分泌調整剤、消炎剤、収斂剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤等、さらに生理活性作用を有する動植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を必要に応じて適宜配合し、剤型に応じて常法により製造することができる。
【００４７】
本発明の皮膚外用剤の剤型は、任意であり、化粧水などの可溶化系、乳液、クリームなどの乳化系、または、軟膏、分散液、粉末系などの従来皮膚外用剤に用いられる何れの剤型でもかまわない。また、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）美白効果試験
夏期の太陽光に４時間（１日２時間２日間）晒された２０〜２５歳の健常な女性２０名を被験者とし、左右上腕内側部皮膚を対象として太陽光に晒された日の５日後より、各皮膚外用剤を朝夕１回ずつ２週間塗布した。皮膚外用剤の処方は下記に示す。
【００５０】
（実施例２、３）美白効果用皮膚外用剤
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１６）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら冷却し、クリームを調製した。薬剤で示した抽出物は、製造例で製造したものを使用し、コントロールには、５０％１，３−ブチレングリコール溶液を使用した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（１０）防腐剤 適量
（１１）キサンタンガム ０．１％
（１２）グリセリン １．０％
（１３）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（１４）防腐剤 適量
（１５）薬剤（表３記載） ５．０％
（１６）精製水 残余
【００５１】
【表３】
【００５２】
使用後の淡色化効果を下記の判定基準に基づいて判定した。結果を表４に記す。
【００５３】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな淡色化効果が認められた。
やや有効：コントロールに比較して淡色化効果が認められた。
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった。
【００５４】
また、日焼け後の肌質の改善効果を下記の判定基準に基づいて判定した。結果を表４に記す。
【００５５】
（判定基準）
有効 ：コントロールに比較して明らかな肌質の改善効果が認められた。
やや有効：コントロールに比較して明らかな肌質の改善効果が認められた。
効果なし：コントロールとほぼ同程度であった。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４から明らかなように、淡色化効果に関しては、比較例、実施例共に効果の差はなく、有効な結果を示した。チロシナーゼ活性阻害作用効果のあるソウハクヒ抽出物とメラニン合成抑制剤であるサンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物の組み合わせにて、有効な淡色化効果があることが確認された。一方、日焼け後の肌質の改善効果では、活性酸素消去剤を加えた組み合わせ、さらにエストロゲン様作用のあるカッコン抽出物を加えた組み合わせ、さらに本発明のアセチルチロシンを組み合わせたクリームに明らかな差異があることが示された。本発明の皮膚外用剤に日焼けの淡色効果及び肌質の改善効果があることが確認された。
【００５８】
（実施例４）しみの改善効果試験
２５歳〜３９歳のしみに悩む女性６０名を被験者とし、各１０名ずつ実施例１，２及び比較例１〜４のクリームを朝夕２回、洗顔後に顔面皮膚に連日塗布し、３ケ月間使用後及び６ケ月間使用した後、しみに対する改善効果について調べた。使用期間中に皮膚の異常を訴えた者はいなかった。効果は、顔面のしみの状態を視覚評価した。結果を表５に示す。
【００５９】
（判定基準）
有効 ：しみが目立たなくなった。
やや有効：しみが以前より目立たなくなった。
効果なし：変化なし。
【００６０】
【表５】
【００６１】
表５より明らかなように、本発明の組み合わせの皮膚外用剤にしみ改善の相乗効果をみいだすことができた。
【００６２】
さらに、本発明による美白用皮膚外用剤の実施例を示す。いずれの実施例も美白効果を有し、安全性の高い皮膚外用剤であった。
【００６３】
（実施例５）化粧水
下記成分（９）〜（１２）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（８）及び（１３）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調製した。
（成分） （重量％）
（１）クインスシードエキス ５．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ２．０％
（４）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．０％
（５）サンザシ抽出物（製造例２） １．０％
（６）ボタンピ抽出物（製造例６） １．０％
（７）カッコン抽出物（製造例９） １．０％
（８）アセチルチロシン ０．０１％
（９）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（１０）エチルアルコール ５．０％
（１１）防腐剤 適量
（１２）香料 適量
（１３）精製水 残余
【００６４】
（実施例６）乳液
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１５）及び（１７）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、乳液を調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合リシノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（１０）防腐剤 適量
（１１）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．０％
（１２）セイヨウボダイジュ抽出物（製造例３） １．０％
（１３）オリーブ葉抽出物（製造例７） １．０％
（１４）カッコン抽出物（製造例９） １．０％
（１５）アセチルチロシン ０．０５％
（１６）香料 適量
（１７）精製水 残余
【００６５】
（実施例７）石けん
石けん製造の定法により下記成分を混合し製した。
（成分） （重量％）
（１）石けん素地 ５３．２％
（２）スクロール １９．４％
（３）ホホバ油 ０．２５％
（４）ソウハクヒ.抽出物（製造例１） １．５％
（５）クロレラ抽出物（製造例４） ０．５％
（６）ボタンピ抽出物（製造例６） ０．５％
（７）カッコン抽出物（製造例９） ０．５％
（８）アセチルチロシン ０．１％
（９）濃グリセリン ６．５％
（１０）ヒドロキシエタンジホスホン酸 ０．１５％
（１１）常水 残余
【００６６】
（実施例８）クレンジングジェル
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（１１）及び（１３）を７０℃に加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１２）を加えてクレンジングジェルを製した。
（成分） （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５８．８％
（３）防腐剤 適量
（４）ソウハクヒ抽出物（製造例１） １．５％
（５）セイヨウボダイジュ抽出物（製造例３） ０．５％
（６）ワレモコウ抽出物（製造例５） ０．５％
（７）カッコン抽出物（製造例９） ０．５％
（８）アセチルチロシン ０．１％
（９）濃グリセリン ５．９％
（１０）アスコルビン酸 ０．５％
（１１）ソルビトール ５．０％
（１２）香料 適量
（１３）精製水 残余
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
【請求項２】
メラニン合成抑制剤が、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物、から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【請求項３】
活性酸素消去剤が、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【請求項１】
下記の（Ａ）〜（Ｅ）を含有することを特徴とする美白用皮膚外用剤。
（Ａ）チロシナーゼ活性阻害作用を有するソウハクヒ抽出物
（Ｂ）メラニン合成抑制剤
（Ｃ）活性酸素消去剤
（Ｄ）エストロゲン様作用を有するカッコン抽出物
（Ｅ）ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するアセチルチロシン
【請求項２】
メラニン合成抑制剤が、サンザシ抽出物、セイヨウボダイジュ抽出物、クロレラ抽出物、から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【請求項３】
活性酸素消去剤が、ワレモコウ抽出物、ボタンピ抽出物、オリーブ葉抽出物、茶抽出物から選ばれる１種以上の植物抽出物である請求項１の美白用皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００６−２４１００９（Ｐ２００６−２４１００９Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５５３７０（Ｐ２００５−５５３７０）
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【出願人】（５９９０９８５１８）株式会社ディーエイチシー (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【出願人】（５９９０９８５１８）株式会社ディーエイチシー (31)
【Ｆターム（参考）】
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