単一光子分光計
３２チャネルＰＭＴセンサーに基づくファイバー化された単一光子の鋭敏な分光計は、広い検出ダイナミックレンジに非常に鋭敏である。分光計は、複数の蛍光マーカー（例えば複数の蛍光染料によって放出された多色蛍光信号または放射の構成など）でラベルが付けられた生体サンプルの正確かつ高速な検出、同定および解析を可能にする。分光計のファイバー化された光入力は、分析された蛍光のファイバー集束に基づいた任意の測定システムへの容易および高効率な結合を可能にする。分光計は非常に正確なＤＮＡ塩基配列決定を提供する。３２チャネルＰＭＴ単一光子検出器は、２０ビット以上の検出ダイナミックレンジを有して、毎秒約３３００のフレームのフレーム率を有している。検出器のピクセルのダイナミックレンジは、毎秒１０８の光子計数に達する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、センサーシステムに関し、特に、複数の蛍光マーカーから多色蛍光放射を検出し、複数の蛍光マーカーでラベル付された生体サンプルの解析のための単一光子センサーシステムおよび方法に関する。センサーシステムおよび検出方法は、光学スペクトル分離ユニットと、検出ユニットと、集められたデータに関する信号処理アルゴリズムと、を含んでいる。
【０００２】
本出願は、２００７年１０月２５日に提出された合衆国仮出願、シリアル番号６１／０００，３２０の優先権を主張する。
【０００３】
本明細書で開示された発明は、国立ヒトゲノム研究所から資金源授与番号Ｒ２１ＨＧ００３７１７０２の下の国庫補助でなされた。したがって、米国政府は本開示において一定の権利を持っている。
【背景技術】
【０００４】
単一光子を登録することに基づいて、多くの蛍光検出技術は利用可能である。上記の技術は通常、単一光子検出（ＳＰＤ）技術と呼ばれる。それらの複雑性と費用のために、バイオ医学の応用では、単一光子検出技術の多くは、時間分解蛍光分光法または単一蛍光性分子の検出に用いられる。
【０００５】
図１のブロック図において示されるように、従来の単一光子検出器はこれまで、単一光子センサーまたは光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器、パルス増幅器、パルス整形器、カウンター、およびコンピューターを含むいくつかのモジュールから成っていた。単一光子検出器の性能を妨げる要因は従来、利用可能な光子計数デバイスの比較的狭い線型性ダイナミックレンジである。検出器のダイナミックレンジは、検出器が単一光子に応答するために必要とする応答時間（τRESPONSE）によって決定される。量τRESPONSEは、デバイスの全部のモジュールの応答時間に依存し、個別のモジュールの応答時間の和であると一般に考えられる。図２のグラフにおいて示されるように、実際上、現在利用可能な単一光子センサーにおける最短の応答時間は１ｎｓである。しかしながら、あるτRESPONSEを有する従来の単一光子ＰＭＴ検出器は、従来、毎秒１０６−１０７光子計数のダイナミックレンジに制限されている。
【０００６】
生物学の応用では（特にＤＮＡ検出において）、ＤＮＡ塩基配列決定システムは、従来、超高速ＤＮＡ塩基配列決定法を処理し、検出することができない。実際、従来のＤＮＡ塩基配列決定装置は毎秒１０−３０フレームでの記録する配列決定処理に制限されている。さらに、従来のＤＮＡマシンのダイナミックレンジは１６ビットに制限されている。ＢｉｇＤｙｅ ＤＮＡ塩基配列決定標準の連続希釈法のための従来の装置はこれまで、望ましいことよりも少なくとも１０倍、相対的に鋭敏ではない。
【０００７】
したがって、毎秒１０７光子計数を超える（例えば毎秒１０８光子計数まで）線型性範囲、毎秒１０−３０フレームを越えるＤＮＡ塩基配列決定処理性能、および非常に鋭敏なＢｉｇＤｙｅ ＤＮＡ塩基配列決定標準を有する光子計数器を有する単一光子検出器を含むセンサーの必要性がある。マルチチャネル単一光子検出器に基づいた（例えば３２チャネルＰＭＴセンサーに基づいた）分光計は、多色放射の極めて正確な高速検出を可能にするだろう。特に、上記の検出器は、蛍光性の成分の組み合わせの非常に正確で高速の認識、およびＤＮＡ塩基配列決定の高品質検出を実証するだろう。
【発明の概要】
【０００８】
３２チャネルＰＭＴセンサーに基づいて、ファイバー化された（ｆｉｂｅｒｉｚｅｄ）単一光子の鋭敏な分光計は、広い検出ダイナミックレンジに非常に鋭敏である。分光計は、複数の蛍光マーカー（例えば複数の蛍光染料によって放出された多色蛍光信号または放射の構成など）でラベルが付けられた生体サンプルの正確かつ高速な検出、同定および解析を可能にする。分光計のファイバー化された光入力は、分析された蛍光のファイバー集束に基づいた任意の測定システムへの容易および高効率な結合を可能にする。分光計は非常に正確なＤＮＡ塩基配列決定を提供する。３２チャネルＰＭＴ単一光子検出器は、２０ビット以上の検出ダイナミックレンジを有して、毎秒約３３００のフレームのフレーム率を有している。検出器のピクセルのダイナミックレンジは、毎秒１０７の光子計数に達する可能性があり、さらに１０倍改良することができる。
【０００９】
複数の蛍光性の成分の組み合わせの検出および認識を可能にするために、マルチチャネル検出器のダイナミックレンジを有効に増加させる信号処理方法が用いられる。一実施形態において、微細な量の複数の蛍光染料の混合物によって放出された単一光子放射を測定することができ、染料混合物における個別の染料の内容を非常に正確に決定することができる蛍光検知センサーは記述される。３２チャネルＰＭＴ、パルス増幅器、コンパレータおよびカウンターを含む上記のセンサー（すなわち単一光子検出器）は、１ｎｓに等しいかまたは１ｎｓより小さい（例えば０．１ｎｓ、０．０１ｎｓ）のτRESPONSE時間を有している可能性がある。個別の蛍光染料によって放出された蛍光信号の正確な分離を可能にする信号処理アルゴリズムが利用される。
【００１０】
特に、ここで実施形態は以下を開示している。
【００１１】
光スペクトル分離器に多色光を伝達する光ファイバー、
少なくとも１つのマルチチャネル光検出器（光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記受信光スペクトルの単一光子に応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している）、
マルチチャネル増幅器（増幅器チャネルはそれぞれ、前記マルチチャネル光検出器の前記センサーチャネルの対応する１つからの光スペクトルに対応する前記電流パルスを受け取り、かつ前記電流パルスを増幅するのに適している）、および
マルチチャネル光子計数器（カウンターチャネルはそれぞれ前記マルチチャネル増幅器の前記増幅器チャネルの対応する１つから前記増幅された電流パルスを受け取るのに適していて、前記マルチチャネル光子計数器は所定の時間間隔上の各カウンターチャネルにおいて前記増幅された電流パルスを合計するのに適した積分器を有している）。
【００１２】
次のステップを具備するＤＮＡ配列を同定する方法もまた開示される。
【００１３】
蛍光染料で選択ＤＮＡ断片にラベルを付けること、
前記ＤＮＡ断片を光ファイバー分離キャピラリーへ入力すること、
前記ＤＮＡ断片から蛍光スペクトルを生成するために、所定波長のレーザー光により前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて前記ラベル付けされたＤＮＡ断片を照明すること、
前記ＤＮＡ断片からの蛍光スペクトルにより光ファイバーを照明すること、
前記光ファイバーは前記蛍光スペクトルを光スペクトル分離器に伝え、
前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器上に入射し、
光検出器チャネルはそれぞれ、感光性ピクセルがある光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じて電流パルスを生成するために適合した複数の感光性ピクセルを有している。
【００１４】
カラーコードされた微小粒子を検出する方法がさらに開示される。
【００１５】
蛍光染料で微小粒子にラベルを付けること、
緩衝液で前記ラベルが付けられた微小粒子を懸濁すること、
所定の速度で光ファイバーキャピラリーに、前記ラベルが付けられた微小粒子を有する前記緩衝液を通すこと、
前記光ファイバーキャピラリー内の前記ラベルが付けられた微小粒子を、蛍光スペクトルをそこから生成するためにレーザー光で照明すること、
前記ラベルが付けられた微小粒子からの蛍光スペクトルにより光ファイバー照明すること、前記光ファイバーは、光スペクトル分離器に前記蛍光スペクトルを運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取り、前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じた電流パルスを生成することに適した感光性ピクセルを有している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明のさらなる理解について、以下の図面への参照がなされてもよい。
【図１】図１は従来の単一光子センサーのブロック図である。
【図２】図２は商用の３２チャネルＰＭＴのうちの１つのチャネルから直接測定されたパルスを示すグラフである。
【図３】図３は単一光子感度があるセンサーのブロック図である。
【図４】図４はスペクトル分離モジュールの概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは図４のスペクトル分離モジュールの斜視図である。
【図５】図５は２つの３２チャネルＰＭＴ検出器を有する２重スペクトル分離モジュールの斜視図である。
【図６】図６は４００ＭＨｚ２６ｄＢの増幅器での増幅の後にＳｉＰＭダイオードから測定されたパルスを示す。
【図６Ａ】図６Ａは３段、２ＧＨｚ、６０ｄＢのパルス増幅器の電子回路図である。
【図７】図７はＰＭＴからの典型的な１ｎｓ電圧パルスを示す。
【図８】図８は３２チャネル単一光子検出器に関する概略ブロック図である。
【図９】図９は３２チャネルＰＭＴの１つのチャネルからの増幅されたパルスのパルス波形と、ＰＥＣＬコンパレータ後のパルス波形を表す。
【図１０】図１０は２段のパルス増幅器の回路図である。
【図１１】図１１は単一光子検出器のチャネルクロストークを示すグラフである。
【図１２】図１２は高速光子計数器のブロック図である。
【図１３】図１３は単一光子検出器の１つのチャネルの光対光子計数特性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、３２チャネルＰＭＴセンサーを有する分光計の、上のパネルではチャネル分解能を示し、下のパネルでは波長分解能を示す。
【図１５】図１５は単一光子検出器に関する光学系のブロック図である。
【図１６】図１６は、３つの波長に関して測定された図１５の単一光子検出器の１つのチャネルの光対光子計数特性を示すグラフである。
【図１７】図１７は、光子検出モジュールの出力での光子計数分布のヒストグラムを示す。
【図１８】図１８は、単一レーンのＤＮＡ塩基配列決定装置の写真および概略図から成る。
【図１９】図１９は、ＤＮＡ塩基配列決定データを処理するために用いられる、上のパネルではシステム行列Ｃを示し、下のパネルではカラーでコンボリューション行列を示すグラフから成る。
【図２０】図２０はＤＮＡ塩基配列決定の掃引線および品質スコアのグラフである。
【図２１】図２１は、カラーコードの認識およびカラー解読をシミュレートしたコンピューターの精度を示すグラフから成る。
【図２２】図２２はビーズ検出システムの概略図である。
【図２３】図２３は無作為に着色されたビーズの認識を示すグラフである。
【図２４】図２４は３２チャネル高速大ダイナミックレンジの単一光子分光計のブロック図である。
【図２５】図２５は３２チャネルパルス増幅器に関する概略回路図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図３を参照すると、微細な量の複数の蛍光染料の混合によって放出された放射を測定するための単一光子感度を持っているセンサー１０のブロック図が示される。光学の入力ファイバー１１は、その後、図４に概略的に示されるスペクトル分離モジュール１２に通される多色の蛍光を収集する。モジュール１２を通過した後に、分解された蛍光信号は、３２チャネル光センサー１３の感光性ピクセルを照明する。そのセンサーは、ほんの一例として（日本の会社であるHamamatsuによって製造される）３２チャネルＰＭＴアレイＨ７２６０−２０でもよい。分離された波長の各々は、ＰＭＴの１つのチャネルによって検出され、ＰＭＴのチャネルはそれぞれ、約１０ｎｍの範囲の波長を検出することができる。受信光子は、増幅と光子計数を受ける極めて短い電流パルスを生成する。例えば、図７に示されるように、ＰＭＴが単光子計数法モードで動作しているときに、チャネルはそれぞれ、入射光子束に応じた短い約１ｎｓの電流パルスのストリームを生成する。パルス振幅は８−１２ｍＶの対応するピーク電圧を有する０．４―０．６ｍＡに及ぶ。パルスはパルス振幅より小さなしきい電圧で設定されるコンパレータによって数えられる。得られた光子計数は、記録とデータ処理のためにコンピューター１４に転送される。
【００１８】
一実施形態において、スペクトル分離モジュール１２は、４８０ｎｍから６３０ｎｍまでの一連の波長内の多色の蛍光の分離および測定を行なう。図４および４Ａを参照すると、多色の蛍光は、コリメーター１７（その一例はニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造されるＦ８１０ＳＭＡ−５４３コリメーターでもよい）に結合される光ファイバー入力１６を介してスペクトル分離モジュールに提示される。コリメーター１７は、直径約１０ｍｍの並列の多色のビームを生成する。コリメートされたまたは平行なビームは、レーザー除去フィルター１８を通って、回折格子１９（それはニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造される回折格子ＧＲ１３−１８５０のような回折格子でもよい）によってその構成波長成分に分離される。一実施形態において、回折格子１９は４９０ｎｍから６３０ｎｍまで波長の範囲内で、蛍光のスペクトルの分離および測定を行なうために調整されてもよい。
【００１９】
分離された単色ビーム成分は、３２チャネルＰＭＴ １３のピクセル上に集中する。上記の集束は球面集束ミラー２１（それはニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造される球面鏡ＣＭ２５４−０７５−Ｇ０１でもよい）および円柱レンズ（それはまたＴｈｏｒｌａｂｓ社によって製造される円柱レンズＬＪ１０９５Ｌ２でもよい）によって遂行されてもよい。
【００２０】
一実施形態において、スペクトル分離モジュールは、１０ｎｍだけ異なる波長を検出することができる。分離した波長はそれぞれ、ＰＭＴの１つのチャネルによって多くは検出される。
【００２１】
ＰＭＴチャネルはそれぞれ、約１０ｎｍの範囲で波長を検出する。
【００２２】
分光計のスペクトル分離モジュールは１ｎｍもの高いスペクトル分解能を提供することができる。約１０ｎｍのスペクトル分解能は、０．２ｍｍの距離によって分離される０．８ｍｍ×７ｍｍ検出ゾーンを有する３２チャネルＰＭＴによって得られてもよい。光子受信ファイバーのアレイ（各アレイは単一光子センサーを照明するために接続されている）を使用することによって、センサーの全体のスペクトル分解能を向上させることができることを見出している。各光子センサーのファイバー束を有する分光計のスペクトル分解能は、約５ｎｍであるとわかっている。実際、高いスペクトル分解能が必要な場合、受信ファイバーを、いくつかの応用においてバンドパスフィルターとして用いることができる。蛍光染料は広い光学スペクトルを有しているが、ファイバー束のいくつかのアレイは染料スペクトルを集め、かつ、より詳細に以下で記述されるように、分光計のいくつかのチャネルに及ぶために染料スペクトルを導くことに用いられてもよい。
【００２３】
図５を参照すると、分光計の一実施形態はより広範囲の波長に適しているかもしれない。波長の範囲を増加させるために、２色性平板ビームスプリッター２３が用いられてもよく、ほんの一例として、ニュージャージー州のＥｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓ社によって製造されるビームスプリッターＮＴ４７−４２４でもよい。ビームスプリッターはまたニューヨーク州のＳｅｍｒｏｃｋ社によって製造されるビームスプリッターＦＦ６５０−Ｄｉ０１でもよい。入射放射線（すなわち光）がコリメートされた後、ビームスプリッター２３はコリメート光を２つの部分に分割する。短波長（例えばＥｄｍｕｎｄのビームスプリッターに関して５３０−５８５ｎｍまたはＳｅｍｒｏｃｋのビームスプリッターに関して５００−６４０ｎｍ）は、１つの経路２４に偏向される。同時に、より長波長（例えばＥｄｍｕｎｄのビームスプリッターに関して６０１−８００ｎｍおよびＳｅｍｒｏｃｋのビームスプリッターに関して６６０−８２５ｎｍ）は、第２の経路２６に導かれる。長および短波長は、それによって分光計内におよそ９０度で空間的に分離される。２色性平板ビームスプリッターの使用は、検出器装置の型に依存して、５００−８００ｎｍおよび３００−５００ｎｍの波長範囲内の分光計において、広範囲のスペクトルの分離およびよりよいスペクトル分解能を許す。商用検出器モデルＨ７６２０−２０およびＨ７６２０−０４は、上記の波長範囲に関してそれぞれ有用であることがわかっている。
【００２４】
従来の技術における当業者は、センサーまたは分光計が２つの異なる型のマルチチャネル単一光子検出器を含んでもよいことを理解するだろう。例えば、この発明の要旨を逸脱しない範囲で、ＰＭＴは長波長に使用され、シリコン光電子増倍管（ＳｉＰＭ）ダイオード検波器は短波長に使用されてもよい。ＳｉＰＭダイオードは、ＣＭＯＳ技術であり比較的安く、共通のシリコン基板上に並列に共に接続されているマトリクス状の個別のピクセルから成る。単一光子に応じて、ＳｉＰＭは単一電圧のパルスを生成する。技術は、ＳｉＰＭのアレイが同じチップ上に統合された駆動および読出電子回路で使用されてもよいようなものである。ＳｉＰＭは（約１０５−１０７での）高い利得であり、比較的低電圧（例えば約２０−７０Ｖ）で動作する。それらの応答時間は１−２０ｎｓの範囲で変化する。図６を参照すると、約２ｎｓ単一光子パルスが、４００ＭＨｚ、２６ｄＢのパルス増幅器での増幅後、ＳｉＰＭダイオードから得られてもよいことが理解される。ＳｉＰＭダイオードと共に、１段か、２段か、または３段の２ＧＨｚ、６０ｄＢのＳｉＰＭパルス増幅器が、単一光子計数領域での単一光子のための検出器として使用されうることが見出されている。図６Ａは、３段、２ＧＨｚ、６０ｄＢのパルス増幅器のための電子回路図を示す。ＳｉＰＭアレイもまた、単一光子分光計のための単一光子センサーとして用いられてもよい。ＳｉＰＭもまた、ＤＮＡ塩基配列決定の検出に適応可能であるとわかっている。
【００２５】
半透鏡が二色性のビームスプリッターの代わりに用いられてもよいことは、従来の技術における当業者によって理解されるだろう。半透鏡の使用は、分光計によって受け取られた全光子束が２つの単一光子検出器によって検出されるので、検出ダイナミックレンジを増加させる可能性がある。同様に、光子束はいくつかの束に分裂され、それぞれの束は専用の単一光子検出器によって検出される。また上記のアプローチもまた、光子検出システムのダイナミックレンジを増加させるために用いられうる。
【００２６】
図８を参照すると、一実施形態では、検出器は、表面実装型デバイス技術に基づく３２チャネルパルス増幅器２７と、フィールドプログラムされたゲートアレイに基づく３２チャネル光子計数器３１と、からなる。検出器の増幅器部分は、３２の同一パルス増幅チャネル２８を含んでいる。そのチャネルのそれぞれは、一実施形態において、３５−４０ｄＢの利得および１ＧＨｚの帯域幅を有している。検出器も、約２ｎｓの増減時間を各々有する、３２の高速のコンパレータ２９が提供されるかもしれない。この配置は、最小パルス幅を近似的に４．５ｎｓに制限し、１０−５０ｍＶから、確実にコンパレータをトリガーすることができるレベルまで、ＰＭＴ負パルスを増加させる。図９は、上部の掃引線で３２チャネルＰＭＴの１つのチャネルからの増幅されたパルスのパルス形状を示し、下部の掃引線でＰＥＣＬコンパレータの後のパルス形状を示す。
【００２７】
パルス増幅器のための電子回路の実施形態を表す図１０を参照すると、２つのＢＧＡ ４２７増幅器３２および３３（すなわちそれぞれＵ５７、Ｕ５８）からなる２段増幅器を示す。増幅段はそれぞれ、２ＧＨｚの範囲において２０デシベルの増幅を提供する。増幅された信号は、１ｎｓのτRESPONSEを有するＡＤＣＣＭＰ５５３ ＬＶＰＥＣＬコンパレータ３４へ入力される。負の増幅された信号パルスは、カウンター３１へ入力されるコンパレータからＰＥＣＬレベル出力パルスを生成する（図８）。
【００２８】
ポテンショメータ３６（すなわち、０から３．３ボルトまでのポテンショメータＲ９）を用いて、基準電圧を調整することができる。一実施形態においては、１．２Ｖ（増幅器の中間点）から増幅されたパルス高まで、基準電圧を設定することができる。雑音のレベル以上でとどまるがパルス底にできるだけ近づくために、しきい電圧を選択することができる。１段の増幅器がまたコンパレータ３４をトリガーするための十分な利得を提供してもよいことが理解されるだろう。上記の実施形態では、キャパシタ３７（すなわちキャパシタＣ３５）を使用しなくてもよい。結果として生じる回路は、２０ｄＢの増幅を提供し、パルスの極性を一度だけ変化させる。示されるように、図９は、上部の掃引線ではコンパレータ３４に入力される前に増幅されたパルスのパルス形状を示し、下部の掃引線ではコンパレータ３４から出力されたパルスのパルス形状を示す。
【００２９】
２つの主な型のクロストークが単一光子検出器に発生する可能性がある。１つの型は３２チャネルＰＭＴの内部での電子クロストークである。図１１は、ＰＭＴの隣接のチャネル間の典型的なクロストークをグラフで表わす。上記のクロストークは、ＰＭＴ内部の電子光学部品のある特徴によって発生する。３２チャネルＰＭＴにおけるチャネルクロストークは、光学および電子コンポーネントを含んでいる。光学クロストークは不完全な集光により隣接チャネルの照明から発生し、電子クロストークはＰＭＴチャネル間の内部電子フラックスによって引き起こされる。約３パーセントのより小さいチャネルクロストークは、個別チャネルが光ファイバーによって照明される場合、既知の３２チャネルＰＭＴ内で観測される可能性がある。
【００３０】
別の型のクロストークは、増幅器での増幅チャネルとカウンターでのチャネルとの間の電子クロストークである。一般に、増幅器のチャネルと３２チャネル光子計数器のチャネルの間の電子クロストークは観測されていない。しかし、センサーにおいて非常に小さなチャネルクロストークでさえ、例えば色素混合の解析、特に異なる色素成分の組成が数桁だけ異なっている場合、曖昧さを引き起こす可能性がある。光学のクロストークを最小限にするために、単一のＰＭＴチャネルは、商用の５３２ｎｍのＮｄＹＡＧレーザーからのビームをそれらに集中させることにより照明されてもよい。以上のように、チャネルクロストーク全体は数パーセントポイントに制限され、それはメインチャンネルで測定された信号に比べて線型である。
【００３１】
図８を再び参照すると、増幅の後、増幅器２７の各々のチャネルからの出力は、３２チャネル高速光子計数器３１へ入力される。カウンター３１は、チャンネル入力に到達するパルスを合計する。積分時間間隔はカウンター３１内のシンクロジェネレーター（図示せず）によって提供される。一実施形態において、最小の積算時間は約０．３ｍｓである。
【００３２】
図１２を参照すると、ブロック図は、高速カウンター３１（図８）の実施形態の詳細を提供する。この実施形態では、高速カウンターは１対の同一の計数回路３８および３８Ａを具備する。計数回路はそれぞれ、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａ、それぞれ３つのＰＥＣＬからＴＴＬへの３状態バッファー４１Ａ−Ｃおよび４１Ｄ−Ｆ、およびそれぞれ３つのＡＮＤゲート４２Ａ−Ｃおよび４２Ｄ−Ｆからなる。計数回路はそれぞれ、固定値同期化バイトユニット４４、同期化ブロック２バイトカウンター４６、３つの３状態バッファー４７Ａ−Ｃおよび３つのＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃから成る同期化回路へ入力される。
【００３３】
高速カウンターはまた、水晶振動子５１、１４段のバイナリリップルカウンター５２、およびそれぞれがカウンター５２の段に対応する複数のスイッチ５３から成る制御回路４９を含んでいる。制御回路４９はまた、バイトカウンター５４を含んでいて、その出力はブロックカウンター５６へ入力される。バイトカウンター５４およびブロックカウンター５６は各々、ＡＮＤゲート４２Ａ−Ｆおよび４８Ａ−Ｃに接続される。バイトカウンター５４の出力も、１対の付加的なＡＮＤゲート５７Ａおよび５７Ｂへ入力され、それぞれのゲートは４つのＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄに接続する。ノットゲート５９はブロックカウンター５６、およびＡＮＤゲート４２Ａ−Ｆおよび４８Ａ−Ｃに接続される。制御回路は、４つのＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄの各々に接続されるフリップフロップを含んでいる。ＬＰＴ出力コントロール回路６２は、時間遅延ユニット６３、ＯＲゲート６４およびフリップフロップから成る。
【００３４】
高速増幅器２７からのパルスは、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａの入力に同時に提供される。これらのカウンターのうちの１つは常に計数モードにあり一方、他方は保留にされている。蓄積されたデータは、バイト単位で、バイト数に対応するＰＥＣＬからＴＴＬへの３状態バッファーを介して、ＬＴＰポート６７へ転送される。
【００３５】
３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａの状態は、対応するＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄによって変換される制御回路信号によって決定される。一例として、ＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ｂからの出力信号は、保持モードで３バイトのＰＥＣＬカウンター３９を保持し、同時に、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９Ａを計数モードに設定する。ＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ｃからの出力信号は、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９Ａを保持モードに設定し保持し、そして３バイトのＰＥＣＬカウンター３９を計数モードに設定する。変換器５８Ａおよび５８Ｃからの出力信号は、そのデータがＬＰＴポート６７へ転送された後、対応する３バイトのＰＥＣＬカウンターをリセットする。
【００３６】
各伝送された１０２バイト後に、同期化回路４３からの３つのシンクロバイトが開始される。第１のバイトは、図１１に示されるように、０００１０００１の固定値を持っていて、第２と第３番のバイトは、同期化ブロック２バイトカウンター４６のそのときの現在状況を表わす。カウンター４６のシンクロバイト出力は、対応する３状態バッファー４７Ａ−Ｃを通して、システム出力６７に渡される。
【００３７】
制御回路４９の水晶振動子５１は、１４段のバイナリリップルカウンター５２に渡される２ＭＨｚクロックパルスを生成する。カウンター５２は、参照数字６８によって概して示される１４本の出力ピンを有している。各ピンはクッロクパルスを出力し、その初期周波数は２から１６３８６までの係数で割られる。スイッチ５３は、１−１４から適切なピンを選び、かつそれによって全回路のためにクロック周波数を設定するために用いられる。この実施形態では、スイッチは、ＬＰＴポート６７へのデータの伝送速度を、毎秒１２２から１，０００，０００バイトまで設定することができる。
【００３８】
クロックパルスはバイトカウンター５４に渡される。各クロックパルスを受け取った後に、バイトカウンター５４は連続して、図１１の「バイト」数字１、２、３として示される３つの出力のそれぞれの信号を生成する。上記の信号はそれぞれ、対応するデータバイトを伝送し、データバイトはそれぞれ計数回路３８および３８Ａの両方へ渡される。データ信号もそれぞれ、対応するＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃを通じて同期化回路４３に提示される。
【００３９】
バイトカウンター５４からの第４番目の出力上でのハイ（ｈｉｇｈ）は、カウンターをリセットし、伝送された３バイトワード数をカウントするブロックカウンター５６に渡される。３４番目の３バイトワード（それは１０２データバイトと等しい）を数える際、ブロックカウンター５６は、３５番目の３バイトワードに関する信号を生成する。この信号は、同期化回路のデータがＬＰＴ出力６７に提示されることを可能にするＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃに提示される。同時に、３５番目の３バイトワードに関する信号は、計数回路３８および３８Ａの出力を阻む。３６番目の３バイトのワードに対応するブロックカウンター５６からの出力信号は、図１２に示すように、カウンターをリセットし、１０５バイトのシーケンス数をカウントするために同期化ブロック２バイトカウンター４６をクロックする。同期化ブロック２バイトカウンター４６は、６５５３６の値が達せられた後、リセットする。
【００４０】
フリップフロップ６１は、バイトカウンター５４からの全ての第１のバイトパルスによってトリガーされる。フリップフロップ６１によって生成された信号は、３バイトＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａを交互にカウントまたはホールドモードにする。上記の信号はまた、カウンターの出力を有効にするか無効にし、ＡＮＤゲート５７Ａおよび５７Ｂを通じてカウンターへのリセットパルスの伝送を許容するかブロックする。図１３は、図１２に表されたカウンターの型の１つのチャネルの、典型的な光対光子計数特性を示すグラフを表す。
【００４１】
図７を再び参照すると、典型的な電圧パルスは、パルス増幅器の実施形態の出力および入力において表される。増幅されたパルスの幅は、近似的に、入力パルスの幅より約５つの谷間だけ長い５ｎｓである。検出器のダイナミックレンジ（暗騒音に対する最大の光子計数の比）は、−２０ビットである。データ記録ソフトウェアの使用によって、２ｎｓ未満のパルス持続時間は、パルス振幅−１．５Ｖでのカウンターによって解明されるかもしれない。
【００４２】
本実施形態の３２チャネル単一光子検出器の感度および線型性により、毎秒５×１０７計数と同様の高い光子計数率を記録することができる。実際、検出器の線型性は、例えば、毎秒２×１０７光子計数を超える非常に広範囲の線型の光子計数を可能にする。２ｘ１０８と同じくらいの光子カウントも観測されている。これらの計数範囲は、任意の既知の商用の単一光子検出器の検出ダイナミックレンジを超えるだろう。本実施形態の検出器と、利用可能な商用の単一光子検出器（例えばモデルＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１２−ＦＣ）との光子検出効率の比較は、４９０ｎｍで、本実施形態の３２チャネルＰＭＴ検出器の光子検出効率が、先の商用のＳＰＣＭの光子検出効率の約２０％であったし、それは６１０ｎｍで５％まで減少したことを示す。
【００４３】
図８および１２を参照して、カウンター３１によって収集されたデータは、標準ＩＥＥＥ １２８４パラレルポートインターフェース６７を用いて、ＰＣに転送される。データは、バイナリフォーマットを用いて１０５バイトのフレームにおいて転送される。データフレームは、それぞれの３２検出チャネル（チャネル当たり３バイト）のために得られる複数のカウント値から成る。フレームはそれぞれ、次のフィールドを含んでいる６バイトのヘッダーで始まる。ミリ秒で測定される２バイトカウント期間長、１バイトカウンター型、および２バイトフレーム番号。フレーム番号は、現在のフレーム数を含んでいる。数は、オーバーフローにより増加するシーケンスをこのように形成する各次のフレームのために１だけインクリメントされる。フレーム番号は、同期マークとして機能し、連続データストリームでデータフレームを見つけるために、データ処理ソフトウェアによって用いられる。フレーム番号はまた、データ保全の検証のため、および伝送線路に干渉によって導入されたエラーを見つけるために用いられる。特別のソフトウェアパッケージは、カウンターによって転送されたデータのオンライン視覚化、および録音を行なう。
【００４４】
蛍光スペクトルを処理する際に、信号処理の主な課題は、別個で知られている蛍光性のスペクトルを有するｎ染料からできている染料混合によって生成される蛍光信号への個別の蛍光染料の寄与の決定である。混合における個別の染料の寄与は、もし分光計が検出された蛍光に対する線型応答を生成すれば、分光計のＮ独立チャネルにおいて測定される蛍光の分解によって見つけられうる。
【００４５】
一例として、分析された蛍光染料数ｎ＜Ｎ（例えばＤＮＡ塩基配列決定に関しては≪＝４）ならば、既知のシステム行列手法Ｈ（Ｎｘｎ） ＝ （ｈ１，ｈ２．．．，ｈｎ）を用いて、ここでｈｉ ＝ （ｈ１ｉ．．．ｈＮｉ）Ｔ，（１≦ｉ≦ｎ）は、分析された染料混合における蛍光染料のスペクトルを表わすＮ−成分ベクトルである、個別の蛍光染料ｈｉに関するスペクトル応答より先にシステムを較正することによりシステム行列Ｈを得ることは可能である。ｒ＝（ｒ１．．ｒＮ）Ｔが染料混合の測定された蛍光性のスペクトルであり、ｓ ＝ （ｓ１，ｓ２，．．．，ｓｎ）Ｔが、個別の蛍光染料の濃度を表わす成分ウェイトのベクトルである場合、ノイズω ＝ ｛ω１．．．ωＮ）Ｔがある状態における、測定スペクトルｒは次のとおりである：
ｒ＝Ｈｓ＋ω （１）
式（１）の最適解ｓは、雑音成分ωｉの分布特性に依存する。単純化された仮定はωｉが独立していて、同一に分布している通常のランダム値を仮定し、よく知られ計算上効率的な最小分散の、以下の
【数１】
【００４６】
を推定するための公平な解決法が、１９９３年にＫａｙによって実現された（Fundamentals of Statistical Signal Processing. Estimation Theory のp. 97）。
【数２】
【００４７】
光子計数において、個別率観察ｒｉは、等しい平均と分散を有するポアソン分布を有している。より高い光子計数率（１つの観察期間当たり５０以上のカウント）については、観測された率は、「真実の」平均率ｒｉと、以下のように平均率に依存する分散を有するガウス雑音ωｉとの重ね合せによってよく近似される。
【００４８】
【数３】
より正確な解決法は、独立した非同一に分布した正規なランダム変数ｇによって得られ得る。式（１）の一般解は、上記の１９９３年にケイによってこれまでに導かれた以下である。
【数４】
【００４９】
ここでＣは成分ωｉの共分散行列である。ωｉの独立により、行列Ｃは対角である：
【数５】
【００５０】
ここでσｉ２はωｉの分散である。実際上、平均率
【数６】
【００５１】
は未知であり、観測された率ｒｉは、分散の計算のための用いられる：
【数７】
【００５２】
分散σｉ２は各測定のために推定される。σｉ２とｒｉとを関連づける関数は、ｒｉを得るために用いられる、前処理するそれぞれの方法に関して特殊である。例えば、ｒｉがサンプリング周期の間光子の計数によって直接得られる場合、σｉ２＝ｒｉである。バックグラウンドｂｉが計数観測の結果から引かれる場合、σｉ２＝ｒｉ＋ｂｉとなる。ｒｉがｋサンプリング周期にわたる計数観測を平均化することによって得られる場合、σｉ２＝ｒｉ／ｋである。式（３）の推定量は、より正確だが式（２）の推定量より多くの計算上のリソースを要する。
【００５３】
以上記述された信号処理技術は、クロストーク除去の段階でバックグラウンド減算を可能にする。これは、バックグラウンドを表わす付加的なスペクトル（行列Ｈにおける列）を生成することにより実現される。新規の行列Ｈの式（２）および（３）の推定量は、他のスペクトル成分からバックグラウンドを分けるだろう。
【００５４】
図１５を参照して、単一光子検出器の特性化のために用いられた測定構成のブロック図が示される。構成では、（モノクロメーターまたは５３２ｎｍのレーザーであってもよい）光源６９からの光は、１セットの中性光学フィルター７１を通して渡され、ＧＲＩＮレンズ７２で終端されるファイバーに結合される。ＧＲＩＮレンズからの光は３２チャネルＰＭＴの３２の光電陰極のうちの１つの上に集中する。光源６９としてモノクロメーターを有する図１５に示される構成を用いて、単一光子検出器用に測定された光子計数および光特性は、図１６に表される。理解されるように、３つの測定波長すべてについては、検出器の出力は毎秒１０８光子計数までは線型のままであり、検出器のダイナミックレンジは、毎秒２ｘ１０８光子計数を超える。絶対的な計数率における有意差は、６３０ｎｍと比較して、４８８ｎｍと５３０ｎｍの波長に関して示される。６００ｎｍより長い波長ではＰＭＴの量子効率の減少がある。
【００５５】
本実施形態の光子計数システムにおけるノイズは、光子計数の一時的な分布によって決定される。正しく操作する光子計数器は、光子計数率推定の分散（例えば積分周期の間に数えられた光子数）がその平均値と等しいポアソン分布を利用する。これは光子検出器の信号対雑音比に関するより低い境界を設定する。図１７は、４つの異なる照明レベルに関する光子検出モジュールの出力で光子計数分布のヒストグラムを示す。光子計数は２５ｍｓの区間中に収集され、照明レベルごとに約３０分に関するデータ記録ソフトウェアを用いて記録された。図１７は、すべての４つの照明レベルに関して平均値と分散との間のよい一致を示す。これは、測定されたノイズが、検出器によって検出された光子束の確率的な本質によって引き起こされただけであることを示し、検出器自体が付加的なノイズを少しも生成しないことを示す。
【００５６】
一実施形態において、いくつかの既知の蛍光染料からできている混合の認識および鋭敏な検出を必要とする応用に、単一光子分光計を用いることができる。特に、本明細書で記述された分光計は、商用のＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーによる蛍光励起を用いる単一の融解石英キャピラリーにおいて電気泳動によって行なわれるＤＮＡ塩基配列決定の検出のために、光センサーとして用いられてもよい。レーザー波長を抑えるために、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーのためのそれぞれ５０Ｄ ５２２ｎｍおよび５３８ｎｍのレーザーエッジフィルター（５２２ＡＥＬＰ、５３８ＡＥＬＰ、オメガオプティカル社、バーモント州、ＵＳＡ）が用いられてもよい。
【００５７】
図１８を参照して、単一レーンのＤＮＡ塩基配列決定装置の実施形態の写真および概略図が示される。ＤＮＡサンプルは、写真に示される単一のキャピラリー分離モジュールにおける電気泳動の分離を受ける。モジュールは、内蔵の電圧計および電流計を有する小型の高電圧供給７３（１５ｋＶ以内）、ポリマー置換システム７４、温度制御システム７６（２５−７０℃±０．０１℃）、ＤＮＡサンプルおよび流動バッファーのためのチューブチェンジャー回転荷台７７、および精密光学系７８から成る。図１８の概略図を参照すると、蛍光性にラベルが付けられたＤＮＡ断片が、光学系７８を通過する場合、それらは、ユニフェイズ、カリフォルニア州によって作られたＡｒイオンレーザ（４８８および５１４ｎｍ、２０ｍＷ）のような（しかしこれに限定されない）ファイバー化されたレーザー、またはＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒ、ネバダ州によって作られたＮｄ：ＹＡＧレーザー（５３２ｎｍ、２５ｍＷ、ＧＣＬ−０２５−Ｓ）によって照明される。レーザー励起蛍光は（２００ｍｋｍコア径があってもよい）ファイバー８１によって収集され、スペクトル分離モジュール１２（図３）に送られる。一実施形態において、オメガオプティカル社（ＶＴ）によって作られた５ＯＤ ５２２ｎｍおよび５３８ｎｍのレーザーエッジフィルター（５２２ＡＥＬＰ、および５３８ＡＥＬＰ）は、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーのレーザー波長をそれぞれ抑制するために用いられてもよい。
【００５８】
アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー、カリフォルニア州）から得られたＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ１．１シーケンシング標準とラベルが付けられたＤＮＡサンプルは、２５μｌのフォルムアミドにおいて変性して、注入の直前にＨＰＬＣ等級水において１から５まで希釈された。ＤＮＡ分離は、４０ｃｍ（３５ｃｍの分離長さ）のコーティングされていない（５０μｍの内径および３６５μｍ外径を有して、５０℃においてＰＯＰ−７分離媒体で満たされている）キャピラリーにおいて１５０Ｖ／ｃｍで行われた。この例において、流動バッファーが用いられた。
【００５９】
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴターミネーターのラベル付けために用いられた４つの染料によって生成された蛍光強度を推定するための少なくとも２つの有効なアプローチがある。このような１つのアプローチは上記の式（３）にしたがって測定スペクトルを分解することである。全測定スペクトルの分解に関して、各染料を記述するスペクトル成分ｃｉは、染料ごとに分離して放射された蛍光を測定することによって、および光子計数率の測定されたベクトルを正規化することによって実験的に得られる。混合における個別の染料の濃度ｓ［ｎ］の決定は、時刻フレームごとに行なわれる。染料濃度の得られた配列は、４つの塩基配列決定の掃引線（sequencing traces）を形成し、これらはさらに塩基呼び出し（base calling）にも用いられる。
【００６０】
別のアプローチは仮想フィルターの応用である。仮想フィルターの方法は、成分スペクトルが十分に分離される場合、用いられてもよい。空間的に十分に分離された波長を有するスペクトルを含んでいる入射光は、選択された受け入れ角度を有するファイバー束の入力端を照射する。有限の受け入れ角度のために、特定のファイバーは特定の波長からのみ信号を収集し、光検出器の特定チャネルに信号を送る。一例として、仮想フィルターは、３つのＰＭＴチャネルを選択することにより形成されてもよく、その結果、各染料の蛍光の各々の３つの異なる波長のそれぞれが、３つのＰＭＴチャネルのうちの１つによって捕獲され、したがって割り当てられたチャネルでの測定に最大のものを寄与し、他のチャネルでの最小の応答を提供する。上記のシステムは、マルチカラーの蛍光の検出のための帯域フィルターを不必要にする。別の例では、特定の染料のかつ特定の波長を有している空間的に広いスペクトルは、いくつかの（例えば３つの）ファイバーまたはファイバー束のグループによって同時に捕獲される。上記の処理によって、システムの信号対雑音比での減少のないダイナミックレンジでの著しい増加が可能になる。
【００６１】
一実施形態において、狭いエミッションスペクトルを有するスペクトルに関する線型性の高ダイナミックレンジは、実現されてもよい。そこで、各染料の蛍光の各々のいくつかの波長は、ＰＭＴチャネルのうちの１つによって捕獲され、したがって割り当てられたチャネルでの測定に最大のものを寄与し、他のチャネルでの最小の応答を提供する。ファイバーは特定の波長を１ｘＮ光検出器内の対応する検出器へ通過させる。そこから、信号は空間的に分離されたスペクトルを収集するためのＭｘＮ光検出器に渡される。投影光学系はＭｘＮ光検出器のＮ番目の列にＮ番目の波長を投影するために用いられてもよい。したがって、特定の波長の信号は、Ｍ個の単一光子光検出器によって同時に収集される。この処理はまた、システムに関する高い信号対雑音比および線型性の高ダイナミックレンジを実現する。
【００６２】
記述された実施形態に関するデータ処理アプローチでは、４つの塩基配列決定の掃引線は、ノイズフィルタリングまたはスムージング、基線減算、クロストーク除去、モビリティシフト補正、ピーク高さ、および間隔等価を含む標準処理を受ける。ピーク当たり７−１５ポイントまで再サンプリング後、トレースは．ＳＣＦフォーマットで記憶され、標準ベースコールＰＨＲＥＤソフトウェアによって処理される。処理の結果は、それらの位置と品質のスコアを有する基本呼び出しの配列として返される。
【００６３】
以上示されるように、ＤＮＡ塩基配列決定データの処理への少なくとも２つのアプローチがある。図１９（それはシステム行列グラフ８２と、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーに関するカラーデコンボリューション行列８３および８４とをそれぞれ示す）を参照すると、単純化されたデータ処理アプローチは、ＰＭＴの、チャネル１８（５４６ｎｍ）、チャネル１５（５６８ｎｍ）、チャネル１１（５８９ｎｍ）およびチャネル５（６１０ｎｍ）から得られた信号を用いるだろう。チャネル１８、１５、１１および５はそれぞれ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣに対応する。ＡｒイオンおよびＮｄＹＡＧレーザーに関する導かれたカラーデコンボリューション行列８３および８４は、図１９の下部においてスプレッドシートフォーマットで示される。一方、システムの行列Ｈの決定のためのスペクトル成分ｈｉは、各染料によって別々に放出された蛍光の測定によって、および図１９の上部のグラフ８２において示される光子計数率の測定されたベクトルを正規化することによって、実験的に得られてもよい。
【００６４】
塩基配列決定データの処理への前述したアプローチは、同様な塩基配列決定の掃引線および塩基呼び出し品質をもたらす。しかしながら、小さな信号対雑音比によって特徴付けられる測定に関しては、全測定スペクトラムの分解は、それは、分光計の４つだけの選択されたチャネルで得られる蛍光だけよりも各染料によって放射される蛍光についての全情報を使用するので、よりよい結果を与える。染料から得られる蛍光スペクトラム全体を用いることの別の利点は、検出ダイナミックレンジの著しい増加である。実際、本明細書で説明された３２チャネル光検出器において、チャネルは毎秒２×１０７光子計数まで線型応答を有していて、もし測定された蛍光染料が広域スペクトラムを有していれば、この染料に関する検出の線型範囲はセンサーの同時に照明されるチャネル数に比例するだろう。
【００６５】
図２０は、ＡｒイオンおよびＮｄＹＡＧレーザーを用いて、本明細書に記述された分光計の実施形態で得られた、２つのＤＮＡ塩基配列決定の掃引線およびベースコール品質スコアを示す。２つのレーザーで記録された塩基配列決定の掃引線は、極めて類似したように見え、品質スコアはほとんど同一である。得られたＱ２０シーケンス読み出し長は、約６５０の塩基対と同様な長さである。その読み出し長は、（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社からのモデルＡＢＩ−３７３０のような）商用のＤＮＡシーケンサーでの同様なキャピラリー長に関して得られた読み出し長と極めてよく一致する。
【００６６】
一実施形態において、単一光子分光計はカラーコードを認識し正確に解読してもよい。図２１を参照すると、上部は、強くオーバーラップするスペクトルを有する３つの型のＱＤを含んでいる混合の解読と測定とを示す。図２１の中央部は、ＱＤ２の内容混合が０％から１５％まで変わる場合、予混されかつ解読される濃度のほぼ完全な一致を実現することができることを示す。図２１の下部での曲線は、単一光子分光計によって行なわれた測定のコンピューターシミュレーションに関して得られた解読結果と同様に、ＱＤ混合（１測定当たり約１０，０００光子）ごとに数千の測定を行なうことにより得られた解読統計を示す。
【００６７】
一実施形態において、単一光子分光計はカラーコード化された微小粒子を検出してもよい。図２２を参照すると、ビーズポンプシステム８６の中に保持された緩衝液において個別のビーズが懸濁されるビーズリーダシステムが示される。ビーズは、キャピラリー８７を介して高速でそれらを押すことにより測定される。励起ビーム８８は、ビーズにおいて蛍光を励起する。蛍光は、光ファイバー化された検出器８９によって検出され、適切な分光計または光学反射系９１を介して単一光子検出器９２に提示される。検出された信号は、コンピューター（図示せず）によって記録され、記録されたデータは適切に処理される。一実施形態において、ポンプ装置８６はプログラマブルなマイクロポンプであり、キャピラリー８７は２５μｍのＩＤキャピラリーである。励起ビーム８８によってキャピラリーの均一照明を確保するために、キャピラリーは光ヘッド（図示せず）に挿入される。ビーム８８は適切にファイバー化されたレーザー源（図示せず）によって生成される。ビーズがレーザー光線を通過する場合、それらは、ファイバー化されたミクロな対物鏡８９によって収集される蛍光を放出する。収集された蛍光は分光計９１に送られ、それは（この実施形態では高速マルチチャネル検出器である）単一光子検出器９２によって検出される。
【００６８】
図２３を参照すると、図２２のビーズリーダはランダムに有色のビーズの測定を行なうために用いられてもよい。一実施形態において、測定は量子ドットで色がつけられたポリスチレンビーズでなされた。１００の上記のビーズに関して得られた解読結果は図２３に示され、ここでｘ軸はビーズリーダによって検出された順にビーズ番号を示し、ｙ軸は１に規格化されたビーズコードを示す。
【００６９】
先のビーズの検出システムの主な特性は、単位時間当たりに検出され、かつ要求された精度で解読されうるビーズの数である。一般に、解読精度は、ビーズの検出時間中に収集された光子数によって決定される。量子ドットの商用セットについては、ビーズから収集された全光子数が１０４より大きくなる場合、９９パーセントと同様の高い解読精度をうることができる。ビーズの検出が発生する率は、光子検出器のダイナミックレンジに依存する。図２４のブロック図を参照すると、一実施形態では毎秒１０４もの高いビーズの検出率は、スペクトル分離モジュール９３、３２チャネルＰＭＴ ９４、３２チャネルＦＰＧＡ ９６、高速ＵＳＢマイクロコントローラ９７、およびコンピューター９８から成る光子検出器で得られる。上記のようなシステムは、チャネル当たり毎秒１０８の光子計数の線型範囲、および毎秒３２ＭＢのデータ転送速度を有する。図２４におけるブロック図において示されるシステムの３２チャネルパルス増幅器の１つのチャネルの回路図は、図２５に示される。
【００７０】
種々の実施形態は、ある程度の特殊性または精度で、または１以上の個々の実施形態を参照して上に記述されているが、当業者は、ここでクレームされた発明の精神または範囲から外れずに、開示された実施形態への多数の変更を行うことができる。上記の詳細な説明に含まれており、添付図面において示される主題は、特定の実施形態のみを例証するが制限しない解釈されることが意図される。詳細または構成の変更は、以下のクレームにおいて定義されるような発明の要素から外れずに行なわれてもよい。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、センサーシステムに関し、特に、複数の蛍光マーカーから多色蛍光放射を検出し、複数の蛍光マーカーでラベル付された生体サンプルの解析のための単一光子センサーシステムおよび方法に関する。センサーシステムおよび検出方法は、光学スペクトル分離ユニットと、検出ユニットと、集められたデータに関する信号処理アルゴリズムと、を含んでいる。
【０００２】
本出願は、２００７年１０月２５日に提出された合衆国仮出願、シリアル番号６１／０００，３２０の優先権を主張する。
【０００３】
本明細書で開示された発明は、国立ヒトゲノム研究所から資金源授与番号Ｒ２１ＨＧ００３７１７０２の下の国庫補助でなされた。したがって、米国政府は本開示において一定の権利を持っている。
【背景技術】
【０００４】
単一光子を登録することに基づいて、多くの蛍光検出技術は利用可能である。上記の技術は通常、単一光子検出（ＳＰＤ）技術と呼ばれる。それらの複雑性と費用のために、バイオ医学の応用では、単一光子検出技術の多くは、時間分解蛍光分光法または単一蛍光性分子の検出に用いられる。
【０００５】
図１のブロック図において示されるように、従来の単一光子検出器はこれまで、単一光子センサーまたは光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器、パルス増幅器、パルス整形器、カウンター、およびコンピューターを含むいくつかのモジュールから成っていた。単一光子検出器の性能を妨げる要因は従来、利用可能な光子計数デバイスの比較的狭い線型性ダイナミックレンジである。検出器のダイナミックレンジは、検出器が単一光子に応答するために必要とする応答時間（τRESPONSE）によって決定される。量τRESPONSEは、デバイスの全部のモジュールの応答時間に依存し、個別のモジュールの応答時間の和であると一般に考えられる。図２のグラフにおいて示されるように、実際上、現在利用可能な単一光子センサーにおける最短の応答時間は１ｎｓである。しかしながら、あるτRESPONSEを有する従来の単一光子ＰＭＴ検出器は、従来、毎秒１０６−１０７光子計数のダイナミックレンジに制限されている。
【０００６】
生物学の応用では（特にＤＮＡ検出において）、ＤＮＡ塩基配列決定システムは、従来、超高速ＤＮＡ塩基配列決定法を処理し、検出することができない。実際、従来のＤＮＡ塩基配列決定装置は毎秒１０−３０フレームでの記録する配列決定処理に制限されている。さらに、従来のＤＮＡマシンのダイナミックレンジは１６ビットに制限されている。ＢｉｇＤｙｅ ＤＮＡ塩基配列決定標準の連続希釈法のための従来の装置はこれまで、望ましいことよりも少なくとも１０倍、相対的に鋭敏ではない。
【０００７】
したがって、毎秒１０７光子計数を超える（例えば毎秒１０８光子計数まで）線型性範囲、毎秒１０−３０フレームを越えるＤＮＡ塩基配列決定処理性能、および非常に鋭敏なＢｉｇＤｙｅ ＤＮＡ塩基配列決定標準を有する光子計数器を有する単一光子検出器を含むセンサーの必要性がある。マルチチャネル単一光子検出器に基づいた（例えば３２チャネルＰＭＴセンサーに基づいた）分光計は、多色放射の極めて正確な高速検出を可能にするだろう。特に、上記の検出器は、蛍光性の成分の組み合わせの非常に正確で高速の認識、およびＤＮＡ塩基配列決定の高品質検出を実証するだろう。
【発明の概要】
【０００８】
３２チャネルＰＭＴセンサーに基づいて、ファイバー化された（ｆｉｂｅｒｉｚｅｄ）単一光子の鋭敏な分光計は、広い検出ダイナミックレンジに非常に鋭敏である。分光計は、複数の蛍光マーカー（例えば複数の蛍光染料によって放出された多色蛍光信号または放射の構成など）でラベルが付けられた生体サンプルの正確かつ高速な検出、同定および解析を可能にする。分光計のファイバー化された光入力は、分析された蛍光のファイバー集束に基づいた任意の測定システムへの容易および高効率な結合を可能にする。分光計は非常に正確なＤＮＡ塩基配列決定を提供する。３２チャネルＰＭＴ単一光子検出器は、２０ビット以上の検出ダイナミックレンジを有して、毎秒約３３００のフレームのフレーム率を有している。検出器のピクセルのダイナミックレンジは、毎秒１０７の光子計数に達する可能性があり、さらに１０倍改良することができる。
【０００９】
複数の蛍光性の成分の組み合わせの検出および認識を可能にするために、マルチチャネル検出器のダイナミックレンジを有効に増加させる信号処理方法が用いられる。一実施形態において、微細な量の複数の蛍光染料の混合物によって放出された単一光子放射を測定することができ、染料混合物における個別の染料の内容を非常に正確に決定することができる蛍光検知センサーは記述される。３２チャネルＰＭＴ、パルス増幅器、コンパレータおよびカウンターを含む上記のセンサー（すなわち単一光子検出器）は、１ｎｓに等しいかまたは１ｎｓより小さい（例えば０．１ｎｓ、０．０１ｎｓ）のτRESPONSE時間を有している可能性がある。個別の蛍光染料によって放出された蛍光信号の正確な分離を可能にする信号処理アルゴリズムが利用される。
【００１０】
特に、ここで実施形態は以下を開示している。
【００１１】
光スペクトル分離器に多色光を伝達する光ファイバー、
少なくとも１つのマルチチャネル光検出器（光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記受信光スペクトルの単一光子に応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している）、
マルチチャネル増幅器（増幅器チャネルはそれぞれ、前記マルチチャネル光検出器の前記センサーチャネルの対応する１つからの光スペクトルに対応する前記電流パルスを受け取り、かつ前記電流パルスを増幅するのに適している）、および
マルチチャネル光子計数器（カウンターチャネルはそれぞれ前記マルチチャネル増幅器の前記増幅器チャネルの対応する１つから前記増幅された電流パルスを受け取るのに適していて、前記マルチチャネル光子計数器は所定の時間間隔上の各カウンターチャネルにおいて前記増幅された電流パルスを合計するのに適した積分器を有している）。
【００１２】
次のステップを具備するＤＮＡ配列を同定する方法もまた開示される。
【００１３】
蛍光染料で選択ＤＮＡ断片にラベルを付けること、
前記ＤＮＡ断片を光ファイバー分離キャピラリーへ入力すること、
前記ＤＮＡ断片から蛍光スペクトルを生成するために、所定波長のレーザー光により前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて前記ラベル付けされたＤＮＡ断片を照明すること、
前記ＤＮＡ断片からの蛍光スペクトルにより光ファイバーを照明すること、
前記光ファイバーは前記蛍光スペクトルを光スペクトル分離器に伝え、
前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器上に入射し、
光検出器チャネルはそれぞれ、感光性ピクセルがある光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じて電流パルスを生成するために適合した複数の感光性ピクセルを有している。
【００１４】
カラーコードされた微小粒子を検出する方法がさらに開示される。
【００１５】
蛍光染料で微小粒子にラベルを付けること、
緩衝液で前記ラベルが付けられた微小粒子を懸濁すること、
所定の速度で光ファイバーキャピラリーに、前記ラベルが付けられた微小粒子を有する前記緩衝液を通すこと、
前記光ファイバーキャピラリー内の前記ラベルが付けられた微小粒子を、蛍光スペクトルをそこから生成するためにレーザー光で照明すること、
前記ラベルが付けられた微小粒子からの蛍光スペクトルにより光ファイバー照明すること、前記光ファイバーは、光スペクトル分離器に前記蛍光スペクトルを運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取り、前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じた電流パルスを生成することに適した感光性ピクセルを有している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明のさらなる理解について、以下の図面への参照がなされてもよい。
【図１】図１は従来の単一光子センサーのブロック図である。
【図２】図２は商用の３２チャネルＰＭＴのうちの１つのチャネルから直接測定されたパルスを示すグラフである。
【図３】図３は単一光子感度があるセンサーのブロック図である。
【図４】図４はスペクトル分離モジュールの概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは図４のスペクトル分離モジュールの斜視図である。
【図５】図５は２つの３２チャネルＰＭＴ検出器を有する２重スペクトル分離モジュールの斜視図である。
【図６】図６は４００ＭＨｚ２６ｄＢの増幅器での増幅の後にＳｉＰＭダイオードから測定されたパルスを示す。
【図６Ａ】図６Ａは３段、２ＧＨｚ、６０ｄＢのパルス増幅器の電子回路図である。
【図７】図７はＰＭＴからの典型的な１ｎｓ電圧パルスを示す。
【図８】図８は３２チャネル単一光子検出器に関する概略ブロック図である。
【図９】図９は３２チャネルＰＭＴの１つのチャネルからの増幅されたパルスのパルス波形と、ＰＥＣＬコンパレータ後のパルス波形を表す。
【図１０】図１０は２段のパルス増幅器の回路図である。
【図１１】図１１は単一光子検出器のチャネルクロストークを示すグラフである。
【図１２】図１２は高速光子計数器のブロック図である。
【図１３】図１３は単一光子検出器の１つのチャネルの光対光子計数特性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、３２チャネルＰＭＴセンサーを有する分光計の、上のパネルではチャネル分解能を示し、下のパネルでは波長分解能を示す。
【図１５】図１５は単一光子検出器に関する光学系のブロック図である。
【図１６】図１６は、３つの波長に関して測定された図１５の単一光子検出器の１つのチャネルの光対光子計数特性を示すグラフである。
【図１７】図１７は、光子検出モジュールの出力での光子計数分布のヒストグラムを示す。
【図１８】図１８は、単一レーンのＤＮＡ塩基配列決定装置の写真および概略図から成る。
【図１９】図１９は、ＤＮＡ塩基配列決定データを処理するために用いられる、上のパネルではシステム行列Ｃを示し、下のパネルではカラーでコンボリューション行列を示すグラフから成る。
【図２０】図２０はＤＮＡ塩基配列決定の掃引線および品質スコアのグラフである。
【図２１】図２１は、カラーコードの認識およびカラー解読をシミュレートしたコンピューターの精度を示すグラフから成る。
【図２２】図２２はビーズ検出システムの概略図である。
【図２３】図２３は無作為に着色されたビーズの認識を示すグラフである。
【図２４】図２４は３２チャネル高速大ダイナミックレンジの単一光子分光計のブロック図である。
【図２５】図２５は３２チャネルパルス増幅器に関する概略回路図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図３を参照すると、微細な量の複数の蛍光染料の混合によって放出された放射を測定するための単一光子感度を持っているセンサー１０のブロック図が示される。光学の入力ファイバー１１は、その後、図４に概略的に示されるスペクトル分離モジュール１２に通される多色の蛍光を収集する。モジュール１２を通過した後に、分解された蛍光信号は、３２チャネル光センサー１３の感光性ピクセルを照明する。そのセンサーは、ほんの一例として（日本の会社であるHamamatsuによって製造される）３２チャネルＰＭＴアレイＨ７２６０−２０でもよい。分離された波長の各々は、ＰＭＴの１つのチャネルによって検出され、ＰＭＴのチャネルはそれぞれ、約１０ｎｍの範囲の波長を検出することができる。受信光子は、増幅と光子計数を受ける極めて短い電流パルスを生成する。例えば、図７に示されるように、ＰＭＴが単光子計数法モードで動作しているときに、チャネルはそれぞれ、入射光子束に応じた短い約１ｎｓの電流パルスのストリームを生成する。パルス振幅は８−１２ｍＶの対応するピーク電圧を有する０．４―０．６ｍＡに及ぶ。パルスはパルス振幅より小さなしきい電圧で設定されるコンパレータによって数えられる。得られた光子計数は、記録とデータ処理のためにコンピューター１４に転送される。
【００１８】
一実施形態において、スペクトル分離モジュール１２は、４８０ｎｍから６３０ｎｍまでの一連の波長内の多色の蛍光の分離および測定を行なう。図４および４Ａを参照すると、多色の蛍光は、コリメーター１７（その一例はニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造されるＦ８１０ＳＭＡ−５４３コリメーターでもよい）に結合される光ファイバー入力１６を介してスペクトル分離モジュールに提示される。コリメーター１７は、直径約１０ｍｍの並列の多色のビームを生成する。コリメートされたまたは平行なビームは、レーザー除去フィルター１８を通って、回折格子１９（それはニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造される回折格子ＧＲ１３−１８５０のような回折格子でもよい）によってその構成波長成分に分離される。一実施形態において、回折格子１９は４９０ｎｍから６３０ｎｍまで波長の範囲内で、蛍光のスペクトルの分離および測定を行なうために調整されてもよい。
【００１９】
分離された単色ビーム成分は、３２チャネルＰＭＴ １３のピクセル上に集中する。上記の集束は球面集束ミラー２１（それはニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社に製造される球面鏡ＣＭ２５４−０７５−Ｇ０１でもよい）および円柱レンズ（それはまたＴｈｏｒｌａｂｓ社によって製造される円柱レンズＬＪ１０９５Ｌ２でもよい）によって遂行されてもよい。
【００２０】
一実施形態において、スペクトル分離モジュールは、１０ｎｍだけ異なる波長を検出することができる。分離した波長はそれぞれ、ＰＭＴの１つのチャネルによって多くは検出される。
【００２１】
ＰＭＴチャネルはそれぞれ、約１０ｎｍの範囲で波長を検出する。
【００２２】
分光計のスペクトル分離モジュールは１ｎｍもの高いスペクトル分解能を提供することができる。約１０ｎｍのスペクトル分解能は、０．２ｍｍの距離によって分離される０．８ｍｍ×７ｍｍ検出ゾーンを有する３２チャネルＰＭＴによって得られてもよい。光子受信ファイバーのアレイ（各アレイは単一光子センサーを照明するために接続されている）を使用することによって、センサーの全体のスペクトル分解能を向上させることができることを見出している。各光子センサーのファイバー束を有する分光計のスペクトル分解能は、約５ｎｍであるとわかっている。実際、高いスペクトル分解能が必要な場合、受信ファイバーを、いくつかの応用においてバンドパスフィルターとして用いることができる。蛍光染料は広い光学スペクトルを有しているが、ファイバー束のいくつかのアレイは染料スペクトルを集め、かつ、より詳細に以下で記述されるように、分光計のいくつかのチャネルに及ぶために染料スペクトルを導くことに用いられてもよい。
【００２３】
図５を参照すると、分光計の一実施形態はより広範囲の波長に適しているかもしれない。波長の範囲を増加させるために、２色性平板ビームスプリッター２３が用いられてもよく、ほんの一例として、ニュージャージー州のＥｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓ社によって製造されるビームスプリッターＮＴ４７−４２４でもよい。ビームスプリッターはまたニューヨーク州のＳｅｍｒｏｃｋ社によって製造されるビームスプリッターＦＦ６５０−Ｄｉ０１でもよい。入射放射線（すなわち光）がコリメートされた後、ビームスプリッター２３はコリメート光を２つの部分に分割する。短波長（例えばＥｄｍｕｎｄのビームスプリッターに関して５３０−５８５ｎｍまたはＳｅｍｒｏｃｋのビームスプリッターに関して５００−６４０ｎｍ）は、１つの経路２４に偏向される。同時に、より長波長（例えばＥｄｍｕｎｄのビームスプリッターに関して６０１−８００ｎｍおよびＳｅｍｒｏｃｋのビームスプリッターに関して６６０−８２５ｎｍ）は、第２の経路２６に導かれる。長および短波長は、それによって分光計内におよそ９０度で空間的に分離される。２色性平板ビームスプリッターの使用は、検出器装置の型に依存して、５００−８００ｎｍおよび３００−５００ｎｍの波長範囲内の分光計において、広範囲のスペクトルの分離およびよりよいスペクトル分解能を許す。商用検出器モデルＨ７６２０−２０およびＨ７６２０−０４は、上記の波長範囲に関してそれぞれ有用であることがわかっている。
【００２４】
従来の技術における当業者は、センサーまたは分光計が２つの異なる型のマルチチャネル単一光子検出器を含んでもよいことを理解するだろう。例えば、この発明の要旨を逸脱しない範囲で、ＰＭＴは長波長に使用され、シリコン光電子増倍管（ＳｉＰＭ）ダイオード検波器は短波長に使用されてもよい。ＳｉＰＭダイオードは、ＣＭＯＳ技術であり比較的安く、共通のシリコン基板上に並列に共に接続されているマトリクス状の個別のピクセルから成る。単一光子に応じて、ＳｉＰＭは単一電圧のパルスを生成する。技術は、ＳｉＰＭのアレイが同じチップ上に統合された駆動および読出電子回路で使用されてもよいようなものである。ＳｉＰＭは（約１０５−１０７での）高い利得であり、比較的低電圧（例えば約２０−７０Ｖ）で動作する。それらの応答時間は１−２０ｎｓの範囲で変化する。図６を参照すると、約２ｎｓ単一光子パルスが、４００ＭＨｚ、２６ｄＢのパルス増幅器での増幅後、ＳｉＰＭダイオードから得られてもよいことが理解される。ＳｉＰＭダイオードと共に、１段か、２段か、または３段の２ＧＨｚ、６０ｄＢのＳｉＰＭパルス増幅器が、単一光子計数領域での単一光子のための検出器として使用されうることが見出されている。図６Ａは、３段、２ＧＨｚ、６０ｄＢのパルス増幅器のための電子回路図を示す。ＳｉＰＭアレイもまた、単一光子分光計のための単一光子センサーとして用いられてもよい。ＳｉＰＭもまた、ＤＮＡ塩基配列決定の検出に適応可能であるとわかっている。
【００２５】
半透鏡が二色性のビームスプリッターの代わりに用いられてもよいことは、従来の技術における当業者によって理解されるだろう。半透鏡の使用は、分光計によって受け取られた全光子束が２つの単一光子検出器によって検出されるので、検出ダイナミックレンジを増加させる可能性がある。同様に、光子束はいくつかの束に分裂され、それぞれの束は専用の単一光子検出器によって検出される。また上記のアプローチもまた、光子検出システムのダイナミックレンジを増加させるために用いられうる。
【００２６】
図８を参照すると、一実施形態では、検出器は、表面実装型デバイス技術に基づく３２チャネルパルス増幅器２７と、フィールドプログラムされたゲートアレイに基づく３２チャネル光子計数器３１と、からなる。検出器の増幅器部分は、３２の同一パルス増幅チャネル２８を含んでいる。そのチャネルのそれぞれは、一実施形態において、３５−４０ｄＢの利得および１ＧＨｚの帯域幅を有している。検出器も、約２ｎｓの増減時間を各々有する、３２の高速のコンパレータ２９が提供されるかもしれない。この配置は、最小パルス幅を近似的に４．５ｎｓに制限し、１０−５０ｍＶから、確実にコンパレータをトリガーすることができるレベルまで、ＰＭＴ負パルスを増加させる。図９は、上部の掃引線で３２チャネルＰＭＴの１つのチャネルからの増幅されたパルスのパルス形状を示し、下部の掃引線でＰＥＣＬコンパレータの後のパルス形状を示す。
【００２７】
パルス増幅器のための電子回路の実施形態を表す図１０を参照すると、２つのＢＧＡ ４２７増幅器３２および３３（すなわちそれぞれＵ５７、Ｕ５８）からなる２段増幅器を示す。増幅段はそれぞれ、２ＧＨｚの範囲において２０デシベルの増幅を提供する。増幅された信号は、１ｎｓのτRESPONSEを有するＡＤＣＣＭＰ５５３ ＬＶＰＥＣＬコンパレータ３４へ入力される。負の増幅された信号パルスは、カウンター３１へ入力されるコンパレータからＰＥＣＬレベル出力パルスを生成する（図８）。
【００２８】
ポテンショメータ３６（すなわち、０から３．３ボルトまでのポテンショメータＲ９）を用いて、基準電圧を調整することができる。一実施形態においては、１．２Ｖ（増幅器の中間点）から増幅されたパルス高まで、基準電圧を設定することができる。雑音のレベル以上でとどまるがパルス底にできるだけ近づくために、しきい電圧を選択することができる。１段の増幅器がまたコンパレータ３４をトリガーするための十分な利得を提供してもよいことが理解されるだろう。上記の実施形態では、キャパシタ３７（すなわちキャパシタＣ３５）を使用しなくてもよい。結果として生じる回路は、２０ｄＢの増幅を提供し、パルスの極性を一度だけ変化させる。示されるように、図９は、上部の掃引線ではコンパレータ３４に入力される前に増幅されたパルスのパルス形状を示し、下部の掃引線ではコンパレータ３４から出力されたパルスのパルス形状を示す。
【００２９】
２つの主な型のクロストークが単一光子検出器に発生する可能性がある。１つの型は３２チャネルＰＭＴの内部での電子クロストークである。図１１は、ＰＭＴの隣接のチャネル間の典型的なクロストークをグラフで表わす。上記のクロストークは、ＰＭＴ内部の電子光学部品のある特徴によって発生する。３２チャネルＰＭＴにおけるチャネルクロストークは、光学および電子コンポーネントを含んでいる。光学クロストークは不完全な集光により隣接チャネルの照明から発生し、電子クロストークはＰＭＴチャネル間の内部電子フラックスによって引き起こされる。約３パーセントのより小さいチャネルクロストークは、個別チャネルが光ファイバーによって照明される場合、既知の３２チャネルＰＭＴ内で観測される可能性がある。
【００３０】
別の型のクロストークは、増幅器での増幅チャネルとカウンターでのチャネルとの間の電子クロストークである。一般に、増幅器のチャネルと３２チャネル光子計数器のチャネルの間の電子クロストークは観測されていない。しかし、センサーにおいて非常に小さなチャネルクロストークでさえ、例えば色素混合の解析、特に異なる色素成分の組成が数桁だけ異なっている場合、曖昧さを引き起こす可能性がある。光学のクロストークを最小限にするために、単一のＰＭＴチャネルは、商用の５３２ｎｍのＮｄＹＡＧレーザーからのビームをそれらに集中させることにより照明されてもよい。以上のように、チャネルクロストーク全体は数パーセントポイントに制限され、それはメインチャンネルで測定された信号に比べて線型である。
【００３１】
図８を再び参照すると、増幅の後、増幅器２７の各々のチャネルからの出力は、３２チャネル高速光子計数器３１へ入力される。カウンター３１は、チャンネル入力に到達するパルスを合計する。積分時間間隔はカウンター３１内のシンクロジェネレーター（図示せず）によって提供される。一実施形態において、最小の積算時間は約０．３ｍｓである。
【００３２】
図１２を参照すると、ブロック図は、高速カウンター３１（図８）の実施形態の詳細を提供する。この実施形態では、高速カウンターは１対の同一の計数回路３８および３８Ａを具備する。計数回路はそれぞれ、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａ、それぞれ３つのＰＥＣＬからＴＴＬへの３状態バッファー４１Ａ−Ｃおよび４１Ｄ−Ｆ、およびそれぞれ３つのＡＮＤゲート４２Ａ−Ｃおよび４２Ｄ−Ｆからなる。計数回路はそれぞれ、固定値同期化バイトユニット４４、同期化ブロック２バイトカウンター４６、３つの３状態バッファー４７Ａ−Ｃおよび３つのＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃから成る同期化回路へ入力される。
【００３３】
高速カウンターはまた、水晶振動子５１、１４段のバイナリリップルカウンター５２、およびそれぞれがカウンター５２の段に対応する複数のスイッチ５３から成る制御回路４９を含んでいる。制御回路４９はまた、バイトカウンター５４を含んでいて、その出力はブロックカウンター５６へ入力される。バイトカウンター５４およびブロックカウンター５６は各々、ＡＮＤゲート４２Ａ−Ｆおよび４８Ａ−Ｃに接続される。バイトカウンター５４の出力も、１対の付加的なＡＮＤゲート５７Ａおよび５７Ｂへ入力され、それぞれのゲートは４つのＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄに接続する。ノットゲート５９はブロックカウンター５６、およびＡＮＤゲート４２Ａ−Ｆおよび４８Ａ−Ｃに接続される。制御回路は、４つのＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄの各々に接続されるフリップフロップを含んでいる。ＬＰＴ出力コントロール回路６２は、時間遅延ユニット６３、ＯＲゲート６４およびフリップフロップから成る。
【００３４】
高速増幅器２７からのパルスは、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａの入力に同時に提供される。これらのカウンターのうちの１つは常に計数モードにあり一方、他方は保留にされている。蓄積されたデータは、バイト単位で、バイト数に対応するＰＥＣＬからＴＴＬへの３状態バッファーを介して、ＬＴＰポート６７へ転送される。
【００３５】
３バイトのＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａの状態は、対応するＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ａ−Ｄによって変換される制御回路信号によって決定される。一例として、ＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ｂからの出力信号は、保持モードで３バイトのＰＥＣＬカウンター３９を保持し、同時に、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９Ａを計数モードに設定する。ＴＴＬからＰＥＣＬへの変換器５８Ｃからの出力信号は、３バイトのＰＥＣＬカウンター３９Ａを保持モードに設定し保持し、そして３バイトのＰＥＣＬカウンター３９を計数モードに設定する。変換器５８Ａおよび５８Ｃからの出力信号は、そのデータがＬＰＴポート６７へ転送された後、対応する３バイトのＰＥＣＬカウンターをリセットする。
【００３６】
各伝送された１０２バイト後に、同期化回路４３からの３つのシンクロバイトが開始される。第１のバイトは、図１１に示されるように、０００１０００１の固定値を持っていて、第２と第３番のバイトは、同期化ブロック２バイトカウンター４６のそのときの現在状況を表わす。カウンター４６のシンクロバイト出力は、対応する３状態バッファー４７Ａ−Ｃを通して、システム出力６７に渡される。
【００３７】
制御回路４９の水晶振動子５１は、１４段のバイナリリップルカウンター５２に渡される２ＭＨｚクロックパルスを生成する。カウンター５２は、参照数字６８によって概して示される１４本の出力ピンを有している。各ピンはクッロクパルスを出力し、その初期周波数は２から１６３８６までの係数で割られる。スイッチ５３は、１−１４から適切なピンを選び、かつそれによって全回路のためにクロック周波数を設定するために用いられる。この実施形態では、スイッチは、ＬＰＴポート６７へのデータの伝送速度を、毎秒１２２から１，０００，０００バイトまで設定することができる。
【００３８】
クロックパルスはバイトカウンター５４に渡される。各クロックパルスを受け取った後に、バイトカウンター５４は連続して、図１１の「バイト」数字１、２、３として示される３つの出力のそれぞれの信号を生成する。上記の信号はそれぞれ、対応するデータバイトを伝送し、データバイトはそれぞれ計数回路３８および３８Ａの両方へ渡される。データ信号もそれぞれ、対応するＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃを通じて同期化回路４３に提示される。
【００３９】
バイトカウンター５４からの第４番目の出力上でのハイ（ｈｉｇｈ）は、カウンターをリセットし、伝送された３バイトワード数をカウントするブロックカウンター５６に渡される。３４番目の３バイトワード（それは１０２データバイトと等しい）を数える際、ブロックカウンター５６は、３５番目の３バイトワードに関する信号を生成する。この信号は、同期化回路のデータがＬＰＴ出力６７に提示されることを可能にするＡＮＤゲート４８Ａ−Ｃに提示される。同時に、３５番目の３バイトワードに関する信号は、計数回路３８および３８Ａの出力を阻む。３６番目の３バイトのワードに対応するブロックカウンター５６からの出力信号は、図１２に示すように、カウンターをリセットし、１０５バイトのシーケンス数をカウントするために同期化ブロック２バイトカウンター４６をクロックする。同期化ブロック２バイトカウンター４６は、６５５３６の値が達せられた後、リセットする。
【００４０】
フリップフロップ６１は、バイトカウンター５４からの全ての第１のバイトパルスによってトリガーされる。フリップフロップ６１によって生成された信号は、３バイトＰＥＣＬカウンター３９および３９Ａを交互にカウントまたはホールドモードにする。上記の信号はまた、カウンターの出力を有効にするか無効にし、ＡＮＤゲート５７Ａおよび５７Ｂを通じてカウンターへのリセットパルスの伝送を許容するかブロックする。図１３は、図１２に表されたカウンターの型の１つのチャネルの、典型的な光対光子計数特性を示すグラフを表す。
【００４１】
図７を再び参照すると、典型的な電圧パルスは、パルス増幅器の実施形態の出力および入力において表される。増幅されたパルスの幅は、近似的に、入力パルスの幅より約５つの谷間だけ長い５ｎｓである。検出器のダイナミックレンジ（暗騒音に対する最大の光子計数の比）は、−２０ビットである。データ記録ソフトウェアの使用によって、２ｎｓ未満のパルス持続時間は、パルス振幅−１．５Ｖでのカウンターによって解明されるかもしれない。
【００４２】
本実施形態の３２チャネル単一光子検出器の感度および線型性により、毎秒５×１０７計数と同様の高い光子計数率を記録することができる。実際、検出器の線型性は、例えば、毎秒２×１０７光子計数を超える非常に広範囲の線型の光子計数を可能にする。２ｘ１０８と同じくらいの光子カウントも観測されている。これらの計数範囲は、任意の既知の商用の単一光子検出器の検出ダイナミックレンジを超えるだろう。本実施形態の検出器と、利用可能な商用の単一光子検出器（例えばモデルＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１２−ＦＣ）との光子検出効率の比較は、４９０ｎｍで、本実施形態の３２チャネルＰＭＴ検出器の光子検出効率が、先の商用のＳＰＣＭの光子検出効率の約２０％であったし、それは６１０ｎｍで５％まで減少したことを示す。
【００４３】
図８および１２を参照して、カウンター３１によって収集されたデータは、標準ＩＥＥＥ １２８４パラレルポートインターフェース６７を用いて、ＰＣに転送される。データは、バイナリフォーマットを用いて１０５バイトのフレームにおいて転送される。データフレームは、それぞれの３２検出チャネル（チャネル当たり３バイト）のために得られる複数のカウント値から成る。フレームはそれぞれ、次のフィールドを含んでいる６バイトのヘッダーで始まる。ミリ秒で測定される２バイトカウント期間長、１バイトカウンター型、および２バイトフレーム番号。フレーム番号は、現在のフレーム数を含んでいる。数は、オーバーフローにより増加するシーケンスをこのように形成する各次のフレームのために１だけインクリメントされる。フレーム番号は、同期マークとして機能し、連続データストリームでデータフレームを見つけるために、データ処理ソフトウェアによって用いられる。フレーム番号はまた、データ保全の検証のため、および伝送線路に干渉によって導入されたエラーを見つけるために用いられる。特別のソフトウェアパッケージは、カウンターによって転送されたデータのオンライン視覚化、および録音を行なう。
【００４４】
蛍光スペクトルを処理する際に、信号処理の主な課題は、別個で知られている蛍光性のスペクトルを有するｎ染料からできている染料混合によって生成される蛍光信号への個別の蛍光染料の寄与の決定である。混合における個別の染料の寄与は、もし分光計が検出された蛍光に対する線型応答を生成すれば、分光計のＮ独立チャネルにおいて測定される蛍光の分解によって見つけられうる。
【００４５】
一例として、分析された蛍光染料数ｎ＜Ｎ（例えばＤＮＡ塩基配列決定に関しては≪＝４）ならば、既知のシステム行列手法Ｈ（Ｎｘｎ） ＝ （ｈ１，ｈ２．．．，ｈｎ）を用いて、ここでｈｉ ＝ （ｈ１ｉ．．．ｈＮｉ）Ｔ，（１≦ｉ≦ｎ）は、分析された染料混合における蛍光染料のスペクトルを表わすＮ−成分ベクトルである、個別の蛍光染料ｈｉに関するスペクトル応答より先にシステムを較正することによりシステム行列Ｈを得ることは可能である。ｒ＝（ｒ１．．ｒＮ）Ｔが染料混合の測定された蛍光性のスペクトルであり、ｓ ＝ （ｓ１，ｓ２，．．．，ｓｎ）Ｔが、個別の蛍光染料の濃度を表わす成分ウェイトのベクトルである場合、ノイズω ＝ ｛ω１．．．ωＮ）Ｔがある状態における、測定スペクトルｒは次のとおりである：
ｒ＝Ｈｓ＋ω （１）
式（１）の最適解ｓは、雑音成分ωｉの分布特性に依存する。単純化された仮定はωｉが独立していて、同一に分布している通常のランダム値を仮定し、よく知られ計算上効率的な最小分散の、以下の
【数１】
【００４６】
を推定するための公平な解決法が、１９９３年にＫａｙによって実現された（Fundamentals of Statistical Signal Processing. Estimation Theory のp. 97）。
【数２】
【００４７】
光子計数において、個別率観察ｒｉは、等しい平均と分散を有するポアソン分布を有している。より高い光子計数率（１つの観察期間当たり５０以上のカウント）については、観測された率は、「真実の」平均率ｒｉと、以下のように平均率に依存する分散を有するガウス雑音ωｉとの重ね合せによってよく近似される。
【００４８】
【数３】
より正確な解決法は、独立した非同一に分布した正規なランダム変数ｇによって得られ得る。式（１）の一般解は、上記の１９９３年にケイによってこれまでに導かれた以下である。
【数４】
【００４９】
ここでＣは成分ωｉの共分散行列である。ωｉの独立により、行列Ｃは対角である：
【数５】
【００５０】
ここでσｉ２はωｉの分散である。実際上、平均率
【数６】
【００５１】
は未知であり、観測された率ｒｉは、分散の計算のための用いられる：
【数７】
【００５２】
分散σｉ２は各測定のために推定される。σｉ２とｒｉとを関連づける関数は、ｒｉを得るために用いられる、前処理するそれぞれの方法に関して特殊である。例えば、ｒｉがサンプリング周期の間光子の計数によって直接得られる場合、σｉ２＝ｒｉである。バックグラウンドｂｉが計数観測の結果から引かれる場合、σｉ２＝ｒｉ＋ｂｉとなる。ｒｉがｋサンプリング周期にわたる計数観測を平均化することによって得られる場合、σｉ２＝ｒｉ／ｋである。式（３）の推定量は、より正確だが式（２）の推定量より多くの計算上のリソースを要する。
【００５３】
以上記述された信号処理技術は、クロストーク除去の段階でバックグラウンド減算を可能にする。これは、バックグラウンドを表わす付加的なスペクトル（行列Ｈにおける列）を生成することにより実現される。新規の行列Ｈの式（２）および（３）の推定量は、他のスペクトル成分からバックグラウンドを分けるだろう。
【００５４】
図１５を参照して、単一光子検出器の特性化のために用いられた測定構成のブロック図が示される。構成では、（モノクロメーターまたは５３２ｎｍのレーザーであってもよい）光源６９からの光は、１セットの中性光学フィルター７１を通して渡され、ＧＲＩＮレンズ７２で終端されるファイバーに結合される。ＧＲＩＮレンズからの光は３２チャネルＰＭＴの３２の光電陰極のうちの１つの上に集中する。光源６９としてモノクロメーターを有する図１５に示される構成を用いて、単一光子検出器用に測定された光子計数および光特性は、図１６に表される。理解されるように、３つの測定波長すべてについては、検出器の出力は毎秒１０８光子計数までは線型のままであり、検出器のダイナミックレンジは、毎秒２ｘ１０８光子計数を超える。絶対的な計数率における有意差は、６３０ｎｍと比較して、４８８ｎｍと５３０ｎｍの波長に関して示される。６００ｎｍより長い波長ではＰＭＴの量子効率の減少がある。
【００５５】
本実施形態の光子計数システムにおけるノイズは、光子計数の一時的な分布によって決定される。正しく操作する光子計数器は、光子計数率推定の分散（例えば積分周期の間に数えられた光子数）がその平均値と等しいポアソン分布を利用する。これは光子検出器の信号対雑音比に関するより低い境界を設定する。図１７は、４つの異なる照明レベルに関する光子検出モジュールの出力で光子計数分布のヒストグラムを示す。光子計数は２５ｍｓの区間中に収集され、照明レベルごとに約３０分に関するデータ記録ソフトウェアを用いて記録された。図１７は、すべての４つの照明レベルに関して平均値と分散との間のよい一致を示す。これは、測定されたノイズが、検出器によって検出された光子束の確率的な本質によって引き起こされただけであることを示し、検出器自体が付加的なノイズを少しも生成しないことを示す。
【００５６】
一実施形態において、いくつかの既知の蛍光染料からできている混合の認識および鋭敏な検出を必要とする応用に、単一光子分光計を用いることができる。特に、本明細書で記述された分光計は、商用のＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーによる蛍光励起を用いる単一の融解石英キャピラリーにおいて電気泳動によって行なわれるＤＮＡ塩基配列決定の検出のために、光センサーとして用いられてもよい。レーザー波長を抑えるために、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーのためのそれぞれ５０Ｄ ５２２ｎｍおよび５３８ｎｍのレーザーエッジフィルター（５２２ＡＥＬＰ、５３８ＡＥＬＰ、オメガオプティカル社、バーモント州、ＵＳＡ）が用いられてもよい。
【００５７】
図１８を参照して、単一レーンのＤＮＡ塩基配列決定装置の実施形態の写真および概略図が示される。ＤＮＡサンプルは、写真に示される単一のキャピラリー分離モジュールにおける電気泳動の分離を受ける。モジュールは、内蔵の電圧計および電流計を有する小型の高電圧供給７３（１５ｋＶ以内）、ポリマー置換システム７４、温度制御システム７６（２５−７０℃±０．０１℃）、ＤＮＡサンプルおよび流動バッファーのためのチューブチェンジャー回転荷台７７、および精密光学系７８から成る。図１８の概略図を参照すると、蛍光性にラベルが付けられたＤＮＡ断片が、光学系７８を通過する場合、それらは、ユニフェイズ、カリフォルニア州によって作られたＡｒイオンレーザ（４８８および５１４ｎｍ、２０ｍＷ）のような（しかしこれに限定されない）ファイバー化されたレーザー、またはＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒ、ネバダ州によって作られたＮｄ：ＹＡＧレーザー（５３２ｎｍ、２５ｍＷ、ＧＣＬ−０２５−Ｓ）によって照明される。レーザー励起蛍光は（２００ｍｋｍコア径があってもよい）ファイバー８１によって収集され、スペクトル分離モジュール１２（図３）に送られる。一実施形態において、オメガオプティカル社（ＶＴ）によって作られた５ＯＤ ５２２ｎｍおよび５３８ｎｍのレーザーエッジフィルター（５２２ＡＥＬＰ、および５３８ＡＥＬＰ）は、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーのレーザー波長をそれぞれ抑制するために用いられてもよい。
【００５８】
アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー、カリフォルニア州）から得られたＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ１．１シーケンシング標準とラベルが付けられたＤＮＡサンプルは、２５μｌのフォルムアミドにおいて変性して、注入の直前にＨＰＬＣ等級水において１から５まで希釈された。ＤＮＡ分離は、４０ｃｍ（３５ｃｍの分離長さ）のコーティングされていない（５０μｍの内径および３６５μｍ外径を有して、５０℃においてＰＯＰ−７分離媒体で満たされている）キャピラリーにおいて１５０Ｖ／ｃｍで行われた。この例において、流動バッファーが用いられた。
【００５９】
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴターミネーターのラベル付けために用いられた４つの染料によって生成された蛍光強度を推定するための少なくとも２つの有効なアプローチがある。このような１つのアプローチは上記の式（３）にしたがって測定スペクトルを分解することである。全測定スペクトルの分解に関して、各染料を記述するスペクトル成分ｃｉは、染料ごとに分離して放射された蛍光を測定することによって、および光子計数率の測定されたベクトルを正規化することによって実験的に得られる。混合における個別の染料の濃度ｓ［ｎ］の決定は、時刻フレームごとに行なわれる。染料濃度の得られた配列は、４つの塩基配列決定の掃引線（sequencing traces）を形成し、これらはさらに塩基呼び出し（base calling）にも用いられる。
【００６０】
別のアプローチは仮想フィルターの応用である。仮想フィルターの方法は、成分スペクトルが十分に分離される場合、用いられてもよい。空間的に十分に分離された波長を有するスペクトルを含んでいる入射光は、選択された受け入れ角度を有するファイバー束の入力端を照射する。有限の受け入れ角度のために、特定のファイバーは特定の波長からのみ信号を収集し、光検出器の特定チャネルに信号を送る。一例として、仮想フィルターは、３つのＰＭＴチャネルを選択することにより形成されてもよく、その結果、各染料の蛍光の各々の３つの異なる波長のそれぞれが、３つのＰＭＴチャネルのうちの１つによって捕獲され、したがって割り当てられたチャネルでの測定に最大のものを寄与し、他のチャネルでの最小の応答を提供する。上記のシステムは、マルチカラーの蛍光の検出のための帯域フィルターを不必要にする。別の例では、特定の染料のかつ特定の波長を有している空間的に広いスペクトルは、いくつかの（例えば３つの）ファイバーまたはファイバー束のグループによって同時に捕獲される。上記の処理によって、システムの信号対雑音比での減少のないダイナミックレンジでの著しい増加が可能になる。
【００６１】
一実施形態において、狭いエミッションスペクトルを有するスペクトルに関する線型性の高ダイナミックレンジは、実現されてもよい。そこで、各染料の蛍光の各々のいくつかの波長は、ＰＭＴチャネルのうちの１つによって捕獲され、したがって割り当てられたチャネルでの測定に最大のものを寄与し、他のチャネルでの最小の応答を提供する。ファイバーは特定の波長を１ｘＮ光検出器内の対応する検出器へ通過させる。そこから、信号は空間的に分離されたスペクトルを収集するためのＭｘＮ光検出器に渡される。投影光学系はＭｘＮ光検出器のＮ番目の列にＮ番目の波長を投影するために用いられてもよい。したがって、特定の波長の信号は、Ｍ個の単一光子光検出器によって同時に収集される。この処理はまた、システムに関する高い信号対雑音比および線型性の高ダイナミックレンジを実現する。
【００６２】
記述された実施形態に関するデータ処理アプローチでは、４つの塩基配列決定の掃引線は、ノイズフィルタリングまたはスムージング、基線減算、クロストーク除去、モビリティシフト補正、ピーク高さ、および間隔等価を含む標準処理を受ける。ピーク当たり７−１５ポイントまで再サンプリング後、トレースは．ＳＣＦフォーマットで記憶され、標準ベースコールＰＨＲＥＤソフトウェアによって処理される。処理の結果は、それらの位置と品質のスコアを有する基本呼び出しの配列として返される。
【００６３】
以上示されるように、ＤＮＡ塩基配列決定データの処理への少なくとも２つのアプローチがある。図１９（それはシステム行列グラフ８２と、ＡｒイオンおよびＮｄ−ＹＡＧレーザーに関するカラーデコンボリューション行列８３および８４とをそれぞれ示す）を参照すると、単純化されたデータ処理アプローチは、ＰＭＴの、チャネル１８（５４６ｎｍ）、チャネル１５（５６８ｎｍ）、チャネル１１（５８９ｎｍ）およびチャネル５（６１０ｎｍ）から得られた信号を用いるだろう。チャネル１８、１５、１１および５はそれぞれ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣに対応する。ＡｒイオンおよびＮｄＹＡＧレーザーに関する導かれたカラーデコンボリューション行列８３および８４は、図１９の下部においてスプレッドシートフォーマットで示される。一方、システムの行列Ｈの決定のためのスペクトル成分ｈｉは、各染料によって別々に放出された蛍光の測定によって、および図１９の上部のグラフ８２において示される光子計数率の測定されたベクトルを正規化することによって、実験的に得られてもよい。
【００６４】
塩基配列決定データの処理への前述したアプローチは、同様な塩基配列決定の掃引線および塩基呼び出し品質をもたらす。しかしながら、小さな信号対雑音比によって特徴付けられる測定に関しては、全測定スペクトラムの分解は、それは、分光計の４つだけの選択されたチャネルで得られる蛍光だけよりも各染料によって放射される蛍光についての全情報を使用するので、よりよい結果を与える。染料から得られる蛍光スペクトラム全体を用いることの別の利点は、検出ダイナミックレンジの著しい増加である。実際、本明細書で説明された３２チャネル光検出器において、チャネルは毎秒２×１０７光子計数まで線型応答を有していて、もし測定された蛍光染料が広域スペクトラムを有していれば、この染料に関する検出の線型範囲はセンサーの同時に照明されるチャネル数に比例するだろう。
【００６５】
図２０は、ＡｒイオンおよびＮｄＹＡＧレーザーを用いて、本明細書に記述された分光計の実施形態で得られた、２つのＤＮＡ塩基配列決定の掃引線およびベースコール品質スコアを示す。２つのレーザーで記録された塩基配列決定の掃引線は、極めて類似したように見え、品質スコアはほとんど同一である。得られたＱ２０シーケンス読み出し長は、約６５０の塩基対と同様な長さである。その読み出し長は、（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社からのモデルＡＢＩ−３７３０のような）商用のＤＮＡシーケンサーでの同様なキャピラリー長に関して得られた読み出し長と極めてよく一致する。
【００６６】
一実施形態において、単一光子分光計はカラーコードを認識し正確に解読してもよい。図２１を参照すると、上部は、強くオーバーラップするスペクトルを有する３つの型のＱＤを含んでいる混合の解読と測定とを示す。図２１の中央部は、ＱＤ２の内容混合が０％から１５％まで変わる場合、予混されかつ解読される濃度のほぼ完全な一致を実現することができることを示す。図２１の下部での曲線は、単一光子分光計によって行なわれた測定のコンピューターシミュレーションに関して得られた解読結果と同様に、ＱＤ混合（１測定当たり約１０，０００光子）ごとに数千の測定を行なうことにより得られた解読統計を示す。
【００６７】
一実施形態において、単一光子分光計はカラーコード化された微小粒子を検出してもよい。図２２を参照すると、ビーズポンプシステム８６の中に保持された緩衝液において個別のビーズが懸濁されるビーズリーダシステムが示される。ビーズは、キャピラリー８７を介して高速でそれらを押すことにより測定される。励起ビーム８８は、ビーズにおいて蛍光を励起する。蛍光は、光ファイバー化された検出器８９によって検出され、適切な分光計または光学反射系９１を介して単一光子検出器９２に提示される。検出された信号は、コンピューター（図示せず）によって記録され、記録されたデータは適切に処理される。一実施形態において、ポンプ装置８６はプログラマブルなマイクロポンプであり、キャピラリー８７は２５μｍのＩＤキャピラリーである。励起ビーム８８によってキャピラリーの均一照明を確保するために、キャピラリーは光ヘッド（図示せず）に挿入される。ビーム８８は適切にファイバー化されたレーザー源（図示せず）によって生成される。ビーズがレーザー光線を通過する場合、それらは、ファイバー化されたミクロな対物鏡８９によって収集される蛍光を放出する。収集された蛍光は分光計９１に送られ、それは（この実施形態では高速マルチチャネル検出器である）単一光子検出器９２によって検出される。
【００６８】
図２３を参照すると、図２２のビーズリーダはランダムに有色のビーズの測定を行なうために用いられてもよい。一実施形態において、測定は量子ドットで色がつけられたポリスチレンビーズでなされた。１００の上記のビーズに関して得られた解読結果は図２３に示され、ここでｘ軸はビーズリーダによって検出された順にビーズ番号を示し、ｙ軸は１に規格化されたビーズコードを示す。
【００６９】
先のビーズの検出システムの主な特性は、単位時間当たりに検出され、かつ要求された精度で解読されうるビーズの数である。一般に、解読精度は、ビーズの検出時間中に収集された光子数によって決定される。量子ドットの商用セットについては、ビーズから収集された全光子数が１０４より大きくなる場合、９９パーセントと同様の高い解読精度をうることができる。ビーズの検出が発生する率は、光子検出器のダイナミックレンジに依存する。図２４のブロック図を参照すると、一実施形態では毎秒１０４もの高いビーズの検出率は、スペクトル分離モジュール９３、３２チャネルＰＭＴ ９４、３２チャネルＦＰＧＡ ９６、高速ＵＳＢマイクロコントローラ９７、およびコンピューター９８から成る光子検出器で得られる。上記のようなシステムは、チャネル当たり毎秒１０８の光子計数の線型範囲、および毎秒３２ＭＢのデータ転送速度を有する。図２４におけるブロック図において示されるシステムの３２チャネルパルス増幅器の１つのチャネルの回路図は、図２５に示される。
【００７０】
種々の実施形態は、ある程度の特殊性または精度で、または１以上の個々の実施形態を参照して上に記述されているが、当業者は、ここでクレームされた発明の精神または範囲から外れずに、開示された実施形態への多数の変更を行うことができる。上記の詳細な説明に含まれており、添付図面において示される主題は、特定の実施形態のみを例証するが制限しない解釈されることが意図される。詳細または構成の変更は、以下のクレームにおいて定義されるような発明の要素から外れずに行なわれてもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのマルチチャネル光検出器と、
各光検出器チャネルは、別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記受け取られた光スペクトルの単一光子に応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有し、
マルチチャネル増幅器と、
各増幅器チャネルは、前記マルチチャネル光検出器の前記センサーチャネルのうちの対応する１つから光スペクトルに対応する前記電流パルスを受け取り、かつ前記電流パルスを増幅するのに適していて、
マルチチャネル光子計数器と、
各カウンターチャネルは、前記マルチチャネル増幅器の前記増幅器チャネルのうちの対応する１つから前記増幅された電流パルスを受け取るのに適していて、前記マルチチャネル光子計数器は、所定の時間間隔上の各カウンターチャネルにおいて前記増幅された電流パルスを合計するのに適した積分器を有している、
を具備する単一光子センサー。
【請求項２】
光スペクトル分離器に多色光を伝達する光ファイバーを具備する請求項１の単一光子センサー。
【請求項３】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器は、複数のチャネルを有する線型な光電子増倍管アレイを具備し、前記チャネルはそれぞれ前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取る請求項２の単一光子センサー。
【請求項４】
前記線型な光電子増倍管アレイは、４以上チャネル、８以上のチャネル、１６以上のチャネル、および３２以上のチャネルを有する複数の線型な光電子増倍管アレイから成るグループから選択される請求項３の単一光子センサー。
【請求項５】
前記線型な光電子増倍管アレイは、３２チャネルを含んでいる請求項４の単一光子センサー。
【請求項６】
前記マルチチャネル増幅器は、３２のパルス増幅チャネルを具備し、前記パルス増幅チャネルのそれぞれは、前記線型な光電子増倍管アレイの３２チャネルのうちの対応する１つから前記電流パルスを受け取るのに適している請求項５の単一光子センサー。
【請求項７】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、２ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項８】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項９】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、０．１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、０．０１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項１１】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲は、毎秒少なくとも１０７光子計数までである請求項１の単一光子センサー。
【請求項１２】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲は、毎秒１０８光子計数である請求項１の単一光子センサー。
【請求項１３】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲Ｒが、Ｒ≧１／τRESPONSEであり、τRESPONSEは単一光子に応答する単一光子計数器によって必要とされる時間である請求項１の単一光子センサー。
【請求項１４】
前記マルチチャネル光検出器は、シリコン光電子増倍管を具備し、シリコン光電子増倍管のチャネルのそれぞれはマトリクス状の個別のピクセルを具備し、前記チャネルは共通のシリコン基板上で並列に共に接続される請求項１の単一光子センサー。
【請求項１５】
１対の前記マルチチャネル光検出器と、入射多色光を受け取り、かつ前記多色光の２本の別個のビームを生成するのに適した光ビームスプリッターと、を具備し、光の前記ビームは１対の前記光スペクトル分離器のうちの１つに入力する請求項２の単一光子センサー。
【請求項１６】
それぞれの前記１対のマルチチャネル光検出器のセンサーチャネルはそれぞれ、前記１対の光スペクトル分離器のそれぞれから別個の光スペクトルを受け取り、かつそれらに応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１７】
前記光ビームスプリッターは２色性ミラー（dichroic mirror）を具備する請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１８】
前記光ビームスプリッターは半透鏡を具備する請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１９】
前記多色光は、複数の蛍光染料によって形成された混合物によって生成された蛍光性スペクトルから成る請求項１の単一光子センサー。
【請求項２０】
入射多色光の単一波長を受け取り、かつ光の前記単一波長を、マルチチャネル光検出器の１以上のチャネルを定義する感光性ピクセルに伝達するのに適した光ファイバーを具備する単一光子センサー。
【請求項２１】
前記入射多色光は、複数の蛍光染料によって形成された混合物によって生成された蛍光性スペクトルから成る請求項２０の単一光子センサー。
【請求項２２】
前記光ファイバーが入射蛍光性スペクトルの単一波長に対応する光の受理の所定の角度を定義する入力終了を具備する、クレーム２１の単一光子センサー。
【請求項２３】
前記光ファイバーのそれぞれは、前記光ファイバーの他のものによって受け取られる入射蛍光性スペクトルの波長とは異なる前記入射蛍光性スペクトルの単一波長を受け取り、入射蛍光性スペクトルの前記単一波長を、前記マルチチャネル光検出器のチャネルのうちの対応する１つに伝達するのに適している請求項２２の単一光子センサー。
【請求項２４】
所定の複数の前記光ファイバーは、前記入射蛍光スペクトルの単一波長を受け取るのに適し、かつ入射蛍光スペクトルの前記単一波長を、前記マルチチャネル光検出器の複数の対応する前記チャネルに伝達するのに適している請求項２２の単一光子センサー。
【請求項２５】
ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
蛍光染料で選択されたＤＮＡ断片をラベル付け、
前記ＤＮＡ断片を光ファイバー分離キャピラリーへ入力し、
前記ＤＮＡ断片から蛍光スペクトルを生成するために、前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて所定の波長のレーザー光で前記ラベル付されたＤＮＡ断片を照明し、
前記ＤＮＡ断片からの蛍光スペクトルで光ファイバーを照明する、前記光ファイバーは前記蛍光スペクトルを光スペクトル分離器に運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取りかつ前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応答する電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している、ステップを具備する方法。
【請求項２６】
前記レーザー光は、ＡｒイオンおよびＮｄ：ＹＡＧレーザーのグループから選択されたレーザーによって生成され、前記レーザーの波長は４８８ｎｍから５３２ｎｍまでの範囲内である請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記所定の波長は、４８８ｎｍ、５１４ｎｍおよび５３２ｎｍのうちの一つである請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記光ファイバー分離キャピラリーは約２００マイクロメーターのコア径を有している請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて前記ＤＮＡ断片を電気泳動的に分離するステップを具備する請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器が３２チャネルの線型な光電子増倍管アレイを具備する請求項２５の方法。
【請求項３１】
カラーコードされた微小粒子を検出する方法であって、
蛍光染料で微小粒子にラベルを付け、
緩衝液で前記ラベルが付けられた微小粒子を懸濁し、
所定の速度で光ファイバーキャピラリーに、前記ラベルが付けられた微小粒子を有する前記緩衝液を通し、
前記光ファイバーキャピラリー内の前記ラベルが付けられた微小粒子を、蛍光スペクトルをそこから生成するためにレーザー光で照明し、
前記ラベルが付けられた微小粒子からの前記蛍光スペクトルで光ファイバー照明すること、前記光ファイバーは、光スペクトル分離器に前記蛍光スペクトルを運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取り、前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じた電流パルスを生成することに適した感光性ピクセルを有している方法。
【請求項３２】
請求項１の前記単一光子カウンターにより前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の前記光子を計数するステップを具備する請求項３１の方法。
【請求項１】
少なくとも１つのマルチチャネル光検出器と、
各光検出器チャネルは、別個の光スペクトルを受け取り、かつ前記受け取られた光スペクトルの単一光子に応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有し、
マルチチャネル増幅器と、
各増幅器チャネルは、前記マルチチャネル光検出器の前記センサーチャネルのうちの対応する１つから光スペクトルに対応する前記電流パルスを受け取り、かつ前記電流パルスを増幅するのに適していて、
マルチチャネル光子計数器と、
各カウンターチャネルは、前記マルチチャネル増幅器の前記増幅器チャネルのうちの対応する１つから前記増幅された電流パルスを受け取るのに適していて、前記マルチチャネル光子計数器は、所定の時間間隔上の各カウンターチャネルにおいて前記増幅された電流パルスを合計するのに適した積分器を有している、
を具備する単一光子センサー。
【請求項２】
光スペクトル分離器に多色光を伝達する光ファイバーを具備する請求項１の単一光子センサー。
【請求項３】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器は、複数のチャネルを有する線型な光電子増倍管アレイを具備し、前記チャネルはそれぞれ前記光スペクトル分離器から別個の光スペクトルを受け取る請求項２の単一光子センサー。
【請求項４】
前記線型な光電子増倍管アレイは、４以上チャネル、８以上のチャネル、１６以上のチャネル、および３２以上のチャネルを有する複数の線型な光電子増倍管アレイから成るグループから選択される請求項３の単一光子センサー。
【請求項５】
前記線型な光電子増倍管アレイは、３２チャネルを含んでいる請求項４の単一光子センサー。
【請求項６】
前記マルチチャネル増幅器は、３２のパルス増幅チャネルを具備し、前記パルス増幅チャネルのそれぞれは、前記線型な光電子増倍管アレイの３２チャネルのうちの対応する１つから前記電流パルスを受け取るのに適している請求項５の単一光子センサー。
【請求項７】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、２ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項８】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項９】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、０．１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器の各チャネルによって生成された前記電流パルスのそれぞれは、０．０１ナノ秒未満の持続時間τＰＵＬＳＥを有している請求項１の単一光子センサー。
【請求項１１】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲は、毎秒少なくとも１０７光子計数までである請求項１の単一光子センサー。
【請求項１２】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲は、毎秒１０８光子計数である請求項１の単一光子センサー。
【請求項１３】
前記マルチチャネル光子計数器の線型の光子計数の範囲Ｒが、Ｒ≧１／τRESPONSEであり、τRESPONSEは単一光子に応答する単一光子計数器によって必要とされる時間である請求項１の単一光子センサー。
【請求項１４】
前記マルチチャネル光検出器は、シリコン光電子増倍管を具備し、シリコン光電子増倍管のチャネルのそれぞれはマトリクス状の個別のピクセルを具備し、前記チャネルは共通のシリコン基板上で並列に共に接続される請求項１の単一光子センサー。
【請求項１５】
１対の前記マルチチャネル光検出器と、入射多色光を受け取り、かつ前記多色光の２本の別個のビームを生成するのに適した光ビームスプリッターと、を具備し、光の前記ビームは１対の前記光スペクトル分離器のうちの１つに入力する請求項２の単一光子センサー。
【請求項１６】
それぞれの前記１対のマルチチャネル光検出器のセンサーチャネルはそれぞれ、前記１対の光スペクトル分離器のそれぞれから別個の光スペクトルを受け取り、かつそれらに応じて電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１７】
前記光ビームスプリッターは２色性ミラー（dichroic mirror）を具備する請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１８】
前記光ビームスプリッターは半透鏡を具備する請求項１５の単一光子センサー。
【請求項１９】
前記多色光は、複数の蛍光染料によって形成された混合物によって生成された蛍光性スペクトルから成る請求項１の単一光子センサー。
【請求項２０】
入射多色光の単一波長を受け取り、かつ光の前記単一波長を、マルチチャネル光検出器の１以上のチャネルを定義する感光性ピクセルに伝達するのに適した光ファイバーを具備する単一光子センサー。
【請求項２１】
前記入射多色光は、複数の蛍光染料によって形成された混合物によって生成された蛍光性スペクトルから成る請求項２０の単一光子センサー。
【請求項２２】
前記光ファイバーが入射蛍光性スペクトルの単一波長に対応する光の受理の所定の角度を定義する入力終了を具備する、クレーム２１の単一光子センサー。
【請求項２３】
前記光ファイバーのそれぞれは、前記光ファイバーの他のものによって受け取られる入射蛍光性スペクトルの波長とは異なる前記入射蛍光性スペクトルの単一波長を受け取り、入射蛍光性スペクトルの前記単一波長を、前記マルチチャネル光検出器のチャネルのうちの対応する１つに伝達するのに適している請求項２２の単一光子センサー。
【請求項２４】
所定の複数の前記光ファイバーは、前記入射蛍光スペクトルの単一波長を受け取るのに適し、かつ入射蛍光スペクトルの前記単一波長を、前記マルチチャネル光検出器の複数の対応する前記チャネルに伝達するのに適している請求項２２の単一光子センサー。
【請求項２５】
ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
蛍光染料で選択されたＤＮＡ断片をラベル付け、
前記ＤＮＡ断片を光ファイバー分離キャピラリーへ入力し、
前記ＤＮＡ断片から蛍光スペクトルを生成するために、前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて所定の波長のレーザー光で前記ラベル付されたＤＮＡ断片を照明し、
前記ＤＮＡ断片からの蛍光スペクトルで光ファイバーを照明する、前記光ファイバーは前記蛍光スペクトルを光スペクトル分離器に運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取りかつ前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応答する電流パルスを生成するのに適した感光性ピクセルを有している、ステップを具備する方法。
【請求項２６】
前記レーザー光は、ＡｒイオンおよびＮｄ：ＹＡＧレーザーのグループから選択されたレーザーによって生成され、前記レーザーの波長は４８８ｎｍから５３２ｎｍまでの範囲内である請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記所定の波長は、４８８ｎｍ、５１４ｎｍおよび５３２ｎｍのうちの一つである請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記光ファイバー分離キャピラリーは約２００マイクロメーターのコア径を有している請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記光ファイバー分離キャピラリーにおいて前記ＤＮＡ断片を電気泳動的に分離するステップを具備する請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのマルチチャネル光検出器が３２チャネルの線型な光電子増倍管アレイを具備する請求項２５の方法。
【請求項３１】
カラーコードされた微小粒子を検出する方法であって、
蛍光染料で微小粒子にラベルを付け、
緩衝液で前記ラベルが付けられた微小粒子を懸濁し、
所定の速度で光ファイバーキャピラリーに、前記ラベルが付けられた微小粒子を有する前記緩衝液を通し、
前記光ファイバーキャピラリー内の前記ラベルが付けられた微小粒子を、蛍光スペクトルをそこから生成するためにレーザー光で照明し、
前記ラベルが付けられた微小粒子からの前記蛍光スペクトルで光ファイバー照明すること、前記光ファイバーは、光スペクトル分離器に前記蛍光スペクトルを運び、前記光スペクトル分離器からの出力は少なくとも１つのマルチチャネル光検出器に入射し、光検出器チャネルはそれぞれ、前記光スペクトル分離器からの別個の光スペクトルを受け取り、前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の単一光子に応じた電流パルスを生成することに適した感光性ピクセルを有している方法。
【請求項３２】
請求項１の前記単一光子カウンターにより前記別個の光スペクトルのそれぞれ異なる波長の前記光子を計数するステップを具備する請求項３１の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２０１１−５０１１８９（Ｐ２０１１−５０１１８９Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１０４１（Ｐ２０１０−５３１０４１）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５０１２
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０８２６３８７７）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニバーシティー・オブ・ニューヨーク (1)
【住所又は居所原語表記】３５ Ｓｔａｔｅ Ｓｔｒｅｅｔ， Ａｌｂａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２２０１−０００９， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５０１２
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０８２６３８７７）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニバーシティー・オブ・ニューヨーク (1)
【住所又は居所原語表記】３５ Ｓｔａｔｅ Ｓｔｒｅｅｔ， Ａｌｂａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２２０１−０００９， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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