骨の形成と再構築のための組成物および方法
Ｗｎｔ共役受容体ＬＲＰ５の高骨量（ＨＢＭ）変異（Ｇ１７１Ｖ）が標準的Ｗｎｔシグナル伝達を調節する機序について研究調査した。この変異は、Ｄｋｋタンパク質−１による拮抗作用を低減させることがすでに分かっており、Ｇ１７１が局在する第１のＹＷＴＤ繰り返しドメインがＤｋｋタンパク質による拮抗作用を担っているのではないかと考えられる。しかしながら、本発明者らは、ＤＫＫ１による拮抗作用には、第１の繰り返しドメインではなく第３のＹＷＴＤ反復配列が必要であることを見いだした。そうではなく、本発明者らは、Ｇ１７１Ｖ変異が細胞表面でＬＲＰ５とＭｅｓｄすなわちＬＲＰ５／６分子のシャペロンタンパク質との相互作用を乱すことを見いだした。細胞表面ＬＲＰ５分子のレベルが低下すると傍分泌の枠組みでのＷｎｔシグナル伝達も低減されるが、変異は、自己分泌の枠組みで同時発現されたＷｎｔの活性に影響するようには見えなかった。骨芽細胞が自己分泌的に標準的ＷｎｔであるＷｎｔ７ｂを生成し、骨細胞が傍分泌Ｄｋｋ１を生成するという観察結果とあわせて、本発明者らは、Ｇ１７１Ｖ変異が、傍分泌Ｄｋｋ１の標的数を減らして自己分泌Ｗｎｔの活性に影響することなく拮抗させることで、骨芽細胞でＷｎｔ活性の増加を引き起こすのではないかと考えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への参照
本願は、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（骨形成を刺激するための組成物および方法）」で２００３年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／５０４，８６０号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本願は、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ（骨形成および細胞の自己複製を刺激または促進するための組成物および方法）」で２００４年５月１９日に出願されたダン・ウ（Ｄａｎ Ｗｕ）らによる特許出願に関連したものであり、その内容全体を本願明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、骨折、骨疾患、骨損傷、骨異常、腫瘍、増殖またはウイルス感染の治療の際の治療方法、組成物およびその用途の分野に関する。特に、本発明の方法および組成物は、骨形成または骨再構築の刺激、促進、阻害を対象とするものである。
【０００４】
本願に引用または本願で確認した特許、特許出願、特許出願公開公報、化学論文などについてはいずれも、本発明が属する技術分野の状況を一層よく説明する目的で、その全体を本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
公衆衛生上の大きな問題のひとつに骨粗鬆症があり、特に高齢者のあいだでは普通に見られる（１，１５，２１）。６５歳よりも高齢の人々の骨折の大多数は骨粗鬆症（１５，４０）が原因である。骨粗鬆症による骨折の危険性を明確にする際の判断要素のひとつがピーク骨量（ヒーニー（Ｈｅａｎｅｙ）ら、２０００）であるが、このピーク骨量の変動には遺伝因子が大きくかかわっていることが研究から分かっている。最近になって、骨量を調節する遺伝子のうちの１種がポジショナルクローニングで同定された。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）の機能喪失型変異すなわち、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の共役受容体（２７）が、ヒトでの骨密度の減少を主徴とする常染色体劣性疾患である骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連していることが明らかになった（９）。また、家族性高骨量（ＨＢＭ）の表現型を示す２つの独立した家系（ｋｉｎｄｒｅｄ）には、ＬＲＰ５にＧｌｙ１７１からＶａｌへの置換変異（Ｇ１７１Ｖ）があることも明らかになった（５，２２）。ごく最近では、Ｇ１７１Ｖ変異の同じ構造ドメインで別のＨＢＭ変異が報告された（３６）。さらに、標的遺伝子組み換えによってＬＲＰ５遺伝子を不活化したマウスには、ＯＰＰＧ患者のものと同様の表現型が認められ（１６）、マウスでＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖをトランスジェニック発現させるとＨＢＭが得られた（２）。さらに、マウス初代骨芽細胞ではＬＲＰ５の不在下でＷｎｔに対する応答性が低下（１６）し、Ｗｎｔ（９）または活性化β−カテニン（４）によって標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性が刺激されて、骨芽細胞様細胞で骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の産生が誘導された。まとめると、これらの証拠から、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路が骨の発達の調節に重要な役割を果たしていることが分かる。
【０００６】
最近まで、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路はＷｎｔがｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｆｚタンパク質に結合すると開始されると考えられていた。７つの膜貫通ドメインを含有するＦｚタンパク質が、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が関与するはっきりしない機序でβ−カテニンのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）依存性リン酸化を抑制する。この抑制によってβ−カテニンが安定する。こうして安定すると、β−カテニンはリンパ系増強因子−１（ＬＥＦ−１）やＴ細胞因子（ＴＣＦ）をはじめとする転写調節因子と相互作用して、遺伝子転写を活性化することができる（７，１０，３８）。最近、遺伝学的な研究や生化学的な研究によって、標準的Ｗｎｔシグナル伝達にはＦｚタンパク質だけでなく共役受容体が必要だということを示す確かな証拠が得られている（２７，２８）。また、ＬＲＰ５／６（ＬＲＰ５またはＬＲＰ６）のハエオーソログＡｒｒｏｗが、Ｗｎｔ−１のハエオーソログであるＷｇのシグナル伝達に必要であることが明らかになった（３７）。ＬＲＰ５とＬＲＰ６は、発現パターンこそ異なるが基本的には同じように機能する、よく似たホモログである。一方、ＬＲＰ６は、ツメガエル胚でＷｎｔ１に結合し、Ｗｎｔ誘導発生過程を調節することが明らかになった（３４）。また、ＬＲＰ６欠損マウスには、さまざまなＷｎｔタンパク質が欠乏したときに生じる発育障害に類似した発育障害が認められた（３０）。さらに、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ａｒｒｏｗが、アキシンを結合してアキシンの分解とβ−カテニンの安定化を引き起こすことで、標準的Ｗｎｔシグナルの形質導入に関与していることも明らかになった（２５，３５）。ＬＲＰ５／６−によるシグナル伝達過程がＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に依存しているようには見えない（１８，３１）。最近になって、シャペロンタンパク質であるＭｅｓｄが、細胞表面へのＬＲＰ５／６輸送に必要なものとして同定された（６，１１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ツメガエルのＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）−１は、最初は頭部形成に重要な役割を果たすＷｎｔアンタゴニストとして発見された（８）。これまでのところ、Ｄｋｋは哺乳動物で４種類のメンバーが同定されている（１７，２６）。これらのメンバーは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４である。Ｄｋｋ１とＤｋｋ２は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と単一膜貫通タンパク質Ｋｒｅｍｅｎに同時に結合して標準的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する（３，２３，２４，３２）。以前、ＬＲＰ５ ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が標準的Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ１による拮抗作用を減弱させるように見えることが報告されている（５）。本発明は、この減弱の機序について説明するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、骨形成または骨再構築に関与する受容体または共役受容体のドメインのキャビティと、同様に機能するＤｋｋ、Ｗｎｔ、Ｍｅｓｄまたは他のタンパク質との機能的相互作用を明らかにするモデルについて説明するものである。これらの受容体としては、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体があげられるが、これに限定されるものではない。ＬＲＰ５受容体は、４つのＹＷＴＤ繰り返しドメインで構成される。各ドメインには、複数のアミノ酸ＹＷＴＤ反復配列が含まれる。また、ＬＲＰ５受容体にはＬＤＬ受容体反復配列もある。ＬＲＰ５とＬＲＰ６はいずれもよく似たホモログであり、基本的に同じように機能するが、発現パターンは異なっている。
【０００９】
本発明は、これらのキャビティに結合またはこれと相互作用してＷｎｔシグナル伝達を刺激、阻害または調節し、ひいては骨形成、腫瘍形成ならびにＷｎｔシグナル伝達によって調節される他のあらゆる生物学的過程および病理学的過程を刺激、阻害または調節する外来化合物または外因性化合物を同定するための方法を提供するものである。外来化合物とは、外部ソースから導入されるものではない天然化合物との対比で、細胞または生物に自然にはあるいは通常は見られない化合物を含む。化合物については、さまざまなスクリーニング法とアッセイを用いて米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））のデータベースから同定した。これらの化合物を修飾して、同じように効果的に機能する、ＮＣＩのデータベースや自然界には見られない派生物（ｄｅｒｉｖａｔｅ）またはアナログを作出することも可能であった。ＤｋｋとＬＲＰ５／６との相互作用、ＷｎｔとＬＲＰ５／６との相互作用、ＭｅｓｄとＬＲＰ５／６との相互作用を乱す化合物を同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
すでに報告されているように（５）、Ｃ末端にＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異とＨＡ−エピトープタグとを含有するＬＲＰ５変異体タンパク質（ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ）を発現させ（図３Ａ）ても、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）（図３Ａ）に比してＬＥＦ−１依存性転写活性は増加しなかった。また、Ｇ１７１Ｖ変異は、自己分泌の枠組みで同時発現されたＷｎｔ１によって刺激される活性をさらに増強するには至らなかった（図３Ｂ）。ＬＥＦ−１は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の下流側標的転写因子である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで測定されるその活性が、標準的Ｗｎｔ活性を測るのに広く用いられている（１２，２０）。このように、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｗｎｔシグナル伝達の形質導入にあたって構成的に活性でもなければ一層コンピテントであるわけでもない。驚いたことに、ＬＲＰ６での対応する変異であるＧ−１５８残基からＶａｌ残基への置換によって、おそらくは受容体が不活化されて、これがＷｎｔ−１と相乗作用することはできなくなった（図３Ａ）。
【００１１】
ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｋｒｅｍｅｎの非存在下でＬＲＰ５ＷｔよりもＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低いことが明らかになった（５）。Ｄｋｋ１誘導阻害を容易にすることが知られているＤｋｋ結合単一膜貫通タンパク質である（２３）。この研究では、本発明者らはＫｒｅｍｅｎの存在下で、この変異による影響を試験した。Ｋｒｅｍｅｎ１の同時発現によってＤｋｋによる阻害が有意に増強され（図３Ｂ）、すでに報告がなされているＫｒｅｍｅｎの作用（２３）が確認された。すなわち、Ｋｒｅｍｅｎの非存在下で観察されたものと同様に、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＤｋｋ１の両方の存在下で、ＷｎｔはＬＲＰ５Ｗｔを発現しているものよりも、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞の方で高い活性を示した（図３Ｂ）。この違いがマルチプラスミドトランスフェクションの結果ではないことを裏付けるために、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｉｎ１およびＬＲＰ５のタンパク質発現（図３Ｃ）について検討した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞と２種類の骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３および２Ｔ３で自己分泌型Ｗｎｔ１活性のＤｋｋによる阻害に対する耐性が上昇するという同様の結果が観察された。
【００１２】
なぜＬＲＰ５ Ｇ１７１Ｖの方がＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低いのかを説明する有力な仮説に、ＬＲＰ５とＤｋｋ１との間の相互作用が変異によって乱れる可能性があるというものがある。Ｄｋｋ１による拮抗作用にはＧ１７１を含有する第１のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であるという仮説には筋が通っている。この仮説を試験するために、第３および第４のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失したＬＲＰ５Ｒ１２と、第１および第２のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失したＬＲＰ５Ｒ３４という２つのＬＲＰ５欠失変異体を生成した（図１）。ＬＲＰ６（２４）に対してすでに報告がなされているように、欠失があってもＬＲＰ５Ｒ１２はＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４ではそうはいかなかった（図６Ａ）ことから、ＬＲＰ５Ｒ１２はＷｎｔ共役受容体の機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２が存在すると、Ｋｒｅｍｅｎが同時発現されていてもＤｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった（図６Ａ）。このことから、Ｄｋｋ１による阻害には最後の２つのＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なのかもしれないと考えられる。Ｄｋｋ１による阻害に必要な配列をさらに明確にするために、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失した別のＬＲＰ５変異体であるＬＲＰ５Ｒ１２４を生成した（図１）。ＬＲＰ５Ｒ１２と同様に、ＬＲＰ５Ｒ１２４もＤｋｋ１による阻害に対する耐性があった（図６Ａ）ことから、Ｄｋｋ１による阻害には第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なであることが分かる。
【００１３】
第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが完全に欠失すると、ＬＲＰ５のコンホメーション全体が変化する可能性があるため、Ｄｋｋ１による阻害を乱すことが可能であろうこのドメインの点変異を作製した。ＬＤＬ受容体の三次元構造（１３）から推定した第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの三次元構造に基づいて、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を作製した（図７Ａ）。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える機能を判断し、これを図３Ａに示す。変異体のうちの９つ（５％超）にＤｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が見られ、そのすべてに同一表面に局在する変異が含まれていた（図７Ａ）。これらの変異のうち、Ｅ７２１変異に最も強い影響が認められ、津続いてＷ７８１、次はＹ７１９であった（図７Ｂ）。第１および第２のＹＷＴＤ繰り返しドメインにおけるＥ７２１対応残基の変異（それぞれＤ１１１およびＤ４１８）では、Ｄｋｋによる阻害に対する感受性は有意に変化しなかった。Ｄｋｋ１による阻害に対する耐性のある変異体はすべて、Ｄｋｋ２による阻害に対しても耐性があった。このデータはすべて、Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であるという結論を裏付けるものとなっている。
【００１４】
Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であることの明らかな理由のひとつに、このドメインがＤｋｋ１結合を担っているということがある。ＨＥＫ細胞の表面で発現されるＬＲＰ５へのＤｋｋ１−ＡＰ融合タンパク質の直接的な結合を測定した（２３）。図６Ｃに示されるように、Ｄｋｋ１−ＡＰは飽和を示した。ＬＲＰ５を発現しているＨＥＫ細胞に対する結合曲線。この結合は、ＬＲＰ５／６の折りたたみと輸送を容易にすることが分かっているＭｅｓｄすなわちＬＲＰ５／６シャペロン（６，１１）が同時発現されるときにだけ測定できた。驚いたことに、ＬＲＰ５Ｅ７２１は依然としてＤｋｋ１の有意な結合を示し、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖで見られるものよりも結合率が高かった（図６Ｃ）。ＬＲＰ５Ｅ７２１は、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖに比してＤｋｋ１による阻害に対する耐性が極めて高い（図７Ｂ）が、ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶよりもＤｋｋ１に対する結合性がよかった（図６Ｃ）。第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが実際にＤｋｋ１と結合できることを示すために、Ｒ３４またはＲ３４Ｅ（Ｒ３４ＥはＥ７２１変異のあるＲ３４である）を発現しているＨＥＫ細胞に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合について検討した。Ｒ３４にはＤｋｋ１−ＡＰの有意な結合が認められたが、Ｒ３４Ｅではこのようにならなかった（図１５Ａ）ことから、Ｒ３４はＤｋｋ１を結合でき、結合を生じるにはＥ７２１が必要であることが分かる。これについては、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインだけがＤｋｋ１と結合する機能をＬＲＰ５Ｅ７２１に持たせることのできるＬＲＰ５上の唯一のＤｋｋ結合部位ではないという観察結果から説明できる。この説明を、Ｒ１２もＤｋｋ１に結合可能であった（図１５Ａ）という観察結果を得ることで裏付けた。Ｒ１２およびＲ３４はいずれもＤｋｋ１と結合できるが、Ｄｋｋ１に対するその親和性は全長ＬＲＰ５の親和性（最大結合率の半分から推測）よりも少なくとも５分の１未満であるように思われる。Ｒ１２またはＲ３４を発現している細胞への最大結合率は、ＬＲＰ５Ｗｔの最大結合率に匹敵するか、おそらくはこれよりも高い（Ｒ１２またはＲ３４への結合は可能な限り最大の入力でも飽和に達したようには見えなかった）が、Ｒ１２およびＲ３４の発現レベルをウェスタン分析で推測すると（図１５Ｂ）、ＬＲＰ５Ｗｔの場合のほぼ２倍であった。このことは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６にはＤｋｋ１への結合部位が２ヶ所以上あるという結論の裏付けとなる。
【００１５】
第１のＹＷＴＤ繰り返しドメインの点変異であるＧ１７１Ｖは、Ｄｋｋ１の見かけ上の結合を劇的に減らす（図６Ｃ）。ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶについてのＤｋｋ１結合曲線の特徴からみて、最大結合率が６分の１に落ちる（図６Ｃ）のにもかかわらず、Ｇ１７１Ｖ変異がＤｋｋ１への親和性を変化させているとは思えない。ＬＲＰ５ＷｔとＬＲＰ５Ｇ１７１はいずれも同じようなレベルで発現される（図６Ｃ）が、Ｇ１７１Ｖ変異の方が細胞表面でのＬＲＰ５受容体が少なかった。Ｍｅｓｄが細胞表面へのＬＲＰ５受容体の輸送に重要な役割を果たしていることは周知であるため、Ｇ１７１Ｖ変異を調べて、これがＭｅｓｄの機能を妨害したのか否かを判断した。Ｍｅｓｄについては、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と相互作用することがすでに分かっている（１１）。この所見と一致して、ＬＲＰ５およびＭｅｓｄの共免疫沈降が（図２Ａ）。Ｒ１２とＭｅｓｄとの相互作用も検出した（図２Ｂ）。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）とＲ１２とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱すのに対し、Ｅ７２１変異はこの相互作用には影響しない（図２Ａ、レーン２および３）ということが分かった。Ｍｅｓｄの機能（折りたたみとＬＲＰ５またはＬＲＰ６の輸送）にＬＲＰ５とＭｅｓｄとの間の相互作用が重要であれば、Ｇ１７１Ｖ変異も膜貫通ドメインのないＬＲＰ５変異体の分泌を妨げるはずである。予想どおり、Ｇ１７１Ｖ変異は、それぞれ膜貫通ドメインと細胞内ドメインのないＲ１２および全長ＬＲＰ５であるＲ１２Ｔ（図２Ｃ）およびＲｌ−４（図２Ｄ）の分泌を阻害した。Ｅ７２１変異を持つＲｌ−４は、その分泌を阻害しなかった。また、ＬＲＰ５ＷｔおよびＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している生きた細胞を表面でビオチン標識し、ＬＲＰ５タンパク質を免疫沈降した上でストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてウェスタン分析で細胞表面でのＬＲＰ５タンパク質レベルを比較した。図２Ｅに示すように、ビオチン標識されたＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの量はＬＲＰ５Ｗｔの量よりも明らかに少ないが、免疫複合体における２種類のＬＲＰ５分子のレベルは同じである。このことから、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の細胞表面輸送を妨害していることが確認される。
【００１６】
Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５ヌルまたは低形質の変異で見られるものとは逆の骨の表現型と関連しているため、高形質のアレルではないかと予測された（５，９，１６，２２）。細胞表面の受容体が少なくなればなるほどＷｎｔも低くなるはずだという仮定に基づくと、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの細胞表面での提示が弱いことは、上記の予測内容と矛盾するであろう。しかしながら、傍分泌または内分泌の枠組みを模する外因的なＷｎｔを加えると、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している細胞はＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりも少ない応答を示した（図１６Ａ）。これは、ＷｎｔがＬＲＰ５分子と同時発現された場合には起こらなかった（図３Ａ）。変異は自己分泌型のＷｎｔ活性に影響するようには思えず、Ｗｎｔタンパク質は、受容体が実際に細胞表面まで輸送される前にその受容体に結合してシグナル伝達イベントを活性化させることができるのではないかと考えられる。これらの観察結果から、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖが骨芽細胞でその分化時にどのようにしてＷｎｔ活性を高めるのかが明らかになる。骨芽細胞がその分化時に自己分泌的に標準的Ｗｎｔを生成し、骨でＤｋｋ１が傍分泌的に生成される場合に、変異はＷｎｔ活性よりもＤｋｋによる拮抗作用の方に一層大きく影響する。骨髄間質細胞の骨芽細胞培養における１９のマウスＷｎｔ遺伝子すべての発現を調べた。Ｗｎｔ遺伝子のうちのひとつであるＷｎｔ７ｂで、分化誘導後にその発現に顕著な増加が認められた（図１６Ａ）。Ｗｎｔ７ｂがＬＥＦ−１レポーター遺伝子と標準的Ｗｎｔ経路を刺激する機能が示された（図１６Ｂ）。また、骨細胞と最終分化した骨芽細胞でＤｋｋ１が高いレベルで発現され、骨芽細胞を分化させるための傍分泌因子として機能していた（図１６Ｃ）。
【００１７】
本発明は、ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異がどのようにして標準的Ｗｎｔシグナル伝達を促進するのかを説明するものである。Ｇ１７１Ｖ変異が高形質ではないかという仮定は、この変異に関連する表現型と、同時発現されたＷｎｔ活性のＤｋｋによる阻害に対して変異体ＬＲＰ５受容体が一層高い耐性を持つようだという過去の観察結果に基づくものであった（５）。最初の仮説は、変異がＬＲＰ５のＤｋｋ１結合領域に局在しているため、ＤｋｋとＬＲＰ５の直接的な相互作用が妨害されるのではないかというものであった。本発明は、Ｇ１７１Ｖ変異が局在する第１のドメインではなくＬＲＰ５受容体の第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインで、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＤｋｋ１との間の相互作用を直接妨害することはないことを示している。そうではなくて、Ｇ１７１Ｖ変異はＬＲＰ５とそのシャペロンＭｅｓｄとの相互作用を妨害し、細胞表面へのＬＲＰ５の輸送を妨げるため、細胞表面に到達するＬＲＰ５分子の数が少なくなる。
【００１８】
分化している骨芽細胞が自己分泌型Ｗｎｔタンパク質を生成し、骨の傍分泌型Ｄｋｋタンパク質を利用できるかぎり、骨芽細胞が分化する際にＧ１７１Ｖ変異によってＷｎｔ活性が増加する可能性がある。これは、ＬＲＰ５ＷｔまたはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している骨芽細胞は同じように自己分泌的に標準的Ｗｎｔに応答するが、傍分泌Ｄｋｋには変異体ＬＲＰ５を発現している細胞に対する拮抗作用が少ないためである。このため、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している細胞でＷｎｔシグナル伝達活性が高まる。図１６に示されるように、骨芽細胞が標準的ＷｎｔであるＷｎｔ７ｂを発現し、骨細胞から生成されるＤｋｋ１を利用できるという、両方の状態が存在する。
【００１９】
Ｇ１７１Ｖ変異があればそのＷｎｔ共役受容体の役割とは無関係な機序によって骨量が増えるかもしれないが、Ｇ１７１Ｖ変異がＷｎｔ活性を落として骨量を増やすことは非常に考えにくい。ヒトとマウスでの遺伝的な証拠や生化学的な証拠をはじめとして、入手可能な証拠からはいずれも、Ｗｎｔ活性と骨形成との間に正の関係があることが分かる。ヒトとマウスのどちらでも、ＬＲＰ５ヌルまたは低形質の変異によって、Ｇ１７１Ｖ変異のあるヒトまたはマウスで見られる表現型とは逆の骨の表現型が得られる（５，９，１６，２２）。また、標準的Ｗｎｔタンパク質は骨芽細胞の増殖と分化の両方を刺激する（９，１６）のに大使、Ｄｋｋ１は骨髄間質細胞培養系で骨芽細胞の分化を阻害する。これらの所見に、骨芽細胞の分化後にＷｎｔ７ｂの発現が劇的に上方制御される（図１６Ｂ）という所見をあわせて考えると、標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性が増大することで骨形成量が増すのではないかと思われる。他方、Ｄｋｋ１は分化している骨芽細胞では低いレベルで生成され、最終分化した骨芽細胞である骨細胞ではこれよりも高いレベルで生成される。骨細胞によって生成されるＤｋｋ１は、骨芽細胞活性の調節における負のフィードバック機序として骨再構築機能の調節に関与していた。
【００２０】
最初の２つのＹＷＴＤ反復配列はＤｋｋ１と結合できる（図１５Ａ）が、これらの配列はＷｎｔシグナル伝達のＤＫＫによる阻害には必要ない（図６Ａ）。これは、図１６Ｄに示されるように、最初の２つのＹＷＴＤ反復配列に対するＤｋｋ１の結合、ドメインが、Ｄｋｋ１とＫｒｅｍｅｎの同時相互作用とは両立されないためである。Ｗｎｔシグナル伝達のＤＫＫ１による阻害には、ＫｒｅｍｅｎおよびＬＲＰ５／６の両方に対してＤｋｋ１が同時に相互作用する必要がある（２４）。ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造に基づいて、ＬＲＰ５の最初の３つのＹＷＴＤ繰り返しドメイン各々が、一端に広い開口、他端に狭い開口のある樽状構造を形成する（第４の繰り返しドメインには構造的に推定できるだけの十分なアミノ酸配列相同性がない）。この構造情報から、Ｄｋｋ１結合のために重要な第３のＹＷＴＤ繰り返しドメイン上のアミノ酸残基を同定することができた。これらの結果から、Ｄｋｋ１は樽状構造の広い方の開口を介して第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインと相互作用することが分かった。最初の２つのＹＷＴＤ繰り返しドメインでの同時ではあるが別個ではないＥ７２１の変異相当の残基（それぞれＤ１１１およびＤ４８１）がＲ１２に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を無効にするため、Ｄｋｋ１はこれら２つの繰り返しドメインと同じような形で相互作用する。このＬＲＰ５のＥ７２１残基はＤｋｋ１の塩基性残基との間で塩橋を形成し得る。この推論は、結晶学を用いたニドジェンとラミニンとの相互作用についての最近の研究によって裏付けられる。ニドジェンのラミニン相互作用ドメインは、ＬＲＰ５のＹＷＴＤ繰り返しドメインとアミノ酸配列相同性で同じ樽状構造を持ち、このニドジェンドメインの接触残基のうちのひとつがラミニンのＬｙｓ残基との間で塩橋を形成するＥ７２１相当のＧｌｕである（３３）。
【００２１】
本発明では、細胞に提供されると、骨形成または骨再構築の刺激、促進、阻害または調節に関与する共役受容体のドメインに見られる部位またはキャビティに結合し、これと相互作用し、あるいはこれに適合する化合物を同定した。これらの受容体としては、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体あるいは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６（ＬＲＰ５／６）受容体系に関与する他のあらゆる受容体があげられる。ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、Ｗｎｔ活性を増大または低減させるよう機能するドメイン含有ＣＲＤすなわちＷｎｔ結合部位を持つ共役受容体である。
【００２２】
化合物については、実施例にて説明するスクリーニング法で同定した。これらの化合物のうちのいくつかは、ＤｋｋとＬＲＰ５の相互作用を乱すことが明らかになった。他の化合物は、おそらくはＬＲＰ５／６に対するＷｎｔの結合を阻害することでＷｎｔシグナル伝達を阻害した。本発明の化合物は、細胞には存在しないが、外部ソースに由来する外来化合物または外因性化合物である。これらの化合物は、アゴニストすなわち受容体と組み合わさってイベントを開始できる作用物質と、アンタゴニストすなわち受容体と組み合わさってアゴニスト（ａｇａｏｎｉｓｔｓ）の作用を阻害する作用物質と、あるときはアクションを引き起こすように見え、別の時にはアゴニストの作用を弱めることでアクションを阻害するなど、アゴニストとアンタゴニストの両方の特徴を持つ部分アゴニストと、を含む。これらの化合物のなかには、親和性または製剤や化合物が受容体の結合部位に誘引される度合いを高めることが明らかになっているもある。
【００２３】
骨密度を高くするＬＲＰ５Ｇｌ７ｌＶ変異はＭｅｓｄ−ＬＲＰ５相互作用を弱め、細胞表面に存在するＬＲＰ５受容体が少なくなる。同じようにＭｅｓｄ−ＬＲＰ５相互作用を乱し、骨形成または骨再構築によって骨密度を増す化合物が見いだされた。
【００２４】
Ｗｎｔ活性（が高い状態は、多くの癌と関連してきた。ＬＲＰ５受容体の第２のドメインへのＷｎｔの結合を乱すことで、このＷｎｔ活性を落とし、Ｗｎｔ活性を阻害するとともに、Ｗｎｔ活性の増大を特徴とする腫瘍および増殖を治療する化合物が見いだされた。
【００２５】
Ｗｎｔシグナル伝達は骨形成の正の調節因子であることが分かっている。Ｗｎｔ活性を高めて骨形成、骨形成または骨再構築を助長することができる化合物も同定された。
【００２６】
Ｄｋｋは、ＬＲＰ５受容体の第３のドメインに結合またはこれと相互作用すると、Ｗｎｔアンタゴニストとして働く。Ｄｋｋ−ＬＲＰ５相互作用を阻害して骨の形成または再構築を助長する化合物が同定された。ひとつの化合物であるＮＣＩ３６６２１８の骨芽細胞分化を組織培養モデルで試験した。ＧＦＰを骨芽細胞のマーカーとして利用できる、２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーター（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）で制御される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジーンを持つ３ヶ月齢のマウスから骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を単離した。８日目と１２日目に、培養をＮＣＩ３６６２１８化合物で処理した。同じ日に、培養を対照としてのＤＭＳＯでも処理した。細胞をＮＣＩ３６６２１８で処理した後、ＤＭＳＯで処理した場合よりも多くの細胞がＧＦＰ陽性になった。これらの結果から、ＮＣＩ３６６２１８化合物が骨芽細胞の分化を刺激することが分かる。ＷｎｔのＤｋｋによる阻害を減弱する化合物（ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２など）には、骨粗鬆症および他の骨疾患を治療する潜在的な治療用途がある。
【００２７】
ＷｎｔおよびＤｋｋは、間葉系幹細胞の増殖と分化を調節することが分かっている。骨形成を調節し、造血（ｈｅｍａｅｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞を発達・分化させるためのメセンチル（ｍｅｓｅｎｃｈｙｌ）幹細胞調節因子として機能する化合物が同定されている。
【００２８】
Ｗｎｔは造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞の増殖と分化を調節することが分かっている。骨形成を調節し、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにて幹細胞を増殖・増大させるための造血（ｈｅｍａｅｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞調節因子として機能する化合物が同定されている。
【００２９】
材料および方法
細胞培養、トランスフェクション、ＣＭの調製、ルシフェラーゼアッセイ。
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）株Ａ２９３Ｔとマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を維持し、上述したようにトランスフェクトした（１）。１０％ＦＣＳ含有α−ＭＥＭ中で前骨芽細胞株２Ｔ３およびＭＣ３Ｔ３を培養した。ルシフェラーゼアッセイのために、２４ウェルのプレートの細胞を５×１０４個／ウェルで播種し、リポフェクタミンプラス（インヴィトロジェン、カリフォルニア州）を製造業者が提案しているように用いて、１ウェルあたり０．５μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。通常、ＬａｃＺプラスミドを用いて、各トランスフェクションごとのＤＮＡ濃度を等しくした。トランスフェクションの２４時間後に細胞抽出物を回収した。上述したようにしてルシフェラーゼアッセイを実施した（１、２）。ＧＦＰの蛍光強度に対してルミネセンス強度を正規化した。Ｄｋｋ１−ＡＰ含有ＣＭを調製するために、６ウェルのプレートに細胞４×１０５個／ウェルでＨＥＫ細胞を播種し、１ウェルあたり１μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＣＭを回収した。
【００３０】
発現プラスミドの構成と変異誘発
高フィデリティの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕウルトラ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州）を用いるＰＣＲによって、ヒトＬＲＰ５、ＬＲＰ６、マウスＷｎｔ１、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２の野生型と変異体型を生成した。ＨＡエピトープタグまたはＦｌａｇエピトープタグを全長分子と変異体分子のＣ末端に導入した。これらの分子の発現をＣＭＶプロモーターによって駆動した。外部のソースからＬＥＦ−１レポーター遺伝子コンストラクトを得た（３）。
【００３１】
Ｄｋｋ１−ＡＰ結合アッセイおよび免疫沈降アッセイ。
２４ウェルのプレートに入れたＨＥＫ細胞にＬＲＰ５とその変異体をトランスフェクトした。１日後、細胞を冷たい洗浄緩衝液（ＢＳＡおよびＮａＮ３を含有するＨＢＢＳ）で洗浄し、マウスＤｋｋ１−ＡＰ条件培地を用いて氷上で２時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、溶解させた。ライセートを６５℃で１０分間加熱し、トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）ルミネセンスＡＰアッセイキットを用いてそのＡＰ活性を求めた。免疫沈降アッセイを上述したようにして実施した（４）。
【００３２】
細胞表面タンパク質のビオチン化
ＨＥＫ細胞に、ＬａｃＺ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞を氷冷ＰＢＳ中にて０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で標識し、上述したようにして洗浄し、溶解させた（５）。抗ＨＡ抗体およびＡ／Ｇアガロースタンパク質を用いて細胞ライセートを免疫沈降させた。
【００３３】
初代骨芽細胞培養
３ヶ月齢のマウスから得た骨髄間質細胞（ＢＭＳ）の骨芽細胞培養を上述したようにして生成した（６）。１０ｎＭのデキサメタゾン、８ｍＭβ−グリセロホスフェート、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下、細胞が骨原性分化するように誘導した。２日ごとに培地を交換した。
【００３４】
相同性モデリング
スイスプロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（エントリー名Ｑ９ＵＰ６６［８］）から得た配列を用いて、ＩＣＭ（モルソフト（Ｍｏｌｓｏｆｔ）Ｌ．Ｌ．Ｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））でＬＲＰ５の第３のＹＷＴＤ−ＥＧＦドメインの相同性モデルを構築した。ＬＤＬ受容体（低密度リポタンパク質）ＹＷＴＤ−ＥＧＦドメイン（ＰＤＢコード１ＩＪＱ［９］）をテンプレートとして選択した。
【００３５】
仮想スクリーニング
ＵＮＩＴＹＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のデータベースで、Ｇｌｕ４５６末端で６つのプロペラによって形成されたキャビティに適合できる化合物をスクリーニングした。次に、エネルギー最小化用のＦｌｅｘＸＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて候補化合物をＬＲＰ５ドメインのＤｋｋ１結合キャビティにドッキングさせた［１０］。以後の実験的な試験用に、計算で最も高い結合親和性を示した化合物を、米国国立癌研究所の癌治療・診断部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）発生学的治療プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）製剤合成＆化学部（Ｄｒｕｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｒａｎｃｈ）から得た。スクリーニングの第２ラウンドおよび第３ラウンドを、生化学的アッセイの結果に基づいて実施した。
【実施例】
【００３６】
１．ＬＲＰ５の欠失変異体
一組のＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲフラグメントをベクターにサブクローンし（ｓｕｃｌｏｎｅｄ）て、いくつかのＬＲＰ５欠失変異体を得た。第３および第４のドメイン（残基６４６から１１９８）の欠失がＬＲＰ５Ｒ１２となり、第１および第２のドメイン（残基１から６４６）の欠失はＬＲＰ５Ｒ３４、第３のドメイン（残基９４７から１１９８）の欠失はＬＲＰ５Ｒ１２４となった。（図１参照）。
【００３７】
２．ＬＲＰ５のドメインＩはＭｅｓｄによるＬＲＰ５の機能に不可欠である。
２．１ ＬＲＰ５の第１のドメインにおけるＧ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の輸送を乱す。
（Ａ）ＬＲＰ５とＭｅｓｄの相互作用
図２Ａに示すようにしてＨＥＫ細胞に発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を実施した。ＭｅｓｄにはＦｌａｇタグを付加し、ＬＲＰ５分子にはすべてＨＡタグを付加した。これらの結果から、ドメインＩのＧ１７１Ｖ変異はＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）とＲ１２とＭｅｓｄとのそうご作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱すが、ドメインＩＩＩのＥ７２１変異はこれらの相互作用に対して何ら影響を示さない（図２Ａ、レーン２および３）ということが分かった。
【００３８】
（Ｂ）ＬＲＰ５変異体は自ら細胞表面に効率よく存在することはない。
図２Ｂおよび図２Ｃに示すように、ＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１−４およびＲ１−４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養培地に分泌される膜貫通ドメインのないＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、条件培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心処理した。上清を抗ＨＡ抗体で免疫沈降（図２Ｃ）させるか、ＡＰアッセイに用いた（図２Ｄ）。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液にも溶解させ、ウェスタンブロッティングで分析した（図２Ｃおよび図２Ｄの下側のパネル）。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異が細胞表面に対するＬＲＰ５の提示を減弱することが分かる。
【００３９】
（Ｃ）細胞表面ＬＲＰ５レベルの評価
ＨＥＫ細胞に、ＬａｃＺ、野生型ＨＡ−ＬＲＰ５またはＨＡ−ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞表面をビオチン標識して抗ＨＡ抗体でＬＲＰ５分子を沈降させた後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を用いるウェスタン分析によって細胞表面ＬＲＰ５分子レベルを検出した（図２Ｅの上側のパネル）。免疫複合体におけるＬＲＰ５のレベルを下側のパネルに示す。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異体の細胞表面提示が減少することが分かる。
【００４０】
２．２ ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは同時発現されたＷｎｔの活性のＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低い。
（Ａ）Ｇ１７１Ｖ変異が標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性に対して及ぼす影響。
図３Ａに示すようにして、ＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＧＦＰ発現プラスミドと一緒に、ＨＥＫ細胞にプラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させた。「材料および方法」で説明したようにして溶解後の細胞のＧＦＰレベルとルシフェラーゼ活性を求め、ＧＦＰレベルに対して正規化した。ＬａｃＺをトランスフェクトした細胞の活性を１００％として、対照を得た。ＬＲＰ５タンパク質または抗ＬＲＰ６抗体が持つＨＡタグに特異的な抗体を用いて、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６、ＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現を検出した（図３Ａ）。これらの結果から、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）に比してＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が、それ自体または同時発現されたＷｎｔに対する形質導入シグナルでＬＥＦ−１依存性転写活性の増大につながらなかったことが分かる。
【００４１】
（Ｂ）Ｇ１７１ Ｖ変異が同時発現されたＷｎｔ１によって刺激された標準的シグナル伝達活性に対して及ぼす影響
図３Ｂに示すように、ＬＲＰ５ＷｔまたはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦレポーター、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎのプラスミドをトランスフェクトした。ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下、ヒトＨＥＫ細胞にＬａｃＺをトランスフェクトするか、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＷｎｔ１を同時トランスフェクトした。ウェスタンブロッティングでタンパク質の発現レベルを確認した（図３Ｃ）。Ｋｒｅｍｅｎ１およびＤＫＫ１の両方の存在下、ＷｎｔはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞でＬＲＰ５Ｗｔを発現しているものよりも高い活性を示した（図３Ｂ）。これらの結果から、Ｄｋｋ１の存在下では、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの方が野生型よりも多くのシグナルを伝達する（ｔｒａｎｄｕｃｅ）ことが分かる。
【００４２】
２．３ ＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合
図４に示すようにしてＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドとＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクトし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製したＣＭを用いて氷上でインキュベートした。「材料および方法」で説明したようにして、ＡＰ活性を任意単位（ＡＵ）で求めた。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図４Ｂに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ変異体を発現している細胞の方がＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりも明白なＤｋｋ結合が少ないことが分かる（図４Ａ）が、これは図２に示す細胞表面にＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖが少ないことと一致する。
【００４３】
３．Ｗｎｔ活性にはＬＲＰ５のドメインＩＩが必要である。
図５に示すようにＨＥＫ細胞にＬＥＦ活性レポータープラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。発現プラスミドＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖは、第２のドメインに点変異のあるＬＲＰ５受容体である。１日後、細胞を溶解させた。「材料および方法」で説明したようにして、溶解後の細胞のＧＦＰレベルとルシフェラーゼ活性を求め、ＧＦＰレベルに対して正規化した。図５は、ＬＲＰ５Ｗｔに比して、ＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９ＶがＷｎｔシグナル伝達を無効にできることを示している。これらの結果から、Ｗｎｔ活性にはドメインＩＩが必要だということが分かる。
【００４４】
４．Ｄｋｋによる阻害にはドメインＩＩＩが必要である。
４．１ ドメインＩＩＩの分析
（Ａ）ドメインＩＩＩの機能的分析
図６Ａに示すようにして、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミドおよび発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔ ＬＲＰ５とその変異体分子の発現を図６Ｂに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は依然としてＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４ではそうはいかなかった（図６Ａ）ということが分かり、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４はＷｎｔ共役受容体の機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在すると、Ｄｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった（図６Ａ）。このことから、Ｄｋｋ１による阻害にはドメインＩＩＩが必要なのかもしれないと考えられる。
【００４５】
（Ｂ）ＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対するＤＫＫ１−ＡＰの結合
図６Ｃに示すようにしてＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドおよびＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクトし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製したＣＭを用いて氷上でインキュベートした。「方法および材料」で説明したようにして、ＡＰ活性を任意単位で求めた。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図６Ｃの右側のパネルに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｒ３４はＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であるということが分かる。（図６Ｃ）
【００４６】
４．２ Ｄｋｋ阻害に必要なドメインＩＩＩの相互作用表面でのアミノ酸残基の同定
（Ａ） 相互作用表面ＩＩＩでのＡｌａ置換変異の概略図
ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造（１３）に基づいて、ドメインＩＩＩの空間充填モデルを推定した。スイスプロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（エントリー名Ｑ９ＵＰ６６［１８］）から得た配列を用いて、ＩＣＭ（モルソフト（Ｍｏｌｓｏｆｔ）Ｌ．Ｌ．Ｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））でＤｋｋ１のドメインＩＩＩの相同性モデルを構築した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ＹＷＴＤ−ＥＧＦドメイン（ＰＤＢコード１ ＩＪＱ［２２］）をテンプレートとして選択した。この三次元構造に基づいて、本発明者らは、ドメインＩＩＩの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を生成した（図７Ａ）。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える機能を判断し、これを図７Ａに示す。変異体のうちの９つ（５％超）にＤｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が見られ、変異同一表面に局在する変異が含まれていた（図７Ａ）。
【００４７】
（Ｂ） 代表的な点変異がＬＲＰ５のＷｎｔ共役受容体活性に対して及ぼす影響
図７Ｂに示すようにして、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下側のパネルに示す。１９の変異のうち、Ｅ７２１変異でＤｋｋ１による阻害に対する最も強い影響が認められ、続いてＷ７８１、次がＹ７１９であった（図７Ｂ）。
【００４８】
５．ＬＲＰ５の特定ドメインと相互作用するスクリーニング化合物
５．１ ドメインＩＩＩをテンプレートとして用いたスクリーニング化合物
（Ａ） 仮想スクリーニング
ＵＮＩＴＹＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２）で、ドメインＩＩＩのキャビティに適合できる化合物をスクリーニングした。このデータベースは自由に検索可能なものであり、２５０，２５１の小さな化合物の配位を含む。公差０．３ÅのＲ７６４およびＥ７２１と、キャビティに向かってＴｒｐ７８１から３．２Å離れている公差１．０Åの疎水性中心からなるように検索クエリを設計した。化合物の柔軟性を考慮して、高速でコンホメーション的に柔軟な三次元検索［２１］に対応できるＵＮＩＴＹＴＭプログラムのディレクテッドトウィーク（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｗｅａｋ）アルゴリズムを適用した。
【００４９】
続いて、ＵＮＩＴＹＴＭプログラムを用いて得られた候補化合物を、リガンドをタンパク質結合部位に短時間かつ柔軟にドッキングさせる［４４］、エネルギー最小化用のＦｌｅｘｘＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））でＤｋｋ１結合表面にドッキングさせた［１７］。Ｄｋｋ１認識に不可欠であることが分かっている、残基Ｅ７２１、Ｗ８６４、Ｙ７１９、Ｒ７６４、Ｄ８７７、Ｆ８８８、Ｇ７８２、Ｗ７８１およびＭ８９１（図７Ａ）を、計算時に考慮した。ドッキング手順に続いて、Ｄｋｋ１結合ポケットに結合する予測した機能に基づいて、ＣｓｃｏｒｅＴＭプログラムを用いて化合物をランク付けした。ＣｓｃｏｒｅＴＭでは、タンパク質リガンド複合体の個々のスコアリング機能がどれだけうまく果たされるかに基づいて、相対的なコンセンサススコアを生成した［８］。次に、ＣｓｃｏｒｅＴＭで手作業での最終的な目視検査を行った。コンセンサススコアが最も高かった４０の化合物をＮＣＩにリクエストしたが、入手不可のものがあったため１７の化合物を手に入れた。次に、これらの化合物でＤｋｋ−１結合アッセイを行った（セクション５参照）。これらの化合物のうちの３つが、ＬＲＰ−５に対するＤｋｋ１の結合に影響することが明らかになった。すなわち、ＮＣＩ１０６１６４（図８Ａ）はＤｋｋ１結合を３２％阻害し、一方ＮＣＩ３９９１４（図８Ｂ）およびＮＣＩ６６０２２４（図８Ｃ）はＤｋｋ１結合をそれぞれ６４５％および２７５％刺激した。ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４の刺激作用は、これらの化合物と第３のドメインのＤｋｋ１結合キャビティとの相互作用が促進されたことによるものかもしれない。この促進は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５の相互作用表面間に存在するギャップがブリッジされたことによる可能性がある。アントラ−９，１０−キノン（図９Ａ）は化合物ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４に共通の部分構造であるため、アントラ−９，１０−クニノン（ｑｕｎｉｎｏｎｅ）がＬＲＰ５との結合相互作用において鍵となる役割を果たしているのかもしれない。ＵＮＩＴＹＴＭプログラムの類似性検索アルゴリズムを用いて、アントラ−９，１０−キノンに近いＮＣＩデータベースに見られた化合物の二次元検索を実施した。次に、ＦｌｅｘＸＴＭプログラムを用いて上述したようにしてヒットしたものをドッキングさせた。スコアが最も高かった２５の化合物をＮＣＩから得て試験した。化合物ＮＣＩ６５７５６６（図９Ｂ）およびＮＣＩ３６６２１８（図１０Ａ）が、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１による阻害を逆転できた。図９Ｃに示すＮＣＩ３６６２１８由来のテンプレートを用いて新規な二次元類似性検索を実施し、１３の候補化合物を同定した。（後述するような）生物学的アッセイから、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋによる阻害を逆転させ、ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１結合を乱すには、ＮＣＩ８６４２（図１０Ｂ）が最適な化合物であることが分かった。
【００５０】
（Ｂ）生物学的アッセイ
生物学的アッセイを利用して、仮想スクリーニングで同定された化合物をスクリーニングした。
【００５１】
（１）Ｄｋｋ−Ｉ結合アッセイ
セクション２（図４）で説明したようにして、最初の２つのドメインがない全長ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４変異体を発現しているＨＥＫ細胞に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を実施した。１７の化合物からなる第１のバッチで、まずは全長ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１結合の阻害についてスクリーニングした。本発明者らは、ＮＣＩ１０６１６４がＤｋｋ１結合に対して６８％の阻害作用を示すのに対し、ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４はＤｋｋ１結合をそれぞれ６５４％および２７６％刺激することを明らかにした。（表Ｉ参照）
【００５２】
（ＩＩ）Ｗｎｔ活性アッセイ
Ｗｎｔシグナル伝達にはＬＲＰ５の第２および第３のドメインが必要であり、これらのドメインはおそらく、Ｗｎｔ分子と直接的に相互作用する。これらのドメインは広範囲にわたってアミノ酸配列が相同であるが、第３のドメインに結合する特定の化合物が最初の２つのドメインにも結合し、潜在的にＷｎｔ活性の阻害を引き起こしているという可能性がある。化合物の第２のバッチについては、まずＷｎｔ活性アッセイを用いてスクリーニングした上で、結合アッセイを用いてスクリーニングし、Ｄｋｋ阻害を逆転させる化合物がＬＲＰ５に対するＤｋｋ結合を阻害することを確認した。表ＩＩに示されるように、第２のバッチのうち２５の化合物をＷｎｔ活性アッセイでスクリーニングした。これらの化合物を以下の項目について調べた。１）基礎レポーター活性の阻害、２）Ｗｎｔ活性の阻害、３）Ｗｎｔ活性のＤｋｋによる阻害の逆転。表ＩＩに示されるように、２５の化合物のうちの１７がＷｎｔ活性を３０％よりも多く阻害することが明らかになった。ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ６５７５６６という２つの化合物が、Ｗｎｔ活性に影響せずにＷｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１による阻害を逆転させることが明らかになった。
【００５３】
どの化合物がＤｋｋによる阻害を逆転させるのかを判断するために、仮想スクリーニングを用いて化合物の第３のバッチを同定した。１３の化合物を同定し、Ｗｎｔ活性スクリーニングを行った。表ＩＩＩに示されるように、３つの化合物がＷｎｔ活性を大幅に阻害し、１つの化合物（ＮＣＩ８６４２）がＤｋｋによる阻害を有意に逆転させることが明らかになった。
【００５４】
図１１および図１２に示すように、ＮＣＩ８６４２およびＮＣＩ３６６２１８の両方をＷｎｔ活性アッセイおよびＤｋｋ結合アッセイでさらに特徴付けした。Ｄｋｋによる阻害を逆転させるにはＮＣＩ８６４２の方が効果的であった。ＮＣＩ８６４２にもＮＣＩ３６６２１８より広い範囲の有効濃度があった。どちらの化合物も、高い濃度でＷｎｔ阻害を示しはじめた。どちらの化合物も最初の２つのドメインのない全長ＬＲＰ５およびＬＲＰ５ Ｒ３４変異体に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を阻害するため、どちらの化合物もＤｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を乱してＤｋｋによる阻害を逆転させた。Ｄｋｋ１結合の阻害にはＮＣＩ３６６２１８よりもＮＣＩ８６４２の方が効果的であることが分かったが、これはＷｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋによる拮抗作用の逆転で有効性が増した結果と一致していた。
【００５５】
（ＩＩＩ）骨原性アッセイ
ａ）培養での骨原性アッセイ
Ｗｎｔは培養した骨芽細胞の増殖と分化を刺激し、Ｄｋｋはこの過程を阻害する。したがって、これらの化合物は骨形成量を増す。ＢＳＰ、オステオカルシン、コラーゲンの発現をはじめとする骨形成マーカーの発現または石灰化を調べれば、このことをモニターすることができる。２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーターによって駆動されるＧＦＰの発現もモニターした。図１３は、ＮＣＩ３６６２１８がＧＦＰ発現を刺激し、骨芽細胞の分化が増しているのではないかということを示している。図１４は、ＮＣＩ３６６２１８が石灰化を刺激することを示している。ＮＣＩ３６６２１８も頭蓋冠の有機培養（ｏｒｇａｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）で骨形成を刺激する。
【００５６】
ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの骨原性アッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏでのこれらの化合物の有効性についての試験を行い、これらの化合物がｉｎ ｖｉｖｏで骨形成量を増すのかどうかを判断することができる。頭蓋冠の外面と骨髄キャビティ内にさまざまな化合物用量を注入することができる。骨形成の増加については、組織学的に調べることができ、また、ｐＱＣＴ、ＤＮＸ、Ｘ線ラジオオートグラフィを用いて調べることもできる。
【００５７】
（ＩＶ）β−カテニンレベルアッセイ
Ｗｎｔシグナル伝達によってサイトゾルのＢ−カテニンを安定させる。このようにして得られるβ−カテニンのレベルによって、これらの化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を調べることができる。たとえば、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤｋｋ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物と組み合わせた化合物でマウスＬ１細胞を８時間処理した。対照として用いた細胞もＷｎｔ３ａ ＣＭまたはＤｋｋ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物だけで８時間処理した。特異的抗β−カテニン抗体を利用して、細胞ライセートでのβ−カテニンレベルをウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで測定した。化合物で処理した細胞のβ−カテニンレベルを、対照での場合と比較した。この方法を利用して、化合物を生物学的にスクリーニングしても構わない。［４９］
【００５８】
（Ｖ）ＬＲＰ５／６のＰＰＰＳＰ部位のリン酸化
最近になって、ＷｎｔがＬＲＰ５の細胞内ドメインにおいてＰＰＰＳＰモチーフでＬＲＰ５のリン酸化を刺激することが発見された（タマイ（Ｔａｍａｉ）ら、２００４）。リン酸化したＰＳＰＰＰに特異的な抗体を得て、Ｗｎｔ活性を調べるのに利用することができる（タマイら、２００４）。このアッセイの利点は、受容体の活性化だけしか測定しない点にある。このイベントに加わる化合物は、他のアッセイでスクリーニングされた化合物よりもＷｎｔ細胞内シグナル伝達イベントに影響する可能性が低い。たとえば、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤＫＫ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物と組み合わせた化合物でＨＥＫ細胞を１０〜６０分間処理した。対照として用いた細胞については、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤＫＫ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物だけで６時間処理した。リン酸化ＰＰＰＳＰ部位に対する特異的抗体を用いて、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＰＰＰＳＰ部位のリン酸化をウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで測定した。リン酸化ＬＤＬＲ−ＰＰＰＳＰ部位のレベルに基づいて、Ｗｎｔ活性に対する影響を示す化合物をスクリーニングする目的で、化合物で処理した細胞を対照と比較した。この方法を利用して、化合物を生物学的にスクリーニングしても構わない。［４９］
【００５９】
５．２ ＬＲＰ５のドメインＩＩをテンプレートとして用いて化合物をスクリーニング
（Ａ）仮想スクリーニング
「材料および方法」で説明したような相同性モデリングを用いて、このドメインの構造を推定することができる。セクション４．２で説明したように、部位特異的変異誘発を利用して、Ｗｎｔシグナル伝達に必要な残基をマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法を用いて、このＷｎｔシグナル伝達表面に仮想スクリーニング法を適用した。ドメインＩＩはＷｎｔシグナル伝達に関与するため、ドメインＩＩをテンプレートとして用いて同定される化合物がＷｎｔシグナル伝達を上昇またはＷｎｔシグナル伝達を低減させる可能性がある。ドメインＩＩとドメインＩＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増大させる、２）Ｄｋｋ結合を低減させる、３）Ｄｋｋ拮抗作用を増大させるおよび／または４）Ｄｋｋ拮抗作用を低減させる可能性がある。
【００６０】
（Ｂ）生物学的アッセイ
セクション５．１（Ｂ）で説明した生物学的アッセイを用いて化合物を試験した。セクション５．１（Ｂ）、Ｉ〜Ｖで説明した方法で、Ｗｎｔ活性を増大または低減させる化合物を同定した。また、５．１（Ｂ）、Ｉで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１結合を促進または阻害する化合物を求めた。さらに、５．１（Ｂ）、ＩＩで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１拮抗作用を促進または阻害する化合物を求めた。
【００６１】
５．３ ＬＲＰ５のドメインＩをテンプレートとして用いて化合物をスクリーニング
（Ａ）仮想スクリーニング
「材料および方法」で説明したような相同性モデリングを用いて、このドメインの構造を推定することができる。図２で説明したように、部位特異的変異誘発を利用して、Ｍｅｓｄの結合と機能に必要な残基をマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法を用いて、このＭｅｓｄ結合表面に仮想スクリーニング法を適用した。ドメインＩはＭｅｓｄ機能に関与するため、ドメインＩをテンプレートとして用いて同定される化合物は、細胞表面へのＬＲＰ５提示を増大または低減させることでＷｎｔシグナル伝達を増大または低減させるおよび／またはＤｋｋ拮抗作用を増大または低減させる可能性がある。ドメインＩとドメインＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物はＷｎｔシグナル伝達を増大または低減させる可能性がある。ドメインＩとドメインＩＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増大させる、２）Ｄｋｋ結合を低減させる、３）Ｄｋｋ拮抗作用を増大させるおよび／または４）Ｄｋｋ拮抗作用を低減させる可能性がある。
【００６２】
（Ｂ）生物学的アッセイ
セクション５．１（Ｂ）、Ｉ〜Ｖで説明した方法で、Ｗｎｔ活性を増大または低減させる化合物を同定した。また、セクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１結合を促進または阻害する化合物を求めた。さらに、セクション５．１（Ｂ）、ＩＩで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１拮抗作用を促進または阻害する化合物を求めた。図２に示すアッセイで、Ｍｅｓｄ機能に影響する化合物を求めた。
【００６３】
６．ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のＣＲＤと相互作用する化合物のスクリーニング。
Ｗｎｔは、ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリの膜貫通受容体を介してシグナル伝達する。このｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、細胞膜を数回通り抜ける。ｆｒｉｚｚｌｅｄのＮ末端細胞外領域に局在する保存されたシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）がＷｎｔ結合部位として作用する。分泌されたｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質Ｆｒｚｂ−１がＣＲＤを含有し、Ｗｎｔシグナル伝達発現のアンタゴニストとして機能する。
【００６４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ８およびマウスから分泌されたＦｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３のＣＲＤの結晶構造が求められている。（ダン（Ｄａｎｎ）Ｃ．ら）Ｗｎｔ結合アッセイおよび変異誘発アッセイによってＷｎｔ結合部位も求められている。
【００６５】
６．１ 仮想スクリーニング
５．１（Ａ）で説明した仮想スクリーニング法を用いて、ＣＲＤと相互作用してＷｎｔシグナル伝達経路を調節する潜在的な化合物をスクリーニングした。−マウスタンパク質から得た周知のＣＲＤ構造をテンプレートとして用いて相同性モデルを作製した。他のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリメンバーまたはヒトｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質ＣＲＤ領域の相同性モデルを作製した。ＣＲＤ−Ｗｎｔ相互作用に関与する構造とアミノ酸に基づいて、エネルギー最小化法を利用して各化合物の生物学的活性をさらに試験するための化合物をスクリーニングした。生物学的活性が高かった化合物については、同様の構造クエリを用いて別の候補化合物を同定した。
【００６６】
６．２ 生物学的アッセイ
Ｗｎｔ−結合アッセイを利用して、化合物がｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質のＣＲＤ領域に対して及ぼす影響をスクリーニングした。ＣＲＤペプチド（またはｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質）が、検出可能なマーカー（Ｍｙｃ−タグなど）のある細胞の表面で発現された。化合物およびＷｎｔアルカリホスファターゼ融合タンパク質（Ｗｎｔ８−ＡＰなど）を含有する培地を用いた。インキュベーション後、免疫組織化学染色を利用して結合を求めた。候補化合物がＷｎｔ結合に対する影響を示したら、（５．１（Ｂ）で説明したような）他の生物学的アッセイを適用して、Ｗｎｔシグナル伝達に対する各化合物の影響を求めた。［２７，３８，１２］
【００６７】
７．Ｄｋｋと相互作用する化合物のスクリーニング
７．１ 仮想スクリーニング
Ｄｋｋ１の構造を解明し、セクション４．２で説明したようにして、ＫｒｅｍｅｎおよびＬＲＰ５／６に対するその相互作用表面を変異誘発でマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法で仮想スクリーニングを実施した。ＬＲＰ５またはＫｒｅｍｅｎへのＤｋｋ結合を増大または低減させるか、あるいはＷｎｔのＤｋｋによる阻害を増大または低減させる化合物が明らかになった。
【００６８】
７．２ 生物学的（Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ）アッセイ
セクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したようにして、ＬＲＰ５に対するＤｋｋ結合を増大または低減させる化合物を求めた。また、細胞にＬＲＰ５ではなくＫｒｅｍｅｎをトランスフェクトしたこと以外はセクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したようにして、Ｋｒｅｍｅｎに対するＤｋｋ結合を増大または低減させる化合物を求めた。さらに、セクション５．１（Ｂ）、ＩＩ〜ＩＩＩで説明したようにして、Ｄｋｋ拮抗作用を増大または低減させる化合物を求めた。
【００６９】
８．Ｄｖｌドメインと相互作用する化合物のスクリーニング
Ｗｎｔ−ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体複合体によって細胞質のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）タンパク質が活性化される。これらのタンパク質は、標準的と非標準的の両方のＷｎｔシグナル伝達経路に不可欠である。Ｄｖｌタンパク質は、Ｎ末端のＤＩＸドメイン、中央のＰＤＺドメイン、Ｃ末端のＤＥＰドメインで構成される。これらの３つの保存ドメインは各々、異なるタンパク質に関連しているため、各々異なる経路で機能する。
【００７０】
ＤＩＸドメインはホモダイマーとして存在し、優勢に螺旋構造を形成する。パルスフィールド勾配ＮＭＲ研究でこれを判断した。ＤＩＸドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでアクチンストレスファイバおよび細胞質小胞への標的を媒介する。よって、これはＷｎｔシグナル伝達における分岐点を表す可能性がある。標準的Ｗｎｔシグナル伝達によるβ−カテニンの安定化には、Ｄｖｌのメンバランス（ｍｅｍｂｅｒａｎｃｅ）標的を伴う。マウスＤｖｌ２のＬｙｓ ５８、Ｓｅｒ ５９、Ｍｅｔ ６０は、アクチン相互作用に決定的に関与する。Ｌｙｓ ６８およびＧｌｕ ６９は細胞質小胞の局在化に重要である。
【００７１】
ＰＤＺドメインは、いくつかの分子と相互作用し、標準的と非標準的の両方のＷｎｔ経路で重要な役割を果たす。ツメガエルの三次元ＰＤＺドメイン構造が求められている（シェイット（Ｃｈｅｙｅｔｔｅ）ら）。化学シフト摂動ＮＭＲ分光法と結合アッセイを用いることで、ｆｒｉｚｚｌｅｄの保存されたモチーフＫＴＸＸＸＷとマウスＤｖｌ１のＰＤＺドメインとの間に直接的な相互作用があることが分かった。これによって、結合領域を判断することができる。（ウォング（Ｗｏｎｇ）ら）。
【００７２】
Ｄｖｌタンパク質のＤＥＰドメインは、Ｗｎｔ経路でＤｖｌ下流のエフェクタータンパク質にシグナルを伝達する。哺乳類の細胞におけるβ−カテニン活性の上方制御とＬｅｆ−Ｉによる転写の刺激には、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインが必要である。マウスＤｖｌ１ ＤＥＰドメインの構造が求められている。（ウォング（Ｗｏｎｇ）ら）Ｌｙｓ４３４、Ａｓｐ４４５、Ａｓｐ ４４８が、タンパク質−タンパク質相互作用において重要な役割を果たし、その変異であるＷｎｔ−１がＬｅｆ−１の活性化を誘導したことが分かっている。
【００７３】
８．１ 仮想（Ｖｉｔｕａｌ）スクリーニング
ＤＩＸドメインの二次構造と機能性残基が求められているため、既存のタンパク質ドメインのスクリーニングを用いて三次構造配置についての情報を得ることができる。潜在的な候補とこれについてのシミュレーションによって、結合分析用の候補化合物を生成できる。結合に影響する候補化合物を分析することができ、似たような化合物からなる新しいグループを生物学的にアッセイすることができる。ＰＤＺおよびＤＥＰの三次元構造は周知であるため、セクション５．１で説明した方法と似た仮想スクリーニング法を利用すればよい。この構造をテンプレートとして利用して、ヒトタンパク質ドメインまたは他の同様の機能的タンパク質ドメインの相同性モデルを作製することができる。特定の機能に関与する構造とアミノ酸とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングすることができる。各化合物の生物学的活性を試験することができる。高い生物学的活性を示す化合物については、同様の構造クエリを用いてさらに候補化合物を見つけることができ、生物学的活性をさらにアッセイすることになる。
【００７４】
８．２ 生物学的アッセイ
ＤＩＸドメイン小胞の局在化には、アクチン結合領域のアクチン結合阻害アッセイと、Ｘｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓの発現レベルを利用することができる。化合物の処理後は、タグ付きＤＩＸを含有する構成済みのベクターを細胞にトランスフェクトすることができる。続いて、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｎｓｃｅｎｃｅ）染色を利用して、アクチン結合阻害を求めることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、小胞局在化のＸｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓ レベルを検出することができる。
【００７５】
ＰＤＺドメインの初期スクリーニングにはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを利用することができる。ＤｖｌのＰＤＺドメインに結合するペプチド（Ｄｒｐ Ｃ末端領域など）を利用すればよい。ビーズに結合した精製後のタグ付きペプチドをＰＤＺドメインおよび各化合物と混合し、インキュベーション後に、抗体を使って結合した化合物を検出することができる。各化合物の結合効率の作用（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｆｆｅｃｔ）を求めることができる。
【００７６】
標準的Ｗｎｔ経路に影響する化合物をスクリーニングするには、ドメインにルシフェラーゼアッセイを用いればよい。細胞にＤｖｌドメインをトランスフェクトすることができる。これらの細胞を化合物と一緒にインキュベートすると、Ｗｎｔ／β−カテニン活性化ルシフェラーゼ活性をアッセイできるため、これによって各化合物の作用を測定できる。
【００７７】
続いて、化合物をその構造に基づいて分類し、同定された化合物をさらにスクリーニングする。タンパク質結合に影響する候補の化合物を同定したら、５．１（Ｂ）においてセクションで説明した他の生物学的アッセイを使って各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を判断することができる。［５７，６，５８，５５，７］
【００７８】
９． β−カテニンと相互作用する化合物のスクリーニング
β−カテニンは核へのＷｎｔシグナルの伝達を媒介することで、標的遺伝子を活性化させる。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニンの分解を防止し、β−カテニンが蓄積して後から核に転座してＴｃｆ／ＬＥＦファミリー（ｆａｍｉｌｉｙ）のタンパク質のメンバーとの間で転写活性化複合体を形成できるようにする。
【００７９】
β−カテニンならびに、これがアキシン、Ｌｅｆ、ＴＣＦおよび他のいくつかのタンパク質との間で形成する複合体の結晶構造が解明されている。この情報は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニングに利用することができる。
【００８０】
β−カテニンは、ＡＰＣ、ＬＥＦ／ＴＣＦ、Ｅ−カドヘリン、コンダクチン（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ）／アキシンの結合部位であるＮ末端 アルマジロ反復配列を含有する。これらの結合部位はいずれも、β−カテニンのアルマジロ反復配列単位３〜８に局在している。因子の結合によってグルーブが占領されるため、他の競合するβ−カテニンパートナーが同時に結合することはできなくなる。
【００８１】
９．１ 仮想スクリーニング
セクション５．１で説明した仮想スクリーニングに近い改変ストラテジーを利用して、結合対象となるβ−カテニン相互作用の化合物を同定することができる。β−カテニンをテンプレートとして用いて、異なる種から得られるβ−カテニンの相同性モデルを生成することができる。ＬＥＦ／ＴＣＦ、アキシンおよびＡＰＣとの相互作用に関与する必須アミノ酸と構造とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングし、候補化合物のグループを作製することができる。上述したタンパク質はいずれもβ−カテニンの似たような位置を占めるため、生物学的アッセイを使って各化合物をスクリーニングすると、４つの相互作用がすべて試験される。初期の生物学的活性に基づいて、有効化合物の構造を分析し、似たような方法を使って化合物の新しいグループを試験する。別の生物学的アッセイを実施して、最も有効な化合物を同定してもよい。
【００８２】
９．２ 生物学的アッセイ
β−カテニンパートナーはいずれも似たような位置を占めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳およびタンパク質結合アッセイを利用して各化合物の有効性を求めることができる。タグ付きβ−カテニン、ＴＣＦ、ＡＰＣ、ＬＥＦまたはアキシンコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて転写して、翻訳することができる。対象となる化合物を用いてインキュベート後、イムノブロッティングを利用して結合を検出すればよい。Ｗｎｔ結合に影響する化合物を同定したら、セクション５．１（Ｂ）で説明したような他の生物学的アッセイを利用して、各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を判断することができる。［５２，４３，１６，５９，１１］
【００８３】
１０．ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子と相互作用する化合物のスクリーニング
調節因子ヌクレオタンパク質複合体のアセンブリと機能において構築的な役割を果たすＤＮＡ結合タンパク質に、リンパ球エンハンサー結合因子（ＬＥＦ）がある。これは、高移動度群（ＨＭＧ）ドメインによって特異的なヌクレオチド配列を認識する。ＴＣＲ−α遺伝子エンハンサーからの最適な結合部位を含有する１５塩基対のオリゴヌクレオチドデュプレックスと複合化したマウスＬＥＦ−ｌのＨＭＧドメインのソリューション（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）構造が解明されている。
【００８４】
１０．１ 仮想スクリーニング
セクション５．１で説明した仮想スクリーニングに近いストラテジーを利用して、ＨＭＧ−オリゴヌクレオチド結合と相互作用し、これによって遺伝子発現調節の活性に影響する潜在的な化合物をスクリーニングすることができる。構造に基づいて、ＨＭＧドメインを含有するタンパク質は、自らが結合する対象となるＤＮＡを屈曲させる。ＤＮＡの屈曲または結合能に影響する化合物はいずれも、遺伝子発現の調節に影響をおよぼす。周知の構造をテンプレートとして用いて、異なる種のＬＥＦ ＨＭＧドメインの相同性モデルを作製することができる。ＨＭＧ−オリゴ相互作用に関与するアミノ酸と構造とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングすることができる。強制的に屈曲させるか、屈曲を禁止する化合物を選択する。ＤＮＡ結合（ｂｉｄｉｎｇ）活性を利用して化合物をスクリーニングした。生物学的活性がかなり高いか、かなり低い化合物についても、同様の構造クエリを用いて別の候補化合物（ｃｏｍｏｐｏｕｎｄ）を同定することができる。
【００８５】
１０．２ 生物学的アッセイ
ＤＮＡ結合アッセイを利用して、化合物をスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドとＨＭＧドメインを、これらの化合物と一緒にインキュベートする。ゲル遅延度アッセイを用いて、ＤＮＡ結合を求める。均一に１３Ｃ標識したＮＭＲを用いて結合実験を改変し、ドメインの屈曲を分析することができる。ＬＥＦ制御された遺伝子調節が直接影響するため、ルシフェラーゼアッセイも利用して化合物の影響を検出することができる。タンパク質の結合に影響している化合物を同定したら、５．１（Ｂ）で説明した他の生物学的アッセイを利用して各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を求めることができる。［３３］
【００８６】
１１． 他の何らかのＷｎｔシグナル伝達関連タンパク質と相互作用する化合物のスクリーニング
Ｗｎｔシグナル伝達に関与する別のタンパク質因子が存在する。将来的に、その構造を解明することができるかもしれない。相互作用表面構造に基づいて、セクション５で説明したようにして化合物をスクリーニングし、その生物学的活性を試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
図面の簡単な説明
【図１】野生型ＬＲＰ５とその欠失変異体の概略図を示す。
【図２】Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の輸送を乱すことを説明するための図である。図示のように、ＨＥＫ細胞に発現プラスミドをトランスフェクとした。１日後、この細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を実施した。ＭｅｓｄにはＦｌａｇタグを付加し、ＬＲＰ５分子にはすべてＨＡタグを付加した。Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）ならびにＲ１２とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱したのに対し、Ｅ７２１変異はこれらの相互作用に影響しなかった（図２Ａ、レーン２および３）。図２Ａおよび図２Ｂの下側のパネルは、免疫沈降用の等量のＷｔおよび変異体ＬＲＰ５投与量を示す。［ＨＥＫ細胞に、図示のＭｅｓｄプラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。］Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１−４およびＲｌ−４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養の上清に分泌されることのある膜貫通ドメインが欠如したＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、条件培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心分離した。上清を抗ＨＡ抗体によって免疫沈降（図２Ｃ）させるか、あるいはＡＰアッセイに利用した（図２Ｄ）。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液にも溶解させ、ウェスタンブロッティングで分析した（図２Ｃおよび図２Ｄの下側のパネル）。このデータから、Ｇ１７１Ｖ変異がＲ１２およびＲｌ−４の分泌を阻害することが分かる。図２Ｅは、細胞表面のＬＲＰ５を検出する結合アッセイを用いて、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の細胞表面輸送に干渉することを確かめるものである。細胞表面をビオチン標識し、ＬＲＰ５分子を抗ＨＡ抗体で沈降させた（図２Ｅ、上側のパネル）後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を用いるウェスタン分析で細胞表面のＬＲＰ５分子濃度を検出した。免疫複合体中のＬＲＰ５濃度を図２Ｅの下側のパネルに示す。
【図３】ＬＲＰ５のＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が、同時発現したＷｎｔ活性のＤｋｋ１による阻害よりも影響されにくいことを示す。図３Ａの左側のパネルは、Ｗｎｔ1、ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異の存在下または非存在下でＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドと一緒に図示のようにＨＥＫ細胞にプラスミドをトランスフェクトしても、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）に比してＬＥＦ−１依存性転写活性が上昇しなかったことを示す。図３Ａの右側のパネルは、ＬＲＰ５タンパク質または抗ＬＲＰ６抗体のＨＡタグに特異的な抗体によって求めた、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６、ＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現レベルを示す。図３Ｂは、ＨＥＫ細胞にＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトすると、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎが、ＷｔまたはＧ１７１Ｖ ＬＲＰ５の存在下で図示のようになることを示す。Ｄｋｋが存在する場合、ＬＲＰ５Ｗｔを発現しているＨＥＫ細胞よりも、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞の方が、ＬＥＦ−１レポーター指標Ｗｎｔ活性が有意に高い。Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ、ＬＲＰ５のタンパク質発現レベルを、図３Ｃに示すようにしてウェスタンブロッティングで確認した。
【図４】ＬＲＰ５Ｇ１７１を発現している細胞の方が、ＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりもＤｋｋ１結合部位が少ないことを説明するための図（図４Ａ）である。図４Ｂは、トランスフェクション後のＷｔと変異体ＬＲＰ５の同じ量の発現を示している。
【図５】Ｗｎｔ活性にＬＲＰ５の第２のドメインが必要であることを示す。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、ＬＥＦレポーター活性を上述したようにして測定した。図５に示す結果から、ＬＲＰ５ＷｔよりもＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖ（第２のドメインに点変異があるＬＲＰ５）の方がＷｎｔシグナル伝達を無効にする可能性があることが分かる。
【図６】Ｄｋｋによる拮抗作用にはＬＲＰ５の第３のドメインが必要であることを説明するための図である。図６Ａは、Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であることを示している。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は依然としてＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４はこれができなかったことから、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４のいずれかがＷｎｔ共役受容体機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在すると、Ｋｒｅｍｅｎの同時発現にもかかわらずＤｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった。このことから、Ｄｋｋ１による阻害には第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なのではないかと考えられる。ＬＲＰ５Ｗｔとその変異体分子の発現レベルを図６Ｂに示す。図６Ｃは、ＬＲＰ５Ｒ３４がＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であることを説明するための図である。図６Ｄは変異の概略図である。
【図７】ＷｎｔをＤｋｋで阻害するには、相互作用表面を構成している第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインのアミノ酸残基が必要であることを示す。図７Ａでは、ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造（１３）に基づいて第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの空間充填モデルを推定した。三次元構造に基づいて、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を生成した。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える能力を判断した。この変異体のうちの９つ（５％超）で、Ｄｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が認められたが、いずれも同一表面に局在した変異を含有していた。図７Ｂでは、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｉｎｌプラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下側のパネルに示す。１９の変異のうち、Ｅ７２１変異でＷｎｔのＤｋｋ１による阻害に対する最も強い影響が認められ、続いてＷ７８１、次はＹ７１９であった。ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶでもＷｎｔのＤｋｋ１による阻害に対する影響が認められた。
【図８】米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））から得られた３種類の化合物の二次元構造を示す。ＮＣＩ１０６１６４（図８Ａ）はＤｋｋ１結合に対して６８％の阻害作用を示し、ＮＣＩ３９９１４（図８Ｂ）とＮＣＩ６６０２２４（図８Ｃ）はそれぞれ、Ｄｋｋ１結合を６５４％および２７６％増加させる。
【図９】ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４における共通の部分構造であるアントラ−９，１０−キノン（図９Ａ）の二次元構造を説明するための図である。図９Ｂは、ＮＣＩ ６５７５６６の二次元構造を示す。図９Ｃは、二次元の類似性探索に用いたテンプレートを示す。
【図１０】Ｄｋｋ１−ＬＲＰ５相互作用を特異的に妨害し、Ｄｋｋ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を逆転させる化合物であるＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８、図１０Ａ）とＮＣＩ８６４２（ＩＩＩＣ３、図１０Ｂ）の二次元構造を示す。
【図１１】ＮＣＩ３６６２１８とＮＣＩ８６４２がＤｋｋ１阻害を逆転させることを説明するための図である。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＧＦＰ発現プラスミドと共にＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクとした。次に、これらの細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８化合物とＮＣＩ８６４２化合物で処理し、続いて対照としてのＣＭ、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＷｎｔ ３ａ／Ｄｋｋ１ ＣＭ混合物で６時間処理した。ＤＭＳＯで処理した細胞のレポーター活性を１００％とした。図１１は、特定の濃度で、ＮＣＩ３６６２１８（図１１Ａ）とＮＣＩ８６４２（図１１Ｂ）がＷｎｔ活性のＤｋｋによる阻害を有意に逆転可能であることを示している。
【図１２】ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２がＬＲＰ５に対するＤｋｋ１の結合を阻害できることを示す。ＨＥＫ細胞に、ＭｅｓｄプラスミドとＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４とをトランスフェクトした。１日後、細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８とＮＣＩ８６４２で処理し、ｍＤｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製した条件培地（ＣＭ）を用いて氷上でインキュベートした。ＡＰ活性を上述したようにして求めた。ＤＭＳＯで処理した細胞のＡＰ活性を１００％とした。図１２は、ＮＣＩ３６６２１８（図１２Ａ）とＮＣＩ８６４２（図１２Ｂ）が、ＬＲＰ５Ｗｔに対するＤｋｋ１の結合ならびにＬＲＰ５Ｒ３４に対するＤｋｋタンパク質の結合を阻害することを示している。
【図１３】ＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８）によって骨芽細胞の分化を刺激できることを説明するための図である。ＧＦＰを骨芽細胞のマーカーとして利用できる、２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーター（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）１１で制御される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジーンを持つ３ヶ月齢のマウスから骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を単離した。８日目と１２日目に、それぞれ９μＭと２６μＭのＩＩＣ８化合物で培養を処理した。これと同じ時点、対照としてのＤＭＳＯで培養を処理した。図１３は、ＢＭＳ培養をＩＩＣ８で処理した場合に骨芽細胞分化マーカー２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰの供給が開始された（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ）ことを示している。
【図１４】骨原性アッセイを示す。ＮＣＩ３６６２１８の存在下および非存在下で初代骨髄間質骨芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）を培養し、分化を誘導した。２０日後、骨形成過程を反映している骨芽細胞の石灰化がキシレンオレンジ染色で観察された。ＮＣＩ３６６２１８は石灰化を２倍刺激した。
【図１５】ＬＲＰ５Ｒ１２とＬＲＰ５Ｒ３４のどちらもＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であり、Ｇ１７１Ｖ ＬＲＰ５変異体が細胞表面に対するＤｋｋ結合を無効にし得ることを説明するための図である。図４Ａは、Ｄｋｋ１がＬＲＰ５Ｒ１２とＬＲＰ５Ｒ３４のどちらにも結合可能であるが、Ｒ１２ＧＶ（ＬＲＰ５Ｒ１２におけるＧ１７１Ｖ変異）およびＲ３４Ｅ（Ｅ７２１変異のあるＬＲＰ５Ｒ３４）でトランスフェクトした細胞では細胞表面に対するＤｋｋ１結合が有意に低かったことを示す。図４Ｂは、トランスフェクション後のＷｔと変異体ＬＲＰ５の同じ量の発現を示している。
【図１６】骨原性細胞でのＤｋｋ１とＷｎｔ７ｂの発現を説明するための図である。分化誘導後の異なる時点で骨髄間質細胞の細胞培養から全ＲＮＡを単離した。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲでＤｋｋとＷｎｔの発現レベルを求めた。Ｗｎｔ７ｂでは、分化誘導後にその発現に顕著な増加が認められた（図７Ａ）。Ｗｎｔ ７ｂがＬＥＦ−１レポーター遺伝子を刺激する能力を試験したところ、標準的Ｗｎｔ経路を刺激することができた（図７Ｂ）。図７Ｃは、マウス長骨部分のインサイチュハイブリダイゼーション画像である。この画像から、Ｄｋｋ１の大半が骨細胞で発現されることが分かる。図Ｄは、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｄｋｋ、ＬＲＰ、Ｗｎｔ、Ｆｚ間の相互作用について説明するための図である。
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への参照
本願は、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（骨形成を刺激するための組成物および方法）」で２００３年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／５０４，８６０号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本願は、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ（骨形成および細胞の自己複製を刺激または促進するための組成物および方法）」で２００４年５月１９日に出願されたダン・ウ（Ｄａｎ Ｗｕ）らによる特許出願に関連したものであり、その内容全体を本願明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、骨折、骨疾患、骨損傷、骨異常、腫瘍、増殖またはウイルス感染の治療の際の治療方法、組成物およびその用途の分野に関する。特に、本発明の方法および組成物は、骨形成または骨再構築の刺激、促進、阻害を対象とするものである。
【０００４】
本願に引用または本願で確認した特許、特許出願、特許出願公開公報、化学論文などについてはいずれも、本発明が属する技術分野の状況を一層よく説明する目的で、その全体を本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
公衆衛生上の大きな問題のひとつに骨粗鬆症があり、特に高齢者のあいだでは普通に見られる（１，１５，２１）。６５歳よりも高齢の人々の骨折の大多数は骨粗鬆症（１５，４０）が原因である。骨粗鬆症による骨折の危険性を明確にする際の判断要素のひとつがピーク骨量（ヒーニー（Ｈｅａｎｅｙ）ら、２０００）であるが、このピーク骨量の変動には遺伝因子が大きくかかわっていることが研究から分かっている。最近になって、骨量を調節する遺伝子のうちの１種がポジショナルクローニングで同定された。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）の機能喪失型変異すなわち、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の共役受容体（２７）が、ヒトでの骨密度の減少を主徴とする常染色体劣性疾患である骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連していることが明らかになった（９）。また、家族性高骨量（ＨＢＭ）の表現型を示す２つの独立した家系（ｋｉｎｄｒｅｄ）には、ＬＲＰ５にＧｌｙ１７１からＶａｌへの置換変異（Ｇ１７１Ｖ）があることも明らかになった（５，２２）。ごく最近では、Ｇ１７１Ｖ変異の同じ構造ドメインで別のＨＢＭ変異が報告された（３６）。さらに、標的遺伝子組み換えによってＬＲＰ５遺伝子を不活化したマウスには、ＯＰＰＧ患者のものと同様の表現型が認められ（１６）、マウスでＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖをトランスジェニック発現させるとＨＢＭが得られた（２）。さらに、マウス初代骨芽細胞ではＬＲＰ５の不在下でＷｎｔに対する応答性が低下（１６）し、Ｗｎｔ（９）または活性化β−カテニン（４）によって標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性が刺激されて、骨芽細胞様細胞で骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の産生が誘導された。まとめると、これらの証拠から、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路が骨の発達の調節に重要な役割を果たしていることが分かる。
【０００６】
最近まで、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路はＷｎｔがｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｆｚタンパク質に結合すると開始されると考えられていた。７つの膜貫通ドメインを含有するＦｚタンパク質が、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が関与するはっきりしない機序でβ−カテニンのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）依存性リン酸化を抑制する。この抑制によってβ−カテニンが安定する。こうして安定すると、β−カテニンはリンパ系増強因子−１（ＬＥＦ−１）やＴ細胞因子（ＴＣＦ）をはじめとする転写調節因子と相互作用して、遺伝子転写を活性化することができる（７，１０，３８）。最近、遺伝学的な研究や生化学的な研究によって、標準的Ｗｎｔシグナル伝達にはＦｚタンパク質だけでなく共役受容体が必要だということを示す確かな証拠が得られている（２７，２８）。また、ＬＲＰ５／６（ＬＲＰ５またはＬＲＰ６）のハエオーソログＡｒｒｏｗが、Ｗｎｔ−１のハエオーソログであるＷｇのシグナル伝達に必要であることが明らかになった（３７）。ＬＲＰ５とＬＲＰ６は、発現パターンこそ異なるが基本的には同じように機能する、よく似たホモログである。一方、ＬＲＰ６は、ツメガエル胚でＷｎｔ１に結合し、Ｗｎｔ誘導発生過程を調節することが明らかになった（３４）。また、ＬＲＰ６欠損マウスには、さまざまなＷｎｔタンパク質が欠乏したときに生じる発育障害に類似した発育障害が認められた（３０）。さらに、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ａｒｒｏｗが、アキシンを結合してアキシンの分解とβ−カテニンの安定化を引き起こすことで、標準的Ｗｎｔシグナルの形質導入に関与していることも明らかになった（２５，３５）。ＬＲＰ５／６−によるシグナル伝達過程がＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に依存しているようには見えない（１８，３１）。最近になって、シャペロンタンパク質であるＭｅｓｄが、細胞表面へのＬＲＰ５／６輸送に必要なものとして同定された（６，１１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ツメガエルのＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）−１は、最初は頭部形成に重要な役割を果たすＷｎｔアンタゴニストとして発見された（８）。これまでのところ、Ｄｋｋは哺乳動物で４種類のメンバーが同定されている（１７，２６）。これらのメンバーは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４である。Ｄｋｋ１とＤｋｋ２は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と単一膜貫通タンパク質Ｋｒｅｍｅｎに同時に結合して標準的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する（３，２３，２４，３２）。以前、ＬＲＰ５ ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が標準的Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ１による拮抗作用を減弱させるように見えることが報告されている（５）。本発明は、この減弱の機序について説明するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、骨形成または骨再構築に関与する受容体または共役受容体のドメインのキャビティと、同様に機能するＤｋｋ、Ｗｎｔ、Ｍｅｓｄまたは他のタンパク質との機能的相互作用を明らかにするモデルについて説明するものである。これらの受容体としては、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体があげられるが、これに限定されるものではない。ＬＲＰ５受容体は、４つのＹＷＴＤ繰り返しドメインで構成される。各ドメインには、複数のアミノ酸ＹＷＴＤ反復配列が含まれる。また、ＬＲＰ５受容体にはＬＤＬ受容体反復配列もある。ＬＲＰ５とＬＲＰ６はいずれもよく似たホモログであり、基本的に同じように機能するが、発現パターンは異なっている。
【０００９】
本発明は、これらのキャビティに結合またはこれと相互作用してＷｎｔシグナル伝達を刺激、阻害または調節し、ひいては骨形成、腫瘍形成ならびにＷｎｔシグナル伝達によって調節される他のあらゆる生物学的過程および病理学的過程を刺激、阻害または調節する外来化合物または外因性化合物を同定するための方法を提供するものである。外来化合物とは、外部ソースから導入されるものではない天然化合物との対比で、細胞または生物に自然にはあるいは通常は見られない化合物を含む。化合物については、さまざまなスクリーニング法とアッセイを用いて米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））のデータベースから同定した。これらの化合物を修飾して、同じように効果的に機能する、ＮＣＩのデータベースや自然界には見られない派生物（ｄｅｒｉｖａｔｅ）またはアナログを作出することも可能であった。ＤｋｋとＬＲＰ５／６との相互作用、ＷｎｔとＬＲＰ５／６との相互作用、ＭｅｓｄとＬＲＰ５／６との相互作用を乱す化合物を同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
すでに報告されているように（５）、Ｃ末端にＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異とＨＡ−エピトープタグとを含有するＬＲＰ５変異体タンパク質（ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ）を発現させ（図３Ａ）ても、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）（図３Ａ）に比してＬＥＦ−１依存性転写活性は増加しなかった。また、Ｇ１７１Ｖ変異は、自己分泌の枠組みで同時発現されたＷｎｔ１によって刺激される活性をさらに増強するには至らなかった（図３Ｂ）。ＬＥＦ−１は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の下流側標的転写因子である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで測定されるその活性が、標準的Ｗｎｔ活性を測るのに広く用いられている（１２，２０）。このように、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｗｎｔシグナル伝達の形質導入にあたって構成的に活性でもなければ一層コンピテントであるわけでもない。驚いたことに、ＬＲＰ６での対応する変異であるＧ−１５８残基からＶａｌ残基への置換によって、おそらくは受容体が不活化されて、これがＷｎｔ−１と相乗作用することはできなくなった（図３Ａ）。
【００１１】
ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｋｒｅｍｅｎの非存在下でＬＲＰ５ＷｔよりもＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低いことが明らかになった（５）。Ｄｋｋ１誘導阻害を容易にすることが知られているＤｋｋ結合単一膜貫通タンパク質である（２３）。この研究では、本発明者らはＫｒｅｍｅｎの存在下で、この変異による影響を試験した。Ｋｒｅｍｅｎ１の同時発現によってＤｋｋによる阻害が有意に増強され（図３Ｂ）、すでに報告がなされているＫｒｅｍｅｎの作用（２３）が確認された。すなわち、Ｋｒｅｍｅｎの非存在下で観察されたものと同様に、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＤｋｋ１の両方の存在下で、ＷｎｔはＬＲＰ５Ｗｔを発現しているものよりも、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞の方で高い活性を示した（図３Ｂ）。この違いがマルチプラスミドトランスフェクションの結果ではないことを裏付けるために、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｉｎ１およびＬＲＰ５のタンパク質発現（図３Ｃ）について検討した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞と２種類の骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３および２Ｔ３で自己分泌型Ｗｎｔ１活性のＤｋｋによる阻害に対する耐性が上昇するという同様の結果が観察された。
【００１２】
なぜＬＲＰ５ Ｇ１７１Ｖの方がＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低いのかを説明する有力な仮説に、ＬＲＰ５とＤｋｋ１との間の相互作用が変異によって乱れる可能性があるというものがある。Ｄｋｋ１による拮抗作用にはＧ１７１を含有する第１のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であるという仮説には筋が通っている。この仮説を試験するために、第３および第４のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失したＬＲＰ５Ｒ１２と、第１および第２のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失したＬＲＰ５Ｒ３４という２つのＬＲＰ５欠失変異体を生成した（図１）。ＬＲＰ６（２４）に対してすでに報告がなされているように、欠失があってもＬＲＰ５Ｒ１２はＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４ではそうはいかなかった（図６Ａ）ことから、ＬＲＰ５Ｒ１２はＷｎｔ共役受容体の機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２が存在すると、Ｋｒｅｍｅｎが同時発現されていてもＤｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった（図６Ａ）。このことから、Ｄｋｋ１による阻害には最後の２つのＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なのかもしれないと考えられる。Ｄｋｋ１による阻害に必要な配列をさらに明確にするために、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが欠失した別のＬＲＰ５変異体であるＬＲＰ５Ｒ１２４を生成した（図１）。ＬＲＰ５Ｒ１２と同様に、ＬＲＰ５Ｒ１２４もＤｋｋ１による阻害に対する耐性があった（図６Ａ）ことから、Ｄｋｋ１による阻害には第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なであることが分かる。
【００１３】
第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが完全に欠失すると、ＬＲＰ５のコンホメーション全体が変化する可能性があるため、Ｄｋｋ１による阻害を乱すことが可能であろうこのドメインの点変異を作製した。ＬＤＬ受容体の三次元構造（１３）から推定した第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの三次元構造に基づいて、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を作製した（図７Ａ）。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える機能を判断し、これを図３Ａに示す。変異体のうちの９つ（５％超）にＤｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が見られ、そのすべてに同一表面に局在する変異が含まれていた（図７Ａ）。これらの変異のうち、Ｅ７２１変異に最も強い影響が認められ、津続いてＷ７８１、次はＹ７１９であった（図７Ｂ）。第１および第２のＹＷＴＤ繰り返しドメインにおけるＥ７２１対応残基の変異（それぞれＤ１１１およびＤ４１８）では、Ｄｋｋによる阻害に対する感受性は有意に変化しなかった。Ｄｋｋ１による阻害に対する耐性のある変異体はすべて、Ｄｋｋ２による阻害に対しても耐性があった。このデータはすべて、Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であるという結論を裏付けるものとなっている。
【００１４】
Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であることの明らかな理由のひとつに、このドメインがＤｋｋ１結合を担っているということがある。ＨＥＫ細胞の表面で発現されるＬＲＰ５へのＤｋｋ１−ＡＰ融合タンパク質の直接的な結合を測定した（２３）。図６Ｃに示されるように、Ｄｋｋ１−ＡＰは飽和を示した。ＬＲＰ５を発現しているＨＥＫ細胞に対する結合曲線。この結合は、ＬＲＰ５／６の折りたたみと輸送を容易にすることが分かっているＭｅｓｄすなわちＬＲＰ５／６シャペロン（６，１１）が同時発現されるときにだけ測定できた。驚いたことに、ＬＲＰ５Ｅ７２１は依然としてＤｋｋ１の有意な結合を示し、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖで見られるものよりも結合率が高かった（図６Ｃ）。ＬＲＰ５Ｅ７２１は、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖに比してＤｋｋ１による阻害に対する耐性が極めて高い（図７Ｂ）が、ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶよりもＤｋｋ１に対する結合性がよかった（図６Ｃ）。第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが実際にＤｋｋ１と結合できることを示すために、Ｒ３４またはＲ３４Ｅ（Ｒ３４ＥはＥ７２１変異のあるＲ３４である）を発現しているＨＥＫ細胞に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合について検討した。Ｒ３４にはＤｋｋ１−ＡＰの有意な結合が認められたが、Ｒ３４Ｅではこのようにならなかった（図１５Ａ）ことから、Ｒ３４はＤｋｋ１を結合でき、結合を生じるにはＥ７２１が必要であることが分かる。これについては、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインだけがＤｋｋ１と結合する機能をＬＲＰ５Ｅ７２１に持たせることのできるＬＲＰ５上の唯一のＤｋｋ結合部位ではないという観察結果から説明できる。この説明を、Ｒ１２もＤｋｋ１に結合可能であった（図１５Ａ）という観察結果を得ることで裏付けた。Ｒ１２およびＲ３４はいずれもＤｋｋ１と結合できるが、Ｄｋｋ１に対するその親和性は全長ＬＲＰ５の親和性（最大結合率の半分から推測）よりも少なくとも５分の１未満であるように思われる。Ｒ１２またはＲ３４を発現している細胞への最大結合率は、ＬＲＰ５Ｗｔの最大結合率に匹敵するか、おそらくはこれよりも高い（Ｒ１２またはＲ３４への結合は可能な限り最大の入力でも飽和に達したようには見えなかった）が、Ｒ１２およびＲ３４の発現レベルをウェスタン分析で推測すると（図１５Ｂ）、ＬＲＰ５Ｗｔの場合のほぼ２倍であった。このことは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６にはＤｋｋ１への結合部位が２ヶ所以上あるという結論の裏付けとなる。
【００１５】
第１のＹＷＴＤ繰り返しドメインの点変異であるＧ１７１Ｖは、Ｄｋｋ１の見かけ上の結合を劇的に減らす（図６Ｃ）。ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶについてのＤｋｋ１結合曲線の特徴からみて、最大結合率が６分の１に落ちる（図６Ｃ）のにもかかわらず、Ｇ１７１Ｖ変異がＤｋｋ１への親和性を変化させているとは思えない。ＬＲＰ５ＷｔとＬＲＰ５Ｇ１７１はいずれも同じようなレベルで発現される（図６Ｃ）が、Ｇ１７１Ｖ変異の方が細胞表面でのＬＲＰ５受容体が少なかった。Ｍｅｓｄが細胞表面へのＬＲＰ５受容体の輸送に重要な役割を果たしていることは周知であるため、Ｇ１７１Ｖ変異を調べて、これがＭｅｓｄの機能を妨害したのか否かを判断した。Ｍｅｓｄについては、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と相互作用することがすでに分かっている（１１）。この所見と一致して、ＬＲＰ５およびＭｅｓｄの共免疫沈降が（図２Ａ）。Ｒ１２とＭｅｓｄとの相互作用も検出した（図２Ｂ）。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）とＲ１２とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱すのに対し、Ｅ７２１変異はこの相互作用には影響しない（図２Ａ、レーン２および３）ということが分かった。Ｍｅｓｄの機能（折りたたみとＬＲＰ５またはＬＲＰ６の輸送）にＬＲＰ５とＭｅｓｄとの間の相互作用が重要であれば、Ｇ１７１Ｖ変異も膜貫通ドメインのないＬＲＰ５変異体の分泌を妨げるはずである。予想どおり、Ｇ１７１Ｖ変異は、それぞれ膜貫通ドメインと細胞内ドメインのないＲ１２および全長ＬＲＰ５であるＲ１２Ｔ（図２Ｃ）およびＲｌ−４（図２Ｄ）の分泌を阻害した。Ｅ７２１変異を持つＲｌ−４は、その分泌を阻害しなかった。また、ＬＲＰ５ＷｔおよびＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している生きた細胞を表面でビオチン標識し、ＬＲＰ５タンパク質を免疫沈降した上でストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてウェスタン分析で細胞表面でのＬＲＰ５タンパク質レベルを比較した。図２Ｅに示すように、ビオチン標識されたＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの量はＬＲＰ５Ｗｔの量よりも明らかに少ないが、免疫複合体における２種類のＬＲＰ５分子のレベルは同じである。このことから、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の細胞表面輸送を妨害していることが確認される。
【００１６】
Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５ヌルまたは低形質の変異で見られるものとは逆の骨の表現型と関連しているため、高形質のアレルではないかと予測された（５，９，１６，２２）。細胞表面の受容体が少なくなればなるほどＷｎｔも低くなるはずだという仮定に基づくと、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの細胞表面での提示が弱いことは、上記の予測内容と矛盾するであろう。しかしながら、傍分泌または内分泌の枠組みを模する外因的なＷｎｔを加えると、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している細胞はＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりも少ない応答を示した（図１６Ａ）。これは、ＷｎｔがＬＲＰ５分子と同時発現された場合には起こらなかった（図３Ａ）。変異は自己分泌型のＷｎｔ活性に影響するようには思えず、Ｗｎｔタンパク質は、受容体が実際に細胞表面まで輸送される前にその受容体に結合してシグナル伝達イベントを活性化させることができるのではないかと考えられる。これらの観察結果から、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖが骨芽細胞でその分化時にどのようにしてＷｎｔ活性を高めるのかが明らかになる。骨芽細胞がその分化時に自己分泌的に標準的Ｗｎｔを生成し、骨でＤｋｋ１が傍分泌的に生成される場合に、変異はＷｎｔ活性よりもＤｋｋによる拮抗作用の方に一層大きく影響する。骨髄間質細胞の骨芽細胞培養における１９のマウスＷｎｔ遺伝子すべての発現を調べた。Ｗｎｔ遺伝子のうちのひとつであるＷｎｔ７ｂで、分化誘導後にその発現に顕著な増加が認められた（図１６Ａ）。Ｗｎｔ７ｂがＬＥＦ−１レポーター遺伝子と標準的Ｗｎｔ経路を刺激する機能が示された（図１６Ｂ）。また、骨細胞と最終分化した骨芽細胞でＤｋｋ１が高いレベルで発現され、骨芽細胞を分化させるための傍分泌因子として機能していた（図１６Ｃ）。
【００１７】
本発明は、ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異がどのようにして標準的Ｗｎｔシグナル伝達を促進するのかを説明するものである。Ｇ１７１Ｖ変異が高形質ではないかという仮定は、この変異に関連する表現型と、同時発現されたＷｎｔ活性のＤｋｋによる阻害に対して変異体ＬＲＰ５受容体が一層高い耐性を持つようだという過去の観察結果に基づくものであった（５）。最初の仮説は、変異がＬＲＰ５のＤｋｋ１結合領域に局在しているため、ＤｋｋとＬＲＰ５の直接的な相互作用が妨害されるのではないかというものであった。本発明は、Ｇ１７１Ｖ変異が局在する第１のドメインではなくＬＲＰ５受容体の第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインで、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＤｋｋ１との間の相互作用を直接妨害することはないことを示している。そうではなくて、Ｇ１７１Ｖ変異はＬＲＰ５とそのシャペロンＭｅｓｄとの相互作用を妨害し、細胞表面へのＬＲＰ５の輸送を妨げるため、細胞表面に到達するＬＲＰ５分子の数が少なくなる。
【００１８】
分化している骨芽細胞が自己分泌型Ｗｎｔタンパク質を生成し、骨の傍分泌型Ｄｋｋタンパク質を利用できるかぎり、骨芽細胞が分化する際にＧ１７１Ｖ変異によってＷｎｔ活性が増加する可能性がある。これは、ＬＲＰ５ＷｔまたはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している骨芽細胞は同じように自己分泌的に標準的Ｗｎｔに応答するが、傍分泌Ｄｋｋには変異体ＬＲＰ５を発現している細胞に対する拮抗作用が少ないためである。このため、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現している細胞でＷｎｔシグナル伝達活性が高まる。図１６に示されるように、骨芽細胞が標準的ＷｎｔであるＷｎｔ７ｂを発現し、骨細胞から生成されるＤｋｋ１を利用できるという、両方の状態が存在する。
【００１９】
Ｇ１７１Ｖ変異があればそのＷｎｔ共役受容体の役割とは無関係な機序によって骨量が増えるかもしれないが、Ｇ１７１Ｖ変異がＷｎｔ活性を落として骨量を増やすことは非常に考えにくい。ヒトとマウスでの遺伝的な証拠や生化学的な証拠をはじめとして、入手可能な証拠からはいずれも、Ｗｎｔ活性と骨形成との間に正の関係があることが分かる。ヒトとマウスのどちらでも、ＬＲＰ５ヌルまたは低形質の変異によって、Ｇ１７１Ｖ変異のあるヒトまたはマウスで見られる表現型とは逆の骨の表現型が得られる（５，９，１６，２２）。また、標準的Ｗｎｔタンパク質は骨芽細胞の増殖と分化の両方を刺激する（９，１６）のに大使、Ｄｋｋ１は骨髄間質細胞培養系で骨芽細胞の分化を阻害する。これらの所見に、骨芽細胞の分化後にＷｎｔ７ｂの発現が劇的に上方制御される（図１６Ｂ）という所見をあわせて考えると、標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性が増大することで骨形成量が増すのではないかと思われる。他方、Ｄｋｋ１は分化している骨芽細胞では低いレベルで生成され、最終分化した骨芽細胞である骨細胞ではこれよりも高いレベルで生成される。骨細胞によって生成されるＤｋｋ１は、骨芽細胞活性の調節における負のフィードバック機序として骨再構築機能の調節に関与していた。
【００２０】
最初の２つのＹＷＴＤ反復配列はＤｋｋ１と結合できる（図１５Ａ）が、これらの配列はＷｎｔシグナル伝達のＤＫＫによる阻害には必要ない（図６Ａ）。これは、図１６Ｄに示されるように、最初の２つのＹＷＴＤ反復配列に対するＤｋｋ１の結合、ドメインが、Ｄｋｋ１とＫｒｅｍｅｎの同時相互作用とは両立されないためである。Ｗｎｔシグナル伝達のＤＫＫ１による阻害には、ＫｒｅｍｅｎおよびＬＲＰ５／６の両方に対してＤｋｋ１が同時に相互作用する必要がある（２４）。ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造に基づいて、ＬＲＰ５の最初の３つのＹＷＴＤ繰り返しドメイン各々が、一端に広い開口、他端に狭い開口のある樽状構造を形成する（第４の繰り返しドメインには構造的に推定できるだけの十分なアミノ酸配列相同性がない）。この構造情報から、Ｄｋｋ１結合のために重要な第３のＹＷＴＤ繰り返しドメイン上のアミノ酸残基を同定することができた。これらの結果から、Ｄｋｋ１は樽状構造の広い方の開口を介して第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインと相互作用することが分かった。最初の２つのＹＷＴＤ繰り返しドメインでの同時ではあるが別個ではないＥ７２１の変異相当の残基（それぞれＤ１１１およびＤ４８１）がＲ１２に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を無効にするため、Ｄｋｋ１はこれら２つの繰り返しドメインと同じような形で相互作用する。このＬＲＰ５のＥ７２１残基はＤｋｋ１の塩基性残基との間で塩橋を形成し得る。この推論は、結晶学を用いたニドジェンとラミニンとの相互作用についての最近の研究によって裏付けられる。ニドジェンのラミニン相互作用ドメインは、ＬＲＰ５のＹＷＴＤ繰り返しドメインとアミノ酸配列相同性で同じ樽状構造を持ち、このニドジェンドメインの接触残基のうちのひとつがラミニンのＬｙｓ残基との間で塩橋を形成するＥ７２１相当のＧｌｕである（３３）。
【００２１】
本発明では、細胞に提供されると、骨形成または骨再構築の刺激、促進、阻害または調節に関与する共役受容体のドメインに見られる部位またはキャビティに結合し、これと相互作用し、あるいはこれに適合する化合物を同定した。これらの受容体としては、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体あるいは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６（ＬＲＰ５／６）受容体系に関与する他のあらゆる受容体があげられる。ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、Ｗｎｔ活性を増大または低減させるよう機能するドメイン含有ＣＲＤすなわちＷｎｔ結合部位を持つ共役受容体である。
【００２２】
化合物については、実施例にて説明するスクリーニング法で同定した。これらの化合物のうちのいくつかは、ＤｋｋとＬＲＰ５の相互作用を乱すことが明らかになった。他の化合物は、おそらくはＬＲＰ５／６に対するＷｎｔの結合を阻害することでＷｎｔシグナル伝達を阻害した。本発明の化合物は、細胞には存在しないが、外部ソースに由来する外来化合物または外因性化合物である。これらの化合物は、アゴニストすなわち受容体と組み合わさってイベントを開始できる作用物質と、アンタゴニストすなわち受容体と組み合わさってアゴニスト（ａｇａｏｎｉｓｔｓ）の作用を阻害する作用物質と、あるときはアクションを引き起こすように見え、別の時にはアゴニストの作用を弱めることでアクションを阻害するなど、アゴニストとアンタゴニストの両方の特徴を持つ部分アゴニストと、を含む。これらの化合物のなかには、親和性または製剤や化合物が受容体の結合部位に誘引される度合いを高めることが明らかになっているもある。
【００２３】
骨密度を高くするＬＲＰ５Ｇｌ７ｌＶ変異はＭｅｓｄ−ＬＲＰ５相互作用を弱め、細胞表面に存在するＬＲＰ５受容体が少なくなる。同じようにＭｅｓｄ−ＬＲＰ５相互作用を乱し、骨形成または骨再構築によって骨密度を増す化合物が見いだされた。
【００２４】
Ｗｎｔ活性（が高い状態は、多くの癌と関連してきた。ＬＲＰ５受容体の第２のドメインへのＷｎｔの結合を乱すことで、このＷｎｔ活性を落とし、Ｗｎｔ活性を阻害するとともに、Ｗｎｔ活性の増大を特徴とする腫瘍および増殖を治療する化合物が見いだされた。
【００２５】
Ｗｎｔシグナル伝達は骨形成の正の調節因子であることが分かっている。Ｗｎｔ活性を高めて骨形成、骨形成または骨再構築を助長することができる化合物も同定された。
【００２６】
Ｄｋｋは、ＬＲＰ５受容体の第３のドメインに結合またはこれと相互作用すると、Ｗｎｔアンタゴニストとして働く。Ｄｋｋ−ＬＲＰ５相互作用を阻害して骨の形成または再構築を助長する化合物が同定された。ひとつの化合物であるＮＣＩ３６６２１８の骨芽細胞分化を組織培養モデルで試験した。ＧＦＰを骨芽細胞のマーカーとして利用できる、２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーター（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）で制御される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジーンを持つ３ヶ月齢のマウスから骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を単離した。８日目と１２日目に、培養をＮＣＩ３６６２１８化合物で処理した。同じ日に、培養を対照としてのＤＭＳＯでも処理した。細胞をＮＣＩ３６６２１８で処理した後、ＤＭＳＯで処理した場合よりも多くの細胞がＧＦＰ陽性になった。これらの結果から、ＮＣＩ３６６２１８化合物が骨芽細胞の分化を刺激することが分かる。ＷｎｔのＤｋｋによる阻害を減弱する化合物（ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２など）には、骨粗鬆症および他の骨疾患を治療する潜在的な治療用途がある。
【００２７】
ＷｎｔおよびＤｋｋは、間葉系幹細胞の増殖と分化を調節することが分かっている。骨形成を調節し、造血（ｈｅｍａｅｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞を発達・分化させるためのメセンチル（ｍｅｓｅｎｃｈｙｌ）幹細胞調節因子として機能する化合物が同定されている。
【００２８】
Ｗｎｔは造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞の増殖と分化を調節することが分かっている。骨形成を調節し、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにて幹細胞を増殖・増大させるための造血（ｈｅｍａｅｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞調節因子として機能する化合物が同定されている。
【００２９】
材料および方法
細胞培養、トランスフェクション、ＣＭの調製、ルシフェラーゼアッセイ。
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）株Ａ２９３Ｔとマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を維持し、上述したようにトランスフェクトした（１）。１０％ＦＣＳ含有α−ＭＥＭ中で前骨芽細胞株２Ｔ３およびＭＣ３Ｔ３を培養した。ルシフェラーゼアッセイのために、２４ウェルのプレートの細胞を５×１０４個／ウェルで播種し、リポフェクタミンプラス（インヴィトロジェン、カリフォルニア州）を製造業者が提案しているように用いて、１ウェルあたり０．５μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。通常、ＬａｃＺプラスミドを用いて、各トランスフェクションごとのＤＮＡ濃度を等しくした。トランスフェクションの２４時間後に細胞抽出物を回収した。上述したようにしてルシフェラーゼアッセイを実施した（１、２）。ＧＦＰの蛍光強度に対してルミネセンス強度を正規化した。Ｄｋｋ１−ＡＰ含有ＣＭを調製するために、６ウェルのプレートに細胞４×１０５個／ウェルでＨＥＫ細胞を播種し、１ウェルあたり１μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＣＭを回収した。
【００３０】
発現プラスミドの構成と変異誘発
高フィデリティの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕウルトラ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州）を用いるＰＣＲによって、ヒトＬＲＰ５、ＬＲＰ６、マウスＷｎｔ１、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２の野生型と変異体型を生成した。ＨＡエピトープタグまたはＦｌａｇエピトープタグを全長分子と変異体分子のＣ末端に導入した。これらの分子の発現をＣＭＶプロモーターによって駆動した。外部のソースからＬＥＦ−１レポーター遺伝子コンストラクトを得た（３）。
【００３１】
Ｄｋｋ１−ＡＰ結合アッセイおよび免疫沈降アッセイ。
２４ウェルのプレートに入れたＨＥＫ細胞にＬＲＰ５とその変異体をトランスフェクトした。１日後、細胞を冷たい洗浄緩衝液（ＢＳＡおよびＮａＮ３を含有するＨＢＢＳ）で洗浄し、マウスＤｋｋ１−ＡＰ条件培地を用いて氷上で２時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、溶解させた。ライセートを６５℃で１０分間加熱し、トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）ルミネセンスＡＰアッセイキットを用いてそのＡＰ活性を求めた。免疫沈降アッセイを上述したようにして実施した（４）。
【００３２】
細胞表面タンパク質のビオチン化
ＨＥＫ細胞に、ＬａｃＺ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞を氷冷ＰＢＳ中にて０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で標識し、上述したようにして洗浄し、溶解させた（５）。抗ＨＡ抗体およびＡ／Ｇアガロースタンパク質を用いて細胞ライセートを免疫沈降させた。
【００３３】
初代骨芽細胞培養
３ヶ月齢のマウスから得た骨髄間質細胞（ＢＭＳ）の骨芽細胞培養を上述したようにして生成した（６）。１０ｎＭのデキサメタゾン、８ｍＭβ−グリセロホスフェート、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下、細胞が骨原性分化するように誘導した。２日ごとに培地を交換した。
【００３４】
相同性モデリング
スイスプロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（エントリー名Ｑ９ＵＰ６６［８］）から得た配列を用いて、ＩＣＭ（モルソフト（Ｍｏｌｓｏｆｔ）Ｌ．Ｌ．Ｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））でＬＲＰ５の第３のＹＷＴＤ−ＥＧＦドメインの相同性モデルを構築した。ＬＤＬ受容体（低密度リポタンパク質）ＹＷＴＤ−ＥＧＦドメイン（ＰＤＢコード１ＩＪＱ［９］）をテンプレートとして選択した。
【００３５】
仮想スクリーニング
ＵＮＩＴＹＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のデータベースで、Ｇｌｕ４５６末端で６つのプロペラによって形成されたキャビティに適合できる化合物をスクリーニングした。次に、エネルギー最小化用のＦｌｅｘＸＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて候補化合物をＬＲＰ５ドメインのＤｋｋ１結合キャビティにドッキングさせた［１０］。以後の実験的な試験用に、計算で最も高い結合親和性を示した化合物を、米国国立癌研究所の癌治療・診断部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）発生学的治療プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）製剤合成＆化学部（Ｄｒｕｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｒａｎｃｈ）から得た。スクリーニングの第２ラウンドおよび第３ラウンドを、生化学的アッセイの結果に基づいて実施した。
【実施例】
【００３６】
１．ＬＲＰ５の欠失変異体
一組のＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲフラグメントをベクターにサブクローンし（ｓｕｃｌｏｎｅｄ）て、いくつかのＬＲＰ５欠失変異体を得た。第３および第４のドメイン（残基６４６から１１９８）の欠失がＬＲＰ５Ｒ１２となり、第１および第２のドメイン（残基１から６４６）の欠失はＬＲＰ５Ｒ３４、第３のドメイン（残基９４７から１１９８）の欠失はＬＲＰ５Ｒ１２４となった。（図１参照）。
【００３７】
２．ＬＲＰ５のドメインＩはＭｅｓｄによるＬＲＰ５の機能に不可欠である。
２．１ ＬＲＰ５の第１のドメインにおけるＧ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の輸送を乱す。
（Ａ）ＬＲＰ５とＭｅｓｄの相互作用
図２Ａに示すようにしてＨＥＫ細胞に発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を実施した。ＭｅｓｄにはＦｌａｇタグを付加し、ＬＲＰ５分子にはすべてＨＡタグを付加した。これらの結果から、ドメインＩのＧ１７１Ｖ変異はＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）とＲ１２とＭｅｓｄとのそうご作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱すが、ドメインＩＩＩのＥ７２１変異はこれらの相互作用に対して何ら影響を示さない（図２Ａ、レーン２および３）ということが分かった。
【００３８】
（Ｂ）ＬＲＰ５変異体は自ら細胞表面に効率よく存在することはない。
図２Ｂおよび図２Ｃに示すように、ＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１−４およびＲ１−４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養培地に分泌される膜貫通ドメインのないＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、条件培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心処理した。上清を抗ＨＡ抗体で免疫沈降（図２Ｃ）させるか、ＡＰアッセイに用いた（図２Ｄ）。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液にも溶解させ、ウェスタンブロッティングで分析した（図２Ｃおよび図２Ｄの下側のパネル）。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異が細胞表面に対するＬＲＰ５の提示を減弱することが分かる。
【００３９】
（Ｃ）細胞表面ＬＲＰ５レベルの評価
ＨＥＫ細胞に、ＬａｃＺ、野生型ＨＡ−ＬＲＰ５またはＨＡ−ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞表面をビオチン標識して抗ＨＡ抗体でＬＲＰ５分子を沈降させた後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を用いるウェスタン分析によって細胞表面ＬＲＰ５分子レベルを検出した（図２Ｅの上側のパネル）。免疫複合体におけるＬＲＰ５のレベルを下側のパネルに示す。これらの結果から、Ｇ１７１Ｖ変異体の細胞表面提示が減少することが分かる。
【００４０】
２．２ ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは同時発現されたＷｎｔの活性のＤｋｋ１による阻害に対する感受性が低い。
（Ａ）Ｇ１７１Ｖ変異が標準的Ｗｎｔシグナル伝達活性に対して及ぼす影響。
図３Ａに示すようにして、ＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＧＦＰ発現プラスミドと一緒に、ＨＥＫ細胞にプラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させた。「材料および方法」で説明したようにして溶解後の細胞のＧＦＰレベルとルシフェラーゼ活性を求め、ＧＦＰレベルに対して正規化した。ＬａｃＺをトランスフェクトした細胞の活性を１００％として、対照を得た。ＬＲＰ５タンパク質または抗ＬＲＰ６抗体が持つＨＡタグに特異的な抗体を用いて、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６、ＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現を検出した（図３Ａ）。これらの結果から、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）に比してＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が、それ自体または同時発現されたＷｎｔに対する形質導入シグナルでＬＥＦ−１依存性転写活性の増大につながらなかったことが分かる。
【００４１】
（Ｂ）Ｇ１７１ Ｖ変異が同時発現されたＷｎｔ１によって刺激された標準的シグナル伝達活性に対して及ぼす影響
図３Ｂに示すように、ＬＲＰ５ＷｔまたはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦレポーター、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎのプラスミドをトランスフェクトした。ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下、ヒトＨＥＫ細胞にＬａｃＺをトランスフェクトするか、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＷｎｔ１を同時トランスフェクトした。ウェスタンブロッティングでタンパク質の発現レベルを確認した（図３Ｃ）。Ｋｒｅｍｅｎ１およびＤＫＫ１の両方の存在下、ＷｎｔはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞でＬＲＰ５Ｗｔを発現しているものよりも高い活性を示した（図３Ｂ）。これらの結果から、Ｄｋｋ１の存在下では、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの方が野生型よりも多くのシグナルを伝達する（ｔｒａｎｄｕｃｅ）ことが分かる。
【００４２】
２．３ ＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合
図４に示すようにしてＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドとＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクトし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製したＣＭを用いて氷上でインキュベートした。「材料および方法」で説明したようにして、ＡＰ活性を任意単位（ＡＵ）で求めた。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図４Ｂに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ変異体を発現している細胞の方がＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりも明白なＤｋｋ結合が少ないことが分かる（図４Ａ）が、これは図２に示す細胞表面にＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖが少ないことと一致する。
【００４３】
３．Ｗｎｔ活性にはＬＲＰ５のドメインＩＩが必要である。
図５に示すようにＨＥＫ細胞にＬＥＦ活性レポータープラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。発現プラスミドＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖは、第２のドメインに点変異のあるＬＲＰ５受容体である。１日後、細胞を溶解させた。「材料および方法」で説明したようにして、溶解後の細胞のＧＦＰレベルとルシフェラーゼ活性を求め、ＧＦＰレベルに対して正規化した。図５は、ＬＲＰ５Ｗｔに比して、ＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９ＶがＷｎｔシグナル伝達を無効にできることを示している。これらの結果から、Ｗｎｔ活性にはドメインＩＩが必要だということが分かる。
【００４４】
４．Ｄｋｋによる阻害にはドメインＩＩＩが必要である。
４．１ ドメインＩＩＩの分析
（Ａ）ドメインＩＩＩの機能的分析
図６Ａに示すようにして、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミドおよび発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔ ＬＲＰ５とその変異体分子の発現を図６Ｂに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は依然としてＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４ではそうはいかなかった（図６Ａ）ということが分かり、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４はＷｎｔ共役受容体の機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在すると、Ｄｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった（図６Ａ）。このことから、Ｄｋｋ１による阻害にはドメインＩＩＩが必要なのかもしれないと考えられる。
【００４５】
（Ｂ）ＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対するＤＫＫ１−ＡＰの結合
図６Ｃに示すようにしてＨＥＫ細胞にＭｅｓｄプラスミドおよびＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクトし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製したＣＭを用いて氷上でインキュベートした。「方法および材料」で説明したようにして、ＡＰ活性を任意単位で求めた。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図６Ｃの右側のパネルに示す。これらの結果から、ＬＲＰ５Ｒ３４はＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であるということが分かる。（図６Ｃ）
【００４６】
４．２ Ｄｋｋ阻害に必要なドメインＩＩＩの相互作用表面でのアミノ酸残基の同定
（Ａ） 相互作用表面ＩＩＩでのＡｌａ置換変異の概略図
ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造（１３）に基づいて、ドメインＩＩＩの空間充填モデルを推定した。スイスプロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（エントリー名Ｑ９ＵＰ６６［１８］）から得た配列を用いて、ＩＣＭ（モルソフト（Ｍｏｌｓｏｆｔ）Ｌ．Ｌ．Ｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））でＤｋｋ１のドメインＩＩＩの相同性モデルを構築した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ＹＷＴＤ−ＥＧＦドメイン（ＰＤＢコード１ ＩＪＱ［２２］）をテンプレートとして選択した。この三次元構造に基づいて、本発明者らは、ドメインＩＩＩの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を生成した（図７Ａ）。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える機能を判断し、これを図７Ａに示す。変異体のうちの９つ（５％超）にＤｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が見られ、変異同一表面に局在する変異が含まれていた（図７Ａ）。
【００４７】
（Ｂ） 代表的な点変異がＬＲＰ５のＷｎｔ共役受容体活性に対して及ぼす影響
図７Ｂに示すようにして、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下側のパネルに示す。１９の変異のうち、Ｅ７２１変異でＤｋｋ１による阻害に対する最も強い影響が認められ、続いてＷ７８１、次がＹ７１９であった（図７Ｂ）。
【００４８】
５．ＬＲＰ５の特定ドメインと相互作用するスクリーニング化合物
５．１ ドメインＩＩＩをテンプレートとして用いたスクリーニング化合物
（Ａ） 仮想スクリーニング
ＵＮＩＴＹＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２）で、ドメインＩＩＩのキャビティに適合できる化合物をスクリーニングした。このデータベースは自由に検索可能なものであり、２５０，２５１の小さな化合物の配位を含む。公差０．３ÅのＲ７６４およびＥ７２１と、キャビティに向かってＴｒｐ７８１から３．２Å離れている公差１．０Åの疎水性中心からなるように検索クエリを設計した。化合物の柔軟性を考慮して、高速でコンホメーション的に柔軟な三次元検索［２１］に対応できるＵＮＩＴＹＴＭプログラムのディレクテッドトウィーク（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｗｅａｋ）アルゴリズムを適用した。
【００４９】
続いて、ＵＮＩＴＹＴＭプログラムを用いて得られた候補化合物を、リガンドをタンパク質結合部位に短時間かつ柔軟にドッキングさせる［４４］、エネルギー最小化用のＦｌｅｘｘＴＭプログラム（トリポスインコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．））でＤｋｋ１結合表面にドッキングさせた［１７］。Ｄｋｋ１認識に不可欠であることが分かっている、残基Ｅ７２１、Ｗ８６４、Ｙ７１９、Ｒ７６４、Ｄ８７７、Ｆ８８８、Ｇ７８２、Ｗ７８１およびＭ８９１（図７Ａ）を、計算時に考慮した。ドッキング手順に続いて、Ｄｋｋ１結合ポケットに結合する予測した機能に基づいて、ＣｓｃｏｒｅＴＭプログラムを用いて化合物をランク付けした。ＣｓｃｏｒｅＴＭでは、タンパク質リガンド複合体の個々のスコアリング機能がどれだけうまく果たされるかに基づいて、相対的なコンセンサススコアを生成した［８］。次に、ＣｓｃｏｒｅＴＭで手作業での最終的な目視検査を行った。コンセンサススコアが最も高かった４０の化合物をＮＣＩにリクエストしたが、入手不可のものがあったため１７の化合物を手に入れた。次に、これらの化合物でＤｋｋ−１結合アッセイを行った（セクション５参照）。これらの化合物のうちの３つが、ＬＲＰ−５に対するＤｋｋ１の結合に影響することが明らかになった。すなわち、ＮＣＩ１０６１６４（図８Ａ）はＤｋｋ１結合を３２％阻害し、一方ＮＣＩ３９９１４（図８Ｂ）およびＮＣＩ６６０２２４（図８Ｃ）はＤｋｋ１結合をそれぞれ６４５％および２７５％刺激した。ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４の刺激作用は、これらの化合物と第３のドメインのＤｋｋ１結合キャビティとの相互作用が促進されたことによるものかもしれない。この促進は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５の相互作用表面間に存在するギャップがブリッジされたことによる可能性がある。アントラ−９，１０−キノン（図９Ａ）は化合物ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４に共通の部分構造であるため、アントラ−９，１０−クニノン（ｑｕｎｉｎｏｎｅ）がＬＲＰ５との結合相互作用において鍵となる役割を果たしているのかもしれない。ＵＮＩＴＹＴＭプログラムの類似性検索アルゴリズムを用いて、アントラ−９，１０−キノンに近いＮＣＩデータベースに見られた化合物の二次元検索を実施した。次に、ＦｌｅｘＸＴＭプログラムを用いて上述したようにしてヒットしたものをドッキングさせた。スコアが最も高かった２５の化合物をＮＣＩから得て試験した。化合物ＮＣＩ６５７５６６（図９Ｂ）およびＮＣＩ３６６２１８（図１０Ａ）が、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１による阻害を逆転できた。図９Ｃに示すＮＣＩ３６６２１８由来のテンプレートを用いて新規な二次元類似性検索を実施し、１３の候補化合物を同定した。（後述するような）生物学的アッセイから、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋによる阻害を逆転させ、ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１結合を乱すには、ＮＣＩ８６４２（図１０Ｂ）が最適な化合物であることが分かった。
【００５０】
（Ｂ）生物学的アッセイ
生物学的アッセイを利用して、仮想スクリーニングで同定された化合物をスクリーニングした。
【００５１】
（１）Ｄｋｋ−Ｉ結合アッセイ
セクション２（図４）で説明したようにして、最初の２つのドメインがない全長ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４変異体を発現しているＨＥＫ細胞に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を実施した。１７の化合物からなる第１のバッチで、まずは全長ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１結合の阻害についてスクリーニングした。本発明者らは、ＮＣＩ１０６１６４がＤｋｋ１結合に対して６８％の阻害作用を示すのに対し、ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４はＤｋｋ１結合をそれぞれ６５４％および２７６％刺激することを明らかにした。（表Ｉ参照）
【００５２】
（ＩＩ）Ｗｎｔ活性アッセイ
Ｗｎｔシグナル伝達にはＬＲＰ５の第２および第３のドメインが必要であり、これらのドメインはおそらく、Ｗｎｔ分子と直接的に相互作用する。これらのドメインは広範囲にわたってアミノ酸配列が相同であるが、第３のドメインに結合する特定の化合物が最初の２つのドメインにも結合し、潜在的にＷｎｔ活性の阻害を引き起こしているという可能性がある。化合物の第２のバッチについては、まずＷｎｔ活性アッセイを用いてスクリーニングした上で、結合アッセイを用いてスクリーニングし、Ｄｋｋ阻害を逆転させる化合物がＬＲＰ５に対するＤｋｋ結合を阻害することを確認した。表ＩＩに示されるように、第２のバッチのうち２５の化合物をＷｎｔ活性アッセイでスクリーニングした。これらの化合物を以下の項目について調べた。１）基礎レポーター活性の阻害、２）Ｗｎｔ活性の阻害、３）Ｗｎｔ活性のＤｋｋによる阻害の逆転。表ＩＩに示されるように、２５の化合物のうちの１７がＷｎｔ活性を３０％よりも多く阻害することが明らかになった。ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ６５７５６６という２つの化合物が、Ｗｎｔ活性に影響せずにＷｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１による阻害を逆転させることが明らかになった。
【００５３】
どの化合物がＤｋｋによる阻害を逆転させるのかを判断するために、仮想スクリーニングを用いて化合物の第３のバッチを同定した。１３の化合物を同定し、Ｗｎｔ活性スクリーニングを行った。表ＩＩＩに示されるように、３つの化合物がＷｎｔ活性を大幅に阻害し、１つの化合物（ＮＣＩ８６４２）がＤｋｋによる阻害を有意に逆転させることが明らかになった。
【００５４】
図１１および図１２に示すように、ＮＣＩ８６４２およびＮＣＩ３６６２１８の両方をＷｎｔ活性アッセイおよびＤｋｋ結合アッセイでさらに特徴付けした。Ｄｋｋによる阻害を逆転させるにはＮＣＩ８６４２の方が効果的であった。ＮＣＩ８６４２にもＮＣＩ３６６２１８より広い範囲の有効濃度があった。どちらの化合物も、高い濃度でＷｎｔ阻害を示しはじめた。どちらの化合物も最初の２つのドメインのない全長ＬＲＰ５およびＬＲＰ５ Ｒ３４変異体に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を阻害するため、どちらの化合物もＤｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を乱してＤｋｋによる阻害を逆転させた。Ｄｋｋ１結合の阻害にはＮＣＩ３６６２１８よりもＮＣＩ８６４２の方が効果的であることが分かったが、これはＷｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋによる拮抗作用の逆転で有効性が増した結果と一致していた。
【００５５】
（ＩＩＩ）骨原性アッセイ
ａ）培養での骨原性アッセイ
Ｗｎｔは培養した骨芽細胞の増殖と分化を刺激し、Ｄｋｋはこの過程を阻害する。したがって、これらの化合物は骨形成量を増す。ＢＳＰ、オステオカルシン、コラーゲンの発現をはじめとする骨形成マーカーの発現または石灰化を調べれば、このことをモニターすることができる。２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーターによって駆動されるＧＦＰの発現もモニターした。図１３は、ＮＣＩ３６６２１８がＧＦＰ発現を刺激し、骨芽細胞の分化が増しているのではないかということを示している。図１４は、ＮＣＩ３６６２１８が石灰化を刺激することを示している。ＮＣＩ３６６２１８も頭蓋冠の有機培養（ｏｒｇａｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）で骨形成を刺激する。
【００５６】
ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの骨原性アッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏでのこれらの化合物の有効性についての試験を行い、これらの化合物がｉｎ ｖｉｖｏで骨形成量を増すのかどうかを判断することができる。頭蓋冠の外面と骨髄キャビティ内にさまざまな化合物用量を注入することができる。骨形成の増加については、組織学的に調べることができ、また、ｐＱＣＴ、ＤＮＸ、Ｘ線ラジオオートグラフィを用いて調べることもできる。
【００５７】
（ＩＶ）β−カテニンレベルアッセイ
Ｗｎｔシグナル伝達によってサイトゾルのＢ−カテニンを安定させる。このようにして得られるβ−カテニンのレベルによって、これらの化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を調べることができる。たとえば、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤｋｋ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物と組み合わせた化合物でマウスＬ１細胞を８時間処理した。対照として用いた細胞もＷｎｔ３ａ ＣＭまたはＤｋｋ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物だけで８時間処理した。特異的抗β−カテニン抗体を利用して、細胞ライセートでのβ−カテニンレベルをウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで測定した。化合物で処理した細胞のβ−カテニンレベルを、対照での場合と比較した。この方法を利用して、化合物を生物学的にスクリーニングしても構わない。［４９］
【００５８】
（Ｖ）ＬＲＰ５／６のＰＰＰＳＰ部位のリン酸化
最近になって、ＷｎｔがＬＲＰ５の細胞内ドメインにおいてＰＰＰＳＰモチーフでＬＲＰ５のリン酸化を刺激することが発見された（タマイ（Ｔａｍａｉ）ら、２００４）。リン酸化したＰＳＰＰＰに特異的な抗体を得て、Ｗｎｔ活性を調べるのに利用することができる（タマイら、２００４）。このアッセイの利点は、受容体の活性化だけしか測定しない点にある。このイベントに加わる化合物は、他のアッセイでスクリーニングされた化合物よりもＷｎｔ細胞内シグナル伝達イベントに影響する可能性が低い。たとえば、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤＫＫ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物と組み合わせた化合物でＨＥＫ細胞を１０〜６０分間処理した。対照として用いた細胞については、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＤＫＫ１−Ｗｎｔ３ａ ＣＭ混合物だけで６時間処理した。リン酸化ＰＰＰＳＰ部位に対する特異的抗体を用いて、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＰＰＰＳＰ部位のリン酸化をウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで測定した。リン酸化ＬＤＬＲ−ＰＰＰＳＰ部位のレベルに基づいて、Ｗｎｔ活性に対する影響を示す化合物をスクリーニングする目的で、化合物で処理した細胞を対照と比較した。この方法を利用して、化合物を生物学的にスクリーニングしても構わない。［４９］
【００５９】
５．２ ＬＲＰ５のドメインＩＩをテンプレートとして用いて化合物をスクリーニング
（Ａ）仮想スクリーニング
「材料および方法」で説明したような相同性モデリングを用いて、このドメインの構造を推定することができる。セクション４．２で説明したように、部位特異的変異誘発を利用して、Ｗｎｔシグナル伝達に必要な残基をマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法を用いて、このＷｎｔシグナル伝達表面に仮想スクリーニング法を適用した。ドメインＩＩはＷｎｔシグナル伝達に関与するため、ドメインＩＩをテンプレートとして用いて同定される化合物がＷｎｔシグナル伝達を上昇またはＷｎｔシグナル伝達を低減させる可能性がある。ドメインＩＩとドメインＩＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増大させる、２）Ｄｋｋ結合を低減させる、３）Ｄｋｋ拮抗作用を増大させるおよび／または４）Ｄｋｋ拮抗作用を低減させる可能性がある。
【００６０】
（Ｂ）生物学的アッセイ
セクション５．１（Ｂ）で説明した生物学的アッセイを用いて化合物を試験した。セクション５．１（Ｂ）、Ｉ〜Ｖで説明した方法で、Ｗｎｔ活性を増大または低減させる化合物を同定した。また、５．１（Ｂ）、Ｉで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１結合を促進または阻害する化合物を求めた。さらに、５．１（Ｂ）、ＩＩで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１拮抗作用を促進または阻害する化合物を求めた。
【００６１】
５．３ ＬＲＰ５のドメインＩをテンプレートとして用いて化合物をスクリーニング
（Ａ）仮想スクリーニング
「材料および方法」で説明したような相同性モデリングを用いて、このドメインの構造を推定することができる。図２で説明したように、部位特異的変異誘発を利用して、Ｍｅｓｄの結合と機能に必要な残基をマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法を用いて、このＭｅｓｄ結合表面に仮想スクリーニング法を適用した。ドメインＩはＭｅｓｄ機能に関与するため、ドメインＩをテンプレートとして用いて同定される化合物は、細胞表面へのＬＲＰ５提示を増大または低減させることでＷｎｔシグナル伝達を増大または低減させるおよび／またはＤｋｋ拮抗作用を増大または低減させる可能性がある。ドメインＩとドメインＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物はＷｎｔシグナル伝達を増大または低減させる可能性がある。ドメインＩとドメインＩＩＩは相同であるため、仮想スクリーニングで同定される化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増大させる、２）Ｄｋｋ結合を低減させる、３）Ｄｋｋ拮抗作用を増大させるおよび／または４）Ｄｋｋ拮抗作用を低減させる可能性がある。
【００６２】
（Ｂ）生物学的アッセイ
セクション５．１（Ｂ）、Ｉ〜Ｖで説明した方法で、Ｗｎｔ活性を増大または低減させる化合物を同定した。また、セクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１結合を促進または阻害する化合物を求めた。さらに、セクション５．１（Ｂ）、ＩＩで説明したアッセイを用いて、Ｄｋｋ１拮抗作用を促進または阻害する化合物を求めた。図２に示すアッセイで、Ｍｅｓｄ機能に影響する化合物を求めた。
【００６３】
６．ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のＣＲＤと相互作用する化合物のスクリーニング。
Ｗｎｔは、ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリの膜貫通受容体を介してシグナル伝達する。このｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、細胞膜を数回通り抜ける。ｆｒｉｚｚｌｅｄのＮ末端細胞外領域に局在する保存されたシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）がＷｎｔ結合部位として作用する。分泌されたｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質Ｆｒｚｂ−１がＣＲＤを含有し、Ｗｎｔシグナル伝達発現のアンタゴニストとして機能する。
【００６４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ８およびマウスから分泌されたＦｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３のＣＲＤの結晶構造が求められている。（ダン（Ｄａｎｎ）Ｃ．ら）Ｗｎｔ結合アッセイおよび変異誘発アッセイによってＷｎｔ結合部位も求められている。
【００６５】
６．１ 仮想スクリーニング
５．１（Ａ）で説明した仮想スクリーニング法を用いて、ＣＲＤと相互作用してＷｎｔシグナル伝達経路を調節する潜在的な化合物をスクリーニングした。−マウスタンパク質から得た周知のＣＲＤ構造をテンプレートとして用いて相同性モデルを作製した。他のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリメンバーまたはヒトｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質ＣＲＤ領域の相同性モデルを作製した。ＣＲＤ−Ｗｎｔ相互作用に関与する構造とアミノ酸に基づいて、エネルギー最小化法を利用して各化合物の生物学的活性をさらに試験するための化合物をスクリーニングした。生物学的活性が高かった化合物については、同様の構造クエリを用いて別の候補化合物を同定した。
【００６６】
６．２ 生物学的アッセイ
Ｗｎｔ−結合アッセイを利用して、化合物がｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質のＣＲＤ領域に対して及ぼす影響をスクリーニングした。ＣＲＤペプチド（またはｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質）が、検出可能なマーカー（Ｍｙｃ−タグなど）のある細胞の表面で発現された。化合物およびＷｎｔアルカリホスファターゼ融合タンパク質（Ｗｎｔ８−ＡＰなど）を含有する培地を用いた。インキュベーション後、免疫組織化学染色を利用して結合を求めた。候補化合物がＷｎｔ結合に対する影響を示したら、（５．１（Ｂ）で説明したような）他の生物学的アッセイを適用して、Ｗｎｔシグナル伝達に対する各化合物の影響を求めた。［２７，３８，１２］
【００６７】
７．Ｄｋｋと相互作用する化合物のスクリーニング
７．１ 仮想スクリーニング
Ｄｋｋ１の構造を解明し、セクション４．２で説明したようにして、ＫｒｅｍｅｎおよびＬＲＰ５／６に対するその相互作用表面を変異誘発でマッピングした。セクション５．１（Ａ）で説明した方法で仮想スクリーニングを実施した。ＬＲＰ５またはＫｒｅｍｅｎへのＤｋｋ結合を増大または低減させるか、あるいはＷｎｔのＤｋｋによる阻害を増大または低減させる化合物が明らかになった。
【００６８】
７．２ 生物学的（Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ）アッセイ
セクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したようにして、ＬＲＰ５に対するＤｋｋ結合を増大または低減させる化合物を求めた。また、細胞にＬＲＰ５ではなくＫｒｅｍｅｎをトランスフェクトしたこと以外はセクション５．１（Ｂ）、Ｉで説明したようにして、Ｋｒｅｍｅｎに対するＤｋｋ結合を増大または低減させる化合物を求めた。さらに、セクション５．１（Ｂ）、ＩＩ〜ＩＩＩで説明したようにして、Ｄｋｋ拮抗作用を増大または低減させる化合物を求めた。
【００６９】
８．Ｄｖｌドメインと相互作用する化合物のスクリーニング
Ｗｎｔ−ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体複合体によって細胞質のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）タンパク質が活性化される。これらのタンパク質は、標準的と非標準的の両方のＷｎｔシグナル伝達経路に不可欠である。Ｄｖｌタンパク質は、Ｎ末端のＤＩＸドメイン、中央のＰＤＺドメイン、Ｃ末端のＤＥＰドメインで構成される。これらの３つの保存ドメインは各々、異なるタンパク質に関連しているため、各々異なる経路で機能する。
【００７０】
ＤＩＸドメインはホモダイマーとして存在し、優勢に螺旋構造を形成する。パルスフィールド勾配ＮＭＲ研究でこれを判断した。ＤＩＸドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでアクチンストレスファイバおよび細胞質小胞への標的を媒介する。よって、これはＷｎｔシグナル伝達における分岐点を表す可能性がある。標準的Ｗｎｔシグナル伝達によるβ−カテニンの安定化には、Ｄｖｌのメンバランス（ｍｅｍｂｅｒａｎｃｅ）標的を伴う。マウスＤｖｌ２のＬｙｓ ５８、Ｓｅｒ ５９、Ｍｅｔ ６０は、アクチン相互作用に決定的に関与する。Ｌｙｓ ６８およびＧｌｕ ６９は細胞質小胞の局在化に重要である。
【００７１】
ＰＤＺドメインは、いくつかの分子と相互作用し、標準的と非標準的の両方のＷｎｔ経路で重要な役割を果たす。ツメガエルの三次元ＰＤＺドメイン構造が求められている（シェイット（Ｃｈｅｙｅｔｔｅ）ら）。化学シフト摂動ＮＭＲ分光法と結合アッセイを用いることで、ｆｒｉｚｚｌｅｄの保存されたモチーフＫＴＸＸＸＷとマウスＤｖｌ１のＰＤＺドメインとの間に直接的な相互作用があることが分かった。これによって、結合領域を判断することができる。（ウォング（Ｗｏｎｇ）ら）。
【００７２】
Ｄｖｌタンパク質のＤＥＰドメインは、Ｗｎｔ経路でＤｖｌ下流のエフェクタータンパク質にシグナルを伝達する。哺乳類の細胞におけるβ−カテニン活性の上方制御とＬｅｆ−Ｉによる転写の刺激には、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインが必要である。マウスＤｖｌ１ ＤＥＰドメインの構造が求められている。（ウォング（Ｗｏｎｇ）ら）Ｌｙｓ４３４、Ａｓｐ４４５、Ａｓｐ ４４８が、タンパク質−タンパク質相互作用において重要な役割を果たし、その変異であるＷｎｔ−１がＬｅｆ−１の活性化を誘導したことが分かっている。
【００７３】
８．１ 仮想（Ｖｉｔｕａｌ）スクリーニング
ＤＩＸドメインの二次構造と機能性残基が求められているため、既存のタンパク質ドメインのスクリーニングを用いて三次構造配置についての情報を得ることができる。潜在的な候補とこれについてのシミュレーションによって、結合分析用の候補化合物を生成できる。結合に影響する候補化合物を分析することができ、似たような化合物からなる新しいグループを生物学的にアッセイすることができる。ＰＤＺおよびＤＥＰの三次元構造は周知であるため、セクション５．１で説明した方法と似た仮想スクリーニング法を利用すればよい。この構造をテンプレートとして利用して、ヒトタンパク質ドメインまたは他の同様の機能的タンパク質ドメインの相同性モデルを作製することができる。特定の機能に関与する構造とアミノ酸とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングすることができる。各化合物の生物学的活性を試験することができる。高い生物学的活性を示す化合物については、同様の構造クエリを用いてさらに候補化合物を見つけることができ、生物学的活性をさらにアッセイすることになる。
【００７４】
８．２ 生物学的アッセイ
ＤＩＸドメイン小胞の局在化には、アクチン結合領域のアクチン結合阻害アッセイと、Ｘｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓの発現レベルを利用することができる。化合物の処理後は、タグ付きＤＩＸを含有する構成済みのベクターを細胞にトランスフェクトすることができる。続いて、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｎｓｃｅｎｃｅ）染色を利用して、アクチン結合阻害を求めることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、小胞局在化のＸｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓ レベルを検出することができる。
【００７５】
ＰＤＺドメインの初期スクリーニングにはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを利用することができる。ＤｖｌのＰＤＺドメインに結合するペプチド（Ｄｒｐ Ｃ末端領域など）を利用すればよい。ビーズに結合した精製後のタグ付きペプチドをＰＤＺドメインおよび各化合物と混合し、インキュベーション後に、抗体を使って結合した化合物を検出することができる。各化合物の結合効率の作用（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｆｆｅｃｔ）を求めることができる。
【００７６】
標準的Ｗｎｔ経路に影響する化合物をスクリーニングするには、ドメインにルシフェラーゼアッセイを用いればよい。細胞にＤｖｌドメインをトランスフェクトすることができる。これらの細胞を化合物と一緒にインキュベートすると、Ｗｎｔ／β−カテニン活性化ルシフェラーゼ活性をアッセイできるため、これによって各化合物の作用を測定できる。
【００７７】
続いて、化合物をその構造に基づいて分類し、同定された化合物をさらにスクリーニングする。タンパク質結合に影響する候補の化合物を同定したら、５．１（Ｂ）においてセクションで説明した他の生物学的アッセイを使って各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を判断することができる。［５７，６，５８，５５，７］
【００７８】
９． β−カテニンと相互作用する化合物のスクリーニング
β−カテニンは核へのＷｎｔシグナルの伝達を媒介することで、標的遺伝子を活性化させる。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニンの分解を防止し、β−カテニンが蓄積して後から核に転座してＴｃｆ／ＬＥＦファミリー（ｆａｍｉｌｉｙ）のタンパク質のメンバーとの間で転写活性化複合体を形成できるようにする。
【００７９】
β−カテニンならびに、これがアキシン、Ｌｅｆ、ＴＣＦおよび他のいくつかのタンパク質との間で形成する複合体の結晶構造が解明されている。この情報は、標準的Ｗｎｔシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニングに利用することができる。
【００８０】
β−カテニンは、ＡＰＣ、ＬＥＦ／ＴＣＦ、Ｅ−カドヘリン、コンダクチン（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ）／アキシンの結合部位であるＮ末端 アルマジロ反復配列を含有する。これらの結合部位はいずれも、β−カテニンのアルマジロ反復配列単位３〜８に局在している。因子の結合によってグルーブが占領されるため、他の競合するβ−カテニンパートナーが同時に結合することはできなくなる。
【００８１】
９．１ 仮想スクリーニング
セクション５．１で説明した仮想スクリーニングに近い改変ストラテジーを利用して、結合対象となるβ−カテニン相互作用の化合物を同定することができる。β−カテニンをテンプレートとして用いて、異なる種から得られるβ−カテニンの相同性モデルを生成することができる。ＬＥＦ／ＴＣＦ、アキシンおよびＡＰＣとの相互作用に関与する必須アミノ酸と構造とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングし、候補化合物のグループを作製することができる。上述したタンパク質はいずれもβ−カテニンの似たような位置を占めるため、生物学的アッセイを使って各化合物をスクリーニングすると、４つの相互作用がすべて試験される。初期の生物学的活性に基づいて、有効化合物の構造を分析し、似たような方法を使って化合物の新しいグループを試験する。別の生物学的アッセイを実施して、最も有効な化合物を同定してもよい。
【００８２】
９．２ 生物学的アッセイ
β−カテニンパートナーはいずれも似たような位置を占めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳およびタンパク質結合アッセイを利用して各化合物の有効性を求めることができる。タグ付きβ−カテニン、ＴＣＦ、ＡＰＣ、ＬＥＦまたはアキシンコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて転写して、翻訳することができる。対象となる化合物を用いてインキュベート後、イムノブロッティングを利用して結合を検出すればよい。Ｗｎｔ結合に影響する化合物を同定したら、セクション５．１（Ｂ）で説明したような他の生物学的アッセイを利用して、各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を判断することができる。［５２，４３，１６，５９，１１］
【００８３】
１０．ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子と相互作用する化合物のスクリーニング
調節因子ヌクレオタンパク質複合体のアセンブリと機能において構築的な役割を果たすＤＮＡ結合タンパク質に、リンパ球エンハンサー結合因子（ＬＥＦ）がある。これは、高移動度群（ＨＭＧ）ドメインによって特異的なヌクレオチド配列を認識する。ＴＣＲ−α遺伝子エンハンサーからの最適な結合部位を含有する１５塩基対のオリゴヌクレオチドデュプレックスと複合化したマウスＬＥＦ−ｌのＨＭＧドメインのソリューション（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）構造が解明されている。
【００８４】
１０．１ 仮想スクリーニング
セクション５．１で説明した仮想スクリーニングに近いストラテジーを利用して、ＨＭＧ−オリゴヌクレオチド結合と相互作用し、これによって遺伝子発現調節の活性に影響する潜在的な化合物をスクリーニングすることができる。構造に基づいて、ＨＭＧドメインを含有するタンパク質は、自らが結合する対象となるＤＮＡを屈曲させる。ＤＮＡの屈曲または結合能に影響する化合物はいずれも、遺伝子発現の調節に影響をおよぼす。周知の構造をテンプレートとして用いて、異なる種のＬＥＦ ＨＭＧドメインの相同性モデルを作製することができる。ＨＭＧ−オリゴ相互作用に関与するアミノ酸と構造とに基づいて、エネルギー最小化法を利用して化合物をスクリーニングすることができる。強制的に屈曲させるか、屈曲を禁止する化合物を選択する。ＤＮＡ結合（ｂｉｄｉｎｇ）活性を利用して化合物をスクリーニングした。生物学的活性がかなり高いか、かなり低い化合物についても、同様の構造クエリを用いて別の候補化合物（ｃｏｍｏｐｏｕｎｄ）を同定することができる。
【００８５】
１０．２ 生物学的アッセイ
ＤＮＡ結合アッセイを利用して、化合物をスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドとＨＭＧドメインを、これらの化合物と一緒にインキュベートする。ゲル遅延度アッセイを用いて、ＤＮＡ結合を求める。均一に１３Ｃ標識したＮＭＲを用いて結合実験を改変し、ドメインの屈曲を分析することができる。ＬＥＦ制御された遺伝子調節が直接影響するため、ルシフェラーゼアッセイも利用して化合物の影響を検出することができる。タンパク質の結合に影響している化合物を同定したら、５．１（Ｂ）で説明した他の生物学的アッセイを利用して各化合物がＷｎｔシグナル伝達に対して及ぼす影響を求めることができる。［３３］
【００８６】
１１． 他の何らかのＷｎｔシグナル伝達関連タンパク質と相互作用する化合物のスクリーニング
Ｗｎｔシグナル伝達に関与する別のタンパク質因子が存在する。将来的に、その構造を解明することができるかもしれない。相互作用表面構造に基づいて、セクション５で説明したようにして化合物をスクリーニングし、その生物学的活性を試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
図面の簡単な説明
【図１】野生型ＬＲＰ５とその欠失変異体の概略図を示す。
【図２】Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の輸送を乱すことを説明するための図である。図示のように、ＨＥＫ細胞に発現プラスミドをトランスフェクとした。１日後、この細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を実施した。ＭｅｓｄにはＦｌａｇタグを付加し、ＬＲＰ５分子にはすべてＨＡタグを付加した。Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ａ、レーン１および３）ならびにＲ１２とＭｅｓｄとの相互作用（図２Ｂ、レーン１および２）の両方を乱したのに対し、Ｅ７２１変異はこれらの相互作用に影響しなかった（図２Ａ、レーン２および３）。図２Ａおよび図２Ｂの下側のパネルは、免疫沈降用の等量のＷｔおよび変異体ＬＲＰ５投与量を示す。［ＨＥＫ細胞に、図示のＭｅｓｄプラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。］Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１−４およびＲｌ−４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養の上清に分泌されることのある膜貫通ドメインが欠如したＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、条件培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心分離した。上清を抗ＨＡ抗体によって免疫沈降（図２Ｃ）させるか、あるいはＡＰアッセイに利用した（図２Ｄ）。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液にも溶解させ、ウェスタンブロッティングで分析した（図２Ｃおよび図２Ｄの下側のパネル）。このデータから、Ｇ１７１Ｖ変異がＲ１２およびＲｌ−４の分泌を阻害することが分かる。図２Ｅは、細胞表面のＬＲＰ５を検出する結合アッセイを用いて、Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５の細胞表面輸送に干渉することを確かめるものである。細胞表面をビオチン標識し、ＬＲＰ５分子を抗ＨＡ抗体で沈降させた（図２Ｅ、上側のパネル）後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を用いるウェスタン分析で細胞表面のＬＲＰ５分子濃度を検出した。免疫複合体中のＬＲＰ５濃度を図２Ｅの下側のパネルに示す。
【図３】ＬＲＰ５のＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異が、同時発現したＷｎｔ活性のＤｋｋ１による阻害よりも影響されにくいことを示す。図３Ａの左側のパネルは、Ｗｎｔ1、ＨＢＭ Ｇ１７１Ｖ変異の存在下または非存在下でＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドと一緒に図示のようにＨＥＫ細胞にプラスミドをトランスフェクトしても、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）に比してＬＥＦ−１依存性転写活性が上昇しなかったことを示す。図３Ａの右側のパネルは、ＬＲＰ５タンパク質または抗ＬＲＰ６抗体のＨＡタグに特異的な抗体によって求めた、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６、ＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現レベルを示す。図３Ｂは、ＨＥＫ細胞にＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトすると、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎが、ＷｔまたはＧ１７１Ｖ ＬＲＰ５の存在下で図示のようになることを示す。Ｄｋｋが存在する場合、ＬＲＰ５Ｗｔを発現しているＨＥＫ細胞よりも、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現しているＨＥＫ細胞の方が、ＬＥＦ−１レポーター指標Ｗｎｔ活性が有意に高い。Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ、ＬＲＰ５のタンパク質発現レベルを、図３Ｃに示すようにしてウェスタンブロッティングで確認した。
【図４】ＬＲＰ５Ｇ１７１を発現している細胞の方が、ＬＲＰ５Ｗｔを発現している細胞よりもＤｋｋ１結合部位が少ないことを説明するための図（図４Ａ）である。図４Ｂは、トランスフェクション後のＷｔと変異体ＬＲＰ５の同じ量の発現を示している。
【図５】Ｗｎｔ活性にＬＲＰ５の第２のドメインが必要であることを示す。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミドと発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、ＬＥＦレポーター活性を上述したようにして測定した。図５に示す結果から、ＬＲＰ５ＷｔよりもＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖ（第２のドメインに点変異があるＬＲＰ５）の方がＷｎｔシグナル伝達を無効にする可能性があることが分かる。
【図６】Ｄｋｋによる拮抗作用にはＬＲＰ５の第３のドメインが必要であることを説明するための図である。図６Ａは、Ｄｋｋによる阻害に第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要であることを示している。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｅｎ１プラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は依然としてＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を増強できたが、ＬＲＰ５Ｒ３４はこれができなかったことから、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４のいずれかがＷｎｔ共役受容体機能を保持しているのではないかと考えられる。しかしながら、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在すると、Ｋｒｅｍｅｎの同時発現にもかかわらずＤｋｋ１はＷｎｔシグナル伝達を阻害することができなかった。このことから、Ｄｋｋ１による阻害には第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインが必要なのではないかと考えられる。ＬＲＰ５Ｗｔとその変異体分子の発現レベルを図６Ｂに示す。図６Ｃは、ＬＲＰ５Ｒ３４がＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であることを説明するための図である。図６Ｄは変異の概略図である。
【図７】ＷｎｔをＤｋｋで阻害するには、相互作用表面を構成している第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインのアミノ酸残基が必要であることを示す。図７Ａでは、ＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ繰り返しドメインの構造（１３）に基づいて第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの空間充填モデルを推定した。三次元構造に基づいて、第３のＹＷＴＤ繰り返しドメインの表面にＡｌａ置換変異を含有する１９のＬＲＰ５変異体を生成した。これらの変異体ＬＲＰ５タンパク質のＤｋｋ１による阻害に耐える能力を判断した。この変異体のうちの９つ（５％超）で、Ｄｋｋ１による阻害に対する感受性の変化が認められたが、いずれも同一表面に局在した変異を含有していた。図７Ｂでは、ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ活性レポータープラスミド、Ｋｒｅｍｉｎｌプラスミド、発現プラスミドをトランスフェクトした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下側のパネルに示す。１９の変異のうち、Ｅ７２１変異でＷｎｔのＤｋｋ１による阻害に対する最も強い影響が認められ、続いてＷ７８１、次はＹ７１９であった。ＬＲＰ５Ｇ１７１ＶでもＷｎｔのＤｋｋ１による阻害に対する影響が認められた。
【図８】米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））から得られた３種類の化合物の二次元構造を示す。ＮＣＩ１０６１６４（図８Ａ）はＤｋｋ１結合に対して６８％の阻害作用を示し、ＮＣＩ３９９１４（図８Ｂ）とＮＣＩ６６０２２４（図８Ｃ）はそれぞれ、Ｄｋｋ１結合を６５４％および２７６％増加させる。
【図９】ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４における共通の部分構造であるアントラ−９，１０−キノン（図９Ａ）の二次元構造を説明するための図である。図９Ｂは、ＮＣＩ ６５７５６６の二次元構造を示す。図９Ｃは、二次元の類似性探索に用いたテンプレートを示す。
【図１０】Ｄｋｋ１−ＬＲＰ５相互作用を特異的に妨害し、Ｄｋｋ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を逆転させる化合物であるＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８、図１０Ａ）とＮＣＩ８６４２（ＩＩＩＣ３、図１０Ｂ）の二次元構造を示す。
【図１１】ＮＣＩ３６６２１８とＮＣＩ８６４２がＤｋｋ１阻害を逆転させることを説明するための図である。ＨＥＫ細胞に、ＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＧＦＰ発現プラスミドと共にＬＲＰ５プラスミドをトランスフェクとした。次に、これらの細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８化合物とＮＣＩ８６４２化合物で処理し、続いて対照としてのＣＭ、Ｗｎｔ３ａ ＣＭまたはＷｎｔ ３ａ／Ｄｋｋ１ ＣＭ混合物で６時間処理した。ＤＭＳＯで処理した細胞のレポーター活性を１００％とした。図１１は、特定の濃度で、ＮＣＩ３６６２１８（図１１Ａ）とＮＣＩ８６４２（図１１Ｂ）がＷｎｔ活性のＤｋｋによる阻害を有意に逆転可能であることを示している。
【図１２】ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２がＬＲＰ５に対するＤｋｋ１の結合を阻害できることを示す。ＨＥＫ細胞に、ＭｅｓｄプラスミドとＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４とをトランスフェクトした。１日後、細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８とＮＣＩ８６４２で処理し、ｍＤｋｋ１−ＡＰを発現しているＨＥＫ細胞から調製した条件培地（ＣＭ）を用いて氷上でインキュベートした。ＡＰ活性を上述したようにして求めた。ＤＭＳＯで処理した細胞のＡＰ活性を１００％とした。図１２は、ＮＣＩ３６６２１８（図１２Ａ）とＮＣＩ８６４２（図１２Ｂ）が、ＬＲＰ５Ｗｔに対するＤｋｋ１の結合ならびにＬＲＰ５Ｒ３４に対するＤｋｋタンパク質の結合を阻害することを示している。
【図１３】ＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８）によって骨芽細胞の分化を刺激できることを説明するための図である。ＧＦＰを骨芽細胞のマーカーとして利用できる、２．３ＫｂのＣｏｌｌＡｌプロモーター（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）１１で制御される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジーンを持つ３ヶ月齢のマウスから骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を単離した。８日目と１２日目に、それぞれ９μＭと２６μＭのＩＩＣ８化合物で培養を処理した。これと同じ時点、対照としてのＤＭＳＯで培養を処理した。図１３は、ＢＭＳ培養をＩＩＣ８で処理した場合に骨芽細胞分化マーカー２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰの供給が開始された（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ）ことを示している。
【図１４】骨原性アッセイを示す。ＮＣＩ３６６２１８の存在下および非存在下で初代骨髄間質骨芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）を培養し、分化を誘導した。２０日後、骨形成過程を反映している骨芽細胞の石灰化がキシレンオレンジ染色で観察された。ＮＣＩ３６６２１８は石灰化を２倍刺激した。
【図１５】ＬＲＰ５Ｒ１２とＬＲＰ５Ｒ３４のどちらもＤｋｋ１結合部位を含有し、Ｄｋｋ１結合にはＲ３４のＥ７２１が必要であり、Ｇ１７１Ｖ ＬＲＰ５変異体が細胞表面に対するＤｋｋ結合を無効にし得ることを説明するための図である。図４Ａは、Ｄｋｋ１がＬＲＰ５Ｒ１２とＬＲＰ５Ｒ３４のどちらにも結合可能であるが、Ｒ１２ＧＶ（ＬＲＰ５Ｒ１２におけるＧ１７１Ｖ変異）およびＲ３４Ｅ（Ｅ７２１変異のあるＬＲＰ５Ｒ３４）でトランスフェクトした細胞では細胞表面に対するＤｋｋ１結合が有意に低かったことを示す。図４Ｂは、トランスフェクション後のＷｔと変異体ＬＲＰ５の同じ量の発現を示している。
【図１６】骨原性細胞でのＤｋｋ１とＷｎｔ７ｂの発現を説明するための図である。分化誘導後の異なる時点で骨髄間質細胞の細胞培養から全ＲＮＡを単離した。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲでＤｋｋとＷｎｔの発現レベルを求めた。Ｗｎｔ７ｂでは、分化誘導後にその発現に顕著な増加が認められた（図７Ａ）。Ｗｎｔ ７ｂがＬＥＦ−１レポーター遺伝子を刺激する能力を試験したところ、標準的Ｗｎｔ経路を刺激することができた（図７Ｂ）。図７Ｃは、マウス長骨部分のインサイチュハイブリダイゼーション画像である。この画像から、Ｄｋｋ１の大半が骨細胞で発現されることが分かる。図Ｄは、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｄｋｋ、ＬＲＰ、Ｗｎｔ、Ｆｚ間の相互作用について説明するための図である。
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【公表番号】特表２００８−５０５１９０（Ｐ２００８−５０５１９０Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７３６３（Ｐ２００７−５２７３６３）
【出願日】平成１７年５月１８日（２００５．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７１９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５３５４
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５００３３４０７０）エンゾー セラピューティクス， インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｎｚｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｏ Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｉｎｃ．， ５２７ Ｍａｄｉｓｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， ９ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００２２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５０６３８５８５２）
【出願人】（５０６３８４３２７）
【出願人】（５０６３８３９８４）
【出願人】（５０６３８５８６３）
【出願人】（５０６３８５８７４）
【出願人】（５０６３８３９３９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１８日（２００５．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７１９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５３５４
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５００３３４０７０）エンゾー セラピューティクス， インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｎｚｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｏ Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｉｎｃ．， ５２７ Ｍａｄｉｓｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， ９ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００２２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５０６３８５８５２）
【出願人】（５０６３８４３２７）
【出願人】（５０６３８３９８４）
【出願人】（５０６３８５８６３）
【出願人】（５０６３８５８７４）
【出願人】（５０６３８３９３９）
【Ｆターム（参考）】
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