“クリックケミストリー”架橋によって得られたヒアルロン酸誘導体
【課題】ヒアルロン酸又はその誘導体をからなるポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の提供。
【解決手段】多糖鎖の少なくとも1つが“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体をからなるポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体を用いる。関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科の分野において、また、生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのためのマトリックスとしてのその使用を記載する。
【解決手段】多糖鎖の少なくとも1つが“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体をからなるポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体を用いる。関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科の分野において、また、生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのためのマトリックスとしてのその使用を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、“クリックケミストリー(click chemistry)”架橋によって得られたヒアルロン酸誘導体に関する。
特に、本発明は、“クリックケミストリー”型の一つ以上の反応、特にアルキン誘導体とアジド誘導体との間の1,3-双極子付加環化(cycloaddition)によって架橋されたヒアルロン酸及び他のポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体、架橋度でモジュレートされ得る物理化学的及び流体力学的特性を有する、上記の誘導体から得られた生体適合性ヒドロゲル、二つの適切な誘導体化多糖類ブロックの間に共有結合を形成することによる上記ヒドロゲルの調製方法、及び関節内補充療法(viscosupplementation)、形成外科において、また、医療分野において生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのための細胞支持体及び/又はマトリックスとして及び腫瘍再建外科における薬用ゲルとしてのその使用に関する。また、これらの生物活性分子及び/又は巨大分子、即ち、生物学的に又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子が多糖類の上記架橋とそれに伴うヒドロゲル自体の形成の間に直接ヒドロゲルに物理的に組み込まれる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸(HA)は、D-グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンからなる天然の線状ヘテロ多糖であり、50,000〜13,000,000Daに変動し得る分子量は我々の生物体のコンパートメントごとに実際に存在する由来に左右される。HAが生理的に及ぼす役割は非常に多い: 多くの組織の細胞を機械的に支持すること、例えば、関節の潤滑、多くの生物学的及び生理的過程のモジュレーション(特に、膜受容体CD44との交互作用により仲介される増殖、移動及び細胞分化)。病状又は外傷によって損傷を受けた関節の軟骨の変性に関してHA保護作用は周知である: この状態において、炎症性サイトカイン、特にインターロイキン-1(IL-1)が関節腔に強い濃度で存在する。これらは、軟骨自体の崩壊を促進し、軟骨細胞増殖を阻止する(van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615)。種々の科学的な実験から、ヒアルロン酸がIL-1の作用と対照的であり、負の作用を大幅に低下させ、且つそれが注入される関節の軟骨組織に修復作用を及ぼすことができることが示されている(Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555)。更に、関節レベルで、滑液中に含有するヒアルロン酸は、緩慢な運動の間、粘性潤滑剤として作用し、一方、弾性特性の結果として、急速な運動の間、関節に影響し得る可能な外傷又は微視的損傷を吸収する。
HAの組織水和機能と瘢痕性機能も広範囲に知られ、創傷、潰瘍及び種々の種類の皮膚病巣の治療において、長く用いられる薬剤の調製に利用されている(例えば、Balasz A. et al., Cosmetics & Toiletries, 1984, 5:8-17)。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、いかなる供給源からも誘導できる; 例えば、ニワトリのとさか(EP 138572 B1)からの抽出又は発酵(EP 716688 B1)によって得ることができ、50,000〜3,000,000Daの範囲にある分子量を有することができる。
本特許出願の範囲に用いられる用語“ヒアルロン酸”は、ポリカルボン酸とその塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム塩の形での双方の多糖を意味する。
【０００３】
HA分子を供することができる多くの化学変性もまた、当該技術において、既知であり、実質的に下記のものである:
- 有機及び/又は無機塩基との加塩化(EP 138572 B1);
- HAと脂肪族、アルアリファチック(araliphatic)、脂環式、芳香族、環状及び複素環(HYAFF(登録商標))系のアルコールとのエステル化、エステル化%は用いられるアルコールの種類によって変動し得る(EP 216453 B1);
- HAと脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環(HYADD(登録商標))系のアミンとのアミド化、アミド化%は0.1〜50%の範囲にある(EP 1095064 B1)、
- 硫酸化度が1/4までのHAのO-硫酸化(EP 702699 B1);
- HAの脱アセチル化: N-アセチルグルコサミン画分は、好ましくは0.1〜30%の範囲にある脱アセチル化%において、脱アセチル化される(EP 1313772 B1);
- N-アセチルグルコサミン画分の第一ヒドロキシルの酸化から得られるHAの過カルボキシル化、過カルボキシル化度は0.1〜100%の範囲にある(HYOXX(登録商標)、特許出願EP 1339753)。
【０００４】
出発多糖の生体適合性、扱いやすさ及び使用施設を維持するが、これらのプロセスによって得られるポリマーは、それに適用される化学変性によっては、生理的環境における分解速度が異なり、水溶解度が異なり、機械的プロファイルが異なる可能性がある。
HAの化学変性は、更に、内部エステル化による多糖鎖の架橋からなり(EP 341745 B1)、分子量がより大きい網目構造(ACP(登録商標))を形成し、その密度は到達した架橋度に左右される; このプロセスは、生分解速度がより遅いこと及び出発基質に関して粘弾性と粘膜接着の特性がより高いことを特徴とする生体材料を得るのに有効である。
同様の重合特性を得るために、エポキシド(De Belder et al., WO 86/00912)、アルカリ溶液のジビニルスルホン(E.A. Balazs et al., US 4,582,865)、ビスカルボジイミド(J.W. Kuo et al., US 6,537,979)及び種々の他の試薬、例えば、ホルムアルデヒド、ジメチル尿素、エチレンオキシド、ポリイソシアネート(E.A. Balazs et al., UK 8420560)の場合のように、二官能性リンカーの導入による多糖の化学的架橋によって同様方法が示されている。
ヒアルロン酸の化学誘導体の架橋によるヒドロゲルの調製の他の個々の例は、D. Renier et al.(WO 02/18450)が、部分的N-脱アセチル化HAを用い、多成分反応によって架橋を得る方法、及びD. Bellini et al. (US 2005/0119219A1)が、光反応性エステル誘導体の光化学的処理後に多糖鎖の間の共有結合とそれに伴うゲルの形成を得る方法を記載している。
当該技術の状態の上記引例のほとんどに、形成外科の皮膚充填剤として、関節内病状の治療における関節内補充療法用の流体として、眼科手術の硝子体液の代用の材料として、術後付着の予防における粘膜接着材料として、組織工学における足場の調製用の生体材料として及び/又は生物活性分子放出システム用のマトリックスとして得られたゲルの使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】EP 138572 B1
【特許文献２】EP 716688 B1
【特許文献３】EP 216453 B1
【特許文献４】EP 1095064 B1
【特許文献５】EP 702699 B1
【特許文献６】EP 1313772 B1
【特許文献７】EP 1339753
【特許文献８】EP 341745 B1
【特許文献９】WO 86/00912
【特許文献１０】US 4,582,865
【特許文献１１】US 6,537,979
【特許文献１２】UK 8420560
【特許文献１３】WO 02/18450
【特許文献１４】US 2005/0119219A1
【特許文献１５】WO 03/101972
【特許文献１６】WO 2006/005046
【特許文献１７】WO 98/30575
【特許文献１８】EP 138572
【特許文献１９】EP 0716688
【特許文献２０】EP 138572 B1
【特許文献２１】EP 0216453 B1
【特許文献２２】EP 1095064 B1
【特許文献２３】PD2005A000242
【特許文献２４】EP0702699 B1
【特許文献２５】EP 0971961 A1
【特許文献２６】EP 0341745 B1
【特許文献２７】EP 1313772 B1
【特許文献２８】EP 1339753 A1
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615
【非特許文献２】Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555
【非特許文献３】Balasz A. et al., Cosmetics & Toiletries, 1984, 5:8-17
【非特許文献４】O. Diels, K. Alder, Ann. 1928, 460, 98
【非特許文献５】O. Diels, K. Alder, Ann. 1929, 470, 62
【非特許文献６】O. Diels, K. Alder, Ber. 1929, 62, 2081 2087
【非特許文献７】G.A. Pagani, A. Abbotto,“Chimica Eterociclica”, Ed. Piccin
【非特許文献８】R. Huisgen et al., Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507
【非特許文献９】R, Huisgen, Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613-628
【非特許文献１０】V. Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599
【非特許文献１１】C.W. Torφe et al., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064
【非特許文献１２】Z. Li et al., Tetrahedron Letters, 2004, 45, 3143-3146
【非特許文献１３】S. Chittaboina et al., Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2331-2336
【非特許文献１４】T. Hasegawa et al., Carbohydrate Research, 2006, 341, 35-40
【非特許文献１５】J. Ossipov et al., Macromolecules, 2006, 39(5), 1709-1718
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ヒアルロン酸の架橋誘導体の調製の技術の状態に記載され用いられたものと別の方法、著しい利点を有する別の方法を確認することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それ故、本発明の目的は、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程、
i)ヒアルロン酸、及び必要により他のポリカルボキシル化多糖又はそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成、
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応
を含む前記方法に関する。
本発明の目的は、更に、上記方法において、得られるポリカルボキシル化多糖類の同一架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型の反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記誘導体に関する。
【発明の効果】
【０００９】
用語“クリックケミストリー”は、具体的な特性、例えば、速さ、位置選択性、高収量を特徴とし、また、一般に20kcal/モル以上の高熱力学的推進力を有する種々のグループの化学反応を含み確認する。
“クリック”反応の中で、付加環化反応、例えば、ディールス-アルダー反応、特にフイスゲン(Huisgen)1,3-双極子付加環化が、本発明において、特に重要である。付加環化の一例は、二つの不飽和分子が反応して、π電子を用いた二つ新たなσ結合の形成により環状化合物を形成する反応からなる。
ディールス-アルダー反応(O. Diels, K. Alder, Ann. 1928, 460, 98; O. Diels, K. Alder, Ann. 1929, 470, 62; O. Diels, K. Alder, Ber. 1929, 62, 2081 2087)は、これらが4π電子(ジエン)系と2π電子(ジエノフィル)系を示すので付加環化[4+2]である。反応生成物は、置換シクロヘキサンである。ジエノフィルは、また、複素環の形成によって炭素と他の原子(例えば、酸素)との間に二重結合を含有することができる。
機序は、ほぼ確実に協調し、単一ステップでは: 必ずしも同じ程度でない場合であっても、新たな炭素-炭素結合の双方が同じ遷移状態で部分的に形成される。ディールス-アルダー反応は、それが環状化合物を形成することから、有効であるだけでなく、中でもそれが広範囲の試薬について大きい施設により行われるからである。反応は、ジエノフィルの電子-誘引置換基により支持されるが、簡単なアルケンも反応できる; 反応は、しばしば、試薬を簡単に混合することによって熱の生成と共に生じる。
1,3-双極子付加環化は、1,3-双極子と親双極性との間で、部分的に又は全体に飽和された、5-原子芳香族複素環を熱力学的に形成させることができる付加環化である。1,3-双極子は、八重線又は六重線双性イオンの形によって記載することができ且つアリル型(角のある構造)又はプロパルギル-アレン型をもつことができる化合物である。1,3-双極子は、中心原子として、N、O又はS原子を有し得る。中心原子としての窒素を有する1,3-双極子が最も重要である。プロパルギル(線状)タイプの窒素1,3-双極子の例は、アジド、ニトリリド(nitrilide)、ニトリルイミン、ニトリルイミン、ジアゾアルカン及び亜酸化窒素である。イソオキサゾール環とピラゾール環の構造において、1,3-双極子付加環化反応の適用は、それらの位置選択性(ほぼ全体の)と立体特異性のために特に重要である(G.A. Pagani, A. Abbotto,“Chimica Eterociclica”, Ed. Piccin)。
【００１０】
この種の反応の中で、フイスゲン[3+2] 1,3-双極子付加環化反応が特に興味深い(R. Huisgen et al., Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507): これらは、二置換1,2,3-トリアゾール環を特徴とする、単一誘導体を急速に高収量で形成することにつながる有機アジドと末端アルキン基を有する化学種の間の縮合反応である(R, Huisgen, Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613-628)。上記反応は、1,4-及び1,5-二置換トリアゾール環の混合物を生成する(図1を参照のこと)。
1,4-二置換1,2,3-トリアゾール環のみの形成につながる(図2)、2002年に、反応触媒として銅(I)を用いる可能性が発見されるまで、位置選択性を制御するために種々の試みがなされた(V. Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599; C.W. Torφe et al., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064; B.K. Sharples et al., WO 03/101972)。
この種の反応において、置換された第一アジド、第二アジド、第三アジド、芳香族アジドが用いられる。種々の官能基、例えば、エステル、酸、アルケン、アルコール、アミンの存在によって損なわれない前記反応には、アルキン末端基を有する多くの化合物が使用し得る。
アジドとアルキン間の同じ種類の反応は、アルキンが電子-誘引置換基を有する場合に、水性の環境中の穏やかな条件下で触媒の非存在下でも生じる(Z. Li et al., Tetrahedron Letters, 2004, 45, 3143-3146)。
いわゆる“クリックケミストリー”の分野の中で特に適切であるこの反応の実際的重要性は、末端アジド基とアルキン基を様々な有機分子に簡単に挿入することに由来する。続いて、これらの基は、種々の可能な官能性を有する他の化学種の存在下で互いも反応する。この優位性が、新たな結合の形成、それ故、新たな生成物は、位置選択性で、急速でなければならず、且つ高収量で行わなければならない、薬剤発見から表面科学まで、多くの部門において、特に有利であることがわかった。
【００１１】
例えば、フイスゲン反応は、1,2,3-トリアゾール環を含有する架橋によって単糖類や二糖類を急速に且つ効果的に結合するために(S. Chittaboina et al., Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2331-2336)、導入するのが難しい官能基を同様の方法で線状β-グルカンに結合するために(T. Hasegawa et al., Carbohydrate Research, 2006, 341, 35-40)、広範囲のデンドリマーの高収量による位置選択性の合成のために(V. Fokin et al., WO 2006/005046)、オリゴヌクレオチドやタンパク質のような巨大分子と他の分子的実体とのカップリングのために(W. Pieken et al., WO 98/30575)、トリアゾール基を含有するリンカーによってポリビニルアルコールを架橋するために(J. Ossipov et al., Macromolecules, 2006, 39(5), 1709-1718)、近年実際に用いられている。
付加環化反応は種々のタイプの化学誘導体を得る一般の合成手順であるとして知られるが、本発明による方法は、多糖鎖の少なくとも一つが充分にモジュレートされ得る既知の架橋度を有するヒドロゲルの生成において、ヒアルロン酸又はその誘導体 - 他のウロナン(uronane)や一般ポリカルボン酸塩としても - の適切に官能基化された鎖からなる、ポリカルボキシル化多糖類の“クリックケミストリー”反応による架橋を想定している。
本発明による方法の特に有利な態様は、架橋反応が望ましくない副生成物を形成せずに異なる分子の存在下で行われ得るという事実にあり、従って、特に、新たなタイプの生体適合性材料の生成、及びヒドロゲルの形成工程において、直接に種々のタイプの生物活性分子の取り込みだけでなく、放出システムのマトリックスにおいて、また、再建外科用又は遺伝子療法用の薬用ゲルにおいて、細胞物質の取り込みを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】1,3-双極子付加環化による1,2,3-トリアゾールの形成を示すスキームである。
【図２】アジドとアルキン間の“クリック”反応を示すスキームである。
【図３】本発明に記載される架橋生成物を示す一般構造である。
【図４】付加環化反応に使用し得る多糖ブロックa)及びb)を示す一般構造である。
【図５】ヒアルロン酸鎖がフイスゲン付加環化(アジド-アルキン)によって得られたヒドロゲルの写真である。
【図６】アジドとアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋したゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図７】アジドとアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋したゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図８】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物の構造である。
【図９】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とプロパルギルアミンとの反応生成物の構造である。
【図１０】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１１】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物と11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンとの反応生成物の構造である。
【図１２】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とHANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物とのヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図１３】ヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースの混合ヒドロゲルの構造である。
【図１４】Hyaffllp50ヒドロゲルの構造である。
【図１５】Hyaff9p10ヒドロゲルの構造である。
【図１６】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１７】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１８】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とHANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物とのヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図１９】ヒドロゲル(触媒CuCl)に最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図２０】ヒドロゲル(触媒CuCl)に最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２１】ヒドロゲル(触媒CuSO4・5H2O)に最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２２】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,4-ジエチニルベンゼンの反応生成物の構造である。
【図２３】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,6-ヘプタジインの反応生成物の構造である。
【図２４】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,8-ノナジインの反応生成物の構造である。
【図２５】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とプロパルギルエーテルの反応生成物の構造である。
【図２６】1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図２７】1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２８】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図２９】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図３０】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図３１】1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図３２】1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的は、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程:
i)ヒアルロン酸、及び必要により他のポリカルボキシル化多糖又はそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成;
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応
を含む前記方法に関する。
本発明の目的は、また、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型の反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記誘導体に関する。
“クリックケミストリー”反応は、続いて前記反応に関係する末端官能基を導入するように、以前に変性された同じ多糖鎖の間の急速且つ有効な付加環化反応である。
本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の前記架橋多糖類及び医療分野において、特に、関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科において、生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の遺伝子治療のためのマトリックスとして及び放出制御システムのためのマトリックスとして、また、組織工学又は再生に用いられる細胞物質のための生体材料や支持体としてのそれらの使用に関する。
本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の架橋誘導体をマトリックスとして含む、生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システムに関する。特に、本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の架橋誘導体をマトリックスとして含む、遺伝子治療に用いられるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの放出制御システムに関する。
【００１４】
架橋誘導体、本発明の目的 - 及びそれから得られるヒドロゲル - は、分子が“クリック”反応の一つに反応性の末端基、例えば、アジド、アルキン、ジエン、アルケン、ニトリルオキシド、ジアゾアルカンを有するヒアルロン酸(及びその誘導体)及び/又は他のポリカルボキシル化多糖類の簡単な誘導体化によって高収量がいわゆる“クリックケミストリー”ドメインに属している簡単で急速な反応によって水性溶媒中で調製できる。また、驚くべきことに、これらの多糖誘導体及びヒドロゲルの形成反応の間、上述のものと異なる多くの種類の官能基を有する他の分子が、望ましくない副生成物を形成せずに且つ付加環化反応の速度、収量及び可能な位置選択性に影響せずに反応混合物中に存在し得ることがわかった。このことは、広範囲の簡単な生物活性分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び他のポリマーが、これらの調製方法の間に直接本発明の目的のヒドロゲルに物理的に組み込まれ得ることを意味する。
特に、このようにして得られた材料は、これらが同じ多糖類の再建による生物体において、生体適合性で分解可能である多糖類及び低毒性、トリアゾールの場合のように抗菌活性さえも有する分子に由来するので、良好な生体適合性を特徴とする。本発明に使用し得るヒアルロン酸は、例えば、ニワトリのとさか(EP 138572)からの抽出によって又は発酵(EP 0716688)によっていかなる供給源にも由来することができ、分子量が400〜3,000,000Da、特に、50,000〜1,000,000Daの範囲にあり得る。
架橋誘導体の調製に必要な中間体の調製に使用し得るヒアルロン酸誘導体、本発明の目的は、以下のものである:
1)有機塩基及び/又は無機塩基による塩、また、生物学的に活性なもの(EP 138572 B1);
2)HYAFF(登録商標): ヒアルロン酸と脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環系のアルコールとのエステル、エステル化%は、アルコールタイプ及び使用するアルコールの長さによって変動し得るが、ポリマーがなお水溶性でなければならず且つ遊離カルボキシル基を含まなければならないので、90%以下である(EP 0216453 B1);
3)HYADD(登録商標): 脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環系のアミンを有するヒアルロン酸のアミド、アミド化%は、ポリマーがなお水溶性でなければならないので、50%以下である(EP 1095064 B1);
4)ヒアルロン酸又はその誘導体と異なるファミリーに属する抗腫瘍活性を有する薬剤との間に直接又は間接の合成によって(分子スペーサを介して)得られる生体結合生成物(イタリア特許出願PD2005A000242);
5)ヒアルロン酸のO-硫酸化誘導体(EP0702699 B1)及びN-硫酸化誘導体(EP 0971961 A1);
6)ACP(登録商標): ヒアルロン酸の内部エステル、エステル化%は、ポリマーがなお水溶性でなければならないので、20%以下である(EP 0341745 B1);
7)HAの脱アシル化生成物: N-アセチルグルコサミン画分が脱アセチル化され、脱アセチル化%は、好ましくは0.1〜30%の範囲にある(EP 1313772 B1);
8)N-アセチルグルコサミン画分の第一ヒドロキシルの酸化から得られるHAの過カルボキシル化生成物(HYOXX(登録商標) EP 1339753 A1))。
【００１５】
本発明による架橋方法に使用し得るヒアルロン酸及びその上記誘導体の遊離カルボキシル基は、カルボン酸、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のグループに属する元素、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムのカチオンのカルボキシ化塩、又はテトラアルキルアンモニウムイオン、好ましくは、テトラブチルアンモニウム、ベンザルコニウム、2-クロロ-1-メチルピリジン、セチルピリジンのカルボキシ化塩の形で存在できる。
架橋誘導体の調製に使用し得る他の天然又は合成のポリカルボキシル化多糖類、本発明の目的は、例えば、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン、硫酸化デルマタン、硫酸化ヘパラン、硫酸化ヘパリン(又はこれらのそれぞれの塩)のグループに属するものだけでなく、他の天然多糖類、例えば、アルギン酸又はその塩、また、合成多糖類、例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)又はこれらの塩である。
それ故、本発明は、図3に一般的に記載される架橋多糖構造を有する誘導体に関し、ここで、図示されるように、架橋に関係する二つ鎖の少なくとも一つは、ヒアルロン酸、又は以前に記載されたその誘導体の一つであり(この場合、ヒアルロン酸基は、単に説明のために示されている)、第二鎖は、同じか又は他のいかなるポリカルボキシル化多糖でもあり得る、ここで、順次:
- X1及びX2は、独立して、O基、NH基、OC(O)基、S基であり得る(又はカルボン酸誘導体は、それぞれ、エステル、アミド、無水物、チオエステルであり得る);
- R1及びR2は、独立して、場合によりヘテロ原子を含有してもよい、1〜20に変動する多くの炭素原子で置換された又は置換されていない脂肪族鎖、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特に他のトリアゾール基であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有し得るか又は生物活性分子の誘導体であり得る;
- Cycは、環内のC原子の数が3〜8の範囲にある、飽和又は不飽和の置換された又は置換されていない脂環式、芳香族又は非芳香族系の残基、好ましくは、置換シクロヘキセン又は置換シクロヘキサン; 又は飽和又は不飽和の置換された又は置換されていない複素環系、芳香族又は非芳香族の残基、好ましくは置換トリアゾールであり得る。
【００１６】
Cyc基は、場合によりそれ自体の生物活性を有してもよい; Cyc基は、いずれにせよ、本特許出願において、定義したように、クリックケミストリーの範囲に属する付加環化反応の生成物でなければならない。
上記架橋生成物は、それぞれ化学構造を有するように二つ以上の変性多糖ブロック間に一つ以上の共有化学結合が形成する一つ以上の付加環化反応よって得られる(図4を参照のこと)。
単に説明のために、図4における双方の多糖ブロックは、そのカルボキシル基の一部のレベルで適切に官能基化されたヒアルロン酸イオンからなるが、二つブロックの一方は、同様に変性された異なるポリカルボキシル化多糖によって示すことができる。
図4の構造において、X1基、R1基及びY1基は、以下のように定義される:
- X1及びX2は、独立してO基、NH基、OC(O)基、S基であり得る(即ち、カルボン酸誘導体は、それぞれ、エステル、アミド、無水物、チオエステルであり得る);
- R1及びR2は、独立して、場合により、ヘテロ原子、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特に他のトリアゾール基を含有してもよい、炭素原子の数が1〜20に変動する置換された又は置換されていない脂肪族鎖であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有することもでき又は生物活性分子の誘導体でもあり得る;
- Y1及びY2は、本特許出願に従って定義されるように、“クリックケミストリー”の範囲に属する付加環化反応において、互いに反応できる基を含有する残基、好ましくは、ディールスアルダー付加環化又は1,3-双極子付加環化において、互いに反応できる基を含有する残基である。より詳しくは、対(Y1、Y2)は、一組の(1,3-不飽和ジエノフィル)、又は(1,3-双極子、親双極性)タイプである、ここで:
- 1,3-不飽和化合物は、1,3-ジエン(共役ジエンとも呼ばれる)の誘導体、好ましくは1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれる;
- ジエノフィル化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれる;
- 1,3-双極子化合物は、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれる;
- 親双極性化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる。
【００１７】
本発明に従って架橋生成物を形成するブロックとして使用し得る、図4に示される多糖誘導体は、ヒアルロン酸 - 又はその塩又は誘導体から - 又は他のポリカルボキシル化多糖 - 又はその塩又は誘導体から - 出発して、当該技術の状態において、すでに知られる手順及び手段に従って、カルボキシル自体又は、エステル化の場合には、エステル化アルコールの活性化の後に、カルボキシルレベルのエステル化、アミド化、チオエステル化の反応又は無水物の形成によって簡単に調製し得る。
それ故、本発明の架橋誘導体の調製方法は、以下の二工程を含む:
i) ヒアルロン酸、場合により、他のポリカルボキシル化多糖又はそれらのそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成;
ii) 鎖間の共有結合の形成による合成誘導体との間の付加環化反応。
本発明に用いられる付加環化反応は、いわゆるクリックケミストリー範囲に属し、その結果として、望ましくない副生成物を生じない特性に加えて、急速で、簡単で、効率的で、更に、関係する基が適切に選ばれる場合には、位置選択性である特性を有する。本特許出願の範囲において、用いられる“クリック”反応の理想的な条件は、水性溶媒の使用を想定しているが、有機溶媒、合成(多糖塩又は誘導体)に関係する化学種がその中で、又は混合溶媒中に可溶性である場合には、好ましくは非プロトン性極性有機溶媒を代わりに選ぶ可能性を除外しない。反応混合物における単一多糖誘導体の濃度は、多糖の種類及び誘導体の種類によって通常1〜500mg/ml、好ましくは5〜100mg/mlの範囲にある。いずれの場合においても、反応温度は、通常4〜60°C、特に15〜40°Cの範囲にあるが、架橋生成物、その結果としてヒドロゲルの形成は、数秒〜30分間、特に数秒〜10分間に変動する撹拌時間後に行われる。
付加環化反応は、水性反応混合物中に1〜50mg/ml、好ましくは1〜5mg/mlの範囲にある最終濃度で存在する、Cu(I)塩の方の触媒作用によって又はその場でCu(I)を生成する系、好ましくはCu(II)塩(例えば、CuSO4)及びアスコルビン酸をからなる触媒濃度での系の触媒作用によって又は上記反応性基についての置換基が同じ反応をこれらの条件でも急速で効率的にする場合には、いかなる触媒も存在させずに行うことができる。
【００１８】
本発明の目的で上記反応によって得られるヒドロゲルは、水又は溶媒を更に吸収すると共に膨潤する能力を有し、これらの特性の一つが、達成される架橋度に従ってモジュレートされ得る粘弾特性にある。特に、これらのヒドロゲルは、多少の粘性と粘膜接着性の流体の形で、又は壁-壁型の、その結果として機械的耐性がより大きい緻密な三次元構造で存在し得る(図5を参照のこと)。
要するに、ヒドロゲル、本発明の目的は、以下のパラメーターを考慮して得られモジュレートされ得る:
i.出発多糖類又はそれらの誘導体の分子量;
ii.架橋形成に続いて用いられる基に関連する、出発多糖類又はそれらの誘導体の誘導体化度;
iii.出発多糖類の誘導体の場合、架橋に係合しないカルボキシル基に結合される分子の種類及びそれらの誘導体化度;
iv.ゲルを得るために用いられる出発材料の濃度;
v.多糖とY1基間に可能なスペーサとして作用するR1基の種類;
vi.ゲルが調製される溶液の種類。
このように合成されたゲルは多糖マトリックスに由来するので、医療分野において、特に、関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科の分野において広範囲に適用される。
ヒドロゲルの形の架橋誘導体は、好ましくは、形成外科において皮膚充填剤として、腫瘍再建外科において充填剤として、遺伝子治療においてポリヌクレオチドの放出用マトリックスとして、組織工学において組織再生の細胞物質を含有する支持体として用いられる。
特に、軟骨及び滑液組織の変性疾患用の治療の最も広範囲に用いられ且つ有効な種類の一つが著しい粘弾特性を有する化合物の関節内注射である、骨関節分野において、上で指定される一つ以上のパラメーターの変化によって本明細書に記載されるヒドロゲルの流動学的特性をモジュレートする能力が、革新的医療装置の開発ための強力な道具であることがわかった。
【００１９】
更にまた、異なる方法を利用する本発明に記載される架橋法は、滑液腔に直接ヒアルロン酸(及び/又はその誘導体)からなるヒドロゲルを形成するために、関節内注射によって最初に第一成分を、次に第二成分をCu(I)に基づく触媒を存在させて又は存在させずに、最初は低粘度を有する溶液からなるので二つのより痛みを伴わない注射によって投与することにより用いられる。
骨関節分野における本発明の架橋誘導体の使用の他の利点は、ヒドロゲルの形の架橋ヒアルロン酸が、特に、より安定な結合、例えば、アミド結合によってカルボキシルレベルで誘導体化される場合には、投与の部位において、より長い滞留時間を可能にする、流体で注入される関節内補充化合物に関して、また、出発多糖又は本発明のその目的と異なる方法に従って架橋された多糖に基づいて、より長い化学分解時間を有するという事実にある。
この後者の驚くべき特性は、PBS 0.2Mにおいても人工血漿においても、HAの架橋誘導体(本特許出願の実施例3に記載されるようにヒドロゲルの形で得られる)の37°Cにおける生体外で分解実験の結果により証明され得る。
以下の表において、実際に、化学安定性と流体力学的安定性の評価パラメーターが、それぞれ、カルボキシルレベルの誘導体の置換度と動的粘度である、37°CにおけるPBS 0.2Mの分解試験に関する、ACP(登録商標)5%(自動架橋ポリマー、約5%のHAの内部エステル)と実施例3の生成物として記載される誘導体との間の比較データに注目されたい。試験は、既知量のそれぞれの誘導体を既知容量のH2Oに膨潤すると共に形成されたヒドロゲルを10mg/mlの化学種の濃度が得られるまでPBSで希釈することにより行った。37°Cでのインキュベーションの間、誘導体の置換度の減少と得られたヒドロゲルの粘度の低下が種々の観察時間の間にモニタされた。
【００２０】
【００２１】
生理的条件下の明らかな化学安定性に加えて、レオロジー性能の非常に長い維持も認められる。
それ故、同じ多用途性、粘弾性、生体適合性及び緩慢な生物分解性の特性は、本発明の架橋誘導体が形成外科の分野における皮膚充填剤として用いることを可能にする。
本発明のヒドロゲルの重要な特性は、広範囲の生物学的又は薬理的に活性な分子が、収量の反応速度と定量性にほとんど影響せずに、また、望ましくない副生成物の形成を引き起こすプロセスに関係せずに、多糖類の架橋の間にその中に組み込まれ得るという事実からなる。
本発明の方法に用いられる付加環化反応に関係する官能基は、実際に高度に特異的な反応性を特徴とするか又はいかなる場合でも組み込まれる分子に存在する機能がこれらの点で不活性であるように選ぶことができる。
それ故、本発明の目的は、一つ以上の生物学的に又は薬理的に活性な分子で充填された、以前に記載された方法によって得られる、ゲルの形での薬理的に活性な分子の放出制御システムの調製方法であって、これらの分子は、架橋される部分的多糖誘導体と一緒にゲルを形成する前に反応溶媒(これが水性にしても有機にしても)に溶解され、その後、架橋の後に形成されるポリマーマトリックスに物理的に且つ均一に組み込まれたままである、前記方法に関する。
本発明の生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムにおいて、生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子は、活性成分、例えば、タンパク質、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、細胞増殖抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、麻酔剤、鎮痛剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓薬、抗凝固薬、止血剤、局所、皮下、筋肉内又は関節内使用のための線維素溶解剤や血栓溶解薬剤より選ばれる。
ヒアルロン酸の適切なアジド及びアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋した後に得られるヒドロゲルの形のマトリックスに組み込まれた抗新生物薬(ドキソルビシン)及び抗炎症剤(ベンジダミン)の放出曲線を、説明のために下記に示す(更により詳細な説明のために実施例に関する項、特に実施例13を参照のこと)。
第一の例において、塩酸ドキソルビシンの最大量は、約50時間で放出され、ゲルに最初に組み込まれた量の50%に等しいことが認められる(図6を参照のこと)。
【００２２】
第二の図において、塩酸ベンジダミン塩の最大量は、約6時間で放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤量の80%に等しい(図7を参照のこと)。
ゲルの形の薬剤のこれらの放出制御システムは、多くの適用分野を、特に皮膚科、腫瘍学、呼吸器学及び骨関節の分野においてもち得る。
特に、関節内使用の場合、上記ゲルは、活性成分、例えば抗炎症性物質、メタルプロテアーゼ阻害剤、NOシンターゼ阻害剤又は関節症及び/又は関節炎の病状の治療のための他の生物学的に活性な分子を含有できるので、ゲルによって与えられる主に機械的な関節内補充作用を伴う一つ又は複数の有効成分の緩慢な放出を得る。
特に、本発明の目的は、癌塊を切除した後、腫瘍再建外科又は腫瘍神経外科における放出制御システムの使用であって、ヒドロゲルが、抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制剤及び/又は薬理的に活性な分子としてのそれらの前駆物質を含有する、前記使用に関する。
良好な生体適合性、緩慢な生分解及び著しい粘膜接着により示される特定の利点に基づいて、抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制薬を充填したこれらの放出制御システムの局所限局投与が、例えば、顔の手術の場合に、特に有効で有利であることがわかる。
実際に、これらの適用の形において、架橋多糖マトリックス自体の“充填剤”の機能は、再発新生物の形成を防止するために、前記マトリックスによってゆっくりと放出される薬剤の活性と関連している。
以前に記載された放出制御システムの可能な投与部位は、腫瘍塊の切除のための外科的介入に由来するそれらの組織腔又は空間すべてを含み、構造機能と充填機能及び薬理的活性双方を有する薬用ヒドロゲルの形で生体適合性生成物を導入することが適切である。特に、大脳新生物(例えば、悪性脳腫瘍)の切除後のくも膜下投与、大腸、膀胱、肝臓及び膵臓の腫瘍を切除した後の腹腔内投与、及び再建的乳房成形術の場合における乳房腫瘍を切除した後の投与が特に興味深い。
本発明の放出制御システムのこの適用形態に使用し得る薬理的に活性な分子の例は、既知の抗腫瘍活性又は細胞増殖抑制活性及び/又は場合によりその前駆物質を有するものすべて、特に上記新生物の治療に薬理的に有効な分子、好ましくはパクリタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン及びメトトレキセートである。
本発明のより良い説明のために以下の実施例を示す。
【実施例１】
【００２３】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの700kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。次に、以下の反応成分を順次添加した: 1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)及び0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン。この混合液を室温で24時間撹拌し、次にNaCl飽和溶液に対して24時間透析し(MWCO=12kDa)、次に一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物1(図8を参照のこと)を白色の粉末として回収した。
生成物1とプロパルギルアミンとの反応
500mgの生成物1を20mlの蒸留水に溶解した。次に、2mlのプロパルギルアミンと以前に調製した2mlの2%w/v CuCl水溶液を添加した。この混合液を室温で1時間撹拌し、この溶液をNaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物を白色粉末として回収した(図9を参照のこと)。
【実施例２】
【００２４】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、1.62gのNHSS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの200kDa HAナトリウム塩に添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物2(図10を参照のこと)を白色粉末として回収した。
生成物2と11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンとの反応
500mgの生成物2を、20mlの蒸留水に溶解した。次に、3mlの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン及び以前に調製した2mlの2%w/vCuCl水溶液を添加した。この混合液を室温で1時間撹拌し、この溶液を、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物を白色粉末として回収した(図11を参照のこと)。
【実施例３】
【００２５】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)及び0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で透析させ、凍結乾燥して、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色の粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。反応液を、室温で24時間撹拌し、次に、透析チューブ12kDaに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
水性溶媒中のヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。30mgのCuClを1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いてCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
【実施例４】
【００２６】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
1gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。478mgのEDC・HCl及び540mgのNHSS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、続いて次に1.65mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を、室温で8時間撹拌し、次に、12kDaのカットオフチューブ中でNaCl飽和溶液に対して、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物5(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。478mgのEDC・HCl及び540mgのNHSS、次に0.520mlのプロパルギルアミンを添加した。系を、室温で8時間撹拌し、次にNaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、フラスコに移した溶液を凍結させ、凍結乾燥して、生成物2を白色粉末として回収した。
BSAの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
20mlの1%w/vウシ血清アルブミン水溶液(BSA)を調製した; 次に、300mgの生成物5を6mlの上記溶液に完全に溶解し、次に、生成物2について類似の手順を続けた。2%w/v CuCl水溶液を、別々に調製した。ポリマーの溶液を混合し、続いて1mlのCuCl溶液を添加し、図12のゲルの形成まで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを恒量に達するまで蒸留水に対して透析した。
【実施例５】
【００２７】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。次に、1.43gのEDC・HCl(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを、順次添加した。この反応液を、室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を12kDaのカットオフ透析チューブに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
BSAの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
25mlの2%w/vウシ血清アルブミン水溶液(BSA)を調製した; 次に、400mgの生成物3と400mgの生成物4を8mlの上記溶液に完全に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いて、CuCl溶液を添加し、図12のゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを蒸留水に対して透析し、過剰のCuClを除去した。
【実施例６】
【００２８】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.86mgのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を12kDaのカットオフ透析チューブに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
IL-2の存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。0.5mgのインターロイキン2(IL 2)も0.5mlの水に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いてインターロイキン2の溶液を添加し、この混合液を軽く撹拌した。最後にCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。15mgの塩酸ドキソルビシンも1mlの水に溶解した。30mgのCuClを1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いて塩酸ドキソルビシンの溶液を添加し、この混合液を軽く撹拌した。最後にCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
【実施例７】
【００２９】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるCMCのアミド化
2gのCMC(カルボキシメチルセルロース)を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.57gのEDC・HCl、0.94mgのNHS、続いて2.71mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物6を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2.87gのEDC・HCl、1.72gのNHS、次に1.73mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10を参照のこと)を白色粉末として回収した。
水性溶媒中でのヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースの混合ヒドロゲルの形成
500mgの生成物6(CMC誘導体)を10mlの蒸留水に溶解し、同様にして生成物4を溶解した。2%w/v CuCl水溶液を別々に調製した。二つの異なるポリマーの溶液を混合し、次に1.50mlのCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図13)。次に、恒量に達するまでゲルを蒸留水に対して透析した。
【実施例８】
【００３０】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDa HAナトリウム塩を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.86mgのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、5.50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物5(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2.36gのEDC・HCl、1.41gのNHS、次に5.42mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gのCMCに添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物7を白色粉末として回収した。
水性溶媒/有機溶媒中でのヒアルロン酸とCMCの混合ヒドロゲルの形成
500mgの生成物5と500gの生成物7(CMC誘導体)を、5mlの蒸留水と5mlのNMPに別々に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、次に、CuCl溶液を添加し、混合ヒアルロン酸/カルボキシメチルセルロースゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、CuClと有機溶媒を除去し、前記透析を恒量のゲルに達するまで行った。
【実施例９】
【００３１】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHyaffllp50のアミド化
2gのHyaffllp50を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.32gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.79gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に3.04mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物8を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHyaffllp50のアミド化
1.32gのEDC・HCl、0.79gのNHS、次に0.95mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gのHyaffllp50に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物9を白色粉末として回収した。
水性溶媒/有機溶媒中でのHyaffllp50ヒドロゲルの形成
400mgの上記二つの誘導体8と9の各々を、4mlの蒸留水と4mlのNMPに別々に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、次に、CuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図14を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルに達するまで過剰のCuClを除去した。
【実施例１０】
【００３２】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHyaff9p10のアミド化
1gのHyaff9p10を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。470mgのEDC・HCl、530mgのNHSS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、続いて次に、1.60mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を室温で8時間撹拌し、次に、チューブ(カットオフ12kDa)内でNaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物8を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHyaff9p10のアミド化
1gのHyaff9p10を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。この溶液に、470mgのEDC・HCl、540mgのNHSS、次に530ml(3×)のプロパルギルアミンを添加した。この系を室温で8時間撹拌し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。この溶液をフラスコに移し、続いて、凍結させ、凍結乾燥し、生成物11を白色粉末として回収した。
水性溶媒中でのHyaff9p10ヒドロゲルの形成
300mgの生成物10と300mgの生成物11を、6mlの蒸留水に完全に、また、に別々に溶解した。2%w/v CuCl水溶液を別々に調製した。次に、ポリマーの溶液を混合し、1mlのCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図15を参照のこと)。次に、恒量のゲルに達するまで、ゲルを蒸留水に対して透析した。
【実施例１１】
【００３３】
EDCoHCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDaのHAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4 に溶解する。次に、2.90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、1.77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、及び5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコへ移し、液体窒素中で凍結させ、次に、凍結乾燥させる。生成物1を白色粉末として回収する(図16を参照のこと)。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2,90gのEDC・HCl、1,77gのNHS、次に1,73mlのプロパルギルアミンを、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの200kDa HAナトリウム塩に添加する。この反応液を室温で48時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=14kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液を、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物2(図17を参照のこと)を白色粉末として回収する。
BSAの存在下に水性溶媒中での触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
25mlの2%w/vウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を調製する; 次に、500mgの生成物1と500mgの生成物2を14mlの上記溶液に溶解する。続いて、50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた2mlの水性溶液と40mgのアスコルビン酸の4mlの水性溶液を添加し、数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図18を参照のこと)は、BSAタンパク質を組み込んでいる。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性溶媒中での触媒のCuClによる架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
29mgの塩酸ドキソルビシンを2mlの水に溶解し、次に、上記の通りに合成される50mgの生成物1と50mgの生成物2を添加する。続いて、この溶液に830μLの1%w/v CuCl溶液を添加し、溶液に存在する薬剤を直接組み込んだ数分後にゲルを形成する。
触媒のCuClによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約160時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の25%に等しい(図19を参照のこと)。
【００３４】
塩酸ベンジダミンの存在下に水性溶媒中で触媒のCuClにより架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
69mgの塩酸ベンジダミンを2mlの水に溶解し、次に、上記の通りに合成された50mgの生成物1と50mgの生成物2を添加する。
続いて、この溶液に830μLの1%w/v CuCl溶液を添加し、薬剤を直接組み込んだ数分後にゲルを形成する。
触媒のCuClによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlのリン酸緩衝液pH=7.4から放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約3.5時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の88%に等しい(図20を参照のこと)。
ベンジダミン塩酸塩の存在下に水性溶媒の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸により架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
50mgの生成物1と50mgの生成物2を、1,3mlの蒸留水に溶解し、別に13,8mgの塩酸ベンジダミンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液を塩酸ベンジダミンと混合する; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水性溶液と0,1mlの20mgのアスコルビン酸水溶液を添加する。
この混合液を数分間渦状に撹拌する。
急速に形成されたゲルは、塩酸ベンジダミンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約5時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の70%に等しい(図21を参照のこと)。
【実施例１２】
【００３５】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDaのHAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解する。次に、2,90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、1,77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、及び5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコへ移し、液体窒素中で凍結させ、次に、凍結乾燥させる。生成物1を白色粉末として回収する(図16を参照のこと)。
触媒のCuSO4・5H2O及びアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,4-ジエチニルベンゼンの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、150mgの1,4-ジエチニルベンゼンを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図22を参照のこと)を白色粉末として回収する。
【００３６】
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,6-ヘプタジインとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,13mlの1,6-ヘプタジインを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図23を参照のこと)を白色粉末として回収する。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,8-ノナジインとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,18mlの1,8-ノナジインを1,5 mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5 mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図24を参照のこと)を白色粉末として回収する。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1とプロパルギルエーテルとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,12mlのプロパルギルエーテルを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、続いて、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図25を参照のこと)を白色粉末として回収する。
【実施例１３】
【００３７】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解する。続いて、2,90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、1,77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、次に、5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。この反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、次に凍結乾燥する。生成物1を白色粉末として回収する。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中での触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し、3mgの1,4-ジエチニルベンゼンを0,2mlのDMSOに別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。三つの溶液を混合し、次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られる0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図26を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
上で示された構造に従って架橋した、水性/有機溶媒中で触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約50時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の5%に等しい(図27を参照のこと)。
【００３８】
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 9.86mlのDMSO中の140μlの1,6-ヘプタジインの溶液を別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とドキソルビシンの溶液と0.2mlの1,6-ヘプタジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1 mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図28を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約250時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の23%に等しい(図29を参照のこと)。
塩酸ベンジダミンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oによって得られる1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 9.86mlのDMSO中の140μlの1,6-ヘプタジインの溶液を別々に溶解し、13,8mgの塩酸ベンジダミンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とベンジダミンの溶液と0.2mlの1,6-ヘプタジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図28を参照のこと)は、塩酸ベンジダミンを内部に組み込んでいる。
【００３９】
上に示された構造に従って架橋された、触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約6時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の80%に等しい(図30を参照のこと)。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 11.23mlのDMSO中の200μlの1,8-ノナジインの溶液を別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とドキソルビシンの溶液と0.2mlの1,8-ノナジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌させる。急速に形成されたゲル(図31を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oによって得られた1,8-ノナジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記のヒドロゲルに行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約100時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の14%に等しい(図32を参照のこと)。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、“クリックケミストリー(click chemistry)”架橋によって得られたヒアルロン酸誘導体に関する。
特に、本発明は、“クリックケミストリー”型の一つ以上の反応、特にアルキン誘導体とアジド誘導体との間の1,3-双極子付加環化(cycloaddition)によって架橋されたヒアルロン酸及び他のポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体、架橋度でモジュレートされ得る物理化学的及び流体力学的特性を有する、上記の誘導体から得られた生体適合性ヒドロゲル、二つの適切な誘導体化多糖類ブロックの間に共有結合を形成することによる上記ヒドロゲルの調製方法、及び関節内補充療法(viscosupplementation)、形成外科において、また、医療分野において生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのための細胞支持体及び/又はマトリックスとして及び腫瘍再建外科における薬用ゲルとしてのその使用に関する。また、これらの生物活性分子及び/又は巨大分子、即ち、生物学的に又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子が多糖類の上記架橋とそれに伴うヒドロゲル自体の形成の間に直接ヒドロゲルに物理的に組み込まれる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸(HA)は、D-グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンからなる天然の線状ヘテロ多糖であり、50,000〜13,000,000Daに変動し得る分子量は我々の生物体のコンパートメントごとに実際に存在する由来に左右される。HAが生理的に及ぼす役割は非常に多い: 多くの組織の細胞を機械的に支持すること、例えば、関節の潤滑、多くの生物学的及び生理的過程のモジュレーション(特に、膜受容体CD44との交互作用により仲介される増殖、移動及び細胞分化)。病状又は外傷によって損傷を受けた関節の軟骨の変性に関してHA保護作用は周知である: この状態において、炎症性サイトカイン、特にインターロイキン-1(IL-1)が関節腔に強い濃度で存在する。これらは、軟骨自体の崩壊を促進し、軟骨細胞増殖を阻止する(van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615)。種々の科学的な実験から、ヒアルロン酸がIL-1の作用と対照的であり、負の作用を大幅に低下させ、且つそれが注入される関節の軟骨組織に修復作用を及ぼすことができることが示されている(Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555)。更に、関節レベルで、滑液中に含有するヒアルロン酸は、緩慢な運動の間、粘性潤滑剤として作用し、一方、弾性特性の結果として、急速な運動の間、関節に影響し得る可能な外傷又は微視的損傷を吸収する。
HAの組織水和機能と瘢痕性機能も広範囲に知られ、創傷、潰瘍及び種々の種類の皮膚病巣の治療において、長く用いられる薬剤の調製に利用されている(例えば、Balasz A. et al., Cosmetics & Toiletries, 1984, 5:8-17)。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、いかなる供給源からも誘導できる; 例えば、ニワトリのとさか(EP 138572 B1)からの抽出又は発酵(EP 716688 B1)によって得ることができ、50,000〜3,000,000Daの範囲にある分子量を有することができる。
本特許出願の範囲に用いられる用語“ヒアルロン酸”は、ポリカルボン酸とその塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム塩の形での双方の多糖を意味する。
【０００３】
HA分子を供することができる多くの化学変性もまた、当該技術において、既知であり、実質的に下記のものである:
- 有機及び/又は無機塩基との加塩化(EP 138572 B1);
- HAと脂肪族、アルアリファチック(araliphatic)、脂環式、芳香族、環状及び複素環(HYAFF(登録商標))系のアルコールとのエステル化、エステル化%は用いられるアルコールの種類によって変動し得る(EP 216453 B1);
- HAと脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環(HYADD(登録商標))系のアミンとのアミド化、アミド化%は0.1〜50%の範囲にある(EP 1095064 B1)、
- 硫酸化度が1/4までのHAのO-硫酸化(EP 702699 B1);
- HAの脱アセチル化: N-アセチルグルコサミン画分は、好ましくは0.1〜30%の範囲にある脱アセチル化%において、脱アセチル化される(EP 1313772 B1);
- N-アセチルグルコサミン画分の第一ヒドロキシルの酸化から得られるHAの過カルボキシル化、過カルボキシル化度は0.1〜100%の範囲にある(HYOXX(登録商標)、特許出願EP 1339753)。
【０００４】
出発多糖の生体適合性、扱いやすさ及び使用施設を維持するが、これらのプロセスによって得られるポリマーは、それに適用される化学変性によっては、生理的環境における分解速度が異なり、水溶解度が異なり、機械的プロファイルが異なる可能性がある。
HAの化学変性は、更に、内部エステル化による多糖鎖の架橋からなり(EP 341745 B1)、分子量がより大きい網目構造(ACP(登録商標))を形成し、その密度は到達した架橋度に左右される; このプロセスは、生分解速度がより遅いこと及び出発基質に関して粘弾性と粘膜接着の特性がより高いことを特徴とする生体材料を得るのに有効である。
同様の重合特性を得るために、エポキシド(De Belder et al., WO 86/00912)、アルカリ溶液のジビニルスルホン(E.A. Balazs et al., US 4,582,865)、ビスカルボジイミド(J.W. Kuo et al., US 6,537,979)及び種々の他の試薬、例えば、ホルムアルデヒド、ジメチル尿素、エチレンオキシド、ポリイソシアネート(E.A. Balazs et al., UK 8420560)の場合のように、二官能性リンカーの導入による多糖の化学的架橋によって同様方法が示されている。
ヒアルロン酸の化学誘導体の架橋によるヒドロゲルの調製の他の個々の例は、D. Renier et al.(WO 02/18450)が、部分的N-脱アセチル化HAを用い、多成分反応によって架橋を得る方法、及びD. Bellini et al. (US 2005/0119219A1)が、光反応性エステル誘導体の光化学的処理後に多糖鎖の間の共有結合とそれに伴うゲルの形成を得る方法を記載している。
当該技術の状態の上記引例のほとんどに、形成外科の皮膚充填剤として、関節内病状の治療における関節内補充療法用の流体として、眼科手術の硝子体液の代用の材料として、術後付着の予防における粘膜接着材料として、組織工学における足場の調製用の生体材料として及び/又は生物活性分子放出システム用のマトリックスとして得られたゲルの使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】EP 138572 B1
【特許文献２】EP 716688 B1
【特許文献３】EP 216453 B1
【特許文献４】EP 1095064 B1
【特許文献５】EP 702699 B1
【特許文献６】EP 1313772 B1
【特許文献７】EP 1339753
【特許文献８】EP 341745 B1
【特許文献９】WO 86/00912
【特許文献１０】US 4,582,865
【特許文献１１】US 6,537,979
【特許文献１２】UK 8420560
【特許文献１３】WO 02/18450
【特許文献１４】US 2005/0119219A1
【特許文献１５】WO 03/101972
【特許文献１６】WO 2006/005046
【特許文献１７】WO 98/30575
【特許文献１８】EP 138572
【特許文献１９】EP 0716688
【特許文献２０】EP 138572 B1
【特許文献２１】EP 0216453 B1
【特許文献２２】EP 1095064 B1
【特許文献２３】PD2005A000242
【特許文献２４】EP0702699 B1
【特許文献２５】EP 0971961 A1
【特許文献２６】EP 0341745 B1
【特許文献２７】EP 1313772 B1
【特許文献２８】EP 1339753 A1
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615
【非特許文献２】Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555
【非特許文献３】Balasz A. et al., Cosmetics & Toiletries, 1984, 5:8-17
【非特許文献４】O. Diels, K. Alder, Ann. 1928, 460, 98
【非特許文献５】O. Diels, K. Alder, Ann. 1929, 470, 62
【非特許文献６】O. Diels, K. Alder, Ber. 1929, 62, 2081 2087
【非特許文献７】G.A. Pagani, A. Abbotto,“Chimica Eterociclica”, Ed. Piccin
【非特許文献８】R. Huisgen et al., Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507
【非特許文献９】R, Huisgen, Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613-628
【非特許文献１０】V. Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599
【非特許文献１１】C.W. Torφe et al., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064
【非特許文献１２】Z. Li et al., Tetrahedron Letters, 2004, 45, 3143-3146
【非特許文献１３】S. Chittaboina et al., Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2331-2336
【非特許文献１４】T. Hasegawa et al., Carbohydrate Research, 2006, 341, 35-40
【非特許文献１５】J. Ossipov et al., Macromolecules, 2006, 39(5), 1709-1718
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ヒアルロン酸の架橋誘導体の調製の技術の状態に記載され用いられたものと別の方法、著しい利点を有する別の方法を確認することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それ故、本発明の目的は、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程、
i)ヒアルロン酸、及び必要により他のポリカルボキシル化多糖又はそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成、
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応
を含む前記方法に関する。
本発明の目的は、更に、上記方法において、得られるポリカルボキシル化多糖類の同一架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型の反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記誘導体に関する。
【発明の効果】
【０００９】
用語“クリックケミストリー”は、具体的な特性、例えば、速さ、位置選択性、高収量を特徴とし、また、一般に20kcal/モル以上の高熱力学的推進力を有する種々のグループの化学反応を含み確認する。
“クリック”反応の中で、付加環化反応、例えば、ディールス-アルダー反応、特にフイスゲン(Huisgen)1,3-双極子付加環化が、本発明において、特に重要である。付加環化の一例は、二つの不飽和分子が反応して、π電子を用いた二つ新たなσ結合の形成により環状化合物を形成する反応からなる。
ディールス-アルダー反応(O. Diels, K. Alder, Ann. 1928, 460, 98; O. Diels, K. Alder, Ann. 1929, 470, 62; O. Diels, K. Alder, Ber. 1929, 62, 2081 2087)は、これらが4π電子(ジエン)系と2π電子(ジエノフィル)系を示すので付加環化[4+2]である。反応生成物は、置換シクロヘキサンである。ジエノフィルは、また、複素環の形成によって炭素と他の原子(例えば、酸素)との間に二重結合を含有することができる。
機序は、ほぼ確実に協調し、単一ステップでは: 必ずしも同じ程度でない場合であっても、新たな炭素-炭素結合の双方が同じ遷移状態で部分的に形成される。ディールス-アルダー反応は、それが環状化合物を形成することから、有効であるだけでなく、中でもそれが広範囲の試薬について大きい施設により行われるからである。反応は、ジエノフィルの電子-誘引置換基により支持されるが、簡単なアルケンも反応できる; 反応は、しばしば、試薬を簡単に混合することによって熱の生成と共に生じる。
1,3-双極子付加環化は、1,3-双極子と親双極性との間で、部分的に又は全体に飽和された、5-原子芳香族複素環を熱力学的に形成させることができる付加環化である。1,3-双極子は、八重線又は六重線双性イオンの形によって記載することができ且つアリル型(角のある構造)又はプロパルギル-アレン型をもつことができる化合物である。1,3-双極子は、中心原子として、N、O又はS原子を有し得る。中心原子としての窒素を有する1,3-双極子が最も重要である。プロパルギル(線状)タイプの窒素1,3-双極子の例は、アジド、ニトリリド(nitrilide)、ニトリルイミン、ニトリルイミン、ジアゾアルカン及び亜酸化窒素である。イソオキサゾール環とピラゾール環の構造において、1,3-双極子付加環化反応の適用は、それらの位置選択性(ほぼ全体の)と立体特異性のために特に重要である(G.A. Pagani, A. Abbotto,“Chimica Eterociclica”, Ed. Piccin)。
【００１０】
この種の反応の中で、フイスゲン[3+2] 1,3-双極子付加環化反応が特に興味深い(R. Huisgen et al., Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507): これらは、二置換1,2,3-トリアゾール環を特徴とする、単一誘導体を急速に高収量で形成することにつながる有機アジドと末端アルキン基を有する化学種の間の縮合反応である(R, Huisgen, Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613-628)。上記反応は、1,4-及び1,5-二置換トリアゾール環の混合物を生成する(図1を参照のこと)。
1,4-二置換1,2,3-トリアゾール環のみの形成につながる(図2)、2002年に、反応触媒として銅(I)を用いる可能性が発見されるまで、位置選択性を制御するために種々の試みがなされた(V. Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599; C.W. Torφe et al., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064; B.K. Sharples et al., WO 03/101972)。
この種の反応において、置換された第一アジド、第二アジド、第三アジド、芳香族アジドが用いられる。種々の官能基、例えば、エステル、酸、アルケン、アルコール、アミンの存在によって損なわれない前記反応には、アルキン末端基を有する多くの化合物が使用し得る。
アジドとアルキン間の同じ種類の反応は、アルキンが電子-誘引置換基を有する場合に、水性の環境中の穏やかな条件下で触媒の非存在下でも生じる(Z. Li et al., Tetrahedron Letters, 2004, 45, 3143-3146)。
いわゆる“クリックケミストリー”の分野の中で特に適切であるこの反応の実際的重要性は、末端アジド基とアルキン基を様々な有機分子に簡単に挿入することに由来する。続いて、これらの基は、種々の可能な官能性を有する他の化学種の存在下で互いも反応する。この優位性が、新たな結合の形成、それ故、新たな生成物は、位置選択性で、急速でなければならず、且つ高収量で行わなければならない、薬剤発見から表面科学まで、多くの部門において、特に有利であることがわかった。
【００１１】
例えば、フイスゲン反応は、1,2,3-トリアゾール環を含有する架橋によって単糖類や二糖類を急速に且つ効果的に結合するために(S. Chittaboina et al., Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2331-2336)、導入するのが難しい官能基を同様の方法で線状β-グルカンに結合するために(T. Hasegawa et al., Carbohydrate Research, 2006, 341, 35-40)、広範囲のデンドリマーの高収量による位置選択性の合成のために(V. Fokin et al., WO 2006/005046)、オリゴヌクレオチドやタンパク質のような巨大分子と他の分子的実体とのカップリングのために(W. Pieken et al., WO 98/30575)、トリアゾール基を含有するリンカーによってポリビニルアルコールを架橋するために(J. Ossipov et al., Macromolecules, 2006, 39(5), 1709-1718)、近年実際に用いられている。
付加環化反応は種々のタイプの化学誘導体を得る一般の合成手順であるとして知られるが、本発明による方法は、多糖鎖の少なくとも一つが充分にモジュレートされ得る既知の架橋度を有するヒドロゲルの生成において、ヒアルロン酸又はその誘導体 - 他のウロナン(uronane)や一般ポリカルボン酸塩としても - の適切に官能基化された鎖からなる、ポリカルボキシル化多糖類の“クリックケミストリー”反応による架橋を想定している。
本発明による方法の特に有利な態様は、架橋反応が望ましくない副生成物を形成せずに異なる分子の存在下で行われ得るという事実にあり、従って、特に、新たなタイプの生体適合性材料の生成、及びヒドロゲルの形成工程において、直接に種々のタイプの生物活性分子の取り込みだけでなく、放出システムのマトリックスにおいて、また、再建外科用又は遺伝子療法用の薬用ゲルにおいて、細胞物質の取り込みを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】1,3-双極子付加環化による1,2,3-トリアゾールの形成を示すスキームである。
【図２】アジドとアルキン間の“クリック”反応を示すスキームである。
【図３】本発明に記載される架橋生成物を示す一般構造である。
【図４】付加環化反応に使用し得る多糖ブロックa)及びb)を示す一般構造である。
【図５】ヒアルロン酸鎖がフイスゲン付加環化(アジド-アルキン)によって得られたヒドロゲルの写真である。
【図６】アジドとアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋したゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図７】アジドとアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋したゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図８】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物の構造である。
【図９】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とプロパルギルアミンとの反応生成物の構造である。
【図１０】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１１】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物と11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンとの反応生成物の構造である。
【図１２】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とHANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物とのヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図１３】ヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースの混合ヒドロゲルの構造である。
【図１４】Hyaffllp50ヒドロゲルの構造である。
【図１５】Hyaff9p10ヒドロゲルの構造である。
【図１６】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１７】HANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物の構造である。
【図１８】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とHANaのプロパルギルアミンによるアミド化生成物とのヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図１９】ヒドロゲル(触媒CuCl)に最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図２０】ヒドロゲル(触媒CuCl)に最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２１】ヒドロゲル(触媒CuSO4・5H2O)に最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２２】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,4-ジエチニルベンゼンの反応生成物の構造である。
【図２３】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,6-ヘプタジインの反応生成物の構造である。
【図２４】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物と1,8-ノナジインの反応生成物の構造である。
【図２５】HANaの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるアミド化生成物とプロパルギルエーテルの反応生成物の構造である。
【図２６】1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図２７】1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図２８】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図２９】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【図３０】1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ベンジダミンが経時放出される量のグラフである。
【図３１】1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの構造である。
【図３２】1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルに最初に組み込まれた塩酸ドキソルビシンが経時放出される量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的は、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程:
i)ヒアルロン酸、及び必要により他のポリカルボキシル化多糖又はそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成;
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応
を含む前記方法に関する。
本発明の目的は、また、ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型の反応により架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記誘導体に関する。
“クリックケミストリー”反応は、続いて前記反応に関係する末端官能基を導入するように、以前に変性された同じ多糖鎖の間の急速且つ有効な付加環化反応である。
本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の前記架橋多糖類及び医療分野において、特に、関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科において、生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の遺伝子治療のためのマトリックスとして及び放出制御システムのためのマトリックスとして、また、組織工学又は再生に用いられる細胞物質のための生体材料や支持体としてのそれらの使用に関する。
本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の架橋誘導体をマトリックスとして含む、生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システムに関する。特に、本発明の目的は、また、ヒドロゲルの形の架橋誘導体をマトリックスとして含む、遺伝子治療に用いられるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの放出制御システムに関する。
【００１４】
架橋誘導体、本発明の目的 - 及びそれから得られるヒドロゲル - は、分子が“クリック”反応の一つに反応性の末端基、例えば、アジド、アルキン、ジエン、アルケン、ニトリルオキシド、ジアゾアルカンを有するヒアルロン酸(及びその誘導体)及び/又は他のポリカルボキシル化多糖類の簡単な誘導体化によって高収量がいわゆる“クリックケミストリー”ドメインに属している簡単で急速な反応によって水性溶媒中で調製できる。また、驚くべきことに、これらの多糖誘導体及びヒドロゲルの形成反応の間、上述のものと異なる多くの種類の官能基を有する他の分子が、望ましくない副生成物を形成せずに且つ付加環化反応の速度、収量及び可能な位置選択性に影響せずに反応混合物中に存在し得ることがわかった。このことは、広範囲の簡単な生物活性分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び他のポリマーが、これらの調製方法の間に直接本発明の目的のヒドロゲルに物理的に組み込まれ得ることを意味する。
特に、このようにして得られた材料は、これらが同じ多糖類の再建による生物体において、生体適合性で分解可能である多糖類及び低毒性、トリアゾールの場合のように抗菌活性さえも有する分子に由来するので、良好な生体適合性を特徴とする。本発明に使用し得るヒアルロン酸は、例えば、ニワトリのとさか(EP 138572)からの抽出によって又は発酵(EP 0716688)によっていかなる供給源にも由来することができ、分子量が400〜3,000,000Da、特に、50,000〜1,000,000Daの範囲にあり得る。
架橋誘導体の調製に必要な中間体の調製に使用し得るヒアルロン酸誘導体、本発明の目的は、以下のものである:
1)有機塩基及び/又は無機塩基による塩、また、生物学的に活性なもの(EP 138572 B1);
2)HYAFF(登録商標): ヒアルロン酸と脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環系のアルコールとのエステル、エステル化%は、アルコールタイプ及び使用するアルコールの長さによって変動し得るが、ポリマーがなお水溶性でなければならず且つ遊離カルボキシル基を含まなければならないので、90%以下である(EP 0216453 B1);
3)HYADD(登録商標): 脂肪族、アルアリファチック、脂環式、芳香族、環状及び複素環系のアミンを有するヒアルロン酸のアミド、アミド化%は、ポリマーがなお水溶性でなければならないので、50%以下である(EP 1095064 B1);
4)ヒアルロン酸又はその誘導体と異なるファミリーに属する抗腫瘍活性を有する薬剤との間に直接又は間接の合成によって(分子スペーサを介して)得られる生体結合生成物(イタリア特許出願PD2005A000242);
5)ヒアルロン酸のO-硫酸化誘導体(EP0702699 B1)及びN-硫酸化誘導体(EP 0971961 A1);
6)ACP(登録商標): ヒアルロン酸の内部エステル、エステル化%は、ポリマーがなお水溶性でなければならないので、20%以下である(EP 0341745 B1);
7)HAの脱アシル化生成物: N-アセチルグルコサミン画分が脱アセチル化され、脱アセチル化%は、好ましくは0.1〜30%の範囲にある(EP 1313772 B1);
8)N-アセチルグルコサミン画分の第一ヒドロキシルの酸化から得られるHAの過カルボキシル化生成物(HYOXX(登録商標) EP 1339753 A1))。
【００１５】
本発明による架橋方法に使用し得るヒアルロン酸及びその上記誘導体の遊離カルボキシル基は、カルボン酸、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のグループに属する元素、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムのカチオンのカルボキシ化塩、又はテトラアルキルアンモニウムイオン、好ましくは、テトラブチルアンモニウム、ベンザルコニウム、2-クロロ-1-メチルピリジン、セチルピリジンのカルボキシ化塩の形で存在できる。
架橋誘導体の調製に使用し得る他の天然又は合成のポリカルボキシル化多糖類、本発明の目的は、例えば、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン、硫酸化デルマタン、硫酸化ヘパラン、硫酸化ヘパリン(又はこれらのそれぞれの塩)のグループに属するものだけでなく、他の天然多糖類、例えば、アルギン酸又はその塩、また、合成多糖類、例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)又はこれらの塩である。
それ故、本発明は、図3に一般的に記載される架橋多糖構造を有する誘導体に関し、ここで、図示されるように、架橋に関係する二つ鎖の少なくとも一つは、ヒアルロン酸、又は以前に記載されたその誘導体の一つであり(この場合、ヒアルロン酸基は、単に説明のために示されている)、第二鎖は、同じか又は他のいかなるポリカルボキシル化多糖でもあり得る、ここで、順次:
- X1及びX2は、独立して、O基、NH基、OC(O)基、S基であり得る(又はカルボン酸誘導体は、それぞれ、エステル、アミド、無水物、チオエステルであり得る);
- R1及びR2は、独立して、場合によりヘテロ原子を含有してもよい、1〜20に変動する多くの炭素原子で置換された又は置換されていない脂肪族鎖、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特に他のトリアゾール基であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有し得るか又は生物活性分子の誘導体であり得る;
- Cycは、環内のC原子の数が3〜8の範囲にある、飽和又は不飽和の置換された又は置換されていない脂環式、芳香族又は非芳香族系の残基、好ましくは、置換シクロヘキセン又は置換シクロヘキサン; 又は飽和又は不飽和の置換された又は置換されていない複素環系、芳香族又は非芳香族の残基、好ましくは置換トリアゾールであり得る。
【００１６】
Cyc基は、場合によりそれ自体の生物活性を有してもよい; Cyc基は、いずれにせよ、本特許出願において、定義したように、クリックケミストリーの範囲に属する付加環化反応の生成物でなければならない。
上記架橋生成物は、それぞれ化学構造を有するように二つ以上の変性多糖ブロック間に一つ以上の共有化学結合が形成する一つ以上の付加環化反応よって得られる(図4を参照のこと)。
単に説明のために、図4における双方の多糖ブロックは、そのカルボキシル基の一部のレベルで適切に官能基化されたヒアルロン酸イオンからなるが、二つブロックの一方は、同様に変性された異なるポリカルボキシル化多糖によって示すことができる。
図4の構造において、X1基、R1基及びY1基は、以下のように定義される:
- X1及びX2は、独立してO基、NH基、OC(O)基、S基であり得る(即ち、カルボン酸誘導体は、それぞれ、エステル、アミド、無水物、チオエステルであり得る);
- R1及びR2は、独立して、場合により、ヘテロ原子、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特に他のトリアゾール基を含有してもよい、炭素原子の数が1〜20に変動する置換された又は置換されていない脂肪族鎖であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有することもでき又は生物活性分子の誘導体でもあり得る;
- Y1及びY2は、本特許出願に従って定義されるように、“クリックケミストリー”の範囲に属する付加環化反応において、互いに反応できる基を含有する残基、好ましくは、ディールスアルダー付加環化又は1,3-双極子付加環化において、互いに反応できる基を含有する残基である。より詳しくは、対(Y1、Y2)は、一組の(1,3-不飽和ジエノフィル)、又は(1,3-双極子、親双極性)タイプである、ここで:
- 1,3-不飽和化合物は、1,3-ジエン(共役ジエンとも呼ばれる)の誘導体、好ましくは1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれる;
- ジエノフィル化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれる;
- 1,3-双極子化合物は、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれる;
- 親双極性化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる。
【００１７】
本発明に従って架橋生成物を形成するブロックとして使用し得る、図4に示される多糖誘導体は、ヒアルロン酸 - 又はその塩又は誘導体から - 又は他のポリカルボキシル化多糖 - 又はその塩又は誘導体から - 出発して、当該技術の状態において、すでに知られる手順及び手段に従って、カルボキシル自体又は、エステル化の場合には、エステル化アルコールの活性化の後に、カルボキシルレベルのエステル化、アミド化、チオエステル化の反応又は無水物の形成によって簡単に調製し得る。
それ故、本発明の架橋誘導体の調製方法は、以下の二工程を含む:
i) ヒアルロン酸、場合により、他のポリカルボキシル化多糖又はそれらのそれぞれの塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成;
ii) 鎖間の共有結合の形成による合成誘導体との間の付加環化反応。
本発明に用いられる付加環化反応は、いわゆるクリックケミストリー範囲に属し、その結果として、望ましくない副生成物を生じない特性に加えて、急速で、簡単で、効率的で、更に、関係する基が適切に選ばれる場合には、位置選択性である特性を有する。本特許出願の範囲において、用いられる“クリック”反応の理想的な条件は、水性溶媒の使用を想定しているが、有機溶媒、合成(多糖塩又は誘導体)に関係する化学種がその中で、又は混合溶媒中に可溶性である場合には、好ましくは非プロトン性極性有機溶媒を代わりに選ぶ可能性を除外しない。反応混合物における単一多糖誘導体の濃度は、多糖の種類及び誘導体の種類によって通常1〜500mg/ml、好ましくは5〜100mg/mlの範囲にある。いずれの場合においても、反応温度は、通常4〜60°C、特に15〜40°Cの範囲にあるが、架橋生成物、その結果としてヒドロゲルの形成は、数秒〜30分間、特に数秒〜10分間に変動する撹拌時間後に行われる。
付加環化反応は、水性反応混合物中に1〜50mg/ml、好ましくは1〜5mg/mlの範囲にある最終濃度で存在する、Cu(I)塩の方の触媒作用によって又はその場でCu(I)を生成する系、好ましくはCu(II)塩(例えば、CuSO4)及びアスコルビン酸をからなる触媒濃度での系の触媒作用によって又は上記反応性基についての置換基が同じ反応をこれらの条件でも急速で効率的にする場合には、いかなる触媒も存在させずに行うことができる。
【００１８】
本発明の目的で上記反応によって得られるヒドロゲルは、水又は溶媒を更に吸収すると共に膨潤する能力を有し、これらの特性の一つが、達成される架橋度に従ってモジュレートされ得る粘弾特性にある。特に、これらのヒドロゲルは、多少の粘性と粘膜接着性の流体の形で、又は壁-壁型の、その結果として機械的耐性がより大きい緻密な三次元構造で存在し得る(図5を参照のこと)。
要するに、ヒドロゲル、本発明の目的は、以下のパラメーターを考慮して得られモジュレートされ得る:
i.出発多糖類又はそれらの誘導体の分子量;
ii.架橋形成に続いて用いられる基に関連する、出発多糖類又はそれらの誘導体の誘導体化度;
iii.出発多糖類の誘導体の場合、架橋に係合しないカルボキシル基に結合される分子の種類及びそれらの誘導体化度;
iv.ゲルを得るために用いられる出発材料の濃度;
v.多糖とY1基間に可能なスペーサとして作用するR1基の種類;
vi.ゲルが調製される溶液の種類。
このように合成されたゲルは多糖マトリックスに由来するので、医療分野において、特に、関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科の分野において広範囲に適用される。
ヒドロゲルの形の架橋誘導体は、好ましくは、形成外科において皮膚充填剤として、腫瘍再建外科において充填剤として、遺伝子治療においてポリヌクレオチドの放出用マトリックスとして、組織工学において組織再生の細胞物質を含有する支持体として用いられる。
特に、軟骨及び滑液組織の変性疾患用の治療の最も広範囲に用いられ且つ有効な種類の一つが著しい粘弾特性を有する化合物の関節内注射である、骨関節分野において、上で指定される一つ以上のパラメーターの変化によって本明細書に記載されるヒドロゲルの流動学的特性をモジュレートする能力が、革新的医療装置の開発ための強力な道具であることがわかった。
【００１９】
更にまた、異なる方法を利用する本発明に記載される架橋法は、滑液腔に直接ヒアルロン酸(及び/又はその誘導体)からなるヒドロゲルを形成するために、関節内注射によって最初に第一成分を、次に第二成分をCu(I)に基づく触媒を存在させて又は存在させずに、最初は低粘度を有する溶液からなるので二つのより痛みを伴わない注射によって投与することにより用いられる。
骨関節分野における本発明の架橋誘導体の使用の他の利点は、ヒドロゲルの形の架橋ヒアルロン酸が、特に、より安定な結合、例えば、アミド結合によってカルボキシルレベルで誘導体化される場合には、投与の部位において、より長い滞留時間を可能にする、流体で注入される関節内補充化合物に関して、また、出発多糖又は本発明のその目的と異なる方法に従って架橋された多糖に基づいて、より長い化学分解時間を有するという事実にある。
この後者の驚くべき特性は、PBS 0.2Mにおいても人工血漿においても、HAの架橋誘導体(本特許出願の実施例3に記載されるようにヒドロゲルの形で得られる)の37°Cにおける生体外で分解実験の結果により証明され得る。
以下の表において、実際に、化学安定性と流体力学的安定性の評価パラメーターが、それぞれ、カルボキシルレベルの誘導体の置換度と動的粘度である、37°CにおけるPBS 0.2Mの分解試験に関する、ACP(登録商標)5%(自動架橋ポリマー、約5%のHAの内部エステル)と実施例3の生成物として記載される誘導体との間の比較データに注目されたい。試験は、既知量のそれぞれの誘導体を既知容量のH2Oに膨潤すると共に形成されたヒドロゲルを10mg/mlの化学種の濃度が得られるまでPBSで希釈することにより行った。37°Cでのインキュベーションの間、誘導体の置換度の減少と得られたヒドロゲルの粘度の低下が種々の観察時間の間にモニタされた。
【００２０】
【００２１】
生理的条件下の明らかな化学安定性に加えて、レオロジー性能の非常に長い維持も認められる。
それ故、同じ多用途性、粘弾性、生体適合性及び緩慢な生物分解性の特性は、本発明の架橋誘導体が形成外科の分野における皮膚充填剤として用いることを可能にする。
本発明のヒドロゲルの重要な特性は、広範囲の生物学的又は薬理的に活性な分子が、収量の反応速度と定量性にほとんど影響せずに、また、望ましくない副生成物の形成を引き起こすプロセスに関係せずに、多糖類の架橋の間にその中に組み込まれ得るという事実からなる。
本発明の方法に用いられる付加環化反応に関係する官能基は、実際に高度に特異的な反応性を特徴とするか又はいかなる場合でも組み込まれる分子に存在する機能がこれらの点で不活性であるように選ぶことができる。
それ故、本発明の目的は、一つ以上の生物学的に又は薬理的に活性な分子で充填された、以前に記載された方法によって得られる、ゲルの形での薬理的に活性な分子の放出制御システムの調製方法であって、これらの分子は、架橋される部分的多糖誘導体と一緒にゲルを形成する前に反応溶媒(これが水性にしても有機にしても)に溶解され、その後、架橋の後に形成されるポリマーマトリックスに物理的に且つ均一に組み込まれたままである、前記方法に関する。
本発明の生物学的及び/又は薬理的に活性な分子及び/又は巨大分子の放出制御システムにおいて、生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子は、活性成分、例えば、タンパク質、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、細胞増殖抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、麻酔剤、鎮痛剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓薬、抗凝固薬、止血剤、局所、皮下、筋肉内又は関節内使用のための線維素溶解剤や血栓溶解薬剤より選ばれる。
ヒアルロン酸の適切なアジド及びアルキン誘導体のフイスゲン反応によって架橋した後に得られるヒドロゲルの形のマトリックスに組み込まれた抗新生物薬(ドキソルビシン)及び抗炎症剤(ベンジダミン)の放出曲線を、説明のために下記に示す(更により詳細な説明のために実施例に関する項、特に実施例13を参照のこと)。
第一の例において、塩酸ドキソルビシンの最大量は、約50時間で放出され、ゲルに最初に組み込まれた量の50%に等しいことが認められる(図6を参照のこと)。
【００２２】
第二の図において、塩酸ベンジダミン塩の最大量は、約6時間で放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤量の80%に等しい(図7を参照のこと)。
ゲルの形の薬剤のこれらの放出制御システムは、多くの適用分野を、特に皮膚科、腫瘍学、呼吸器学及び骨関節の分野においてもち得る。
特に、関節内使用の場合、上記ゲルは、活性成分、例えば抗炎症性物質、メタルプロテアーゼ阻害剤、NOシンターゼ阻害剤又は関節症及び/又は関節炎の病状の治療のための他の生物学的に活性な分子を含有できるので、ゲルによって与えられる主に機械的な関節内補充作用を伴う一つ又は複数の有効成分の緩慢な放出を得る。
特に、本発明の目的は、癌塊を切除した後、腫瘍再建外科又は腫瘍神経外科における放出制御システムの使用であって、ヒドロゲルが、抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制剤及び/又は薬理的に活性な分子としてのそれらの前駆物質を含有する、前記使用に関する。
良好な生体適合性、緩慢な生分解及び著しい粘膜接着により示される特定の利点に基づいて、抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制薬を充填したこれらの放出制御システムの局所限局投与が、例えば、顔の手術の場合に、特に有効で有利であることがわかる。
実際に、これらの適用の形において、架橋多糖マトリックス自体の“充填剤”の機能は、再発新生物の形成を防止するために、前記マトリックスによってゆっくりと放出される薬剤の活性と関連している。
以前に記載された放出制御システムの可能な投与部位は、腫瘍塊の切除のための外科的介入に由来するそれらの組織腔又は空間すべてを含み、構造機能と充填機能及び薬理的活性双方を有する薬用ヒドロゲルの形で生体適合性生成物を導入することが適切である。特に、大脳新生物(例えば、悪性脳腫瘍)の切除後のくも膜下投与、大腸、膀胱、肝臓及び膵臓の腫瘍を切除した後の腹腔内投与、及び再建的乳房成形術の場合における乳房腫瘍を切除した後の投与が特に興味深い。
本発明の放出制御システムのこの適用形態に使用し得る薬理的に活性な分子の例は、既知の抗腫瘍活性又は細胞増殖抑制活性及び/又は場合によりその前駆物質を有するものすべて、特に上記新生物の治療に薬理的に有効な分子、好ましくはパクリタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン及びメトトレキセートである。
本発明のより良い説明のために以下の実施例を示す。
【実施例１】
【００２３】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの700kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。次に、以下の反応成分を順次添加した: 1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)及び0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン。この混合液を室温で24時間撹拌し、次にNaCl飽和溶液に対して24時間透析し(MWCO=12kDa)、次に一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物1(図8を参照のこと)を白色の粉末として回収した。
生成物1とプロパルギルアミンとの反応
500mgの生成物1を20mlの蒸留水に溶解した。次に、2mlのプロパルギルアミンと以前に調製した2mlの2%w/v CuCl水溶液を添加した。この混合液を室温で1時間撹拌し、この溶液をNaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物を白色粉末として回収した(図9を参照のこと)。
【実施例２】
【００２４】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、1.62gのNHSS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの200kDa HAナトリウム塩に添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物2(図10を参照のこと)を白色粉末として回収した。
生成物2と11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンとの反応
500mgの生成物2を、20mlの蒸留水に溶解した。次に、3mlの11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン及び以前に調製した2mlの2%w/vCuCl水溶液を添加した。この混合液を室温で1時間撹拌し、この溶液を、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物を白色粉末として回収した(図11を参照のこと)。
【実施例３】
【００２５】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)及び0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で透析させ、凍結乾燥して、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色の粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。反応液を、室温で24時間撹拌し、次に、透析チューブ12kDaに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
水性溶媒中のヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。30mgのCuClを1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いてCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
【実施例４】
【００２６】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
1gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。478mgのEDC・HCl及び540mgのNHSS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、続いて次に1.65mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を、室温で8時間撹拌し、次に、12kDaのカットオフチューブ中でNaCl飽和溶液に対して、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物5(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。478mgのEDC・HCl及び540mgのNHSS、次に0.520mlのプロパルギルアミンを添加した。系を、室温で8時間撹拌し、次にNaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、フラスコに移した溶液を凍結させ、凍結乾燥して、生成物2を白色粉末として回収した。
BSAの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
20mlの1%w/vウシ血清アルブミン水溶液(BSA)を調製した; 次に、300mgの生成物5を6mlの上記溶液に完全に溶解し、次に、生成物2について類似の手順を続けた。2%w/v CuCl水溶液を、別々に調製した。ポリマーの溶液を混合し、続いて1mlのCuCl溶液を添加し、図12のゲルの形成まで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを恒量に達するまで蒸留水に対して透析した。
【実施例５】
【００２７】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。次に、1.43gのEDC・HCl(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、0.86gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを、順次添加した。この反応液を、室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を12kDaのカットオフ透析チューブに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
BSAの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
25mlの2%w/vウシ血清アルブミン水溶液(BSA)を調製した; 次に、400mgの生成物3と400mgの生成物4を8mlの上記溶液に完全に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いて、CuCl溶液を添加し、図12のゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを蒸留水に対して透析し、過剰のCuClを除去した。
【実施例６】
【００２８】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの69kDa HAナトリウム塩を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.86mgのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、3.30mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物3(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
1.43gのEDC・HCl、0.86gのNHS、次に1.04mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を12kDaのカットオフ透析チューブに移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
IL-2の存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。0.5mgのインターロイキン2(IL 2)も0.5mlの水に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いてインターロイキン2の溶液を添加し、この混合液を軽く撹拌した。最後にCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性溶媒中でのヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
400mgの生成物3と400gの生成物4を、完全に溶解するまで8mlの蒸留水に別々に溶解した。15mgの塩酸ドキソルビシンも1mlの水に溶解した。30mgのCuClを1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、続いて塩酸ドキソルビシンの溶液を添加し、この混合液を軽く撹拌した。最後にCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図12を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルまで過剰のCuClを除去した。
【実施例７】
【００２９】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるCMCのアミド化
2gのCMC(カルボキシメチルセルロース)を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.57gのEDC・HCl、0.94mgのNHS、続いて2.71mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物6を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2.87gのEDC・HCl、1.72gのNHS、次に1.73mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの69kDa HAナトリウム塩に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物4(図10を参照のこと)を白色粉末として回収した。
水性溶媒中でのヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースの混合ヒドロゲルの形成
500mgの生成物6(CMC誘導体)を10mlの蒸留水に溶解し、同様にして生成物4を溶解した。2%w/v CuCl水溶液を別々に調製した。二つの異なるポリマーの溶液を混合し、次に1.50mlのCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図13)。次に、恒量に達するまでゲルを蒸留水に対して透析した。
【実施例８】
【００３０】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDa HAナトリウム塩を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.43gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.86mgのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に、5.50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物5(図8と同じ化学構造を有する)を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2.36gのEDC・HCl、1.41gのNHS、次に5.42mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gのCMCに添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥して、生成物7を白色粉末として回収した。
水性溶媒/有機溶媒中でのヒアルロン酸とCMCの混合ヒドロゲルの形成
500mgの生成物5と500gの生成物7(CMC誘導体)を、5mlの蒸留水と5mlのNMPに別々に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、次に、CuCl溶液を添加し、混合ヒアルロン酸/カルボキシメチルセルロースゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、CuClと有機溶媒を除去し、前記透析を恒量のゲルに達するまで行った。
【実施例９】
【００３１】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHyaffllp50のアミド化
2gのHyaffllp50を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。1.32gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、0.79gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、続いて次に3.04mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加した。この混合液を室温で24時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いてこの溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物8を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHyaffllp50のアミド化
1.32gのEDC・HCl、0.79gのNHS、次に0.95mlのプロパルギルアミンを、80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gのHyaffllp50に添加した。この反応液を室温で24時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=12kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物9を白色粉末として回収した。
水性溶媒/有機溶媒中でのHyaffllp50ヒドロゲルの形成
400mgの上記二つの誘導体8と9の各々を、4mlの蒸留水と4mlのNMPに別々に溶解した。30mgのCuClを、1.50mlの蒸留水に別々に溶解した。次に、ポリマーの溶液を混合し、次に、CuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図14を参照のこと)。次に、ゲルを蒸留水に対して透析して、恒量のゲルに達するまで過剰のCuClを除去した。
【実施例１０】
【００３２】
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHyaff9p10のアミド化
1gのHyaff9p10を、80mlの100mM MES緩衝液、pH=6に溶解した。470mgのEDC・HCl、530mgのNHSS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、続いて次に、1.60mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを添加した。この溶液を室温で8時間撹拌し、次に、チューブ(カットオフ12kDa)内でNaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥した。生成物8を白色粉末として回収した。
EDC・HCl及びNHSSの存在下にpH=6の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHyaff9p10のアミド化
1gのHyaff9p10を80mlの100mM MES緩衝液、pH=4に溶解した。この溶液に、470mgのEDC・HCl、540mgのNHSS、次に530ml(3×)のプロパルギルアミンを添加した。この系を室温で8時間撹拌し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=12kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析した。この溶液をフラスコに移し、続いて、凍結させ、凍結乾燥し、生成物11を白色粉末として回収した。
水性溶媒中でのHyaff9p10ヒドロゲルの形成
300mgの生成物10と300mgの生成物11を、6mlの蒸留水に完全に、また、に別々に溶解した。2%w/v CuCl水溶液を別々に調製した。次に、ポリマーの溶液を混合し、1mlのCuCl溶液を添加し、ゲルが形成されるまで数分間渦状に撹拌した(図15を参照のこと)。次に、恒量のゲルに達するまで、ゲルを蒸留水に対して透析した。
【実施例１１】
【００３３】
EDCoHCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDaのHAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4 に溶解する。次に、2.90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、1.77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、及び5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコへ移し、液体窒素中で凍結させ、次に、凍結乾燥させる。生成物1を白色粉末として回収する(図16を参照のこと)。
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中でのプロパルギルアミンによるHANaのアミド化
2,90gのEDC・HCl、1,77gのNHS、次に1,73mlのプロパルギルアミンを、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解した2gの200kDa HAナトリウム塩に添加する。この反応液を室温で48時間撹拌し、次に、この溶液を透析チューブ(MWCO=14kDa)に移し、NaCl飽和溶液に対して24時間透析し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液を、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物2(図17を参照のこと)を白色粉末として回収する。
BSAの存在下に水性溶媒中での触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
25mlの2%w/vウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を調製する; 次に、500mgの生成物1と500mgの生成物2を14mlの上記溶液に溶解する。続いて、50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた2mlの水性溶液と40mgのアスコルビン酸の4mlの水性溶液を添加し、数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図18を参照のこと)は、BSAタンパク質を組み込んでいる。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性溶媒中での触媒のCuClによる架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
29mgの塩酸ドキソルビシンを2mlの水に溶解し、次に、上記の通りに合成される50mgの生成物1と50mgの生成物2を添加する。続いて、この溶液に830μLの1%w/v CuCl溶液を添加し、溶液に存在する薬剤を直接組み込んだ数分後にゲルを形成する。
触媒のCuClによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約160時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の25%に等しい(図19を参照のこと)。
【００３４】
塩酸ベンジダミンの存在下に水性溶媒中で触媒のCuClにより架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
69mgの塩酸ベンジダミンを2mlの水に溶解し、次に、上記の通りに合成された50mgの生成物1と50mgの生成物2を添加する。
続いて、この溶液に830μLの1%w/v CuCl溶液を添加し、薬剤を直接組み込んだ数分後にゲルを形成する。
触媒のCuClによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlのリン酸緩衝液pH=7.4から放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約3.5時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の88%に等しい(図20を参照のこと)。
ベンジダミン塩酸塩の存在下に水性溶媒の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸により架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
50mgの生成物1と50mgの生成物2を、1,3mlの蒸留水に溶解し、別に13,8mgの塩酸ベンジダミンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液を塩酸ベンジダミンと混合する; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水性溶液と0,1mlの20mgのアスコルビン酸水溶液を添加する。
この混合液を数分間渦状に撹拌する。
急速に形成されたゲルは、塩酸ベンジダミンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oによって得られる架橋ヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約5時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の70%に等しい(図21を参照のこと)。
【実施例１２】
【００３５】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDaのHAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解する。次に、2,90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩、1,77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、及び5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコへ移し、液体窒素中で凍結させ、次に、凍結乾燥させる。生成物1を白色粉末として回収する(図16を参照のこと)。
触媒のCuSO4・5H2O及びアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,4-ジエチニルベンゼンの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、150mgの1,4-ジエチニルベンゼンを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図22を参照のこと)を白色粉末として回収する。
【００３６】
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,6-ヘプタジインとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,13mlの1,6-ヘプタジインを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。続いて、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図23を参照のこと)を白色粉末として回収する。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1と1,8-ノナジインとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,18mlの1,8-ノナジインを1,5 mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、次に、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5 mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図24を参照のこと)を白色粉末として回収する。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸による水性/有機溶媒中の生成物1とプロパルギルエーテルとの反応
500mgの生成物1を45mlの蒸留水に溶解し、0,12mlのプロパルギルエーテルを1,5mlのDMSOに溶解する。これらの溶液を混合し、続いて、3mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた1,5mlの水溶液と88mgのアスコルビン酸の2mlの水溶液を添加する。この混合液を室温で4時間撹拌し、次に、この溶液をEDTA飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、次に、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、生成物(図25を参照のこと)を白色粉末として回収する。
【実施例１３】
【００３７】
EDC・HCl及びNHSの存在下にpH=4の水性溶媒中での11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンによるHANaのアミド化
2gの200kDa HAナトリウム塩を、80mlの50mM MES緩衝液、pH=4に溶解する。続いて、2,90gのEDC・HCl(N-(3,ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)、1,77gのNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、次に、5,50mlの90% 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミンを順次添加する。この反応液を室温で48時間撹拌し、次に、NaCl飽和溶液に対して24時間透析(MWCO=14kDa)し、一定の導電率に達するまで蒸留水に対して透析する。次に、この溶液をフラスコに移し、液体窒素中で凍結させ、次に凍結乾燥する。生成物1を白色粉末として回収する。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中での触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し、3mgの1,4-ジエチニルベンゼンを0,2mlのDMSOに別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。三つの溶液を混合し、次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られる0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図26を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
上で示された構造に従って架橋した、水性/有機溶媒中で触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,4-ジエチニルベンゼンによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記ヒドロゲルについて行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約50時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の5%に等しい(図27を参照のこと)。
【００３８】
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 9.86mlのDMSO中の140μlの1,6-ヘプタジインの溶液を別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とドキソルビシンの溶液と0.2mlの1,6-ヘプタジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1 mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図28を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約250時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の23%に等しい(図29を参照のこと)。
塩酸ベンジダミンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oによって得られる1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 9.86mlのDMSO中の140μlの1,6-ヘプタジインの溶液を別々に溶解し、13,8mgの塩酸ベンジダミンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とベンジダミンの溶液と0.2mlの1,6-ヘプタジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌する。急速に形成されたゲル(図28を参照のこと)は、塩酸ベンジダミンを内部に組み込んでいる。
【００３９】
上に示された構造に従って架橋された、触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られた1,6-ヘプタジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ベンジダミンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=308nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
塩酸ベンジダミンの最大量は、約6時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の80%に等しい(図30を参照のこと)。
塩酸ドキソルビシンの存在下に水性/有機溶媒中の触媒のCuSO4・5H2Oとアスコルビン酸によって得られる1,8-ノナジインによるヒアルロン酸のヒドロゲルの形成
100mgの生成物1を1,1mlの蒸留水に溶解し; 11.23mlのDMSO中の200μlの1,8-ノナジインの溶液を別々に溶解し、23,2mgの塩酸ドキソルビシンを0,5mlの蒸留水に溶解する。ヒアルロン酸の溶液とドキソルビシンの溶液と0.2mlの1,8-ノナジインの溶液とを混合し; 次に、1mlのH2O中の50mgのCuSO4・5H2Oによって得られた0,1mlの水溶液と20mgのアスコルビン酸の0,1mlの水溶液を添加する。この混合液を数分間渦状に撹拌させる。急速に形成されたゲル(図31を参照のこと)は、塩酸ドキソルビシンを内部に組み込んでいる。
触媒のCuSO4・5H2Oによって得られた1,8-ノナジインによるヒアルロン酸に基づくヒドロゲルからの薬剤塩酸ドキソルビシンの放出測定
100mlの蒸留水中のヒドロゲルから放出される塩酸ドキソルビシンの量を、既知の濃度の薬剤の溶液を用いて構成される検定線に吸光度値を内挿することによってλ=486nmにおけるU.V.分光光度的測定によって決定する。
薬剤の放出測定を、上記のヒドロゲルに行う。
塩酸ドキソルビシンの最大量は、約100時間にわたって放出され、ゲルに最初に組み込まれた薬剤の量の14%に等しい(図32を参照のこと)。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程、
i)ヒアルロン酸、及び任意に他のポリカルボキシル化多糖又はその塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成、
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程i)において得られた部分誘導体が、クリックケミストリーの範囲に属する一つ以上の付加環化反応、好ましくはディールスアルダー付加環化反応又は1,3-双極子付加環化反応によって鎖間に共有結合を形成することにより、次の工程ii)において互いに反応できる基を含有する対の残基を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対の残基が、一組の(1,3-不飽和、ジエノフィル)型又は(1,3-双極子、親双極性)型であって、
- 1,3-不飽和化合物が、1,3-ジエン(共役ジエンとも呼ばれる)の誘導体、好ましくは1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれ、
- ジエノフィル化合物が、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロ-アルケン、ニトロ-アルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれ、
- 1,3-双極子化合物が、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれ、
- 親双極性化合物が、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程i)において得られた部分誘導体が、それぞれ以下の化学構造(図4の通り)を有する二つ以上の変性多糖ブロックである、請求項１に記載の方法。
【化１】
(式中、Xi基、Ri基及びYi基は、以下のように定義される。
- X1及びX2は、独立してO基、NH基、OC(O)基、S基である。
- R1及びR2は、独立して、場合により、ヘテロ原子、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特にトリアゾール基を含有してもよい、炭素原子の数が1〜20に変動する置換された又は置換されていない脂肪族鎖であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有することもでき又は生物活性分子の誘導体でもあり得る。
- Y1及びY2は、ディールスアルダー付加環化反応又は1,3-双極子付加環化において互いに反応できる基を含有する残基であり、好ましくは、対(Y1、Y2)は、一組の(1,3-不飽和、ジエノフィル)、又は(1,3-双極子、親双極性)型である。ここで、
- 1,3-不飽和化合物は、1,3-ジエン、好ましくは、1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれる。
- ジエノフィル化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロ-アルケン、ニトロ-アルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれる。
- 1,3-双極子化合物は、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれる。
- 親双極性化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる)。
【請求項５】
工程ii)が、水性溶媒又は非プロトン性極性有機溶媒中又は混合溶媒中で行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
工程ii)が、1〜500mg/ml、好ましくは5〜100mg/mlの範囲にある反応混合物中の濃度の工程i)において得られた多糖部分誘導体の存在下に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
いずれの工程も、4〜60°C、好ましくは15〜40°Cの範囲にある反応温度で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
架橋生成物、その結果としてヒドロゲルを形成するための工程ii)が、数秒〜30分間、好ましくは数秒〜10分間変動する撹拌時間を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
工程ii)が、1〜50mg/ml、好ましくは1〜5mg/mlの範囲にある最終濃度の水性反応混合物中に存在するCu(I)塩の方の触媒作用によって又はその場でCu(I)を生成する系、好ましくは、触媒濃度でのCu(II)塩(例えば、CuSO4)とアスコルビン酸からなる系の触媒作用によって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法によって得られる、“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記架橋誘導体。
【請求項１１】
ヒアルロン酸及びその誘導体の遊離カルボキシル基が、テトラアルキルアンモニウムのカルボン酸又はカルボキシ化塩の形で又はアルカリ金属又はアルカリ土類金属のグループに属する元素のカチオンの形で、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩としての形で存在する、請求項10に記載の架橋誘導体。
【請求項１２】
天然又は合成のポリカルボキシル化多糖類の多糖鎖が、更に、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン、硫酸化デルマタン、硫酸化ヘパラン、硫酸化ヘパリン及びこれらのそれぞれの塩のグループに属するものだけでなく、他の天然多糖類、例えば、アルギン酸及びその塩、また、合成多糖類、例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)及びこれらの塩より選ばれる、請求項10に記載の架橋誘導体。
【請求項１３】
ヒドロゲルの形である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の架橋誘導体。
【請求項１４】
ヒドロゲルが、多少粘性で粘膜接着性の流体、又は壁-壁型の緻密な三次元構造である、請求項13に記載の架橋誘導体。
【請求項１５】
ヒドロゲルの形成中に、簡単な生物学的又は薬理的に活性な分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、他のポリマー、細胞物質を物理的に組み込む、請求項13に記載の架橋誘導体。
【請求項１６】
関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科において、遺伝子治療のための又は生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのためのマトリックスとして、また、組織工学のための細胞物質を含有する生体材料として、請求項13〜15のいずれか1項に記載の架橋誘導体の使用。
【請求項１７】
骨関節分野での関節内補充療法における、請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
ヒアルロン酸(及び/又はその誘導体)からなるヒドロゲルの形成が、最初に部分多糖誘導体の関節内注射、続いて、Cu(I)に基づく触媒を存在させて又は存在させずに、第二の部分多糖誘導体の関節内注射によって直接滑液腔に行われる、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
形成外科において皮膚充填剤としての、請求項16に記載の使用。
【請求項２０】
腫瘍再建外科において外科用充填剤としての、請求項16に記載の使用。
【請求項２１】
マトリックスとして、請求項13に記載のヒドロゲルの形の架橋誘導体を含む、生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システム。
【請求項２２】
マトリックスとして、請求項13に記載のヒドロゲルの形の架橋誘導体を含む、遺伝子治療に用いられるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの放出制御システム。
【請求項２３】
組織工学又は再生に用いられる細胞物質を含有する、請求項13に記載の架橋誘導体からなる、ヒドロゲルの形のマトリックス。
【請求項２４】
生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子が、活性成分、例えば、タンパク質、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、細胞増殖抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、麻酔剤、鎮痛剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓薬、抗凝固薬、止血剤、局所、皮下、筋肉内又は関節内使用のための線維素溶解剤や血栓溶解薬剤より選ばれることを特徴とする、請求項21に記載のシステム。
【請求項２５】
皮膚科、腫瘍学、呼吸器学及び骨関節の分野において、また、組織工学のための請求項21、22又は24のいずれか1項に記載のゲルの形の放出制御システムの使用。
【請求項２６】
関節内投与によって請求項25に記載の使用であって、ゲルが、活性成分、例えば、抗炎症性物質、メタルプロテアーゼ阻害剤、NOシンターゼ阻害剤、又は関節症及び/又は関節炎の病状の治療のための他の生物学的に又は医薬的に活性な分子を含有する、前記使用。
【請求項２７】
腫瘍再建外科又は腫瘍神経外科における請求項25に記載の使用であって、ヒドロゲルが、薬理的に活性な分子として抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制剤及び/又はこれらの前駆物質を含有する、前記使用。
【請求項２８】
薬理的に活性な分子が、パクリタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン及びメトトレキセートより選ばれることを特徴とする、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
一つ以上の生物学的又は薬理的に活性な分子を、架橋すべき多糖部分誘導体と共に反応溶媒に溶解することを特徴とする、請求項21に記載のゲルの形の薬剤の放出制御システムの調製方法。
【請求項１】
ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体の調製方法であって、多糖鎖の少なくとも一つが、“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる前記方法であって、以下の工程、
i)ヒアルロン酸、及び任意に他のポリカルボキシル化多糖又はその塩又は誘導体の部分誘導体(エステル、アミド、チオエステル、無水物)の合成、
ii)鎖間の共有結合の形成による工程i)において得られた誘導体間の付加環化反応、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程i)において得られた部分誘導体が、クリックケミストリーの範囲に属する一つ以上の付加環化反応、好ましくはディールスアルダー付加環化反応又は1,3-双極子付加環化反応によって鎖間に共有結合を形成することにより、次の工程ii)において互いに反応できる基を含有する対の残基を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対の残基が、一組の(1,3-不飽和、ジエノフィル)型又は(1,3-双極子、親双極性)型であって、
- 1,3-不飽和化合物が、1,3-ジエン(共役ジエンとも呼ばれる)の誘導体、好ましくは1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれ、
- ジエノフィル化合物が、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロ-アルケン、ニトロ-アルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれ、
- 1,3-双極子化合物が、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれ、
- 親双極性化合物が、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程i)において得られた部分誘導体が、それぞれ以下の化学構造(図4の通り)を有する二つ以上の変性多糖ブロックである、請求項１に記載の方法。
【化１】
(式中、Xi基、Ri基及びYi基は、以下のように定義される。
- X1及びX2は、独立してO基、NH基、OC(O)基、S基である。
- R1及びR2は、独立して、場合により、ヘテロ原子、又は芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環系の基、特にトリアゾール基を含有してもよい、炭素原子の数が1〜20に変動する置換された又は置換されていない脂肪族鎖であり得る、また、これらは生物活性分子の誘導体を含有することもでき又は生物活性分子の誘導体でもあり得る。
- Y1及びY2は、ディールスアルダー付加環化反応又は1,3-双極子付加環化において互いに反応できる基を含有する残基であり、好ましくは、対(Y1、Y2)は、一組の(1,3-不飽和、ジエノフィル)、又は(1,3-双極子、親双極性)型である。ここで、
- 1,3-不飽和化合物は、1,3-ジエン、好ましくは、1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フランより選ばれる。
- ジエノフィル化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合された、アルケン、アルキン又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロ-アルケン、ニトロ-アルキン、マレイン酸無水物及びキノンより選ばれる。
- 1,3-双極子化合物は、ニトリル-オキシド、アジド、ジアゾ-アルカン、アレン及びニトロンの誘導体、好ましくはアジドの誘導体より選ばれる。
- 親双極性化合物は、一つ以上の電子-誘引基が二重結合又は三重結合に結合されたアルケン、アルキンより又はアルケン又はアルキンの誘導体、好ましくはアクリレート、アクリルアミド、フマレート、ビニルケトン、ニトロアルケン、ニトロアルキン、マレイン酸無水物、メチルアセチレン、キノンより選ばれる)。
【請求項５】
工程ii)が、水性溶媒又は非プロトン性極性有機溶媒中又は混合溶媒中で行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
工程ii)が、1〜500mg/ml、好ましくは5〜100mg/mlの範囲にある反応混合物中の濃度の工程i)において得られた多糖部分誘導体の存在下に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
いずれの工程も、4〜60°C、好ましくは15〜40°Cの範囲にある反応温度で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
架橋生成物、その結果としてヒドロゲルを形成するための工程ii)が、数秒〜30分間、好ましくは数秒〜10分間変動する撹拌時間を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
工程ii)が、1〜50mg/ml、好ましくは1〜5mg/mlの範囲にある最終濃度の水性反応混合物中に存在するCu(I)塩の方の触媒作用によって又はその場でCu(I)を生成する系、好ましくは、触媒濃度でのCu(II)塩(例えば、CuSO4)とアスコルビン酸からなる系の触媒作用によって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ポリカルボキシル化多糖類の架橋誘導体であって、多糖鎖の少なくとも一つが、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法によって得られる、“クリックケミストリー”型反応によって架橋されたヒアルロン酸又はその誘導体からなる、前記架橋誘導体。
【請求項１１】
ヒアルロン酸及びその誘導体の遊離カルボキシル基が、テトラアルキルアンモニウムのカルボン酸又はカルボキシ化塩の形で又はアルカリ金属又はアルカリ土類金属のグループに属する元素のカチオンの形で、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩としての形で存在する、請求項10に記載の架橋誘導体。
【請求項１２】
天然又は合成のポリカルボキシル化多糖類の多糖鎖が、更に、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン、硫酸化デルマタン、硫酸化ヘパラン、硫酸化ヘパリン及びこれらのそれぞれの塩のグループに属するものだけでなく、他の天然多糖類、例えば、アルギン酸及びその塩、また、合成多糖類、例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)及びこれらの塩より選ばれる、請求項10に記載の架橋誘導体。
【請求項１３】
ヒドロゲルの形である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の架橋誘導体。
【請求項１４】
ヒドロゲルが、多少粘性で粘膜接着性の流体、又は壁-壁型の緻密な三次元構造である、請求項13に記載の架橋誘導体。
【請求項１５】
ヒドロゲルの形成中に、簡単な生物学的又は薬理的に活性な分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、他のポリマー、細胞物質を物理的に組み込む、請求項13に記載の架橋誘導体。
【請求項１６】
関節内補充療法、形成外科、腫瘍再建外科において、遺伝子治療のための又は生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システムのためのマトリックスとして、また、組織工学のための細胞物質を含有する生体材料として、請求項13〜15のいずれか1項に記載の架橋誘導体の使用。
【請求項１７】
骨関節分野での関節内補充療法における、請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
ヒアルロン酸(及び/又はその誘導体)からなるヒドロゲルの形成が、最初に部分多糖誘導体の関節内注射、続いて、Cu(I)に基づく触媒を存在させて又は存在させずに、第二の部分多糖誘導体の関節内注射によって直接滑液腔に行われる、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
形成外科において皮膚充填剤としての、請求項16に記載の使用。
【請求項２０】
腫瘍再建外科において外科用充填剤としての、請求項16に記載の使用。
【請求項２１】
マトリックスとして、請求項13に記載のヒドロゲルの形の架橋誘導体を含む、生物学的又は薬理的活性を有する分子及び/又は巨大分子の放出制御システム。
【請求項２２】
マトリックスとして、請求項13に記載のヒドロゲルの形の架橋誘導体を含む、遺伝子治療に用いられるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの放出制御システム。
【請求項２３】
組織工学又は再生に用いられる細胞物質を含有する、請求項13に記載の架橋誘導体からなる、ヒドロゲルの形のマトリックス。
【請求項２４】
生物学的又は薬理学的活性を有する分子及び/又は巨大分子が、活性成分、例えば、タンパク質、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、細胞増殖抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、麻酔剤、鎮痛剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓薬、抗凝固薬、止血剤、局所、皮下、筋肉内又は関節内使用のための線維素溶解剤や血栓溶解薬剤より選ばれることを特徴とする、請求項21に記載のシステム。
【請求項２５】
皮膚科、腫瘍学、呼吸器学及び骨関節の分野において、また、組織工学のための請求項21、22又は24のいずれか1項に記載のゲルの形の放出制御システムの使用。
【請求項２６】
関節内投与によって請求項25に記載の使用であって、ゲルが、活性成分、例えば、抗炎症性物質、メタルプロテアーゼ阻害剤、NOシンターゼ阻害剤、又は関節症及び/又は関節炎の病状の治療のための他の生物学的に又は医薬的に活性な分子を含有する、前記使用。
【請求項２７】
腫瘍再建外科又は腫瘍神経外科における請求項25に記載の使用であって、ヒドロゲルが、薬理的に活性な分子として抗新生物薬及び/又は細胞増殖抑制剤及び/又はこれらの前駆物質を含有する、前記使用。
【請求項２８】
薬理的に活性な分子が、パクリタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン及びメトトレキセートより選ばれることを特徴とする、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
一つ以上の生物学的又は薬理的に活性な分子を、架橋すべき多糖部分誘導体と共に反応溶媒に溶解することを特徴とする、請求項21に記載のゲルの形の薬剤の放出制御システムの調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２０１０−５０２８２４（Ｐ２０１０−５０２８２４Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７７２８（Ｐ２００９−５２７７２８）
【出願日】平成１９年９月５日（２００７．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００７７５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１５２５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０７３８２９７９）フィディア ファルマチェウティチ ソシエタ ペル アチオニ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月５日（２００７．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００７７５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１５２５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０７３８２９７９）フィディア ファルマチェウティチ ソシエタ ペル アチオニ (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]