タンパク質の官能性の調節
薬理学的に重要な各種の新規化合物および治療方法を得るために、特定の天然のタンパク質と相互作用しうる分子の合理的な識別方法を提供する。概述すると、この方法は、特定の目的タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドを識別し、このタンパク質の一部を形成し、上記のスイッチ制御リガンドと相互作用する相補的なスイッチ制御ポケットを識別する過程を含むものである。このリガンドは、インビボで上記のポケットと相互に作用して上記のタンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記のタンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、上記のタンパク質が、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行する。次に、上記のタンパク質の第一コンホメーションおよび第二コンホメーションの各サンプルを用意し、そして、これらのサンプルの１以上の候補分子に対するスクリーニングを、候補分子とサンプルとを接触させることによって行る。この過程により、このタンパク質のポケット領域と結合する小型の分子を識別することができる。新規なタンパク質とモジュレータとのアダクト、およびタンパク質の活性の変更方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本出願は、仮出願である米国特許出願第６０／４３７，４８７号のＰｒｏｃｅｓｓ Ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４０３号のＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４１５号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，３０４号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、および米国特許出願第６０／４６３，８０４号のＭｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ Ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００３年４月１８日出願）についての権利を主張するものである。これらの各出願は、ここに言及することをもって、本発明に組み込むものである。
【０００２】
１．技術分野
本発明は、広義には、タンパク質の活性モジュレータの役目を果たす分子の新規で合理化された識別方法、ならびに新規なタンパク質とモジュレータのアダクトに関するものである。より詳細には、本発明は、こうした方法およびアダクトであって、好適な態様では、スイッチ制御リガンドとこれと相補的なスイッチ制御ポケットとの相互作用を含むタンパク質コンホメーションの変化機構を利用するような方法およびアダクトに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
２．先行技術の説明
近年、基礎研究によって、ヒト遺伝コードやそれによって生成されるタンパク質について、かつてない量の情報が生命科学コミュニティにもたらされている。２００１年には、ヒトゲノムの完全配列も報告された（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ；Ｎａｔｕｒｅ（２００１） ４０９：８６０；Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１） ２９１：１３０４）。全世界の研究コミュニティは、現在、こうした遺伝子配列によってコードされる５０，０００以上のタンパク質の分類に着手しており、さらに重要なこととして、主要な疾患でありながら、治療が十分に行われていないヒトの疾患の原因タンパク質の識別に取り組んでいる。ヒトゲノムやそのタンパク質によってもたらされる情報、特に、タンパク質の機能をコンホメーションによって制御する分野について多大な情報が存在するにもかかわらず、製薬産業が小型分子治療薬の開発に着手しうるような方法論や戦略は、小型分子治療薬を結合させる際に天然のタンパク質結合部位を利用するところから有意には先に進んでいない。こうした天然の部位は、通常、必須の細胞機能を営むうえで、各種のタンパク質によって利用されている部位であり、その際には、タンパク質がこうした部位に結合することによって天然の基質の処理が進行したり、タンパク質によって、天然リガンド由来の信号が伝達されたりする。これらの天然部位は、タンパク質ファミリー内の他の多くのタンパク質によっても広範に利用されているので、こうした部位と相互に作用する薬剤では、選択性の欠如が問題となることも多く、その結果、最大効力を達成するには治療域が不十分となることも多い。こうした小型分子では、副作用および有害性は、臨床以前の創薬時、臨床治験の間、またはその後市場で明らかになる。副作用および有害性は、薬剤開発プロセスに見られる高い消耗率の主因であり続けている。キナーゼタンパク質ファミリーのタンパク質については、こうした天然部位での相互作用についてのレビューが最近報告されている（Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ： １９９７−２０００，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１） １１： ４０５−４２９；Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２） ２： ｉｓｓｕｅ ９を参照されたい）。
【０００４】
タンパク質は可撓性であることが知られており、この可撓性を利用して、タンパク質の別々の可撓性の活性部位に結合する小型分子を見いだした事例が報告されている。こうした利用についてのレビューについては、Ｔｅａｇｕｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．５２７−５４１（２００３）を参照されたい。また、Ｗｕら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．３９９−４１０（２００３）も参照されたい。しかし、これらの報告では、タンパク質の天然の活性部位のみに結合する小型分子に焦点があてられている。Ｐｅｎｇら，Ｂｉｏ． Ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｔｒｓ．，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．３６９３−３６９９（２００３），およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８９，ｐ．１９３８（２０００）には、ａｂｌキナーゼの阻害物質が記載されている。こうした阻害物質については、国際公開番号第ＷＯ２００２／０３４７２７号に特定されている。こうした一群の阻害物質は、ＡＴＰ活性部位に結合し、その一方で、キナーゼ触媒ループの動きを誘導するようなかたちでも結合を生じる。Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，ｐ．２６８（２００２）には、国際公開番号第ＷＯ００／４３３８４号、およびＲｅｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２９９４−３００８（２００２）にも開示されている阻害物質ｐ３８α−キナーゼが報告されている。これらの一群の阻害物質も、キナーゼのＡＴＰ活性部位で結合し、同時に、キナーゼ活性化ループの動きを生じる。
【０００５】
さらに最近、キナーゼは、活性化ループおよびキナーゼドメイン調節ポケットを利用して、触媒活性の状態を制御していることが開示されている。この点については、最近レビューが公開されている。Ｍ．ＨｕｓｅおよびＪ．Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ（２００２）１０９：２７５を参照されたい。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、特定の天然タンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する分子を識別する方法、ならびに新規なタンパク質と小型分子モジュレータのアダクトに関するものである。本発明の方法の側面では、天然タンパク質が持つ性質、すなわち、タンパク質は、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定のタンパク質を生物学的に上方調節して酵素とすることができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的に下方調節することができる。また、本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然のタンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、天然のタンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する新規な小型分子モジュレータを合理的に開発する方法を提供するものである。また、新規なタンパク質と小型分子とのアダクトも提供する。本発明は、好ましくは、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという天然タンパク質の性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定の酵素タンパク質を生物学的に上方調節することができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的に下方調節することができる。本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然タンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【０００８】
本発明で使用する場合には、「スイッチ制御リガンド」とは、天然タンパク質内の領域またはドメインであって、内部に、生化学的修飾、具体的には、リン酸化、硫酸化、アシル化、または酸化によってインビボで過渡的に修飾されて個別のいずれかをとる１以上のアミノ酸残基を有するものを意味する。同様に、「スイッチ制御ポケット」は、天然のタンパク質内の複数の隣接または非隣接アミノ酸残基であって、インビボで、上記個別状態のいずれかにあるスイッチ制御リガンドの過渡的に修飾された残基と結合して、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうる残基、および／または非天然のスイッチ制御調節分子と結合して、タンパク質のコンホメーションを誘導または制御することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうる残基を含むものであるようなものを意味する。
【０００９】
本発明のタンパク質・モジュレータ・アダクトは、スイッチ制御ポケットを備えた天然のタンパク質と、タンパク質の上記スイッチ制御ポケット領域に結合した非天然分子を含むものであり、この分子は、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによってそのタンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目を果たしている。好ましくは、このタンパク質は、対応するスイッチ制御リガンドも備えており、このリガンドは、インビボで、ポケットと相互作用を生じてタンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、リガンドとポケットの相互作用が生じると、そのタンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットの相互作用の不在下では、第二の異なったコンホメーションおよび生物学的活性をとるものである。
【００１０】
スイッチ制御リガンド／スイッチ制御ポケットの相互作用の性質については、図１〜４の模式図を考慮すると、理解しやすい。すなわち、図１に、「オン」スイッチ制御ポケット１０２および「オフ」スイッチ制御ポケット１０４、ならびにスイッチ制御リガンド１０６を含むタンパク質１００を模式的に示す。また、この模式的に描いたタンパク質は、ＡＴＰ活性部位１０８も含んでいる。図１のこのタンパク質の例では、リガンド１０６は、側鎖にＯＨ基１１０を含むアミノ酸残基３つを備えている。オフ・ポケット１０４は、対応するＸ残基１１２を、オン・ポケット１０２は、Ｚ残基１１４を含んでいる。この例では、タンパク質１００は、リガンド１０６上のＯＨ基１１０の荷電状態に応じて、コンホメーションが変化し、すなわち、ＯＨ基は、修飾されていない場合には、中性の電荷を示すが、これらの基がリン酸化されると、負の電荷を示すことになる。
【００１１】
ポケット１０２および１０４とリガンド１０６の官能性については、図２〜４を考慮すると理解しやすい。図２では、リガンド１０６がオフ・ポケット１０４と協同的に相互作用して、ＯＨ基１１０が、ポケット１０４の一部を形成するＸ残基１１２と相互作用している。こうした相互作用は、主に、ＯＨ基１１０と残基１１２の間の水素結合によるものである。このリガンド／ポケット相互作用が生じると、タンパク質１００が、図１に見られるのとは異なった、タンパク質のオフの、すなわち、生物学的に下方調節されたコンホメーションに対応するコンホメーションをとるようになる。
【００１２】
図３は、リガンド１０６が、図２のオフのポケット相互作用コンホメーションからシフトし、ＯＨ基１１０がリン酸化されて、リガンドが負に帯電した状態を示す。この状態では、リガンドは、ポケット１０２と相互に作用することによって、タンパク質のコンホメーションを、オン、すなわち生物学的に上方調節された状態（図４）に変化させようとする傾向が強い。図４ａには、リガンド１０６上のリン酸化された基が、正に帯電した残基１１４に引き寄せられて、安定化されたイオン状の結合を示している状態を示す。図４のコンホメーションでは、タンパク質のコンホメーションが、図２のオフのコンホメーションとは異なる状態となっており、ＡＴＰ活性部位が利用可能な状態となって、タンパク質がキナーゼ酵素として機能しうる状態となっていることに注意されたい。
【００１３】
図１〜４は、タンパク質が、別々のポケット１０２および１０４ならびにリガンド１０６を示す単純な状況について示すものである。しかし、多くの事例では、もっと複雑なスイッチ制御ポケットのパターンが観察される。図６は、小型分子との相互作用に適したポケットが、リガンド１０６と、たとえばポケット１０２の双方に由来するアミノ酸残基から形成されている状態を示す。こうしたケースを、リガンド１０６とポケットの双方に由来する残基から構成される「複合型スイッチ制御ポケット」と称し、番号１２０で示す。このポケット１２０と相互に作用してタンパク質を調節する小型分子１２２も図示する。
【００１４】
さらに複雑なスイッチポケットを図７に示す。このポケットは、オン・ポケット１０２由来の残基と、ＡＴＰ部位１０８とを含み、「組合わせ型スイッチ制御ポケット」と称するポケットを構成している。この組合わせ型のポケットを、番号１２４で示す。このポケットは、リガンド１０６由来の残基をさらに含むものとすることができる。このポケット１２４と相互に作用してタンパク質を調節する適当な小型分子１２６も図示する。
【００１５】
したがって、図１〜４に示すような単純なポケットの状況の場合には、小型分子は、単純なポケット１０２または１０４と相互に作用するのに対し、図６および７に示すようなさらに複雑な状況では、相互作用を生じるポケットが、ポケット１２０または１２４の領域に存在することになることが理解されるはずである。このように、広義では、小型分子は、各スイッチ制御ポケットの「領域」で相互作用を生じる。
【００１６】
図８および９は、インシュリン受容体のキナーゼドメインタンパク質のＸ線結晶構造解析によって得られたリボン図であり、図８は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのタンパク質を青で示す。この写真では、黄色のストランドは、スイッチ制御リガンドの配列、マゼンタの部分は、リガンド配列と相互に作用して、タンパク質を生物学的に上方調節されたコンホメーションに保つ相補的なオンのスイッチ制御ポケットを形成する鍵残基を示す。一方、図９は、オフのコンホメーション、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションのタンパク質を、真鍮模擬色で示す。この図では、スイッチ制御配列を図８と同じく黄色で示し、オフのスイッチ制御ポケットの鍵残基は緑で示す。スイッチ制御リガンドとオフのスイッチ制御ポケットとの相互作用によって、タンパク質が、図示した生物学的に下方調節されたコンホメーションに保たれる。
【００１７】
模式図についてさらに説明すると、図８の図は、リガンド１０６がポケット１０２と相互に作用する図４に対応する。同様に、図９は、リガンド１０６がポケット１０４と相互に作用する図２に対応する。
【００１８】
当業者は、特定のタンパク質が、タンパク質をオンのポケットとの相互作用へと導く傾向のあるリガンド１０６のリン酸化が生じているのか、タンパク質をオフのポケットとの相互作用を生じるコンホメーションへと導く傾向のあるリン酸基のリガンドからの脱離が生じているのかにもとづいて、上方調節されたコンホメーションと下方調節されたコンホメーションとの間で経時的に「スイッチ」されることを理解できるはずである。このように、スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用によって生じるコンホメーションの変化は、動的な性格をもつものであり、究極的には細胞内の状態によって支配されている。
【００１９】
また、タンパク質のコンホメーションに異常が生じると、病状が悪化する可能性があることも理解されるはずである。たとえば、所定のタンパク質が、オフのコンホメーション、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションのままとなってしまうと、活性のタンパク質が必要とされるような代謝プロセスが停止、遅滞したり、望ましくない副作用が生じる可能性がある。同様に、タンパク質が、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのままとなってしまうと、代謝プロセスが促進されすぎて、その結果、健康上の重篤な問題が生じる場合もある。
【００２０】
しかし、タンパク質活性を調節して、正常なインビボのタンパク質の活性を復元または近似させうる小型分子化合物を開発しうることを見出した。図５からわかるように、小型分子１１６はオフのポケット１０４と相互に作用して、リガンド１０６のポケット１０４との相互作用を防止することができる。この場合、この簡略仮想図では、タンパク質１００は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのままでいる可能性が高くなる。あるいは、小型分子１１８がオンのポケット１０２と相互作用することにより、リガンド１０６のポケット１０２との相互作用を防止することもできる。この場合、この簡略模式図では、リガンド１０６がオフのポケット１０４と相互作用して、タンパク質がオフのコンホメーションに移動する、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションとなる可能性が高くなる。
【００２１】
したがって、タンパク質を分析して、相互作用するスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットの位置および配列を確認し、同時に、これらがどのように相互作用してタンパク質が、生物学的に上方調節されたコンホメーションと、下方調節されたコンホメーションの間でスイッチされるのかを理解することは、タンパク質の活性を調節しうる小型分子化合物を設計・開発する際に使用できる強力な手段となる。
【００２２】
一般に、特定の天然タンパク質と相互に作用してタンパク質活性を調節する分子を識別する方法では、まず、タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドと、同じくタンパク質の一部を形成し、このリガンドと相互作用するスイッチ制御ポケットとを識別する。リガンドとポケットとは、協同して相互に作用して、タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、その際には、タンパク質は、リガンドとポケットが相互作用すると、第一コンホメーションと対応する第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットが相互作用しない場合には、第一コンホメーションとは異なる第二のコンホメーションおよび生物学的活性をとる。
【００２３】
次の工程では、第一および第二のコンホメーションのタンパク質の各サンプルを用意し、これらのタンパク質サンプルを使用して、候補小型分子のスクリーニング・アッセイをを行う。こうしたスクリーニングでは、一般に、候補分子を、サンプルの少なくとも１つと接触させ、どの小型分子が、上記で識別したタンパク質のスイッチ制御ポケット領域と結合するかを識別する。
【００２４】
本発明の方法は、多岐にわたる天然の哺乳動物（たとえばヒト）のタンパク質、たとえば野生型のコンセンサスタンパク質、疾病の多形、疾病の融合タンパク質、および／または人工的に操作した改変タンパク質に適用することができる。適用可能なタンパク質の分類群としては、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質を挙げることができ、具体的には、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質を挙げることができる。大抵の場合、対象タンパク質の分子量は少なくとも約１５ｋＤａ、より一般には、約３０ｋＤａを超えるものである。
【００２５】
本発明の方法の過程では、数多くの技法を用いて、１以上のスイッチ制御リガンド配列および１以上のスイッチ制御ポケットを識別し、候補小型分子モジュレータの上方および下方調節を判定することができる。一般に、こうした方法としては、生物情報学的分析、Ｘ線結晶構造解析、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、およびアフィニティ系のスクリーニングを挙げることができる。また、全くの通常技術、たとえば、部位特異的突然変異誘発および標準的な生化学実験法も役立つはずである。
【００２６】
生物情報学的分析を実施すると、実験を行うことなく、関連したリガンドおよびポケットを識別することが可能である。たとえば、関連タンパク質に関するデータは、場合によっては、利用可能なデータベース、たとえばＰＵＢＭＥＤの使用のみによっても評価することができる。したがって、最初の工程では、配列情報ＰＵＢＭＥＤを、対象タンパク質の公知の構造について調べる。次に、ＢＬＡＳＴ検索を行って、選択した最小ストリンジェンシー（たとえば、６０％以上）を含む他の配列を確認することができる。この検索によって、対象点突然変異または多形、ならびに異常融合タンパク質が明らかとなる可能性がある。これらの検索対象は、いずれも、疾患の原因となりうるものであり、疾患の原因となる機能性または機能障害性のスイッチ制御リガンド配列および／またはポケットの識別についての洞察が得られる可能性がある。こうした生物情報学的分析の具体例については、実施例１で後述する。
【００２７】
Ｘ線結晶構造解析法では、まず、高度に精製されたタンパク質が得られるタンパク質発現法が必要である。全遺伝子を合成する技術を使用して、使用する特定の発現系に対して最適化したタンパク質遺伝子を化学的に合成することもできる。通常技術を用いて、合成オリゴヌクレオチドから任意の遺伝子を迅速に合成することができる。ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ（登録商標））と付随する分子生物学的方法を用いると、任意の遺伝子を合成することができる。全遺伝子を合成する方が、最適な発現にむけて、コドンを最適化した遺伝子を迅速に合成できるので、伝統的なクローニング法より有利である。また、複雑な突然変異（たとえば、多くの異なった変異の組合わせによるもの）を、複数工程でなく１工程で生成することも可能である。制限部位を戦略的に配置すると、必要に応じて、突然変異を迅速に付加することができる。したがって、この技術を用いると、より短時間に、はるかに多くの遺伝子構築物を生成できる。タンパク質配列の選択は、系統分析、分子モデリングおよび構造予測、公知の発現、機能的なデータ・スクリーニング、報告済みの文献データの組合わせを用いて判断して、タンパク質製造戦略を開発する。発現構築物を市販の製品および／またはベクターを用いて製造して、タンパク質を、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞で発現させることができる。大腸菌の発現系を使用して、他のタンパク質を製造することもできる。遺伝子は、アフィニティ・タグを付加することによって修飾することもできる。遺伝子は、欠失、点突然変異、タンパク質の融合を生成することによって修飾して、発現を改善したり、精製の便宜をはかったり、結晶化を促進したりすることもできる。
【００２８】
タンパク質の精製： 発現実験で得られた全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、ミクロ流動化のうち、可溶性のタンパク質を得るうえで最も効果的な方法で破砕する。抽出物のタンパク質精製を、複数のカラム（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ、Ｑ−ｓｅｐｈ、Ｓ−Ｓｅｐｈ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ、およびＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅを含む複数のカラム）を標準的な手順で並行して走らせるロボット装置を使用してパラレルに実施し、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。この情報を、公開されている精製プロトコールと組合わせて、精製プロトコールを迅速に開発する。精製を終了したら、タンパク質を、複数の生物物理学的アッセイ（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、分析用ゲル濾過、等）に供する。
【００２９】
結晶の成長とＸ線による品質分析： スパース行列および集束結晶化スクリーンを、リガンド有りと無しの場合について２以上の温度で用意する。リガンド無しで得た結晶（アポ結晶）をリガンド含浸実験に用いる。結晶の成長状態を、最初の結果にもとづいて、タンパク質結晶に対して最適化する。適当なタンパク質結晶が得られたら、スクリーニングを行って、各種の凍結保存状態について、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶイメージングプレート装置およびＸ−ＳＴＲＥＡＭクリオスタットで、回折能を測定する。回折能のよいタンパク質結晶を、Ｘ線回折データの収集に使用するか、液体窒素中でその後のシンクロトロンＸ線放射源でのデータ収集用に保存する。タンパク質結晶の回折限界を、少なくとも２回回折画像を、９０°の間隔をおいたφスピンドルで撮影することによって決定する。回折画像を収集する間は、φスピンドルを１°揺動する。双方の画像を、Ｘ線データ解析のＨＫＬ−２０００スイートと分解ソフトウェアで処理する。タンパク質結晶の回折解像度は、インデクシングした反射の５０％以上が１シグマ以上の強さを有する解像シェルの高い側の解像限界として受け取る。
【００３０】
Ｘ線回折データの収集： タンパク質結晶が、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶシステムまたはシンクロトロンで３．０Å以上の回折を示すことがわかった場合には、完全なデータセットをシンクロトロンで収集する。ここで、完全なデータセットとは、解像度が最大のシェルでの全ての反射の９０％以上を収集した場合として定義するものである。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理用のソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理する（固有反射と強度に分解する）。
【００３１】
構造の決定： タンパク質の構造を、１以上のタンパク質検索モデルを利用した分子置換（ＭＲ）で決定する。このＭＲ法では、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）から入手可能なタンパク質の座標セットを使用する。必要に応じて、構造の決定は、重原子を用いた多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）および／または多波長異常分散（ＭＡＤ）法で行う。結晶（重原子を含まない母液または凍結保護物質で洗浄後のもの）のＥＸＡＦＳスキャンで適当な重原子シグナルが得られた場合には、重原子を含浸させた結晶についてのについてのＭＡＤシンクロトロンのデータセットを集める。誘導化のための重原子のデータセットの解析は、計算プログラムのＣＣＰ４結晶構造解析スイートを使用して行うことができる。重原子の部位を、（│ＦＰＨ│−│ＦＰ│）２の差のパターソンおよび（│Ｆ＋│−│Ｆ−│）２の異常差パターソン図で識別する。
【００３２】
スイッチ制御リガンド配列およびポケットの識別に際しては、強磁場核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析法を使用することもできる。ＮＭＲを用いた研究で、タンパク質、特にタンパク質キナーゼの構造を解明できることが報告されている。（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ；“ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ” Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：１９８６、Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｍｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９５、Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｊ．ら，Ｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｍｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１９９６．、Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｎ．Ｒ．；Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｌ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｍｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，２０），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ：２００３。
【００３３】
この２０年間で、ＮＭＲは、タンパク質の構造やタンパク質と他の生体分子との相互作用を探り、小型分子とタンパク質の相互作用の詳細を明らかにするうえで強力な技法に育ってきた。ＮＭＲ法は、Ｘ線結晶構造解析法と相補的であり、これらの２つの技法を組合わせると、タンパク質と小型分子の相互作用がどのようなものなのかを明らかとするうえで強力な戦略を立てることが可能となる。特に有用なＮＭＲ法は、１５Ｎおよび／または１３Ｃ標識タンパク質を調製し、このタンパク質のスイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットとの相互作用、または小型分子モジュレータのスイッチ制御ポケット領域との相互作用にともなって生じるタンパク質のコンホメーション変化時の化学シフトの動揺を分析するものである。
【００３４】
円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質のコンホメーションを調べるのに適した技法であり（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｃｕｕｍ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒｅｇｉｏｎ；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７８） ２９：９３、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎ．（１９９０） ７：２０５、Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．“Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ ２） Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ ７，１９８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｏｖａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．，Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．；Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９８９）、特に、タンパク質キナーゼのコンホメーションの変化を調べるうえでの円偏光二色性の利用も報告されている（Ｂｏｓｃａ，Ｌ．；Ｍｏｒａｎ，Ｆ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．（１９９３） ２９０：８２７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｒｃ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎｓ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３） ４２： ２０８、Ｄｅｎｇ，Ｚ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋｅｍｐ，Ｒ．Ｇ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−１−ｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９９） ３７１： ３２６；、Ｒｅｅｄ，Ｊ；Ｋｉｎｚｅｌ，Ｖ；Ｋｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｃ．；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ａ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ／ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５） ２４： ２９６７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｔｏｍｏ，Ｓ．；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔ．；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ ＵＶ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１） ４０： １５７９７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ａｃｉｄｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ａｓｐ２１ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１） ４０： １１９、Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｉ．；Ｂａｃｋｅｓｊｏ，Ｃ．−Ｍ．；Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｅ．；Ｌａｕｒｅｎ，Ｓ．；Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｉ．Ｅ．；“Ｓｉｘ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ−ｃａｕｓｉｎｇ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ： ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ．” Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００） １６４： ４１７０、Ｒａｉｍｂａｕｌｔ，Ｃ．；Ｃｏｕｔｈｏｎ，Ｆ．；Ｖｉａｌ，Ｃ．；Ｂｕｃｈｅｔ，Ｒ．；“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ａｎｄ ＫＣｌ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ． Ｉｎｆｒａｒｅｄ，ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ，ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．” Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５） ２３４： ５７０、Ｓｈａｈ，Ｊ．；Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｇ．Ｇ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９２） １１１９： １９）。
【００３５】
キナーゼの活性化（上方調節）に際して生じる、下方調節状態の場合よりはっきりとしたヘリックスの組織化およびコンホメーションの変化については、ＣＤによって観察することができる。スイッチ制御ポケットに基づく小型分子による調節が生じる結果、優勢なコンホメーション状態が安定化する可能性がある。小型分子モジュレータの存在下で得られたＣＤスペクトルと、モジュレータの不在下で得られたＣＤスペクトルの相関を調べると、小型分子の結合の性質を判定し、そうした結合を通常のＡＴＰ拮抗阻害物質の結合と区別することができる。
【００３６】
各種の生物分析法によって、小型分子のタンパク質に対する結合アフィニティを測定することができる。候補の小型分子モジュレータをスクリーニングする早期の段階では、キャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＺＥ）を利用するアフィニティ系のスクリーニング法を用いることができる。小型分子モジュレータとタンパク質の相互作用についてのＫｄｓ（解離定数）を直接測定することもできる。（Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｈ．；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｇｕｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ；Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９８）７１５： ２９−５４、 Ｙｅｎ−Ｈｏ Ｃｈｕ，Ｙ． −Ｈ．；Ｌｅｅｓ，Ｗ．Ｊ．；Ｓｔａｓｓｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．；Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．；Ｕｓｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４） ３３： １０６１６−１０６２１、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｇ．；Ａｎｄｅｒｅｇｇ Ｒ．Ｊ．；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｎｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９９） ５５： １１６５３−１１６６、Ｓｈｅｎ Ｈｕ，Ｓ．；Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ｎ．Ｊ．；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２００２） ７４： ２８３３−２８５０、Ｈｏｎｄａ，Ｓ．；Ｔａｇａ，Ａ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｋａｋｈｉ，Ｋ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９２） ５９７： ３７７−３８２、Ｃｏｌｔｏｎ，Ｉ．Ｊ．；Ｃａｒｂｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｒａｏ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： Ａ ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｏｒｇａｎｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９８） １９： ３６７−３８２。
【００３７】
別のアフィニティ系のスクリーニング法では、候補タンパク質と結合する蛍光プローブ・レポータを利用する。候補である小型分子モジュレータを、この蛍光プローブアッセイでスクリーニングする。タンパク質と結合する化合物を、蛍光プローブ・レポータの蛍光の低減によって測定する。この方法については、以下の実施例１で報告する。
【００３８】
本発明は、小型分子モジュレータとタンパク質のアダクトも提供する。タンパク質は、上述したタイプのものとする。モジュレータに関しては、モジュレータは、モジュレータとタンパク質の結合を最大限促進するために、スイッチ制御ポケット領域内の活性残基と相補的な官能基を有する必要がある。たとえば、各種キナーゼの場合には、１〜３のジカルボニル結合を有するモジュレータが有用であることが多いことがわかった。陽イオン性のスイッチ制御ポケットが見いだされた場合には、小型分子モジュレータは、酸性の官能基または部分、たとえばスルホン基、ホスホン基、カルボキシル基を有するものとすることが多い。分子量に関しては、好適なモジュレータは、通常、分子量が約１２０−６５０Ｄａ、より好ましくは約３００〜５５０Ｄａである。これらの小型分子モジュレータを全細胞環境で調べる場合には、小型分子モジュレータの特性が、小型分子モジュレータの細胞浸透性を最適化する周知の原理に適合する必要がある（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ Ｒｕｌｅ ｏｆ ５，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅｓ １−３，ｐｐ３−２５（１９９７））。
【００３９】
本発明は、タンパク質の生物学的活性を変更する方法も提供するものであり、この方法では、一般に、まず、スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質を用意する。次に、このタンパク質を、非天然分子のモジュレータと、このモジュレータがタンパク質のポケット領域に結合するような条件で接触させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する。
以下の実施例は、本発明の代表的な方法について説明するものである。しかし、これらの実施例は、例示を目的としてここに記載するものであって、実施例中の何らかの記載をもって、本発明全体の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
この実施例では、天然タンパク質の一部を形成するスイッチ制御ポケットの領域と相互作用して、タンパク質のインビボでの生物学的活性を調節する小型分子を識別および／または開発する技術を例示する。具体的には、本発明の方法を用いて、公知のキナーゼタンパク質ファミリーすなわち、ａｂｌ、ｐ３８−α、Ｇｓｋ−３β、インシュリン受容体−１、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ、およびトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼの分析を行った。
【００４１】
工程１：キナーゼタンパク質内のスイッチ制御リガンドの識別と分類
一般に、キナーゼのスイッチ制御リガンドは、この特徴に関しての十分に詳しい情報が入手可能であるならば、各キナーゼから得られた配列および構造についてのデータを使用することよって識別することができる。したがって、本方法のこの工程は、実験をおこなわなくても実施可能である。キナーゼに関する公知のデータを用いることで、過渡的に修飾可能なアミノ酸残基を容易に識別することができ、これらのアミノ酸残基は、こうしたタンパク質の場合には、リン酸化またはアシル化によって修飾される。スイッチ制御リガンド配列の全範囲がどこまでである可能性があるのかについては、推定可能である。キナーゼの場合に役立つもう一つの事項としては、リガンドが、残基のＤＦＧ配列から始まることが多いことを挙げることができる（本明細書では、明細書を通じて一文字アミノ酸コードを使用する）。
【００４２】
Ａｂｌキナーゼ
全長のＢＣＲ−Ａｂｌの配列を、本明細書では配列番号３４で示す。このａｂｌキナーゼおよびｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質キナーゼのスイッチ制御リガンド配列の一つは、配列：Ｄ３８１、Ｆ３８２、Ｇ３８３、Ｌ３８４、Ｓ３８５、Ｒ３８６、Ｌ３８７、Ｍ３８８、Ｔ３８９、Ｇ３９０、Ｄ３９１、Ｔ３９２、Ｙ３９３、Ｔ３９４、Ａ３９５、Ｈ３９６（リガンド１）（配列番号１）によって構成されている。上流の調節キナーゼまたは自己リン酸化によって（ｂｃｒ）ａｂｌが活性化すると、Ｙ３９３がリン酸化され、したがって、Ｙ３９３が、過渡的に修飾される残基である（Ｔａｎｉｓら，Ｍｏｌｅｕｌｃａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）２３：３８８４、ＢｒａｓｈｅｒおよびＶａｎ Ｅｔｔｅｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）２７５：３５６３１）。スイッチ制御リガンド配列は、ＤＦＧで始まり、Ｈ３９６で終わる。
【００４３】
別のスイッチ制御リガンドは、配列Ｍｙｒ−Ｇ２Ｑ３Ｑ４Ｐ５Ｇ６Ｋ７Ｖ８Ｌ９Ｇ１０Ｄ１１Ｑ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｐ１５Ｓ１６Ｌ１７（リガンド２）（配列番号２）を有している。ａｂｌキナーゼのアイソフォーム１Ｂに特異的なリガンド２は、ａｂｌタンパク質配列のＮ末端キャップであり、より具体的には、Ｇ２（グリシン２）に位置するＮ末端ミリストリル基である（ＪａｃｋｓｏｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：４４９、Ｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９９９）１４５１：１）。
【００４４】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ（配列番号３）のスイッチ制御リガンド配列は、配列： Ｄ１６８、Ｆ１６９、Ｇ１７０、Ｌ１７１、Ａ１７２、Ｒ１７３、Ｈ１７４、Ｔ１７５、Ｄ１７６、Ｄ１７７、Ｅ１７８、Ｍ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１、Ｙ１８２、Ｖ１８３、Ａ１８４、Ｔ１８５、Ｒ１８６、Ｗ１８７、Ｙ１８８、Ｒ１８９（配列番号４）によって構成されている。ｐ３８−αが上流の調節キナーゼによって活性化されるとＴ１８０およびＹ１８２がリン酸化され（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）４：４２３およびこの文献の参考文献を参照のこと）、したがって、これらが過渡的に修飾可能な残基である。
【００４５】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
全長のＧｓｋ−３βキナーゼの配列を、本明細書では配列番号３２で示す。１ＧＮＧ結晶構造に対応するＧｓｋ−３βキナーゼの配列を、本明細書では配列番号３３で示す。Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質のスイッチ制御リガンド配列は、配列：Ｄ２００、Ｆ２０１、Ｇ２０２、Ｓ２０３、Ａ２０４、Ｋ２０５、Ｑ２０６、Ｌ２０７、Ｖ２０８、Ｋ２０９、Ｇ２１０、Ｅ２１１、Ｐ２１２、Ｎ２１３、Ｖ２１４、Ｓ２１５、Ｙ２１６、Ｉ２１７、Ｃ２１８、Ｓ２１９、Ｋ２２０（Ｇｓｋリガンド１）（配列番号５）によって構成され、上流の調節キナーゼによる活性化が生じるとＹ２１６がリン酸化される（Ｈｕｇｈｅｓら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９３）１２：８０３、Ｌｅｓｏｒｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）７２：５７６、ｔｅｒ Ｈａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）８：５９３およびこれらの文献の参考文献を参照のこと。
【００４６】
別のスイッチ制御リガンド配列は：Ｇ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｒ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｓ９、Ｆ１０、Ａ１１、Ｅ１２（Ｇｓｋリガンド２）（配列番号６）であり、Ｓ９が、上流のキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔの作用によってリン酸化される（Ｄａｊａｎｉら，Ｃｅｌｌ（２００１）１０５：７２１、Ｃｒｏｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７８：７８５）。Ｓ９が過渡的に修飾可能な残基である。
【００４７】
インシュリン受容体キナーゼ−１
全長のＩＲＫ−１遺伝子を、本明細書では、配列番号３５で示す。１ＧＡＧ結晶構造に対応する配列を、本明細書では、配列番号３６で示す。配列番号３６では、少なくとも最初の残基が、配列番号３５と異なることに注意されたい。このインシュリン受容体キナーゼ−１のスイッチ制御リガンド配列は、配列：Ｄ１１５０、Ｆ１１５１、Ｇ１１５２、Ｍ１１５３、Ｔ１１５４、Ｒ１１５５、Ｄ１１５６、Ｉ１１５７、Ｙ１１５８、Ｅ１１５９、Ｔ１１６０、Ｄ１１６１、Ｙ１１６２、Ｙ１１６３、Ｒ１１６４、Ｋ１１６５、Ｇ１１６６、Ｇ１１６７、Ｋ１１６８、Ｇ１１６９、Ｌ１１７０（配列番号７）によって構成されている。Ｙ１１５８、Ｙ１１６２、およびＹ１１６３が、過渡的に修飾可能な残基であり、インシュリン受容体がインシュリンによって活性化されるとリン酸化される（Ｈｕｂｂａｒｄら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９７）１６：５５７２およびこの文献の参考文献を参照のこと）。
【００４８】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋ
全長のＡｔｋ１配列を、本明細書では、配列番号３７で示す。タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔキナーゼのみのドメインを、本明細書では、配列番号３８で示す。これらの配列は、Ｎ末端とＣ末端が異なっていることに注意されたい。また、キナーゼのみのドメインは、全長配列の残基１４３で始まっている。タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋのスイッチ制御リガンド配列は、Ｐ４６８、Ｈ４６９、Ｆ４７０、Ｐ４７１、Ｑ４７２、Ｆ４７３、Ｓ４７４、Ｙ４７５、Ｓ４７６、Ａ４７７、Ｓ４７８（配列番号８）によって構成されている。Ｓ４７４が、過渡的に修飾可能な残基であり、上流のキナーゼ調節タンパク質による活性化が生じるとリン酸化され、リン酸化されていないＰＫＢ／Ａｔｋと比べて、ＰＫＢ／Ｐｔｋ活性を１，０００倍上昇させる（Ｙａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２）９：１２２７およびこの文献の参考文献を参照のこと）。
【００４９】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
ＴＧＦ−Ｂ−Ｉ受容体キナーゼの全長配列を本明細書では、配列番号３９で示す。このトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御リガンドが、Ｔ１８５、Ｔ１８６、Ｓ１８７、Ｇ１８８、Ｓ１８９、Ｇ１９０、Ｓ１９１、Ｇ１９２、Ｌ１９３、Ｐ１９４、Ｌ１８５、Ｌ１９６（配列番号９）である。Ｔ１８５、Ｔ１８６、Ｓ１８７、Ｓ１８９、およびＳ１９１が、過渡的に修飾可能な残基であり、トランスフォーミング成長因子Ｂ−ＩＩ受容体のキナーゼ活性が活性化されると、一部または全体がリン酸化される（Ｗｒａｎａら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３４１、ＣｈｅｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１５６５）。
【００５０】
工程２：スイッチ制御ポケットの識別と分類
スイッチ制御リガンドの識別の場合と同じく、相補的なスイッチ制御ポケットも、公開されたキナーゼのデータ、特に、Ｘ線結晶構造解析から推定することができる。この分析の最初の工程は、対応するスイッチ制御リガンド内の先に識別した過渡的に修飾可能な残基に結合する残基を識別する作業であった。
【００５１】
Ａｂｌキナーゼ
ａｂｌキナーゼ（配列番号３０）のＸ線結晶構造解析によって、１ＦＰＵ（配列番号１０）（Ｓｃｈｌｉｎｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８９：１９３８）および１ＩＥＰ（配列番号１１）（Ｎａｇａｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）６２：４２３６）の構造にもとづく推定スイッチ制御ポケットの配列が明らかとなった。スイッチ制御ポケットの配列は、上記で識別したキナーゼのスイッチ制御リガンド１の配列と相補的であり、α−Ｃヘリックス（残基２７９〜２９３）と触媒ループ（残基３５９〜３６８）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、α−Ｃヘリックス由来のリシン２８５と、触媒ループ由来のアルギニン３６２が、スイッチ制御ポケットの一部を形成しており、ちなみに、これらの残基は、スイッチ制御リガンド由来の過渡的に修飾された（リン酸化）残基Ｙ３９３の結合を安定化させる。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基２５３〜２７９）、Ｎ−ｌｏｂｅ（残基２７１）、β−５ストランド（残基３１３〜３１８）由来の残基、α−Ｃヘリックス（残基２８０〜２９０）由来の他のアミノ酸、触媒ループ（残基３５９〜３６８）由来の他のアミノ酸が挙げられる。また、Ｃローブ残基４０１または４１６は、このポケットの基部を形成しているものと予測される。
【００５２】
表１は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼのリガンド１のスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。アミノ酸残基の位置に言及する場合は、いずれも、全長タンパク質に関するものであり、全長タンパク質の位置２２３から始まる配列番号３０に関するものではない。
【００５３】
【表１】
【００５４】
ａｂｌキナーゼのＸ線結晶構造解析によって、リガンド２と相補的な構造１ＯＰＬ（配列番号１２および１３）にもとづく推定スイッチ制御ポケットの配列が明らかとなった。ａｂｌキナーゼのアイソフォーム１Ｂの構造１ＯＰＬのＸ線結晶構造解析によって、この推定スイッチ制御ポケットが明らかとなる（Ｎａｇａｒら，Ｃｅｌｌ（２００３）１１２：８５９）。
【００５５】
表２は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼのリガンド２と相補的なスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸配列を示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ（配列番号３１）のＸ線結晶構造解析によって、１ＫＶ２（配列番号１４）の構造（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら；Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ，Ｂｉｏｌ．９，ｐｐ．２６８−２７２（２００２））にもとづく推定スイッチ制御ポケットが明らかとなる。さきに識別したスイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基６１〜７８）と触媒ループ（残基１４６〜１５５）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン６７および／またはアルギニン７０は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１４９は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸としては、グリシンに富んだループ（残基３４〜３６）由来の残基、α−Ｃヘリックス（残基６１〜７８）由来のアミノ酸、触媒ループ（残基１４６〜１５５）由来のアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基１９７〜２００由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００５８】
表３は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
ｇｓｋ−３βキナーゼのＸ線結晶構造解析によって、１ＧＮＧ（配列番号１５）、１Ｈ８Ｆ（配列番号１６および１７）、１１０９（配列番号１８）および１Ｏ９Ｕ（配列番号２８および２９）の構造（Ｆｒａｍｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．１３２１−１３２７（２００１）、Ｄａｊａｎｉら，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．７２１−７３２（２００１）、Ｄａｊａｎｉら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４９４−５０１（２００３）、およびｔｅｒ Ｈａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．５９３−５９６（２００１））にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。さきに識別したスイッチ制御リガンド配列１および２に対応するスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基９６〜１０４）と触媒ループ（残基１７７〜１８６）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン９６は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１８０は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基６６〜６８）に由来する残基、α−Ｃヘリックス（残基９０〜１０４）に由来するアミノ酸、触媒ループ（残基１７７〜１８６）に由来するアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基２３３〜２３５由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００６１】
表４は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６２】
【表４】
【００６３】
インシュリン受容体キナーゼ−１
インシュリン受容体キナーゼ−１のＸ線結晶構造解析によって、１ＧＡＧ（配列番号１９および２０）、１ＩＲＫ（配列番号２１）の構造（Ｐａｒａｎｇら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８，ｐ．３７（２００１）；Ｈｕｂｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，ｐ．４７６（１９９４））にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。スイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基１０３７〜１０５４）と触媒ループ（残基１１２７〜１１３７）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン１０３９は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１１３１は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基１００５〜１００７）に由来する残基、α−Ｃヘリックス（残基１０３７〜１０５４）に由来するアミノ酸、触媒ループ（残基１１２７〜１１３７）に由来するアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基１１８５〜１１８７由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００６４】
表５は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６５】
【表５】
【００６６】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ
タンパク質キナーゼＢ／ＡｋｔのＸ線結晶構造解析によって、１ＧＺＫ（配列番号２２）、１ＧＺＯ（配列番号２３）、１ＧＺＮ（配列番号２４）の構造（Ｙａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２）９：１２２７）にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。対応するスイッチ制御リガンド配列に対するスイッチ制御ポケットは、Ｂヘリックス（残基１８５〜１９０）、Ｃヘリックス（残基１９４〜２０４）、β−５ストランド（残基２２５〜２３１）に由来するアミノ酸残基から構成されている。具体的には、アルギニン２０２は、Ｃヘリックスに由来する。
【００６７】
表６は、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔのスイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６８】
【表６】
【００６９】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのＸ線結晶構造解析によって、１Ｂ６Ｃ（配列番号２５）の構造（Ｈｕｓｅら，Ｃｅｌｌ（１９９９）９６：４２５）にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。スイッチ制御ポケットは、ＧＳ−１ヘリックス、ＧＳ−２ヘリックス、Ｎローブ残基２５３〜２６６、α−Ｃヘリックス残基２４２〜２５２に由来するアミノ酸残基によって構成されている。
【００７０】
表７は、ＴＧＦ Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７１】
【表７】
【００７２】
第二のスイッチ制御ポケットは、ＴＧＦ Ｂ−１受容体キナーゼ中に存在している。このスイッチ制御ポケットは、上述の（ｂｃｒ）ａｂｌ（表１）、ｐ３８−αキナーゼ（表３）、ｇｓｋ−３βキナーゼ（表４）について記載したポケットと類似している。ＴＧＦ Ｂ−１は、ポケットに適合する明瞭な相補的なスイッチ制御リガンドを持たないものの、このポケットは、進化的に保存されており、小型分子スイッチ制御モジュレータの結合に際して利用可能となっている。このポケットは、グリシンに富んだループ、α−Ｃヘリックス、触媒ループ、スイッチ制御リガンド配列、Ｃローブに由来する残基から構成されている。
【００７３】
表８は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７４】
【表８】
【００７５】
第三のスイッチ制御ポケットは、空間的には、ＡＴＰ結合ポケットとα−Ｃヘリックスの間に位置しており、表９に特定した構築物に由来する残基から構成されている。このポケットは、αＣヘリックスが「閉形態」に歪んだ結果形成され、阻害タンパク質ＦＫＢＰ１２（配列番号２６）が結合する（Ｈｕｓｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００１）８：６７１を参照のこと）。
【００７６】
表９は、第三スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７７】
【表９】
【００７８】
工程３：スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用の性質の確認、および小型分子の設計上適当な座位の識別
【００７９】
１．一般的な計算法
スイッチ制御ポケット、そしてスイッチ制御ポケットとリガンドの相互作用をコンピュータを利用して描写するにあたっては、ＳｕｒｆＮｅｔ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．，１９９５，１３，３２３）、ＰＡＳＳ（Ｇ．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．Ｊｒ．；Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．２０００，１４，３８３）、Ｖｏｉｄｏｏ（Ｇ．Ｊ．ＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＴ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ（１９９４） Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ５０，１７８−１８５；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｃｒ．ａｃ．ｕｋ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ａｃｔａ／ｔｏｃｓ／ａｃｔａｄ／１９９４／ａｃｔａｄ５００２．ｈｔｍｌ；、およびＳｑｕａｒｅｓ（Ｊｉａｎｇ，Ｆ．；Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｈ．；“Ｓｏｆｔ−ｄｏｃｋｉｎｇ”： Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｕｂｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２１９，７９）を改変したものを、ポケットの可視化を行うＧＲＡＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｔｏｒ．ｂｉｏｃ．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｇｒａｓｐ／）と組合わせて使用した。小型分子のケモタイプをこれらの推定部位にパニングおよびドッキングするにあたっては、ＳｏｆｔＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｌｓｏｎ−ｗｅｂ／ｄｏｃ／ａｕｔｏｄｏｃｋ／；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．；Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｒ．Ｓ．；Ｈｕｅｙ，Ｒ．；Ｈａｒｔ，Ｗ．Ｅ．；Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．；Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，１９，１６３９］およびＤｏｃｋ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｐｈａｒｍ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｋｕｎｔｚ／ｄｏｃｋ．ｈｔｍｌ；Ｅｗｉｎｇ，Ｔ．Ｄ．Ａ．；Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９９７，１８，１１７５］を、ＡＭＢＥＲベース［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｅｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ａｍｂｅｒ／ａｍｂｅｒ．ｈｔｍｌ］の束縛分子ダイナミクスと適宜組合わせて使用した。
【００８０】
ポケット解析プログラムで使用される一般的なアプローチは、隙間領域を画定し、この領域を用いて、タンパク質表面で溶剤がアクセスするうえで利用できる穴を決定するというものである。隙間領域は、球または立方体を基本として把握し、隙間領域の画定に際しては、まず、２つ以上の原子間の領域を球または立方体（全形または裁頭形）で充填し、これらを使用して、３Ｄ密度マップを計算し、このマップの輪郭を描いて、隙間領域の表面を画定する。サーフネット（Ｓｕｒｆｎｅｔ）の使用者用マニュアルから抜粋した球についての一般的なアプローチは、下記のようなものである。
【００８１】
ａ．２つの原子ＡおよびＢのファンデルワールス面の間に、ちょうど各面に接触するように、試行隙間球が配置されている。
【００８２】
ｂ．隣接する原子について、順番に考えていく。いずれかの原子が、隙間球に貫入するようであれば、試行隙間球の半径を、隙間球が貫入している原子とちょうど接触するようになるまで低減する。この過程を、すべての隣接する原子について考慮するまで繰り返す。球の半径が、所定の最低限度（通常１．０Ａ）に満たない場合には、この球は不適である。そうでない場合には、最終的な隙間球を保存する。
【００８３】
この手順を、全ての原子のペアについて考慮し、隙間領域が球で充填されるまで継続する。
【００８４】
ｄ．次に、ガウス型関数を使用して、球を使用して格子点の３Ｄアレイ状の点を更新する。
【００８５】
ｅ． この更新は、格子の輪郭を１００．０の輪郭レベルで描いた際に、得られる３Ｄ面が各隙間球と対応するように行う。
【００８６】
ｆ．すべての球で格子が更新されたら、最終的な３Ｄ輪郭が、相互貫入する隙間球の表面を表し、したがって、表面ポケットを構成するポケット原子群の範囲を確定することになる。
【００８７】
ポケット分析に影響を及ぼす要因としては、格子点の間隔、用いる輪郭レベル、隙間を充填するのに使用する球の半径の最小および最大限度を挙げることができる。一般に、スイッチ制御ポケットのサイズおよび形状は、各個別プログラムによって決定された計算スイッチ制御ポケットを重ね合わせることによって見いだされるコンセンサス・ポケットによって描かれる。
【００８８】
上述したように、スイッチ制御リガンドと１以上のスイッチ制御ポケットの相互作用が生じると、「複合型スイッチポケット」と称されるポケットが形成されることが見いだされた。この複合型スイッチポケットは、スイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケット由来のアミノ酸残基を含む配列を有している。
【００８９】
別のケースでは、スイッチ制御ポケットまたは複合型スイッチ制御ポケットが、活性部位ポケット（たとえば、キナーゼのＡＴＰポケット）と重なって、「組合わせ型スイッチ制御ポケット」が形成されることがある。こうした組合わせ型スイッチ制御ポケットは、スイッチ制御阻害物質の役目をはたす小型分子との結合に際しての座位としても有用な可能性がある。
【００９０】
複合型スイッチポケットおよび組合せ型スイッチポケットは、もちろん、スイッチ制御ポケットに関して上述したのと同じ技法を使用することによって解析することができる。
【００９１】
Ａｂｌキナーゼ
ＳＵＲＦＮＥＴでのポケットの解析を図１０に示す。スイッチ制御ポケットを青で強調してある。このスイッチ制御ポケットをＧＲＡＳＰで見たところを、図１１に示す。図中、タンパク質の複合型ポケット領域を丸で囲んである。図１２に、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。複合型ポケットを構成するアミノ酸残基は、先に識別したスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットによって提供される。スイッチ制御ポケットの模式図を、図６に示す。
【００９２】
表１０に、複合型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基を示す。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
この複合型スイッチ制御ポケット用の小型分子の当初の設計では、Ｎローブのβストランド残基（Ｍ２７８）、α−Ｃヘリックス（Ｅ２８２、Ｋ２８５）、α−Ｅヘリックス（Ｆ３５９）、触媒ループ（Ｉ３６０、Ｈ３６１、Ｒ３６２、Ｄ３６３、Ｎ３６８）、スイッチ制御リガンド配列（Ｒ３８６、Ｌ３８７、Ｙ３９３）、Ｃループ残基（Ｆ４０１）、およびα−Ｆヘリックス（Ｆ４１６）に由来するアミノ酸と結合する化学プローブに焦点をあてた。この複合型スイッチ制御ポケットを利用すると、この（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼ複合型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる阻害物質を設計することができる。
【００９５】
スクリーニング用に選択された代表的な化合物は、Ｎ−（４−メチル−３−（４−フェニルピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−Ｌ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミドである。
【００９６】
図１３は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの組合わせ型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。組合せ型ポケットを構成するアミノ酸残基は、先に識別したスイッチ制御リガンド、スイッチ制御ポケット、ＡＴＰ活性部位に由来する。組合わせ型スイッチ制御ポケットの模式図を、図７に示す。
【００９７】
表１１に、組合せ型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基を示す。
【００９８】
【表１１】
【００９９】
この組合わせ型スイッチ制御ポケットを利用すると、この（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの組合わせ型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる阻害物質を設計することができる。
【０１００】
スクリーニング用に選ばれた代表的な化合物としては、Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（１，１，３−トリオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−２−イルメチル）−ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−Ｄ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−Ｌ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−イルアミノ）−フェニル］−４−（４，４−ジオキソ−４−チオモルホリノメチル）ベンズアミド、およびＮ−（３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）−４−メチルフェニル）−４−（（１−メチル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−４−イル）メチル）ベンズアミドを挙げることができる。
【０１０１】
ｐ３８−αキナーゼ
ＳＵＲＦＮＥＴでポケットを解析した図を図１４に示す。複合型スイッチ制御ポケットを青で強調してある。この複合型スイッチ制御ポケットをＧＲＡＳＰで見たところを、図１５に示す。
【０１０２】
図１６は、ｐ３８−αキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。これらのアミノ酸は、グリシンに富んだループ（Ｙ３５）、α−Ｃヘリックス（Ｉ６２、Ｉ６３、Ｒ６７、Ｒ７０、Ｌ７４、Ｌ７５、Ｍ７８）、α−Ｄヘリックス（Ｉ１４１、Ｉ１４６）、触媒ループ（Ｉ１４７、Ｈ１４８、Ｒ１４９、Ｄ１５０、Ｎ１５５）、Ｎローブストランド（Ｌ１６７）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ１６８、Ｆ１６９）、およびα−Ｆヘリックス（Ｙ２００）に由来するものである。複合型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基については、下表で説明する。
【０１０３】
表１２に、複合型スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【０１０４】
【表１２】
【０１０５】
この複合型スイッチ制御ポケットを利用すると、このｐ３８−αキナーゼのスイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる制御物質を設計することが可能となる。
【０１０６】
代表的な化合物としては、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）プロピオン酸、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニルプロピオン酸、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素、および１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素を挙げることができる。
【０１０７】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
ポケットをＳＵＲＦＮＥＴで解析した図を、図１７に示す。図中では、複合型スイッチ制御ポケットが青で強調してある。この複合型スイッチ制御ポケットのＧＲＡＳＰによる解析図を、図１８に示す。
【０１０８】
図１９は、ｇｓｋ−３βキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。残基は、グリシンに富んだループ（Ｆ６７）、α−Ｃヘリックス（Ｒ９６、Ｉ１００、Ｍ１０１、Ｌ１０４）、α−Ｄヘリックス（Ｉ１４１、Ｉ１４６）、触媒ループ（Ｉ１７７、Ｃ１７８、Ｈ１７９、Ｒ１８０、Ｄ１８１、Ｎ１８６）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ２００、Ｆ２０１、Ｓ２０３、Ｋ２０５、Ｌ２０７、Ｖ２０８、Ｐ２１２、Ｎ２１３、Ｖ２１４、Ｙ２１６）、およびα−Ｆヘリックス（Ｙ２００）に由来するものである。このポケットを利用すると、このｇｓｋ−３βキナーゼ複合型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる小型分子モジュレータ化合物を設計することができる。
【０１０９】
表１３に示す複合型ポケットは、デュアル機能性を備えたスイッチ制御ポケットである。このポケットは、相補的なリガンド配列１（Ｇｓｋリガンド１）と結合すると、タンパク質の活性を上方調節するオンのポケットとして機能する。また、このポケットは、相補的なリガンド配列２（Ｇｓｋリガンド２）と結合すると、タンパク質の活性を下方調節するオフのポケットとして機能する。
【０１１０】
表１３に、複合型スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
工程４：各種のスイッチ制御状態に静的に封じ込められたタンパク質の発現および精製
遺伝子の合成：遺伝子は、ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ（登録商標）、Ｅｍｅｒａｌｄ／ｄｅＣＯＤＥ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を使用してコドンの使用を最適化することにより、完全に合成オリゴヌクレオチドから製造した。全遺伝子の合成を行うと、コドンを最適化した遺伝子を迅速に合成することができる。制限部位を戦略的に配置すると、必要に応じて、突然変異を迅速に付加することができる。
【０１１３】
タンパク質は、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞または大腸菌の発現系で発現させた。遺伝子は、場合によっては、アフィニティ・タグを導入することによって修飾することもでき、この場合、タグを付したタンパク質の一工程での抗体−アフィニティ精製を行うことが可能となることも多い。構築物は、結晶性、リガンドとの相互作用、精製、コドンの使用に関して最適化した。昆虫細胞培養能力が月１００リットル以上の容量１１リットルのバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）２基を使用した。
【０１１４】
タンパク質の精製：タンパク質の精製には、ＡＫＴＡ精製装置、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ、Ｐａｒｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏｍｂ、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５ホモジナイザー、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒ（登録商標）タンパク質製造装置（Ｅｍｅｒａｌｄの自動並行精製装置）を使用した。精製タンパク質の特性解析には、蛍光分光法、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析、動的光散乱の機器を使用した。
【０１１５】
全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、またはミクロ流動化で破砕した。抽出物を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒ（登録商標）装置を使用して、タンパク質の並行精製に供した。このＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒは、Ｅｍｅｒａｌｄによって開発されたロボット装置で、（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、金属キレート、Ｑ−ｓｅｐｈ、Ｓ−Ｓｅｐｈ、フェニル−Ｓｅｐｈ、およびシバクロンブルーを含む）複数の精製カラムで精製を同時に行うことができる。得られた分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。精製タンパク質は、各種の生物物理学的アッセイ（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、分析用ゲル濾過など）に供して、精製レベルを測定した。
【０１１６】
Ａｂｌキナーゼ
Ａｂｌ構築物１（キナーゼドメイン、６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５３４）、Ａｂｌ構築物２（キナーゼドメイン、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５１８）、ａｂｌ構築物３（キナーゼドメイン、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５１８、Ｙ４１２Ｆの変異）、ａｂｌ構築物４（アイソフォーム、Ｋ２９Ｒ／Ｅ３０Ｄの変異を含む１Ｂ１−５３１、ＴＥＶ−６ｘＨｉｓ−Ｇｌｕ）、ａｂｌ構築物５（Ｋ２９Ｒ／Ｅ３０Ｄ／Ｙ４１２Ｆの変異を含むアイソフォーム１Ｂ１−５３１）の全遺伝子合成およびサブクローニングを完了し、昆虫細胞でトランスフェクションを実施した。Ｂｃｒ−ａｂｌ構築物１（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基１−２０２９）およびｂｃｒ−ａｂｌ構築物２（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基１−２０２９；Ｙ４１２Ｆ変異体）も同様に調製し、昆虫細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション生成物を、必要に応じて、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０７９０またはＧｌｅｅｖｅｃの存在下でフェルンバッハで培養して、生成した（ｂｃｒ）Ａｂｌタンパク質が、Ｙ２４５またはＹ４１２でリン酸化されていないことを確認した（Ｔａｎｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，ｐ ３８８４，（２００３）、Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７５，ｐ ３５６３１，（２０００）を参照されたい）。タンパク質の発現レベルを、免疫沈降法とＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。ａｂｌ構築物１および２のタンパク質の発現レベルは、１０ｍｇ／Ｌを超えていた。これらの阻害物質の存在下で発現された精製タンパク質のＰｙ２０（抗ホスホチロシン抗体）ウェスタン・ブロッティングを行って、これらのタンパク質が、Ｙ２４５またはＹ４１２でリン酸化されていないことを確認した。
【０１１７】
図２０および２１は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィー（図２０）、およびその後のＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィー（図２１）の後にＰＤ１８０９７０の存在下で発現されたａｂｌ−構築物２の純度を示す。図２２は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーで得られたａｂｌ構築物２についての溶出特性を示し、図２３は、ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたＡｂｌ構築物２についての溶出特性を示す。この形態のａｂｌは、リン酸化されていない物理的状態にある。
【０１１８】
図２４は、ｔｅｖプロテアーゼで処理してＧｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶアフィニティ・タグを除去した後のＡｂｌ構築物２の溶出特性を示す。分画１７〜１９には、Ｇｌｕ−６ｘ／Ｈｉｓ−ＴＥＶタグが無傷のままのａｂｌタンパク質が含有されており、分画２０〜２３には、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグが除去されたａｂｌタンパク質が含有されている。プール分画２０〜２３を紫外線で解析すると（図２５）、吸収の最大が３６０ｎｍに見られ、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０９７０がａｂｌのＡＴＰポケットに結合したまま存在していること示唆され、ａｂｌタンパク質が、発現および精製の間も、非リン酸化状態に保持されていることが確認された。
【０１１９】
図２６は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーおよびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのクロマトグラフィーで精製したａｂｌ構築物５タンパク質（ａｂｌの１−５３１、Ｙ４１２Ｆ変異体）の溶出プロファイルを示す。図２７は、精製プール分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅでの解析結果を示す。
【０１２０】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ構築物１（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、全長）または構築物２（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基５−３５４）の全遺伝子合成を完了し、タンパク質をアラビノース誘導性ベクターおよびＴ７プロモータベクターの双方を使用して大腸菌で発現させた。２種の発現ベクター（ｐＥＴ１５ｂおよびｐＢＡＤ）でのｐ３８−αキナーゼの発現を、０．５ＭのＩＰＴＧ（ｐＥＴ１５ｂ）または０．２％のアラビノース（ｐＢＡＤ）による誘導の後に調べた。タンパク質の発現は、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。誘導後のｐＢＡＤ構築物でのｐ３８−αの発現は、抗ＧＬＵモノクローナル抗体を用いた免疫沈降で明瞭に示された。
【０１２１】
図２８は、Ｑ−セファロースを用いたクロマトグラフィーでのｐ３８−αタンパク質の溶出プロファイルを示す。プール精製分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅの結果を、図２９に示す。
【０１２２】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
構築物１（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、全長、１Ｈ８Ｆタンパク質と同配列）、構築物２（１０ｘＨｉｓ、残基２７−３９３、１ＧＮＧタンパク質と同配列）、構築物３（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基３５−３８５）について、全遺伝子合成を完了した。昆虫細胞でトランスフェクションを行った。タンパク質の発現を、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。構築物３の発現レベルは、５ｍｇ／Ｌを超えていた。ｇｓｋ−３βタンパク質の精製で用いた手順では、スイッチ制御リガンドの非リン酸化キナーゼ（ＧＳＫ−Ｐ）とスイッチ制御リガンドのリン酸化キナーゼ（ＧＳＫ＋Ｐ）の双方の形態を、同じ発現過程で単離することが可能であった。ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で実施した。この工程に引き続いて、ＰＯＲＯＳ ＨＳ（陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。図３０は、ＧＳＫ＋Ｐタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルであり、予測分子イオンが４２８６２Ｄａであることが示されている。
図３１は、ＧＳＫ−Ｐタンパク質のＭＡＤＬＩ−ＴＯＦスペクトルであり、予測分子イオンが４２７８１であることが示されている。
【０１２３】
図３２および３３に、ＰＯＲＯＳ ＨＳクロマトグラフィーの分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、ホスホチロシン抗体ＰＹ−２０で染色したものを示す。分画１０〜１５は、ＰＹ−２０抗体によってイメージングされ、スイッチ制御リガンドのチロシン残基にリン酸塩が存在していることが示唆された。分画１７〜２９は、ＰＹ−２０抗体によってはイメージングされず、スイッチ制御リガンドのチロシンのリン酸化が生じていないことが示唆された。
【０１２４】
工程５：小型分子スイッチ制御モジュレータ候補を用いた精製タンパク質のスクリーニング
Ｐ３８−αキナーゼのスクリーニング／Ｐ３８ＭＡＰキナーゼの結合アッセイ
小型分子モジュレータのｐ３８ＭＡＰキナーゼに対する結合活性を、公開された方法（Ｃ．Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）９，２６８−２７２、Ｊ．Ｒｅｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）４５，２９９４−３００８）で修飾したＳＫＦ８６００２を蛍光プローブとして用いた競合アッセイで測定した。概述すると、ｐ３８キナーゼ（Ｋｄ＝１８０ｎＭ）の有力な阻害物質であるＳＫＦ８６００２は、キナーゼとの結合時に３４０ｎｍで励起されると４２０ｎｍ周辺で蛍光を発する。したがって、ｐ３８キナーゼの阻害物質の結合アフィニティは、ＳＫＦ８６００２からの蛍光を低減する能力によって測定することができる。ＳＫＦ８６００２は、ｐ３８−αキナーゼのＡＴＰ活性部位ポケットの合体状況に関してのレポーターの役目を果たす蛍光プローブ物質となる。ｐ３８−αキナーゼのスイッチ制御ポケットと結合する小型分子モジュレータは、タンパク質のコンホメーションを歪ませて、蛍光プローブＳＫＦ８６００２の結合能力を妨害する。したがって、小型分子が、蛍光プローブの結合を妨害する能力を利用して、スイッチ制御ポケットに対する結合状態を実験的に読み取ることができる。対照実験を実施して、小型分子モジュレータが、ＡＴＰポケットで競合することによって、蛍光プローブの結合と直接競合するかどうかについて判定した。アッセイは、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＢＭＧ）に載置した３８４プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ３８４プレート）で実施した。具体的には、反応混合物は、０．１５％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルグルコシドと２ｍＭのＥＤＴＡとを含有する２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン緩衝液（ｐＨ７）中に、１μＭのＳＫＦ８６００２、８０ｎＭのｐ３８キナーゼ、および各種濃度の阻害物質を含んでいた（最終容積６５μｌ）。酵素を加えることによって反応を開始した。プレートを、室温（約２５℃）で２時間インキュベートし、その後、４２０ｎｍでの発光および３４０ｎｍでの励起を読み取った。ｒｆｕ（相対蛍光ユニット）値を、対照（小型分子モジュレータ不在のもの）の値と比較することによって、小型分子の各濃度での阻害率を計算した。小型分子モジュレータのＩＣ５０の値を、小型分子モジュレータの濃度範囲で得られた阻害率の値から、Ｐｒｉｓｍで計算した。時間依存性の阻害について評価する場合には、プレートを複数の反応時間、たとえば、０．５、１、２、３、４、および６時間で読み取った。ＩＣ５０の値を、各時点について計算した。ＩＣ５０の値が反応時間とともに（４時間に２倍以上）低減する場合には、阻害が時間依存性であると認定した。
【０１２５】
【表１４】
ＩＣ５０の値は、反応時間２時間で得たものである
【０１２６】
工程６：タンパク質の調節についてのスイッチ制御機構の確認
【０１２７】
タンパク質に対するアフィニティを有するか、タンパク質活性の機能的調節を示すことが見いだされた小型分子を、生化学的に調べて、結合または機能の調節が、天然のリガンド部位（たとえば、キナーゼタンパク質のＡＴＰ部位）と非競合性または未競合性であるかどうかについて判定した。この過程は、標準的なＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ型の解析を行うことによって実施した。
【０１２８】
スイッチ制御モジュレータの各種タンパク質との結合モードを、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ法で判定した。以下のセクションでは、分子の結合モードを判定する際に使用したＸ線結晶構造解析技術の概要を説明する。
【０１２９】
Ｘ線結晶構造解析を使用した、タンパク質調節のスイッチ制御機構の判定
【０１３０】
１．結晶化の実験施設：結晶化の試行のデータは、すべて、専用に構築したデータベース・ソフトウェアを使用して捕捉し、このソフトウェアは、結晶化試験を行い、結果を監視する各種のロボット装置を駆動する。Ｂ． コンピュータ・ハードウェア：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｉｎｕｘのワークステーション、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００のサーバー、およびＳｉｌｉｃｏｎ ＧｒａｐｈｉｃｓのＯ２のワークステーション。 Ｃ． Ｘ線結晶構造解析ソフトウェア： ＨＫＬ２０００（ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを含む）（Ｘ線回折データの処理）、ＭＯＳＦＩＬＭ、ＣＣＰ４スイーツ（ＡＭＯＲＥ、ＭＯＬＲＥＰ、およびＲＥＦＭＡＣを含む）（分子置換、ＭＩＲ、およびＭＡＤによるフェージングをはじめとする各種の結晶構造解析計算オペレーション）、ＳｎＢ（重原子の位置）、ＳＨＡＲＰ（重原子のフェージング・プログラム）、ＣＮＸ（モデルの精緻化をはじめとする各種の結晶構造解析計算オペレーション）、ＥＰＭＲ（分子置換）、ＸｔａｌＶｉｅｗ（モデルの可視化および構築）。
【０１３１】
２．結晶の成長とＸ線による品質分析：スパース行列および集束結晶化スクリーンを、リガンド有りと無しの場合について２以上の温度で用意する。リガンド無しで得た結晶（アポ結晶）をリガンド含浸実験に用いる。適当なタンパク質結晶が得られたら、スクリーニングを行って、各種の凍結保存状態について、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶイメージングプレート装置およびＸ−ＳＴＲＥＡＭクリオスタットで、タンパク質結晶の回折能を測定する。回折能のよいタンパク質結晶を、インハウスでのＸ線回折データの収集に使用するか、液体窒素中でその後のシンクロトロンＸ線放射源（アルゴンヌ国立研究所の高度光子源のＣＯＭ−ＣＡＴビームラインまたは他のシンクロトロンビームライン）でのデータ収集用に保存する。タンパク質結晶の回折限界を、少なくとも２回回折画像を、９０°の間隔をおいたφスピンドルで撮影することによって決定する。回折画像を収集する間は、φスピンドルを１°揺動する。双方の画像を、Ｘ線データ解析のＨＫＬ−２０００スイートと分解ソフトウェアで処理する。タンパク質結晶の回折解像回折解像度は、インデクシングした反射の５０％以上が１シグマ以上の強さを有する解像シェルの高い側の解像限界として受け取る。
【０１３２】
３．Ｘ線回折データの収集：完全なデータセットとは、解像度が最大のシェルでの全ての反射の９０％以上を収集した場合として定義するものである。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理用のソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理する（固有反射と強度に分解する）。
【０１３３】
４．構造の決定：タンパク質−小型分子複合体の構造を、ＰＤＢから入手可能な１以上のタンパク質検索モデルを利用して、分子置換（ＭＲ）で決定する。必要に応じて、構造の決定は、重原子を用いた多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）および／または多波長異常分散（ＭＡＤ）法で行う。結晶（重原子を含まない母液または凍結保護物質で洗浄後のもの）のＥＸＡＦＳスキャンで適当な重原子シグナルが得られた場合には、重原子を含浸させた結晶についてのＭＡＤシンクロトロンのデータセットを集める。誘導化のための重原子のデータセットの解析は、計算プログラムのＣＣＰ４結晶構造解析スイートを使用して行うことができる。重原子の部位を、（│ＦＰＨ│−│ＦＰ│）２の差のパターソンおよび（│Ｆ＋│−│Ｆ−│）２の異常差パターソン図で識別する。
【０１３４】
工程７：上記工程の繰り返しによる、小型分子のスイッチ制御モジュレータの改良
【０１３５】
タンパク質活性を調節することが見いだされた各小型分子を、タンパク質スーパーファミリー内の他のタンパク質（たとえば、候補タンパク質がキナーゼである場合なら、他の各種キナーゼ）、またタンパク質ファミリー間（たとえば、候補タンパク質がキナーゼである場合なら、ホスファターゼおよび転写因子のような他の各種のタンパク質クラス）でのアフィニティおよび機能の調節について評価した。小型分子のスクリーニング・ライブラリーも、このスクリーニング・パラダイム内で評価を行った。構造活性関係（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、ＳＡＲ）も評価し、その後、小型分子を、候補タンパク質に対してより有効となるように、および／または、候補タンパク質の調節に関しての選択的が増し、標的タンパク質と対抗的なタンパク質との相互作用が低減するように設計した。
【０１３６】
キナーゼタンパク質の解析によって、スイッチ制御ポケットには、相補的なスイッチ制御リガンドに対する結合のしかたによって分類される４つの種類があること、すなわち、（１）通常は、相補的なスイッチ制御リガンド（帯電リガンド）で、セリン、トレオニン、またはチロシンアミノ酸残基がリン酸化されることによって、または、メチオニンまたはシステインアミノ酸の硫黄原子が酸化されることによって形成される帯電リガンドを安定化して結合するポケット、（２）水素結合または疎水性の相互作用（水素結合／疎水性リガンド）の機序によってリガンドに結合するポケット；（３）アシル化残基（アシル化リガンド）を有するリガンドを結合するポケット、および（４）リガンドと内因的に結合することはないものの、非天然のスイッチ制御モジュレータ化合物（非識別リガンド）と結合しうるポケット、の４種類があることが明らかとなった。また、これらの４種類のポケットは、図１〜４に模式的に示す単純型のポケット、図６に示す複合型のポケット、または図７の複合型のポケットである可能性がある。最後に、ポケットは、ポケットが有するスイッチ制御の機能性によって定義することもでき、すなわち、ポケットは、スイッチ制御リガンドと相互に作用すると、生物学的に情報調節されたコンホメーションを生じるオンのタイプである場合、スイッチ制御リガンドと相互に作用すると、生物学的に下方調節されたコンホメーションを生じるオフのタイプである場合、そして「デュアル機能性」ポケットと称する、すなわち、同じポケットが、異なった相補的なスイッチ制御リガンドと相互に作用することによって、オンのポケットとオフのポケットの両方の役目をはたすことを意味するポケットである場合がある。これと同じ一連のポケットは、すべての対象タンパク質、すなわち、スイッチ制御リガンド配列と相補的なスイッチ制御ポケットとの相互作用によってコンホメーションの変化が生じるようなタンパク質のすべてで見いだすことができる。
【０１３７】
下記の表１５は、工程２および３で説明したポケットを、ポケットの分類および種類に関して、さらに識別するものである。
【０１３８】
【表１５】
【０１３９】
本発明の主目的は、選択されたタンパク質の１以上のスイッチ制御ポケットの領域に結合して、タンパク質の活性を調節する非天然小型分子のモジュレータ化合物の設計、開発を可能とすることである。この機能的目標は、スイッチ制御ポケットの種類（オン、オフ、デュアル）、選択したモジュレータ化合物の性質、モジュレータ化合物とタンパク質の間の相互作用的結合の種類に応じて、いくつかの異なった方法で達成することができる。
【０１４０】
たとえば、選択されたモジュレータ化合物は、選択されたスイッチ制御ポケットに、スイッチ制御リガンドのアゴニストとして結合することができ、すなわち、モジュレータ化合物は、天然の相補的なスイッチ制御リガンドによって生じるのと同じタイプのコンホメーションの変化を生じることができる。さしたがって、スイッチ制御リガンドのアゴニストが、オンのポケットと結合した場合には、結果として、タンパク質の活性の上方調節が生じ、オフのポケットと結合した場合には、下方調節が生じる。
【０１４１】
これとは逆に、所定のモジュレータは、スイッチ制御リガンドのアンタゴニストとして結合することもでき、すなわち、モジュレータ化合物は、天然の相補的なスイッチ制御リガンドによって生じるのとは逆のタイプのコンホメーションの変化を生じることもできる。したがって、スイッチ制御リガンドのアンタゴニストが、オンのポケットと結合した場合には、結果として、タンパク質の活性の下方調節が生じ、オフのポケットと結合した場合には、上方調節が生じる。
【０１４２】
デュアル機能性のポケットの場合、また非識別リガンドが存在するポケットの場合には、モジュレータ化合物は、生じる応答の種類に応じて、機能的アゴニストとして作用している場合も、機能的アンタゴニストとして作用している場合もある。
【０１４３】
＜実施例２＞
スイッチ制御小型分子候補の合成
以下の実施例では、キナーゼタンパク質と相互作用するスイッチ制御分子の候補として特に有用な化合物の合成について説明する。これらの実施例では、アルファベットを付した実施例は、中間生成物の合成について、番号を付した実施例は、最終化合物の合成について記載したものである。
［Ｂｏｃ−スルファミド］アミノエステル（反応物質ＡＡ）、１，５，７，−トリメチル−２，４−ジオキソ−３−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノナン−７−カルボン酸（反応物質ＢＢ）、およびケンプ酸無水物（反応物質ＣＣ）を、文献の方法に従って製造した。詳細については、Ａｓｋｅｗら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，１０８２を参照されたい。
【０１４４】
実施例Ａ
【０１４５】
【化１】
ｍ−アミノ安息香酸（２００ｇ、１．４６ｍｏｌ）の濃ＨＣｌへの溶液（２００ｍＬ）に、ＮａＮＯ２（１０２ｇ、１．４６ｍｏｌ）の水溶液（２５０ｍＬ）を０℃で加えた。反応混合物を１時間撹拌し、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（６６２ｇ、２．９２ｍｏｌ）の濃ＨＣｌ（２Ｌ）への溶液を０℃で加え、反応系をさらに室温で２時間撹拌した。沈殿を濾別し、エタノールおよびエーテルで洗浄したところ、３−ヒドラジノ安息香酸ヒドロクロリドが、白色固形物として得られた。
前反応で得られた粗生成物（２００ｇ、１．０６ｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタンニトリル（１４６ｇ、１．１６７ｍｏｌ）のエタノール（２Ｌ）溶液を一晩加熱還流した。反応溶液を真空中で蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製したところ、３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸エチル（実施例Ａ、１１６ｇ、４０％）が白色固形物として、３−（５−アミノ−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（９３ｇ、３６％）とともに得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３），１．２８（ｓ，９Ｈ）．
【０１４６】
実施例Ｂ
【０１４７】
【化２】
イソシアン酸１−ナフチル（９．４２ｇ、５５．７ｍｍｏｌ）とピリジン（４４ｍＬ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）への溶液に、実施例Ａ（８．０ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）への溶液を０℃で加えた。混合物を室温にて１時間撹拌し、固形分がすべて溶解するまで加熱し、室温にてさらに３時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で急冷した。沈殿物を濾過し、希ＨＣｌおよびＨ２Ｏで洗浄し、真空中で乾燥して、３−［３−ｔ−ブチル−５−（３−ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸エチル（１２．０ｇ、９５％）を、白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．００（ｓ，１Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ），８．２５ ７．４２（ｍ，１１Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），４．３０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．２６（ｓ，９Ｈ），１．０６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４５７．１０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１４８】
実施例Ｃ
【０１４９】
【化３】
実施例Ａ（１０．７ｇ、７０．０ｍｍｏｌ）のピリジン（５６ｍＬ）とＴＨＦ（３０ｍＬ）の混合物への溶液に、カルバミン酸４−ニトロフェニル４−クロロフェニル（１０ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）への溶液を０℃で加えた。混合物を、室温にて１時間撹拌し、固形分がすべて溶解するまで加熱し、室温にてさらに３時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）を加え、水相を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を一緒にし、１Ｎ ＮａＯＨ、０．１Ｎ ＨＣｌ、および飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶剤を真空中で除去したところ３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝安息香酸エチル（８．０ｇ、５２％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．１１（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｍ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），４．３０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４１（Ｍ＋＋Ｈ）．
【０１５０】
実施例Ｄ
【０１５１】
【化４】
実施例Ｂ（８．２０ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）への溶液に、かきまぜながら、ＬｉＡｌＨ４粉末（２．６６ｇ、７０．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中で−１０℃にて加えた。混合物を、室温にて２時間撹拌し、過剰のＬｉＡｌＨ４を、氷を徐々に加えることによって分解した。反応混合物を、希ＨＣｌでｐＨ７まで酸性化し、真空中で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を一緒にして、真空中で濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（ヒドロキシメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（７．４０ｇ、９９％）が、白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．１９（ｓ，１Ｈ），９．０４（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．２６−７．３５（ｍ，１１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５２】
実施例Ｅ
【０１５３】
【化５】
実施例Ｃ（１．６６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）とＳＯＣｌ２（０．６０ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）のＣＨ３Ｃｌ（１００ｍＬ）への溶液を３時間還流し、真空中で濃縮して、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−クロロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（１．６８ｇ、９７％）を白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．２６（ｓ，１Ｈ），９．１５（ｓ，１Ｈ），８．４２−７．４１（ｍ，１１Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５４】
実施例Ｆ
【０１５５】
【化６】
実施例Ｃ（１．６０ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）への溶液に、撹拌しながら、ＬｉＡｌＨ４粉末（４１３ｍｇ、１０．９ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中で−１０℃にて加えた。混合物を２時間撹拌し、氷を加えることによって過剰なＬｉＡｌＨ４を急冷した。溶液を希ＨＣｌで酸性化してｐＨ７とした。溶液を徐々に除去し、固形分を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２００＋１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−ヒドロキシメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素（１．４０ｇ、９７％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．１１（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．２７（ｍ，８Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），５．３０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．２６（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５６】
実施例Ｇ
【０１５７】
【化７】
実施例Ｆ（８００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とＳＯＣｌ２（０．３０ｍＬ、４ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）への溶液を、３時間にわたって穏やかに還流した。溶剤を真空中で蒸発させ、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍＬ）に加えた。溶剤を除去すると、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（クロロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素（８１２ｍｇ、９７％）が白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．５７（ｓ、１Ｈ）、８．７５（ｓ、１Ｈ）、７．６３（ｓ、１Ｈ）、７．５０−７．２６（ｍ、７Ｈ）、６．３５（ｓ、１Ｈ）、４．８３（ｓ、２Ｈ）、１．２７（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５８】
実施例Ｈ
【０１５９】
【化８】
ＬｉＡｌＨ４（５．２８ｇ、１３９．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０００ｍＬ）への懸濁液に、実施例Ａ（２０．０ｇ、６９．６ｍｍｏｌ）をＮ２中で０℃にて少量ずつ加えた。反応混合物を５時間撹拌し、０℃の１Ｎ ＨＣｌで急冷し、沈殿物を濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、濾液を蒸発させたところ、［３−（５−アミノ−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］メタノール（１５．２ｇ、８９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．４９（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｓ，１Ｈ），５．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２４６．１９（Ｍ＋Ｈ＋）．
前反応で得られた粗生成物（５．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＳＯＣｌ２（４．８５ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌し、真空中で濃縮し、３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−クロロメチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（５．４ｇ）を得、これを、Ｎ３（３．９３ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）への溶液に加えた。反応混合物を３０℃に２時間加熱し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）に加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を一緒にし、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮したところ、３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アジドメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（１．５０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）が得られた。
【０１６０】
実施例I
【０１６１】
【化９】
実施例Ｈを無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、１−イソシアノナフタレン（１．１３ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）とピリジン（５．２７ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を３時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）で急冷し、得られた沈殿を濾過し、１Ｎ ＨＣｌとエーテルで洗浄して、１−［２−（３−アジドメチル−フェニル）−５−ｔ−ブチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−３−ナフタレン−１−イル−尿素（２．４ｇ、９８％）を白色固形物として得た。
前反応で得られた粗生成物とＰｄ／Ｃ（０．４ｇ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）への溶液を、１気圧で室温にて２時間水素化した。触媒を濾過によって除去し、濾液を真空中で濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アミノメチル）フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（２．２ｇ、９６％）が黄色固形物として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．０２（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６７−７．３３（ｍ，９Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１４（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１６２】
実施例Ｊ
【０１６３】
【化１０】
実施例Ｈ（１．５０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）への溶液を、イソシアン酸４−クロロフェニル（１．０２ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）とピリジン（５．２７ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に、室温で加えた。反応混合物を、３時間撹拌し、その後、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）を加えた。沈殿を濾過し、１Ｎ ＨＣｌおよびエーテルで洗浄したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アミノメチル）フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素（２．２８ｇ、９７％）が白色固形物として得られ、この生成物は、それ以上精製することなく次工程に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２４（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１６４】
実施例Ｋ
【０１６５】
【化１１】
ベンジルアミン（１６．５ｇ、１５４ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸エチル（５１．５ｇ、３０８ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）への溶液に、 Ｋ２ＣＯ３（１２７．５ｇ、９２４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にて３時間撹拌し、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、真空中で濃縮し、クロマトグラフィーにかけたところ、Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンエチルエステル（２９ｇ、６７％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３９−７．２３（ｍ，５Ｈ），４．１６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），３．９１（ｓ，２Ｈ），３．５４（ｓ，４Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ：２８０（Ｍ＋＋Ｈ）．
Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンエチルエステル（７．７０ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）のメチルアミンアルコール溶液（２５〜３０％、５０ｍＬ）への溶液を、密封管中で３時間５０℃に加熱し、室温に冷却し、真空中で濃縮したところ、Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンメチルアミドが得られた。収量（７．６３ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．７５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），３．２０（ｓ，４Ｈ），２．８１（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ２５０（Ｍ＋Ｈ＋）．
Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンメチルアミド（３．０９ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）との混合物に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１５ｇ）を加えた。混合物を撹拌し、４０ｐｓｉのＨ２中で、４０℃に１０時間加熱し、濾過し、真空中で濃縮したところ、Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−グリシンメチルアミドが得られた。収量（１．７６ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ６．９５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．２３（ｓ，４Ｈ），２．７９（ｄ，Ｊ＝６．０，４．８Ｈｚ），２．２５（ｂｒ ｓ １Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ１６０（Ｍ＋Ｈ＋）
【０１６６】
実施例Ｌ
【０１６７】
【化１２】
【０１６８】
＜実施例３＞
【０１６９】
【化１３】
化合物１，１−ジオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−３−オン（９４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とＮａＨ（５．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の混合物のＴＨＦ（２ｍＬ）への溶液を、Ｎ２中で、−１０℃にて、ＮａＨがすべて溶解するまで１時間にわたって撹拌した。実施例Ｅ（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、Ｈ２Ｏで急冷し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を一緒にして真空中で濃縮し、残留物を調製用ＨＰＬＣで精製したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−｛［３−（１，１，３−トリオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−２−イル）メチル］フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（１８ｍｇ）が、白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７１−７．４４（ｍ，１１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５３３．４０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７０】
＜実施例５＞
【０１７１】
【化１４】
イソシアン酸クロロスルホニル（１９．８μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）への０℃の溶液に、撹拌しながら、ピロリジン（１８．８μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）を、反応溶液の温度が５℃を超えて上昇することのないような速さで加えた。１．５時間撹拌した後、実施例Ｊ（９７．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（９５μＬ、０．６７８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）への溶液を、反応温度が５℃を超えて上昇することのないような速さで加えた。添加を完了したら、反応溶液を室温まで温め、一晩撹拌した。反応混合物を、１０％のＨＣｌに加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶剤を除去し、粗生成物を、調製用ＨＰＬＣで精製したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルカルボニル）アミノ］スルホニル］アミノメチル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４３−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．２３−７．２５（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），３．０２（ｍ，４Ｈ），１．７５（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５７４．００（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７２】
＜実施例６＞
【０１７３】
【化１５】
標記化合物を、実施例Ｉを使用して、実施例５と同様にして製造したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルカルボニル）アミノ］スルホニル］アミノメチル］−フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８８（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．５０（ｍ，７Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｓ，１Ｈ），３．３２−３．３６（ｍ，４Ｈ），１．７７−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５９０．０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７４】
＜実施例７＞
【０１７５】
【化１６】
【０１７６】
ＸＨ2Ｘλ2（０．５μΛ）に溶解しているクロロスルホニルイソシアネート（１９．８μΛ，２２７μμｏλ）の０℃でかくはんされている溶液へ、実施例Ｊ（９７．３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）が、反応溶液の温度が５℃を超えないような速度で添加された。１．５時間のかくはんの後、ＣＨ2Ｃｌ2（１．５ｍＬ）に溶解しているピロリジン（１８．８μＬ，０．２２７ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（９５μＬ，０．６７８ｍｍｏｌ）の溶液が、反応溶液の温度が５℃を超えないような速度で添加された。添加が完了したら、反応溶液は室温まで加温され、一晩かくはんされた。反応混合物は、１０％ＨＣｌに注がれ、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出され、有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄され、Ｍｇ2ＳＯ4で乾燥され、ろ過された。溶媒の除去の後、粗物質は、分取ＨＰＬＣによって精製され、１−（３−tert−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルスルホニル）アミノ］カルボニル］アミノメチル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）ウレアが得られた。
【０１７７】
＜実施例８＞
【０１７８】
【化１７】
【０１７９】
標記化合物を、実施例Ｉを使用して、実施例７と同様にして製造したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルスルホニル）アミノ］カルボニル］アミノメチル］−フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８８（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．５０（ｍ，７Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｓ，１Ｈ），３．３２−３．３６（ｍ，４Ｈ），１．７７−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５９０．０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１８０】
＜実施例２１＞
【０１８１】
【化１８】
【０１８２】
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２(４ｍｌ）中の実施例Ｌ（０．２ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）と１−ナフチルイソシアネート（０．１０ｇ，０．６ｍｍｏｌ）の混合物を窒素下１８時間室温で攪拌した。溶媒を真空で除去し粗製品をエチルアセテート／ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２(3/1/0.7）を溶出液(0.11g、灰色がかった白色固体）に使ったカラムクロマトグラフィーで精製し１−{３−tert−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル}−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア、融点１９４−１９６を得た。
【０１８３】
＜実施例２３＞
【０１８４】
【化１９】
【０１８５】
実施例Ｌ（０．２ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）とフェニルイソシアネート（０．０９ｇ，０．６ｍｍｏｌ）を用いて実施例２１と同様の方法で標題化合物１−{３−tert−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル}−３−フェニルウレアを合成した。
【０１８６】
実施例Ｎ
【０１８７】
【化２０】
（３−ニトロフェニル）酢酸（２３ｇ、１２７ｍｍｏｌ）のメタノール（２５０ｍｌ）への溶液と、触媒量の真空中で濃縮したＨ２ＳＯ４を１８時間加熱還流した。反応混合物を、真空中で濃縮して、黄色の油を得た。この生成物をメタノール（２５０ｍｌ）に溶解し、氷浴中にて１８時間撹拌し、アンモニアをゆっくり通気した。揮発成分を真空中で除去した。残留物を、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥して、２−（３−ニトロフェニル）アセトアミド（１４ｇ、灰白色の固形物）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．１（ｓ，１Ｈ），８．０（ｄ，１Ｈ），７．７（ｄ，１Ｈ），７．５（ｍ，１Ｈ），７．１（ｂｄ ｓ，１Ｈ），６．２（ｂｒｓ，１Ｈ），３．６（ｓ，２Ｈ）．
【０１８８】
前反応で得られた粗生成物（８ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（１ｇ）のエタノール（１００ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉで１８時間にわたって水素化し、セライトで濾過した。揮発成分を真空中で除去したところ、２−（３−アミノフェニル）アセトアミド（５．７ｇ）が得られた。この物質の溶液（７ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を、６Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、激しく撹拌した。亜硝酸ナトリウム（３．２２ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）の水（５０ｍｌ）への溶液を加えた。３０分後に、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（２６ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）への溶液を加えた。反応混合物を、０℃で３時間撹拌した。ｐＨを、５０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１４に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒にして真空中で濃縮したところ、２−（３−ヒドラジノフェニル）アセトアミドが得られた。
【０１８９】
前反応で得られた粗生成物（約１５ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（１．８５ｇ、１５ｍｍｏｌ）のエタノール（６０ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（１．５ｍｌ）への溶液を１時間還流し、室温に冷却した。反応混合物を、固形の炭酸水素ナトリウムを加えることによって中和した。スラリーを濾過し、揮発成分を真空中で除去したところ、残留物が得られ、この残留物を酢酸エチルで抽出した。溶剤を真空中で除去したところ、２−［３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］アセトアミドが、白色固形物（３．２ｇ）として得られ、この生成物は、それ以上精製せずに使用した。
【０１９０】
＜実施例２５＞
【０１９１】
【化２１】
実施例Ｎ（２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１２４ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて１８時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、粗製物を酢酸エチル（８ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が、白色固形物（０．２２ｇ）として得られた。融点： ２３０℃(dec.)；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：
δ９．１２（ｓ，１Ｈ），８．９２（ｓ，１Ｈ），８．３２−８．０８（ｍ，３Ｈ），７．９４−７．４４（ｍ，８Ｈ），６．４４（ｓ，１Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ．
【０１９２】
＜実施例２６＞
【０１９３】
【化２２】
標記化合物を、実施例Ｎ（０．２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．１１２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を使用して、実施例２３と同様にして合成したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素が白色固形物（０．２８ｇ）として得られた。融点：２２２ ２２４℃(dec.)；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；δ９．１５（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），７．５５−７．３１（ｍ，８Ｈ），６．３９（ｓ，１Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ．
【０１９４】
実施例Ｐ
【０１９５】
【化２３】
３−（３−アミノ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル（６ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（１ｇ）の混合物のエタノール（５０ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉにて１８時間水素化し、セライトで濾過した。真空中で揮発成分を除去したところ、３−（３−アミノ−フェニル）プロピオン酸のメチルエステルが（６ｇ）得られた。
前反応で得られた粗生成物（５．７ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）の６Ｎ ＨＣｌ（３５ｍｌ）への溶液を激しく撹拌しながら、０℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム（２．２ｇ）の水（２０ｍｌ）への溶液を加えた。１時間後、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（１８ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（３５ｍｌ）への溶液を加え、混合物を０℃で３時間撹拌した。ｐＨを、固形ＫＯＨを用いてｐＨ１４に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をまとめて真空中で濃縮したところ、３−（３−ヒドラジノ−フェニル）プロピオン酸メチル（１．７ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物（１．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（１．２ｇ、９．７ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（２ｍｌ）への撹拌溶液を、１８時間還流し、室温に冷却した。揮発成分を真空中で除去し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮し、残留物を、酢酸エチルのヘキサンへの３０％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製したところ、３−［３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］プロピオン酸メチル（３．２ｇ）が得られ、この生成物はそれ以上精製せずに使用した。
【０１９６】
＜実施例２９＞
【０１９７】
【化２４】
実施例Ｐ（０．３５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１９ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて２０時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、残留物を、水酸化リチウム（０．１ｇ）を含むＴＨＦ（３ｍｌ）／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）／水（１．５ｍｌ）の溶液中で室温にて３時間撹拌し、ＥｔＯＡｃおよび希クエン酸溶液で希釈した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、揮発成分を真空中で除去した。残留物を、メタノールのＣＨ２Ｃｌ２への３％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（ナフタレン−１−ｙｌ）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニルプロピオン酸（０．２２ｇ、褐色の固形物）を得た。融点：１０５−１０７；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８７−７．３６（ｍ，１０Ｈ），７．１８−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０１９８】
＜実施例３０＞
【０１９９】
【化２５】
標記化合物を、実施例Ｐ（０．３０ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．１４６ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を使用して、実施例２９と同様にして合成したところ、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）プロピオン酸（０．０５ｇ、白色固形物）が得られた。融点：８５ ８７；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２１（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．１４（ｍ，７Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２００】
実施例Ｑ
【０２０１】
【化２６】
３−（４−アミノフェニル）アクリル酸エチル（１．５ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（０．３ｇ）の混合物のエタノール（２０ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉにて１８時間水素化し、セライトで濾過した。真空中で揮発成分を除去したところ、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸エチル（１．５ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物溶液（１．５ｇ、８．４ｍｍｏｌ）を、６ＮのＨＣｌ（９ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、激しく撹拌した。亜硝酸ナトリウム（０．５８ｇ）の水（７ｍｌ）への溶液を加えた。１時間後、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（５ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（１０ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物は、０℃で３時間攪拌された。反応混合物のｐＨを固形ＫＯＨを用いてｐＨ１４に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をまとめて真空中で濃縮したところ、３−（４−ヒドラジノ−フェニル）−プロピオン酸エチル（１ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物（１ｇ、８．８ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（０．７ｇ）のエタノール（８ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（１ｍｌ）への溶液を、１８時間還流し、室温に冷却した。揮発成分を、真空中で除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。残留物を、溶出液としてメタノールのＣＨ２Ｃｌ２への０．７％溶液を使用したカラムクロマトグラフィーで精製し、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸エチル（０．５７ｇ）を得た。
【０２０２】
＜実施例３１＞
【０２０３】
【化２７】
実施例Ｑ（０．２５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて２０時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、残留物を、水酸化リチウム（０．１ｇ）を含むＴＨＦ（３ｍｌ）／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）／水（１．５ｍｌ）の溶液中で室温にて３時間撹拌し、ＥｔＯＡｃおよび希クエン酸溶液で希釈した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、揮発成分を真空中で除去した。残留物を、メタノールのＣＨ２Ｃｌ２への４％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸（０．１８ｇ、灰白色の固形物）を得た。融点：１２０ １２２；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８９−７．０６（ｍ，１１Ｈ），６．５（ｓ，１Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２０４】
＜実施例３２＞
【０２０５】
【化２８】
標記化合物を、実施例Ｑ（０．１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．０７７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を使用して、実施例３１と同様にして合成したところ、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸（０．１６ｇ、灰白色固形物）が得られた。融点：１１２−１１４；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１６（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｓ，２Ｈ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２０６】
＜実施例３９＞
【０２０７】
【化２９】
【０２０８】
＜実施例４１＞
【０２０９】
【化３０】
【０２１０】
磁気式かくはん棒が備えられた１００ｍＬの丸底フラスコで、実施例３９（２．０７ｇ）がＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）に溶解され、氷浴で０℃まで冷却された。ＢＢｒ3（ＣＨ2Ｃｌ2の１Ｍ溶液；７．５ｍＬ）が時間をかけて添加された。反応物は一晩中室温に加温された。さらなるＢＢｒ3（ＣＨ2Ｃｌ2の１Ｍ溶液を２×１ｍＬ、合計で９．５ｍｍｏｌが添加された）が添加され、反応物はＭｅＯＨを添加することによってクエンチされた。溶媒の蒸発により結晶物質が生成し、これは、溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（９．６：０．４）を用いたシリカゲル（３０ｇ）によるクロマトグラフィーによって分離され、１−［３−tert−ブチル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（０．４０ｇ，２０％）が得られた。
【０２１１】
実施例Ｘ
【０２１２】
【化３１】
【０２１３】
＜実施例５９＞
【０２１４】
【化３２】
【０２１５】
実施例Ｘ（１．３７ｇ）とｐ−ブロモフェニルイソシアネート（９９０ｍｇ）を用いて実施例４１と同様の方法で、標題化合物４−{３−tert−ブチル−５−［３−（４−ブロモフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル}安息香酸メチルを白色結晶（１．４ｇ、５９％）で、ＨＰＬＣ純度：９４％、融点２７０−２７２で得た。
【０２１６】
＜実施例６０＞
【０２１７】
【化３３】
実施例５９（７００ｍｇ）の３０ｍＬのトルエンへの溶液（−７８℃）に、水素化ジイソブチルアルミニウムのトルエン溶液（１Ｍ トルエン溶液、７．５ｍＬ）を１０分間滴下して加えた。反応混合物を、−７８℃で３０分間撹拌し、その後０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、真空中で無水状態となるまで濃縮し、Ｈ２Ｏで処理した。固形物を濾過し、アセトニトリルで処理した。溶液を無水状態となるまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルに溶解し、ヘキサンで沈殿させたところ、黄色の固形物が得られ、この固形物を真空中で乾燥させたところ、１−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−ヒドロキシメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］尿素（４００ｍｇ、６１％）が得られた。ＨＰＬＣ純度：９５％；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．２（ｓ，１Ｈ），８．４（ｓ，１Ｈ），７．５（ｍ，８Ｈ），６．４（ｓ，１Ｈ），５．３（ｔ，１Ｈ），４．６（ｄ，２Ｈ），１．３（ｓ，９Ｈ）．
上掲の参考文献は、いずれも、ここに言及することによって、本発明に組み込むものである。また、同時に出願する２件の出願、すなわち、Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ，米国特許出願番号１０／７４６，４６０号（２００３年１２月２４日出願）およびＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ，米国特許出願番号１０／７４６，４０７号（２００３年１２月２４日出願）も、ここに言及することによって、本発明に組み込むものである。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
この特許または出願のファイルは、１以上のカラー図面を含むものである。カラー図面を含む本特許または特許出願の公報の複写物は、特許庁に請求し、必要な費用を支払うことによって入手可能である。
【図１】図１は、「オン」および「オフ」のスイッチ制御ポケット、過渡的に修飾可能なスイッチ制御リガンド、および活性ＡＴＰ部位を含む、本発明の天然哺乳動物タンパク質の模式図である。
【図２】図２は、図１のタンパク質の模式図であり、この図では、スイッチ制御リガンドがオフのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、生物学的に下方調節された第一コンホメーションをとっている。
【図３】図３は、図１と同様の図であるが、スイッチ制御リガンドの特定のアミノ酸残基のＯＨ基がリン酸化され、スイッチ制御リガンドが、帯電して修飾された状態を示す。
【図４】図４は、図２と同様の図であるが、この図では、スイッチ制御リガンドがオンのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、図２の第一コンホメーションとは異なる、生物学的に活性な第二コンホメーションをとっている。
【図４ａ】図４ａは、スイッチ制御リガンドのリン酸化された残基と、オンのスイッチ制御ポケット由来の相補的な残基との典型的な結合を図示する拡大模式図である。
【図５】図５は、図１と同様の図であるが、オンおよびオフのスイッチ制御ポケットと結合関係にある小型分子化合物を模式的に示す。
【図６】図６は、スイッチ制御リガンドおよびオンのスイッチ制御ポケットのそれぞれの一部から複合型スイッチ制御ポケットが形成され、小型分子が、この複合型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図７】図７は、オンのスイッチ制御ポケット、スイッチ制御リガンド配列、活性ＡＴＰ部位のそれぞれの一部から組合わせ型スイッチ制御ポケットが形成され、小型分子が、この組合わせ型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図８】図８は、Ｘ線結晶構造解析で得られたリボン図であり、生物学的に上方調節された状態にあるインシュリン受容体のキナーゼタンパク質のオンのコンホメーションを示すものである。
【図９】図９は、図８と同様の図であるが、タンパク質が生物学的に下方調節され、オフのコンホメーションにある状態を示すものである。
【図１０】図１０は、ａｂｌキナーゼを、ＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１１】図１１は、ａｂｌキナーゼを、ＧＲＡＳＰで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１２】図１２は、ａｂｌキナーゼタンパク質のリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１３】図１３は、ａｂｌキナーゼタンパク質のリボン図であり、組合せ型のスイッチ制御ポケット（オンのスイッチ制御ポケット／スイッチ制御リガンド配列／ＡＴＰ活性部位）を示す。
【図１４】図１４は、ｐ３８キナーゼを、ＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１５】図１５は、ｐ３８キナーゼを、ＧＲＡＳＰで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１６】図１６は、ｐ３８キナーゼタンパク質のリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケット重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１７】図１７は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質をＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１８】図１８は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質をＧＲＡＳＰで可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１９】図１９は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質のリボン図であり、組合せ型のオン・オフ・スイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図２０】図２０は、非リン酸化状態の準精製ａｂｌのキナーゼドメインのタンパク質を識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】図２１は、非リン酸化状態の精製ａｂｌのキナーゼタンパク質を識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２２】図２２は、準精製ａｂｌキナーゼドメインタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２３】図２３は、精製ａｂｌキナーゼドメインタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２４】図２４は、ＴＥＶタグの解裂前（レーン２〜４）および後（レーン５〜８）のａｂｌ キナーゼタンパク質を識別したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２５】図２５は、精製ａｂｌタンパク質の、紫外線スペクトルであり、このタンパク質のＡＴＰ部位には、小型分子阻害物質であるＰＤ１８０７９０が結合している。
【図２６】図２６は、ニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィーおよびＱ−セファロースを用いたクロマトグラフィーで精製を行った際の、ａｂｌ構築物５タンパク質（ａｂｌ １−５３１，Ｙ４１２Ｆ 変異型）のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２７】図２７は、精製ａｂｌ構築物５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２８】図２８は、非リン酸化状態にある精製ｐ３８αキナーゼタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２９】図２９は、非リン酸化状態にある精製ｐ３８αキナーゼタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図３０】図３０は、リン酸化状態にある活性化されたＧｓｋ３−βタンパク質の質量スペクトルである。
【図３１】図３１は、非リン酸化状態にある活性化されていないＧｓｋ３−βタンパク質の質量スペクトルである。
【図３２】図３２は、ウェスタンブロットで、リン酸化されたＧｓｋ３−βタンパク質をホスホチロシン抗体によって染色したところである。
【図３３】図３３は、ウェスタンブロットで、リン酸化されていないＧｓｋ３−βタンパク質をホスホチロシン抗体によって染色したところである。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本出願は、仮出願である米国特許出願第６０／４３７，４８７号のＰｒｏｃｅｓｓ Ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４０３号のＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４１５号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，３０４号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、および米国特許出願第６０／４６３，８０４号のＭｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ Ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００３年４月１８日出願）についての権利を主張するものである。これらの各出願は、ここに言及することをもって、本発明に組み込むものである。
【０００２】
１．技術分野
本発明は、広義には、タンパク質の活性モジュレータの役目を果たす分子の新規で合理化された識別方法、ならびに新規なタンパク質とモジュレータのアダクトに関するものである。より詳細には、本発明は、こうした方法およびアダクトであって、好適な態様では、スイッチ制御リガンドとこれと相補的なスイッチ制御ポケットとの相互作用を含むタンパク質コンホメーションの変化機構を利用するような方法およびアダクトに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
２．先行技術の説明
近年、基礎研究によって、ヒト遺伝コードやそれによって生成されるタンパク質について、かつてない量の情報が生命科学コミュニティにもたらされている。２００１年には、ヒトゲノムの完全配列も報告された（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ；Ｎａｔｕｒｅ（２００１） ４０９：８６０；Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１） ２９１：１３０４）。全世界の研究コミュニティは、現在、こうした遺伝子配列によってコードされる５０，０００以上のタンパク質の分類に着手しており、さらに重要なこととして、主要な疾患でありながら、治療が十分に行われていないヒトの疾患の原因タンパク質の識別に取り組んでいる。ヒトゲノムやそのタンパク質によってもたらされる情報、特に、タンパク質の機能をコンホメーションによって制御する分野について多大な情報が存在するにもかかわらず、製薬産業が小型分子治療薬の開発に着手しうるような方法論や戦略は、小型分子治療薬を結合させる際に天然のタンパク質結合部位を利用するところから有意には先に進んでいない。こうした天然の部位は、通常、必須の細胞機能を営むうえで、各種のタンパク質によって利用されている部位であり、その際には、タンパク質がこうした部位に結合することによって天然の基質の処理が進行したり、タンパク質によって、天然リガンド由来の信号が伝達されたりする。これらの天然部位は、タンパク質ファミリー内の他の多くのタンパク質によっても広範に利用されているので、こうした部位と相互に作用する薬剤では、選択性の欠如が問題となることも多く、その結果、最大効力を達成するには治療域が不十分となることも多い。こうした小型分子では、副作用および有害性は、臨床以前の創薬時、臨床治験の間、またはその後市場で明らかになる。副作用および有害性は、薬剤開発プロセスに見られる高い消耗率の主因であり続けている。キナーゼタンパク質ファミリーのタンパク質については、こうした天然部位での相互作用についてのレビューが最近報告されている（Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ： １９９７−２０００，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１） １１： ４０５−４２９；Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２） ２： ｉｓｓｕｅ ９を参照されたい）。
【０００４】
タンパク質は可撓性であることが知られており、この可撓性を利用して、タンパク質の別々の可撓性の活性部位に結合する小型分子を見いだした事例が報告されている。こうした利用についてのレビューについては、Ｔｅａｇｕｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．５２７−５４１（２００３）を参照されたい。また、Ｗｕら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．３９９−４１０（２００３）も参照されたい。しかし、これらの報告では、タンパク質の天然の活性部位のみに結合する小型分子に焦点があてられている。Ｐｅｎｇら，Ｂｉｏ． Ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｔｒｓ．，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．３６９３−３６９９（２００３），およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８９，ｐ．１９３８（２０００）には、ａｂｌキナーゼの阻害物質が記載されている。こうした阻害物質については、国際公開番号第ＷＯ２００２／０３４７２７号に特定されている。こうした一群の阻害物質は、ＡＴＰ活性部位に結合し、その一方で、キナーゼ触媒ループの動きを誘導するようなかたちでも結合を生じる。Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，ｐ．２６８（２００２）には、国際公開番号第ＷＯ００／４３３８４号、およびＲｅｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２９９４−３００８（２００２）にも開示されている阻害物質ｐ３８α−キナーゼが報告されている。これらの一群の阻害物質も、キナーゼのＡＴＰ活性部位で結合し、同時に、キナーゼ活性化ループの動きを生じる。
【０００５】
さらに最近、キナーゼは、活性化ループおよびキナーゼドメイン調節ポケットを利用して、触媒活性の状態を制御していることが開示されている。この点については、最近レビューが公開されている。Ｍ．ＨｕｓｅおよびＪ．Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ（２００２）１０９：２７５を参照されたい。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、特定の天然タンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する分子を識別する方法、ならびに新規なタンパク質と小型分子モジュレータのアダクトに関するものである。本発明の方法の側面では、天然タンパク質が持つ性質、すなわち、タンパク質は、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定のタンパク質を生物学的に上方調節して酵素とすることができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的に下方調節することができる。また、本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然のタンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、天然のタンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する新規な小型分子モジュレータを合理的に開発する方法を提供するものである。また、新規なタンパク質と小型分子とのアダクトも提供する。本発明は、好ましくは、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという天然タンパク質の性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定の酵素タンパク質を生物学的に上方調節することができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的に下方調節することができる。本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然タンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【０００８】
本発明で使用する場合には、「スイッチ制御リガンド」とは、天然タンパク質内の領域またはドメインであって、内部に、生化学的修飾、具体的には、リン酸化、硫酸化、アシル化、または酸化によってインビボで過渡的に修飾されて個別のいずれかをとる１以上のアミノ酸残基を有するものを意味する。同様に、「スイッチ制御ポケット」は、天然のタンパク質内の複数の隣接または非隣接アミノ酸残基であって、インビボで、上記個別状態のいずれかにあるスイッチ制御リガンドの過渡的に修飾された残基と結合して、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうる残基、および／または非天然のスイッチ制御調節分子と結合して、タンパク質のコンホメーションを誘導または制御することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうる残基を含むものであるようなものを意味する。
【０００９】
本発明のタンパク質・モジュレータ・アダクトは、スイッチ制御ポケットを備えた天然のタンパク質と、タンパク質の上記スイッチ制御ポケット領域に結合した非天然分子を含むものであり、この分子は、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによってそのタンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目を果たしている。好ましくは、このタンパク質は、対応するスイッチ制御リガンドも備えており、このリガンドは、インビボで、ポケットと相互作用を生じてタンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、リガンドとポケットの相互作用が生じると、そのタンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットの相互作用の不在下では、第二の異なったコンホメーションおよび生物学的活性をとるものである。
【００１０】
スイッチ制御リガンド／スイッチ制御ポケットの相互作用の性質については、図１〜４の模式図を考慮すると、理解しやすい。すなわち、図１に、「オン」スイッチ制御ポケット１０２および「オフ」スイッチ制御ポケット１０４、ならびにスイッチ制御リガンド１０６を含むタンパク質１００を模式的に示す。また、この模式的に描いたタンパク質は、ＡＴＰ活性部位１０８も含んでいる。図１のこのタンパク質の例では、リガンド１０６は、側鎖にＯＨ基１１０を含むアミノ酸残基３つを備えている。オフ・ポケット１０４は、対応するＸ残基１１２を、オン・ポケット１０２は、Ｚ残基１１４を含んでいる。この例では、タンパク質１００は、リガンド１０６上のＯＨ基１１０の荷電状態に応じて、コンホメーションが変化し、すなわち、ＯＨ基は、修飾されていない場合には、中性の電荷を示すが、これらの基がリン酸化されると、負の電荷を示すことになる。
【００１１】
ポケット１０２および１０４とリガンド１０６の官能性については、図２〜４を考慮すると理解しやすい。図２では、リガンド１０６がオフ・ポケット１０４と協同的に相互作用して、ＯＨ基１１０が、ポケット１０４の一部を形成するＸ残基１１２と相互作用している。こうした相互作用は、主に、ＯＨ基１１０と残基１１２の間の水素結合によるものである。このリガンド／ポケット相互作用が生じると、タンパク質１００が、図１に見られるのとは異なった、タンパク質のオフの、すなわち、生物学的に下方調節されたコンホメーションに対応するコンホメーションをとるようになる。
【００１２】
図３は、リガンド１０６が、図２のオフのポケット相互作用コンホメーションからシフトし、ＯＨ基１１０がリン酸化されて、リガンドが負に帯電した状態を示す。この状態では、リガンドは、ポケット１０２と相互に作用することによって、タンパク質のコンホメーションを、オン、すなわち生物学的に上方調節された状態（図４）に変化させようとする傾向が強い。図４ａには、リガンド１０６上のリン酸化された基が、正に帯電した残基１１４に引き寄せられて、安定化されたイオン状の結合を示している状態を示す。図４のコンホメーションでは、タンパク質のコンホメーションが、図２のオフのコンホメーションとは異なる状態となっており、ＡＴＰ活性部位が利用可能な状態となって、タンパク質がキナーゼ酵素として機能しうる状態となっていることに注意されたい。
【００１３】
図１〜４は、タンパク質が、別々のポケット１０２および１０４ならびにリガンド１０６を示す単純な状況について示すものである。しかし、多くの事例では、もっと複雑なスイッチ制御ポケットのパターンが観察される。図６は、小型分子との相互作用に適したポケットが、リガンド１０６と、たとえばポケット１０２の双方に由来するアミノ酸残基から形成されている状態を示す。こうしたケースを、リガンド１０６とポケットの双方に由来する残基から構成される「複合型スイッチ制御ポケット」と称し、番号１２０で示す。このポケット１２０と相互に作用してタンパク質を調節する小型分子１２２も図示する。
【００１４】
さらに複雑なスイッチポケットを図７に示す。このポケットは、オン・ポケット１０２由来の残基と、ＡＴＰ部位１０８とを含み、「組合わせ型スイッチ制御ポケット」と称するポケットを構成している。この組合わせ型のポケットを、番号１２４で示す。このポケットは、リガンド１０６由来の残基をさらに含むものとすることができる。このポケット１２４と相互に作用してタンパク質を調節する適当な小型分子１２６も図示する。
【００１５】
したがって、図１〜４に示すような単純なポケットの状況の場合には、小型分子は、単純なポケット１０２または１０４と相互に作用するのに対し、図６および７に示すようなさらに複雑な状況では、相互作用を生じるポケットが、ポケット１２０または１２４の領域に存在することになることが理解されるはずである。このように、広義では、小型分子は、各スイッチ制御ポケットの「領域」で相互作用を生じる。
【００１６】
図８および９は、インシュリン受容体のキナーゼドメインタンパク質のＸ線結晶構造解析によって得られたリボン図であり、図８は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのタンパク質を青で示す。この写真では、黄色のストランドは、スイッチ制御リガンドの配列、マゼンタの部分は、リガンド配列と相互に作用して、タンパク質を生物学的に上方調節されたコンホメーションに保つ相補的なオンのスイッチ制御ポケットを形成する鍵残基を示す。一方、図９は、オフのコンホメーション、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションのタンパク質を、真鍮模擬色で示す。この図では、スイッチ制御配列を図８と同じく黄色で示し、オフのスイッチ制御ポケットの鍵残基は緑で示す。スイッチ制御リガンドとオフのスイッチ制御ポケットとの相互作用によって、タンパク質が、図示した生物学的に下方調節されたコンホメーションに保たれる。
【００１７】
模式図についてさらに説明すると、図８の図は、リガンド１０６がポケット１０２と相互に作用する図４に対応する。同様に、図９は、リガンド１０６がポケット１０４と相互に作用する図２に対応する。
【００１８】
当業者は、特定のタンパク質が、タンパク質をオンのポケットとの相互作用へと導く傾向のあるリガンド１０６のリン酸化が生じているのか、タンパク質をオフのポケットとの相互作用を生じるコンホメーションへと導く傾向のあるリン酸基のリガンドからの脱離が生じているのかにもとづいて、上方調節されたコンホメーションと下方調節されたコンホメーションとの間で経時的に「スイッチ」されることを理解できるはずである。このように、スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用によって生じるコンホメーションの変化は、動的な性格をもつものであり、究極的には細胞内の状態によって支配されている。
【００１９】
また、タンパク質のコンホメーションに異常が生じると、病状が悪化する可能性があることも理解されるはずである。たとえば、所定のタンパク質が、オフのコンホメーション、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションのままとなってしまうと、活性のタンパク質が必要とされるような代謝プロセスが停止、遅滞したり、望ましくない副作用が生じる可能性がある。同様に、タンパク質が、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのままとなってしまうと、代謝プロセスが促進されすぎて、その結果、健康上の重篤な問題が生じる場合もある。
【００２０】
しかし、タンパク質活性を調節して、正常なインビボのタンパク質の活性を復元または近似させうる小型分子化合物を開発しうることを見出した。図５からわかるように、小型分子１１６はオフのポケット１０４と相互に作用して、リガンド１０６のポケット１０４との相互作用を防止することができる。この場合、この簡略仮想図では、タンパク質１００は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的に上方調節されたコンホメーションのままでいる可能性が高くなる。あるいは、小型分子１１８がオンのポケット１０２と相互作用することにより、リガンド１０６のポケット１０２との相互作用を防止することもできる。この場合、この簡略模式図では、リガンド１０６がオフのポケット１０４と相互作用して、タンパク質がオフのコンホメーションに移動する、すなわち生物学的に下方調節されたコンホメーションとなる可能性が高くなる。
【００２１】
したがって、タンパク質を分析して、相互作用するスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットの位置および配列を確認し、同時に、これらがどのように相互作用してタンパク質が、生物学的に上方調節されたコンホメーションと、下方調節されたコンホメーションの間でスイッチされるのかを理解することは、タンパク質の活性を調節しうる小型分子化合物を設計・開発する際に使用できる強力な手段となる。
【００２２】
一般に、特定の天然タンパク質と相互に作用してタンパク質活性を調節する分子を識別する方法では、まず、タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドと、同じくタンパク質の一部を形成し、このリガンドと相互作用するスイッチ制御ポケットとを識別する。リガンドとポケットとは、協同して相互に作用して、タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、その際には、タンパク質は、リガンドとポケットが相互作用すると、第一コンホメーションと対応する第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットが相互作用しない場合には、第一コンホメーションとは異なる第二のコンホメーションおよび生物学的活性をとる。
【００２３】
次の工程では、第一および第二のコンホメーションのタンパク質の各サンプルを用意し、これらのタンパク質サンプルを使用して、候補小型分子のスクリーニング・アッセイをを行う。こうしたスクリーニングでは、一般に、候補分子を、サンプルの少なくとも１つと接触させ、どの小型分子が、上記で識別したタンパク質のスイッチ制御ポケット領域と結合するかを識別する。
【００２４】
本発明の方法は、多岐にわたる天然の哺乳動物（たとえばヒト）のタンパク質、たとえば野生型のコンセンサスタンパク質、疾病の多形、疾病の融合タンパク質、および／または人工的に操作した改変タンパク質に適用することができる。適用可能なタンパク質の分類群としては、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質を挙げることができ、具体的には、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質を挙げることができる。大抵の場合、対象タンパク質の分子量は少なくとも約１５ｋＤａ、より一般には、約３０ｋＤａを超えるものである。
【００２５】
本発明の方法の過程では、数多くの技法を用いて、１以上のスイッチ制御リガンド配列および１以上のスイッチ制御ポケットを識別し、候補小型分子モジュレータの上方および下方調節を判定することができる。一般に、こうした方法としては、生物情報学的分析、Ｘ線結晶構造解析、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、およびアフィニティ系のスクリーニングを挙げることができる。また、全くの通常技術、たとえば、部位特異的突然変異誘発および標準的な生化学実験法も役立つはずである。
【００２６】
生物情報学的分析を実施すると、実験を行うことなく、関連したリガンドおよびポケットを識別することが可能である。たとえば、関連タンパク質に関するデータは、場合によっては、利用可能なデータベース、たとえばＰＵＢＭＥＤの使用のみによっても評価することができる。したがって、最初の工程では、配列情報ＰＵＢＭＥＤを、対象タンパク質の公知の構造について調べる。次に、ＢＬＡＳＴ検索を行って、選択した最小ストリンジェンシー（たとえば、６０％以上）を含む他の配列を確認することができる。この検索によって、対象点突然変異または多形、ならびに異常融合タンパク質が明らかとなる可能性がある。これらの検索対象は、いずれも、疾患の原因となりうるものであり、疾患の原因となる機能性または機能障害性のスイッチ制御リガンド配列および／またはポケットの識別についての洞察が得られる可能性がある。こうした生物情報学的分析の具体例については、実施例１で後述する。
【００２７】
Ｘ線結晶構造解析法では、まず、高度に精製されたタンパク質が得られるタンパク質発現法が必要である。全遺伝子を合成する技術を使用して、使用する特定の発現系に対して最適化したタンパク質遺伝子を化学的に合成することもできる。通常技術を用いて、合成オリゴヌクレオチドから任意の遺伝子を迅速に合成することができる。ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ（登録商標））と付随する分子生物学的方法を用いると、任意の遺伝子を合成することができる。全遺伝子を合成する方が、最適な発現にむけて、コドンを最適化した遺伝子を迅速に合成できるので、伝統的なクローニング法より有利である。また、複雑な突然変異（たとえば、多くの異なった変異の組合わせによるもの）を、複数工程でなく１工程で生成することも可能である。制限部位を戦略的に配置すると、必要に応じて、突然変異を迅速に付加することができる。したがって、この技術を用いると、より短時間に、はるかに多くの遺伝子構築物を生成できる。タンパク質配列の選択は、系統分析、分子モデリングおよび構造予測、公知の発現、機能的なデータ・スクリーニング、報告済みの文献データの組合わせを用いて判断して、タンパク質製造戦略を開発する。発現構築物を市販の製品および／またはベクターを用いて製造して、タンパク質を、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞で発現させることができる。大腸菌の発現系を使用して、他のタンパク質を製造することもできる。遺伝子は、アフィニティ・タグを付加することによって修飾することもできる。遺伝子は、欠失、点突然変異、タンパク質の融合を生成することによって修飾して、発現を改善したり、精製の便宜をはかったり、結晶化を促進したりすることもできる。
【００２８】
タンパク質の精製： 発現実験で得られた全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、ミクロ流動化のうち、可溶性のタンパク質を得るうえで最も効果的な方法で破砕する。抽出物のタンパク質精製を、複数のカラム（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ、Ｑ−ｓｅｐｈ、Ｓ−Ｓｅｐｈ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ、およびＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅを含む複数のカラム）を標準的な手順で並行して走らせるロボット装置を使用してパラレルに実施し、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。この情報を、公開されている精製プロトコールと組合わせて、精製プロトコールを迅速に開発する。精製を終了したら、タンパク質を、複数の生物物理学的アッセイ（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、分析用ゲル濾過、等）に供する。
【００２９】
結晶の成長とＸ線による品質分析： スパース行列および集束結晶化スクリーンを、リガンド有りと無しの場合について２以上の温度で用意する。リガンド無しで得た結晶（アポ結晶）をリガンド含浸実験に用いる。結晶の成長状態を、最初の結果にもとづいて、タンパク質結晶に対して最適化する。適当なタンパク質結晶が得られたら、スクリーニングを行って、各種の凍結保存状態について、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶイメージングプレート装置およびＸ−ＳＴＲＥＡＭクリオスタットで、回折能を測定する。回折能のよいタンパク質結晶を、Ｘ線回折データの収集に使用するか、液体窒素中でその後のシンクロトロンＸ線放射源でのデータ収集用に保存する。タンパク質結晶の回折限界を、少なくとも２回回折画像を、９０°の間隔をおいたφスピンドルで撮影することによって決定する。回折画像を収集する間は、φスピンドルを１°揺動する。双方の画像を、Ｘ線データ解析のＨＫＬ−２０００スイートと分解ソフトウェアで処理する。タンパク質結晶の回折解像度は、インデクシングした反射の５０％以上が１シグマ以上の強さを有する解像シェルの高い側の解像限界として受け取る。
【００３０】
Ｘ線回折データの収集： タンパク質結晶が、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶシステムまたはシンクロトロンで３．０Å以上の回折を示すことがわかった場合には、完全なデータセットをシンクロトロンで収集する。ここで、完全なデータセットとは、解像度が最大のシェルでの全ての反射の９０％以上を収集した場合として定義するものである。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理用のソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理する（固有反射と強度に分解する）。
【００３１】
構造の決定： タンパク質の構造を、１以上のタンパク質検索モデルを利用した分子置換（ＭＲ）で決定する。このＭＲ法では、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）から入手可能なタンパク質の座標セットを使用する。必要に応じて、構造の決定は、重原子を用いた多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）および／または多波長異常分散（ＭＡＤ）法で行う。結晶（重原子を含まない母液または凍結保護物質で洗浄後のもの）のＥＸＡＦＳスキャンで適当な重原子シグナルが得られた場合には、重原子を含浸させた結晶についてのについてのＭＡＤシンクロトロンのデータセットを集める。誘導化のための重原子のデータセットの解析は、計算プログラムのＣＣＰ４結晶構造解析スイートを使用して行うことができる。重原子の部位を、（│ＦＰＨ│−│ＦＰ│）２の差のパターソンおよび（│Ｆ＋│−│Ｆ−│）２の異常差パターソン図で識別する。
【００３２】
スイッチ制御リガンド配列およびポケットの識別に際しては、強磁場核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析法を使用することもできる。ＮＭＲを用いた研究で、タンパク質、特にタンパク質キナーゼの構造を解明できることが報告されている。（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ；“ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ” Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：１９８６、Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｍｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９５、Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｊ．ら，Ｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｍｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１９９６．、Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｎ．Ｒ．；Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｌ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｍｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，２０），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ：２００３。
【００３３】
この２０年間で、ＮＭＲは、タンパク質の構造やタンパク質と他の生体分子との相互作用を探り、小型分子とタンパク質の相互作用の詳細を明らかにするうえで強力な技法に育ってきた。ＮＭＲ法は、Ｘ線結晶構造解析法と相補的であり、これらの２つの技法を組合わせると、タンパク質と小型分子の相互作用がどのようなものなのかを明らかとするうえで強力な戦略を立てることが可能となる。特に有用なＮＭＲ法は、１５Ｎおよび／または１３Ｃ標識タンパク質を調製し、このタンパク質のスイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットとの相互作用、または小型分子モジュレータのスイッチ制御ポケット領域との相互作用にともなって生じるタンパク質のコンホメーション変化時の化学シフトの動揺を分析するものである。
【００３４】
円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質のコンホメーションを調べるのに適した技法であり（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｃｕｕｍ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒｅｇｉｏｎ；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７８） ２９：９３、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎ．（１９９０） ７：２０５、Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．“Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ ２） Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ ７，１９８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｏｖａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．，Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．；Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９８９）、特に、タンパク質キナーゼのコンホメーションの変化を調べるうえでの円偏光二色性の利用も報告されている（Ｂｏｓｃａ，Ｌ．；Ｍｏｒａｎ，Ｆ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．（１９９３） ２９０：８２７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｒｃ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎｓ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３） ４２： ２０８、Ｄｅｎｇ，Ｚ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋｅｍｐ，Ｒ．Ｇ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−１−ｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９９） ３７１： ３２６；、Ｒｅｅｄ，Ｊ；Ｋｉｎｚｅｌ，Ｖ；Ｋｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｃ．；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ａ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ／ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５） ２４： ２９６７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｔｏｍｏ，Ｓ．；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔ．；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ ＵＶ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１） ４０： １５７９７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ａｃｉｄｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ａｓｐ２１ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｄｏｍａｉｎ： Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１） ４０： １１９、Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｉ．；Ｂａｃｋｅｓｊｏ，Ｃ．−Ｍ．；Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｅ．；Ｌａｕｒｅｎ，Ｓ．；Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｉ．Ｅ．；“Ｓｉｘ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ−ｃａｕｓｉｎｇ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ： ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ．” Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００） １６４： ４１７０、Ｒａｉｍｂａｕｌｔ，Ｃ．；Ｃｏｕｔｈｏｎ，Ｆ．；Ｖｉａｌ，Ｃ．；Ｂｕｃｈｅｔ，Ｒ．；“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ａｎｄ ＫＣｌ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ． Ｉｎｆｒａｒｅｄ，ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ，ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．” Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５） ２３４： ５７０、Ｓｈａｈ，Ｊ．；Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｇ．Ｇ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９２） １１１９： １９）。
【００３５】
キナーゼの活性化（上方調節）に際して生じる、下方調節状態の場合よりはっきりとしたヘリックスの組織化およびコンホメーションの変化については、ＣＤによって観察することができる。スイッチ制御ポケットに基づく小型分子による調節が生じる結果、優勢なコンホメーション状態が安定化する可能性がある。小型分子モジュレータの存在下で得られたＣＤスペクトルと、モジュレータの不在下で得られたＣＤスペクトルの相関を調べると、小型分子の結合の性質を判定し、そうした結合を通常のＡＴＰ拮抗阻害物質の結合と区別することができる。
【００３６】
各種の生物分析法によって、小型分子のタンパク質に対する結合アフィニティを測定することができる。候補の小型分子モジュレータをスクリーニングする早期の段階では、キャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＺＥ）を利用するアフィニティ系のスクリーニング法を用いることができる。小型分子モジュレータとタンパク質の相互作用についてのＫｄｓ（解離定数）を直接測定することもできる。（Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｈ．；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｇｕｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ；Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９８）７１５： ２９−５４、 Ｙｅｎ−Ｈｏ Ｃｈｕ，Ｙ． −Ｈ．；Ｌｅｅｓ，Ｗ．Ｊ．；Ｓｔａｓｓｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．；Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．；Ｕｓｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４） ３３： １０６１６−１０６２１、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｇ．；Ａｎｄｅｒｅｇｇ Ｒ．Ｊ．；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｎｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９９） ５５： １１６５３−１１６６、Ｓｈｅｎ Ｈｕ，Ｓ．；Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ｎ．Ｊ．；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２００２） ７４： ２８３３−２８５０、Ｈｏｎｄａ，Ｓ．；Ｔａｇａ，Ａ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｋａｋｈｉ，Ｋ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９２） ５９７： ３７７−３８２、Ｃｏｌｔｏｎ，Ｉ．Ｊ．；Ｃａｒｂｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｒａｏ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ： Ａ ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｏｒｇａｎｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９８） １９： ３６７−３８２。
【００３７】
別のアフィニティ系のスクリーニング法では、候補タンパク質と結合する蛍光プローブ・レポータを利用する。候補である小型分子モジュレータを、この蛍光プローブアッセイでスクリーニングする。タンパク質と結合する化合物を、蛍光プローブ・レポータの蛍光の低減によって測定する。この方法については、以下の実施例１で報告する。
【００３８】
本発明は、小型分子モジュレータとタンパク質のアダクトも提供する。タンパク質は、上述したタイプのものとする。モジュレータに関しては、モジュレータは、モジュレータとタンパク質の結合を最大限促進するために、スイッチ制御ポケット領域内の活性残基と相補的な官能基を有する必要がある。たとえば、各種キナーゼの場合には、１〜３のジカルボニル結合を有するモジュレータが有用であることが多いことがわかった。陽イオン性のスイッチ制御ポケットが見いだされた場合には、小型分子モジュレータは、酸性の官能基または部分、たとえばスルホン基、ホスホン基、カルボキシル基を有するものとすることが多い。分子量に関しては、好適なモジュレータは、通常、分子量が約１２０−６５０Ｄａ、より好ましくは約３００〜５５０Ｄａである。これらの小型分子モジュレータを全細胞環境で調べる場合には、小型分子モジュレータの特性が、小型分子モジュレータの細胞浸透性を最適化する周知の原理に適合する必要がある（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ Ｒｕｌｅ ｏｆ ５，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅｓ １−３，ｐｐ３−２５（１９９７））。
【００３９】
本発明は、タンパク質の生物学的活性を変更する方法も提供するものであり、この方法では、一般に、まず、スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質を用意する。次に、このタンパク質を、非天然分子のモジュレータと、このモジュレータがタンパク質のポケット領域に結合するような条件で接触させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する。
以下の実施例は、本発明の代表的な方法について説明するものである。しかし、これらの実施例は、例示を目的としてここに記載するものであって、実施例中の何らかの記載をもって、本発明全体の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
この実施例では、天然タンパク質の一部を形成するスイッチ制御ポケットの領域と相互作用して、タンパク質のインビボでの生物学的活性を調節する小型分子を識別および／または開発する技術を例示する。具体的には、本発明の方法を用いて、公知のキナーゼタンパク質ファミリーすなわち、ａｂｌ、ｐ３８−α、Ｇｓｋ−３β、インシュリン受容体−１、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ、およびトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼの分析を行った。
【００４１】
工程１：キナーゼタンパク質内のスイッチ制御リガンドの識別と分類
一般に、キナーゼのスイッチ制御リガンドは、この特徴に関しての十分に詳しい情報が入手可能であるならば、各キナーゼから得られた配列および構造についてのデータを使用することよって識別することができる。したがって、本方法のこの工程は、実験をおこなわなくても実施可能である。キナーゼに関する公知のデータを用いることで、過渡的に修飾可能なアミノ酸残基を容易に識別することができ、これらのアミノ酸残基は、こうしたタンパク質の場合には、リン酸化またはアシル化によって修飾される。スイッチ制御リガンド配列の全範囲がどこまでである可能性があるのかについては、推定可能である。キナーゼの場合に役立つもう一つの事項としては、リガンドが、残基のＤＦＧ配列から始まることが多いことを挙げることができる（本明細書では、明細書を通じて一文字アミノ酸コードを使用する）。
【００４２】
Ａｂｌキナーゼ
全長のＢＣＲ−Ａｂｌの配列を、本明細書では配列番号３４で示す。このａｂｌキナーゼおよびｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質キナーゼのスイッチ制御リガンド配列の一つは、配列：Ｄ３８１、Ｆ３８２、Ｇ３８３、Ｌ３８４、Ｓ３８５、Ｒ３８６、Ｌ３８７、Ｍ３８８、Ｔ３８９、Ｇ３９０、Ｄ３９１、Ｔ３９２、Ｙ３９３、Ｔ３９４、Ａ３９５、Ｈ３９６（リガンド１）（配列番号１）によって構成されている。上流の調節キナーゼまたは自己リン酸化によって（ｂｃｒ）ａｂｌが活性化すると、Ｙ３９３がリン酸化され、したがって、Ｙ３９３が、過渡的に修飾される残基である（Ｔａｎｉｓら，Ｍｏｌｅｕｌｃａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）２３：３８８４、ＢｒａｓｈｅｒおよびＶａｎ Ｅｔｔｅｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）２７５：３５６３１）。スイッチ制御リガンド配列は、ＤＦＧで始まり、Ｈ３９６で終わる。
【００４３】
別のスイッチ制御リガンドは、配列Ｍｙｒ−Ｇ２Ｑ３Ｑ４Ｐ５Ｇ６Ｋ７Ｖ８Ｌ９Ｇ１０Ｄ１１Ｑ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｐ１５Ｓ１６Ｌ１７（リガンド２）（配列番号２）を有している。ａｂｌキナーゼのアイソフォーム１Ｂに特異的なリガンド２は、ａｂｌタンパク質配列のＮ末端キャップであり、より具体的には、Ｇ２（グリシン２）に位置するＮ末端ミリストリル基である（ＪａｃｋｓｏｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：４４９、Ｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９９９）１４５１：１）。
【００４４】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ（配列番号３）のスイッチ制御リガンド配列は、配列： Ｄ１６８、Ｆ１６９、Ｇ１７０、Ｌ１７１、Ａ１７２、Ｒ１７３、Ｈ１７４、Ｔ１７５、Ｄ１７６、Ｄ１７７、Ｅ１７８、Ｍ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１、Ｙ１８２、Ｖ１８３、Ａ１８４、Ｔ１８５、Ｒ１８６、Ｗ１８７、Ｙ１８８、Ｒ１８９（配列番号４）によって構成されている。ｐ３８−αが上流の調節キナーゼによって活性化されるとＴ１８０およびＹ１８２がリン酸化され（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）４：４２３およびこの文献の参考文献を参照のこと）、したがって、これらが過渡的に修飾可能な残基である。
【００４５】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
全長のＧｓｋ−３βキナーゼの配列を、本明細書では配列番号３２で示す。１ＧＮＧ結晶構造に対応するＧｓｋ−３βキナーゼの配列を、本明細書では配列番号３３で示す。Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質のスイッチ制御リガンド配列は、配列：Ｄ２００、Ｆ２０１、Ｇ２０２、Ｓ２０３、Ａ２０４、Ｋ２０５、Ｑ２０６、Ｌ２０７、Ｖ２０８、Ｋ２０９、Ｇ２１０、Ｅ２１１、Ｐ２１２、Ｎ２１３、Ｖ２１４、Ｓ２１５、Ｙ２１６、Ｉ２１７、Ｃ２１８、Ｓ２１９、Ｋ２２０（Ｇｓｋリガンド１）（配列番号５）によって構成され、上流の調節キナーゼによる活性化が生じるとＹ２１６がリン酸化される（Ｈｕｇｈｅｓら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９３）１２：８０３、Ｌｅｓｏｒｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）７２：５７６、ｔｅｒ Ｈａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）８：５９３およびこれらの文献の参考文献を参照のこと。
【００４６】
別のスイッチ制御リガンド配列は：Ｇ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｒ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｓ９、Ｆ１０、Ａ１１、Ｅ１２（Ｇｓｋリガンド２）（配列番号６）であり、Ｓ９が、上流のキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔの作用によってリン酸化される（Ｄａｊａｎｉら，Ｃｅｌｌ（２００１）１０５：７２１、Ｃｒｏｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７８：７８５）。Ｓ９が過渡的に修飾可能な残基である。
【００４７】
インシュリン受容体キナーゼ−１
全長のＩＲＫ−１遺伝子を、本明細書では、配列番号３５で示す。１ＧＡＧ結晶構造に対応する配列を、本明細書では、配列番号３６で示す。配列番号３６では、少なくとも最初の残基が、配列番号３５と異なることに注意されたい。このインシュリン受容体キナーゼ−１のスイッチ制御リガンド配列は、配列：Ｄ１１５０、Ｆ１１５１、Ｇ１１５２、Ｍ１１５３、Ｔ１１５４、Ｒ１１５５、Ｄ１１５６、Ｉ１１５７、Ｙ１１５８、Ｅ１１５９、Ｔ１１６０、Ｄ１１６１、Ｙ１１６２、Ｙ１１６３、Ｒ１１６４、Ｋ１１６５、Ｇ１１６６、Ｇ１１６７、Ｋ１１６８、Ｇ１１６９、Ｌ１１７０（配列番号７）によって構成されている。Ｙ１１５８、Ｙ１１６２、およびＹ１１６３が、過渡的に修飾可能な残基であり、インシュリン受容体がインシュリンによって活性化されるとリン酸化される（Ｈｕｂｂａｒｄら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９７）１６：５５７２およびこの文献の参考文献を参照のこと）。
【００４８】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋ
全長のＡｔｋ１配列を、本明細書では、配列番号３７で示す。タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔキナーゼのみのドメインを、本明細書では、配列番号３８で示す。これらの配列は、Ｎ末端とＣ末端が異なっていることに注意されたい。また、キナーゼのみのドメインは、全長配列の残基１４３で始まっている。タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋのスイッチ制御リガンド配列は、Ｐ４６８、Ｈ４６９、Ｆ４７０、Ｐ４７１、Ｑ４７２、Ｆ４７３、Ｓ４７４、Ｙ４７５、Ｓ４７６、Ａ４７７、Ｓ４７８（配列番号８）によって構成されている。Ｓ４７４が、過渡的に修飾可能な残基であり、上流のキナーゼ調節タンパク質による活性化が生じるとリン酸化され、リン酸化されていないＰＫＢ／Ａｔｋと比べて、ＰＫＢ／Ｐｔｋ活性を１，０００倍上昇させる（Ｙａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２）９：１２２７およびこの文献の参考文献を参照のこと）。
【００４９】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
ＴＧＦ−Ｂ−Ｉ受容体キナーゼの全長配列を本明細書では、配列番号３９で示す。このトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御リガンドが、Ｔ１８５、Ｔ１８６、Ｓ１８７、Ｇ１８８、Ｓ１８９、Ｇ１９０、Ｓ１９１、Ｇ１９２、Ｌ１９３、Ｐ１９４、Ｌ１８５、Ｌ１９６（配列番号９）である。Ｔ１８５、Ｔ１８６、Ｓ１８７、Ｓ１８９、およびＳ１９１が、過渡的に修飾可能な残基であり、トランスフォーミング成長因子Ｂ−ＩＩ受容体のキナーゼ活性が活性化されると、一部または全体がリン酸化される（Ｗｒａｎａら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３４１、ＣｈｅｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１５６５）。
【００５０】
工程２：スイッチ制御ポケットの識別と分類
スイッチ制御リガンドの識別の場合と同じく、相補的なスイッチ制御ポケットも、公開されたキナーゼのデータ、特に、Ｘ線結晶構造解析から推定することができる。この分析の最初の工程は、対応するスイッチ制御リガンド内の先に識別した過渡的に修飾可能な残基に結合する残基を識別する作業であった。
【００５１】
Ａｂｌキナーゼ
ａｂｌキナーゼ（配列番号３０）のＸ線結晶構造解析によって、１ＦＰＵ（配列番号１０）（Ｓｃｈｌｉｎｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８９：１９３８）および１ＩＥＰ（配列番号１１）（Ｎａｇａｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）６２：４２３６）の構造にもとづく推定スイッチ制御ポケットの配列が明らかとなった。スイッチ制御ポケットの配列は、上記で識別したキナーゼのスイッチ制御リガンド１の配列と相補的であり、α−Ｃヘリックス（残基２７９〜２９３）と触媒ループ（残基３５９〜３６８）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、α−Ｃヘリックス由来のリシン２８５と、触媒ループ由来のアルギニン３６２が、スイッチ制御ポケットの一部を形成しており、ちなみに、これらの残基は、スイッチ制御リガンド由来の過渡的に修飾された（リン酸化）残基Ｙ３９３の結合を安定化させる。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基２５３〜２７９）、Ｎ−ｌｏｂｅ（残基２７１）、β−５ストランド（残基３１３〜３１８）由来の残基、α−Ｃヘリックス（残基２８０〜２９０）由来の他のアミノ酸、触媒ループ（残基３５９〜３６８）由来の他のアミノ酸が挙げられる。また、Ｃローブ残基４０１または４１６は、このポケットの基部を形成しているものと予測される。
【００５２】
表１は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼのリガンド１のスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。アミノ酸残基の位置に言及する場合は、いずれも、全長タンパク質に関するものであり、全長タンパク質の位置２２３から始まる配列番号３０に関するものではない。
【００５３】
【表１】
【００５４】
ａｂｌキナーゼのＸ線結晶構造解析によって、リガンド２と相補的な構造１ＯＰＬ（配列番号１２および１３）にもとづく推定スイッチ制御ポケットの配列が明らかとなった。ａｂｌキナーゼのアイソフォーム１Ｂの構造１ＯＰＬのＸ線結晶構造解析によって、この推定スイッチ制御ポケットが明らかとなる（Ｎａｇａｒら，Ｃｅｌｌ（２００３）１１２：８５９）。
【００５５】
表２は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼのリガンド２と相補的なスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸配列を示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ（配列番号３１）のＸ線結晶構造解析によって、１ＫＶ２（配列番号１４）の構造（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら；Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ，Ｂｉｏｌ．９，ｐｐ．２６８−２７２（２００２））にもとづく推定スイッチ制御ポケットが明らかとなる。さきに識別したスイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基６１〜７８）と触媒ループ（残基１４６〜１５５）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン６７および／またはアルギニン７０は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１４９は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸としては、グリシンに富んだループ（残基３４〜３６）由来の残基、α−Ｃヘリックス（残基６１〜７８）由来のアミノ酸、触媒ループ（残基１４６〜１５５）由来のアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基１９７〜２００由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００５８】
表３は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
ｇｓｋ−３βキナーゼのＸ線結晶構造解析によって、１ＧＮＧ（配列番号１５）、１Ｈ８Ｆ（配列番号１６および１７）、１１０９（配列番号１８）および１Ｏ９Ｕ（配列番号２８および２９）の構造（Ｆｒａｍｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．１３２１−１３２７（２００１）、Ｄａｊａｎｉら，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．７２１−７３２（２００１）、Ｄａｊａｎｉら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４９４−５０１（２００３）、およびｔｅｒ Ｈａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．５９３−５９６（２００１））にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。さきに識別したスイッチ制御リガンド配列１および２に対応するスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基９６〜１０４）と触媒ループ（残基１７７〜１８６）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン９６は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１８０は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基６６〜６８）に由来する残基、α−Ｃヘリックス（残基９０〜１０４）に由来するアミノ酸、触媒ループ（残基１７７〜１８６）に由来するアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基２３３〜２３５由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００６１】
表４は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６２】
【表４】
【００６３】
インシュリン受容体キナーゼ−１
インシュリン受容体キナーゼ−１のＸ線結晶構造解析によって、１ＧＡＧ（配列番号１９および２０）、１ＩＲＫ（配列番号２１）の構造（Ｐａｒａｎｇら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８，ｐ．３７（２００１）；Ｈｕｂｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，ｐ．４７６（１９９４））にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。スイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットは、α−Ｃヘリックス（残基１０３７〜１０５４）と触媒ループ（残基１１２７〜１１３７）の組合せに由来する２つの塩基性アミノ酸のクラスターを備えている。具体的には、アルギニン１０３９は、α−Ｃヘリックスに由来し、アルギニン１１３１は、触媒ループに由来する。スイッチ制御ポケットに寄与する他の予測されるアミノ酸残基としては、グリシンに富んだループ（残基１００５〜１００７）に由来する残基、α−Ｃヘリックス（残基１０３７〜１０５４）に由来するアミノ酸、触媒ループ（残基１１２７〜１１３７）に由来するアミノ酸を挙げることができる。また、Ｃローブ残基１１８５〜１１８７由来のアミノ酸は、このポケットの基部を形成している。
【００６４】
表５は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６５】
【表５】
【００６６】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ
タンパク質キナーゼＢ／ＡｋｔのＸ線結晶構造解析によって、１ＧＺＫ（配列番号２２）、１ＧＺＯ（配列番号２３）、１ＧＺＮ（配列番号２４）の構造（Ｙａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００２）９：１２２７）にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。対応するスイッチ制御リガンド配列に対するスイッチ制御ポケットは、Ｂヘリックス（残基１８５〜１９０）、Ｃヘリックス（残基１９４〜２０４）、β−５ストランド（残基２２５〜２３１）に由来するアミノ酸残基から構成されている。具体的には、アルギニン２０２は、Ｃヘリックスに由来する。
【００６７】
表６は、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔのスイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００６８】
【表６】
【００６９】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのＸ線結晶構造解析によって、１Ｂ６Ｃ（配列番号２５）の構造（Ｈｕｓｅら，Ｃｅｌｌ（１９９９）９６：４２５）にもとづくスイッチ制御ポケットが明らかとなる。スイッチ制御ポケットは、ＧＳ−１ヘリックス、ＧＳ−２ヘリックス、Ｎローブ残基２５３〜２６６、α−Ｃヘリックス残基２４２〜２５２に由来するアミノ酸残基によって構成されている。
【００７０】
表７は、ＴＧＦ Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７１】
【表７】
【００７２】
第二のスイッチ制御ポケットは、ＴＧＦ Ｂ−１受容体キナーゼ中に存在している。このスイッチ制御ポケットは、上述の（ｂｃｒ）ａｂｌ（表１）、ｐ３８−αキナーゼ（表３）、ｇｓｋ−３βキナーゼ（表４）について記載したポケットと類似している。ＴＧＦ Ｂ−１は、ポケットに適合する明瞭な相補的なスイッチ制御リガンドを持たないものの、このポケットは、進化的に保存されており、小型分子スイッチ制御モジュレータの結合に際して利用可能となっている。このポケットは、グリシンに富んだループ、α−Ｃヘリックス、触媒ループ、スイッチ制御リガンド配列、Ｃローブに由来する残基から構成されている。
【００７３】
表８は、スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７４】
【表８】
【００７５】
第三のスイッチ制御ポケットは、空間的には、ＡＴＰ結合ポケットとα−Ｃヘリックスの間に位置しており、表９に特定した構築物に由来する残基から構成されている。このポケットは、αＣヘリックスが「閉形態」に歪んだ結果形成され、阻害タンパク質ＦＫＢＰ１２（配列番号２６）が結合する（Ｈｕｓｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００１）８：６７１を参照のこと）。
【００７６】
表９は、第三スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す
【００７７】
【表９】
【００７８】
工程３：スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用の性質の確認、および小型分子の設計上適当な座位の識別
【００７９】
１．一般的な計算法
スイッチ制御ポケット、そしてスイッチ制御ポケットとリガンドの相互作用をコンピュータを利用して描写するにあたっては、ＳｕｒｆＮｅｔ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．，１９９５，１３，３２３）、ＰＡＳＳ（Ｇ．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．Ｊｒ．；Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．２０００，１４，３８３）、Ｖｏｉｄｏｏ（Ｇ．Ｊ．ＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＴ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ（１９９４） Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ５０，１７８−１８５；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｃｒ．ａｃ．ｕｋ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ａｃｔａ／ｔｏｃｓ／ａｃｔａｄ／１９９４／ａｃｔａｄ５００２．ｈｔｍｌ；、およびＳｑｕａｒｅｓ（Ｊｉａｎｇ，Ｆ．；Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｈ．；“Ｓｏｆｔ−ｄｏｃｋｉｎｇ”： Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｕｂｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２１９，７９）を改変したものを、ポケットの可視化を行うＧＲＡＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｔｏｒ．ｂｉｏｃ．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｇｒａｓｐ／）と組合わせて使用した。小型分子のケモタイプをこれらの推定部位にパニングおよびドッキングするにあたっては、ＳｏｆｔＤｏｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｌｓｏｎ−ｗｅｂ／ｄｏｃ／ａｕｔｏｄｏｃｋ／；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．；Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｒ．Ｓ．；Ｈｕｅｙ，Ｒ．；Ｈａｒｔ，Ｗ．Ｅ．；Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．；Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，１９，１６３９］およびＤｏｃｋ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｐｈａｒｍ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｋｕｎｔｚ／ｄｏｃｋ．ｈｔｍｌ；Ｅｗｉｎｇ，Ｔ．Ｄ．Ａ．；Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９９７，１８，１１７５］を、ＡＭＢＥＲベース［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｅｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ａｍｂｅｒ／ａｍｂｅｒ．ｈｔｍｌ］の束縛分子ダイナミクスと適宜組合わせて使用した。
【００８０】
ポケット解析プログラムで使用される一般的なアプローチは、隙間領域を画定し、この領域を用いて、タンパク質表面で溶剤がアクセスするうえで利用できる穴を決定するというものである。隙間領域は、球または立方体を基本として把握し、隙間領域の画定に際しては、まず、２つ以上の原子間の領域を球または立方体（全形または裁頭形）で充填し、これらを使用して、３Ｄ密度マップを計算し、このマップの輪郭を描いて、隙間領域の表面を画定する。サーフネット（Ｓｕｒｆｎｅｔ）の使用者用マニュアルから抜粋した球についての一般的なアプローチは、下記のようなものである。
【００８１】
ａ．２つの原子ＡおよびＢのファンデルワールス面の間に、ちょうど各面に接触するように、試行隙間球が配置されている。
【００８２】
ｂ．隣接する原子について、順番に考えていく。いずれかの原子が、隙間球に貫入するようであれば、試行隙間球の半径を、隙間球が貫入している原子とちょうど接触するようになるまで低減する。この過程を、すべての隣接する原子について考慮するまで繰り返す。球の半径が、所定の最低限度（通常１．０Ａ）に満たない場合には、この球は不適である。そうでない場合には、最終的な隙間球を保存する。
【００８３】
この手順を、全ての原子のペアについて考慮し、隙間領域が球で充填されるまで継続する。
【００８４】
ｄ．次に、ガウス型関数を使用して、球を使用して格子点の３Ｄアレイ状の点を更新する。
【００８５】
ｅ． この更新は、格子の輪郭を１００．０の輪郭レベルで描いた際に、得られる３Ｄ面が各隙間球と対応するように行う。
【００８６】
ｆ．すべての球で格子が更新されたら、最終的な３Ｄ輪郭が、相互貫入する隙間球の表面を表し、したがって、表面ポケットを構成するポケット原子群の範囲を確定することになる。
【００８７】
ポケット分析に影響を及ぼす要因としては、格子点の間隔、用いる輪郭レベル、隙間を充填するのに使用する球の半径の最小および最大限度を挙げることができる。一般に、スイッチ制御ポケットのサイズおよび形状は、各個別プログラムによって決定された計算スイッチ制御ポケットを重ね合わせることによって見いだされるコンセンサス・ポケットによって描かれる。
【００８８】
上述したように、スイッチ制御リガンドと１以上のスイッチ制御ポケットの相互作用が生じると、「複合型スイッチポケット」と称されるポケットが形成されることが見いだされた。この複合型スイッチポケットは、スイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケット由来のアミノ酸残基を含む配列を有している。
【００８９】
別のケースでは、スイッチ制御ポケットまたは複合型スイッチ制御ポケットが、活性部位ポケット（たとえば、キナーゼのＡＴＰポケット）と重なって、「組合わせ型スイッチ制御ポケット」が形成されることがある。こうした組合わせ型スイッチ制御ポケットは、スイッチ制御阻害物質の役目をはたす小型分子との結合に際しての座位としても有用な可能性がある。
【００９０】
複合型スイッチポケットおよび組合せ型スイッチポケットは、もちろん、スイッチ制御ポケットに関して上述したのと同じ技法を使用することによって解析することができる。
【００９１】
Ａｂｌキナーゼ
ＳＵＲＦＮＥＴでのポケットの解析を図１０に示す。スイッチ制御ポケットを青で強調してある。このスイッチ制御ポケットをＧＲＡＳＰで見たところを、図１１に示す。図中、タンパク質の複合型ポケット領域を丸で囲んである。図１２に、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。複合型ポケットを構成するアミノ酸残基は、先に識別したスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットによって提供される。スイッチ制御ポケットの模式図を、図６に示す。
【００９２】
表１０に、複合型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基を示す。
【００９３】
【表１０】
【００９４】
この複合型スイッチ制御ポケット用の小型分子の当初の設計では、Ｎローブのβストランド残基（Ｍ２７８）、α−Ｃヘリックス（Ｅ２８２、Ｋ２８５）、α−Ｅヘリックス（Ｆ３５９）、触媒ループ（Ｉ３６０、Ｈ３６１、Ｒ３６２、Ｄ３６３、Ｎ３６８）、スイッチ制御リガンド配列（Ｒ３８６、Ｌ３８７、Ｙ３９３）、Ｃループ残基（Ｆ４０１）、およびα−Ｆヘリックス（Ｆ４１６）に由来するアミノ酸と結合する化学プローブに焦点をあてた。この複合型スイッチ制御ポケットを利用すると、この（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼ複合型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる阻害物質を設計することができる。
【００９５】
スクリーニング用に選択された代表的な化合物は、Ｎ−（４−メチル−３−（４−フェニルピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−Ｌ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミドである。
【００９６】
図１３は、（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの組合わせ型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。組合せ型ポケットを構成するアミノ酸残基は、先に識別したスイッチ制御リガンド、スイッチ制御ポケット、ＡＴＰ活性部位に由来する。組合わせ型スイッチ制御ポケットの模式図を、図７に示す。
【００９７】
表１１に、組合せ型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基を示す。
【００９８】
【表１１】
【００９９】
この組合わせ型スイッチ制御ポケットを利用すると、この（ｂｃｒ）ａｂｌキナーゼの組合わせ型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる阻害物質を設計することができる。
【０１００】
スクリーニング用に選ばれた代表的な化合物としては、Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（１，１，３−トリオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−２−イルメチル）−ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−Ｄ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−Ｌ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミド、−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−イルアミノ）−フェニル］−４−（４，４−ジオキソ−４−チオモルホリノメチル）ベンズアミド、およびＮ−（３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）−４−メチルフェニル）−４−（（１−メチル−３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−４−イル）メチル）ベンズアミドを挙げることができる。
【０１０１】
ｐ３８−αキナーゼ
ＳＵＲＦＮＥＴでポケットを解析した図を図１４に示す。複合型スイッチ制御ポケットを青で強調してある。この複合型スイッチ制御ポケットをＧＲＡＳＰで見たところを、図１５に示す。
【０１０２】
図１６は、ｐ３８−αキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。これらのアミノ酸は、グリシンに富んだループ（Ｙ３５）、α−Ｃヘリックス（Ｉ６２、Ｉ６３、Ｒ６７、Ｒ７０、Ｌ７４、Ｌ７５、Ｍ７８）、α−Ｄヘリックス（Ｉ１４１、Ｉ１４６）、触媒ループ（Ｉ１４７、Ｈ１４８、Ｒ１４９、Ｄ１５０、Ｎ１５５）、Ｎローブストランド（Ｌ１６７）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ１６８、Ｆ１６９）、およびα−Ｆヘリックス（Ｙ２００）に由来するものである。複合型ポケットを構成している具体的なアミノ酸残基については、下表で説明する。
【０１０３】
表１２に、複合型スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【０１０４】
【表１２】
【０１０５】
この複合型スイッチ制御ポケットを利用すると、このｐ３８−αキナーゼのスイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる制御物質を設計することが可能となる。
【０１０６】
代表的な化合物としては、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）プロピオン酸、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニルプロピオン酸、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素、および１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素を挙げることができる。
【０１０７】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
ポケットをＳＵＲＦＮＥＴで解析した図を、図１７に示す。図中では、複合型スイッチ制御ポケットが青で強調してある。この複合型スイッチ制御ポケットのＧＲＡＳＰによる解析図を、図１８に示す。
【０１０８】
図１９は、ｇｓｋ−３βキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットを構成する鍵アミノ酸残基を示す。残基は、グリシンに富んだループ（Ｆ６７）、α−Ｃヘリックス（Ｒ９６、Ｉ１００、Ｍ１０１、Ｌ１０４）、α−Ｄヘリックス（Ｉ１４１、Ｉ１４６）、触媒ループ（Ｉ１７７、Ｃ１７８、Ｈ１７９、Ｒ１８０、Ｄ１８１、Ｎ１８６）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ２００、Ｆ２０１、Ｓ２０３、Ｋ２０５、Ｌ２０７、Ｖ２０８、Ｐ２１２、Ｎ２１３、Ｖ２１４、Ｙ２１６）、およびα−Ｆヘリックス（Ｙ２００）に由来するものである。このポケットを利用すると、このｇｓｋ−３βキナーゼ複合型スイッチ制御ポケット内に繋ぎ止められる小型分子モジュレータ化合物を設計することができる。
【０１０９】
表１３に示す複合型ポケットは、デュアル機能性を備えたスイッチ制御ポケットである。このポケットは、相補的なリガンド配列１（Ｇｓｋリガンド１）と結合すると、タンパク質の活性を上方調節するオンのポケットとして機能する。また、このポケットは、相補的なリガンド配列２（Ｇｓｋリガンド２）と結合すると、タンパク質の活性を下方調節するオフのポケットとして機能する。
【０１１０】
表１３に、複合型スイッチ制御ポケットを形成しているタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
工程４：各種のスイッチ制御状態に静的に封じ込められたタンパク質の発現および精製
遺伝子の合成：遺伝子は、ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ（登録商標）、Ｅｍｅｒａｌｄ／ｄｅＣＯＤＥ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を使用してコドンの使用を最適化することにより、完全に合成オリゴヌクレオチドから製造した。全遺伝子の合成を行うと、コドンを最適化した遺伝子を迅速に合成することができる。制限部位を戦略的に配置すると、必要に応じて、突然変異を迅速に付加することができる。
【０１１３】
タンパク質は、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞または大腸菌の発現系で発現させた。遺伝子は、場合によっては、アフィニティ・タグを導入することによって修飾することもでき、この場合、タグを付したタンパク質の一工程での抗体−アフィニティ精製を行うことが可能となることも多い。構築物は、結晶性、リガンドとの相互作用、精製、コドンの使用に関して最適化した。昆虫細胞培養能力が月１００リットル以上の容量１１リットルのバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）２基を使用した。
【０１１４】
タンパク質の精製：タンパク質の精製には、ＡＫＴＡ精製装置、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ、Ｐａｒｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏｍｂ、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５ホモジナイザー、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒ（登録商標）タンパク質製造装置（Ｅｍｅｒａｌｄの自動並行精製装置）を使用した。精製タンパク質の特性解析には、蛍光分光法、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析、動的光散乱の機器を使用した。
【０１１５】
全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、またはミクロ流動化で破砕した。抽出物を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒ（登録商標）装置を使用して、タンパク質の並行精製に供した。このＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒは、Ｅｍｅｒａｌｄによって開発されたロボット装置で、（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、金属キレート、Ｑ−ｓｅｐｈ、Ｓ−Ｓｅｐｈ、フェニル−Ｓｅｐｈ、およびシバクロンブルーを含む）複数の精製カラムで精製を同時に行うことができる。得られた分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。精製タンパク質は、各種の生物物理学的アッセイ（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、分析用ゲル濾過など）に供して、精製レベルを測定した。
【０１１６】
Ａｂｌキナーゼ
Ａｂｌ構築物１（キナーゼドメイン、６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５３４）、Ａｂｌ構築物２（キナーゼドメイン、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５１８）、ａｂｌ構築物３（キナーゼドメイン、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基２４８−５１８、Ｙ４１２Ｆの変異）、ａｂｌ構築物４（アイソフォーム、Ｋ２９Ｒ／Ｅ３０Ｄの変異を含む１Ｂ１−５３１、ＴＥＶ−６ｘＨｉｓ−Ｇｌｕ）、ａｂｌ構築物５（Ｋ２９Ｒ／Ｅ３０Ｄ／Ｙ４１２Ｆの変異を含むアイソフォーム１Ｂ１−５３１）の全遺伝子合成およびサブクローニングを完了し、昆虫細胞でトランスフェクションを実施した。Ｂｃｒ−ａｂｌ構築物１（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基１−２０２９）およびｂｃｒ−ａｂｌ構築物２（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基１−２０２９；Ｙ４１２Ｆ変異体）も同様に調製し、昆虫細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション生成物を、必要に応じて、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０７９０またはＧｌｅｅｖｅｃの存在下でフェルンバッハで培養して、生成した（ｂｃｒ）Ａｂｌタンパク質が、Ｙ２４５またはＹ４１２でリン酸化されていないことを確認した（Ｔａｎｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，ｐ ３８８４，（２００３）、Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７５，ｐ ３５６３１，（２０００）を参照されたい）。タンパク質の発現レベルを、免疫沈降法とＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。ａｂｌ構築物１および２のタンパク質の発現レベルは、１０ｍｇ／Ｌを超えていた。これらの阻害物質の存在下で発現された精製タンパク質のＰｙ２０（抗ホスホチロシン抗体）ウェスタン・ブロッティングを行って、これらのタンパク質が、Ｙ２４５またはＹ４１２でリン酸化されていないことを確認した。
【０１１７】
図２０および２１は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィー（図２０）、およびその後のＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィー（図２１）の後にＰＤ１８０９７０の存在下で発現されたａｂｌ−構築物２の純度を示す。図２２は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーで得られたａｂｌ構築物２についての溶出特性を示し、図２３は、ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたＡｂｌ構築物２についての溶出特性を示す。この形態のａｂｌは、リン酸化されていない物理的状態にある。
【０１１８】
図２４は、ｔｅｖプロテアーゼで処理してＧｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶアフィニティ・タグを除去した後のＡｂｌ構築物２の溶出特性を示す。分画１７〜１９には、Ｇｌｕ−６ｘ／Ｈｉｓ−ＴＥＶタグが無傷のままのａｂｌタンパク質が含有されており、分画２０〜２３には、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグが除去されたａｂｌタンパク質が含有されている。プール分画２０〜２３を紫外線で解析すると（図２５）、吸収の最大が３６０ｎｍに見られ、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０９７０がａｂｌのＡＴＰポケットに結合したまま存在していること示唆され、ａｂｌタンパク質が、発現および精製の間も、非リン酸化状態に保持されていることが確認された。
【０１１９】
図２６は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーおよびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのクロマトグラフィーで精製したａｂｌ構築物５タンパク質（ａｂｌの１−５３１、Ｙ４１２Ｆ変異体）の溶出プロファイルを示す。図２７は、精製プール分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅでの解析結果を示す。
【０１２０】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ構築物１（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、全長）または構築物２（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基５−３５４）の全遺伝子合成を完了し、タンパク質をアラビノース誘導性ベクターおよびＴ７プロモータベクターの双方を使用して大腸菌で発現させた。２種の発現ベクター（ｐＥＴ１５ｂおよびｐＢＡＤ）でのｐ３８−αキナーゼの発現を、０．５ＭのＩＰＴＧ（ｐＥＴ１５ｂ）または０．２％のアラビノース（ｐＢＡＤ）による誘導の後に調べた。タンパク質の発現は、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。誘導後のｐＢＡＤ構築物でのｐ３８−αの発現は、抗ＧＬＵモノクローナル抗体を用いた免疫沈降で明瞭に示された。
【０１２１】
図２８は、Ｑ−セファロースを用いたクロマトグラフィーでのｐ３８−αタンパク質の溶出プロファイルを示す。プール精製分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅの結果を、図２９に示す。
【０１２２】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
構築物１（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、全長、１Ｈ８Ｆタンパク質と同配列）、構築物２（１０ｘＨｉｓ、残基２７−３９３、１ＧＮＧタンパク質と同配列）、構築物３（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ、残基３５−３８５）について、全遺伝子合成を完了した。昆虫細胞でトランスフェクションを行った。タンパク質の発現を、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。構築物３の発現レベルは、５ｍｇ／Ｌを超えていた。ｇｓｋ−３βタンパク質の精製で用いた手順では、スイッチ制御リガンドの非リン酸化キナーゼ（ＧＳＫ−Ｐ）とスイッチ制御リガンドのリン酸化キナーゼ（ＧＳＫ＋Ｐ）の双方の形態を、同じ発現過程で単離することが可能であった。ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で実施した。この工程に引き続いて、ＰＯＲＯＳ ＨＳ（陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。図３０は、ＧＳＫ＋Ｐタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルであり、予測分子イオンが４２８６２Ｄａであることが示されている。
図３１は、ＧＳＫ−Ｐタンパク質のＭＡＤＬＩ−ＴＯＦスペクトルであり、予測分子イオンが４２７８１であることが示されている。
【０１２３】
図３２および３３に、ＰＯＲＯＳ ＨＳクロマトグラフィーの分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、ホスホチロシン抗体ＰＹ−２０で染色したものを示す。分画１０〜１５は、ＰＹ−２０抗体によってイメージングされ、スイッチ制御リガンドのチロシン残基にリン酸塩が存在していることが示唆された。分画１７〜２９は、ＰＹ−２０抗体によってはイメージングされず、スイッチ制御リガンドのチロシンのリン酸化が生じていないことが示唆された。
【０１２４】
工程５：小型分子スイッチ制御モジュレータ候補を用いた精製タンパク質のスクリーニング
Ｐ３８−αキナーゼのスクリーニング／Ｐ３８ＭＡＰキナーゼの結合アッセイ
小型分子モジュレータのｐ３８ＭＡＰキナーゼに対する結合活性を、公開された方法（Ｃ．Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）９，２６８−２７２、Ｊ．Ｒｅｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）４５，２９９４−３００８）で修飾したＳＫＦ８６００２を蛍光プローブとして用いた競合アッセイで測定した。概述すると、ｐ３８キナーゼ（Ｋｄ＝１８０ｎＭ）の有力な阻害物質であるＳＫＦ８６００２は、キナーゼとの結合時に３４０ｎｍで励起されると４２０ｎｍ周辺で蛍光を発する。したがって、ｐ３８キナーゼの阻害物質の結合アフィニティは、ＳＫＦ８６００２からの蛍光を低減する能力によって測定することができる。ＳＫＦ８６００２は、ｐ３８−αキナーゼのＡＴＰ活性部位ポケットの合体状況に関してのレポーターの役目を果たす蛍光プローブ物質となる。ｐ３８−αキナーゼのスイッチ制御ポケットと結合する小型分子モジュレータは、タンパク質のコンホメーションを歪ませて、蛍光プローブＳＫＦ８６００２の結合能力を妨害する。したがって、小型分子が、蛍光プローブの結合を妨害する能力を利用して、スイッチ制御ポケットに対する結合状態を実験的に読み取ることができる。対照実験を実施して、小型分子モジュレータが、ＡＴＰポケットで競合することによって、蛍光プローブの結合と直接競合するかどうかについて判定した。アッセイは、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＢＭＧ）に載置した３８４プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ３８４プレート）で実施した。具体的には、反応混合物は、０．１５％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルグルコシドと２ｍＭのＥＤＴＡとを含有する２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン緩衝液（ｐＨ７）中に、１μＭのＳＫＦ８６００２、８０ｎＭのｐ３８キナーゼ、および各種濃度の阻害物質を含んでいた（最終容積６５μｌ）。酵素を加えることによって反応を開始した。プレートを、室温（約２５℃）で２時間インキュベートし、その後、４２０ｎｍでの発光および３４０ｎｍでの励起を読み取った。ｒｆｕ（相対蛍光ユニット）値を、対照（小型分子モジュレータ不在のもの）の値と比較することによって、小型分子の各濃度での阻害率を計算した。小型分子モジュレータのＩＣ５０の値を、小型分子モジュレータの濃度範囲で得られた阻害率の値から、Ｐｒｉｓｍで計算した。時間依存性の阻害について評価する場合には、プレートを複数の反応時間、たとえば、０．５、１、２、３、４、および６時間で読み取った。ＩＣ５０の値を、各時点について計算した。ＩＣ５０の値が反応時間とともに（４時間に２倍以上）低減する場合には、阻害が時間依存性であると認定した。
【０１２５】
【表１４】
ＩＣ５０の値は、反応時間２時間で得たものである
【０１２６】
工程６：タンパク質の調節についてのスイッチ制御機構の確認
【０１２７】
タンパク質に対するアフィニティを有するか、タンパク質活性の機能的調節を示すことが見いだされた小型分子を、生化学的に調べて、結合または機能の調節が、天然のリガンド部位（たとえば、キナーゼタンパク質のＡＴＰ部位）と非競合性または未競合性であるかどうかについて判定した。この過程は、標準的なＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ型の解析を行うことによって実施した。
【０１２８】
スイッチ制御モジュレータの各種タンパク質との結合モードを、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ法で判定した。以下のセクションでは、分子の結合モードを判定する際に使用したＸ線結晶構造解析技術の概要を説明する。
【０１２９】
Ｘ線結晶構造解析を使用した、タンパク質調節のスイッチ制御機構の判定
【０１３０】
１．結晶化の実験施設：結晶化の試行のデータは、すべて、専用に構築したデータベース・ソフトウェアを使用して捕捉し、このソフトウェアは、結晶化試験を行い、結果を監視する各種のロボット装置を駆動する。Ｂ． コンピュータ・ハードウェア：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｉｎｕｘのワークステーション、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００のサーバー、およびＳｉｌｉｃｏｎ ＧｒａｐｈｉｃｓのＯ２のワークステーション。 Ｃ． Ｘ線結晶構造解析ソフトウェア： ＨＫＬ２０００（ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを含む）（Ｘ線回折データの処理）、ＭＯＳＦＩＬＭ、ＣＣＰ４スイーツ（ＡＭＯＲＥ、ＭＯＬＲＥＰ、およびＲＥＦＭＡＣを含む）（分子置換、ＭＩＲ、およびＭＡＤによるフェージングをはじめとする各種の結晶構造解析計算オペレーション）、ＳｎＢ（重原子の位置）、ＳＨＡＲＰ（重原子のフェージング・プログラム）、ＣＮＸ（モデルの精緻化をはじめとする各種の結晶構造解析計算オペレーション）、ＥＰＭＲ（分子置換）、ＸｔａｌＶｉｅｗ（モデルの可視化および構築）。
【０１３１】
２．結晶の成長とＸ線による品質分析：スパース行列および集束結晶化スクリーンを、リガンド有りと無しの場合について２以上の温度で用意する。リガンド無しで得た結晶（アポ結晶）をリガンド含浸実験に用いる。適当なタンパク質結晶が得られたら、スクリーニングを行って、各種の凍結保存状態について、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶイメージングプレート装置およびＸ−ＳＴＲＥＡＭクリオスタットで、タンパク質結晶の回折能を測定する。回折能のよいタンパク質結晶を、インハウスでのＸ線回折データの収集に使用するか、液体窒素中でその後のシンクロトロンＸ線放射源（アルゴンヌ国立研究所の高度光子源のＣＯＭ−ＣＡＴビームラインまたは他のシンクロトロンビームライン）でのデータ収集用に保存する。タンパク質結晶の回折限界を、少なくとも２回回折画像を、９０°の間隔をおいたφスピンドルで撮影することによって決定する。回折画像を収集する間は、φスピンドルを１°揺動する。双方の画像を、Ｘ線データ解析のＨＫＬ−２０００スイートと分解ソフトウェアで処理する。タンパク質結晶の回折解像回折解像度は、インデクシングした反射の５０％以上が１シグマ以上の強さを有する解像シェルの高い側の解像限界として受け取る。
【０１３２】
３．Ｘ線回折データの収集：完全なデータセットとは、解像度が最大のシェルでの全ての反射の９０％以上を収集した場合として定義するものである。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理用のソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理する（固有反射と強度に分解する）。
【０１３３】
４．構造の決定：タンパク質−小型分子複合体の構造を、ＰＤＢから入手可能な１以上のタンパク質検索モデルを利用して、分子置換（ＭＲ）で決定する。必要に応じて、構造の決定は、重原子を用いた多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）および／または多波長異常分散（ＭＡＤ）法で行う。結晶（重原子を含まない母液または凍結保護物質で洗浄後のもの）のＥＸＡＦＳスキャンで適当な重原子シグナルが得られた場合には、重原子を含浸させた結晶についてのＭＡＤシンクロトロンのデータセットを集める。誘導化のための重原子のデータセットの解析は、計算プログラムのＣＣＰ４結晶構造解析スイートを使用して行うことができる。重原子の部位を、（│ＦＰＨ│−│ＦＰ│）２の差のパターソンおよび（│Ｆ＋│−│Ｆ−│）２の異常差パターソン図で識別する。
【０１３４】
工程７：上記工程の繰り返しによる、小型分子のスイッチ制御モジュレータの改良
【０１３５】
タンパク質活性を調節することが見いだされた各小型分子を、タンパク質スーパーファミリー内の他のタンパク質（たとえば、候補タンパク質がキナーゼである場合なら、他の各種キナーゼ）、またタンパク質ファミリー間（たとえば、候補タンパク質がキナーゼである場合なら、ホスファターゼおよび転写因子のような他の各種のタンパク質クラス）でのアフィニティおよび機能の調節について評価した。小型分子のスクリーニング・ライブラリーも、このスクリーニング・パラダイム内で評価を行った。構造活性関係（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、ＳＡＲ）も評価し、その後、小型分子を、候補タンパク質に対してより有効となるように、および／または、候補タンパク質の調節に関しての選択的が増し、標的タンパク質と対抗的なタンパク質との相互作用が低減するように設計した。
【０１３６】
キナーゼタンパク質の解析によって、スイッチ制御ポケットには、相補的なスイッチ制御リガンドに対する結合のしかたによって分類される４つの種類があること、すなわち、（１）通常は、相補的なスイッチ制御リガンド（帯電リガンド）で、セリン、トレオニン、またはチロシンアミノ酸残基がリン酸化されることによって、または、メチオニンまたはシステインアミノ酸の硫黄原子が酸化されることによって形成される帯電リガンドを安定化して結合するポケット、（２）水素結合または疎水性の相互作用（水素結合／疎水性リガンド）の機序によってリガンドに結合するポケット；（３）アシル化残基（アシル化リガンド）を有するリガンドを結合するポケット、および（４）リガンドと内因的に結合することはないものの、非天然のスイッチ制御モジュレータ化合物（非識別リガンド）と結合しうるポケット、の４種類があることが明らかとなった。また、これらの４種類のポケットは、図１〜４に模式的に示す単純型のポケット、図６に示す複合型のポケット、または図７の複合型のポケットである可能性がある。最後に、ポケットは、ポケットが有するスイッチ制御の機能性によって定義することもでき、すなわち、ポケットは、スイッチ制御リガンドと相互に作用すると、生物学的に情報調節されたコンホメーションを生じるオンのタイプである場合、スイッチ制御リガンドと相互に作用すると、生物学的に下方調節されたコンホメーションを生じるオフのタイプである場合、そして「デュアル機能性」ポケットと称する、すなわち、同じポケットが、異なった相補的なスイッチ制御リガンドと相互に作用することによって、オンのポケットとオフのポケットの両方の役目をはたすことを意味するポケットである場合がある。これと同じ一連のポケットは、すべての対象タンパク質、すなわち、スイッチ制御リガンド配列と相補的なスイッチ制御ポケットとの相互作用によってコンホメーションの変化が生じるようなタンパク質のすべてで見いだすことができる。
【０１３７】
下記の表１５は、工程２および３で説明したポケットを、ポケットの分類および種類に関して、さらに識別するものである。
【０１３８】
【表１５】
【０１３９】
本発明の主目的は、選択されたタンパク質の１以上のスイッチ制御ポケットの領域に結合して、タンパク質の活性を調節する非天然小型分子のモジュレータ化合物の設計、開発を可能とすることである。この機能的目標は、スイッチ制御ポケットの種類（オン、オフ、デュアル）、選択したモジュレータ化合物の性質、モジュレータ化合物とタンパク質の間の相互作用的結合の種類に応じて、いくつかの異なった方法で達成することができる。
【０１４０】
たとえば、選択されたモジュレータ化合物は、選択されたスイッチ制御ポケットに、スイッチ制御リガンドのアゴニストとして結合することができ、すなわち、モジュレータ化合物は、天然の相補的なスイッチ制御リガンドによって生じるのと同じタイプのコンホメーションの変化を生じることができる。さしたがって、スイッチ制御リガンドのアゴニストが、オンのポケットと結合した場合には、結果として、タンパク質の活性の上方調節が生じ、オフのポケットと結合した場合には、下方調節が生じる。
【０１４１】
これとは逆に、所定のモジュレータは、スイッチ制御リガンドのアンタゴニストとして結合することもでき、すなわち、モジュレータ化合物は、天然の相補的なスイッチ制御リガンドによって生じるのとは逆のタイプのコンホメーションの変化を生じることもできる。したがって、スイッチ制御リガンドのアンタゴニストが、オンのポケットと結合した場合には、結果として、タンパク質の活性の下方調節が生じ、オフのポケットと結合した場合には、上方調節が生じる。
【０１４２】
デュアル機能性のポケットの場合、また非識別リガンドが存在するポケットの場合には、モジュレータ化合物は、生じる応答の種類に応じて、機能的アゴニストとして作用している場合も、機能的アンタゴニストとして作用している場合もある。
【０１４３】
＜実施例２＞
スイッチ制御小型分子候補の合成
以下の実施例では、キナーゼタンパク質と相互作用するスイッチ制御分子の候補として特に有用な化合物の合成について説明する。これらの実施例では、アルファベットを付した実施例は、中間生成物の合成について、番号を付した実施例は、最終化合物の合成について記載したものである。
［Ｂｏｃ−スルファミド］アミノエステル（反応物質ＡＡ）、１，５，７，−トリメチル−２，４−ジオキソ−３−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノナン−７−カルボン酸（反応物質ＢＢ）、およびケンプ酸無水物（反応物質ＣＣ）を、文献の方法に従って製造した。詳細については、Ａｓｋｅｗら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，１０８２を参照されたい。
【０１４４】
実施例Ａ
【０１４５】
【化１】
ｍ−アミノ安息香酸（２００ｇ、１．４６ｍｏｌ）の濃ＨＣｌへの溶液（２００ｍＬ）に、ＮａＮＯ２（１０２ｇ、１．４６ｍｏｌ）の水溶液（２５０ｍＬ）を０℃で加えた。反応混合物を１時間撹拌し、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（６６２ｇ、２．９２ｍｏｌ）の濃ＨＣｌ（２Ｌ）への溶液を０℃で加え、反応系をさらに室温で２時間撹拌した。沈殿を濾別し、エタノールおよびエーテルで洗浄したところ、３−ヒドラジノ安息香酸ヒドロクロリドが、白色固形物として得られた。
前反応で得られた粗生成物（２００ｇ、１．０６ｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタンニトリル（１４６ｇ、１．１６７ｍｏｌ）のエタノール（２Ｌ）溶液を一晩加熱還流した。反応溶液を真空中で蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製したところ、３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸エチル（実施例Ａ、１１６ｇ、４０％）が白色固形物として、３−（５−アミノ−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（９３ｇ、３６％）とともに得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｂｒｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３），１．２８（ｓ，９Ｈ）．
【０１４６】
実施例Ｂ
【０１４７】
【化２】
イソシアン酸１−ナフチル（９．４２ｇ、５５．７ｍｍｏｌ）とピリジン（４４ｍＬ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）への溶液に、実施例Ａ（８．０ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）への溶液を０℃で加えた。混合物を室温にて１時間撹拌し、固形分がすべて溶解するまで加熱し、室温にてさらに３時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で急冷した。沈殿物を濾過し、希ＨＣｌおよびＨ２Ｏで洗浄し、真空中で乾燥して、３−［３−ｔ−ブチル−５−（３−ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸エチル（１２．０ｇ、９５％）を、白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．００（ｓ，１Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ），８．２５ ７．４２（ｍ，１１Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），４．３０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．２６（ｓ，９Ｈ），１．０６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４５７．１０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１４８】
実施例Ｃ
【０１４９】
【化３】
実施例Ａ（１０．７ｇ、７０．０ｍｍｏｌ）のピリジン（５６ｍＬ）とＴＨＦ（３０ｍＬ）の混合物への溶液に、カルバミン酸４−ニトロフェニル４−クロロフェニル（１０ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）への溶液を０℃で加えた。混合物を、室温にて１時間撹拌し、固形分がすべて溶解するまで加熱し、室温にてさらに３時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）を加え、水相を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を一緒にし、１Ｎ ＮａＯＨ、０．１Ｎ ＨＣｌ、および飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶剤を真空中で除去したところ３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝安息香酸エチル（８．０ｇ、５２％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．１１（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｍ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），４．３０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４１（Ｍ＋＋Ｈ）．
【０１５０】
実施例Ｄ
【０１５１】
【化４】
実施例Ｂ（８．２０ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）への溶液に、かきまぜながら、ＬｉＡｌＨ４粉末（２．６６ｇ、７０．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中で−１０℃にて加えた。混合物を、室温にて２時間撹拌し、過剰のＬｉＡｌＨ４を、氷を徐々に加えることによって分解した。反応混合物を、希ＨＣｌでｐＨ７まで酸性化し、真空中で濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を一緒にして、真空中で濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（ヒドロキシメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（７．４０ｇ、９９％）が、白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．１９（ｓ，１Ｈ），９．０４（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．２６−７．３５（ｍ，１１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５２】
実施例Ｅ
【０１５３】
【化５】
実施例Ｃ（１．６６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）とＳＯＣｌ２（０．６０ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）のＣＨ３Ｃｌ（１００ｍＬ）への溶液を３時間還流し、真空中で濃縮して、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−クロロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（１．６８ｇ、９７％）を白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．２６（ｓ，１Ｈ），９．１５（ｓ，１Ｈ），８．４２−７．４１（ｍ，１１Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５４】
実施例Ｆ
【０１５５】
【化６】
実施例Ｃ（１．６０ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）への溶液に、撹拌しながら、ＬｉＡｌＨ４粉末（４１３ｍｇ、１０．９ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中で−１０℃にて加えた。混合物を２時間撹拌し、氷を加えることによって過剰なＬｉＡｌＨ４を急冷した。溶液を希ＨＣｌで酸性化してｐＨ７とした。溶液を徐々に除去し、固形分を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２００＋１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−ヒドロキシメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素（１．４０ｇ、９７％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．１１（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．２７（ｍ，８Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），５．３０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．２６（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５６】
実施例Ｇ
【０１５７】
【化７】
実施例Ｆ（８００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とＳＯＣｌ２（０．３０ｍＬ、４ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）への溶液を、３時間にわたって穏やかに還流した。溶剤を真空中で蒸発させ、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍＬ）に加えた。溶剤を除去すると、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（クロロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素（８１２ｍｇ、９７％）が白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．５７（ｓ、１Ｈ）、８．７５（ｓ、１Ｈ）、７．６３（ｓ、１Ｈ）、７．５０−７．２６（ｍ、７Ｈ）、６．３５（ｓ、１Ｈ）、４．８３（ｓ、２Ｈ）、１．２７（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５８】
実施例Ｈ
【０１５９】
【化８】
ＬｉＡｌＨ４（５．２８ｇ、１３９．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０００ｍＬ）への懸濁液に、実施例Ａ（２０．０ｇ、６９．６ｍｍｏｌ）をＮ２中で０℃にて少量ずつ加えた。反応混合物を５時間撹拌し、０℃の１Ｎ ＨＣｌで急冷し、沈殿物を濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、濾液を蒸発させたところ、［３−（５−アミノ−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］メタノール（１５．２ｇ、８９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．４９（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｓ，１Ｈ），５．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２４６．１９（Ｍ＋Ｈ＋）．
前反応で得られた粗生成物（５．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＳＯＣｌ２（４．８５ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌し、真空中で濃縮し、３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−クロロメチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（５．４ｇ）を得、これを、Ｎ３（３．９３ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）への溶液に加えた。反応混合物を３０℃に２時間加熱し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）に加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を一緒にし、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮したところ、３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アジドメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（１．５０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）が得られた。
【０１６０】
実施例I
【０１６１】
【化９】
実施例Ｈを無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、１−イソシアノナフタレン（１．１３ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）とピリジン（５．２７ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を３時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）で急冷し、得られた沈殿を濾過し、１Ｎ ＨＣｌとエーテルで洗浄して、１−［２−（３−アジドメチル−フェニル）−５−ｔ−ブチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−３−ナフタレン−１−イル−尿素（２．４ｇ、９８％）を白色固形物として得た。
前反応で得られた粗生成物とＰｄ／Ｃ（０．４ｇ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）への溶液を、１気圧で室温にて２時間水素化した。触媒を濾過によって除去し、濾液を真空中で濃縮したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アミノメチル）フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（２．２ｇ、９６％）が黄色固形物として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．０２（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６７−７．３３（ｍ，９Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１４（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１６２】
実施例Ｊ
【０１６３】
【化１０】
実施例Ｈ（１．５０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）への溶液を、イソシアン酸４−クロロフェニル（１．０２ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）とピリジン（５．２７ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に、室温で加えた。反応混合物を、３時間撹拌し、その後、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）を加えた。沈殿を濾過し、１Ｎ ＨＣｌおよびエーテルで洗浄したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（アミノメチル）フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素（２．２８ｇ、９７％）が白色固形物として得られ、この生成物は、それ以上精製することなく次工程に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４２４（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１６４】
実施例Ｋ
【０１６５】
【化１１】
ベンジルアミン（１６．５ｇ、１５４ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸エチル（５１．５ｇ、３０８ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）への溶液に、 Ｋ２ＣＯ３（１２７．５ｇ、９２４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にて３時間撹拌し、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、真空中で濃縮し、クロマトグラフィーにかけたところ、Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンエチルエステル（２９ｇ、６７％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３９−７．２３（ｍ，５Ｈ），４．１６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），３．９１（ｓ，２Ｈ），３．５４（ｓ，４Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ：２８０（Ｍ＋＋Ｈ）．
Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンエチルエステル（７．７０ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）のメチルアミンアルコール溶液（２５〜３０％、５０ｍＬ）への溶液を、密封管中で３時間５０℃に加熱し、室温に冷却し、真空中で濃縮したところ、Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンメチルアミドが得られた。収量（７．６３ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．７５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），３．２０（ｓ，４Ｈ），２．８１（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ２５０（Ｍ＋Ｈ＋）．
Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−Ｎ−（フェニルメチル）−グリシンメチルアミド（３．０９ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）との混合物に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１５ｇ）を加えた。混合物を撹拌し、４０ｐｓｉのＨ２中で、４０℃に１０時間加熱し、濾過し、真空中で濃縮したところ、Ｎ−（２−メチルアミノ−２−オキソエチル）−グリシンメチルアミドが得られた。収量（１．７６ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ６．９５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．２３（ｓ，４Ｈ），２．７９（ｄ，Ｊ＝６．０，４．８Ｈｚ），２．２５（ｂｒ ｓ １Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ１６０（Ｍ＋Ｈ＋）
【０１６６】
実施例Ｌ
【０１６７】
【化１２】
【０１６８】
＜実施例３＞
【０１６９】
【化１３】
化合物１，１−ジオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−３−オン（９４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とＮａＨ（５．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の混合物のＴＨＦ（２ｍＬ）への溶液を、Ｎ２中で、−１０℃にて、ＮａＨがすべて溶解するまで１時間にわたって撹拌した。実施例Ｅ（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、Ｈ２Ｏで急冷し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を一緒にして真空中で濃縮し、残留物を調製用ＨＰＬＣで精製したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−｛［３−（１，１，３−トリオキソ−［１，２，５］チアジアゾリジン−２−イル）メチル］フェニル｝−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素（１８ｍｇ）が、白色粉末として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７１−７．４４（ｍ，１１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５３３．４０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７０】
＜実施例５＞
【０１７１】
【化１４】
イソシアン酸クロロスルホニル（１９．８μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）への０℃の溶液に、撹拌しながら、ピロリジン（１８．８μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）を、反応溶液の温度が５℃を超えて上昇することのないような速さで加えた。１．５時間撹拌した後、実施例Ｊ（９７．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（９５μＬ、０．６７８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）への溶液を、反応温度が５℃を超えて上昇することのないような速さで加えた。添加を完了したら、反応溶液を室温まで温め、一晩撹拌した。反応混合物を、１０％のＨＣｌに加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶剤を除去し、粗生成物を、調製用ＨＰＬＣで精製したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルカルボニル）アミノ］スルホニル］アミノメチル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４３−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．２３−７．２５（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），３．０２（ｍ，４Ｈ），１．７５（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５７４．００（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７２】
＜実施例６＞
【０１７３】
【化１５】
標記化合物を、実施例Ｉを使用して、実施例５と同様にして製造したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルカルボニル）アミノ］スルホニル］アミノメチル］−フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８８（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．５０（ｍ，７Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｓ，１Ｈ），３．３２−３．３６（ｍ，４Ｈ），１．７７−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５９０．０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１７４】
＜実施例７＞
【０１７５】
【化１６】
【０１７６】
ＸＨ2Ｘλ2（０．５μΛ）に溶解しているクロロスルホニルイソシアネート（１９．８μΛ，２２７μμｏλ）の０℃でかくはんされている溶液へ、実施例Ｊ（９７．３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）が、反応溶液の温度が５℃を超えないような速度で添加された。１．５時間のかくはんの後、ＣＨ2Ｃｌ2（１．５ｍＬ）に溶解しているピロリジン（１８．８μＬ，０．２２７ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（９５μＬ，０．６７８ｍｍｏｌ）の溶液が、反応溶液の温度が５℃を超えないような速度で添加された。添加が完了したら、反応溶液は室温まで加温され、一晩かくはんされた。反応混合物は、１０％ＨＣｌに注がれ、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出され、有機相は飽和塩化ナトリウムで洗浄され、Ｍｇ2ＳＯ4で乾燥され、ろ過された。溶媒の除去の後、粗物質は、分取ＨＰＬＣによって精製され、１−（３−tert−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルスルホニル）アミノ］カルボニル］アミノメチル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）ウレアが得られた。
【０１７７】
＜実施例８＞
【０１７８】
【化１７】
【０１７９】
標記化合物を、実施例Ｉを使用して、実施例７と同様にして製造したところ、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［［３−Ｎ−［［（１−ピロリジニルスルホニル）アミノ］カルボニル］アミノメチル］−フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８８（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．５０（ｍ，７Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｓ，１Ｈ），３．３２−３．３６（ｍ，４Ｈ），１．７７−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５９０．０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１８０】
＜実施例２１＞
【０１８１】
【化１８】
【０１８２】
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２(４ｍｌ）中の実施例Ｌ（０．２ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）と１−ナフチルイソシアネート（０．１０ｇ，０．６ｍｍｏｌ）の混合物を窒素下１８時間室温で攪拌した。溶媒を真空で除去し粗製品をエチルアセテート／ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２(3/1/0.7）を溶出液(0.11g、灰色がかった白色固体）に使ったカラムクロマトグラフィーで精製し１−{３−tert−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル}−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア、融点１９４−１９６を得た。
【０１８３】
＜実施例２３＞
【０１８４】
【化１９】
【０１８５】
実施例Ｌ（０．２ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）とフェニルイソシアネート（０．０９ｇ，０．６ｍｍｏｌ）を用いて実施例２１と同様の方法で標題化合物１−{３−tert−ブチル−１−［３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−イル}−３−フェニルウレアを合成した。
【０１８６】
実施例Ｎ
【０１８７】
【化２０】
（３−ニトロフェニル）酢酸（２３ｇ、１２７ｍｍｏｌ）のメタノール（２５０ｍｌ）への溶液と、触媒量の真空中で濃縮したＨ２ＳＯ４を１８時間加熱還流した。反応混合物を、真空中で濃縮して、黄色の油を得た。この生成物をメタノール（２５０ｍｌ）に溶解し、氷浴中にて１８時間撹拌し、アンモニアをゆっくり通気した。揮発成分を真空中で除去した。残留物を、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥して、２−（３−ニトロフェニル）アセトアミド（１４ｇ、灰白色の固形物）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．１（ｓ，１Ｈ），８．０（ｄ，１Ｈ），７．７（ｄ，１Ｈ），７．５（ｍ，１Ｈ），７．１（ｂｄ ｓ，１Ｈ），６．２（ｂｒｓ，１Ｈ），３．６（ｓ，２Ｈ）．
【０１８８】
前反応で得られた粗生成物（８ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（１ｇ）のエタノール（１００ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉで１８時間にわたって水素化し、セライトで濾過した。揮発成分を真空中で除去したところ、２−（３−アミノフェニル）アセトアミド（５．７ｇ）が得られた。この物質の溶液（７ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を、６Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、激しく撹拌した。亜硝酸ナトリウム（３．２２ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）の水（５０ｍｌ）への溶液を加えた。３０分後に、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（２６ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）への溶液を加えた。反応混合物を、０℃で３時間撹拌した。ｐＨを、５０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１４に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒にして真空中で濃縮したところ、２−（３−ヒドラジノフェニル）アセトアミドが得られた。
【０１８９】
前反応で得られた粗生成物（約１５ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（１．８５ｇ、１５ｍｍｏｌ）のエタノール（６０ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（１．５ｍｌ）への溶液を１時間還流し、室温に冷却した。反応混合物を、固形の炭酸水素ナトリウムを加えることによって中和した。スラリーを濾過し、揮発成分を真空中で除去したところ、残留物が得られ、この残留物を酢酸エチルで抽出した。溶剤を真空中で除去したところ、２−［３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］アセトアミドが、白色固形物（３．２ｇ）として得られ、この生成物は、それ以上精製せずに使用した。
【０１９０】
＜実施例２５＞
【０１９１】
【化２１】
実施例Ｎ（２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１２４ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて１８時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、粗製物を酢酸エチル（８ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（ナフタレン−１−イル）尿素が、白色固形物（０．２２ｇ）として得られた。融点： ２３０℃(dec.)；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：
δ９．１２（ｓ，１Ｈ），８．９２（ｓ，１Ｈ），８．３２−８．０８（ｍ，３Ｈ），７．９４−７．４４（ｍ，８Ｈ），６．４４（ｓ，１Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ．
【０１９２】
＜実施例２６＞
【０１９３】
【化２２】
標記化合物を、実施例Ｎ（０．２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．１１２ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を使用して、実施例２３と同様にして合成したところ、１−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−［３−（カルバモイルメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル｝−３−（４−クロロフェニル）尿素が白色固形物（０．２８ｇ）として得られた。融点：２２２ ２２４℃(dec.)；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；δ９．１５（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），７．５５−７．３１（ｍ，８Ｈ），６．３９（ｓ，１Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ．
【０１９４】
実施例Ｐ
【０１９５】
【化２３】
３−（３−アミノ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル（６ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（１ｇ）の混合物のエタノール（５０ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉにて１８時間水素化し、セライトで濾過した。真空中で揮発成分を除去したところ、３−（３−アミノ−フェニル）プロピオン酸のメチルエステルが（６ｇ）得られた。
前反応で得られた粗生成物（５．７ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）の６Ｎ ＨＣｌ（３５ｍｌ）への溶液を激しく撹拌しながら、０℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム（２．２ｇ）の水（２０ｍｌ）への溶液を加えた。１時間後、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（１８ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（３５ｍｌ）への溶液を加え、混合物を０℃で３時間撹拌した。ｐＨを、固形ＫＯＨを用いてｐＨ１４に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をまとめて真空中で濃縮したところ、３−（３−ヒドラジノ−フェニル）プロピオン酸メチル（１．７ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物（１．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（１．２ｇ、９．７ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（２ｍｌ）への撹拌溶液を、１８時間還流し、室温に冷却した。揮発成分を真空中で除去し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮し、残留物を、酢酸エチルのヘキサンへの３０％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製したところ、３−［３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］プロピオン酸メチル（３．２ｇ）が得られ、この生成物はそれ以上精製せずに使用した。
【０１９６】
＜実施例２９＞
【０１９７】
【化２４】
実施例Ｐ（０．３５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１９ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて２０時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、残留物を、水酸化リチウム（０．１ｇ）を含むＴＨＦ（３ｍｌ）／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）／水（１．５ｍｌ）の溶液中で室温にて３時間撹拌し、ＥｔＯＡｃおよび希クエン酸溶液で希釈した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、揮発成分を真空中で除去した。残留物を、メタノールのＣＨ２Ｃｌ２への３％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（ナフタレン−１−ｙｌ）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニルプロピオン酸（０．２２ｇ、褐色の固形物）を得た。融点：１０５−１０７；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８７−７．３６（ｍ，１０Ｈ），７．１８−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０１９８】
＜実施例３０＞
【０１９９】
【化２５】
標記化合物を、実施例Ｐ（０．３０ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．１４６ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を使用して、実施例２９と同様にして合成したところ、３−（３−｛３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）プロピオン酸（０．０５ｇ、白色固形物）が得られた。融点：８５ ８７；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２１（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．１４（ｍ，７Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２００】
実施例Ｑ
【０２０１】
【化２６】
３−（４−アミノフェニル）アクリル酸エチル（１．５ｇ）と活性炭担持１０％Ｐｄ（０．３ｇ）の混合物のエタノール（２０ｍｌ）への溶液を、３０ｐｓｉにて１８時間水素化し、セライトで濾過した。真空中で揮発成分を除去したところ、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸エチル（１．５ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物溶液（１．５ｇ、８．４ｍｍｏｌ）を、６ＮのＨＣｌ（９ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、激しく撹拌した。亜硝酸ナトリウム（０．５８ｇ）の水（７ｍｌ）への溶液を加えた。１時間後、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（５ｇ）の６Ｎ ＨＣｌ（１０ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物は、０℃で３時間攪拌された。反応混合物のｐＨを固形ＫＯＨを用いてｐＨ１４に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をまとめて真空中で濃縮したところ、３−（４−ヒドラジノ−フェニル）−プロピオン酸エチル（１ｇ）が得られた。
前反応で得られた粗生成物（１ｇ、８．８ｍｍｏｌ）と４，４−ジメチル−３−オキソペンタンニトリル（０．７ｇ）のエタノール（８ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（１ｍｌ）への溶液を、１８時間還流し、室温に冷却した。揮発成分を、真空中で除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。残留物を、溶出液としてメタノールのＣＨ２Ｃｌ２への０．７％溶液を使用したカラムクロマトグラフィーで精製し、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸エチル（０．５７ｇ）を得た。
【０２０２】
＜実施例３１＞
【０２０３】
【化２７】
実施例Ｑ（０．２５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）とイソシアン酸１−ナフチル（０．１３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）への溶液を、Ｎ２中で室温にて２０時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、残留物を、水酸化リチウム（０．１ｇ）を含むＴＨＦ（３ｍｌ）／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）／水（１．５ｍｌ）の溶液中で室温にて３時間撹拌し、ＥｔＯＡｃおよび希クエン酸溶液で希釈した。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、揮発成分を真空中で除去した。残留物を、メタノールのＣＨ２Ｃｌ２への４％溶液を溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸（０．１８ｇ、灰白色の固形物）を得た。融点：１２０ １２２；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８９−７．０６（ｍ，１１Ｈ），６．５（ｓ，１Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２０４】
＜実施例３２＞
【０２０５】
【化２８】
標記化合物を、実施例Ｑ（０．１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸４−クロロフェニル（０．０７７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を使用して、実施例３１と同様にして合成したところ、３−｛４−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝フェニル）プロパン酸（０．１６ｇ、灰白色固形物）が得られた。融点：１１２−１１４；１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１６（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｓ，２Ｈ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ
【０２０６】
＜実施例３９＞
【０２０７】
【化２９】
【０２０８】
＜実施例４１＞
【０２０９】
【化３０】
【０２１０】
磁気式かくはん棒が備えられた１００ｍＬの丸底フラスコで、実施例３９（２．０７ｇ）がＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）に溶解され、氷浴で０℃まで冷却された。ＢＢｒ3（ＣＨ2Ｃｌ2の１Ｍ溶液；７．５ｍＬ）が時間をかけて添加された。反応物は一晩中室温に加温された。さらなるＢＢｒ3（ＣＨ2Ｃｌ2の１Ｍ溶液を２×１ｍＬ、合計で９．５ｍｍｏｌが添加された）が添加され、反応物はＭｅＯＨを添加することによってクエンチされた。溶媒の蒸発により結晶物質が生成し、これは、溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（９．６：０．４）を用いたシリカゲル（３０ｇ）によるクロマトグラフィーによって分離され、１−［３−tert−ブチル−１−（３−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（０．４０ｇ，２０％）が得られた。
【０２１１】
実施例Ｘ
【０２１２】
【化３１】
【０２１３】
＜実施例５９＞
【０２１４】
【化３２】
【０２１５】
実施例Ｘ（１．３７ｇ）とｐ−ブロモフェニルイソシアネート（９９０ｍｇ）を用いて実施例４１と同様の方法で、標題化合物４−{３−tert−ブチル−５−［３−（４−ブロモフェニル）ウレイド］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル}安息香酸メチルを白色結晶（１．４ｇ、５９％）で、ＨＰＬＣ純度：９４％、融点２７０−２７２で得た。
【０２１６】
＜実施例６０＞
【０２１７】
【化３３】
実施例５９（７００ｍｇ）の３０ｍＬのトルエンへの溶液（−７８℃）に、水素化ジイソブチルアルミニウムのトルエン溶液（１Ｍ トルエン溶液、７．５ｍＬ）を１０分間滴下して加えた。反応混合物を、−７８℃で３０分間撹拌し、その後０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、真空中で無水状態となるまで濃縮し、Ｈ２Ｏで処理した。固形物を濾過し、アセトニトリルで処理した。溶液を無水状態となるまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルに溶解し、ヘキサンで沈殿させたところ、黄色の固形物が得られ、この固形物を真空中で乾燥させたところ、１−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−ヒドロキシメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］尿素（４００ｍｇ、６１％）が得られた。ＨＰＬＣ純度：９５％；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．２（ｓ，１Ｈ），８．４（ｓ，１Ｈ），７．５（ｍ，８Ｈ），６．４（ｓ，１Ｈ），５．３（ｔ，１Ｈ），４．６（ｄ，２Ｈ），１．３（ｓ，９Ｈ）．
上掲の参考文献は、いずれも、ここに言及することによって、本発明に組み込むものである。また、同時に出願する２件の出願、すなわち、Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ，米国特許出願番号１０／７４６，４６０号（２００３年１２月２４日出願）およびＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ，米国特許出願番号１０／７４６，４０７号（２００３年１２月２４日出願）も、ここに言及することによって、本発明に組み込むものである。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
この特許または出願のファイルは、１以上のカラー図面を含むものである。カラー図面を含む本特許または特許出願の公報の複写物は、特許庁に請求し、必要な費用を支払うことによって入手可能である。
【図１】図１は、「オン」および「オフ」のスイッチ制御ポケット、過渡的に修飾可能なスイッチ制御リガンド、および活性ＡＴＰ部位を含む、本発明の天然哺乳動物タンパク質の模式図である。
【図２】図２は、図１のタンパク質の模式図であり、この図では、スイッチ制御リガンドがオフのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、生物学的に下方調節された第一コンホメーションをとっている。
【図３】図３は、図１と同様の図であるが、スイッチ制御リガンドの特定のアミノ酸残基のＯＨ基がリン酸化され、スイッチ制御リガンドが、帯電して修飾された状態を示す。
【図４】図４は、図２と同様の図であるが、この図では、スイッチ制御リガンドがオンのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、図２の第一コンホメーションとは異なる、生物学的に活性な第二コンホメーションをとっている。
【図４ａ】図４ａは、スイッチ制御リガンドのリン酸化された残基と、オンのスイッチ制御ポケット由来の相補的な残基との典型的な結合を図示する拡大模式図である。
【図５】図５は、図１と同様の図であるが、オンおよびオフのスイッチ制御ポケットと結合関係にある小型分子化合物を模式的に示す。
【図６】図６は、スイッチ制御リガンドおよびオンのスイッチ制御ポケットのそれぞれの一部から複合型スイッチ制御ポケットが形成され、小型分子が、この複合型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図７】図７は、オンのスイッチ制御ポケット、スイッチ制御リガンド配列、活性ＡＴＰ部位のそれぞれの一部から組合わせ型スイッチ制御ポケットが形成され、小型分子が、この組合わせ型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図８】図８は、Ｘ線結晶構造解析で得られたリボン図であり、生物学的に上方調節された状態にあるインシュリン受容体のキナーゼタンパク質のオンのコンホメーションを示すものである。
【図９】図９は、図８と同様の図であるが、タンパク質が生物学的に下方調節され、オフのコンホメーションにある状態を示すものである。
【図１０】図１０は、ａｂｌキナーゼを、ＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１１】図１１は、ａｂｌキナーゼを、ＧＲＡＳＰで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１２】図１２は、ａｂｌキナーゼタンパク質のリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１３】図１３は、ａｂｌキナーゼタンパク質のリボン図であり、組合せ型のスイッチ制御ポケット（オンのスイッチ制御ポケット／スイッチ制御リガンド配列／ＡＴＰ活性部位）を示す。
【図１４】図１４は、ｐ３８キナーゼを、ＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１５】図１５は、ｐ３８キナーゼを、ＧＲＡＳＰで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１６】図１６は、ｐ３８キナーゼタンパク質のリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケット重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１７】図１７は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質をＳＵＲＦＮＥＴで可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１８】図１８は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質をＧＲＡＳＰで可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１９】図１９は、Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質のリボン図であり、組合せ型のオン・オフ・スイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図２０】図２０は、非リン酸化状態の準精製ａｂｌのキナーゼドメインのタンパク質を識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】図２１は、非リン酸化状態の精製ａｂｌのキナーゼタンパク質を識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２２】図２２は、準精製ａｂｌキナーゼドメインタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２３】図２３は、精製ａｂｌキナーゼドメインタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２４】図２４は、ＴＥＶタグの解裂前（レーン２〜４）および後（レーン５〜８）のａｂｌ キナーゼタンパク質を識別したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２５】図２５は、精製ａｂｌタンパク質の、紫外線スペクトルであり、このタンパク質のＡＴＰ部位には、小型分子阻害物質であるＰＤ１８０７９０が結合している。
【図２６】図２６は、ニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィーおよびＱ−セファロースを用いたクロマトグラフィーで精製を行った際の、ａｂｌ構築物５タンパク質（ａｂｌ １−５３１，Ｙ４１２Ｆ 変異型）のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２７】図２７は、精製ａｂｌ構築物５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２８】図２８は、非リン酸化状態にある精製ｐ３８αキナーゼタンパク質のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２９】図２９は、非リン酸化状態にある精製ｐ３８αキナーゼタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図３０】図３０は、リン酸化状態にある活性化されたＧｓｋ３−βタンパク質の質量スペクトルである。
【図３１】図３１は、非リン酸化状態にある活性化されていないＧｓｋ３−βタンパク質の質量スペクトルである。
【図３２】図３２は、ウェスタンブロットで、リン酸化されたＧｓｋ３−βタンパク質をホスホチロシン抗体によって染色したところである。
【図３３】図３３は、ウェスタンブロットで、リン酸化されていないＧｓｋ３−βタンパク質をホスホチロシン抗体によって染色したところである。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の天然タンパク質と相互に作用して、そのタンパク質の活性を調節する分子を識別する方法であって、
上記タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドを識別し、
上記タンパク質の一部を形成し、上記スイッチ制御リガンドと相互作用するスイッチ制御ポケットを識別し、ここで上記リガンドは、インビボで上記ポケットと相互に作用して上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、上記タンパク質が、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものであり、
上記タンパク質の第一コンホメーションおよび第二コンホメーションの各サンプルを用意し、そして、
１以上の候補分子に対する上記サンプルの１以上のスクリーニングを、候補分子を上記サンプルの一つと接触させることによって行い、このタンパク質のポケット領域に結合してタンパク質の活性を調節する小型分子を識別する
過程を含む方法。
【請求項２】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記スイッチ制御リガンド配列およびスイッチ制御ポケットの識別過程が、生物情報学的分析、Ｘ線結晶構造解析、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、およびアフィニティ系のスクリーニングよりなる群から選ばれるものである請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記のタンパク質を用意する過程が、上記の第一および第二のコンホメーションに対応するそれぞれの状態に静的に封じ込められている上記タンパク質の実質的に精製されたサンプルを得る過程である請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記の接触過程が、アフィニティ系のスクリーニング、キャピラリーゾーン電気泳動、蛍光プローブ置換分析、磁気共鳴スペクトロスコピー、円偏光二色性、Ｘ線結晶構造解析よりなる群から選ばれる技術を含むものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記タンパク質がキナーゼタンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質と、このタンパク質のスイッチ制御ポケットに結合している非天然分子を含むタンパク質・モジュレータ・アダクトであって、この分子が、上記タンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによって上記タンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目をはたしているアダクト。
【請求項１１】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を誘導する役目をはたしている請求項１０記載のアダクト。
【請求項１２】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を制限する役目をはたしている請求項１０記載のアダクト。
【請求項１３】
上記タンパク質が、スイッチ制御リガンドも含んでおり、このリガンドが、インビボで上記ポケットと相互作用して、上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節しており、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が、第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１４】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１５】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１６】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１７】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１８】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項１０記載のアダクト。
【請求項１９】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項１８記載のアダクト。
【請求項２０】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項１０記載のアダクト。
【請求項２１】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項２０記載のアダクト。
【請求項２２】
上記タンパク質が、キナーゼタンパク質である請求項１０記載のアダクト。
【請求項２３】
タンパク質の生物学的活性を変更する方法であって、
スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質を用意し、
上記タンパク質を、非天然分子のモジュレータと接触させ、
上記モジュレータを上記タンパク質の上記ポケットの領域に結合させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する
過程を含むタンパク質の生物学的活性を変更する方法。
【請求項２４】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を誘導する役目をはたしている請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を制限する役目をはたしている請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
上記タンパク質が、スイッチ制御リガンドも含んでおり、このリガンドが、インビボで上記ポケットと相互作用して、上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節しており、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が、第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
上記タンパク質が、キナーゼタンパク質である請求項３２記載の方法。
【請求項１】
特定の天然タンパク質と相互に作用して、そのタンパク質の活性を調節する分子を識別する方法であって、
上記タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドを識別し、
上記タンパク質の一部を形成し、上記スイッチ制御リガンドと相互作用するスイッチ制御ポケットを識別し、ここで上記リガンドは、インビボで上記ポケットと相互に作用して上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、上記タンパク質が、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものであり、
上記タンパク質の第一コンホメーションおよび第二コンホメーションの各サンプルを用意し、そして、
１以上の候補分子に対する上記サンプルの１以上のスクリーニングを、候補分子を上記サンプルの一つと接触させることによって行い、このタンパク質のポケット領域に結合してタンパク質の活性を調節する小型分子を識別する
過程を含む方法。
【請求項２】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記スイッチ制御リガンド配列およびスイッチ制御ポケットの識別過程が、生物情報学的分析、Ｘ線結晶構造解析、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、およびアフィニティ系のスクリーニングよりなる群から選ばれるものである請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記のタンパク質を用意する過程が、上記の第一および第二のコンホメーションに対応するそれぞれの状態に静的に封じ込められている上記タンパク質の実質的に精製されたサンプルを得る過程である請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記の接触過程が、アフィニティ系のスクリーニング、キャピラリーゾーン電気泳動、蛍光プローブ置換分析、磁気共鳴スペクトロスコピー、円偏光二色性、Ｘ線結晶構造解析よりなる群から選ばれる技術を含むものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記タンパク質がキナーゼタンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質と、このタンパク質のスイッチ制御ポケットに結合している非天然分子を含むタンパク質・モジュレータ・アダクトであって、この分子が、上記タンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによって上記タンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目をはたしているアダクト。
【請求項１１】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を誘導する役目をはたしている請求項１０記載のアダクト。
【請求項１２】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を制限する役目をはたしている請求項１０記載のアダクト。
【請求項１３】
上記タンパク質が、スイッチ制御リガンドも含んでおり、このリガンドが、インビボで上記ポケットと相互作用して、上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節しており、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が、第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１４】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１５】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１６】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１７】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１０記載のアダクト。
【請求項１８】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項１０記載のアダクト。
【請求項１９】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項１８記載のアダクト。
【請求項２０】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項１０記載のアダクト。
【請求項２１】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項２０記載のアダクト。
【請求項２２】
上記タンパク質が、キナーゼタンパク質である請求項１０記載のアダクト。
【請求項２３】
タンパク質の生物学的活性を変更する方法であって、
スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質を用意し、
上記タンパク質を、非天然分子のモジュレータと接触させ、
上記モジュレータを上記タンパク質の上記ポケットの領域に結合させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する
過程を含むタンパク質の生物学的活性を変更する方法。
【請求項２４】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を誘導する役目をはたしている請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
上記分子が、上記タンパク質のコンホメーションの変化を制限する役目をはたしている請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
上記タンパク質が、スイッチ制御リガンドも含んでおり、このリガンドが、インビボで上記ポケットと相互作用して、上記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節しており、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が、第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
上記ポケットが、オンのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
上記ポケットが、オフのポケットであり、上記分子が、アンタゴニストとして、上記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
上記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
上記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
上記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
上記タンパク質が、キナーゼタンパク質である請求項３２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２００６−５１７６５４（Ｐ２００６−５１７６５４Ａ）
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８６２６（Ｐ２００５−５０８６２６）
【出願日】平成１５年１２月２６日（２００３．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１４５０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１０８４
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５０５２４７３０６）デシファラ ファーマスーティカルズ， エルエルシー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月２６日（２００３．１２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１４５０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１０８４
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５０５２４７３０６）デシファラ ファーマスーティカルズ， エルエルシー (10)
【Ｆターム（参考）】
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