アッセイ、方法および手段
【課題】低酸素誘導因子（ＨＩＦ）レベルまたは活性の増加または減少に関連した症状の治療に使用するためのＨＩＦモジュレーターを提供する。
【解決手段】複数の特定のアミノ酸配列を有する新規クラスのヒドロキシラーゼ、ならびにＨＩＦヒドロキシル化活性を有するその変異体および断片を取得することからなり、該ポリペプチドは特に、プロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。ＨＩＦヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質をモニターすることからなる。
【解決手段】複数の特定のアミノ酸配列を有する新規クラスのヒドロキシラーゼ、ならびにＨＩＦヒドロキシル化活性を有するその変異体および断片を取得することからなり、該ポリペプチドは特に、プロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。ＨＩＦヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質をモニターすることからなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素誘導因子（HIF）ヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、
・HIFヒドロキシラーゼが試験物質の非存在下で該基質と相互作用する条件下、該ヒドロキシラーゼの基質の存在下で該ヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、
・該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用、または相互作用の欠如を確認する、
ことを含んでなるアッセイ方法。
【請求項２】
試験物質の存在下での該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用を、該ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性を測定することにより確認する、請求項1記載のアッセイ方法。
【請求項３】
該ヒドロキシラーゼと試験物質とを2-オキソグルタル酸の存在下で接触させ、コハク酸およびCO2への2-オキソグルタル酸の代謝回転を測定することにより該ヒドロキシラーゼ活性を測定する、請求項2記載のアッセイ方法。
【請求項４】
基質中の1個以上のプロリン残基のヒドロキシル化を測定することにより該ヒドロキシラーゼ活性を測定する、請求項2または3記載のアッセイ方法。
【請求項５】
基質がHIFポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項６】
HIFポリペプチドが、HIF-1α、HIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンを含むその断片、HIF-1αのペプチド類似体、あるいはHIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンを含むその断片のペプチド類似体を含み、HIF-1αのPro 564および／またはPro 402、あるいは前記の同等のプロリンのヒドロキシル化を測定する、請求項5記載のアッセイ方法。
【請求項７】
基質が、ヒトHIF-1α配列の残基549-582のように残基556-574を含むポリペプチド配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項８】
HIFヒドロキシラーゼがプロリルヒドロキシラーゼである、請求項1〜7のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項９】
HIFヒドロキシラーゼが、
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
HIFヒドロキシラーゼが配列番号2、4、6もしくは8、FLJ21620（BAB15101）またはClorf12（NP071334）から選ばれる、請求項1〜9のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
HIFポリペプチドを発現する細胞を準備し、該細胞内でHIFヒドロキシラーゼを組換え的に発現させ、該細胞を試験物質と接触させ、該細胞におけるHIFポリペプチドの存在量もしくは安定性またはHIF関連活性をモニターして、HIFヒドロキシラーゼ活性に対する該試験物質の効果を判定する、請求項5〜10のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
HIF関連活性が、フォン・ヒッペル-リンダウタンパク質（VHL）との相互作用、HIFにより媒介される転写、HIF調節性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の発現から選ばれる、請求項11記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
HIFヒドロキシラーゼがヒトHIFヒドロキシラーゼである、請求項1〜12のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
HIFポリペプチドがヒトHIF-1αまたはHIF-2αである、請求項1〜13のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
（a）請求項1〜14のいずれか1項記載のアッセイ方法により物質を同定し、
（b）そのようにして同定された物質を製薬上許容される賦形剤と共に製剤化する、
ことを含んでなる医薬組成物の提供方法。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか1項記載のアッセイ方法により同定された物質。
【請求項１７】
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含んでなるポリペプチド。
【請求項１８】
請求項17記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１９】
（i）配列番号1、3、5もしくは7またはその相補的配列、
（ii）ストリンジェントな条件下、（i）に記載の配列にハイブリダイズする配列、
（iii）遺伝暗号の結果として、（i）または（ii）に記載の配列に縮重している配列、
（iv）（i）に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有する配列、または
（v）ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドまたはHIFヒドロキシラーゼに特異的な抗体を産生しうるポリペプチドをコードする、配列（i）、（ii）、（iii）または（iv）のいずれかの断片、
を含む、請求項18記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
DNAである、請求項18または19記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２２】
請求項17記載のポリペプチドと特異的に結合しうる抗体またはそのフラグメント。
【請求項２３】
ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体、および製薬上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２５】
HIFレベルまたは活性の増加または減少に関連した症状あるいはHIFレベルまたは活性をモジュレーションすることが望ましい症状の治療用の医薬の製造における、HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーター、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体の使用。
【請求項２６】
前記症状が、虚血、創傷治癒、自家、同種および異種移植、全身性高血圧、癌ならびに炎症性疾患よりなる群から選ばれる、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーターが、HIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ（CPH）インヒビターであり、前記症状が、HIFレベルまたは活性の減少に関連したものである、請求項25または26記載の使用。
【請求項２８】
前記インヒビターが、式：
R1-A*B*C*D(R2)y (A)
[式中、基R1は、触媒作用中に2-オキソグルタル酸の5-カルボキシラートに結合するアルギニンの側鎖との静電的相互作用を生成することができる；A*Bは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2個の原子の鎖であり、該鎖は官能基化されていてもよい；A、B、CおよびDは単結合および／または二重結合および／または三重結合により互いに連結されており、yは0または1である；C*Dは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2個の原子の鎖であり、鎖C-Dは官能基化されていてもよく、こうして、yが0または1である場合には、鎖C-Dの原子の少なくとも1つは、金属基とキレート形成する能力を有し、yが1である場合には、鎖C-Dは、金属基とのキレート形成が可能なR2に結合している]を有する、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
R1が-CO2H、-SO3H、-B(OH)2または-PO3H2である、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
y=0であり、Cおよび／またはDが=S、=O、-SHまたは-OHに結合している、請求項28または29記載の使用。
【請求項３１】
yが1であり、R2が-SH、-OH、-CO2H、-SO3H、-B(OH)2、-PO3H2、-NHOH、-CONHR3、-CONHOR3、-CONR3OHまたはCONR3OR3（ここで、R3は、官能基化されていてもよい炭素数1〜6の分枝状または直鎖状アルキル基である）である、請求項28または29記載の使用。
【請求項３２】
前記インヒビターが、式：
【化１】
［式中、R1およびRは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは官能基化されていてもよい）、いずれかの天然アミノ酸側鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である；Xは、NH、NR''（ここで、R''は、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖）またはOである；Yは、OまたはSである］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３３】
前記インヒビターがジメチルオキサリルグリシンである、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
前記インヒビターが、式：
【化２】
［式中、R1およびRは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、いずれかの天然アミノ酸側鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である；Yは、OまたはSである］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３５】
前記インヒビターが、式：
【化３】
［式中、RI〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル、ハロゲン基（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、カルボキシラート基、所望により1個以上のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1個以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）、あるいはC(=O)XR基であり、ここで、Xは、O、NH、NR（ここで、Rは、H、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキルを含有するアルコキシ、1または2個のN、S、OまたはP原子を含有する4〜7員複素環、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）またはOである）であり、mは0または1である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３６】
前記インヒビターが、式：
【化４】
［式中、RIII〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは、所望により、1、2、3、4または5個のハロ置換を含有していてもよい）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３７】
前記インヒビターが、式：
【化５】
［式中、R1、R2、R3およびR4は、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、OH、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖を有するO-アルキル、COOH、分枝状または直鎖状C1-C6アルキルエステル、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1個以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３８】
前記インヒビターが、式：
【化６】
［式中、RI〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは、所望により、1、2、3、4または5個のハロ置換を含有していてもよい）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３９】
前記インヒビターが、式：
【化７】
（式中、A*B*C*Dは、請求項28で定義したとおりであり、R21は、水素またはアシルである）を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項４０】
HIFヒドロキシラーゼのモジュレーターがHIFヒドロキシラーゼポリペプチドの選択的インヒビターであり、前記症状がHIFレベルまたは活性の減少に関連したものである、請求項25記載の使用。
【請求項４１】
HIF活性の増加または減少に関連した症状あるいはHIF活性をモジュレーションすることが望ましい症状の治療方法であって、それを必要する個体に、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項17記載のポリペプチドの活性のモジュレーター、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体を治療に有効な量で投与することを含んでなる方法。
【請求項４２】
細胞内のHIFポリペプチドの量をモジュレーションする方法であって、HIFヒドロキシラーゼのプロリルヒドロキシラーゼ活性を抑制する物質と該細胞とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項４３】
前記モジュレーターが請求項16記載の物質である、請求項41または42記載の方法。
【請求項４４】
前記モジュレーターがHIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するが、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼの生物活性は抑制しない、請求項41〜43のいずれか1項記載の方法。
【請求項４５】
請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項17記載のポリペプチドの活性のモジュレーター、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体および製薬上許容される賦形剤を混合することを含んでなる、医薬組成物の製造方法。
【請求項４６】
HIFヒドロキシラーゼの製造方法であって、
（a）適当な発現系においてHIFヒドロキシラーゼをコードする核酸からの発現を生じさせて、該ポリペプチドを組換え的に産生させ、
（b）組換え的に産生された該ポリペプチドによるHIFポリペプチドのヒドロキシル化を確認する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４７】
HIFヒドロキシラーゼを同定するためのアッセイ方法であって、
（a）試験ポリペプチドを準備し、
（b）HIFポリペプチドがHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される条件下、HIFポリペプチドと該試験ポリペプチドとを接触させ、
（c）HIFポリペプチドのヒドロキシル化を確認する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４８】
HIFポリペプチドのプロリルヒドロキシル化のための、請求項17記載のポリペプチドの使用。
【請求項４９】
配列番号9：
DLDLEMLAP*YIPMDDDFQL（配列番号9）
（ここで、P*は4-ヒドロキシプロリンである）
で表される単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号9の変異体である単離されたポリペプチドであって、該変異体がP*以外のいずれかのアミノ酸の1〜4個のアミノ酸置換を含み、該変異体がHIF-αサブユニットとVHLとの相互作用に拮抗する能力を保有している、前記の単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
請求項49または請求項50記載のポリペプチドを、試験物質の存在下、VHLのHIF-1α結合ドメインと接触させ、該ポリペプチドの相互作用を測定することを含んでなる、VHLとHIF-αとの相互作用のモジュレーターに関するアッセイ。
【請求項５２】
VHLにより媒介されるHIF-α破壊のインヒビターに関するアッセイであって、
・HIF-α VHL結合ドメイン中のプロリン残基のヒドロキシル化に適した条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片を、その対応するプロリル-ヒドロキシラーゼと共に供給し、
・ヒドロキシル化の推定モジュレーターを供給し、
・プロリン残基のヒドロキシル化の量が推定モジュレーターによりモジュレーションされたか否かを判定する、
ことを含んでなるアッセイ。
【請求項５３】
HIF-α中のプロリン残基のヒドロキシル化の促進物質に関するアッセイであって、
・低酸素条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片を供給し、ただし、該HIF-αまたはその断片はVHL結合ドメイン中にプロリン残基を含有するものであり、
・推定ヒドロキシル化促進物質を供給し、
・該物質がプロリンのヒドロキシル化をもたらすか否かを判定する、
ことを含んでなるアッセイ。
【請求項５４】
請求項17記載のポリペプチドの基質の同定方法であって、試験ポリペプチド基質を請求項17記載のHIFヒドロキシラーゼと接触させ、該試験ポリペプチド基質のヒドロキシル化をモニターすることを含んでなる方法。
【請求項５５】
（a）請求項19記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、または
（b）請求項19記載のポリヌクレオチドに対するRNAi、
を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１】
低酸素誘導因子（HIF）ヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、
・HIFヒドロキシラーゼが試験物質の非存在下で該基質と相互作用する条件下、該ヒドロキシラーゼの基質の存在下で該ヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、
・該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用、または相互作用の欠如を確認する、
ことを含んでなるアッセイ方法。
【請求項２】
試験物質の存在下での該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用を、該ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性を測定することにより確認する、請求項1記載のアッセイ方法。
【請求項３】
該ヒドロキシラーゼと試験物質とを2-オキソグルタル酸の存在下で接触させ、コハク酸およびCO2への2-オキソグルタル酸の代謝回転を測定することにより該ヒドロキシラーゼ活性を測定する、請求項2記載のアッセイ方法。
【請求項４】
基質中の1個以上のプロリン残基のヒドロキシル化を測定することにより該ヒドロキシラーゼ活性を測定する、請求項2または3記載のアッセイ方法。
【請求項５】
基質がHIFポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項６】
HIFポリペプチドが、HIF-1α、HIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンを含むその断片、HIF-1αのペプチド類似体、あるいはHIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンを含むその断片のペプチド類似体を含み、HIF-1αのPro 564および／またはPro 402、あるいは前記の同等のプロリンのヒドロキシル化を測定する、請求項5記載のアッセイ方法。
【請求項７】
基質が、ヒトHIF-1α配列の残基549-582のように残基556-574を含むポリペプチド配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項８】
HIFヒドロキシラーゼがプロリルヒドロキシラーゼである、請求項1〜7のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項９】
HIFヒドロキシラーゼが、
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
HIFヒドロキシラーゼが配列番号2、4、6もしくは8、FLJ21620（BAB15101）またはClorf12（NP071334）から選ばれる、請求項1〜9のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
HIFポリペプチドを発現する細胞を準備し、該細胞内でHIFヒドロキシラーゼを組換え的に発現させ、該細胞を試験物質と接触させ、該細胞におけるHIFポリペプチドの存在量もしくは安定性またはHIF関連活性をモニターして、HIFヒドロキシラーゼ活性に対する該試験物質の効果を判定する、請求項5〜10のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
HIF関連活性が、フォン・ヒッペル-リンダウタンパク質（VHL）との相互作用、HIFにより媒介される転写、HIF調節性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の発現から選ばれる、請求項11記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
HIFヒドロキシラーゼがヒトHIFヒドロキシラーゼである、請求項1〜12のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
HIFポリペプチドがヒトHIF-1αまたはHIF-2αである、請求項1〜13のいずれか1項記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
（a）請求項1〜14のいずれか1項記載のアッセイ方法により物質を同定し、
（b）そのようにして同定された物質を製薬上許容される賦形剤と共に製剤化する、
ことを含んでなる医薬組成物の提供方法。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか1項記載のアッセイ方法により同定された物質。
【請求項１７】
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含んでなるポリペプチド。
【請求項１８】
請求項17記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１９】
（i）配列番号1、3、5もしくは7またはその相補的配列、
（ii）ストリンジェントな条件下、（i）に記載の配列にハイブリダイズする配列、
（iii）遺伝暗号の結果として、（i）または（ii）に記載の配列に縮重している配列、
（iv）（i）に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有する配列、または
（v）ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドまたはHIFヒドロキシラーゼに特異的な抗体を産生しうるポリペプチドをコードする、配列（i）、（ii）、（iii）または（iv）のいずれかの断片、
を含む、請求項18記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
DNAである、請求項18または19記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２２】
請求項17記載のポリペプチドと特異的に結合しうる抗体またはそのフラグメント。
【請求項２３】
ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体、および製薬上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２５】
HIFレベルまたは活性の増加または減少に関連した症状あるいはHIFレベルまたは活性をモジュレーションすることが望ましい症状の治療用の医薬の製造における、HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーター、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体の使用。
【請求項２６】
前記症状が、虚血、創傷治癒、自家、同種および異種移植、全身性高血圧、癌ならびに炎症性疾患よりなる群から選ばれる、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーターが、HIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ（CPH）インヒビターであり、前記症状が、HIFレベルまたは活性の減少に関連したものである、請求項25または26記載の使用。
【請求項２８】
前記インヒビターが、式：
R1-A*B*C*D(R2)y (A)
[式中、基R1は、触媒作用中に2-オキソグルタル酸の5-カルボキシラートに結合するアルギニンの側鎖との静電的相互作用を生成することができる；A*Bは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2個の原子の鎖であり、該鎖は官能基化されていてもよい；A、B、CおよびDは単結合および／または二重結合および／または三重結合により互いに連結されており、yは0または1である；C*Dは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2個の原子の鎖であり、鎖C-Dは官能基化されていてもよく、こうして、yが0または1である場合には、鎖C-Dの原子の少なくとも1つは、金属基とキレート形成する能力を有し、yが1である場合には、鎖C-Dは、金属基とのキレート形成が可能なR2に結合している]を有する、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
R1が-CO2H、-SO3H、-B(OH)2または-PO3H2である、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
y=0であり、Cおよび／またはDが=S、=O、-SHまたは-OHに結合している、請求項28または29記載の使用。
【請求項３１】
yが1であり、R2が-SH、-OH、-CO2H、-SO3H、-B(OH)2、-PO3H2、-NHOH、-CONHR3、-CONHOR3、-CONR3OHまたはCONR3OR3（ここで、R3は、官能基化されていてもよい炭素数1〜6の分枝状または直鎖状アルキル基である）である、請求項28または29記載の使用。
【請求項３２】
前記インヒビターが、式：
【化１】
［式中、R1およびRは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは官能基化されていてもよい）、いずれかの天然アミノ酸側鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である；Xは、NH、NR''（ここで、R''は、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖）またはOである；Yは、OまたはSである］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３３】
前記インヒビターがジメチルオキサリルグリシンである、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
前記インヒビターが、式：
【化２】
［式中、R1およびRは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、いずれかの天然アミノ酸側鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である；Yは、OまたはSである］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３５】
前記インヒビターが、式：
【化３】
［式中、RI〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル、ハロゲン基（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、カルボキシラート基、所望により1個以上のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1個以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）、あるいはC(=O)XR基であり、ここで、Xは、O、NH、NR（ここで、Rは、H、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキルを含有するアルコキシ、1または2個のN、S、OまたはP原子を含有する4〜7員複素環、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）またはOである）であり、mは0または1である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３６】
前記インヒビターが、式：
【化４】
［式中、RIII〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは、所望により、1、2、3、4または5個のハロ置換を含有していてもよい）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３７】
前記インヒビターが、式：
【化５】
［式中、R1、R2、R3およびR4は、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、OH、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖を有するO-アルキル、COOH、分枝状または直鎖状C1-C6アルキルエステル、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1個以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３８】
前記インヒビターが、式：
【化６】
［式中、RI〜RVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（これは、所望により、1、2、3、4または5個のハロ置換を含有していてもよい）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項３９】
前記インヒビターが、式：
【化７】
（式中、A*B*C*Dは、請求項28で定義したとおりであり、R21は、水素またはアシルである）を有する、請求項28〜31のいずれか1項記載の使用。
【請求項４０】
HIFヒドロキシラーゼのモジュレーターがHIFヒドロキシラーゼポリペプチドの選択的インヒビターであり、前記症状がHIFレベルまたは活性の減少に関連したものである、請求項25記載の使用。
【請求項４１】
HIF活性の増加または減少に関連した症状あるいはHIF活性をモジュレーションすることが望ましい症状の治療方法であって、それを必要する個体に、請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項17記載のポリペプチドの活性のモジュレーター、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体を治療に有効な量で投与することを含んでなる方法。
【請求項４２】
細胞内のHIFポリペプチドの量をモジュレーションする方法であって、HIFヒドロキシラーゼのプロリルヒドロキシラーゼ活性を抑制する物質と該細胞とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項４３】
前記モジュレーターが請求項16記載の物質である、請求項41または42記載の方法。
【請求項４４】
前記モジュレーターがHIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するが、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼの生物活性は抑制しない、請求項41〜43のいずれか1項記載の方法。
【請求項４５】
請求項16記載の物質、請求項17記載のポリペプチド、請求項17記載のポリペプチドの活性のモジュレーター、請求項18〜20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項21記載のベクターまたは請求項22記載の抗体および製薬上許容される賦形剤を混合することを含んでなる、医薬組成物の製造方法。
【請求項４６】
HIFヒドロキシラーゼの製造方法であって、
（a）適当な発現系においてHIFヒドロキシラーゼをコードする核酸からの発現を生じさせて、該ポリペプチドを組換え的に産生させ、
（b）組換え的に産生された該ポリペプチドによるHIFポリペプチドのヒドロキシル化を確認する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４７】
HIFヒドロキシラーゼを同定するためのアッセイ方法であって、
（a）試験ポリペプチドを準備し、
（b）HIFポリペプチドがHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される条件下、HIFポリペプチドと該試験ポリペプチドとを接触させ、
（c）HIFポリペプチドのヒドロキシル化を確認する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４８】
HIFポリペプチドのプロリルヒドロキシル化のための、請求項17記載のポリペプチドの使用。
【請求項４９】
配列番号9：
DLDLEMLAP*YIPMDDDFQL（配列番号9）
（ここで、P*は4-ヒドロキシプロリンである）
で表される単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号9の変異体である単離されたポリペプチドであって、該変異体がP*以外のいずれかのアミノ酸の1〜4個のアミノ酸置換を含み、該変異体がHIF-αサブユニットとVHLとの相互作用に拮抗する能力を保有している、前記の単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
請求項49または請求項50記載のポリペプチドを、試験物質の存在下、VHLのHIF-1α結合ドメインと接触させ、該ポリペプチドの相互作用を測定することを含んでなる、VHLとHIF-αとの相互作用のモジュレーターに関するアッセイ。
【請求項５２】
VHLにより媒介されるHIF-α破壊のインヒビターに関するアッセイであって、
・HIF-α VHL結合ドメイン中のプロリン残基のヒドロキシル化に適した条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片を、その対応するプロリル-ヒドロキシラーゼと共に供給し、
・ヒドロキシル化の推定モジュレーターを供給し、
・プロリン残基のヒドロキシル化の量が推定モジュレーターによりモジュレーションされたか否かを判定する、
ことを含んでなるアッセイ。
【請求項５３】
HIF-α中のプロリン残基のヒドロキシル化の促進物質に関するアッセイであって、
・低酸素条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片を供給し、ただし、該HIF-αまたはその断片はVHL結合ドメイン中にプロリン残基を含有するものであり、
・推定ヒドロキシル化促進物質を供給し、
・該物質がプロリンのヒドロキシル化をもたらすか否かを判定する、
ことを含んでなるアッセイ。
【請求項５４】
請求項17記載のポリペプチドの基質の同定方法であって、試験ポリペプチド基質を請求項17記載のHIFヒドロキシラーゼと接触させ、該試験ポリペプチド基質のヒドロキシル化をモニターすることを含んでなる方法。
【請求項５５】
（a）請求項19記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、または
（b）請求項19記載のポリヌクレオチドに対するRNAi、
を含んでなるポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ−Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ−Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ−Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ−Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００９−５０２６０（Ｐ２００９−５０２６０Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０２０１０（Ｐ２００８−２０２０１０）
【出願日】平成２０年８月５日（２００８．８．５）
【分割の表示】特願２００２−５７４３７０（Ｐ２００２−５７４３７０）の分割
【原出願日】平成１４年３月２１日（２００２．３．２１）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月５日（２００８．８．５）
【分割の表示】特願２００２−５７４３７０（Ｐ２００２−５７４３７０）の分割
【原出願日】平成１４年３月２１日（２００２．３．２１）
【出願人】（５０３３４２６４９）アイシス イノヴェイション リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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