カスパーゼ−３活性阻害剤
【課題】カスパーゼ−３活性を阻害する低分子阻害剤、さらに詳細には、医薬品として有用性の高いと認識されているペプチド骨格を持たない新規低分子阻害剤を提供すること。
【解決手段】特定のファーマコフォアを有する化合物又はその塩を含むカスパーゼ−３活性阻害剤、及びそのカスパーゼ−３活性阻害活性に基づくアポトーシス阻害剤。
【解決手段】特定のファーマコフォアを有する化合物又はその塩を含むカスパーゼ−３活性阻害剤、及びそのカスパーゼ−３活性阻害活性に基づくアポトーシス阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカスパーゼ−３活性阻害剤に関する。さらに詳細には、本発明はカスパーゼ−３活性を阻害するアポトーシス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは遺伝子に制御された細胞死の一様式であり、アポトーシスに特徴的な細胞の形態学的変化やＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化により特徴づけられている。アポトーシスのシグナル伝達経路には多くの分子が関与しているが、その中でもカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）はその実行因子として中心的な役割を担っている。現在、１４種類のカスパーゼが同定されており、主にアポトーシスではカスパーゼ−２、−３、−６、−７、−８、−９が、そして炎症反応ではカスパーゼ−１、−４、−５が関与することが示されている。アポトーシスに関与するカスパーゼはさらに、イニシエータータイプ（カスパーゼ−２、−８、−９）とエフェクタータイプ（カスパーゼ−３、−６、−７）に分類される。カスパーゼは通常、不活性な前駆体として存在し、特定のＡｓｐ残基部位でプロセッシングを受けることにより、３つのパートに分かれ、分子量約２０ｋＤ及び約１０ｋＤの断片（ｐ２０、ｐ１０）を２つずつ含む四量体の活性型となる。アポトーシスの刺激に応じてイニシエータータイプのカスパーゼが最初に活性化して、プロテアーゼ活性を発揮できるようになり、これがエフェクタータイプのカスパーゼをプロセッシングして活性化させ、細胞内の構成成分を切断する（カスパーゼカスケード）。これまでに６０以上のカスパーゼの基質タンパク質が同定されている。
アポトーシスにおけるカスパーゼカスケードの破綻は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌などの疾患の発症に深く関与していることが明らかとなっている。特に、カスパーゼ−３は、アポトーシスの実行時に中心的な役割を果たすエフェクタータイプのカスパーゼであるため、その特異的阻害剤は、カスパーゼ−３の生理的役割だけではなく、疾患との関連性を解明する上での重要なツールとなる。さらに、カスパーゼ阻害剤は、ＡＬＳ、敗血症、脳虚血の治療に有効であることも示されている（非特許文献１〜３）。
カスパーゼ阻害剤の有効性が報告されるに伴い、ペプチド性阻害剤から低分子阻害剤への変換設計（ペプチドミメティクス）、及びＨＴＳ（Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を用いた低分子阻害剤の探索が活発に行われるに到っている。ペプチドミメティクスのベース配列としてカスパーゼ−３阻害剤であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯなどが利用され、これまでに、多くのペプチドミメティクスが報告されている（非特許文献４〜６）。そこでの課題は、医薬品としての物性に乏しい負電荷をもつカルボン酸、及びペプチド骨格をいかにＤｒｕｇ−ｌｉｋｅな骨格へと変換設計していくかである。しかしながら、細胞／動物レベルにおいて効果を示したペプチド性阻害剤はいくつか報告されているが、低分子阻害剤の成功事例はほとんどないのが現状である。
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｍ．ら， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ−１ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎ ａｎ ＡＬＳ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８， ｐ．３３５−３３９
【非特許文献２】Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ，Ｒ．Ｓ．ら， Ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ： ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ． （２０００） Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ｐ．４９６−５０１
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．ら， Ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｆｆｏｒｄｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｌａｙｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． （１９９８） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． １０１， ｐ．１９９２−１９９９
【非特許文献４】Ｈａｎ，Ｙ．ら， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｓｐａｒｔｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． （２００４） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．， １４， ｐ．８０５−８０８
【非特許文献５】Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら， Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． （２００４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ４７， ｐ．２４６６−２４７４
【非特許文献６】Ｍｉｃａｌｅ，Ｎ．ら， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ−３． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． （２００４） ４７， ｐ．６４５５−６４５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の課題は、カスパーゼ−３活性を阻害する低分子阻害剤、さらに詳細には、医薬品として有用性が高いと認識されている、ペプチド骨格を持たない新規低分子阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、カスパーゼ−３の特定の３つの結合ポケット（図１〜３、Ｓ１〜Ｓ３）との結合領域を有する化合物がカスパーゼ−３活性を有意に阻害し、さらにはアポトーシスを阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。なお、本明細書中のファーマコフォアの定義においては原子間距離を実線で示している。
【０００５】
〔１〕 以下のファーマコフォア
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】
【化３】
【０００９】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
のいずれかを有する化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
〔２〕 以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化５】
【００１２】
〔式中、Ｌは単結合、置換されていてもよいメチレン、−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ１２は水素又は水酸基であり、Ｒ１３は水素又はメチルであり、Ｒ１４は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよい複素環基であり、Ｒ１５は水素又は水酸基であり、Ｒ１６及びＲ１７のいずれか一方が水素又はスルホニルであり、他方が−Ｌ−Ｒ１４（Ｌ及びＲ１４は上記定義と同じ）で示される〕
で示される化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
〔３〕 Ｒ１４が置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル又は置換されていてもよいチアゾリルである、上記〔２〕に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
〔４〕 アポトーシス阻害剤である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
〔５〕 以下の式（ＩＩＩ）
【００１３】
【化６】
【００１４】
〔式中、Ｌは単結合又は−Ｏ−であり、Ｒ２１は置換されていてもよいナフチル又は置換されていてもよい含窒素複素環基である〕
で示される化合物又はその塩。
〔６〕 Ｒ２１が置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル又は置換されていてもよいインドリルである、上記〔５〕に記載の化合物又はその塩。
〔７〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア１ともいう）
【００１５】
【化７】
【００１６】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔８〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア２ともいう）
【００１７】
【化８】
【００１８】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔９〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア３ともいう）
【００１９】
【化９】
【００２０】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１０〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２１】
【化１０】
【００２２】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１１〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２３】
【化１１】
【００２４】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１２〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２５】
【化１２】
【００２６】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００２７】
カスパーゼ−３活性を阻害する本発明の低分子阻害剤は、医薬品として有用性が高いと認識されているペプチド骨格を持たないものであるので、アポトーシスの抑制が所望される疾患に対する医薬として有用でありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
Ｒ２におけるＣ１−６アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキルを意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシルなどが挙げられる。
【００２９】
Ｒ１４における置換されていてもよいＣ１−６アルキルのＣ１−６アルキルとは、Ｒ２について記載したＣ１−６アルキルと同じであるが、メチルが好ましい。
Ｒ１４における置換されていてもよいアリールのアリールとは、単環式又は縮合二環式の芳香族基を意味し、例えば、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
Ｒ１４における置換されていてもよい複素環基の複素環基とは、窒素原子及びイオウ原子からなる群から選ばれる少なくとも１つの原子を環構成原子に含む単環式若しくは縮合二環式の脂肪族環基又は芳香族環基を意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、インドリル、チアゾリル、２，３−ジヒドロピロリルなどが挙げられる。
【００３０】
Ｒ２１における置換されていてもよい含窒素複素環基の含窒素複素環基とは、少なくとも１つの窒素原子を環構成原子に含む単環式又は縮合二環式の複素環基を意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、インドリル、２，３−ジヒドロピロリルなどが挙げられる。
【００３１】
Ｌにおける置換されていてもよいメチレンの置換基としては、例えば、３−カルボキシ−５−メチル−４−オキソ−シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン、３−カルボキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ナフタレン−１−イリデンなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよい含窒素複素環基、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル、及び、置換されていてもよいチアゾリルが有していてもよい置換基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル−オキシカルボニル、フェニル、オキソ、２−（４−ブロモ−フェニル）フラン−５−イルメチリデン、２−オキソ−クロメン−３−イル、塩素、スルホニル、ニトロ、ピリジン−２−イル−アミノスルホニル、置換されていてもよいＣ１−６アルキル（置換基としては、カルバモイル、カルボキシなどが挙げられる）、水酸基、カルボキシなどが挙げられる。ここでの置換基としてのＣ１−６アルキルとしては、Ｒ２について記載したＣ１−６アルキルと同じものが挙げられるが、メチル及びエチルが好ましい。
【００３２】
Ｒ２における置換されていてもよいＣ１−６アルキルとしては、エトキシカルボニルメチルが好ましい。
Ｒ１４としては、置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル、及び、置換されていてもよいチアゾリルが好ましく、エトキシカルボニルメチル、フェニル、２，６−ジクロロ−３−スルホニル−フェニル、４−ニトロ−フェニル、４−（ピリジン−２−イル−アミノスルホニル）−フェニル、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ナフチル、３−［２−（４−ブロモ−フェニル）フラン−５−イルメチリデン］−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−ピロリル、４−（２−オキソ−クロメン−３−イル）−チアゾール−２−イル、１−カルバモイルメチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシメチル−３−メチル−ピロール−５−イル、１−カルバモイルエチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシエチル−３−メチル−ピロール−５−イル、５−カルバモイルエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル、及び、５−カルボキシエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルが特に好ましい。
Ｒ２１における置換されていてもよいナフチルとしては、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ナフチルが好ましい。
Ｒ２１における置換されていてもよい含窒素複素環基としては、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、及び、置換されていてもよいインドリルが好ましく、１−カルバモイルメチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシメチル−３−メチル−ピロール−５−イル、１−カルバモイルエチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシエチル−３−メチル−ピロール−５−イル、５−カルバモイルエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル、及び、５−カルボキシエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルが好ましい。
【００３３】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかで示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００３４】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよい含窒素複素環基であって、該含窒素複素環基が単環式の化合物は、例えば、後述の製造例１に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３５】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよい含窒素複素環基であって、該含窒素複素環基が縮合二環式の化合物は、例えば、後述の製造例５に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３６】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよいナフチルは、例えば、後述の製造例７に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３７】
ファーマコフォア１〜３及び式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物は塩を形成することもでき、これもまた本発明に包含される。当該塩は生物学的に許容される通常無毒の塩であり、無機塩基との塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えば、トリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸もしくはスルホン酸付加塩（例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩又は酸付加塩が例示される。加えて、それらの溶媒和化合物（例えば、包接化合物（例えば水和物等））もまた、本発明に包含される。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法は例えば以下のようにして行うことができる。
ファーマコフォア定義
ファーマコフォア１〜３のいずれかを満たす化合物を選択し、慣用のドッキングプログラムを用いてカスパーゼ−３の立体構造と該化合物の結合スコアを計算し、結合スコアの良好な化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。ここで用いられるドッキングプログラムは、特に限定されず、当分野で一般的に利用可能なソフトウェアを用いればよく、そのようなソフトウェアとしては、例えば、ＤＯＣＫ、ＡＵＴＯＤＯＣＫなどが挙げられるが、定義したファーマコフォアを満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラムが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価としては、例えば、酵素反応生成物の蛍光分光分析などが挙げられる。
このようにして、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明におけるカスパーゼ−３活性阻害活性とは、例えば、酵素反応生成物の蛍光分光分析などのカスパーゼ−３活性を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にカスパーゼ−３活性を阻害する活性を意味し、１００μＭでの％阻害が２５％以上であるのが好ましく、５０％以上であるのがさらに好ましい。
【００４０】
また、本発明におけるアポトーシス阻害効果とは、例えば、ＤＮＡラダーなどのアポトーシスによる細胞死を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にアポトーシスを阻害する効果を意味し、そのIＣ５０が１００μＭ以下であるのが好ましく、５０μＭ以下であるのがさらに好ましい。
【００４１】
本発明の阻害剤を医薬として使用する場合、ファーマコフォア１〜３及び式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物並びにその塩（以下、これらを総称して本発明の化合物ともいう）の少なくとも１種を、医薬上許容される担体（例えば、賦形剤、希釈剤等）などの必要な成分と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の慣用の任意の剤形に製剤化して、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００４２】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリジン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラバン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の阻害剤を医薬として用いる場合、好ましい剤形は、経口又は注射製剤である。好適な経口製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の本発明の化合物を溶解させた液剤、有効量の該化合物を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の該化合物を懸濁させた懸濁液剤、有効量の該化合物を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。好適な注射製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。本発明の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、本発明の化合物および医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００４４】
本発明の薬剤の投与量は、有効成分である本発明の化合物の有効量、該化合物の細胞毒性、病気の進行度、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり３０μｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４６】
カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物の同定
Ｃａｓｐａｓｅ−３特異的阻害ペプチドであるＡｃ−ＤＮＬＤ−ＣＨＯのＬＤの結合様式を基に図１に示すファーマコフォア１を構築した。
予め構築しておいた化合物ライブラリよりファーマコフォア１を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（ファーマコフォア１を満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ． Ｄ． Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、後述の実施例１の化合物を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、さらに図２に示すファーマコフォア２を構築した。
【００４７】
化合物ライブラリよりファーマコフォア２を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（ファーマコフォア２を満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ． Ｄ． Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて、構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、後述の実施例２〜８の化合物を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、カスパーゼ−３特異的阻害を規定するＤＮＬＤ（配列表配列番号１）中のＮ（Ｓ３ポケットに結合する）結合配置（Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ａ．， Ｔａｋａｓａｗａ Ｒ．， Ｔａｎｕｍａ Ｓ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｆｉｔｎｅｓｓ ｓｃｏｒｅ． ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （２００４） ４， ７．）を考慮して、新規化合物を設計し、図３に示すファーマコフォア３を構築した。
【００４８】
ファーマコフォア３をもとに以下の製造例１〜７の化合物をモデリングした。製造例１〜７の化合物は以下の合成スキームに従って作製できる。
【００４９】
製造例１
工程１
１，４−ジヒドロキシナフタレンの水酸基の一方を慣用の手法を用いてＰ１（ベンジル基、ｔ−ブチル基などのフェノール性水酸基の保護基）で保護し、１の化合物を得る。
【００５０】
【化１３】
【００５１】
工程２
２−クロロオキサゾール−４−カルボン酸エチルエステルと工程１で得られる１の化合物とから、Ａ．Ａｆｚａｌｉら，Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３，３３５（１９８３）の記載に準じ、２の化合物を得る。
【００５２】
【化１４】
【００５３】
工程３
２の化合物から、Ｊ．Ｗ．Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４７，９６の記載に準じ、３の化合物を得る。
【００５４】
【化１５】
【００５５】
（式中、Ｐ２はベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基である）
【００５６】
工程４
３の化合物から、Ｇ．Ａ．Ｏｌａｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，１２４７（１９７９）及びＲ．Ｆ．Ｎｙｓｔｒｏｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９，２５４８（１９４７）の記載に準じ、４の化合物を得る。
【００５７】
【化１６】
【００５８】
工程５
４の化合物から、Ｄ．Ｈ．Ｒ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９６９（１９９１）の記載に準じ、５の化合物を得る。
【００５９】
【化１７】
【００６０】
工程６
５の化合物のＰ１を慣用の手法を用いて脱保護し、６の化合物を得る。
【００６１】
【化１８】
【００６２】
工程７
６の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））及びＯ．Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，４０，２３８０（１９６７）の記載に準じ、７の化合物を得る。
【００６３】
【化１９】
【００６４】
工程８
７の化合物のＰ２を慣用の手法を用いて脱保護し、８の化合物を得る。
【００６５】
【化２０】
【００６６】
工程９
８の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９及びＲ．Ａｐｐｅｌら，Ｂｅｒ．，１１６，２０３７（１９８３）の記載に準じ、９の化合物を得る。
【００６７】
【化２１】
【００６８】
工程１０
９の化合物から、Ｇ．Ａ．Ｏｌａｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，１２４７（１９７９）の記載に準じ、製造例１の化合物を得る。
【００６９】
【化２２】
【００７０】
製造例２〜４
以下の表１に示す製造例２〜４の化合物は、製造例１に準じ、合成することができる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
製造例５
工程１
４−（３−ヒドロキシプロピル）ベンゼン−１，２−ジオールの一級水酸基を慣用の手法を用いてＰ１（ベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基）で保護し、１の化合物を得る。
【００７３】
【化２３】
【００７４】
工程２
１の化合物から、Ｗ．Ｈ．Ｈａｒｔｕｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６３，５０７（１９４１）の記載に準じ、２の化合物を得る。
【００７５】
【化２４】
【００７６】
工程３
２の化合物のアミノ基を慣用の手法を用いてＰ２（ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などのアミノ基の保護基）で保護し、３の化合物を得る。
【００７７】
【化２５】
【００７８】
工程４
３の化合物から、Ｔ．Ｃｈｏｓｈｉ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１２１（７），４８７（２００１）の記載に準じ、４の化合物を得る。
【００７９】
【化２６】
【００８０】
工程５
１，４−ジヒドロキシナフタレンの水酸基の一方を慣用の手法を用いてＰ３（ベンジル基、ｔ−ブチル基などのフェノール性水酸基の保護基）で保護し、５の化合物を得る。
【００８１】
【化２７】
【００８２】
工程６
５の化合物から、Ｔ．Ｃｈｏｓｈｉ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１２１（７），４８７（２００１）の記載に準じ、６の化合物を得る。
【００８３】
【化２８】
【００８４】
工程７
工程４で得られる４の化合物と工程６で得られる６の化合物とから、Ｊ．Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．，４０７（１９８６）の記載に準じ、７の化合物を得る。
【００８５】
【化２９】
【００８６】
工程８
７の化合物のＰ３を慣用の手法を用いて脱保護し、８の化合物を得る。
【００８７】
【化３０】
【００８８】
工程９
８の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））を用いて、９の化合物を得る。
【００８９】
【化３１】
【００９０】
工程１０
９の化合物から、Ｐ．Ｇ．Ｇａｓｓｍａｎら，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，ＶＩ，６０１（１９８８）の記載に準じ、１０の化合物を得る。
【００９１】
【化３２】
【００９２】
工程１１
１０の化合物の一級水酸基を慣用の手法を用いてＰ４（ベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基）で保護し、１１の化合物を得る。
【００９３】
【化３３】
【００９４】
工程１２
１１の化合物のＰ１を慣用の手法を用いて脱保護し、１２の化合物を得る。
【００９５】
【化３４】
【００９６】
工程１３
１２の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９及びＲ．Ａｐｐｅｌら，Ｂｅｒ．，１１６，２０３７（１９８３）の記載に準じ、１３の化合物を得る。
【００９７】
【化３５】
【００９８】
工程１４
１３の化合物のＰ４を慣用の手法を用いて脱保護し、１４の化合物を得る。
【００９９】
【化３６】
【０１００】
工程１５
１４の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９の記載に準じ、製造例５の化合物を得る。
【０１０１】
【化３７】
【０１０２】
製造例６
【０１０３】
【化３８】
【０１０４】
製造例６の化合物は、製造例５に記載の方法に準じ、合成することができる。
【０１０５】
製造例７
工程１
１，１’−ビナフタレン−４，４’−ジオールとナトリウムを反応させ、１の化合物を得る。
【０１０６】
【化３９】
【０１０７】
工程２
１の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））を用いて、製造例７の化合物を得る。
【０１０８】
【化４０】
【０１０９】
同定化合物の活性の測定
同定化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性及びアポトーシス阻害効果を以下に記載の手順により測定した。測定に使用した化合物は、実施例１の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｏ１６２５）、実施例２の化合物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓ９８４５６６）、実施例３の化合物はＴｉｍＴｅｃ社（ＳＴ９０４３０７）、実施例４の化合物はＳｐｅｃｓ社（ＡＧ−６９０／３７０９９１３３）、実施例５の化合物はＡｓｉｎｅｘ社（ＢＡＳ０４８８０６４６）、実施例６の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｃ１０１８）、実施例７の化合物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｒ３２０８９７）、実施例８の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｓ０８８３）より購入した。
【０１１０】
カスパーゼ−３活性阻害活性の測定
カスパーゼ−３の活性は、基質として、製品コード３１７１−ｖの基質を株式会社ペプチド研究所から購入し、これを用いて測定した。１ ｕｎｉｔの活性型リコンビナントカスパーゼ−３（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入）を、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）において、撹拌しながら３７℃３０分、緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）中、試験化合物とともにインキュベートした。次いで、２００μＭ基質を各ウェルに添加し、９６ウェルプレートリーダーＷａｌｌａｃｅ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、６０分間１分間隔にて３９０ｎｍの波長で励起し、４６０ｎｍの蛍光波長を測定し、各試験化合物の１００μＭでの％阻害（実施例２の化合物についてはＩＣ５０も）を以下のように算出した。
％阻害：
化合物を入れた状態の蛍光強度を化合物なしの状態の蛍光強度で割って１００をかける。この値は％活性を示すので、１００から％活性を引くことにより％阻害とした。
％阻害＝１００−｛（化合物（＋）の蛍光強度／化合物（−）の蛍光強度）×１００｝
ＩＣ５０：
各濃度における％阻害を算出し、Ｘ軸を化合物濃度の対数、Ｙ軸に％阻害をとったグラフを作成し、５０％阻害に対応する濃度をＩＣ５０とした。
結果を表２−１及び２−２に示す。
【０１１１】
【表２−１】
【０１１２】
【表２−２】
【０１１３】
アポトーシス阻害効果の測定
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２ｍＬを６ウェルプレートに播種し、各濃度の試験化合物を加え、１時間、プレインキュベートした。その後、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ２μＭ、６時間の処理によりアポトーシスを誘導した。
処理の終わった細胞を回収し、２４μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、攪拌し、２０ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏＫを５μＬ加えて５０℃で３時間インキュベートした。その後、さらに１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを５μＬ加えて３７℃で１．５時間インキュベートした。このサンプルを２０μＬ取って１．８％ アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡの断片化を検出した。
最後にゲルをＥｔＢｒ染色した後、ＵＶ照射下で写真撮影し、その写真をデンシトメトリーにかけ、定量化することにより、アポトーシス阻害効果を評価した。結果を図４に示す。
（参考文献：改訂 アポトーシス実験プロトコール 基礎編、田沼靖一監修、秀潤社 ７９頁）
【０１１４】
これらの結果から、本発明の化合物は、優れたカスパーゼ−３活性阻害活性及びアポトーシス阻害効果を有することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ファーマコフォア１を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図２】ファーマコフォア２を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図３】ファーマコフォア３を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ａは水素結合アクセプター、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図４】実施例２の化合物のアポトーシス阻害効果に関する実験結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号１：カスパーゼ−３特異的阻害を規定する配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカスパーゼ−３活性阻害剤に関する。さらに詳細には、本発明はカスパーゼ−３活性を阻害するアポトーシス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは遺伝子に制御された細胞死の一様式であり、アポトーシスに特徴的な細胞の形態学的変化やＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化により特徴づけられている。アポトーシスのシグナル伝達経路には多くの分子が関与しているが、その中でもカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）はその実行因子として中心的な役割を担っている。現在、１４種類のカスパーゼが同定されており、主にアポトーシスではカスパーゼ−２、−３、−６、−７、−８、−９が、そして炎症反応ではカスパーゼ−１、−４、−５が関与することが示されている。アポトーシスに関与するカスパーゼはさらに、イニシエータータイプ（カスパーゼ−２、−８、−９）とエフェクタータイプ（カスパーゼ−３、−６、−７）に分類される。カスパーゼは通常、不活性な前駆体として存在し、特定のＡｓｐ残基部位でプロセッシングを受けることにより、３つのパートに分かれ、分子量約２０ｋＤ及び約１０ｋＤの断片（ｐ２０、ｐ１０）を２つずつ含む四量体の活性型となる。アポトーシスの刺激に応じてイニシエータータイプのカスパーゼが最初に活性化して、プロテアーゼ活性を発揮できるようになり、これがエフェクタータイプのカスパーゼをプロセッシングして活性化させ、細胞内の構成成分を切断する（カスパーゼカスケード）。これまでに６０以上のカスパーゼの基質タンパク質が同定されている。
アポトーシスにおけるカスパーゼカスケードの破綻は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌などの疾患の発症に深く関与していることが明らかとなっている。特に、カスパーゼ−３は、アポトーシスの実行時に中心的な役割を果たすエフェクタータイプのカスパーゼであるため、その特異的阻害剤は、カスパーゼ−３の生理的役割だけではなく、疾患との関連性を解明する上での重要なツールとなる。さらに、カスパーゼ阻害剤は、ＡＬＳ、敗血症、脳虚血の治療に有効であることも示されている（非特許文献１〜３）。
カスパーゼ阻害剤の有効性が報告されるに伴い、ペプチド性阻害剤から低分子阻害剤への変換設計（ペプチドミメティクス）、及びＨＴＳ（Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を用いた低分子阻害剤の探索が活発に行われるに到っている。ペプチドミメティクスのベース配列としてカスパーゼ−３阻害剤であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯなどが利用され、これまでに、多くのペプチドミメティクスが報告されている（非特許文献４〜６）。そこでの課題は、医薬品としての物性に乏しい負電荷をもつカルボン酸、及びペプチド骨格をいかにＤｒｕｇ−ｌｉｋｅな骨格へと変換設計していくかである。しかしながら、細胞／動物レベルにおいて効果を示したペプチド性阻害剤はいくつか報告されているが、低分子阻害剤の成功事例はほとんどないのが現状である。
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｍ．ら， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ−１ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎ ａｎ ＡＬＳ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８， ｐ．３３５−３３９
【非特許文献２】Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ，Ｒ．Ｓ．ら， Ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ： ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ． （２０００） Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ｐ．４９６−５０１
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．ら， Ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｆｆｏｒｄｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｌａｙｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． （１９９８） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． １０１， ｐ．１９９２−１９９９
【非特許文献４】Ｈａｎ，Ｙ．ら， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｓｐａｒｔｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． （２００４） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．， １４， ｐ．８０５−８０８
【非特許文献５】Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら， Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． （２００４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ４７， ｐ．２４６６−２４７４
【非特許文献６】Ｍｉｃａｌｅ，Ｎ．ら， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ−３． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． （２００４） ４７， ｐ．６４５５−６４５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の課題は、カスパーゼ−３活性を阻害する低分子阻害剤、さらに詳細には、医薬品として有用性が高いと認識されている、ペプチド骨格を持たない新規低分子阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、カスパーゼ−３の特定の３つの結合ポケット（図１〜３、Ｓ１〜Ｓ３）との結合領域を有する化合物がカスパーゼ−３活性を有意に阻害し、さらにはアポトーシスを阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。なお、本明細書中のファーマコフォアの定義においては原子間距離を実線で示している。
【０００５】
〔１〕 以下のファーマコフォア
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】
【化３】
【０００９】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
のいずれかを有する化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
〔２〕 以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化５】
【００１２】
〔式中、Ｌは単結合、置換されていてもよいメチレン、−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ１２は水素又は水酸基であり、Ｒ１３は水素又はメチルであり、Ｒ１４は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよい複素環基であり、Ｒ１５は水素又は水酸基であり、Ｒ１６及びＲ１７のいずれか一方が水素又はスルホニルであり、他方が−Ｌ−Ｒ１４（Ｌ及びＲ１４は上記定義と同じ）で示される〕
で示される化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
〔３〕 Ｒ１４が置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル又は置換されていてもよいチアゾリルである、上記〔２〕に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
〔４〕 アポトーシス阻害剤である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
〔５〕 以下の式（ＩＩＩ）
【００１３】
【化６】
【００１４】
〔式中、Ｌは単結合又は−Ｏ−であり、Ｒ２１は置換されていてもよいナフチル又は置換されていてもよい含窒素複素環基である〕
で示される化合物又はその塩。
〔６〕 Ｒ２１が置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル又は置換されていてもよいインドリルである、上記〔５〕に記載の化合物又はその塩。
〔７〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア１ともいう）
【００１５】
【化７】
【００１６】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔８〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア２ともいう）
【００１７】
【化８】
【００１８】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔９〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア（以下、ファーマコフォア３ともいう）
【００１９】
【化９】
【００２０】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１０〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２１】
【化１０】
【００２２】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１１〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２３】
【化１１】
【００２４】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
〔１２〕 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２５】
【化１２】
【００２６】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００２７】
カスパーゼ−３活性を阻害する本発明の低分子阻害剤は、医薬品として有用性が高いと認識されているペプチド骨格を持たないものであるので、アポトーシスの抑制が所望される疾患に対する医薬として有用でありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
Ｒ２におけるＣ１−６アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキルを意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシルなどが挙げられる。
【００２９】
Ｒ１４における置換されていてもよいＣ１−６アルキルのＣ１−６アルキルとは、Ｒ２について記載したＣ１−６アルキルと同じであるが、メチルが好ましい。
Ｒ１４における置換されていてもよいアリールのアリールとは、単環式又は縮合二環式の芳香族基を意味し、例えば、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
Ｒ１４における置換されていてもよい複素環基の複素環基とは、窒素原子及びイオウ原子からなる群から選ばれる少なくとも１つの原子を環構成原子に含む単環式若しくは縮合二環式の脂肪族環基又は芳香族環基を意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、インドリル、チアゾリル、２，３−ジヒドロピロリルなどが挙げられる。
【００３０】
Ｒ２１における置換されていてもよい含窒素複素環基の含窒素複素環基とは、少なくとも１つの窒素原子を環構成原子に含む単環式又は縮合二環式の複素環基を意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、インドリル、２，３−ジヒドロピロリルなどが挙げられる。
【００３１】
Ｌにおける置換されていてもよいメチレンの置換基としては、例えば、３−カルボキシ−５−メチル−４−オキソ−シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン、３−カルボキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ナフタレン−１−イリデンなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよい含窒素複素環基、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル、及び、置換されていてもよいチアゾリルが有していてもよい置換基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル−オキシカルボニル、フェニル、オキソ、２−（４−ブロモ−フェニル）フラン−５−イルメチリデン、２−オキソ−クロメン−３−イル、塩素、スルホニル、ニトロ、ピリジン−２−イル−アミノスルホニル、置換されていてもよいＣ１−６アルキル（置換基としては、カルバモイル、カルボキシなどが挙げられる）、水酸基、カルボキシなどが挙げられる。ここでの置換基としてのＣ１−６アルキルとしては、Ｒ２について記載したＣ１−６アルキルと同じものが挙げられるが、メチル及びエチルが好ましい。
【００３２】
Ｒ２における置換されていてもよいＣ１−６アルキルとしては、エトキシカルボニルメチルが好ましい。
Ｒ１４としては、置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル、及び、置換されていてもよいチアゾリルが好ましく、エトキシカルボニルメチル、フェニル、２，６−ジクロロ−３−スルホニル−フェニル、４−ニトロ−フェニル、４−（ピリジン−２−イル−アミノスルホニル）−フェニル、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ナフチル、３−［２−（４−ブロモ−フェニル）フラン−５−イルメチリデン］−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−ピロリル、４−（２−オキソ−クロメン−３−イル）−チアゾール−２−イル、１−カルバモイルメチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシメチル−３−メチル−ピロール−５−イル、１−カルバモイルエチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシエチル−３−メチル−ピロール−５−イル、５−カルバモイルエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル、及び、５−カルボキシエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルが特に好ましい。
Ｒ２１における置換されていてもよいナフチルとしては、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−ナフチルが好ましい。
Ｒ２１における置換されていてもよい含窒素複素環基としては、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、及び、置換されていてもよいインドリルが好ましく、１−カルバモイルメチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシメチル−３−メチル−ピロール−５−イル、１−カルバモイルエチル−４−メチル−イミダゾール−２−イル、１−カルボキシエチル−３−メチル−ピロール−５−イル、５−カルバモイルエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル、及び、５−カルボキシエチル−２−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルが好ましい。
【００３３】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれかで示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００３４】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよい含窒素複素環基であって、該含窒素複素環基が単環式の化合物は、例えば、後述の製造例１に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３５】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよい含窒素複素環基であって、該含窒素複素環基が縮合二環式の化合物は、例えば、後述の製造例５に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３６】
式（ＩＩＩ）で示される化合物のうちＲ２１が置換されていてもよいナフチルは、例えば、後述の製造例７に記載の合成スキームによって合成することができる。
【００３７】
ファーマコフォア１〜３及び式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物は塩を形成することもでき、これもまた本発明に包含される。当該塩は生物学的に許容される通常無毒の塩であり、無機塩基との塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えば、トリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸もしくはスルホン酸付加塩（例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩又は酸付加塩が例示される。加えて、それらの溶媒和化合物（例えば、包接化合物（例えば水和物等））もまた、本発明に包含される。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法は例えば以下のようにして行うことができる。
ファーマコフォア定義
ファーマコフォア１〜３のいずれかを満たす化合物を選択し、慣用のドッキングプログラムを用いてカスパーゼ−３の立体構造と該化合物の結合スコアを計算し、結合スコアの良好な化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。ここで用いられるドッキングプログラムは、特に限定されず、当分野で一般的に利用可能なソフトウェアを用いればよく、そのようなソフトウェアとしては、例えば、ＤＯＣＫ、ＡＵＴＯＤＯＣＫなどが挙げられるが、定義したファーマコフォアを満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラムが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価としては、例えば、酵素反応生成物の蛍光分光分析などが挙げられる。
このようにして、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明におけるカスパーゼ−３活性阻害活性とは、例えば、酵素反応生成物の蛍光分光分析などのカスパーゼ−３活性を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にカスパーゼ−３活性を阻害する活性を意味し、１００μＭでの％阻害が２５％以上であるのが好ましく、５０％以上であるのがさらに好ましい。
【００４０】
また、本発明におけるアポトーシス阻害効果とは、例えば、ＤＮＡラダーなどのアポトーシスによる細胞死を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にアポトーシスを阻害する効果を意味し、そのIＣ５０が１００μＭ以下であるのが好ましく、５０μＭ以下であるのがさらに好ましい。
【００４１】
本発明の阻害剤を医薬として使用する場合、ファーマコフォア１〜３及び式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物並びにその塩（以下、これらを総称して本発明の化合物ともいう）の少なくとも１種を、医薬上許容される担体（例えば、賦形剤、希釈剤等）などの必要な成分と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の慣用の任意の剤形に製剤化して、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００４２】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリジン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラバン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の阻害剤を医薬として用いる場合、好ましい剤形は、経口又は注射製剤である。好適な経口製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の本発明の化合物を溶解させた液剤、有効量の該化合物を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の該化合物を懸濁させた懸濁液剤、有効量の該化合物を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。好適な注射製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。本発明の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、本発明の化合物および医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００４４】
本発明の薬剤の投与量は、有効成分である本発明の化合物の有効量、該化合物の細胞毒性、病気の進行度、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり３０μｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４６】
カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物の同定
Ｃａｓｐａｓｅ−３特異的阻害ペプチドであるＡｃ−ＤＮＬＤ−ＣＨＯのＬＤの結合様式を基に図１に示すファーマコフォア１を構築した。
予め構築しておいた化合物ライブラリよりファーマコフォア１を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（ファーマコフォア１を満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ． Ｄ． Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、後述の実施例１の化合物を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、さらに図２に示すファーマコフォア２を構築した。
【００４７】
化合物ライブラリよりファーマコフォア２を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（ファーマコフォア２を満たす化合物をカスパーゼ−３上のそれに重ね合わせた複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場（Ｗ． Ｄ． Ｃｏｒｎｅｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， ５１７９−５１９７ （１９９５））を用いて、構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、後述の実施例２〜８の化合物を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、カスパーゼ−３特異的阻害を規定するＤＮＬＤ（配列表配列番号１）中のＮ（Ｓ３ポケットに結合する）結合配置（Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ａ．， Ｔａｋａｓａｗａ Ｒ．， Ｔａｎｕｍａ Ｓ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｆｉｔｎｅｓｓ ｓｃｏｒｅ． ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （２００４） ４， ７．）を考慮して、新規化合物を設計し、図３に示すファーマコフォア３を構築した。
【００４８】
ファーマコフォア３をもとに以下の製造例１〜７の化合物をモデリングした。製造例１〜７の化合物は以下の合成スキームに従って作製できる。
【００４９】
製造例１
工程１
１，４−ジヒドロキシナフタレンの水酸基の一方を慣用の手法を用いてＰ１（ベンジル基、ｔ−ブチル基などのフェノール性水酸基の保護基）で保護し、１の化合物を得る。
【００５０】
【化１３】
【００５１】
工程２
２−クロロオキサゾール−４−カルボン酸エチルエステルと工程１で得られる１の化合物とから、Ａ．Ａｆｚａｌｉら，Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３，３３５（１９８３）の記載に準じ、２の化合物を得る。
【００５２】
【化１４】
【００５３】
工程３
２の化合物から、Ｊ．Ｗ．Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４７，９６の記載に準じ、３の化合物を得る。
【００５４】
【化１５】
【００５５】
（式中、Ｐ２はベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基である）
【００５６】
工程４
３の化合物から、Ｇ．Ａ．Ｏｌａｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，１２４７（１９７９）及びＲ．Ｆ．Ｎｙｓｔｒｏｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９，２５４８（１９４７）の記載に準じ、４の化合物を得る。
【００５７】
【化１６】
【００５８】
工程５
４の化合物から、Ｄ．Ｈ．Ｒ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９６９（１９９１）の記載に準じ、５の化合物を得る。
【００５９】
【化１７】
【００６０】
工程６
５の化合物のＰ１を慣用の手法を用いて脱保護し、６の化合物を得る。
【００６１】
【化１８】
【００６２】
工程７
６の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））及びＯ．Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，４０，２３８０（１９６７）の記載に準じ、７の化合物を得る。
【００６３】
【化１９】
【００６４】
工程８
７の化合物のＰ２を慣用の手法を用いて脱保護し、８の化合物を得る。
【００６５】
【化２０】
【００６６】
工程９
８の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９及びＲ．Ａｐｐｅｌら，Ｂｅｒ．，１１６，２０３７（１９８３）の記載に準じ、９の化合物を得る。
【００６７】
【化２１】
【００６８】
工程１０
９の化合物から、Ｇ．Ａ．Ｏｌａｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，１２４７（１９７９）の記載に準じ、製造例１の化合物を得る。
【００６９】
【化２２】
【００７０】
製造例２〜４
以下の表１に示す製造例２〜４の化合物は、製造例１に準じ、合成することができる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
製造例５
工程１
４−（３−ヒドロキシプロピル）ベンゼン−１，２−ジオールの一級水酸基を慣用の手法を用いてＰ１（ベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基）で保護し、１の化合物を得る。
【００７３】
【化２３】
【００７４】
工程２
１の化合物から、Ｗ．Ｈ．Ｈａｒｔｕｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６３，５０７（１９４１）の記載に準じ、２の化合物を得る。
【００７５】
【化２４】
【００７６】
工程３
２の化合物のアミノ基を慣用の手法を用いてＰ２（ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などのアミノ基の保護基）で保護し、３の化合物を得る。
【００７７】
【化２５】
【００７８】
工程４
３の化合物から、Ｔ．Ｃｈｏｓｈｉ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１２１（７），４８７（２００１）の記載に準じ、４の化合物を得る。
【００７９】
【化２６】
【００８０】
工程５
１，４−ジヒドロキシナフタレンの水酸基の一方を慣用の手法を用いてＰ３（ベンジル基、ｔ−ブチル基などのフェノール性水酸基の保護基）で保護し、５の化合物を得る。
【００８１】
【化２７】
【００８２】
工程６
５の化合物から、Ｔ．Ｃｈｏｓｈｉ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１２１（７），４８７（２００１）の記載に準じ、６の化合物を得る。
【００８３】
【化２８】
【００８４】
工程７
工程４で得られる４の化合物と工程６で得られる６の化合物とから、Ｊ．Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．，４０７（１９８６）の記載に準じ、７の化合物を得る。
【００８５】
【化２９】
【００８６】
工程８
７の化合物のＰ３を慣用の手法を用いて脱保護し、８の化合物を得る。
【００８７】
【化３０】
【００８８】
工程９
８の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））を用いて、９の化合物を得る。
【００８９】
【化３１】
【００９０】
工程１０
９の化合物から、Ｐ．Ｇ．Ｇａｓｓｍａｎら，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，ＶＩ，６０１（１９８８）の記載に準じ、１０の化合物を得る。
【００９１】
【化３２】
【００９２】
工程１１
１０の化合物の一級水酸基を慣用の手法を用いてＰ４（ベンジル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基などの一級水酸基の保護基）で保護し、１１の化合物を得る。
【００９３】
【化３３】
【００９４】
工程１２
１１の化合物のＰ１を慣用の手法を用いて脱保護し、１２の化合物を得る。
【００９５】
【化３４】
【００９６】
工程１３
１２の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９及びＲ．Ａｐｐｅｌら，Ｂｅｒ．，１１６，２０３７（１９８３）の記載に準じ、１３の化合物を得る。
【００９７】
【化３５】
【００９８】
工程１４
１３の化合物のＰ４を慣用の手法を用いて脱保護し、１４の化合物を得る。
【００９９】
【化３６】
【０１００】
工程１５
１４の化合物から、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７９，３９９の記載に準じ、製造例５の化合物を得る。
【０１０１】
【化３７】
【０１０２】
製造例６
【０１０３】
【化３８】
【０１０４】
製造例６の化合物は、製造例５に記載の方法に準じ、合成することができる。
【０１０５】
製造例７
工程１
１，１’−ビナフタレン−４，４’−ジオールとナトリウムを反応させ、１の化合物を得る。
【０１０６】
【化３９】
【０１０７】
工程２
１の化合物から、Ｋｏｌｂｅ反応（Ａ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙら，Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，５７，５８３（１９５７））を用いて、製造例７の化合物を得る。
【０１０８】
【化４０】
【０１０９】
同定化合物の活性の測定
同定化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性及びアポトーシス阻害効果を以下に記載の手順により測定した。測定に使用した化合物は、実施例１の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｏ１６２５）、実施例２の化合物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓ９８４５６６）、実施例３の化合物はＴｉｍＴｅｃ社（ＳＴ９０４３０７）、実施例４の化合物はＳｐｅｃｓ社（ＡＧ−６９０／３７０９９１３３）、実施例５の化合物はＡｓｉｎｅｘ社（ＢＡＳ０４８８０６４６）、実施例６の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｃ１０１８）、実施例７の化合物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｒ３２０８９７）、実施例８の化合物はＳｉｇｍａ社（Ｓ０８８３）より購入した。
【０１１０】
カスパーゼ−３活性阻害活性の測定
カスパーゼ−３の活性は、基質として、製品コード３１７１−ｖの基質を株式会社ペプチド研究所から購入し、これを用いて測定した。１ ｕｎｉｔの活性型リコンビナントカスパーゼ−３（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入）を、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）において、撹拌しながら３７℃３０分、緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）中、試験化合物とともにインキュベートした。次いで、２００μＭ基質を各ウェルに添加し、９６ウェルプレートリーダーＷａｌｌａｃｅ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、６０分間１分間隔にて３９０ｎｍの波長で励起し、４６０ｎｍの蛍光波長を測定し、各試験化合物の１００μＭでの％阻害（実施例２の化合物についてはＩＣ５０も）を以下のように算出した。
％阻害：
化合物を入れた状態の蛍光強度を化合物なしの状態の蛍光強度で割って１００をかける。この値は％活性を示すので、１００から％活性を引くことにより％阻害とした。
％阻害＝１００−｛（化合物（＋）の蛍光強度／化合物（−）の蛍光強度）×１００｝
ＩＣ５０：
各濃度における％阻害を算出し、Ｘ軸を化合物濃度の対数、Ｙ軸に％阻害をとったグラフを作成し、５０％阻害に対応する濃度をＩＣ５０とした。
結果を表２−１及び２−２に示す。
【０１１１】
【表２−１】
【０１１２】
【表２−２】
【０１１３】
アポトーシス阻害効果の測定
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２ｍＬを６ウェルプレートに播種し、各濃度の試験化合物を加え、１時間、プレインキュベートした。その後、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ２μＭ、６時間の処理によりアポトーシスを誘導した。
処理の終わった細胞を回収し、２４μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、攪拌し、２０ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏＫを５μＬ加えて５０℃で３時間インキュベートした。その後、さらに１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを５μＬ加えて３７℃で１．５時間インキュベートした。このサンプルを２０μＬ取って１．８％ アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡの断片化を検出した。
最後にゲルをＥｔＢｒ染色した後、ＵＶ照射下で写真撮影し、その写真をデンシトメトリーにかけ、定量化することにより、アポトーシス阻害効果を評価した。結果を図４に示す。
（参考文献：改訂 アポトーシス実験プロトコール 基礎編、田沼靖一監修、秀潤社 ７９頁）
【０１１４】
これらの結果から、本発明の化合物は、優れたカスパーゼ−３活性阻害活性及びアポトーシス阻害効果を有することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ファーマコフォア１を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図２】ファーマコフォア２を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図３】ファーマコフォア３を示す図である。図中、Ｓ１〜Ｓ３は、カスパーゼ−３との結合領域、Ａは水素結合アクセプター、Ｄは水素結合ドナー、Ｈｙは疎水領域を示し、Ｒ１〜Ｒ３は本明細書に定義したとおりである。
【図４】実施例２の化合物のアポトーシス阻害効果に関する実験結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号１：カスパーゼ−３特異的阻害を規定する配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のファーマコフォア
【化１】
【化２】
【化３】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
のいずれかを有する化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項２】
以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化４】
【化５】
〔式中、Ｌは単結合、置換されていてもよいメチレン、−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ１２は水素又は水酸基であり、Ｒ１３は水素又はメチルであり、Ｒ１４は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよい複素環基であり、Ｒ１５は水素又は水酸基であり、Ｒ１６及びＲ１７のいずれか一方が水素又はスルホニルであり、他方が−Ｌ−Ｒ１４（Ｌ及びＲ１４は上記定義と同じ）で示される〕
で示される化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１４が置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル又は置換されていてもよいチアゾリルである、請求項２に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項４】
アポトーシス阻害剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項５】
以下の式（ＩＩＩ）
【化６】
〔式中、Ｌは単結合又は−Ｏ−であり、Ｒ２１は置換されていてもよいナフチル又は置換されていてもよい含窒素複素環基である〕
で示される化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ２１が置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル又は置換されていてもよいインドリルである、請求項５に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化７】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項８】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化８】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化９】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１０】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１１】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１２】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１】
以下のファーマコフォア
【化１】
【化２】
【化３】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
のいずれかを有する化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項２】
以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化４】
【化５】
〔式中、Ｌは単結合、置換されていてもよいメチレン、−Ｏ−、−Ｎ＝Ｎ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ１２は水素又は水酸基であり、Ｒ１３は水素又はメチルであり、Ｒ１４は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよい複素環基であり、Ｒ１５は水素又は水酸基であり、Ｒ１６及びＲ１７のいずれか一方が水素又はスルホニルであり、他方が−Ｌ−Ｒ１４（Ｌ及びＲ１４は上記定義と同じ）で示される〕
で示される化合物又はその塩を含む、カスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１４が置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいインドリル又は置換されていてもよいチアゾリルである、請求項２に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項４】
アポトーシス阻害剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のカスパーゼ−３活性阻害剤。
【請求項５】
以下の式（ＩＩＩ）
【化６】
〔式中、Ｌは単結合又は−Ｏ−であり、Ｒ２１は置換されていてもよいナフチル又は置換されていてもよい含窒素複素環基である〕
で示される化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ２１が置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル又は置換されていてもよいインドリルである、請求項５に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化７】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項８】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化８】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化９】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、カスパーゼ−３活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１０】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１１】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化１２】
〔式中、Ｒ１はカルボキシ又はスルホニルであり、Ｒ２はＣ１−６アルキルであり、Ｒ３はカルボニル、スルホニル、アミノ、カルボキシ又はニトロである〕
に合致するかどうかを調べる工程と、
合致した化合物のカスパーゼ−３活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害効果を有する化合物をスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−８８９４（Ｐ２００７−８８９４Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９４３７０（Ｐ２００５−１９４３７０）
【出願日】平成１７年７月１日（２００５．７．１）
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１日（２００５．７．１）
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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